ES2708976T3

ES2708976T3 - Procedimiento para producir EMD de estabilidad aumentada

Info

Publication number: ES2708976T3
Application number: ES15702962T
Authority: ES
Inventors: Alessandra Apicella; Peggy Heunemann
Original assignee: Straumann Holding AG
Current assignee: Straumann Holding AG
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2015-01-19
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2035-01-19
Also published as: US20160324728A1; EP3094308B1; JP2017502995A; WO2015106970A1; JP6483139B2; EP3094308A1

Abstract

Un procedimiento para producir una formulación farmacéutica, dental y/o cosmética que comprende proteínas de la matriz del esmalte y/o proteínas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehículo farmacéutico adecuado, que comprende las siguientes etapas: a. aislar proteínas de la matriz del esmalte y/o proteínas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) de unos dientes de mamíferos en desarrollo, b. disolver dichas proteínas aisladas en un vehículo farmacéutico adecuado, c. disminuir el pH de dicha formulación inicialmente hasta por debajo de pH 4, y d. calentar dicha formulación hasta entre 40-100ºC durante al menos 10 minutos

Description

DESCRIPCION

Procedimiento para producir EMD de estabilidad aumentada

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) purificadas, que es estable al calor. En particular, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir formulaciones estables de protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD), en donde dichas protemas y/o derivados se solubilizan en una formulacion de pH bajo antes de ser sometidas a una etapa de tratamiento con calor.

Antecedentes de la invencion

Las protemas de la matriz del esmalte, presentes en la matriz del esmalte, son muy bien conocidas como precursores del esmalte. Antes de la formacion del cemento dental, las protemas de la matriz del esmalte se depositan en la superficie de la rafz en el extremo apical de la rafz del diente en desarrollo. Hay evidencias de que la matriz del esmalte depositada es el factor iniciador para la formacion del cemento dental. De nuevo, la formacion del cemento dental en sf esta asociada con el desarrollo del ligamento periodontal y el hueso alveolar. Las protemas de la matriz del esmalte pueden promover por lo tanto la regeneracion periodontal imitando el desarrollo de la union natural en el diente (Gestrelius S, Lyngstadaas SP, Hammarstnam L. Emdogain - periodontal regeneration based on biomimicry. Clin Oral Invest 4:120-125 (2000)).

Las protemas de la matriz del esmalte aisladas pueden inducir no solo uno sino una cascada orquestada de factores, encontrados naturalmente en tejidos que se desarrollan adyacentes a la matriz del esmalte. Imitan el entorno natural de un tejido en desarrollo, y por tanto imitan una estimulacion natural para la regeneracion de tejidos, diferenciacion celular y/o maduracion.

El derivado de la matriz del esmalte (EMD), en la forma de un extracto acido purificado de protemas de la matriz del esmalte del cerdo, se ha empleado previamente con exito para restaurar el ligamento periodontal funcional, el cemento dental y el hueso alveolar en pacientes con una perdida grave de la union del diente (Hammarstrom et al, 1997, Journal of Clinical Periodontology 24, 658-668).

Ademas, en estudios sobre celulas del ligamento periodontal (PDL) cultivadas, se mostro que la velocidad de union, el crecimiento y el metabolismo de estas celulas fueron aumentados significativamente cuando estuvo presente EMD en los cultivos. Tambien, las celulas expuestas al EMD mostraron una senalizacion de cAMP intracelular aumentada y una produccion autocrina de factores de crecimiento, cuando se compararon con los controles. Las celulas epiteliales, por otra parte, aunque aumentan la senalizacion de cAMP y la secrecion de factores de crecimiento cuando estuvo presente EMD, fueron inhibidas tanto en proliferacion como crecimiento (Lyngstadaas et al., 2001, Journal of Clinical Periodontology 28, 181-188).

Se ha descrito previamente en la bibliograffa de patentes que las protemas de la matriz del esmalte y los derivados de la matriz del esmalte (EMD) pueden inducir la formacion de tejido duro (es decir, formacion del esmalte, patente de EE.UU. N° 4.672.032 (Slavkin)), promocionar la union entre tejidos duros (patentes europeas EP-B-0 337 967 y EP-B-0263 086), promover la curacion de heridas abiertas, tales como de la piel y la mucosa, tener un efecto beneficioso sobre el tratamiento de infecciones y enfermedades inflamatorias (patentes europeas EP-1059934 y EP-01201915.4), reparar tejido mineralizado y no mineralizado, tal como hueso, cartflago, dientes, tejido blando y mucosa, tratar una afeccion que implica inflamacion o infeccion (solicitud de patente internacional WO 06/64381), inducir la regeneracion de la dentina (solicitud de patente internacional WO 01/97834), promover la aceptacion de un injerto (solicitud de patente internacional WO 00/53197), inducir apoptosis en el tratamiento de neoplasmas (solicitud de patente internacional WO 00/53196), regular el desequilibrio en una respuesta inmunitaria a una infeccion o inflamacion sistemica (solicitud de patente internacional WO 03/024479), y facilitar el llenado de la cavidad de una herida y/o defecto de tejido despues de una operacion y/o trauma, tal como una cirugfa citorreductiva (solicitud de patente internacional WO 02/080994).

El EMD esta compuesto de varias protemas, tales como melogeninas, enamelina, protema del penacho, proteasas y albumina. Las amelogeninas, un constituyente mayoritario del EMD, al menos hasta 60%-90%, tal como 70-90%, son una familia de protemas hidrofobas derivables de un unico gen por corte y empalme alternativo y procesamiento postsecretor controlado. Estan altamente conservadas a traves de la evolucion de los vertebrados, y demuestran un alto nivel global de homologfa de secuencias entre todos los vertebrados superiores examinados (80%). De hecho, las secuencias de transcripcion de genes de amelogenina porcina y humana difieren solo en 4% de las bases. Por tanto, las protemas de la matriz del esmalte y/o las protemas EMD, aunque de origen porcino, se consideran “propias” cuando se encuentran en el cuerpo humano y pueden promover la regeneracion dental en los seres humanos sin desencadenar respuestas alergicas u otras reacciones indeseables. La Protema Derivada de la Matriz del Esmalte (EMD) es el precursor del esmalte mas conocido. Su disolucion acuosa espesada con PGA se comercializa bajo el nombre registrado Straumann® Emdogain®.

El EMD es el componente activo del gel Straumann® Emdogain®, usado en terapia regenerativa para pacientes que padecen enfermedad periodontal. En esta formulacion, el alginato de propilenglicol (PGA) actua como vehmulo para la liberacion del EMD sobre el tejido afectado. Una vez que se ha aplicado Emdogain®, es dedr, en condiciones de pH aproximadamente neutro, el e Md , que esta cerca de su punto isoelectrico (pH 6,8), precipita y forma una capa compacta que promueve la proliferacion celular y la extension de ligamentos, dando como resultado un recrecimiento de tejido relativamente rapido. Los individuos tratados con Emdogain® han experimentado un llenado oseo significativo, y se ha mostrado que la reganancia de union clmica continua durante mas que un ano despues del tratamiento. Sin embargo, es importante que el EMD permanezca estable o muestre una evolucion predecible en propiedades durante el almacenamiento, si se ha de evitar su precipitacion antes de la aplicacion.

Para mantener el EMD en disolucion acuosa, la disolucion debe tener un pH muy por debajo del punto isoelectrico (IEP) de la protema. Para el EMD, el IEP es pH 6,5, por tanto, se prefiere mas que el pH de la disolucion sea aproximadamente 5,0. En general, la durabilidad de la disolucion es determinada por el valor de pH al que el EMD es capaz de precipitar aun sobre la superficie del diente. Se considera que la precipitacion ocurre en condiciones fisiologicas, es decir, un pH cerca del IEP. Sin embargo, para una aplicacion facil, la disolucion se espesa mediante PGA. El pH y la capacidad amortiguadora tanto del entorno de la rafz del diente como de la mezcla EMD-PGA influyen en el comportamiento de precipitacion de las protemas EMD.

Qmmicamente, el PGA es un ester de acido algmico, que deriva de kelp (alga marina). Algunos de los grupos carboxilo estan esterificados con propilenglicol, algunos estan neutralizados con un alcali apropiado, y algunos permanecen libres. El PGA en sf es acido, y por tanto el pH de la disolucion de EMD disminuye despues de disolverse el PGA en la disolucion de EMD. Lo que es mas, en condiciones acidas, el pH sigue disminuyendo con el tiempo, debido a la degradacion natural del PGA. Por tanto, debido a las propiedades intrmsecas del PGA anadido, es necesario empezar con un pH relativamente alto en la disolucion para permitir una vida util del producto mas larga.

Los alginatos de propilenglicol muestran aproximadamente 40% de perdida en viscosidad despues de un ano a 25°C, y tambien se vuelven menos soluble. El alginato de amonio es generalmente menos estable que cualquiera de los anteriores. El acido algmico es el menos estable de los productos, y cualquier material de cadena larga se degrada a cadenas mas cortas en pocos meses a temperaturas ambientales. Sin embargo, los alginatos que comprenden material de cadena corta son estables, y un acido algmico con un grado de polimerizacion (DP) de aproximadamente 40 unidades de acido uronico por cadena mostrara un cambio muy pequeno a lo largo de un ano a una temperatura de 20°C. Sin embargo, el uso principal del acido algmico, como disgregante en comprimidos farmaceuticos, depende de su capacidad de hincharse cuando se humedece, y esto no es afectado por los cambios en el DP. Por lo tanto los alginatos comerciales deben almacenarse a un pH neutro en un lugar fresco, es decir, a temperaturas de 25°C o mas bajas, ya que las temperaturas elevadas y un pH acido pueden causar una despolimerizacion significativa, afectando a las propiedades comercialmente utiles, tales como la viscosidad y la resistencia del gel. Dichos alginatos contienen habitualmente 10-13% de humedad, y la velocidad de despolimerizacion aumenta segun es aumentada la proporcion de humedad, por tanto el area de almacenamiento debe estar seca.

Como se menciono anteriormente, las protemas EMD se han formulado antes en una disolucion acuosa con PGA, en donde la degradacion del PGA proporciona productos acidos, que a su vez disminuyen el pH con el tiempo. A temperaturas elevadas, la degradacion se acelera. Para evitar la acidificacion acelerada del producto, y por tanto limitar este efecto, los productos tienen que ser transportados y almacenados a temperaturas bajas, es decir, a un intervalo de temperaturas de 2 a 8°C.

