ES2708450T3

ES2708450T3 - Bacterias ácido lácticas y bifidobacterias para tratar endotoxemia

Info

Publication number: ES2708450T3
Application number: ES10747076T
Authority: ES
Inventors: Rémy Burcelin; Didier Carcano; Pierre Desreumaux; Sampo Lahtinen; Nina Rautonen; Heli Putaala; Kirsti Tiihonen; Rodolphe Barrangou
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: International N and H Denmark ApS
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2019-04-09
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: EP2459203A1; PL2459203T3; US10543239B2; EP2459203B1; US9259447B2; DK2459203T3; BR112012001812A2; BR112012001812B1; WO2011013106A1; US20160113976A1; US20120183516A1; CN102470152A

Abstract

Una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxemia metabólica en un mamífero.

Description

DESCRIPCION

Bacterias acido lacticas y bifidobacterias para tratar endotoxemia

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos usos de la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas, (en particular, aunque no exclusivamente, bacterias probioticas), y a productos alimentarios, productos de alimentacion, suplementos dieteticos y formulaciones farmaceuticas que los contienen.

Antecedentes de la invencion

La endotoxemia se define como la presencia de un nivel elevado de lipopolisacaridos (tambien conocidos como endotoxinas) en el cuerpo. Los lipopolisacaridos (LPS), tambien conocidos como lipoglicanos, son moleculas grandes que consisten en al menos un resto lipfdico y al menos un resto polisacarido unidos por un enlace covalente. Los LPS se encuentran en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, actuan como endotoxinas y provocan fuertes respuestas inmunitarias en los animales.

Cani et al., Diabetes, 2007, 56, 1761-1772, describe la induccion de un aumento de la endotoxemia en ratones alimentados con una dieta con alto contenido de grasa. Los autores encontraron que la concentracion de LPS en plasma vana a lo largo del dfa, aumentando hasta un maximo al final de la oscuridad, el periodo de alimentacion para los ratones alimentados con una dieta normal, y que una dieta con alto contenido de grasa hizo que la endotoxemia fuera elevada durante todo el dfa. Los autores definen el termino 'endotoxemia metabolica' como un aumento cronico de 2 a 3 veces de la concentracion de lipopolisacaridos (LPS) en plasma desde los niveles basales, inducido por una dieta con alto contenido de grasa, y observan que los niveles de endotoxemia alcanzados fueron 10-50 veces menores que los obtenidos durante el shock septico.

La translocacion bacteriana se define como el paso de bacterias viables desde el tracto intestinal a traves de la mucosa epitelial en el cuerpo. Las bacterias pueden entrar en el sistema linfatico a traves de los ganglios linfaticos mesentericos y, por lo tanto, pueden circular de forma sistemica. Las bacterias tambien pueden entrar en la circulacion sangumea (bacteriemia) y tambien se pueden localizar en tejidos. La translocacion bacteriana puede ocurrir en una serie de afecciones medicas, incluyendo el crecimiento excesivo de bacterias intestinales, lesion intestinal y shock. Cualquier afeccion medica asociada con un aumento de la permeabilidad intestinal puede conducir potencialmente a la translocacion bacteriana.

Como los LPS se originan a partir de bacterias en el intestino, la translocacion de bacterias desde el intestino en el cuerpo puede servir potencialmente como un mecanismo potencial para la endotoxemia, incluyendo la endotoxemia metabolica. Si las bacterias Gram-negativas se desplazan en el cuerpo, sirven como una fuente de LPS. Sin embargo, en la actualidad no se conoce la ruta exacta de los LPS en el cuerpo en la endotoxemia metabolica: se considera que la translocacion bacteriana puede ser una posible explicacion, pero los LPS libres del intestino tambien puede entrar en el cuerpo durante la absorcion normal de lfpidos. Tambien es posible que varios mecanismos se produzcan al mismo tiempo.

Schiffrin et al., Br. J. Nutr., 2009, 101, 961-966, describen el uso de un suplemento de yogur probiotico en pacientes de edad avanzada con crecimiento excesivo de bacterias en el intestino delgado (SIBO). Se evaluaron los efectos con respecto al la colonizacion intestinal, permeabilidad intestinal, translocacion de endotoxinas y modificacion de las funciones inmunes innatas. Sin embargo, la endotoxemia en los pacientes que se describen en el presente documento es la endotoxemia por shock septico, que esta causada por la infeccion con agentes patogenos, tales como bacterias patogenicas, y porque, como se describe en Cani et al., en el artfculo que se ha mencionado anteriormente, los niveles de LPS en plasma aumentan en un factor mucho mayor que los niveles normales. Esto es distinto de la endotoxemia metabolica, que como se ha descrito anteriormente esta causada generalmente por la dieta (en particular, por una dieta con alto contenido de grasa) y porque el aumento de los niveles de LPS en plasma (expresado como un multiplo de los niveles normales) es mucho mas bajo.

Sumario de la Invencion

En un aspecto, la invencion proporciona el uso de una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxemia metabolica en un mairnfero.

En otro aspecto, la invencion proporciona una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxina metabolica, en la que la endotoxemia metabolica comprende un aumento del nivel de lipopolisacaridos en el cuerpo del mai^ero en un factor en el intervalo de 1,5 a 20 en comparacion con los niveles basales de lipopolisacarido.

En otro aspecto, la invencion proporciona una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxina metabolica, en la que la endotoxemia metabolica comprende un aumento del nivel de lipopolisacaridos en el cuerpo del mairnfero en un factor en el intervalo de 2 a 4 en comparacion con los niveles basales de lipopolisacarido.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxina metabolica, en la que la endotoxemia esta inducida por la dieta y/o asociada a la dieta.

Ademas en otro aspecto adicional, la invencion proporciona una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxina metabolica, en la que el animal continua ingiriendo una dieta con alto contenido de grasa durante el transcurso del tratamiento.

Ademas en otro aspecto, la invencion proporciona una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxina metabolica, en la que la bacteria se administra en combinacion con uno o mas prebioticos.

Ademas en otro aspecto, la invencion proporciona una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxina metabolica, en la que el prebiotico se selecciona entre alginato, xantano, pectina, goma de algarrobo, inulina, goma guar, un galacto-oligosacarido, un fructo-oligosacarido, polidextrosa, lactitol, lactosacarosa, un oligosacarido de soja, palatinosa, un isomalto-oligosacarido, un gluco-oligosacarido o un xilooligosacarido, o una mezcla de cualquiera de los mismos.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 ilustra el nivel de LPS en plasma (endotoxemia) en ratones a los que se les administra comida normal (NC), dieta con alto contenido de grasa (HFD), o dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion, en particular la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus (NCFM), la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B420) o una combinacion de las dos (NCFM B420); La Figura 2 ilustra el nivel de tejido medio de bacterias de la familia Enterobacteriaceae (niveles por encima del lfmite de deteccion) en ratones a los que se les administra comida normal, dieta con alto contenido de grasa, o dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (NCFM, B420 o NCFM B420);

La Figura 3 ilustra el nivel de tejido medio de bacterias del genero Enterococcus (niveles por encima del lfmite de deteccion) en ratones a los que se les administra comida normal, dieta con alto contenido de grasa, o dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (NCFM, B420 o NCFM B420);

La Figura 4 ilustra el nivel de tejido medio de bacterias del genero Lactobacillus (niveles por encima del lfmite de deteccion) en ratones a los que se les administra comida normal, dieta con alto contenido de grasa, o dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (NCFM, B420 o NCFM B420);

La Figura 5 ilustra el nivel de tejido medio de bacterias de la clase Bacteroidetes (niveles por encima del lfmite de deteccion) en ratones a los que se les administra comida normal, dieta con alto contenido de grasa, o dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (NCFM, B420 o NCFM B420);

La Figura 6 ilustra el nivel de tejido medio de Bacterium de Dominio Total (niveles por encima del lfmite de deteccion) en ratones a los que se les administra comida normal, dieta con alto contenido de grasa, o dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (NCFM, B420 o NCFM B420);

La Figura 7 ilustra los niveles de E. coli en la mucosa o diferentes segmentos de la abertura interna de ratones a los que se les administra una dieta con alto contenido de grasa y se tratan con vetnculo o una dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (B420);

La Figura 8 ilustra el efecto en la adhesion de Escherichia coli en la mucosa del ciego de ratones a los que se les administra una dieta con alto contenido de grasa y se tratan con vetnculo o una dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (B420), sola o en combinacion con un prebiotico;

La Figura 9 ilustra el efecto en la translocacion de Escherichia coli en los tejidos hospedadores de ratones a los que se les administra una dieta con alto contenido de grasa y se tratan con vetnculo o una dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (B420), sola o en combinacion con un prebiotico; y

La Figura 10 ilustra el efecto en los niveles de insulina en ayunas y secrecion de insulina en estado con alimento de ratones a los que se les administra una dieta con alto contenido de grasa y se tratan con vetnculo o una dieta con alto contenido de grasa suplementada con bacterias de acuerdo con la presente invencion (B420), sola o en combinacion con un prebiotico.

Descripcion detallada de la invencion

Bacterias Acido Lacticas y Bifidobacterias

La bacteria usada en realizaciones de la presente invencion se selecciona entre una bacteria acido lactica (LAB), una Bifidobacterium o una mezcla de cualquiera de las mismas. En la presente memoria descriptiva, la expresion 'bacteria del acido lactica' incluye cualquier bacteria capaz de producir, como el producto metabolico final principal de la fermentacion de carbohidratos, acido lactico o al menos uno de sus derivados (incluyendo, pero no limitado a, acido acetico o acido propionico) Por lo tanto, la expresion tiene como objeto incluir bacterias acido propionicas (PAB), que producen acido propionico como producto de fermentacion de carbohidratos.

