ES2712656T3

ES2712656T3 - Métodos de administración de dalbavancina para el tratamiento de infecciones bacterianas

Info

Publication number: ES2712656T3
Application number: ES03789744T
Authority: ES
Inventors: Marco Cavaleri; Timothy Henkel; Daniela Jabes; Adriano Malabarba; Giorgio Mosconi; Martin Stogniew; Richard J White
Original assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2003-11-14
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2023-11-14
Also published as: HUE041133T2; US20040198715A1; DK1565201T3; US20050130909A1; WO2004045637A1; US20050130914A1; WO2004045636A1; KR101173310B1; JP2013155188A; JP5519090B2; NO20052362D0; AU2003298662A1; AU2003294262A1; US7115564B2; US20050032721A1; US6900175B2; MXPA05005338A; US20040220122A1; IL239913A0; PT1565201T

Abstract

Uso de dalbavancina en la fabricación de un medicamento para su uso en un método para tratar una infección bacteriana en un humano que lo necesita, comprendiendo el método: administrar dosis terapéuticamente eficaces de dalbavancina inicial y posteriores en un portador farmacéuticamente aceptable al paciente, en el que cada dosis está separada por de cinco a diez días y en el que la cantidad de la dosis inicial es de 500 mg a 5000 mg, y en el que la cantidad de la dosis inicial es al menos aproximadamente dos veces la cantidad de dalbavancina contenida en la dosis posterior.

Description

DESCRIPCION

Metodos de administracion de dalbavancina para el tratamiento de infecciones bacterianas

Campo de la invencion

Esta solicitud se refiere a composiciones de dalbavancina y a metodos de uso de tales composiciones en metodos de tratamiento de infecciones bacterianas, tal como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invencion

Segun el Centro para el control y la prevencion de enfermedades estadounidense, las infecciones hospitalarias del torrente sangumeo son una causa de muerte importante en los Estados Unidos. Aproximadamente el cinco por ciento de los siete millones de cateteres venosos centrales (CVC) insertados anualmente en los Estados Unidos se asocian con al menos un episodio de infeccion del torrente sangumeo (aproximadamente 350000 al ano). Las infecciones del torrente sangumeo relacionadas con cateteres se producen cuando entran bacterias al torrente sangumeo a traves de un cateter intravenoso y pueden ser potencialmente mortales.

Las infecciones de la piel y tejidos blandos (SSTI) son un estado medico comun y a menudo la consecuencia de procedimientos quirurgicos o traumatismo. Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes son los patogenos aislados mas frecuentemente de pacientes con infecciones de tejidos profundas, aunque cualquier organismo patogeno, incluyendo aquellos que se encuentran en piel sana, puede provocar infeccion. Muchas SSTI tienen una gravedad de leve a moderada, permitiendo un tratamiento exitoso con agentes antimicrobianos orales y limpieza local. En cambio, infecciones mas graves o complicadas, que frecuentemente se producen en pacientes con factores de riesgo subyacentes (por ejemplo, deterioro vascular, diabetes) y/o infecciones provocadas por bacterias diffciles de tratar o multirresistentes, pueden requerir terapia antimicrobiana intravenosa potente y desbridamiento quirurgico agresivo.

Los estafilococos son un problema terapeutico y clmico y se han asociado cada vez mas con infecciones hospitalarias desde principios de la decada de 1960. La especie positiva para coagulasa Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) ha sido problematica durante mucho tiempo tanto en infecciones hospitalarias como extrahospitalarias, y se han reconocido varios estafilococos negativos para coagulasa como patogenos oportunistas en humanos, especialmente en el tratamiento de pacientes enfermos cnticos en unidades de cuidados intensivos. Otra causa importante de preocupacion clmica es el aislamiento creciente de cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a penicilina en muchas partes del mundo.

Los antibioticos glicopeptfdicos vancomicina y teicoplanina se han usado frente a infecciones hospitalarias graves provocadas por patogenos grampositivos multirresistentes, particularmente MRSA, estafilococos negativos para coagulasa (CoNS) y enterococos. La vancomicina y la teicoplanina se usan para infecciones provocadas por MRSA, y hasta hace poco, todas las cepas aisladas eran susceptibles de manera uniforme. Sin embargo, el aislamiento de cepas de Staphylococcus aureus con resistencia o susceptibilidad intermedia a teicoplanina asf como a vancomicina se ha notificado ahora con frecuencia creciente. Se han notificado varias cepas resistentes a vancomicina, clasificadas “VanA”, “VanB” o “VanC”, basandose en el mecanismo de resistencia. Por tanto, se necesitan opciones de tratamiento alternativas.

La teicoplanina es al menos tan activa como la vancomicina frente a la mayona de bacterias grampositivas y parece provocar menos acontecimientos adversos. Ambas formas de tratamiento requieren al menos dosificacion una vez al dfa para lograr una recuperacion completa. Actualmente, las opciones terapeuticas para infecciones graves provocadas por algunos de estos patogenos son bastante limitadas. La resistencia emergente de patogenos grampositivos a vancomicina hace que sea muy deseable la disponibilidad de nuevos antibioticos con potencial de eficacia aumentada.

Ademas, senan deseables pautas posologicas menos frecuentes que las terapias disponibles actualmente para potenciar el bienestar del paciente, especialmente para administracion de antibioticos parenteral, por ejemplo, intravenosa o intramuscular. Se necesitan algunas veces estancias en el hospital por la necesidad de administracion de antibioticos varias veces al dfa por medios parenterales, y sena ventajosa una dosificacion menos frecuente para permitir que tal tratamiento se hiciera de forma ambulatoria.

Aunque una dosificacion menos frecuente es una caractenstica deseable de una pauta de administracion de antibioticos, el “margen farmaceutico”, es decir, el perfil de toxicidad, del antibiotico administrado debe ser suficientemente aceptable como para permitir administrar una sola dosis grande sin comprometer el tratamiento provocando reacciones adversas graves en el paciente tratado. Ademas, incluso cuando un antibiotico muestra un margen farmaceutico adecuado, solo es posible una dosificacion menos frecuente si el antibiotico muestra una semivida en suero adecuada para mantener la eficacia terapeutica a lo largo del intervalo de dosificacion deseado. La semivida en suero de un antibiotico dicta tanto la longevidad de un farmaco in vivo como la duracion despues de la administracion cuando el nivel en suero alcanzara un nivel valle mmimo que todavfa es eficaz de manera bactericida. El nivel valle en suero a lo largo del tiempo despues de la administracion de una primera dosis de antibiotico dicta cuando debe administrase una dosis adicional para conservar un nivel bactericida mmimo del antibiotico in vivo.

En vista de lo anterior, un antibiotico que presente actividad frente a uno o mas cepas bacterianas resistentes a antibioticos, particularmente MRSA, que pudiera administrarse en un intervalo de dosificacion de una vez cada 5-7 dfas o mas, sena de valor comercial y satisfana una necesidad largamente sentida en la tecnica.

Eliopoulos comenta en “Newer glycopeptides and derivatives for MSRA” que se ha completado el reclutamiento para un ensayo de fase II en infecciones bacterianas de piel/partes blandas complicadas, con dosificacion de dalbavancina una vez a la semana (vease ABSTRACTS OF THE INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND, vol. 42, 2002, pagina 465, 42.a Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy; San Diego, CA, EE.UU.; 27-30 de Septiembre, 2002, 2002).

Dowell et al. describen una administracion de dalbavancina en una sola dosis en “The pharmacokinetic and renal excretion of dalbavancin in healthy subjets” (vease ABSTRACTS OF THE INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND; vol. 42, 2002, pagina 18, American Society for Microbiology (ASM) Annual Meeting in Infectious Disease; San Diego, CA, EE.UU.; 27-30 de Septiembre, 2002, 2002).

Sumario de la invencion

La invencion proporciona composiciones y usos de las mismas para tratamiento o prevencion de una infeccion bacteriana con dalbavancina, tal como se define en las reivindicaciones. Sorprendentemente, se ha encontrado que formulaciones estabilizadas de dalbavancina muestran tanto un margen farmaceutico asf como una semivida en suero prolongada para permitir pautas de tratamiento de aproximadamente una vez cada 5-7 dfas o mas, mientras se conservan las propiedades antibacterianas in vivo.

Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica que incluye una dosis unitaria de dalbavancina en una cantidad suficiente para proporcionar un nivel en plasma profilactica o terapeuticamente eficaz de dalbavancina en un individuo durante al menos cinco dfas, un estabilizador y un portador farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se formulan generalmente en una forma farmaceuticamente aceptable para su administracion a un individuo, tal como una formulacion acuosa farmaceuticamente aceptable. Tales composiciones farmaceuticas se administran preferiblemente por vfas parenterales, por ejemplo, intravenosa o intramuscular. Por consiguiente, en esta realizacion preferida, estas composiciones farmaceuticas son normalmente esteriles.

En algunas realizaciones, se proporciona una dosis unitaria de dalbavancina en forma de polvo seco (por ejemplo, liofilizado) y se reconstituye en un portador farmaceuticamente aceptable, tal como una formulacion acuosa esteril, antes de su administracion a un individuo. En una realizacion, el portador farmaceuticamente aceptable incluye dextrosa al 5 % en agua. Una composicion farmaceutica de la invencion puede administrase a un mairnfero que necesita tratamiento o prevencion de una infeccion bacteriana, tal como un humano. En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica puede incluir al menos un antibiotico que no es dalbavancina, tal como un antibiotico que es eficaz (por ejemplo, bactericida) contra una bacteria gramnegativa y/o un antibiotico que es eficaz contra especies grampositivas contra las que la dalbavancina no es eficaz, tales como cepas bacterianas resistentes a vancomicina VanA.

Se emplean una o mas sustancias estabilizantes para inhibir la degradacion de uno o mas componentes de dalbavancina durante el almacenamiento como una formulacion en polvo seco (por ejemplo, liofilizado) y/o como una formulacion acuosa antes de su administracion a un individuo. A lo largo del tiempo, la degradacion puede dar como resultado la formacion indeseable de componentes menos activos y/o inactivos que podnan provocar potencialmente efectos adversos in vivo. Los estabilizadores preferidos incluyen componentes anionicos tales como azucares o alcoholes de azucares, por ejemplo, un mono-, di- o polisacarido, o derivado del mismo, tales como, por ejemplo, manitol, lactosa, sacarosa, sorbitol, glicerol, celulosa, trehalosa, maltosa o dextrosa, o mezclas de los mismos. Cualquier referencia en la descripcion a metodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmaceuticas y medicamentos de la presente invencion para su uso en un metodo para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. En otro aspecto, se proporcionan metodos para tratar una infeccion bacteriana en un individuo que lo necesita, incluyendo administrar al menos una dosis unitaria de dalbavancina en una cantidad suficiente para proporcionar un nivel en plasma terapeuticamente eficaz de dalbavancina en el individuo durante al menos cinco dfas, y un portador farmaceuticamente aceptable. Un nivel en plasma terapeuticamente eficaz de dalbavancina es generalmente de al menos de aproximadamente 4 mg de dalbavancina por litro de plasma. En una realizacion, la cantidad de dosificacion de dalbavancina administrada es una cantidad que es clmicamente eficaz y que tambien ha reducido efectos secundarios adversos en comparacion con el tratamiento de referencia con farmacos tales como teicoplanina y vancomicina.

Puede administrate dalbavancina como una sola dosis o como multiples dosis. En algunas realizaciones, se administra una sola dosis de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 4000 mg, por ejemplo 3000 mg, de dalbavancina. En diversas realizaciones, una sola dosis de dalbavancina puede incluir al menos aproximadamente cualquiera de 0,1, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 o 3 gramos.

En otras realizaciones, se administran dos dosis con de cinco a diez dfas de diferencia, tal como aproximadamente una semana de diferencia. La primera dosis puede ser de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000 mg de dalbavancina y la segunda dosis puede ser de aproximadamente 250 mg a aproximadamente 2500 mg de dalbavancina. A menudo, la primera dosis incluye de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3 veces, a menudo al menos aproximadamente dos veces la cantidad de dalbavancina contenida en la segunda dosis. Por ejemplo, la primera dosis puede ser de aproximadamente 1000 mg y la segunda dosis puede ser de aproximadamente 500 mg de dalbavancina. En metodos en los que se administran dos dosis, el nivel valle en plasma de dalbavancina en un individuo antes de la administracion de la segunda dosis es generalmente de al menos aproximadamente 4 mg, a menudo al menos aproximadamente 10 mg, a menudo al menos aproximadamente 20 mg, mas a menudo al menos aproximadamente 30 mg de dalbavancina por litro de plasma, y todavfa mas a menudo al menos aproximadamente 40 mg de dalbavancina por litro de plasma.

A menudo, los metodos de la invencion incluyen administracion parenteral, por ejemplo administracion intravenosa. En algunas realizaciones, la administracion es intravenosa con la velocidad de administracion controlada de manera que la administracion se produce durante al menos aproximadamente 30 minutos o mas.

Pueden usarse metodos de la invencion para tratar una infeccion bacteriana grampositiva, tal como, por ejemplo, una infeccion de piel y tejido blando por Staphylococcus aureus o Streptococcus pyogenes. En algunas realizaciones, la infeccion es resistente a penicilina y/o multirresistente.

En otro aspecto, se proporciona un metodo para prevenir una infeccion bacteriana que incluye administrar al menos una dosis unitaria de dalbavancina en una cantidad suficiente para proporcionar un nivel en plasma profilacticamente eficaz de dalbavancina en el individuo durante al menos aproximadamente un dfa, tres dfas, cinco dfas, una semana, o diez dfas o mas, y un portador farmaceuticamente aceptable. La dosificacion de dalbavancina puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1000 mg. En algunas realizaciones, se administra dalbavancina antes, durante o posteriormente a un procedimiento medico o una estancia en el hospital.

Los metodos terapeuticos o profilacticos de la invencion pueden incluir la administracion de al menos un antibiotico que no es dalbavancina, preferiblemente un antibiotico que es eficaz contra una bacteria gramnegativa y/o un antibiotico que es eficaz contra cepas grampositivas contra las que la dalbavancina no es eficaz, tales como cepas VanA.

En otro aspecto, se divulgan kits que incluyen al menos una dosis unitaria de dalbavancina en una cantidad suficiente para proporcionar un nivel en plasma terapeuticamente eficaz durante al menos aproximadamente cinco dfas o un nivel en plasma profilacticamente eficaz de dalbavancina durante al menos aproximadamente un dfa en un individuo, e instrucciones para su uso en un metodo de tratamiento o profilaxis de una infeccion bacteriana. Un kit puede contener dos dosificaciones unitarias, incluyendo una primera dosificacion de 1,5 a 3 veces, a menudo al menos aproximadamente dos veces la cantidad de dalbavancina incluida en una segunda dosificacion. Los kits tambien pueden incluir un antibiotico que no es dalbavancina, preferiblemente eficaz contra una bacteria gramnegativa.

En una realizacion, se divulgan kits que incluyen un primer recipiente que contiene una composicion de dalbavancina en polvo seco (por ejemplo, liofilizado) y un segundo recipiente que contiene una cantidad predeterminada de una disolucion acuosa fisiologicamente aceptable para mezclar con la composicion de dalbavancina. Tales disoluciones son preferiblemente disoluciones acuosas esteriles. En una realizacion, los kits incluyen un medio de suministro para administrar la composicion de dalbavancina a un individuo, por ejemplo un medio de administracion intravenosa o jeringa.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 representa la concentracion en plasma de dalbavancina frente al tiempo tras una sola infusion intravenosa de 1000 mg de dalbavancina.

La figura 2 representa datos de calorimetna de valoracion isotermica para la union de dalbavancina a albumina serica humana (parte superior) y una representacion grafica de los datos ajustados a una curva determinada a partir de un modelo de union 2:1 de dalbavancina:protema (parte inferior).

La figura 3 representa un espectro de masas con ionizacion por electrospray de dalbavancina.

La figura 4 es un grafico de concentracion de dalbavancina frente a razon de poblacion de multimeros con respecto a monomeros de dalbavancina y representa un aumento de la razon de poblacion de multimeros con respecto a monomeros de dalbavancina con concentracion creciente de dalbavancina.

La figura 5 es un grafico de pH frente a razon de poblacion de multimeros con respecto a monomeros de dalbavancina y representa un aumento de la razon de poblacion de multfmeros con respecto a monomeros de dalbavancina con pH creciente.

La figura 6 representa un espectro de masas con ionizacion por electrospray de dalbavancina en una disolucion de pH 5 de formiato de amonio 5 mM.

La figura 7 representa un espectro de masas con ionizacion por electrospray de dalbavancina en una disolucion de pH 5 de formiato de amonio 50 mM.

La figura 8 representa un espectro de masas con ionizacion por electrospray de dalbavancina en una disolucion de pH 5 de formiato de amonio 100 mM.

La figura 9 representa un espectro de masas con ionizacion por electrospray de teicoplanina (50 |ig/ml) en agua. La figura 10 representa un espectro de masas con ionizacion por electrospray de teicoplanina (100 |ig/ml) en agua. La figura 11 representa el efecto de HSA sobre la constante de disociacion aparente para la union dalbavancina/tripeptido a 26 °C (pH 7,4).

La figura 12 representa una comparacion de datos de calorimetna isotermica (ITC) para la union de tripeptido a vancomicina y dalbavancina en condiciones identicas, usando la misma disolucion de tripeptido.

Las figuras 13A y 13B representan la posible interaccion de monomeros y multimeros de dalbavancina (incluyendo dfmeros) con ligando de tripeptido y ^hS^a. La figura 13A representa dalbavancina en equilibrio de monomero-dfmero en disolucion, que se une como monomero a dos sitios diferenciados en HSA. La figura 13B representa la union de ligando a dfmero de dalbavancina en disolucion y mas debilmente a monomeros de dalbavancina unidos a HSA. Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona pautas posologicas mejoradas y nuevas composiciones de dalbavancina, y metodos mejorados de tratamiento de infecciones bacterianas resistentes a antibioticos. En particular, la invencion proporciona composiciones de dalbavancina que tienen actividad frente a uno mas cepas de bacterias resistentes a antibioticos, tales como MRSA, que pueden administrarse en una pauta posologica de una vez cada 5-7 dfas o mas. La dalbavancina, a la que tambien se hace referencia en la bibliograffa cientffica como BI 397 o VER001, es una mezcla de glicopeptidos semisinteticos, cuyas propiedades se han notificado en las patentes estadounidenses n.os 5.606.036, 5.750.509, 5.843.679 y 5.935.238.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “dalbavancina” se refiere a composiciones que comprenden uno o mas, preferiblemente dos o mas, homologos estrechamente relacionados, denominados “A⁰”, “A¹”, “B⁰”, “B¹”, “C⁰” y “C¹”, tal como se describe a continuacion, o monomeros, multfmeros (es decir, dfmero o multimero de orden superior), tautomeros, esteres, solvatos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, “dfmero” o “multimero” se refiere a o bien un homodfmero o bien un homomultimero, es decir, un dfmero o multimero compuesto de monomeros del mismo homologo de dalbavancina, o un heterodfmero o heteromultimero, es decir, un dfmero o multimero compuesto de monomeros de al menos dos homologos de dalbavancina diferentes. La dalbavancina incluye a menudo “MAG”, una variante no homologa descrita a continuacion. Individualmente, los homologos de dalbavancina y MAG se denominan algunas veces en el presente documento “componentes de dalbavancina”.

