ES2708697T3 - Compuesto de indocianina, método de síntesis del mismo, método de purificación del mismo, composición diagnóstica utilizando el compuesto de indocianina y dispositivo para medición in vivo de la cinética y dispositivo para la circulación de visualización usando la composición diagnóstica - Google Patents

Compuesto de indocianina, método de síntesis del mismo, método de purificación del mismo, composición diagnóstica utilizando el compuesto de indocianina y dispositivo para medición in vivo de la cinética y dispositivo para la circulación de visualización usando la composición diagnóstica Download PDF

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Tetsuya Arai
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Nagoya University NUC
Mie University NUC
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Abstract

Un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la siguiente fórmula química 11 o un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina en el cual al menos una parte de un grupo naftilo de una indocianina está incluido en una cavidad de una ciclodextrina, representada por la siguiente fórmula química 12:**Fórmula** en donde s es un número entero de 0 o más y 4 o menos; y R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo arilo, un átomo de halógeno, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo sulfonilo, un grupo ácido sulfónico, un grupo alquiloxicarbonilo, un grupo ariloxicarbonilo, un grupo alquilcarbonilo, un grupo arilcarbonilo o un anillo heterocíclico;**Fórmula** en donde s es un número entero de 0 o más y 4 o menos; y R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo arilo, un átomo de halógeno, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo sulfonilo, un grupo ácido sulfónico, un grupo alquiloxicarbonilo, un grupo ariloxicarbonilo, un grupo alquilcarbonilo, un grupo arilcarbonilo o un anillo heterocíclico.

Description

DESCRIPCION
Compuesto de indocianina, metodo de smtesis del mismo, metodo de purificacion del mismo, composicion diagnostica utilizando el compuesto de indocianina y dispositivo para medicion in vivo de la cinetica y dispositivo para la circulacion de visualizacion usando la composicion diagnostica
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un compuesto de indocianina como se define en las reivindicaciones, que es un pigmento verde util para tecnologfas de diagnostico medico, tecnologfas quirurgicas medicas, tecnologfas de analisis y medicion cientffica, tecnolog^as de impresion, tecnolog^as de escritura, tecnolog^as de recubrimiento, tecnologfas de colorantes y tecnologfas de tincion y tiene una propiedad capaz de emitir fluorescencia en el infrarrojo cercano, un metodo de smtesis y un metodo de purificacion de los mismos, y una composicion de diagnostico. Mas particularmente, la presente invencion se relaciona con un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de cadena de azucar dclica que es un pigmento verde y tiene una propiedad capaz de emitir fluorescencia en el infrarrojo cercano, un metodo de smtesis y un metodo de purificacion del mismo, y una composicion de diagnostico que usa el compuesto de indocianina.
Antecedentes de la invencion
Hasta ahora se han sintetizado compuestos de indocianina que son pigmentos verdes y emiten fluorescencia en el infrarrojo cercano, y tienen varias aplicaciones, como pigmentos para tenir utilizados en cirugfas del cuerpo vttreo del ojo, pigmentos usados en medicamentos para probar las funciones hepaticas, pigmentos usados en medicamentos para probar las funciones circulatorias, pigmentos utilizados para operaciones quirurgicas y compuestos fluorescentes en el infrarrojo cercano utilizados para operaciones quirurgicas en campos medicos; tincion de protemas o azucares y compuestos para la generacion de fluorescencia en campos cientfficos; y pigmentos para tecnologfas de impresion. De estos compuestos de indocianina, un compuesto que se llama verde de indocianina (en lo sucesivo denominado "ICG") se ha utilizado durante casi 50 anos como medicamento para probar las funciones hepaticas o las funciones circulatorias. El ICG se ha utilizado recientemente para operaciones medicas o diagnosticos medicos, utilizando su propiedad de alta permeabilidad a la luz de un tejido biologico, mediante la administracion topica de ICG a un cuerpo tal como un vaso sangumeo, un vaso linfatico, un cerebro, un ojo, un estomago, una mama y un esofago, piel u otro sitio y observando la fluorescencia infrarroja cercana de ICG, que aun es una prueba, como la aplicacion de ICG que no sean los medicamentos para evaluar las funciones hepaticas o la funcion circulatoria (Documento no Patente 1).
Documentos tecnicos del arte anterior
Documento no Patente
Documento no Patente 1: " All of ICG fluorescence Navigation Surgery", supervised and edited by Mitsuo Kusano, Intermedica Co., Ltd, (publicada en noviembre de 2008).
Documento no Patente 2: URL (https://www.daiichisankyo.co.jp/med/contents/di/dg2/pi/pdf /pi_dg2_0909.pdf) de la pagina principal de Internet en la que se adjunta un documento adjunto a "(marca registrada) Diagnogreen for injection 25mg* "(Daiichi Sankyo Company, Limited).
Documento no Patente 3: R. C. Benson, H. A. Kues, Phys. Med. Biol., 23, 159-163 (1978).
Documento no Patente 4: S. Yoneyama, T. Saito, Y. Komatsu, I. Koyama, K. Takahashi, J. Duvoll-Young, IOVS, 37, 1286-1290 (1998).
Documento no Patente 5: Y. Ye, W. P. Li, C. J. Anderson, J. Kao, G. V. Nikiforovich, S. Achilefu, J. Am. Chem. Soc., 125, 7766-7767 (2003).
Documento no Patente 6: K. Teranishi and S. Tanabe, ITELetters on Batteries, New Technologies & Medicine, 1, 53­ 60 (2000).
Documento no Patente 7: MICHAEL O'SHAUGHNESSY et al: 1994 Wiley-Liss, Inc MICROSURGERY 15: 40 S 412 1994.
Documento no Patente 8: RALPH J. P. M et al: 1997 Wiley-Liss, Inc. MICROSURGERY 17: 402-4081996.
Documentos de Patente
El documento WO9849176 (A1) se refiere a reactivos de marcacion fluorescentes glicoconjugados solubles en agua que comprenden un colorante fluorescente, uno o mas residuos de azucar o carbohidratos que imparten solubilidad en agua, y un grupo reactivo que permite la union covalente del reactivo a un sustrato.
El documento WO2007025768 (A1) se refiere a nanoparffculas que tienen actividad opticamente fluorescente, mas espedficamente una matriz de nanoparffculas que comprende un coagregado de al menos un polielectrolito cargado y al menos un agente activo con carga opuesta, en donde el agente activo es un agente fluorescente opticamente hidrofilo.
Resumen de la invencion
Problemas para resolver mediante la invencion
Un cromoforo verde (una estructura qrnmica necesaria para exhibir verde) y un fluoroforo en el infrarrojo cercano (una estructura qrnmica necesaria para exhibir fluorescencia en el infrarrojo cercano) de ICG, son, sin embargo, hidrofobos y, por lo tanto, los grupos sulfonilo estan unidos al extremo de la cadena lateral para hacerlos solubles en agua. Esto genera muchos problemas descritos a continuacion para el ICG convencional.
Cuando se usa la preparacion de ICG en aplicaciones medicas, generalmente se agrega agua destilada a 25 mg de ICG en una cantidad de aproximadamente 5 mL a 10 mL, y el ICG se disuelve por agitacion por vibracion. Si el ICG no esta completamente disuelto, a veces puede ocurrir vomito, nausea, fiebre o un smtoma similar a un choque (Documento no Patente 2). Ademas, es imposible disolverlo inicialmente en otra solucion acuosa como solucion salina fisiologica debido a la insolubilizacion (Documento no Patente 2).
El ICG es soluble en agua porque los grupos sulfonilo estan unidos al mismo, como se describio anteriormente, pero tiene una actividad superficial debido a su estructura qrnmica en la que hay muchos grupos hidrocarburo hidrofobos, y por lo tanto tiene una propiedad de adsorcion a los lfpidos. Cuando se administra a un tejido biologico, como un vaso sangumeo o un organo, en consecuencia, se adhiere al sitio inyectado, se filtra por error o fluye hacia atras, por lo que a veces se puede adherir a un tejido biologico no deseado. El ICG que se adhiere al tejido biologico no puede eliminarse facilmente del tejido biologico limpiandolo o succionando, lo que da lugar a una posibilidad en la que haya interferencia en una operacion quirurgica o un diagnostico medico.
El ICG tiene una propiedad de ensamblar moleculas en una solucion acuosa. El ICG, por lo tanto, tiene una intensidad de fluorescencia baja en una solucion acuosa, aunque la propiedad es uno de los factores principales (Documentos No Patente 3 y 4).
Ademas, el ICG se torna insolubilizado a medida que el tiempo avanza despues de que se disuelve en agua y, por lo tanto, es diffcil almacenarlo en el estado de una solucion acuosa a largo plazo. Ademas, a baja temperatura, su conservacion por congelacion promueve la insolubilizacion.
La preparacion de ICG incluye 5% o menos de NaI, y tiene un defecto en donde puede causar hipersensibilidad al yodo (Documento no Patente 2).
Cuando se inyecta ICG por via intravenosa, se acumula rapidamente en el hffgado y se excreta a traves del hffgado y, por lo tanto, la generacion de imagenes de fluorescencia de otro organo como rinon, ureter, vejiga, uretra, corazon o pulmon es diffcil.
Ademas, cuando se inyecta ICG por via intravenosa, se transfiere con la sangre y se transfiere un poco a los tejidos perifericos, y, por consiguiente, es diffcil observar la transferencia a un tejido intersticial.
El objetivo de la presente invencion es resolver los problemas del ICG convencional descrito anteriormente; en otras palabras, el objetivo de la presente invencion es proporcionar un compuesto de indocianina novedoso que sea un pigmento verde y presente fluorescencia en el infrarrojo cercano, caracterizado por una alta solubilidad en agua o solucion salina fisiologica, extraccion facil de un tejido biologico, una asociacion baja de molecula en una solucion acuosa, una intensidad de fluorescencia en el infrarrojo cercano alta en una solucion acuosa y una generacion de imagenes de fluorescencia de un organo distinto al hffgado, como rinon, ureter, vejiga, uretra, corazon o pulmon. La presente invencion proporciona ademas un metodo de smtesis qrnmica y un metodo de purificacion del nuevo compuesto de indocianina que tiene las caracteffsticas descritas anteriormente. Proporcionar una composicion de diagnostico que incluya el nuevo compuesto de indocianina tambien es un problema para resolver mediante la invencion.
Medios para resolver el problema
Los presentes inventores han repetido estudios minuciosos para resolver los problemas descritos anteriormente; como resultado, han encontrado un compuesto que exhibe fluorescencia en el infrarrojo cercano, que se puede usar en una operacion quirurgica o diagnostico medico que utiliza la propiedad de exhibir fluorescencia en el infrarrojo cercano, y han resuelto los problemas del ICG descritos anteriormente.
Los presentes inventores han encontrado una nueva indocianina como se define en las reivindicaciones, que es un pigmento verde caracterizado por una alta solubilidad en agua o solucion salina fisiologica, facil eliminacion de un tejido biologico, una baja asociacion de moleculas en una solucion acuosa, una alta Intensidad de fluorescencia en el infrarrojo cercano en una solucion acuosa y exposicion de fluorescencia en el infrarrojo cercano; y han completado la presente invencion. Ademas, han encontrado un metodo de smtesis qmmica y un metodo de purificacion del nuevo compuesto de indocianina, y han completado la presente invencion. Ademas, han proporcionado una composicion de diagnostico que incluye el nuevo compuesto de indocianina. Ademas, han proporcionado un metodo para obtener imagenes de fluorescencia de un organo distinto al tngado, incluso en administracion intravenosa, utilizando la composicion de diagnostico. Ademas, han proporcionado un metodo para evaluar la biocinetica del nuevo compuesto de indocianina, en relacion con un equilibrio horizontal en un cuerpo vivo y un dispositivo para medir la biocinetica, y un metodo y un dispositivo para visualizar la circulacion de la sangre, el fluido linfatico, la orina u otro fluido en un cuerpo vivo.
La invencion se define por las reivindicaciones. Cualquier asunto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Un primer compuesto de indocianina novedoso de la presente invencion es un compuesto en donde una ciclodextrina de cadena de azucar ciclica esta unida covalentemente a un cromoforo verde (una estructura qmmica necesaria para exhibir verde) y un fluoroforo en el infrarrojo cercano (una estructura qmmica necesaria para exhibir cerca fluorescencia infrarroja) del ICG. Ademas, un segundo nuevo compuesto de indocianina de la invencion es un nuevo compuesto de indocianina que se caracteriza porque una unidad estructural naftilo que es una unidad estructural hidrofoba de una estructura de indocianina esta incluido en una cavidad de una ciclodextrina para cubrir una unidad estructural naftilo que es una unidad estructural hidrofoba con un grupo de glucosa hidrofila, hidratando de este modo tridimensionalmente muchas regiones de la estructura de la molecula de indocianina. El ICG se caracteriza por tener una propiedad tipo tensioactivo en la que tiene tanto unidades estructurales hidrofobas como propiedades hidrofilas causadas por grupos sulfonilo; mientras que, el compuesto de la invencion se caracteriza por no tener propiedades de tipo tensioactivo porque las unidades estructurales hidrofobas en su molecula estan cubiertas con las ciclodextrinas. Mas detalladamente, las presentes invenciones son:
<1> Un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la siguiente formula qmmica 11 o un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina en el cual al menos una parte de un grupo naftilo de una indocianina esta incluido en una cavidad de una ciclodextrina, representada por la siguiente formula qmmica 12:
[Formula Qmmica 11]
en donde s es un numero entero de 0 o mas y 4 o menos; y R es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo, un grupo arilo, un atomo de halogeno, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo sulfonilo, un grupo acido sulfonico, un grupo alquiloxicarbonilo, un grupo ariloxicarbonilo, un grupo alquilcarbonilo, un grupo arilcarbonilo o un anillo heterodclico;
[Formula Qmmica 12]
Figure imgf000005_0001
en donde s es un numero entero de 0 o mas y 4 o menos; y R es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo, un grupo arilo, un atomo de halogeno, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo sulfonilo, un grupo acido sulfonico, un grupo alquiloxicarbonilo, un grupo ariloxicarbonilo, un grupo alquilcarbonilo, un grupo arilcarbonilo o un anillo heterodclico.
