ES2709027T3 - Determinación de género, viabilidad y/o etapa de desarrollo de embriones aviarios in ovo - Google Patents

Determinación de género, viabilidad y/o etapa de desarrollo de embriones aviarios in ovo Download PDF

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Abstract

Un proceso para la determinación no destructiva del género y/o etapa de desarrollo de un embrión aviar en un huevo, que comprende (a) detectar al menos un primer marcador de desarrollo para la determinación de la etapa de desarrollo seleccionada de Betaína, Aspartato, Arginina, Glutamato, glutamina y prolina y/o al menos un primer marcador de desarrollo para la determinación del género seleccionado entre Glucosa, Colina y/o Valina en el líquido alantoico de un huevo en un período de tiempo desde el inicio de la incubación del huevo hasta la eclosión; (b) medir la cantidad de al menos primer compuesto marcador del desarrollo detectado para la determinación de la etapa de desarrollo y/o el género; y (c) comparar la cantidad con una línea de base establecida para hombres y mujeres, y/o la etapa de desarrollo del embrión, para determinar si el embrión es masculino o femenino y/o la etapa de desarrollo del embrión.

Description

d e s c r ip c io n
Determinacion de genero, viabilidad y/o etapa de desarrollo de embriones aviarios in ovo
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un proceso para la determinacion del genero; y/o etapa de desarrollo de un embrion aviar en ovuIos, determinando la presencia de marcadores de desarrollo en el huevo mas espedficamente en el fluido alantoico. El presente proceso se refiere ademas a un proceso para la seleccion de huevos masculinos y femeninos, y a la produccion de vacunas y/o polluelos que usan estos huevos seleccionados.
Antecedentes de la invencion
Los huevos fertilizados de la mayona de las especies aviares, en particular Ios criados comercialmente, como el polio domesticado (Gallus gallus domesticus), Ios patos, gansos y pavos tienden a resultar en la eclosion en una distribucion casi igual de polios machos y hembras. En la gestion de incubacion, puede ser conveniente separar las aves segun varias caractensticas, en particular el genero. Por ejemplo, puede ser conveniente inocular aves macho y hembra con diferentes vacunas, o separar las poblaciones para obtener eficiencias de alimentacion, mejorar la uniformidad de procesamiento y reducir Ios costes de produccion cuando hay diferencias en la tasa de crecimiento y Ios requisitos nutricionales de aves macho y hembra. Aun mas, para la produccion comercial de huevos, la incubacion y crianza de polios machos es altamente indeseable, Io que lleva al sacrificio de miles de millones de pollitos machos cada ano.
Ademas, hay un porcentaje de huevos que no estan fertilizados o que no comprenden un embrion viable al comienzo del penodo de incubacion, Io que reduce en gran medida la capacidad de las incubadoras en Ios criaderos. Hasta ahora, la determinacion de Ios embriones viables, es decir, Ios embriones vivos se realizo tipicamente empleando una tecnica conocida como “mirar a trasluz”, como se describe, por ejemplo, en Ios documentos EP-A-2369336 y US 7950349. En este documento, se inspecciona un huevo utilizando una fuente de Iuz que emite Iuz de una longitud de onda que permite pasar al menos en parte a traves del huevo.
Aunque esto puede permitir identificar si un huevo contiene un embrion vivo, sin embargo, para obtener resultados confiables, requerira que el huevo haya progresado al menos hasta el dfa 11, o incluso a una etapa posterior de su desarrollo. Ademas, aunque esta tecnica puede discriminar entre huevos vivos y no vivos, no permite determinar de manera confiable el genero y otras caractensticas de las aves no eclosionadas.
Como resultado, se requiere una capacidad de incubacion de las granjas de polios actuales, que es al menos el doble de necesaria si se dispone de una seleccion de genero temprana, Io que permite la seleccion de embriones de pollitos principalmente hembras.
En consecuencia, sena de gran valor para el medio ambiente, mediante la reduccion de la cantidad de energfa y otros recursos requeridos, pero igualmente para la eliminacion del corte innecesario de pollitos machos, asf como la reduccion del estres para las aves recien nacidas, si se dispoma de un metodo de etapa temprana que permitiera determinar el genero de Ios embriones aviares antes de la fase de incubacion, tambien permitina aumentar considerablemente la capacidad de Ios criaderos.
Un beneficio adicional sena si el metodo tambien permitiera seleccionar embriones viables en lugar de huevos no fertilizados y/o por Io demas no viables, aumentando aun mas la eficiencia del proceso de incubacion.
Y Feng et al. divulga en Appl. Magn. Reson (2007), 32257-268, el analisis de Ios metabolitos en el Kquido alantoico de Ios huevos de gallina el dfa 9 mediante espectroso^a de NMR a una intensidad de campo super alta de 900 MHz . El documento US6365339 divulga un metodo para la determinacion de genero de un embrion aviar que comprende: obtener una muestra de fluido alantoico del embrion; analizar la muestra para un pico de un compuesto espedfico del sexo en un espectro de un espectrometro de movilidad de iones; y correlacionar el pico del espectro de muestra para diferenciar un embrion masculino de uno femenino.