La dalbavancina se prepara mediante modificacion qrnmica del complejo glicopeptfdico natural A-40.926 tal como se describe en Malabarba y Donadio (1999) Drugs of the Future 24(8):839-846. El componente predominante de la dalbavancina es factor B⁰, que representa >75 % de todo el complejo.

La cantidad de cada uno de los componentes presentes en una composicion de dalbavancina viene dictada por una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, las condiciones de fermentacion empleadas en la preparacion del complejo glicopeptfdico natural A-40926, que es el precursor de dalbavancina (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.843.679), las condiciones empleadas para recuperar A-40926 del caldo de fermentacion, las reacciones qrnmicas empleadas para esterificar selectivamente el grupo carboxilo del resto de azucar de A-40926, las condiciones empleadas para amidar el grupo peptidilcarboxilo, las condiciones empleadas para saponificar el ester del grupo carboxilo de la funcion acido N-acilaminoglucuronico, las condiciones empleadas para recuperar la dalbavancina de la mezcla de smtesis, y similares.

En realizaciones preferidas, las composiciones de dalbavancina comprenden al menos de aproximadamente el 80 a aproximadamente el 98 % en peso del componente B⁰. En realizaciones particularmente preferidas, la dalbavancina comprende las siguientes cantidades de Bo:

Tabla 1. Cantidades preferidas de componente Bo en la composicion de dalbavancina

1 cada intervalo representa el % en moles de Bo en relacion con los componentes totales de dalbavancina presentes en la composicion de dalbavancina incluyendo MAG

La estructura qmmica de varios de los componentes de dalbavancina se representa en la formula I a continuation:

Todos los componentes anteriores de dalbavancina son activos de manera bactericida frente a varias bacterias grampositivas. Sin embargo, un componente de dalbavancina no homologo, denominado “MAG”, que carece de un resto acilglucoronamina presente en otros componentes, es menos eficaz de manera bactericida, tanto in vivo como in vitro, que otros componentes de dalbavancina. Se cree que MAG es un producto de descomposicion de uno o mas de los otros componentes de dalbavancina. Por consiguiente, en una realizacion preferida, la cantidad de MAG en dalbavancina es menor de aproximadamente el 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1 o 0,5 por ciento en moles de todos los componentes de dalbavancina presentes, incluyendo MAG.

Se cree que la dalbavancina inhibe la biosmtesis de la pared celular bacteriana mediante union a precursores que terminan en D-alanil-D-alanina de peptidoglicanos. Multimeros dimericos o de orden superior de dalbavancina pueden presentar propiedades antibacterianas adicionales por interaccion de las cadenas laterales lipofilas con la membrana citoplasmatica de bacterias. Vease, por ejemplo, Malabarba y Ciabatti, et al. (2001) Current Medicinal Chemistry 8:1759-1773. Una elaboracion adicional de multimeros de dalbavancina puede encontrarse en el documento estadounidense con n.° de serie 10/_, titulado “DALBAVANCIN COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF BACTERIAL INFECTIONS” (Composiciones de dalbavancina para el tratamiento de infecciones bacterianas), presentado simultaneamente con el presente documento como n.° de expediente del apoderado 34231-20052.00. Datos clmicos, no clmicos e in vitro indican que la dalbavancina es beneficiosa para el tratamiento de infecciones grampositivas graves provocadas por MRSA y CoNS, y todas las especies enterococicas distintas de VanA y estreptococicas, incluyendo fenotipos VanB y VanC escasamente susceptibles o resistentes a vancomicina.

La dalbavancina es mas activa in vitro frente a estafilococos (incluyendo algunas cepas resistentes a teicoplanina) que la teicoplanina y vancomicina. La dalbavancina tiene mejor actividad frente a estreptococos, incluyendo cepas resistentes a penicilina, que la teicoplanina o vancomicina. La dalbavancina es activa in vitro e in vivo frente a varias bacterias grampositivas, incluyendo la mayona de cepas resistentes a farmacos.

La dalbavancina se administra normalmente a un individuo como una composicion de dalbavancina. Tal como se usa en el presente documento, el termino “composicion de dalbavancina” o “formulacion de dalbavancina” se refiere a una composicion, normalmente una composicion farmaceutica que comprende dalbavancina, tal como se definio anteriormente, y uno o mas componentes distintos de dalbavancina tales como, por ejemplo, un portador farmaceuticamente aceptable, un estabilizador, tampones u otros componentes similares.

Tal como se muestra en el ejemplo 1, la dalbavancina es eficaz a intervalos de dosis de una semana. Por tanto, una ventaja de la dalbavancina frente a otras opciones de tratamiento es la capacidad para administrar este antibiotico una vez a la semana, maximizando de ese modo la adhesion al tratamiento del paciente y minimizando potencialmente la necesidad de o disminuyendo la duracion de una estancia en el hospital para la administracion parenteral de antibioticos. Una dosificacion menos frecuente permite a menudo el tratamiento de forma ambulatoria, disminuyendo por tanto los costes de tratamiento. Tal como se muestra adicionalmente en el ejemplo 1, una segunda dosis de dalbavancina aproximadamente una semana despues de la administracion de la primera dosificacion, donde la segunda dosis es aproximadamente la mitad de la primera dosis, proporciona inesperadamente una mejora significativa en la eficacia de tratamiento.

Metodos de uso

Se proporcionan metodos para la administracion de dalbavancina a un individuo que necesita tratamiento para una infeccion bacteriana. El tratamiento puede incluir profilaxis, terapia o cura. Los metodos incluyen la administracion de una o mas dosis unitarias de dalbavancina en una cantidad profilactica o terapeuticamente eficaz.

Tal como se usa en el presente documento, “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de dalbavancina que producira un resultado terapeuticamente deseado (por ejemplo, reduccion o eliminacion de una infeccion bacteriana). Una cantidad terapeuticamente eficaz puede administrarse en una o mas dosis. Una “cantidad profilacticamente eficaz” se refiere a una cantidad de dalbavancina suficiente para prevenir o reducir la gravedad de una futura infeccion bacteriana cuando se administra a un individuo que es susceptible de y/o que puede contraer una infeccion bacteriana, por ejemplo, en virtud de un procedimiento medico o estancia en el hospital, o exposicion a un individuo con una infeccion bacteriana. La dalbavancina se administra generalmente en un portador farmaceuticamente aceptable.

La dalbavancina se proporciona a menudo como una sal de clorhidrato, que es libremente soluble en agua.

Normalmente, la dalbavancina se administra como una “dosis unitaria” en una formulacion de dalbavancina que incluye una cantidad de dalbavancina suficiente para proporcionar un nivel en plasma profilactica o terapeuticamente eficaz de dalbavancina durante varios dfas, a menudo al menos aproximadamente 5 dfas, una semana o 10 dfas, cuando se administra a un individuo.

Tal como se usa en el presente documento, “individuo” se refiere a un vertebrado, normalmente un mairnfero, a menudo un humano.

Todos los homologos de dalbavancina descritos anteriormente muestran una semivida en plasma prolongada, a menudo 9 dfas o mas, aunque se cree que MAG tiene una semivida mas corta que otros homologos. La semivida larga permite intervalos entre dosificaciones mas largos que la vancomicina o teicoplanina. Tal como se describe en el ejemplo 1, la dosificacion semanal de dalbavancina es eficaz para el control de infecciones bacterianas, en contraste con la pauta posologica de dos veces al dfa que se usa a menudo para vancomicina o la pauta de una vez al dfa usada generalmente para teicoplanina. La dosificacion menos frecuente de dalbavancina ofrece ventajas de tratamiento significativas con respecto a vancomicina y teicoplanina, particularmente con respecto a la comodidad y adhesion al tratamiento del paciente mejoradas con la pauta de tratamiento. Sorprendentemente pueden administrarse dosis altas (es decir, que dan como resultando niveles en suero altos y duraderos sorprendentes), y con menor frecuencia que otras opciones de tratamiento disponibles. La nueva pauta posologica disponible para dalbavancina da como resultado eficacia mejorada porque a las concentraciones requeridas para lograr una dosificacion menos frecuente, la dalbavancina muestra efectos adversos mmimos in vivo, evidenciando un gran margen farmaceutico, y ademas porque los niveles en sangre de dalbavancina se mantienen por encima de niveles bactericidas mmimos durante todo el protocolo de tratamiento, evidenciando una semivida en suero prolongada para dalbavancina. La combinacion del gran margen farmaceutico acoplado con la semivida en suero prolongada permite una dosificacion menos frecuente de dalbavancina.

Ademas, la dalbavancina se formula preferiblemente con un estabilizador que inhibe la degradacion de uno o mas de los componentes de la dalbavancina. En una realizacion preferida, se formula dalbavancina con una razon en peso 1:2 de manitol:dalbavancina. En otra realizacion preferida, se formula dalbavancina con una razon en peso 1:1:4 de manitol:lactosa:dalbavancina.

En algunas realizaciones, se administra una formulacion de dalbavancina a una dosificacion que da como resultado niveles en plasma terapeuticamente eficaces (es decir, bactericidas) del farmaco durante varios dfas, a menudo al menos de 5 a 10 dfas, a menudo al menos aproximadamente una semana. Generalmente, la dalbavancina se mantiene en el plasma a o por encima de la concentracion bactericida minima de aproximadamente 4 mg/l durante al menos 5 dfas. A menudo, la dalbavancina se mantiene a un nivel en plasma de al menos aproximadamente 5 mg/l, a menudo al menos aproximadamente 10 mg/l, a menudo al menos aproximadamente 20 mg/l, a menudo al menos aproximadamente 30 mg/l, a menudo al menos aproximadamente 40 mg/l, durante al menos 5 dfas, a menudo al menos aproximadamente una semana o mas. Pueden medirse los niveles en plasma de dalbavancina mediante metodos que se conocen bien en la tecnica, tales como cromatograffa de lfquidos, espectrometna de masas o bioensayo microbiologico. Un ejemplo de un metodo para cuantificar dalbavancina en plasma se proporciona en el ejemplo 5.

Los lfmites superiores para los niveles de concentracion en plasma de dalbavancina vienen dictados generalmente por las dosificaciones que inhiben efectos adversos inaceptables en la poblacion de pacientes tratada.

Pueden administrarse composiciones de dalbavancina en una sola dosis o en multiples dosis. Cuando se administra como una sola dosis, la composicion de dalbavancina se formula preferiblemente para que contenga cantidades suficientes de dalbavancina para lograr propiedades antibacterianas in vivo durante al menos 5 dfas, preferiblemente al menos 7 dfas y mas preferiblemente al menos 10 dfas.

Cuando se emplean multiples dosis, puede administrarse dalbavancina semanalmente durante dos o mas semanas. En una realizacion, se administra dalbavancina en al menos dos dosis, a menudo en dos dosis con de 5 a 10 dfas de diferencia, mas a menudo una vez a la semana durante dos semanas. Tal como se muestra en el ejemplo 1, una pauta posologica de este tipo proporciona ventajas significativas con respecto a protocolos de tratamiento con antibioticos convencionales.

Tambien pueden administrarse composiciones de dalbavancina en multiples dosis con dos o mas dfas o al menos una semana de diferencia o en una o mas dosis bisemanalmente. En algunas realizaciones, se administra una composicion de dalbavancina semanalmente, seguido de administracion bisemanal o mensual. En algunas realizaciones, se administra dalbavancina en intervalos semanales durante 2, 3, 4, 5, 6 o mas semanas.

De la manera mas ventajosa, no se requiere dosificacion diaria porque se usan dosis superiores, menos frecuentes. Las dosis multiples o individuales pueden oscilar, por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 gramos. Una sola dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 gramos, por ejemplo, de aproximadamente 3 gramos, puede administrarse para diversos tratamientos contra infecciones. Si se administran multiples dosis, por ejemplo, semanalmente, cada dosis puede oscilar, por ejemplo, desde aproximadamente 0,25 hasta aproximadamente 5,0 gramos.

Para realizaciones en las que se administra una sola dosis para tratar una infeccion, la cantidad de la dosis puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 gramos, o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4 gramos, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3,5 gramos, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 gramos por ejemplo, aproximadamente 3 gramos. En algunas realizaciones, una sola dosis de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5 o 3 gramos se administra para el tratamiento de una infeccion bacteriana. Para realizaciones en las que se administra una sola dosis para profilaxis, la cantidad de la dosis puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 gramos, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 gramo, por ejemplo, aproximadamente 0,5 o aproximadamente 0,25 gramos.

En programas de dosificacion que incluyen multiples dosificaciones, se administra una primera dosis mas alta, es decir, por ejemplo, de aproximadamente 1,5 a 3 veces mayor, que una o mas dosis posteriores. Por ejemplo, la primera dosis puede ser de aproximadamente 0,5 gramos a aproximadamente 5 gramos y la segunda dosis de aproximadamente 0,25 gramos a aproximadamente 2,5 gramos, la primera dosis puede ser de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 2 g y la segunda dosis de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1 gramo, o la primera dosis puede ser de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 3 g y la segunda dosis de aproximadamente 0,2 a 1,5 g. En algunas realizaciones, se administran al menos dos dosificaciones en las que la primera dosificacion incluye aproximadamente el doble de dalbavancina que dosificaciones posteriores. En una realizacion, una primera dosificacion incluye aproximadamente 1 gramo de dalbavancina y una dosificacion posterior incluye aproximadamente 0,5 gramos. En otra realizacion, una primera dosificacion incluye aproximadamente 0,5 gramos de dalbavancina y una dosificacion posterior incluye aproximadamente 0,25 gramos.

En algunas realizaciones, se administra una composicion de dalbavancina en dos dosis con al menos aproximadamente una semana de diferencia. A menudo, dos dosis de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,5 gramos de dalbavancina se administran con de 5 a 10dfas de diferencia, mas a menudo aproximadamente 1 semana de diferencia. En una realizacion, una primera dosificacion de aproximadamente 1 gramo de dalbavancina y una segunda dosificacion de aproximadamente 0,5 gramos de dalbavancina se administran con aproximadamente 1 semana de diferencia.

En una pauta posologica multiple, el tiempo entre las dosis pueden oscilar, por ejemplo, entre 5 y 10 dfas, a menudo aproximadamente una semana. La frecuencia de dosis puede ser, por ejemplo, dos dosis semanales, o multiples dosis semanales. El intervalo de dosificacion, o tiempo entre dosis, puede ser, por ejemplo, cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas. El numero de dosis administradas, puede ser, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas dosis, administrandose cada dosis despues de la dosis inicial tras el intervalo de dosificacion seleccionado.

En un programa de dosificacion multiple, a menudo el “nivel valle”, o el nivel de dalbavancina en plasma despues de una primera dosis de dalbavancina y justo antes de la administracion de una segunda dosis, es al menos de aproximadamente 4 mg/l. Preferiblemente, el nivel valle al final de un intervalo de dosificacion tal como de aproximadamente una semana es al menos de aproximadamente 20 mg/l, mas preferiblemente al menos aproximadamente 30 mg/l e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 40 mg/l.

Puede administrarse dalbavancina por via parenteral, por ejemplo, por via intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), subcutanea (s.c.), intraperitoneal (i.p.) o intratecal (i.t.). La pauta posologica y dosificacion real administrada puede variar dependiendo de factores tales como la naturaleza y gravedad de la infeccion, la edad, el peso y la salud general del paciente y la tolerancia de un paciente particular a dalbavancina, pero los profesionales de la salud lo podran determinar. En una realizacion, a una dosis intravenosa de un gramo de dalbavancina le sigue una dosis intravenosa de 0,5 gramos una semana mas tarde.

La administracion y el suministro del farmaco al paciente, por ejemplo, por via intravenosa, pueden realizarse a una velocidad controlada, de modo que la concentracion en la sangre no aumenta demasiado rapido ni provoca que se produzca precipitacion. En algunas realizaciones, se administra dalbavancina a una velocidad apropiada de manera que el farmaco forma un complejo con protema(s) endogena(s) en el torrente sangumeo. Sin pretender restringirse a una teona particular, se cree que protema endogena, tal como albumina serica humana, puede formar un complejo in vivo con una o dos moleculas de monomeros homologos de dalbavancina. Cuando esta presente una cantidad suficiente de dalbavancina, se cree que se uniran hasta dos moleculas de homologo de dalbavancina a la protema endogena y se cree ademas que este complejo se forma uniendo moleculas homologas diferenciadas de dalbavancina en dos sitios de union diferentes. Alternativamente, es posible que dalbavancina dimerica se una a un solo sitio de union en la protema endogena. Una elaboracion adicional en los complejos de dalbavancina-protema endogena comentados anteriormente puede encontrarse en el documento estadounidense con n.° de serie 10/_, titulado “COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING BACTERIAL INFECTIONS WITH PROTEIN-DALBAVANCIN COMPLEXES” (Composiciones y metodos para tratar infecciones bacterianas con complejos de protema-dalbavancina), presentado simultaneamente con el presente documento como n.° de expediente del apoderado 34231-20053.00.

La duracion de la infusion puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2 horas. Por ejemplo, puede usarse una duracion de infusion de aproximadamente 30 minutos cuando la dosis es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 gramo. La administracion intravenosa en condiciones de velocidad controlada puede generar concentraciones de dalbavancina en el cuerpo que estan en gran exceso de lo que puede conseguirse en la fase de disolucion a pH fisiologico in vitro. Aunque no se desea limitarse por la teona, esto puede deberse a la formacion de un complejo de dalbavancina con protema(s) endogena(s) tal(es) como seroalbumina, lo que puede aumentar la capacidad del plasma para absorber dalbavancina.

La formacion de un complejo de dalbavancina in vitro o ex vivo puede permitir una administracion mas rapida, tal como al menos aproximadamente 1 minuto, al menos aproximadamente 10minutos o al menos aproximadamente 20 minutos. Un complejo de este tipo puede conseguirse mezclando albumina serica humana y/u otra protema endogena con dalbavancina, formando de ese modo el complejo in vitro o ex vivo, y administrando entonces este complejo al paciente tratado. Alternativamente, la albumina serica humana u otra protema endogena puede obtenerse de fuentes autologas o mediante expresion de un microorganismo modificado para que contenga el gen para la protema.

La cantidad de dalbavancina administrada puede ser cualquiera de las dosificaciones divulgadas en el presente documento. La dosis de dalbavancina se elige generalmente de manera que el farmaco permanecera en un nivel en plasma profilactica o terapeuticamente eficaz (es decir, bactericida) durante un periodo de tiempo extendido, a menudo al menos 5 dfas, mas a menudo aproximadamente una semana o mas. Se prefiere la administracion de una dosis de dalbavancina que produce y mantiene concentraciones bactericidas durante al menos aproximadamente una semana (o de 5 a 10 dfas). Una concentracion bactericida se define como la concentracion de dalbavancina requerida para destruir al menos el 99 % de las bacteria presentes al inicio de un experimento in vitro a lo largo de un penodo de 24 horas. Una concentracion bactericida minima de dalbavancina en plasma es normalmente de aproximadamente 4 mg/l.

