ES2710024T3

ES2710024T3 - Biotejido de colágeno y uso del mismo

Info

Publication number: ES2710024T3
Application number: ES13181876T
Authority: ES
Inventors: Robert J Hariri; Aleksandr M Kaplunovsky; Patricia A Murphy
Original assignee: Celularity Inc
Current assignee: Celularity Inc
Priority date: 2002-03-26
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2019-04-22
Anticipated expiration: 2023-03-26
Also published as: KR100999247B1; AU2011201662A1; EP1575572B1; ZA200407650B; KR20050002906A; EP2700309B1; IL164220A0; EP2700309A1; NZ535799A; EP2702871A1; AU2011201662B2; AU2003226018B2; AU2003226018A1; US20030187515A1; DK2702871T3; HK1085384A1; PT2702871T; DK2700309T3; JP5931327B2; CA2479903A1

Abstract

Una composición que comprende un biotejido de colágeno para uso en cirugía, en donde dicho biotejido de colágeno comprende una membrana amniótica humana deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, en donde dicha membrana amniótica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa.

Description

DESCRIPCION

Biotejido de colageno y uso del mismo

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden membranas de colageno producidas a partir de amnios, denominado en la presente memoria biotejido de colageno, para uso en cirugfa. El biotejido de colageno de la invencion tiene la integridad estructural de la membrana amniotica sin tratar nativa, es decir, la estructura terciaria y cuaternaria nativa. En la presente memoria se describe un metodo para preparar un biotejido de colageno a partir de membrana de placenta, preferentemente una membrana de placenta humana que tiene una membrana corionica y amniotica, por descelularizacion de la membrana amniotica. Tal metodo no forma parte de la invencion. Segun la invencion, la membrana amniotica esta completamente descelularizada. La composicion que comprende biotejido de colageno de la invencion tiene numerosos usos en el campo medico y quirurgico incluyendo, por ejemplo, reparacion de vasos sangumeos, construccion y sustitucion de un vaso sangumeo, sustitucion de tendones y ligamentos, vendaje de heridas, injertos quirurgicos, usos oftalmicos, suturas y otros. Los beneficios del biotejido se deben, en parte, a sus propiedades ffsicas tales como resistencia biomecanica, flexibilidad, capacidad de sutura, y baja inmunogenicidad, particularmente cuando se deriva de placenta humana.

Antecedentes de la invencion

Membrana amniotica: anatoirna e histologfa

El saco placentario esta formado por dos capas conectadas estrechamente mediante tejido conjuntivo laxo. Se conocen como las capas amniotica y corionica (vease la fig. 1). La capa amniotica es la mas interna de las dos capas y entra en contacto con el fluido amniotico que rodea al feto y en conjunto forman el saco amniotico. La capa amniotica es avascular y esta revestida con epitelio columnar sencillo que recubre una membrana basal y tiene un espesor de 30-60 micrometres. La membrana corionica es la capa mas externa del saco y esta muy celularizada. El arbol vascular se origina en la placenta y se extiende a las membranas de la placenta a traves de la capa corionica. La capa corionica se separa de la capa amniotica mediante tejido colector flexible y combinadas, las dos capas miden 120-180 micrometros. Las membranas de la placenta tienen una matriz de colageno que esta muy cargada de mucopolisacaridos y se cree que sirven principalmente como un saco protector para el feto en desarrollo. Las membranas tambien mantienen una barrera para agentes infecciosos e inmunologicos presentes en la circulacion materna. Las membranas de la placenta tienen medios de transporte tanto activos como pasivos. La mayona de las moleculas pequenas y protemas pueden viajar libremente a traves de ellos, pero las protemas grandes como IgM no pueden cruzar a traves de la capa basal.

La conservacion de las membranas de la placenta (que son de fuentes animales o humanas) en alcohol etflico al 95% o glicerol mezclados en proporciones de un 50-50% con medios de cultivo tisular se ha usado para la conservacion de la membrana amniotica antes de su congelacion. Estos conservantes eliminan la vitalidad de los tejidos de placenta haciendo los nucleos picnoticos pero la matriz de colageno y las membranas basales se conservan. De forma interesante, ambas formas de conservacion tambien eliminan la antigenicidad de las membranas trasplantadas y tambien cualquier agente potencialmente virulento. La conservacion nuevamente se consigue despues de que las membranas amnioticas se separen cuidadosamente del corion. El lado de la membrana amniotica con la lamina y epitelio basales es brillante y el lado opuesto frente al corion no tiene brillo.

Aplicaciones clmicas previas de las membranas amnioticas

Los posibles problemas potenciales con tejidos xenogenicos (tejidos de otras especies) portadores de enfermedades zoonoticas o que causan rechazo entre especies han provocado que estos tejidos resulten menos deseables. Los injertos alogenicos, o injertos de diferentes individuos de la misma especie, siguen siendo la fuente preferente de materiales para injerto en seres humanos. La escasez de tejidos de donantes humanos para injerto es un problema creciente que ha estimulado el desarrollo de nuevos materiales para injerto de tejido. Muy a menudo estas fuentes de material biologico de partida son escasas, diffciles de obtener, y con un coste muy elevado. Sin embargo, la lamina de colageno de amnios humano tiene caractensticas biomecanicas deseables utiles en aplicaciones de injerto de tejido. Por lo tanto, las membranas amnioticas son una buena fuente de material de injerto alogenico.

La membrana fetal que incluye la membrana amniotica y corionica se ha usado en cirugfas documentadas ya en 1910 y ha sido revisada por Trelford y Trelford-Sauder en 1979 (vease Trelford y Trelford-Sauder, 1979, Am. J. Obstet. Gynecol. 833). En 1910, Davis fue el primero en informar del uso de membranas fetales como un material quirurgico en trasplantes de piel, por ejemplo en pieles quemadas y ulceradas (Davis et al., 1910, Johns Hopkins Med. J.; 15: 307). Estos estudios se realizaron principalmente en animales y los ensayos en seres humanos fueron decepcionantes. Desde entonces se ha expandido el uso de las membranas amnioticas en cirugfa (ver, p.ej., Stern et al., 1913, JAMA, 13: 973-4; Sabella et al., 1913 Med. Records NY, 83: 478-80; de Rotth et al., 1940 Arch. Opthalmol, 23: 522-5; Sorsby et al., 1946, Br. J. Opthamlol. 30: 337-45). En la actualidad se usa como un aposito biologi piel quemada, heridas en la piel, y ulceras cronicas en las piernas, como un tejido adyuvante en la reconstruccion quirurgica de vagina artificial, y para la reparacion de onfaloceles (Vease por ejemplo, Trelford y Trelford-Sauder, 1979, 134 Am. J. Obstet. Gynecol. 833; Colocho et al., 1974 Arch. Surg. 109: 370-3; Faulk et al. 1980, Lancet, 1156; Prasad et al., 1986, J. Trauma, 26: 945-6; Subrahmanyan et al., 1995, J. Plastic Surg. 48: 477-8; Gruss et al., 1978, J. Can. Med. Assoc. 118: 1237-46; Ward et al., 1984, Br. J. Plastic Surg. 37: 191-3; Dhall, 1984, J. Obstet. Gynaecol. 91: 279 82). Tambien se ha usado para prevenir la adherencia de tejido en procedimientos quirurgicos del abdomen, cabeza y pelvis (Gharib etal., 1996, Pediatr. Surg. Int. 11: 96-9; Rennekampff et al., 1994, Invest. Surg. 7: 187-93). En la decada de 1940, varios autores informaron del papel beneficioso de la membrana amniotica en el tratamiento de una diversidad de trastornos de la superficie ocular (vease, por ejemplo, de Rotth et al., 1940 Arch. Opthalmol, 23: 522-5; Sorsby et al., 1946, Br. J. Opthalmol. 30: 337-45; Lavery et al., 1946, Trans. Opthalmol. Soc. UK, 66: 668).

Se han descrito anteriormente numerosos intentos realizados para optimizar la preparacion y conservacion de las membranas amnioticas para uso en trasplante (vease, por ejemplo, Dua et al., 1999, Br. J. Opthalmol. 83: 748-52 ("Dua") para una revision). Diversas preparaciones de membranas amnioticas han incluido conservacion con mezclas de solucion salina y antibiotico, deshidratacion con alcohol con o sin separacion de la capa amniotica de la capa corionica. Sin embargo, todos los metodos que se describen en Dua, y en las referencias que se han descrito anteriormente aun presentan deficiencias que es necesario abordar mediante mejoras en la preparacion y conservacion de las membranas amnioticas.

Mas recientemente, se han descrito metodos que se basan en la congelacion para la conservacion de la membrana amniotica para su aplicacion en procedimientos quirurgicos de injerto de tejido para corregir defectos epiteliales de la cornea. Ver, p.ej., las patentes US n° 6.152.142 y n° 6.326.019B1 ("Tseng"). Tseng describe una membrana amniotica que esta montada sobre un sustrato y se conserva en una mezcla de medio de Eagle modificado por Dulbecco y glicerol y se congela a -80°C. El procedimiento de congelacion del tejido en cualquier tiempo durante su preparacion fragiliza la membrana amniotica de Tseng, y la fragiliza todavfa mas despues de las etapas de descongelacion y activacion. El proceso de congelacion del tejido en cualquier momento durante su preparacion hace que la membrana amniotica de Tseng sea fragil, e incluso mas fragil despues de las etapas de descongelacion y activacion. Ademas, las etapas de descongelacion y activacion anaden tiempo necesario para la manipulacion de la membrana amniotica. Ademas, debido a la fragilidad de la membrana amniotica de Tseng causada por la etapa de congelacion en el proceso de conservacion y preparacion, se requiere un soporte o apoyo estructural para garantizar la integridad estructural de la membrana amniotica de Tseng durante el almacenamiento. Esto presenta la dificultad anadida de separar la membrana amniotica conservada del respaldo, el cual, debido a su fragilidad, puede ser diffcil de manipular y separar intacto. La separacion de la membrana amnios del soporte aumenta de este modo la probabilidad de ruptura de la membrana, y aumenta el periodo de tiempo necesario para activar la membrana amniotica para permitir la impregnacion a fondo de la solucion de activacion en la membrana amniotica congelada antes de realizar el procedimiento quirurgico, lo que conduce al aumento del tiempo de preparacion en la sala de cirugfa. El almacenamiento y el transporte tambien se complican por la necesidad de congelacion a - 80 °C. Por ultimo, las membranas de Tseng por lo general no estan descelularizadas; como resultado, las membranas amnioticas preparadas de este modo por lo general son opacas y no tienen una composicion estructural uniforme.

Mas recientemente, Yui et al., la patente US n° 5.618.312 (la "patente 312") describe la preparacion de laminas de colageno a partir de estrato compacto de la membrana de tejido. Aunque el material descrito es principalmente colageno, es lo suficientemente debil debido a su procesamiento para requerir una etapa separada de reticulacion con el fin de hacer que sea lo suficientemente resistente para uso medico, por ejemplo, que se pueda suturar. En la Patente 312 se describe un metodo para reticulacion que usa el tratamiento a alta temperatura, preferentemente de 100 ° a 110 °C, el cual se cree que afecta de forma adversa a la conformacion nativa del colageno. Yui et al., patente US n° 5.876.451 describe un material de colageno similar obtenidos a partir de placenta. Este material, sin embargo, se trata durante la preparacion con proteasas como parte de una etapa de descelularizacion, lo que probablemente tal como resultado la destruccion y/o interrupcion de la conformacion nativa de los componentes de la matriz; por lo tanto, la matriz de colageno resultante no mantiene su conformacion nativa.

La patente US n° 6.152.142 (Tseng) se refiere a un metodo de preparacion, almacenamiento y uso de un injerto quirurgico de membrana amniotica humana que se ha separado de la membrana corionica y en el que la membrana amniotica se mantiene en estado hidratado en todo momento, incluso durante el almacenamiento. La solucion de almacenamiento comprende un medio de cultivo y un agente hiperosmotico, en el que se mantiene la hidratacion de la membrana amniotica.

Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica de una membrana amniotica mejorada para uso en aplicaciones medicas, de diagnostico, y cosmeticas, que tenga mejores caractensticas estructurales. La presente invencion proporciona composiciones que comprenden dicho biotejido, que comprende colageno que, a diferencia de los biotejidos a base de colageno anteriores, mantiene la estructura ternaria y cuaternaria del colageno nativo. Como resultado, el biotejido de colageno de la presente invencion se prepara facilmente, se usa facilmente, y es lo suficientemente resistente para fines medicos y quirurgicos, y proporciona un sustrato superior para la curacion de heridas.

Compendio de la invencion

La presente invencion proporciona una composicion que comprende un biotejido de colageno para uso en cirugfa, en la que: dicho biotejido de colageno comprende una membrana amniotica humana deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, en la que dicha membrana amniotica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa.

En algunas realizaciones, la composicion se utiliza como injerto quirurgico.

En otras realizaciones, el biotejido de colageno en la composicion comprende elastina y fibronectina. En una realizacion espedfica, la composicion comprende un laminado de membrana amniotica que comprende por lo menos dos capas del biotejido de colageno.

En una realizacion, la composicion se aplica directamente en un sitio quirurgico de un sujeto. En realizaciones espedficas, el sitio quirurgico se selecciona del grupo que consiste en un ojo, piel, una superficie serosa del abdomen, una superficie serosa de la cavidad toracica, un pericardio seroso, una superficie mucosa de la cavidad oral, una superficie mucosa de la cavidad nasal, una superficie del tracto respiratorio, una superficie del tracto gastrointestinal y una superficie del tracto urogenital.

En otras realizaciones, la composicion se aplica en un sitio interior del cuerpo de un sujeto, o en un sitio exterior del cuerpo de un sujeto. En una realizacion particular, la composicion es para uso durante una cirugfa para evitar la fuga de sangre por imeas de sutura o para cubrir sitios de anastomosis durante la cirugfa. En otra realizacion, las composiciones estan destinadas al uso durante una cirugfa intraperitoneal para evitar la adhesion. En todavfa otra realizacion, la composicion esta destinada el uso durante una cirugfa cerebral para prestar apoyo a la reparacion dural. En todavfa otra realizacion, la composicion esta destinada al uso como sustrato para fomentar la regeneracion nerviosa en el sistema nervioso central y periferico. En otra realizacion, la composicion esta destinada al uso en la reconstruccion de tejidos blandos para evitar la adhesion en reparaciones de articulaciones o tendones.

En alguna realizaciones, el biotejido de colageno comprendido en la composicion para uso de la invencion se impregna con una biomolecula, preferentemente un antibiotico, una hormona, un factor de crecimiento, un agente antitumoral, un agente antifungico, un agente antivmco, un antihistammico, un agente antiinflamatorio, un agente antiinfeccioso, plata elemental, una enzima bactericida, un agente de cicatrizacion de heridas, acido hialuronico, un sellante de heridas, un atrayente celular o un reactivo de andamiaje. En una realizacion particular, el antibiotico se selecciona del grupo que comprende clindamicina, minociclina, doxiciclina y gentamicina.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno comprendido en el a composicion para uso de la invencion se llena con celulas, preferentemente celulas madre espedficas de tejido, celulas progenitoras comprometidas, celulas fibroblastoides, condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas parenquimatosas pancreaticas, neuroblastos y celulas progenitoras musculares.

La presente invencion proporciona ademas un injerto quirurgico que comprende un biotejido de colageno, en el que el biotejido de colageno comprende una membrana amniotica humana deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, en la que dicha membrana amniotica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa.

Dentro de los lfmites de la presente invencion, la referencia a un biotejido de colageno, un biotejido y una membrana amniotica de la invencion en la descripcion a continuacion implica el biotejido de colageno y la membrana amniotica comprendida en la composicion para uso en cirugfa o comprendida en el injerto quirurgico de la presente invencion segun se define en las reivindicaciones.

En la presente memoria se describe un metodo de preparacion de un biotejido de colageno a partir de placenta, preferentemente una placenta humana, que resulta en un biotejido de colageno con propiedades ffsicas y bioffsicas mejoradas. Preferentemente el metodo de la preparacion Implica una manipulacion minima de la membrana amniotica. Un metodo de preparacion no forma parte de la invencion. El biotejido de colageno de la invencion, a diferencia de los descritos en la tecnica anterior, debido a la forma en la que se procesan, presentan una estructura terciaria y cuaternaria nativa intactas. La composicion de la presente invencion comprende ademas una membrana amniotica o biotejido derivados de placenta que presentan caractensticas superiores de aumento de la resistencia a la traccion, capacidad de sutura, e inmunogenicidad reducida que da como resultado una reduccion del rechazo de huespedinjerto. La composicion de la presente invencion puede almacenarse en forma de laminas deshidratadas sin congelacion o crioconservacion. Preferentemente, la membrana amniotica derivada de placenta se deriva de una placenta humana para uso en pacientes humanos. Sin embargo, se pueden usar los mismos metodos usando placentas de diversas especies animales para uso veterinario en pacientes animales.

En la presente memoria se describe ademas un metodo para preparar un biotejido de colageno que comprende proporcionar una placenta, preferentemente una placenta humana, separar las capas amniotica y corionica la una de la otra, y descelularizar la membrana amniotica a la vez que se conserva la arquitectura de la matriz extracelular subyacente. El metodo tambien implica el lavado y el secado de la membrana descelularizada. Este metodo proporciona un biotejido deshidratado, descelularizado que puede permanecer estable en condiciones esteriles de almacenamiento a temperatura ambiente y que posteriormente se vuelve a hidratar y se injerta a o se implanta en un sujeto.

La placenta puede proceder de una hembra humana que ha pasado por un parto por cesarea o un parto natural. Se usan ensayos serologicos y bacteriologicos comunes para el experto en la materia para determinar si la placenta es de un donante que esta libre de una enfermedad transmisible. Ademas, la placenta puede someterse a ensayo para definir que esta libre de por lo menos una enfermedad transmisible. La fuente de la placenta puede ser conocida, incluyendo el historial medico, el tipo sangumeo, los datos inmunologicos y las caractensticas de genotipo del donante.

Aunque la placenta puede ser de cualquier mairnfero, el donante es preferentemente una hembra humana. La exsanguinacion de la placenta puede llevarse a cabo mediante metodos comunes conocidos por el experto en la materia antes de separar la membrana amniotica de la membrana corionica.

La descelularizacion de la membrana amniotica comprende eliminar todo el material celular visible y residuos celulares de la membrana amniotica, p.ej., de la cara materna de la membrana amniotica y de la cara fetal de la membrana amniotica. La descelularizacion de la membrana amniotica no debena dar como resultado la alteracion de la Integridad estructural de la membrana amniotica ni alterar la composicion bioqmmica. Por consiguiente, la descelularizacion de la membrana amniotica no supone la congelacion en ningun punto durante la preparacion de la membrana amniotica o en la puesta en contacto de la membrana con una proteasa. Preferentemente, la membrana amniotica se descelulariza usando una solucion que contiene un detergente debil, por ejemplo, una solucion que comprende monohidrato de sal sodica del acido desoxicolico al 0,01-1,0%, un detergente no ionico, Triton X-100, un detergente anionico, o dodecil sulfato sodico o a una combinacion de los mismos.

Una vez la membrana amniotica ha sido descelularizada, la membrana puede lavarse y secarse, preferentemente con calor suave bajo vado.

La invencion proporciona una composicion que comprende biotejido de colageno que comprende una membrana amniotica deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, de manea que la membrana presenta la estructura terciaria y cuaternaria nativas para uso en cirugfa. En otras realizaciones, el biotejido de colageno que comprende una membrana amniotica descelularizada libre de sustrato, que comprende colageno, elastina y fibronectina. En todavfa otras realizaciones, el biotejido de colageno comprende una membrana amniotica deshidratada, descelularizada, uniforme, translucida, y libre de sustrato, con la condicion de que la membrana amniotica nunca haya estado en contacto con una proteasa.

