ES2973794T3 - Bifidobacterium breve 207-1 y uso del mismo - Google Patents

Bifidobacterium breve 207-1 y uso del mismo Download PDF

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Abstract

Se proporcionan bifidobacterium breve 207-1 y una composición, un cultivo, un producto alimenticio o un suplemento dietético que lo comprende, y su uso en la preparación de medicamentos o productos para el cuidado de la salud. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Bifidobacterium breve207-1 y uso del mismo
Campo técnico
La presente solicitud se refiere aBifidobacterium breveo progenie del mismo. De manera específica, la presente solicitud se refiere a unBifidobacterium breve207-1 y una composición, cultivo, producto alimenticio o complemento dietético que comprende el mismo. La presente solicitud también se refiere a un uso deBifidobacterium breve207-1 y composición, cultivo, producto alimenticio o complemento dietético que comprende el mismo en la fabricación de un medicamento o producto para el cuidado de la salud.
Antecedentes
Entre el 70 % y el 80 % de las células inmunitarias del cuerpo humano se encuentran en el intestino humano. Al mismo tiempo, el número total de bacterias en el intestino humano puede alcanzar los 100 billones, lo que representa aproximadamente el 78 % del total de microbios humanos. Por tanto, el intestino proporciona una plataforma importante para que el sistema inmunitario del hospedador interactúe con los microorganismos. La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) creen que los probióticos son microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del hospedador. Un gran número de pruebasin vitroy ensayos clínicos han demostrado que los probióticos tienen buenos efectos de aplicación en la salud intestinal del hospedador y la regulación inmunitaria.
Los probióticos pueden regular la función inmunitaria del hospedador a través de diferentes mecanismos. En términos de función de la barrera mucosa, los probióticos pueden competir con organismos invasores por los sitios de unión en las células de la mucosa, evitando de este modo que las bacterias penetren en la mucosa y entren en los tejidos profundos; regulando las uniones estrechas entre las células epiteliales intestinales y fortaleciendo la función de barrera de las células de la mucosa; inhibiendo la disolución y apoptosis de las células de la mucosa intestinal y manteniendo la integridad de la mucosa gastrointestinal. Los probióticos también pueden mejorar la función inmunitaria innata al mejorar la actividad fagocítica de las células presentadoras de antígenos (APC), tales como los fagocitos, CD, mejorando la capacidad de destrucción de los linfocitos NK y potenciando el nivel de expresión de citocinas (p. ej., factores proinflamatorios como IL-12, IFN-y, TNF-a y factores antiinflamatorios como TGF-p, IL-10, etc.) para controlar la intensidad de la respuesta inflamatoria. Al mismo tiempo, los probióticos pueden potenciar la inmunidad adaptativa. Los probióticos colonizados en la mucosa intestinal pueden promover la capacidad de respuesta de los linfocitos T y B a la estimulación antigénica, estimulan los tejidos linfoides relevantes en la mucosa intestinal e inducen la secreción de sIgA. Los probióticos como sustancias antigénicas pueden ser fagocitados por las células M. El antígeno de las células M se libera rápidamente y es absorbido por las CD, que presentan el antígeno a los linfocitos T CD4+ vírgenes, activando los linfocitos Th1 o Th2 para equilibrar la proporción de reacciones Th1 y Th2.
Adicionalmente, que los probióticos, como las bacterias lácticas, puedan ejercer los beneficios para la salud mencionados anteriormente en el cuerpo también depende de si la cepa puede tolerar el mecanismo de defensa del tracto gastrointestinal en el cuerpo, como el ambiente de pH bajo en los jugos gástricos y los ácidos biliares en el intestino delgado. Solo cuando llegan vivos al intestino, se adhieren a las células epiteliales intestinales y colonizan el intestino, pueden producir metabolitos beneficiosos e interactuar con el hospedador.
Por tanto, la detección de bacterias lácticas que pueden penetrar en el intestino y tener una alta viabilidad es la consideración principal para el desarrollo de probióticos. Los probióticos con alta capacidad de supervivencia, así como la capacidad de regular la función inmunitaria del hospedador y la función antialérgica aún están por desarrollarse.
Contenido de la invención
En la presente invención, salvo que se indique lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los significados que el comúnmente entendido por aquellos expertos en la materia. Al mismo tiempo, para comprender mejor la presente invención, a continuación se proporcionan definiciones y explicaciones de los términos relacionados.
Como se usa en el presente documento, el término "progenie" se refiere a células de progenie producidas por microorganismos mediante crecimiento (p. ej., crecimiento mediante cultivo en medio de cultivo). Es fácil entender que en el crecimiento y cultivo de microorganismos, especialmente bacterias, pueden ocurrir ciertos cambios (p. ej., mutación de una o varias bases) en el material genético, y estos cambios pueden ocurrir espontáneamente o pueden ser el resultado de mutagénesis con agentes químicos y/o físicos (p. ej., mutágenos) y/o tecnología de ADN recombinante conocida en la técnica. Por tanto, la progenie deBifidobacterium breveen el presente documento pretende abarcar la progenie cuyo material genético no ha cambiado o ha cambiado en comparación con elBifidobacterium brevede la presente invención. Por supuesto, la progenie aún conserva las funciones de la cepa de la que deriva (p. ej., capaz de mejorar la inmunidad, mejorar las reacciones alérgicas, etc.).
Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que es farmacológica y/o fisiológicamente compatible con el sujeto y el principio activo, que es bien conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Editado por Gennaro AR, 19a ed. Pensilvania: Mack Publishing Company, 1995), e incluye sin limitación: agentes ajustadores del pH, tensioactivos, adyuvantes, potenciadores de la fuerza iónica. Por ejemplo, los agentes de ajuste del pH incluyen, pero sin limitación, tampón fosfato; los tensioactivos incluyen, pero sin limitación, tensioactivos catiónicos, aniónicos o no iónicos, tales como Tween-80; y los potenciadores de la fuerza iónica incluyen, pero sin limitación, cloruro de sodio.
Como se usa en el presente documento, la expresión "suplemento dietético" se refiere a un producto comestible que puede proporcionar a los consumidores efectos beneficiosos (p. ej., efectos nutricionales, efectos preventivos, efectos terapéuticos u otros efectos beneficiosos). En este contexto, el suplemento dietético cubre productos para el cuidado de la salud, productos nutricionales, suplementos y otros productos.
Como se usa en el presente documento, el término "medicamento" abarca medicamentos utilizados tanto en medicina humana como animal como en medicina veterinaria, así como aquellos utilizados para su incorporación en piensos para animales (p. ej., piensos para ganado y/o alimentos para mascotas). Adicionalmente, el término "medicamento", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier sustancia que proporcione efectos terapéuticos, preventivos y/o beneficiosos. El término "medicamento" como se utiliza en el presente documento no se limita necesariamente a sustancias que requieren una aprobación de comercialización, sino que incluye materiales que pueden usarse en cosméticos, productos para el cuidado de la salud, alimentos (incluyendo, por ejemplo, piensos y bebidas), cultivos probióticos y suplementos dietéticos.
Como se usa en el presente documento, el término "UFC (Unidades formadoras de colonias)" se refiere al número total de colonias microbianas tales como bacterias, hongos y levaduras en un producto, y generalmente se utiliza para el cálculo del recuento viable.