La bacteria se puede usar en cualquier forma capaz de ejercer los efectos que se describen en el presente documento. Por ejemplo, las bacterias pueden ser bacterias viables, latentes, inactivas o muertas. Preferentemente, las bacterias son bacterias viables.

Las bacterias pueden comprender bacterias completas o pueden comprender componentes bacterianos. Los ejemplos de los componentes de este tipo incluyen componentes de la pared celular bacteriana tales como peptidoglicano, acidos nucleicos bacterianos tales como ADN y ARN, componentes de membrana bacteriana y componentes estructurales bacterianos tales como protemas, carbohidratos, lfpidos y combinaciones de los mismos tales como lipoprotemas, glicolfpidos y glicoprotemas.

Las bacterias tambien pueden comprender o como alternativa comprenden metabolitos bacterianos. En la presente memoria descriptiva, la expresion 'metabolitos bacterianos' incluye todas las moleculas producidas o modificadas por las bacterias (probioticas) como resultado del metabolismo bacteriano durante el crecimiento, supervivencia, persistencia, transito o existencia de bacterias durante la fabricacion y el almacenamiento de productos probioticos y durante el transito gastrointestinal en un mairnfero. Los ejemplos incluyen todos los acidos organicos, acidos inorganicos, bases, protemas y peptidos, enzimas y coenzimas, aminoacidos y acidos nucleicos, carbohidratos, lfpidos, glicoprotemas, lipoprotemas, glicolfpidos, vitaminas, todos los compuestos bioactivos, metabolitos que contienen un componente inorganico y todas las moleculas pequenas, por ejemplo moleculas nitrosas o moleculas que contienen un acido sulfuroso.

Preferentemente las bacterias comprenden bacterias completas, mas preferentemente bacterias viables completas. Preferentemente la bacteria acido lactica y/o Bifidobacterium que se va a usar en la presente invencion es a bacteria acido lactica y/o Bifidobacterium que generalmente se reconoce como segura y, que esta preferentemente aprobada por GRAS.

Una persona con experiencia estara rapidamente informada de las especies espedficas y/o cepas de bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a partir de los generos que se describen en el presente documento que se usa en las industrias alimentaria y/o agncola y que generan el que se consideran adecuadas para consumo humano y/o animal.

Preferentemente, la bacteria acido lactica y/o Bifidobacterium usaba de acuerdo con la presente invencion es una que es adecuada para consumo humano y/o animal.

En la presente invencion, las bacterias usadas pueden ser del mismo tipo (genero, especie y cepa) o pueden comprender una mezcla de generos, especies y/o cepas.

Las bacterias acido lacticas adecuadas se pueden seleccionar entre los generos Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Pediococcus, y Streptococcus y mezclas de los mismos. Por lo general, las bacterias acido lacticas se seleccionan entre las especies Leuconostoc spp., Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus jensenii, y combinaciones de cualquiera de las mismas.

Las Bifidobacteria se seleccionan entre las especies Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, y Bifidobacterium angulatum, y combinaciones de cualquiera de las mismas.

Preferentemente, las bacterias usadas en la presente invencion se seleccionan entre los generos Lactobacillus o Bifidobacterium y mezclas de los mismos. Mas preferentemente, las bacterias usadas en la presente invencion se seleccionan entre las especies Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, o Bifidobacterium bifidium, y mezclas de las mismas. Es especialmente preferente una combinacion de bacterias de la especie Lactobacillus acidophilus y bacterias de la especie Bifidobacterium animalis.

En una realizacion particularmente preferente, las bacterias usadas la presente invencion son de la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus. La cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus esta disponible en el mercado en Danisco A/S con el nombre comercial HOWARU™ Dophilus.

En una realizacion alternativa particularmente preferente, las bacterias usadas en la presente invencion son de la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B420). Esta cepa esta disponible en el mercado en Danisco A/S. En una realizacion alternativa particularmente preferente, las bacterias usadas en la presente invencion son de la cepa 33 de Lactobacillus salivarius 33 (Ls-33). Esta cepa esta disponible en el mercado en Danisco A/S.

En una realizacion, la bacteria usada en la presente invencion es una bacteria probiotica. En la presente memoria descriptiva, la expresion 'bacteria probiotica' se define como la cobertura de cualquier bacteria no patogena que, cuando se administra viva en cantidades adecuadas, confiere un beneficio para la salud en el hospedador. Estas cepas probioticas generalmente tienen la capacidad de sobrevivir el pase a traves de la parte superior del tracto digestivo. No son patogenicas ni toxicas y ejercen su efecto beneficioso sobre la salud, por un lado, a traves de las interacciones ecologicas con la flora residente en el tracto digestivo, y por otro lado, por su capacidad para influir en el sistema inmunologico de manera positiva a traves del "GALT" (tejido linfoide asociado al intestino). Dependiendo de la definicion de probioticos, estas bacterias, cuando se administran en un numero suficiente, tienen la capacidad de progresar vivas a traves del intestino, sin embargo, no atraviesan la barrera intestinal y, por lo tanto, sus efectos principales se inducen en la abertura interna y/o la pared del tracto gastrointestinal. A continuacion forman parte de la flora residente durante el periodo de administracion. Esta colonizacion (o colonizacion transitoria) permite que las bacterias probioticas ejerzan un efecto beneficioso, tal como la represion de microorganismos potencialmente patogenos presentes en la flora e interacciones con el sistema inmunologico del intestino.

En realizaciones preferentes, la bacteria usada en la presente invencion es una bacteria acido lactica probiotica y/o una bacteria Bifidobacterium probiotica.

En algunas realizaciones preferentes, la bacteria Bifidobacterium se usa en la presente invencion junto con una bacteria del genero Lactobacillus. Una combinacion de bacterias Bifidobacterium y Lactobacillus de acuerdo con la presente invencion presenta un efecto sinergico en ciertas aplicaciones (es decir, un efecto que es mayor que el efecto aditivo de las bacterias cuando se usa por separado). Por ejemplo, las combinaciones que, ademas de tener efecto de mairnfero como componentes individuales, pueden tener un efecto beneficioso en los otros componentes de la combinacion, por ejemplo produciendo metabolitos que a continuacion se usan a su vez como una fuente de energfa por otros componentes de la combinacion, o pueden mantener condiciones fisiologicas que favorecen a los otros componentes.

Por lo general, las bacterias Lactobacillus usadas en la combinacion se seleccionan entre las especies Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus jensenii, y combinaciones de cualquiera de las mismas.

En realizaciones preferentes, la bacteria Lactobacillus usada en la presente invencion es una Lactobacillus probiotica.

Preferentemente, la bacteria Lactobacillus usada en la presente invencion es de la especie Lactobacillus acidophilus. En una realizacion particularmente preferente, las bacterias usadas en la presente invencion comprenden una combinacion de la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B420) y la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus.

Dosificacion

La bacteria acido lactica y/o Bifidobacterium usada de acuerdo con la presente invencion (tal como una cepa de Lactobacillus spp.; por ejemplo una cepa de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius y/o Lactobacillus plantarum, tal como una cepa de Lactobacillus acidophilus o Lactobacillus salivarius, por ejemplo la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus o la cepa 33 de Lactobacillus salivarius) y/o una cepa de Bifidobacterium spp., tal como una cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, por ejemplo la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B420)), puede comprender de 106 a 1012 CFU de bacterias/g de soporte, y mas particularmente de 108 a 1012 CFU de bacterias/g de soporte, preferentemente de 109 a 1012 CFU/g para la forma liofilizada.

De forma adecuada la bacteria acido lactica y/o Bifidobacterium usada de acuerdo con la presente invencion (tal como una cepa de Lactobacillus spp.; por ejemplo una cepa de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius y/o Lactobacillus plantarum, tal como una cepa de Lactobacillus acidophilus o Lactobacillus salivarius, por ejemplo la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus o la cepa 33 de Lactobacillus salivarius) y/o una cepa de Bifidobacterium spp., tal como una cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, por ejemplo la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B420)), se puede administrar a una dosificacion de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis. Con el termino "por dosis" se hace referencia a que esta cantidad de microorganismo se proporciona un sujeto ya sea al dfa o por ingesta, preferentemente al dfa. Por ejemplo, si el microorganismo se va a administrar en un producto alimentario (por ejemplo en un yogur) - entonces el yogur contendra preferentemente de aproximadamente 108 a 1012 CFU del microorganismo. Como alternativa, sin embargo, esta cantidad de microorganismo se puede separar en multiples administraciones cada una de las cuales consistiendo en una cantidad mas pequena de carga microbiana - siempre y cuando la cantidad total de microorganismo recibido por el sujeto en cualquier momento espedfico (por ejemplo cada periodo de 24 horas) es de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo, preferentemente de 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo.

De acuerdo con la presente invencion una cantidad eficaz de al menos una cepa de un microorganismo puede ser de al menos 106 CFU de microorganismo/dosis, preferentemente de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dosis.

En una realizacion, preferentemente la bacteria acido lactica y/o Bifidobacterium usada de acuerdo con la presente invencion (tal como una cepa de Lactobacillus spp.; por ejemplo una cepa de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius y/o Lactobacillus plantarum y/o una cepa de Bifidobacterium spp., tal como una cepa de Lactobacillus acidophilus o Lactobacillus salivarius, por ejemplo la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus o la cepa 33 de Lactobacillus salivarius) tal como una cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, por ejemplo la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B420)) se puede administrar una dosificacion de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dfa, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dfa. Por lo tanto, la cantidad eficaz en esta realizacion puede ser de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismoMa, preferentemente de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 CFU de microorganismo/dfa.

CFU representa "unidades formadoras de colonias". Por 'soporte' se hace referencia al producto alimentario, suplemento dietetico buen soporte farmaceuticamente aceptable.

