ES2708804T3 - Adaptador vesicular y usos de este en la construcción y secuenciación de bibliotecas de ácidos nucleicos - Google Patents

Adaptador vesicular y usos de este en la construcción y secuenciación de bibliotecas de ácidos nucleicos Download PDF

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Abstract

Un adaptador vesicular de oligonucleótido para construir una biblioteca de ácidos nucleicos, que comprende: una región bicatenaria emparejada en 5' en un primer extremo terminal del adaptador; una región bicatenaria emparejada en 3' en un segundo extremo terminal del adaptador, que comprende una primera cadena y una segunda cadena complementarias entre sí, en donde la primera cadena comprende un saliente en el extremo 3' de esta y la segunda cadena comprende una base fosforilada en el extremo 5' de esta para proporcionar un extremo terminal adhesivo; y una región vesicular no emparejada entre la región bicatenaria emparejada en 5' y la región bicatenaria emparejada en 3', en donde la región vesicular no emparejada comprende una primera cadena y una segunda cadena no complementarias entre sí y la primera cadena es de una longitud mayor que la segunda cadena, en donde el adaptador vesicular es de una longitud de al menos 20 nt, preferentemente de 25 a 50 nt, y con mayor preferencia de 30 a 45 nt.

Description

DESCRIPCION
Adaptador vesicular y usos de este en la construccion y secuenciacion de bibliotecas de acidos nucleicos
La presente descripcion se refiere al campo de la biotecnolog â, en particular, a un adaptador vesicular y a un metodo para construir una biblioteca de acidos nucleicos y a un metodo para secuenciar la misma.
Antecedentes de la invencion
La tecnologfa de secuenciacion de segunda generacion, tambien conocida como tecnologfa de secuenciacion de proxima generacion, se denomina con respecto a la tecnologfa de secuenciacion de primera generacion representada por el metodo de secuenciacion de Sanger. La tecnologfa de secuenciacion de segunda generacion se representa por la pirosecuenciacion 454/Roche, la secuenciacion de smtesis de polimerasa Illumina/Solexa y la secuenciacion de ligasa ABI/SOLiD, y su caractenstica comun es un rendimiento alto de secuenciacion. En comparacion con estas plataformas de secuenciacion predominantes, la plataforma de secuenciacion de Complete Genomics (CG) con el rendimiento mas alto puede producir 9,9 Tb de datos en cada corrida, y su salida puede alcanzar los 50 Gb por hora, que es de 10-25 veces mayor que la de las plataformas de secuenciacion predominantes. Con respecto a la longitud de lectura para haploides, entre las plataformas de secuenciacion predominantes, solo el secuenciador de Illumina puede alcanzar una longitud de lectura de 8-10 kb para haploides, mientras que el secuenciador de CG puede alcanzar una longitud de lectura mayor que 99 kb. Ademas, el secuenciador de CG puede alcanzar una precision de hasta el 99,999 %, mejor que otros secuenciadores comerciales. Por lo tanto, en comparacion con las plataformas de secuenciacion predominantes, la plataforma de secuenciacion de CG tiene ventajas unicas.
En el proceso de construccion de una biblioteca de secuenciacion de acidos nucleicos, generalmente es necesario introducir un adaptador con una secuencia conocida para la secuenciacion. Sin embargo, se ha informado que cuando un adaptador se liga para la construccion de la biblioteca de manera conocida, no solo la eficiencia de ligacion no es lo suficientemente alta, sino que ademas surgen muchos subproductos de nivel bajo. Ademas, como la plataforma de secuenciacion de CG adopta una biblioteca monocatenaria dclica para la secuenciacion, las bibliotecas bicatenarias lineales construidas para las plataformas de secuenciacion predominantes no son por lo tanto adecuadas para los secuenciadores de CG. Sin embargo, en lo que respecta al metodo para construir la biblioteca monocatenaria dciica para la secuenciacion de acidos nucleicos, no se ha informado literatura hasta ahora.
Basado en la situacion anterior, se requiere desarrollarcon urgencia en latecnica relacionada un adaptador con eficiencia y precision alta de ligacion.
El documento WO 2009/1333466 proporciona metodos y composiciones para etiquetar asimetricamente un fragmento de acido nucleico mediante el uso de adaptadores asimetricos.
Bennet y otros. (2014) Biotechniques 56 (6) 289-300: "Library construction for ancient genomics; single strand or double­ strand?" describen una PCR mediada por ligacion de fragmentos de restriccion a partir de moleculas de ADN grandes.
Resumen
Un objeto de la presente descripcion es proporcionar en modalidades un adaptador vesicular para construir una biblioteca monocatenaria dclica para la secuenciacion de acidos nucleicos con alta eficiencia.
Otro objeto de la presente descripcion es proporcionar en modalidades un metodo para construir la biblioteca monocatenaria dclica y un metodo para secuenciar la misma.
En modalidades de un primer aspecto de la presente descripcion, se proporciona un adaptador vesicular de oligonucleotido para construir una biblioteca de acidos nucleicos, el adaptador vesicular de oligonucleotido comprende:
una region bicatenaria emparejada en 5' en un primer extremo terminal del adaptador;
una region bicatenaria emparejada en 3' en un segundo extremo terminal del adaptador, que comprende una primera cadena y una segunda cadena complementarias entre sf, en donde la primera cadena comprende un saliente en el extremo 3' de esta y la segunda cadena comprende una base fosforilada en el extremo 5' de esta para proporcionar un extremo terminal adhesivo; y
una region vesicular no emparejada entre la region bicatenaria emparejada en 5' y la region bicatenaria emparejada en 3',
en donde la region vesicular no emparejada comprende una primera cadena y una segunda cadena no complementarias entre sf y la primera cadena es de una longitud mayor que la segunda cadena,
en donde el adaptador vesicular es de una longitud de al menos 20 nt, preferentemente de 25 a 50 nt, y con mayor preferencia de 30 a 45 nt.