Como se usa en el presente documento, la expresión "UFC/dosis" se refiere a la cantidad de bacterias presentes en la composición/producto alimenticio o suplemento dietético/composición farmacéutica proporcionada al sujeto todos los días o cada vez. Por ejemplo, en determinadas realizaciones,Bifidobacterium breveen el producto alimenticio o suplemento dietético está presente en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis (p. ej., de 108 a 1012 UFC/dosis). En esta realización, siBifidobacterium brevese aplica en un producto alimenticio (p. ej., en bebidas sólidas, yogur), el producto alimenticio (p. ej., bebidas sólidas, yogur) proporcionado al sujeto todos los días o cada vez puede contener aproximadamente de 106 a 1012 UFC deBifidobacterium breve.Por supuesto, como alternativa, la cantidad de dichas bacterias se puede dividir y administrar en varios lotes. Siempre que la cantidad total deBifidobacterium breverecibido por el sujeto en cualquier momento específico (p. ej., un período de cada 24 horas) sea de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 UFC, cumple con el requisito del producto alimenticio o suplemento dietético mencionado anteriormente en el queBifidobacterium breveestá presente en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis (p. ej., de 108 a 1012 UFC/dosis).
Los inventores de la presente solicitud seleccionaron una cepa deBifidobacterium brevecon un importante potencial probiótico específico de cepa de 265 cepas derivadas del tracto intestinal de recién nacidos sanos a través de una gran cantidad de experimentos. Los inventores de la presente solicitud han confirmado a través de un gran número de experimentos que elBifidobacterium brevetiene buena tolerancia al ambiente ácido de los jugos gástricos y las sales biliares, tiene una alta capacidad de adhesión al tracto intestinal y puede mejorar la inmunidad, mejorar o aliviar los síntomas de alergias, y así completar la presente invención.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente solicitud proporciona unBifidobacterium breveo progenie del mismo, elBifidobacterium breveestá depositado en el Centro de Colección de Cultivos Microbianos de Guangdong y tiene un número de registro de GDMc C N.° 60962.
En un segundo aspecto, la presente solicitud proporciona una composición que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo.
En determinadas realizaciones, la composición comprende además un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacteria, hongo (p. ej., levadura), o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, elBifidobacterium brevepuede usarse en combinación con una o más especies diferentes de microorganismos, en el que las otras especies de microorganismos pueden tener un efecto beneficioso sobre la salud de un hospedador al que se administra.
En determinadas realizaciones, el microorganismo es un probiótico.
En determinadas realizaciones, el probiótico se selecciona de bacteria probiótica, levadura probiótica, o cualquier combinación de las mismas.
Como se usa en el presente documento, la expresión "bacteria probiótica" se define como cualquier bacteria no patógena, y cuando se administra como bacteria viva en una cantidad suficiente a un hospedador, puede tener un efecto beneficioso sobre la salud del hospedador.
En determinadas realizaciones, la bacteria se selecciona del grupo que consiste enLactobacillusspp.,Bifidobacteriumspp.,Bacillusspp.,Propionibacteriumspp.,Streptococcusspp.,Lactococcusspp.,Pediococcusspp.,Enterococcusspp.,Staphylococcusspp., o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la bacteria deBifidobacteriumspp. se selecciona del grupo que consiste en:Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis,o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la bacteria deLactobacillusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus iners, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius,o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la bacteria deBacillusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Bacillus subtilis, Bacillus coagulans,o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la bacteria dePropionibacteriumspp. se selecciona del grupo que consiste en:Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acidipropionici,o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la bacteria deStreptococcusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Streptococcus thermophilus, Streptococcus salivarius,o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la bacteria deLactococcusspp. esLactococcus lactis.
En determinadas realizaciones, la bacteria deEnterococcusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium,o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la levadura se selecciona del grupo que consiste enSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Kluyveromyces marxianus,o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la composición comprende además un aditivo adicional.
Los expertos en la materia pueden seleccionar y ajustar el aditivo adicional de acuerdo con las necesidades. En determinadas realizaciones, el aditivo adicional se selecciona del grupo que consiste en otro nutriente, mineral, vitamina, o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, el aditivo adicional puede tener un efecto beneficioso sobre la salud del hospedador al que se administra.
En determinadas realizaciones, el otro nutriente se selecciona del grupo que consiste en fibra dietética, prebióticos, proteína (p. ej., enzimas), hidrato de carbono, lípido (p. ej., grasa), mineral, vitamina, ingrediente vegetal (p. ej., extracto de planta), aminoácido, inmunomodulador, sustituto de la leche, o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, el mineral se selecciona del grupo que consiste en hierro, zinc, potasio, sodio, calcio, magnesio y cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la vitamina se selecciona del grupo que consiste en vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B12, vitamina A, vitamina C, vitamina D, vitamina E, vitamina K y cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la composición sirve como cultivo iniciador (p. ej., cultivo iniciador para producto fermentado vegetal, cultivo iniciador para producto lácteo). En dichas realizaciones, elBifidobacterium breveen la composición se utiliza como cultivo iniciador para participar en un proceso de fermentación. Por ejemplo, en el proceso de preparación de yogur,Bifidobacterium breve,como probiótico, se fermenta junto con leche fresca para preparar yogur.
En determinadas realizaciones, la composición se usa para preparar un producto alimenticio y/o un suplemento dietético (p. ej., alimento para el cuidado de la salud).
En determinadas realizaciones, el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en bebida sólida, dulces o zumo de frutas; o, el producto alimenticio es un producto lácteo (p. ej., yogur, leche fermentada aromatizada, bebida de bacterias lácticas, queso).
En determinadas realizaciones, el suplemento dietético está formulado para administración oral.
En determinadas realizaciones, el suplemento dietético está en forma de pastilla, polvo, cápsula, comprimido, gránulo, polvo, opérculo, gránulo de disolución oral, sobre, gragea o líquido.
En algunas realizaciones, preferentemente,Bifidobacterium breveestá presente en la composición en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis (p. ej., de 108 a 1012 UFC/dosis).
En un tercer aspecto, la presente solicitud proporciona un producto alimenticio o suplemento dietético que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado o la composición anteriormente mencionada.
En el contexto, el término "alimento" es amplio, incluyendo alimentos y bebidas para humanos, así como alimentos y bebidas para animales (es decir, piensos). En determinadas realizaciones, el producto alimenticio es apto y está diseñado para el consumo humano.
Se puede entender que, dependiendo del uso, modo de aplicación o modo de administración, el producto alimenticio de la presente solicitud puede estar en forma líquida, sólida, suspensión o polvo.
En determinadas realizaciones, el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en bebida sólida, caramelo o zumo de fruta, o el producto alimenticio es un producto lácteo (p. ej., yogur, leche fermentada aromatizada, bebida de bacterias lácticas, queso).
En determinadas realizaciones, el suplemento dietético está formulado para administración oral.
En determinadas realizaciones, el suplemento dietético está en forma de pastilla, polvo, cápsula, comprimido, gránulo, polvo, opérculo, gránulo de disolución oral, sobre, gragea o líquido.