Lo que es mas, en la formulacion Straumann Emdogain® disponible en el mercado, la protema de la matriz del esmalte (EMD) se calienta despues de su aislamiento durante 3 horas a aproximadamente 80°C a fin de inactivar proteasas residuales. Se ha encontrado recientemente que este necesario tratamiento con calor es un factor clave en causar una degradacion y desnaturalizacion irreversibles del EMD en sf, contribuyendo a su vez a una vida util mas corta y/o menos actividad de la formulacion.

Dado su relativamente alto contenido de amelogenina, se espera que el autoensamblaje del EMD implique estructuras jerarquicas basadas en aglomerados esfericos a nanoescala, denominados en lo que sigue “nanoesferas”. Sin embargo, generalmente tales estructuras son solo marginalmente estables, y por tanto son sensibles a tensiones ambientales, tales como cambios en la temperatura o el pH. Estos pueden dar como resultado un despliegue irreversible, conduciendo a su vez a un aumento de la solubilidad en protemas que son generalmente mas estables en su estado plegado nativo. En cualquier caso, las protemas ya no podran llevar a cabo sus funciones, y eventualmente pueden precipitar pronto. Lo que es mas, a veces, tambien puede ocurrir una agregacion entre especies desplegadas parcialmente, conduciendo a una eficacia limitada del producto. Se sabe que el contacto hidrofobo es responsable en gran medida de las interacciones intermoleculares y la agregacion en las protemas, pero los residuos cargados tambien pueden jugar un papel importante. Por lo tanto, la interaccion de estos ultimos con aminoacidos cargados positivamente puede proporcionar un medio para limitar el despliegue y/o la precipitacion temprana. Claramente, cualquier supresor de la agregacion tal no debe interferir con las conformaciones de las protemas y las propiedades regenerativas del EMD. Ademas, la eleccion del aditivo debe ser compatible con los requisitos clmicos de las aplicaciones dentales.

Descripcion de la invencion

Como se demuestra claramente en la seccion experimental, se investigo la estabilidad del EMD en un entorno acuoso usando variaciones de pH y tension termica para acelerar la agregacion y el despliegue de las protemas (Casal HL, Kohler U, Mantsch HH. Structural and conformational changes of p-lactoglobulin B: an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein structure and Molecular Enzymology 1998; 957(1):11-20.). Despues los resultados se compararon adicionalmente con los resultados obtenidos en presencia de arginina a fin de evaluar la eficacia del pH o bien de la arginina en limitar las interacciones intermoleculares del EMD y por tanto el grado de desnaturalizacion, agregacion, precipitacion, despliegue y/o repliegue. Finalmente, se evaluo la influencia de la arginina sobre la cinetica de precipitacion del EMD y EMD/PGA usando el metodo de turbidez de flujo detenido (SF). Los hallazgos proporcionan una nueva y sorprendente vision en el proceso de despliegue/repliegue del EMD y evidencias de que el uso de un pH bajo, y/o arginina, como aditivo estabilizante, para productos a base de EMD tiene el potencial de extender significativamente su vida util efectiva.

La presente invencion, por tanto, describe por primera vez un procedimiento para producir una formulacion de EMD con estabilidad mejorada y por tanto una capacidad regenerativa prolongada de la formulacion de EMD durante el almacenamiento.

La presente invencion describe por primera vez un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado, que se caracteriza por una vida util y/o durabilidad de al menos 12 meses a 2°C-Rt , tal como de al menos 12 meses a RT.

El procedimiento para producir dicha formulacion que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado comprende tfpicamente las siguientes etapas:

a. aislar protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) de unos dientes de mamfferos en desarrollo,

b. disolver dichas protemas aisladas en un vehmulo farmaceutico adecuado,

c. disminuir el pH de dicha formulacion inicialmente hasta por debajo de o como maximo pH 4, y

d. calentar dicha formulacion hasta entre 20-100°C durante al menos 10 minutos.

En una realizacion, el pH de la formulacion se disminuye en la etapa c. hasta por debajo de pH 4, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, o por debajo de 3,5, o hasta 4 como maximo, tal como hasta 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2, 4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 o 4.

El pH de la formulacion puede ser disminuido alternativamente en la etapa c. hasta entre pH4-pH2, tal como hasta entre pH4-pH3,5, o tal como hasta entre pH3,5-pH 2.

La formulacion de la etapa c. se calienta en la etapa d. hasta 20-100°C, tal como hasta 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100°C durante al menos 10 minutos. En una realizacion, la formulacion de la etapa c. se calienta en la etapa d. hasta al menos 80°C durante al menos 1-3 horas, tal como hasta al menos 80°C durante al menos 3 horas, o hasta al menos 50°C durante al menos 1 hora, o hasta al menos 20°C durante al menos 1 hora.

La etapa d. puede repetirse una o varias veces, si fuera necesario, para conseguir el resultado deseado de inactivar proteasas inherentes y/o contaminantes residuales en la formulacion.

Como se demuestra claramente en la seccion experimental, (vease la Fig 2A), despues de un tratamiento con calory una incubacion durante 12 h a 25 °C, el EMD mostro cambios conformacionales significativos de las helices a, mientras que las laminas p nativas no fueron afectadas en gran medida por el tratamiento con calor, es decir, se pudo observar una agregacion sustancial del EMD.

La adicion de arginina a pH 2 condujo a hallazgos que indicaban que las conformaciones asociadas con las helices a permanecieron estables incluso despues del tratamiento con calor. Ademas, las laminas p permanecieron sin cambios despues del tratamiento con calor, lo que sugiere que habfa tenido lugar un cambio conformacional limitado de la superficie expuesta. Por lo tanto se infiere que la arginina se une a sitios de agregacion externos de las protemas EMD, que pueden incluir vueltas p. Ademas, al neutralizar los sitios de union del EMD, se espera que la arginina promueva una compacidad de la estructura de la protema, vista tambien en un aumento del tamano de las nanoesferas. Tomados conjuntamente, estos resultados implican que la arginina estabiliza la estructura del EMD a pH 2 con respecto al tratamiento con calor.

La distribucion de tamanos de partmula del EMD a pH 2 en ausencia de arginina (vease la Fig 2C) demostro que un tratamiento con calor hasta 70 °C y un enfriamiento hasta 20 °C conducen a cambios conformacionales (veanse tambien las micrograffas TEM en la Fig 3A-B). Son visibles en la Fig 3A nanofilamentos y nanoesferas de aproximadamente 70 nm o menos de diametro, tfpicos de la amelogenina en su estado nativo (7), pero, como se ve en la Fig 3B, estos se agregaron parcialmente despues del tratamiento con calor. La agregacion despues del tratamiento con calor estuvo ausente en presencia de arginina a pH 2. Dado que la desnaturalizacion del EMD no ocurrio en presencia de arginina, se concluye que estuvo ausente un despliegue inducido por calor a pH 2. Por tanto, la estructura de nanoesferas del EMD permanecio sustancialmente intacta (Fig 3C-D).

No obstante, el EMD solubilizado en pH bajo, tal como en pH 2, medido a 20 y 90 °C, y a 20 °C despues del tratamiento con calor sugiere que la agregacion inducida por la temperature fue revertida en gran medida al enfriar (experimented no mostrados).

Como se muestra en la Fig 4A, el tratamiento con calor de formulaciones de EMD con pH 5 dio como resultado una organizacion molecular del EMD significativamente modificada.

Como puede verse en la Fig 4C, el tratamiento con calor de formulaciones con EMD a pH 5 condujo a una agregacion aumentada (vease tambien la Fig 5A-B). Estaban presentes inicialmente nanofilamentos y nanoesferas aisladas (Fig 5A), pero se observo una aglomeracion extensa despues del tratamiento con calor (Fig 5B). Se supuso que las nanoesferas, cuyas dimensiones en el EMD preparado fueron consistentes de nuevo con las tfpicas de la amelogenina, se agregan durante el tratamiento con calor. Como se ve a partir de la Fig 4D, la arginina limita esta agregacion.

Por tanto, como se observa a pH 2, el tratamiento con calor de las formulaciones de EMD a pH 5 puede dar como resultado una desagregacion parcial de las nanoesferas. Esto se reflejo en la Fig 5C-D, lo que sugiere que los nanofilamentos presentes inicialmente en los espedmenes se han roto hasta nanoesferas e incluso fragmentos mas pequenos despues del tratamiento con calor.

En contraste, a pH 10, las conformaciones de las protemas estan fuertemente modificadas con respecto a las conformaciones nativas vistas a pH mas bajo (Fig 6A). Ademas, la combinacion de pH alto y cargas ionicas estabiliza la estructura secundaria durante el tratamiento con calor en ausencia de arginina. En presencia de arginina, por el contrario, los espectros obtenidos antes y despues del tratamiento con calor ya no se superponen; la proporcion de espirales aleatorias se reduce, y los picos correspondientes a las estructuras de vueltas p son distinguibles de nuevo (Fig 6B).

La Fig 7 confirma que la morfologfa del EMD a pH alto es muy diferente a la observada a pH mas bajo, caracterizandose por extensos aglomerados amorfos similares a geles.

El vehteulo farmaceutico adecuado es tipicamente un amortiguador universal, tal como un amortiguador de Britton-Robinson, un amortiguador de Carmody, un amortiguador acetico (acido acetico/acetato de sodio), un amortiguador salino, un amortiguador cftrico (acido cftrico/citrato de sodio y/o HCl/citrato de sodio), o un amortiguador de sodio ffsico.

El vehteulo farmaceutico adecuado tambien puede seleccionarse del grupo que consiste en acido acetico acuoso, acido cftrico o H2O.

En una realizacion, se usa acido acetico a pH 2-pH 8, tal como a pH 5.

En particular, en el ensayo experimental, se usa un amortiguador de Britton-Robinson.

La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehteulo farmaceutico adecuado, en donde las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) comprenden al menos 60-100% de amelogenina, tal como al menos 60-70, 60-80, 70-90, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 97%, tal como al menos 99% de amelogenina, que tiene un peso molecular medio seleccionado del grupo que consiste en entre 18-25 kDa, tal como entre 20-24 kDa, entre 20-22 kDa, y 20 kDa.