Los ejemplos de indicaciones que pueden tratarse incluyen infecciones de piel y tejido blando (SSTI) tanto complicadas como sin complicaciones, infecciones del torrente sangumeo (BSI), infecciones del torrente sangumeo relacionadas con cateteres (CRBSI), osteomielitis, infecciones de articulaciones protesicas, profilaxis quirurgica, endocarditis, neumoma hospitalaria o extrahospitalaria, neumoma neumococica, tratamiento emprnco de neutropenia febril, infecciones del espacio articular e infecciones por dispositivos (por ejemplo, marcapasos y desfibriladores cardfacos internos). Pueden tratarse infecciones bacterianas grampositivas o resistentes a antibioticos, tales como una infeccion por el genero Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, o Clostridium, en particular Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus Grupos A y C, Neisseria gonorrhoeae o Clostridium difficile.

La invencion proporciona metodos para tratamiento de infecciones de piel y tejido blando (SSTI). Los pacientes que pueden beneficiarse de este tratamiento pueden tener infecciones o bien profundas o bien superficiales. SSTI puede implicar a tejido blando mas profundo y/o requerir intervencion quirurgica significativa, tal como por ejemplo un absceso serio, ulcera infectada, quemadura seria o celulitis extensa y profunda. Tambien pueden tratarse heridas quirurgicas infectadas.

La presentacion clmica de la infeccion de piel y partes blandas puede variar de foliculitis leve a fascitis necrosante grave. El modo de contraerla puede tambien variar con infecciones de piel y partes blandas extrahospitalarias, que a menudo estan precedidas por lesiones que resultan de actividades recreativas o de exposicion laboral, y se asocian habitualmente con una diversidad mayor de patogenos. Las infecciones de piel y partes blandas hospitalarias se asocian generalmente con procedimientos quirurgicos, el desarrollo de ulceras de decubito y cateterizacion. Las infecciones posquirurgicas son la tercera infeccion hospitalaria mas frecuente y representan el 17% de todas las infecciones hospitalarias notificadas al Sistema nacional de vigilancia de infecciones hospitalarias (NNIS). La fuente mas frecuente de infeccion es la flora endogena del paciente. Los patogenos aislados mas frecuentemente de SSTI son Staphylococcus aureus, estafilococos negativos para coagulasa y Enterococcus spp.

Los smtomas de infecciones SSTI pueden incluir eritema, dolor a la palpacion o dolor, calor o efusion localizado, secrecion o supuracion, hinchazon o induracion, enrojecimiento o fluctuacion. Los pacientes que pueden beneficiarse del tratamiento con los metodos de la invencion incluyen aquellos con infecciones profundas o complicadas o infecciones que requieren intervencion quirurgica, o pacientes con enfermedad vascular periferica o diabetes mellitus subyacente. Estas infecciones a menudo estan provocadas por bacterias grampositivas tales como especies de Staphylococcus o Streptococcus, tales como Staphylococcus aureus o Streptococcus pyogenes. Los metodos para el tratamiento de una infeccion bacteriana de piel o tejido blando incluyen administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de dalbavancina a un individuo que necesita tratamiento, en una cantidad y segun una pauta posologica tal como se comento anteriormente. En algunas realizaciones, se administra una composicion de dalbavancina por via intravenosa en dos dosis, a menudo con de 5 a 10dfas de diferencia, mas a menudo con aproximadamente 1 semana de diferencia. En algunas realizaciones, la primera dosificacion incluye al menos el doble de dalbavancina que la segunda dosificacion. En una realizacion, la primera dosificacion es de aproximadamente 1000 mg y la segunda dosificacion es de aproximadamente 500 mg.

La invencion tambien proporciona metodos para la prevencion profilactica de la aparicion de una infeccion bacteriana, por ejemplo una infeccion provocada por Staphylococcus aureus, o por una bacteria del genero de Neisseria o Clostridium. En un metodo profilactico de la invencion, se administra una cantidad profilacticamente eficaz de dalbavancina a un individuo que puede ser susceptible de contraer una infeccion bacteriana, por ejemplo, a traves de un procedimiento medico. A menudo, se administra dalbavancina en una cantidad suficiente para proporcionar un nivel en plasma profilacticamente eficaz durante al menos aproximadamente 1 dfa, al menos aproximadamente 3 dfas, al menos aproximadamente 5 dfas o al menos aproximadamente una semana o mas. Pueden administrarse composiciones de dalbavancina, por ejemplo, por via parenteral, por ejemplo, inyeccion por via intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), subcutanea (s.c.), o intratecal (i.t.), previa o posteriormente a la cirugfa como etapa preventiva contra la infeccion. Pueden administrarse composiciones de dalbavancina de manera inmediatamente previa o posterior a, 1 o mas dfas o aproximadamente una semana previa o posteriormente a, o durante un procedimiento medico invasivo tal como cirugfa o una estancia en un centro de cuidados medicos tal como un hospital para prevenir una infeccion. Puede usarse un metodo profilactico en cualquier situacion en la que es posible o probable que un individuo pueda contraer una infeccion bacteriana, incluyendo situaciones en la que un individuo se ha expuesto o es probable que se haya expuesto a un individuo infectado de manera bacteriana. Para metodos profilacticos, pueden administrarse composiciones de dalbavancina o bien como una sola dosis o bien como dos o mas dosis de igual o diferente cantidad que se administran con de varios dfas a aproximadamente una semana de diferencia. En una realizacion, puede administrarse una composicion de dalbavancina previa a o simultaneamente con la insercion de un cateter intravenoso con el fin de prevenir una infeccion relacionada con el torrente sangumeo.

Para metodos profilacticos, pueden administrase composiciones de dalbavancina en multiples dosis, segun cualquiera de los programas de dosificacion descritos anteriormente. A menudo, se administra una composicion de dalbavancina como una sola dosis que comprende de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 gramos, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 gramo, por ejemplo, aproximadamente 0,25 gramos o aproximadamente 0,5 gramos. En una realizacion, se administra una sola dosis de aproximadamente 0,25 gramos por via intravenosa a lo largo de un lapso de tiempo de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1 hora, por ejemplo, aproximadamente 30 minutos. En otra realizacion, la composicion de dalbavancina se administra por via intravenosa simultaneamente con la administracion de otro tratamiento farmaceutico (por ejemplo, antibiotico). En cualquiera de los metodos terapeuticos o profilacticos descritos anteriormente, la composicion de dalbavancina puede administrarse o bien simultaneamente o bien secuencialmente con al menos otro antibiotico. En algunas realizaciones, se administra ademas de dalbavancina, al menos otro antibiotico que es eficaz (por ejemplo, bactericida) frente a una o mas especies bacterianas gramnegativas y/o una cepa bacteriana grampositiva frente a la que la dalbavancina no es eficaz. En algunas realizaciones, se administran dalbavancina y al menos un antibiotico que es eficaz (por ejemplo, bactericida) frente al menos una especie bacteriana gramnegativa como una mezcla en la composicion de dalbavancina.

Composiciones farmaceuticas

La invencion proporciona composiciones farmaceuticas formuladas para la administracion de dalbavancina segun los metodos descritos anteriormente. Las composiciones farmaceuticas de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones, pueden estar en forma de una dosis unitaria de dalbavancina que incluye una cantidad de dalbavancina suficiente para proporcionar un nivel en plasma profilactica o terapeuticamente eficaz de dalbavancina durante varios dfas, a menudo al menos aproximadamente 3 dfas, al menos aproximadamente 5 dfas o al menos aproximadamente una semana o mas cuando la composicion se administra a un individuo, y un portador farmaceuticamente aceptable. Generalmente, un nivel en plasma profilactica o terapeuticamente eficaz de dalbavancina es al menos de aproximadamente 4 mg por litro de plasma. Pueden medirse niveles en plasma de dalbavancina mediante metodos bien conocidos en la tecnica, tales como aquellos descritos anteriormente.

La dalbavancina puede estar opcionalmente en una forma farmaceuticamente aceptable para su administracion a un individuo, opcionalmente como una sal no toxica, farmaceuticamente aceptable.

Ejemplos de sales adecuadas de dalbavancina incluyen sales formadas mediante reaccion convencional tanto con acidos organicos como inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorddrico, bromddrico, sulfurico, fosforico, acetico, trifluoroacetico, tricloroacetico, sucdnico, dtrico, ascorbico, lactico, maleico, glutamico, canforico, glutarico, glicolico, ftalico, tartarico, laurico, estearico, salidlico, metanosulfonico, bencenosulfonico, sorbico, pfcrico, benzoico, cinamico, y similares. Los ejemplos representativos de bases que pueden formar sales con dalbavancina incluyen hidroxidos de metales alcalinos o metales alcalinoterreos tales como hidroxido de sodio, potasio, calcio, magnesio y bario, amodaco y aminas organicas aromaticas, alidclicas o alifaticas tales como metilamina, dimetilamina, dietilamina, etanolamina y picolina. (Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.606.036.)

En algunas realizaciones, se proporciona una formulacion acuosa farmaceuticamente aceptable de dalbavancina que es adecuada para administracion parenteral, tal como, por ejemplo, inyeccion intravenosa. Para preparar una formulacion acuosa de este tipo, pueden usarse metodos bien conocidos en la tecnica, y puede usarse cualquier portador, diluyente, excipiente u otros aditivos farmaceuticamente aceptables normalmente usados en la tecnica. En una realizacion, una formulacion acuosa farmaceuticamente aceptable para inyeccion intravenosa incluye dextrosa al 5 %.

Una composicion farmaceutica para administracion parenteral incluye dalbavancina y un diluyente fisiologicamente aceptable tal como agua desionizada, solucion salina fisiologica, dextrosa al 5 %, disolvente miscible con agua (por ejemplo, alcohol edico, polietilenglicol, propilenglicol, etc.), vedculo no acuoso (por ejemplo, aceite tal como aceite de mafz, aceite de semillas de algodon, aceite de cacahuete y aceite de sesamo), u otros diluyentes usados de manera comun. La formulacion puede incluir adicionalmente un agente de solubilizacion tal como polietilenglicol, polipropilenglicol u otro agente de solubilizacion conocido, tampones para estabilizar la disolucion (por ejemplo, citratos, acetatos y fosfatos) y/o antioxidantes (por ejemplo, acido ascorbico o bisulfito de sodio). (Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.143.739.) Otros portadores farmaceuticos adecuados y sus formulaciones se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Tal como se conoce en la tecnica, tambien pueden prepararse preparaciones farmaceuticas de la invencion para que contengan niveles aceptables de materiales particulados (por ejemplo, libres de partfculas) y para que no sean pirogenicos (por ejemplo, que cumplan los requisitos de un inyectable en la farmacopea estadounidense).

En una realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica disolviendo una dosis secada (por ejemplo, liofilizada) de dalbavancina, que contiene un estabilizador o mezcla de estabilizadores, en una cantidad de agua y preferiblemente agua desionizada en un volumen suficiente para su solubilizacion. Normalmente, la cantidad de agua suficiente para su solubilizacion es de aproximadamente 10 ml y el pH resultante de la disolucion de dalbavancina esta por encima de 3,0, y aproximadamente de 3,5 a 4,5. La dilucion de esta disolucion anadiendola a una segunda cantidad de un diluyente acuoso, que contiene a menudo dextrosa al 5 %, tal como una cantidad contenida en una bolsa de goteo para administracion intravenosa, eleva el pH de la disolucion de dalbavacina hasta de aproximadamente 5 a 5,5. En otra realizacion, el pH de la disolucion de dalbavancina en una bolsa de goteo es de aproximadamente 4,5. La segunda cantidad de disolucion acuosa puede ser desionizada o esteril, o tanto desionizada como esteril. En una realizacion, el diluyente acuoso es dextrosa al 5 %.

Las composiciones farmaceuticas para administracion parenteral pueden constituirse en viales esteriles que contienen una o mas dosis unitarias de dalbavancina en una cantidad profilactica o terapeuticamente eficaz tal como se describio anteriormente, incluyendo opcionalmente un excipiente, en condiciones en las que la eficacia bactericida de la dalbavancina se conserva. La composicion puede estar en forma de un polvo seco (por ejemplo, liofilizado). Antes de su uso, puede anadirse un diluyente fisiologicamente aceptable y retirarse la disolucion por medio de una jeringa para su administracion a un paciente. Una formulacion farmaceutica tal como se describio anteriormente puede esterilizarse por cualquier medio aceptable incluyendo, por ejemplo, metodos de esterilizacion por radiacion gamma o de haz de electrones, o mediante filtracion esteril.

Una formulacion tfpica para la administracion parenteral puede incluir dalbavancina en una concentracion tal como de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 mg de dalbavancina por ml de preparacion final.

En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica segun la invencion incluye una mezcla de dalbavancina y uno o mas antibioticos adicionales. Preferiblemente, al menos un antibiotico distinto de dalbavancina en la mezcla es eficaz (por ejemplo, bactericida) frente a una o mas especies de bacterias gramnegativas, tal como, por ejemplo, aztreonam, y/o frente a una o mas cepas bacterianas grampositivas frente a las que la dalbavancina no es eficaz, tal como, por ejemplo, linezolida o daptomicina. La mezcla tambien puede incluir un portador farmaceuticamente aceptable tal como se describio anteriormente.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen una o mas sustancias estabilizantes que inhiben la degradacion de uno o mas de los componentes de dalbavancina a materiales inactivos o menos activos, por ejemplo, MAG. Tal como se usa en el presente documento, “sustancia estabilizante” o “estabilizador” se refiere a una sustancia que estabiliza el nivel de uno o mas de los componentes constitutivos de dalbavancina, por ejemplo, B⁰, en la composicion. Una “cantidad eficaz de estabilizacion” se refiere a una cantidad de un estabilizador suficiente para potenciar estabilidad a largo plazo de uno o mas componentes de una composicion de dalbavancina. En algunas realizaciones, puede proporcionarse una cantidad eficaz de estabilizacion mediante una mezcla de dos o mas sustancias estabilizantes, cada una de las cuales por sf sola no esta presente en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto estabilizante.

Los ejemplos de estabilizadores incluyen, por ejemplo, sustancias no ionicas tales como azucares, por ejemplo, mono-, di- o polisacaridos, o derivados de los mismos, alcoholes de azucares o polioles. Tales sustancias estabilizantes incluyen, por ejemplo, manitol, lactosa, sacarosa, sorbitol, glicerol, celulosa, trehalosa, maltosa, rafinosa, o mezclas de los mismos.

En una realizacion, la composicion farmaceutica incluye una razon en peso de manitol:dalbavancina 1:2. En otra realizacion, la composicion farmaceutica incluye una razon en peso de manitol:lactosa:dalbavancina 1:1:4. Sorprendentemente, se ha encontrado que una combinacion de manitol y lactosa proporciona un efecto estabilizante mayor que cualquier sustancia sola. A menudo, el pH de una composicion farmaceutica de la invencion es, por ejemplo, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, por ejemplo aproximadamente 3,5 o aproximadamente 4,5. En algunas realizaciones, pueden emplearse uno o mas procedimientos para reducir la formacion de MAG. Por ejemplo, puede emplearse liofilizacion de dalbavancina en presencia de una sustancia estabilizante, tal como manitol, para reducir la cantidad de MAG formada.

El almacenamiento de composiciones de dalbavancina es a menudo por debajo de la temperatura ambiental, tal como a aproximadamente 5 °C, para potenciar la estabilidad.

Eficacia mejorada y efectos secundarios reducidos

La dosificacion semanal de dalbavancina a niveles de dosificacion altos (es decir, que dan como resultando niveles en suero altos y duraderos sorprendentes) muestra un perfil de seguridad sorprendentemente bueno, similar a, o mejor que, el observado con la terapia de referencia de dosis mas bajas de antibioticos convencionales administrados diariamente o incluso 2-4 veces diariamente, tal como se demuestra mediante los ejemplos en el presente documento. Una dosificacion sorprendentemente alta (es decir, que da como resultado niveles en suero altos y duraderos sorprendentes) de dalbavancina puede administrarse, con menos frecuencia que otros antibioticos, y sin efectos secundarios adversos, permitiendo adhesion al tratamiento del paciente y eficacia mejoradas.

Tal como se comento en el ejemplo 1, el tratamiento con dalbavancina da como resultado una baja incidencia de acontecimientos adversos. Acontecimientos adversos graves incluyen cualquier experiencia adversa con farmacos que se produce a cualquier dosis que da como resultado un fallecimiento, es potencialmente mortal, da como resultado hospitalizacion o prolongacion de una hospitalizacion existente, o discapacidad o incapacidad persistente o significativa. En el ensayo de fase II descrito en el ejemplo 1, el 90% de las reacciones adversas, tales como diarrea, nauseas, hiperglucemia, dolor de extremidades, vomitos y estrenimiento, tuvieron una gravedad de leve a moderada. El uso de dalbavancina en el ensayo del ejemplo 1 no dio como resultado acontecimientos adversos graves relacionados con el tratamiento del farmaco en estudio.

Kits

Tambien se divulgan kits para su uso en metodos de tratamiento o profilaxis de infecciones bacterianas. Los kits incluyen una composicion farmaceutica de la invencion, por ejemplo que incluye al menos una dosis unitaria de dalbavancina, e instrucciones que proporcionan informacion a un profesional sanitario en cuanto a su uso para tratar o prevenir una infeccion bacteriana. Pueden proporcionarse instrucciones en forma impresa o en forma de un medio electronico tal como un disquete, CD o DVD, o en forma de una direccion de un sitio web de donde pueden obtenerse tales instrucciones. A menudo, una dosis unitaria de dalbavancina incluye una dosificacion de manera que cuando se administra a un individuo, se mantiene en el individuo un nivel en plasma profilactica o terapeuticamente eficaz de dalbavancina durante al menos 5 dfas. En algunas realizaciones, un kit incluye dos dosificaciones unitarias que van a administrarse con al menos 5 dfas de diferencia, a menudo con aproximadamente una semana de diferencia, a menudo incluyendo una primera dosificacion de dalbavancina que es de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3 veces mayor que la segunda dosificacion. A menudo se incluye la dalbavancina como una composicion farmaceutica acuosa esteril o composicion de polvo seco (por ejemplo, liofilizada).

Se proporciona un envasado adecuado. Tal como se usa en el presente documento, “envasado” se refiere a un material o matriz solido usados habitualmente en un sistema y capaz de contener dentro de los lfmites fijados una composicion de dalbavancina adecuada para su administracion a un individuo. Tales materiales incluyen frascos de vidrio y plastico (por ejemplo, polietileno, polipropileno y policarbonato), viales, papel, plastico y envolturas laminadas de plastico-papel de aluminio y similares. Si se emplean tecnicas de esterilizacion de haz de electrones, el envasado debena tener una densidad suficientemente baja como para permitir la esterilizacion del contenido.