En determinadas realizaciones, el producto alimenticio o complemento dietético también puede comprender (pero no limitarse a) una o cualquier combinación de las siguientes sustancias: probiótico (p. ej., bacteria probiótica), fibra alimentaria, prebióticos, proteína (p. ej., enzima), hidrato de carbono, lípido (p. ej., grasa), vitamina, mineral, ingrediente vegetal (p. ej., extracto de planta), aminoácido, inmunomodulador, sustituto de la leche, o metabolito o extracto deBifidobacterium breveo progenie del mismo. En algunas realizaciones, la composición de la presente invención también se puede combinar con diferentes edulcorantes o agentes aromatizantes, sustancias tonificantes, estabilizantes, deslizantes, cargas y otros materiales auxiliares que sean aceptables en los alimentos.
En determinadas realizaciones, elBifidobacterium breveo progenie del mismo está presente en forma de un concentrado.
En determinadas realizaciones, elBifidobacterium breveen el producto alimenticio o suplemento dietético está presente en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis (p. ej., de 108 a 1012 UFC/dosis).
En un cuarto aspecto, la presente solicitud proporciona una composición farmacéutica que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado.
Como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" abarca composiciones farmacéuticas utilizadas en seres humanos, así como composiciones farmacéuticas utilizadas en animales (p. ej., aplicaciones veterinarias). En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica es para usar en humanos. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una formulación deBifidobacterium breve.En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para su administración oral.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de pastilla, polvo, cápsula, comprimido, gránulo, polvo, opérculo, gránulo de disolución oral, sobre, gragea o líquido.
Preferentemente, elBifidobacterium breveen la composición farmacéutica está presente en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis (p. ej., de 108 a 1012 UFC/dosis).
En un quinto aspecto, la presente solicitud proporciona un cultivo, que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado.
En determinadas realizaciones, el cultivo comprende además un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacteria, hongo (p. ej., levadura), o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, el cultivo comprende además un ingrediente que proporciona nutrientes (p. ej., medio sólido o líquido, capa de células alimentadora).
En algunas realizaciones, el ingrediente que proporciona nutrientes se selecciona del grupo que consiste en prebióticos, proteína (p. ej., enzima), hidrato de carbono, lípido (p. ej., grasa), probiótico, vitamina, inmunomodulador, sustituto de la leche, mineral, aminoácido o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, el cultivo comprende además un filtrado de cultivo sin células deBifidobacterium breveo progenie del mismo.
En determinadas realizaciones, el cultivo comprende además un derivado deBifidobacterium breveo progenie del mismo.
En determinadas realizaciones, el derivado se selecciona del grupo que consiste en metabolito, enzima, componente estructural celular (p. ej., pared celular o componente de la misma), polisacárido extracelular, bacteriocina, compuesto que contiene componente inmunogénico, o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, el microorganismo está vivo o muerto, como lisado o extracto, o como producto bacteriano, o como sobrenadante.
En un sexto aspecto, la presente solicitud proporciona un uso delBifidobacterium breveo progenie del mismo mencionados anteriormente o la composición mencionada anteriormente o la composición farmacéutica mencionada anteriormente o el cultivo mencionado anteriormente en la fabricación de un medicamento o suplemento dietético o producto para el cuidado de la salud, el medicamento o suplemento dietético o producto para el cuidado de la salud se usa para inhibir la inflamación o aliviar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, o para mejorar la inmunidad del sujeto, o para prevenir una infección bacteriana o viral o una enfermedad autoinmunitaria en el sujeto, o para mejorar o aliviar una reacción o síntoma alérgico en el sujeto.
En determinadas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad causada por inflamación de la retina (p. ej., retinitis, queratitis), una enfermedad causada por la inflamación de la piel (p. ej., dermatitis, eccema), una enfermedad causada por la inflamación de las vías respiratorias (p. ej., infección de las vías respiratorias superiores) y una enfermedad causada por inflamación del tubo digestivo (p. ej., enfermedad inflamatoria intestinal).
En determinadas realizaciones, la infección bacteriana o viral se selecciona del grupo que consiste en gripe bacteriana, gripe viral, infección del tracto urinario, vaginitis y cervicitis.
En determinadas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, diabetes, artritis reumatoide y encefalitis autoinmunitaria.
En determinadas realizaciones, la reacción o síntoma alérgico se selecciona del grupo que consiste en eccema, dermatitis atópica, asma y alergia alimentaria.
En algunas realizaciones, el medicamento o suplemento dietético o producto para el cuidado de la salud puede promover la activación de las células inmunitarias, promover la producción de citocinas, inhibir la inflamación o aliviar enfermedades inflamatorias.
En determinadas realizaciones, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-10, IL-6, IL-12, TNF-a o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, la citocina antiinflamatoria es IL-10.
En algunas realizaciones, el medicamento o suplemento dietético o producto para el cuidado de la salud puede reducir el nivel de IgE e inhibir la reacción alérgica mediada por IgE.
En algunas realizaciones, el medicamento o suplemento dietético o producto para el cuidado de la salud se usa solo o en combinación adicionalmente con un agente antifúngico, analgésico, fármaco antiinflamatorio, agente cicatrizante o humectante.
En determinadas realizaciones, el sujeto es un mamífero.
En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir una inflamación o aliviar una enfermedad inflamatoria, o prevenir una infección bacteriana o viral o una enfermedad autoinmunitaria, o mejorar o aliviar una reacción alérgica o un síntoma de la misma, en donde el método comprende: administrar elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado o la composición anteriormente mencionada o la composición farmacéutica anteriormente mencionada a un sujeto que lo necesite.
En determinadas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad causada por inflamación de la retina (p. ej., retinitis, queratitis), enfermedades causadas por inflamación de la piel (p. ej., dermatitis, eccema), una enfermedad causada por la inflamación de las vías respiratorias (p. ej., infección de las vías respiratorias superiores) y una enfermedad causada por inflamación del tubo digestivo (p. ej., enfermedad inflamatoria intestinal).
En determinadas realizaciones, la infección bacteriana o viral se selecciona del grupo que consiste en gripe bacteriana, gripe viral, infección del tracto urinario, vaginitis y cervicitis.
En determinadas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, diabetes, artritis reumatoide, encefalitis autoinmunitaria y similares.
En determinadas realizaciones, la reacción alérgica o síntoma de la misma se selecciona del grupo que consiste en eccema, dermatitis atópica, asma y alergia alimentaria.
En determinadas realizaciones, elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado o la composición farmacéutica anteriormente mencionada se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste en administración oral, administración por inyección (p. ej., inyección intravenosa o inyección intramuscular), aplicación tópica (p. ej., frote), o cualquier combinación de las mismas.
En determinadas realizaciones, elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado o la composición farmacéutica anteriormente mencionada se administra sola, o en combinación con otro agente antifúngico, analgésico, fármaco antiinflamatorio, agente cicatrizante o humectante.
En determinadas realizaciones, el sujeto es un mamífero.
En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para mejorar la inmunidad de un sujeto, comprendiendo el método: administrar elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado o la composición anteriormente mencionada o la composición farmacéutica anteriormente mencionada a un sujeto que lo necesite.
En determinadas realizaciones, elBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado o la composición farmacéutica anteriormente mencionada se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste en administración oral, administración por inyección (p. ej., inyección intravenosa o inyección intramuscular), o cualquier combinación de las mismas.
En determinadas realizaciones, el sujeto es un mamífero.