Gu D.-C. et al, Chinese Journal of Animal Science, voI. 7, 23-25 divulga el analisis de las concentraciones de acido aspartico libre, acido glutamico, arginina y leucina en fluidos alantoicos y amnioticos durante la incubacion de cna de huevos por HPLC. Sin embargo, el proceso descrito no va mas alia de producir una imea de base para la comparacion de huevos de una fecha de puesta no especificada, sino que simplemente establece una imea de base para cuatro aminoacidos. Ademas, el metodo de examen divulgado es destructivo, ya que no se permitieron Ios huevos con embriones vivos para madurar y convertirse en cnas despues del examen o para otros fines, como la produccion de vacunas
Los documentos US-A-2003/0096319 y WO-A-2006124456 divulgan metodos para determinar el genero de un embrion aviar en un huevo al determinar la presencia de un compuesto esteroide estrogenico en una muestra de Ifquido embrionario, como Ifquido alantoico o sangre del huevo aviar Si bien esto puede ser factible sin la destruccion del huevo, las cantidades de esteroides estrogenicos son mmimas. El documento WO 98/14781 describe un metodo para determinar el genera de un ave que comprende detectar la presencla o ausencla de un nlvel elevado de hormona relaclonada con el sexo. en el Kquido extraembrionario del huevo de ave, y luego determinar el sexo del ave dentro del huevo por la presencia de un nivel elevado de hormona relacionada con el sexo. Preferiblemente, la hormona relacionada con el sexo es un estrogeno. El fluido extraembrionario es fluido alantoico. Tambien se describen los metodos de clasificacion. y la prueba solo tendra exito despues del desarrollo de las gonadas, por lo tanto, en un punto comparativamente tardra en el desarrollo del embrion. Aun mas, el metodo del documento WO-A-2006124456 tambien requerira la modificacion de marcadores de fluorescencia para cada especie y subgrupo de la misma, o la modificacion genetica de dichas especies. J.T. Lokemoen, et. al (J. Field Ornithol VoI. 67, No.4, paginas 660-668, 1996) divulgan un metodo de mirar a trasluz (no destructivo para el embrion en un huevo) para determinar la etapa de incubacion (= etapa de desarrollo) de Ios huevos de paseriformes.
Ohta Y. et al., Poultry Science, voI.80, No.10, 1430-1346, divulga el efecto de la administracion in ovo de aminoacidos, para ver como afecta esto a las concentraciones de aminoacidos de Ios embriones y otros contenidos de huevos de Ios huevos reproductores de polios de engorde. Sin embargo, este no es un metodo para determinar el genera, la viabilidad y/o la etapa de desarrollo de un huevo aviar.
Resumen de la invencion
De acuerdo con lo anterior, la presente invencion se refiere a un proceso para la determinacion no destructiva del genero y/o la etapa de desarrollo de un embrion aviar en un huevo, que comprende (a) detectar al menos un primer marcador de desarrollo para la determinacion de la etapa seleccionada de Betaina. Aspartato, arginina, glutamato, glutamina y prolina y/o al menos un primer marcador de desarrollo para la determinacion del genero seleccionado entre glucosa, colina y/o valina en el Ifquido alantoico de un huevo en un penodo de tiempo desde el inicio de la incubacion del huevo hasta la eclosion;
(b) medir la cantidad de al menos primer compuesto marcador del desarrollo detectado para la determinacion de la etapa de desarrollo y/o el genero; y (c) comparar la cantidad con una imea de base establecida para machos y hembras, o etapa de desarrollo del embrion para determinar si el embrion es masculino o femenino y/o la etapa de desarrollo del embrion.
Preferiblemente, (c) incluye un analisis univariado o multivariado de Ios metabolitos medidos, y una determinacion de la asociacion del embrion aviar con una cierta poblacion que comprende un programa de analisis de componentes principales y/o un programa de analisis de regresion de mrnimos cuadrados parcial.
La presente divulgacion se refiere ademas al uso de una multitud de huevos obtenidos mediante este proceso, en el que comprende determinar la etapa de desarrollo del embrion y el tiempo hasta que es probable que se produzca la eclosion, y la separacion de Ios huevos en multitud de huevos con similares o iguales etapas de desarrollo, para la produccion de alimento para animales y/o humanos, para la produccion y/o aislamiento de compuestos cosmeticos, medicos y/o nutricionales, para la produccion de metano mediante fermentacion y/o produccion de fertilizantes de alta calidad.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 representa el modelado parcial de mmimos cuadrados, un analisis de datos multivariado no supervisado, para datos de 1H RMN para agrupar muestras en base a todos Ios metabolitos detectados en 1H RMN de un conjunto de laboratorio de huevos de gallina. F representa hembra, M representa macho.