La presente invencion se refiere ademas a un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehteulo farmaceutico adecuado, que comprende ademas mezclar la formulacion de la etapa d. con un modificador de la viscosidad adecuado.

En una realizacion, dicho procedimiento comprende ademas ajustar el pH de la formulacion de la etapa d. hasta al menos pH5 antes de mezclar dicha formulacion con un modificador de la viscosidad adecuado, tal como PGA. Dicho PGA puede ser PGA esterilizado por haces de electrones. Preferiblemente, dicho PGA es alginato de propilenglicol (PGA) esterilizado con un peso molecular medio ponderal por encima de 130 kDa.

En una realizacion alternativa, dicho procedimiento comprende ademas ajustar el pH de la formulacion de la etapa d. hasta pH5 como maximo antes de mezclar dicha formulacion con un modificador de la viscosidad adecuado. El pH de dicha formulacion se ajusta tfpicamente a entre pH 2-pH 5, tal como entre pH 2,5-pH 4,5, o a entre pH2-pH4, tal como a pH 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,3, 3,5, 3,8, 4,0, 4,3 o 4,5.

En dicha realizacion alternativa, el modificador de la viscosidad se selecciona del grupo que consiste en acido hialuronico. El acido hialuronico puede ser esterilizado por haces de electrones.

En aun otra realizacion alternativa, el procedimiento de la presente invencion comprende ajustar el pH de la formulacion de la etapa d. hasta pH 5 como maximo sin mezclar dicha formulacion con ningun modificador de la viscosidad adecuado. El pH de dicha formulacion se ajusta tipicamente a entre pH 2-pH 5, tal como entre pH 2,5-pH 4,5, o a entre pH 2-pH 4, tal como a pH 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,3, 3,5, 3,8, 4,0, 4,3 o 4,5.

La presente invencion tambien se refiere a una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento segun la presente invencion.

La presente invencion se refiere por tanto a una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado, que se caracteriza por una vida util y/o durabilidad de al menos 12 meses a 2°C-RT, tal como de al menos 12 meses a RT, y que se produce por un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a. aislar protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) de unos dientes de mairnferos en desarrollo,

b. disolver dichas protemas aisladas en un vehmulo farmaceutico adecuado,

Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento de la presente invencion comprende tfpicamente protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) a una concentracion de entre 5-35 mg/ml de la formulacion, tal como al menos 5, 10, 15, 20, 25, 29, 30, 31, 32 o 35 mg/ml de la formulacion.

En otra realizacion, una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento de la presente invencion comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) a una concentracion de entre 100 |j-5 mg/ml de la formulacion, tal como al menos 100, 150, 250, 500 jg/m l de la formulacion, o tal como al menos 1, 2, 3, 4 o 5 mg/ml de la formulacion.

Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento de la presente invencion puede comprender ademas arginina. En una realizacion, dicha arginina tiene una concentracion de 1-500 mM cuando se anade a la formulacion, tal como al menos 1, 10, 100, 250, 300, 400 o 500 mM. En otra realizacion, dicha arginina tiene una concentracion de 1, 10, 100, 250, 300, 400, 450 o 500 mM. Por regla general, la concentracion de arginina en la formulacion es 500 mM como maximo.

La arginina es el aminoacido existente en la naturaleza mas comun. Su estructura, su capacidad para formar enlaces de H y su distribucion de carga en condiciones fisiologicas son tales que la arginina se une facilmente a grupos cargados negativamente, y tambien puede interactuar fuertemente con entornos polares, tales como agua. De hecho la arginina ha demostrado ser eficaz como aditivo para la prevencion de la agregacion de protemas, y tambien se sabe que tiene un efecto relativamente menor sobre la estabilidad de la estructura nativa en muchos casos, con lo que puede considerarse que es un reactivo no desnaturalizante.

La presente invencion investigo la estabilidad del EMD en un entorno acuoso usando variaciones del pH y tension termica para acelerar la agregacion y despliegue de las protemas. Despues se compararon los resultados con los resultados obtenidos en presencia de pH bajo y/o arginina a fin de evaluar su eficacia en limitar interacciones intermoleculares del EMD y por tanto el grado de desnaturalizacion, agregacion, precipitacion, despliegue y/o repliegue. Finalmente, se evaluo la influencia del pH bajo y la arginina sobre la cinetica de precipitacion del EMD y EMD/PGA usando el metodo de la turbidez de flujo detenido (SF).

Los hallazgos que condujeron a la presente invencion proporcionan una nueva y sorprendente vision en el proceso de despliegue/repliegue del EMD, y evidencias de que el uso de un pH bajo y/o arginina como aditivo estabilizante para productos a base de EMD tiene el potencial de extender significativamente su vida util efectiva.

Usando diversas tecnicas analfticas, la presente invencion demuestra por primera vez que la adicion de arginina a EMD acuoso puede limitar la desnaturalizacion del EMD a pH acido, ademas, tambien evidencia que la adicion de arginina a EMD acuoso puede revertir la agregacion a gran escala a pH alto. La investigacion de la cinetica de liberacion del EMD posterior a un aumento por etapas en el pH hasta pH 7, que es cercano al punto isoelectrico del EMD, tambien mostro que la arginina no tiene una influencia adversa sobre las velocidades de precipitacion desde una disolucion acuosa o bien desde un vehmulo de gel de PGA. De hecho, la respuesta en sistemas con un pH inicial de 5 fue similar con arginina a la de a pH 2, con y sin arginina, reflejando de nuevo el efecto estabilizante de la arginina sobre el EMD. Los resultados mostrados en el experimento 1 indican por lo tanto que la arginina tiene el potencial de mejorar significativamente la vida de almacenamiento de geles a base de EMD/PGA usados en terapia regenerativa, sin comprometer la liberacion del EMD en el sitio de aplicacion.

La presente invencion se refiere ademas a una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento de la presente invencion que comprende ademas un ceramico oseo y/o un injerto oseo adecuados.

La presente invencion se refiere ademas a una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento de la presente invencion para uso en medicina.

En particular, una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento de la presente invencion esta destinado al uso en la fabricacion de un medicamento para el uso en el tratamiento de heridas y/o en el tratamiento de enfermedades periimplantarias y/o periodontitis o para inducir la formacion de tejido mineralizado.

Tambien se concibe en la presente invencion un metodo para la curacion de heridas y/o para el tratamiento de enfermedades periimplantarias y/o periodontitis o para inducir la formacion de tejido mineralizado, en donde un paciente necesitado de ello se trata con o se le administra una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado que es producido por un procedimiento de la presente invencion.

Se describe un kit que comprende una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 18-28, y al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en granulos, hueso, ceramicos, andamios, un injerto oseo, material de hueso natural, un bloque oseo, dientes artificiales, y un implante.

Definiciones

“Tejidos blandos”, (es decir, tejidos no mineralizados), puede usarse en el presente contexto de manera intercambiable con tejido gingival, y pueden definirse como tejidos que contienen colageno o epitelio, incluyendo piel y mucosa, musculo, vasos sangumeos y linfaticos, tejidos nerviosos, glandulas, tendones, ojos y cartflagos. En general, la formulacion de la presente invencion puede usarse para promover la curacion de una herida no solo en piel y mucosa, sino en cualquier tejido gingival de un paciente necesitado de ello.

La expresion “formacion de tejido duro” en “tejido mineralizado” puede resumirse como la produccion por celulas de una matriz organica capaz de aceptar mineral, con los prerrequisitos de actividad de la enzima fosfatasa alcalina y una buena irrigacion sangumea. En general, la formulacion de la presente invencion puede usarse para promover la formacion de tejido duro en un paciente necesitado de ello.

Sustancias activas del esmalte

Como se emplea en la presente memoria, “matriz del esmalte” significa un precursor del esmalte, y puede obtenerse de cualquier fuente natural relevante, es decir, un marnffero en el que los dientes esten en desarrollo. Una fuente adecuada son dientes en desarrollo de animales sacrificados tales como, p.ej., terneros, cerdos o corderos. Otra fuente es p.ej. piel de pescado. En el presente contexto, la expresion “una sustancia activa del esmalte” se usa para abarcar protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) sin distinguir su fuente.

La matriz del esmalte puede prepararse a partir de dientes en desarrollo como se describio previamente (patentes europeas EP-B-0337967 y EP-B-0263086). La matriz del esmalte se retira por raspado y las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) se preparan, p.ej., por extraccion con una disolucion acuosa tal como un amortiguador, un acido o base diluidos o una mezcla de agua/disolvente, seguido de exclusion de tamanos, desalinizacion u otras etapas de purificacion, seguido alternativamente de liofilizacion. Las enzimas pueden ser desactivadas alternativamente por tratamiento con calor o disolventes, en cuyo caso los derivados pueden almacenarse en forma lfquida sin liofilizacion.

Como fuente alternativa de las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) tambien se pueden usar rutas de smtesis aplicables generalmente, bien conocidas por un experto en la tecnica, o usar celulas eucarioticas y/o procarioticas cultivadas modificadas por tecnicas de ADN. Las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) pueden ser por tanto de origen recombinante, y alternativamente modificarse geneticamente y/o qmmicamente (vease, p.ej., Sambrook, J. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

En el presente contexto, las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) incluyen una o varias protemas de la matriz del esmalte o partes o fragmentos de tales protemas, producidas naturalmente por corte y empalme alterno o procesamiento, o por escision enzimatica o bien qmmica de una protema de longitud natural, o por smtesis de polipeptidos in vitro o in vivo (p.ej., metodos de ADN recombinante y/o cultivo de celulas diploides). Las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) tambien incluyen polipeptidos o protemas relacionados con la matriz del esmalte. Los polipeptidos o protemas pueden unirse a una molecula portadora biodegradable adecuada, tales como acidos poliammicos o polisacaridos, o combinaciones de los mismos. Ademas, la expresion protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) tambien abarca sustancias analogas sinteticas.

Las protemas son macromoleculas biologicas constituidas por residuos de aminoacidos enlazados entre sf por enlaces peptidicos. Las protemas, como polfmeros lineales de aminoacidos, tambien se llaman polipeptidos. Por regla general, las protemas tienen 50-800 residuos de aminoacidos, y por tanto tienen pesos moleculares en el intervalo de aproximadamente 6.000 a aproximadamente varios cientos de miles de Dalton o mas. Las protemas pequenas se llaman peptidos, oligopeptidos o polipeptidos. En el contexto de la presente invencion, un “fragmento de polipeptido” para uso de acuerdo con la presente invencion se refiere a un polipeptido que puede ser, pero no se limita a, de 1-50 aminoacidos de longitud, tal como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 47, 48, 49 o 50 aminoacidos. Tales polipeptidos tambien pueden ser mas largos que 50 aminoacidos.