Sujetos / Indicaciones Medicas

Las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion se administran a un mairnfero, incluyendo por ejemplo ganado (incluyendo vacas, caballos, cerdos, pollos y ovejas), y seres humanos. En algunos aspectos de la presente invencion el mai^ero es un animal de compafua (incluyendo mascotas), tal como un perro o un gato por ejemplo. En algunos aspectos de la presente invencion, el sujeto puede ser de forma adecuada un ser humano.

Los inventores han encontrado sorprendentemente que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que pertenece la presente invencion son capaces de disminuir los niveles de lipopolisacaridos (LPS) en plasma sangumeo. Este hallazgo confiere a las bacterias el potencial de utilidad en el tratamiento de endotoxemia, en particular endotoxemia metabolica.

El LPS es un componente principal de la pared celular de las bacterias gram-negativas, que se produce en el intestino como un componente de la microbiota gram-negativa pero tambien como LPS libre. La reduccion de la endotoxemia metabolica puede resultar de la reduccion de la translocacion de las bacterias gram-negativas en el hospedador, reduccion de la absorcion del LPS libre por el hospedador, o aumento de la eliminacion de LPS por el hospedador.

En la presente memoria descriptiva, el termino 'endotoxemia' cuando se usa solo se refiere a la presencia de un nivel elevado de lipopolisacaridos (tambien conocidos como endotoxinas) en el cuerpo (en particular, aunque no exclusivamente, en plasma sangumeo) cuando se compara con los niveles basales de lipopolisacarido. El termino 'endotoxemia' cuando se usa solo pretende incluir tanto endotoxemia metabolica, definira con mas detalle a continuacion, y endotoxemia de otras etiologfas, tales como endotoxemia causada por infecciones patogenicas (especialmente infecciones bacterianas) o endotoxemia causada por crecimiento excesivo de bacterias del intestino delgado (SIBO).

En algunas realizaciones, las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion se usan para tratar endotoxemia metabolica. En un aspecto, la expresion 'endotoxemia metabolica' se refiere a endotoxemia (como se ha definido anteriormente) inducida por una dieta con alto contenido de grasa. La expresion 'dieta con alto contenido de grasa' se define con mas detalle a continuacion.

En un aspecto, la expresion 'endotoxemia metabolica' se refiere a un aumento del nivel de lipopolisacaridos en el cuerpo del mairnfero (en particular, aunque no exclusivamente, en plasma sangumeo) en un factor que vana de 1,5 a 20, preferentemente de 2 a 10, tal como de 2 a 4, preferentemente de 2 a 3,5, en comparacion con los niveles basales (normal) de lipopolisacarido de mai^ero. El aumento de los niveles de lipopolisacarido generalmente se mide con el ensayo de amebocitos de Limulus, un ensayo bien conocido por las personas con experiencia en la materia.

Por el contrario, en el caso de endotoxemia causada por infecciones patogenicas, tales como infecciones bacterianas (endotoxemia por shock septico), los niveles de LPS en el cuerpo del mai^ero, especialmente el cuerpo humano (en particular, aunque no exclusivamente, en la sangre) generalmente aumentan en un factor mayor que 20, tal como mayor que 30, preferentemente mayor que 50, tal como mayor que 70, tal como mayor que 100, tal como mayor que 150, tal como mayor que 200 veces en comparacion con los niveles basales (normal) de lipopolisacarido de mai^ero.

Los niveles basales de lipopolisacaridos en seres humanos generalmente estan en el intervalo de 1-2 Unidades de Endotoxina (EU) por ml, tal como se mide con el ensayo de amebocitos de Limulus, un ejemplo del cual es el ensayo de extracto de amebocitos de Limulus con el ensayo Cinetico-QCL (Bio Whittaker, Cambrex BioScience).

Por lo tanto en un aspecto alternativo, la expresion 'endotoxemia metabolica' se refiere a un nivel de lipopolisacaridos en el cuerpo (en particular, aunque no exclusivamente, en plasma sangumeo) que vana de 1,5 a 40, preferentemente de 2 a 20, tal como de 2 a 8, preferentemente de 2 a 7, Unidades de Endotoxina (EU)/ml, tal como se mide con el ensayo de extracto de amebocitos de Limulus.

Por el contrario, en el caso de endotoxemia causada por infecciones patogenicas, tales como infecciones bacterianas (endotoxemia por shock septico), los niveles de LPS en el cuerpo del mai^ero, especialmente el cuerpo humano (en particular, aunque no exclusivamente, en la sangre) generalmente son mayores que 40, tal como mayores que 60, preferentemente mayores que 100, tal como mayores que 140, tal como mayores que 200, tal como mayores que 300, tal como mayores que 400 EU/ml, tal como se mide con el ensayo de extracto de amebocitos de Limulus. Los presentes inventores tambien han encontrado de forma sorprendente que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente divulgacion pueden reducir en nivel de bacterias en tejidos metabolicamente muy importantes, el tejido adiposo mesenterico, tejido adiposo subcutaneo, ganglio linfatico mesenterico y ganglio linfatico subcutaneo, y el hHgado y bazo. Esto confiere el potencial para que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente divulgacion se puedan usar para prevenir o tratar la translocacion bacteriana en tejidos y evitar o tratar la endotoxemia metabolica.

En realizaciones particularmente preferentes, las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente divulgacion se pueden usar para reducir los niveles de bacterias de la familia Enterobacteriaceae en el tejido adiposo mesenterico y la clase Bacteriodetes en el tejido hepatico. Estos dos grupos bacterianos principales contienen LPS como un componente de la pared celular bacteriana y por lo tanto actuan como fuente potencial de LPS en plasma elevado, que esta asociado con la endotoxemia metabolica. Estos tejidos desempenan un papel particularmente importante en la endotoxemia metabolica y otras enfermedades metabolicas, dado que el LPS causo inflamacion en estos tejidos, lo que conduce de forma potencial a una cascada de sucesos adversos que incluyen alteracion del metabolismo de la glucosa y reduccion de la sensibilidad a la insulina.

Los presentes inventores tambien han encontrado de forma sorprendente que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion son capaces de regular la absorcion de lfpidos. Sin desear quedar limitado a la teona, se cree que, como los LPS se transportan principalmente en los lfpidos, la regulacion de la absorcion de lfpidos reduce la cantidad de bacterias y, por lo tanto, la cantidad de LPS que pasan la barrera intestinal. Esto confiere la posibilidad de que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion se usen para prevenir el paso de los LPS en tejidos y, por lo tanto, para prevenir o tratar la endotoxemia metabolica.

Ademas, los presentes inventores han encontrado de forma sorprendente que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion son capaces de reducir la adhesion bacteriana gramnegativa elevada en el tracto gastrointestinal. Sin desear quedar limitado a la teona, se cree que la reduccion de la adhesion bacteriana gram-negativa elevada reduce la cantidad de bacterias y, por lo tanto, la cantidad de LPS que pasan la barrera intestinal. Esto confiere la posibilidad de que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria se usen para prevenir el paso de los LPS en tejidos y, por lo tanto, para prevenir o tratar la endotoxemia metabolica.

Las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion son adecuadas para su administracion a mai^eras tanto diabeticos como obesos. Tambien podnan ser adecuadas para mai^eras diabeticos y no obesos, asf como para mairnferos obesos que poseen los factores de riesgo para diabetes, pero que aun no estan en un estado diabetico. Este aspecto se discute con mas detalle a continuacion.

En realizaciones preferentes, la condicion que se esta tratando o previniendo esta inducida por la dieta y/o asociada a la dieta. Los presentes inventores han encontrado de forma sorprendente que las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria se pueden usar de acuerdo con la presente divulgacion para tratar una serie de afecciones inducidas por la dieta y/o asociadas a la dieta, como se describe con mas detalle en el presente documento.

En particular, el uso de bacterias acido lacticas y/o Bifidobacterias de acuerdo con la presente invencion es adecuado para el tratamiento de mai^eras que ingieren una dieta con alto contenido de grasa. Este aspecto se discute con mas detalle a continuacion.

Las composiciones son adecuadas para su uso en pacientes obesos y diabeticos. En la presente memoria descriptiva, el termino 'diabetes' incluye todas las formas de diabetes que, como se ha indicado anteriormente, se caracteriza por un metabolismo desordenado y un nivel anomalamente alto de azucar en sangre (hiperglucemia) como resultado de niveles insuficientes de la hormona insulina. Por lo tanto, el termino incluye diabetes de Tipo 1, diabetes de Tipo 2, diabetes gestacional y alteracion de la tolerancia a la glucosa. La diabetes de Tipo 1 se caracteriza por la perdida de las celulas beta productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el pancreas, lo que conduce a una deficiencia de insulina. La diabetes mellitus de Tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina o reduccion de la sensibilidad a la insulina, combinada con una reduccion de la secrecion reducida de insulina. La diabetes gestacional se define formalmente como "cualquier grado de intolerancia a la glucosa con inicio o primer reconocimiento durante el embarazo". La Alteracion de la Tolerancia a la Glucosa (IGT) es un estado prediabetico de disglucemia que esta asociado a la resistencia a la insulina y un aumento del riesgo de patologfa cardiovascular. De acuerdo con los criterios de la Organizacion Mundial de la Salud y la Asociacion Americana de Diabetes, la alteracion de la tolerancia a la glucosa se define como niveles de glucosa a las dos horas de 140 a 199 mg por dl (de 7,8 a 11,0 mmol) en el ensayo de tolerancia a la glucosa oral de 75 g. Se dice que un paciente esta con la afeccion de IGT cuando tiene un nivel de glucosa elevado de manera intermedia despues de 2 horas, pero menos de lo que podna calificar para la diabetes mellitus de tipo 2. La glucosa en ayunas puede ser normal o ligeramente elevada. La IGT puede preceder a la diabetes mellitus de tipo 2 durante muchos anos. La IGT tambien es un factor de riesgo para la mortalidad.