La Figura 2 muestra el modelo de mmimos cuadrados parciales, un analisis de datos multivariado no supervisado, para Ios datos de 1H NMR para agrupar muestras basandose en todos Ios metabolitos detectados en 1H NMR de un conjunto de pruebas mas grande de un criadero de polios comercial. F representa hembra, M representa macho.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se describe ahora mas detalladamente a continuacion con referenda al dibujo adjunto, en el que se muestra una realizacion preferida de la invencion. A menos que se defina lo contrario, todos Ios terminos tecnicos y cientificos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion.
Los terminos “aviar” y “ave”, como se usan en este documento, incluyen machos o hembras de cualquier especie aviar, pero estan destinados principalmente a abarcar aves de corral que se cnan comercialmente para huevos o carne. De acuerdo con, Ios terminos “ave” y “aviar” estan especialmente destinados a abarcar polio, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes.
El termino “incubacion” en este documento se refiere al proceso por el cual las aves incuban sus huevos y al desarrollo del embrion dentro del huevo despues de abandonar el tracto de la gallina. El penodo de incubacion en este documento se refiere al tiempo ininterrumpido durante el cual un huevo en particular se somete a condiciones que imitan la incubacion hasta la eclosion, es decir, la emergencla de las aves, incluida cualquler manipulacion o transferencla de, por ejemplo, una incubadora a una unidad de incubacion, siempre que se no se estanque el desarrollo de un ave.
El termino “in ovo”, como se usa en el presente documento, se refiere a los embriones de aves contenidos dentro de un huevo antes de la eclosion. La presente invencion puede ponerse en practica con cualquier tipo de huevo de ave, que incluye, entre otros, huevos de gallina, pavo, pato, ganso, codorniz y faisan (domesticados).
Los terminos “ inyeccion” e “inyeccion” en el presente documento abarcan metodos para insertar un dispositivo (tfpicamente un dispositivo alargado) en un huevo o embrion, incluidos los metodos para administrar o descargar una sustancia en un huevo o embrion, metodos para eliminar una sustancia (es decir, una muestra) de un ovulo o embrion, y/o metodos para insertar un dispositivo detector en un huevo o embrion.
La determinacion de acuerdo con la presente invencion se realiza como un metodo no destructivo, es decir, permitiendo que crezcan los embriones aviares as ^probados, si asf se desea, o sometiendolos a etapas adicionales como la produccion de vacunas in ovo, siempre que el embrion sea viable.
El termino “fluido alantoico” en el presente documento abarca el fluido alantoico con o sin la presencia de otros materiales de huevo. Por ejemplo, el termino fluido alantoico puede incluir una mezcla de sangre y fluido alantoico. Las realizaciones de la presente invencion no se limitan a extraer material del fluido alantoico o de areas cercanas a la superficie superior de un huevo. La eliminacion del material del fluido alantoico como se describe en este documento se proporciona como un simple ejemplo de posibles realizaciones de la presente invencion.
Se pueden extraer de un huevo diversos materiales que incluyen, entre otros, membrana amniotica, yema, cascara, albumina, tejido, y/o sangre, y se analizan para identificar uno o mas marcadores de desarrollo, como se describe a continuacion. El material puede ser extrafdo de huevos que tengan virtualmente cualquier orientacion. El termino “ubicacion predeterminada” en este documento indica una posicion fija o profundidad dentro de un huevo. Por ejemplo, un dispositivo puede inyectarse en un huevo a una profundidad fija y/o posicion fija en el huevo. En realizaciones alternativas, la inyeccion puede llevarse a cabo basandose en la informacion obtenida del huevo, por ejemplo, con respecto a la posicion del embrion o la cavidad subgerminal dentro del huevo. El termino “comparar la cantidad” puede incluir ventajosamente un analisis univariado o preferiblemente multivariado de los metabolitos medidos, y una determinacion de la asociacion de un embrion aviar con una cierta poblacion. La etapa puede comprender determinar la presencia de los analitos, es decir, los metabolitos, en el material de la muestra mediante analisis estadfstico multivariado del espectro de masas, NMR, o datos adecuados medidos de otra manera. El programa de analisis estad^stico multivariado comprende preferiblemente un programa de analisis de componentes principales y/o un programa de analisis de regresion de mmimos cuadrados parciales. Por lo tanto, la divulgacion tambien se refiere a un proceso, aparato y sistema para la determinacion del genera y/o etapa de desarrollo de un embrion aviar in ovo, que comprende un programa de analisis estadfstico multivariado, asf como un proceso implementado por microprocesador para la determinacion del mismo. Los procesos y aparatos de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgacion se pueden utilizar para identificar una o mas caractensticas de un huevo en cualquier momento durante el penodo de desarrollo embrionario, tambien denominado penodo de incubacion del mismo. Las realizaciones de la presente invencion no se limitan a un dfa particular durante el penodo de desarrollo embrionario.
En el presente proceso, los marcadores de desarrollo pueden analizarse preferiblemente de forma invasiva o no invasiva.
