ES2710802T3 - Acido nucleico antisentido - Google Patents

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Abstract

Un oligómero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (a) a (c) a continuación, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable de este: (a) un oligómero antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 1 o 2; (b) un oligómero antisentido que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene deleción, sustitución, inserción y/o adición de 1 a 5 nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 1 o 2, y tiene una actividad que provoca la omisión del exón 51 en el gen de la distrofina humana; y (c) el oligómero antisentido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omisión del exón 51 en el gen de la distrofina humana.

Description

DESCRIPCION
Acido nucleico antisentido
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un oligomero antisentido que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana, y una composicion farmaceutica que comprende el oligomero.
Antecedentes
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la forma mas frecuente de distrofia muscular progresiva hereditaria que afecta a uno de cada 3.500 ninos recien nacidos. Aunque las funciones motoras rara vez son diferentes a las de los humanos sanos en la infancia y la ninez, la debilidad muscular se observa en ninos de aproximadamente 4 a 5 anos de edad. Despues, la debilidad muscular progresa hacia la perdida de la movilidad alrededor de los 12 anos y la muerte por insuficiencia cardfaca o respiratoria a los veinte anos. La DMD es un trastorno tan grave. Actualmente, no existe una terapia eficaz para la DMD disponible, y se desea fuertemente desarrollar un novedoso agente terapeutico.
Se sabe que la DMD tiene como causa una mutacion en el gen de la distrofina. El gen de la distrofina se encuentra en el cromosoma X y es un gen enorme que consta de 2,2 millones de pares de nucleotidos de ADN. El ADN se transcribe en precursores de ARNm, y los intrones se eliminan mediante corte y empalme para sintetizar un ARNm de 11.058 bases, en el que 79 exones se unen. Este ARNm se traduce en 3.685 aminoacidos para producir la protema distrofina. La protema distrofina se asocia con el mantenimiento de la estabilidad de la membrana en las celulas musculares y es necesaria para que las celulas musculares sean menos fragiles. El gen de la distrofina de pacientes con DMD contiene una mutacion y por lo tanto, la protema distrofina, que es funcional en las celulas musculares, rara vez se expresa. Por lo tanto, la estructura de las celulas musculares no puede mantenerse en el cuerpo de los pacientes con DMD, lo que conduce a un gran influjo de iones de calcio en las celulas musculares. Consecuentemente, se produce una respuesta similar a la inflamacion para promover la fibrosis de manera que las celulas musculares solo pueden regenerarse con dificultad.
La distrofia muscular de Becker (BMD) tambien es causada por una mutacion en el gen de la distrofina. Los smtomas involucran debilidad muscular acompanada de atrofia muscular pero tfpicamente son leves y lentos en el progreso de la debilidad muscular, en comparacion con la DMD. En muchos casos, su inicio es en la edad adulta. Se considera que las diferencias en los smtomas clmicos entre la DMD y la BMD residen en si el marco de lectura para los aminoacidos en la traduccion del ARNm de la distrofina en la protema distrofina se interrumpe por la mutacion o no (Documento que no es patente 1). Mas espedficamente, en la DMD, la presencia de la mutacion cambia el marco de lectura de los aminoacidos de manera que se suprime la expresion de la protema distrofina funcional, mientras que en la BMD la protema distrofina que funciona, aunque de manera imperfecta, se produce porque se conserva el marco de lectura de los aminoacidos, mientras que una parte de los exones se eliminan por la mutacion.
Se espera que la omision de exon sirva como un metodo para tratar la DMD. Este metodo implica modificar el corte y empalme para restaurar el marco de lectura de aminoacidos del ARNm de la distrofina e inducir la expresion de la protema distrofina que tiene la funcion parcialmente restaurada (Documento que no es patente 2). La parte de la secuencia de aminoacidos, que es un objetivo para la omision de exones, se perdera. Por esta razon, la protema distrofina expresada por este tratamiento se vuelve mas corta que la normal pero como el marco de lectura de aminoacidos se mantiene, la funcion para estabilizar las celulas musculares se retiene parcialmente. Consecuentemente, se espera que la omision de exon conduzca a la DMD a smtomas similares a los de la BMD que es mas leve. El enfoque de omision de exon paso las pruebas en animales con ratones o perros y ahora se evalua en ensayos clmicos en pacientes humanos con DMD.
La omision de un exon puede inducirse mediante la union de acidos nucleicos antisentido que se dirigen al sitio de corte y empalme 5' o 3' o ambos sitios, o sitios internos de los exones. Solo se incluira un exon en el ARNm cuando el complejo del espliceosoma reconozca sus dos sitios de corte y empalme. Asf, la omision de exon puede inducirse mediante la fijacion como objetivos de los sitios de corte y empalme con acidos nucleicos antisentido. Ademas, la union de una protema SR a un potenciador de del corte y empalme exonico (ESE) se considera necesaria para que un exon se reconozca por el mecanismo de corte y empalme. Consecuentemente, la omision de exon tambien puede inducirse mediante la fijacion como objetivo del ESE.
Dado que una mutacion del gen de la distrofina puede variar en dependencia de los pacientes con DMD, los acidos nucleicos antisentido deben disenarse basados en el sitio o el tipo de mutacion genetica respectiva. En el pasado, los acidos nucleicos antisentido que inducen la omision de exon para los 79 exones se produjeron por Steve Wilton, y otros, Universidad de Australia Occidental (Documento que no es patente 3), y los acidos nucleicos antisentido que inducen la omision de exon para 39 exones se produjeron por Annemieke Aartsma-Rus, y otros, Holanda (Documento que no es patente 4).
Se considera que aproximadamente el 13 % de todos los pacientes con DMD pueden tratarse por omision del exon 51 (de aqrn en adelante denominado "exon 51"). En los ultimos anos, una pluralidad de organizaciones de investigacion informaron sobre los estudios en los que el exon 51 en el gen de la distrofina fue objeto de omision de exon (Documentos de patentes del 1 al 7; documentos que no son patentes del 5 al 6). Sin embargo, todavfa no se establece una tecnica de omision del exon 51 con una alta eficiencia.
La patente num. WO2010/048586A1 describe un compuesto antisentido que contiene 20-35 subunidades de morfolino para omitir el exon 51 del ARNm preprocesado de distrofina humana mientras que la patente num. WO2011/154427A1 describe un acido nucleico que codifica un pequeno ARN nuclear (snRNA) capaz de hibridar con las uniones de los sitios de corte y empalme 5' y 3' y con al menos un potenciador de empalme exonico del exon 45 o el exon 51 del pre ARNm de la distrofina.
Documento de la tecnica anterior
Documento de patente
Documento de patente 1: Publicacion internacional num. WO 2004/048570
Documento de patente 2: Publicacion internacional num. WO 2002/024906
Documento de patente 3: Publicacion internacional num. WO 2010/048586
Documento de patente 4: Publicacion internacional num. WO 2010/050801
Documento de patente 5: Patente de los EE.UU. num. US 2010/0168212
Documento de patente 6: Publicacion internacional num. WO2010/048586A1
Documento de patente 7: Publicacion internacional num. WO2011/154427A1
Documento que no es patente 1: Monaco A. P. y otros, Genomics 1988; 2: pag. 90-95
Documento que no es patente 2: Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: pag. 167-172
Documento que no es patente 3: Wilton S. D., y otros, Molecular Therapy 2007: 15: pag. 1288-96
Documento que no es patente 4: Annemieke Aartsma-Rus y otros, (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Documento que no es patente 5: Aoki Y., y otros, Molecular therapy 2010: 18: pag. 1995-2005
Documento que no es patente 6: Nakano S., y otros, Pediatr Int. 2011: 53: 524-429
Descripcion de la invencion
Problemas a resolver por la invencion
En las circunstancias anteriores, se desearon oligomeros antisentido que indujeran la omision del exon 51 en el gen de la distrofina con una alta eficacia y productos terapeuticos de la distrofia muscular que comprenden oligomeros de estos.
Medios para resolver el problema
Como resultado de estudios detallados de los contenidos tecnicos de los documentos anteriores y de la estructura del gen de la distrofina, los presentes inventores encontraron que la omision del exon 51 puede inducirse con una alta eficacia mediante la administracion del oligomero antisentido que tiene las secuencias de nucleotidos representadas por la sec. con num. de ident.: 1 y 2. Con base en este descubrimiento, los presentes inventores lograron la presente invencion.
Es decir, la presente invencion es la siguiente.
[1] Un oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (a) a (d) a continuacion:
(a) un oligomero antisentido que comprende una secuencia de nucleotidos de sec. con num. de ident.: 1 o 2;
(b) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene delecion, sustitucion, insercion y/o adicion de 1 a 5 nucleotidos en la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2, y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana;
(c) un oligomero antisentido que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana; y
(d) un oligomero antisentido que se hibrida en condiciones rigurosas a un oligonucleotido que consiste en una secuencia de nucleotidos complementaria a la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
[2] Un oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (e) a (h) a continuacion:
(e) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2;
(f) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene delecion, sustitucion, insercion y/o adicion de 1 a 3 nucleotidos en la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2, y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana;
(g) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana; y
(h) un oligomero antisentido que se hibrida en condiciones altamente rigurosas a un oligonucleotido que consiste en una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
[3] Un oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en (i) y (j) a continuacion:
un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2; y (j) un oligomero antisentido que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
[4] El oligomero antisentido segun cualquiera de [1] a [3] anterior, que es un oligonucleotido.
[5] El oligomero antisentido de acuerdo con [4] anterior, en donde se modifica el resto azucar y/o la region de union a fosfato de al menos un nucleotido que constituye el oligonucleotido.