En la presente memoria descriptiva, el termino obesidad esta relacionado con el mdice de masa corporal (IMC). El mdice de masa corporal (IMC) (calculado como peso en kilogramos dividido entre el cuadrado de la altura en metros) es la medida mas comunmente aceptada para sobrepeso y/u obesidad. Un IMC que supera 25 se considera sobrepeso. La obesidad se define como un IMC de 30 o mas, con un IMC de 35 o mas siendo considerado como obesidad de comorbilidad grave y un IMC de 40 o mas obesidad morbida.

Como se ha indicado anteriormente, el termino "obesidad" como se usa en el presente documento incluye obesidad, obesidad de comorbilidad y obesidad morbida. Por lo tanto, el termino "obeso" tal como se usa en el presente documento se puede definir como un sujeto que tiene un IMC mayor que o igual a 30. En algunas situaciones, de forma adecuada un sujeto obeso puede tener un IMC mayor que o igual a 30, de forma adecuada 35, de forma adecuada 40.

Aunque la composicion de la invencion es particularmente adecuada para uso en pacientes que son tanto diabeticos como obesos, la composicion tambien es adecuada para aquellos que son diabeticos pero no obesos. Tambien puede ser adecuada para pacientes obesos que posean los factores de riesgo de diabetes, pero que aun no estan en un estado diabetico, ya que se podna esperar que una persona obesa (pero no diabetica) pudiera limitar las consecuencias metabolicas de su obesidad, es decir, la diabetes o al menos un desarrollo de resistencia a la insulina.

En la presente memoria descriptiva el termino "tratamiento" o "que trata" se refiere a cualquier administracion de las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria de acuerdo con la presente invencion e incluye: (1) prevenir que la enfermedad especificada se produzca en un animal que pueda estar predispuesto a la enfermedad, pero que aun no experimenta ni presenta la patologfa o sintomatologfa de la enfermedad (incluyendo la prevencion de uno o mas factores de riesgo asociados con la enfermedad); (2) inhibir la enfermedad en un animal que esta experimentando o presentando la patologfa o sintomatologfa del sujeto enfermo (es decir, detener un desarrollo adicional de la patologfa y/o sintomatologfa), o (3) mejorar la enfermedad en un animal que esta experimentando o presentando la patologfa o sintomatologfa del sujeto enfermo (es decir, invertir la patologfa y/o sintomatologfa).

Dieta

Como se ha indicado anteriormente, los mai^eras diabeticos y/o obesos tratados con bacterias de acuerdo con la presente invencion pueden continuar ingiriendo una dieta con alto contenido de grasa a la vez que se mitigan las consecuencias metabolicas de su afeccion o afecciones. En la presente memoria descriptiva, la expresion 'dieta con alto contenido de grasa' se refiere a una dieta que generalmente contiene al menos un 20 %, preferentemente al menos un 25 %, tal como al menos un 30 %, por ejemplo al menos un 35 %, tal como al menos un 40 %, por ejemplo al menos un 45 %, tal como al menos un 50 %, por ejemplo al menos un 55 %, tal como al menos un 60 %, por ejemplo al menos un 65 %, tal como al menos un 70 %, por ejemplo al menos un 75 %, tal como al menos un 80 %, por ejemplo al menos un 85 %, tal como al menos un 90 % de calonas a partir de la grasa.

En algunas realizaciones, los mairnferos diabeticos y/o obesos tratados con bacterias de acuerdo con la presente invencion pueden ingerir una dieta con alto contenido de carbohidratos a la vez que se mitigan las consecuencias metabolicas de su afeccion o afecciones. En la presente memoria descriptiva, la expresion 'directa con alto contenido de carbohidratos' se refiere una dieta que generalmente contiene al menos un 50 %, por ejemplo al menos un 55 %, tal como al menos un 60 %, por ejemplo al menos un 65 %, tal como al menos un 70 %, por ejemplo al menos un 75 %, tal como al menos un 80 %, por ejemplo al menos un 85 %, tal como al menos un 90 % de calonas a partir del carbohidrato.

Composiciones

Aunque es posible administrar bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria solas de acuerdo con la presente invencion, las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria se administran general y preferentemente sobre o en un soporte como parte de un producto, en particular como un componente de un producto alimentario, un suplemento dietetico o una formulacion farmaceutica. Estos productos generalmente contienen componentes adicionales bien conocidos por las personas con experiencia en la materia.

En la presente invencion se puede usar cualquier producto que pueda beneficiarse de la composicion. Estos incluyen, pero no se limitan a, alimentos, en particular conservas de fruta y productos lacteos y productos obtenidos a partir de alimento lacteo, y productos farmaceuticos. En el presente documento las bacterias acido lactica se pueden denominar "la composicion de la presente invencion" o "la composicion".

Alimento

En una realizacion, las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria se usan de acuerdo con la invencion en un producto alimentario tal como un suplemento alimentario, una bebida o un polvo a base de leche. En el presente documento, el termino "alimento" se usa en un sentido amplio - y cubre alimento para seres humanos asf como alimento para animales (es decir, una alimentacion). En un aspecto preferente, el alimento es para consumo humano. El alimento se puede presentar en forma de una solucion o en forma de un solido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.

Cuando se usa como, o en la preparacion de, un alimento, tal como un alimento funcional, la composicion de la presente invencion se puede usar en conjunto con uno o mas de: un vehnculo nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un adyuvante nutricionalmente aceptable, un agente nutricionalmente activo.

A modo de ejemplo, la composicion de la presente invencion se puede usar como un ingrediente para refrescos, un zumo de fruta o una bebida que comprende protema de suero de leche, tes saludables, bebidas de cacao, bebidas lacteas y debidas con bacterias acido lacticas, yogur y yogur para beber, quesos, helado, helados de hielo y postres, confitena, bizcochos, tartas y mezclas para pasteles, alimentos de aperitivo, comidas y bebidas equilibradas, rellenos de frutas, glaseados, rellenos de panadena de chocolate, rellenos con sabor a carta de queso, rellenos de tartas con sabor a frutas, glaseado para tarta y donut, cremas de relleno de panadena instantanea, rellenos para galletas, relleno de panadena listo para usar, relleno de calonas reducidas, bebida nutricional para adultos, bebida de soja/zumo acidificada, bebida de chocolate aseptica/mezclada, mezclas de barra, bebidas en polvo, leche de soja/pura y de chocolate enriquecida con calcio, bebida de cafe enriquecida con calcio.

La composicion se puede usar adicionalmente como un ingrediente en productos alimentarios tales como salsa de queso americana, agente antiaglomerante para queso rallado y troceado, salsa de patatas fritas, crema de queso, crema agria sin grasa con aderezo dulce batida mezclada en seco, crema dulce lactea para congelar/descongelar, aderezo batido estable a la congelacion/descongelacion, queso cheddar natural con bajo contenido de grasa y ligero, yogur de estilo suizo con bajo contenido de grasa, postres congelados aireados, helado de envase duro, de etiqueta ecologica, economfa mejorada y satisfaccion del helado de envase duro, helado con bajo contenido de grasa: helado de crema, salsa barbacoa, salsa de queso para mojar, aderezo de queso cottage, salsa Alfredo en mezcla seca, salsa de queso mezcla, salsa de tomate de mezcla seca y otros.

La expresion "producto lacteo" tal como se usa en el presente documento se refiere a la inclusion de un medio que comprende leche de origen animal y/o vegetal. Como leche de origen animal se puede mencionar la leche de vaca, oveja, cabra o bufalo. Como leche de origen vegetal se puede mencionar cualquier sustancia fermentable de origen vegetal que se pueda usar de acuerdo con la invencion, en particular que tenga su origen en sojas, arroz o cereales. Aun mas preferentemente el producto alimentario usado de acuerdo con la invencion es una leche fermentada o leche humanizada.

Para ciertos aspectos, la presente invencion se puede usar preferentemente en conexion con la produccion de yogur, tal como de vida de yogur fermentado, yogur, yogur para beber, queso, crema fermentada, postres a base de leche y otros.

De forma adecuada, la composicion se puede usar adicionalmente como un ingrediente en una o mas aplicaciones de queso, aplicaciones de carne, o aplicaciones que comprenden cultivos protectores.

La presente invencion tambien proporciona un metodo para preparar un alimento o un ingrediente alimentario, metodo que comprende la mezcla de la composicion de acuerdo con la presente invencion con otro ingrediente alimentario.

De forma ventajosa, la presente invencion se refiere a productos que se han puesto en contacto con la composicion de la presente invencion (y opcionalmente con otros componentes/ingredientes), en los que la composicion se usa en una cantidad que pueda mejorar los beneficios nutricionales y/o de salud del producto.

Como se usa en el presente documento la expresion "poner en contacto" se refiere a la aplicacion indirecta o directa de la composicion de la presente invencion al producto. Los ejemplos de los metodos de aplicacion que se pueden usar, incluyen, pero no se limitan a, tratar el producto en un material que comprende la composicion, aplicacion directa mediante mezcla de la composicion con el producto, pulverizacion de la composicion sobre la superficie del producto o inmersion del producto en una preparacion de la composicion.

Cuando el producto de la invencion es un alimento comestible, la composicion de la presente invencion se mezcla preferentemente con el producto. Como alternativa, la composicion se puede incluir en la emulsion o ingredientes sin procesar de un alimento comestible. En una alternativa adicional, la composicion se puede aplicar como a condimento, glaseado, mezcla colorante, y similares. Para algunas aplicaciones, es importante que la composicion se haga disponible sobre o con respecto a la superficie de un producto al que va a afectar/tratar. Esto permite que la composicion transmita una o mas de las siguientes caractensticas favorables: beneficios de nutricion y/o salud. Las composiciones de la presente divulgacion se pueden aplicar para entremezclar, revestir y/o impregnar un producto con una cantidad controlada de un microorganismo viable.