En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un uso delBifidobacterium breveo progenie del mismo anteriormente mencionado o la composición anteriormente mencionada o el cultivo antes mencionado en la fabricación de un cultivo iniciador, en el que el cultivo iniciador es útil en la fermentación de un alimento sólido (p. ej., queso) o un alimento líquido (p. ej., yogur, leche fermentada aromatizada, bebidas con bacterias lácticas).
Efectos beneficiosos
ElBifidobacterium brevede la presente solicitud tiene buena tolerancia al ambiente ácido de los jugos gástricos y las sales biliares, y tiene una alta capacidad de adhesión al tracto intestinal, y puede activar la actividad de los macrófagos y promover la expresión de citocinas. Concretamente, elBifidobacterium brevede la presente solicitud puede aumentar significativamente la expresión del factor antiinflamatorio IL-10, puede inhibir la inflamación o aliviar enfermedades inflamatorias y mejorar la inmunidad. Adicionalmente, elBifidobacterium brevede la presente solicitud puede reducir el nivel de IgE sérica y mejorar las reacciones alérgicas.
Las realizaciones de la presente invención se describirán en detalle a continuación junto con los dibujos y ejemplos adjuntos. No obstante, aquellos expertos en la materia entenderán que los siguientes dibujos y ejemplos solo se utilizan para ilustrar la presente invención, pero no para limitar el alcance de la presente invención. De acuerdo con los dibujos adjuntos y la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas, varios objetos y aspectos ventajosos de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la materia.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra la morfología de la colonia deBifidobacterium breve207-1 cultivado en la placa, en donde, la Fig. 1A muestra la morfología de la colonia deBifidobacterium breve207-1 cultivado en la placa BF, la Fig. 1B muestra la morfología de la colonia deBifidobacterium breve207-1 cultivado en la placa TOS.
La Fig. 2 muestra una vista microscópica deBifidobacterium breve207-1 con tinción Gram.
La Fig. 3 muestra los niveles séricos de IgE de ratones del modelo OVA que recibieron o no tratamiento conBifidobacterium breve207-1.
Notas sobre el depósito de materiales biológicos
ElBifidobacterium breve207-1 ha sido depositado en el Centro de Colección de Cultivos Microbianos de Guangdong (GDMCC) ubicado en el quinto piso del Edificio 59, N.° 100, Xianlie Middle Road, Guangzhou. Tiene el número de registro GDMCC No. 60962 y la fecha de depósito es el 15 de enero de 2020.
Modos específicos para llevar a cabo la invención
La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos que pretenden ilustrar la invención en lugar de limitarla.
Salvo que se indique lo contrario, los experimentos y métodos descritos en los ejemplos se realizan básicamente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y descritos en diversas referencias. Por ejemplo, técnicas convencionales como la inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y el ADN recombinante utilizados en la presente invención se pueden encontrar en: Sambrook, Fritsch y Maniatis, "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", 2a edición (1989); "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY", Editado por F.M. Ausubelet al.,(1987); "METHODS IN ENZYMOLOGY" (serie, Academic Publishing Company): "PCR 2: A p Ra CTICAL APPROACH", Editado por M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor (1995); y ANIMAL CELL CULTURE, Editado por R.I. Frescheni (1987).
Adicionalmente, si las condiciones específicas no estuvieran especificadas en los ejemplos, debe realizarse de acuerdo con las condiciones convencionales o las condiciones recomendadas por el fabricante. Los reactivos o instrumentos utilizados sin indicar el fabricante de los mismos eran todos productos convencionales que podían adquirirse comercialmente. Los expertos en la materia saben que las realizaciones describen la presente invención a modo de ilustración y no pretenden limitar el alcance de protección reivindicado por la presente invención. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan a esta solicitud como referencia en su totalidad.
Ejemplo 1. Aislamiento e identificación de cepas
En la presente solicitud, se aislaron 265 cepas de muestras de heces de recién nacidos a término normales nacidos en el West China Women's and Children's Hospital de la Universidad de Sichuan, y se seleccionó una cepa deBifidobacterium breveque fue denominadaBifidobacterium breve207-1. Entre ellos, los criterios de inclusión para recién nacidos fueron: vivir en cinco distritos de Chengdu; edad gestacional de 37-42 semanas, peso al nacer de entre 2500-4000 g y bebés sin anomalías congénitas ni defectos de nacimiento. Los criterios de exclusión fueron: uso de antibióticos por las madres en el mes anterior al parto; padres con enfermedades infecciosas como el SIDA, tuberculosis, hepatitis B y recién nacidos no aptos para recoger heces debido a enfermedades graves como la neumonía neonatal.
Se recogieron heces frescas de bebés de 1-4 meses y se colocaron en tubos de recogida de heces asépticos. Después del muestreo, se almacenó temporalmente a 4 °C y se envió al laboratorio a baja temperatura por el personal que recogió las muestras para dilución y cultivo de la muestra de heces. En caso de no poder procesarse inmediatamente, se almacenó en condiciones anaerobias a 4 °C y se cultivó el mismo día.
Se pesaron 0,5 g de heces, se añadieron 4,5 ml de diluyente fecal (4,5 g de KH<2>PO<4>, 6,0 g de Na<2>HPO<4>, 0,5 g de clorhidrato de L-cisteína, se mezclaron 0,5 g de Tween-80, 1,0 g de agar con 1000 ml de agua destilada, se esterilizó por autoclave a 121 °C durante 15 min para su uso posterior), se agitó y se mezcló bien y se diluyó 10 veces en serie. Se tomaron 100 pl de mezcla fecal con el grado de dilución adecuado y se extendieron en una placa con glucosa (5 % de sangre de caballo), sangre, medio de cultivo de hígado (medio de cultivo BL) mediante una varilla en forma de L y se llevó a cabo el cultivo anaerobio a 37 °C durante 48 h. Se seleccionaron de la placa BL las colonias deBifidobacteriumsospechosas (aquellas colonias que eran de color marrón o rojo pardusco, con una superficie lisa y húmeda, una forma redonda y elevada y un borde limpio, y con un diámetro de aproximadamente 3-5 mm), se subcultivaron en una placa con un medio selectivo deBifidobacterium,es decir, agar propionato TOS, y se cultivaron en condiciones anaerobias a 37 °C durante 48 horas. A continuación, se recogieron de la placa TOS las colonias, se inocularon en una placa MRS y se cultivaron en condiciones anaerobias a 37 °C. También se observó el crecimiento de las colonias ante la presencia de oxígeno. Se realizaron tinciones de Gram y observación microscópica de las cepas.
Los experimentos anteriores demostraron que la cepa era estrictamente aerobia y era un bacilo grampositivo, con uno o ambos extremos hinchados o bifurcados, y sin esporas. Se determina preliminarmente que la cepa aislada en la solicitud es unBifidobacterium(mostrado en las Fig. 1 y 2).