<2> El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina segun el item <1>, que es un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la siguiente formula qmmica 15 o 19:
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000006_0001
o que es un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina en el cual al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina esta incluido en una cavidad de una ciclodextrina, representada por la siguiente formula qmmica 16 o 20:
Figure imgf000006_0002
<3> El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina segun el item <2>, que esta representado por la formula qmmica 19 o 20.
<4> El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina segun el item <2>, que esta representado por la formula qmmica 15 o 16.
<5> Un metodo de smtesis qmmica del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la formula qmmica 15 o 19 de acuerdo con el item <2>, que incluye: (1) una etapa de mezclar un compuesto de acido indocianincarboxflico representado por la siguiente formula 13 o 18 con una aminociclodextrina representada por la siguiente formula 14 en un medio, y (2) una etapa de una reaccion de deshidratacion-condensacion de la mezcla mediante la adicion de un agente de deshidratacion-condensacion al mismo:
Figure imgf000007_0001
<6> Un metodo de smtesis qmmica del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la formula qmmica 16 o 20 segun el ttem <2>, que incluye un paso para someter el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la formula qmmica 15 o 19 a una reaccion de inclusion en agua.
<7> Un metodo de purificacion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con uno cualquiera de los puntos <1> a <4>, que incluye una etapa de purificacion del compuesto mediante una cromatograffa en columna eluyendo con un medio que incluye HCl.
<8> Una composicion de diagnostico que es una solucion acuosa que incluye el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con uno cualquiera de los items <1> a <4>, y se usa infundiendolo en un cuerpo.
<9> La composicion de diagnostico segun el item <8>, que no incluye sustancialmente yodo.
<10> Una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica
Figure imgf000007_0002
en la cual al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina esta incluido en una cavidad de una ciclodextrina, y preferiblemente una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 20, que tiene un valor ESI-MS m/z [M]+ correspondiente a una formula molecular C135H197N4O73, o
una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 20, purificada por el metodo de purificacion de acuerdo con el item <7>.
<11> Una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 16:
Figure imgf000008_0001
en la cual al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina esta incluido en una cavidad de una ciclodextrina, y preferiblemente una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 16, que tiene un valor ESI-MS m/z [M]+ correspondiente a una formula molecular C131H191N4O72, o
una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 16, purificada por el metodo de purificacion de acuerdo con el item <7>.
<12> Una composicion que comprende la indocianina unida a ciclodextrina solida de acuerdo con uno cualquiera de los ftems<10> y <11>.
<13>. Una composicion de diagnostico de acuerdo con uno cualquiera de los items <8> y <9>
para uso en operaciones medicas o diagnosticos medicos, en los cuales se observa la fluorescencia en el infrarrojo cercano emitida por la administracion de la composicion de diagnostico a un cuerpo, o,
para uso en operaciones medicas o diagnostico medico, en el cual se observa la fluorescencia en el infrarrojo cercano emitida por la administracion de la composicion de diagnostico en al menos uno de un vaso sangmneo, vaso linfatico, cerebro, ojo, estomago, mama, esofago, piel, rinon, ureter, vejiga, uretra, pulmon y corazon, o,
para uso en operaciones medicas o diagnosticos medicos, en donde las operaciones medicas o diagnosticos medicos brindan al menos una imagen visual, evaluacion de la circulacion cerebral, imagenes durante la cirugfa cerebral, identificacion de un ganglio linfatico centinela, evaluacion de linfedema, colangiograffa intraoperatoria, marcado del tumor, imagenes de la arteria coronaria y una imagen de un vaso sangmneo abdominal.
<14> La composicion diagnostica segun el item <13>, en donde la composicion diagnostica se usa para la visualizacion de una circulacion de sangre, lfquido linfatico, lfquido de tejido intersticial u orina.
<15> La composicion diagnostica segun el item <13>, en donde la composicion diagnostica se usa para imagenes de fluorescencia de rinon, ureter, vejiga o uretra.
Efecto de la invencion
Se puede proporcionar un compuesto a partir del compuesto de indocianina unido a la ciclodextrina de la presente invencion que es un pigmento verde y exhibe fluorescencia en el infrarrojo cercano caracterizado porque una solubilidad en agua o solucion salina fisiologica es mas alta que la de ICG, se puede eliminar facilmente desde un tejido biologico, una asociacion de moleculas es baja en una solucion acuosa, una intensidad de fluorescencia en el infrarrojo cercano es alta en una solucion acuosa, se pueden realizar imagenes de fluorescencia de otros organos ademas del tugado, y no incluye yodo. Ademas, el metodo de smtesis del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion puede proporcionar una smtesis util del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina. Ademas, el metodo de purificacion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion puede proporcionar una purificacion util del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina. Ademas, el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion muestra una solubilidad suficiente incluso si no incluye yodo, y, en consecuencia, puede proporcionar una composicion de diagnostico que no incluya yodo, el cual conduce a la hipersensibilidad al yodo. Esta composicion de diagnostico muestra un comportamiento biologico diferente de una composicion de diagnostico que incluye ICG convencional solo, y por lo tanto puede proporcionar varios dispositivos utiles que utilizan las propiedades.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados de las pruebas de adsorcion de ICG y el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 para la piel humana. Muestra un estado inmediatamente despues de la aplicacion de una solucion acuosa 1 mM (0.03 mL) que incluye ICG o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 en un brazo (fotograffa de la izquierda), un estado inmediatamente despues de lavarlo con agua 5 minutos mas tarde (fotograffa del medio) y un estado inmediatamente despues de frotarlo y lavarlo con agua (fotograffa de la derecha), donde un punto en el lado derecho es un marcador con un boffgrafo rojo.
La Figura 2 muestra los resultados de las pruebas de adsorcion de ICG y el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 en una fibra de celulosa. Muestra un estado inmediatamente despues de la aplicacion de una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 a un hisopo de algodon (una fotograffa superior), y un estado inmediatamente despues de 5 segundos de lavado con agua corriente despues de 3 minutos (una fotograffa inferior).
La Figura 3 muestra los resultados de las pruebas de adsorcion de ICG y el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 para un modelo de carne de un cuerpo vivo. Muestra un estado inmediatamente despues de la aplicacion de una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o el compuesto representado por la formula qmmica 20 a una parte de depresion con un diametro de 5 mm de una carne de lomo de cerdo (fotograffa de la izquierda), y un estado inmediatamente despues de 10 segundos de lavado con agua corriente despues de 3 minutos (fotograffa de la derecha).
La Figura 4 muestra los resultados de las pruebas de adsorcion de ICG y el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 a un modelo de protema de un cuerpo vivo. Muestra un estado inmediatamente despues de la aplicacion de una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 a una parte de depresion con un diametro de 5 mm de una carne de pechuga de pollo (fotograffa de la izquierda) y un estado inmediatamente despues de 10 segundos de lavado con agua corriente despues de 3 minutos (fotograffa de la derecha).
La Figura 5 muestra los resultados de las pruebas de adsorcion de ICG y el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 en una fibra qmmica hidrofoba. Muestra un estado inmediatamente despues de la aplicacion de una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 a una mascara de polipropileno (fotograffa de la izquierda), y un estado inmediatamente despues de un segundo lavado con agua corriente despues de 20 minutos (fotograffa de la derecha).
La Figura 6 muestra los resultados de las pruebas de asociacion de moleculas de ICG y el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20. El grafico a la izquierda muestra los resultados de ICG, y el grafico de la derecha muestra los resultados del compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20.
La Figura 7 es un grafico que muestra la dependencia de la concentracion de la intensidad de fluorescencia en la sangre venosa humana de ICG, el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20, y el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16.
La Figura 8 es una vista que muestra un estado de observacion cuando ICG, el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20, o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16 se administra a una rata.
La Figura 9 muestra vistas que muestran los estados de fluorescencia en una cavidad abdominal cuando el ICG, el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20, o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16 se administra a una rata.
La Figura 10 muestra las vistas obtenidas administrando una solucion acuosa 0.1 mM (0.075 mL) que incluye el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16 a una vena caudada de una rata Wistar macho (14 semanas de edad, 300 g), y tomando una imagen del mismo utilizando un sistema de observacion infrarrojo cercano PDE fabricado por Hamamatsu Photonics K.K. La de la izquierda es una imagen monocromatica a traves de luz visible, y a la derecha es una imagen de fluorescencia.
La Figura 11 muestra las vistas obtenidas al administrar una solucion acuosa 0.1 mM (0.075 mL) que incluye el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16 a una vena caudada de una rata Wistar macho (14 semanas de edad, 300 g), y tomar una imagen de la misma utilizando un endoscopio fluorescente en el infrarrojo cercano. La izquierda es una imagen monocroma a traves de la luz visible, y la derecha es una imagen de fluorescencia.
La Figura 12 muestra vistas de los estados de fluorescencia en una region dorsal del pie cuando se administra ICG, el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16 se administra a una rata.
La Figura 13 es una grafica que muestra cambios con el tiempo en la intensidad de fluorescencia en una region dorsal del pie cuando ICG, el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20, o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16 se administra a una rata.
La Figura 14 es una grafica que muestra cambios con el tiempo en la intensidad de fluorescencia en una region dorsal del pie cuando ICG, el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20, o el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16 se administra a una rata.
La Figura 15 es una ilustracion que muestra un procedimiento para observar directamente un vaso sangmneo de una rata.
La Figura 16 es una vista que muestra un area (colgajo de piel de cremaster) observada directamente en un vaso sangmneo de una rata.
La Figura 17 es una vista que muestra los estados de fluorescencia de un vaso sangmneo de una rata a la que se administra ICG y tejidos a su alrededor.
La Figura 18 es una vista que muestra los estados de fluorescencia de un vaso sangmneo de una rata a la que se administra el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 y los tejidos a su alrededor.
La Figura 19 es un grafico que muestra los volumenes de un pie izquierdo de una rata medidos inmediatamente despues de la administracion (postinyeccion) y una semana despues de la administracion (1 semana despues) en un grupo en el cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual la administracion no se realiza (normal) en grupos de experimentos que utilizan TK1, en donde el eje vertical muestra el volumen (mL).
La Figura 20 es un grafico que muestra los resultados de las pruebas de Von Frey de un pie izquierdo de una rata medidos inmediatamente despues de la administracion (postinyeccion) y una semana despues de la administracion (1 semana despues) en un grupo en cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual la administracion no se realiza (normal) en grupos de experimentos que usan TK1, en donde el eje vertical muestra una carga (g) cuando se obtiene una respuesta.
La Figura 21 es un grafico que muestra los cambios en la luminancia de la superficie del pie izquierdo despues de inyectar TK1 inmediatamente despues de la inyeccion de carragenina en un grupo en el cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual no se realiza la administracion (normal), donde el eje vertical muestra una luminancia (unidad arbitraria) y el eje horizontal muestra un tiempo (segundo).
La Figura 22 es una grafica que muestra los cambios en la luminancia de la superficie del pie izquierdo despues de inyectar TK1 una semana despues de la inyeccion de carragenina en un grupo en el cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual no se realiza la administracion (normal), donde el eje vertical muestra una luminancia (unidad arbitraria) y el eje horizontal muestra un tiempo (segundo).
La Figura 23 es una grafica que muestra los volumenes de un pie izquierdo de una rata medidos inmediatamente despues de la administracion (despues de la inyeccion) y una semana despues de la administradon (1 semana despues) en un grupo en el cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual la administracion no se realiza (normal) en grupos de experimentos que usan ICG, en donde el eje vertical muestra un volumen (mL).
La Figura 24 es una grafica que muestra los resultados de las pruebas de Von Frey de un pie izquierdo de una rata medidos inmediatamente despues de la administracion (post inyeccion) y una semana despues de la administracion (1 semana despues) en un grupo en el cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual la administracion no se realiza (normal) en grupos de experimentos que usan ICG, en donde el eje vertical muestra una carga (g) cuando se obtiene una respuesta.
La Figura 25 es una grafica que muestra los cambios en la luminancia de la superficie del pie izquierdo despues de inyectar ICG inmediatamente despues de la inyeccion de carragenina en un grupo en el cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual no se realiza la administracion (normal), donde el eje vertical muestra una luminancia (unidad arbitraria) y el eje horizontal muestra un tiempo (segundo).