Preferentemente, la composicion se usa para fermentar leche o leche enriquecida con sacarosa o medios lacticos con sacarosa y/o maltosa en la que los medios resultantes que contienen todos los componentes de la composicion - es decir, dicho microorganismo de acuerdo con la presente divulgacion - se pueden anadir como un ingrediente a la leche para yogur en concentraciones adecuadas - tal como por ejemplo en concentraciones en el producto final que ofrecen una dosis diaria de 106-1010 cfu. El microorganismo de acuerdo con la presente divulgacion se puede usar antes o despues de la fermentacion del yogur.

Para algunos aspectos, los microorganismos de acuerdo con la presente divulgacion se usan como, o en la preparacion de, alimentos para animales, tal como alimentos para ganado, en particular alimentos para aves (tales como pollo), o alimentos para mascotas.

De forma ventajosa, cuando el producto es un producto alimentario, las bacterias acido lacticas debenan permanecer eficaces durante el periodo de la fecha normal de "caducidad de venta" o "caducidad" durante la cual el minorista ofrece el producto alimentario para su venta. Preferentemente, el tiempo eficaz se debena extender despues de tales fechas hasta el final del periodo de frescura normal cuando el deterioro del alimento empieza a ser evidente. Los periodos de duracion deseados y el periodo de almacenamiento normal variaran de alimento comestible a alimento comestible las personas con una experiencia habitual en la materia reconoceran que los periodos de almacenamiento variaran dependiendo del tipo de alimento comestible, el tamano del alimento comestible, temperaturas de almacenamiento, condiciones de procesamiento, material de envasado y equipo de envasado.

Ingrediente Alimentario

La composicion de la presente invencion se puede usar como un ingrediente alimentario y/o ingrediente de alimentacion.

Como se usa en el presente documento, la expresion "ingrediente alimentario" o "ingrediente de alimentacion" incluye una formulacion que es o que se puede anadir a alimentos funcionales o alimentos comestibles como un suplemento nutricional. El ingrediente alimentario puede estar en forma de una solucion o en forma de un solido -dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.

Suplementos Alimentarios

La composicion de la presente invencion puede ser - o se puede anadir a - suplementos alimentarios (en el presente documento tambien denominados suplementos dieteticos).

Alimentos Funcionales

La composicion de la presente invencion puede ser - o se puede anadir a - alimentos funcionales.

Como se usa el presente documento, la expresion "alimento funcional" se refiere a un alimento que puede proporcionar no solamente un efecto nutricional, sino que tambien puede proporcionar al consumidor un efecto beneficioso adicional.

Por consiguiente, los alimentos funcionales son alimentos habituales que tienen componentes o ingredientes (tales como los que se describen en el presente documento) incorporados en los mismos que transmiten al alimento una funcionalidad espedfica - por ejemplo beneficio medico o ffsico - ademas de un efecto simplemente nutricional. Aunque no hay una definicion legal de un alimento funcional, la mayona de las partes con interes en este area estan de acuerdo en que se trata de alimentos comercializados con efectos de salud espedficos mas alla de los efectos nutricionales basicos.

Algunos alimentos funcionales son agentes nutraceuticos. En el presente documento, la expresion "agente nutraceutico" se refiere a un alimento que puede proporcionarnos solamente un efecto nutricional y/o una satisfaccion de sabor, sino que tambien puede proporcionar al consumidor un efecto terapeutico (u otro efecto beneficioso). Los agentes nutraceuticos cruzan las lmeas de division tradicionales entre alimentos y medicina.

Medicamento

El termino "medicamento" como se usa en el presente documento incluye medicamentos para uso tanto humano como animal en medicina humana y veterinaria. Ademas, el termino "medicamento" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sustancia que proporciona un efecto terapeutico y/o beneficios. El termino "medicamento" como se usa en el presente documento no esta limitado necesariamente a sustancias que necesitan una Aprobacion de Marketing, pero pueden incluir sustancias que se pueden usar en cosmeticos, agentes nutraceuticos, alimento (incluyendo alimentos y bebidas por ejemplo), cultivos probioticos, y remedios naturales. Ademas, el termino "medicamento" como se usa en el presente documento incluye un producto disenado para su incorporacion en alimentacion animal, por ejemplo alimentacion de ganado y/o alimento de mascotas.

Agente farmaceutico

La composicion de la presente invencion se puede usar como - o en la preparacion de - un agente farmaceutico. En el presente documento, la expresion "agente farmaceutico" se usa en un sentido amplio - y cubre agentes farmaceuticos para seres humanos asf como agentes farmaceuticos para animales (es decir, aplicaciones veterinarias). En un aspecto preferente, el agente farmaceutico es para uso humano y/o para cna de animales. El agente farmaceutico puede ser para fines terapeuticos - que pueden ser de naturaleza curativa o paliativa o preventiva. El agente farmaceutico puede ser incluso para fines de diagnostico.

Un soporte farmaceuticamente aceptable puede ser por ejemplo un soporte en forma de comprimidos formados mediante compresion, comprimidos, capsulas, pomadas, supositorios o soluciones que se pueden beber. A continuacion se proporcionan otras formas adecuadas.

Cuando se usa como - o en la preparacion de - un agente farmaceutico, la composicion de la presente invencion se puede usar en conjunto con uno o mas de: un vedculo farmaceuticamente aceptable, un diluyente farmaceuticamente aceptable, un excipiente farmaceuticamente aceptable, un adyuvante farmaceuticamente aceptable, un ingrediente farmaceuticamente activo.

El agente farmaceutico puede estar en forma de una solucion o en forma de un solido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.

Las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion se pueden usar como ingredientes farmaceuticos. En el presente documento, la composicion puede ser el unico componente activo o puede ser al menos uno de un numero (es decir, 2 o mas) de componentes activos.

El ingrediente farmaceutico puede estar en forma de una solucion o en forma de un solido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.

Las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion se pueden usar en cualquier forma adecuada - ya sea cuando estan solos o cuando estan presentes en una combinacion con otros componentes o ingredientes. En el presente documento las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion se pueden denominar "la composicion". De forma analoga, las combinaciones que comprenden la composicion de la presente invencion y otros componentes y/o ingredientes (es decir, ingredientes - tales como ingredientes alimentarios, ingredientes alimentarios funcionales o ingredientes farmaceuticos) se pueden usar en cualquier forma adecuada.

Las bacterias acido lacticas y/o Bifidobacteria a las que se refiere la presente invencion se pueden usar en forma de preparaciones solidas o lfquidas o alternativas de las mismas. Los ejemplos de preparaciones solidas incluyen, pero no se limitan a, comprimidos, capsulas, polvos, granulos y polvos que se pueden humectar, secar por pulverizacion o liofilizar. Los ejemplos de preparaciones lfquidas incluyen, pero no se limitan a, soluciones acuosas, organicas o acuosas-organicas, suspensiones y emulsiones.

Los ejemplos adecuados de formas incluyen uno o mas de: comprimidos, pfldoras, capsulas, ovulos, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para aplicaciones de liberacion, retardada, modificada, sostenida, pulsada o controlada.

A modo de ejemplo, si la composicion de la presente invencion se usa en una forma de comprimido - tal como para uso como un ingrediente funcional - los comprimidos tambien pueden contener uno o mas de: excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato sodico, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibasico y glicina; agentes disgregantes tales como almidon (preferentemente almidon de mafz, patata o tapioca), glicolato sodico de almidon, croscarmelosa sodica y ciertos silicatos complejos; aglutinantes de granulacion tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arabiga; pueden estar incluidos agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, acido estearico, behenato de glicerilo y talco.

Los ejemplos de veldculos nutricionalmente aceptables para uso en la preparacion de las formas incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, gelatina de petroleo, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azucares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, acido silfcico, parafina viscosa, aceite de perfume, monogliceridos y digliceridos de acido graso, esteres de acido graso petroetral, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, y similares.

Los excipientes preferentes para las formas incluyen lactosa, almidon, una celulosa, azucar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular.

Para suspensiones acuosas y/o elixires, la composicion de la presente invencion se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, materia colorante o colorantes, con agentes emulsionantes y/o de suspension y con diluyentes tales como agua, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

Las formas tambien pueden incluir capsulas de gelatina; capsulas de fibra, comprimidos de fibra, etc.; o incluso bebidas de fibra.

Los ejemplos adicionales de forma incluyen cremas. Para algunos aspectos, el microorganismo usado en la presente invencion se puede usar en cremas farmaceuticas y/o cosmeticas tales como cremas solares y/o cremas para despues del sol por ejemplo.

En un aspecto, la composicion de acuerdo con la presente invencion se puede administrar en un aerosol, por ejemplo por medio de una pulverizacion nasal, por ejemplo para su administracion al tracto respiratorio.

Prebioticos

La composicion de la presente invencion puede contener adicionalmente uno o mas prebioticos. Los prebioticos son una categona de alimento funcional, definidos como ingredientes alimentarios no digeribles que influyen de forma beneficiosa en el hospedador al estimular de forma selectiva de crecimiento y/o actividad de una o de un numero limitado de bacterias (en particular, aunque no exclusivamente, probioticos, Bifidobacteria y/o bacterias acido lacticas) en el colon, y de ese modo mejoran la salud del hospedador. Por lo general, los prebioticos son carbohidratos (tales como oligosacaridos), pero la definicion no excluye a los que no son carbohidratos. Las formas mas prevalentes de prebioticos se clasifican nutricionalmente como fibra soluble. En cierta medida, muchas formas de fibra dietetica presentan un cierto nivel de efecto prebiotico.