Se utilizó el método de PCR para identificar la cepa aislada. El ADN bacteriano se extrajo mediante un método de ebullición. Se usaron cebadores específicos paraBifidobacteriumspp. y cebadores específicos para 8 cepas deBifidobacterium(GrupoB. adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, grupo B. catenulatum, B. dentium, B. infantis, B. longum)para la amplificación por PCR del ADN bacteriano. Las secuencias de los cebadores se pueden encontrar en la bibliografía (Matsuki T,et al.2004, Appl Environ Microbiol) y se muestran en la Tabla 1. El sistema de amplificación comprendía 25 pl de 2xTaq MasterMix (Beijing Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd ), 2 pl de cada uno de los cebadores en dirección 5' y dirección 3' (10 pmol/l), 4 pl de ADN molde y 17 pl de ddH<2>O. La amplificación por PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: predesnaturalización a 94 °C durante 2 min; desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 30 s (35 ciclos); extensión final a 72 °C durante 2 min. Los productos de PCR se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 % (se disolvieron 0,4 g de agarosa en 20 ml de tampón 0,5 x TBE con calentamiento, se añadió 1 pl de Goldview, y el volumen de carga fue de 5 pl y la electroforesis se realizó a 80 V durante 20 min), y se usó un ChemiDoc XRS+ System (un sistema de imágenes en gel) para hacer fotografías para la identificación deBifidobacterium.
Los resultados de la identificación por PCR se muestran en la Tabla 2. Se observó una fuerte banda positiva para los productos de PCR amplificados a partir de los cebadores deBifidobacteriumspp. y los cebadores deB. breve,y los cebadores restantes no dieron como resultado ningún producto de PCR. Por tanto, la cepa obtenida en la solicitud esBifidobacterium breve.
Asimismo, se determinó el genoma completo deBifidobacterium breve207-1 utilizando la plataforma de secuenciación PacBio Sequel2, la longitud de su genoma era de 2.352.089 pb, el contenido de GC fue del 58,8 % respectivamente (en los que el contenido de GC se refería a proporciones de guanina y citosina en las cuatro bases del ADN), el genoma cromosómico contenía 2.077 genes codificantes, 58 genes de ARNt, 9 genes de ARNr (incluidos ARNr 5s, ARNr 16s y ARNr 23s) y otros 14 tipos de genes de ARN.
Basándose en los resultados experimentales de identificación por PCR y secuenciación del genoma completo mencionados anteriormente, la presente solicitud obtuvo una nueva cepa, es decir,Bifidobacterium breve207-1, que se depositó el 15 de enero de 2020.
Tabla 1. Secuencias de cebadores
continuación
Tabla 2. Resultados de identificación deBifidobacterium
Nota: "++" representa una banda positiva fuerte; "+" representa una banda positiva; "±" representa una banda débilmente positiva; "-" representa negativo.
Ejemplo 2. Estudio sobre las características probióticas deBifidobacterium breve207-1
1. Análisis experimental de tolerancia al ácido y a las sales biliares deBifidobacterium breve207-1
1.1 Preparación de la suspensión bacteriana de prueba:Bifidobacterium breve207-1 fue reanimado con medio TOS y sometido a pases dos veces para su uso posterior. Después de 48 horas de cultivo TOS, las bacterias se rasparon en 2 ml de diluyente fecal, se agitó en vórtex y se mezcló bien, y la concentración se ajustó aproximadamente a 108 a 109 UFC/ml.
1.2 Preparación de soluciones de cultivo de ácido gástrico simulado y sales biliares simuladas
Preparación de solución de cultivo de ácido gástrico simulado: Se preparó la solución de cultivo en caldo MRS, se esterilizó y, a continuación, se ajustó con 1 mol/l de HCl a un valor de pH de 3,0, preparando de este modo la solución de cultivo de ácido gástrico simulado.
Preparación de la solución de cultivo de sales biliares simuladas: Se preparó la solución de cultivo en caldo MRS, se esterilizó y, a continuación, se añadió sal biliar bovina a una concentración del 0,1 %, se ajustó con 1 mol/l de HCl a un pH de 8,0 y, a continuación, se filtró para esterilización con una membrana microporosa de 0,22 pm, preparando de este modo la solución de cultivo de sales biliares.
1.3 Pruebas de tolerancia al ácido gástrico y a las sales biliares
Prueba de tolerancia al ácido deBifidobacterium breve207-1: se colocaron 0,9 ml de la solución de cultivo de ácido gástrico simulado en un tubo EP, se añadió 0,1 ml de la suspensión bacteriana preparada, se agitó en vórtex y se mezcló bien y, a continuación, se colocó en una incubadora anaerobia y se cultivó a 37 °C durante 2 horas. Las pruebas se realizaron a las 0 h y 2 h, y se establecieron 3 pruebas paralelas para la cepa en cada momento. Se utilizó como control el caldo MRS (pH=7) sin ajustar el pH, se observó el crecimiento de bacterias y se excluyó la muerte de bacterias causada por otros factores.
Prueba de tolerancia a las sales biliares deBifidobacterium breve207-1: se colocaron 0,9 ml de la solución de cultivo de sales biliares en un tubo EP, se añadió 0,1 ml de la suspensión bacteriana preparada, se agitó en vórtex y se mezcló bien y, a continuación, se colocó en una incubadora anaerobia y se cultivó a 37 °C durante 24 horas. Las pruebas se realizaron a las 0 h y 24 h, y se establecieron 3 pruebas paralelas para la cepa en cada momento. Como control se utilizó el caldo MRS (pH=7) sin sales biliares, se observó el crecimiento de bacterias y se excluyó la muerte de bacterias causada por otros factores.
Una vez completado el cultivo anterior, se llevó a cabo inmediatamente una dilución en gradiente de 10 veces, el diluyente con el grado de dilución apropiado se inoculó por puntos en una placa TOS, se cultivó en condiciones anaerobias a 37 °C durante 24-48 horas y se sometió a recuento. Como concentración bacteriana inicial se utilizó el resultado del recuento de la inoculación con dilución de 0 horas. Los resultados se compararon con las tasas de supervivencia, que se calcularon de acuerdo a la siguiente fórmula:
Tasa de supervivencia (%) = concentración de bacterias viables después del cultivo (UFC/ml) / concentración de bacterias viables a las 0 horas (UFC/ml) x 100
Los resultados experimentales mostraron que la tasa de supervivencia deBifidobacterium breve207-1 después de 2 horas de digestión en la solución de cultivo de ácido gástrico simulado de pH=3 fue del 86,3 %; la tasa de supervivencia después de 24 horas de cultivo en la solución de cultivo de sales biliares fue del 73,6 %. Por tanto, se pudo ver que elBifidobacterium breve207-1 tenía buena tolerancia al ácido gástrico y las sales biliares y podía resistir eficazmente el ambiente extremo del tubo digestivo superior, para llegar al tubo digestivo inferior, como el colon, para realizar funciones saludables. Por tanto, elBifidobacterium breve207-1 cumple los requisitos básicos como probiótico.
2. Capacidad de adhesión deBifidobacterium breve207-1 a la mucosa intestinal
2.1 Método de prueba de adherencia: Después de reanimar y subcultivarBifidobacterium breve207-1 en la placa TOS durante tres generaciones, se ajustó la absorbancia DO600 de la suspensión bacteriana a 1,051 ± 0,005 (concentración de 1x109 UFC/ml). Se utilizaron las cepas comercialesBifidobacterium animalis subsp. lactisBB-12 yLactobacillus rhamnosusLGG como cepas de control para experimentos paralelos y sus suspensiones bacterianas se prepararon de acuerdo con el mismo método descrito anteriormente.