[6] El oligomero antisentido de acuerdo con [4] o [5] anteriores, en donde el resto azucar de al menos un nucleotido que constituye el oligonucleotido es una ribosa en la que el grupo 2'-OH se reemplaza por uno seleccionado del grupo que consiste en OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br e I (en donde R es un alquilo o un arilo y R' es un alquileno).
[7] El oligomero antisentido de acuerdo con uno cualquiera de [4] a [6] anteriores, en donde la region de union a fosfato de al menos un nucleotido que constituye el oligonucleotido es cualquiera seleccionado del grupo que consiste en un enlace fosforotioato, un enlace fosforoditioato, un enlace alquilfosfonato, un enlace fosforamidato y un enlace boranofosfato.
[8] El oligomero antisentido de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3] anteriores, que es un oligomero de morfolino.
[9] El oligomero antisentido de acuerdo con [8] anterior, en donde se modifica el resto del anillo de morfolina, la region de union a fosfato, el extremo 3' y/o el extremo 5' de al menos un morfolino que constituya el oligomero de morfolino.
[10] El oligomero antisentido de acuerdo con [9] o [10] anteriores, en donde la region de union a fosfato de al menos un morfolino que constituye el oligomero de morfolino es cualquiera seleccionado de un enlace fosforodiamidato, un enlace fosforotioato, un enlace fosforoditioato, un enlace alquilfosfonato, un enlace fosforamidato y un enlace de boranofosfato.
[11] El oligomero antisentido de acuerdo con [10] anterior, que es un oligomero de morfolino fosforodiamidato.
[12 ] El oligomero antisentido de acuerdo con uno cualquiera del [9] al [11] anteriores, en donde el extremo 5' es cualquiera de las formulas qmmicas de la (1) a la (3) a continuacion:
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[13] Una composition farmaceutica para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende como ingrediente activo el oligomero antisentido de acuerdo con uno cualquiera del [1] al [12] anteriores, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este.
[14] La composicion farmaceutica de acuerdo con [13] anterior, que comprende un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
[15 ] Un metodo para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende administrar a un paciente con distrofia muscular el oligomero antisentido de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [12] anteriores o la composicion farmaceutica de acuerdo con [13] o [14] anteriores.
[16] El metodo para el tratamiento de acuerdo con [15] anterior, en donde el paciente con distrofia muscular es un paciente con deleciones de nucleotidos dentro de los exones 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 o 47­ 50.
[17] El metodo de tratamiento de acuerdo con [15] o [16] anteriores, en donde el paciente es un ser humano.
[18] El uso del oligomero antisentido de acuerdo con uno cualquiera del [1] al [12] anteriores en la fabrication de la composicion farmaceutica para el tratamiento de la distrofia muscular.
[19] El oligomero antisentido de acuerdo con uno cualquiera del [1] al [12] anteriores, para usar en el tratamiento de la distrofia muscular.
[20] El oligomero antisentido de acuerdo con [19] anterior, en donde el paciente con distrofia muscular en dicho tratamiento es un paciente con deleciones de nucleotidos dentro de los exones 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19­ 50, 43-50 o 47-50.
[21] El oligomero antisentido de acuerdo con [19] o [20] anteriores, en donde el paciente es un ser humano.
Efectos de la invention
El oligomero antisentido de la presente invencion puede inducir la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana con una alta eficacia. Ademas, los smtomas de la distrofia muscular de Duchenne pueden aliviarse eficazmente mediante la administration de la composicion farmaceutica de la presente invencion.
Breve description de las figuras
La Figura 1 muestra la eficacia de la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana en la lmea celular de rabdomiosarcoma humano (celulas RD).
Modo de implementar la invencion
De aqu en adelante, la presente invencion se describe en detalle. Se pretende que las modalidades descritas a continuacion se presenten a manera de ejemplo simplemente para describir la invencion pero no se limitan unicamente a las siguientes modalidades. La presente invencion puede implementarse de varias maneras sin apartarse de la esencia de la invencion.
1. Oligomero antisentido
La presente invencion proporciona el oligomero antisentido (de aqu en lo adelante denominado "oligomero antisentido de la presente invencion") que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana con una alta eficacia.
[Exon 51 en el gen de la distrofina humana]
En la presente invencion, el termino "gen" pretende significar un gen genomico e incluye, ademas, ADNc, precursor de ARNm yARNm. Preferentemente, el gen es un precursor de ARNm, es decir, pre ARNm.
En el genoma humano, el gen de la distrofina humana se localiza en el locus Xp21.2. El gen de la distrofina humana tiene un tamano de 2,2 millones de pares de nucleotidos y es el gen mas grande entre los genes humanos conocidos. Sin embargo, las regiones codificantes del gen de la distrofina humana son solo 14 kb, que se distribuyen en 79 exones a lo largo del gen de la distrofina humana (Roberts, RG, y otros, Genomics, 16: 536-538 (1993)). El pre ARNm, que es la transcripcion del gen de la distrofina humana, sufre un corte y empalme para generar un ARNm maduro de 14 kb. Se conoce la secuencia de nucleotidos del gen de la distrofina de tipo salvaje humano (Num. de acceso del GeneBank NM_004006).
La secuencia de nucleotidos del exon 51 en el gen de la distrofina de tipo salvaje humano se representa por la sec. con num. de ident.: 3.
[oligomero antisentido]
El oligomero antisentido de la presente invencion se diseno para provocar la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana, y modificar asf la protema codificada por el gen de la distrofina de tipo DMD en la protema distrofina de tipo BMD. Por consiguiente, el exon 51 en el gen de la distrofina que es el objetivo de la omision del exon por parte del oligomero antisentido incluye tanto los tipos salvajes como los mutantes.
El oligomero antisentido de la presente invencion es espedficamente el oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (a) a (d) a continuacion.
(a) un oligomero antisentido que comprende una secuencia de nucleotidos de sec. con num. de ident.: 1 o 2;
(b) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene delecion, sustitucion, insercion y/o adicion de 1 a 5 nucleotidos en la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2, y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana;
(c) un oligomero antisentido que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana; y
(d) un oligomero antisentido que se hibrida en condiciones rigurosas a un oligonucleotido que consiste en una secuencia de nucleotidos complementaria a la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
Los oligomeros antisentido de (b) a (d) son mutantes del oligomero antisentido de (a) en particular y se pretenden que correspondan a mutaciones del gen de la distrofina de los pacientes, por ejemplo, polimorfismo.
Como otra modalidad, el oligomero antisentido de la presente invencion es espedficamente el oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (k) a (n) a continuacion.
(k) Un oligomero antisentido que comprende la secuencia de nucleotidos mostrada por cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33;
(l) Un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene delecion, sustitucion, insercion y/o adicion de 1 a 5 nucleotidos en la secuencia de nucleotidos mostrada por cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33, y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana;
(m) Un oligomero antisentido que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana; y
(n) Un oligomero antisentido que se hibrida en condiciones rigurosas a un oligonucleotido que consiste en una secuencia de nucleotidos complementaria a la secuencia de nucleotidos mostrada por cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
Los oligomeros antisentido de ( l) a (n) son mutantes del oligomero antisentido de (k) en particular y se pretende que correspondan a mutaciones, del gen de la distrofina de los pacientes, por ejemplo, polimorfismo.
Ademas, el oligomero antisentido de la presente invencion es el oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (o) a (r) a continuacion.
(o) Un oligomero antisentido que consiste en la secuencia de nucleotidos mostrada por cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33;
(p) Un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene delecion, sustitucion, insercion y/o adicion de 1 a 3 nucleotidos en la secuencia de nucleotidos mostrada por cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33, y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana;
(q) Un oligomero antisentido que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana; y
(r) Un oligomero antisentido que se hibrida en condiciones altamente rigurosas a un oligonucleotido que consiste en una secuencia de nucleotidos complementaria a la secuencia de nucleotidos mostrada por cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
Ademas, el oligomero antisentido de la presente invencion es el oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en (i) y (j) a continuacion:
(i) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos de cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33; o
(j) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de cualquiera de las sec. con num. de ident.: de la 6 a la 33 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
Tal como se usa en la presente descripcion, el termino "oligomero antisentido que hibrida en condiciones rigurosas" se refiere, por ejemplo, a un oligomero antisentido que se obtuvo por hibridacion de colonias, hibridacion de placas, hibridacion Southern o lo similar, mediante el uso como una sonda detodo o parte de un oligonucleotido que consiste en una secuencia de nucleotidos complementaria a la secuencia de nucleotidos de, por ejemplo, la sec. con num. de ident.: 1. El metodo de hibridacion que puede usarse incluye metodos descritos en, por ejemplo," Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001," "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997," etc.
Como se usa en la presente descripcion, el termino "condiciones rigurosas" puede ser cualquiera de las condiciones de baja rigurosidad, condiciones de moderada rigurosidad o condiciones de alta rigurosidad. El termino "condicion de baja rigurosidad" es, por ejemplo, SSC 5x, solucion de Denhardt 5x, 0,5 % de SDS, 50 % de formamida a 32 °C. El termino "condicion de rigurosidad moderada" es, por ejemplo, SSC 5x, solucion de Denhardt 5x, 0,5 % de SDS, 50 % de formamida a 42 °C, o SSC 5x, 1 % de SDS, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 50 % de formamida a 42 °C. El termino "condicion de alta rigurosidad" es, por ejemplo, (1) SSC 5x, solucion de Denhardt 5x, 0,5 % de SDS, 50 % de formamida a 50 °C, (2) SSC 0,2x, 0,1 % DE SDS a 60 °C, (3) SSC 0,2X, 0,1 % de SDS a 62 °C, (4) SSC 0,2x, 0,1 % de SDS a 65 °C, o (5) SSC 0,1x, 0,1 % de SDS a 65 °C, pero no se limita a estos. Bajo estas condiciones, se espera que el oligomero antisentido con mayor homologfa se obtenga de manera eficiente a temperaturas mas altas, aunque hay multiples factores que influyen en la rigurosidad de la hibridacion, incluida la temperatura, la concentracion de la sonda, la longitud de la sonda, la fuerza ionica, el tiempo, la concentracion de sal y otros, y los expertos en la tecnica puede seleccionar aproximadamente estos factores para lograr una rigurosidad similar.