La Figura 26 es un grafico que muestra los cambios en la luminancia de la superficie del pie izquierdo despues de inyectar ICG una semana despues de la inyeccion de carragenina en un grupo en el cual se realiza la administracion de carragenina (edema) y un grupo en el cual no se realiza la administracion (normal), donde el eje vertical muestra una luminancia (unidad arbitraria) y el eje horizontal muestra un tiempo (segundo).
Modo de realizacion de la invencion
La composicion de diagnostico de la presente invencion se puede usar en el diagnostico incluso si el yodo no se incluye empleando el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion descrito a continuacion como un pigmento. La composicion de diagnostico puede sustituirse por una composicion de diagnostico que incluye un verde de indocianina que se ha utilizado hasta ahora. La aplicacion del mismo puede incluir, por ejemplo, farmacos de prueba de funcion hepatica, farmacos de prueba de funcion circulatoria, y similares. Ademas, la composicion se puede aplicar a operaciones medicas y diagnosticos medicos en los cuales se observa fluorescencia en el infrarrojo cercano emitida por su administracion a un cuerpo tal como vaso sangumeo, vaso linfatico, cerebro, ojo, estomago, seno, esofago, piel, rinon, ureter, vejiga, uretra, pulmon, corazon u otra porcion. Se considera que el pigmento incluido en la composicion de diagnostico de la invencion tiene una baja propiedad de union a un cuerpo vivo, y puede marcar una unidad estructural necesaria durante un largo tiempo. La composicion de diagnostico puede incluir una sal como agente isotonizante y otros aditivos si es necesario. Se puede emplear una forma en la que los ingredientes se disuelven arbitrariamente, ademas de una forma que se prepara previamente en el estado de una solucion acuosa. Esta composicion de diagnostico puede administrarse por inyeccion, infusion, aplicacion o administracion oral.
Esta composicion de diagnostico puede usarse preferiblemente cuando se visualiza una circulacion de una solucion acuosa tal como sangre, fluido linfatico, fluido de tejido intersticial u orina. La visualizacion de la circulacion de la sangre se puede utilizar, por ejemplo, en una determinacion de necrosis mediante la evaluacion de una circulacion periferica, una evaluacion del compromiso del tejido despues de una revascularizacion o una operacion de trasplante, un diagnostico de insuficiencia de la circulacion sangumea o similares. Ademas, es aplicable a una imagen del ojo, una evaluacion de una circulacion cerebral, una imagen durante una operacion en una operacion quirurgica del cerebro, una identificacion de un ganglio linfatico centinela en un cancer (un cancer de mama, cancer de esofago, cancer de estomago, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de piel y similares), una evaluacion de linfedema, una colangiograffa intraoperatoria, una marca de tumor, una imagen coronaria, una imagen de un vaso sangumeo abdominal (arteria hepatica, aorta abdominal, flujo sangumeo del tracto digestivo, y similares), en estos archivos, la visualizacion se ha realizado hasta ahora. La composicion tambien permite una imagen de fluorescencia de un rinon y un sistema excretor como el rinon, el ureter, la vejiga o la uretra.
<1. Compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no inclusion y smtesis del mismo>
El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no inclusion de la presente invencion incluye la formula qrnmica 11, y un metodo de smtesis del mismo puede realizarse haciendo reaccionar un compuesto de indocianina con un compuesto de ciclodextrina en una solucion.
Dado que el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no inclusion de la presente invencion se forma uniendo covalentemente el compuesto de indocianina al compuesto de ciclodextrina a traves de un enlace amida, puede usarse un metodo de smtesis del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no inclusion, puede realizarse mediante una reaccion de deshidratacion-condensacion del compuesto de acido indocianincarbox^lico con el compuesto de aminociclodextrina en una solucion.
<2. Compuesto de indocianina unida a ciclodextrina tipo inclusion >
El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion es un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la formula qrnmica 12 en donde una indocianina esta unida covalentemente a una ciclodextrina de cadena de azucar dclica, que se caracteriza porque al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina esta incluido en una cavidad de la ciclodextrina.
Para incluir al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina en la cavidad de la ciclodextrina, la presente invencion utiliza un espaciador y la indocianina esta unida covalentemente a la ciclodextrina de cadena de azucar dclica a traves del espaciador. En este momento, al controlar la longitud del espaciador, es posible controlar el grado de inclusion del grupo naftilo de la indocianina en la cavidad de la ciclodextrina.
El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina que se caracteriza porque la indocianina se une covalentemente a la ciclodextrina de cadena de azucar dclica a traves del espaciador, y el grupo naftilo de la indocianina se incluye en la cavidad de la ciclodextrina, en consecuencia, es un compuesto de la formula qrnmica 12.
<3. Smtesis del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina tipo inclusion >
El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina tipo inclusion de la presente invencion es un compuesto como se describio anteriormente, y el metodo de smtesis del mismo puede realizarse disolviendo el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina tipo inclusion, que se sintetiza como se indico anteriormente y se utiliza como un precursor de smtesis, en una solucion acuosa. La solucion acuosa puede incluir cualquier material siempre que no impida la inclusion, y el contenido de agua no este particularmente limitado. La temperatura adecuada en la inclusion es de -20°C a 100°C, preferiblemente de 0°C a 50°C. El tiempo requerido para la inclusion es de aproximadamente un mes inmediatamente despues de la adicion a la solucion acuosa. Como se describio anteriormente, esta claro que la reaccion de inclusion puede tomar varios formatos dependiendo de la propiedad del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no-inclusion, la temperatura de la reaccion de inclusion, la composicion o la concentracion de la solucion acuosa, y similares.
El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no inclusion de la presente invencion se puede convertir en el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo inclusion disolviendolo en un medio que incluye agua. El contenido de agua en el medio no esta particularmente limitado, y es deseable que sea del 50% en peso o mas porque cuando el contenido es mas alto, la inclusion avanza facilmente en principio. Si hay un compuesto capaz de formar el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo inclusion en un medio distinto de la solucion acuosa, no es necesario realizar la inclusion utilizando la solucion acuosa.
El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo inclusion se puede formar en la etapa de la smtesis del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no-inclusion, y en tal caso, la reaccion de inclusion no se requiere de nuevo.
<4. Metodo de smtesis de indocianina unida a ciclodextrina de tipo no inclusion (Un ejemplo de smtesis)>
Se toma como ejemplo una smtesis del compuesto representado por la formula qrnmica 11. El compuesto de indocianina representado por la formula qrnmica 11 se puede obtener, por ejemplo, mezclando el compuesto representado por la formula qrnmica 13, que se sintetiza en un metodo descrito en el Documento no Patente 5, el compuesto representado por la formula qrnmica 14, que se sintetiza en un metodo descrito en el Documento no Patente 6, un agente de deshidratacion-condensacion como una carbodiimida soluble en agua (WSC: por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida clorhidrato) o diciclohexilcarbodiimida (DCC), y un medio tal como piridina, N,N-dimetilformamida o una solucion acuosa; y haciendo reaccionar la mezcla a una temperatura de -20°C a 60°C durante 10 minutos a 100 horas. Ademas, se puede agregar un activador como el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) para activar la reaccion. La cantidad del agente de deshidratacion-condensacion es 2 veces o mas moles que la del compuesto representado por la formula qrnmica 13, y la cantidad del medio utilizado no esta limitada siempre que los productos de reaccion se disuelvan y la reaccion de deshidratacion-condensacion no se vea obstaculizada. El activador no esta limitado siempre que active la reaccion de deshidratacion-condensacion, y la cantidad de adicion del mismo no este limitada mientras la reaccion de deshidratacion-condensacion avance como se espera.
[Formula Qmmica 13]
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<5. Metodo de purificacion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no inclusion>
Una mezcla que incluye el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no-inclusion sintetizado en el metodo descrito anteriormente se disuelve en una solucion acuosa acida, la solucion resultante se aplica a cromatograffa en columna de fase reversa, y la elucion de la misma se realiza usando, como eluyente, por ejemplo, cualquiera de una solucion mixta de agua y metanol que incluye un acido, una solucion mixta de agua y acetonitrilo que incluye un acido, una solucion mixta de agua y etanol que incluye un acido, y una solucion mixta de agua y acetona que incluye un acido, por lo que el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no-inclusion puede ser aislado y purificado con una alta pureza. El acido no esta limitado siempre que no descomponga el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no-inclusion, la elucion se puede realizar de manera efectiva y un tratamiento posterior se puede realizar facilmente despues de la elucion. Los ejemplos del mismo pueden incluir acido clorhndrico, acido trifluoroacetico, acido acetico, acido sulfurico, acido nftrico, acido formico y similares. Se prefieren acido clorhndrico, acido trifluoroacetico y acido acetico s, y el acido clorhfdrico es mas preferible. La concentracion del acido no esta limitada, siempre que no descomponga el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no-inclusion, la elucion se puede realizar de manera efectiva y se puede realizar facilmente un tratamiento posterior despues de la elucion. Es preferiblemente de 0.01 mM a 10 mM, mas preferiblemente de 0.1 mM a 1 mM. Cuando la concentracion se ajusta a este rango, el compuesto deseado no se descompone y se puede eluir rapidamente. El medio se elimina del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no inclusion que se eluye, por lo que se puede obtener en estado solido. El medio se puede eliminar mediante liofilizacion.
<6. Metodo de smtesis (un ejemplo de smtesis) y metodo de purificacion (un ejemplo de purificacion) del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina tipo inclusion>
El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de tipo no-inclusion representado por la formula qmmica 11 que se ha sintetizado y purificado en los metodos descritos anteriormente es el tipo de no inclusion, por ejemplo, en DMSO, pero se convierte en el compuesto tipo inclusion representado por la formula qmmica 12 inmediatamente despues de su disolucion en agua. Este fenomeno puede ser confirmado por una 1H RMN.
El compuesto de tipo inclusion, por consiguiente, existe como el compuesto de tipo inclusion en una solucion acuosa, y se puede usar como el compuesto de tipo inclusion. Ademas, cuando se elimina el agua de la solucion acuosa que incluye el compuesto de tipo inclusion, es posible obtener el compuesto de tipo inclusion en estado solido.
<7. Dispositivo para medir la biocinetica y dispositivo para visualizar la circulacion aplicada al cuerpo vivo en donde se administra la composicion de diagnostico>
• Dispositivo para la medicion de la biocinetica
El presente dispositivo se completa con base en la caractenstica en la cual el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion, empleado como la composicion de diagnostico de la presente invencion (en lo sucesivo, se puede denominar arbitrariamente como el "compuesto de la presente invencion"), tiene diferentes biocineticas, como el grado de transferencia a un tejido intersticial, con respecto a las del ICG.
El compuesto de la presente invencion tiene una diferencia con el ICG en la rata metabolica y la velocidad de transferencia desde el sistema circulatorio, como la sangre o el fluido linfatico a un tejido intersticial, y la proporcion del compuesto de la presente invencion que se incorpora al tejido intersticial es relativamente mas alta que la del ICG. Cuando se analiza la cinetica del compuesto de la presente invencion en un cuerpo vivo, por lo tanto, se puede evaluar exactamente un mecanismo del desplazamiento de fluidos corporales en el cuerpo vivo (biocinetica). Cuando las condiciones de medicion (estado activo de un cuerpo vivo, temperatura ambiente y similares) se hacen lo mas estacionarias posible con el uso del presente dispositivo, la biocinetica puede medirse con mayor precision.
Una forma de un desplazamiento anormal de fluido corporal en un cuerpo vivo es la generacion de edema. Aqm, segun la llamada "hipotesis de Starling", generalmente se considera que un fluido corporal (fluido) en un cuerpo vivo fluye desde una arteria a un tejido intersticial, y luego desde el tejido intersticial a una vena.
Se puede considerar que este desplazamiento de fluido de la arteria a la vena se puede calcular como (A)-(B)-(C)+(D) en donde (A) es un desplazamiento de fluido que fluye hacia el exterior de un sistema circulatorio causado por una diferencia entre la presion arterial y la presion del tejido intersticial, (B) es un desplazamiento de fluido que fluye hacia el interior del sistema circulatorio, causado por una diferencia entre la presion de la vena y la presion del tejido intersticial, (C) es un desplazamiento de fluido que fluye desde un tejido intersticial hacia una arteria causado por una diferencia entre la presion osmotica del fluido del tejido intersticial y la presion osmotica de la sangre arterial, y (D) es un desplazamiento de fluido que fluye desde el tejido intersticial hacia una vena causado por una diferencia entre la presion osmotica del fluido tisular intersticial y la presion osmotica de la sangre venosa.
Cuando la diferencia entre la presion arterial y la presion de la vena se reduce debido a insuficiencia cardfaca, o la presion osmotica del lfquido del tejido intersticial disminuye debido a desnutricion, se rompe el equilibrio de los desplazamientos de fluido (A) a (D), dando por lo tanto como resultado la generacion de edema. Ademas, cuando la permeabilidad de un vaso capilar se vuelve anormal (selectividad anormal de la penetracion de material) como en la diabetes mellitus, el balance de los desplazamientos de fluido (A) a (D) tambien se rompe, lo que resulta en la generacion de edema. Aqm, ha habido una condicion en la que no existe un metodo simple para evaluar directamente la permeabilidad anormal de un vaso capilar, y por lo tanto, hasta ahora ha sido diffcil especificar una causa detallada de la generacion de edema, incluso si la generacion de edema, que es un fenomeno, puede ser detectada.