Los kits tambien pueden incluir opcionalmente equipo para la administracion de dalbavancina, tal como, por ejemplo, jeringas o equipo para administracion intravenosa, y/o una disolucion esteril, por ejemplo, un diluyente tal como dextrosa al 5 %, para preparar una composicion en polvo seco (por ejemplo, liofilizada) para su administracion. Los kits pueden incluir, ademas de dalbavancina, un antibiotico distinto de dalbavancina o mezcla de antibioticos distintos de dalbavancina, para su uso con dalbavancina tal como se describio en los metodos anteriores.

En los ejemplos a continuacion, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Si una abreviatura no esta definida, tiene el significado generalmente aceptado.

AcOH = acido acetico

AcONa = acetato de sodio

ac. = acuoso

AST = aspartato aminotransferasa

ALT = alanina aminotransferasa

BV = volumen de lecho

CV = coeficiente de variacion

d = diametro

D = dalton

DCC = diciclohexilcarbodiamida

DMEPA = 3-(dimetilamino)-propilamina

DMSO = dimetilsulfonamida

eq = equivalentes

EU = unidades de endotoxina

g = gramo

CG = cromatograffa de gases

HCl = acido clorhndrico

H²O = agua

HOBT = 1-hidroxibenzotiazol hidratado

HPLC = cromatograffa de ffquidos de alta resolucion

H²SO⁴= acido sulfurico

IPA = isopropilamina

UI = unidad internacional

KF = fluoruro de potasio

kg = kilogramo

l = litro

CL/EM/EM = cromatograffa de ffquidos/espectrometna de masas/espectrometna de masas LDH = lactato deshidrogenasa

LSC = recuento por centelleo ffquido

m³= metro cubico

MeOH = metanol

mg = miligramo

ml = mililitro

mol = molar

PM = peso molecular

N = normal

NaOH = hidroxido de sodio

NMP = N-metil-2-pirrolidona

QTD = distribucion tisular cuantitativa

tR = tiempo de retencion

d.e. = desviacion estandar

TEA = trietilamina

Los ejemplos siguientes tienen la finalidad de ilustrar la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1. Eficacia y seguridad de dalbavancina una vez a la semana en infecciones de piel y tejido blando profundas

Este estudio controlado, aleatorizado evaluo la seguridad y eficacia de dos pautas posologicas de dalbavancina. Pacientes adultos con infecciones de piel y tejido blando (SSTI) que implican estructuras de piel profundas o que requieren intervencion quirurgica se aleatorizaron en tres grupos: el grupo de estudio 1 recibio 1100 mg de dalbavancina por medio de inyeccion intravenosa (i.v.) el dfa 1; el grupo de estudio 2 recibio 1 g de dalbavancina i.v. el dfa 1 y 500 mg de dalbavancina i.v. el dfa 8; el grupo de estudio 3 recibio “tratamiento de referenda”. Se valoraron los acontecimientos adversos y la respuesta microbiologica y clmica.

Poblaciones para analisis

Habfa 62 pacientes aleatorizados en el estudio; todos recibieron al menos una dosis del medicamento del estudio. Se evaluaron cuatro poblaciones del estudio para determinar la seguridad y eficacia y se definieron tal como sigue: La poblacion de intencion de tratar (ITT) incluyo todos los pacientes que recibieron al menos una dosis de farmaco del estudio (todos los sujetos del estudio aleatorizados). La poblacion de intencion de tratar microbiologica (MITT) eran todos pacientes ITT que teman un patogeno grampositivo confirmado por cultivo inicialmente. Se definio la poblacion evaluable clmicamente como aquellos que 1) cumplieron todos los criterios de entrada al estudio, 2) no tuvieron cambios en la terapia antimicrobiana para infeccion grampositiva tras el dfa 4, excepto para terapia decreciente oral (solo aplicada al grupo de tratamiento de referencia), 3) volvieron para la visita de valoracion de seguimiento (FU) (a menos de un fallo de tratamiento) y 4) no recibieron un antimicrobiano concomitante no aprobado en el protocolo (a menos de un fallo de tratamiento). La poblacion evaluable microbiologicamente era el subconjunto de pacientes evaluables clmicamente que teman un patogeno grampositivo confirmado por cultivo inicialmente.

Las poblaciones del estudio se muestran en la tabla 2.

Tabla 2. Poblaciones del estudio para tratamiento de SSTI con dalbavancina

ITT - intencion de tratar

MITT - subconjunto de poblacion de ITT con infeccion grampositiva confirmada por cultivo

EOT - fin de tratamiento

FU - seguimiento

La mediana de edad de los sujetos era de 50-55 anos (intervalo 18-86 anos). No habfa diferencias aparentes en la edad en los grupos de tratamiento. Habfa diferencias de sexo en los grupos de tratamiento, pero globalmente el estudio recluto el mismo numero de hombres y mujeres. La poblacion de pacientes era predominantemente de raza blanca. Estos resultados concordaban para las poblaciones tanto de ITT como clmicamente evaluables.

Se reclutaron 62 pacientes, 20 en el grupo de estudio 1 y 21 cada uno de los grupos de estudio 2 y 3. Los comparadores mas comunes para el tratamiento de referencia eran clindamicina, ceftriaxona, vancomicina y cefazolina. La duracion media del tratamiento en el grupo de estudio 3 fue de 15 dfas.

Patogenos iniciales y susceptibilidad

De los 62 pacientes de ITT, el 66 % (14 con una sola dosis de dalbavancina, 13 con dos dosis de dalbavancina, 14 con tratamiento de referencia) teman una terapia previa contra un patogeno grampositivo aislado (poblacion de MITT). El patogeno mas comun era S. aureus. La distribucion de patogenos iniciales se muestra en la tabla 3.

Tabla 3. Patogenos grampositivos iniciales e intervalo de MIC de dalbavancina para la poblacion de MITT

Respuestas microbiologicas y clmicas

La eficacia de las tres pautas de tratamiento se determino valorando la respuesta clmica de los pacientes y las respuestas microbiologicas documentadas o supuestas. El criterio de valoracion de eficacia primario fue la respuesta clmica en la visita de seguimiento para la poblacion clmicamente evaluable. Se categorizo la respuesta clmica, para las visitas de tanto EOT como FU, como exito (cura o mejora) o fracaso (incluyendo resultados indeterminados). Los pacientes clasificados como exitos no deben haber recibido tratamiento antibacteriano sistemico adicional para su infeccion. Se definio el fracaso como la persistencia de uno o mas signos y smtomas sistemicos o locales de SSTI de manera que se requirio tratamiento con agentes antibacterianos sistemicos nuevos o adicionales para las SSTI. Se valoro el desenlace microbiologico, una variable de eficacia secundaria, en la subpoblacion de pacientes que teman SSTI documentadas microbiologicamente (es decir, al menos un patogeno inicial identificado). Se valoro una respuesta microbiologica para cada patogeno grampositivo identificado inicialmente (es decir, erradicacion, supuesta erradicacion, persistencia, supuesta persistencia). Para pacientes para los que no se realizaron cultivos de seguimiento, las respuestas microbiologicas para patogenos iniciales se supusieron basandose en la respuesta clmica. La respuesta microbiologica por paciente en las visitas de EOT y FU se catalogo como exito (es decir, todos los organismos grampositivos erradicados o supuestamente erradicados) o fracaso (es decir, al menos un organismo grampositivo persistfa o se supuso que ha persistido, multiples patogenos con erradicacion parcial). Tanto en las visitas de EOT como FU, se valoraron la colonizacion y la superinfeccion. En la visita de FU, una respuesta bacteriologica del paciente podna incluir tambien recafda.

Eficacia cHnica

Las tasas de exito clmico se muestran en la tabla 4. En la poblacion evaluable clmicamente, el 61,5% de los pacientes en grupo de una sola dosis de dalbavancina, el 94,1 % del grupo de dos dosis de dalbavancina y el 76,2 % del grupo de tratamiento de referencia se clasificaron como exitos en el momento de la valoracion de FU. En un subanalisis exploratorio de aquellos pacientes categorizados con SSTI profunda o complicada inicialmente, la terapia con dos dosis de dalbavancina tambien proporciono una tasa de exito clmico mayor (93,8 %), en comparacion con las terapias con una sola dosis de dalbavancina y de tratamiento de referencia, el 58,3 % y el 73,7 %, respectivamente.

Se encontraron tasas de exito similares en las valoraciones tanto de EOT como de FU en las poblaciones evaluables microbiologicamente y de ITT de apoyo con una tendencia constante hacia una respuesta mas favorable tras tratamiento con dos dosis de dalbavancina (tabla 3). Para la poblacion de MITT, las tasas de exito clmico en la valoracion de FU para aquellos con S. aureus resistente a meticilina (MRSA) fueron del 50 % (3/6) para una sola dosis de dalbavancina, el 80 % (4/5) para dos dosis de dalbavancina y el 50 % (1/2) para pacientes tratados con una pauta de tratamiento de referencia.

Tabla 4. Tasas de exito clmico por grupo de tratamiento y poblacion de analisis

Eficacia microbiologica

Las tasas de exito de las diferentes pautas de tratamiento con respecto a diferentes patogenos se muestra en la tabla 5. Para la poblacion evaluable microbiologicamente, las tasas de erradicacion/supuesta erradicacion en la valoracion de FU para todos los organismos fue del 58,3 % (7/12) para una sola dosis de dalbavancina, del 92,3 % (12/13) para dos dosis de dalbavancina y del 70,6 % (12/17) para pacientes en el grupo de tratamiento de referencia. Para cepas aisladas que persistian, no hubo cambio en MIC de dalbavancina. En FU, las tasas de erradicacion de S. aureus fueron mayores para el grupo de dos dosis de dalbavancina (90 %) en comparacion con tratamientos de una sola dosis de dalbavancina (50%) y tratamiento de referencia (60%). Se observaron hallazgos similares para la poblacion de MITT; dos dosis de dalbavancina erradicaron el 80 % de las cepas aisladas de MRSA (tabla 5).

Tabla 5. Tasas de exito por patogeno para la poblacion de ITT microbiologicamente en la valoracion de FU

Para las poblaciones de MITT y evaluables microbiologicamente, se resumen las tasas de exito microbiologico en EOT y FU en la tabla 6. Se notificaron tasas de exito microbiologico comparables en ambas visitas para pacientes tratados con dos dosis de dalbavancina y pautas de tratamiento de referencia (aproximadamente del 64 % al 77 %), mientras que aquellos a los que se les dio una sola dosis de dalbavancina tuvieron tasas de exito menores (<40 %). Las tasas de exito microbiologico en EOT/FU en la poblacion evaluable microbiologicamente igualaron a los hallazgos de respuesta clmica: el 38,5%/27,3% para una sola dosis de dalbavancina, el 72,7 %/72,7 % para dos dosis de dalbavancina y el 71,4%/64,3% para terapia de tratamiento de referencia. Se observaron hallazgos similares para la poblacion de MITT (datos no mostrados).

Tabla 6. Tasas de exito microbiologico

Analisis farmacocinetico

Para pacientes aleatorizados a los grupos de tratamiento de dalbavancina, se obtuvieron 5 ml de sangre el dfa 8 para la determinacion de las concentraciones de dalbavancina en plasma. Para pacientes aleatorizados para recibir una dosis de 500 mg de dalbavancina el dfa 8, se obtuvo sangre justo antes de la administracion de la segunda dosis. Se obtuvieron muestras de 5 ml de sangre adicionales los dfas 10 y 24 para pacientes que se aleatorizaron al grupo de una sola dosis de dalbavancina y los dfas 20 y 34 para aquellos que recibieron dos dosis de dalbavancina. Se determinaron concentraciones en plasma de dalbavancina usando metodos de cromatograffa de lfquidos y espectrofotometro de masas validados. El lfmite inferior de cuantificacion era de 500 ng/ml para plasma.

Las concentraciones de dalbavancina medias recogidas en los d^as del estudio 8, 10 y 24 en la pauta una sola dosis fueron de 31,1 ±7,1, 25,2 ± 4,8 y 10,2 ±3,5 mg/l (media ± D.E.), respectivamente. Las concentraciones de dalbavancina tras la pauta de dos dosis los dfas del estudio 8 (antes de la segunda dosis), 20 y 34 fueron de 30,4 ± 8,2, 21,2 ±10,0 y 9,0 ± 4,4 mg/l, respectivamente. Tal como se esperaba, todos los pacientes teman concentraciones de dalbavancina de mas de 20 mg/l a lo largo de la primera semana tras la primera dosis, y se mantuvieron niveles por encima de 20 mg/l durante una semana adicional con una dosis adicional de 500 mg i.v. el dfa 8. Generalmente, las concentraciones bactericidas mmimas son de aproximadamente 4 a 10 mg/l.

Evaluacion de seguridad

Se evaluo a cada paciente que recibio al menos una dosis de farmaco del estudio (poblacion de ITT) para determinar la seguridad de farmacos a traves de la monitorizacion de acontecimientos adversos (AA), incluyendo resultados de prueba de laboratorio clmico anomalos y signos vitales. Se evaluaron los AA por el investigador segun su gravedad (leves, moderados, graves, potencialmente mortales), y por la relacion con el farmaco del estudio (no relacionado, probablemente no relacionado, posiblemente relacionado o probablemente relacionado).

Se presenta un resumen de los datos de AA en la tabla 7. La mayona de las reacciones adversas (90 %) se considero que teman una gravedad de leve a moderada. Todas las reacciones adversas graves (8 acontecimientos en 5 pacientes) no estaban relacionadas con el tratamiento del farmaco de estudio. Aproximadamente el 59 % de todos los pacientes que notificaron al menos un AA emergente del tratamiento (19 de una sola dosis de dalbavancina, 16 de dos dosis de dalbavancina, 21 de tratamiento de referencia) experimentaron un acontecimiento que el investigador categorizo como posible o probablemente relacionado con el farmaco del estudio. Espedficamente, se notificaron AA relacionados con el farmaco en 11 pacientes (55%) de una sola dosis de dalbavancina, 10 (48%) de dos dosis de dalbavancina y 12 (57%) de tratamiento de referencia. Los AA relacionados con el farmaco notificados mas frecuentemente en grupos tanto de dalbavancina como de tratamiento de referencia fueron diarrea y nauseas. En la tabla 8 se presenta un resumen de tipos de AA observados para los diferentes grupos de tratamiento.

Ningun paciente tratado con dalbavancina abandono el tratamiento prematuramente debido a un AA. Tres de 21 (14 %) pacientes en una pauta de tratamiento de referencia abandonaron el tratamiento prematuramente debido a un AA, incluyendo un paciente que desarrollo urticaria el dfa 1 que estaba probablemente relacionada con el farmaco y dos pacientes que tuvieron AA no relacionados con el farmaco del estudio (superinfeccion con P. aeruginosa y nivel valle de vancomicina elevado).

Tabla 7. Resumen de datos de acontecimientos adversos (AA)

Tabla 8. Acontecimientos adversos mas comunes

Discusion

Este ensayo de fase II aleatorizado, abierto, muestra que la dalbavancina es eficaz para el tratamiento de adultos con SSTI. La mayona de los pacientes reclutados teman infecciones profundas o complicadas (>90 %) e infecciones que requenan intervencion quirurgica (~70 %), mientras que aproximadamente el 45 % teman diabetes mellitus subyacente.

Dos dosis semanales de dalbavancina tuvieron una tasa de respuesta clmica numericamente mayor que o bien una sola dosis de dalbavancina o la pauta de tratamiento de referencia. Datos de poblaciones tanto de ITT como evaluables clmicamente sugieren que una pauta de dos dosis inyectables semanales secuenciales de dalbavancina (1000 mg, 500 mg semanalmente) es eficaz en el tratamiento de SSTI. El grupo de tratamiento de referencia se trato durante una mediana de duracion de 13dfas. En el seguimiento, se considero exitos clmicos al 94% de los pacientes clmicamente evaluables tratados con dos dosis de dalbavancina, frente al 76 % de aquellos a los que se les administro una pauta de tratamiento de referencia y el 61,5% de pacientes que recibieron una sola dosis de dalbavancina.

El organismo aislado mas frecuentemente aislado inicialmente fue S. aureus. En este ensayo, aproximadamente el 83 % de los pacientes estaban infectados con S. aureus y el 38 % de todas las cepas de S. aureus eran MRSA. Un unico patogeno provoco la mayona de las infecciones (80 %). Los MIC para dalbavancina contra cepas aisladas grampositivas, incluyendo MRSA, oscilaron entre 0,016 y 0,25 mg/l.

Las tasas de exito microbiologico igualaron a las de respuesta clmica para la poblacion evaluable clmicamente. Para todos los organismos combinados, el tratamiento con la pauta de dos dosis de dalbavancina semanalmente proporciono mayores tasas de erradicacion en la valoracion 2 semanas tras la terapia (92 %) en comparacion con terapias de una sola dosis de dalbavancina (58 %) y tratamiento de referencia (71 %). Globalmente, se observaron tasas de erradicacion de S. aureus en el 90 %, el 50 % y el 60 % de los pacientes, respectivamente. Para la poblacion de MITT, las tasas de erradicacion para MRSa fueron del 80% para la pauta de dos dosis de dalbavancina frente al 50 % tanto para las terapias de una sola dosis de dalbavancina como de tratamiento de referencia.

Las concentraciones de dalbavancina obtenidas al final de los periodos de tratamiento de una sola dosis y dos dosis semanalmente (dfa 10 o dfa 20, respectivamente) fueron similares, sugiriendo poca acumulacion de farmaco tras la segunda dosis semanal. La mayor tasa de exito clmico observada con la pauta de dos dosis sugiere destruccion dependiente de tiempo en la que se proporcionaron niveles sostenidos de farmaco o exposicion a farmaco con dos dosis de dalbavancina separadas por una semana. Los niveles en plasma de dalbavancina medidos al final del intervalo de dosificacion semanal fueron sustancialmente mayores que el MIC⁹⁰notificado para patogenos responsables de la mayona de SSTI (<0,03 a 0,5 mg/l), incluyendo los encontrados en este ensayo. Estos niveles tambien estaban por encima de las concentraciones bactericidas mmimas de 4 a 10 mg/l.

La tasa global de reacciones adversas era similar para tanto las pautas de dalbavancina como el grupo de tratamiento de referencia. Los acontecimientos adversos gastrointestinales relacionados con farmacos (es decir, diarrea y nauseas) fueron los mas comunmente notificados en los tres grupos de tratamiento. La mayona de estos acontecimientos fueron leves y autolimitados. Ningun paciente tratado con dalbavancina se retiro del estudio de manera temprana debido a una reaccion adversa, ni se notifico ningun acontecimiento adverso grave atribuible al glicopeptido, sin embargo el 14% del grupo de tratamiento de referencia se retiro debido a efectos adversos. Por tanto, la nueva pauta posologica tuvo efectos secundarios reducidos adversos en comparacion con el tratamiento de referencia. Los datos de este ensayo no encontraron evidencia de que dalbavancina induzca algun grado de hepatotoxicidad o nefrotoxicidad clmicamente significativas.