Si el analisis se realiza de forma invasiva, esto normalmente incluye la extraccion de una muestra de material de huevo. La muestra se toma preferiblemente del fluido alantoico, ya que es probable que esto dane al embrion. El fluido alantoico es tfpicamente un medio excretor para los metabolitos nitrogenados de un embrion aviar. El fluido alantoico comienza a formarse alrededor del dfa 3 de incubacion, segun lo revelado por Hamburger, V y Hamilton, HL (1951). “A series of normal stages in the development of the chick embryo”. Journal of Morphology 88 (1) 49-92.
En este documento se indica que la alantoides fue distinguible 65 horas despues de la incubacion, como una bolsa corta de pared gruesa, que aun no es vesicular. Despues de 72 horas, la alantoides era vesicular, de tamano variable en el promedio del tamano del cerebro medio, lo que indica que la alantoides y el fluido alantoico estan presentes a partir del dfa 3.
Alcanza un volumen maximo aproximadamente el d^a 13 de incubacion y luego disminuye de volumen a medida que la incubacion continua debido a la perdida de humedad y la resorcion del fluido, pero aun esta presente en volumenes significativos el d^a 18 de incubacion.
El fluido alantoico esta separado de la cascara del huevo por las membranas de la capa interna y externa y las membranas corioalantoicas. Aunque el fluido alantoico abarca toda la periferia de un huevo embrionado, el fluido alantoico generalmente se acumula en la parte superior de un huevo directamente debajo de las membranas que recubren la celula de aire.
La acumulacion del fluido alantoico en la parte superior del huevo se debe a la gravedad y al desplazamlento del embrlon denso y del saco vitelino. Intentar tomar muestras con precision del fluido alantoico a traves de la parte superior de un huevo mientras el huevo esta en posicion vertical puede ser diffcil debido a la variabilidad del espacio de aire de un huevo a otro. La gravedad se puede utilizar para agrupar el fluido alantoico en un sitio localizado. Cuando un huevo se gira sobre su eje longitudinal, el fluido alantoico se acumulara en la parte superior del huevo, directamente debajo de la cascara. La colocacion del huevo en su eje longitudinal hace que el fluido alantoico sea util para la extraccion de una muestra
La extraccion de material, como el fluido alantoico de los huevos, se puede realizar de varias maneras, incluida la penetracion de la cascara del huevo y la insercion de una canula de muestreo a traves de las membranas. Luego se puede recuperar una muestra del fluido a muestrear, mientras que la membrana y/o la cascara se sellan activamente con un sellador adecuado o se deja sellar.
Los metodos y aparatos adecuados para la penetracion de huevos y el muestreo invasivo de material de huevo se divulgan, por ejemplo, en los documentos Us -A -20070137577 WO-A-OO/22921 o WO-A-99/34667 sometido a un protocolo adecuado para permitir la deteccion de los marcadores de desarrollo, y un analisis de las cantidades relativas y/o absolutas de marcadores de desarrollo presentes.
La muestra puede analizarse mediante cualquier metodo adecuado para detectar y cuantificar el marcador o marcadores de desarrollo. Preferiblemente, el analisis se realiza mediante un metodo de imagen de resonancia magnetica que incluye metodos de resonancia nuclear: metodos de resonancia espectral que incluyen espectroscopia infrarroja o Raman, y/o metodos analfticos como GC o HPLC junto con detectores adecuados, espectroscopia de fluorescencia y/o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, incluidos los metodos humedos y secos, como el uso de un metodo de varilla de nivel. Si bien los metodos invasivos permiten tomar una muestra directamente y someter el fluido muestreado a un analisis, preferiblemente el analisis se realiza de manera no invasiva debido a la eficiencia de dicho metodo de analisis y al hecho de que la cascara y las membranas de los huevos permanecen imperforadas.
Se puede emplear cualquier metodo adecuado para realizar dicho analisis no invasivo. Tfpicamente, se pueden emplear metodos de resonancia espectral cuantitativa que incluyen espectroscopia infrarroja o Raman, preferiblemente usando espectros secundarios para la determinacion de la presencia y cantidades absolutas y/o relativas de marcadores de desarrollo presentes en un huevo, mientras que varias publicaciones han divulgado el uso de metodos no invasivos, por ejemplo, los documentos US-A-2011/144473 y US-A-7950349, estas publicaciones solo describen vagamente los espectros de emision globales, que en la practica no permiten seleccionar la etapa de desarrollo, la viabilidad y/o el genera de un embrion. El presente proceso difiere en particular de los metodos divulgados en que se determina la presencia de componentes espedficos en el huevo, lo que se puede hacer ventajosamente utilizando espectros derivados secundarios que permiten buscar selectivamente las cantidades absolutas y relativas de uno o mas compuestos marcadores del desarrollo.