En una realizacion, un prebiotico es un ingrediente fermentado de forma selectiva que permite cambios espedficos, tanto en la composicion y/o actividad en la microflora gastrointestinal que confiere beneficios de bienestar y salud en el hospedador.

De forma adecuada, el prebiotico se puede usar de acuerdo con la presente invencion en una cantidad de 0,01 a 100 g / dfa, preferentemente de 0,1 a 50 g / dfa, mas preferentemente de 0,5 a 20 g / dfa. En una realizacion, el prebiotico se puede usar de acuerdo con la presente invencion en una cantidad de 1 a 100 g / dfa, preferentemente de 2 a 9 g / dfa, mas preferentemente de 3 a 8 g / dfa. En otra realizacion, el prebiotico se puede usar de acuerdo con la presente invencion en una cantidad de 5 a 50 g / dfa, preferentemente de 10 a 25 g / dfa.

Los ejemplos de fuentes dieteticas de prebioticos incluyen sojas, fuentes de inulina (tales como alcachofa de Jerusalen, jfcama, y ra^ z de achicoria), avena sin procesar, trigo sin refinar, cebada y yacon sin refinar.

Los ejemplos de prebioticos adecuados incluyen alginato, xantano, pectina, goma de algarrobo (LBG), inulina, goma guar, galacto-oligosacarido (GOS), fructo-oligosacarido (FOS), polidextrosa (es decir, Litesse®), lactitol, lactosacarosa, oligosacaridos de soja, isomaltulosas (Palatinose™), isomalto-oligosacaridos, gluco-oligosacaridos, xilo-oligosacaridos, mano-oligosacaridos, beta-glucanos, celobiosa, rafinosa, gentiobiosa, melibiosa, xilobiosa, ciclodextrinas, isomaltosa, trehalosa, estaquiosa, panosa, pululano, verbascosa, galactomananos, y todas las formas de almidones resistentes. Un ejemplo particularmente preferente de un prebiotico es la polidextrosa.

Ademas en un aspecto adicional, la invencion proporciona el uso de una combinacion de:

(a) una bacteria acido lactica, una Bifidobacterium o una mezcla de cualquiera de las mismas; y

(b) un prebiotico;

en la fabricacion de un producto alimentario, suplemento dietetico o medicamento para reducir los niveles de insulina en ayunas en un mairnfero.

(b) un prebiotico;

en la fabricacion de un producto alimentario, suplemento dietetico o medicamento para aumentar la secrecion de insulina en estado con alimento en un mai^ero.

Dentro del alcance de la presente invencion se preve que las realizaciones de la invencion se pueden combinar de modo que las combinaciones de cualquiera de las caractensticas que se describen en el presente documento estan incluidas dentro del alcance de la presente invencion. En particular, dentro del alcance de la presente invencion se preve que cualquiera de los efectos terapeuticos de las bacterias se puede presentar de forma simultanea.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y Metodos

Modelo animal y tratamiento probiotico

Una poblacion base de cincuenta ratones C57BI/6 macho de 10 semanas de edad se alimentaron con una Comida Normal (NC) (A03, SAFE, Augy, Francia), o una dieta con alto contenido de grasa (HFD) (que comprendfa un 72 % de grasa (aceite de mafz y grasa), un 28 % de protema y < 1 % de carbohidratos) (SAFE, Augy, Francia) durante 4 semanas. Esta dieta tiene la ventaja peculiar de que induce diabetes antes del inicio de la obesidad (vease por ejemplo Cani et al., 2008 "Role of gut microflora in the development of obesity and insulin resistance following highfat diet feeding". Pathol Biol (Paris); Cani et al., Diabetes, 2008, 57, 1470-81; Knauf et al., Endocrinology 2008, 149, 4768-77; Cani et al., Diabetologia 2007, 50, 2374-83; Cani et al., Diabetes 2007, 56, 1761-1772 y Turini et al., Swiss Med Wkly 2007, 137, 700-4).

Despues de la alimentacion con la dieta con alto contenido de grasa (antes de la alimentacion con probiotico), los ratones se sometieron a un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal. El area bajo la curva se calculo y los ratones se enviaron de forma homogenea de acuerdo con los diferentes grupos experimentales o diez ratones por grupo (10 ratones por grupo). Los datos mostraron que todos los ratones estaban en un estado diabetico antes de la alimentacion con probiotico. Los ratones fueron alimentados durante cuatro semanas mas con una comida normal (n = 10) o una HFD (n = 40). Los ratones con la dieta HFD se trataron diariamente durante 4 semanas con uno de los siguientes:

1. Tratado con vehfculo

2. La cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B420) (109/bacterias por raton)

3. Lactobacillus acidophilus NCFM (NCFM) (109/bacterias por raton),

4. NCFM B420 (5x108 B420 5x108 NCFM por raton).

Los ratones se alojaron en un entorno controlado (ciclo de luz del dfa de 12 h invertido, luz apagada a las 10:00 a.m.).

Endotoxemia y plasma CD14

Las muestras de sangre se recogieron de los ratones al final de los tratamientos con probiotico o de control. El ensayo de endotoxina basado en un extracto de amebocitos de Limulus con ensayo Cinetico-QCL (Bio Whittaker, Cambrex BioScience) se uso para la cuantificacion de LPS en plasma (endotoxemia) - se trata de un ensayo cuantitativo, cinetico para la deteccion de endotoxina bacteriana Gram-negativa. Los sueros se diluyen de 1/20 a 1/100 y se calientan durante rondas de 10 min a 70 °C. El lfmite inferior de deteccion de LPS fue de 0,001 Unidades de Endotoxina/ml. El plasma sCD14, el receptor de LPS, se midio usando un metodo inmunoenzimatico (IBL, GmbH, Hamburgo, Alemania).

Cuantificacion de ADN microbiano en tejidos de raton

Despues del sacrificio, los siguientes tejidos de raton se recogieron de forma aseptica: tejido adiposo mesenterico, tejido adiposo subcutaneo, e tngado. Los tejidos se congelaron de forma instantanea y se mantuvieron congelados hasta su analisis. Antes de la extraccion del ADN, los tejidos se homogeneizaron usando un aparato de lisis de muestras biologicas automatico Precellys 24 (Bertin Technologies, Tarnos, Francia). Las muestras se pesaron y se diluyeron con 1,4 ml de Tampon ASL (Qiagen, Hilden, Alemania) en tubos CK14 que conteman perlas de ceramica (Bertin). Las muestras se molieron con perlas durante 3 x 30 segundos a 6.800 rpm y se mantuvieron en hielo entre las realizaciones. El sobrenadante se recogio y se transfirio a tubos VK01 que conteman polvo de vidrio (Bertin) y el proceso de molienda se repitio. El sobrenadante se recogio de nuevo se transfirio a tubos Eppendorf de 2 ml. El ADN bacteriano se aislo se purifico usando el Kit QIAmp DNA Stool Mini (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El ADN bacteriano se midio mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando cebadores espedficos de grupo o genero. Los grupos bacterianos diana (y los cebadores y condiciones usados) fueron: Bacteria de dominio total (sin publicar), familia Enterobacteriaceae (Matsuda et al., App. Env. Microbiol., 2007, 73, 32-39), genero Bifidobacterium (Makivuokko et al., Nutrition and Cancer 2005, 52 (1), 93-103), genero Lactobacillus (Walter et al., Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 2578-2585, Heilig et al., Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68, 114-123), clase Bacteroidetes y genero Enterococcus (Rinttila et al., J. Appl. Microbiol., 2004, 97, 1166-1177). El equipo usado para el analisis de PCR cuantitativa fue el Sistema de PCR en tiempo Real 7500 FAST de Applied Biosystems o el Sistema de Deteccion de Secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Los resultados se expresaron como log celulas por gramo de tejido por encima del lfmite de deteccion de cada grupo bacteriano en cada tejido. Los lfmites de deteccion se determinaron por separado para cada grupo bacteriano en cada tipo de tejido.

Resultados

Endotoxemia y plasma CD14

La dieta con alto contenido de grasa (HFD) se asocio con 2-3 veces el promedio de aumento en comparacion con la endotoxemia basal (nivel basal de LPS en plasma) de los ratones alimentados con comida normal (NC) (Figura 1). Este aumento de LPS en plasma asociado con una dieta con alto contenido de grasa se define como endotoxemia metabolica.

Todos los tratamientos probioticos fueron capaces de reducir la endotoxemia metabolica de forma significativa en los ratones e invertir los efectos adversos de la dieta con alto contenido de grasa. El nivel promedio de sCD14 en plasma, el receptor principal de LPS, de los ratones tratados con probioticos y dieta con alto contenido de grasa fue de aproximadamente cuatro veces mas bajo que el de los ratones que recibieron dieta con alto contenido de grasa solamente.

Tomados en conjunto, los resultados demuestran que el tratamiento probiotico reduce la endotoxemia metabolica y ademas reduce los receptores circulantes de LPS, que tambien son elevados con la dieta con alto contenido de grasa. El LPS es un componente principal de la pared celular de las bacterias gram-negativas, que se produce en el intestino como un componente de la microbiota gram-negativa pero tambien como LPS libre. La reduccion de la endotoxemia metabolica puede resultar de la reduccion de la translocacion de bacterias gram-negativas en el hospedador, reduccion en la absorcion del LPS libre por el hospedador, o aumento de la eliminacion de LPS por el hospedador. Por lo tanto, los probioticos se pueden usar como un metodo innovador para prevenir o tratar la endotoxemia metabolica.