En algunas realizaciones, el biotejido comprende ademas una o mas biomoleculas, por ejemplo, agentes terapeuticos, que incluyen antibioticos, hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifungicos, agentes antivirales, medicamentos para el dolor, antihistammicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiinfecciosos, agentes para curacion de heridas, selladores de heridas, atrayentes celulares y reactivos de andamiajes. En un ejemplo espedfico, el biotejido de colageno puede estar impregnado con uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etc. El biotejido tambien se puede impregnar con una o mas moleculas pequenas, incluyendo moleculas organicas pequenas, tales como inhibidores espedficos de procesos bioqmmicos particulares, por ejemplo, inhibidores de receptores de membrana, inhibidores de quinasas, inhibidores de crecimiento, farmacos anticancer, antibioticos, etc. En algunas realizaciones, el biotejido de colageno se impregna con una biomolecula, durante la produccion o durante la preparacion para cirugfa dependiendo de su uso previsto.

En algunas realizaciones, la invencion comprende un laminado de membrana amniotica que comprende por lo menos dos capas del biotejido de la invencion. En la presente memoria se describen ademas metodos de preparacion del mismo. En otras realizaciones, la invencion comprende conformar los laminados en andamiajes tridimensionales dependiendo del uso pretendido, que incluye, laminas, fibras, esferas y tubos.

En la presente memoria se describe ademas un metodo para preparar un laminado de membrana amniotica que comprende: proporcionar una placenta que comprende una membrana amniotica y una membrana corionica; separar la membrana amniotica respecto de la membrana corionica; y descelularizar la membrana amniotica. El metodo comprende ademas lavar la membrana amniotica descelularizada al menos una vez; formar capas de al menos dos de las membranas amnioticas descelularizadas en contacto entre sf de modo que se forma un laminado de membrana amniotica; y secar el laminado de membrana amniotica descelularizada. Ademas, el metodo para preparar un laminado de membrana amniotica comprende, secar al menos dos membranas amnioticas preparadas de acuerdo con los metodos de la invencion, y formar capas de al menos dos membranas amnioticas en contacto entre sf de modo que se forma un laminado de membrana amniotica.

En algunas realizaciones, las capas de membrana amniotica se ponen en contacto mutuo en presencia de un adhesivo para formar un laminado de membrana amniotica. El adhesivo utilizado segun las composiciones de la invencion puede ser cualquier pegamento biologico conocido por el experto en la materia, preferentemente un pegamento biocompatible, incluyendo pegamento natural, p.ej., fibronectina, fibrina o pegamento sintetico. En otras realizaciones, las capas de membrana amniotica se entrecruzan entre sf para formar un laminado de membrana amniotica. Puede utilizarse cualquier reactivo de entrecruzamiento y metodo conocido por el experto en la materia, incluyendo el entrecruzamiento qmmico, el entrecruzamiento peptfdico, el entrecruzamiento por UV, el entrecruzamiento con radiacion, el entrecruzamiento de fibronectina, el entrecruzamiento de fibrinogeno o el entrecruzamiento de hidrogel. En otras realizaciones, los laminados de membrana amniotica no comprenden un adhesivo.

En algunas realizaciones, la invencion comprende utilizar la composicion que comprende el biotejido de colageno de la invencion como injerto quirurgico. En una realizacion espedfica, la invencion comprende el uso del injerto quirurgico en un procedimiento quirurgico en un sujeto, preferentemente un ser humano, que comprende aplicar el injerto directamente sobre el sitio quirurgico.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno comprende un laminado de membrana amniotica, o un andamiaje tridimensional del mismo que comprende ademas una o mas composiciones de hidrogel. La composicion de hidrogel debe comprender un polfmero que incluye alcohol polivimlico, polietilenglicol, acido hialuronico, y derivados y analogos de los mismos.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion, laminados, andamiajes tridimensionales, o composiciones de hidrogel de los mismos se pueden poblar adicionalmente con celulas, tales como celulas madre, celulas adultas diferenciadas, celulas progenitoras, preferentemente humanas de modo que las celulas sean uniformes y confluyentes.

En la presente memoria se describen ademas metodos de produccion de alto nivel de biotejido de colageno, laminados del mismo, andamiajes tridimensionales del mismo y composiciones de hidrogel del mismo, particularmente, aunque sin limitacion, la produccion a escala comercial. El metodo resuelve las dificultades de la produccion de cantidades a gran escala de membranas amnioticas para uso en ensayos clmicos y la comercializacion.

La invencion comprende composiciones que comprenden un biotejido de colageno de la invencion para uso en cirugfa, tal como para la administracion de farmaco, la ingeniena de tejidos, usos relacionados urologicos, p.ej., la correccion de la incontinencia urinaria; usos oftalmologicos, p.ej., para el tratamiento de un trastorno de la superficie ocular, y como injerto quirurgico oftalmico; usos vasculares, p.ej., la reparacion de vasos sangumeos, la construccion y sustitucion de un vaso sangumeo; usos cardiologicos, p.ej., como dispositivo prostetico en la construccion de valvulas enfermas; usos relacionados con neuronas, p.ej., la reparacion de nervios lesionados, especialmente nervios perifericos seccionados, como sustituto dural, y como protesis en torno a anastomosis nerviosas; usos relacionados con huesos, p.ej., para el tratamiento de defectos ortopedicos, como sustitucion osea, usos dermatologicos, p.ej., para el tratamiento de heridas (externas e internas), heridas agudas y cronicas, heridas congenitas, y quemaduras; para el tratamiento de condiciones de la piel, p.ej., lesiones en la piel, piel envejecida, arrugas, lmeas finas, adelgazamiento, elasticidad reducida de la piel, piel rugosa, y piel danada por el sol, como vendaje para heridas, y para el tratamiento de infecciones de heridas.

En una realizacion espedfica, puede utilizarse un injerto quirurgico que comprende un biotejido de colageno de la invencion en un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad o trastorno relacionada con los ojos, p.ej., una enfermedad de la superficie ocular, en un sujeto, que comprende utilizar el biotejido de colageno de la invencion, por ejemplo aplicando el biotejido como injerto quirurgico sobre la superficie corneal enferma del sujeto. En otra realizacion, el injerto quirurgico de la invencion puede utilizarse en un metodo de tratamiento y/o prevencion de una condicion de la piel en un sujeto, que comprende utilizar un biotejido de la invencion, por ejemplo, poniendo en contacto la piel con el biotejido. En todavfa otra realizacion, el injerto quirurgico de la invencion puede utilizarse en el tratamiento de una herida y/o quemadura en un sujeto, que comprende poner en contacto la herida y/o quemadura con un biotejido de la invencion. En otra realizacion espedfica, el injerto quirurgico de la invencion puede utilizarse en un metodo de correccion de la incontinencia urinaria en un sujeto, preferentemente, un ser humano, que comprende utilizar un biotejido de colageno de la invencion como implante.

En otras realizaciones, la invencion comprende utilizar una composicion de la invencion para administrar un agente terapeutico en un sujeto, que comprende poner en contacto el sujeto con un biotejido de colageno de la invencion. La invencion comprende ademas utilizar una composicion de la invencion para administrar celulas en un sujeto, que comprende poblar un biotejido de colageno o laminado de la invencion con celulas vivas, por ejemplo en la ingeniena de tejidos.

La invencion proporciona un injerto quirurgico que comprende el biotejido de la invencion para uso en un procedimiento quirurgico. El injerto quirurgico se puede aplicar a un sitio interno o externo del sujeto, preferentemente un ser humano.

Breve descripcion de las figuras

Fig. 1. El corion y la membrana amniotica de una placenta humana.

Fig. 2. Fotomicrograffa del biotejido de colageno.

A. ANTES DEL PROCESAMIENTO

B. DESPUES DEL PROCESAMIENTO

Fig. 3. El biotejido de colageno. El biotejido de colageno de la invencion se ejemplifica como presentando una superficie translucida uniforme con un patron en relieve.

Fig. 4. Marco de malla y biotejido seco dentro del mismo.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona una composicion que comprende un biotejido de colageno para uso en: Cirugfa, en la que dicho biotejido de colageno comprende una membrana amniotica humana deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, en la que dicha membrana amniotica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa.

En algunas realizaciones, la composicion se utiliza como injerto quirurgico.

En otras realizaciones, la composicion se aplica en un sitio interior del cuerpo de un sujeto, o en un sitio exterior del cuerpo de un sujeto. En una realizacion particular, la composicion esta destinada al uso durante una cirugfa para evitar la fuga de sangre por lmeas de sutura o para cubrir sitios de anastomosis durante la cirugfa. En otra realizacion, las composiciones estan destinadas al uso durante una cirugfa intraperitoneal para evitar la adhesion. En todavfa otra realizacion, la composicion esta destinada al uso durante una cirugfa cerebral para prestar apoyo a la reparacion dural. En todavfa otra realizacion, la composicion esta destinada al uso como sustrato para fomentar la regeneracion nerviosa en el sistema nervioso central y periferico. En otra realizacion, la composicion esta destinada al uso en la reconstruccion de tejidos blandos para evitar la adhesion en reparaciones de articulaciones o tendones.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno comprendido en la composicion para uso de la invencion se llena con celulas, preferentemente celulas madre espedficas de tejido, celulas progenitoras comprometidas, celulas fibroblastoides, condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas parenquimatosas pancreaticas, neuroblastos y celulas progenitoras musculares.

Generalmente, la presente invencion se refiere a una membrana o biotejido de colageno derivado de la placenta de un mairnfero, preferentemente de un ser humano. El biotejido de colageno se prepara para que mantenga la conformacion nativa del colageno, es decir, la conformacion terciaria y cuaternaria nativa, en el producto final. Ademas del biotejido de colageno, en el presente documento se describen ademas metodos para preparar el biotejido de colageno, y para usar el biotejido en una instalacion medica.

La presente invencion proporciona una composicion que comprende un biotejido de colageno que comprende una membrana amniotica deshidratada, descelularizada y libre de sustrato de modo que la membrana amniotica tenga una estructura terciaria y cuaternaria nativa para uso en cirugfa. En algunas realizaciones de la invencion, el biotejido de colageno descelularizado y libre de sustrato comprende ademas colageno, elastina y fibronectina.

En algunas realizaciones, la composicion para uso en la invencion comprende ademas un laminado de membrana amniotica que comprende un biotejido de colageno de la invencion. El laminado de membrana amniotica comprende por lo menos dos capas del biotejido de colageno que se aplican en contacto mutuo formando el laminado de membrana amniotica. En otras realizaciones, la composicion para uso en la invencion comprende un andamiaje tridimensional, tal como un tubo, que comprende un biotejido de colageno de la invencion. En todavfa otras realizaciones, la composicion para uso en la invencion comprende un biotejido de colageno de la invencion, un laminado del mismo, o un andamiaje tridimensional del mismo que comprende ademas una composicion de hidrogel.

La composicion e injertos quirurgicos de la invencion comprenden de esta manera diversas formas y configuraciones del biotejido de colageno, incluyendo laminados, andamiajes tridimensionales y composiciones de hidrogel. La invencion proporciona cualquiera forma medica quirurgicamente util de las composiciones de injerto quirurgico de la invencion. Independientemente de la forma o configuracion particular, las composiciones de la invencion pueden comprender ademas una o mas biomoleculas, preferentemente un agente terapeutico. Las composiciones de injerto quirurgico de la invencion que comprenden una biomolecula tienen numerosos usos en el campo medico quirurgico, tal como se describe en detalle en la presente memoria. En algunas realizaciones, la invencion comprende llenar las composiciones de la invencion con celulas vivas con el fin de que las celulas sean uniformes y confluyentes. Las composiciones e injertos quirurgicos de la invencion poblados con celulas tienen numerosos usos en el campo medico y dental para fines de ingeniena de tejidos.

En la presente memoria se describen ademas metodos para preparar un biotejido de colageno, un laminado del mismo, un andamiaje tridimensional del mismo, o una composicion de hidrogel. En un ejemplo espedfico, en la presente memoria se describe un metodo para preparar un biotejido de colageno procedente de una placenta, que tiene una membrana amniotica y una membrana corionica, que comprende: separar la membrana amniotica respecto de la membrana corionica; y descelularizar la membrana amniotica con el fin de que la membrana amniotica no este en contacto con una enzima, por ejemplo, una proteasa. En otros ejemplos, el metodo implica adicionalmente lavar y secar la membrana amniotica descelularizada. En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para preparar un laminado de membrana amniotica a partir de una placenta que tiene una membrana amniotica y una membrana corionica, que comprende: separar la membrana amniotica respecto de la membrana corionica, descelularizar la membrana amniotica, y formar capas de al menos dos de las membranas amnioticas descelularizadas en contacto entre sf de modo que se forme un laminado de membrana amniotica. La membrana amniotica descelularizada se seca antes de aplicar en capas. En otro ejemplo, la membrana amniotica descelularizada se seca despues de aplicar en capas, de modo que al menos dos de las membranas amnioticas descelularizadas esten en contacto mutuo.

La invencion proporciona un injerto quirurgico que comprende el biotejido de colageno utilizado en la invencion, laminados del mismo, andamiajes tridimensionales del mismo, o composiciones de hidrogel del mismo que resultan utiles en un contexto medico, dental y quirurgico. De hecho, se espera que las composiciones de la invencion tengan un aumento de la utilidad terapeutica y clmica con respecto a los otros biomateriales conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, los injertos quirurgicos de la invencion resultan utiles en un metodo de tratamiento y/o prevencion de una enfermedad o trastorno relacionado con los ojos en un sujeto utilizando una composicion de la invencion. En una realizacion espedfica, los injertos quirurgicos de la invencion resultan utiles en un metodo de tratamiento y/o prevencion de una enfermedad o trastorno relacionado con los ojos en un sujeto, que comprende aplicar el biotejido de colageno sobre la superficie de un ojo enfermo del sujeto.

En otras realizaciones, los injertos quirurgicos de la invencion resultan utiles en un metodo de tratamiento y/o prevencion de una condicion de la piel en un sujeto, preferentemente un ser humano. En una realizacion espedfica, el metodo comprende poner en contacto la piel del sujeto con la composicion. En otra realizacion espedfica, el injerto quirurgico se aplica directamente sobre la superficie de la piel del sujeto, que es el sitio de la afeccion cutanea.

El injerto quirurgico de la invencion tambien resulta util en un metodo de tratamiento de una herida o una quemadura en un sujeto, preferentemente un ser humano, que comprende poner en contacto el injerto quirurgico en el sitio de la herida o quemadura.

La invencion proporciona utilizar una composicion de la invencion que comprende dicho biotejido de colageno y un laminado de membrana amniotica en un procedimiento quirurgico, tal como cirugfa oftalmica, cirugfa cardiovascular, cirugfa periodontal, cirugfa neurologica, cirugfa dental y cirugfa ortopedica.

La invencion comprende utilizar una composicion de la invencion para administrar una biomolecula, preferentemente un agente terapeutico en un sujeto, preferentemente un ser humano. La invencion comprende ademas utilizar una composicion de la invencion para administrar celulas en un sujeto, preferentemente un ser humano, en el que la composicion se ha llenado adicionalmente con celulas.

Biotejido de colageno

La invencion proporciona una composicion y un injerto quirurgico que comprende una membrana amniotica colagenosa, en la presente memoria denominada biotejido de colageno de la invencion. El biotejido de colageno de la invencion mantiene la integridad estructural de la membrana amniotica no tratada nativa, es decir, conserva la estructura terciaria y cuaternaria de las protemas estructurales en sus composiciones, tales como colageno, elastina y posiblemente fibronectina. De esta manera, el biotejido de colageno de la invencion esta compuesto de las mismas protemas estructurales que las membranas amnioticas nativas o no tratadas. Por lo tanto, el biotejido de colageno que se desvela en el presente documento esta formado por las mismas protemas estructurales que las membranas amnioticas nativas o sin tratar.

Espedficamente, la presente invencion proporciona una composicion y un injerto quirurgico que comprende un biotejido de colageno que comprende una membrana amniotica deshidratada, descelularizada y libre de sustrato (es decir, sin respaldo de filtro), de manera que la membrana amniotica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa (ver la fig. 2A y B). La membrana amniotica deshidratada, descelularizada, y libre de sustrato de la invencion es un biotejido translucido de material uniforme, es decir, con una cantidad minima o nula de celulas, con una apariencia tal como se muestra en la fig. 3, que comprende una lamina helicoidal alfa de triple helice levogira de la matriz descelularizada (Vease, por ejemplo, Molecular Blology of the Cell, 1989, Alberts etal., ed., Garland Publishlng Inc., New York, NY).

El biotejido de colageno de la invencion puede tener su origen en la membrana amniotica de cualquier mamffero, por ejemplo, origen equino, bovino, porcino o catarrino, pero lo mas preferentemente tiene su origen en placenta humana. En una realizacion preferente, el biotejido de la invencion tiene la estructura terciaria y cuaternaria nativa del material de colageno en su composicion.

El biotejido de colageno de la invencion, en contraste con los que se describen en la tecnica anterior, se manipula de forma minima, es dedr, el biotejido de colageno de la invencion se somete como maximo a un tratamiento o manipulacion qmmica o biologica, por ejemplo, descelularizacion en un detergente debil. Tal como se usa en la presente memoria, "manipulado de forma minima" se refiere a una falta de tratamiento enzimatico, por ejemplo, tratamiento con proteasas, tratamiento con calor elevado, tratamiento qmmico agresivo, exposicion a detergentes o acidos fuertes, de la membrana amniotica de la invencion en cualquier etapa durante la preparacion del biotejido de colageno. El tratamiento con proteasas de la membrana amniotica, como parte de la etapa de descelularizacion, compromete la integridad estructural del biotejido, por ejemplo, afecta a la estructura terciaria y/o cuaternaria del material de colageno. La manipulacion minima de la membrana amniotica en la preparacion del biotejido de la invencion, por el contrario, da como resultado un producto con mayor resistencia mecanica y un producto translucido con respecto a los de la tecnica anterior.

El biotejido de colageno descelularizado, libre de sustrato de la invencion comprende colageno (incluyendo, colageno de tipo I, IV y II), asf como fibronectina y elastina. Esta combinacion es responsable en parte de la resistencia mecanica incrementada del biotejido de la invencion, tal como se prepara de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria. Como resultado del procesamiento y manipulacion mmimos, el biotejido de colageno de la invencion mantiene la composicion de la membrana nativa. El colageno es el material estructural principal de los vertebrados y esta presente en tejidos de funcion principalmente mecanica. La molecula de colageno consiste en tres cadenas de polipeptidos denominadas cadenas alfa (cada una de aproximadamente 1000 aminoacidos de longitud) entrelazadas entre sf al igual que en un acuerdo de tres hebras formando una superhelice levogira regular. Se han identificado al menos 19 tipos de colageno y todos ellos poseen la misma organizacion tridimensional (Vease, por ejemplo, Lee et al., 2001, International J. of Pharmaceutics, 221: 1-22).

La membrana amniotica de la presente invencion es superior en forma, biomecanica, y caractensticas estructurales a las informadas en la tecnica anterior y conocidas por los inventores, en parte, en base al descubrimiento de un nuevo metodo de preparacion de la membrana amniotica y una fuente controlada y abundante de placenta humana, tal como se describe en la presente memoria (Vease la Seccion 5.2).

En particular, biotejido de colageno de la presente invencion tiene una o mas de las siguientes caractensticas en comparacion con una o mas de las membranas amnioticas de la tecnica anterior: resistencia a la traccion incrementada, capacidad de sutura superior, inmunogenicidad reducida que da como resultado una reduccion de la respuesta de rechazo del huesped al injerto; facilidad de almacenamiento y transporte sin la necesidad de congelacion ni crioconservacion, requisitos mmimos de preparacion posterior para manipulacion y activacion, es decir, rehidratacion, procedimientos antes de su uso, y la capacidad para su almacenamiento a temperatura ambiente durante penodos de tiempo prolongados a la vez que se mantiene la integridad estructural y funcional. La Tabla 1 resumen las ventajas del biotejido de la invencion en comparacion con las de la tecnica anterior.