En particular, la espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier derivada (FTIR) y FT-Raman, o una combinacion de las mismas, puede emplearse ventajosamente para lograr la precision y repetibilidad necesarias, mientras que los metodos de resonancia magnetica nuclear pueden emplearse adecuadamente para determinar la naturaleza de los marcadores de desarrollo, y establecer una lmea de base para calibrar el sistema.
El presente proceso permite ventajosamente determinar el genera de un embrion, y/o preferiblemente las etapas de desarrollo desde el comienzo de la incubacion del huevo hasta la eclosion.
Preferiblemente, la determinacion se realiza en un penodo de 1 a 15 dfas, mas preferiblemente de 2 a 14, aun mas preferiblemente de 3 a 13, e incluso mas preferiblemente de 4 a 12 d^as despues de que se inicie la incubacion tal como realizar la etapa a) preferiblemente en un penodo de tiempo de 6 a 12 dfas despues del comienzo de la incubacion del huevo.
Esto permite evitar los costes involucrados en la incubacion de huevos que no son viables y/o no son del genero deseado. Ademas, se puede determinar la etapa de desarrollo real de un huevo. Para especies con tiempos de incubacion mas cortos o mas largos que los de los polios domesticados, se pueden aplicar otros penodos, segun corresponda.
En el presente documento se divulgan marcadores de desarrollo seleccionados de azucares, aminoacidos y sus respectivos metabolitos y/o precursores.
De estos marcadores de desarrollo de particular importancia en el contexto de la presente invencion son la glucosa, la colina y la valina, cada una de las cuales tuvo una influencia estad^sticamente significativa en la determinacion del genero del embrion aviar.
Sin desear estar ligados a ninguna teona particular, se considera que la Colina y la trimetilglicina, su derivado de aminoacido, se usan particularmente para apoyar el desarrollo del sistema nervioso del feto. Se encontro que la proporcion de colina y trimetilglicina (betarna) difiere fuertemente entre los embriones macho y hembra, mientras que tambien las cantidades absolutas de colina eran mayores en el l^quido alantolco de Ios embrlones femenlnos. En general, la colina y sus metabolites son necesarios para tres propositos fisiologicos principales: funciones de integridad estructural roles y senalizacion de las membranas celulares, la neurotransmision colinergica (smtesis de acetilcolina) y una fuente importante de grupos metilo a traves de su metabolito, la trimetilglicina (betama), que participa en las v^as de smtesis de S-adenosilmetionina (SAM), Valina y Glucosa, por otro lado, tambien se encontro que vanan significativamente entre embriones macho y hembra
Cuando la especie aviar es Gallus gallus domesticus, un primer marcador de desarrollo o mas es la glucosa en una cantidad absoluta para un embrion femenino en el rango de 30 pM/ml a 70 pM/ml, y para un embrion macho de 1 pM/ml a 30 pM/ml en el fluido alantoico.
Otro marcador de desarrollo primero o adicional para Ios embriones de Gallus gallus domesticus es la colina, en una cantidad absoluta para un embrion femenino en el rango de 110 pM/ml a 130 pM/ml, y para un embrion masculino de 90 pM/ml hasta, pero sin incluir 110 pM/ml, en el fluido alantoico.
Sin embargo, otro marcador de desarrollo primero o adicional para Ios embriones de Gallus gallus domesticus es Valina, en una cantidad absoluta para un embrion femenino en el rango de 110 pM/ml a 130 pM/ml, y para un embrion macho de 90 pM/ml hasta, pero sin incluir, 110 pM/ml, en el fluido alantoico.
Preferiblemente, en el proceso en cuestion, se detecta al menos un segundo marcador en la etapa (a), y en el que Ios marcadores al menos primero y segundo se analizan y se comparan con la lmea de base, y entre sf para establecer una relacion de marcador de desarrollo.
Al correlacionar el analisis de dos o tres marcadores, la selectividad de la determinacion de genera puede mejorarse ventajosamente. De acuerdo con Io anterior, preferiblemente se detectan y analizan al menos un primer y un segundo y/o un marcador de desarrollo adicional, en donde las cantidades absolutas y la proporcion de al menos el primero al segundo y/o marcadores adicionales se emplean para determinar el genero
El presente proceso comprende ademas ventajosamente determinar si un embrion en un huevo es macho o hembra, y separar una multitud de huevos macho de una multitud de huevos hembra para formar una seleccion de huevos predominantemente masculina o predominantemente femenina.
Las selecciones de huevos hembra o macho asf formadas pueden someterse ventajosamente a un proceso de incubacion y eclosion para formar una poblacion de polios predominantemente femenina o masculina.
El presente proceso comprende ademas preferiblemente inyectar un virus o material similar a virus en cada huevo identificado como que contiene un embrion vivo y macho o hembra y, preferiblemente, despues de la incubacion comprende aislar la vacuna obtenida de Ios huevos incubados.
Despues de la inyeccion con un virus de semilla, Ios huevos que contienen embriones vivos se transfieren preferiblemente a una incubadora durante un penodo de tiempo predeterminado. Al final de este penodo de tiempo, Ios huevos se transfieren a una estacion de recoleccion de vacunas donde se extrae el material de cada huevo, por ejemplo, el Ifquido amniotico.
