TR201901409T4 - Kuş embriyolarının cinsiyetinin, yaşayabilirliğinin ve/veya gelişim aşamasının in ovo belirlenmesi. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, bir yumurtanın içindeki bir kuş embriyosunun cinsiyetinin, gelişim aşamasının zararlı olmayan şekilde belirlenmesine yönelik, (a) yumurtanın inkübasyonunun başlangıcından kuluçkadan çıkmaya kadar olan bir zaman periyodunda bir yumurtanın şekerleri ve/veya amino asitleri, prekursörleri ve metabolitlerinden seçilen en az birinci bir gelişim işareti bileşiğinin tespit edilmesini; (b) en az birinci tespit edilen gelişim işareti bileşiğinin miktarının ölçülmesini; ve (c) miktarın erkek veya dişiye yönelik oluşturulan bir temel çizgi ve/veya embriyonun canlı, erkek ve/veya dişi olduğunu belirlemek üzere canlı ve ölü veya gelişmemiş embriyo ve/veya embriyonun gelişim aşaması ile karşılaştırılmasını içeren bir proses ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME KUS EMBRIYOLARININ CINSIYETININ, YASAYABILIRLIGININ VE/VEYA GELISIM ASAMASININ IN OVO BELIRLENMESI Bulus Sahasi Mevcut bulus, yumurtanin içinde daha spesifik olarak alantoyik sivinin içinde gelisim isaretlerinin varligi belirlenerek cinsiyetin; ve/veya bir in ova kus embriyosunun gelisim asamasinin belirlenmesine yönelik bir proses ile ilgilidir.

Mevcut proses ayrica erkek yumurtalarin ve disi yumurtalarin seçimine yönelik bir prosese ve bu seçilen yumurtalar kullanilarak asilarin ve/veya civcivlerin üretimine refere eder.

Bulusun Altyapisi Çogu kus türünün döllenmis yumurtalari, Özellikle ticari olarak yetistirilenler, örnegin evcillestirilmis tavuk (Gallus gallus domesticus), ördekler, kazlar ve hindiler, erkek ve disi civcivlerin yaklasik olarak esit dagiliminda kuluçkadan çikmaya neden olma egilimi gösterir. Kuluçka yönetiminde çesitli özelliklere, özellikle cinsiyete bagli olarak kuslarin ayrilmasi istenebilir. Örnegin farkli erkek ve disi kuslara farkli asilar yapilmasi veya yem etkinligi kazanmak, proses istikrarini gelistirmek üzere popülasyonlarin ayrilmasi ve erkek ve disi kuslarin büyüme hizi ve besin gereksinimlerinde farkliliklarin oldugu üretim maliyetlerinin azaltilmasi istenebilir. Ancak ticari yumurta üretimine yönelik her yil milyarlarca erkek civcivin ayrilmasina neden olan, erkek civcivlerin inkübasyonu ve yetistirilmesi yüksek oranda istenmez.

Ayrica döllenmemis olan veya kuluçka yerlerinde inkübatörlerin kapasitesini önemli derecede azaltan, inkübasyon periyodunun baslangicinda yasayabilir bir embriyoyu içermeyen yumurtalarin bir yüzdesi mevcuttur. Simdiye kadar yasayabilirligin, diger bir ifadeyle canli embriyolarin belirlenmesi tipik olarak olarak bilinen bir teknik kullanilarak gerçeklestirilmistir. Burada bir yumurta, en azindan kismi olarak yumurtadan geçmesi saglanan bir dalgaboyunda isigi yayan bir isik kaynagi kullanilarak incelenir.

Bu bir yumurtanin canli bir embriyoyu içerip içermediginin tanimlanmasini saglayabilirken güvenilir sonuçlar vermek amaciyla yumurtanin gelisiminin en az 11. gününe veya daha sonraki bir asamasina ilerlemis olmasini gerektirecektir.

Ayrica bu teknigin canli ve canli olmayan yumurtalari ayirt edebilmesine ragmen kuluçkadan çikmayan kuslarin cinsiyetinin ve diger özelliklerinin güvenilir bir sekilde belirlenmesini saglamaz.

Sonuç olarak birincil olarak sadece disi civciv embriyolarinin seçimine olanak saglayan, erken bir cinsiyet seçiminin mevcut olabilmesi halinde gerekli olandan en az iki kati kadar fazla olmak üzere mevcut civciv çiftliklerinin bir inkübasyon kapasitesi gereklidir.

Buna göre ayni zamanda kuluçka yerlerinin kapasitesinin güçlü bir sekilde artmasina olanak saglayan, inkübasyon fazindan önce kus embriyolarinin cinsiyetinin belirlenmesine olanak saglayan bir sekilde bir erken asama yönteminin mevcut olmasi halinde bu, enerji ve gerekli olan diger kaynaklarinin miktarindaki azalma ancak gereksiz erkek civcivlerin kesilmesinin esit bir sekilde ortadan kaldirilmasi ayrica yeni kuluçkadan çikan kuslarin sterinin azaltilmasi açisindan çevreye yönelik çok degerli olacaktir.

Diger bir fayda, kuluçkadan çikma prosesinin etkinligini arttiran bir sekilde yöntemin ayni zamanda döllenmemis ve/veya diger bir sekilde cansiz olan yumurtalar üzerinde yasayabilen embriyolarin seçilmesine olanak saglamasidir. yüksek alan siddetinde NMR spektroskopisi tarafindan 9. günde tavuk yumurtalarinin alantoyik sivisinda metabolitlerin analizini açiklar. USÖ365339, bir kus embriyosunun cinsiyetinin belirlenmesine yönelik, asagidaki adimlari içeren bir yöntemi açiklar: embriyoda bir alantoyik sivi numunesinin elde edilmesi; bir iyon hareketlilik spektrometresinden bir spektrum içinde cinsiyete özel bir bilesigin bir pikine yönelik numunenin analiz edilmesi; ve bir erkegi disi embriyodan ayirt etmek üzere numune spektrum pikinin iliskilendirilmesi.