Las protemas de la matriz del esmalte son protemas que normalmente estan presentes en la matriz del esmalte, es decir, el precursor del esmalte (Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl.

1:282-91), o protemas que pueden obtenerse por escision de tales protemas. En general, tales protemas tienen un peso molecular por debajo de 120.000 Dalton, e incluyen amelogeninas, no amelogeninas, no amelogeninas ricas en prolina y tuftelinas.

Los ejemplos de protemas para el uso segun la invencion son amelogeninas, no amelogeninas ricas en prolina, tuftelina, protemas del penacho, protemas del suero, protemas salivares, ameloblastina, sheathlina y derivados de las mismas, y mezclas de las mismas. Ademas, se encuentran otras protemas para el uso segun la invencion en el producto comercializado EMDOGAIN® (BIORA AB, Suecia).

EMDOGAIN® (BIORA AB, S-20512 Malmo, Suecia) contiene 30 mg de protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD), calentadas durante 3 horas a aproximadamente 80 °C a fin de inactivar proteasas residuales, y 1 ml de Disolucion de Vehmulo (Alginato de Propilenglicol), que se mezclan antes de la aplicacion, a menos que la protema y el vehmulo esten ensayados por separado. La relacion de pesos es aproximadamente 80/8/12 entre los picos de protema principales a 20, 14 y 5 kDa, respectivamente.

En general, las protemas mayoritarias de una matriz de esmalte se conocen como amelogeninas. Son sustancias notablemente hidrofobas que en condiciones fisiologicas forman agregados. Pueden llevar o ser portadoras de otras protemas o peptidos.

No obstante, a la luz del hecho bien conocido de que la amelogenina es una protema evolucionaria muy conservativa, y esta documentado que la homologfa entre las especies es alta, se concibe en la actualidad que podnan encontrarse secuencias analogas en las protemas de la matriz del esmalte de la rata, el ser humano o el raton, p.ej. en la amelogenina, que ejerzan efectos biologicos similares, p.ej. posean actividad osteogenica. Por consiguiente la presente invencion tambien abarca secuencias analogas a la amelogenina porcina, que son al menos 80-95% identicas a la amelogenina humana, tal como al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% identicas, y que muestran actividad biologica identica.

En la presente invencion, las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) pueden estar aisladas de tejido mairnfero, ser fragmentos de polipeptidos recombinantes purificados, o fragmentos de polipeptidos que estan fabricados sinteticamente. Como se sabe bien en la tecnica, un polipeptido producido de manera recombinante diferira ligeramente de la protema modelo endogena, especialmente cuando es producido en un sistema procariotico. La presente invencion abarca fragmentos de polipeptidos producidos de manera recombinante, que son al menos 95% identicos a la amelogenina humana endogena, tal como al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% identicos, y que muestran actividad biologica analoga.

Un polipeptido fabricado sinteticamente, por otra parte, como se sabe bien en la tecnica, puede disenarse por supuesto para portar una diversidad de permutaciones qmmicas que no obstaculizaran y/o afectaran a su actividad biologica original, p.ej. su actividad antiinflamatoria o proangiogenetica. Por consiguiente, la presente invencion abarca tambien fragmentos de polipeptidos permutados sinteticamente que son al menos 80-95% identicos a la amelogenina humana, un homologo, analogo o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, tal como al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% identicos, y que muestran actividad biologica analoga.

Adicionalmente, se considera que cualquier variante conservativa de la secuencia de un fragmento de polipeptido que sea al menos 80-95% identica a la amelogenina humana, tal como al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% identica, y que muestre actividad biologica analoga, esta, en virtud de su relacion funcional con dichas secuencias, dentro del alcance de la presente invencion.

Una variante conservativa de una secuencia se define en el presente contexto como una secuencia de aminoacidos que se conserva al menos tal como al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5%, cuando se comparan variantes de la misma secuencia de aminoacidos entre especies diferentes. El grado de conservacion de una variante puede calcularse, como se conoce en el campo, segun su derivacion de PAM (vease Dayhoff, Schwartz, y Orcutt (1978) Atlas Protein Seq. Struc. 5:345 352), o en base a comparaciones de Bloques de secuencias derivadas de la base de datos de Bloques descrita por Henikoff y Henikoff (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(22):10915-9.

Las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Se entendera que pueden mezclarse con vehmulos o diluyentes adecuados, que no interferiran con su proposito pretendido y se contemplaran aun como sustancialmente aisladas.

En la presente invencion, es muy adecuado un programa de algoritmos locales para determinar la identidad. Los programas de algoritmos locales (tales como Smith-Waterman) comparan una subsecuencia en una secuencia con una subsecuencia en una segunda secuencia, y encuentran la combinacion de subsecuencias y la alineacion de esas subsecuencias que da la puntuacion de similitud global mas alta. Los espacios internos, si se permiten, estan penalizados. Los algoritmos locales funcionan bien para comparar dos protemas multidominio, que tienen un unico dominio o solo un sitio de union en comun.

Los metodos para determinar la identidad y similitud estan codificados en programas disponibles publicamente. Los metodos de programas informaticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG (Devereux, J et al (1994)) BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S.F. et al (1990)). El programa b La STX esta disponible publicamente en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S.F. et al (1990)). Cada programa de analisis de secuencias tiene una matriz de puntuacion por defecto y penalidades de espacios por defecto. En general, se esperana que un biologo molecular usara los ajustes por defecto establecidos por el programa informatico usado.

Las protemas de una matriz de esmalte pueden ser divididas tfpicamente en una parte de peso molecular alto y una parte de peso molecular bajo, fraccion que contiene protemas extrafbles en acido acetico denominadas generalmente amelogeninas (consultense las patentes europeas EP-B-0337967 y EP-B-0263086).

En general, la matriz del esmalte, los derivados de la matriz del esmalte y las protemas de la matriz del esmalte son sustancias hidrofobas, es decir, menos solubles en agua, especialmente a temperaturas aumentadas. En general, estas protemas son solubles a valores de pH no fisiologicos y a una temperatura baja, tal como aproximadamente 4-20°C, tfpicamente alrededor de 4-8°C, mientras que se agregaran y precipitaran a la temperatura corporal (35-37°C) y pH neutro (aproximadamente a pH 7).

En una realizacion preferida espedficamente, una formulacion para el uso segun la presente invencion comprende por tanto protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) que, despues de una aplicacion in vivo, son capaces de formar agregados u oligomeros y precipitar. El tamano de partfcula de dichos agregados propensos a precipitar es menos que 70 nm, tfpicamente en un intervalo entre 1 nm y 70 nm (nanoesferas de amelogenina), tal como de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 20 nm, tal como entre 1 pm y 20 nm, 1 pm y 10 nm, 5 pm y 10 nm, 10 pm y 1 nm, 100 pm y 10 nm, 100 pm y 1 nm, 1 pm y 1 nm, 1 pm y 5nm, 1 pm y 15 nm.

Formulaciones farmaceuticas

Las formulaciones farmaceuticas segun la presente invencion comprenden un vehmulo farmaceutico adecuado seleccionado del grupo que consiste en un amortiguador universal, tal como un amortiguador de Britton-Robinson, un amortiguador de Carmody, un amortiguador acetico (acido acetico/acetato de sodio), un amortiguador salino, un amortiguador cftrico (acido cftrico/citrato de sodio y/o HCl/citrato de sodio), o un amortiguador de sodio ffsico, acido acetico acuoso, acido cftrico y H²O.

Si se anade arginina a la formulacion, se anade al amortiguador y se ajusta el pH antes de mezclar el amortiguador con EMD.

El amortiguador de Britton-Robinson (conocido tambien como BRB, conocido tambien como PEM) es un amortiguador de pH “universal” usado para el intervalo pH 2 a pH 12. Por regla general, el pH se ajusta a valores mas altos usando NaOH. Los amortiguadores universales consisten en mezclas de acidos de fuerza decreciente (pK^acreciente), con lo que el cambio en pH es aproximadamente proporcional a la cantidad de alcali anadido. Consiste en una mezcla de H³BO³0,04 M, H³PO⁴0,04 M y CH³COOH 0,04 M que ha sido valorada hasta el pH deseado con NaOH. Britton y Robinson tambien propusieron una segunda formulacion que daba una respuesta de pH esencialmente lineal al alcali anadido de pH 2,5 a pH 9,2 (y amortigua a pH 12). Esta mezcla consiste en acido cftrico 0,0286 M, KH²PO⁴0,0286 M H³BO³0,0286 M, veronal 0,0286 M y HCl 0,0286 M valorado con NaOH 0,2 M.

En una realizacion, se usa acido cftri

con un pH alrededor de 8.

En el contexto de la presente invencion, una formulacion puede ser una formulacion farmaceutica y/o terapeutica y/o cosmetica. En la actualidad, una formulacion farmaceutica y/o terapeutica tambien pretende abarcar formulaciones cosmeticas, as ^como formulaciones que pertenecen a la llamada zona gris entre farmaceuticas y cosmeticas, es decir, cosmeceuticas.

Para la administracion a un individuo (tal como un animal o un ser humano), las protemas de la matriz del esmalte y/o las protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) se formulan preferiblemente en una formulacion farmaceutica que contiene las protemas de la matriz del esmalte y/o las protemas derivadas de la matriz del esmalte, y, opcionalmente, uno o mas vehmulos farmaceuticos adecuados.

Una formulacion que comprende las protemas de la matriz del esmalte y/o las protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) segun la presente invencion, para ser administrada, puede adaptarse para la administracion por cualquier via adecuada, p.ej. por administracion sistemica a un paciente mediante un tubo, jeringuilla, pulverizador o dispositivo de drenado.

Ademas, una formulacion puede adaptarse para la administracion en conexion con cirugfa, p.ej. como una administracion sistemica por infusion en la sangre, linfa, ascitos o fluidos espinales, o por inhalacion. Para la aplicacion sistemica, las formulaciones segun la invencion pueden contener vehmulos farmaceuticamente aceptables no toxicos convencionales y excipientes segun la invencion, incluyendo microesferas y liposomas.