Cuando se usan estuches disponibles comercialmente para la hibridacion, por ejemplo, puede usarse un sistema Alkphos Direct Labelling and Detection System (GE Healthcare). En este caso, de acuerdo con el protocolo adjunto, despues del cultivo con una sonda marcada durante la noche, la membrana se lava con un tampon de lavado primario que contiene SDS al 0,1 % (p/v) a 55 °C, para detectar de esta manera el oligomero antisentido hibridado. Alternativamente, cuando la sonda se marca con digoxigenina (DIG) mediante el uso de un reactivo disponible comercialmente (por ejemplo, una mezcla PCR Labelling Mix (Roche Diagnostics), etc.) para producir una sonda basada en la totalidad o parte de la secuencia complementaria de la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 3, la hibridacion puede detectarse con un estuche DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche Diagnostics).
En adicion al oligomero antisentido descrito anteriormente, otro oligomero antisentido que puede hibridarse incluye oligomeros antisentido que tienen 90 % o mas, 91 % o mas, 92 % o mas, 93 % o mas, 94 % o mas, 95 % o mas, 96 % o mas, 97 % o mas, 98 % o mas, 99 % o mas, 99,1 % o mas, 99,2 % o mas, 99,3 % o mas, 99,4 % o mas, 99,5 % o mas, 99,6 % o mas, 99,7 % o mas, 99,8 % o mas, y 99,9 % o mas de identidad con la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2, segun lo calculado por el software de busqueda de homologfa tal como FASTA y BLAST mediante el uso de los parametros predeterminados.
La identidad entre secuencias de nucleotidos puede determinarse mediante el uso de FASTA (Science 227 (4693): 1435­ 1441, (1985)) o del algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) por Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Se desarrollaron programas llamados blastn, blastx, tblastn y tblastx basados en el algoritmo BLAST (Altschul SF, y otros: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Cuando una secuencia de nucleotidos se secuencia mediante el uso de blastn, los parametros son, por ejemplo, puntuacion=100 y longitud de palabra=12. Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parametros predeterminados para cada programa.
El termino "causa la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana" pretende significar que mediante la union del oligomero antisentido de la presente invencion al sitio correspondiente al exon 51 del transcripto (por ejemplo, pre mRNA) del gen de la distrofina humana, por ejemplo, la secuencia de nucleotidos correspondiente al extremo 5' del exon 53 se corta y empalma en la secuencia de nucleotidos correspondiente al extremo 3' del exon 50 en pacientes con DMD con delecion del exon 52 cuando el transcrito sufre un corte y empalme, lo que resulta en la formacion de un ARNm maduro que esta libre de cambio de marco de codon.
En la presente descripcion, el termino "union" descrito anteriormente pretende significar que cuando el oligomero antisentido de la presente invencion se mezcla con la transcripcion del gen de la distrofina humana, ambos se hibridan en condiciones fisiologicas para formar un acido nucleico de doble cadena. El termino "bajo condiciones fisiologicas" se refiere a las condiciones establecidas para imitar el entorno in vivo en terminos de pH, composicion de sal y temperatura. Las condiciones son, por ejemplo, de 25 a 40 °C, preferentemente, 37 °C, pH de 5 a 8, preferentemente, pH 7,4 y 150 mM de concentracion de cloruro de sodio.
Si la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana ocurre o no, puede confirmarse mediante la introduccion del oligomero antisentido de la presente invencion en una celula de expresion de distrofina (por ejemplo, celulas de rabdomiosarcoma humano), mediante la amplificacion de la region que rodea el exon 51 del ARNm del gen de la distrofina humana del ARN total de la celula de expresion de la distrofina por RT-PCR y mediante la realizacion de una PCR anidada o de un analisis de secuencia en el producto amplificado por PCR.
La eficiencia de omision puede determinarse de la siguiente manera. El ARNm para el gen de la distrofina humana se recolecta de las celulas de prueba; en el ARNm, el nivel del polinucleotido "A" de la banda donde se omite el exon 51 y el nivel del polinucleotido "B" de la banda donde no se omite el exon 51 se miden. Mediante el uso de estos valores de medicion de "A" y "B", la eficiencia se calcula mediante la siguiente ecuacion:
Eficiencia de omision (%) = A/(A+B) x 100
Preferentemente, el oligomero antisentido de la presente invencion causa la omision del exon 51 con una eficiencia del 10 % o mas, 20 % o mas, 30 % o mas, 40 % o mas, 50 % o mas, 60 % o mas, 70 % o superior, 80 % o superior, y 90 % o mas. Para el calculo de la eficiencia de omision, puede consultarse la publicacion internacional num. WO2012/029986.
El oligomero antisentido de la presente invencion incluye, por ejemplo, un oligonucleotido, oligomero de morfolino o acido nucleico peptidico (PNA), que tiene una longitud de 16 a 35 nucleotidos. La longitud es, preferentemente, de 19 a 32, de 20 a 31, 21 o 30 nucleotidos y se prefieren oligomeros de morfolino.
El oligonucleotido descrito anteriormente (de aqu en adelante denominado "el oligonucleotido de la presente invencion") es el oligomero antisentido de la presente invencion compuesto de nucleotidos como unidades constituyentes. Tales nucleotidos pueden ser cualquiera de los ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos y nucleotidos modificados.
El nucleotido modificado se refiere a uno que tiene nucleobases, restos de azucar y/o regiones de union a fosfato total o parcialmente modificados, que constituyen el ribonucleotido o desoxirribonucleotido.
En la presente invencion, la nucleobase incluye, por ejemplo, adenina, guanina, hipoxantina, citosina, timina, uracilo y bases modificadas de estas. Los ejemplos de tales bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, pseudouracilo, 3-metiluracilo, dihidrouracilo, 5-alquilcitosinas (por ejemplo, 5-metilcitosina), 5-alquiluracilos (por ejemplo, 5-etiluracilo), 5-halouracilos (5-bromouracilo), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidinas (6-metiluracilo), 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5'-carboximetilaminometilo-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, 1-metiladenina, 1-metilhipoxantina, 2,2-dimetilguanina, 3-metilcitosina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5-metilaminometiluracilo, 5-metilcarbonilmetiluracilo, 5-metiloxiuracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, acido uracil-5-oxietilactico, 2-tiociosina, purina, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, isoguanina, indol, imidazol, xantina, etc.
La modificacion del resto de azucar puede incluir, por ejemplo, modificaciones en la posicion 2' de la ribosa y modificaciones de las otras posiciones del azucar. La modificacion en la posicion 2' de la ribosa incluye el reemplazo del 2'-OH de la ribosa con OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br o I, en donde R representa un alquilo o un arilo y R' representa un alquileno.
La modificacion para las otras posiciones del azucar incluye, por ejemplo, el reemplazo de O en la posicion 4' de la ribosa o desoxirribosa con S, que une entre las posiciones 2' y 4' del azucar, por ejemplo, LNA (acido nucleico bloqueado) o ENA (acidos nucleicos con puentes 2'-O,4'-C-etileno), pero no se limita a estos.
Una modificacion de la region de union a fosfato incluye, por ejemplo, una modificacion de la sustitucion del enlace fosfodiester con un enlace fosforotioato, un enlace fosforoditioato, un enlace alquil fosfonato, un enlace fosforoamidato o un enlace boranofosfato (Enya y otros: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160 ) (cf., por ejemplo, Reediciones nacionales de Japon de las Solicitudes al PCT num. 2006/129594 y 2006/038608).
En esta invencion, el alquilo es, preferentemente, un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 atomos de carbono. Los ejemplos espedficos incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, ferc-pentilo, n-hexilo e isohexilo. El alquilo puede sustituirse opcionalmente. Ejemplos de tales sustituyentes son un halogeno, un alcoxi, ciano y nitro. El alquilo puede sustituirse con de 1 a 3 sustituyentes.
En esta invencion, el cicloalquilo es, preferentemente, un cicloalquilo que tiene de 5 a 12 atomos de carbono. Los ejemplos espedficos incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclodecilo y ciclododecilo.
En esta invencion, el halogeno incluye fluor, cloro, bromo y yodo.
El alcoxi es un alcoxi lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, ferc-butoxi, n-pentiloxi, isopentiloxi, n-hexiloxi, isohexiloxi, etc. Entre otros, se prefiere un alcoxi que tiene de 1 a 3 atomos de carbono.
En esta invencion, el arilo es, preferentemente, un arilo que tiene de 6 a 10 atomos de carbono. Los ejemplos espedficos incluyen fenilo, a-naftilo y p-naftilo. Entre otros, se prefiere el fenilo. El arilo puede sustituirse opcionalmente. Ejemplos de tales sustituyentes son un alquilo, un halogeno, un alcoxi, ciano y nitro. El arilo puede sustituirse con de uno a tres de tales sustituyentes.
En esta invencion, el alquileno es, preferentemente, un alquileno lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 atomos de carbono. Los ejemplos espedficos incluyen metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, 2-(etil) trimetileno y 1 -(metil) tetrametileno.