El tratamiento de dos dosis de dalbavancina parece eficaz para tratamiento de pacientes con SSTI complicadas. En este ensayo clmico se tolero bien dalbavancina a ambas dosis, con un perfil de acontecimientos adversos similar al del grupo de tratamiento de referencia.

Ejemplo 2. Farmacocinetica y excrecion renal de dalbavancina en sujetos sanos

Los objetivos principales de este estudio fueron caracterizar la farmacocinetica de dalbavancina y calcular la magnitud de la excrecion renal en sujetos sanos que reciben una dosis terapeutica del farmaco. Fue un estudio no comparativo, abierto.

Tratamiento con farmaco del estudio

Se les administro a sujetos sanos masculinos o femeninos de entre 18 y 65 anos de edad una sola dosis i.v. de 1000 mg de dalbavancina infundida durante 30 minutos.

Se reclutaron seis sujetos, una mujer y cinco varones, recibieron medicamento del estudio y completaron todos los aspectos del estudio. Tres sujetos eran de raza blanca y tres sujetos eran afroamericanos. La edad media era de 29,8 anos (intervalo de 22 a 63). La altura media era de 68,6 pulgadas (intervalo de 63 a 75) y el peso medio era de 179,6 libras (de 140 a 244).

Farmacocinetica

Se recogieron sangre y orina (recogidas de 24 h) en los dfas de estudio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28 y 42. Se extrajeron muestras de sangre en tubos heparinizados y se centrifugaron. Se separo el plasma y se almaceno congelado a -20 °C hasta el momento del ensayo. Se sometieron a ensayo muestras de plasma y orina para determinar dalbavancina usando metodos de CL/EM/EM validados. El lfmite inferior de cuantificacion del ensayo era de 500 ng/ml para orina y plasma.

Se estimaron los parametros farmacocineticos de dalbavancina mediante metodos no compartimentales usando el software WinNonlin™ (Pharsight Corporation). Los valores de concentracion maxima (Cmax) se obtuvieron directamente a partir de los datos observados. El area bajo la curva (AUC) de concentracion en plasma-tiempo se calculo usando la regla trapezoidal lineal. El aclaramiento (CL) se calculo como dosis/AUC. La semivida de eliminacion (t-io) se estimo mediante regresion lineal de la parte log-lineal de la curva de concentracion logantmica frente al tiempo. Se calcularon estimaciones del volumen de distribucion (V^z) usando los parametros de regresion, mientras que el volumen de distribucion en estado estacionario (V^ss) se calculo a partir del area bajo el primer momento de la curva (AUMC) multiplicado por la dosis y dividido entre AUC. La cantidad acumulada de dalbavancina excretada en orina se determino integrando la tasa de excrecion de orina (AURC). El CL^r, o aclaramiento renal, se calculo como la razon: CL^r= AURC/AUC.

Las concentraciones en plasma de dalbavancina frente al tiempo se muestran para todos los sujetos en la figura 1. Se presentan parametros farmacocineticos en la tabla 9. Las concentraciones eran similares en todos los sujetos. Las concentraciones maximas en plasma eran de aproximadamente 300 mg/l y se lograron inmediatamente tras el final de la infusion. La dalbavancina muestra un volumen de distribucion aparente de mas de 10 l y se supone que esta bien distribuida en el lfquido extracelular.

La dalbavancina se elimino lentamente con una t-i^/2de 9-12 dfas. El aclaramiento total del farmaco era de 0,0431 ± 0,0074 l/h. La fraccion estimada de farmaco excretado inalterado en orina era del 42 % de la dosis administrada, y el aclaramiento renal se estimo como 0,018 l/h. La variabilidad observada en los sujetos fue baja con un coeficiente de variacion menor del 22 % en todos los parametros farmacocineticos.

Tabla 9. Parametros farmacocineticos

Cmax t1/2 AUC Vz CL Vss AURC % de CLr mg/l h mg.h/l l l/h l mg excrecion l/h renal

Media 301 257 23843 16,0 0,0431 11,5 419 41,9 0,0181

D.E. 65 21 4526 3,1 0,0074 2,13 27 2,7 0,0036

% de CV 21,6 8,1 19,0 19,5 17,1 18,6 6,4 6,4 20,1 Mm. 243 227 19844 11,7 0,0332 8,58 379 37,9 0,0130 Max. 394 282 30100 19,6 0,0504 13,9 448 44,8 0,0226 Valoraciones de seguridad

Se registraron y valoraron acontecimientos adversos segun su gravedad y relacion con el farmaco de estudio. Se recogieron datos de laboratorio (analisis qmmicos, CBC con diferencial, analisis de orina) y se valoraron los cambios desde los valores iniciales y fuera de intervalo. Se obtuvieron ECG, examen ffsico y signos vitales, y se valoraron los cambios desde el nivel inicial.

La dalbavancina se tolero bien en este estudio. No se notificaron muertes o acontecimientos adversos graves de sujetos durante este estudio y ningun sujeto se retiro prematuramente de este estudio debido a un AA.

Todos los voluntarios notificaron al menos un AA, todos de intensidad leve. Tres voluntarios notificaron AA que estaban posiblemente relacionados con el medicamento del estudio: ALT elevada (valor de 46 Ul/l, lfmite superior de la normalidad 40 Ul/l) en un sujeto; eosinofilia (valor 0,5 * 103/|il, lfmite superior de la normalidad 0,4 * 103/|il), LDH elevado (valor 303 Ul/l, lfmite superior de la normalidad 90 Ul/l), ALT elevada (valor 54 Ul/l, lfmite superior de la normalidad 40 Ul/l), AST elevada (valor 42 Ul/l, lfmite superior de la normalidad 40 Ul/l) todo en un sujeto; y acufenos en un sujeto.

No se observaron tendencias en los resultados de ECG, signos vitales, analtticas y hematologfa tras el nivel inicial. Discusion

Se tolero bien una sola dosis i.v. de 1000 mg de dalbavancina. Tras una sola infusion intravenosa de 1000 mg, se mantienen concentraciones en plasma de dalbavancina por encima de 45 mg/l durante al menos siete dfas. Esto esta por encima de las concentraciones que se sabe que son bactericidas (4-32 mg/l). Esto apoya el uso de dalbavancina como pauta una vez a la semana. El perfil de eliminacion urinaria indica que la excrecion renal es una ruta de eliminacion importante, con aproximadamente el 40 % excretado en orina. Este hallazgo es consecuente con observaciones en animales. Ya que los rinones no son la ruta de eliminacion exclusiva, puede que no sea necesario un ajuste de la dosificacion de dalbavancina en pacientes con disfuncion renal.

Ejemplo 3. Union a protemas de dalbavancina usando microcalorimetna de valoracion isotermica

Se midio la union de dalbavancina a proteinas mediante microcalorimetna de valoracion isotermica (ITC) en fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 25 y 37 °C usando un instrumento de Microcal VP-ITC. En un experimento tipico, se inyectaron 25 * 10 |il de protema (~150 |iM) en una celda de calonmetro que contema disolucion de dalbavancina (~5 |iM). Se determinaron las concentraciones de dalbavancina y protema reales midiendo la absorbencia a 280 nm. Los experimentos de control incluyeron inyecciones de protema en tampon (en ausencia de dalbavancina) para explicar los calores de dilucion de protema en condiciones identicas. Para comparacion, se realizaron experimentos similares con algunas modificaciones necesarias usando teicoplanina.

Se llevaron a cabo experimentos con dalbavancina con cada una de las siguientes protemas: albumina humana; albumina de perro; albumina de rata; albumina bovina; y a-glicoprotema humana. La teicoplanina se estudio con albumina y a-glicoprotema humanas. Se muestra una comparacion de afinidades de union a dos temperaturas diferentes en la tabla 10.

Tabla 10. Comparacion de afinidades de union aparentes (Ka, * 105 M"1)

25 °C 37 °C

Dalbavancina

Albumina humana 1,35 (± 0,2) 1,33 (± 0,15)

Albumina de rata 3,1 (± 0,5) 2,8 (± 1,8)

Albumina de perro 0,62 (± 0,09) 0,50 (± 0,13)

Albumina bovina 1,38 (± 0,14)

a-Glicoprotema 1,84 (± 0,36) 4,8 (± 2,3)

Teicoplanina

Albumina humana 0,96 (± 0,08)

g-Glicoproteina 0,07 (± 0,01)

Los ± errores entre parentesis son las desviaciones estandar obtenidas de la rutina de ajuste.

Se analizaron efectos termicos integrados, despues de la correccion para calores de dilucion, mediante regresion no lineal usando un modelo de union a un solo sitio simple con el paquete de software convencional Microcal ORIGIN. Se integraron los datos en bruto (|ical/s) para cada inyeccion para dar el efecto termico total por adicion, entonces se dividio entre la cantidad de inyectante para dar kcal/mol de inyectante. Se aplico la misma integracion para efectos de dilucion de control, y esto se resto de los datos de valoracion reales. Esto proporciono un diferencial de la curva de union en la que la magnitud de union es proporcional al calor total liberado (o absorbido). Entonces, se analizo esto mediante metodos de regresion no lineal en cuanto a diversos modelos de union convencionales. El modelo mas simple supone equilibrio de union no competitiva simple, y proporciona tres parametros:

Ka (= 1/Kdis) es la asociacion de union (constante de disociacion)

AH = la entalpfa de union (el tamano de senal relacionada con union)

N = numero de sitios de union (asumiendo que el modelo de union es correcto)

Asumiendo union no competitiva, N es el numero (relativo) de moles de inyectante requeridos para saturar todos los sitios de union disponibles en la muestra. Para los experimentos de dalbavancina, dalbavancina es la “muestra” y la protema (HSA, etc.) es el “inyectante”. Estos resultados preliminares indican que la union es relativamente debil y, debido a la escasa solubilidad de la dalbavancina, es diffcil determinar la estequiometna de union (N) ineqmvocamente. Sin embargo, tal como se observa en la figura 2, en todos los casos, los datos se ajustan bien con N<1 (es decir, menos de uno a uno de protema respecto a dalbavancina). En consecuencia, un valor de N = 0,5 significa que solo son necesarios la mitad de los moles de protema para unir toda la dalbavancina de lo que cabna esperar. Dicho de otro modo, cada protema se une aparentemente a dos moleculas de dalbavancina. Es posible que la dalbavancina forme un dfmero que se une 1:1 con una protema. Los resultados de modelado de estequiometna de union sugieren que dos moleculas dalbavancina se unen a una molecula de protema, a diferencia de teicoplanina, que muestra union 1:1.

La tabla 11 presenta el porcentaje calculado unido para concentraciones de antibiotico en el intervalo 1-500 |iM, suponiendo concentraciones fisiologicas de albumina serica humana (6 * 10-4 M) y a-glucopeptido (1,5 * 10-5M). Para relacionar esto con la situacion clmica, la concentracion maxima de dalbavancina en el hombre es aproximadamente de 300 mg/l, o 165 |iM.

Tabla 11. Porcentaje calculado de union de teicoplanina y dalbavancina a protemas plasmaticas

ND = no realizado

En estos experimentos, la union de dalbavancina a albumina serica humana supera el 98 %. La fraccion unida es bastante constante en el intervalo seleccionado de concentraciones de dalbavancina, es decir 1-500 |iM. Este intervalo abarca las concentraciones terapeuticas en el hombre. La union de dalbavancina a a-glicoprotema es mucho mayor que la de teicoplanina. La dalbavancina demuestra alta capacidad y baja afinidad por protemas plasmaticas de diferente origen, con valores de Ka similares en protemas de todas las especies sometidas a prueba. Estos resultados ayudan a explicar algunas de las caractensticas farmacocineticas unicas de la dalbavancina. La union y formacion de un complejo de dalbavancina:protema 2:1 tambien explica la semivida prolongada, y el volumen de distribucion aparente, que se aproxima al volumen de agua extracelular. La baja afinidad ayuda a explicar la actividad in vivo observada, que supera enormemente lo que cabna esperar para un compuesto con una fraccion libre cercana al 1 %. La alta capacidad de las protemas plasmaticas ayuda a explicar las concentraciones en plasma relativamente altas logradas a pesar de la escasa solubilidad del compuesto a pH fisiologico.

Ejemplo 4. Atributos farmacocineticos y distribucion tisular de dalbavancina en ratas

Se realizaron dos estudios en ratas a las que se les administro una sola infusion i.v. de 20 mg/kg de [3H]-dalbavancina. Se recogieron excrementos y mas de 40 tejidos diferentes a lo largo de 70 dfas tras la administracion, y se determino la distribucion tisular y farmacocinetica de la radioactividad derivada del farmaco.

Para estos estudios, se uso [3H]-dalbavancina purificada por HPLC. El farmaco radiomarcado se preparo mediante intercambio de tritio y se purifico por HPLC.

Estudio de balance de masa en ratas

Se llevaron a cabo estudios de balance de masa para determinar el patron de excrecion de dalbavancina tras una sola infusion intravenosa (i.v.) de dalbavancina en ratas macho.

Quince ratas Sprague-Dawley macho recibieron una sola dosis i.v. de 3H-dalbavancina (20 mg/kg, 100 |iCi/rata). Tras la administracion de la dosis, se recogieron orina y heces a intervalos de 24 horas hasta 14, 36 y 70 dfas despues de la dosis (3 ratas/tiempo de recogida final). Tambien se recogieron lavados de jaula con agua y metanol. Se analizaron los cadaveres al final del periodo de recogida. Todas las muestras se analizaron para determinar su contenido de radioactividad total mediante recuento de centelleo lfquido (LSC).

Tras la administracion i.v. de 3H-dalbavancina en ratas, se elimino la radioactividad derivada de farmaco tanto en orina (~ 2/3 de radioactividad excretada) como en heces (~ 1/3 de radioactividad excretada). Aproximadamente la mitad de la radioactividad administrada se elimino en la orina y heces en el plazo de la primera semana, lo que concuerda con una t-ic en plasma de aproximadamente 1 semana. A los 70 dfas despues de la dosis, solo el 4,5 % de la dosis permaneda en el cadaver. Se recupero radioactividad despreciable en los lavados de jaula. Practicamente toda la radioactividad administrada (orina, heces, cadaver, lavados de jaula e intercambio de tritio) se explico durante el estudio.

Estudio de distribucion tisular cuantitativa (QTD) en ratas

Se llevaron a cabo estudios de distribucion tisular cuantitativa para valorar la distribucion tisular de dalbavancina tras una sola infusion i.v. de dalbavancina a ratas macho.

Cuarenta y una ratas Sprague-Dawley macho recibieron una sola infusion i.v. de 3H-dalbavancina (20 mg/kg, 50 (|iCi/rata). Las ratas (3 por punto de tiempo) se sometieron a eutanasia a las 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 336, 840, 1176 y 1680 horas despues de la dosis para la recogida de sangre, plasma y tejidos (incluyendo cadaver). Todas las muestras se analizaron por LSC.

Se determinaron los perfiles concentracion-tiempo para mas de 40 tejidos, incluyendo rinon, tngado, bazo, sangre, plasma, pulmon y piel. Las concentraciones y valores t-i^/2de la radioactividad derivada de farmaco en tejidos, incluyendo piel, fueron comparables a los observados en plasma. Se encontro que la dalbavancina se distribuyo rapida y ampliamente teniendo todos los tejidos concentraciones cuantificables de radioactividad derivada de farmaco en un plazo de 12 horas despues de la post-infusion. La mayona de tejidos alcanzaron la concentracion maxima (Cmax) en un plazo de 24 h despues de la dosis. La radioactividad recuperada despues de 5 dfas era de <5 % de la dosis en cualquier tejido individual. A los 70 dfas despues de la dosis, solo el cadaver conservaba >1 % (2,34 %) de la radioactividad administrada. Por tanto, la dalbavancina no se acumulo en ningun tejido, organo o componente celular sangumeo individual. Las concentraciones de radioactividad en el SNC eran bajas pero detectables en este modelo animal sano. Se encontro que la dalbavancina penetra en la piel con concentraciones de radioactividad derivada de farmaco que eran tal altas como o mayores que en plasma. La razon en sangre con respecto a plasma de radioactividad derivada de farmaco permanecio relativamente constante a lo largo del tiempo y era <1.

Como parte de los estudios de QTD, se recogieron muestras de bilis de ratas con el conducto biliar canulado (4 animales) durante 384 h (16 dfas) despues de la dosis. Casi el 11 % de la dosis se recupero en la bilis a lo largo de 384 h despues de la dosis. Esto representa la mayona de la radioactividad derivada de farmaco hallada en heces.

Ejemplo 5. Determinacion cuantitativa de dalbavancina en plasma mediante HPLC-EM/EM

Se desarrollo un metodo de HPLC-EM/EM para la medicion cuantitativa de dalbavancina en plasma, tal como se describe a continuacion.

Preparacion de patrones de control de calidad y calibracion de dalbavancina

Se prepararon disoluciones madre de dalbavancina disolviendo dalbavancina en agua desionizada para preparar una disolucion de 1000 |ig/ml, seguido de diluciones en serie en agua desionizada para preparar disoluciones de 500, 50 y 10 |ig /ml.

Se prepararon patrones de calibracion de concentracion de dalbavancina de 100, 60 y 40 |ig/ml realizando adiciones conocidas en plasma humano de volumenes apropiados de una disolucion madre de dalbavancina de 1000 |ig/ml preparada tal como se describio anteriormente. Se prepararon patrones de calibracion de concentracion 20 y 10 |ig/ml realizando adiciones conocidas en plasma humano de volumenes apropiados de una disolucion madre de dalbavancina de 500 |ig/ml, y se preparo un patron de calibracion de 0,5 |ig/ml realizando adiciones conocidas en plasma humano de un volumen apropiado de una disolucion madre de 10 |ig/ml.

Se prepararon patrones de control de calidad de 90 y 30 |ig/ml de dalbavancina realizando adiciones conocidas en plasma humano de un volumen apropiado de una disolucion madre de dalbavancina de 1000 |ig/ml preparada tal como se describio anteriormente. Se preparo un patron de control de calidad de 1,5 |ig/ml realizando adiciones conocidas en plasma humano de un volumen apropiado de una disolucion de 50 |ig/ml.

Preparacion de disolucion de trabajo de patron interno

Se preparo tal como sigue una disolucion de trabajo de 30 |ig/ml de patron interno BI-K0098, que es el derivado de dietilaminopropilamino de A-40926. Se disolvieron aproximadamente 10 mg de BI-K0098 en aproximadamente 10 ml de fase movil A (el 80 % de formiato de amonio/acido formico 10 mM, pH 3 (v/v), el 10 % de acetonitrilo (v/v) y el 10% de 2-propanol (v/v)) para preparar una disolucion madre de patron interno de 1000 |ig/ml. Entonces, la disolucion madre (300 ml) se diluyo hasta un volumen de 10 ml con fase movil A para preparar una disolucion de patron interno de 30 |ig/ml.