Ademas, en la presente memoria se describe un biotejido de colageno que comprende una membrana corionica deshidratada, descelularizada, y libre de sustrato, preferentemente una membrana corionica humana. Se espera que un biotejido de colageno que comprende una membrana corionica presente propiedades comparables a las del biotejido de colageno de la invencion que comprende una membrana amniotica. En la presente memoria se describen todas las formas medicamente utiles del biotejido de colageno que comprende una membrana corionica que incluye, aunque sin limitacion, laminados, andamiajes tridimensionales y composiciones de hidrogel.

TABLA 1. Biotejidos de la invencion frente a preparaciones tradicionales de membrana amniotica

En una realizacion preferente, el biotejido de colageno de la invencion es translucido, es decir, opticamente transparente. En otra realizacion preferente, el biotejido de colageno de la invencion es delgado y ligero. En una realizacion espedfica, el biotejido de colageno deshidratado de la invencion es de 0,3 a 0,6 mg/cm2 En una realizacion espedfica, el biotejido de colageno de la invencion presenta un grosor de al menos 30 micrometros. En otra realizacion espedfica, el biotejido de colageno de la invencion tiene un espesor de aproximadamente 10 a 40 micrometros.

La invencion comprende el uso del biotejido de colageno de la invencion en diversas configuraciones, p.ej., inserciones, escudos. En general, el biotejido se puede configurar en cualquier forma medicamente util. Por ejemplo, el biotejido de colageno se puede configurar para uso en su totalidad, es decir, uso del biotejido de colageno a partir de una placenta entera. Como alternativa, el biotejido de colageno se puede cortar en tiras, parches o rollos, o se puede tejer en hilos. En otra realizacion, el biotejido de colageno, en forma de una lamina o laminado de un solo espesor, se puede recortar a intervalos regulares y expandir para formar, por ejemplo, una malla.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno plano, por ejemplo, tiene una superficie sin pendiente ni curvatura. En otras realizaciones, el biotejido de colageno no es completamente plano y presenta una superficie texturada, p.ej., depresiones u hoyos en la superficie.

En una realizacion preferente espedfica, la invencion comprende un laminado de membrana amniotica que comprende al menos dos capas del biotejido de colageno de la invencion. Las capas se pueden unir ffsicamente entre sf, por ejemplo a traves del uso de un pegamento, fijaciones, o mediante estampado termico de una parte de los biotejidos, por ejemplo, la periferia de al menos una de dichas capas, para fusionar las capas. Dado que el biotejido tiene un "grano", el biotejido se puede laminar en una diversidad de formas. En una realizacion, todas las capas de dicho laminado tienen la misma orientacion del grano. En otra realizacion, al menos una de las capas esta en una orientacion del grano que esta girada aproximadamente 90 grados (es decir, es aproximadamente perpendicular a) a la orientacion del grano de al menos una de las otras capas. En una realizacion mas espedfica, dichas capas perpendiculares son adyacentes entre s f En todavfa otra realizacion, dicho laminado comprende al menos tres capas del biotejido de colageno, en el que las estructuras del grano de cada una de dichas al menos tres capas estan giradas aproximadamente 60 grados con respecto a la estructura del grano de las dos capas restantes. En otra realizacion, dicho laminado contiene al menos un primer material y un segundo material, en el que dicho primer material es el biotejido de colageno de la invencion, y dicho segundo material es cualquier otra sustancia que puede formar un laminado con el biotejido de colageno. En una realizacion espedfica, dicho segundo es una lamina o membrana derivada de una membrana distinta a la membrana amniotica. En otra realizacion espedfica, dicho segundo material es un material no natural, por ejemplo, polilactona, poliacetato o pelfcula de plastico. En algunas realizaciones, el laminado de membrana amniotica es una multicapa, que comprende al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 20, al menos 80, al menos 100, al menos 1.000 membranas amnioticas que se han preparado de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria. El laminado de membrana amniotica de la invencion puede contener un numero de capas ilimitado.

Los laminados tienen una rigidez estructural mayor que permite dar forma al laminado en estructuras tridimensionales complejas. Tales estructuras tridimensionales pueden incluir laminas, tubos, microesferas.

El biotejido de colageno tambien se puede asociar a otro material, en una sola lamina o en forma de un laminado. Por ejemplo, el biotejido se puede asociar con, es decir, unir a, pelfcula de plastico flexible, gasa, laminas de plastico, endoprotesis vasculares, valvulas, dispositivos ortopedicos, vendajes, parches, etc.

El biotejido de colageno puede comprender uno o mas compuestos o sustancias que no forman parte de la matriz de colageno del biotejido. Por ejemplo, el biotejido de colageno se puede impregnar, durante la produccion o durante la preparacion para la cirugfa, con una biomolecula. Tales biomoleculas incluyen pero no se limitan a, antibioticos (tales como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina), hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifungicos, agentes antivirales, medicamentos para el dolor, antihistammicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiinfecciosos que incluyen, pero no se limitan a plata (tales como sales de plata, que incluyen, pero no se limitan a nitrato de plata y sulfadiazina de plata), plata elemental, antibioticos, enzimas bactericidas (tal como lisozoma), agentes de cicatrizacion de heridas (tales como citoquinas que incluyen, pero no se limitan a PDGF, TGF y timosina), acido hialuronico como agente de cicatrizacion de heridas, selladores de heridas (tales como fibrina con o sin trombina), atrayentes celulares y reactivos de andamiajes (tales como fibronectina). En un ejemplo espedfico, el biotejido de colageno se puede impregnar con al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento del epitelio, etc. El biotejido tambien se puede impregnar con moleculas organicas pequenas tales como inhibidores espedficos de procesos bioqmmicos particulares, por ejemplo, inhibidores de receptores de membrana, inhibidores de quinasas, inhibidores del crecimiento, farmacos anticancer, antibioticos, etc.

En todavfa otras realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion se puede combinar con un hidrogel. Cualquier composicion de hidrogel conocida por un experto en la materia esta comprendida dentro de la invencion, por ejemplo, cualquiera de las composiciones de hidrogel descritas en las siguientes revisiones: Graham, 1998, Med. Device Technol. 9 (1): 18-22; Peppas et al., 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46; Nguyen et al., 2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14; Henincl et al., 2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13-36; Skelhorne et al., 2002, Med. Device. Technol.

13(9): 19-23; Schmedlen et al., 2002, Biomaterials 23: 4325-32. En una realizacion espedfica, la composicion de hidrogel se aplica en el biotejido de colageno, es decir, se descarga en la superficie del biotejido de colageno. La composicion de hidrogel, por ejemplo, se puede pulverizar en el biotejido de colageno, suturar en la superficie del biotejido, empapar con el biotejido de colageno, banar con el biotejido de colageno o revestir sobre la superficie del biotejido de colageno.

Los hidrogeles utiles en las composiciones de la invencion se pueden preparar a partir de cualquier polfmero interactivo con el agua o soluble en agua conocido en la tecnica, que incluye, pero no se limita a, alcohol polivimlico (PVA), metacrilato de polihidroxietilo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, acido hialuronico, dextrano o derivados y analogos de los mismos.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion esta impregnado adicionalmente con una o mas biomoleculas antes de su combinacion con un hidrogel. En otras realizaciones, la composicion de hidrogel esta impregnada adicionalmente con una o mas biomoleculas antes de su combinacion con un biotejido de colageno de la invencion. Tales biomoleculas incluyen pero no se limitan a, antibioticos (tales como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina), hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifungicos, agentes antivirales, medicamentos para el dolor, antihistairnnicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiinfecciosos que incluyen, pero no se limitan a plata (tales como sales de plata, que incluyen, pero no se limitan a nitrato de plata y sulfadiazina de plata), plata elemental, antibioticos, enzimas bactericidas (tal como lisozima), agentes de cicatrizacion de heridas (tales como citoquinas que incluyen, pero no se limitan a PDGF, TGF y timosina), acido hialuronico como agente de cicatrizacion de heridas, selladores de heridas (tales como fibrina con o sin trombina), atrayentes celulares y reactivos de andamiajes (tales como fibronectina). En un ejemplo espedfico, el biotejido de colageno o composicion de hidrogel se puede impregnar con al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento del epitelio, etc. Preferentemente, la biomolecula es un agente terapeutico.

En algunas realizaciones, la composicion de hidrogel se combina con un laminado que comprende el biotejido de la invencion.

La composicion de biotejido de hidrogel/colageno presenta utilidad en el campo medico, incluyendo el tratamiento de heridas, quemaduras y afecciones cutaneas (p.ej., para tratar la cicatrizacion), usos cosmeticos (p.ej., cirugfa cosmetica) y cualquier uso como implante. En algunas realizaciones, la composicion de biotejido de hidrogel/colageno se aplica por via topica en un sujeto, es decir, sobre la superficie de la piel, por ejemplo, para el tratamiento de una herida. En otras realizaciones, la composicion de biotejido de hidrogel/colageno se puede usar en el interior de un sujeto, por ejemplo en forma de un implante, para que llegue a ser una estructura permanente o semipermanente en el organismo. En algunas realizaciones, las composiciones de hidrogel se formulan para que no sean biodegradables. En todavfa otras realizaciones, la composicion de hidrogel se formula para que sea biodegradable. En una realizacion espedfica, la composicion de hidrogel se formula para que se degrade en dfas. En otra realizacion espedfica, la composicion de hidrogel se degrada en meses.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion se llena con celulas, de modo que las celulas sean uniformes y confluyentes. Entre las celulas que se pueden usar para llenar un biotejido de la invencion incluyen, aunque sin limitacion, celulas madre, preferentemente celulas madre humanas, celulas adultas diferenciadas humanas, celulas madre totipotentes, celulas madre pluripotentes, celulas madre multipotentes, celulas madre espedficas de tejidos, celulas madre de tipo embrionario, celulas precursoras comprometidas y celulas fibroblastoides. En otras realizaciones, la invencion comprende el biotejido de la invencion lleno con clases espedficas de celulas progenitoras, incluyendo condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas parenquimatosas pancreaticas, neuroblastos y celulas progenitoras musculares. Las celulas para uso no se derivan de embriones humanos.

Procedimiento para producir biotejidos de colageno (que no forma parte de la invencion)

En la presente memoria se describe un metodo para preparar un biotejido de colageno de la invencion. En particular, en el presente documento se desvela un metodo para preparar un biotejido de colageno que comprende: proporcionar una placenta, que comprende una membrana amniotica y una membrana corionica; separar la membrana amniotica de la membrana corionica; y descelularizar la membrana amniotica. En un ejemplo, el metodo implica adicionalmente el lavado y secado de la membrana amniotica descelularizada.

Preferentemente, la placenta es de origen humano para uso en sujetos humanos. En algunos ejemplos, en la presente memoria se describe una placenta de una especie animal para uso en un sujeto humano. En otros ejemplos descritos en la presente memoria, es una placa de una especie animal para uso veterinario en sujetos animales.

En un ejemplo, la placenta para uso en los metodos descritos en la presente memoria se obtiene tan pronto como resulte posible despues del parto del recien nacido. En todavfa otro ejemplo, la placenta se extrae inmediatamente despues del parto por cesarea de un bebe sano normal. La condicion es que la placenta se extraiga bajo condiciones asepticas. En algunos casos, la placenta se almacena durante 48 horas desde el momento del parto antes de cualquier tratamiento adicional. En otros casos, la placenta se almacena durante un maximo de 5 dfas desde el momento del parto antes de cualquier tratamiento adicional.

Preferentemente, la placenta, cordon umbilical, y sangre del cordon umbilical se transportan desde el quirofano o sala de partos a otra ubicacion, por ejemplo, un laboratorio para su procesamiento adicional. La placenta se transporta preferentemente en un dispositivo esteril para transporte tal como una bolsa o un recipiente esteril, que opcionalmente se afsla termicamente. En algunos casos, la placenta se almacena a temperatura ambiente hasta el tratamiento adicional. En otros casos, la placenta se refrigera hasta el tratamiento adicional, es decir, se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a 8°C. En todavfa otras realizaciones, la placenta se almacena bajo condiciones esteriles durante un maximo de 5 dfas antes del tratamiento adicional. En otro ejemplo, la placenta se manipula y se procesa bajo condiciones asepticas, tal como es conocido por el experto en la materia. El laboratorio esta equipado preferentemente equipado con un sistema de filtracion con HEPA (tal como se define mediante la clasificacion de habitacion limpia, que tiene una clase de 1.000 o superior). En un ejemplo, el sistema de filtracion con HEPA se enciende al menos 1 hora antes del uso de la habitacion de laboratorio para llevar a cabo los metodos dados a conocer en la presente memoria.

En determinadas realizaciones, se lleva a cabo la exsanguinacion de la placenta, es decir, se drena completamente de la sangre del cordon umbilical que queda tras el nacimiento. En algunas realizaciones, la exsanguinacion de la placenta se realizo al 70%, al 80%, al 90%, al 95% o al 99%.

El metodo comprende el cribado de la madre gestante antes del momento del nacimiento, usando tecnicas convencionales conocidas por el experto en la materia, para enfermedades transmisibles, entre ellas, aunque sin limitacion, VIH, VHB, VHC, VLHT, sffilis, CMV, y otros patogenos vmcos que es conocido que contaminan el tejido de la placenta. Preferentemente, los metodos usados para identificar sistematicamente una enfermedad de transmision siguen el reglamento tal como lo establece la Federal Drug Administration. La madre gestante se puede cribar (por ejemplo, se extrae una muestra de sangre con fines diagnosticos) al mes del nacimiento, preferentemente a los dos meses del nacimiento, todavfa mas preferentemente a la semana del nacimiento, y lo mas preferentemente, en el momento del nacimiento. Solamente se usan tejidos recogidos de donantes cuyas madres dieron negativo o no reactivo a los patogenos que se han mencionado anteriormente para producir un biotejido de la invencion. Preferentemente, se obtiene una historia minuciosa paterna y medica y social detonante de la membrana de la placenta, que incluye, por ejemplo, una historia familiar detallada.

El donante se criba usando ensayos serologicos y bacteriologicos convencionales usados por el experto en la materia. Cualquier ensayo o prueba diagnostica que identifique el patogeno o patogenos se encuentra comprendido dentro del alcance del metodo descrito en la presente memoria, aunque son ensayos preferentes los que combinan una alta precision con la capacidad de un rendimiento elevado. En un ejemplo, el metodo comprende cribar el donante utilizando tecnicas estandares conocidas por el experto en la materia para antfgenos y/o anticuerpos. Un ejemplo no limitativo de antfgenos y anticuerpos incluye: cribado de anticuerpos (a Ty ); cribado de alanina aminotransferasa (ALT); anticuerpo nuclear de la hepatitis (acido nucleico y ELISA); antfgeno de superficie de la hepatitis B; anticuerpo del virus de la hepatitis C; VIH-1 y VIH-2; VLHT-1 y v Lh T-2; ensayo de sffilis (RPR); ensayo de anticuerpos del CMV; y ensayo de la hepatitis C y VIH. Los ensayos usados pueden ser ensayos basados en acidos nucleicos o ensayos basados en ELISA tal como lo conoce un experto en la materia.

El metodo comprende adicionalmente el ensayo de la sangre del cordon umbilical del recien nacido usando tecnicas convencionales conocidas por el experto en la materia (vease, por ejemplo, Cotorruelo et al., 2002, Clin Lab. 48(5-6):271-81; Maine et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn.,1(1):19-29; Nielsen et al., 1987, J. Clin. Microbiol. 25(8):1406-10). En un ejemplo, la sangre del cordon umbilical del recien nacido se somete a ensayo para patogenos bacterianos (incluyendo bacterias Gram-positivas y Gram-negativas) y hongos usando tecnicas convencionales conocidas para el experto en la materia. El grupo sangumeo y el factor Rh de la sangre del cordon umbilical del recien nacido se determina usando tecnicas convencionales conocidas por el experto en la materia. Ademas, se obtiene CBC con diferenciar a partir de la sangre del cordon umbilical del recien nacido usando metodos convencionales conocidos por el experto en la materia. En todavfa otra realizacion, se realiza un cultivo de bacterias aerobicas a partir de la sangre del cordon umbilical del recien nacido, usando metodos convencionales conocidos por el experto en la tecnica. Solamente se usan tejidos recogidos de donantes que tienen un CBC dentro de un ffmite normal (por ejemplo, ninguna anomaffa ni desviacion gruesa respecto del nivel normal), ensayo negativo para serologfa y bacteriologfa, y ensayo negativo o no reactivo para enfermedad infecciosa y contaminacion para producir un biotejido de la invencion.

Un metodo ejemplar de preparacion de un biotejido de colageno de la invencion comprende las siguientes etapas.

Etapa I. El procesamiento de la membrana placentaria se lleva a cabo de manera que se separa el cordon umbilical del disco placentario (opcionalmente) y se separa la membrana amniotica de la membrana corionica. En un ejemplo preferente, la membrana amniotica se separa de la membrana corionica antes de cortar la membrana de la placenta. La separacion de la membrana amniotica de la membrana corionica se realiza preferentemente comenzando en el borde de la membrana de la placenta. En otro ejemplo, la membrana amniotica se separa de la membrana corionica usando la diseccion roma, por ejemplo, con dedos enguantados. Despues de la separacion de la membrana amniotica respecto de la membrana corionica y del disco placentario, el tronco del cordon umbilical se corta por ejemplo, con tijeras, y se separa del disco placentario. En determinados ejemplos, cuando no resulta posible la separacion de las membranas amniotica y corionica sin romper el tejido, el metodo comprende el corte de las membranas amniotica y corionica a partir del disco placentario como un solo trozo y a continuacion desprenderlas, separandolas.

A continuacion, la membrana amniotica se almacena preferentemente en una solucion salina esteril. En algunos ejemplos, la solucion salina esteril esta tamponada. En un ejemplo preferente, la solucion salina esteril para almacenar la membrana amniotica es una solucion de NaCI al 0,9 % esteril. Preferentemente, la membrana amniotica se almacena por refrigeracion, a una temperatura de al menos 4°C. En determinados casos, la membrana amniotica se refrigera a una temperatura de al menos 2°C, al menos 6°C, o de hasta 8°C. En este punto, la membrana amniotica se puede almacenar hasta 5 dfas, con la condicion de que se refrigere y que se conserve cubiertas con solucion salina esteril. Preferentemente, la membrana amniotica separada se refrigera durante un maximo de 72 horas desde el momento del parto antes de la siguiente etapa del proceso.

Etapa II. Una vez que la membrana amniotica ha sido separada de la membrana corionica, el metodo comprende la descelularizacion de la membrana amniotica. Cualquier procedimiento de descelularizacion conocido por el experto en la materia esta comprendido en los metodos de la descripcion, con la condicion de que el procedimiento para descelularizar la membrana amniotica no incluya ninguna congelacion de la membrana amniotica. Tal como se usa en la presente memoria, descelularizar se refiere a retirar todo el material celular y residuos celulares (por ejemplo, todo el material celular y residuos celulares visibles) respecto de las membranas amnioticas de la invencion. La descelularizacion de la membrana amniotica asegura que se retiran basicamente todas las celulas asociadas normalmente con la matriz de colageno de la membrana amniotica. La descelularizacion de la membrana amniotica de la Invencion que retira "basicamente todas" las celulas asociadas con la matriz de colageno retiran preferentemente al menos un 90% de las celulas, mas preferentemente retira al menos un 95% de las celulas, y lo mas preferentemente, retira al menos un 99% de las celulas. Las membranas amnioticas descelularizadas de acuerdo con los metodos de la descripcion son delgadas de forma uniforme, es decir, de 10-40 micrometros de grosor, lisas (tal como se determina al tacto) y de aspecto transparente.