En esta invencion, el acilo incluye un alcanoflo o aroilo lineal o ramificado. Los ejemplos de alcanoilo incluyen formilo, acetilo, 2-metilacetilo, 2,2-dimetilacetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoilo, 2,2-dimetilpropionilo, hexanoilo, etc. Los ejemplos de aroilo incluyen benzoilo, toluoilo y naftoilo. El aroilo puede sustituirse opcionalmente en posiciones sustituibles y puede sustituirse con un(os) alquilo(s).
Preferentemente, el oligonucleotido de la presente invencion es el oligomero antisentido de la presente invencion que contiene una unidad constituyente representada por la siguiente formula general en donde el grupo -OH en la posicion 2' de la ribosa se sustituye con metoxi y la region de union a fosfato es un enlace fosforotioato:
Figure imgf000008_0001
en donde Base representa una nucleobase.
El oligonucleotido de la presente invencion puede sintetizarse facilmente mediante el uso de varios sintetizadores automaticos (por ejemplo, oligopilot AKTA plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternativamente, la smtesis tambien puede confiarse a una organizacion deterceros (por ejemplo, Promega Inc., Takara Co., o Japan Bio Service Co.), etc.
El oligomero de morfolino de la presente invencion es el oligomero antisentido de la presente invencion que comprende la unidad constituyente representada por la siguiente formula general:
Figure imgf000009_0001
en donde la Base tiene el mismo significado que se definio anteriormente, y,
W representa un grupo mostrado por cualquiera de los siguientes grupos:
Figure imgf000009_0002
en donde X representa -CH2R1, -OCH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 o F;
R1 representa H o un alquilo;
R2 y R3, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa H, un alquilo, un cicloalquilo o un arilo;
Y 1 representa O, S, CH2 o NR1;
Y2 representa O, S o NR1;
Z representa O o S.
Preferentemente, el oligomero de morfolino es un oligomero que comprende una unidad constituyente representada por la formula general a continuation (oligomero de morfolino fosforodiamidato (de aqm en adelante denominado como "PMO")).
Figure imgf000009_0003
en donde Base, R2 y R3 tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
El oligomero de morfolino de la presente invention comprende uno que tiene nucleobases total o parcialmente modificadas, restos de anillo de morfolina, regiones de union a fosfato, extremo 3' y/o extremo 5' que constituyen el oligomero de morfolino.
Una modification de la region de union a fosfato incluye, porejemplo, una modification de la sustitucion con un enlace de fosforodiamidato, un enlace de fosforotioato, un enlace de fosforoditioato, un enlace alquilfosfonato, un enlace de fosforamidato y un enlace boranofosfato (Enya y otros: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2O08, 18, 9154-9160)(cf., por ejemplo, Reediciones nacionales de Japon de las aplicaciones del PCT num. 2006/129594 y 2006/038608).
El oligomero de morfolino puede producirse de acuerdo con, porejemplo, la patente num. WO 1991/009033 o la patente num. WO 2009/064471. En particular, el PMO puede producirse mediante el procedimiento descrito en la patente num. WO 2009/064471 o producirse mediante el proceso que se muestra a continuation.
[Metodo para producir PMO]
Una modalidad de PMO es, por ejemplo, el compuesto representado por la formula general (I) a continuacion (de aqu en en adelante PMO (I)).
Figure imgf000010_0001
en donde Base, R2 y R3 tienen el mismo significado que se definio anteriormente; y,
n es un numero entero dado de 1 a 99, preferentemente, un numero entero de 24 a 34, de 27 a 31 o de 28 a 30, preferentemente, 29.
El PMO (I) puede producirse de acuerdo con un metodo conocido, por ejemplo, puede producirse mediante la realization de los procedimientos en las siguientes etapas.
Los compuestos y reactivos utilizados en las etapas a continuacion no se limitan particularmente siempre que se usan comunmente para preparar PMO.
Ademas, las siguientes etapas pueden llevarse a cabo mediante el metodo de fase liquida o el metodo de fase solida (mediante el uso de sintetizadores automaticos de fase solida disponibles comercialmente o manuales). Al producir PMO por el metodo de fase solida, se desea usar sintetizadores automaticos en vista de procedimientos de operation simples y smtesis precisa.
(1) Etapa A:
El compuesto representado por la formula general (II) a continuacion (de aqu en adelante denominado Compuesto (II)) se hace reaccionar con un acido para preparar el compuesto representado por la formula general (III) a continuacion (de aqu en adelante denominado Compuesto (III)):
Figure imgf000010_0002
en donde n, R2 y R3 tienen el mismo significado que se definio anteriormente;
cada BP representa independientemente una nucleobase que puede protegerse opcionalmente;
T representa tritilo, monometoxitritilo o dimetoxitritilo; y,
L representa hidrogeno, un acilo o un grupo representado por la formula general (IV) a continuacion (de aqu en adelante denominado grupo (IV)).
Figure imgf000010_0003
La "nucleobase" para BP incluye la misma "nucleobase" que en la Base, siempre que el grupo amino o hidroxi en la nucleobase mostrada por BP se proteja. Tal grupo protector para amino no se limita particularmente siempre que se use como un grupo protector para acidos nucleicos. Los ejemplos espedficos incluyen benzoflo, 4-metoxibenzoilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, fenilacetilo, fenoxiacetilo, 4-terc-butilfenoxiacetilo, 4-isopropilfenoxiacetilo y (dimetilamino)metileno. Los ejemplos espedficos del grupo protector para el grupo hidroxi incluyen 2-cianoetilo, 4-nitrofenetilo, fenilsulfoniletilo, metilsulfoniletilo y trimetilsililetilo, y fenilo, que puede sustituirse por de 1 a 5 grupos de extraccion de electrones en posiciones sustituibles opcionales, difenilcarbamoilo, dimetilcarbamoilo, dietilcarbamoilo, metilfenilcarbamoilo, 1 -pirolidinilcarbamoilo, morfolinocarbamoilo, 4-(terc-butilcarboxi) bencilo, 4-[(dimetilamino)carboxi] bencilo y 4-(fenilcarboxi)bencilo, (cf., porejemplo, patente num. WO 2009/064471).
El "vehmulo solido" no se limita particularmente siempre que sea un vehmulo utilizable para la reaccion en fase solida de los acidos nucleicos. Se desea que el vehmulo solido tenga las siguientes propiedades: por ejemplo, (i) es escasamente soluble en reactivos que pueden usarse para la smtesis de derivados de acido nucleico de morfolino (por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, tetrazol, A/-metilimidazol, piridina, antndrido acetico, lutidina, acido trifluoroacetico); (ii) es qmmicamente estable a los reactivos utilizables para la smtesis de derivados de acido nucleico de morfolino; (iii) puede modificarse qmmicamente; (iv) puede cargarse con los derivados de acido nucleico de morfolino deseados; (v) tiene una resistencia suficiente para soportar alta presion a traves de tratamientos; y (vi) tiene un intervalo de diametro de partmula y distribucion uniforme. Espedficamente, poliestireno hinchable (por ejemplo, resina de aminometil poliestireno 1 % de divinilbenceno reticulado (200-400 mesh) (2,4-3,0 mmol/g) (fabricado porTokyo Chemical Industry), Resina de poliestireno aminometilado HCl [divinilbenceno 1 %, 100-200 mesh] (fabricado por Peptide Institute, Inc.), poliestireno no hinchable (por ejemplo, Primer Support (fabricado por GE Healthcare)), poliestireno unido a la cadena PEG (por ejemplo, resina de NH2-PEG (fabricada por Watanabe Chemical Co.), resina TentaGel), vidrio de poro controlado (vidrio de poro controlado; CPG) (fabricado por, porejemplo, CPG), vidrio de poro controlado con oxalilo (cf., porejemplo, Alul y otros, Nucleic Acids Research, vol. 19, 1527 (1991)), soporte de TentaGel-soporte derivatizado de aminopolietilenglicol (por ejemplo, Wright y otros, cf., Tetrahedron Letters,vol. 34, 3373 (1993) y un copolfmero de poros-poliestireno/divinilbenceno.
Un "enlazador" que puede usarse es un enlazador conocido que se use generalmente para enlazar acidos nucleicos o derivados de acidos nucleicos de morfolino. Los ejemplos incluyen 3-aminopropilo, succinilo, 2,2'-dietanosulfonilo y un alquil amino de cadena larga (LCAA).
Esta etapa puede realizarse al hacer reaccionar el Compuesto (II) con un acido.
El "acido" que puede usarse en esta etapa incluye, por ejemplo, acido trifluoroacetico, acido dicloroacetico y acido tricloroacetico. El acido utilizado esta apropiadamente en un intervalo de, por ejemplo, 0,1 equivalentes molares a 1000 equivalentes molares basados en 1 mol de Compuesto (II), preferentemente, en un intervalo de 1 equivalente molar a 100 equivalentes molares basados en 1 mol de Compuesto (II).
Puede usarse una amina organica en combinacion con el acido descrito anteriormente. La amina organica no se limita particularmente e incluye, por ejemplo, trietilamina. La cantidad de amina organica utilizada esta apropiadamente en un intervalo de, porejemplo, 0,01 equivalentes molares a 10 equivalentes molares y, preferentemente, en un intervalo de 0,1 equivalentes molares a 2 equivalentes molares, basado en 1 mol de acido.
Cuando se usa una sal o mezcla del acido y la amina organica en esta etapa, la sal o mezcla incluye, por ejemplo, una sal o mezcla de acido trifluoroacetico y trietilamina, y mas espedficamentealentes de acido1 equivalente de trietilamina y 2 equivalentes de acido trifluoroacetico.