Gu D.-C. et al, Chinese Journal of Animal Science, Vol. 7, 23-25, HPLC tarafindan yumurta üretimi inkübasyonu sirasinda alantoyik ve amniyonik sivilarin içinde serbest aspartik asit, glutamik asit, arjinin ve kösin konsantrasyonlarinin analizini açiklar. Ancak açiklanan proses, belirtilmeyen bir yumurtlama tarihinin yumurtalarinin karsilastirmasina yönelik bir temel çizgisi üretmenin ötesine geçmez ancak kolay bir sekilde dört amino aside yönelik bir temel çizgi olusturur. Ayrica açiklanan inceleme yöntemi, canli embriyolari olan yumurtalarin incelemeden sonra kuluçkadan çikana kadar olgunlasmasina olanak saglamamasi açisindan zararlidir veya asi üretimi gibi diger amaçlara yönelik kullanilir. veya kan gibi bir embriyonik sivi numunesinde bir östrojenik steroid bilesigin varliginin belirlenmesiyle bir yumurtada bir kus embriyosunun cinsiyetinin belirlenmesine yönelik yöntemleri açiklar. Bu yumurtaya zarar vermeden uygulanabilirken östrojenik steroidin miktarlari minimumdur.

WO 98/14781, bir kusun cinsiyetinin in ovo belirlenmesine yönelik, kus yumurtasinin ekstra embriyonik sivisi içinde cinsiyet ile ilgili bir hormonun yüksek bir seviyesinin varliginin veya yoklugunun tespit edilmesini ve akabinde bunun içindeki cinsiyet ile ilgili hormonun yüksek bir seviyesinin varliginda yumurtanin içindeki kusun cinsiyetinin belirlenmesini içeren bir yöntemi açiklar.

Tercihen cinsiyet ile ilgili hormon, bir östrojendir. Ekstra embriyonik sivi, alantoyik sividir. Ayni zamanda siniflandirma yöntemleri açiklanir ve test sadece gonadlarin gelisiminden sonra, bu nedenle embriyonun gelisiminde karsilastirmali zamanda her bir türün ve bunun alt grubunun Iloresans isaretlerinin modifikasyonunu veya bu tür türlerin genetik modifikasyonunu gerektirecektir. J .T. Lokemoen, et. al (J. Field Ornithol Vol 67, No. 4, pages 660- 668, 1996), ötücü kuslarin yumurtalarinin inkübasyon asamasini (:gelisim asamasi) belirlemek üzere bir isiga tutma yöntemini (bir yumurtanin içindeki embriyoya zararli olmayan) açiklar. yumurtalarda embriyolarin ve diger yumurta içeriklerinin amino asit konsantrasyonlarini nasil etkiledigini görmek amaciyla amino asitlerin in 0v0 uygulamasinin etkisini açiklar. Ancak bu, bir kus yumurtasinin cinsiyetini, yasayabilirligini ve/veya gelisim asamasini belirlemek üzere bir yöntem degildir.

Bulusun Kisa Açiklamasi Buna göre mevcut bulus, bir yumurtanin içindeki bir kus embriyosunun cinsiyetinin ve/veya gelisim asamasinin zararli olmayan sekilde belirlenmesine yönelik, (a) Betain, Asparat, Arjinin, Glutamat, Glutamin ve Prolinden seçilen gelisim asamasinin belirlenmesine yönelik en az birinci bir gelisim isaretinin ve/veya yumurtanin inkübasyonunun baslangicindan kuluçkadan çikmaya kadar olan bir zaman periyodunda bir yumurtanin alantoyik sivisinda Glukoz, Kolin ve/veya Valinden seçilen Cinsiyetin belirlenmesine yönelik en az birinci bir gelisim isaretinin tespit edilmesi; (b) gelisim asamasi ve/veya cinsiyetin belirlenmesine yönelik en az birinci tespit edilen gelisim isareti bilesiginin miktarinin ölçülmesi; ve (c) miktarin erkek veya disiye yönelik olusturulan bir temel çizgi veya embriyonun erkek veya disi oldugunu belirlemek üzere gelisim asamasi ve/veya embriyonun gelisim asamasi ile karsilastirilmasi. 02263-P-0001 Tercihen (c), ölçülen metabolitlerin tek degiskenli veya çok degiskenli bir analizini ve ana bilesenler analizi programini ve/veya kismi en küçük kareler regresyonu analizi programini içeren belirli bir popülasyon ile kus embriyosunun iliskisinin belirlenmesini içerir.

Mevcut açiklama ayrica bu proses ile elde edilen çok sayida yumurtanin kullanimi ile ilgilidir, burada bu, embriyonun gelisim asamasinin ve kuluçkadan çikmanin meydana gelmesine kadar olan sürenin belirlenmesini ve hayvan ve/veya insan besini üretimine yönelik, kozmetik, medikal ve/veya besinsel bilesenlerin üretimine ve/veya izolasyonuna yönelik, fermentasyon araciligiyla metan üretimine ve/veya yüksek kalitede gübre üretimine yönelik yumurtalarin benzer veya esit gelisim asamasi olan birçok yumurtaya ayrilmasini içerir.

Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1, tavuk yumuitalarinin bir laboratuvar grubundan lH NMR olarak tespit edilen metabolitlerine tamamina bagli olarak grup numunelerine lH NMR verilerine yönelik kismi en küçük kare modellemesini, denetlenmeyen çok degiskenli bir veri analizini gösterir. F, disiyi temsil eder, M erkegi temsil eder.

Sekil 2, bir ticari tavuk kuluçka yerinden daha büyük bir laboratuvar grubunun iH NMR”si olarak tespit edilen metabolitlerine tamamina bagli olarak grup numunelerine lH NMR verilerine yönelik kismi en küçük kare modellemesini, denetlenmeyen çok degiskenli bir veri analizini gösterir. F, disiyi temsil eder, M erkegi temsil eder.

Bulusun Detayli Açiklamasi Mevcut bulus bu noktada bulusun tercih edilen bir düzenlemesinin gösterildigi ekli sekillere referans ile bundan sonra tam olarak açiklanir. Aksi belirtilmedigi sürece burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel ifadeler, bu bulusun ait oldugu 02263-P-0001 teknikte uzman olan kisilerden biri tarafindan yaygin olarak anlasilan ile ayni anlama sahiptir.