Reduccion de translocacion bacteriana en tejidos

La dieta con alto contenido de grasa se asocio con niveles elevados de ADN bacteriano en los tejidos, en comparacion con la comida normal. El impacto fue particularmente evidente en el tejido adiposo mesenterico, en el que niveles elevados de la familia Enterobacteriaceae (Figura 2), genero Enterococcus (Figura 3), genero Lactobacillus (Figura 4) y Bacterium de Dominio total (Figura 6) se asociaron con la dieta con alto contenido de grasa. En el tejido adiposo subcutaneo, se detectaron niveles elevados de clase Bacteroidetes en ratones alimentados con una dieta con alto contenido de grasa (Figura 5). El genera Bifidobacterium no se detecto en cantidades significativas en ninguno de los tejidos.

El tratamiento probiotico redujo de forma significativa los niveles de ADN bacteriano en los tejidos. En el tejido adiposo mesenterico, el tratamiento con B420 redujo de forma significativa el nivel de la familia Enterobacteriaceae (Figura 2), y el tratamiento con NCFM mostro una tendencia hacia la reduccion de niveles de la familia Enterobacteriaceae (Figura 2) y el genero Lactobacillus (Figura 4). En el hfgado, la combinacion de NCFM y B420 presenta una tendencia a reducir el nivel del genero Lactobacillus (Figura 4), mientras que el tratamiento con NCFM solo presenta una tendencia a reducir los niveles de la clase Bacteroidetes (Figura 5) y el Bacterium de Dominio (Figura 6), y el tratamiento con B420 presenta una tendencia a reducir los niveles de la clase Bacteroidetes (Figura 5). Tambien se observaron tendencias hacia abajo estadfsticamente no significativas para otras bacterias y tejidos (Figuras 2 a 6).

Los resultados demuestran que el tratamiento probiotico puede reducir el nivel de bacterias en tejidos metabolicamente muy importantes, el tejido adiposo mesenterico y el hngado. De ese modo, los probioticos se pueden usar como un metodo innovador para prevenir o tratar la translocacion bacteriana en tejidos, asociado con una dieta con alto contenido de grasa y endotoxemia metabolica. En particular la reduccion de la familia Enterobacteriaceae en el tejido adiposo mesenterico y la clase Bacteriodetes en el tejido hepatico puede ser fisiologicamente importante. Estos dos grupos bacterianos principales contienen LPS como un componente de la pared celular bacteriana y por lo tanto actuan como fuente potencial de LPS en plasma elevado, que esta asociado con la endotoxemia metabolica. Estos tejidos desempenan un papel particularmente importante en la endotoxemia metabolica y otras enfermedades metabolicas, ya que el LPS causa inflamacion en estos tejidos, conduciendo potencialmente una cascada de sucesos adversos que incluyen alteracion del metabolismo de la glucosa y reduccion de la sensibilidad a la insulina.

Ejemplo 2

Introduccion

El objeto de este estudio fue determinar en ratones el efecto de una alimentacion con alto contenido de grasas en la flora intestinal, translocacion bacterial y glucemia, asf como el papel protector potencial de la cepa NCFM™ de Lactobacillus acidophilus (NCFM™) en estos parametros.

Materiales y metodos

Se indujeron obesidad y diabetes en ratones macho C57BL/6 mediante una dieta para animales con alto contenido de grasa (60 % de grasa, HFD). Los ratones de control recibieron una dieta convencional (4 % de grasa, LFD). Desde las 19 semanas de edad, estos ratones recibieron 109 CFU/dfa de la cepa NCFM™ de Lactobacillus acidophilus durante 3 semanas. La glucemia en ayunas se midio antes y despues del tratamiento con la cepa NCFM™.

Un ensayo de sensibilidad a la insulina intraperitoneal se realizo el dfa antes del sacrificio. El analisis de la flora adherente colonica y translocacion bacteriana se realizo con los siguientes metodos.

Analisis bacteriano

Despues de la diseccion, el colon y el fleon se recogieron. La pared iliaca y el colon se usaron para identificar y cuantificar la flora adherente.

Las muestras se conservaron hasta 2 horas en medio Ringer/Tween 80 en condiciones anaerobica. Despues de homogenizacion, las muestras se incubaron en Caldo de Cultivo de Cerebro y Corazon para enriquecer e identificar el numero mas elevado de bacterias anaerobias y aero-anaerobias.

Se realizaron diluciones de 1 a 10 y de 1 a 100 en medio de cistema de Ringer. Estas diluciones se extendieron en agar Columbia enriquecido con un 5 % de sangre de caballo desfibrinada (CS) y se incubaron a 37 °C en atmosfera aerobia y anaerobia. Se hizo el recuento de las colonias y se identificaron entre 2 y 7 dfas despues de la extension. Se usaron tres tipos de medio. Agar en cierto modo no selectivo, agar DCL (Desoxicolato, Citrato, y Lactosa) Para aislar enterobacterias y agar MRS (Man, Rogosa, Sharpe) espedfico para Lactobacillus spp. La identificacion de las bacterias se realizo mediante la determinacion del tipo respiratorio, la tincion Gram y las caractensticas metabolicas. Translocacion bacteriana

Despues de diseccion, los ganglios linfaticos mesentericos (MLN) y el tejido adiposo mesenterico (MAT) se recogieron. La translocacion bacteriana se cuantifico en MLN y MAT.

Las muestras se conservaron hasta 2 horas en medio de Ringer/Tween 80 en condiciones analogicas. Despues de homogenizacion, se inoculo 1 ml de las metas iniciales en caldo de cultivo de enriquecimiento de cerebro-corazon con el fin de disminuir el umbral de deteccion para muestras con un nivel bacteriano bajo. Los cultivos de enriquecimiento se cubrieron con una capa de parafina con el fin de permitir el crecimiento de bacterias anaerobias incubadas durante cuatro dfas y se comprobo para crecimiento diario.

Los cultivos positivos se aislaron en placas de agar con sangre de Columbia modificada incubadas 48 h en condiciones anaerobias. Se subcultivaron e identificar diferentes tipos de colonias. Todas las incubaciones se realizaron a 37 °C. Los recuentos bacterianos se establecieron y expresaron como log CFU/ g de tejido.

Resultados

A las 18 semanas de edad, los ratones con una dieta con alto contenido de grasa (HFD) pesaban un 39 % mas que los ratones con la dieta de control (LFD) (39,2 ± 3,3 con respecto a 28,1 ± 1,1 g, p < 0,01). La hiperglucemia en ayunas aumento en un 77 % (174 ± 31 con respecto a 98 ± 6 mg/dl, p < 0,01), y la sensibilidad a la insulina disminuyo (un 2 con respecto a un 48 % de glucemia disminuyo 60 min despues de inyeccion de insulina) se encontro en el grupo de HFD en comparacion con LFD.

La administracion de la cepa NCFM™ de Lactobacillus acidophilus no modifico la glucemia en ayunas de los ratones con LFD (95 ± 5 mg/dl con respecto a. 92 ± 6 mg/dl). Sin embargo, la glucemia de los ratones con HFD disminuyo de forma significativa, lo que tendfa hacia la normalizacion (226 ± 23 mg/dl con respecto a 125 ± 10 mg/dl, p < 0,02). Los ratones con HFD tratados con la cepa NCFM™ permanecieron resistentes a la insulina.

Los ratones con HFD presentaron una flora adherente colonica significativamente mas abundante (6.5 ± 0.7 con respecto a 4,6 ± 0,4 log CFU/g, p < 0,01) incluyendo mas Lactobacilli (6,0 ± 0,5 con respecto a 4,5 ± 0,2, p < 0,01) y Enterococci (5,4 ± 0,4 con respecto a 4,4 ± 0,2 log CFU/g, p < 0,01). Este exceso se cancelo con el tratamiento con la cepa NCFM™ (de nuevo a 5,4 ± 0,6 log CFU/g para flora total, 4,3 ± 0,2 log CFU/g para Lactobacilli, y 4,6 ± 0,4 log CFU/g para Enterococci). El aumento de las bacterias detectadas en la grasa mesenterica de los ratones con HFD (3,8 ± 1,5 con respecto a 2,2 ± 0,9 log CFU/g) se modifico ligeramente con el tratamiento con la cepa NCFM™ (4,0 ± 1,2 log CFU/g). En el colon y el fleon de los ratones con HFD, la flora se diversifico con apariencia de bacterias Gram-negativas, que no se eliminaron con la cepa NCFM™. En los ganglios linfaticos mesentericos, las bacterias Gram-positivas aparecieron en los ratones con una dieta con alto contenido de grasa, y desaparecieron despues del tratamiento con la cepa NCFM™.

Conclusion

La cepa probiotica NCFM™ de Lactobacillus acidophilus presenta una tendencia a normalizar la hiperglucemia en ayunas de ratones obesos y diabetico. Los ultimos presentaban una flora intestinal adherente mas abundante y mas diversificada que los ratones de control. El tratamiento con la cepa NCFM™ de Lactobacillus acidophilus condujo a una disminucion de los niveles de bacterias adheridas a la mucosa en el colon, y a una eliminacion de las bacterias Gram-positivas potencialmente patogenicas en Aeon, colon y ganglios linfaticos mesentericos.

Ejemplo 3

Medicion de translocacion de Escherichia coli adherente a mucosa y luminal y translocacion de E. coli

El efecto del tratamiento probiotico en la adhesion mucosal y translocacion bacteriana de E. coli se determino mediante cultivo. El modelo de raton y el tratamiento probiotico usados fueron los mismos que los que se han descrito en el Ejemplo 1 y se ha mencionado anteriormente. Ademas, se incluyo un grupo que recibfa una combinacion del probiotico con un componente prebiotico (fructo-oligosacaridos a 0,2 g por animal al dfa).