La administracion de una formulacion segun la presente invencion tambien puede realizarse por cualquier otra via de administracion convencional, tales como, pero no limitadas a, una via oral, parenteral, intravenosa, bucal, aural, rectal, vaginal, intraperitoneal, topica (dermica) o nasal, o por la administracion a una cavidad corporal tal como p.ej. una rafz de un diente o un canal de una rafz de un diente.

Por supuesto, pueden ser relevantes tambien otras aplicaciones, tales como, p.ej., la aplicacion sobre dentaduras postizas, protesis, implantes, y la aplicacion a cavidades corporales tales como la cavidad oral, nasal y vaginal. La mucosa puede seleccionarse de mucosa oral, bucal, nasal, aural, rectal y vaginal. Ademas, la aplicacion puede ser directamente en o sobre una herida u otras lesiones de tejidos blandos.

Ademas, la aplicacion dentro del area dental/odontologica es de gran importancia. Son ejemplos relevantes la aplicacion a bolsas periodontales (dentales), a encfas o a heridas gingivales u otras heridas situadas en la cavidad oral, o en conexion con cirugfa oral.

Una formulacion para uso de acuerdo con la presente invencion puede estar, pero no se limita a, en la forma de, p.ej., una formulacion fluida, semisolida o solida tal como, pero no limitada a, lfquidos disueltos para transfusiones, tales como suero salino esteril, disolucion de Ringer, disoluciones de glucosa, suero salino tamponado con fosfato, sangre, plasma, agua, polvos, microcapsulas, parches bioabsorbibles, pociones, laminas, vendas, apositos, implantes, pfldoras, pulverizadores, jabones, supositorios, vagitorios, pasta de dientes, lociones, enjuague bucal, champu, microesferas, nanopartmulas, pulverizadores, aerosoles, dispositivos para inhalacion, disoluciones, dispersiones, agentes humectantes, suspensiones, emulsiones, pastas, pomadas, pomadas hidrofilas, cremas, geles, hidrogeles (p.ej. polietilenglicoles), vendajes, dispositivos, plantillas, geles inteligentes, injertos, disoluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, pelmulas, espumas, almohadillas, esponjas (p.ej. esponjas de colageno), sistemas de administracion transdermica, granulos, granulados, capsulas, perlas de agarosa o chitosan, comprimidos, microcapsulas, polvos liofilizados, granulos, granulados o pelets, y mezclas de los mismos.

Los agentes de suspension adecuados son, p.ej., gomas existentes en la naturaleza tales como, p.ej., goma arabiga, goma xantana o goma tragacanto; celulosas tales como, p.ej., carboximetilcelulosa de sodio, celulosa microcristalina (p.ej. Avicel® RC 591, metilcelulosa); alginatos y kitosanos tales como, pero no limitados a, alginato de sodio, etc.

Una formulacion lfquida, para el uso de acuerdo con la presente invencion, puede ser, p.ej., pero no se limita a, una disolucion, dispersion o suspension para la aplicacion sobre una superficie de p.ej. un implante o dispositivo medico, o material para la sustitucion de huesos. Una vez aplicada, la formulacion puede solidificarse, p.ej. por secado, hasta una formulacion solida o al menos altamente viscosa que no se disuelve en el almacenamiento ni cuando el implante o dispositivo esta en uso.

Tal formulacion se aplica preferiblemente en condiciones esteriles y/o esterilizadas despues de la aplicacion por irradiacion o exposicion a gas oxido de etileno. Cuando la formulacion esta en la forma de una formulacion lfquida, tambien puede aplicarse poco antes de que el implante o dispositivo medico, o material para la sustitucion de huesos, se vaya a introducir en el cuerpo. Como alternativa a aplicar una formulacion que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) en el implante o dispositivo medico, o material para la sustitucion de huesos, la formulacion puede aplicarse sobre una superficie de un tejido que este en contacto con el implante o dispositivo medico, o material para la sustitucion de huesos, tal como un tejido que comprenda una proporcion sustancial de celulas epiteliales como se indico anteriormente. Ademas, la formulacion puede aplicarse tanto sobre el implante o dispositivo medico, o material para la sustitucion de huesos, como sobre un tejido en contacto con los mismos.

Una formulacion segun la presente invencion tambien puede formularse, ademas de lo que ya se ha descrito en la presente memoria, segun la practica farmaceutica convencional, vease, p.ej., “Remington's Pharmaceutical Sciences” y “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”, editados por Swarbrick, J. & J.C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1988.

Un vehmulo farmaceutico adecuado es una sustancia que es sustancialmente inocua para el individuo al que la formulacion se va a administrar. Tal excipiente cumple normalmente los requisitos dados por las autoridades sanitarias nacionales. Las farmacopeas oficiales, tales como p.ej. la Farmacopea Britanica, la Farmacopea de los Estados Unidos de America y la Farmacopea Europea, fijan estandares para vehmulos farmaceuticos adecuados.

Los vehmulos farmaceuticos adecuados pueden incluir disolventes, agentes amortiguadores, conservantes, humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, agentes de suspension, agentes formadores de geles, bases de pomadas, potenciadores de la penetracion, perfumes, polvos y agentes protectores de la piel. Sin embargo, debe ponerse enfasis en que la invencion no se limita a los mismos.

En la presente invencion, la formulacion que comprende las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) puede ser incorporada en una matriz polimerica para que sea liberada por degradacion de la matriz polimerica, por accion enzimatica y/o por difusion. Dicha matriz polimerica es adecuada para el crecimiento celular interno, o bien oclusiva de las celulas. Por tanto, esta comprendida en la invencion en particular una formulacion farmaceutica y/o cosmetica de las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD), en una concentracion total baja dentro de la formulacion, en donde una regulacion espacial y/o selectiva de la liberacion de dichas protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) permite que se libere un gran porcentaje de las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) en el momento de una actividad celular apropiada.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica y/o terapeutica para administrar las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) segun la presente invencion, que comprende una matriz polimerica, adecuada para el crecimiento, crecimiento interno y/o migracion celular, o bien que es oclusiva de las celulas, y una fraccion y/o fragmento de polipeptido, en donde dicha matriz se forma por una reaccion de adicion nucleofila entre un nucleofilo fuerte y un enlace insaturado conjugado, o un grupo insaturado conjugado.

En una formulacion de pasta de dientes o enjuague bucal u otra formulacion para la aplicacion a los dientes o las rames de los dientes, las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) segun la presente invencion pueden estar presentes en un estado disuelto en un vehmulo de pH ligeramente acido, o bien como una dispersion en un vehmulo de pH neutro. Se preve que las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) segun la invencion pueden formar una capa protectora sobre la superficie de los dientes, impidiendo de este modo la adhesion de bacterias productoras de caries. En tales preparaciones para el cuidado dental, las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) pueden formularse junto con uno o mas compuestos que tengan un efecto preventivo de la caries, notablemente fluor u otro elemento traza tal como vanadio o molibdeno. A pH neutro, se cree que el elemento traza esta unido a (p.ej. por enlaces ionicos) o incrustado en las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD), desde las que es liberado para ejercer su efecto preventivo de la caries cuando las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) se disuelven a un pH de aproximadamente 5,5 o menos, p.ej. debido a la produccion de acidos por las bacterias productoras de caries.

En una formulacion farmaceutica para uso segun la invencion, las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte segun la presente invencion estan presentes generalmente en una concentracion que vana de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 99,9% en peso. La cantidad de formulacion aplicada dara como resultado normalmente una cantidad de protema total por cm2 de area de pulpa dental correspondiente a de aproximadamente 0,005 mg/mm2 a aproximadamente 5 mg/mm2, tal como de aproximadamente 0,01 mg/mm2 a aproximadamente 3 mg/mm2.

En los casos donde las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte segun la presente invencion se administren en la forma de una formulacion lfquida, la concentracion de las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte segun la presente invencion en la formulacion esta en un intervalo que corresponde a de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/ml, p.ej. de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 35 mg/ml, tal como 30 mg/ml. Son deseables en algunos casos, y tambien pueden obtenerse, concentraciones mas altas, tal como una concentracion de al menos aproximadamente 100 mg/ml.

Leyendas a las figuras

Fig. 1. Absorcion UV-Vis de EMD en amortiguador BR a pH2 durante un aumento de temperatura de 20 a 30 °C y a temperaturas mas altas. En presencia de arginina (Fig 1(b)). Los resultados obtenidos a pH5 se muestran en las Figs.

1(c) y 1(d).

Fig 2. Espectros FT-IR de segunda derivada de EMD (A) y EMD/arginina (B) a pH 2 y 25 °C, antes (curvas solidas) y despues (curvas discontinuas) de un tratamiento con calor a 90 °C. Espectros 3D-DLS de EMD (C) y EMD/arginina (D) a pH 2 y 20 °C, antes (azul) y despues (rojo) de un tratamiento con calor a 70 °C.

Fig. 3. Micrograffas electronicas de transmision de EMD y EMD/arginina a pH 2 y 20 °C antes (A-C) y despues (B-D) de un tratamiento con calor a 90 °C.

Fig 4. Espectros FT-IR de segunda derivada de EMD (A) y EMD/arginina (B) a pH 5 y 25 °C, antes (curvas solidas) y despues (curvas discontinuas) de un tratamiento con calor a 90 °C. Espectros 3D-DLS de EMD (C) y EMD/arginina (D) a pH 5 y 20 °C, antes (azul) y despues (rojo) de un tratamiento con calor a 70 °C.

Fig. 5. Micrograffas electronicas de transmision de EMD y EMD/arginina a 20 °C y pH 5 antes (A-C) y despues (B-D) de un tratamiento con calor a 90 °C.

Fig 6. Espectros FT-IR de segunda derivada de EMD (A) y EMD/arginina (B) a pH 10 y 25 °C, antes (curvas solidas) y despues (curvas discontinuas) de un tratamiento con calor a 90 °C. Espectros 3D-DLS de EMD (C) y EMD/arginina (D) a pH 10 y 20 °C, antes (azul) y despues (rojo) de un tratamiento con calor a 70 °C.

Fig. 7. Micrograffas electronicas de transmision de EMD y EMD/arginina a pH 10 y 20 °C antes (A-C) y despues (B-D) de un tratamiento con calor a 90 °C.