De acuerdo con Io anterior, el presente proceso tambien comprende preferiblemente las etapas de la eutanasia de un embrion en el huevo infectado, y la recoleccion de Ifquido amniotico de cada huevo sacrificado, en el que el Ifquido amniotico comprende una vacuna; y preferiblemente aislar una vacuna del Ifquido amniotico. Preferiblemente, el virus comprende el virus de la gripe humana y, por Io tanto, el Ifquido amniotico recogido comprende la vacuna de la gripe humana.
Los marcadores de desarrollo utilizados en la presente invencion tambien pueden emplearse para determinar la edad de un embrion.
Los marcadores de desarrollo divulgados en el presente documento utiles para la determinacion de la edad del embrion se seleccionan preferiblemente de aminoacidos, y sus respectivos metabolites y/o precursores. Los solicitantes encontraron que, en particular, las cantidades absolutas y relativas de aminoacidos, mas preferiblemente trimetilglicina, tambien conocida como Betama, Aspartato y Asparagina, Glutamato y Glutamina y Pralina podnan estar directamente relacionados con la etapa de desarrollo de un embrion aviar in ovo. Esto es muy relevante, ya que hay pocas caractensticas que permiten determinar la etapa de desarrollo, o la edad, de un embrion aviar, en particular en las primeras etapas del desarrollo.
De acuerdo con Io anterior, el presente proceso tambien permite, preferiblemente, seleccionar huevos de esencialmente la misma etapa de desarrollo, o edad real, y combinar una multitud de huevos de esencialmente la misma edad, para someter a Ios huevos a una incubacion controlada. El penodo de incubacion resultante debe ser mas uniforme, resultando en una poblacion de polios mas uniforme, de mayor calidad debido al estres acumulado, y reduciendo el numero de aves incubadas tempranas que estan expuestas a una exposicion prolongada a las condlclones de incubacion artificial
La poblacion de aves incubadas resultante mostrara una calidad mas alta, lo que resultara en un mayor rendimiento y menores requisitos de seguimiento para la poblacion de polios, por ejemplo, a traves de cantidades reducidas de tratamientos.
De manera similar, el uso de poblaciones de huevos seleccionadas por edad tambien permitira preparar vacunas de manera mas eficiente, ya que aqm la etapa de desarrollo de un embrion aviar es relevante para el momento en el que se inyecta un virus de la manera mas eficiente, y una vacuna recolectada.
La presente divulgacion tambien se refiere a selecciones de huevos y despues de incubar a un pollito o a una poblacion de polios obtenible mediante el proceso.
Los siguientes ejemplos no limitativos se proporcionan para ilustrar la invencion.
Ejemplo 1 Protocolo de perfil metabolico in ovo
Los huevos de Gallus gallus domesticus se incubaron a 37.8°C, girando cada hora, en una incubadora modelo 50, obtenible comercialmente de MS Broedmachines V.O.F.
Se incubo un grupo de 12 huevos durante 9 dfas, un segundo grupo de 12 huevos durante 10 dfas y un tercer grupo de 12 huevos durante 11 dfas.
Se sacaron los huevos de la incubadora, se colocaron en un soporte de papel, bajo un microscopio, con el saco de aire hacia arriba. La cascara y las membranas se perforaron y se rompieron abiertas alrededor del saco de aire, dejando las membranas internas intactas.
Usando la Iu z , se localizaron los vasos sangumeos que se extendfan sobre la membrana de la capa interna, y se realizo una pequena puncion que evitaba Ios vasos sangumeos a traves de las membranas interna y externa en la cavidad alantoica.
Se sesgo el huevo y luego se uso una pipeta de 1 ml para soplar aire en la cavidad, despues de lo cual se extrajeron 1.5 a 2 ml de fluido alantoico usando la pipeta. Esto se transfirio a un criovial, que se sumergio inmediatamente en nitrogeno Kquido. Las muestras se sacaron y se almacenaron a -80°C.
Se saco el embrion del huevo, cortando las membranas y usando una cuchara pequena. Se coIoco en un tubo falcon lleno con etanol al 96% y en hielo y se almaceno en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
El fluido alantoico se extrajo de -80°C descongelado y se extrajo una muestra de 1 ml y se coIoco en un vial de vidrio.
1 ml de cloroformo y 1 ml de una mezcla de metanol y agua (1:1). se agregaron a la muestra utilizando pipetas de Pasteur de vidrio. Los viales se cerraron con una tapa y luego se agitaron durante 20 segundos y luego se colocaron a 4°C durante 10 minutos. Usando una pipeta Pasteur de vidrio, se extrajo 1 ml de la parte superior de la mezcla y se transfirio a un criovial. La tapa de este criovial se perforo y se liofilizo durante la noche. Este producto liofilizado se empleo como muestra de n M r .