El acido que puede usarse en esta etapa puede usarse, ademas, en forma de una dilucion con un solvente apropiado en una concentracion de 0,1 % a 30 %. El solvente no se limita particularmente en la medida en que es inerte a la reaccion e incluye, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, un alcohol (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), agua o una mezcla de estos.
La temperatura de reaccion en la reaccion descrita anteriormente esta, preferentemente, en un intervalo de porejemplo, 10 °C a 50 °C, con mayor preferencia, en un intervalo de 20 °C a 40 °C, y con la maxima preferencia, en un intervalo de 25 °C a 35 °C.
El tiempo de reaccion puede variar en dependencia del tipo de acido usado y la temperatura de reaccion, y esta en un intervalo apropiado de 0,1 minutos a 24 horas en general y, preferentemente, en un intervalo de 1 minuto a 5 horas.
Despues de completar esta etapa, puede adicionarse una base, si es necesario, para neutralizar el acido que permanece en el sistema. La "base" no se limita particularmente e incluye, por ejemplo, diisopropilamina. La base puede usarse, ademas, en forma de una dilucion con un solvente apropiado en una concentracion de 0,1 % (v/v) a 30 % (v/v).
El solvente usado en esta etapa no se limita particularmente siempre que sea inerte a la reaccion e incluya diclorometano, acetonitrilo, un alcohol (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), agua y una mezcla de estos. La temperatura de reaccion esta, preferentemente, en un intervalo de, porejemplo, 10 °C a 50 °C, con mayor preferencia, en un intervalo de 20 °C a 40 °C, y con la maxima preferencia, en un intervalo de 25 °C a 35 °C.
El tiempo de reaction puede variar segun el tipo de base usada y la temperatura de reaction, y esta en un intervalo apropiado de 0,1 minutos a 24 horas en general y, preferentemente, en un intervalo de 1 minuto a 5 horas.
En el Compuesto (II), el compuesto de formula general (IIa) a continuation (de aqu en adelante Compuesto (IIa)), en donde n es 1 y L es un grupo (IV), puede producirse mediante el siguiente procedimiento.
Figure imgf000012_0001
en donde BP, T, el enlazador y el veticulo solido tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
Etapa 1:
El compuesto representado por la formula general (V) a continuacion se hace reaccionar con un agente acilante para preparar el compuesto representado por la formula general (VI) a continuacion (de aqu en adelante denominado Compuesto (VI)).
Figure imgf000012_0004
en donde BP, T y el enlazador tienen el mismo significado que se definio anteriormente; y,
R4 representa hidroxi, un halogeno, un grupo carboxilo o amino.
Esta etapa puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos para introducir enlazadores, mediante el uso del Compuesto (V) como material de partida.
En particular, el compuesto representado por la formula general (VIa) a continuacion puede producirse al realizar el metodo conocido como esterification, mediante el uso del Compuesto (V) y el anhidrido sucdnico.
Figure imgf000012_0002
en donde BP y T tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
Etapa 2:
El Compuesto (VI) reacciona con un vehiculo solido por un agente de condensation para preparar el Compuesto (IIa).
Figure imgf000012_0003
en donde BP, R4, T, el enlazador y el vehiculo solido tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
Esta etapa puede realizarse mediante el uso del Compuesto (VI) y un vehnculo solido de acuerdo con un proceso conocido como reaccion de condensacion.
En el Compuesto (II), el compuesto representado por la formula general (IIa2) a continuacion, donde n es de 2 a 99 (preferentemente, un numero entero dado de 25 a 35, de 28 a 32, o de 29 a 31, preferentemente, 30) y L es un grupo representado mediante la formula general (IV) puede producirse mediante el uso del Compuesto (IIa) como material de partida y mediante la repeticion de la etapa A y ela etapa B del metodo de produccion de PMO descrito en la especificacion para un numero deseado de veces.
Figure imgf000013_0001
en donde BP, R2, R3, T, el enlazador y el vehfculo solido tienen el mismo significado que el definido anteriormente; y, n' representa de 1 a 98 (en una modalidad espedfica, n' es de 1 a 34, de 1 a 33, de 1 a 32, de 1 a 31, de 1 a 30, de 1 a 29, de 1 a 28, de 1 a 27, de 1 a 26, de 1 a 25, de 1 a 24).
(2) Etapa B
El compuesto (III) se hace reaccionar con un compuesto de monomero de morfolino en presencia de una base para preparar el compuesto representado por la formula general (VII) a continuacion (de aqrn en adelante denominado Compuesto (VII)):
Figure imgf000013_0002
en donde BP, L, n, R2, R3 y T tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
Esta etapa puede realizarse al hacer reaccionar el Compuesto (III) con el compuesto de monomero de morfolino en presencia de una base.
El compuesto de monomero de morfolino incluye, por ejemplo, los compuestos representados por la formula general (VIII) a continuacion:
Figure imgf000014_0001
en donde BP, R2, R3 y T tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
La "base" que puede usarse en esta etapa incluye, por ejemplo, diisopropilamina, trietilamina y N-etilmorfolina. La cantidad de la base usada esta apropiadamente en un intervalo de 1 equivalente molar a 1000 equivalentes molares basados en 1 mol del Compuesto (III), preferentemente, de 10 equivalentes molares a 100 equivalentes molares basados en 1 mol del Compuesto (III).
El compuesto de monomero de morfolino y la base que pueden usarse en esta etapa pueden usarse, ademas, como una dilution con un solvente apropiado en una concentration de 0,1 % a 30 %. El solvente no se limita particularmente en la medida en que es inerte a la reaction e incluye, por ejemplo, N,N-dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, DMF, diclorometano, acetonitrilo, tetrahidrofurano o una mezcla de estos.
La temperatura de reaccion esta, preferentemente, en un intervalo de, por ejemplo, de 0 °C a 100 °C, y con mayor preferencia, en un intervalo de 10 °C a 50 °C.
El tiempo de reaccion puede variar segun el tipo de base utilizada y la temperatura de reaccion, y esta en un intervalo apropiado de 1 minuto a 48 horas en general y, preferentemente, en un intervalo de 30 minutos a 24 horas.
Ademas, despues de completar esta etapa, puede adicionarse un agente acilante, si es necesario. El "agente acilante" incluye, por ejemplo, anhidrido acetico, cloruro de acetilo y anhidrido fenoxiacetico. El agente acilante puede usarse, ademas, como una dilucion con un solvente apropiado en una concentracion de 0,1 % a 30 %. El solvente no se limita particularmente en la medida en que es inerte a la reaccion e incluye, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, tetrahidrofurano y alcohol(es) (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), agua o una mezcla de estos.
Si es necesario, una base como piridina, lutidina, colidina, trietilamina, diisopropiletilamina, N-etilmorfolina, etc. puede usarse, ademas, en combination con el agente acilante. La cantidad de agente acilante esta apropiadamente en un intervalo de 0,1 equivalentes molares a 10000 equivalentes molares y, preferentemente, en un intervalo de 1 equivalente molar a 1000 equivalentes molares. La cantidad de la base esta apropiadamente en un intervalo de, por ejemplo, 0,1 equivalentes molares a 100 equivalentes molares y, preferentemente, en un intervalo de 1 equivalente molar a 10 equivalentes molares, basado en 1 mol del agente acilante.
La temperatura de reaccion en esta reaccion esta, preferentemente, en un intervalo de 10 °C a 50 °C, con mayor preferencia, en un intervalo de 10 °C a 50 °C, con mucha mayor preferencia, en un intervalo de 20 °C a 40 °C, y con la maxima preferencia, en un intervalo de 25 °C a 35 °C. El tiempo de reaccion puede variar segun el tipo de agente acilante usado y la temperatura de reaccion, y esta en un intervalo apropiado de 0,1 minutos a 24 horas en general y, preferentemente, en un intervalo de 1 minuto a 5 horas.
(3) Etapa C:
En el Compuesto (VII) producido en el Paso B, el grupo protector se elimina mediante el uso de un agente de desproteccion para preparar el compuesto representado por la formula general (IX).
Figure imgf000014_0002
en donde Base, BP, L, n, R2, R3 y T tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
Esta etapa puede realizarse al hacer reaccionar el Compuesto (VII) con un agente de desproteccion.
El "agente de desproteccion" incluye, por ejemplo, metilamina y agua amoniacal concentrada. El "agente de desproteccion" usado en esta etapa puede usarse, ademas, como una dilucion con, por ejemplo, agua, metanol, etanol, alcohol isopropflico, acetonitrilo, tetrahidrofurano, DMF, N,N-dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, o una mezcla de estos solventes. Entre ellos, se prefiere el etanol. La cantidad del agente de desproteccion utilizado esta apropiadamente en un intervalo de 1 equivalente molar a 100000 equivalentes molares y, preferentemente, en un intervalo de 10 equivalentes molares a 1000 equivalentes molares, basado en 1 mol del Compuesto (VII).
La temperatura de reaction esta apropiadamente en un intervalo de 15 °C a 75 °C, preferentemente, en un intervalo de 40 °C a 70 °C, y con mayor preferencia, en un intervalo de 50 °C a 60°C. El tiempo de reaccion para la desproteccion puede variar en dependencia del tipo de Compuesto (VII), la temperatura de reaccion, etc., y esta apropiadamente en un intervalo de 10 minutos a 30 horas, preferentemente, de 30 minutos a 24 horas, y con mayor preferencia en un intervalo de 5 horas a 20 horas.
(4) Etapa D:
El PMO (I) se produce al hacer reaccionar el Compuesto (IX) producido en la etapa C con un acido:
Figure imgf000015_0001
en donde Base, n, R2, R3y T tienen el mismo significado que se definio anteriormente.
Esta etapa puede realizarse mediante la adicion de un acido al Compuesto (IX).