En una modalidad de la presente descripcion, el extremo terminal adhesivo de la region bicatenaria emparejada en 3' tiene una cola de una sola base.
En una modalidad de la presente descripcion, la cola de una sola base es timina (T).
En una modalidad de la presente descripcion, la primera cadena de la region vesicular no emparejada es mas larga que la segunda cadena de la region vesicular no emparejada por al menos 5 a 30 nt.
En una modalidad de la presente descripcion, la region bicatenaria emparejada en 5' tiene ademas un extremo terminal adhesivo.
En una modalidad de la presente descripcion, un extremo terminal adhesivo de la region bicatenaria emparejada en 5' tiene de 1 a 3 bases no complementarias.
En una modalidad de la presente descripcion, el adaptador vesicular comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y es de una estructura de formula I desde el extremo terminal 5' al extremo terminal 3':
Y0-Y1-Y2 (I)
en la cual
Y0 representa la region bicatenaria emparejada en 5', y es de una longitud de 10 a 15 nt, preferentemente 11 nt;
Y1 representa una region bicatenaria no emparejada, cuya cadena sentido es de una longitud de 5 a 30 nt mas larga que la de la cadena antisentido;
Y2 representa la region bicatenaria emparejada en 3'.
En una modalidad de la presente descripcion, el adaptador vesicular tiene las secuencias siguientes:
5’-GTCCTAAGACCNGATCGGGCTTCGACTGGAGACTCCGACTT-3' (sec. con num. de ident :1)
5 -/phos/AjGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGACAT-3’ (sec. con num. de ident:2)
En modalidades de un segundo aspecto de la presente descripcion, se proporciona un kit. El kit incluye:
un contenedor;
un adaptador vesicular de oligonucleotido de la invencion como se describe en la presente para construir una biblioteca, en donde el adaptador vesicular de oligonucleotido esta contenido en el contenedor;
un primer cebador que tiene la misma secuencia que al menos una porcion de la primera cadena de la region vesicular no emparejada;
un segundo cebador, emparejado espedficamente con la segunda cadena de la region vesicular no emparejada; y una instruccion.
En una modalidad de la presente descripcion, el primer cebador se usa como un cebador de secuenciacion.
En una modalidad de la presente descripcion, el adaptador esta contenido en un contenedor.
En modalidades de un tercer aspecto de la presente descripcion, se proporciona un metodo para construir una biblioteca monocatenaria dclica. El metodo incluye:
(a) reparar los extremos de un fragmento de ADN bicatenario para obtener un fragmento de ADN bicatenario con extremos terminales romos;
(b) agregar una base de adenina (A) a cada extremo 3' del fragmento de ADN bicatenario con los extremos terminales romos obtenidos en (a), para obtener un fragmento de ADN bicatenario con la base A en cada extremo 3' de este; (c) unir un adaptador vesicular de oligonucleotido de la invencion a cada extremo terminal del fragmento de ADN bicatenario con la base A en cada extremo 3' de este obtenido en (b) para obtener un fragmento de ADN bicatenario ligado con el adaptador vesicular de oligonucleotido en cada extremo terminal de este;
(d) emplear el fragmento de ADN bicatenario ligado con el adaptador vesicular de oligonucleotido en cada extremo terminal de este obtenido en (c), como una plantilla para la amplificacion por PCR con un par de cebadores como se describio anteriormente para obtener un producto de ADN amplificado, en donde uno de los pares de cebadores se marca con biotina;
(e) aislarel ADN monocatenario marcado con biotina a partir del producto de ADN bicatenario amplificado obtenido en (d) mediante el uso de perlas recubiertas con avidina mediante la combinacion "avidina-biotina" para obtener de esta forma la cadena simple menos biotina para la ciclacion;
(f) someter el ADN monocatenario menos biotina obtenido en (e) a la ciclacion en presencia de una molecula monocatenaria cicladora.
En una modalidad de la presente descripcion, el fragmento de ADN bicatenario ligado con el adaptador vesicular de oligonucleotido en cada extremo terminal de este obtenido en (c) tiene una estructura de formula III:
K1-K2-K3 (III)
en la cual,
K1 representa un adaptador vesicular como se describio anteriormente;
K2 representa una secuencia de ADN arbitraria (secuencia de un fragmento a secuenciar);
K3 representa otro adaptador vesicular como se describio anteriormente,
en la cual K1 y K3 se conectan a K2, respectivamente, en dos extremos terminales de K2.
En una modalidad de la presente descripcion, K2 tiene una longitud de aproximadamente 150 pb a aproximadamente 250 pb.
En una modalidad de la presente descripcion, el metodo incluye ademas:
(g) digerir los ADN no ciclados obtenidos en (f) con nucleasas que digieren espedficamente ADN lineales para obtener un producto previo; y
(h) purificar el producto previo obtenido en (g) para obtener la biblioteca monocatenaria dclica.
En una modalidad de la presente descripcion, el fragmento de ADN bicatenario en (a) se prepara mediante:
(a0) fragmentar una muestra de ARNm para obtener ARNm fragmentados; y
(a1) transcribir inversamente los ARNm fragmentados para obtener el producto amplificado de ADNc como los fragmentos de ADN bicatenario.