Fig. 8. T(t) a partir de medidas de flujo detenido sobre (A) EMD y (B) PGA/EMD en amortiguador BR (pH2 o pH5), con o sin arginina, mezclado con hidroxido de sodio para elevar su pH a 7.

Fig. 9. Tabla 1. Resumen de los parametros usados para ajustar la ecuacion (1) a los datos en la Fig. 8.

La Fig. 10 muestra la cinetica de precipitacion transiente desde EMD acuoso y gel Straumann Emdogain™ (EMD/PGA), reflejada por las medidas de flujo detenido de la transmitancia, T, en funcion del tiempo t, despues de elevar el pH de los espedmenes a 7, es decir, cerca del punto isoelectrico del EMD (pH 6,8).

Fig 11 Configuracion experimental para las medidas de flujo detenido, que comprende un fotoespectrometro de flujo detenido BioLogic SFM-400 equipado con cuatro jeringuillas, un mezclador de bolas Berger (BB) y un mezclador de alta densidad (HDS) (29).

Seccion experimental

Los presentes experimentos describen esfuerzos para mejorar la estabilidad y por tanto prolongar la capacidad regenerativa del gel Emdogain™ durante el almacenamiento a pH bajo, mediante el uso de pH bajo y/o arginina como supresor de la agregacion. Se analizaron espedmenes de EMD con y sin pH bajo y/o arginina por espectroscopfa de infrarrojos por transformada de Fourier, espectroscopfa de absorbancia UV-Vis, dispersion de luz dinamica en 3D y microscopfa electronica de transmision. Los resultados demostraron que la arginina no solo estabiliza la estructura nativa del EMD durante un ciclado termico a pH bajo, sino tambien puede inducir el repliegue a pH alto. Ademas, la fotoespectrometna de flujo detenido indico que la presencia de arginina no influye en la precipitacion del EMD desde la disolucion acuosa ni el complejo de gel posteriormente a un aumento por etapas en el pH.

Experimento 1:

Materiales y metodos

EMD

Se liofilizo una disolucion de EMD 2012 (Biora/Straumann) con una concentracion de 29 mg/ml en 10 mg/ml de acido acetico acuoso usando un liofilizador Vitris, operando a -8°C. Se pusieron 100 a 150 g de la disolucion de EMD en dos matraces conicos de 250 ml, que se sumergieron en nitrogeno lfquido, y se liofilizaron durante 48 h. El material liofilizado se recogio y se homogeneizo mediante una mezcla suave con una espatula, mortero y mano. Despues se redisolvio el EMD a temperatura ambiente (RT) en amortiguador de Britton-Robinson (0,1M de H³BO³, H³PO⁴, CH³COOH puros), y se ajusto el pH a 2, 2,5 y 10 a una concentracion de EMD de 29 mg/ml. Se anadio arginina con una concentracion de 500 mM a disoluciones amortiguadoras antes de la adicion del EMD. Se almacenaron los espedmenes con y sin arginina a 4 °C durante una noche antes de la caracterizacion a fin de estabilizarlos.

PGA

El PGA tema su origen en FMC BioPolymer, y fue esterilizado por Sterigenics, San Diego, usando un acelerador de electrones de 20 eV (30 kGy por bolsa de 100 g). Fue proporcionado por Biora AB (Straumann AG, Basilea) y se almaceno a 4 °C en un frigonfico antes del uso. Se prepararon complejos hidrocoloides de protema-veldculo (EMD/PGA) anadiendo EMD acuoso a polvo de PGA (EMD/p Ga 1:2). Se agitaron las mezclas con una barra agitadora magnetica hasta que el polfmero se disolvio totalmente a temperatura ambiente, y posteriormente se almacenaron a 4 °C durante una noche para estabilizacion. Todos los espedmenes se prepararon usando agua milli-Q desionizada doblemente.

Espectroscopfa de infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR) en modo transmision

Se uso Espectroscop^a de infrarrojos en modo transmision para monitorizar los cambios en la estructura secundaria del EMD despues del tratamiento con calor (17). Se incubaron almuotas de 200 pl de disoluciones de EMD, preparadas con pH diferente, a 25°C durante 1 hora. Despues se aumento la temperatura hasta 90 °C a 2 °C/min y se incubaron las almuotas a esta temperatura durante 1 hora adicional. Despues se enfriaron hasta 25 °C a 2 °C/min y se incubaron durante 12 horas a esta temperatura para mejorar su estabilidad. Se llevaron a cabo medidas de absorbancia de IR antes y despues del tratamiento con calor depositando una gota de 10 pl de cada especimen sobre una ventana IR de CaF2 pulida y dejandola secar. Despues de la adquisicion, se uso un analisis derivativo secundario y normalizacion para resolver la estructura fina de los espectros en la region amida I.

Espectroscopfa de absorcion UV-Vis

Se puso EMD acuoso en una cubeta de cuarzo de 1 mm y se analizo mediante un espectrometro V-670 Varian a una longitud de onda fija de 280 nm. Este valor corresponde a la absorcion del triptofano, un aminoacido presente en el nucleo hidrofobo de las protemas. Se midio la intensidad de absorcion, que refleja la solubilidad del EMC, es decir, la exposicion del triptofano al disolvente, a temperaturas entre 20 y 80 °C (Schmid, 2001).

Dispersion de luz dinamica

Se uso una tecnologfa avanzada de dispersion de luz dinamica (DLS) por correlacion cruzada 3D modulada para investigar las dimensiones de los agregados de EMD. Las medidas se realizaron usando un aparato de LS Instruments equipado con un laser de He-Ne que emitfa un haz de luz polarizada de una longitud de onda de 632,8 nm. Se pusieron los espedmenes en tubos de vidrio de 10 mm de diametro, y las medidas se realizaron a temperaturas de 20 a 70 °C en etapas de 10 °C. La celda de las muestras se mantuvo dentro de /- 0,1 °C de la temperatura requerida usando un termostato controlado por un programa. Las fluctuaciones de intensidad dispersada se recogieron a un angulo fijo de 90° promediando 3 ejecuciones de 600 segundos cada una. La funcion de correlacion de tiempo (TCF) de la intensidad dispersada se analizo usando el metodo CONTIN (Block, I. D. & Scheffold, F. Modulated 3d cross-correlation light scattering: Improving turbid sample characterization. Review of Scientific Instruments, 2010; 81 : 123107-7).

Microscopfa electronica de transmision (TEM)

Se investigo la morfologfa del EMD con y sin arginina, en diferentes amortiguadores y a diferentes pH, usando un Microscopio Electronico de Transmision (TEM) Tecnai Spirit BioTWIN de 80 kV en modo de campo brillante. Se trataron por calor espedmenes seleccionados a 90 °C, se enfriaron hasta 25 °C y se incubaron durante 12 h. Los espedmenes para el analisis TEM se prepararon usando tincion negativa mediante un metodo secuencial de dos gotitas como se describe en la bibliograffa (http://web.path.ox.ac.uk/~bioimaging/ bitm/instructions_and_information/ EM/neg_stain.pdf).

Fotoespectrometna de flujo detenido

La cinetica de liberacion desde EMD acuoso y EMD/PGA, y sus homologos estabilizados por arginina se investigo por fotoespectrometna de flujo detenido (SF) de cinetica rapida, con un dispositivo BioLogic SFM400/S conectado a una unidad espectrometrica MOS-250, que emitia luz a una longitud de onda de 290 nm. Se prepararon espedmenes de EMD de 1 mg/ml con y sin arginina en amortiguador de Britton-Robinson a pH 2 y 5. Despues se aumento el pH hasta 7 (es decir, pH fisiologico) por adicion de hidroxido de sodio (NaOH) 250 mM a los espedmenes inicialmente a pH 2 y NaOH 50 mM a los espedmenes inicialmente a pH 5. Se uso en todo el experimento un caudal total de 6 ml/s y un volumen celular de flujo total de aproximadamente 351 pl. En estas condiciones, el uso de una celula de flujo f C-15 para la deteccion de transmitancia implico un tiempo muerto de 10 ms. Los espedmenes tamponados y las disoluciones de NaOH se almacenaron en jeringuillas de alto rendimiento y se inyectaron volumenes equivalentes (1:1) por medio de un mezclador de alta densidad en la celula de flujo de observacion (1,5 mm de longitud de camino de luz). La transmitancia de los espedmenes se midio durante un tiempo de aproximadamente 15 s, y la reproducibilidad se verifico repitiendo las medidas cuatro veces. El metodo y la configuracion experimental se muestran esquematicamente en la Fig 11 (Barth, I. Grillo, y M. Gradzielski. Dynamics of formation of vesicles studied by highly time-resolved stopped-flow experiments. Tenside Surf. Det., 2010, 47:300-306).

Resultados y discusion

Analisis estructural de disoluciones de EMD con y sin arginina a diferentes pH

Es bien sabido en el campo de la tecnica que el EMD es muy soluble a 4°C. Por lo tanto, se disolvio EMD a 4°C y despues se analizo a 25 °C (RT), antes y despues de un tratamiento termico a T=80, 70 y 100°C, respectivamente, a fin de investigar su estabilidad alrededor de RT incluso despues de una fuerte tension de temperatura.

Comportamiento de conformacion y agregacion del EMD

Como se muestra en la Fig. 1(a), la absorcion UV-Vis del EMD en amortiguador BR a pH2 aumenta cuando la temperatura se elevo de 20 a 30 °C, indicando una tendencia de las protemas EMD a desplegarse, exponiendo sus residuos internos al amortiguador. La tendencia fue revertida a temperaturas mas altas, sin embargo, disminuyendo gradualmente la absorcion desde su nivel inicial, implicando que el EMD comienza a precipitar desde alrededor de 40 °C. Se observaron dos diferencias principales en presencia de arginina (Fig. 1 (b)): la intensidad de lmea de base a 20 °C aumento, indicando una agregacion mas extensa a temperaturas bajas que en ausencia de arginina, y la disminucion en absorcion a temperaturas altas fue menos marcada, sugiriendo una velocidad de precipitacion reducida. Los resultados obtenidos a pH5 se muestran en las Figs. 1(c) y 1(d). El comportamiento fue cualitativamente similar al observado a pH2, pero la absorcion alcanzo la saturacion a 30 °C en este caso, reflejando una tendencia aumentada para que el EMD se solubilice a pH5, incluso en presencia de arginina, aunque se infirio de nuevo que la arginina causa una disminucion en las velocidades de precipitacion a temperaturas altas.