Burada kullanildigi üzere “kuslara ait” ve “kus” ifadeleri, herhangi bir kus türünün erkek veya disilerini içerir ancak birincil olarak yumurtalara veya ete yönelik ticari olarak yetistirilen kümes hayvanlarini kapsamasi amaçlanir. Buna göre “kus” ve “kusa ait” ifadelerinin özellikle tavuklari, hindiler, ördekleri, kazlari, bildircini ve sülünleri kapsamasi amaçlanir.

Buradaki “inkübasyon” ifadesi, kuslarin yumurtalarindan çiktiklari prosese ve disi kusun alanindan ayrildiktan sonra yumurtanin içindeki embriyonun gelisimine refere eder. Burada inkübasyon periyodu, bir kusun gelisiminin durdurulmamasi kosuluyla herhangi bir islem veya örnegin bir inkübatörden bir kuluçka birimine aktarimlar dahil olmak üzere belirli bir kusun kuluçkadan çikana, diger bir ifadeyle kuslarin dogmasina kadar kuluçkaya benzeyen kosullara tabi tutuldugu, Burada kullanildigi üzere “in ovo” ifadesi, kuluçkadan çikmadan önce bir yumurtanin içinde bulunan kus embriyolarina refere eder. Mevcut bulus, bunlarla sinirli olmamak üzere (evcillestirilmis) tavuk, hindir, ördek, kaz, bildircin ve sülün yumurtalarini içeren herhangi bir türdeki kus yumurtasi ile gerçeklestirilebilir.

Burada “enjeksiyon” ve “enjekte etme” ifadeleri, bir maddenin bir yumurtaya veya embriyoya dagitilmasi veya bosaltilmasi yöntemleri, bir maddenin (diger bir ifadeyle, bir numune) bir yumurtadan veya embriyodan çikartilmasi yöntemlerini ve/veya bir detektör cihazinin bir yumurtaya veya embriyoya yerlestirilmesi yöntemleri dahil olmak üzere bir cihazin (tipik olarak uzun bir cihaz) bir yumurtaya ve embriyoya yerlestirilmesi yöntemlerini kapsar. 02263-P-0001 Mevcut bulusa göre belirleme islemi, zararli olmayan bir yöntem olarak, diger bir ifadeyle bu sekilde test edilen kus embriyolarinin büyümesine, istenilmesi halinde bunun embriyonun canli olmasi kosuluyla in ovo asi üretimi gibi diger adimlara tabi tutulmasina olanak saglayan sekilde gerçeklestirilir.

Burada “alantoyik sivi” ifadesi, diger yumurta materyallerinin varligi ile veya bu olmadan alantoyik siviyi kapsar. Örnegin alantoyik sivi ifadesi, kan ve alantoyik sivinin bir karisimini içerebilir. Mevcut bulusun düzenlemeleri, alantoyik sividan veya bir yumurtanin üst yüzeyine yakin olan alanlardan çikan materyal ile sinirli degildir. Burada açiklandigi üzere alantoyik sividan materyalin uzaklastirilmasi, mevcut bulusun olasi düzenlemelerinin sadece bir örnegi olarak saglanir.

Bunlarla sinirli olmamak üzere amniyon, yumurta sarisi, kabuk, albümin, doku, membran ve/veya kani içeren çesitli materyaller, bir yumurtadan çikartilabilir ve gggid_a açiklandigi üzere bir veya daha fazla gelisim isaretini tanimlamak üzere incelenebilir. Materyal, neredeyse herhangi bir oryantasyona sahip olmayan yumurtalardan çikartilabilir. Burada “önceden belirlenen lokasyon” ifadesi, sabit bir pozisyonu veya bir yumurtanin içindeki derinligi gösterir. Örnegin bir cihaz, bir yumurtanin içinde sabit bir derinlige ve/veya yumurtanin içinde sabit bir pozisyona enjekte edilebilir. Alternatif düzenlemelerde enjeksiyon, örnegin embriyonun pozisyonuna veya yumurtanin içindeki subgerminal kaviteye iliskin yumurtadan elde edilen bilgiye bagli olarak gerçeklestirilebilir. “Miktarin karsilastirilmasi” ifadesi avantajli bir sekilde Ölçülen metabolitlerin tek degiskenli veya tercihen çok degiskenli bir analizi ve belirli bir popülasyon ile bir kus embriyosunun iliskisinin belirlenmesini içerebilir. Adim, kütle spektrali, NMR veya diger sekilde ölçülen uygun verilerin çok degiskenli istatistiksel analizi ile numune materyalindeki analitlerin, diger bir ifadeyle metabolitlerin varliginin belirlenmesini içerebilir. Çok degiskenli istatistiksel analiz programi tercihen ana bilesenler analizi programini ve/veya kismi en küçük kareler regresyonu analizi programini içerir. Bu nedenle açiklama ayni zamanda bunun belirlenmesine yönelik bir mikroislemci ile uygulanan prosesin yani sira çok degiskenli 02263-P-0001 istatistiksel analiz programini içeren, bir kus embriyosunun cinsiyetinin ve/veya gelisim asamasinin in ovo belirlenmesine yönelik bir proses, aparat ve sisteme yöneliktir. Mevcut açiklamanin düzenlemelerine göre prosesler ve aparat, ayni zamanda bunun inkübasyon periyodu olarak refere edilen embriyonik gelisim periyodu sirasinda herhangi bir zamanda bir yumurtanin bir veya daha fazla özelliginin tanimlanmasina yönelik kullanilabilir. Mevcut bulusun düzenlemeleri, embriyonik gelisim periyodu sirasinda belirli bir gün ile sinirli degildir.

Mevcut proseste gelisim isaretleri tercihen invazif olarak veya invazif olmayan bir sekilde analiz edilebilir.

Analizin invazif olarak gerçeklestirilmesi halinde bu tipik olarak yumurta materyalinin bir numunesinin çikartilmasini içerir. Bunun embriyoya zarar verme ihtimalinin daha az olmasi nedeniyle numune tercihen alantoyik sividan alinir.