En una modalidad de la presente descripcion, el fragmento de ADN bicatenario en (a) se obtiene mediante la fragmentacion de una muestra de ADN.
En una modalidad de la presente descripcion, la avidina en (e) es estreptavidina.
En una modalidad de la presente descripcion, el par de cebadores en (d) incluye:
un cebador directo:
5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC (sec. con num. de ident:3); y
Un cebador inverso: 5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT (sec. con num. de ident.:4),
en el cual,
5-/phos/ indica que el nucleotido del extremo terminal 5' se modifica por fosforilacion;
NNNNNNNNNN representa una secuencia etiqueta, donde N representa adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G); y
5-/bio/ indica que el nucleotido del extremo terminal 5' se marca con biotina.
En una modalidad de la presente descripcion, la molecula monocatenaria cicladora en (f) es de una secuencia: TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC (sec. con num. de ident.: 5).
En una modalidad de la presente descripcion, las nucleasas usadas en (g) son exonucleasas.
En una modalidad de la presente descripcion, las nucleasas usadas en (g) incluyen una primera exonucleasa que digiere espedficamente ADN monocatenarios lineales y una segunda exonucleasa que digiere espedficamente ADN bicatenarios lineales.
En una modalidad de la presente descripcion, las nucleasas incluyen una mezcla de enzimas de Exo I y Exo III.
La invencion permite la provision de una biblioteca de secuenciacion para una plataforma de secuenciacion de rendimiento alto que requiere una biblioteca monocatenaria dclica, tal como la plataforma de secuenciacion de Complete Genomics. Breve descripcion de las figuras
La Fig. 1 es un diagrama de flujo que muestra el metodo para construir una biblioteca de acidos nucleicos de acuerdo con una modalidad de la presente descripcion;
La Fig. 2 es un diagrama que muestra la estructura de un adaptador vesicular de acuerdo con una modalidad de la presente descripcion;
La Fig. 3 es un diagrama que muestra el resultado de una concentracion del producto de PCR purificado detectado mediante Agilent 2100 en la construccion de la biblioteca de acidos nucleicos; y
La Fig. 4 es un electroferograma de bibliotecas detectadas por un gel desnaturalizado TBE al 6 %, donde los carriles 1 y 2 representan cada uno una biblioteca monocatenaria dclica, mientras que el carril 3 representa la escalera de ARNmc de rango bajo.
Descripcion Detallada
Los presentes inventores han desarrollado por primera vez un adaptador vesicular para construir de manera eficiente una biblioteca de secuenciacion de acidos nucleicos con alta calidad a traves de estudios extensos y profundos y un tamizaje extenso. Los resultados experimentales muestran que, en comparacion con los datos de secuenciacion obtenidos a partir de otras tecnicas de construccion de bibliotecas de secuenciacion de acidos nucleicos, la biblioteca de secuenciacion de acidos nucleicos construida con el adaptador vesicular de la presente descripcion tiene una calidad y correlacion mas altas, que puede usarse en la plataforma de secuenciacion de CG, para obtener de esta manera datos altamente autenticos y confiables sin influencia adversa en el analisis de la informacion. Basado en esto, se ha completado la presente invencion.
Plataforma de secuenciacion de CG
Para la plataforma de secuenciacion de CG, las nanoesferas de ADN se embeben en un chip mediante el uso de tecnologfa de nanochip de ADN de alta densidad, y las bases en la secuencia se leen con la tecnologfa de ligacion sondasitio de anclaje combinatoria (cPAL, por sus siglas en ingles).
Se obtuvieron ADN monocatenarios dclicos despues de la construccion de la biblioteca. Se formo una nanoesfera de ADN (DNB, por sus siglas en ingles), que inclrna mas de 200 copias de ADN monocatenarios dclicos, mediante amplificacion por cfrculo rodante, y despues se embebio en un agujero en un chip mediante el uso de la tecnologfa de nanochip de ADN de alta densidad, con cada agujero capaz de alojar solo una nanoesfera de ADN (ya que una nanoesfera de ADN, una vez que se combina con el agujero en el chip, excluira la combinacion de otras nanoesferas de ADN con el mismo agujero). La tasa de ocupacion del nanochip de ADN fue superior al 90 %, y cada nanochip de ADN preparado puede alojar 180 mil millones de bases para la obtencion de imagenes.
La tecnica cPAL usa sondas marcadas con cuatro colores diferentes para leer las bases adyacentes al adaptador en un maximo de 10 bases consecutivas por cada vez. Como cada secuenciacion es independiente entre sf, es decir, el resultado de la secuenciacion no se afecta por un resultado de secuenciacion anterior, se evita de esta forma la acumulacion de errores, lo que resulta en un resultado de secuenciacion de alta precision con una tasa de error de base tan baja como 1/100.000. Durante la secuenciacion, se anade una molecula de anclaje a un par complementario con el adaptador, despues las sondas marcadas con cuatro colores diferentes se emparejan con las bases correspondientes de la plantilla con las ligasas de ADN. Los tipos de bases se determinan por obtencion de imagenes de grupos fluorescentes. Otra ventaja de la tecnologfa cPAL es que las concentraciones de sondas y enzimas pueden reducirse en gran medida ya que las bases se leen mediante el uso de una tecnologfa de ligacion sonda-sitio de anclaje combinatoria (cPAL) no continua y sin enlace. A diferencia de la secuenciacion por smtesis, pueden leerse varias bases una vez en cada ciclo de cPAL, de manera que los consumos de los reactivos de secuenciacion y el tiempo de obtencion de imagenes pueden reducirse en gran medida. En comparacion con la popular tecnologfa actual de secuenciacion de proxima generacion, los metodos para construir una biblioteca y secuenciar la misma de acuerdo con las modalidades de la presente descripcion pueden obtener muchos mas datos a la vez que consumen menos reactivos.