Preparacion de muestras para analisis

Se prepararon muestras tal como sigue para la determinacion cuantitativa de la concentracion de dalbavancina en plasma. A 50 |il de patrones de calibracion o de control de calidad preparados tal como se describio anteriormente, se les anadieron 100 |il de disolucion normalizada de trabajo de patron interno y se mezclaron. Se dejo que la mezcla se equilibrara durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de adicion de 250 |il de acetonitrilo. Entonces se agito la mezcla en vortex durante 10segundos, seguido de centrifugacion durante 1 minuto a aproximadamente 10000 rpm en una microcentnfuga 4214 de ALC. Se transfirio el sobrenadante a tubos limpios y se evaporo hasta sequedad en un sistema Savant Speed-Vac a aproximadamente 40 °C. Entonces se resuspendieron las muestras en 150 |il de fase movil A.

Metodo analftico

Se inyectaron muestras de 50 |il preparadas para analisis tal como se describio anteriormente en una columna Fenomenex Jupiter C¹⁸(50 x ²mm, C¹⁸5 |im 300 A), y se analizaron en condiciones de HPLC en gradiente a una velocidad de flujo de 0,3 ml/min. Las condiciones en gradiente eran: inicial, el 80 % de fase movil A/el 20 % de fase movil B (el 20 % de formiato de amonio/acido formico 10 mM, pH 3 (v/v), el 40 % de acetonitrilo (v/v), el 40 % de 2-propanol (v/v)); 1 minuto, el 20 % de fase movil A/el 80 % de fase movil B; 2 minutos, el 20 % de fase movil A/el 80 % de fase movil B; 2,5 minutos, vuelta a condiciones iniciales.

El sistema de HPLC se acoplo con un espectrometro de masas de cuadrupolo triple PE SCIEX API-2000, con turboion spray operando en un modo de ionizacion positivo. Se uso aire para generar un spray en la fuente de iones. Se fijo la temperatura de sonda a 500 °C con nitrogeno como gas cortina. Se empleo monitorizacion de reacciones multiples (^mR^m) usando nitrogeno como gas de colision. Los analitos se detectaron por monitorizacion de las siguientes transiciones de iones: 909,3 Da ^ 1429,3 Da para dalbavancina, y 923,3 Da ^ 1457,3 Da para el patron interno (BI-K0098). Para evitar la contaminacion del espectrometro de masas, se realizo una derivacion del flujo despues de columna en el primer minuto y 2,5 minutos despues del comienzo del ciclo cromatografico.

Se uso el software Sample Control 1.4 para la adquisicion de analisis de datos y se uso el software MacQuan 1.6 para la integracion de picos cromatograficos y evaluacion de datos estadfsticos.

Curvas de calibracion

Se valoro la linealidad del metodo de ensayo sometiendo a ensayo patrones de calibracion para generar una curva de calibracion. La concentracion de dalbavancina en una muestra de plasma se determino calculando la razon de areas de pico entre dalbavancina y el patron interno.

Se construyeron curvas de calibracion para las concentraciones de dalbavancina a lo largo de un intervalo analftico de 0,5-100 |ig de dalbavancina/ml de plasma humano usando la ecuacion y = A+ Bx (ponderado 1/x), donde A representa la ordenada en el origen de la curva, B representa la pendiente de la curva, x representa la concentracion de dalbavancina del patron de calibracion (|ig/ml) e y representa la razon de areas de pico de dalbanvancina con respecto al patron interno. Se construyeron tres curvas de calibracion independientes. Los resultados mostraron que la razon de areas de dalbavancina/patron interno y las concentraciones de dalbavancina variaban linealmente a lo largo del intervalo analftico. El ftmite inferior de cuantificacion (LLOQ) era de 0,5 |ig de dalbavancina por ml de plasma humano. Las pendiente de las curvas de calibracion eran reproducibles y sus coeficientes de correlacion eran mayores de 0,9995.

Estabilidad de dalbavancina en plasma

La estabilidad de dalbavancina en muestras de plasma se sometio a prueba analizando tres patrones de control de calidad por duplicado de muestras de plasma humano, preparadas tal como se describio anteriormente, a dos concentraciones diferentes, 1,5 y 90 |ig/ml. La concentracion de dalbavancina detectable era estable despues de tres ciclos de tratamiento de congelacion-descongelacion. La concentracion de dalbavancina en muestras procesadas era estable despues de 24 horas a temperatura ambiente. No se observo reduccion en la concentracion de dalbavancina con respecto a las muestras de tiempo cero.

Ejemplo 6. Analisis por espectroscopia de masas de dalbavancina.

Se investigo la naturaleza de multfmeros de dalbavancina en disolucion y se determinaron las condiciones que influyen en la razon de poblacion de multimeros de dalbavancina con respecto a monomeros de dalbavancina mediante espectroscopia de masas por electrospray (ESI-EM).

Se realizaron los experimentos usando un espectrometro de masas API III+ de Applied Biosystem dotado de una fuente de turboion spray, un analizador de cuadrupolo triple, operando en modo de iones positivos. Se notifican las condiciones optimizadas en la tabla 12 a continuacion.

Tabla 12: Condiciones instrumentales para analisis de dalbavancina en espectrometro de masas API III+ de Applied Biosystem.

Dalbavancina en disolucion

Se ajustaron los parametros instrum ental en una disolucion de dalbavancina que contema 0,1 mg/ml de dalbavancina disuelta en una disolucion de agua:isopropanol 8:2. Se adquirio un espectro de dalbavancina en disolucion en el intervalo de 500-2000 uma tras inyeccion directa de la disolucion. El espectro resultante, tal como se observa en la figura 3, indica la presencia de multimeros de dalbavancina. Como ejemplo no limitativo, se atribuye un perfil del espectro al homomultimero de B⁰, que esta presente como especie ionica (2nM y(+3)), donde n es un numero entero positivo que indica la multiplicidad del homomultimero, por ejemplo, n = 1 cuando el multimero es un homodfmero y n = 2 cuando el multimero es un homotetramero, M indica la masa del monomero, y = n y 3 indica una carga ionica de mas tres. Por ejemplo, se proporciona el homodfmero de B⁰cuando n = 1, y = 1, y M = masa de B⁰. Esta especie de homodfmero se asigna a un perfil ionico (2M+3) en el espectro de masas.

Influencia de la concentracion de dalbavancina sobre la razon de poblacion de multmeros de dalbavancina con respecto a monomeros

La influencia de la concentracion de dalbavancina sobre la razon de poblacion de multimeros con respecto a monomeros se evaluo mediante espectroscopfa de masas usando las condiciones descritas anteriormente. Los espectros se adquirieron mediante infusion directa de disoluciones de dalbavancina en concentraciones de 20, 40, 60 y 80 |ig/ml. Se notificaron las intensidades de los picos principales como funcion de la concentracion de dalbavancina y se determinaron las razones de poblacion de multimeros con respecto a monomeros de dalbavancina, tal como se muestra en la figura 4.

Los datos indican que la razon de poblacion de multfmeros de dalbavancina con respecto a monomeros de dalbavancina aumenta con concentracion creciente. Esto puede ayudar a explicar las altas capacidades de carga de farmaco que pueden administrarse a un individuo. La funcion del multimero como deposito del monomero puede disminuir la tendencia de las muestras de concentracion mayor a formar precipitados y potenciar las concentraciones que pueden administrarse a un individuo. La presencia de multfmeros tambien puede permitir una rapida administracion de una dosis de dalbavancina a un individuo.

Se proporciona un ejemplo no limitativo de un metodo de determinacion de la razon de poblacion de multfmeros de dalbavancina con respecto a monomeros, por ejemplo, determinando la razon entre intensidades de pico de iones A y B tal como se muestra en la figura 3. Dividir la intensidad de pico A entre la intensidad de pico B proporciona una medida de la razon de poblacion de multfmeros de dalbavancina con respecto a monomeros.

Influencia del pH sobre la razon de poblacion de multmeros de dalbavancina con respecto a monomeros

Se evaluo la influencia del pH de disolucion sobre la razon de poblacion de multimeros de dalbavancina con respecto a monomeros en las condiciones instrumentales descritas anteriormente y a los siguientes valores de pH de disolucion: 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 y 5,5. Se determino la razon de poblacion de multimeros de dalbavancina con respecto a monomeros a cada uno de los valores de pH y se represento graficamente frente al pH, tal como se observa en la figura 5. Se determino que la razon de poblacion de multimeros de dalbavancina con respecto a monomeros aumenta con pH creciente.

Aunque sin estar limitado a la teona, se cree que los grupos ionicos, tales como un grupo carboxilato en un primer monomero de dalbavancina, ayudan en la estabilizacion de multimeros de dalbavancina formando interacciones ionicas con iones de carga opuesta, tales como grupos nitrogeno terciario, en un segundo monomero de dalbavancina. El pH puede influir en tales interacciones ionicas. Se cree que la tendencia creciente de la dalbavancina a estar presente como multimero a pH mayores indica que las interacciones ionicas son importantes en la estabilizacion de multimeros. En particular, se cree que los multimeros de dalbavancina se desestabilizan a pH inferior, presumiblemente debido a la interrupcion de las interacciones ionicas que contribuyen a la estabilidad de multimeros ya que ciertos grupos funcionales, tales como grupos carboxilato, pueden protonarse a valores de pH inferiores.

Influencia de la fuerza ionica en disolucion sobre la razon de poblacion de multmeros de dalbavancina con respecto a monomeros

Se determino la influencia de la fuerza ionica en disolucion sobre la razon de poblacion de multimeros de dalbavancina con respecto a monomeros mediante espectrometna de masas. Los espectros de masas se obtuvieron en modo positivo de electrospray en un instrumento de trampa de iones Finnigan LCQDeca previamente ajustado y calibrado en modo de electrospray usando Ultramark 1621, cafema y MRFA (L-metionil-arginil-fenilalanil-arginina). Todos los espectros de masas se registraron usando las condiciones enumeradas en la tabla 13. Los parametros de muestra que se investigaron se enumeran en la tabla 14.

Tabla 13. Condiciones de EM

Tabla 14. Parametros de muestra

Se infundieron las disoluciones acuosas de muestra a 10 |il/min mediante una bomba de jeringa Harward y se obtuvieron los espectros de masas tal como se observa en las figuras 6-8.

Los espectros obtenidos indican que la fuerza ionica influye en la razon de poblacion de multimeros de dalbavancina con respecto a monomeros. Se encontro que un aumento de concentracion de tampon se corresponde con una disminucion en los perfiles de masas de multfmeros y por tanto una disminucion en la razon de poblacion de multimeros de dalbavancina con respecto a monomeros.

Tal como se menciono, se cree que las interacciones ionicas son importantes en la estabilidad de multfmeros de dalbavancina. El hecho de que aumentar la fuerza ionica estuviera correlacionado con la disminucion de intensidad de perfiles de masas de multimeros prueba el papel de las interacciones ionicas en la estabilidad de multimeros. Sin embargo, ya que los perfiles de masas de multimeros estaban presentes incluso a fuerza ionicas mayores, otra segunda interaccion puede estar implicada en la estabilizacion de multfmeros.

Sin limitarse a ninguna teona, se cree que las interacciones hidrofobas son importantes para estabilizar las especies de multfmeros de dalbavancina. Si la estabilizacion de estos multfmeros no covalentes de dalbavancina se debiera unicamente a interacciones ionicas, se esperana que un aumento en la fuerza ionica diera como resultado una perdida total de especies de masas de multfmeros. Es decir, se esperana que a medida que aumente la fuerza ionica de la disolucion, las interacciones ionicas que estabilizan el multimero se alteranan debido a la poblacion aumentada de iones en disolucion, con los que los monomeros se asocianan mas facilmente. En consecuencia, la fuerza ionica de la disolucion conducina a que los multfmeros se disocien en componentes de monomero y los espectros de masas resultantes estanan libres de cualquier perfil de masas de multfmeros. Sin embargo, incluso a una fuerza ionica de disolucion alta (tal como formiato de amonio 100 mM), se detecta la presencia de multfmeros de dalbavancina en el espectro de masas. Por consiguiente, se considera que los multfmeros de dalbavancina se estabilizan, al menos en parte, mediante interacciones hidrofobas.

Compuesto similar estructuralmente

Se cree que la eficacia mejorada de la dalbavancina se debe al menos en parte a su capacidad para formar multimeros. Se cree que incluso compuestos muy similares estructuralmente no comparten su caractenstica unica. Se investigo la capacidad para formar multimeros de un compuesto con una estructura qmmica similar a ^{dalbavancina mediante analisis p r espectroscop esp ctros de masas en modo} _{positivo de electrospray en un ins}1^o

_trume1_{nto de tra}1_m ^{^a}

_pa ^de

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_{amente ajustado y calibrado}en modo de electrospray usando Ultramark 1621, cafema y MRFA (L-metionil-arginil-fenilalanil-arginina). Todos los espectros de masas se registraron usando las condiciones enumeradas en la tabla 15. Los parametros de muestra que se investigaron se enumeran en la tabla 16. Se infundieron las disoluciones acuosas de muestra a 10 |il/min mediante una bomba de jeringa Harward y se obtuvieron espectros de masas tal como se observa en las figuras 9 y 10.

Tabla 15. Condiciones de espectros de masas

Tabla 16. Parametros de muestra

n.a. = no ajustado

Un antibiotico glicopeptfdico similar (teicoplanina) no muestra complejos multimericos en disolucion a diversas concentraciones. Esto apoya la indicacion de que compuestos similares estructuralmente no pueden formar especies multimericas en disolucion, y que este fenomeno puede desempenar un papel importante en la actividad de la dalbavancina.

Ejemplo 7. Espectroscopia de masas de desorcion/ionizacion por laser asistida por matriz y tiempo de vuelo (MALDI-TOF) de complejos protema-dalbavancina

Se mezclaron 10 ul de HSA, 0,150 mM con 10 ul de disolucion de dalbavancina (de 0,075 mM, 0,15 mM, 0,3 mM y 1,5 mM) y se incubaron durante 60 min a 37 °C. Se prepararon las muestras para analisis usando la tecnica de gota secada. Se obtuvieron espectros en un espectrometro de masas de tiempo de vuelo BRUKER FLEX III, previamente ajustado y calibrado usando albumina serica bovina patron, adquiriendo y calculando el promedio de los espectros generados por 200 disparos de laser. Matriz: 9 partes de DHB-9 (acido 2,5-dihidroxibenzoico) saturado en acetonitrilo/H²O (50:50), 1 parte de acido sinapmico saturado en acetonitrilo/H²O (50:50). 0,5 ul de disolucion de muestra y 0,5 ul de disolucion matriz se mezclaron y situaron en la diana del laser.

La dalbavancina se une a la protema como monomero (1 HSA 1 dalbavancina). A razones muy altas de dalbavancina con respecto a protema (1:2, 1:10), puede observarse la presencia de complejos que contienen 2 moleculas de dalbavancina por molecula de protema.

Ejemplo 8. Calorimetria de valoracion isotermica de union de la union de dalbavancina a N.N'-diacetil-Lvs-D-Ala-D-Ala en presencia de albumina serica humana

La union de dalbavancina a W,W-diacetil-Lys-D-Ala-D-Ala, un peptido analogo de dianas de pared celular de dalbavancina, se investigo mediante calorimetna de valoracion isotermica (ITC) en presencia de HSA a lo largo de un intervalo de concentraciones (hasta 600 |iM) a 25 °C, con algunas mediciones adicionales a 37 °C. HSA aumento la solubilidad de la dalbavancina y redujo su afinidad de union por el ligando tripeptidico. Se compararon los resultados con los de vancomicina. Los efectos observados se alcanzaron una meseta a concentraciones de HSA relativamente bajas, consecuente con un modelo de union no competitiva que permite la union de ligando a dalbavancina ambos libres en disolucion y (mas debilmente) al complejo dalbavancina-HSA.

Experimentos preliminares demostraron que, en ausencia de protemas sericas, dalbavancina y vancomicina muestran perfiles de union similares: ambas dan union exotermica a W,W'-diacetil-Lys-D-Ala-D-Ala, pero sin evidencia de union a dipeptido (D-Ala-D-Ala) o a Lys-D-Ala-D-lactato. Para la interaccion dalbavancina/tripeptido, los datos eran consecuentes con la union con Kdis = 1-10 |iM, dependiendo de la temperatura, similar a vancomicina en las mismas condiciones. En presencia de HSA, la solubilidad de dalbavancina aumenta significativamente y la afinidad de union por el tripeptido se reduce de una manera consecuente con union competitiva o no competitiva de HSA para el antibiotico. Los experimentos descritos en este ejemplo se disenaron con el fin de: (a) comparar mediciones de dalbavancina/tripeptido a diferentes temperaturas (25 °C y 37 °C) y diferentes concentraciones de HSA; (b) usar estos datos para construir un modelo de union para comparar con los numeros observados.

Biosearch Italia suministro la dalbavancina. Otros reactivos eran de Sigma: clorhidrato de vancomicina (Sigma V-2002, fw 1485,7), N,N'-diacetil-Lys-D-Ala-D-Ala (Sigma D-9904, fw 372,4), albumina humana (HSA; Sigma A-3782; mw 69,366).

Se disolvieron antibioticos y peptidos en tampon acuoso (fosfato de Na 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) que contema HSA, con agitacion suave inmediatamente antes de cada experimento. Las concentraciones de peptidos se determinaron en peso. Las concentraciones de dalbavancina se determinaron o bien en peso o bien por absorbancia UV usando los coeficientes de extincion molar e = 12430 (dalbavancina, A²⁸⁰¹% = 68,42), ⁸²⁸⁰= 6690 (vancomicina). Las concentraciones de HSA se determinaron por absorbancia UV (HSA, ⁸²⁸⁰= 37700; A²⁸⁰¹% = 5,44). Los espectros se registraron a temperatura ambiente en cubetas de cuarzo con paso optico de 1 cm usando espectrofotometros Shimadzu UV-160A o UV-1601, con muestras diluidas cuantitativamente con tampon si era necesario para dar una absorbancia en el intervalo de 0,1-1 A.