Segun el hallazgo descrito anteriormente, se puede esperar que la transferencia del compuesto de la presente invencion se modifique mediante la reduccion de una diferencia entre la presion arterial y la presion de la vena o la reduccion de la presion osmotica en una celula, en comparacion con un caso en donde se genera edema, cuando la penetracion del material se vuelve anormal en la pared de un vaso sangumeo de un vaso capilar. Cuando se observa la transferencia del compuesto de la presente invencion en una cantidad igual o mayor que (o menor que) la correspondiente al desplazamiento del fluido, en consecuencia, se puede determinar la generacion de permeabilidad anormal del vaso capilar. Se puede considerar que cuando la permeabilidad del vaso capilar no se vuelve anormal, el cambio de la transferencia del compuesto de la presente invencion corresponde a una extension del desplazamiento del fluido y, por lo tanto, puede distinguirse del caso en donde la pared del vaso sangumeo se vuelve anormal.
En particular, cuando se emplean dos o mas tipos de compuestos de la presente invencion que tienen una velocidad de transferencia hacia el tejido intersticial diferente entre sf, y se miden y comparan entre sf las biocineticas de estos compuestos, el grado de cambio en la permeabilidad del vaso capilar puede ser evaluado; en otras palabras, cuando se emplean dos o mas tipos de compuestos de la presente invencion que tienen una permeabilidad diferente entre sf a traves de la pared del vaso sangumeo del vaso capilar, y se miden sus permeabilidades, es posible evaluar mas exactamente si la permeabilidad se vuelve anormal o no en la pared del vaso sangumeo. Esto significa que la causa del cambio en el desplazamiento de fluido puede evaluarse mas exactamente empleando dos o mas tipos de compuestos de la presente invencion que tienen una sensibilidad diferente a la permeabilidad anormal de la pared del vaso sangumeo entre sf, y midiendo la biocinetica de los mismos. Ademas de la evaluacion del desplazamiento de fluido mediante el uso del compuesto de la presente invencion, el desplazamiento de fluido se puede medir en un procedimiento habitual.
El dispositivo para medir la biocinetica de la presente invencion tiene medios de excitacion que irradian luz, medios de medicion de la intensidad de la fluorescencia, medios de calculo de la biocinetica y otros medios. Los otros medios se seleccionan segun la demanda de la ocasion, y un ejemplo de ello es la concentracion en un medio de calculo de cuerpo vivo para calcular una concentracion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina a partir de la intensidad de fluorescencia medida por los medios de medicion de intensidad de fluorescencia.
El presente dispositivo es un dispositivo utilizado para medir al menos una parte de un cuerpo vivo en donde se administra la composicion de diagnostico de la presente invencion descrita anteriormente. La cantidad de la composicion de diagnostico administrada es una cantidad con la que se puede observar la fluorescencia cuando la luz de excitacion es irradiada a la unidad estructural que se va a medir. La cantidad apropiada, en consecuencia, vana dependiendo de la unidad estructural de medicion. El tipo de compuesto de la presente invencion incluido en la composicion de diagnostico no esta particularmente limitado. Los compuestos de la presente invencion se pueden usar solos o como una mezcla de dos o mas tipos. En el curso de la medicion puede administrarse adicionalmente una composicion de diagnostico que tenga la misma o diferente composicion.
Los medios de irradiacion de luz de excitacion son medios para irradiar luz de excitacion que tiene una longitud de onda capaz de generar fluorescencia a partir del compuesto de la presente invencion incluido en la composicion de diagnostico administrada. La longitud de onda de la luz de excitacion irradiada puede restringirse a un rango apropiado. Cuando la longitud de onda se limita a un rango lo mas estrecho posible, la fluorescencia puede separarse de la luz de excitacion. La longitud de onda se puede restringir seleccionando una fuente de luz capaz de emitir luz que tenga una longitud de onda apropiada, o restringiendo una longitud de onda a traves de un filtro.
El modo de irradiacion de la luz de excitacion no esta particularmente limitado siempre que la fluorescencia generada pueda medirse por los medios de medicion de intensidad de fluorescencia descritos a continuacion. Ejemplo del mismo puede incluir luces de excitacion contiguas, luz de excitacion pulsatil, luz de excitacion cuya intensidad es variable, y similares. Cuando se cambia la intensidad, la intensidad de la luz de excitacion se puede modular mediante la irradiacion de los impulsos de la luz de excitacion en un intervalo predeterminado, y similares. Es deseable modular la intensidad de la luz de excitacion empleando la modulacion de amplitud de pulso. La luz de excitacion se irradia a una unidad estructural para ser irradiada por un sistema optico apropiado. La unidad estructural que se va a irradiar es una unidad estructural que requiere la medicion de la biocinetica, por ejemplo, cuando se pretende una evaluacion de una unidad estructural en donde se genera un edema, es deseable irradiar directamente la luz de excitacion a la unidad estructural donde se genera el edema.
Un intervalo al que se irradia la luz de excitacion no esta particularmente limitado. El rango de irradiacion se determina de acuerdo a la necesidad. Cuando la luz se irradia a un rango estrecho, la biocinetica subdividida se puede medir con precision en el rango estrecho irradiado. Cuando la luz se irradia a un amplio rango, aumenta la cantidad relativa del compuesto de la presente invencion que emite la fluorescencia mediante la irradiacion de la luz de excitacion y, por lo tanto, la intensidad de la fluorescencia se puede medir con mayor precision.
Ademas, es preferible irradiar la luz de excitacion por los medios de irradiacion de luz de excitacion bajo una condicion en la que se suprime la influencia de la luz ambiente. Por ejemplo, es preferible irradiar la luz de excitacion en un lugar oscuro, o en una condicion en la que un area a la que se irradia la luz de excitacion se cubre de la luz proveniente desde el exterior.
Los medios de medicion de intensidad de fluorescencia son medios para medir una intensidad de la fluorescencia emitida desde una unidad estructural en donde la luz de excitacion se irradia mediante los medios de irradiacion de luz de excitacion. Es preferible medir la luz a partir de la cual se elimina la luz que no sea la fluorescencia (luz ambiente, luz de excitacion y similares) a traves de un filtro capaz de pasar selectivamente la fluorescencia emitida.
Cuando se emplean medios para irradiar luz de excitacion que tiene una intensidad modulada como medios de excitacion que irradian luz, un componente que muestra un cambio correspondiente a la modulacion puede separarse de la intensidad de luz medida, que puede usarse como la intensidad de fluorescencia. Por ejemplo, cuando la intensidad de la luz de excitacion se modula mediante modulacion de amplitud de pulso, se desmodula un componente de la luz que cambia dependiendo de la intensidad del pulso modulado, y se mide su intensidad, separando as^ la intensidad de fluorescencia. Esto puede reducir la influencia de la luz ambiental en los resultados de medicion de la intensidad de fluorescencia.
La concentracion en un medio de calculo de cuerpo vivo es un medio para calcular una concentracion del compuesto de la presente invencion en el cuerpo vivo en base a la intensidad de fluorescencia medida por el medio de medicion de intensidad de fluorescencia. La relacion entre la intensidad de la fluorescencia y la concentracion del compuesto de la presente invencion en el cuerpo vivo puede calcularse en un metodo apropiado. Por ejemplo, se realiza previamente una curva de calibracion, y la concentracion del compuesto de la presente invencion en un cuerpo vivo puede calcularse basandose en la curva de calibracion. Tambien se puede usar el valor absoluto de la intensidad de fluorescencia, ya que es un valor relativo a la concentracion del compuesto de la presente invencion en un cuerpo vivo. La concentracion en un medio de calculo de cuerpo vivo calcula con el tiempo una concentracion del compuesto de la presente invencion en un cuerpo vivo.
Los medios de calculo de la biocinetica son medios para obtener una rata de tiempo de cambio en la concentracion del compuesto de la presente invencion en un cuerpo vivo a partir de los datos de las concentraciones en el cuerpo vivo adquiridas con el tiempo por la concentracion en un medio de calculo en un cuerpo vivo. Los medios de calculo de la biocinetica calculan una velocidad de transferencia del compuesto de la presente invencion desde el sistema circulatorio al tejido intersticial o desde el tejido intersticial al sistema circulatorio en la parte del cuerpo vivo, a partir de la tasa de cambio del tiempo resultante en la concentracion en el cuerpo vivo. La velocidad de transferencia hacia o desde el tejido intersticial tambien se puede calcular directamente a partir del cambio en la intensidad de fluorescencia obtenida con el tiempo por los medios de medicion de intensidad de fluorescencia, sin utilizar las concentraciones en el cuerpo vivo.
En este caso, se puede suponer que existe una alta correlacion entre la transferencia del compuesto de la presente invencion hacia el interior (exterior) del tejido intersticial y el desplazamiento de fluido en el fluido corporal, y por lo tanto un estado de fluido El cambio en una unidad estructural de medicion puede evaluarse midiendo las biocineticas del compuesto de la presente invencion. Ademas, se puede considerar que cuando la pared del vaso sangumeo se vuelve anormal y la permeabilidad del material no es normal, la cinetica del compuesto de la presente invencion cambia en un cuerpo vivo. La permeabilidad del vaso sangumeo, por lo tanto, puede evaluarse mediante la evaluacion de la cinetica del compuesto de la presente invencion.
La rata de tiempo de cambio en la intensidad de fluorescencia (o la concentracion en el cuerpo vivo) se puede obtener al diferenciar el cambio con el tiempo en la intensidad de fluorescencia (o la concentracion en el cuerpo vivo) con el tiempo, o calculando una intensidad de fluorescencia (una concentracion en un cuerpo vivo) por tiempo predeterminado para obtener una diferencia de una intensidad de fluorescencia (o una concentracion en un cuerpo vivo) antes del tiempo predeterminado (despues del tiempo predeterminado).
Se calcula una velocidad de captacion o excrecion dentro o fuera del fluido del tejido intersticial del compuesto de la presente invencion en una parte del cuerpo vivo, a partir de la rata de tiempo resultante de los cambios en la intensidad de la fluorescencia (o la concentracion en el cuerpo vivo). Aqrn, la velocidad de captacion o excrecion dentro o fuera del fluido tisular intersticial se puede obtener como un valor relativo de la intensidad de fluorescencia, y tambien se puede calcular basandose en la concentracion del compuesto de la presente invencion en el tejido intersticial y en la cantidad de lfquido tisular intersticial, cuando se desea obtenerlo con mayor precision. Ademas, cuando se tienen en cuenta la concentracion y la cantidad del compuesto de la presente invencion en sangre o lfquido linfatico, se puede realizar un calculo mas preciso. La concentracion del compuesto de la presente invencion en sangre o similar se puede medir con precision mediante el muestreo de la sangre.
El metodo para calcular una concentracion en el fluido tisular intersticial se puede ejemplificar mediante los siguientes metodos. Un primer metodo es un metodo en donde la concentracion del compuesto de la presente invencion en el cuerpo vivo calculada se aproxima a la concentracion del mismo en el fluido del tejido intersticial en una parte de un cuerpo vivo tal como esta. La concentracion en el lfquido tisular intersticial se puede calcular teniendo en cuenta la cantidad de lfquido tisular intersticial como metodo relevante para el primer metodo. Un segundo metodo es un metodo en donde se mide realmente la concentracion del compuesto de la presente invencion en sangre, una proporcion de la contribucion de los materiales en el vaso sangumeo a un valor medido por los medios de medicion de intensidad de fluorescencia, se calcula mediante un metodo que utiliza otra sustancia estandar que no se transfiere al tejido intersticial (como el ICG), y una concentracion en el fluido del tejido intersticial se puede calcular restando la influencia causada por la concentracion del compuesto de la presente invencion en la sangre realmente medida.
La rata de tiempo de cambio en la concentracion del compuesto de la presente invencion en el fluido del tejido intersticial puede calcularse restando la velocidad de transferencia del tejido intersticial de la velocidad de transferencia al tejido intersticial. Aqm, cuando se supone que la transferencia del compuesto de la presente invencion hacia (o fuera de) el tejido intersticial avanza en una velocidad que se correlaciona con la velocidad de desplazamiento del fluido en el fluido corporal y el desplazamiento del fluido alcanza el equilibrio, la velocidad de transferencia al tejido intersticial y la velocidad de transferencia fuera del tejido intersticial pueden considerarse constantes. Por lo tanto, las velocidades de transferencia se pueden calcular a partir del cambio en la concentracion del compuesto de la presente invencion en la sangre (el cambio causado por el metabolismo, la excrecion, la transferencia a los tejidos y similares) y la rata de tiempo de cambio en la concentracion en el lfquido del tejido intersticial. Incluso si estas velocidades de transferencia vanan, las velocidades de transferencia pueden calcularse haciendo un modelo correspondiente al cambio y aplicandolo.
Cuando la velocidad de transferencia calculada esta fuera del rango de valores mostrado por una pared de un vaso sangumeo normal, se puede considerar que la pared del vaso sangumeo puede volverse anormal. Puede haber un caso en donde se incremente la permeabilidad del compuesto de la presente invencion, asf como un caso en donde se disminuya como resultado de la anormalidad de la pared del vaso sangumeo.
Es un hecho bien conocido que el tejido se vuelve agudamente tumescente debido a diversas lesiones tisulares como inflamacion aguda, isquemia o trauma, y esta es una reaccion tisular muy importante en el entorno medico, independientemente de la region.