Metodo para construir una biblioteca
Una muestra de ARN se digirio con ADNasa I. Los ARN digeridos se purificaron con perlas magneticas limpias de ARN. Los ARNm de los ARN totales se aislaron y purificaron con perlas magneticas Oligo (dT)25, seguido de fragmentacion para obtener ARNm fragmentados. Los ADNc se sintetizaron por transcripcion inversa de los ARNm fragmentados, y despues se repararon en los extremos para formar fragmentos de ADN con extremos terminales romos a los que se anadieron bases A para obtener fragmentos de ADN cada uno con una base A en el extremo terminal 3' de este. Los fragmentos de ADN obtenidos, cada uno con una base A en el extremo terminal 3' de estos, se ligaron con adaptadores vesiculares para obtener fragmentos de ADN ligado cada uno con el adaptador vesicular en cada extremo terminal de este, los que se purificaron con perlas magneticas y despues se amplificaron mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) donde un cebador usado se marca con biotina. El producto de la PCR obtenido de esta forma se aislo mediante perlas magneticas recubiertas con estreptavidina para obtener un producto monocatenario de la PCR, que se ciclo mediante oligonucleotidos puente y ligasas T4. El producto monocatenario de la PCR no ciclado se digirio enzimaticamente para obtener la biblioteca monocatenaria dclica.
Biblioteca monocatenaria dclica
La presente descripcion proporciona ademas en las modalidades una biblioteca monocatenaria dclica, que es adecuada para la secuenciacion y se construye por el metodo descrito anteriormente para construir una biblioteca.
En una modalidad preferida de la presente descripcion, los presentes inventores han verificado completamente la estabilidad, repetibilidad y verdadera fiabilidad del metodo de la presente descripcion mediante la exploracion de la condicion optima para construir la biblioteca y la comparacion de los resultados obtenidos en condicion optima con los obtenidos mediante las otras tecnicas. Ademas, se ha demostrado mediante varios experimentos con muestras diferentes que, los datos de secuenciacion obtenidos por la biblioteca monocatenaria dclica de la presente descripcion son crefoles verdaderamente.
Las ventajas de la presente descripcion radican en que:
(1) El adaptador vesicular para construir la biblioteca de acidos nucleicos se inventa por vez primera.
(2) Con el uso de un adaptador vesicular en las modalidades de la presente descripcion en la construccion de la biblioteca de acidos nucleicos, tanto la eficiencia de ligacion como la eficiencia de la PCR subsecuente son altas y las etapas de seguimiento son pocas.
(3) La biblioteca de acidos nucleicos en las modalidades de la presente descripcion puede usarse, ademas, en una plataforma de secuenciacion que necesita una biblioteca monocatenaria dclica.
(4) El metodo proporcionado en modalidades de la presente descripcion es de rendimiento alto de secuenciacion, precision alta y operacion simple.
(5) El metodo proporcionado en las modalidades de la presente descripcion es de alta estabilidad, repetibilidad y fiabilidad.
La presente descripcion se describira adicionalmente a continuacion con referencia a modalidades espedficas. Se apreciara que estas modalidades se usan meramente para ilustrar la presente descripcion y no deben interpretarse para limitar el alcance de la presente descripcion. Los metodos experimentales en las modalidades siguientes, que no especifican las condiciones detalladas, se llevaran a cabo de acuerdo con las condiciones convencionales, tal como se describio en Sambrook y otros, Molecular Cloning: Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o de acuerdo con las condiciones propuestas por el fabricante. Los porcentajes y las partes son en peso, a menos que se indique de cualquier otra manera.
Materiales y metodos
En las modalidades siguientes, el reactivo se preparo como sigue: 5 * primer tampon de cadena que contiene: cloruro de sodio 80-400 mM, cloruro de magnesio 10-80 mM, Tris-HCl 200 mM a 300 mM, fosfato, y agua como solvente, con un pH de 8,0-8,5. La sustancia estandar, el ARN de referencia humano universal, se compro a Agilent. Dicho ARN es una mezcla de 10 tipos de lmeas celulares humanas (celulas de mama, celulas de carcinoma de hepatoma, celulas cervicales, celulas embrionarias, celulas de glioma maligno, celulas de melanoma, celulas de liposarcoma, celulas de linfoma, celulas T de leucemia y linfocito B de medula osea).
Los fragmentos de ADN se purificaron mediante perlas magneticas Ampure XP.
Los materiales usados en las modalidades de la presente descripcion estan todos disponibles comercialmente, a menos que se especifique de cualquier otra manera.
Modalidad 1
Construccion de biblioteca de ARN con el uso del adaptador de nucleotido vesicular
Los procedimientos espedficos se llevaron a cabo de la manera siguiente (ver los procedimientos que se muestran en la Fig. 1)
Los procedimientos espedficos:
1. Purificacion de ARNm:
1) Se anadio ARN de referencia humano universal estandar (3 |jg, Agilent) en un tubo libre de ARNasa y se diluyo en 50 j l con DEPC. La mezcla obtenida se desnaturalizo a 65 °C durante 5 min despues de una mezcla uniforme para degradar la estructura secundaria del ARN, despues se coloco inmediatamente en hielo para obtener una muestra de ARN. 2) Se anadieron 15 j l de perlas magneticas Dynabeads Oligo (dT)25 a un tubo Ep no adhesivo, se lavaron dos veces con 100 j l de tampon de union, despues se resuspendieron en 50 j l de tampon de union, seguido de combinacion con la muestra de a Rn obtenida en 1), y finalmente se dejo en reposo durante 5 min a temperatura ambiente.