Alantoyik sivi tipik olarak bir kus yumurtasinin nitrojenli metabolitlerine yönelik bir ekskretuar ortamdir. Alantoyik sivi, Hamburger, V ve Hamilton, HL (1951).

Morphology 88 (1) 49-92 tarafindan açiklandigi üzere inkübasyonun yaklasik 3. gününde olusmaya baslar.

Burada inkübasyondan 65 saat sonra allantoisin kisa, kalin duvarli bir paket olarak ancak veziküler olmayan bir sekilde ayirt edilebilir oldugu gösterilir. 72 saat sonra allantois, allantois ve alantoyik sivinin 3. gün mevcut oldugunu gösteren bir sekilde ortalama olarak orta beynin boyutunda boyut olarak degisken, veziküler olmustur.

Bu, inkübasyonun yaklasik olarak 13. gününde maksimum bir hacme ulasir ve akabinde nem kaybi ve sivi resorpsiyonu nedeniyle inkübasyon devam ettigi sürece hacim olarak küçülür ancak inkübasyonun 18. gününde önemli derecede hacimlerde mevcut olmaya devam eder. 02263-P-0001 Alantoyik sivi, iç ve dis kabuk membranlari ve koryoallantoik membranlar olarak yumurta kabugundan ayrilir. Alantoyik sivinin embriyonlasmis yumurtanin tam çevresini kapsamasina ragmen alantoyik sivi tipik olarak hava hücresinin üzerinde bulunan membranlarindan dogrudan altinda olan bir yumurtanin üst kisminda Yumurtanin üst kisminda alantoyik sivinin birikmesi, yer çekimi ve yogun embriyo ve yumurta kesesinin yer degisiminden kaynaklanir. Yumurta dik dururken yumurtanin üst kismi araciligiyla alantoyik sividan dogru bir sekilde numune almaya çalismak, yumurtadan yumurtaya hava boslugunun degisebilmesi nedeniyle zor olabilir. Yer çekimi, sinirlandirilan bir yerde alantoyik siviyi toplamak üzere kullanilabilir. Bir yumurta boylamsal ekseninde açildiginda alantoyik sivi, dogrudan kabugun altinda yumurtanin üst kenarinda toplanacaktir.

Yumurtanin boylamsal ekseni üzerine koyulmasi, alantoyik siviyi bir numunenin çikartilmasina yönelik faydali hale getirir.

Yumurtalarda alantoyik sivi gibi materyalin çikartilmasi, yumurta kabugunun delinmesi ve membranlara bir numune alma kanülünün yerlestirilmesi dahil olmak üzere çesitli yollarda gerçeklestirilebilir. Membran ve/veya kabuk aktif bir sekilde uygun olan bir sizdirmazlik maddesi ile kapatildiginda veya kendisini kapatmasi saglandiginda numunesi alinacak olan sivinin bir numunesi akabinde geri çekilebilir.

Yumurtalarin delinmesine ve yumurta materyalinin invazif olarak numunesinin alinmasina yönelik uygun olan yöntemler ve aparatlar, Örnegin US-A- alinan numune akabinde gelisim isaretlerinin tespitini saglamak üzere uygun bir protokole ve mevcut olan gelisim isaretlerinin ilgili ve/veya mutlak miktarlarinin analizine tabi tutulur. 02263-P-0001 Numune, gelisim isareti veya isaretlerini tespit etmek ve miktarini belirlemek üzere uygun olan herhangi bir yöntem ile analiz edilebilir. Tercihen analiz, nükleer rezonans yöntemlerini içeren bir manyetik rezonans görüntüleme yöntemi: kizilötesi veya Raman spektroskopisini içeren spektral rezonans yöntemleri ve/veya analitik yöntemler, örnegin uygun detektörler ile baglanan GC veya HPLC, floresans spektroskopisi ve/veya yas ve kuru yöntemler, örnegin bir ölçme çubugu yöntemi kullanimi dahil olmak üzere enzime bagli bagisiklik analizi ile gerçeklestirilebilir. invazif yöntemler dogrudan bir numune alinmasina ve numunesi alinan sivinin bir analize tabi tutulmasina olanak saglarken tercihen analiz, bu tür analiz yöntemlerinin etkinligi ve yumurta kabugu ve içindeki membranlarin deliksiz olarak kalmasi nedeniyle invazif olmayan bir sekilde gerçeklestirilir.

Uygun olan herhangi bir yöntem, invazif olmayan bu tür analizleri gerçeklestirmek üzere kullanilabilir. Tipik olarak tercihen bir yumurtanin içinde mevcut olan gelisim isaretlerinin varligini ve mutlak ve/veya ilgili miktarlarini belirlemeye yönelik ikincil spektrumlar kullanilarak, kizilötesi veya Raman spektroskopi dahil olmak üzere nicel spektral rezonans yöntemleri kullanilabilir. olmayan yöntemlerin kullanimini açiklamasina ragmen bu yayinlar sadece uygulama sirasinda bir embriyonun gelisim asamasini, yasayabilirligini ve/veya cinsiyetini seçmeye izin vermeyen tam emisyon spektrumlarini belirsiz bir sekilde açiklar. Mevcut proses, avantajli bir sekilde bir veya daha fazla gelisim isareti bilesiginin mutlak ve ilgili miktarlarini seçici bir sekilde arastirmaya olanak saglayan ikincil türev spektrumlar kullanilarak yapilabilen, yumurtanin içindeki spesifik bilesenlerin varliginin belirlenmesi açisindan özellikle açiklanan yöntemlerden farklidir. Özellikle diferansiyel ikinci türev Fourier dönüsümü-kizilötesi (FTIR) ve FT- Raman spektroskopisi veya bunlarin kombinasyonu, gerekli olan dogrulugu ve tekrar edilebilirligi elde etmek üzere avantajli bir sekilde kullanilabilirken nükleer 02263-P-0001 manyetik rezonans yöntemleri, gelisim isaretlerinin yapisini belirlemek üzere ve sistemi kalibre etmek üzere bir taban çizgisi olusturmak üzere uygun bir sekilde kullanilabilir.