Ejemplo 2
Protocolo de perfil metabolico in ovo
Los huevos de Gallus gallus domesticus se incubaron a 37.8°C en un criadero comercial que giraba cada hora, en una incubadora industrial comercialmente disponible de Petersime NV. Se incubo un grupo de 50 huevos durante 8 dfas, un segundo grupo de 50 huevos durante 9 dfas y un tercer grupo de 50 huevos durante 10 dfas.
Se sacaron Ios huevos de la incubadora, se colocaron en un soporte de plastico bajo un microscopio, con el saco de aire hacia arriba.
La cascara y las membranas se perforaron y rompieron alrededor del saco de aire, dejando las membranas internas intactas. Usando la Iuz, se localizaron Ios vasos sangumeos que se extendfan sobre la membrana de la capa interna, y se realizo una pequena puncion que evitaba Ios vasos sangumeos a traves de las membranas interna y externa hacia la cavidad alantoica.
Se sesgo el huevo y luego se uso una pipeta de 1 ml para soplar aire en la cavidad, despues de lo cual se extrajeron 1.5 a 2 ml de fluido alantoico usando la pipeta. Esto se transfirio a un criovial, que se sumergio inmediatamente en nitrogeno Ifquido. Las muestras se sacaron y se almacenaron a -80°C.
El embrion fue sacado del huevo, cortando las membranas y usando una cuchara pequena. Se coIoco en un tubo falcon lleno con etanol al 96% y en hielo y se almaceno en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
El fluido alantoico se extrajo de -80°C, se descongelo y se puso una muestra de 0.5 ml en criovial. La tapa de este criovial se perforo y se liofilizo durante la noche. Este producto liofilizado se empleo como muestra de RMN.
Determinacion de genero - Verificacion:
El embrion de polio se saco del etanol y se dejo secar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se corto una pequena parte de la pierna izquierda y se uso para extraer ADN, usando un kit de extraccion de ADN (que se puede obtener comercialmente como kit Qiagen DNeasy), despues de Io cual se midio la cantidad con un dispositivo NanoDrop.
Se uso la PCR utilizando el par de cebadores 1272H y 1237L, que se puede obtener comercialmente de Sigma, para determinar el genero del embrion. El programa de PCR utilizado fue de 95°C durante 5 minutos, luego 36 veces a 95°C durante 45 segundos, 56°C durante 45 segundos, 72°C durante 1 minuto, despues de Io cual se realizo una ejecucion a 72°C durante 5 minutos. El genero del embrion se determino en funcion del producto de PCR resultante, identificado mediante el uso de un gel de agar al 2%.
Preparacion de muestra RMN
Se sometieron 50-100 mg del material de muestra obtenido como se describio anteriormente a mediciones de RMN resueltas en H1 H-J (2D) '1 bidimensionales, utilizando acido 3-(trimetilsilil)propionico-2,2,3,3-d4. (TSP) como un estandar interno, como se describe en Nature Protocols, V o I. 5, No. 3, 2010, paginas 536-549, y Phytochemistry 71, 2010, 773-784.
Los datos obtenidos para el Ejemplo 1 se representan en la Tabla 1:
Tabla 1: Datos medidos para embriones macho y hembra
Figure imgf000008_0001
Analisis de datos multivariados
En un modelo de mmimos cuadrados parciales, se empleo un analisis de datos multivariado no supervisado para Ios datos de 1H RMN para agrupar muestras basandose en todos Ios metabolitos detectados en 1H r Mn . La informacion mas importante obtenida fue la correlacion entre dos conjuntos de datos, es decir, las senales de 1H RMN (metabolitos) medidas y la clasificacion de la muestra (informacion del grupo).
El analisis no solo revelo las cantidades absolutas de marcadores de desarrollo para embriones masculinos o femeninos, sino tambien las cantidades relativas. Cuando se agregaron un segundo marcador y un tercer marcador, respectivamente, la selectividad de la prueba aumento aun mas, las Figuras 1 y 2 divulgar Ios resultados de un analisis multivariado del Ejemplo 1 y 2, respectivamente, y superponer con la determinacion de genero.
Ejemplo 3
Determinacion de la edad del embrion
Se repitio el Ejemplo 1, sin embargo, se analizaron Ios siguientes marcadores de desarrollo que se encontraron relevantes para la determinacion de la etapa de desarrollo, o la edad de Ios embriones.
T l 2: D m i i n r I i 11
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0001
Los dates anteriores indican claramente que la etapa de desarrollo de un embrion se puede determinar a partir de uno o mas marcadores de desarrollo.
Se empleo un modelo de mmimos cuadrados parciales, un analisis de datos multivariado no supervisado, para los datos de 1H RMN para agrupar muestras basandose en todos los metabolitos detectados en 1H RMN. La informacion mas importante obtenida fue la correlacion entre dos conjuntos de datos, es dedr, las senales de 1H RMN (metabolitos) medidas y la clasificacion de la muestra (informacion del grupo).