3) El tubo EP no adhesivo se coloco en un MPC (separador magnetico) durante 2 min para eliminar el sobrenadante. Las perlas magneticas restantes se lavaron dos veces con 200 j l de tampon de lavado. Se anadieron 50 j l de tampon de union a un nuevo tubo EP no adhesivo.
4) El tubo EP (es decir, el tubo EP no adhesivo en 3) que contema perlas magneticas se anadio con 50 j l de Tris-HCl 10 mM y se calento a 80 °C durante 2 min para eluir los ARNm de las perlas magneticas. Despues, el tubo EP no adhesivo se transfirio rapidamente al MPC. Los ARNm se transfirieron al nuevo tubo EP no adhesivo que contema el tampon de union en 3), la mezcla obtenida se desnaturalizo a 65 °C durante 5 min para degradar la estructura secundaria de los ARNm, despues se coloco inmediatamente en hielo. Ademas, se anadieron inmediatamente 200 j l de tampon de lavado en el tubo que contema las perlas magneticas restantes para lavar las perlas magneticas dos veces.
5) Se anadieron 100 |jl de muestra de ARNm con perlas magneticas lavadas dos veces y despues se dejaron en reposo durante 5 min a temperatura ambiente. El tubo EP se coloco en el MPC durante 2 min, el sobrenadante se aspiro cuidadosamente y las perlas magneticas restantes se lavaron dos veces con 200 j l de tampon de lavado.
6) El tubo EP que contema las perlas magneticas se anadio con 17 j l de Tris-HCl 10 mM, despues se calento a 80 °C durante 2 min para eluir los ARNm de las perlas magneticas. El tubo EP se coloco rapidamente en el MPC. El eluyente que contema los ARNm se transfirio a un nuevo tubo de PCR de 200 jl. Se reciclaron aproximadamente 16 j l de ARNm.
2. Fragmentacion del ARNm y smtesis de una primera cadena
Despues de combinar con 3 j l de tampon de la primera cadena 5X, el eluyente obtenido en la etapa anterior se incubo primeramente a 94 °C durante 10 min seguido por su colocacion inmediata en hielo, luego se combino con 1 j l de cebadores aleatorios, y se incubo despues a 65 °C durante 5 min para degradar la estructura secundaria seguido de la colocacion en hielo. Se anadio una mezcla de reaccion, formulada con DTT 100 mM (2 jl), mezcla de dNTP 25 mM (0,4 j l ) e inhibidor de ARNasa (0,5 j l ) en el tubo que contema el ARN, a continuacion se mezclo para uniformarla y luego se dejo en reposo durante 2 min a temperatura ambiente, despues se combino con 1 j l de Superscript II (200 U /jl) y agua hasta 25 jl. La reaccion de PCR se realizo de acuerdo con los procedimientos siguientes:
Figure imgf000007_0001
3. Smtesis de una segunda cadena.
Despues de la reaccion de PCR anterior, el sistema de reaccion resultante se anadio a agua hasta 82,8 jl, despues se mezclo con 10 j l del tampon de la segunda cadena 5 X y 1,2 j l de mezcla de dNTP 25 mM en secuencia para uniformarla, seguido de la colocacion en hielo durante 5 min, y despues se mezclo con 1 j l de RNasaH y 5 j l de ADN Pol I para uniformarla. Dicho sistema de reaccion obtenido para sintetizar una segunda cadena se incubo a 16 °C durante 2,5 h.
Despues de que se completo la reaccion, el producto bicatenario resultante se purifico con perlas magneticas Ampure XP, y el producto bicatenario purificado (ADN) se disolvio en 50 j l de tampon EB.
4. Reparacion de extremos
Se anadieron sucesivamente 50 j l de la solucion que contema ADN bicatenarios obtenidos en la etapa anterior con 27,4 j l de agua, 10 j l de tampon de reparacion de extremos 10X, 1,6 j l de mezcla de dNTP 25 mM, 5 j l de ADN polimerasas T4, 1 j l de ADN polimerasa Klenow y 5 j l de PNK T4 para formar 100 j l de sistema de reaccion que se incubo a 20 °C durante 30 min.
Despues de que se completo la reaccion, el producto reparado en los extremos se purifico con perlas magneticas Ampure XP y despues se disolvio en 32 j l de tampon EB.
5. Adicion de base A y ligacion del adaptador
Se anadieron sucesivamente 32 j l de solucion que contema los ADN reparados en los extremos obtenidos en la etapa anterior con 5 j l de tampon de formacion de cola-A, 10 j l de dATP 1 mM y 3 j l de exo Klenow (actividades inhibitorias de exonucleasas para digerir desde el extremo 3' hasta el extremo 5') para formar un sistema de reaccion de 50 jl, que se incubo a 37 °C durante 30 min.
Despues de que se completo la reaccion, el producto con la base A anadida se purifico con perlas magneticas Ampure XP y despues se disolvio en 23 j l de tampon EB.