Mevcut proses, bir embriyonun cinsiyetinin ve/veya tercihen yumurtanin inkübasyonunun baslangicindan kuluçkadan çikana kadar olan gelisim asamalarinin belirlenmesine olanak saglar.

Tercihen belirleme islemi, inkübasyonun baslatilmasindan 1 ila 15 gün, daha fazla tercih edildigi üzere 2 ila 14, daha fazla tercih edildigi üzere 3 ila 13 ve daha fazla tercih edildigi üzere 4 ila 12 gün periyodunda gerçeklestirilir, örnegin adim a), yumurtanin inkübasyonunun baslangicindan sonra 6 ila 12 günlük bir zaman periyodunda gerçeklestirilir.

Bu, canli olmayan ve/veya istenen cinsiyette olmayan yumurtalarin inkübasyonunda bulunan maliyetlerin Önlenmesine olanak saglar. Ayrica bir yumurtanin asil gelisim asamasi belirlenebilir. Evcillestirilmis tavuklarinkine göre daha kisa veya daha uzun inkübasyon süreleri olan türlere yönelik uygun oldugu sürece diger periyotlar uygulanabilir.

Burada sekerler, amino asitler ve bunlarin ilgili metabolitleri ve/veya prekursörlerinden seçilen gelisim isaretleri açiklanir.

Mevcut bulusun baglaminda özellikle önemli olan bu gelisim isaretleri, Glukoz, Kolin ve Valindir, bunlarin her biri, kus embriyosunun cinsiyetinin belirlenmesi üzerinde istatistiksel olarak önemli bir etkiye sahiptir.

Herhangi bir belirli teoriye bagli kalinmak istenmeksizin Kolin ve trimetilglisin, bunun amino asit türevlerinin fetüsün gelisen sinir sistemini desteklemek üzere özellikle kullanildigi düsünülür. Ayni zamanda kolinin mutlak miktarlari disi embriyolarin alantoyik sivida daha yüksek olurken kolin ve trimetilglisin (betain) 02263-P-0001 oraninin erkek ve disi embriyolar arasinda güçlü bir sekilde farkli oldugu bulunmustur. Genel olarak kolin ve bunun metabolitleri, üç ana fizyolojik amaca yönelik gereklidir: hücre membranlarina yönelik yapisal bütünlük ve sinyal verme rolleri, kolinerjik nörotransmisyon (asetilkolin sentezi) ve bunun metabolitleri araciligiyla metil gruplarina yönelik bir ana kaynak, S-adenosilmetiyonin (SAMe) sentezi yolaklarinda bulunan Trimetilglisin (betain), Valin ve Glukozun diger taraftan erkek ve disi embriyolar arasinda önemli derecede degisiklik gösterdigi bulunmustur.

Burada kus türü, Gallus gallus domesticus/tur, birinci veya diger gelisim isareti, uM/ml ila 70 uM/ml araliginda bir disi embriyoya yönelik ve alantoyik sivi içinde 1 uM/ml ila 30 uMimi araliginda bir erkek embriyosuna yönelik mutlak miktarda glukozdur.

Gallus gallus domesticus embriyolarina yönelik birinci ve diger gelisim isareti, 110 tiM/ml ila 130 pM/ml araliginda bir disi embriyosuna yönelik ve alantoyik sivi içinde 90 uM/ml ila bu dahil olmamak üzere 110 uM/mliye kadar bir erkek embriyosuna yönelik mutlak bir miktarda Kolindir.

Ancak Gallus gallus domesticus embriyolarina yönelik birinci ve diger gelisim isareti, 110 uM/ml ila 130 uM/ml araliginda bir disi embriyosuna yönelik ve alantoyik sivi içinde 90 uM/ml ila bu dahil olmamak üzere 110 uM/mlsye kadar bir erkek embriyosuna yönelik mutlak bir miktarda Valindir.

Tercihen söz konusu proseste en az bir ikinci isaret, adim (a) içinde tespit edilir ve burada en az birinci ve ikinci isaret analiz edilir ve bir gelisim isareti orani olusturmak üzere temel çizgisi ve birbiri ile karsilastirilir.

Iki veya üç isaretin analizi iliskilendirilerek cinsiyetin belirlenmesinin seçiciligi avantajli bir sekilde gelistirilebilir. Buna göre tercihen en az birinci ve ikinci ve/veya diger gelisim isareti tespit edilir ve analiz edilir, burada mutlak miktarlar 02263-P-0001 ve en az birincinin ikinci ve/veya diger isaretlere orani, cinsiyeti belirlemek üzere kullanilir.

Mevcut proses ayrica bir yumurtanin içindeki embriyonun erkek ve disi oldugunun belirlenmesini ve baskin olarak erkek veya baskin olarak disi yumurta seçimini olusturmak üzere birçok disi yumurtasindan birçok erkek yumurtasinin ayrilmasini içerir.

Bu sekilde olusturulan disi veya erkek yumurta seçimleri avantajli bir sekilde baskin olarak disi veya erkek civciv popülasyonu olusturmak üzere bir inkübasyon ve kuluçka prosesine tabi tutulabilir.

Mevcut proses ayrica tercihen bir virüs veya virüs benzeri bir materyalin canli bir embriyoyu ve erkek ve disileri içerdigi tanimlanan her bir yumurtanin içine enjekte edilmesini içerir ve tercihen inkübasyondan sonra inkübe edilmis yumurtalardan elde edilen asinin izole edilmesini içerir.

Bir tohum virüsün enjeksiyonundan sonra canli embriyolari içeren yumurtalar tercihen önceden belirlenen bir zaman periyodu boyunca bir inkübatöre aktarilir.

Bu zaman periyodunun sonunda yumurtalar, her bir yumurtadan materyalin, örnegin amniyotik sivinin çikartildigi bir asi toplama istasyonuna aktarilir.