En un ejemplo, la descelularizacion de la membrana amniotica de la invencion comprende retirar sustancialmente todo el material celular material y residuos celulares del lado materno de la membrana amniotica seguido de retirada de todo el material celular y residuos celulares del lado fetal de la membrana amniotica. En una realizacion espedfica, la descelularizacion de la membrana amniotica de la invencion comprende el raspado ffsico en combinacion con el enjuague con una solucion esteril. En otro ejemplo, el raspado ffsico de la membrana amniotica comprende el raspado con un raspador de celulas esteril. En todavfa otro ejemplo, la solucion esteril para enjuagar la membrana amniotica durante la descelularizacion es una solucion acuosa, una solucion que comprende un tampon fisiologico o una solucion salina tal como por ejemplo una solucion de NaCI al 0,9%.

La descelularizacion de la membrana amniotica comprende la retirada de celulas nativas y otros anffgenos y residuos celulares de la membrana amniotica, y, opcionalmente, el tratamiento para inhibir la generacion de nuevos sitios inmunologicos. Al descelularizar la membrana amniotica, se retiran celulas viables nativas, asf como otras estructuras o componentes celulares y acelulares que pueden provocar una respuesta inmune adversa. La tecnica de descelularizacion usada no debena dar como resultado una alteracion gruesa de la anatoirffa de la membrana amniotica ni alterar las propiedades biomecanicas de su composicion estructural, es dedr, la integridad estructural y bioqmmica del colageno, elastina, y posiblemente fibronectina no resultan afectadas por la descelularizacion. Espedficamente, el tratamiento qmmico agresivo y tratamiento con proteasas de la membrana amniotica no se encuentran comprendidas dentro del alcance de la tecnica de descelularizacion descrita en la presente memoria.

Preferentemente, la descelularizacion de la membrana amniotica comprende el uso de una solucion que contiene detergente. Entre los detergentes que se pueden usar de acuerdo con los metodos de la presente invencion se incluyen, detergentes no ionicos, Triton X-100, detergentes anionicos y dodecil sulfato sodico. Los detergentes pueden utilizarse solos o en combinacion en los metodos descritos en la presente memoria. Cualquier detergente anionico suave, es decir, un detergente no caustico, con un pH de 6 a 8, y baja formacion de espuma, se puede usar de acuerdo con los metodos de la descripcion. En un ejemplo, se usa monohidrato de la sal sodica del acido desoxicolico al 0,01 1% en la descelularizacion de la membrana amniotica. Aunque sin pretender limitarse a ningun modo de accion en particular, la descelularizacion de la membrana amniotica de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria puede alterar las membranas celulares y ayudar en la retirada de los residuos celulares de la membrana amniotica. Sin embargo, se debenan realizar etapas para eliminar cualquier nivel de detergente residual en la membrana amniotica, con el fin de, por ejemplo, evitar interferencias con la repoblacion posterior de la membrana amniotica con celulas viables.

Resulta esencial limitar la actividad de proteasa en la preparacion del biotejido de la invencion. Aditivos tales como agentes quelantes de iones metalicos, por ejemplo 1,10-fenantrolina y acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), crean un entorno desfavorable para muchas enzimas proteolfticas. La provision de condiciones suboptimas para proteasas tales como colagenasa, puede ayudar a la proteccion de las composiciones de membrana amniotica tales como colageno de la degradacion durante la etapa de lisis. Se pueden conseguir condiciones suboptimas para las proteasas mediante la formulacion de la solucion de lisis hipotonica para eliminar o limitar la cantidad de iones de calcio y cinc disponibles en la solucion. Muchas proteasas son activas en presencia de iones de calcio y cinc y pierden una gran parte de su actividad en entornos libres de iones de calcio y cinc. Preferentemente, la solucion de lisis hipotonica se preparara seleccionando condiciones de pH, reduccion de la disponibilidad de iones de calcio y cinc, presencia de agentes quelantes de iones metalicos y el uso de inhibidores proteolftica espedficos para colagenasas de modo que la solucion Usara de forma optima las celulas nativas a la vez que se protege la membrana amniotica subyacente de la degradacion proteolftica adversa. Por ejemplo, una solucion de lisis hipotonica puede incluir una solucion tamponada de agua, pH 5,5 a 8, preferentemente pH 7 a 8, libre de iones de calcio y cinc y que incluye un agente quelante de ion metalico tal como EDTA. Ademas, tambien se pueden usar parametros de control de temperatura y tiempo durante el tratamiento de la membrana amniotica con la solucion de lisis hipotonica para limitar la actividad de las proteasas.

Es preferente que el tratamiento de descelularizacion de la membrana amniotica tambien limite la generacion de nuevos sitios inmunologicos. Debido a que se considera que la degradacion enzimatica del colageno conduce a un aumento de la inmunogenicidad, el metodo comprende el tratamiento de la membrana amniotica con enzimas, por ejemplo, nucleasas, que resultan eficaces para inhibir el metabolismo celular, la produccion de protemas y la division celular, que minimizan la proteolisis de las composiciones de la membrana amniotica conservando de este modo la arquitectura subyacente de la membrana amniotica. Ejemplos de nucleasas que se pueden usar de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria resultan eficaces en la digestion del ADN y ARN celulares nativos, incluyendo tanto exonucleasas como endonucleasas. Un ejemplo no limitante de nucleasas que se pueden usar de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria incluye exonucleasas que inhiben la actividad celular, por ejemplo, ADNasa I (SIGMA Chemical Company, St.Louis, Mo.) y ARNasa A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) y endonucleasas que inhiben la actividad celular, por ejemplo, EcoRI (SIGMA Chemical Company, St.Louis, Mo.) y Hind III (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.). Resulta preferible que las nucleasas seleccionadas se apliquen en una solucion de tampon fisiologico que contiene iones, por ejemplo, magnesio, calcio, que resultan optimas para la actividad de la nucleasa. Preferiblemente, la concentracion ionica de la solucion tamponada, la temperatura de tratamiento y la duracion del tratamiento son seleccionadas por el experto en la materia mediante experimentacion rutinaria para garantizar el nivel deseado de actividad de nucleasa. El tampon es preferentemente hipotonico para estimular el acceso de las nucleasas a Interiores celulares.

En otro ejemplo, la descelularizacion de la membrana amniotica descrita en la presente memoria comprende las etapas siguientes. En primer lugar, la membrana amniotica se transfiere a un recipiente esteril limpio, y opcionalmente se aclara con agua esteril y se seca con gasa esteril. A continuacion, el amnios se coloca en una bandeja esteril con el lado materno colocado hacia arriba. Usando un raspador de celulas esteril (por ejemplo, de 32 cm, cuchilla PE, mango PS, NalgeNunc International), el amnios se descelulariza parcialmente por retirada ffsica de todo el material celular visible desde el lado materno de la membrana amniotica. Se usa agua esteril para ayudar en la retirada de las celulas y de los residuos celulares, si fuera necesario. Despues de finalizar la descelularizacion parcial en el lado materno de la membrana amniotica, se da la vuelta a la membrana amniotica de modo que las caras del lado fetal estan hacia arriba. Todos los restos celulares visibles en el lado fetal se retiran suavemente con un raspado de celulas usando una presion minima en la membrana amniotica para evitar el desgarro. Se puede usar agua esteril para ayudar en la retirada de las celulas y de los residuos.

En un ejemplo, la membrana amniotica descelularizada se introduce en un envase esteril lleno de una solucion fisiologica esteril, por ejemplo, solucion de NaCI al 0,9% esteril, antes de su procesamiento adicional. La siguiente etapa de procesamiento de la membrana amniotica debena iniciarse no despues de 2-3 horas despues de la introduccion de la membrana amniotica en la solucion fisiologica esteril. En un ejemplo espedfico, en el caso en que la etapa III sigue inmediatamente a la etapa II, no resulta necesario introducir la membrana amniotica en un recipiente con solucion esteril.

La membrana amniotica se puede cortar durante el proceso de lavado, usando por ejemplo un bistun esteril, para darle forma para un lavado mas facil o para retirar las zonas que no se pueden limpiar.

Etapa III. Despues de la descelularizacion, la membrana amniotica se lava para asegurar la retirada de residuos celulares que pueden incluir protemas celulares, lfpidos celulares, y acidos nucleicos celulares, asf como cualquier residuo extracelular tal como protemas solubles extracelulares, lfpidos y proteoglicanos. Aunque no se pretende quedar ligado por ningun mecanismo de accion, la retirada de este residuo celular y extracelular reduce la inmunogenicidad de la membrana amniotica.

Una vez que las membranas amnioticas de la invencion han sido descelularizadas, las membranas se lavan adicionalmente con el fin de conseguir de forma eficaz la retirada completa de todo el material celular visible y residuos celulares de ambos lados de la membrana amniotica. La solucion es preferentemente una solucion hipotonica acuosa o de baja fuerza Ionica formulada para lisar de forma eficaz las celulas de tejido nativo. Tal solucion hipotonica acuosa puede ser agua desionizada o un tampon hipotonico acuoso. Preferentemente, el tampon hipotonico acuoso contiene adicionalmente aditivos que proporcionan condiciones suboptimas para la actividad de las proteasas, por ejemplo colagenasa, que se pueden liberar como resultado de la lisis celular.

Preferentemente, la membrana amniotica se agita suavemente en el detergente, por ejemplo, en una plataforma oscilante, para ayudar en la descelularizacion. En determinados ejemplos, la membrana amniotica se agita durante al menos 15 minutos, al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, o hasta 120 minutos. La membrana amniotica, despues de la descelularizacion con detergente, se puede descelularizar ffsicamente de nuevo tal como se ha indicado anteriormente; las etapas de descelularizacion ffsica y con detergente se pueden repetir cuando sea necesario, siempre y cuando se mantenga la Integridad de la membrana amniotica, hasta que no quede material celular ni residuos celulares visibles.

En un ejemplo espedfico, el lavado de la membrana amniotica comprende las siguientes etapas: la membrana amniotica descelularizada se introduce en un recipiente esteril que a continuacion se llena con una solucion de descelularizacion en una cantidad suficiente para cubrir la membrana amniotica; el recipiente con la membrana amniotica y la solucion de descelularizacion a continuacion se colocan en una plataforma oscilante (por ejemplo, modelo 100, VWR Scientific Products Corp., P.O. Box 640169, Pittsburgh, PA 15264-0169). La membrana amniotica en la solucion de descelularizacion a continuacion se agita entre 15 minutos y 120 minutos en la plataforma oscilante. Despues de la etapa de agitacion, la membrana amniotica se retira del recipiente y se introduce en una bandeja esteril limpia llena con una solucion esteril, por ejemplo, solucion de NaCI al 0,9%. Usando un nuevo raspador celular esteril, se retira la solucion de descelularizacion residual y se retira cualquier material celular restante de ambos lados de la membrana amniotica. Esta etapa se puede repetir tantas veces como sea necesario para retirar todo el material celular residual visible de ambos lados de la membrana amniotica.

En determinadas realizaciones, la membrana amniotica se seca Inmediatamente (es decir, en 30 minutos) despues de la etapa de descelularizacion. Alternativamente, cuando el procesamiento adicional no se realiza inmediatamente, la membrana amniotica se puede refrigerar, por ejemplo, almacenarse a una temperatura de 2-8°C, durante un maximo de 28 dfas antes del secado. Cuando la membrana amniotica descelularizada se almacena durante mas de tres dfas pero menos de 28 dfas, la solucion esteril que cubre la membrana amniotica se cambia preferentemente de forma periodica, por ejemplo, cada 1-3 dfas.

En determinados ejemplos, cuando la membrana amniotica no se refrigera despues del lavado, la membrana amniotica se lava al menos 3 veces antes de pasar a la etapa IV de la preparacion. En otros ejemplos, cuando la membrana amniotica se ha refrigerado y la solucion esteril se ha cambiado una vez, la membrana amniotica se lava al menos dos veces antes de pasar a la etapa IV de la preparacion. En todavfa otros ejemplos, cuando la membrana amniotica se ha refrigerado y la solucion esteril se ha cambiado dos veces o mas, la membrana amniotica se lava al menos una vez antes de pasar a la etapa IV de la preparacion.

En algunos ejemplos, la membrana amniotica descelularizada se almacena bajo condiciones esteriles y no se lleva a cabo ningun procesamiento adicional, es decir, ningun secado. Antes de pasar a la etapa IV, resulta esencial que todos los ensayos bacteriologicos y serologicos sean evaluados para garantizar que todos los ensayos eran negativos.

Etapa IV. La etapa final del metodo descrito en la presente memoria comprende secar la membrana amniotica descelularizada de la invencion para producir el biotejido de colageno. Se puede usar cualquier metodo de secado de la membrana amniotica con el fin de producir una lamina de colageno plana, seca. Preferentemente, sin embargo, la membrana amniotica se seca al vado.

Un metodo ejemplar para secar la membrana amniotica descelularizada de la invencion comprende las siguientes etapas:

ensamblaje de la membrana amniotica descelularizada para el secado. La membrana amniotica descelularizada se retira de la solucion esteril, y el exceso de fluido se aprieta suavemente. La membrana amniotica descelularizada se estira suavemente a continuacion hasta que esta plana con el lado fetal con la cara en una posicion hacia abajo, por ejemplo, en una bandeja. A continuacion, se da la vuelta a la membrana amniotica descelularizada de modo que el lado fetal tiene la cara hacia arriba, y se coloca en un marco de secado, preferentemente un marco de secado de malla de plastico (por ejemplo, Qulck Count® Plastic Canvas, Unlek, Inc., Waunakee, Wl). El marco de secado puede ser una malla de acero inoxidable esterilizable en autoclave. Preferiblemente, aproximadamente 0,5 centfmetros de la membrana amniotica solapan los bordes del marco de secado. En determinados casos, la superposicion de la membrana amniotica que se extiende mas alla del marco de secado se envuelve sobre la parte superior del marco, por ejemplo, usando un elemento de sujecion o un hemostato. Una vez que la membrana amniotica se ha posicionado sobre el marco de secado, se aplica una gasa esteril sobre la plataforma de secado de un secador de calor (o secador de gel) (por ejemplo, el modelo 583, Bio-Rad Laboratories, 200 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547), de modo que se cubra una superficie ligeramente superior que la de membrana amniotica que descansa en el marco de secado de malla de plastico. Preferentemente, el espesor total de la capa de gasa no supera el espesor de una pasa de 4 x 4 doblada. Se puede usar cualquier aparato de secado con calor que sea adecuado para el secado del material de tipo lamina. El marco de secado se aplica en la parte superior de la gasa en la plataforma de secado de modo que los bordes del marco de plastico se extienden por encima y mas alla de los bordes de la gasa, preferentemente entre 0,1 1,0 cm, mas preferiblemente 0,5-1,0 cm. En otro ejemplo, el marco de secado con la membrana amniotica se aplica sobre la parte superior de la gasa esteril con la cara fetal de la membrana amniotica encarada hacia arriba. En algunos casos, el marco de malla de plastico se aplica sobre la membrana amniotica. En algunas realizaciones, otra malla de marco de plastico se coloca en la parte superior de la membrana amniotica. 4. En otro ejemplo, una lamina de plastico fino (por ejemplo, SW 182, PVC transparente, AEP Industries Inc., South Hackensack, NJ 07606) o una silicona biocompatible se aplica en la parte superior de la malla cubierta con membrana de modo que la lamina se extiende mas alla de todos los bordes. En este caso, el segundo marco de malla no resulta necesario.

En un ejemplo alternativo, se aplica la membrana amniotica una o mas laminas esteriles de material Tyvek (por ejemplo, una lamina de Tyvek para envasado medico, Dupont Tyvek®, P.O. Box 80705, Wilmington, DE 19880-0705), opcionalmente, con una lamina de Tyvek en la parte superior de la membrana (antes de aplicar la lamina de plastico). Este procedimiento alternativo producira una version mas lisa del biotejido (es decir, sin el patron de regiones de compresion de fibra diferencial a lo largo y perpendicularmente al eje del material), que puede resultar ventajoso para determinadas aplicaciones, tales como, por ejemplo, para uso como una matriz para la expansion de celulas, tal como se describe en la presente memoria.

Secado de la membrana amniotica. En algunos ejemplos, el metodo comprende el secado con calor de la membrana amniotica de la invencion al vado. Aunque el secado al vado se puede conseguir a cualquier temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 60 °C, la membrana amniotica se seca preferentemente entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 50 °C, y lo mas preferentemente a aproximadamente 50 °C. Se debena observar que se espera una cierta degradacion del colageno a temperaturas superiores a 50 °C. La temperatura de secado se ajusta preferentemente y se verifica usando un termometro digital calibrado usando una sonda extendida. Preferentemente, la presion de vado se ajusta a aproximadamente -559 mm (-22 pulgadas) de Hg. La etapa de secado continua hasta que la matriz de colageno de la membrana amniotica contiene menos de un 3-12 % de agua tal como se determina, por ejemplo, con un analizador de humedad. Para llevar a cabo esto, la membrana amniotica se puede secar al vado con calor, por ejemplo, durante aproximadamente 60 minutos para conseguir una membrana amniotica deshidratada. En algunos ejemplos, la membrana amniotica se seca durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente 60 minutos. Aunque no se pretende quedar ligado por ningun mecanismo de accion, se cree que del ajuste de calor bajo acoplado con presion de vado permite que la membrana amniotica consiga el estado deshidratado sin desnaturalizar el colageno.

Despues de la finalizacion del procedimiento de secado, la membrana amniotica se enfna durante aproximadamente dos minutos con la bomba de vado funcionando.

Envasado y almacenamiento de la membrana amniotica. Una vez se ha secado la membrana amniotica, se levanta suavemente la membrana separandola del marco de secado. El "levantado" de la membrana puede comprender las siguientes etapas: aunque la bomba todavfa este funcionando, la pelfcula de plastico se retira suavemente de la membrana amniotica comenzando en la esquina, a la vez que se mantiene la membrana amniotica debajo; el marco con la membrana amniotica se despega de la plataforma de secado y se coloca en una tabla para cortar con la cara de la membrana amniotica mirando hacia arriba; se hace una incision, cortando a lo largo del borde 1-2 mm mas alla del borde del marco; a continuacion la membrana amniotica se retira del marco; y se corta en tamanos apropiados tal como lo determine su uso posterior. Preferentemente, la manipulacion de la membrana amniotica en esta etapa se realiza con guantes esteriles.

La membrana amniotica se introduce en un recipiente esteril, por ejemplo, una bolsa abrefacil, y se cierra hermeticamente. El biotejido producido de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria se puede almacenar a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo prolongado tal como se ha indicado anteriormente.

En la presente memoria se describe un metodo para preparar un biotejido de colageno que comprende una membrana corionica. Se espera que los metodos que se han descrito anteriormente se puedan aplicar en el metodo para preparar un biotejido que comprende una membrana corionica. Ademas, en la presente memoria se describe un metodo para preparar un biotejido de colageno que comprende: proporcionar una placenta, que comprende una membrana amniotica y una membrana corionica; separar la membrana amniotica de la membrana corionica; y descelularizar la membrana amniotica. En un ejemplo espedfico, el metodo comprende ademas lavar y secar la membrana corionica descelularizada.

Metodos para preparar andamiajes y laminados tridimensionales (que no forman parte de la invencion)

En la presente memoria se describen metodos para preparar andamiajes tridimensionales, configuraciones y laminados tridimensionales que comprenden el biotejido de colageno de la invencion.

En la presente memoria se describe un metodo para preparar un laminado de membrana amniotica que comprende: proporcionar una placenta, preferentemente una placenta humana, que comprende una membrana amniotica y una membrana corionica, separar la membrana amniotica de la membrana corionica, usando metodos descritos en la presente memoria; descelularizar la membrana amniotica, usando metodos descritos en la presente memoria; lavar la membrana amniotica descelularizada al menos una vez usando metodos descritos en la presente memoria; formar capas de al menos dos de las membranas amnioticas descelularizadas en contacto entre sf de modo que se forma el laminado de membrana amniotica; y secar el laminado de membrana amniotica, usando metodos descritos en la presente memoria.

Alternativamente, el metodo para preparar un laminado de membrana amniotica comprende secar al menos dos membranas amnioticas preparadas y aplicar en capas las dos o mas membranas amnioticas en contacto mutuo, de manera que se forma un laminado de membranas amnioticas.