El "acido" que puede usarse en esta etapa incluye, por ejemplo, acido tricloroacetico, acido dicloroacetico, acido acetico, acido fosforico, acido clorhidrico, etc. El acido usado se usa apropiadamente para permitir que la solution tenga un intervalo de pH de 0,1 a 4,0, y con mayor preferencia, en un intervalo de pH 1,0 a 3,0. El solvente no se limita particularmente siempre que sea inerte a la reaccion e incluya, por ejemplo, acetonitrilo, agua o una mezcla de estos solventes.
La temperatura de reaccion esta apropiadamente en un intervalo de 10 °C a 50 °C, preferentemente, en un intervalo de 20 °C a 40 °C, y con mayor preferencia, en un intervalo de 25 °C a 35 °C. El tiempo de reaccion para la desproteccion puede variar en dependencia del tipo de Compuesto (IX), la temperatura de reaccion, etc., y esta apropiadamente en un intervalo de 0,1 minutos a 5 horas, preferentemente, de 1 minuto a 1 hora, y con mayor preferencia en un intervalo de 1 minuto a 30 minutos.
El PMO (I) puede obtenerse mediante el sometimiento de la mezcla de reaccion obtenida en esta etapa a medios convencionales de separation y purification, como extraction, concentration, neutralization, filtration, separation centrifuga, recristalizacion, cromatografia en columna de fase inversa de C8 a C i8, cromatografia en columna de intercambio cationico, cromatografia en columna de intercambio anionico, cromatografia en columna de filtracion en gel, cromatografia fiquida de alta resolution, dialisis, ultrafiltracion, etc., solos o en combination de estos. Asi, el PMO (I) deseado puede aislarse y purificarse (cf., por ejemplo, en la patente num. WO 1991/09033).
En la purificacion de PMO (I) mediante el uso de cromatografia de fase reversa, por ejemplo, puede usarse una mezcla de solucion de tampon de trietilamina/acetato 20 mM y acetonitrilo como solvente de elucion.
En la purificacion de PMO (I) mediante el uso de cromatografia de intercambio ionico, por ejemplo, puede usarse una mezcla de solucion salina 1 M y solucion acuosa de hidroxido de sodio 10 mM como solvente de elucion.
Un acido nucleico pepfidico es el oligomero de la presente invention que tiene un grupo representado por la siguiente formula general como unidad constituyente:
Figure imgf000016_0001
en donde la Base tiene el mismo significado que se definio anteriormente.
Los acidos nucleicos peptidicos pueden prepararse segun la referencia de, porejemplo, las siguientes literaturas.
1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)
2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)
3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994) 4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995) 5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
En el oligomero de la presente invention, el extremo 5' puede ser cualquiera de las estructuras qmmicas de la (1) a la (3) a continuation y, preferentemente, es (3)-OH.
Figure imgf000016_0002
En lo sucesivo, los grupos mostrados por (1), (2) y (3) anteriores se denominan "Grupo (1)", "Grupo (2)" y "Grupo (3)", respectivamente.
2. Composition farmaceutica
El oligomero de la presente invencion provoca la omision del exon 51 con una mayor eficacia en comparacion con los oligomeros antisentido de la tecnica anterior. Asi, se espera que las condiciones de distrofia muscular puedan aliviarse con una alta eficiencia mediante la administration de la composicion farmaceutica que comprende el oligomero de la presente invencion a pacientes con DMD, que tienen una mutation que se convierte a en marco al omitirel exon 51, por ejemplo, pacientes con deletion del exon 29-50, pacientes con deletion del exon 50, pacientes con deletion del exon 45­ 50, pacientes con delecion del exon 48-50, pacientes con delecion del exon 49-50, pacientes con delecion del exon 52, pacientes con delecion del exon 52-63, pacientes con delecion del exon 13-50, pacientes con delecion del exon 19-50, pacientes con delecion del exon 43-50, o pacientes con delecion del exon 47-50. Por ejemplo, cuando se usa la composicion farmaceutica que comprende el oligomero de la presente invencion, pueden lograrse los mismos efectos terapeuticos incluso en una dosis mas pequena que la de los oligomeros de la tecnica anterior. Consecuentemente, los efectos secundarios pueden aliviarse y esto es economico.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona la composicion farmaceutica para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende como ingrediente activo el oligomero de la presente invencion, una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este (de aqm en adelante denominada "la composicion de la presente invencion"). Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende administrar a un paciente con DMD el oligomero de la presente invencion.
En dicho metodo de tratamiento, el oligomero de la presente invencion puede administrarse como la composicion farmaceutica para el tratamiento de la distrofia muscular.
Ademas, la presente invencion proporciona el uso del oligomero de la presente invencion en la fabricacion de la composicion farmaceutica para el tratamiento de la distrofia muscular y el oligomero de la presente invencion aplicado para el tratamiento de la distrofia muscular.
Ejemplos de la sal farmaceuticamente aceptable del oligomero de la presente invencion contenida en la composicion de la presente invencion son sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, potasio y litio; sales de metales alcalinoterreos tales como sales de calcio y magnesio; sales metalicas tales como sales de aluminio, hierro, zinc, cobre, rnquel, cobalto, etc.; sales de amonio; sales de aminas organicas tales como sales de t-octilamina, dibencilamina, morfolina, glucosamina, ester alqmlico de fenilglicina, etilendiamina, N-metilglucamina, guanidina, dietilamina, trietilamina, diciclohexilamina, N, N'-dibenciletilendiamina, cloroprocama, procama, dietanolamina, N-bencilfenetilamina, piperazina, tetrametilamonio, tris(hidroximetil)aminometano; sales de hidrohaluro tales como sales de hidrofluoratos, hidrocloruros, bromhidratos e hidroyoduros; sales de acidos inorganicos tales como nitratos, percloratos, sulfatos, fosfatos, etc.; sulfonatos de alcano inferior tales como metanosulfonatos, trifluorometanosulfonatos y etanosulfonatos; arilsulfonatos tales como bencenosulfonatos y p-toluenosulfonatos; sales de acidos organicos tales como acetatos, malatos, fumaratos, succinatos, citratos, tartaratos, oxalatos, maleatos, etc.; y sales de aminoacidos tales como sales de glicina, lisina, arginina, ornitina, acido glutamico y acido aspartico. Estas sales pueden producirse por metodos conocidos. Alternativamente, el oligomero de la presente invencion contenido en la composicion de la presente invencion puede estar en forma de un hidrato de este.
La via de administracion para la composicion de la presente invencion no se limita particularmente siempre que sea una via de administracion farmaceuticamente aceptable, y puede elegirse en dependencia del metodo de tratamiento. En vista de la facilidad de administracion en los tejidos musculares, se prefieren la administracion intravenosa, la administracion intraarterial, la administracion intramuscular, la administracion subcutanea, la administracion oral, la administracion de tejidos, la administracion transdermica, etc. Ademas, las formas de dosificacion que estan disponibles para la composicion de la presente invencion no se limitan particularmente, e incluyen, por ejemplo, diversas inyecciones, agentes orales, gotas, inhalaciones, pomadas, lociones, etc.
En la administracion del oligomero de la presente invencion a pacientes con distrofia muscular, la composicion de la presente invencion puede contener un vehnculo para promover el suministro del oligomero a los tejidos musculares. Tal vehnculo no se limita particularmente en la medida en que es farmaceuticamente aceptable, y los ejemplos incluyen vehnculos cationicos tales como liposomas cationicos, polfmeros cationicos, etc., o vehnculos que usan envoltura viral. Los liposomas cationicos son, por ejemplo, liposomas compuestos de 2-O(2-dietilaminoetil)carabamoil-1,3-O-dioleoilglicerol y fosfolfpidos como los constituyentes esenciales (de aqrn en adelante denominado "liposoma A"), Oligofectamina (marca registrada) (fabricada por Invitrogen Corp.), Lipofectina (marca registrada) (fabricada por Invitrogen Corp.), Lipofectamina (marca registrada) (fabricada por Invitrogen Corp.), Lipofectamina 2000 (marca registrada) (fabricada por Invitrogen Corp.), DMRIE-C (marca registrada) (fabricada por Invitrogen Corp.), GeneSilencer (marca registrada) (fabricada por Gene Therapy Systems), TransMessenger (marca registrada) (fabricada por QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (marca registrada) (fabricada por Mirus ) y Nucleofector II (Lonza). Entre otros, se prefiere el liposoma A. Ejemplos de polfmeros cationicos son JetSI (marca registrada) (fabricada por Qbiogene, Inc.) y Jet-PEI (marca registrada) (polietilenimina, fabricada por Qbiogene, Inc.). Un ejemplo de vehnculos que usan envolturas virales es GenomeOne (marca registrada) (liposoma HVJ-E, fabricado por Ishihara Sangyo). Alternativamente, los dispositivos medicos descritos en la patente japonesa num. 2924179 y los vehnculos cationicos descritos en la Reedicion nacional de Japon de las patentes del PCT num. 2006/129594 y 2008/096690 tambien pueden usarse.
Para mas detalles, la patente de los EE.UU. num 4.235.871, la patente de los EE.UU. num. 4.737.323, la patente num. WO96/14057, "New Rr C, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) paginas 33-104", etc. puede referirse,
Una concentracion del oligomero de la presente invencion contenida en la composicion de la presente invencion puede variar en dependencia del tipo de vehnculo, etc., y esta apropiadamente en un intervalo de 0,1 nM a 100 pM, preferentemente, en un intervalo de 100 nM a 10 pM. Una relacion en peso del oligomero de la presente invencion contenida en la composicion de la presente invencion y el vehnculo (vehuculo/oligomero antisentido de la presente invencion) puede variar en dependencia de la propiedad del oligomero, el tipo de vehnculo, etc., y esta apropiadamente en un intervalo de 0,1 a 100, preferentemente, en un intervalo de 0,1 a 10.