Buna göre mevcut proses tercihen ayni zamanda enfekte olan yumurtadaki bir embriyoya ötenazi uygulanmasi ve ötenazi uygulanan her bir yumurtadan amniyotik sivinin toplanmasi, burada amniyotik sivi, asiyi içerir; ve tercihen amniyotik sividan bir asinin izole edilmesi adimlarini içerir. Tercihen virüs, insan influenza virüsünü içerir ve bu nedenle toplanan amniyotik sivi, insan influenza asisini içerir.

Söz konusu bulusta kullanilan gelisim isaretleri tercihen ayni zamanda bir embriyonun yasini belirlemek üzere kullanilabilir. 02263-P-0001 Embriyonun yasinin belirlenmesine yönelik faydali olarak burada açiklanan gelisim isaretleri tercihen amino asitler ve bunlarin ilgili metabolitleri ve/veya prekursörlerinden seçilir. Basvuru sahipleri, özellikle amino asitler, daha fazla tercih edildigi üzere Betain olarak bilinen Trimetilglisin, Aspartat ve Asparajin, Glutamat ve Glutamin ve Pralinin mutlak ve ilgili miktarlarinin kus embriyosunun in ovo gelisim asamasi ile dogrudan ilgili olabilecegini bulmustur. Özellikle gelisimin erken asamalarinda olan bir kus embriyosunun gelisim asamasinin veya yasinin belirlenmesine olanak saglayan yeni özelliklerin mevcut olmasi nedeniyle bu oldukça ilgilidir.

Buna göre mevcut proses ayni zamanda tercihen esas olarak ayni gelisim asamasindaki veya gerçek yastaki yumurtalarin seçilmesine ve esas olarak ayni yastaki birçok yumurtanin kombine edilmesine ve yumurtalarin kontrollü bir inkübasyona tabi tutulmasina olanak saglar. Ortaya çikan kuluçka periyodunun azaltilan stres nedeniyle daha yüksek kalitede daha esit civciv popülasyonuna ortaya çikarak ve yapay inkübasyon kosullarina uzun süre maruziyete tabi tutulan erken kuluçkadan çikan kuslarin sayisini azaltacak sekilde daha esit olmasi Ortaya çikan kuluçkadan çikmis kus popülasyonu, örnegin azaltilmis miktarlarda islem araciligiyla civciv popülasyonuna yönelik daha yüksek verim ve daha düsük takip gereksinimine neden olacak sekilde daha yüksek bir kalite gösterecektir.

Benzer bir sekilde bir kus embriyosunun gelisim asamasinin virüsün en etkili sekilde enjekte edildigi ve bir asinin toplandigi zaman noktasina yönelik ilgili olmasi nedeniyle yumurtalarin seçilen yastaki popülasyonlarinin kullanimi ayni zamanda asilarin daha etkili bir sekilde hazirlanmasina olanak saglayacaktir.

Mevcut açiklama ayni zamanda yumurta seçimleri ve kuluçkadan çiktiktan sonra proses ile elde edilebilen bir civciv veya bir civciv popülasyonu ile ilgilidir. 02263-P-0001 Asagidaki sinirlayici olmayan örnekler, bulusu göstermek üzere saglanir. Örnek 1 In ovo protokol metabolik profilleme Gallus gallus domesticus yumurtalari, MS Broedmachines V.O.F,den ticari olarak elde edilebilen bir inkübatör modeli 50,de saat basi çevrilerek 37.8°C,de inkübe edilmistir. 12 yumurtalik bir grup, 9 gün boyunca, 12 yumurtalik bir ikinci grup 10 gün boyunca ve 12 yumurtalik üçüncü bir grup 11 gün boyunca inkübe edilmistir.

Yumurtalar, inkübatörden çikarilmistir, bir hava torbasi olan bir mikroskop altinda bir kagit tutucuya yerlestirilmistir. Kabuk ve membranlar delinmistir ve iç membranlari saglam birakarak hava torbasinin çevresinde kiriklar açilmistir. yerlestirilmistir ve kan damarlarindan kaçinilarak alantoyik kavite içinde iç ve dis membranlar üzerinde küçük bir delik açilmistir.

Yumurtalar egriltilmistir ve 1 ml pipet akabinde havayi kavitenin içine üflemek üzere kullanilmistir, bundan sonra 1.5 ila 2 ml alantoyik sivi, pipet kullanilarak çikartilmistir. Bu, hemen sivi nitrojen içine yerlestirilen bir kriyoviyale aktarilmistir. Numuneler akabinde disari çikartilmistir ve -80°C°de depolanmistir.

Embriyo, membranlar kesip çikartilarak ve küçük bir kasik kullanilarak yumurtadan çikartilmistir. %96 etanol ile doldurulan bir falkon tüpüne ve buzun üzerine koyulmustur ve oda sicakliginda karanlik bir yerde depolanmistir.

Alantoyik sivi, -80°C'den çikartilmistir, buzu eritilmistir ve 1 in] bir numune çikartilmistir ve bir cam viyalin içine koyulmustur. 1 m1 kloroform ve 1 m1 metanol ve su (lzl) karisimi, can Pasteur pipetleri kullanilarak numuneye 02263-P-0001 eklenmistir. Viyaller, bir kapak kullanilarak kapatilmistir ve akabinde 20 saniye boyunca çalkalanmistir akabinde 10 dakika boyunca 4°C°ye yerlestirilmistir. Bir cam Pasteur pipet kullanilarak karisim üst parçasinin l ml`si disari çikartilmistir ve bir kriyoviyale aktarilmistir. Bu kriyoviyalin kapagi delinmistir ve bir gece boyunca dondurularak kurutulmustur. Bu dondurularak kurutulan ürün, NMR numunesi olarak kullanilmistir.

In ovo protokol metabolik proûlleme Gallus gallus domesticus yumurtalari, Petersime NViden ticari olarak elde edilebilen bir endüstriyel inkübatör içinde saat basi çevrilerek ticari bir kuluçka yerinde 37.80C”de inkübe edilmistir. 50 yumurtalik bir grup, 8 gün boyunca, 50 yumurtalik bir ikinci grup 9 gün boyunca ve 50 yumurtalik üçüncü bir grup 10 Yumurtalar, inkübatörden çikartilmistir, hava torbasi olan bir mikroskop altinda bir plastik tutucunun içine yerlestirilmistir.