Se anadieron sucesivamente 23 j l de la solucion que contema el producto con la base A anadida obtenido en la etapa anterior con 25 j l de tampon ADN ligasa Rapid T42X, 1 j l de mezcla del adaptador vesicular (con una estructura como se muestra en la Fig. 2) (que contiene el adaptador vesicular en una cantidad de 50 jm ol) y 1 j l de ADN ligasa T4 para formar 50 j l de sistema de reaccion, que se incubo a temperatura ambiente durante 15 min.
La secuencia del adaptador fue la siguiente:
5'-GTCCTAAGACCNGATCGGGCTTCGACTGGAGACTCCGACTT-3' (sec. con num. de ident.:1)
5'-/phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGACAT-3' (sec. con num. de ident.: 2)
Despues de que se completo la reaccion, el producto de ligacion se purifico con perlas magneticas Ampure XP, y despues se disolvio en 10 pi de tampon EB.
6. Amplificacion por PCR y purificacion
Se anadieron sucesivamente 30 pl de solucion que contema el producto ligado al adaptador obtenido en la etapa anterior con 10 pl de tampon Phusion 5X, 1 pl de Cebador directo de la PCR (5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC) (sec. con num. de ident.: 3), 1 pl de Cebador Inverso de la PCR (5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT) (sec. con num. de ident.: 4), 0,5 pl de mezcla de dNTP 25 mM, 0,5 pl de ADN polimerasa Phusion y 7 pl de agua para formar 50 pl del sistema de reaccion, que se incubo en el instrumento de la PCR de acuerdo con los procedimientos siguientes:
a. 30 seg, 98 °C
b. 15 ciclos:
10 seg, 98 °C
30 seg, 65 °C
30 seg, 72 °C
c. 5 min, 72 °C
d. mantener a 4 °C
Despues que se completo la reaccion, el producto de la PCR amplificado se purifico con perlas magneticas Ampure XP y despues se disolvio en 32 pl de tampon EB. La concentracion del producto de la PCR purificado se detecto con Agilent 2100, y los resultados se muestran en la Fig. 3.
7. Aislamiento de un producto monocatenario
7.1 Lavado de perlas magneticas recubiertas con estreptavidina
Se mezclaron 30 pl de perlas magneticas recubiertas con estreptavidina (para cada muestra) con 90 pl a 150 pl del tampon de union de perlas magneticas 1X para uniformarla en un tubo no adhesivo, que despues se coloco en un separador magnetico para reposo y adsorcion. El tubo no adhesivo se ajusto para estar en una direccion tal que permite que las perlas magneticas se muevan hacia adelante y hacia atras en el tampon de union de perlas magneticas 1X, seguido por la eliminacion del sobrenadante. Despues de que la etapa de ajuste de la direccion se repitio una vez, se saco el tubo no adhesivo del separador magnetico, se agregaron 30 pl de tampon de union de perlas magneticas 1X, seguido de reposo a temperatura ambiente.
7.2 Despues de combinar con agua hasta 60 pl, el producto de la PCR purificado obtenido en la etapa 6 se mezclo primero con 20 pl de tampon de union de perlas magneticas 4X para uniformarla, y despues se transfirio al tubo no adhesivo obtenido en 7.1 que contema perlas magneticas disuelto en 30 pl de tampon de union de perlas magneticas 1X, seguido de mezcla para uniformarla. Dicha mezcla resultante de 110 pl se incubo a temperatura ambiente durante 15 a 20 min, durante los cuales la mezcla se agito suavemente una vez para que se distribuyera uniformemente.
7.3 El tubo no adhesivo despues de la etapa 7.2 se coloco en el separador magnetico durante 3 a 5 min, seguido de la eliminacion del sobrenadante. Las perlas magneticas restantes se lavaron dos veces con 1 ml de tampon de lavado de perlas magneticas 1Xcomo se describio en la etapa 7.1.
7.4 Las perlas magneticas despues de la etapa 7.3 se mezclaron uniformemente con 78 pl de NaOH 0,1 M mediante soplado hacia arriba y hacia abajo para obtener una mezcla, seguido de reposo durante 10 min y despues se colocaron en el separador magnetico durante 3 a 5 min. Los 74,5 pl de sobrenadante obtenidos de esta forma se transfirieron a un nuevo tubo EP de 1,5 ml.
7.5 Se anadieron 37,5 pl de MOPS 0,3 M en el tubo EP de 1,5 ml despues de la etapa 7.4, seguido de una mezcla para uniformarla, para obtener de esta manera una muestra de 112 pl para su uso.
7.6 La muestra de 112 pl puede almacenarse a -20 °C.
8. Ciclacion del producto monocatenario
8.1 Se formulo una solucion de reaccion de cebador de la manera siguiente aproximadamente 5 min antes:
ON1587 (TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC) (sec. con num. de ident.:5)
agua 43 pl
ON158720 pM 20 pl
Volumen total 63 pl
8.2 Se mezclaron 63 |jl de la solucion de reaccion del cebador obtenida en la etapa 8.1 mediante agitacion meticulosa, se centrifugaron y despues se anadieron a la muestra de 112 j l obtenida en la etapa 7 (la cantidad inicial n de la muestra fue cntica y se controlo generalmente dentro de 100 ng<n<800 ng).
8.3 Se formulo una solucion de reaccion de ligasa de la manera siguiente aproximadamente 5 minutos antes:
agua 135,3 j l
Tampon TA 10X(LK1) 35 j l
ATP 100 mM 3,5 j l
Ligasa 600 U /jl 1,2 j l
total 175 j l
8.4 Se mezclaron 175 j l de solucion de reaccion de ligasa obtenida en la etapa 8.3 mediante agitacion meticulosa, se centrifugaron y despues se anadieron al tubo EP despues de la etapa 8.2 que contema la solucion de reaccion del cebador. Una mezcla obtenida de esta forma en esta etapa se mezclo mediante agitacion durante 10 s para uniformarla, y despues se centrifugo.