Las capas de membrana amniotica producidas de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria se pueden colocar en contacto mutuo en presencia de un adhesivo para formar un laminado de membrana amniotica. El adhesivo usado de acuerdo con los metodos descritos y las composiciones de la invencion puede ser cualquier pegamento biologico conocido por el experto en la materia, preferentemente un adhesivo biocompatible, incluyendo un adhesivo natural, por ejemplo, fibronectina, fibrina o pegamento sintetico. Las capas de membrana amniotica preparadas de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria se entrecruzan entre sf para formar un laminado de membrana amniotica. Cualquier reactivo y metodo de entrecruzamiento conocido por el experto en la materia se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente exposicion, incluyendo el entrecruzamiento qmmico, el entrecruzamiento por radiacion, el entrecruzamiento con fibronectina, el entrecruzamiento con fibrinogeno y el entrecruzamiento con hidrogel. En otros ejemplos, los laminados de membrana amniotica producidos de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria no comprenden un adhesivo.

Almacenamiento y manipulacion del biotejido de colageno (que no forma parte de la invencion)

En la presente memoria se describen medios de almacenamiento del biotejido de colageno como laminas deshidratadas a temperatura ambiente (p.ej., 25°C). En determinados ejemplos, el biotejido de colageno de la invencion se puede almacenar a una temperatura de al menos 10°C, de al menos 15°C, de al menos 20°C, de al menos 25°C, o de al menos 29°C. Preferiblemente, el biotejido de colageno de la invencion no esta refrigerado. El biotejido de colageno de la invencion se puede refrigerar a una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C. Ademas, el biotejido de colageno de la invencion se puede almacenar a cualquiera de las temperaturas anteriormente identificadas durante un periodo de tiempo prolongado. El biotejido de la invencion puede almacenarse bajo condiciones esteriles y no oxidantes. El biotejido producido de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria se puede almacenar a cualquiera de las temperaturas especificadas durante 12 meses o mas sin alteracion de la integridad bioqmmica o estructural (por ejemplo, sin degradacion), sin ninguna alteracion de las propiedades bioqmmicas o bioffsicas del biotejido de colageno. El biotejido producido de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria se puede almacenar durante varios anos sin alteracion de la integridad bioqmmica o estructural (por ejemplo, sin degradacion), sin ninguna alteracion de las propiedades bioqmmicas o bioffsicas del biotejido de colageno. Se espera que el biotejido de la invencion preparado de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria presente una duracion indefinida. El biotejido se puede almacenar en cualquier recipiente adecuado para almacenamiento a largo plazo. Preferentemente, el biotejido de colageno de la invencion se almacena en un envase de bolsa para pelar doble esteril.

En la presente memoria se describen medios de manipulacion del biotejido de colageno de la invencion en su estado seco. El biotejido de colageno puede recortarse antes del uso, por ejemplo antes del uso como injerto quirurgico. La invencion incluye cualquier dimension del biotejido de la invencion que sea compatible para su uso, tal como lo determina un experto en la materia. En algunas realizaciones, la invencion incluye un biotejido de colageno que tiene 1x2 cm; 2x3 cm; 4x4 cm, 5 x 5 o 6 x 8. El biotejido de la invencion se puede cortar en cualquier tamano necesario que este dentro de la limitacion del tamano de la membrana amniotica.

La orientacion de la superficie del biotejido de colageno de la invencion se puede identificar de forma visual. El biotejido de colageno de la invencion tiene un diseno "reticular", que permite la identificacion visual de las superficies materna y fetal por un experto en la materia. En una realizacion espedfica, la orientacion de la superficie del biotejido de colageno se identifica con aumento. El experto en la materia observara que la cara fetal del biotejido de colageno se puede identificar por su diseno reticular concavo, es decir, hundido. A la inversa, la cara materna se puede identificar por su patron reticular convexo, es dedr, elevado.

El biotejido de colageno de la invencion requiere un tiempo de preparacion mmimo antes de su uso. En un ejemplo, el biotejido de colageno de la invencion esta listo para usar en 5 minutos o menos, en 10 minutos o menos, en 15 minutos o menos. El tiempo de preparacion del biotejido de colageno de la invencion antes de su uso, por ejemplo, como un injerto quirurgico, comprende la activacion mediante rehidratacion del biotejido de colageno deshidratado. En algunos ejemplos, el biotejido de colageno de la invencion esta hidratado mientras se encuentre en el sitio quirurgico. En otros ejemplos, el biotejido de colageno de la invencion se hidrata baja condiciones esteriles en una placa. La preparacion comprende la hidratacion del biotejido de colageno de la invencion utilizando un tampon fisiologico esteril. Ademas, la preparacion comprende hidratar el biotejido de colageno de la invencion con una solucion salina esteril, p.ej., solucion de NaCl esteril al 0,9%. En algunos ejemplos, la solucion salina esteril esta tamponada. La hidratacion del biotejido de colageno de la invencion requiere al menos 2 minutos, al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, o al menos 20 minutos. La hidratacion del biotejido de colageno de la invencion se completa en 5 minutos. En todavfa otro ejemplo, la hidratacion del biotejido de colageno de la invencion se completa en 10 minutos. En todavfa otro ejemplo, la hidratacion del biotejido de colageno de la invencion no requiere mas de 10 minutos.

El biotejido de colageno de la invencion, una vez hidratado para su uso, por ejemplo como un injerto quirurgico, presenta una capacidad de sutura incrementada con respecto a las membranas amnioticas de la tecnica, tal como lo determina el experto en la materia. El biotejido de colageno de la invencion no se rompe tan facilmente ni es tan friable como las membranas amnioticas de la tecnica. La invencion comprende biotejidos de colageno que se pueden suturar de forma eficaz.

Esterilizacion

La esterilizacion del biotejido de la invencion se realiza preferentemente por radiacion con haz de electrones usando metodos conocidos por un experto en la tecnica, por ejemplo, Gorham, D. Byrom (ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122. Cualquier dosis de radiacion suficiente para matar por lo menos 99,9% de las bacterias u otros organismos potencialmente contaminantes se encuentra comprendida dentro del alcance de la invencion. Puede utilizarse una dosis de al menos 18-25 kGy para conseguir la esterilizacion final del biotejido de la invencion. La esterilizacion del biotejido de la invencion no incluye, sin embargo, el almacenamiento en antibioticos o glicerol.

Metodos de uso del biotejido de colageno de la invencion

El biotejido de colageno de la invencion presenta numerosos usos en el campo medico y quirurgico debido, en parte, a sus propiedades ffsicas, tales como resistencia biomecanica, flexibilidad, capacidad de sutura, inmunogenicidad baja en comparacion con las membranas tradicionales usadas en la tecnica. Por ejemplo, se espera que el biotejido de colageno de la invencion tenga una mayor utilidad terapeutica para regeneracion guiada de tejidos con respecto a las membranas de la tecnica anterior, por ejemplo, membranas sinteticas de PTFE que no se reabsorben tales como Goretex™; membranas sinteticas resorbibles formadas a partir de copoffmeros de glicolido y lactido; membranas descritas en el documento n° WO-88/08305; patente n° DE-2631909 y patente US n° 5.837.278.

El metodo para preparar el biotejido de colageno de la invencion garantiza la conservacion de la estructura terciaria y cuaternaria del biotejido, haciendo de este modo que el biotejido resulte ideal para su uso pretendido en el campo medico y quirurgico. Tal como se describe con detalle a continuacion, la invencion comprende biotejidos de colageno cuyas propiedades ffsicas permiten que resulte adecuado para usos en una diversidad de aplicaciones medicas y dentales que incluyen la reparacion de vasos sangumeos, la reparacion del utero, sustituciones de tendones, sustituciones de cornea, piel artificial, tratamiento de la enfermedad periodontal, y cicatrizacion de heridas. Dependiendo de su uso pretendido, la invencion comprende el uso del biotejido de colageno como una membrana bidimensional, por ejemplo, membranas que se pueden modelar para que formen vasos tubulares; como un andamiaje tridimensional, por ejemplo, un implante, o como una fibra unidimensional.

Metodos de tratamiento usando el biotejido de colageno de la invencion

Los metodos de tratamiento deben entenderse como biotejidos de colageno para uso en tales metodos.

Metodos para el tratamiento de afecciones cutaneas

La piel humana es un material compuesto de la epidermis y la dermis. La parte superior de la epidermis es el estrato corneo; que es la capa mas dura de la piel, asf como la mas afectada por el entorno que la rodea. Por debajo del estrato corneo se encuentra la parte interna de la epidermis. Por debajo de la epidermis esta la dermis papilar, que esta formada por tejidos conjuntivos relativamente flexibles que definen el microrrelieve de la piel. La dermis reticular, colocada por debajo de la dermis papilar, es un tejido apretado, conjuntivo que se organiza en el espacio. La dermis reticular tambien esta asociada con arrugas gruesas. Por debajo de la dermis se encuentra la capa subcutanea.

Entre las principales funciones de la piel se incluyen proteccion, excrecion, secrecion, absorcion, termorregulacion, pigmentogenesis, acumulacion, percepcion sensorial, y regulacion de procesos inmunologicos. Estas funciones se ven afectadas de forma perjudicial por los cambios en la estructura de la piel debido al envejecimiento y a una exposicion excesiva al sol. Los cambios fisiologicos asociados con el envejecimiento cutaneo incluyen la alteracion de la funcion de barrera y disminucion de la renovacion de celulas epidermicas, por ejemplo, vease, Cerimele, D. et al., 1990, Br.J. Dermatol., 122, supl. 35, paginas 13 a 20. Sin embargo, los metodos y composiciones en la tecnica anterior, presentan un exito limitado en la mejora de las condiciones de la piel, p.ej. De mejora de la elasticidad y suavidad de la piel, o en la eliminacion de arrugas.

El biotejido de colageno. De la invencion presenta aplicaciones medicas, as ^como cosmeticas. El biotejido de colageno de la invencion presenta una utilidad clmica y terapeutica en el tratamiento de condiciones de la piel, incluyendo lesiones cutaneas, envejecimiento de la piel, arrugas, lmeas finas, adelgazamiento, reduccion de la elasticidad de la piel, piel aspera, afecciones cutaneas congenitas y degenerativas, deficiencia de colageno VIl, y piel danada por el sol. En determinadas realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion se puede usar en forma de un implante subcutaneo para afecciones cutaneas tales como cicatrices por acne, surcos glabelares, cicatrices por extirpacion, o cualquier otro defecto del tejido blando conocido de la tecnica. El biotejido de colageno de la invencion presenta utilidad clmica y terapeutica en el tratamiento de cambios asociados con el envejecimiento cutaneo. En determinadas realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion presenta utilidad en la mejora de las arrugas de la piel, y/u otras condiciones tales como la elasticidad y suavidad de la piel. El biotejido de colageno de la invencion se puede usar como un implante, como un laminado, o como una forma enrollada tridimensional para el tratamiento de afecciones cutaneas. El biotejido de colageno se espera que presenta una utilidad clmica incrementada respecto a metodos conocidos de la tecnica para el tratamiento de tales afecciones cutaneas, p.ej., las patentes US n° 5.972.999, n° 5.418.875, n° 5.332.579 y n° 5.198.465, en parte debido a su estabilidad puede proporcionar un efecto duradero mas prolongado.

En una realizacion preferente, el biotejido de colageno de la invencion esta complementado adicionalmente con uno o mas agentes conocidos de la tecnica para el tratamiento de una afeccion cutanea. Entre los ejemplos de tales agentes se incluyen vitaminas, minerales, preparaciones basadas en catequina, N-acetilglucosamina y glucosamina (ver, p.ej., Neldner, 1993, Amer. Acad. Derm. Annl. Mtg. Wash. DC.; Lubell 1996, Cosmetic Dermatol, 9(7): 58-60; Swaine et al., 1995, J. Am. Board of Family Practice, 8(3): 206-16; Shan et al., 1994, Kidney International, 46(2): 388-95).

El biotejido de colageno de la invencion se puede impregnar con cualquier biomolecula con utilidad en el tratamiento de una afeccion cutanea, incluyendo antibioticos (tales como clindamicina, minociclina, doxiciclina y gentamicina), hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifungicos, agentes antivmcos, medicamentos para el dolor, antihistammicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiinfecciosos que incluyen, pero no se limitan a plata (tal como sales de plata, que incluyen, pero no se limitan a nitrato de plata y sulfadiazina de plata), plata elemental, antibioticos, enzimas bactericidas (tales como lisozoma), agentes para curacion de heridas (tales como citoquinas, incluyendo PDGF, TGF y timosina), acido hialuronico como un agente para la cicatrizacion de heridas, selladores de heridas (tales como fibrina con o sin trombina), atrayentes celulares y reactivos de andamiaje (tales como fibronectina). En un ejemplo espedfico, el biotejido de colageno se puede impregnar con al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etc. El biotejido tambien se puede impregnar con moleculas pequenas, tales como moleculas organicas pequenas, tales como inhibidores espedficos de procesos bioqmmicos particulares, por ejemplo, inhibidores de receptores de membrana, inhibidores de quinasas, inhibidores del crecimiento, farmacos anticancer, antibioticos, etc.

Heridas y quemaduras

El biotejido de colageno de la invencion se espera que presente una utilidad clmica incrementada como aposito para heridas, para potenciar la reparacion de tejidos duros y/o blandos, en comparacion con otros biomateriales conocidos en la tecnica, p.ej. los descritos en las patentes US n° 3.157.524, n° 4.320.201, n° 3.800.792, n° 4.837.285 y n° 5.116.620, debido en parte a sus propiedades ffsicas. Dado que el biotejido de colageno de la invencion mantiene la estructura cuaternaria nativa del colageno, proporciona un aumento del crecimiento interior del tejido a traves de la migracion celular a los intersticios de la matriz de colageno. El biotejido de la invencion permite que las celulas se adhieran y crezcan en la matriz de colageno, y que sinteticen sus propias macromoleculas. De esta manera, las celulas producen una nueva matriz que permite el crecimiento del nuevo tejido. Tal desarrollo celular no se observa en otras formas conocidas de colageno tales como fibras, lanas y colageno soluble.

En algunas realizaciones, se proporciona un biotejido de colageno de la invencion para el tratamiento de heridas mediante la aplicacion del biotejido de colageno directamente sobre la piel del sujeto, es decir, sobre el estrato corneo, en el sitio de la herida, de manera que se cubre la herida, por ejemplo utilizando una cinta adhesiva. En otras realizaciones, se proporciona un biotejido de colageno de la invencion para tratar una herida utilizando el biotejido de colageno de la invencion como implante, p.ej. como implante subcutaneo.

La invencion comprende potenciar la tasa de cicatrizacion de heridas mediante la adicion de una macromolecula capaz de estimular el crecimiento hacia el interior del tejido en el biotejido de colageno de la invencion. Entre tales macromoleculas se incluyen acido hialuronico, fibronectina, laminina y proteoglicanos (ver, p.ej., Doillon et al., (1987) Biomaterials 8:195-200; y Doillon y Silver (1986) Biomaterials 7:3-8).

La invencion comprende ademas la incorporacion de agentes farmacologicamente activos que incluyen un factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento de tipo insulmico, factor de crecimiento epidermico, factor beta de crecimiento de transformacion, factor de angiogenesis, antibioticos, agentes antifungicos, agentes espermicidas, hormonas, enzimas, inhibidores enzimaticos en el biotejido de colageno de la invencion tal como se describe en la presente memoria en la seccion 5.4.2.7 para su administracion en la piel, y cualquier biomolecula descrita anteriormente. Preferentemente, los agentes farmacologicamente activos se proporcionan en una cantidad fisiologicamente eficaz.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno se llena adicionalmente con celulas vivas, incluyendo celulas madre alogenicas, celulas madre y celulas adultas autologas, antes de su aplicacion en el sitio de la herida.

El biotejido de colageno de la invencion resulta particularmente util para el tratamiento de infecciones de heridas, por ejemplo, infecciones de heridas despues de una degradacion de heridas quirurgicas o traumaticas. En una realizacion particular, el biotejido de colageno se impregna con una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente util en el tratamiento de una infeccion de heridas, que incluye un antibiotico, un agente antimicrobiano, y un agente antibacteriano. El biotejido de colageno, la invencion presenta utilidad clmica y terapeutica en el tratamiento de infecciones de heridas por cualquier microorganismo conocido en la tecnica, por ejemplo, microorganismos que infectan heridas que se originan dentro del cuerpo humano, que es un deposito conocido para los organismos patogenos, o de origen ambiental. Un ejemplo no limitativo de los microorganismos, cuyo crecimiento en heridas se puede reducir o evitar con los metodos y composiciones de la invencion, son especies de S. aureus, St. epidermis, E. coli, Klebsiella y Pseudomonas, y entre las bacterias anaerobias, Clostridium welchii o tartium, que son la causa de gangrena gaseosa, principalmente en heridas traumaticas profundas.

En otras realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion se usa para el tratamiento de heridas, incluyendo heridas epidermicas, heridas cutaneas, heridas cronicas, heridas agudas, heridas externas, heridas internas (por ejemplo, el biotejido de colageno se pueden volver alrededor de un sitio de anastosmosis durante la cirugfa para evitar la fuga de sangre por las lmeas de sutura, y para evitar que el organismo forme adherencias en el material de sutura), heridas congenitas (por ejemplo, epidermolisis bullosa distrofica). En particular, el biotejido de colageno presenta una utilidad incrementada en el tratamiento de ulceras de presion (por ejemplo, ulceras de decubito). Las ulceras de presion se producen frecuentemente en pacientes sujetos a un periodo prolongado de postracion, por ejemplo, tetraplejicos y paraplejicos que padecen perdida de la piel debido a los efectos de la presion localizada. Las ulceras de presion resultantes presentan erosion dermica y perdida de la epidermis y apendices cutaneos.

El biotejido de colageno de la invencion se puede usar ademas en el tratamiento de quemaduras, incluyendo quemaduras de primer grado, quemaduras de segundo grado (quemaduras de grosor parcial), quemaduras de tercer grado (quemaduras de grosor total), infeccion de heridas por quemaduras, infeccion de heridas por quemaduras extirpadas y sin extirpar, infeccion de heridas de injertos, infeccion del sitio donante, perdida del epitelio de una herida por quemadura previamente injertada o curada o sitio donante de injerto de piel, e impetigo por herida de quemadura.

Ingeniena de tejidos

La invencion comprende el uso del biotejido de colageno de la invencion como vetuculo para el transporte de celulas de piel en cultivo, p.ej. como soporte para el crecimiento y diferenciacion epitelial. En determinadas realizaciones, para llenar el biotejido con celulas para formar tejidos y/o organoides (es decir, que se asemejan en la apariencia superficial o en la estructura a cualquiera de los organos o glandulas del cuerpo), el biotejido se puede tratar con factores de adhesion celular para aumentar la union de celulas al biotejido durante el proceso de repoblacion del biotejido con tales nuevas celulas. En determinadas realizaciones, el grado de union de las celulas aumenta mediante el tratamiento de la membrana amniotica con suero, por ejemplo, suero humano o bovino fetal. En otras realizaciones, el alcance de la union de las celulas aumenta mediante el tratamiento de la membrana amniotica con fibronectina.

El biotejido de colageno de la invencion se puede usar en tecnicas de regeneracion guiada de tejidos, por ejemplo, para regenerar o sustituir tejido enfermo o danado. La invencion comprende el uso del biotejido de la invencion mediante el implante de forma directa del biotejido en el sitio del tratamiento o mediante la formacion de un dispositivo protesico. El biotejido de colageno de la invencion es particularmente util en cualquier situacion, tal como despues de cirugfa especialmente cirugfa oral o dental (tal como se describe con mas detalle en la Seccion 5.4.2.2), en la que se desea el aumento de la curacion de heridas y/o sustitucion de la dermis. La utilidad del biotejido de colageno de la invencion en la regeneracion guiada de tejidos se debe en parte a su capacidad de proporcionar condiciones que evitan el crecimiento hacia adentro de otros tejidos en la zona en la que se necesita la regeneracion.