En adicion al oligomero de la presente invencion y el vehnculo descrito anteriormente, los aditivos farmaceuticamente aceptables pueden formularse opcionalmente, ademas, en la composicion de la presente invencion. Ejemplos de tales aditivos son los adyuvantes de emulsificacion (por ejemplo, acidos grasos que tienen de 6 a 22 atomos de carbono y sus sales farmaceuticamente aceptables, albumina y dextrano), estabilizadores (por ejemplo, colesterol y acido fosfatfdico), agentes isotonizantes (por ejemplo, cloruro de sodio, glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa) y agentes de control del pH (por ejemplo, acido clorhndrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido acetico, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio y trietanolamina). Pueden usarse uno o mas de estos aditivos. El contenido del aditivo en la composicion de la presente invencion es apropiadamente del 90 % en peso o menos, preferentemente, del 70 % en peso o menos y con mayor preferencia, del 50 % en peso o menos.
La composicion de la presente invencion puede prepararse mediante la adicion del oligomero de la presente invencion a una dispersion del vehnculo a y la agitacion adecuada de la mezcla. Los aditivos pueden adicionarse en una etapa apropiada antes o despues de la adicion del oligomero de la presente invencion. Un solvente acuoso que puede usarse para adicionar el oligomero de la presente invencion no se limita particularmente en la medida en que es farmaceuticamente aceptable, y los ejemplos son agua inyectable o agua destilada inyectable, fluido electrolftico tal como solucion salina fisiologica, etc., tales como fluido de glucosa, fluido de maltosa, etc. Un experto en la materia puede elegir adecuadamente las condiciones de pH y temperatura para tal materia.
La composicion de la presente invencion puede prepararse en, porejemplo, una forma lfquida y su preparacion liofilizada. La preparacion liofilizada puede prepararse mediante la liofilizacion de la composicion de la presente invencion en una forma lfquida de una manera convencional. La liofilizacion puede realizarse, por ejemplo, al esterilizar apropiadamente la composicion de la presente invencion en forma lfquida, dispensar una alfcuota en un contenedor de vial, realizar una congelacion preliminar durante 2 horas en condiciones de aproximadamente -40 a -20 °C, realizar un secado primario de aproximadamente 0 a 10 °C bajo presion reducida, y luego realizar un secado secundario de aproximadamente 15 a 25 °C bajo presion reducida. En general, la preparacion liofilizada de la composicion de la presente invencion puede obtenerse mediante el reemplazo del contenido del vial con gas nitrogeno ytapando.
La preparacion liofilizada de la composicion de la presente invencion puede usarse en general despues de la reconstitucion mediante la adicion de una solucion adecuada opcional (lfquido de reconstitucion) y la redisolucion de la preparacion. Tal lfquido de reconstitucion incluye agua inyectable, solucion salina fisiologica y otros fluidos de infusion. Un volumen del lfquido de reconstitucion puede variar en dependencia del uso previsto, etc., no se limita particularmente y es adecuadamente de 0,5 a 2 veces mayor que el volumen antes de la liofilizacion o no mas de 500 mL.
Se desea controlar una dosis de la composicion de la presente invencion a ser administrada, al tener en cuenta los siguientes factores: el tipo y la forma de dosificacion del oligomero de la presente invencion contenida; condiciones de los pacientes que incluyen la edad, peso corporal, etc.; ruta de administracion; y las caractensticas y extension de la enfermedad. Una dosis diaria calculada como la cantidad del oligomero antisentido de la presente invencion esta generalmente en un intervalo de 0,1 mg a 10 g/humano y, preferentemente, de 1 mg a 1 g/humano. Este intervalo numerico puede variar ocasionalmente en dependencia del tipo de enfermedad objetivo, la via de administracion y la molecula objetivo. Por lo tanto, una dosis mas baja que el intervalo puede ser suficiente en alguna ocasion y, a la inversa, una dosis mas alta que el intervalo puede ser requerida ocasionalmente. La composicion puede administrarse de una vez a varias veces al dfa o a intervalos de un dfa a varios dfas.
En otra modalidad mas de la composicion de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un vector capaz de expresar el oligonucleotido de la presente invencion y el vehnculo descrito anteriormente. Tal vector de expresion puede ser un vector capaz de expresar una pluralidad de los oligonucleotidos de la presente invencion. La composicion puede formularse con aditivos farmaceuticamente aceptables como en el caso de que la composicion de la presente invencion contenga el oligomero de la presente invencion. Una concentracion del vector de expresion contenida en la composicion puede variar en dependencia del tipo de vehnculo, etc., y esta apropiadamente en un intervalo de 0,1 nM a 100 pM, preferentemente, en un intervalo de 100 nM a 10 pM. Una relacion en peso del vector de expresion contenido en la composicion y el vetnculo (vehnculo/vector de expresion) puede variar en dependencia de la propiedad del vector de expresion, el tipo de vetnculo, etc., y esta apropiadamente en un intervalo de 0,1 a 100, preferentemente, en un intervalo de 0,1 a 10. El contenido del vetnculo contenido en la composicion es el mismo que en el caso de que la composicion de la presente invencion contenga el oligomero de la presente invencion, y un metodo para producir el mismo tambien es el mismo que en el caso de la composicion de la presente invencion.
De aqrn en adelante, la presente invencion se describira con mas detalle con referencia a los EJEMPLOS y a los EJEMPLOS DE PRUEBA a continuacion, pero no se considera que se limite a estos.
EJEMPLOS
[Ejemplo de referencia 1]
Acido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de amino poliestireno
Etapa 1: Produccion de acido 4-{[(2S, 6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoxi}-4-oxobutanoico
Bajo atmosfera de argon, 3,44 g de N-{1-[(2R, 6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il] -2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida y 1,1 g de 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) se suspendieron en 50 mL de diclorometano y se adicionaron a la suspension 0,90 g de antndrido succmico, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 3 horas. A la mezcla de reaccion se le adicionaron 10 mL de metanol, y la mezcla se concentro a presion reducida. El residuo se extrajo mediante el uso de acetato de etilo y una solucion acuosa de dihidrogenofosfato de potasio 0,5 M. La capa organica resultante se lavo secuencialmente con una solucion acuosa de dihidrogenofosfato de potasio 0,5 M, agua y salmuera en el orden mencionado. La capa organica resultante se seco sobre sulfato de sodio y se concentro a presion reducida para dar 4,0 g del producto.
Etapa 2; Produccion de acido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de amino poliestireno
Despues de que se disolvieron 4,0 g de acido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoxi}-4-oxobutanoico en 200 mL de piridina (deshidratada), se adicionaron a la solucion 0,73 g de 4-DMAP y 11,5 g de clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida. Despues, se adicionaron a la mezcla 25,0 g de resina de amino poliestireno, Primer support 200 amino (fabricada por GE Healthcare Japan Co., Ltd., 17-5214-97) y 8,5 mL de trietilamina, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 4 dfas. Una vez completada la reaccion, la resina se retiro por filtracion. La resina resultante se lavo secuencialmente con piridina, metanol y diclorometano en el orden mencionado, y se seco a presion reducida. A la resina resultante se adicionaron 200 mL de tetrahidrofurano (deshidratado), 15 mL de antudrido acetico y 15 mL de 2,6-lutidina, y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina se retiro por filtracion, se lavo secuencialmente con piridina, metanol y diclorometano en el orden mencionado y se seco a presion reducida para dar 26,7 g del producto.
La cantidad de carga del producto se determino a partir de la cantidad molar de tritilo por g de resina mediante la medicion de la absorbancia de UV a 409 nm mediante el uso de un metodo conocido. La cantidad de carga de la resina era 192,2 pmol/g.
Condiciones de medicion de UV
Aparato: U-2910 (Hitachi, Ltd.)
Solvente: acido metanosulfonico
Longitud de onda: 265 nm
valor de e: 45000
De acuerdo con las descripciones de los EJEMPLOS 1, 2 y el EJEMPLO DE REFERENCIA 1 a continuacion, se sintetizaron los PMO mostrados por los PMO num. 1-3 en la TABLA 1. El PMO sintetizado se disolvio en agua para inyeccion (fabricada porOtsuka Pharmaceutical Factory, Inc.).
[Tabla 1]
Figure imgf000019_0001
[Ejemplo 1]
PMO num. 1
0,2 g de acido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamida-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoxi} 4-oxobutanoico soportado en una resina de aminopoliestireno (Ejemplo de referencia 1) (26 pmol) se lleno en una columna con una punta de filtro. Despues, el ciclo sintetico que se muestra a continuacion se inicio con una maquina de smtesis de acidos nucleicos (AKTA Oligopilot 10 plus). El compuesto de monomero de morfolino deseado se adiciono en cada ciclo de acoplamiento para dar la secuencia de nucleotidos del compuesto del titulo (consulte la Tabla 2 a continuacion).
[Tabla 2]
Figure imgf000020_0001
La solucion de desbloqueo usada fue una solucion de diclorometano que contema acido trifluoroacetico al 3 % (p/v). La solucion neutralizadora y de lavado usada fue una solucion que se obtuvo mediante la disolucion de N,N-diisopropiletilamina en 10 % (v/v) y tetrahidrofurano en 5 % (v/v) en diclorometano que contema 35 % (v/v) de acetonitrilo. La solucion de acoplamiento A usada fue una solucion que se obtuvo mediante la disolucion del compuesto de monomero de morfolino en tetrahidrofurano hasta 0,10 M. La solucion de acoplamiento B usada fue una solucion que se obtuvo mediante la disolucion de N,N-diisopropiletilamina hasta 20 % (v/v) y tetrahidrofurano hasta 10 % (v/v) en acetonitrilo. La solucion de tapado usada fue una solucion que se obtuvo mediante la disolucion de 20 % (v/v) de anhfdrido acetico y 30 % (v/v) de 2,6-lutidina en acetonitrilo.