El modelo multivariado demostro la asociacion entre el genero y/o la edad de un embrion y las cantidades relativas de metabolitos presentes. El uso de metodos analfticos alternativos, como por ejemplo GCMs , dio resultados similares, corroborando as ^los resultados.
El analisis no solo revelo las cantidades absolutas de marcadores de desarrollo para la etapa de desarrollo, sino tambien las cantidades relativas. Cuando se agregaron un segundo, tercer y cuarto marcador, respectivamente, la selectividad de la prueba aumento aun mas.
Los ejemplos anteriores muestran claramente las ventajas del proceso y los materiales de la presente invencion.

Claims (13)

r e iv in d ic a c io n e s
1. Un proceso para la determinacion no destructive del genero y/o etapa de desarrollo de un embrlon aviar en un huevo, que comprende
(a) detectar al menos un primer marcador de desarrollo para la determinacion de la etapa de desarrollo seleccionada de Betama, Aspartato, Arginina, Glutamato, glutamina y prolina y/o al menos un primer marcador de desarrollo para la determinacion del genero seleccionado entre Glucosa, Colina y/o Valina en el Ifquido alantoico de un huevo en un penodo de tiempo desde el inicio de la incubacion del huevo hasta la eclosion;
(b) medir la cantidad de al menos primer compuesto marcador del desarrollo detectado para la determinacion de la etapa de desarrollo y/o el genero; y
(c) comparar la cantidad con una Imea de base establecida para hombres y mujeres, y/o la etapa de desarrollo del embrion, para determinar si el embrion es masculino o femenino y/o la etapa de desarrollo del embrion.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que (c) incluye un analisis univariado o multivariado de los metabolitos medidos, y una determinacion de la asociacion del embrion aviar con una cierta poblacion que comprende un programa de analisis de componentes principales, y/o un programa de analisis de regresion por mmimos cuadrados.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que al menos un segundo marcador se detecta en la etapa (a), y en el que los al menos primeros y segundos marcadores se analizan y se comparan con la Imea de base, y entre sf para establecer una relacion de marcador de desarrollo.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la especie aviar es Gallus gallus domesticus, y en el que un primer marcador de desarrollo o mas es glucosa en cantidad absoluta para un embrion hembra en el rango de 30 pM/ml a 70 pM/ml, y para un embrion masculino de 1 pM/ml hasta 30 pM/ml.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que un marcador de desarrollo primero o adicional es Colina en una cantidad absoluta para un embrion femenino en el intervalo de 110 pM/ml a l3o pM/ml, y para un embrion masculino de 90 pM/ml hasta, pero sin incluir 110 pM/ml.
6. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5, en el que un primer marcador de desarrollo o mas es Valina en una cantidad absoluta para un embrion femenino en el rango de 110 pM/ml a 130 pM/ml, y para un embrion masculino de 90 pM/ml hasta, pero sin incluir 110 pM/ml.
7. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 6, en el que al menos un primer y un segundo marcador de desarrollo se detectan y analizan, y en el que se emplean las cantidades absolutas y la proporcion de al menos el primer a segundo marcador para determinar el genero.
8. Un proceso segun la reivindicacion 7, en el que el analisis se realiza mediante un metodo de formacion de imagenes por resonancia magnetica que incluye metodos de resonancia nuclear; por un metodo de resonancia espectral que incluye espectroscopia infrarroja o Raman; y/o un metodo analttico como GC o HPLC acoplado con detectores adecuados, espectroscopia de fluorescencia y/o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.
9. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas al menos uno de;
(i) determinar si un embrion en un huevo es masculino o femenino, y separar una multitud de huevos masculinos de una multitud de huevos femeninos, para formar una seleccion de huevos predominantemente masculina o predominantemente femenina; (ii) determinar si un embrion en un huevo es masculino o femenino, y separa una multitud de huevos masculinos de una multitud de huevos femeninos, para formar una seleccion de huevos predominantemente masculina o predominantemente femenina, y someter las selecciones de huevos femeninas o masculinas a un proceso de incubacion y eclosion para formar una poblacion predominantemente femenina o masculina de polios.
10. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende (iii) determinar la etapa de desarrollo del embrion y el tiempo hasta que es probable que ocurra la eclosion, y separar los huevos en multitudes de huevos con una etapa de desarrollo similar o igual.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 10; que comprende ademas someter las selecciones de huevos a un proceso de incubacion y eclosion en Imea con la fecha de eclosion prevista, para formar una poblacion de polios de predominantemente la misma etapa de desarrollo.
12. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, que ademas comprende (vi) inyectar un virus o material similar a virus en cada huevo identificado como que contiene un embrion vivo y un macho o una hembra, y/o de una cierta etapa de desarrollo, y (vii) aislar la vacuna obtenida de los huevos incubados.
13. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que la especie aviar es Gallus gallus domesticus, y en el que los marcadores de desarrollo se seleccionan de al menos uno de: Trimetilglicina; Aspartato y/o asparagina; Glutamato y/o Glutamina, y/o Prolina.
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