8.5 La mezcla obtenida en la etapa 8.4 se incubo en una incubadora durante 1,5 h a 37 °C.
8.6 Despues de que se completo la reaccion, se detecto 10 j l de la muestra resultante mediante deteccion por electroforesis en un gel desnaturalizado al 6 %, y la muestra restante en aproximadamente 350 j l se dejo para la reaccion enzimatica siguiente.
9. Digestion enzimatica
9.1 Se formulo una solucion de reaccion de digestion enzimatica de la manera siguiente aproximadamente 5 minutos antes:
agua 1,5 j l
Tampon TA 10X(LK1) 3,7 j l
Exo I 20 U /jl 11,1 j l
Exo III 200 U /jl 3,7 j l
total 20 j l
9.2 Se mezclaron 20 j l de la solucion de reaccion de digestion enzimatica obtenida en la etapa 9.1 mediante agitacion meticulosa, se centrifugaron, y despues se anadieron a 350 j l de la muestra obtenida en la etapa 8.5 para obtener una mezcla.
9.3 La mezcla obtenida en la etapa 9.2 se mezclo mediante agitacion durante 10 s para uniformarla, y se centrifugo, y despues se incubo en la incubadora durante 30 min a 37 °C.
9.4 Despues de 30 min, la reaccion enzimatica se detuvo mediante la adicion de 15,4 j l de EDTA 500 mM.
9.5 Una muestra obtenida en la etapa 9.4 se purifico con perlas magneticas PEG32 1,3X/Tween 20 (o perlas magneticas Ampure XP) de la manera siguiente:
La muestra obtenida en la etapa 9.4 se transfirio a un tubo no adhesivo de 1,5 ml, y despues se combino con 500 j l de perlas magneticas PEG32. La mezcla obtenida de esta forma se dejo para la ligacion a temperatura ambiente durante 15 min, durante los cuales la mezcla se mezclo una vez mediante soplado hacia arriba y hacia abajo para uniformarla. 9.6 El tubo no adhesivo despues de la etapa 9.5 se coloco en el separador magnetico durante 3 a 5 min, despues de lo cual se desecho el sobrenadante, las perlas magneticas restantes se lavaron dos veces con 700 j l de etanol al 75 %, durante cada una de los cuales el tubo no adhesivo se invirtio hacia adelante y hacia atras para permitir que las perlas magneticas se movieran de 2 a 3 veces en el etanol.
9.7 Las perlas magneticas despues del lavado se secaron al aire, y despues se disolvieron nuevamente en 40 j l de TE 1X durante 15 min, durante lo cual la mezcla obtenida de esta forma se mezclo una vez para uniformarla.
9.8 El sobrenadante de la mezcla obtenida en la etapa 9.8 se transfirio a un nuevo tubo EP de 1,5 ml, el producto final se cuantifico con el kit de ensayo de ADNmc Qubit™.
9.9 Se mezclaron respectivamente 5 pl de la muestra y 2 pl de escalera de ARN de rango bajo con 5 pl de tampon de carga de ARN 2X para uniformarla en diferentes tubos de la PCR, los cuales se incubaron a 95 °C durante 2 min para la desnaturalizacion en un instrumento de PCR, y se enfriaron rapidamente en hielo durante 5 min. Las muestras resultantes se detectaron con un gel desnaturalizado TBE al 6 %. Los resultados se muestran en la Fig. 4.
9.10 Estandarizacion de la concentracion
La cantidad inicial de la muestra preparada con nanoesfera de ADN (DNB) se ajusto uniformemente a 7,5 fmol/pl de acuerdo con la concentracion a la que se detectaron cuantitativamente las moleculas monocatenarias.
Modalidad 2
Comparacion de la eficiencia de la PCR del adaptador vesicular en la construccion de la biblioteca con la de otros tipos de adaptadores
Las etapas espedficas fueron las siguientes:
Se llevaron a cabo las mismas etapas que aquellas descritas en la Modalidad 1, donde un adaptador fue el adaptador vesicular, y el adaptador de comparacion fue un adaptador compatible. La amplificacion por PCR y la purificacion como se describio en la etapa 6 se completaron, despues de lo cual se detecto la cantidad de producto de la PCR purificado. La concentracion de la plantilla de la PCR y la concentracion de reciclaje se midieron con el kit de ensayo de ADNbc Qubit.
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla
Adaptador Adaptador compatible Adaptador vesicular
Cantidad de plantilla de la PCR (ng) 10 10
Concentracion de producto reciclado (ng/ul) 5,66 53
Cantidad total de producto reciclado (ng) 226,4 2120
Eficiencia de la PCR 1,366 1,709
Nota : Eficiencia de la PCR = (rendimiento total de la PCR/cantidad inicial de la plantilla) *
(1/ciclos)
Puede verse del resultado anterior que la eficiencia de la PCR del adaptador vesicular es mayor aparentemente que la del adaptador compatible.