Es un item relevante para organos completos, por ejemplo, en una evaluacion de la sutura de un intestino durante una operacion, una evaluacion de un grado de inflamacion como la neumoma, una evaluacion de compatibilidad en un trasplante de organos, una evaluacion de disfuncion cerebral, renal y similares, ademas del caso en donde la generacion de tumescencia se convierte en un problema.
Sin embargo, no hay medios para predecir exactamente una posibilidad o un grado de tumescencia tisular en el momento actual, y solo se predice empmcamente a partir de un grado de lesion tisular. En la mayona de los casos, en consecuencia, se debe considerar un tratamiento despues de que se confirma la generacion de tumescencia, lo cual es una gran restriccion terapeutica.
Si la posibilidad de tumescencia generada se puede predecir de forma temprana con una alta precision, un tratamiento para reducir la tumescencia se puede realizar de manera temprana, por lo que la influencia se puede suprimir al mmimo. Por ejemplo, si un grado de edema cerebral, que sera causado mas adelante, se puede predecir exactamente inmediatamente despues del sangrado del cerebro, la influencia puede mantenerse al mmimo al realizar un tratamiento de descompresion o un tratamiento para reducir la permeabilidad de un vaso sangumeo. De manera similar, si una influencia causada por el estres por isquemia se puede predecir de antemano, el dano secundario causado por un infarto de miocardio o una lesion de la extremidad se puede mantener al mmimo. Como se indico anteriormente, una tecnica de alta precision, la prediccion cuantitativa de tumescencia, tiene el potencial de proporcionar un impacto considerable en la totalidad de la practica medica.
La cuantificacion de la tumescencia de los tejidos, incluido el edema, hasta la fecha se ha evaluado cualitativamente a partir de su apariencia. La cuantificacion se ha intentado, pero solo se puede realizar en condiciones muy limitadas y tiene un defecto en cuanto la evaluacion solo se puede realizar despues de la generacion de la tumescencia.
Para resolver estos problemas, cuando se usa el dispositivo para medir la biocinetica de la presente invencion, la progresion de la tumescencia se puede predecir calculando una velocidad de desplazamiento del fluido dentro o fuera del tejido intersticial. Como se describe en detalle en los Ejemplos, se sabe que el ICG no se transfiere al tejido intersticial durante la progresion de la tumescencia. Por otro lado, se sabe que el compuesto de indocianina unido a la ciclodextrina de la presente invencion puede transferirse dentro o fuera del tejido intersticial, y la transferencia al tejido intersticial se promueve aun mas con el desplazamiento de fluido durante la progresion de la tumescencia. La progresion de la tumescencia, en consecuencia, se puede predecir evaluando la transferencia del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion al tejido intersticial.
Como se considera que la velocidad de desplazamiento del fluido dentro o fuera del tejido intersticial ejerce influencia sobre la gran tumescencia que finalmente se forma, la evaluacion de la velocidad de transferencia del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion, que es relevante para la velocidad de desplazamiento del fluido, puede conducir a la evaluacion de un grado de progresion de tumescencia final. La velocidad de transferencia puede obtenerse calculando una concentracion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina, o puede calcularse utilizando la intensidad de fluorescencia tal como esta. La velocidad de transferencia hacia o desde el tejido intersticial se puede calcular como un valor absoluto, por decirlo asf, y tambien como un valor relativo (por ejemplo, una tasa de cambio en la intensidad de fluorescencia puede adoptarse como un valor relevante para la velocidad de transferencia como es) se calcula y la progresion de la tumescencia se puede predecir de acuerdo con el valor relativo.
El calculo de la progresion de la tumescencia se realiza de manera deseable en funcion de una velocidad de transferencia al tejido intersticial en un penodo normal en donde la tumescencia no avanza. Sin embargo, hay casos en los que la velocidad de transferencia al tejido intersticial no se encuentra en el penodo normal, y en tales casos, por lo tanto, se selecciona un grupo en el cual la tumescencia no avanza como un grupo de control y la velocidad de transferencia obtenida en ese unidad estructural puede ser utilizada en lugar del mismo. El grado de transferencia del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion al tejido intersticial tambien puede evaluarse evaluando una cantidad de sangre que circula y un grado de metabolismo utilizando ICG que no se transfiere al tejido intersticial.
El grado de transferencia del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion al tejido intersticial se mide despues de un penodo de tiempo predeterminado desde la administracion de la composicion de diagnostico de la presente invencion a un cuerpo vivo. El tiempo predeterminado se refiere al tiempo necesario para la distribucion de la composicion diagnostica de la presente invencion en sangre. La razon por la que la evaluacion se realiza utilizando datos despues del curso de tiempo predeterminado es que casi no hay diferencia en el cambio de la intensidad de fluorescencia independientemente de la progresion de la tumescencia, porque la concentracion en la sangre se eleva rapidamente sin casi ninguna influencia causada por un grado de progresion de la tumescencia hasta que la composicion de diagnostico se distribuye en la sangre durante el tiempo predeterminado despues de la administracion de la misma. Una vez que se distribuye en la sangre, la velocidad de transferencia al tejido intersticial cambia segun la presencia o ausencia de la progresion de la tumescencia y, por consiguiente, se puede observar un aumento selectivo de la intensidad de fluorescencia en una unidad estructural en donde la transferencia avanza (es decir, una unidad estructural en la que avanza la tumescencia).
Un metodo concreto para predecir la progresion de la tumescencia puede incluir, por ejemplo, un metodo en donde se presume un volumen de sangre a partir de un peso corporal o similar, se calculan el tamano del pico de la intensidad de fluorescencia y el tiempo que alcanza el pico, a partir del volumen de sangre predicho. A partir del tiempo y la intensidad, la intensidad de la fluorescencia se mide en un momento en donde la intensidad cambiara con la generacion de edema, y se predice un grado de progresion del edema y un grado de edema que probablemente se generara en el futuro a partir de los resultados obtenidos.
• Dispositivo para visualizar la circulacion.
El dispositivo se completa sobre la base del hecho de que el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la invencion (en lo sucesivo puede denominarse arbitrariamente como el "compuesto de la presente invencion") empleado en la composicion de diagnostico de la invencion es diferente de ICG en biocinetica tal como un grado de transferencia en un tejido intersticial.
El compuesto de la presente invencion se transfiere facilmente al fluido tisular intersticial y, por lo tanto, es posible visualizar una circulacion de sangre o fluido linfatico rastreando el comportamiento del compuesto de la presente invencion.
El dispositivo para visualizar la circulacion de la presente invencion tiene medios de excitacion que irradian luz, medios de generacion de imagenes de fluorescencia, medios de generacion de imagenes morfologicas y medios de visualizacion. El dispositivo es un dispositivo utilizado para medir al menos una parte del cuerpo vivo al que se administra la composicion de diagnostico de la invencion descrita anteriormente. La cantidad de la composicion de diagnostico administrada es una cantidad en la que se puede observar la fluorescencia cuando la luz de excitacion se irradia a la unidad estructural que se va a medir. La cantidad apropiada, en consecuencia, vana dependiendo de la unidad estructural de medicion. El tipo de compuesto de la presente invencion incluido en la composicion de diagnostico no esta particularmente limitado. Los compuestos de la presente invencion se pueden usar solos o como una mezcla de los dos o mas tipos. Una composicion de diagnostico que tenga la misma o diferente composicion puede administrarse adicionalmente en el curso de la medicion.
Los medios de irradiacion de luz de excitacion son medios para irradiar luz de excitacion que tiene una longitud de onda capaz de generar fluorescencia a partir del compuesto de la presente invencion incluido en la composicion de diagnostico administrada. La longitud de onda de la luz de excitacion irradiada puede restringirse a un rango apropiado. Cuando la longitud de onda se limita a un rango lo mas estrecho posible, la fluorescencia puede separarse de la luz de excitacion. La longitud de onda se puede restringir seleccionando una fuente de luz capaz de emitir luz que tenga una longitud de onda apropiada, o restringiendo una longitud de onda a traves de un filtro.
El modo de irradiacion de la luz de excitacion no esta particularmente limitado siempre que la fluorescencia generada pueda medirse por los medios de generacion de imagenes de fluorescencia descritos a continuacion. Su ejemplo puede incluir luces de excitacion contiguas, luz de excitacion pulsatil, luz de excitacion cuya intensidad es variable, y similares. Cuando se cambia la intensidad, la intensidad de la luz de excitacion se puede modular mediante la irradiacion de los impulsos de la luz de excitacion en un intervalo predeterminado, y similares. Es deseable modular la intensidad de la luz de excitacion empleando la modulacion de amplitud de pulso.
La luz de excitacion se irradia a una unidad estructural que va a ser irradiada por un sistema optico apropiado. La unidad estructural que se va a irradiar es una unidad estructural en donde se requiere la visualizacion de la circulacion en un cuerpo vivo, y puede incluir, por ejemplo, una unidad estructural en donde la necrosis del tejido avanza debido a una lesion termica, congelacion, inflamacion, herida o infarto, y su periferia. Como la sangre no circula en la unidad estructural en donde el tejido esta necrotizado y hay poca ventaja, incluso si esa unidad estructural se deja como esta, se piensa su eliminacion. En tal caso, es ideal eliminar completamente el area de necrosis entre el area normal y el area de necrosis.
Hasta ahora, la identificacion del area de necrosis se ha realizado mediante una angiograffa de vasos sangumeos en la que se administra un agente de contraste, o un metodo en donde se detecta hipotermia con disminucion de la circulacion sangumea. Sin embargo, la angiograffa de los vasos sangumeos tiene un defecto en cuanto no es facil manejar dispositivos como el dispositivo de irradiacion de rayos X, y de acuerdo con el metodo de evaluacion basado en la temperatura corporal, no es facil obtener una determinacion exacta.
El dispositivo de la presente invencion se puede usar para una aplicacion en la que se realiza una evaluacion del area de necrosis y el area normal debido a la presencia o ausencia de circulacion de fluido corporal (sangre). Si se puede visualizar una unidad estructural sin circulacion, entonces se puede eliminar facilmente la unidad estructural. Ademas de la visualizacion del area de necrosis, es posible evaluar facilmente la aparicion de anomaffas en la funcion circulatoria, ya que la circulacion sangumea se puede observar directamente. Por ejemplo, se puede visualizar una unidad estructural en donde todavfa no se produce necrosis, pero se puede reducir la funcion circulatoria debido a un infarto.
El rango que va a ser irradiado por la luz de excitacion se decide de forma que incluya un area que requiere la visualizacion de la circulacion segun lo requiera la ocasion.
Ademas, es preferible irradiar la luz de excitacion por los medios de irradiacion de luz de excitacion bajo una condicion en la que se suprime la influencia de la luz ambiente. Por ejemplo, es preferible irradiar la luz de excitacion en un lugar oscuro, o en una condicion en la que un area a la que se irradia la luz de excitacion se cubre de la luz desde el exterior.
Los medios de obtencion de imagenes de fluorescencia son medios para adquirir bidimensionalmente una intensidad de fluorescencia emitida por el compuesto de la presente invencion que se ha excitado mediante los medios de excitacion que irradian luz para obtener datos del estado de distribucion del compuesto de la presente invencion en un cuerpo vivo es decir, este medio es un medio para adquirir los datos del estado de distribucion que muestran la distribucion del compuesto de la presente invencion en una parte de un cuerpo vivo como datos de imagen bidimensionales.
Puede estar formado, por ejemplo, por una combinacion de un sistema optico apropiado y un dispositivo de captacion de imagenes tal como una CCD. La resolucion de los datos adquiridos en dos dimensiones se establece en un valor necesario segun el proposito. Es preferible medir la intensidad de fluorescencia de la luz a partir de la cual se elimina otra luz distinta de la fluorescencia (luz ambiente, luz de excitacion y similares) a traves de un filtro capaz de dejar pasar selectivamente la fluorescencia emitida.
Cuando se emplean medios para irradiar luz de excitacion que tiene una intensidad modulada como medios de irradiacion de luz de excitacion, un componente que muestra un cambio correspondiente a la modulacion puede separarse de la intensidad de luz medida, que puede usarse como la intensidad de fluorescencia. Por ejemplo, cuando la intensidad de la luz de excitacion se modula mediante modulacion de amplitud de pulso, se desmodula un componente de la luz que cambia dependiendo de la intensidad del pulso modulado, y se mide su intensidad, separando asf la intensidad de fluorescencia. Esto puede reducir la influencia de la luz ambiental en los resultados de medicion de la intensidad de fluorescencia.
Los medios de generacion de imagenes morfologicas son medios para adquirir bidimensionalmente una intensidad de luz que tiene una longitud de onda diferente a la longitud de onda de la fluorescencia emitida por el compuesto de la presente invencion para obtener datos morfologicos de una parte de un cuerpo vivo, es decir, el medio es el medio de adquirir datos morfologicos que muestran la morfolog^a de la parte del cuerpo vivo como datos de imagen bidimensionales.