La Fig 2A muestra los espectros FT-IR de segunda derivada de EMD en amortiguador de Britton-Robinson a pH 2 en el intervalo de longitudes de onda correspondiente a la region amida I. A 25 °C, los espectros para los espedmenes de EMD preparados mostraron picos a 1.652 y 1.660 cm'1, que se asignaron a las helices a. Tambien fueron visibles picos de laminas p nativas a 1.620, 1.633 y 1.643 cm-1, asf como un pico de laminas p intermoleculares a 1.698 cm-1 (Lambright DG, Balasubramanian S, Boxer SG. Protein relaxation dynamics in human myoglobin. Chemical Physics, 1991. 158:249-260). Despues de un tratamiento con calor e incubacion durante 12 h a 25 °C, la intensidad del pico a 1.660 cm-1 disminuyo, y el pico a 1.652 cm-1 fue sustituido por un pico a 1.654 cm-1, lo que ha sido relacionado previamente con conformaciones desordenadas (Barth A, Zscherp C. What vibrations tell us about proteins. Quarterly Reviews of Biophysics, 2002; 35(4):369-430), sugiriendo cambios conformacionales significativos de las helices a. Aunque el pico de laminas p nativas a 1.633 cm-1 no fue afectado en gran medida por el tratamiento con calor, los picos restantes mostraron intensidades y posiciones modificadas. Asf, el pico a 1.620 cm-1 fue sustituido por un pico mas intenso a 1.617 cm-1, el pico de laminas p intermoleculares a 1.698 cm-1 fue desplazado a aproximadamente 1.697 cm-1 y aparecio un pico adicional a 1.688 cm-1. Esto es significativo, en tanto que picos intensos en el intervalo 1.620-1.615 cm-1 y en el lfmite de longitudes de onda altas de la region amida I pueden indicar una exposicion de los contactos intermoleculares (Barth A, Zscherp C. What vibrations tell us about proteins. Quarterly Reviews of Biophysics, 2002; 35(4):369-430). Tres picos adicionales a 1.668, 1.675 y 1.682 cm-1 se asignaron a vueltas p, que se considera que son indicadores de la compacidad de las estructuras de las protemas, y pueden estar asociados con sitios de agregacion, porque tambien aparecen en las superficies externas de las protemas. Despues de un tratamiento con calor, el pico de vueltas p principal a 1.682 cm-1 se desplazo a aproximadamente 1.680 cm-1, indicando posiblemente de nuevo agregacion (Barth A, Zscherp C. What vibrations tell us about proteins. Quarterly Reviews of Biophysics, 2002; 35(4):369-430). El tratamiento con calor tambien dio como resultado un ligero aumento en la intensidad del pico de vueltas p a 1.668 y una disminucion mas sustancial en la intensidad del pico a 1.675 cm-1.

La adicion de arginina a pH 2 condujo a una disminucion en la intensidad del pico de las helices a centrado a alrededor de 1.660 cm-1 antes del tratamiento con calor, y una disminucion pequena adicional despues del tratamiento con calor, mientras que el pico a 1.652 cm-1 estuvo presente tanto antes como despues del tratamiento con calor (Fig 2B), indicando que las conformaciones asociadas con las helices a permanecen estables. Ademas, el pico de laminas p a aproximadamente 1.620 cm-1 permanecio sin cambios despues del tratamiento con calor, lo que sugiere que habfa tenido lugar un cambio conformacional limitado de la superficie expuesta. El pico mas intenso en el espectro antes y despues del tratamiento con calor fue el pico de vueltas p a aproximadamente 1.681 cm-1. La posicion de este pico fue la misma que la observada despues del tratamiento con calor en ausencia de arginina, en cuyo caso el desplazamiento desde su valor original de 1.682 cm-1 hasta 1.681 cm-1 se atribuyo a agregacion. Esto sugiere que la interaccion protema-protema no es impedida por la presencia de arginina, lo que se espera que promueva la compacidad de la estructura de la protema, explicando la alta intensidad del pico de vueltas p a 1.681 cm-1. Tomados conjuntamente, estos resultados implican que la arginina estabiliza la estructura del EMD a pH 2 con respecto al tratamiento con calor. Sin embargo, no esta claro si la arginina impide el despliegue y/o desnaturalizacion inducidos por calor, o si meramente favorece el repliegue a 25 °C posterior a la desnaturalizacion a temperaturas altas.

Para investigar esto adicionalmente, se llevaron a cabo in situ, por tanto, experimentos de absorbancia UV-Vis y 3D-DLS.

La distribucion de tamanos de partmula del EMD en el amortiguador de Britton Robinson a pH 2 en ausencia de arginina mostro dos picos principales a aproximadamente 8 y 80 nm antes del tratamiento con calor, determinado por DLS (Fig 2C). Despues del tratamiento con calor hasta 70 °C y enfriamiento hasta 20 °C la distribucion de tamanos se hizo mucho mas amplia, con picos que aparecieron a valores mas altos. Por tanto, de manera consistente con los resultados de FT-IR, los cambios conformacionales dominaron en este caso, como tambien reflejan las micrograffas TEM en la Fig 3A-B. Son visibles en la Fig 3A nanofilamentos y nanoesferas de aproximadamente 70 nm o menos de diametro, tfpicos de la amelogenina en su estado nativo (Fanga PA, Conwayb JF, Margolisc HC, Simmerd JP, Beniasha E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Pnas 2011; 108(34):14097-14102.), pero, como se ve en la Fig 3B, estos precipitaron parcialmente despues del tratamiento con calor. La presencia de arginina a pH 2 confiere compacidad al EMD, como sugiere la Fig 2d , que tambien fue consistente con los resultados de FT-IR. Dado que FT-IR mostro que no se produjo desnaturalizacion del EMD en presencia de arginina, se concluye que el despliegue inducido por calor estuvo ausente a pH 2. Por tanto, la estructura de nanoesferas del EMD permanecio sustancialmente intacta (Fig 3C-D).

Ademas, aunque los cambios conformacionales inducidos por calor asociados con el pico a 330 mm estaban aun presentes, fueron menos marcados. De hecho, el estado inicial del especimen se recupero en gran medida despues del enfriamiento posterior e incubacion a 20 °C, como refleja la forma de las curvas de absorbancia a longitudes de onda bajas, proporcionando evidencias adicionales de que la arginina limita las redisposiciones estructurales, presumiblemente por union a las regiones hidrofobas de las protemas constituyentes del EMD.

A pH 5 el espectro de FT-IR del EMD preparado (Fig 2A) mostro un pico de helices a particularmente fuerte a 1.652 cm-1, mientras que la intensidad del pico de helices a a 1.660 cm-1 fue comparable con la observada a pH 2 (Fig 2A). A numeros de onda mas bajos, se observaron picos caractensticos de laminas p nativas a 1.633, 1.623 y 1.615 cm-1, estando este ultimo pico ausente a pH 2 (Fig 2A). Los picos de vueltas p tambien estuvieron presentes a 1.668 y 1.682 cm-1, pero el pico a alrededor de 1.675 cm-1 se fusiono con el pico principal a 163 cm-1 y fue mucho mas debil que a pH 2, sugiriendo una estructura menos compacta. Finalmente, las bajas intensidades de los picos en la region del espectro de numeros de onda altos a alrededor de 1.688 cm-1 y 1.695 cm-1, correspondiente a la banda de laminas p intermoleculares, indico contactos intermoleculares relativamente debiles. El tratamiento con calor dio como resultado algunos cambios en la intensidad de estos picos, pero ninguna modificacion cualitativa importante a la estructura secundaria, con la excepcion de los picos de laminas p intermoleculares y nativas a 1.643 cm-1 y 1.695 cm-1, respectivamente, que se desplazaron a numeros de onda mas bajos. Por tanto, aunque la organizacion molecular del EMD fue modificada significativamente aumentando el pH, no sufrio cambios adicionales importantes despues del tratamiento con calor.

La consecuencia principal de la adicion de arginina a EMD a pH 5 fue un cambio en las conformaciones correspondiente a la region de numeros de onda altos, es decir, en las bandas de vueltas p y laminas p intermoleculares (Fig 4B). Antes del tratamiento con calor, el pico de vueltas p observado a alrededor de 1.675 cm-1 en ausencia de arginina se fusiono con el pico principal centrado en 1.668 cm-1, y el pico de laminas p intermoleculares a 1.695 cm-1 aumento en intensidad. En presencia de arginina, ambos componentes de las vueltas p fueron distinguibles. Sin desear limitar la invencion a esta hipotesis particular, este efecto puede atribuirse a la formacion de complejos entre la arginina e iones en el amortiguador que excluyen que las protemas interactuen con el disolvente. Ademas, la arginina tambien puede interactuar con los sitios de union externos del EMD. El tratamiento con calor dio como resultado una modificacion de las vueltas p, reflejada por la reaparicion de dos picos a 1.668 cm-1 y 1.675 cm-1, y los picos de laminas p intermoleculares a numeros de onda altos disminuyeron en intensidad. Sin embargo, aunque el tratamiento con calor en presencia de arginina afecto a los picos asociados con interacciones intermoleculares, las helices a nativas (1.652 y 1.660 cm-1) parecieron mas estables que en ausencia de arginina, donde los picos correspondientes mostraron cambios en intensidad significativos.

Los resultados de DLS en la Fig 4C mostraron que el maximo de distribucion de tamanos de partmula del EMD preparado a pH 5 fue aproximadamente 80 nm. El tratamiento con calor condujo a una agregacion aumentada, indicada por el ensanchamiento del pico y un desplazamiento hacia 500 nm, y tambien por las imagenes TEM (Fig 5A-B). Estuvieron presentes inicialmente nanofilamentos y nanoesferas aisladas (Fig 5A), pero se observo una aglomeracion extensa despues del tratamiento con calor (Fig 5B). Dado que FT-IR indico poco despliegue, se supuso que las nanoesferas, cuyas dimensiones en el EMD preparado fueron consistentes de nuevo con las tfpicas de la amelogenina (Fanga PA, Conwayb JF, Margolisc HC, Simmerd JP, Beniasha E. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale. Pnas 2011; 108(34):14097-14102.), se agregaron durante el tratamiento con calor. Como se ve a partir de la Fig 4D, la arginina limito esta agregacion. De hecho, despues del tratamiento con calor en presencia de arginina, el pico DLS principal a aproximadamente 100 nm se desplazo a por debajo de 80 nm y disminuyo ligeramente en intensidad, y aparecio un pico adicional a aproximadamente 6 nm. Por tanto, como se observo a pH 2, el tratamiento con calor puede haber dado como resultado la precipitacion de agregados mas grandes. Esto fue reflejado por las imagenes TEM en la Fig 5C-D, lo que sugiere que los nanofilamentos iniciales presentes en los espedmenes se han agregado y precipitado bajo el y/o despues del tratamiento con calor, con lo que solo aparecieron en las imagenes las nanoesferas.