Se realizo calorimetna de valoracion isotermica usando un instrumento Microcal VP-ITC a 25 °C y 37 °C usando procedimientos normalizados de trabajo. Veanse, por ejemplo, Wiseman et al., Anal. Biochem. (1989) 179, 131-137; Cooper, et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. Ser. A-Math. Phys. Eng. Sci. (1993) 345, 23-35; Cooper, A, microcalorimetna de valoracion isotermica en C. Jones, B. Mulloy y A. H. Thomas (Eds.), Microscopy, Optical Spectroscopy, and Macroscopic Techniques. Humana Press, Totowa, NJ, (1994) pags. 137-150; Cooper, A., Microcalorimetna de interacciones protema-protema en J. E. Ladbury y B. Z. Chowdhry (Eds.); Biocalorimetry: The Applications of Calorimetry in the Biological Sciences. Wiley, (1998) pags. 103-111; y Cooper, A., Curr. Opin. Chem. Biol. (1999) 3, 557-563. Antes de la carga, se desgasificaron suavemente las muestras para evitar la formacion de burbujas en la celda del calonmetro. Cada experimento normalmente comprendio 25 inyecciones de 10 |il de disolucion de peptido (= 1 mM) en la celda del calonmetro (volumen = 1,4 ml) que contema disolucion de antibiotico (“ 20-100 |iM). Los experimentos de control implicaban la inyeccion de ligando en tampon en condiciones identicas para determinar los calores de dilucion de peptido, y se usaron estos valores para la correccion de datos de union en bruto antes del analisis. Los experimentos de union de dalbavancina/tripeptido se repitieron varias veces a cada temperatura. Los datos de union de ITC se analizaron usando software convencional Microcal ORIGIN™ para determinar el numero aparente de sitios de union (N), la afinidad de union (Kas = 1/Kdis) y la entalpfa de union (AH).

TABLA 17

Datos termodinamicos para la union de la union de tripeptido a dalbavancina y vancomicina determinados mediante ITC suponiendo un modelo de union no cooperativa simple: efectos de temperatura y HSA.

T N Kas Kdis AH AS [HSA] °C M'1 |iM kcal/mol eu |iM Dalbavancina 10 0,59 6,70E+05 1,49 -10,26 -9,60 0

10 0,59 9,20E+05 1,09 -8,95 -4,30 0 10 0,59 6,85E+05 1,46 -10,30 -9,60 0 10 0,56 6,24E+05 1,60 -10,30 -9,90 0 25 0,6 3,13E+05 3,19 -10,10 -8,90 0 25 x 3,30E+05 3,03 -11,30 -12,60 0 25 x 3,20E+05 3,13 -11,70 -14,00 0 25 x 2,80E+05 3,57 -14,30 -23,00 0 25 0,57 3,03E+05 3,30 -12,60 -17,00 0 25 0,74 3,19E+05 3,13 -11,20 -12,50 0 25 0,54 3,93E+05 2,54 -12,90 -17,60 0 Con HSA 25 0,37 1,18E+05 8,47 -26,40 -65,50 13,6 Con HSA 25 0,35 1,18E+05 8,47 -27,80 -70,10 13,6

Con HSA 25 0,68 3,50E+04 28,57 -20,00 -46,20 34,2

Con HSA 25 0,83 2,76E+04 36,23 -16,90 -36,50 80,7

Con HSA 25 1,38 3,49E+04 28,65 -18,60 -41,70 104

Con HSA 25 0,9 3,10E+04 32,26 -21,05 -50,00 288

Con HSA 25 1,242 2,84E+04 35,21 -19,50 -44,90 430

Con HSA 25 0,86 2,18E+04 45,87 -15,00 -30,40 601

37 0,82 1,30E+05 7,69 -12,50 -16,80 0

37 0,6 1,10E+05 9,09 -17,40 -33,20 0

Con HSA 37 0,179 1,25E+04 80,00 -98,60 -299,00 482

Con HSA 37 0,5 9568 104,52 -26,60 -67,60 516

Vancomicina 10 1,1 6,90E+05 1,45 -9,49 -6,80 0

25 0,91 3,40E+05 2,94 -10,70 -10,60 0

25 0,97 3,60E+05 2,78 -12,90 -17,80 0

Con HSA 25 1,05 2,90E+05 3,45 -10,09 -8,80 513

Los experimentos ITC en la union de tripeptido a dalbavancina en ausencia de HSA proporcionan datos consecuentes para afinidades de union, con Kdis promedio en la region de 1,4, 3,1 y 8,4 |iM a 10, 25 y 37 °C respectivamente (tabla 17). La union es exotermica. Los calculos de concentracion en este caso indican que N se aproxima mas a 0,5 en estas condiciones. Esto es consecuente con la union de una molecula de tripeptido por dfmero de dalbavancina en estas condiciones. Estas afinidades de union y enta^as de union son comparables a las observadas con vancomicina en las mismas condiciones (tabla 17, y D. McPhail, A. Cooper, J. Chem. Soc.-Faraday Trans. (1997) 93, 2283-2289.). Observese tambien que la vancomicina experimenta dimerizacion inducida por ligando a mayores concentraciones.

La adicion de HSA a las mezclas de dalbavancina reduce la afinidad de union aparente entre tripeptido y dalbavancina, aunque la union es mas exotermica aparentemente (tabla 17). La dependencia de la concentracion de HSA para esto a 25 °C se muestra en la figura 11. Despues de una subida inicial (debilitacion) en la Kdis aparente hasta HSA 35 |iM, permanece relativamente constante para concentraciones de HSA superiores aproximandose a niveles fisiologicos (600 |iM). El nivel de meseta a concentraciones altas de HSA (Kdis “ 35 |iM) corresponde a una afinidad de union alrededor de 10-12x mas debil que en ausencia de HSA. Se observa una reduccion similar a 37 °C.

El efecto de HSA no era debido a la interaccion con el tripeptido. Los experimentos de ITC de control para la union de vancomicina al tripeptido en presencia de HSA dieron resultados comparables a los observados en ausencia de HSA (vease la tabla 17). Esto indica que ni el peptido ni el antibiotico estrechamente relacionado, vancomicina, interaccionan con HSA en disolucion. Se deduce que cualquier efecto de HSA sobre la interaccion dalbavancina/tripeptido tiene que deberse a la interaccion entre HSA y dalbavancina.

Sin querer limitarse a ninguna teona, los datos anteriores son consecuentes con un modelo de union no competitiva. Este modelo supone que el ligando tripeptido (L) puede unirse a dalbavancina (D) tanto en el estado libre como (posiblemente con diferente afinidad) en el complejo dalbavancina-HSA.

D L ^ DL ; KL = [D][L]/[DL]

D HSA ^ D.HSA ; KHSa = [D][HSA]/[D.HSA]

D.HSA I ^ LD.HSA ; KLD^hsa= [D.HSA][L]/[LD.HSA]

Constante de disociacion de union de ligando aparente (observada) (no competitiva):

Kapp,L ~ [D total][L]/[complejo DL total]

= ([D] [D.HSA])[L]/([DL] [LD.HSA])

- Kl {1 [HSA]/Khsa}/{1 [HSA].Kl/Khsa-Kldhsa}

Esto muestra una dependencia hiperbolica de Kapp,l de la concentracion de HSA libre que concuerda bien con los datos observados (figura 11). A [HSA] altas esto alcanza un valor asintotico (meseta).

Kapp,l = K^ldhsa(para [HSA] grandes)

Esto sugiere que la afinidad de union por el tripeptido es de alrededor de 35 |iM cuando se une dalbavancina a HSA, en comparacion con 3 |iM para dalbavancina libre (figuras de 25 °C).

Pueden sugerirse mecanismos adicionales en cuanto a si la dalbavancina esta actuando como monomero o como dfmero en sus interacciones con peptidos o protemas. La comparacion directa de dalbavancina con vancomicina (que muestra union inequvoca 1:1 a estas bajas concentraciones) muestra que la union es completa a razones molares mas bajas (N mas bajas) para dalbavancina (figura 12). Esto es consecuente con un complejo dalbavancina:peptido 2:1.

Sin embargo, en presencia de HSA, los valores de N aparentes aumentan (tabla 17), y pueden ser mas consecuentes con complejacion 1:1. Sin querer limitarse a ninguna teona, el modelo mostrado en la figura 13, que muestra la posible interaccion de monomeros y dfmeros de dalbavancina con ligandos tripeptfdicos y HSA, es consecuente con estas observaciones. La figura 13A representa dalbavancina como en equilibrio monomero-dfmero en disolucion (predominantemente como dfmero), pero uniendose como monomero a dos sitios independientes en HSA. Esto es consecuente con los valores de N = 0,5 observados por ITC para la union de protemas sericas a dalbavancina (ejemplo 3). La figura 13B representa la union de ligando al dfmero de dalbavancina en disolucion, y (mas debilmente) a los monomeros de dalbavancina unidos a HSA. Esto es consecuente con la union no competitiva de dalbavancina tanto a tripeptido como a HSA, con estequiometnas aparentes variables.

En resumen, este ejemplo muestra que HSA reduce la afinidad de union de dalbavancina por el ligando tripeptfdico de una manera consecuente con un mecanismo no competitivo y que la dalbavancina unida a HSA conserva su capacidad para unirse a ligandos tripeptfdicos, aunque con afinidad reducida. Estos resultados tambien son consecuentes con un modelo en el que la dalbavancina esta en equilibrio monomero-multfmero, predominantemente multimerica en disolucion, con fuerte afinidad de los multfmeros por ligando peptfdico. Monomeros de dalbavancina, tanto libres como unidos a albumina serica, tambien pueden unirse a peptidos con una afinidad reducida.

Ejemplo 9. Preparaciones de A-40926 y dalbavancina

Preparacion de A-40926

A-40926, el glicopeptido natural producido por fermentacion, fue el material de partida para producir dalbavancina. Se produjo mediante una Nonomuria sp ATCC 39727 como mezcla de A-40926 y su derivado de acetilo (veanse la patente estadounidense n.° 4.935.238 y B. Golstain et al. Antimicrobial Agent and Chemotherapy, dic. de 1987, pags.

1961-1966). El derivado de acetilo se desacetilo en primer lugar a A-40926. Despues de la desacetilacion, se purifico A-40926 mediante cromatograffa en columna en poliamida tal como se describe a continuacion. La siguiente descripcion es representativa del actual metodo de produccion. Las cantidades notificadas en este caso son aproximadamente 1/4 de las cantidades habitualmente de trabajo en una preparacion industrial.

Desacilacion de A-40926

Se ajustaron 10 m3 de caldo de fermentacion (23 °C) que conteman un total de aproximadamente 1 g/l de A-40926 y su derivado de acetilo, con agitacion, a pH 11,4 con NaOH al 30%. Se continuo la agitacion durante 6 horas, entonces se redujo la temperatura hasta 15 °C y se microfiltro el caldo (microfiltro Koch Protosep IV con una membrana de ceramica 0,1 |i de 0,12 m2). Durante la microfiltracion, se anadio agua continuamente al material retenido con el fin de obtener, al final del procedimiento, un material permeado de 20-25 m3 y un material retenido de 4,5-5 m3 (la mitad del valor de partida).

El material permeado, que contema A-40926, se analizo mediante HPLC. Cuando se completo la desacetilacion, el pH de la disolucion de material permeado se ajusto a pH 7 con acido sulfurico al 30 % (almacenado a 20 °C). En este ejemplo, se obtuvieron 25 m3 de caldo filtrado que contema 6,62 kg de A-40926 (268 mg/l). El rendimiento de desacetilacion era del 66,2 %. Si se llevaba a cabo el procedimiento de microfiltracion durante mas tiempo y un mayor volumen de extraccion que los empleados en este procedimiento, puede aumentarse el rendimiento hasta el 90 %.

Purificacion de A-40926 en columna de poliamida

Despues de la extraccion, se purifico A-40926 contenido en el caldo filtrado en una columna de poliamida, tal como se describe a continuacion. La cantidad notificada en esta descripcion es de aproximadamente 1/10 de la cantidad habitualmente de trabajo en una preparacion industrial y es representativa del metodo de produccion actual.

Se suspendieron 500 l de resina de poliamida SC6 (de Macherey Nagel) en agua desmineralizada y se cargaron en una columna. Entonces se acondiciono la resina a pH 6-6,5 eluyendo la columna con al menos 2 BV (volumen de lecho) de una disolucion tampon preparada disolviendo 4 kg de carbonato de sodio en 800 l de agua y ajustando el pH de la disolucion que resulto con acido acetico.

El caldo filtrado de A-40926 (9000 l; ensayo 0,275 mg/l; 2475 g de A-40926; pH 6±0,2; temperatura 10 °C ± 3 °C) se cargo en la columna con aproximadamente 5 g de actividad por litro de resina (se uso habitualmente una razon actividad/resina de 5-8 g/l). Se lavo la columna con las siguientes disoluciones: 3 BV (1500 l) de una disolucion a pH 6 preparada disolviendo 7,5 kg de carbonato de sodio en 1500 l de agua desmineralizada y ajustando el pH con acido acetico; 4 BV (2000 l) de una disolucion a pH 8 preparada disolviendo 10 kg de carbonato de sodio en 2000 l de agua desmineralizada y ajustando el pH con acido acetico; 1,5 BV (750 l) de una disolucion a pH 9 preparada disolviendo 4 kg de carbonato de sodio en 750 l de agua desmineralizada y ajustando el pH con acido acetico.

Se recupero A-40926 de la columna eluyendo con 4 BV (2000 l) de una disolucion tampon a pH 10 preparada disolviendo 10 kg de carbonato de sodio en 2000 l de agua desmineralizada y ajustando el pH con acido acetico. Se recogieron las fracciones que conteman A-40926 purificado (concentracion de A-40926 mayor de 0,5 g/l y % de area de HPLC del componente principal (Bo+B-i) mayor del 80%), se neutralizaron con HCl 1 N y se analizaron mediante HPLC. Se obtuvieron aproximadamente 2000 l de disolucion transparente final.

La resina usada para la purificacion se regenero con 1,5 BV de una mezcla de isopropanol / NaOH al 5% 1:1 seguido de un lavado con 5 BV de agua desmineralizada.

Concentracion de A-40926

La disolucion procedente de la columna se sometio a varias rondas de etapas de dilucion/concentracion para eliminar la mayona de las sales inorganicas en la disolucion. Se concentro la disolucion hasta 80 l mediante nanofiltracion usando una membrana con un punto de corte de 250 D, se diluyo con 80 l de agua desmineralizada y volvio a concentrarse al volumen de partida (80 l) mediante nanofiltracion. Esta operacion se repitio al menos 5 veces. El pH de la disolucion final (80 l, pH 7,5) se ajusto a pH 6,3 con HCl al 23 %. Entonces se diluyo la disolucion con 80 l de acetona, y se ajusto de nuevo su pH a pH 2,6 con HCl al 23 %.

Decoloracion

Se anadieron 680 g de carbon PA 200 C (~0,3 g/g de A-40926) con agitacion a la disolucion obtenida en la etapa anterior (160 l). Se continuo agitando durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, entonces se le anadieron aproximadamente 0,5-0,6 kg de adyuvante de filtracion (DIFBO). La mezcla se filtro a traves de un cartucho filtrante. La disolucion transparente obtenida se concentro a vacio (45 °C) con el fin de reducir la acetona por debajo del 10 %. El volumen final era de aproximadamente 100 l. Entonces se ajusto el pH a 6,7 con NaOH ac., y se continuo con la etapa de concentracion usando el nanofiltro habitual hasta que la concentracion de A-40926 era de alrededor de 100 g/l. Se obtuvieron 20 l de disolucion concentrada (1884 g de A-40926, 94,2 g/l).

Precipitacion y secado

Se diluyo la disolucion anterior con agitacion con 20 l de acetona, y se ajusto su pH a 5,1 con HCl al 10 %. A esta disolucion se le anadieron 5 volumenes de acetona adicionales (100 l) para completar la precipitacion de A-40926. Si el contenido de agua no era <15% en este momento, se anadio acetona adicional. Despues de 2 horas se centrifugo la suspension, y se lavo el solido con 3 * 10 l de acetona nueva. Se analizaron las aguas madres y se descargaron despues de haber comprobado la ausencia de producto.

Se seco A-40926 solido a presion reducida a 30 °C-35 °C en un secador estatico hasta que la acetona residual estaba por debajo del 2 % y el agua era menos del 10 %. Entonces se tamizo el producto a traves de un tamiz de 50 de malla obteniendo 2,08 kg de A-40926 purificado (el 81,4 % en ensayo de HpLC; el 6,2 % de agua; el 4,8 % de cenizas sulfatadas). El rendimiento, partiendo de la actividad cargada en la columna, fue del 68,4 %.

Sntesis de dalbavancina

Se preparo dalbavancina (BI-397) a partir del glicopeptido natural A-40926 a traves de una smtesis en tres etapas tal como se describe en Malabarba y Donadio (1999), Drugs of the Future, 24(8):839-846. Espedficamente, en primer lugar se sometio A-40926 a una etapa de esterificacion para preparar MA, que luego se sometio a una etapa de amidacion para preparar MA-A-1. Entonces una etapa de hidrolisis final convirtio MA-A-1 en dalbavancina.

Etapa de esterificacion (etapa 1)

La siguiente descripcion es representativa del metodo actual en uso.

Preparacion de H²SO⁴al 96 %/MeOH (disolucion A)

En un matraz de fondo redondo de 15 l equipado con un agitador mecanico y un termometro, se anadieron gota a gota 2,28 l de H²SO⁴al 96 % (~300 ml de H²SO⁴al 96 % por kg de polvo de A-40926) a 7,9 l de MeOH. Se uso un bano de hielo externo para mantener la temperatura entre 0 °C y 5 °C.

Procedimiento de reaccion

Se suspendio el material de partida A-40926 (7,6 kg; lote 019, ensayo 85,09 %; actividad 6,46 kg; 3,73 mol) en un reactor revestido de vidrio de 140 l en MeOH (46 l), y se enfrio la suspension resultante a 0 °C ± 2 °C. A esta temperatura la suspension se trato con la disolucion A preparada previamente (H²SO⁴/MeOH). La disolucion resultante se agito a 0 °C durante 22-26 horas mientras que la reaccion (una alfcuota de reaccion diluida 100 veces con mezcla de acetonitrilo/agua 1:1) se monitorizo mediante analisis de HPLC cada dos horas. Se considero completada la esterificacion cuando el A-40926 residual era menos del 5 % y el diester no era mas del 10 % como % de area de HPLC.

Aislamiento de ester (MA)

Cuando se completo la reaccion, se enfrio la mezcla a -5 °C (+/-2 °C) y se diluyo con el mismo volumen de agua fna (54 l) manteniendo la temperatura por debajo de 5 °C. Se precipito el producto (MA) ajustando el pH de la disolucion a 5,5 (+/- 0,2) anadiendo lentamente 10,2 l de trietilamina (TEA). Se continuo la agitacion durante una hora adicional a 0-2 °C, entonces se centrifugo el solido obtenido, se lavo con agua (10 l por kg de A-40926) y finalmente con MeOH (3 l de MeOH por kg de A-40926 de partida) enfriado previamente a 10 °C-15 °C. El lavado con agua se hizo principalmente para eliminar los sulfatos de MA.

Las aguas madres y los lavados se analizaron y se descargaron por separado si conteman menos del 1-2 % de actividad. Se seco el producto a vacfo (50 mm Hg) a 35 °C-40 °C (temperatura externa) hasta que el agua residual era menos del 10 %. Se obtuvieron 7,6 kg de MA (5,63 kg de actividad, 3,23 moles) como polvo parduzco.

El analisis mostro los siguientes valores de % de area de HPLC: MA 89,8, A-40926 3,2, derivado de diester 5,9. El ensayo de HPLC fue el 74,2 %, actividad 5,637 kg; 3,23 moles; rendimiento = 86,5 %. Se uso este material en la siguiente etapa sin ninguna purificacion adicional.