La resina de aminopoliestireno cargada con el PMO sintetizado anteriormente se recupero del recipiente de reaccion y se seco a temperatura ambiente durante al menos 2 horas a presion reducida. El PMO seco cargado en la resina de aminopoliestireno se cargo en un recipiente de reaccion, y se le adicionaron 5 mL de amoniaco agua-etanol (1/4) al 28 %. La mezcla se agito a 55 °C durante 15 horas. La resina de aminopoliestireno se separo por filtracion y se lavo con 1 mL de agua-etanol (1/4). El filtrado resultante se concentro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en 10 mL de una mezcla de solventes de 20 mM de acido acetico - tampon trietilamina (tampon TEAA) y 10 mL de acetonitrilo (4/1) y se filtro a traves de un filtro de membrana. El filtrado obtenido se purifico por HPLC de fase inversa. Las condiciones usadas son las que se muestran en la Tabla 3 a continuacion.
[Tabla 3]
Figure imgf000020_0002
Se analizo cada fraccion y se recupero el producto objetivo y se concentro a presion reducida. Al residuo concentrado se le adicionaron 0,5 mL de solucion acuosa de acido fosforico 2 M y la mezcla se agito durante 15 minutos. Ademas, se adicionaron 2 mL de solucion acuosa de hidroxido de sodio 2 M para hacer la mezcla alcalina, seguido de filtracion a traves de un filtro de membrana (0,45 pm).
La solucion acuosa resultante que contema el producto objetivo se purifico mediante una columna de resina de intercambio anionico. Las condiciones usadas son las que se muestran en la Tabla 4 a continuacion.
[Tabla 4]
Figure imgf000021_0001
Cada fraccion se analizo (en HPLC) y el producto objetivo se obtuvo como una solucion acuosa. A la solucion acuosa resultante se le tamp aoñna fdoiósfato 0,1 M (pH 6,0) para la neutralizacion. A continuacion, la mezcla obtenida se desmineralizo mediante HPLC de fase inversa en las condiciones descritas en la Tabla 5 a continuacion.
[Tabla 5]
Figure imgf000021_0002
( )
El producto objetivo se recupero y la mezcla se concentro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en agua. La solucion acuosa obtenida se liofilizo para dar el compuesto objetivo en forma de un solido blanco similar al algodon.
Figure imgf000021_0003
[Ejemplo 2]
PMO num. 2
El compuesto del titulo se produjo de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 1.
Figure imgf000021_0004
[Ejemplo comparativo 1]
PMO num. 3
El compuesto del titulo se produjo de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 1.
Figure imgf000021_0005
[Ejemplo de prueba 1]
Ensayo in vitro
Los experimented se realizaron mediante el uso de los oligomeros antisentido PMO num. 1 y 2 de la presente invencion y el oligomero antisentido PMO num. 3. Las secuencias de diversos oligomeros antisentido se dan en la Tabla 6 a continuacion.
[Tabla 6]
Figure imgf000022_0001
Mediante el uso de un estuche Nucleofector L de la lmea celular Amaxa en Nucleofector II (Lonza), se transfectaron 0,3, 1, 3, 10 pM de los oligomeros PMO num. 1 y 2 de la presente invencion y el oligomero antisentido PMO num. 3 con 3,5 x105 de celulas RD (lmea celular de rabdomiosarcoma humano). Se uso el Programa T-030.
Despues de la transfeccion, las celulas se cultivaron durante tres dfas en 2 mL de medio esencial mmimo de Eagle (EMEM) (fabricado por Sigma, de aqrn en adelante el mismo) que contema un 10 % de suero fetal de ternera (FCS) (fabricado por Invitrogen) en condiciones de 37 °C y 5 % de CO2. Las celulas se lavaron con PBS (fabricado por Nissui, de aqrn en adelante el mismo) y se adicionaron 500 pL de ISOGEN II (fabricado por Nippon Gene) a las celulas. Una vez que las celulas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante unos minutos para lisar las celulas, el lisado se recogio en un tubo Eppendorf. El ARN total se extrajo de acuerdo con el protocolo adjunto a ISOGEN. La concentracion del ARN total extrafdo se determino mediante el uso de un NanoDrop ND-1000 (fabricado por LMS).
La RT-PCR en una sola etapa se realizo con 400 ng del ARN total extrafdo mediante el uso de un estuche Qiagen One Step RT-PCR Kit (fabricado por Qiagen). Se preparo una solucion de reaccion de acuerdo con el protocolo adjunto al estuche. Se uso un PTC-100 (fabricado por Mj Research) como termociclador. El programa de RT-PCR usado es el siguiente.
50 °C, 30 minutos: reaccion de transcripcion inversa
95 °C, 15 minutos: desnaturalizacion termica.
[94 °C, 30 segundos; 60 °C, 30 segundos; 72 °C, 60 segundos] x 35 ciclos: Amplificacion por PCR
72 °C, 10 minutos: extension final.
Las secuencias de nucleotidos del iniciador directo y del iniciador inverso utilizadas para la RT-PCR se dan a continuacion. Iniciador directo: 5'- CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3' (sec. con num. de ident.: 5)
Iniciador inverso: 5'- GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3' (sec. con num. de ident.: 6)
El producto de reaccion, 1 pL de la RT-PCR anterior se analizo mediante el uso de un Bioanalyzer (fabricado por Agilent Technologies, Inc.). Se midieron el nivel de polinucleotido "A" de la banda con omision del exon 51 y el nivel de polinucleotido "B" de la banda sin omision del exon 51. Sobre la base de estos valores de medicion de "A" y "B", se determino la eficiencia de omision mediante la siguiente ecuacion:
Eficiencia de omision (%) = A/(A+B) x 100
Resultados experimentales
Los resultados se muestran en la figura 1. Este experimento revelo que, los oligomeros antisentido de la presente invencion podnan causar la omision del exon 51 con una eficacia notablemente mas alta que el oligomero antisentido PMO num. 3.
[Ejemplo 3]
PMO num. 4-6
El compuesto del titulo se produjo de acuerdo con el procedimiento del EJEMPLO 1. Las secuencias de diversos oligomeros antisentido se dan a continuacion.
Tabla 7
Figure imgf000023_0001
[Ejemplo 4]
2'-O-metoxi-fosforotioatos mostrados por la sec. con num. de ident.: de la 9 a la 33
Se produjeron varios oligomeros antisentido del titulo por subcontratacion a Japan Bio Service Co. La secuencia de varios oligomeros antisentido se dan en la Tabla 8.
[Tabla 8]
Figure imgf000023_0002

Claims (15)

Reivindicaciones
1. Un oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (a) a (c) a continuacion, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este:
(a) un oligomero antisentido que comprende una secuencia de nucleotidos de sec. con num. de ident.: 1 o 2;
(b) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene delecion, sustitucion, insercion y/o adicion de 1 a 5 nucleotidos en la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2, y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana; y
(c) el oligomero antisentido que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
2. Un oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en de (e) a (g) a continuacion, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este:
(e) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2;
(f) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene delecion, sustitucion, insercion y/o adicion de 1 a 3 nucleotidos en la secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2, y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana; y
(g) un oligomero antisentido que consiste en una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
3. Un oligomero antisentido que se selecciona de un grupo que consiste en (j) a continuacion, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este:
(j) un oligomero antisentido que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de nucleotidos de la sec. con num. de ident.: 1 o 2 y tiene una actividad que provoca la omision del exon 51 en el gen de la distrofina humana.
4. El oligomero antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, que es un oligonucleotido, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este.
5. El oligomero antisentido de acuerdo con la reivindicacion 4, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este, en donde se modifica el resto azucar y/o la region de union a fosfato de al menos un nucleotido que constituye el oligonucleotido.
6. El oligomero antisentido de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este, en donde el resto de azucar de al menos un nucleotido que constituye el oligonucleotido es una ribosa en la que el grupo 2'-OH se reemplaza por uno seleccionado de entre el grupo que consta de OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br y I (en donde R es un alquilo o un arilo y R' es un alquileno).
7. El oligomero antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 6, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este, en donde la region de union a fosfato de al menos un nucleotido que constituye el oligonucleotido es cualquiera seleccionada del grupo que consiste en un enlace de fosforotioato, un enlace fosforoditioato, un enlace alquilfosfonato, un enlace fosforamidato y un enlace boranofosfato.
8. El oligomero antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, que es un oligomero de morfolino, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable del este.
9. El oligomero antisentido de acuerdo con la reivindicacion 8, que es un oligomero de morfolino fosforodiamidato, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este.
10. El oligomero antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este, en donde el extremo 5' es una cualquiera de las formulas qufmicas de la (1) a la (3) a continuacion:
Figure imgf000030_0001
11. Una composicion farmaceutica para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende como ingrediente activo el oligomero antisentido, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10.
12. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 11, que comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
13. El oligomero antisentido, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, para usar en el tratamiento de la distrofia muscular.
14. El oligomero antisentido, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este para usar de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde el paciente con distrofia muscular en dicho tratamiento es un paciente con deleciones de nucleotidos dentro de los exones 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 o 47-50.
15. El oligomero antisentido, o una sal o hidrato farmaceuticamente aceptable de este para usar de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, en donde el paciente es un ser humano.
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