Claims (14)

Reivindicaciones
1. Un adaptador vesicular de oligonucleotido para construir una biblioteca de acidos nucleicos, que comprende:
una region bicatenaria emparejada en 5' en un primer extremo terminal del adaptador;
una region bicatenaria emparejada en 3' en un segundo extremo terminal del adaptador, que comprende una primera cadena y una segunda cadena complementarias entre sf, en donde la primera cadena comprende un saliente en el extremo 3' de esta y la segunda cadena comprende una base fosforilada en el extremo 5' de esta para proporcionar un extremo terminal adhesivo; y
una region vesicular no emparejada entre la region bicatenaria emparejada en 5' y la region bicatenaria emparejada en 3',
en donde la region vesicular no emparejada comprende una primera cadena y una segunda cadena no complementarias entre sf y la primera cadena es de una longitud mayor que la segunda cadena,
en donde el adaptador vesicular es de una longitud de al menos 20 nt, preferentemente de 25 a 50 nt, y con mayor preferencia de 30 a 45 nt.
2. El adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el extremo terminal adhesivo de la region bicatenaria emparejada en 3' tiene una cola de una sola base.
3. El adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con la reivindicacion 2, en donde la cola de una sola base es timina (T).
4. El adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la primera cadena de la region vesicular no emparejada es mas larga que la segunda cadena de la region vesicular no emparejada por al menos 5 a 30 nt.
5. El adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la region bicatenaria emparejada en 5' tambien tiene un extremo terminal adhesivo.
6. El adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la region bicatenaria emparejada en 5' tiene un extremo terminal adhesivo de 1 a 3 bases no complementarias.
7. El adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido y que tiene una estructura de formula I desde el extremo terminal 5' al extremo terminal 3':
Y0-Y1-Y2 (I)
en donde
Y0 representa la region bicatenaria emparejada en 5' y es de una longitud de 10-15 nt, preferentemente 11 nt; Y1 representa una region bicatenaria no emparejada cuya cadena sentido es de una longitud 5-30 nt mas larga que la de la cadena antisentido;
Y2 representa la region bicatenaria emparejada en 3'.
8. Un kit para construir una biblioteca de acidos nucleicos, que comprende:
un contenedor;
un adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para construir una biblioteca en donde el adaptador vesicular de oligonucleotido esta contenido en el contenedor; un primer cebador que tiene la misma secuencia que al menos una porcion de la primera cadena de la region vesicular no emparejada;
un segundo cebador, emparejado espedficamente con la segunda cadena de la region vesicular no emparejada; y
una instruccion.
9. El kit de conformidad con la reivindicacion 8, en donde el primer cebador se proporciona ademas como un cebador de secuenciacion.
10. Uso de un adaptador vesicular de oligonucleotido de conformidad con la reivindicacion 1 para construir una biblioteca de acidos nucleicos en donde un fragmento de ADN bicatenario se liga con el adaptador vesicular de oligonucleotido en cada extremo terminal de este para proporcionar una estructura K1-K2-K3 en la cual K1 y K3 representa cada una un adaptador vesicular ligado mediante el extremo terminal adhesivo de dicha region bicatenaria emparejada en 3', en donde K2 representa una secuencia de ADN arbitraria (secuencia de un fragmento a secuenciar); en el que K1 y K2 se conectan a K2, respectivamente, en dos extremos terminales de K2.
11. El uso de un adaptador de oligonucleotido como se reivindico en la reivindicacion 10, en donde se emplea un kit como se reivindico en la reivindicacion 8 y dichos primer y segundo cebadores de dicho kit se emplean para la amplificacion por PCR mediante el uso de dicha estructura K1-K2-K3.
12. Un metodo para construir una biblioteca monocatenaria dclica, que comprende:
(a) reparar los extremos de un fragmento de ADN bicatenario para obtener un fragmento de ADN bicatenario con extremos terminales romos;
(b) anadir una base de adenina (A) a cada extremo 3' del fragmento de ADN bicatenario con los extremos terminales romos obtenidos en (a), para obtener un fragmento de ADN bicatenario con una base A en cada extremo 3' de este;
(c) ligar un adaptador vesicular de oligonucleotido como se reivindico en la reivindicacion 3 a cada extremo terminal del fragmento de ADN bicatenario con la base A en cada extremo 3' de este obtenido en (b) para obtener un fragmento de ADN bicatenario ligado con el adaptador vesicular de oligonucleotido en cada extremo terminal de este;
(d) emplear el fragmento de ADN bicatenario ligado con el adaptador vesicular de oligonucleotido en cada extremo terminal de este obtenido en (c), como plantilla para la amplificacion por PCR con un par de cebadores como se define en la reivindicacion 8 para obtener un producto amplificado de ADN, en donde uno del par de cebadores se marca con biotina;
(e) aislar el ADN monocatenario marcado con biotina a partir del producto de ADN bicatenario amplificado obtenido en (d) mediante el uso de perlas recubiertas con avidina mediante la combinacion "avidina-biotina", para obtener de esta forma el ADN monocatenario menos biotina para la ciclacion;
(f) someter el ADN monocatenario menos biotina obtenido en (e) a la ciclacion en presencia de una molecula monocatenaria cicladora.
13. El metodo de conformidad con la reivindicacion 12, que comprende ademas:
(g) digerir los ADN no ciclados obtenidos en (f) con nucleasas que digieren espedficamente ADN para obtener un producto previo; y
(h) purificar el producto previo obtenido en (g) para obtener la biblioteca monocatenaria dclica.
14. El metodo de conformidad con la reivindicacion 13, en donde las nucleasas usadas en (g) comprenden una primera exonucleasa que digiere espedficamente ADN monocatenarios lineales y una segunda exonucleasa que digiere espedficamente ADN bicatenarios lineales.
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