Kabuk ve membranlar delinmistir ve iç membranlar saglam birakilarak hava torbasinin çevresinde kiriklar açilmistir. Isik kullanilarak iç kabuk membrani üzerinde bulunan kan damarlari yerlestirilmistir ve kan damarlarindan kaçinilarak alantoyik kavite içinde iç ve dis membranlar üzerinde küçük bir delik açilmistir.

Yumurtalar egriltilmistir ve 1 ml pipet akabinde havayi kavitenin içine üflemek üzere kullanilmistir, bundan sonra 1.5 ila 2 ml alantoyik sivi, pipet kullanilarak çikartilmistir. Bu, hemen sivi nitrojen içine yerlestirilen bir kriyoviyale aktarilmistir. Numuneler akabinde disari çikartilmistir ve -80°C”de depolanmistir. 02263-P-0001 Embriyo, membranlar kesip çikartilarak ve küçük bir kasik kullanilarak yumurtadan çikartilmistir. %96 etanol ile doldurulan bir falkon tüpüne ve buzun üzerine koyulmustur ve oda sicakliginda karanlik bir yerde depolanmistir.

Alantoyik sivi, -80°C”den çikartilmistir, buzu çözülmüstür ve 0.5 ml bir numune, kriyoviyalin içine koyulmustur. Bu kriyoviyalin kapagi delinmistir ve bir gece boyunca dondurularak kurutulmustur. Bu dondurularak kurutulan ürün, NMR numunesi olarak kullanilmistir.

Cinsiyet belirlemesi - Dogrulama: Tavuk embriyosu, etanolden çikartilmistir ve oda sicakliginda 10 dakika boyunca kuruyana kadar disarda birakilmistir. Sol bacagin küçük bir kismi kesilmistir ve bu, bir DNA ekstraksiyonu kiti (Qiagen DNeasy kiti olarak ticari olarak elde edilebilen) kullanilarak DNA ekstraksiyonuna yönelik kullanilmistir, bundan sonra miktar, bir nanodamla cihaz kullanilarak ölçülmüstür.

Sigma'dan ticari olarak elde edilebilen primer çift 1272H ve 1237L kullanan PCR, embriyonun cinsiyetini belirlemek üzere kullanilmistir. Kullanilan PCR 45 saniye boyunca 56°C, 1 dakika boyunca 72°C7dir, bundan sonra bir çalisma, 5 dakika boyunca 72°C,de yapilmistir. Embriyonun cinsiyeti, %2 agar jel kullanilarak tanimlanan ortaya çikan PCR ürününe bagli olarak belirlenmistir.

NMR Numunesinin Hazirlanisi Yukarida açiklandigi gibi elde edilen numune materyalinin 50-100 mg,si, Nature 784 içinde açiklandigi üzere bir iç standart olarak 3-(trimetilsilil)pr0piy0nik- -l Hl H-J-çözünürlüklü NMR ölçümlerine tabi tutulmustur. Örnek lle yönelik elde edilen veri, Tablo l7de gösterilir: Tablo 1: Erkek ve Disi Embriyolarina Yönelik Ölçülen Veri Gelisim Disi (pM/mL; parantez içinde Erkek (uM/mL; parantez içinde Isaretleri standart sapma) standart sapma) Çok degiskenli veri analizi Kismi en küçük kare modellemesini, denetlenmeyen çok degiskenli bir veri analizi, 1H NMR olarak tespit edilen metabolitlerine tamamina bagli olarak grup numunelerine lH NMR verilerine yönelik kullanilmistir. Elde edilen en önemli bilgi, iki veri grubu, diger bir ifadeyle ölçülen 'H NMR sinyalleri (metabolitler) ve numune sinifi (grup bilgisi) arasindaki iliskidir.

Analiz, erkek veya disi embriyolara yönelik gelisim isaretlerinin mutlak miktarlarini ve ayni zamanda ilgili miktarlari ortaya çikarmistir. Ikinci bir isaret ve üçüncü bir isaret eklendiginde sirasiyla testin seçiciligi artmistir, Sekiller 1 ve 2, sirasiyla Örnek 1 ve 2°nin çok degiskenli bir analizinin sonuçlarini açiklar ve cinsiyet belirlemesi ile örtüsür.

Embriyo Yasinin Belirlenmesi Embriyolarin gelisim asamasi veya yasinin belirlenmesine yönelik ilgili oldugu bulunan asagidaki gelisim isaretleri analiz edilerek Örnek 1 tekrar edilmistir.

Gelisim Isaret Trimetilglisin (Betain) Aspanat ve Asparajin Glutamat ve Glutamin Prolin Yukaridaki veriler, bir embriyonun gelisim asamasinin bir veya daha fazla gelisim Tablo 2: Günler 9 ila 11 sirasinda ölçülen veri 9 gün (pM/mL) 10 gün Parantez içinde standart isaretinden belirlenebilecegini açik bir sekilde gösterir.

Kismi en küçük kare modellemesini, denetlenmeyen çok degiskenli bir veri analizi, iH NMR olarak tespit edilen metabolitlerine tamamina bagli olarak grup numunelerine lH NMR verilerine yönelik kullanilmistir. Elde edilen en önemli bilgi, iki veri grubu, diger bir ifadeyle ölçülen 'H NMR sinyalleri (metabolitler) ve numune sinifi (grup bilgisi) arasindaki iliskidir. Çok degiskenli model, bir embriyonun cinsiyeti ve/veya yasi ile mevcut olan metabolitlerin ilgili miktarlari arasindaki iliskiyi göstermistir. Örnegin GCMS gibi alternatif analitik yöntemlerin kullanilmasi benzer sonuçlar vermistir, böylece sonuçlar desteklenmistir. 1] gün O.42(0.13) .34 (3. 91) 31.7 (5.33) 9.02 (1.59) Analiz, gelisim asamasina yönelik gelisim isaretlerinin mutlak miktarlarini ayni zamanda ilgili miktarlari vermistir. Sirasiyla ikinci, üçüncü ve dördüncü isaret eklendiginde testin seçiciligi daha fazla artmistir.