Se añadió una solución de mucina de 500 pg/ml a una placa Maxisorp de 96 pocillos (Nunc), 100 pl por pocillo y se incubó durante la noche en una nevera a 4 °C. Se sacó y se lavó con p Bs tres veces, 200 pl por pocillo, a continuación, se bloqueó con PBS que contenía Tween 20 al 1 % durante 1 h, 100 pl por pocillo. Se tomaron 100 pl de la suspensión bacteriana preparada y se añadieron al micropocillo y se establecieron 3 paralelos para cada cepa. Al mismo tiempo, se usó PBS en lugar de suspensión bacteriana para agregarlo como control en blanco y se establecieron 3 paralelos. La incubación se llevó a cabo durante la noche en una nevera a 4 °C. Después de la incubación, se sacó y se lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % para eliminar las bacterias no adheridas. A continuación, se secó en estufa a 60 °C durante 1 h. A la microplaca seca se le añadió una solución de violeta cristal al 1 %, 100 pl por pocillo y se tiñeron durante 45 min. A continuación, se lavó con PBS 6 veces, se añadió etanol absoluto y se dejó reposar durante 10 minutos para liberar la solución de tinción. Finalmente, se midió la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 590 nm mediante un lector de microplacas.
2.2 Resultados de adherencia deBifidobacterium breve207-1: Los resultados de la prueba de adherencia deBifidobacterium breve207-1 se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Resultados de la prueba de adherencia
N.° N.° de cepa Cepa Valor DO590 (*±S)
1 207-1B. breve0,648 ± 0,001
2 LGGL. rhamnosus0,609 ± 0,018
3 Bb-12B. animalis0,696 ± 0,021
4 Control de blanco-0,089 ± 0,003
La mucina es el componente principal de las células epiteliales intestinales que producen una gran cantidad de moco. El moco puede proteger las células de la mucosa intestinal del contacto con microorganismos patógenos, evitar que las bacterias patógenas invadan las células epiteliales, protegiendo así la función normal de las células epiteliales. Los estudios han demostrado que los probióticos pueden inducir a las células epiteliales intestinales a secretar mucina que forma una biopelícula en la superficie de la mucosa intestinal al ocupar los puntos de unión de la mucosa intestinal, evitando que bacterias extrañas se adhieran a la mucosa intestinal. La cadena de oligosacáridos de la mucina contiene una gran cantidad de sitios específicos que se unen a varios probióticos, especialmente el epítopo al final de la cadena de sacáridos también puede detectar e identificar la flora de los probióticos intestinales y ayudar a la colonización de los probióticos intestinales.
Los resultados de este experimento demostraron queBifidobacterium breve207-1 tenía una capacidad de unión a la mucina similar en comparación con las cepas comercialesBifidobacterium animalisBB12 yLactobacillus rhamnosusLGG. Por tanto, el solicitante cree queBifidobacterium breve207-1 puede adherirse eficazmente a la mucosa intestinal y tiene una excelente capacidad de colonización. Basándose en esto, ocupa la superficie de la mucosa intestinal, forma una barrera probiótica, inhibe la colonización e invasión de bacterias dañinas, regulando de este modo eficazmente la flora intestinal y protegiendo la función inmunitaria normal de las células inmunitarias intestinales.
Ejemplo 3. Propiedades inmunitarias deBifidobacterium breve207-1 mediante un experimento celular
1. Método experimental
Se cultivaron macrófagos de ratón RAW264.7 (5x105/ml), la suspensión deBifidobacterium breve207-1 se ajustó para tener una concentración de 109 UFC/ml, se diluyó 10 veces y se co-cultivó con células y se utilizó como grupo experimental; se utilizó PGN como control positivo (PGN era peptidoglicano de bacterias grampositivas y era la sustancia principal de las bacterias grampositivas que estimulaba e inducía la inflamación de las células inmunitarias del hospedador, de modo que se usó como control positivo para este experimento), se utilizaron Bb-12 y LGG como cepas de control comerciales, se utilizó medio RPMI1640 como control en blanco, se configuraron tres muestras paralelas para cada grupo. Después de 24 horas de co-cultivo, se recogió el sobrenadante celular y se determinaron los niveles de secreción de las proteínas de expresión de citocinas como se muestra en la Tabla 4 mediante el método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). ElBifidobacterium breve207-1 también se utilizó para estimular macrófagos humanos THP-1 mediante el mismo método y se observó su efecto inmunomodulador en células humanas.2. Resultados experimentales y análisis de macrófagos de ratón RAW264.7
2.1 Resultados y análisis del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
Los resultados del experimento ELISA del co-cultivo deBifidobacterium breve207-1 y macrófagos de ratón RAW264.7 se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Resultados de la prueba ELISA (media ± desviación estándar)
Nivel de expresión de citocinas (pg/ml)
N.° de cepa Cepa
IL-6 IL-10 TNF-a 207-1B. breve619,02 ± 13,83 1554,61 ± 305,37 4731,00 ± 173,31 Bb-12B. animal307,44 ±65,03 931,44 ±299,42 9887,97 ± 596,94 LGGL. rhamnosus44,93 ± 39,48 92,07 ± 19,01 8097,62 ± 1006,08 PGN-1005,75 ± 38,74 985,22 ± 130,50 7850,80 ±467,76 Grupo de control-153,39 ±20,75 450,99 ± 135,83 107,29 ± 58,44
Los resultados demostraron que, en comparación con el grupo de control,Bifidobacterium breve207-1 pudo estimular el aumento de los niveles de expresión de los genes de las citocinas IL-6, IL-10 y TNF-a, e indujeron la activación de macrófagos. Concretamente, los resultados del ELISA mostraron que después de la estimulación conBifidobacterium breve207-1, el nivel del factor antiinflamatorio IL-10 aumentó significativamente, especialmente significativamente más alto que en el grupo de Bb-12, LGG, PGN y el grupo control. ElBifidobacterium breve207-1 pudo estimular a los macrófagos para secretar una gran cantidad de citocina antiinflamatoria IL-10, lo que sugiere que esteBifidobacteriumtiene una potencial actividad antiinflamatoria y puede aliviar la inflamación y mejorar las enfermedades inflamatorias.
3. Resultados experimentales y análisis de macrófagos humanos THP-1
Los resultados del experimento ELISA para el co-cultivo deBifidobacterium breve207-1 y macrófagos humanos THP-1 se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados de ELISA para THP-1 (media ± desviación estándar)
Nivel de expresión de citocinas (pg/ml)
N.° de cepa Cepa
IL-6 IL-10 TNF-a 207-1B. breve247,24 ± 14,00 211,16 ± 11,46 1162,38 ± 102,36 PGN-19,97 ± 0,67 14,77 ± 1,26 297,185 ±24,65 Grupo de control-0,34 ± 0,11 0,24 ± 0,33 6,57 ± 1,59
Se puede ver a partir de los resultados de la Tabla 5 queBifidobacterium breve207-1 presentaba el mismo efecto inmunológico en macrófagos humanos que en células animales, y su efecto de activación fue significativamente mayor que el del control positivo PGN. Se puede ver en los dos experimentos anteriores queBifidobacterium breve207-1 tiene un importante efecto inmunológico al estimular la respuesta inmunitaria de los macrófagos y hacer que secreten la citocina antiinflamatoria IL-10.