Por ejemplo, cuando se retira una parte sustancial de una rafz dental debido a caries o enfermedad, resulta deseable que se produzca regeneracion de hueso sano para sustituir el tejido de hueso eliminado. Sin embargo, se ha encontrado que el hueco que deja la retirada de hueso se rellena rapidamente con tejido conjuntivo y que este crecimiento hacia el interior del tejido conjuntivo evita de forma eficaz la regeneracion osea. Para evitar dicho crecimiento hacia el interior, el biotejido de colageno de la invencion se puede insertar quirurgicamente alrededor de la periferia del hueco de la herida. El biotejido impide o dificulta la invasion de hueco de la herida por tipos de celulas no deseadas y de este modo permite que las celulas preferentes crezcan en el cuerpo, curando de ese modo de la herida.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno tiene utilidad como un trasplante para la reconstruccion de la superficie ocular por ejemplo en un sujeto con smdrome de Stevens Johnson, deficiencia de celulas madre lfmbicas secundaria a una quemadura qmmica Ifmbica, o con quemaduras qmmicas y/o termicas. Se espera que el biotejido de la invencion presente una utilidad clmica incrementada, por ejemplo en la estimulacion de la epitelizacion. Se espera que el biotejido de la invencion presente una utilidad clmica incrementada con respecto a las membranas amnioticas usadas en la tecnica con fines de ingeniena de tejidos; vease, por ejemplo, Gomes et al., 2003, Opthalmology, 119: 166-73; Ti et al., 2001, Opthalmology, 108: 1209-1217; Meller et al., 2000, Opthalmology, 107: 980-9; Gris et al., 2002 Opthalmology, 109: 508-12; Koizumi et al., 2000, Invest. Opthal. and Visual Science, 41: 2506-13; Pires et al., 1999, Arch. Opthalmol. 117: 1291-7; Tseng et al., 1998, Arch. Opthalmol. 116:431:441; Heiligenhaus et al., 2001 Invest. Opthal. and Visual Science 42: 1969-74; Anderson et al., 2001, Br. J. Opthalmol. 85: 567-75.

La invencion comprende llenar el biotejido de colageno con celulas vivas, incluyendo celulas de tejido adulto, celulas autologas y celulas madre. Las celulas madre para uso en los metodos de la invencion pueden ser celulas pluripotentes, o celulas diferenciadas espedficas de tejido. Las celulas madre para uso en los metodos de la invencion pueden obtenerse mediante metodos estandares conocidos por el experto en la materia, aunque no se proporcionan a partir de embriones humanos. Preferiblemente, las celulas madre se recogen de acuerdo con el metodo descrito en la solicitud de patente US n° 10/74.976, presentada el 13 de febrero de 2002.

La invencion comprende el uso del biotejido de colageno de la invencion (p.ej., en forma de andamiajes tridimensionales) para el desarrollo de tejido y organoides bioingenieriles, incluyendo vasos sangumeos, valvulas cardiacas, tugado, pancreas y ligamentos. Aunque sin pretender limitarse a ningun mecanismo de accion particular, la utilidad del biotejido de la invencion como tejido de bioingeniena se debe en parte a su propiedad hemostatica de estimulacion de la coagulacion sangumea. El biotejido de la invencion resulta particularmente util para protesis vasculares y como un trasplante en cirugfa vascular. El biotejido de la invencion se puede usar, por ejemplo, como una circunferencia que cubre los sitios de anastomosis de los vasos sangumeos (o vasos que se dirigen a injertos) durante los procedimientos de cirugfa vascular para evitar fugas de sangre de las lmeas de sutura y evitar que el cuerpo forme adherencias en el material de sutura.

Metodos de uso de los biotejidos de colageno en procedimientos quirurgicos

La invencion comprende el uso del biotejido de colageno de la invencion como injerto quirurgico. La invencion comprende un injerto quirurgico que comprende un biotejido de colageno de la invencion o un laminado del mismo. En la presente memoria se describen ademas metodos para preparar el injerto quirurgico.

En algunas realizaciones, se proporciona un injerto quirurgico que comprende el biotejido de colageno de la invencion en un procedimiento quirurgico, de manera que se aplica directamente el injerto quirurgico en el sitio quirurgico del sujeto, p.ej. un sitio interno o un sitio externo. En algunas realizaciones, el biotejido de colageno se usa como injerto quirurgico durante un procedimiento quirurgico tal como se describe en mayor detalle posteriormente, por ejemplo para prevenir fugas de sangre de las lmeas de sutura y para evitar que el cuerpo forme adherencias a los materiales de sutura. En otras realizaciones, el injerto quirurgico se usa como una cubierta de los sitios de anastomosis, por ejemplo, del tracto Gl durante la cirugfa Gl para evitar fugas de lfquidos intestinales y biliares por las lmeas de sutura y para evitar que el cuerpo forme adherencias a los materiales de sutura.

La invencion comprende el uso del biotejido como un injerto o aposito para cubrir heridas cutaneas de quemadura o quirurgicas; para evitar la adherencia en todas las cirugfas intraperitoneales u otra reconstruccion de las superficies serosas que cubren el abdomen, la cavidad toracica y el pericardio; para reconstruir todas las superficies de mucosa que revisten las cavidades oral y nasal, los tractos respiratorios, los tractos gastrointestinales y los tractos urogenitales; como un sustrato para apoyar la reparacion dural en cirugfas cerebrales; como un sustrato para estimular la regeneracion de los nervios en los sistemas nerviosos central y periferico; y para reconstruir los tejidos blandos para evitar la adherencia en reparaciones de articulaciones o tendones.

La invencion comprende impregnar el injerto quirurgico de la invencion con una o mas biomoleculas, preferiblemente un agente terapeutico, dependiendo del uso quirurgico particular pretendido. Tales biomoleculas incluyen pero no se limitan a, antibioticos (tales como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina), hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifungicos, agentes antivirales, medicamentos para el dolor, antihistammicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiinfecciosos que incluyen, pero no se limitan a plata (tales como sales de plata, que incluyen, pero no se limitan a nitrato de plata y sulfadiazina de plata), plata elemental, antibioticos, enzimas bactericidas (tal como lisozima), agentes de cicatrizacion de heridas (tales como citoquinas que incluyen, pero no se limitan a PDGF, TGF y timosina), acido hialuronico como agente de cicatrizacion de heridas, selladores de heridas (tales como fibrina con o sin trombina), atrayentes celulares y reactivos de andamiajes (tales como fibronectina). En un ejemplo espedfico, el biotejido de colageno se puede impregnar con al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etc. El biotejido tambien se puede impregnar con moleculas organicas pequenas tales como inhibidores espedficos de procesos bioqmmicos particulares, por ejemplo, inhibidores de receptores de membrana, inhibidores de quinasas, inhibidores del crecimiento, farmacos anticancer, antibioticos, etc.

La invencion comprende ademas llenar el injerto quirurgico de la invencion con celulas vivas, incluyendo celulas madre, celulas madre pluripotentes, celulas madre multipotentes, celulas madre espedficas de tejido, celulas madre de tipo embrionario, celulas progenitoras comprometidas y celulas fibroblastoides. En otras realizaciones, la invencion comprende llenar el injerto quirurgico de la invencion con clases espedficas de celulas precursoras, incluyendo condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas parenquimatosas pancreaticas, neuroblastos y celulas progenitoras musculares.

Oftalmolog^a

El biotejido de colageno de la invencion tiene utilidad cKnica y terapeutica en el tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular. El biotejido de colageno de la invencion resulta particularmente util para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades de la superficie ocular, incluyendo ulceras/perforaciones de cornea, queratopatia bullosa, dermoides/tumores oculares, pterigion primario, defecto epitelial de la cornea persistente, quemaduras alcalinas agudas y cronicas, quemaduras termicas, aniridia, queratitis atopica, deficiencia de celulas madre lfmbicas idiopaticas, pannus corneal, neovascularizacion, fusion corneal reumatoide, penfigoide cicatricial ocular, ampolla de filtracion con fugas, tubo de la valvula de Ahmed expuesto, celulitis por Serratia en el simblefaron posterior y smdrome de Stevenson Johnson agudo y cronico. El biotejido de colageno de la invencion resulta particularmente eficaz en la estimulacion de la cicatrizacion de defectos persistentes del epitelio corneal con ulceracion; en la estimulacion de la epitelizacion; en la facilitacion del crecimiento de celulas epiteliales y celulas madre; en la reduccion de la inflamacion y el dolor, en la inhibicion de la angiogenesis y la formacion de cicatrices; en la restauracion del fenotipo epitelial; y como un sustrato alternativo al autoinjerto de conjuntiva durante la retirada de la "esclerotica desnuda" del pterigion.

La composicion y el injerto quirurgico de la invencion pueden utilizarse en el trasplante utilizando el biotejido de colageno de la invencion para el tratamiento de la queratopatia bullosa sintomatica, preferiblemente en seres humanos, lo mas preferiblemente en seres humanos con un potencial visual reducido. El biotejido de la invencion se espera que presente una utilidad terapeutica y clmica incrementada con respecto a otros tratamientos convencionales usados en la tecnica para el tratamiento de la queratopatfa bullosa sintomatica, espedficamente, la construccion de colgajo conjuntival. La ventaja del trasplante usando el biotejido de la invencion con respecto a procedimientos convencionales usados en la tecnica para el tratamiento de la queratopatfa bullosa sintomatica, espedficamente, en la construccion de colgajo conjuntival, incluyen, por ejemplo, la reduccion del dolor, la facilidad de uso, un aspecto cosmeticamente mas aceptable, y una reduccion de las complicaciones tales como la ptosis y la deficiencia de celulas madre lfmbicas. El biotejido de colageno de la invencion proporciona una alternativa mejor a los colgajos conjuntivales para la estimulacion de la cicatrizacion de defectos del epitelio corneal con ulceracion; un metodo mejorado para la reconstruccion de la superficie conjuntival para lisis del simblefaron; un metodo mejorado para la extirpacion quirurgica de tumores, lesiones, o tejido cicatricial de la superficie conjuntival o corneal; un metodo mejorado para cirugfas de glaucoma mediante la correccion de fugas de ampolla; un sustrato alternativo mejorado para el autoinjerto conjuntival durante la retirada de la "esclerotica desnuda" del pterigion; y un metodo mejorado para prevenir la reaparicion de la queratopatfa de banda.

La invencion proporciona ademas el uso del biotejido como injerto quirurgico oftalmologico. En la presente memoria se describe la preparacion de injertos que comprenden el biotejido de la invencion, que comprende ademas uno o mas agentes terapeuticos que se pueden administrar en el receptor cuando se encuentran unidos al receptor. Entre los ejemplos de agentes terapeuticos que se pueden administrar usando el biotejido de la invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, pilocarpina, eritromicina, gentamicina, vancomicina, tobramicina, netilmicina, sulfato de polimixina B, trimetoprim, amfotericina B, agentes anticancer, antibioticos, ciclosporina, etc.

El biotejido de colageno de la invencion tambien resulta de utilidad para reducir la turbidez corneal inducida por queratectomfa fotorrefractiva/terapeutica con laser excimer.

El biotejido de colageno de la invencion para uso en procedimientos oftalmicos se puede proporcionar en diversas configuraciones, incluyendo insertos, placas, partfculas, geles, inyecciones acuosas, esponjas y pelfculas.

Las tecnicas de cirugfa convencionales para injertos oftalmicos son conocidas por el experto en la materia.

Un protocolo a modo de ejemplo para uso de un biotejido de colageno de la invencion en forma de un injerto quirurgico oftalmico puede comprender las siguientes etapas: se extirpan los tejidos de cornea y/o conjuntiva danados; se proporciona el injerto quirurgico, preparado de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, bajo condiciones esteriles, y se recorta con una tecnica a mano alzada para cubrir el epitelio de la cornea o la esclerotica desnuda. Usando una sutura, el Injerto se ancla a la union de la esclerotica desnuda y la conjuntiva; se colocan suturas cardinales; y las suturas interrumpidas se usan para crear una distribucion uniforme de la tension en la superficie del injerto; de manera que se evita cualquier espacio entre el Injerto y la esclerotica o cornea del receptor. En la union del injerto y el huesped, el borde libre del injerto debe permanecer bajo la membrana conjuntival del receptor para permitir el deslizamiento del epitelio del huesped a traves de la lamina basal en el punto de union con el tejido de un donante, de lo contrario el destinatario extruira el injerto.

Odontologfa

El biotejido de colageno de la invencion tiene utilidad particular en odontologfa, por ejemplo, cirugfa periodontal, regeneracion guiada de tejidos para regeneracion del tejido periodontal, regeneracion guiada osea, y cubrimiento de la rafz. La invencion comprende el uso del biotejido de colageno de la invencion para estimular la regeneracion de defectos intraoseos periodontales, incluyendo defectos periodontales bilaterales emparejados, defectos intraoseos interdentales, defectos intraoseos de 3 paredes profundos, defectos intraoseos de 2 paredes, y defectos intraoseos 2 y 3. Se espera que el biotejido de colageno de la invencion presente una utilidad terapeutica incrementada y parametros clmicos mejorados en el tratamiento de defectos intraoseos periodontales con respecto a otras tecnicas conocidas en la tecnica, por ejemplo, uso de membranas de colageno entrecruzadas, tales como las descritas en Quteish et al., 1992, J. Clin. Periodontol. 19(7): 476-84; Chung et al., 1990, J. Periodontol. 61(12): 732-6; Mattson et al., 1995, J. Periodontol. 66(7): 635-45; Benque et al., 1997, J. Clin. Periodontol. 24(8): 544-9; Mattson et al., 1999, J. Periodontol. 70(5): 510-7). Entre los ejemplos de parametros clmicos que mejoran usando el biotejido de colageno de la invencion se incluyen indices de placa y gingival, sondaje de la profundidad de la bolsa, sondaje del nivel de union, y clasificacion de la afectacion furcal y defecto oseo, que son conocidos por el experto en la materia.

La invencion comprende ademas el uso del biotejido de la invencion en el tratamiento de defectos de furcacion de clase II, incluyendo defectos bilaterales, defectos de furcacion en molares mandibulares de clase II bucales emparejados y defectos de furcacion mandibulares bilaterales. La utilidad del biotejido de colageno de la invencion para tratar defectos de furcacion de clase II se pueden explicar en parte por su capacidad para regenerar el periodontio perdido en defectos de furcacion. Se espera que el biotejido de la invencion presente una utilidad terapeutica y clmica incrementada con respecto a las membranas de colageno usadas en la tecnica para el tratamiento de defectos de furcacion de clase II, tales como los descritos en Paul et al., 1992, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 12: 123-31; Wang et al., 1994, J. Periodontol. 65: 1029-36; Blumenthal, 1993, J. Periodontol. 64: 925-33; Black et al., 1994, J. Periodontol. 54: 598-604; Yukna et al., 1995, J. Periodontol. 67: 650-7).

La invencion comprende ademas el uso del biotejido de la invencion en procedimientos de cubrimiento radicular. La utilidad del biotejido de la invencion en el cubrimiento radicular se puede explicar en parte debido a su capacidad para sustituir tejido gingival perdido, danado o enfermo basandose en principios de regeneracion tisular guiada. Se espera que el biotejido de la invencion presente una utilidad clmica incrementada en el cubrimiento radicular en comparacion con las membranas de colageno usadas en la tecnica tradicionalmente para el cubrimiento radicular tales como las que se describen en Shieh et al., 1997 J. Periodontol., 68: 770-8; Zahedi et al., 1998 J. Periodontol. 69: 975-81; Ozcan et al., 1997 J. Marmara Univ. Dent. Fa. 2: 588-98; Wang et al., 1997 J. Dent. Res. 78 (Edicion Especial): 119 (Res.

106), por razones que se han mencionado anteriormente.

La invencion comprende ademas el uso del biotejido de colageno en un sujeto con una enfermedad periodontal, incluyendo periodontitis y gingivitis. El biotejido de la invencion tambien presenta utilidad clmica como un adyuvante a procedimientos de raspado y alisado radicular. La invencion comprende tratar un sujeto con una enfermedad periodontal utilizando un biotejido de colageno de la invencion. Un metodo ejemplar para el tratamiento de una enfermedad periodontal en un sujeto utilizando un biotejido de colageno de la invencion comprende insertar un biotejido de colageno, que se impregna preferiblemente con un antibiotico, tal como gluconato de clorhexidina, en uno o mas bolsillos periodontales en el sujeto, por ejemplo, mayores o iguales a 5 mm. Preferentemente, el biotejido de colageno es biodegradable.

El biotejido de colageno de la invencion para uso en odontologfa se puede impregnar con una o mas biomoleculas dependiendo del tipo de trastorno dental que se esta tratando. Cualquier biomolecula conocida en la tecnica para el tratamiento de trastornos dentales esta incluida en los metodos descritos en la presente memoria y composiciones de la invencion. En una realizacion espedfica, el biotejido de colageno usado en el tratamiento de un trastorno dental asociado a una infeccion se puede impregnar con uno o mas antibioticos, incluyendo doxociclina, tetraciclina, gluconato de clorhexidina, y minociclina.

Neurologfa

El biotejido de colageno de la invencion tambien resulta util para la reparacion de nervios lesionados, particularmente en la reparacion de nervios perifericos seccionados, y procedimientos neuroquirurgicos. La invencion comprende el uso del biotejido de colageno, por ejemplo, en sustituciones durales y en la reparacion de nervios perifericos. El biotejido de colageno de la invencion presenta una utilidad clmica incrementada como sustituto dural o en la reparacion de nervios al contrario que los otros metodos usados en la tecnica, por ejemplo, Berger et al., 1970, Acta. Neurochir.

23: 141; Ducker et al., 1968, Mil. Med. 133: 298; patentes US n °4.778.467; n° 4.883.618, n°3.961.805 y n°5.354.305, por los motivos senalados anteriormente.

En algunas realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion puede utilizarse como protesis en torno a anastomosis nerviosas, por ejemplo puede utilizarse para envolver anastomosis de nervios perifericos. El biotejido de colageno de la invencion presenta una utilidad particular en la reparacion nerviosa, por ejemplo, mediante la estimulacion de la formacion de un andamiaje de tejido conjuntivo longitudinal a traves de la zona de reparacion y de este modo da lugar a un patron longitudinal de regeneracion de celulas de la vaina y axonales.

La reparacion de los nervios perifericos se realiza habitualmente usando suturas en un procedimiento conocido como neurorrafia (Jennings et al., 1955, Surgery: 206). Sin embargo, este enfoque ha tenido un exito limitado dado que los metodos de sutura de nervios lesionados resultan diffciles. De esta manera, el biotejido de colageno de la invencion puede proporcionar una alternativa a un metodo sin suturas para la reparacion nerviosa, a traves del cual, por ejemplo, los extremos del nervio se incluyen en un dispositivo protesico tubular que comprende el biotejido de la invencion, y de esta manera aproxima los extremos seccionados hasta que se encuentran muy proximos para la regeneracion.

Urologfa

El biotejido de colageno de la invencion presenta una utilidad en particular en la correccion de la incontinencia urinaria. La incontinencia urinaria resulta de la insuficiencia de la uretra para permanecer cerrada durante el almacenamiento. La causa puede ser extrrnseca, por ejemplo, escaso apoyo anatomico de la uretra y cuello de la vejiga dando como resultado incontinencia y responde a la resuspension del suelo pelvico. La insuficiencia de la uretra, alternativamente, puede ser intrrnseca, es decir, una mala funcion uretral. Tradicionalmente, la incontinencia urinaria se corrige usando agentes de carga, tales como colageno, grasa y silicona (Vease, la revision de Lightner, 2002, Current Opinion in Urology, 12(4): 333-8). El biotejido de colageno de la invencion presenta una mayor utilidad, es decir, mejora la continencia, con respecto a los agentes de carga que se describen en la tecnica. Ademas, el biotejido de colageno de la invencion presenta una mayor utilidad terapeutica, por ejemplo, reduccion de las complicaciones locales, reduccion de la infeccion del tracto urinario, ninguna reaccion del huesped, durabilidad fiable, y mayor seguridad.