Yukaridaki örnekler, mevcut bulusun prosesi ve materyallerinin avantajlarini açik bir sekilde gösterir.

Claims (2)

1. ISTEMLER . Bir yumurtanin içindeki bir kus yumurtasinin cinsiyetinin ve/veya gelisim asamasinin zararli olmayan sekilde belirlenmesine yönelik bir prosestir, asagidaki adimlari içerir (a) Betain, Asparat, Arjinin, Glutamat, Glutamin ve Prolinden seçilen gelisim asamasinin belirlenmesine yönelik en az birinci bir gelisim isaretinin ve/veya yumurtanin inkübasyonunun baslangicindan kuluçkadan çikmaya kadar olan bir zaman periyodunda bir yumurtanin alantoyik sivisinda Glukoz, Kolin ve/veya Valinden seçilen cinsiyetin belirlenmesine yönelik en az birinci bir gelisim isaretinin tespit edilmesi; (b) gelisim asamasi ve/veya cinsiyetin belirlenmesine yönelik en az birinci tespit edilen gelisim isareti bilesiginin miktarinin ölçülmesi; (c) miktarin erkek veya disiye yönelik olusturulan bir temel çizgi ve/Veya embriyonun erkek veya disi oldugunu belirlemek üzere gelisim asamasi ve/veya embriyonun gelisim asamasi ile karsilastirilmasi.
2. 2. Istem l7e göre bir prosestir, burada (c), ölçülen metabolitlerin tek degiskenli veya çok degiskenli bir analizini ve ana bilesenler analizi programini ve/veya kismi en küçük kareler regresyonu analizi programini içeren belirli bir popülasyon ile kus embriyosunun iliskisinin belirlenmesini içerir. . lstem 1 veya 2” ye göre bir prosestir, burada en az bir ikinci isaret, adim (a) içinde tespit edilir ve burada en az birinci ve ikinci isaret analiz edilir ve bir gelisim isareti orani olusturmak üzere temel çizgisi ve birbiri ile karsilastirilir. . Istem 3`e göre bir prosestir, burada kus türü, Gallus gallus domesticus°tur ve burada birinci veya diger gelisim isareti, 30 uM/ml ila 70 uM/ml araliginda bir disi embriyoya yönelik ve 1 uM/m] ila 30 uM/ml araliginda bir erkek embriyosuna yönelik mutlak miktarda Glukozdur. . Istem 4”e göre prosestir, burada birinci veya diger gelisim isareti, 110 uM/ml ila 130 uM/ml araliginda bir disi embriyosuna yönelik ve 90 uM/ml ila bu dahil olmamak üzere `1 `10 uM/mFye kadar bir erkek embriyosuna yönelik mutlak bir miktarda Kolindir. 1. Istemler 4 veya 5 'e göre prosestir, burada birinci ve diger gelisim isareti, 110 uM/ml ila 130 pM/ml araliginda bir disi embriyosuna yönelik ve 90 uM/ml ila bu dahil olmamak üzere 110 uM/m1`ye kadar bir erkek embriyosuna yönelik mutlak bir miktarda Valindir. . Istemler 3 ila 6,ya göre bir prosestir, burada en az birinci ve ikinci gelisim isareti tespit edilir ve analiz edilir ve burada mutlak miktarlar ve en az birincinin ikinci isarete orani, cinsiyeti belirlemek üzere kullanilir. . Istem 7Sye göre bir prosestir, burada analiz, nükleer rezonans yöntemlerini içeren bir manyetik rezonans görüntüleme yöntemi; kizilötesi veya Raman spektroskopisini içeren spektral rezonans yöntemi; ve/veya analitik yöntemler, örnegin uygun detektörler ile baglanan GC veya HPLC, floresans spektroskopisi ve/veya enzime bagli bagisiklik analizi ile gerçeklestirilir. . Önceki istemlerden herhangi birine göre bir prosestir, ayrica asagidaki adimlardan en az birini içerir; (i) bir yumurtanin içindeki embriyonun erkek veya disi oldugunun belirlenmesi ve baskin olarak erkek veya baskin olarak disi yumurta seçimini olusturmak üzere birçok erkek yumurtasinin birçok disi yumurtasindan ayrilmasi; (ii) bir yumurtanin içindeki embriyonun erkek veya disi oldugunun belirlenmesi ve baskin olarak erkek veya baskin olarak disi yumurta seçimini olusturmak üzere birçok erkek yumurtasinin birçok disi yumurtasindan ayrilmasi ve disi veya erkek yumurta seçimlerinin baskin olarak disi veya erkek civciv popülasyonu olusturmak üzere bir inkübasyon ve kuluçka prosesine tabi tutulmasi. 10. Istemler 1 ila 9,dan herhangi birine göre bir prosestir, (iii) embriyonun gelisim asamasinin ve kuluçkadan çikma isleminin meydana gelmesine kadar olan sürenin belirlenmesini ve yumurtalarin benzer veya esit gelisim asamasi olan birçok yumurtaya ayrilmasini içerir. ll. Istem 10,a göre bir prosestir; ayrica baskin olarak ayni gelisim asamasi olan bir civciv popülasyonunu olusturmak üzere beklenen kuluçka tarihi ile hizali olarak yumurta seçimlerinin bir inkübasyona ve kuluçka prosesine tabi tutulmasini içerir. 12. Istem 9 veya lO'a göre prosestir, ayrica (vi) bir virüs veya virüs benzeri bir materyalin canli bir embriyoyu ve erkek veya disileri ve/veya belirli bir gelisim asamasini içerdigi tanimlanan her bir yumurtanin içine enjekte edilmesini ve (vii) inkübe edilmis yumurtalardan elde edilen asinin izole edilmesini içerir. 13. Istem 10'a göre prosestir, burada kus türü, Gallus gallus domesticusatur ve burada gelisim isaretleri, asagidakilerden en az birinden seçilir: Trimetilglisin; Aspartat ve/veya Asparajin; Glutamat ve/veya Glutamin ve/veya Prolin.