Ejemplo 4. Prueba de capacidad inmunomoduladora deBifidobacterium breve207-1
1. Método experimental:
Se seleccionaron un total de 18 ratones BALB/C, machos, de 6 semanas de edad, peso 18-20 g. Se dividieron en 3 grupos, que incluyen: 6 animales en el grupo de control, 6 animales en el grupo de control de intervención de la cepa probiótica comercial LGG, que se había demostrado que tenía la capacidad inmunomoduladora más significativa en ensayos clínicos y con animales, y 6 animales en el grupo de control de intervención deBifidobacterium breve207-1. Los animales del grupo de control recibieron 0,2 ml de solución salina normal por día, y los animales de los grupos de intervención con probióticos recibieron 0,2 ml de solución bacteriana por día (el contenido bacteriano fue de 109ufc). Los animales de cada grupo fueron criados durante 4 semanas y luego sacrificados.
Recogida de muestras: El día antes del inicio del experimento de alimentación por sonda nasogástrica, se pesaron todos los ratones y se recogieron sus heces. El día 14 del experimento, se pesaron todos los ratones y se recogieron sus heces. El día 28 del experimento, se pesaron todos los ratones y se recogieron sus heces, luego se sacrificaron y sus órganos (bazo, pulmón, timo, hígado) fueron recogidos y pesados.
Medición de indicadores: los coeficientes de los órganos del bazo y el timo se determinaron mediante el método de pesaje; la expresión de genes de citocinas en el tejido del bazo se determinó mediante el método RT-PCR.
2. Resultados experimentales:
No hubo diferencias significativas en el peso corporal en cada grupo antes y después de la intervención, lo que indica queBifidobacterium breve207-1 no tuvo ningún efecto adverso sobre el desarrollo normal de los ratones. No hubo diferencias significativas en el coeficiente del bazo y el coeficiente del timo entre los grupos, lo que indica que la acción del efecto inmunomodulador de los probióticos no afectaría a la función normal de los órganos. Como se muestra en la Tabla 6, los experimentos con animales demostraron queBifidobacterium breve207-1 activó macrófagos y estimuló la secreción de varias citocinas relacionadas. IL-10 era una citocina reguladora negativa multifuncional; la secreción promovida de una gran cantidad de factor antiinflamatorio IL-10 cuando el probiótico activó respuestas proinflamatorias (producción de IL-6 y TNF-a) indicaba queBifidobacterium breve207-1 podría equilibrar las respuestas inflamatorias y mantener la homeostasis de la inmunidad celular. La capacidad deBifidobacterium breve207-1 para activar macrófagos para secretar citocinas es mayor que la de la cepa comercial LGG (Tabla 6). Los resultados de los experimentos con animales coincidieron con los resultados de los experimentos con células.
Tabla 6. Nivel de expresión relativa del ARNm de citocinas en el bazo Grupo IL-10 IL-6 IL-12 TNF-a
Grupo de control 1,15 ± 0,28 1,19 ± 0,55 1,18 ± 0,62 0,99 ± 0,47
Grupo 207-1 1,36 ± 0,49 1,23 ± 0,45 2,00 ± 0,88 2,12 ± 0,87
Grupo LGG 0,47 ± 0,14 0,87 ± 0,3 0,35 ±0,11 0,32 ± 0,11
Ejemplo 5. Prueba de inhibición porBifidobacterium breve207-1 de la reacción alérgica
1. Método experimental:
En este experimento, se utilizó ovoalbúmina (OVA) para establecer un modelo de hipersensibilidad a IgE en suero de ratón. La cepa probiótica comercial LGG, que había demostrado tener una capacidad significativa para inhibir reacciones alérgicas en ensayos clínicos y con animales, se utilizó como control para estudiar el efecto deBifidobacterium breve207-1 sobre la inhibición de reacciones alérgicas.
Agrupaciones del experimento: se seleccionó un total de 60 ratones BALB/C machos, de 6 semanas de edad, 18-20 g, y se agruparon como se muestra en la Tabla 7:
Tabla 7. A ru ación de animales de ex erimentación
Intervención: El reactivo OVA fue 40 ug de OVA 0,2 ml de adyuvante Al(OH)<3>(la dosis absoluta fue de 4 mg de Al(OH)<3>). La dosis absoluta del grupo de probióticos fue de 109 UFC y el volumen de alimentación por sonda nasogástrica fue de 0,2 ml/animal/día. Después de alimentación durante 42 días, se realizaron 4 intervenciones de inyección intraperitoneal de OVA el día 7, día 21, día 28 y día 35, respectivamente.
Recogida y detección de muestras: Los animales se sacrificaron el día 42 y se determinaron los contenidos de IgE en suero y la expresión de citocinas del bazo.
2. Resultados experimentales:
La IgE es el principal mediador de la hipersensibilidad de tipo I, y la hipersensibilidad de tipo I es el principal mecanismo fisiológico de la mayoría de las enfermedades alérgicas. Los resultados mostraron queBifidobacterium breve207-1 podría reducir el nivel de IgE sérica en un modelo de ratón alérgico, inhibir las reacciones alérgicas mediadas por IgE y aliviar las enfermedades alérgicas (Fig. 3). Este experimento también demostró que la capacidad deBifidobacterium breve207-1 para reducir la IgE sérica fue mayor que la de la cepa comercial LGG.
Los resultados de la detección de citocinas del bazo mostraron queBifidobacterium breve207-1 aumentó significativamente la expresión del factor antiinflamatorio IL-10 en el bazo (Tabla 8). Hay datos que apuntan a que la IL-10 puede participar en la regulación de TH1 y TH2. Basándose en el análisis de los resultados anteriores, se cree que los probióticos de la presente solicitud pueden inducir la expresión de IL-10, inhibiendo de este modo la actividad de los linfocitos TH1 y TH2 y regulando a la baja el nivel de respuesta inmunitaria del cuerpo, responsable de las reacciones alérgicas.
Tabla 8. Nivel de expresión relativa del ARNm de la citocina IL-10 en el bazo
Nivel de expresión relativa de ARNm
Grupo IL-10
Grupo de control en blanco 1,69 ± 0,95
Grupo de modelo OVA 1,03 ± 0,32
Grupo 207-1 OVA 4,65 ± 0,88
Grupo LGG OVA 1,84 ± 0,89

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. UnBifidobacterium breveo progenie del mismo, en el que elBifidobacterium breveestá depositado en el Centro de Colección de Cultivos Microbianos de Guangdong y tiene un número de registro de GDMCC N.° 60962.