La utilidad del biotejido de colageno de la invencion para corregir la incontinencia urinaria se debe, en parte, a las caractensticas ffsicas unicas del biotejido de colageno tal como se describe en la presente memoria, en particular, su no inmunogenicidad. En algunas realizaciones, el biotejido de colageno se usa como un implante, por ejemplo, como un implante uretral. Aunque no se pretende restringirse a ninguna teona en particular, el biotejido de colageno de la invencion puede presentar una utilidad terapeutica mejorada al aumentar, por ejemplo, la presion del cierre de la uretra y la resistencia al flujo de salida pasivo de orina.

Ortopedia

El biotejido de colageno de la invencion se puede usar en procedimientos de cirugfa ortopedica. En determinadas realizaciones, el biotejido de colageno se puede usar para defectos ortopedicos, por ejemplo, defectos adquiridos o congenitos. La reconstruccion de los defectos locales que resultan de traumatismos o reanimacion quirurgica de un tumor oseo es un problema principal en la cirugfa ortopedica o maxilofacial. Tfpicamente, se han usado sustitutos de hueso sintetico o membranas de colageno debidas en parte a sus actividades osteoinductoras (Vease, por ejemplo. Rao et al., 1995, J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 7(7): 623-45). Sin embargo, un problema comun ha sido una infeccion sistemica como resultado del material implantado. El biotejido de colageno de la invencion, sin embargo, resulta ventajoso con respecto al material usado en la tecnica, particularmente debido a su baja inmunogenicidad como un sustituto oseo para uso en defectos ortopedicos. En algunas realizaciones, el biotejido de colageno se puede usar como protesis para la reconstruccion de tendones, ligamentos y cartflago. En otras realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion puede utilizarse como protesis en la sustitucion osea.

Cirugfa cardiovascular

El biotejido de colageno de la invencion se puede usar en procedimientos de cirugfa cardiovascular, por ejemplo, como una protesis para la construccion de vasos grandes y pequenos; para la reparacion de malformaciones congenitas de los pasos y valvulas danadas.

El biotejido de la invencion presenta una utilidad particular como un trasplante en cirugfa vascular, por ejemplo, trasplante de venas o arterias. La utilidad del biotejido en cirugfa vascular se debe, en parte, a su no toxicidad, no Inmunogenicidad; estabilidad; facilidad de manipulacion; caractenstica antitrombogenica; porosidad minima del implante de la pared celular; disponibilidad en diversos tamanos y reproducibilidad del material. En algunas realizaciones, el biotejido de la invencion puede utilizarse como un sustituto de una valvula.

Administracion de farmacos

El biotejido de colageno de la invencion se puede usar como un vehfculo de administracion de farmacos para la administracion controlada de un farmaco, por ejemplo, un agente terapeutico. En algunas realizaciones, el biotejido de colageno administra el uno o mas agentes terapeuticos en un sujeto, preferentemente un ser humano. Los agentes terapeuticos incluidos dentro del alcance de la Invencion son protemas, peptidos, polisacaridos, conjugados de polisacaridos, vacunas basadas en la genetica, vacunas atenuadas vivas, celulas completas. Un ejemplo no limitante de farmacos para uso en los metodos de la Invencion son antibioticos, agentes anticancer, agentes antibacterianos, agentes antivmcos; vacunas; anestesicos; analgesicos; agentes antiasmaticos; agentes antiinflamatorios; antidepresivos; agentes antiartnticos; agentes antidiabeticos; antipsicoticos; estimulantes del sistema nervioso central; hormonas; inmunosupresores; relajantes musculares y prostaglandinas.

El biotejido de colageno se puede usar como un vetnculo de administracion para la administracion controlada de una o mas moleculas pequenas en un sujeto, preferentemente en un ser humano. En algunas realizaciones, el biotejido de colageno administra una o mas moleculas pequenas en un sujeto, preferentemente un ser humano. Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "molecula pequena", y expresiones analogas, se incluyen, peptidos, peptidomimeticos, aminoacidos, analogos de aminoacidos, polinucleotidos, analogos de polinucleotidos, nucleotidos, analogos de nucleotidos, compuestos organicos o inorganicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorganicos y organometalicos) que presentan un peso molecular inferior a aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular Inferior a aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 500 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular Inferior a aproximadamente 100 gramos por mol, y sales, esteres, y otras formas farmaceuticamente aceptables de tales compuestos. Ademas, se incluyen sales, esteres, y otras formas farmaceuticamente aceptables de tales compuestos.

En determinadas realizaciones, el biotejido de colageno de la invencion como un vehfculo para la administracion de farmacos da como resultado un aumento de la absorcion del farmaco; un perfil farmacocinetico mejorado y la distribucion sistemica del farmaco con respecto a los demas sistemas de administracion de farmaco conocidos en la tecnica. Farmacocinetica mejorada se refiere a que se consigue una mejora del perfil farmacocinetico tal como se mide, por ejemplo, mediante parametros farmacocineticos convencionales, tales como tiempo para alcanzar una concentracion maxima en plasma (Tmax); magnitud de la concentracion maxima en plasma (Cmax); tiempo para inducir una concentracion en sangre o en plasma detectable (Tag). Por absorcion incrementada se hace referencia a que la absorcion del farmaco mejora segun se mide con tales parametros. La medida de los parametros farmacocineticos se realiza de forma rutinaria en la tecnica.

Ejemplos

Metodo para producir el biotejido de colageno

MATERIALES

Los siguientes materiales se usaron en la preparacion del biotejido de colageno.

Materiales/Equipo

Copia del registro de entrega

Copia de Material/Historia de Salud Familiar/Consentimiento Informado

Etiqueta de origen con codigo de barras (numero de ID del donante)

N° de recogida (se asigna un numero secuencial al material entrante)

Registro de procesamiento de tejidos (n° de ID de documento ANT-19F); se mantiene un registro detallado del irocesamiento de cada numero de lote

Placenta humana (con menos de 48 al comienzo del procesamiento)

Pinzas/hemostatos quirurgicos esteriles

Tijeras esteriles

Bistuns esteriles

Raspador de celulas esteril (Nalgene NUNC Int. R0896

Gasa esteril (PSS 4416 no esteril, esterilizada)

Bandejas de acero inoxidable esteriles para aclarado

Bandejas de acero inoxidable desinfectadas para procesamiento

Cesta de plastico desinfectada

Solucion de NaCI al 0,9% esteril (Baxter 2F7124)

Agua Esteril (Milli Q plus 09195 o Baxter 2F7113)

Envases esteriles para muestras (VWR 15704-014)

Equipo de proteccion personal (incluyendo guantes esteriles y no esteriles)

Sala limpia certificada

Solucion de descelularizacion preparada previamente (celulas D); monohidrato del acido desoxicolico al 0,01-1% Recipiente desinfectado

Plataforma oscilante (modelo 100 de VWR)

• Cronometro (VWR 21376890)

• Malla para marco de plastico desinfectada

• Film para envolver de PVC

• Bomba de vado (Schuco-Vac 5711-130)

• Secador de gel (es decir, secador de calor; modelo 583 de BioRad)

• Tabla para cortar de acero inoxidable desinfectada

• Bolsas para envasado

• Regla de acero inoxidable esteril (General Tools MFG. Co 1201)

• Termometro digital trazable (modelo 61161-364, Control Company)

• Sellador automatico Accu-Seal (Accu-Seal, modelo 630-1B6)

La madre gestante fue sometida a cribado en el momento del nacimiento para enfermedades transmisibles, tales como VIH, VHB, VHC, HTLV, sffilis, CMV y otros virus, y otros patogenos que podnan contaminar los tejidos de placenta que se estan recogiendo. Solamente se usaron los tejidos tomados de donantes cuyas madres dieron negativo o no reactivo a los patogenos mencionados anteriormente para producir el biotejido de colageno.

Despues de parto normal, la placenta, el cordon umbilical y la sangre del cordon umbilical se expulsaron espontaneamente del utero en contraccion. La placenta, el cordon umbilical y la sangre del cordon umbilical se recogieron despues del nacimiento. Los materiales se transportaron al laboratorio donde se procesaron en condiciones asepticas en una habitacion Limpia con un sistema de filtracion HEPA, que se encendio al menos una hora antes del procesamiento. Se usaron guantes (esteriles o no esteriles, segun el caso) en todo momento durante la manipulacion del producto. Todos los segmentos (residuos) no usados del amnios/corion y lfquidos contaminados, generados durante el procesamiento del tejido, se eliminaron lo antes posible.

ETAPA I.

Se establecio un campo esteril con laminas de Steri-Wrap esteril y se colocaron sobre el mismo los siguientes instrumentos y accesorios para el procesamiento.

• envase de bandeja esteril

• raspador de celulas esteril

• bistun esteril

• bandeja de procesamiento desinfectada

El n° de ID del recipiente esteril se registro en el registro de procesamiento.

La placenta se retiro del recipiente de transporte y se coloco en la bandeja de acero inoxidable desinfectada. Usando elementos de sujecion y tijeras quirurgicos, se cortaron aproximadamente 5 cm (2 pulgadas) del cordon umbilical del disco placentario. El cordon umbilical se coloco en un recipiente esteril separado para su procesamiento adicional. El recipiente se marco con codigo de barras con ID del tejido; y se identificaron el material y la solucion o soluciones de almacenamiento presentes (por ejemplo, tipo de medios). En algunos casos, se descartaba el cordon umbilical si no era necesario para otros proyectos.

Comenzando desde el borde de la membrana placentaria, el amnios se separo del corion usando diseccion roma con los dedos. Esto se hizo antes de cortar la membrana.

A continuacion, el amnios se separo de toda la superficie del corion y disco placentario, la membrana amniotica se corto alrededor del tronco del cordon umbilical con tijeras y se separo del disco placentario. En algunos casos, si no era posible la separacion de los amnios y el corion sin desgarrar el tejido, el amnios y el corion se cortaron del disco placentario como un solo trozo y luego se desprendieron.

El corion se introdujo en un recipiente para muestras independiente para su uso para otros proyectos. El recipiente se etiqueto con el codigo de barras de ID de tejido, el material y la solucion o soluciones de almacenamiento presentes (por ejemplo, tipo de medios) se identificaron, se marcaron con la identificacion y se registro la fecha.

Si cualquier trozo de amnios todavfa se encontraba unido al disco placentario, este se desprendfa del disco y se cortaba alrededor del cordon umbilical con tijeras. La placenta se coloco de nuevo en el recipiente de transporte para su uso en otros proyectos.

Los datos apropiados se registraron en el registro de procesamiento de tejidos.

La membrana amniotica se mantuvo en la bandeja con solucion esteril de NaCI al 0,9%. Preferentemente, la membrana amniotica se almacena con refrigeracion durante un maximo de 72 horas desde el momento del parto antes de la siguiente etapa en el proceso.

ETAPA II.

La membrana amniotica se saco del recipiente de muestras, un trozo cada vez, y se coloco en la bandeja de acero inoxidable desinfectada. Se colocaron en una bandeja de acero inoxidable esteril independiente llena de agua esteril otros trozos, hasta que estaban listas para su lavado. Se sacaron trozos adicionales de amnios de la bandeja de procesamiento y se colocaron en una bandeja de acero inoxidable para aclarado independiente llena con agua esteril.

La membrana amniotica se enjuago con agua esteril si estaba extremadamente contaminada con fluidos/materiales de sangre materna o fetales cambiando el agua esteril cuando era necesario.

La membrana amniotica se coloco en la bandeja de procesamiento con la cara materna hacia arriba. Usando un Raspador de Celulas esteril, se retiro cuidadosamente, tanto como fue posible, la contaminacion visible y el material celular del lado materno del amnios. (Nota: se debena aplicar una presion minima en esta etapa para evitar que se rompa la membrana). Se uso agua esteril para ayudar en la eliminacion de las celulas y los restos celulares. La membrana amniotica se aclaro adicionalmente con agua esteril en la bandeja de enjuague de acero inoxidable esteril independiente.

Se dio la vuelta a la membrana amniotica de manera que la cara fetal estuviera hacia arriba y se coloco de nuevo en la bandeja de procesamiento y se aclaro con agua esteril. El material celular y los restos visibles se retiraron suavemente usando el Raspador de Celulas (Nota: Se debena aplicar una presion minima en esta etapa para evitar que se rompa la membrana). Se uso agua esteril para ayudar en la eliminacion de las celulas y los restos celulares.

La membrana amniotica se enjuago con agua esteril entre las rondas de lavado en bandejas de enjuague esteriles independientes. El tejido se limpio tantas veces (rondas de lavado) como era necesario para retirar la mayona, si no todo, el material celular y los restos visibles desde ambos lados de la membrana. El agua esteril se cambio de las bandejas de aclarado entre aclarados.

La bandeja de procesamiento se enjuago con agua esteril despues de cada ronda de lavado.

Todos los demas trozos de amnios se procesaron de la misma manera y se colocaron en el mismo recipiente. Se fijo un Codigo de Barras de Id del Tejido, se identificaron el material y la solucion o soluciones de almacenamiento presentes (por ejemplo, tipo de medios), se anadieron las iniciales y la fecha.

La informacion apropiada y la fecha se registraron en el registro de procesamiento de tejidos.

ETAPA III.

La membrana amniotica se retiro de la bandeja de enjuague (o del recipiente de almacenamiento), el exceso de lfquido se apreto suavemente con los dedos y la membrana se coloco en el recipiente para muestras esteril. El recipiente se lleno hasta la marca de 150 ml con solucion de celulas D asegurando que toda la membrana amniotica estaba cubierta y el recipiente se cerro.

El recipiente se coloco en el deposito en la plataforma oscilante. La plataforma oscilante se encendio y la membrana se agito en solucion de celulas D durante un mmimo de 15 minutos y un maximo de 120 minutos en el Ajuste N° 6.

Se establecio un nuevo campo esteril con nuevos instrumentos y la bandeja se desinfecto de la misma manera que en la etapa I. El n° de ID del envase esteril se registro en el registro de procesamiento.

Despues de finalizar la agitacion, la plataforma oscilante se apago y se saco la membrana del recipiente. La membrana se coloco en una nueva bandeja de procesamiento de acero inoxidable esteril. Se anadio solucion esteril de NaCI al 0,9% para cubrir la parte inferior de la bandeja.

Usando un nuevo raspador de celulas esteril, se retiraron las celulas D y el material celular residuales (si los hubiera) de ambas caras del tejido. Esta etapa se repitio tantas veces como fue necesario para retirar tanto como fuera posible de material celular residual visible de toda la superficie en ambos lados. La membrana se aclaro con solucion esteril de NaCI al 0,9% en una bandeja de enjuague independiente entre las rondas de lavado. La solucion esteril de NaCI al 0,9% se cambio en las bandejas de aclarado entre aclarados.

Despues de completar la ultima ronda de lavado, la membrana se enjuago con solucion esteril de NaCI al 0,9% y se introdujo en el nuevo recipiente de muestras esteril lleno de solucion esteril de NaCI al 0,9%.

Todos los trozos restantes de membrana amniotica se procesaron exactamente de la misma forma.

Cuando se procesaron todos los trozos de membrana amniotica y en el recipiente con la solucion esteril de NaCI al 0,9%, el recipiente se introdujo en el deposito de la plataforma oscilante para su agitacion durante un mmimo de 5 minutos en el dial n° 6. Despues de finalizar la agitacion, la membrana se retiro del recipiente de la muestra, la solucion esteril de NaCI al 0,9% se cambio en el recipiente y la membrana se coloco de nuevo en el recipiente de la muestra.

El recipiente para muestras se etiqueto con ID de codigo de barras para tejidos y etiqueta de cuarentena. Se identificaron el material y la solucion o soluciones de almacenamiento presentes (por ejemplo, tipo de medios), y se marco la identificacion y la fecha. El recipiente de la muestra se introdujo en una bolsa limpia con cierre de cremallera y se introdujo en la nevera (a 2-8°C).

Todos los datos apropiados se registraron en el registro de procesamiento de tejidos.

Cuando los resultados serologicos estuvieron disponibles, la etiqueta apropiada (serologfa negativa o para uso exclusivo en investigacion) se aplico en la parte superior de la etiqueta de cuarentena y los recipientes se separaron de los puestos en cuarentena.

ETAPA IV.

Antes de proceder con la etapa IV, se comprobo la revision del estado de los tejidos para asegurarse que todos los resultados del ensayo aplicables eran negativos.

Se creo un campo esteril con lamina Steri-Wrap esteril y todos los instrumentos y accesorios esteriles y desinfectados se prepararon de la misma forma que en las etapas II y III.

La membrana se saco de la nevera y se coloco en una nueva bandeja de procesamiento de acero inoxidable esteril. Se anadio solucion esteril de NaCI al 0,9% para cubrir la parte inferior de la bandeja.

Todo el material y restos celulares visibles (si los hubiera) se retiraron suavemente usando un nuevo raspador de celulas esteril (nota: se debena aplicar una presion minima en esta etapa para evitar el desgarro de la membrana). Se uso solucion esteril de NaCI al 0,9 % para ayudar en la eliminacion de las celulas y los desechos.

La membrana se aclaro en la bandeja de enjuague de acero inoxidable esteril independiente llena con solucion esteril de NaCI al 0,9%. La Solucion de NaCI al 0,9% se cambio entre las rondas de lavado. La membrana se coloco en un nuevo recipiente de muestras esteriles, el recipiente se lleno con solucion esteril recien preparada de NaCI al 0,9 % y se coloco en la plataforma oscilante para su agitacion durante un mmimo de 5 minutos en el Ajuste N° 6.

La etapa anterior se repitio 3 veces y la solucion esteril de NaCI al 0,9% se cambio entre cada agitacion. Los datos apropiados se registraron en el Registro de Procesamiento de Tejidos.

Se saco la membrana del recipiente de espedmenes, un trozo cada vez, el exceso de fluido se elimino apretando suavemente con los dedos y la membrana se coloco en una bandeja de procesamiento esteril. La membrana se estiro suavemente hasta aplanarla; asegurandose de que la cara fetal estaba hacia abajo.

Se preparo el marco cortando la lamina de plastico desinfectada con tijeras esteriles. El tamano del marco debena ser aproximadamente 0,5 cm mas pequeno en cada direccion que el segmento de la membrana. El marco se aclaro en la bandeja de enjuague rellena con solucion esteril de NaCI al 0,9%.

El marco se coloco sobre la superficie de la membrana ligeramente estirada y se presiono sobre ella suavemente. Es fundamental que el lado suave de del marco de plastico se coloque enfrente del tejido.

Usando un bistun, se corto la membrana alrededor del marco dejando aproximadamente 0,5 cm de extension mas alla de los bordes del marco. El exceso de membrana se coloco de nuevo en el recipiente de la muestra.

Los bordes de la membrana que se extienden mas alla del marco se envolvieron sobre los bordes del marco usando abrazaderas o pinzas y se colocaron al lado en la misma bandeja.

El siguiente trozo de membrana se proceso de la misma manera. Resulta importante que la zona total a secar no supere 300 cm2 por secador de calor. A la vez que el trozo de membrana se 'desenmarca', los trozos sin enmarcar debenan permanecer en el recipiente en solucion esteril de NaCI al 0,9%.

Se ajustaron las temperaturas de secado de los secadores y se verificaron usando un termometro digital calibrado con sonda extendida. La temperatura de secado se establecio en 50 °C. Los datos se registraron en el Registro de Procesamiento de Tejidos.

Se activo la bomba de vado.

Se coloco una gasa esteril en la plataforma de secado del secador de calor, cubriendo una superficie ligeramente superior a la superficie de membrana enmarcada. Es importante asegurarse de que el espesor total de la capa de gasa no supere un espesor de una gasa de 4 x 4 doblada.

Una lamina de malla de marco de plastico se coloco en la parte superior de la gasa. Los bordes de la malla de plastico se debenan extender aproximadamente 0,5-1,0 cm mas alla de los bordes de la gasa.