Los medios de generacion de imagenes morfologicas pueden estar formados por un sistema optico apropiado y un dispositivo de captacion de imagenes, tal como CCD. La resolucion de los datos adquiridos en dos dimensiones se establece en un valor necesario segun el proposito. En tal caso, se ajusta para que no se detecte la fluorescencia emitida por la luz de excitacion (o se reduzca la sensibilidad de deteccion). Como los medios de imagenes morfologicas, una estructura en la que la mayona del sistema optico se usa para estos medios y los medios de imagenes de fluorescencia descritos anteriormente, y la luz que tiene una longitud de onda correspondiente a la fluorescencia se introduce en los medios de imagenes de fluorescencia y las luces que tienen otras longitudes de onda se introducen en los medios de imagenes morfologicas a traves de un prisma espectral en una trayectoria optica antes de que se pueda adoptar la introduccion final en el dispositivo de captacion de imagenes. El prisma espectral puede controlar adecuadamente la longitud de onda de la luz que se va a separar formando apropiadamente una pelfcula dicroica.
Ademas, se puede usar un dispositivo de generacion de imagenes como medio de generacion de imagenes de fluorescencia y como medio de generacion de imagenes morfologico. La fluorescencia se puede separar matematicamente de otras luces despues de obtener datos de imagenes bidimensionales. Ademas, los datos del estado de distribucion tambien se pueden obtener como datos de imagenes multiples de una superficie de una parte de un cuerpo vivo en una direccion de profundidad. Un punto focal en el sistema optico adoptado en los medios de generacion de imagenes de fluorescencia se desplaza en la direccion de profundidad, por lo que se pueden obtener multiples datos de imagenes bidimensionales en una direccion de profundidad. Ademas, se adopta un sistema optico capaz de cambiar la distancia focal como medio de excitacion que irradia luz, y el punto focal se desplaza no solo en la superficie de la parte del cuerpo vivo sino tambien en la direccion de la profundidad, o la luz de excitacion ligeramente detenida es irradiada a la parte del cuerpo vivo, por lo que la fluorescencia se puede generar selectivamente no solo en la superficie del cuerpo vivo sino tambien en el interior en la direccion de la profundidad del cuerpo vivo, y la circulacion en esa area puede ser visualizada.
Los medios de visualizacion son medios para mostrar un estado de distribucion del compuesto de la presente invencion en una parte de un cuerpo vivo mediante la superposicion de los datos de estado de distribucion obtenidos por los medios de generacion de imagenes de fluorescencia con los datos morfologicos obtenidos por los medios de generacion de imagenes morfologicas. Cuando una longitud de onda de fluorescencia no esta dentro del rango de luz visible, la longitud de onda de fluorescencia se convierte en una longitud de onda apropiada de luz visible, que se muestra. Es deseable visualizar los datos del estado de distribucion en lugar de los datos morfologicos en terminos de visualizacion de la circulacion. En particular, un area en la que una cantidad de distribucion (es decir, una intensidad de fluorescencia) del compuesto de la presente invencion es baja (si es baja o no, se decide de acuerdo con el proposito de visualizar la circulacion. Por ejemplo, con el fin de visualizar un area de necrosis, se muestra un area en la cual no se observa la circulacion, (es decir, un area en la que no se observa fluorescencia) para que se pueda distinguir de otra area. Por ejemplo, el area se puede mostrar con un color diferente al de otra area, o se puede mostrar con un parpadeo. La superposicion de los datos del estado de distribucion con los datos morfologicos se puede realizar mediante un programa en un ordenador. Los datos bidimensionales pueden mostrarse utilizando un dispositivo de visualizacion habitual. Cuando el dispositivo de visualizacion se coloca entre un cuerpo vivo y un medidor, se puede tratar un cuerpo vivo mientras se observa el dispositivo de visualizacion.
<8. Definiciones, y similares>
En la presente invencion, "grupo alquilo" se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 20 atomos de carbono, que puede tener un sustituyente, y ejemplos de los mismos pueden incluir grupos lineales o grupos ramificados que incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo e icosanilo.
En la presente invencion, "grupo alcoxilo" puede incluir un grupo alcoxilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 atomos de carbono, tal como grupos metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, pentiloxi, hexiloxi, metoxietoxi, metoxipropoxi, etoxietoxi, etoxipropoxi y metoxietoxietoxi.
En la presente invencion, "grupo arilo" puede incluir hidrocarburos aromaticos que tienen de 6 a 20 atomos de carbono, tales como fenilo y naftilo.
Ejemplo
Las realizaciones preferibles de la presente invencion se explicaran espedficamente por medio de Ejemplos, pero el alcance tecnico de la presente invencion no se limita a las realizaciones descritas a continuacion, y se pueden llevar a cabo diversas modificaciones de las mismas en el alcance de la presente invencion.
<Prueba 1: Smtesis y purificacion de compuestos representados por la formula qmmica 15 y la formula qmmica 16>
Una mezcla de 0.20 g de compuesto representado por la formula qmmica 13, 0.94 g de un compuesto representado por la formula qmmica 14, 0.18 g de WSC, 0.12 g de HOBt, 4.0 mL de piridina y 2.0 mL de N,N-dimetilformamida se agito a 0°C durante 6 horas en un lugar oscuro. A continuacion, se anadieron 50 mL de acetona, y se filtro el precipitado a presion reducida. El precipitado se disolvio en una solucion acuosa de acido trifluoroacetico al 0.1%, y la solucion se sometio a cromatograffa en columna ODS. Se uso un lfquido mixto de agua y metanol que inclma acido clorlddrico 1 mM, como eluyente, y se eluyo un compuesto representado por la formula qmmica 15. El eluato se concentro a presion reducida para obtener 0.65 g de un compuesto verde del tipo inclusion representado por la formula qmmica 16, en estado solido (a la concentracion del eluato a presion reducida, el producto se convierte de forma natural en el tipo inclusion, porque el contenido de agua es alto al final de la concentracion).
Formula Qmmica 15
Figure imgf000021_0001
[Formula Qmmica 16]
Figure imgf000022_0002
Los datos del analisis mecanico del producto deseado representado por la formula qmmica 16 se muestran a continuacion. 1H RMN (500 MHz, D2O, 26°C, Acetona: 2.10 ppm) 1.43 (2H, m), 1.55 (2H, m), 1.99 (6H, s), 2.09 (6H, s), 2.63 (6H, m), 2.80 (6H, m), 2.92 (2H, m), 3.02 (2H, dd, J=3.7, 9.8 Hz), 3.08 (2H, t, J=9.2 Hz), 3.2-4.1 (m), 4.19 (2H, t, J=9.8 Hz), 4.26 (2H, t, J=9.8 Hz), 4.33 (2H, m), 4.43 (2H, m), 4.71 (2H, d, J=2.4 Hz), 4.81 (4H, d, J=3.7 Hz), 4.91 (2H, d, J=3.7 Hz), 4.99 (2H, d, J=3.7 Hz), 5.08 (2H, d, J=3.7 Hz), 5.13 (2H, d, J=3.1 Hz), 6.15 (2H, d, J=13 Hz), 6.52 (2H, t, J=12 Hz), 7.43 (4H, m), 7.57 (1H, d, J=12 Hz), 7.57 (2H, d, J=9.2 Hz), 7.78 (2H, m), 8.06 (3H, m), 8.15 (2H, d, J=8.5 Hz). ESI-MS m/z calculado para C131H191N4O722972, encontrado 2973 [M]+.
<Prueba 2: Smtesis y purificacion de compuestos representados por la formula qmmica 19 y la formula qmmica 20>
Una mezcla de 0.17 g de un compuesto representado por la formula qmmica 17, 5 mL de metanol y 0.30 g de t-BuOK se agito a temperatura ambiente durante 12 horas. A continuacion, se agregaron 3 mL de acido clorlmdrico 1 M y luego 50 mL de agua. Se filtro un precipitado, se lavo con agua y se seco a presion reducida para obtener 0.17 g de un compuesto representado por la formula qmmica 18.
[Formula Qmmica 17]
Figure imgf000022_0001
Una mezcla de 0.02 g del compuesto representado por la formula qmmica 18, 0.081 g de un compuesto representado por la formula qmmica 14, 0.016 g de WSC, 0.011 g de HOBt, 0.3 mL de piridina y 0.2 mL de N,N dimetilformamida se agito a 0°C durante 6 horas en un lugar oscuro. A continuacion, se anadieron 5 mL de acetona y se filtro un precipitado a presion reducida. El precipitado se disolvio en una solucion acuosa de acido trifluoroacetico al 0.1%, y la solucion se sometio a una cromatograffa en columna ODS. Se uso un lfquido mixto de agua y metanol que inclma acido clorlmdrico 1 mM como eluyente, y se eluyo un compuesto representado por la formula qmmica 19. El eluato se concentro a presion reducida para obtener 0.045 g de un compuesto verde de tipo inclusion representado por la formula qmmica 20 en estado solido. (En la concentracion del eluato a presion reducida, el producto se convierte de forma natural en el tipo inclusion, porque el contenido de agua es alto en el extremo de concentracion).
Formula Qmmica 19]
Figure imgf000023_0001
Los datos del analisis mecanico del producto deseado representado por la formula qmmica 20 se muestran a continuacion. 1 H RMN (500 MHz, D2O, 40°C, Acetona: 2.26 ppm) 1.54 (2H, m), 1.68 (2H, m), 1.98 (2H, m), 2.19 (6H, s), 2.20 (2H, m), 2.30 (6H, s), 2.6-2.85 (10H, m), 2.95 (2H, m), 3.00 (4H, m), 3.08 (2H, t, J=12 Hz), 3.17 (2H, dd, J=3.7, 9.8 Hz), 3.26 (2H, t, J=9.8 Hz), 3.35-4.30 (m), 4.35 (2H, t, J=9.2 Hz), 4.50 (2H, t, J=9.2 H), 4.52 (2H, m), 4.63 (2H, m), 4.87 (2H, d, J=3.7 Hz), 4.95 (d, J=3.1 Hz), 4.97 (2H, d, J=3.7 Hz), 5.08 (2H, d, J=3.7 Hz), 5.15 (2H, d, J=4.3 Hz), 5.25 (2H, d, J=3.7 Hz), 5.29 (2H, d, J=3.7 Hz), 6.30 (2H, d, J=14.6 Hz), 7.58 (4H, m), 7.73 (2H, d, J=8.5 Hz), 7.95 (2H, m), 8.25 (2H, m), 8.32 (2H, d, J=14.6 Hz), 8.35 (2H, d, J=8.5 Hz). ESI-MS m/z calculado para C135H197N4O733042, encontrado 3042 [M]+.
<Prueba 7: Solubilidad del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion>
Se realizaron pruebas de solubilidad de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) en agua o solucion salina fisiologica. Fue necesaria una agitacion violenta de aproximadamente un minuto para disolver el ICG en polvo de Molecular Probe Inc. en agua o solucion salina fisiologica. Por otro lado, la agitacion por vibracion no fue necesaria para disolver los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion, en particular, los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20, y se disolvieron rapidamente.
<Prueba 8: Adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion a la piel humana>
Se realizaron pruebas de adsorcion de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina (las formulas qmmicas 16 y 20) de la presente invencion a la piel humana. Se coloco una solucion acuosa 1 mM (0.03 mL) que inclma ICG o cada uno de los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) en un brazo y se lavo con agua despues de 5 minutos, se froto y luego se lavo con agua. Los resultados fueron que el ICG no se lavo completamente con agua; mientras que, los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion, en particular los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20 pudieron lavarse facilmente. Se demostro que la adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion a la piel humana fue mucho menor que la de ICG (Figura 1).
<Prueba 9: Adsorcion del compuesto de indocianina unido a la ciclodextrina de la presente invencion a la fibra de celulosa>
Se realizaron pruebas de adsorcion de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) a una fibra de celulosa. Usando un hisopo de algodon (Sanyo Co., Ltd.) como modelo de fibra de celulosa, una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o cada uno de los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) se aplico al modelo y se lavo con agua corriente (agua del grifo, 1 L/minuto) durante 5 segundos despues de 3 minutos. Los resultados fueron que el ICG no se lavo completamente con agua; mientras que los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion, en particular los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20 pudieron lavarse facilmente. Se demostro que la adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion a la fibra de celulosa era mucho menor que la de ICG (Figura 2).
<Prueba 10: Adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion al modelo de carne del cuerpo vivo>
Se realizaron pruebas de adsorcion de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) a un modelo de carne de un cuerpo vivo. Utilizando una carne de lomo de cerdo disponible comercialmente como modelo de carne del cuerpo vivo, se practico una parte de depresion con un diametro de 5 mm en la carne de lomo de cerdo y una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o cada una de las ciclodextrinas. Los compuestos de indocianina enlazados de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) se aplicaron a la parte de la depresion y se lavaron con agua corriente (agua del grifo, 1 L/minuto) durante 10 segundos despues de 3 minutos. Los resultados fueron que el ICG no se lavo completamente con agua; mientras que, los compuestos de indocianina unidos a la ciclodextrina de la presente invencion, en particular los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20, pudieron lavarse facilmente. Se demostro que la adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion al modelo de carne del cuerpo vivo fue mucho menor que la de ICG (Figura 3).