Los ratones en ayunas se trataron mediante sonda con 109 unidades formadoras de colonias de E. coli resistente a ampicilina aislada a partir del raton y se hicieron resistentes a la ampicilina por medio de un plasmido que expresa el gen de p-lactamasa bajo el control de un promotor procariota. Dos horas despues, los ratones se sacrificaron y la mucosa o la abertura interna del duodeno, el yeyuno, el Aeon, el ciego y el colon, se recogieron por separado, se diluyeron, se sembraron en placas sobre agarosa que contema ampicilina y se incubaron durante una noche a 37 °C. Se hizo el recuento del numero de colonias. De forma analoga, la E. coli fluorescente resistente a ampicilina se cultivo a partir de tejidos recogidos que inclrnan tngado, bazo, tejido adiposo mesenterico, tejido adiposo subcutaneo, ganglios linfaticos mesentericos y ganglios linfaticos subcutaneos. La concentracion de insulina se midio a partir de plasma en estado en ayunas asf como el estado con alimento.

Resultados

Con el fin de investigar el papel de la adhesion mucosal en este proceso, la adherencia de Escherichia coli comensal resistente a antibioticos en la mucosa intestinal del raton se cuantifico. La cuantificacion de colonias resistentes a antibioticos en una placa de agarosa que se originan a partir de la mucosa o diferentes segmentos de la abertura interna mostro que la dieta HFD aumentaba los niveles de E. coli asociada a la mucosa, pero el tratamiento con la cepa B420 probiotica reduda la adherencia mucosal de E. coli inducida por HFD con respecto al yeyuno y el Aeon (Figura 7). Aunque los ensayos iniciales no desvelaron cambios en el ciego o en el colon, los ensayos adicionales mostraron que la cepa B420 probiotica reduda la adherencia mucosal de E. coli inducida por HFD con respecto al ciego (Figura 8).

El tratamiento con B420 sola o en combinacion con un prebiotico tambien redujo la translocacion de E. coli en tejidos de raton incluyendo tejidos que inclrnan el dgado, bazo, tejido adiposo mesenterico, tejido adiposo subcutaneo, ganglios linfaticos mesentericos y ganglios linfaticos subcutaneos (Figura 9). La reduccion de la adhesion mucosal y la translocacion de E. coli iba acompanada con un aumento de los niveles de insulina, en particular, una reduccion de los niveles de insulina en estado con alimento y una mejora de la secrecion de insulina despues de la alimentacion (Figura 10).

Ejemplo 4

Reduccion de la expresion genetica

Materiales y Metodos

Las celulas Caco-2 (ECACC, Salisbury, Reino Unido) se usaron como modelo para celulas epiteliales intestinales humanas (IEC) tal como en Putaala H, et al., ("Effect of four probiotic strains and Escherichia coli O157:H7 on tight junction integrity and cyclo-oxigenase expression", Research in Microbiology 2008) y en Makivuokko H, et al., (Nutr. Cancer, 2005, 52, 94-104) en condiciones de cultivo in vitro convencionales que comprendfan una atmosfera humidificada a 37 °C con CO2 al 5 %, y medios de cultivo de celulas Caco-2 (Invitrogen, Carlsbad, CA, US y BD Biosciences, San Jose, CA, US).

Para exposicion de las celulas Caco-2, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis ssp. lactis 420 se propago en caldo de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) durante una noche, las densidades de las celulas bacterianas se determinaron con citometna de flujo (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, Estados Unidos), se sedimentaron (25 °C, 5 min, 3000 g), se lavaron una vez con medio de cultivo de Caco-2, y se diluyeron en medio de cultivo de Caco-2 en una proporcion de 20 a 100 celulas bacterianas con respecto a una celula Caco-2. Despues de esto, las celulas Caco-2 se trataron durante 8 horas en condiciones in vitro convencionales. Como un control, se usaron celulas Caco-2 tratadas con medio de cultivo de Caco-2 sin adicion de la cepa 420 de B. animalis ssp. lactis 420.

Para la exposicion de las celulas Caco-2 en primer lugar se hizo una fermentacion con polidextrosa, polidextrosa al 1 % (v/v) y al 2 % (v/v) (Litesse®) en medio de simulacion de colon en un simulador de colon in vitro al igual que en Makivuokko et al., al que se ha hecho referencia anteriormente. En este estudio se uso la simulacion de colon in vitro que consiste en cuatro etapas y cuatro unidades paralelas.

Una sola unidad comprende cuatro recipientes conectados de forma secuencial (V1, V2, V3 y V4) con condiciones ajustadas para representar diferentes partes del colon humano en series que representan diferentes partes del colon: colon proximal, ascendente, descendente, y distal. Despues de simulacion de la fermentacion con polidextrosa, los sobrenadantes se alimentaron (25 °C, 5 min, 10.000 g), se diluyeron a un 10 % (v/v) en medio de cultivo de celulas Caco-2. Las celulas se trataron durante 24 h en condiciones in vitro convencionales. Como un control, se usaron celulas Caco-2 tratadas del mismo modo con medio de simulacion de colon fermentado sin polidextrosa anadida. Despues de exposicion, el ARN celular total se aislo de las celulas Caco-2 usando el kit RNeasy mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Se uso Affymetrix U133+2.0 GeneChips (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA, Estados Unidos) para estudiar el transcriptoma de celulas humanas. El procesamiento, etiquetado, hibridaciones, lavado, tincion y barrido de ARN durante el procesamiento de la micromatriz se realizaron de acuerdo con las recomendaciones convencionales del fabricante.

Los datos de la micromatriz se procesaron previamente con GC-RMA, y se analizaron estadfsticamente usando el lenguaje de programacion R (version 2.5.0) (R Development Core Team; "R:A language and environment for statistical computing", Viena, Austria: R Foundation for Statistical Computing; 2006), y Bioconductor (version 2.0) (Gentleman RC et al., "Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics" Genome Biol. 2004, 5, R80). Los genes expresados de forma diferencial se seleccionaron basandose en la expresion genetica con una diferencia de proporcion log de mas de 1,6 en la intensidad de la senal en comparacion con la de control para muestras tratadas con la cepa 420 de B. animalis ssp. lactis. Para las muestras de Caco-2 tratadas con polidextrosa, se seleccionaron genes expresados de forma diferencial basandose en su comportamiento total calculado usando la norma de los genes de los tres ultimos recipientes (V2, V3, V4) de simulacion.

La mayona de los genes siguieron un patron similar a traves de los cuatro recipientes: dentro de perfiles regulados de forma negativa, o regulados de forma positiva, la expresion disminuyo o aumento hacia el ultimo recipiente.

Tambien, si un perfil genetico se regulaba de forma positiva en el control, un 0 % de polidextrosa, estaba regulado de forma positiva mas ligeramente en el tratamiento con un 1 % de polidextrosa e incluso mas en un 2 % de polidextrosa. De forma analoga, en los perfiles regulados de forma negativa, el tratamiento con un 2 % de polidextrosa estaba mas regulado de forma negativa que con un 1 % que estaba mas regulado de forma negativa que el control. De ese modo, los genes se definieron como regulados de forma positiva o negativa basandose en los ultimos tres recipientes. La diferencia entre las muestras no tratadas y dos concentraciones de polidextrosa se calculo usando el ensayo t de Student para muestras relacionadas con un valor p de lfmite de separacion p < 0,01. Resultados

La expresion de genes relacionados con la absorcion del colesterol intestinal se regula en celulas Caco-2 con la cepa 420 de B. animalis ssp. lactis 420 (Tabla 1) o con sobrenadantes de fermentacion en polidextrosa (Tabla 2). El efecto de regulacion negativa en APOB, APOC2, APOC3, APOAIV y MTTP tienen un efecto reductor en el colesterol y en la absorcion de trigliceridos desde el intestino (Iqbal J y Hussain MM, American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism 2009, 296, E1183-E1194), mientras que el efecto de regulacion positiva en NPC1 aumentar la formacion de HDL en el intestino (Brunham LR et al., J Clin Invest 2006, 116, 1052-62). NR2F2 y HNF4A son factores de transcripcion que regulan la expresion de genes de apolipoprotema: veanse Antes TJ, et al., Biochemistry 2001, 40, 6720-30 y Leng SY, et al., American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2007, 293, G475-G483.

Tabla 1

Tabla 2

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una bacteria seleccionada entre la cepa NCFM de Lactobacillus acidophilus, la cepa 420 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, o una mezcla de las mismas para uso en el tratamiento de endotoxemia metabolica en un mairnfero.

2. Una bacteria para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la endotoxemia metabolica comprende un aumento del nivel de lipopolisacaridos en el cuerpo del mai^ero en un factor en el intervalo de 1,5 a 20 en comparacion con los niveles basales de lipopolisacarido.

3. Una bacteria para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que la endotoxemia metabolica comprende un aumento del nivel de lipopolisacaridos en el cuerpo del mamffero en un factor en el intervalo de 2 a 4 en comparacion con los niveles basales de lipopolisacarido.

4. Una bacteria para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la endotoxemia esta inducida por la dieta y/o asociada a la dieta.

5. Una bacteria para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el animal continua ingiriendo una dieta con alto contenido de grasa durante el transcurso del tratamiento.

6. Una bacteria para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la bacteria se administra en combinacion con uno o mas prebioticos.

7. Una bacteria para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que el prebiotico se selecciona entre alginato, xantano, pectina, goma de algarrobo, inulina, goma guar, un galacto-oligosacarido, un fructo-oligosacarido, polidextrosa, lactitol, lactosacarosa, un oligosacarido de soja, palatinosa, un isomalto-oligosacarido, un glucooligosacarido o un xilo-oligosacarido, o una mezcla de cualquiera de los mismos.