La membrana enmarcada se levanto suavemente y se coloco en la plataforma del secador de calor en la parte superior de la malla de plastico con la cara de la membrana mirando hacia arriba. Esto se repitio hasta que la cantidad maxima de membrana (sin superar 300 cm2) estuvo en la plataforma del secador de calor. (NOTA: la cara fetal del amnios se encontraba orientada hacia arriba).

Se corto un trozo de film de PVC lo suficientemente larga como para cubrir toda la plataforma de secado del secador de calor mas unos 30 cm (un pie) adicionales.

Con la bomba de vado funcionando, toda la plataforma de secado del secador de calor se cubrio suavemente con la pelfcula de plastico dejando unos 15 cm (1/2 pies), extendiendose mas alla de los bordes de la plataforma de secado en ambas caras. Se procuro que la pelfcula se ajustara fuertemente contra la membrana y la lamina del marco (es decir, que se encontrase "succionada" por el vado) y de que no hubiera fugas de aire ni arrugas sobre la superficie del tejido). Posteriormente, el parpado se cerro.

La bomba de vado se ajusto a aproximadamente -559 mm (-22 pulgadas) de Hg de vado. La calibracion de la bomba se registro despues de 2-3 min de ciclo de secado. La membrana se seco al vado con calor durante aproximadamente 60 minutos. Aproximadamente a los 15-30 minutos del proceso de secado, la capa de gasa esteril se sustituyo en la secadora de calor con una nueva. El espesor total de la capa de gasa no debe superar un espesor de una gasa de 4 x 4 doblada.

Despues del cambio, se procuro que la pelfcula de plastico se estirase fuertemente contra la membrana y la lamina del marco y que no hubiera fugas de aire ni ninguna arruga en la superficie de la membrana.

La integridad del cierre hermetico al vado se comprobo periodicamente comprobando el manometro de la bomba. Despues de finalizar el proceso de secado, se abrio el secador por calor y la membrana se enfrio durante aproximadamente dos minutos con la bomba funcionando.

Se creo un nuevo campo esteril con Steri-wrap esteril y una tabla de cortar de acero Inoxidable desinfectada debajo del mismo. En este punto se usaron guantes esteriles. Con la bomba aun en marcha, la pelfcula de plastico se retiro suavemente de la lamina de membrana comenzando en la esquina y manteniendo la lamina de membrana hacia abajo con una mano enguantada. El bastidor se levanto suavemente con la membrana fuera de la plataforma de secado y se coloco en el campo esteril en la parte superior de la tabla de cortar de acero Inoxidable desinfectada con la cara de la membrana hacia arriba. Usando un bistun, la lamina de membrana se corto haciendo una Incision a lo largo del borde de 1 - 2 mm mas alla del borde del marco. La membrana se mantuvo en el lugar con una mano enguantada (guante esteril). Suavemente, la lamina de membrana se despego del marco retirando lentamente y a continuacion se coloco en el campo esteril en la tabla de corte.

Usando bistun o tijeras afiladas, la lamina de membrana se corto en segmentos de tamano espedfico. Todos los trozos se cortaron y se fijaron en el campo esteril antes de su envasado. Se introdujo un solo trozo de membrana dentro de un recipiente; se puso de bolsa interna para abrir con una mano (esteril) a la vez que se mantema la bolsa con la otra mano (no esteril). Se procuro no tocar los bolsillos con la mano 'esteril'. Cuando todos los trozos estuvieron dentro de las bolsas internas, estas se cerraron hermeticamente. Se fijo una etiqueta con la informacion apropiada (por ejemplo, n° de trozo, n° de lote, etc.) en la zona designada en la parte externa de la bolsa. Todos los trozos de membrana se procesaron de la misma manera. Los envases de bolsillo para abrir marcados y cerrados hermeticamente se colocaron en la bolsa para cerrar con cremallera Impermeable para su almacenamiento hasta que estuvieran listas para transporte a la instalacion o distribuidor para su esterilizacion. Todos los datos apropiados se registraron en el registro de procesamiento de tejidos.

Evaluacion del biotejido de colageno para hidratacion/capacidad de sutura

Para generar una retroalimentacion cualitativa y cuantitativa con respecto a la manipulacion quirurgica, periodos de hidratacion y capacidad de sutura de los biotejidos comprendidos en la presente invencion, se proporcionan para su evaluacion muestras de membrana amniotica preparadas de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria a cuatro cirujanos experimentados especialistas en la cirugfa de la superficie ocular. Las muestras fueron evaluadas por los cirujanos mediante la realizacion de injertos de tejido en muestras de ojo de cerdo para determinar las propiedades de manipulacion quirurgica y capacidad de sutura de los biotejidos de la invencion.

Cada cirujano puede utilizar la metodologfa siguiente:

(1) el biotejido se seca por corte para ajustarse a un solo cuadrante del ojo del cerdo;

(2) el biotejido cortado se coloca en la superficie del ojo del cerdo;

(3) el biotejido se hidrata con solucion salina esteril y se permite que el injerto se active, es decir, se vuelve a hidratar, en el ojo del cerdo durante periodos de hidratacion de 2, 5, 10 y 20 minutes;

(4) el biotejido se sutura al epitelio del ojo del cerdo con varios puntos de sutura de Vicryl 9-0; y

(5) los cirujanos tomaron notas cualitativas con respecto a la calidad del tejido, consistencia, y capacidad de sutura de la membrana amniotica hidratada.

La solicitud da a conocer entre otros los items siguientes (no todos forman parte de la invencion). La invencion se define en las reivindicaciones.

1. Un metodo para preparar un biotejido de colageno a partir de una placenta que tiene una membrana amniotica y una membrana corionica que comprende:

(a) separar la membrana amniotica de la membrana corionica; y

(b) descelularizar la membrana amniotica de manera que la membrana amniotica se ponga en contacto con una enzima.

2. El metodo del item 1, que comprende ademas lavar y secar la membrana amniotica descelularizada.

3. El metodo del item 1, en donde la placenta es una placenta humana.

4. El metodo del item 1, en donde la placenta procede de una mujer que se ha sometido a cesarea o parto natur 5. El metodo del item 1, en donde el metodo comprende adicionalmente la etapa de determinar que la membrana placentaria procede de un donante que ha sido sometido a ensayo para como mmimo una enfermedad transmisible.

6. El metodo del item 1, en donde el donante es una mujer.

7. El metodo del item 1, en donde la placenta se proporciona dentro de las 48 horas posteriores al parto.

8. El metodo del item 1, en donde el metodo comprende adicionalmente la etapa de almacenar la membrana amniotica durante maximo 72 horas despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b).

9. El metodo del item 8, en donde dicho almacenamiento comprende refrigerar la membrana amniotica obtenida en la etapa (a) durante maximo 5 dfas.

10. El metodo del item 1, en donde la descelularizacion de la membrana amniotica en la etapa (b) comprende eliminar todo el material celular visible y los residuos celulares de la membrana amniotica.

11. El metodo del item 1, en donde la descelularizacion de la membrana amniotica en la etapa (b) comprende la eliminacion de todo el material celular visible y los residuos celulares de la cara materna de la membrana amniotica y de la cara fetal de la membrana amniotica.

12. El metodo del item 1, en donde la descelularizacion de la membrana amniotica en la etapa (b) comprende raspar ffsicamente dicha membrana.

13. El metodo del item 1, en donde la descelularizacion de la membrana amniotica en la etapa (b) comprende descelularizar la membrana amniotica con una solucion que contiene detergente.

14. El metodo del item 13, en donde la solucion que contiene detergente es una solucion que comprende monohidrato de sal sodica de acido desoxicolico al 0,01-1,0%.

15. El metodo del item 13, en donde el detergente en la solucion que contiene detergente se selecciona de un grupo que consiste en detergentes no ionicos, Triton X-100, detergentes anionicos y dodecilsulfato sodico o una combinacion de los mismos.

16. El metodo del item 12, en donde dicho raspado ffsico comprende el raspado con un raspador celular.

17. El metodo del item 1, en donde la descelularizacion de la membrana amniotica en la etapa (b) se lleva a cabo en una solucion esteril.

18. El metodo del item 2, en donde el lavado de la membrana amniotica se lleva a cabo en una solucion esteril.

19. El metodo del item 2, en donde el secado de la membrana amniotica descelularizada se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 50°C.

20. Un metodo para preparar un laminado de membrana amniotica a partir de una placenta que tiene una membrana amniotica y una membrana corionica que comprende:

(a) separar la membrana amniotica de la membrana corionica;

(b) descelularizar la membrana amniotica; y

(c) formar capas de al menos dos de las membranas amnioticas descelularizadas en contacto entre sf de modo que se forma un laminado de membrana amniotica.

21. El metodo del item 20, que comprende ademas lavar la membrana amniotica descelularizada al menos una vez despues de la etapa (b) y antes de la etapa (c).

22. El metodo del item 20, que comprende ademas secar el laminado de membrana amniotica descelularizada.

23. El metodo del item 20, que comprende adicionalmente ensamblar al menos dos de dichos laminados de membrana amniotica en un andamiaje tridimensional complejo.

24. Un biotejido de colageno comprende una membrana amniotica humana deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, en donde dicha membrana amniotica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa.

25. Un biotejido de colageno descelularizado y libre de sustrato que comprende colageno, elastina y fibronectina.

26. Un biotejido de colageno preparado mediante el metodo del item 1.

27. El biotejido de colageno del item 24, en donde la membrana amniotica es una membrana amniotica humana.

28. El biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26, en donde el biotejido presenta un grosor de entre aproximadamente 10 y 40 micrometros.

29. El biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26, en donde el biotejido se impregna adicionalmente con una o mas biomoleculas.

30. El biotejido de colageno del item 29, en donde la biomolecula se selecciona del grupo que consiste en antibioticos, hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifungicos, agentes antivmcos, medicaciones para el dolor, antihistammicos, agentes antiinflamatorios, antiinfecciosos, agentes de cicatrizacion de heridas, sellantes de heridas, atrayentes celulares y reactivos de andamiaje.

31. El biotejido de colageno del item 29, en donde el biotejido se impregna ademas con una o mas moleculas pequenas.

32. El biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26, en donde el biotejido se llena adicionalmente con celulas, de manera que dichas celulas son uniformes y confluyentes.

33. El biotejido de colageno del item 32, en donde las celulas son celulas madre humanas o celulas adultas diferenciadas humanas.

34. El biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26, que comprende ademas uno o mas agentes terapeuticos.

35. El biotejido de colageno del item 34, en donde dicho agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en una hormona, un polipeptido, un antibiotico, un agente antifungico y una enzima.

36. El biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26, que comprende ademas uno o mas composiciones de hidrogel.

37. El biotejido de colageno del item 36, en donde la composicion de hidrogel comprende un polfmero seleccionado del grupo que consiste en alcohol de polivimlico, polietilenglicol, acido hialuronico, dextrano, y derivados o analogos de los mismos.

38. Un andamiaje tridimensional que comprende el biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26. 39. El andamiaje tridimensional del item 38, en donde el andamiaje es un tubo.

40. El andamiaje tridimensional del item 38, que comprende ademas una o mas composiciones de hidrogel. 41. El andamiaje tridimensional del item 40, en donde la composicion de hidrogel comprende un polfmero seleccionado del grupo que consiste en alcohol polivimlico, polietilenglicol, acido hialuronico, dextrano, y derivados o analogos de los mismos.

42. Un laminado de membrana amniotica producido mediante el metodo del item 20.

43. Un laminado de membrana amniotica que comprende al menos dos capas del biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26.

44. Un laminado de membrana amniotica que comprende el biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26.

45. El laminado de membrana amniotica de cualquiera de los items 42 a 44, que comprende ademas una o mas composiciones de hidrogel.

46. El laminado de membrana amniotica del item 45, en donde la composicion de hidrogel comprende un polfmero seleccionado del grupo que consiste en alcohol polivimlico, polietilenglicol, acido hialuronico, dextrano, y derivados o analogos de los mismos.

47. Un injerto quirurgico que comprende el biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26.

48. Un metodo de uso del injerto quirurgico del item 47 en un procedimiento quirurgico, en donde dicho injerto quirurgico se aplica directamente en el sitio quirurgico del sujeto.

49. El metodo del item 48, en donde dicho sitio quirurgico se selecciona del grupo que consiste en un ojo, piel, una superficie serosa del abdomen, una superficie serosa de la cavidad toracica, un pericardio seroso, una superficie mucosa de la cavidad oral, una superficie mucosa de la cavidad nasal, una superficie del tracto respiratorio, una superficie del tracto gastrointestinal y una superficie del tracto urogenital.

50. El metodo del item 48, en donde dicho injerto quirurgico se aplica en un sitio interno del cuerpo del sujeto. 51. El metodo del item 48, en donde dicho injerto quirurgico se aplica en un sitio externo del cuerpo del sujeto. 52. El metodo del item 48, en el que dicho sujeto es un ser humano.

53. Un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad ocular en un sujeto, que comprende aplicar el biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26 sobre la superficie de un ojo enfermo del sujeto. 54. El metodo del item 53, en donde la enfermedad ocular se selecciona del grupo que consiste en ulceraciones/perforaciones, queratopatfa bullosa, dermoides/tumores oculares, pterigion primario, defecto epitelial corneal persistente, quemaduras por alcali agudas y cronicas, quemaduras termicas, aniridia, queratitis atopica, deficiencia de celulas madre limbales idiopatica, pannus corneal, neovascularizacion, fusion corneal reumatoide, penfigoide cicatricial ocular, ampolla de filtracion con fugas, tubo de la valvula de Ahmed expuesto, celulitis por Serratia en el simblefaron posterior y smdrome de Stevenson Johnson agudo y cronico.

55. Un metodo de uso del biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26 en procedimientos quirurgicos seleccionados del grupo que consiste en cirugfa oftalmica, cirugfa cardiovascular, cirugfa periodontal, cirugfa neurologica, cirugfa dental y cirugfa ortopedica.

56. Un metodo de uso del biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26 en la correccion de la incontinencia urinaria en un sujeto.

57. Un metodo de administracion de un agente terapeutico en un sujeto, que comprende poner en contacto el sujeto con el biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26.

58. El metodo del item 56 o 57, en donde el sujeto es un ser humano.

59. El metodo del item 57, en donde el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en antibioticos, agentes anticancer, agentes antibacterianos, agentes antivmcos, vacunas, anestesicos, analgesicos, agentes antiasmaticos, agentes antiinflamatorios, antidepresivos, agentes antidiabeticos, antipsicoticos, estimulantes del sistema nervioso central, hormonas, inmunosupresores, relajantes musculares y prostaglandinas.

60. Un metodo de uso del biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26, en donde el tiempo de preparacion del biotejido de colageno comprende la hidratacion del biotejido de colageno.

61. El metodo del item 60, en donde la hidratacion del biotejido comprende la hidratacion con una solucion salina esteril.

62. El metodo del item 60, en donde el biotejido se hidrata durante como mmimo 2 minutos antes del uso.

63. Un metodo de uso de un laminado de membrana amniotica que comprende ademas llenar el laminado con celulas vivas.

64. El metodo del item 63, en donde dichas celulas vivas se seleccionan del grupo que consiste en celulas de tejido adulto y celulas madre.

66. El metodo del item 64, en donde dichas celulas madre son pluripotentes.

67. El metodo del item 64, en donde dichas celulas madre son espedficas de tejido.

68. Un metodo de tratamiento o prevencion de una condicion de la piel en un sujeto, que comprende poner en contacto dicha condicion de la piel con el biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26.

69. El metodo del item 68, en donde dicha condicion de la piel se selecciona del grupo que consiste en una lesion de la piel, arrugas, lmeas finas, adelgazamiento de la piel, elasticidad de la piel reducida, piel rugosa, cicatrices del acne, surcos glabelares, cicatrices de extirpacion, defecto de los tejidos blandos, condicion congenita de la piel, condicion degenerativa de la piel, deficiencia de colageno VII y piel danada por el sol.

70. El metodo del item 68, que comprende ademas la administracion de uno o mas agentes terapeuticos en el sujeto para el tratamiento de una condicion de la piel.

71. El metodo del item 70, en donde dicho o dichos agentes terapeuticos se seleccionan del grupo que consiste en vitaminas, minerales, preparaciones a base de catequinas y glucosamina.

72. Un metodo de tratamiento de una herida en un sujeto, que comprende poner en contacto dicha herida con un biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26.

73. El metodo del item 72, en donde dicha herida se selecciona del grupo que consiste en una herida epidermica, una herida de la piel, una ulcera de presion, una herida cronica, una herida aguda, una herida externa, una herida interna, una herida congenita, una herida por quemadura, una herida quirurgica y una infeccion de herida.

74. Un metodo de tratamiento de una quemadura en un sujeto, que comprende poner en contacto dicha quemadura con un biotejido de colageno de cualquiera de los items 24 a 26.

75. El metodo del item 74, en donde dicha quemadura se selecciona del grupo que consiste en quemadura de primer grado, quemadura de segundo grado, quemadura de tercer grado, una herida por quemadura infectada e impetigo en herida de quemadura.

76. El metodo del item 68, 72 o 74, en donde el sujeto es un ser humano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende un biotejido de colageno para uso en cirugfa, en donde dicho biotejido de colageno comprende una membrana amniotica humana deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, en donde dicha membrana amniotica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa.

2. La composicion para uso segun la reivindicacion 1, en donde la composicion se utiliza como injerto quirurgico.

3. La composicion para uso segun la reivindicacion 1, en donde el biotejido de colageno comprende elastina y fibronectina.

4. La composicion para uso segun la reivindicacion 1 o 3, que comprende un laminado de membrana amniotica que comprende al menos dos capas del biotejido de colageno.

5. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha composicion se aplica directamente a un sitio quirurgico de un sujeto.

6. La composicion para uso segun la reivindicacion 5, en donde dicho sitio quirurgico se selecciona del grupo que consiste en un ojo, piel, una superficie serosa del abdomen, una superficie serosa de la cavidad toracica, un pericardio seroso, una superficie mucosa de la cavidad oral, una superficie mucosa de la cavidad nasal, una superficie del tracto respiratorio, una superficie del tracto gastrointestinal y una superficie del tracto urogenital.

7. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha composicion se aplica a un sitio interno del cuerpo de un sujeto, o a un sitio externo del cuerpo del sujeto.

8. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso durante una cirugfa para evitar la fuga de sangre a partir de lmeas de sutura, o para cubrir sitios de anastomosis durante la cirugfa.

9. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso durante una cirugfa intraperitoneal para evitar adherencias.

10. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso durante una cirugfa cerebral para proporcionar soporte a la reparacion dural.

11. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso como un sustrato para estimular la regeneracion nerviosa en el sistema nervioso central y periferico.

12. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en la reconstruccion de tejidos blandos para evitar adherencias en la reparacion de articulaciones o tendones.

13. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el biotejido de colageno se impregna con una biomolecula, preferiblemente un antibiotico, una hormona, un factor de crecimiento, un agente antitumoral, un agente antifungico, un agente antivmco, un antihistammico, un agente antiinflamatorio, un agente antiinfeccioso, plata elemental, una enzima bactericida, un agente de cicatrizacion de heridas, acido hialuronico, un sellante de heridas, un atrayente celular o un reactivo de andamiaje.

14. La composicion para uso segun la reivindicacion 13, en donde el antibiotico se selecciona del grupo que comprende clindamicina, minociclina, doxociclina y gentamicina.

15. La composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el biotejido de colageno se llena con celulas, preferiblemente celulas madre espedficas de tejido, celulas progenitoras comprometidas, celulas fibroblastoides, condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas parenquimatosas pancreaticas, neuroblastos y celulas progenitoras musculares.

16. Un injerto quirurgico que comprende un biotejido de colageno, en donde el biotejido de colageno comprende una membrana amniotica humana deshidratada, descelularizada y libre de sustrato, en donde dicha membrana amniotica presenta una estructura terciaria y cuaternaria nativa.