<Prueba 11: Adsorcion del compuesto de indocianina unido a la ciclodextrina de la presente invencion al modelo de protema de cuerpo vivo>
Pruebas de adsorcion de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) a un modelo de protema de un cuerpo vivo. Utilizando una carne de pechuga de pollo disponible comercialmente como modelo proteico de cuerpo vivo, se practico una parte de depresion con un diametro de 5 mm en la carne de pechuga de pollo y una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o cada una de las ciclodextrinas. Los compuestos de indocianina enlazados de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) se aplicaron a la parte de la depresion y se lavaron con agua corriente (agua del grifo, 1 L/minuto) durante 10 segundos despues de 3 minutos. Los resultados fueron que el ICG no se lavo completamente con agua; mientras que, los compuestos de indocianina unidos a la ciclodextrina de la presente invencion, en particular los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20, pudieron lavarse facilmente. Se demostro que la adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion al modelo de protema de cuerpo vivo era mucho menor que la de ICG (Figura 4).
<Prueba 12: Adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion a fibra qmmica hidrofoba>
Se realizaron pruebas de adsorcion de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) a una fibra qmmica hidrofoba. Usando una mascara de polipropileno (Tamagawa-Eizai Co., Ltd.) como modelo de fibra qmmica hidrofobica, una solucion acuosa 1 mM (0.05 mL) que incluye ICG o cada uno de los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) se aplico al modelo y se lavo con agua corriente (agua del grifo, 1 L/minuto) durante un segundo despues de dejarlo reposar durante 20 minutos (se dejo reposar durante 20 minutos para eliminar la humedad, porque si la muestra tiene humedad, el compuesto no se adhiere a la mascara). Los resultados fueron que el ICG no se lavo completamente con agua; mientras que, los compuestos de indocianina unidos a la ciclodextrina de la presente invencion, en particular los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20, pudieron lavarse facilmente. Se demostro que la adsorcion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion a la fibra qmmica hidrofoba era mucho menor que la de ICG (Figura 5).
<Prueba 13: Asociacion de moleculas de compuesto de indocianina unida a ciclodextrina de la presente Invencion en solucion acuosa>
Se estudio la asociacion de moleculas de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) en una solucion acuosa. Cada una de las soluciones acuosas de 0.01 mM, 0.025 mM, 0.05 mM y 0,1 mM que incluyen ICG o el compuesto de indocianina unido a la ciclodextrina de la presente invencion (cada formula qmmica 16 y 20) se preparo, se coloco en una celda de cuarzo que tema una longitud de trayectoria optica de 1 mm, y se midio el espectro de absorcion optica de 600 nm a 1000 nm a 25°C. Los resultados mostraron que la asociacion de moleculas, llamada "agregacion H", ocurrio para ICG en este rango de concentracion (Fig. 6, grafico de la izquierda); mientras que la asociacion de moleculas, llamada "agregacion H", no se produjo para los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion, en particular, los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20, en este rango de concentracion (Figura 6, grafica de la derecha).
<Prueba 14: Fluorescencia del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion en solucion acuosa>
Se estudio la fluorescencia de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) en una solucion acuosa. Una solucion acuosa 0.1 pM que incluye ICG o cada uno de los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) se dispuso en una celda de cuarzo cuadrada de 1 cm a 25°C, que se excito con luz de excitacion de 720 nm (paso de banda: 10 nm), y se midio un espectro de fluorescencia (paso de banda: 10 nm). Se calculo una eficiencia de fluorescencia basada en una eficiencia de fluorescencia de ICG, 0.13 (en DMSO, a 25°C). Los resultados fueron que el ICG tuvo una eficiencia cuantica de fluorescencia de 0.021; mientras que los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion, en particular, los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20 tuvieron eficiencias cuanticas de fluorescencia de 0.054 y 0.042, respectivamente. Las eficiencias cuanticas de fluorescencia de los mismos fueron respectivamente 2.6 veces y 2 veces mas que la de ICG.
<Prueba 15: Fluorescencia del compuesto de indocianina unido a la ciclodextrina de la presente invencion en sangre>
Se estudio la fluorescencia de ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) en sangre. El ICG y los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion (las formulas qmmicas 16 y 20) se disolvieron respectivamente en sangre (humana) en una concentracion de 100 pM. La sangre resultante se coloco en una celula de cuarzo triangular a 25°C, que se excito con una luz de excitacion de 760 nm (paso de banda: 10 nm), y se midio un espectro de fluorescencia superficial (paso de banda: 10 nm). El ICG tema una intensidad de fluorescencia de 58 (unidad arbitraria) a la longitud de onda de fluorescencia maxima. Los compuestos de indocianina unidos a ciclodextrina de la presente invencion, en particular, los compuestos representados por la formula qmmica 16 y la formula qmmica 20 teman respectivamente intensidades de fluorescencia de 270 (unidad arbitraria) y 190 (unidad arbitraria), que eran 4.7 veces y 3.3 veces la de ICG. Se podna considerar que esto se debe a que la emision de luz del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion no se vio obstaculizada en el cuerpo vivo.
<Prueba 16: Comportamiento del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion en un cuerpo vivo>
El comportamiento del compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK1) representado por la formula qmmica 19 o 20 0 el compuesto de equilibrio de isomerizacion (TK2) representado por la formula qmmica 15 o 16, que eran ejemplos tfpicos, se evaluo en sangre humana y un cuerpo de rata, que eran cuerpos vivos de interes.
• Comportamiento en fluorescencia en sangre humana
La dependencia de la concentracion en la intensidad de fluorescencia de la superficie de ICG, TK1 o TK2 se evaluo en sangre venosa humana en una celula triangular. Espedficamente, se colocaron 1.0 mL de sangre venosa humana en una celda de cuarzo triangular, y se agrego ICG, TK1 o TK2 a una concentracion determinada. Se irradio luz de excitacion de 760 nm (paso de banda: 10 nm) a 25°C y se midio la fluorescencia superficial (paso de banda: 10 nm). Los resultados se muestran en la Figura 7.
Como se desprende de la Figura 7, se encontro que tanto TK1 como TK2 emitfan fluorescencia en la sangre venosa humana mediante la irradiacion de la luz de excitacion.
• Estudio de posibilidad de administracion en cuerpo de rata.
Se preparo una solucion acuosa que inclma ICG, TK1 o TK2 en una concentracion de 1 mM, y se inyectaron 0.1 mL de la solucion en la vena femoral expuesta en una rata a la que se hada realizado una laparotoirna. A continuacion, se irradiaron 760 nm de luz de excitacion en el abdomen abierto, y se evaluo la presencia o ausencia de fluorescencia.
Como resultado, se observo la fluorescencia de organos internos en el abdomen abierto. Se observo que TK1 y TK2 estaban altamente acumulados en el rinon (como ya se sabe, el ICG esta altamente acumulado en el hngado). No se observaron graves influencias en la rata por la administracion, y se confirmo que podfan administrarse de forma relativamente segura al cuerpo vivo.
• Observacion de distribucion en cuerpo de rata.
Despues de que una rata macho Wistar (9 semanas de edad, peso corporal de 350 g) se anestesio con eter, se administraron por via intraperitoneal 0,1 mL de Nembutal usando una aguja 26 G para realizar la anestesia. La base de la cola de la rata se envolvio firmemente con una banda de goma para evitar el flujo de sangre, y la vena caudada se aseguro con una aguja Therflow de 24 G y se aseguro una lmea periferica insertando una llave de paso de tres vfas y un tubo de extension. La rata se fijo en un soporte plano en posicion supina (Figura 8). Una unidad de camara PDE fabricada por Hamamatsu Photonics K.K. se fijo a exactamente 16 cm del cuerpo de la rata. Cuando todo el cuerpo fue fotografiado extensamente, la distancia era de 20 cm. El rango de observacion fue un rango aproximado mostrado por puntos negros en la Figura 8. A continuacion, se administro ICG, TK1 o TK2 en una concentracion de 1 mM desde la lmea periferica asegurada. La cantidad de administracion fue de 0.1 mL. Despues de 20 minutos desde la administracion, el estado de fluorescencia de la cavidad abdominal que se abrio se muestra en la Figura 9, y el estado de fluorescencia (imagenes a la luminancia maxima) de la region dorsal del pie se muestra en la Figura 12.
La Figura 9 muestra que se acumulo ICG principalmente en el tngado (Figura 9 (a)), y TK1 y TK2 se acumularon principalmente en el rinon (Figura 9 (b) y Figura 9 (C)). La generacion de imagenes en el infrarrojo cercano de los organos internos inmediatamente despues de la administracion mostro que el rinon, el ureter y la vejiga estaban claramente identificados (Figura 10). Ademas, tambien mostro que el endoscopio de infrarrojo cercano puede tomar imagenes del ureter (Figura 11).
omo se desprende de la vista de la imagen 12, el estado en el cual se emitio la fluorescencia de acuerdo con el flujo sangurneo fue claro en la region dorsal del pie. Tambien se encontro que cuando se administro ICG, TK1 o TK2 como se indico anteriormente y se observo fluorescencia en un modelo de isquemia de las extremidades inferiores que fue causada por la ligadura de una arteria femoral derecha de una rata, no se observo la fluorescencia en el area de isquemia y, por lo tanto, se encontro que un grado de flujo sangurneo podfa evaluarse en funcion de la presencia o ausencia de la fluorescencia, aunque no se mostraba en una figura.
Aqm, los cambios con el tiempo en la intensidad de fluorescencia de la region dorsal del pie se muestran en la Figura 13 y en la Figura 14. Ademas, el tiempo que alcanza el valor maximo de intensidad de fluorescencia (Imax), el valor de Imax y el tiempo en la cual el valor alcanzo la mitad del valor de Imax (t1/2) se muestra en la Tabla 1.
[Tabla 1]
Compuesto Tiempo para Imax Imax* t1/2
ICG 0.5 min 124 2.3 min
TK-1 10 min 160 40 min
TK-2 15 min 106 55 min
Como se desprende de la Tabla 1, Figura 13 y Figura 14, se encontro que los tiempos necesarios para alcanzar el valor maximo de intensidad de fluorescencia y los tiempos necesarios para reducirlo a la mitad para TK1 y TK2 eran mas largos que los de ICG, en otras palabras, podnan emitir la fluorescencia durante mucho tiempo en el cuerpo. Se encontro que, por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de ICG se redujo a un valor inicial de la misma en menos de 10 minutos despues de la administracion; mientras que, TK1 y TK2 mostraron una alta intensidad de fluorescencia incluso despues de una hora desde la administracion.
• Observacion a nivel de vasos sangumeos
Se administro ICG o TK1 en un estado en el cual un vaso sangumeo de una rata se expuso directamente y se observo mediante los metodos descritos en los Documentos de Patente No 7 y 8 (Figura 15), y en la Figura 16 se muestra un estado de un colgajo de piel de cremaster despues de la exposicion. Se administro ICG o TK1 en el estado en el cual se expuso el vaso sangumeo y se realizo la observacion. Como resultado, se observo que el ICG se distribufa de manera desigual en el vaso sangumeo, en comparacion con TK1. Se encontro, por lo tanto, que TK1 se transfirio desde el vaso sangumeo al fluido del tejido intersticial. Para estudiarlo con mayor precision, las fotomicrograffas del vaso sangumeo despues de la administracion se muestran en la Figura 17 (ICG) y en la Figura 18 (TK1). Como se desprende de las Figuras 17 y 18, en comparacion con la intensidad de fluorescencia en el vaso sangumeo y la intensidad de fluorescencia en los tejidos circundantes, apenas se observo fluorescencia en el tejido intersticial para ICG; mientras que se observo fluorescencia en el tejido intersticial para TK1, y el aumento de la intensidad de la fluorescencia con el tiempo tambien se observo en el tejido intersticial, aunque no se describe en detalle. Se encontro, por lo tanto, que el ICG apenas se transfiere desde el vaso sangumeo al fluido del tejido intersticial; mientras que TK1 se transfirio desde el vaso sangumeo al fluido del tejido intersticial.
• Evaluacion de la relacion entre el grado de transferencia del compuesto de indocianina unida a ciclodextrina de la presente invencion en tejido intersticial y el tamano del edema formado
(Metodo de evaluacion)
Se seleccionaron ratas (ratas macho, Wister) que teman 10 semanas de edad y aproximadamente 350 g como animales de prueba (n = 4). La rata se anestesio en general con isoflurano y se inyectaron 0.1 mL de A-carragenina al 0.5% en una almohadilla posterior izquierda con una aguja de 26 G, lo que dio lugar a una rapida generacion de edema en el pie. Despues de 15 minutos, se midio el volumen del pie izquierdo de la rata utilizando un dispositivo de medicion del volumen de la almohadilla de la rata (MK-101 CMP PLETHYSMOMETER fabricado por Muromachi Kikai Co., Ltd.).
A continuacion, se suspendio el isoflurano y se confirmo la emergencia de la rata. Despues de realizar la prueba de Von Frey, la rata fue anestesiada en general con isoflurano nuevamente. La vena caudada de la rata se aseguro con una aguja Therflow de 24 G, y luego se fijo en un soporte horizontal en posicion supina. Se coloco una camara PDE fabricada por Hamamatsu Photonics K. K. y se fijo a una altura de 16 cm desde el pedis dorsalis de la rata.