A pH 10, las conformaciones de las protemas fueron modificadas fuertemente con respecto a las conformaciones nativas vistas a pH mas bajo, como corroboran los espectros FTR (Fig 6A), que indicaron una proporcion relativamente alta de estructura espiral aleatoria por ejemplo. Ademas, la combinacion de pH alto y cargas ionicas estabilizo la estructura secundaria durante el tratamiento con calor en ausencia de arginina. En presencia de arginina, por el contrario, los espectros obtenidos antes y despues del tratamiento con calor ya no se solaparon, la proporcion de espirales aleatorias se redujo, y los picos correspondientes a las estructuras de las vueltas p fueron distinguibles de nuevo (Fig 6B).

Aunque los resultados de DLS (Fig 6C-D) proporcionaron poca vision adicional, las micrograffas TEM en la Fig 7 confirmaron que la morfologfa del EMD es muy diferente de la observada a pH mas bajo, caracterizandose por extensos aglomerados amorfos similares a geles.

Cinetica de liberacion desde disoluciones de EMD y geles de EMD/PGA: el papel de la arginina.

La Fig. 8 muestra la cinetica de liberacion transiente desde EMD acuoso y EMD/PGA, reflejada por las medidas de flujo detenido de la transmitancia, T, en funcion del tiempo, t, despues de elevar el pH de los espedmenes a 7, es decir, cerca del punto isoelectrico del EMD (pH 6,8). Estos resultados mostraron de nuevo que la reduccion del pH inicial a 2 o la adicion de arginina dan como resultado una estabilizacion de las conformaciones de EMD nativas. Esto fue evidente tanto para el EMD como los geles de EMD/PGA, en tanto que los juegos de datos respectivos se ^{superpusieron, indicando una dinamica de liberacion similar, con la excepcion de los espe}d ^{menes preparados sin}arginina a pH5 (Fig 8A-B), que mostraron una turbidez significativamente mayor (es decir, T mas baja) a un t dado, y por tanto una mayor tendencia a formar precipitados grandes. Se desprende que la complejacion con PGA no modifico la respuesta intrmseca del EMD. Una comparacion de la Fig 8A y la Fig 8B sugiere no obstante que el PGA limita la precipitacion del EMD, siendo T aproximadamente 10% mayor para los geles de EMD/PGA que para el EMD en el t mas largo, debido presumiblemente a un confinamiento ffsico del EMD por la matriz de PGA. Esto implica que solo es posible una precipitacion total del EMD si el PGA es disuelto al menos parcialmente por el medio disolvente. El efecto del PGA podffa ser demostrado adicionalmente ajustando los datos para T(t) usando una funcion de decaimiento exponencial de segundo orden:

La Eq. 1 describe dos etapas en la formacion de precipitados de protemas, un proceso rapido con una amplitud A y una constante de decaimiento Ti, y un proceso lento dependiente de la gravedad con una amplitud A2 y una constante de decaimiento T2. Como se muestra en la Tabla 1, las constantes de decaimiento para el proceso lento fueron significativamente mayores para EMD/PGA que para EMD.

Estos resultados indican que la adicion de arginina no tiene una influencia adversa sobre la precipitacion en condiciones representativas para su aplicacion en procedimientos quirurgicos, y confirman el efecto estabilizante de las moleculas de arginina sobre el EMD con respecto a la agregacion a pH 5 en presencia de PGA. Ademas, el PGA no tiene tal efecto estabilizante, con lo que las velocidades de liberacion efectiva mas lentas desde los geles de EMD/PGA pueden atribuirse a un atrapamiento ffsico del EMD en la red de hidrogel del PGA, retrasando la aglomeracion a gran escala durante las etapas de precipitacion tardfas.

Cinetica de precipitacion desde disoluciones de EMD y geles de EMD/PGA: el papel de la arginina.

La Fig. 10 muestra la cinetica de precipitacion transiente desde EMD acuoso y gel Straumann Emdogain™ (EMD/PGA), reflejada por las medidas de flujo detenido de la transmitancia, T, en funcion del tiempo, t, despues de elevar el pH de los espedmenes a 7, es decir, cerca del punto isoelectrico del EMD (pH 6,8). Estos resultados mostraron de nuevo que la reduccion del pH inicial a 2 o la adicion de arginina dan como resultado una estabilizacion de las conformaciones del EMD. Esto fue evidente tanto para el EMD como los geles de EMD/PGA, en tanto quelos juegos de datos respectivos se superpusieron, indicando una dinamica de liberacion similar, con la excepcion de los ^esped ^{menes preparados sin arginina a pH5 (Fig 10(a)-(b) y Tabla 1), que mostraron una turbidez significativamente}mayor (es decir, T mas baja) a un t dado, y por tanto una mayor tendencia a formar precipitados grandes. Se desprende que la formacion de complejos con PGA no modifico la respuesta intrmseca del EMD en condiciones representativas de su aplicacion a tejido periodontal danado.

Conclusiones

Se ha mostrado usando diversas tecnicas analfticas que la adicion de arginina a EMD acuoso limita la desnaturalizacion del EMD a pH acido, y tambien hay evidencias de que puede revertir el despliegue a gran escala a pH alto. La investigacion de la cinetica de liberacion del EMD posterior a un aumento por etapas en pH hasta pH 7, que es cercano al punto isoelectrico del EMD, tambien mostro que la arginina no tiene una influencia adversa sobre las velocidades de precipitacion desde una disolucion acuosa o bien un vedculo de gel de PGA. De hecho, la respuesta en sistemas con un pH inicial de 5 fue similar con arginina a la de a pH 2 tanto con como sin arginina, reflejando de nuevo el efecto estabilizante de la arginina sobre el EMD. Estos resultados indican por lo tanto que la arginina, cuyo uso en productos para el tratamiento dental ya esta validado (Sakamoto R, Nishikori S, Shiraki K. High temperature increases the refolding yield of reduced lysozyme: implication for the productive process for folding. Biotechonl. Prog 2004; 20:1128-1133.15. Petrou I, Heu R, Stranick M, Lavander S, Zaidel L, Cummins D et al. A breakthrough therapy for dentin hypersensitivity: how dental products containing 8% arginine and calcium carbonate work to deliver effective relief of sensitive teeth. The Journal of Clinical Dentistry 2009; 20 (1): 23-31.), tiene el potencial de mejorar significativamente la vida de almacenamiento de geles a base de EMD/PGA usados en terapia regenerativa, sin comprometer la liberacion del EMD en el sitio de aplicacion.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado, que comprende las siguientes etapas:

b. disolver dichas protemas aisladas en un vehmulo farmaceutico adecuado,

c. disminuir el pH de dicha formulacion inicialmente hasta por debajo de pH 4, y

d. calentar dicha formulacion hasta entre 40-100°C durante al menos 10 minutos.

2. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun la reivindicacion 1, en donde el pH de dicha formulacion es disminuido en la etapa c. hasta por debajo de 3,5, tal como hasta 3,5 como maximo, tal como hasta 2.

3. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun la reivindicacion 1 o 2, en donde la formulacion en la etapa c. es calentada en la etapa d. hasta al menos 50 °C durante al menos 1 hora, tal como calentada hasta al menos 80°C durante al menos 3 horas.

4. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el vehmulo farmaceutico adecuado se selecciona del grupo que consiste en un amortiguador universal, acido acetico acuoso, acido cftrico y H2O.

5. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) comprenden al menos 60-70% de amelogenina, que tiene un peso molecular medio seleccionado del grupo que consiste en entre 18 y 25 kDa, entre 20 y 24 kDa, entre 20 y 22 kDa, y 20 kDa.

6. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende ademas mezclar la formulacion de la etapa d. con un modificador de la viscosidad adecuado.

7. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun la reivindicacion 6, que comprende ademas ajustar el pH de la formulacion de la etapa d. hasta al menos pH5 antes de mezclar dicha formulacion con un modificador de la viscosidad adecuado.

8. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en donde el modificador de la viscosidad es PGA.

9. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun la reivindicacion 7, en donde el PGA es PGA esterilizado por haces de electrones y en donde la formulacion tiene un pH de al menos pH5.

10. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 o 8, en donde el PGA es alginato de propilenglicol (PGA) esterilizado, con un peso molecular medio ponderal por encima de 130 kDa.

11. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun las reivindicaciones 1-9, que comprende ademas ajustar el pH de la formulacion de la etapa d. hasta pH 5 como maximo, tal como hasta entre pH 2 y pH 5, tal como entre pH 2,5 y pH 4,5, o tal como hasta pH 2,5.

12. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun una cualquiera de la reivindicacion 11, en donde dicha formulacion se mezcla con un modificador de la viscosidad adecuado.

13. Un procedimiento para producir una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en donde el modificador de la viscosidad es acido hialuronico, tal como acido hialuronico esterilizado por haces de electrones.

14. Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado producido por un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que se caracteriza por una vida util y/o durabilidad de al menos 12 meses a 2°C-RT.

15. Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica que comprende protemas de la matriz del esmalte y/o protemas derivadas de la matriz del esmalte (EMD) y un vehmulo farmaceutico adecuado segun la reivindicacion 14, que comprende ademas arginina.

16. Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica segun la reivindicacion 15, en donde dicha arginina tiene una concentracion de 500 mM como maximo.

17. Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, que comprende ademas un ceramico oseo adecuado y/o un injerto oseo.

18. Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, para uso en medicina.

19. Una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, para uso en el tratamiento de heridas y/o en el tratamiento de enfermedades periimplantarias y/o periodontitis.

20. Un kit que comprende una formulacion farmaceutica, dental y/o cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, y al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en granulos, ceramicos oseos, andamios, un injerto oseo, material de hueso natural, un bloque oseo, dientes artificiales y un implante.