2. Una composición, que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo de acuerdo con la reivindicación 1; y la composición opcionalmente comprende además un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacteria, hongo, o cualquier combinación de los mismos.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por uno o más de los siguientes:
(1) el microorganismo es un probiótico;
(2) la bacteria se selecciona del grupo que consiste enLactobacillusspp.,Bifidobacteriumspp.,Bacillusspp.,Propionibacteriumspp.,Streptococcusspp.,Lactococcusspp.,Pediococcusspp.,Enterococcusspp.,Staphylococcusspp., o cualquier combinación de los mismos; y
(3) el hongo es una levadura.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada por uno o más de los siguientes:
(1) la bacteria deLactobacillusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus iners, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius,o cualquier combinación de los mismos;
(2) la bacteria deBifidobacteriumspp. se selecciona del grupo que consiste en:Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis,o cualquier combinación de los mismos;
(3) la bacteria deBacillusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Bacillus subtilis, Bacillus coagulans,o cualquier combinación de los mismos;
(4) la bacteria dePropionibacteriumspp. se selecciona del grupo que consiste en:Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acidipropionici,o cualquier combinación de los mismos;
(5) la bacteria deStreptococcusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Streptococcus thermophilus, Streptococcus salivarius,o cualquier combinación de los mismos;
(6) la bacteria deLactococcusspp. esLactococcus lactis;
(7) la bacteria deEnterococcusspp. se selecciona del grupo que consiste en:Enterococcus faecalis, Enterococcus faeciumo cualquier combinación de los mismos; y
(8) la levadura se selecciona del grupo que consiste enSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces houlardii, Kluyveromyces marxianuso cualquier combinación de los mismos.
5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada por uno o más de los siguientes:
(1) la composición comprende además un aditivo adicional;
(2) la composición comprende además un nutriente;
(3) la composición comprende además fibra dietética, prebiótico, proteína, lípido, mineral, vitamina, ingrediente vegetal (p. ej., extracto y polifenol), o cualquier combinación de los mismos;
(4) la composición se utiliza como cultivo iniciador;
(5) la composición se utiliza como cultivo iniciador para productos vegetales fermentados o como cultivo iniciador para productos lácteos;
(6) elBifidobacterium breveen la composición se utiliza como cultivo iniciador para participar en un proceso de fermentación;
(7) elBifidobacterium breveestá presente en la composición en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis; y
(8) elBifidobacterium breveestá presente en la composición en una cantidad de 1078 *a 1012 UFC/dosis.
6. Un producto alimenticio o suplemento dietético, que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
7. El producto alimenticio o complemento dietético de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por uno o más de los siguientes:
(1) el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en bebida sólida, caramelo o zumo de fruta, o el producto alimenticio es un producto lácteo (p. ej., yogur, leche fermentada aromatizada, bebida de bacterias lácticas, queso);
(2) el suplemento dietético está formulado para administración oral;
(3) el suplemento dietético está en forma de pastilla, polvo, cápsula, comprimido, gránulo, polvo, opérculo, gránulo de disolución oral, sobre, gragea o líquido;
(4) elBifidobacterium breveen el producto alimenticio o suplemento dietético está presente en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis; y
(5) elBifidobacterium breveen el producto alimenticio o suplemento dietético está presente en una cantidad de 108 a 1012 UFC/dosis.
8. Una composición farmacéutica, que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo de acuerdo con la reivindicación 1; y, opcionalmente, comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por uno o más de los siguientes: (1) la composición farmacéutica comprende una formulación delBifidobacterium breve;
(2) la composición farmacéutica se formula para administración oral;
(3) la composición farmacéutica está en forma de pastilla, polvo, cápsula, comprimido, gránulo, polvo, opérculo, gránulo de disolución oral, sobre, gragea o líquido;
(4) elBifidobacterium breveen la composición farmacéutica está presente en una cantidad de 106 a 1012 UFC/dosis; y
(5) elBifidobacterium breveen la composición farmacéutica está presente en una cantidad de 108 a 1012 UFC/dosis.
10. Un cultivo, que comprende elBifidobacterium breveo progenie del mismo de acuerdo con la reivindicación 1; y, opcionalmente, comprende un ingrediente que proporciona nutrientes.
11. El cultivo de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por uno o más de los siguientes:
(1) el cultivo comprende además un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacteria, hongo, o cualquier combinación de los mismos;
(2) el cultivo comprende además una levadura;
(3) el ingrediente que proporciona nutrientes se selecciona del grupo que consiste en medio sólido o líquido, capa de células alimentadoras, o cualquier combinación de los mismos;
(4) el ingrediente que proporciona nutrientes comprende proteína, hidrato de carbono, grasa, probiótico, enzima, vitamina, inmunomodulador, sustituto de la leche, mineral, aminoácido, o cualquier combinación de los mismos; (5) el ingrediente que proporciona nutrientes comprende además un filtrado de cultivo sin células delBifidobacterium breveo progenie del mismo;
(6) el cultivo comprende además un derivado delBifidobacterium breveo progenie del mismo; preferentemente, el derivado se selecciona del grupo que consiste en metabolito, enzima, componente estructural celular, polisacárido extracelular, bacteriocina, compuesto que contiene componente inmunogénico, o cualquier combinación de los mismos;
(7) el cultivo comprende además una pared celular o componente de la misma delBifidobacterium breveo progenie del mismo; y
(8) el microorganismo está vivo o muerto, como lisado o extracto, o como producto bacteriano, o como sobrenadante.
12. ElBifidobacterium breveo progenie del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 o el cultivo de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, para usar para inhibir la inflamación o aliviar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, o para usar para mejorar la inmunidad de un sujeto, o para usar para prevenir una infección bacteriana o viral o una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, o para usar para mejorar o aliviar una reacción alérgica o síntoma de la misma en un sujeto, o para usar para promover la activación de una célula inmunitaria en un sujeto, o para usar para promover la producción de una citocina en un sujeto.
13. ElBifidobacterium breveo progenie del mismo o la composición o la composición farmacéutica o el cultivo para usar de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por uno o más de los siguientes:
(1) la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad causada por inflamación de la retina, una enfermedad causada por inflamación de la piel, una enfermedad causada por inflamación de las vías respiratorias y una enfermedad causada por inflamación del tubo digestivo;
(2) la infección bacteriana o viral se selecciona del grupo que consiste en gripe bacteriana, gripe viral, infección del tracto urinario, vaginitis y cervicitis;
(3) la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, diabetes, artritis reumatoide y encefalitis autoinmunitaria;
(4) la reacción alérgica o síntoma relacionado con la misma se selecciona del grupo que consiste en eccema, dermatitis atópica, asma y alergia alimentaria;
(5) la reacción alérgica es una reacción alérgica mediada por IgE;
(6) elBifidobacterium breveo progenie del mismo o la composición o la composición farmacéutica o el cultivo se utiliza solo o en combinación adicionalmente con un agente antifúngico, analgésico, fármaco antiinflamatorio, agente cicatrizante o humectante;
(7) el sujeto es un mamífero;
(8) el sujeto es un ser humano;
(9) la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-10, IL-6, IL-12, TNF-a, o cualquier combinación de los mismos; y
(10) la citocina es una citocina antiinflamatoria IL-10.
14. ElBifidobacterium breveo progenie del mismo o la composición o la composición farmacéutica o el cultivo para usar de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por uno o más de los siguientes:
(1) la enfermedad causada por la inflamación de la retina es retinitis o queratitis;
(2) la enfermedad causada por la inflamación de la piel es dermatitis o eccema;
(3) la enfermedad causada por la inflamación de las vías respiratorias es una infección de las vías respiratorias superiores; y
(4) la enfermedad causada por la inflamación del tubo digestivo es enfermedad inflamatoria intestinal.
15. Uso delBifidobacterium breveo progenie del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5 o el cultivo de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 en la fabricación de un cultivo iniciador, en el que el cultivo iniciador se utiliza en la fermentación de un alimento sólido (p. ej., queso) o un alimento líquido (p. ej., yogur, leche fermentada aromatizada, bebidas con bacterias lácticas).
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