Una unidad estructural (ROI) que se iba a medir con la camara PDE se fijo en una parte central del pedis dorsalis y se apago la luz. Despues de que se inicio la medicion, se infundieron 0.1 mL de una solucion acuosa que inclufa 1 mmol de TK1 de una vena caudada y se lavo con 1 mL de solucion salina fisiologica durante 5 segundos. Se realizo generacion de imagenes continua durante los primeros 5 minutos despues de la infusion para medir las luminancias en la ROI. A continuacion, se midio la luminancia durante un minuto a intervalos de 5 minutos y la medicion se continuo hasta 120 minutos desde la infusion. Una vez finalizada la medicion, se suspendio el isoflurano para sacar a la rata de la anestesia y se devolvio a una jaula (experimento de inflamacion aguda).
Despues de 7 dfas, se realizo una prueba de Von Frey y luego la rata fue rapidamente anestesiada con isoflurano, y el volumen del pie izquierdo de la rata se midio utilizando el dispositivo de medicion del volumen de almohadilla de rata. La vena caudada de la rata se aseguro con una aguja Therflow de 24 G, y luego se fijo en un soporte horizontal en posicion supina. Una camara PDE fabricada por Hamamatsu Photonics K. K. se fijo a una altura de 16 cm desde el pedis dorsalis de la rata. Despues de establecer la ROI en la parte central del pedis dorsalis y apagar la luz, se inicio la medicion. Se infundio una solucion acuosa que inclma 1 mmol de TK1, 0.1 mL, en una vena caudada, y se lavo con 1 mL de solucion salina fisiologica durante 5 segundos. Se realizo una generacion de imagenes continua durante los primeros 5 minutos despues de la infusion para medir las luminancias en la ROI. A continuacion, se midio la luminancia durante un minuto a intervalos de 5 minutos y la medicion se continuo hasta 120 minutos desde la infusion. Una vez finalizada la medicion, se suspendio el isoflurano para sacar a la rata de la anestesia y se devolvio a la jaula. Un grupo al que no se inyecto A-carragenina se sometio a la misma prueba.
Los mismos procedimientos anteriores se realizaron para ICG.
(Resultados)
Los resultados se muestran en las Figuras 19 a 26. El volumen del pie izquierdo de la rata en el grupo al que se administro TK1 se muestra en la Figura 19 (cuanto mas alto es el eje vertical, mayor es el volumen); los resultados de la prueba de Von Frey se muestran en la Figura 20 (cuanto mas bajo es el eje vertical, mas alta es la hiperalgesia); el cambio en la luminancia inmediatamente despues de la inyeccion se muestra en la Figura 21 (cuanto mas alto es el eje vertical, mayor es la luminancia); y el cambio en la luminancia despues de una semana de la inyeccion de carragenina se muestra en la Figura 23 (cuanto mas alto es el eje vertical, mayor es la luminancia). El volumen del pie izquierdo de la rata en el grupo al que se administro ICG se muestra en la Figura 23 (cuanto mas alto es el eje vertical, mayor es el volumen); los resultados de la prueba de Von Frey se muestran en la Figura 24 (cuanto mas bajo es el eje vertical, mas alta es la hiperalgesia); el cambio en la luminancia inmediatamente despues de la inyeccion se muestra en la Figura 25 (cuanto mas alto es el eje vertical, mayor es la luminancia); y el cambio en la luminancia despues de una semana de la inyeccion de carragenina se muestra en la Figura 26 (cuanto mas alto es el eje vertical, mayor es la luminancia). Los valores en los ejes verticales en todos los graficos son unidades arbitrarias.
Se observo una gran diferencia entre ICG y TK1 en el patron de cambio en la luminancia en el ROI. La luminancia se incremento en poco tiempo despues de la administracion de ICG, y luego se convirtio rapidamente en disminucion y disminuyo a la lmea base en aproximadamente 10 minutos. Por otro lado, el TK1 mostro una trayectoria similar a la del ICG en el aumento de la luminancia en el estado inicial despues de la administracion, pero a continuacion, la luminancia se detuvo en un nivel alto, y tardo 6 horas en volver al lmea base. A partir de estos resultados, se considero que el ICG permaneda en el vaso sangumeo sin fugas al tejido intersticial, y el pasaje en el vaso sangumeo distribuido en el ROI causo el rapido aumento de la luminancia y la subsiguiente disminucion rapida del mismo. Por otra parte, se podna considerar que TK1 reflejo dos fases de una parte en la que se reflejo el paso rapido en el vaso sangumeo en la primera etapa (en adelante, "fase de vasos sangumeos") y una fase en la que TK1, que se filtro gradualmente al tejido intersticial a continuacion, emitio la fluorescencia (en lo sucesivo denominada "fase del tejido intersticial"). Un tiempo necesario para la transferencia desde la fase del vaso sangumeo a la fase del tejido intersticial corresponde a un tiempo predeterminado.
En el experimento de inflamacion aguda, se observo el notable aumento del volumen del pie de la rata despues de la inyeccion de A-carragenina en los grupos TK1 e ICG, y el volumen se normalizo al lado del tendon despues de una semana (Figuras 19 y 23). En la prueba de Von Frey, se observo una hiperalgesia notable despues de la inyeccion de A-carragenina en los grupos TK1 e ICG, y la hiperalgesia se normalizo a la del lado del tendon despues de una semana (Figuras 20 y 24).
Se observo que en la luminancia del pedis dorsalis, el cambio de luminancia en el grupo TK1 no fue diferente al del grupo de control en la fase de vaso sangumeo, pero el aumento de luminancia mas rapido en el grupo de administracion de A-carragenina fue observado en la fase de tejido intersticial, y se observo que el grupo TK1 mantuvo valores altos durante el tiempo de evaluacion (Figura 21). Despues de una semana desde la administracion de A-carragenina, en la cual desaparecio la inflamacion causada por la administracion, no se observo una diferencia en el cambio de luminancia entre el lado de administracion de carragenina y el lado del tendon en la fase del tejido intersticial (Figura 22). Como se muestra claramente en la grafica de la Figura 21, el cambio en la luminancia mostro una curva suave en la fase del tejido intersticial, y se encontro que la altura del pico dependfa de una tasa de cambio en el aumento de la fase del tejido intersticial; en otras palabras, muestra que un cambio de valores en la fase del tejido intersticial se puede predecir con una alta precision mediante un analisis de series de tiempo, y muestra motivos importantes para probar nuestra hipotesis de trabajo.
En el grupo de ICG, la diferencia en la luminancia no se observo inmediatamente despues de la inyeccion de A-carragenina y despues de una semana desde la administracion (Figura 25 y Figura 26). A partir de este resultado, se descubrio que el ICG, que es altamente hidrofobico y hasta ahora se ha utilizado clmicamente, no causo la fuga de la sustancia fluorescente fuera del vaso sangumeo, incluso si hubo una inflamacion aguda severa causada por, por ejemplo, A-carragenina.
A partir de los resultados descritos anteriormente, se hizo evidente que cuando la intensidad de fluorescencia de la unidad estructural en la cual se predice la progresion de la tumescencia se mide con el tiempo durante un termino correspondiente a la fase del tejido intersticial despues de administrar TK1 a un cuerpo vivo, el cambio en la subsiguiente intensidad de fluorescencia se puede predecir, y el cambio en la intensidad de fluorescencia es relevante para la progresion de la tumescencia en esa porcion. Por consiguiente, se puede encontrar que se puede usar TK1 en la prediccion de tumescencia que no se puede predecir mediante el uso de ICG.
Aplicabilidad industrial
Segun el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la formula qmmica 11 o la formula qmmica 12 de la presente invencion, puede proveerse un compuesto que es un pigmento verde y emite fluorescencia en el infrarrojo cercano, que se caracteriza por tener una mayor solubilidad en agua o en solucion salina fisiologica, eliminacion mas facil de los tejidos biologicos, asociacion de moleculas inferiores en una solucion acuosa e intensidad de fluorescencia en el infrarrojo cercano mas alta en una solucion acuosa en comparacion con ICG, y sin incluir yodo. Tambien de acuerdo con el metodo de smtesis del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion, se puede proporcionar una smtesis util del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina. Ademas, segun el metodo de purificacion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de la presente invencion, se puede proporcionar una purificacion util del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina. Ademas, el compuesto de indocianina unido a la ciclodextrina de la presente invencion puede proporcionar una composicion de diagnostico que no incluya yodo, el cual causa hipersensibilidad al yodo, porque el compuesto muestra una solubilidad suficiente incluso si no se incluye el yodo. La composicion de diagnostico muestra un comportamiento biologico diferente al de una composicion de diagnostico convencional que incluye ICG solo, y por lo tanto, se pueden proporcionar diversos metodos de diagnostico y dispositivos de diagnostico utiles utilizando esas propiedades.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la siguiente formula qmmica 11 o un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina en el cual al menos una parte de un grupo naftilo de una indocianina esta incluido en una cavidad de una ciclodextrina, representada por la siguiente formula qmmica 12:
[Formula Qmmica 11]
Figure imgf000030_0001
en donde s es un numero entero de 0 o mas y 4 o menos; y R es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo, un grupo arilo, un atomo de halogeno, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo sulfonilo, un grupo acido sulfonico, un grupo alquiloxicarbonilo, un grupo ariloxicarbonilo, un grupo alquilcarbonilo, un grupo arilcarbonilo o un anillo heterodclico;
[Formula Qmmica 12]
Figure imgf000030_0002
en donde s es un numero entero de 0 o mas y 4 o menos; y R es un atomo de hidrogeno, un grupo alquilo, un grupo arilo, un atomo de halogeno, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo sulfonilo, un grupo acido sulfonico, un grupo alquiloxicarbonilo, un grupo ariloxicarbonilo, un grupo alquilcarbonilo, un grupo arilcarbonilo o un anillo heterodclico.
2. El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina representado por la siguiente formula qmmica 15 o 19:
Figure imgf000031_0001
5 o que es un compuesto de indocianina unido a ciclodextrina en el cual al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina esta incluida en una cavidad de una ciclodextrina, representada por la siguiente formula qmmica 16 o 20:
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000032_0001
3. El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con la reivindicacion 2, que esta representado por la formula qmmica 19 o 20.
4. El compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con la reivindicacion 2, que esta representado por la formula qmmica 15 o 16.
5. Un metodo de smtesis qmmica del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con la formula qmmica 15 o 19 de acuerdo con la reivindicacion 2, que comprende: (1) una etapa de mezclar un compuesto de acido indocianincarboxflico representado por la siguiente formula 13 o 18 con una aminociclodextrina representada por la siguiente formula 14 en un medio, y (2) una etapa de una reaccion de condensacion-deshidratacion de la mezcla mediante la adicion de un agente de condensacion-deshidratacion al mismo:
Figure imgf000032_0002
6. Un metodo de smtesis qmmica del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con la formula qmmica 16 o 20 de acuerdo con la reivindicacion 2, que comprende una etapa de someter el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con la formula qmmica 15 o 19 a una reaccion de inclusion en agua.
7. Un metodo de purificacion del compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una etapa de purificacion del compuesto mediante cromatograffa en columna eluyendo con un medio que incluye HCl.
8. Una composicion de diagnostico el cual es una solucion acuosa que comprende el compuesto de indocianina unido a ciclodextrina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y se usa infundiendolo en un cuerpo.
9. La composicion de diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 8, que no incluye sustancialmente yodo.
10. Una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 20:
Figure imgf000033_0001
en la cual al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina esta incluida en una cavidad de una ciclodextrina, y preferiblemente
una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 20, que tiene un valor ESI-MS m/z [M]+ correspondiente a una formula molecular C135H197N4O73, o
una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 20, purificada por el metodo de purificacion de acuerdo con la reivindicacion 7.
11. Una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 16:
Figure imgf000033_0002
en la cual al menos una parte del grupo naftilo de la indocianina esta incluida en una cavidad de una ciclodextrina, y preferiblemente
una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 16, que tiene un valor ESI-MS m/z [M]+ correspondiente a una formula molecular C131H191N4O72, o
una indocianina solida unida a ciclodextrina representada por la formula qmmica 16, purificada por el metodo de purificacion de acuerdo con la reivindicacion 7.
12. Una composicion que comprende la indocianina unida a ciclodextrina solida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11.
13. Una composicion de diagnostico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9
para uso en operaciones medicas o diagnosticos medicos, en los cuales se observa la fluorescencia en el infrarrojo cercano emitida por la administracion de la composicion de diagnostico a un cuerpo, o,
para uso en operaciones medicas o diagnostico medico, en la cual se observa la fluorescencia en el infrarrojo cercano emitida por la administracion de la composicion de diagnostico en al menos uno de vaso sangumeo, vaso linfatico, cerebro, ojo, estomago, mama, esofago, piel, rinon, ureter, vejiga, uretra, pulmon y corazon, o
para uso en operaciones medicas o diagnosticos medicos, en donde las operaciones medicas o diagnosticos medicos proveen al menos una imagen visual, evaluacion de la circulacion cerebral, generacion de imagenes durante cirugfa cerebral, identificacion de un ganglio linfatico centinela, evaluacion de linfedema, colangiograffa intraoperatoria, marcacion tumoral, imagenes de la arteria coronaria y una imagen de vaso sangumeo abdominal.
14. La composicion de diagnostico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la composicion de diagnostico se usa para la visualizacion de una circulacion de sangre, fluido linfatico, fluido de tejido intersticial u orina.
15. La composicion de diagnostico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la composicion de diagnostico se usa para la generacion de imagenes de fluorescencia de rinon, ureter, vejiga o uretra.
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