Etapa de amidacion (etapa 2)

La siguiente descripcion es representativa del metodo de produccion actual.

Preparacion de la mezcla de DMSO/HCl (disolucion B)

Se puso DMSO (1,6 l) en un matraz de fondo redondo de 10 l, equipado con un agitador mecanico y un termometro, y se enfrio con un bano de hielo por debajo de 10 °C. Entonces se le anadio lentamente HCl al 37% (1 l) con agitacion manteniendo la temperatura de la mezcla por debajo de 25 °C.

Procedimiento de amidacion (produccion de MA-A-1)

Se disolvieron lentamente 5,95 kg de material de partida MA (ensayo 76,3 %, KF 8,9 %; 2,68 moles) con agitacion en 19,2 l de mezcla de DMSO / MeOH 1:1 (~1,6 l de DMSO y 1,6 l de MeOH por kg de polvo de MA) a temperatura ambiente. Despues de 1 hora de agitacion, se le anadieron 709 ml de 3-(dimetilamino)-propilamina (DMEPA, PM 102,1; densidad = 0,812 g/ml; 5,63 moles; 1,96 moles por mol de MA de partida) y 325 g de 1-hidroxibenzotriazol hidratado (HOBTH²O; PM 153,1; 2,04 moles; 0,71 moles por mol de MA de partida) a la mezcla de reaccion. Se continuo agitando hasta que se obtuvo disolucion completa, entonces se ajusto la mezcla a pH 3-3,1 (medido despues de diluir una alfcuota de la reaccion 10 veces con agua) anadiendo lentamente aproximadamente 2,0 l de disolucion B (DMSO/HCl).

Se anadio una disolucion de diciclohexilcarbodiamida (DCC), preparada disolviendo 1,03 kg de DCC (4,99 mol; PM 206,3; 1,74 moles por mol de MA) en 4,1 l de mezcla de DMSO/MeOH 1:1, a la mezcla de reaccion agitada en 10minutos. Se continuo agitando durante 5 horas, entonces se le anadieron 51,5 g adicionales de DCC solido (0,25 moles) a la mezcla de reaccion con el fin de reducir el MA residual por debajo del 5 %, manteniendo el nivel de isoureas menor del 4-5 %. Las isoureas son un grupo de subproductos producidos por reaccion adicional de dalbavancina con el exceso de DCC.

La reaccion se completo normalmente despues de 2 horas adicionales (7 horas en total). Al final se diluyo la mezcla con agua (60 l) para reducir la concentracion de DMSO hasta el 15 % (v/v) y se ajusto a pH 2,3 con HCl 1 N (0,85 l) para destruir cualquier DCC residual.

Hidrolisis de MA-A-1 a dalbavancina (etapa 3)

Despues de 30 minutos se ajusto la mezcla a pH 12,0-12,1 con NaOH al 15 % (8 l). Se continuo agitando durante 4 horas manteniendo la mezcla a este pH con pequenas adiciones de NaOH al 15 %. Despues de este tiempo, el MA-A-1 residual era menos del 0,2 % como % de area de HPLC.

Entonces se acidifico la mezcla a pH 3,0 con HCl 1 N (19 l), y se filtro la suspension para eliminar la diciclohexilurea formada. Se lavo la torta solida en el filtro con agua desmineralizada (2 x 20 l). Se reunieron los lavados y el filtrado, obteniendo una disolucion transparente que se analizo por HPLC. Se obtuvieron 152,8 l de disolucion que contema 21,74 g/l de dalbavancina (actividad total 3322 g; 1,828 moles, rendimiento = 68,2 %).

Purificacion de dalbavancina

La siguiente descripcion es representativa del metodo de produccion actual.

Se dividieron en dos partes los 152,8 l de la disolucion obtenida de la etapa de hidrolisis y que conteman 3322 g de actividad de dalbavancina y cada una se purifico por separado en la misma columna cromatografica que contema 400 l de poliamida. En estos dos ciclos de purificacion la razon actividad/resina era de 4,3 y 4,0 g/l respectivamente. Preparacion de la columna de poliamida

Se limpio la columna revestida de vidrio (diametro interno = 40 cm, h = 320 cm) que contema 400 l de resina de poliamida segun los procedimientos de regeneracion de resina (vease a continuacion) y se acondiciono con 2 BV (800 l) de agua desmineralizada acidificada con 4 l de AcOH (pH = 3,2).

Purificacion de la primera porcion

Se diluyo con H²O (56 l) la primera porcion de 76,4 l de disolucion de partida con el fin de reducir el contenido de DMSO por debajo del 5 % (v/v), y se acidifico hasta pH 2,78 con HCl 1 N (3,4 l). Entonces se cargo esta disolucion en la columna a una velocidad de flujo de 150 l/h. Despues de cargar, se lavo la resina con las siguientes disoluciones: 4 BV (1600 l) de H²O acidificada con AcOH (8 l), pH = 3,2; 5 BV (2000 l) de AcONa 0,1 M, pH = 8,2; 1 BV (400 l) de H²O acidificada con AcOH (1 l), pH = 3,2. Se eluyo la dalbavancina con 4 BV (2400 l) de H²O/MeOH (8:2) acidificada con AcOH (6 l), pH = 3,4.

Durante la etapa de elucion, se recogieron y analizaron 22 fracciones de 50-60 l cada una por HPLC. Se reunieron las fracciones desde 9 hasta 25 (concentracion de dalbavancina mayor de 0,5 g/l y % de area de HPLC de (B⁰+B¹) >80 %), obteniendo 969 l de disolucion con 1,56 kg de dalbavancina (rendimiento = 93,9 %). Entonces se concentro esta disolucion por nanofiltracion, obteniendo 125,7 l de disolucion con 1,38 kg de dalbavancina. Se neutralizaron y descargaron 850 l de material permeado, que contema 145 g de dalbavancina impura (8,7 %).

Regeneracion de la resina

Antes de reutilizarla, se lavo la resina con las siguientes disoluciones: 2,5 BV (1000 l) de MeOH/agua acidificada con acido acetico 1:1 (2,5 ml/l); 2,5 BV (10001) de NaOH al 0,5 %/isopropanol 1:1; 10 BV (40001) de agua desmineralizada. Entonces volvio a equilibrarse la resina con BV (800 l) de agua acidificada con acido acetico (2,5 ml/l).

Purificacion de la segunda porcion

Se diluyo con H²O (56 l) la segunda porcion de la disolucion de partida procedente de la etapa de hidrolisis (76,5 l) para reducir el contenido en DMSO por debajo del 5 % (v/v) y se acidifico hasta pH 2,87 con 3,0 l de HCl 1 N. Entonces se purifico la porcion tal como se describio previamente en la purificacion de la primera porcion. Las fracciones combinadas (vol. = 972 l, 1,54 kg de dalbavancina, rendimiento = 92,7 %) se concentraron por nanofiltracion, obteniendo 133 l de disolucion con 1,46 kg de actividad. Se descargaron 850 l de material permeado, que contema 73 g de dalbavancina (4,3 %).

Volvieron a analizarse y se combinaron las disoluciones concentradas procedentes de las dos etapas de purificacion, dando 2581 de disolucion que contema 2840 g de dalbavancina purificada. El rendimiento de purificacion era del 86 %. El rendimiento total, partiendo de MA, era del 58,3 %.

Regeneracion final de poliamida

Despues del segundo ciclo de purificacion se regenero la poliamida con: 2,5 BV de MeOH-agua 1:1, acidificado con AcOH (2,5 l) a pH = 3,4; 2,5 ^bV de NaOH al 0,5 %-isopropanol 1:1; 10 BV de agua desmineralizada.

Decoloracion y precipitacion de dalbavancina

Se anadieron 1,5 moles de HCl 1 N por mol de dalbavancina y 0,3 g de carbon CG1 (0,85 kg, de NORIT) por gramo de dalbavancina a los 258 l de disolucion obtenida anteriormente. Se agito la mezcla a temperatura ambiente durante al menos 45 min. El pH era de 3,1. Entonces se filtro la suspension en un cartucho SUPRA DISC modelo SDP-EK1 de SEITZSCHENK, y se lavo la torta con 50 l de H²O/MeOH 8:2. Se analizo el filtrado y se concentro otra vez por nanofiltracion, usando una membrana MPS 44 con un punto de corte de 250 D. Se obtuvieron 21,3 l de disolucion concentrada que contema 119 g/l de dalbavancina (pH 4,1; MeOH al 1,9%, CG). Finalmente se anadieron 909 ml de HCl 1 N para ajustar el pH a 2,63, que corresponde a la razon de salificacion de 1,65 molHCl/moldalbavancina.

Se vertio la disolucion (22,2 l), con agitacion, en 200 l de acetona. El solido obtenido despues de la decantacion se centrifugo y se lavo con 14 l de acetona nueva. Entonces se seco el producto a presion reducida (50 mm Hg) a 35 °C, manteniendo la temperatura interna por debajo de 30 °C durante 17 horas. Durante el proceso de secado, se pulverizo 1 l de agua libre de pirogenos (<250 EU/ml), dividida en dos porciones de 0,5 l cada una, sobre el solido despues de tres y cinco horas con el fin de eliminar la acetona residual que de otro modo es diffcil de eliminar. Entonces se tamizo el producto (50 de malla), obteniendo 2592 g de dalbavancina (82,4 % de ensayo de HPLC; agua (KF) 14%; Cl- 3,0%).

Ejemplo 10. Metodos alternativos para A-40926 y preparacion de dalbavancina

Los metodos descritos a continuacion son metodos alternativos que pueden usarse en el procedimiento de preparacion de A-40926 y dalbavancina.

Preparacion de A-40926 sobre XAD-7 HP

Desacetilacion y microfiltracidn del micelio

Se agitaron 150 l de caldo de fermentacion que contema A-40926 (pH 7) en un reactor adecuado a temperatura ambiente (24 °C), y se ajusto a pH 11,5 con una disolucion de NaOH 2,5 N (2,5 l). Despues de 4 horas de agitacion, se ajusto el caldo a pH 10,6 con HCl al 15 %, y se microfiltro a traves de una membrana de 0,2 micrometros. Se recogio 439 l de material permeado transparente y entonces se concentro por nanofiltracion usando una membrana MPS 44 con un punto de corte de 250 D. La disolucion concentrada de A-40926 obtenida (58,6 l; 3,89 g/l) se ajusto a pH 6,4 y se almaceno a 4 °C hasta su uso.

Preparacion de columna y purificacion.

Se suspendio resina XAD-7 HP (8 l) en una disolucion de agua/metanol 1:1, se filtro, y se cargo en una columna de vidrio apropiada (diametro interno de 12 cm) con una bomba peristaltica.

Entonces se lavo la resina con agua y se equilibro con 6 BV de una disolucion acuosa de carbonato de sodio tamponada a pH 6 preparada disolviendo 5 g de carbonato de sodio por litro de agua y ajustando el pH con acido acetico.

Se cargo una porcion de caldo concentrado que contema 194 g de A-40926 en la columna XAD-7 HP. Entonces se lavo la resina con las dos disoluciones tamponadas siguientes, a una velocidad de flujo de A BV/hora, con el fin de eliminar parte de las sustancias coloreadas e hidrofilas presentes: 3 BV (24 l) de disolucion ac. de acido acetico al 0,5 % ajustada a pH 5 con hidroxido de sodio al 30 %; 5 BV (40 l) de una mezcla de agua/acetona 8:2 con 5 ml de acido acetico / l de agua.

Finalmente, se eluyo A-40926 con 8 BV (64 l) de una mezcla de agua/acetona 1:1 acidificada con 5 ml de acido acetico/l de agua. Se recogieron 16 fracciones de 4 l cada una. Las fracciones ricas (desde 5 hasta 15) en las que la concentracion de A-40926 era mayor de 0,5 g/l se reunieron obteniendo una disolucion que contema 163,4 g de A-40926 (43 l, 3,8 g/l). El rendimiento en columna era del 81,3 %. Las otras fracciones (200 l) que conteman 0,23 g/l (45,3 g; 22,2 %) de A-40926 menos puro se descargaron.

Despues de la elucion, se regenero la resina con 6 BV (55 l) de mezcla de NaOH al 0,5 %/isopropanol (1:1), y finalmente se lavo hasta neutralidad con 10 BV de agua.

Tratamiento con carbon.

Las fracciones recogidas se ajustaron a pH 2,5 con HCl al 37 % (70 ml) y luego se decoloraron con 50 g de carbon tipo PA 200 (0,3 g/g de A-40926). Se agito la suspension obtenida durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se filtro a traves de un filtro KS 50 (d = 25 cm, tiempo = 2,5 horas), obteniendo 45,6 l de una disolucion de A-40926 ligeramente amarilla (3,5 g/l; rendimiento = 96,4 %).

Concentracion.

La disolucion decolorada se ajusto a pH 7 con NaOH al 30 % (230 ml) y se concentro mediante nanofiltracion y ultrafiltracion. El uso de estas tecnicas fue importante para la eliminacion de las sustancias hidrofilas que se detectaron en los cromatogramas de HPLC a tR = 2-4 minutos. Cuando el material retenido se concentro hasta 1/10 del volumen inicial (4 l), se anadio el mismo volumen de agua y la disolucion obtenida se concentro otra vez. Esta etapa de concentracion/dilucion se repitio tres veces con el fin de reducir la acetona residual hasta el 0,25 %. La disolucion final (2,2 l, 146,3 g de A-40926, 66,5 g/l, rendimiento = 91,5 %) se analizo mediante HPLC. El rendimiento de purificacion fue del 75,4 %.

Cristalizacion de A-40926.

Se concentro adicionalmente una porcion de 300 ml de la disolucion de A-40926 (19,9 g de A-40926) hasta 100 ml usando un ultrafiltro a escala de laboratorio y entonces se calento a 60 °C-65 °C. El pH de esta disolucion se ajusto a 7 (NaOH al 30 %), y se anadieron gota a gota a esta temperatura 1,2 ml de mezcla de acetona/isopropanol 5:1 por ml de disolucion concentrada. La mezcla que resulto se dejo enfriar a 20 °C. Despues de 1,5 horas, se filtro el solido obtenido, se lavo en el filtro con acetona y se seco a 40 °C durante 15 horas. Se obtuvieron 20,6 g de producto (ensayo de HPLC 82,0 %; 16,9 g de A-40926). El rendimiento de precipitacion fue del 84,9 %. El rendimiento global, partiendo del caldo filtrado, fue de aproximadamente el 64 %.

Preparacion de A-40926 sobre CG-71

Preparacion de la columna

Se vertio resina CG-71 (350 ml) en una columna de vidrio (diametro interno = 4 cm) y se lavo con agua. Se equilibro la resina con 3 BV de una disolucion de carbonato de sodio, preparada disolviendo 5 g de carbonato de sodio en agua a pH 6 con acido acetico. Se cargaron 250 ml de caldo de fermentacion (pH 7) que contema 14,7 g de A-40926 en la columna (42 g/l resina). Se lavo la resina con las tres disoluciones siguientes: 1050 ml (3 BV) de disolucion acuosa de carbonato de sodio (5 g/l) ajustada a pH 6 con acido acetico; 1750 ml (5 BV) de disolucion acuosa de carbonato de sodio (5 g/l) ajustada a pH 8 con acido acetico; 3150 ml (9 BV) de disolucion acuosa de carbonato de sodio (5 g/l) ajustada a pH 9 con acido acetico.

Entonces se eluyo la actividad con 10 BV de agua desmineralizada. Se recogieron 20 fracciones de 500 ml cada una. Se combinaron las fracciones 12 a 15, obteniendo 2,2 l de disolucion purificada que contema 11,7 g de A-40926 (rendimiento = 79,6 %). Entonces se concentro esta disolucion por ultrafiltracion y la disolucion concentrada se diluyo adicionalmente con agua desmineralizada y se ultrafiltro otra vez. La disolucion obtenida se concentro adicionalmente a presion reducida hasta 50 ml.

Cristalizacion de A-40926.

Se calento la disolucion concentrada a 60 °C y se trato con agitacion con una mezcla de acetona/IPA 5:1 (60 ml). Entonces se enfrio lentamente la mezcla a temperatura ambiente. El solido obtenido se filtro, se lavo con acetona en el filtro y se seco a vado a 35 °C durante 80 horas. Se obtuvieron 8,9 g de A-40926 purificado (ensayo de HPLC 84,2 %). El rendimiento general fue del 51 %.

Etapa de amidacion alternativa en sntesis de dalbavancina usando N-metil-2-pirrolidina (NMP) como disolvente Se anadio la mezcla de MA en porciones con agitacion a una mezcla de NMP/MeOH 1:1 (64 ml). Se continuo agitando a 20 °C-25 °C hasta disolucion completa, entonces se le anadieron DMEPA (2,42 ml; 1,96 mol/eq. de MA) y HOBT (1,06 g; 0,71 mol/eq. de MA). Se ajusto el pH de la mezcla de reaccion (comprobado en una muestra diluida 1:10 con agua) hasta 3,0 con 9,37 ml de HCl al 15% en NMP (preparada previamente a partir de 34,0 ml de HCl al 37 % disuelto en 57,7 ml de NMP). Entonces se le anadio con agitacion una disolucion de DCC (3,17 g; 1,57 mol/eq. de MA) en NMP/MeOH 1:1 (12,7 ml). La reaccion se monitorizo por HPLC. La reaccion se completo despues de aproximadamente 6 horas (MA-A-1 88,9%, MA 7,3%, ISO 3,7%). Este experimento sugiere que NMP puede ser una alternativa conveniente a DMSO para la reaccion de amidacion. El cambio de disolvente no influyo sobre la totalidad del procedimiento y la dalbavancina final obtenida era qmmicamente equivalente a otros lotes.

Metodo alternativo de preparacion de dalbavancina: procedimiento en una sola etapa

Se suspendieron 10 g de complejo de A-40926 (valoracion de HPLC 80,66 %, 4,6 mmoles) en 24 ml de MeOH con agitacion a temperatura ambiente en un reactor de vidrio de 100 ml. Se enfrio la mezcla a 0 °C, y se le anadio una disolucion de 4 g de HCl (g) en 16,4 ml de MeOH hasta completar la solubilizacion del producto. Entonces se dejo aumentar la temperatura hasta 20 °C mientras se continuo agitando durante 24 horas adicionales.

Despues de este tiempo, se anadieron 40 ml de DMSO y 0,4 g de HOBT a la mezcla de reaccion.

Entonces se le anadio 1,1-dimetilamina propilamina, ajustando el pH de la mezcla de reaccion resultante entre 3-3,1 (medido despues de diluir una muestra 9:1 con agua). Entonces se le anadieron 1,8 g de DCC solido y se continuo agitando durante 15 horas adicionales. Despues de este tiempo, se transfirio la mezcla de reaccion a un reactor de vidrio de 1 l y se diluyo con 80 ml de agua. Entonces se llevo el pH hasta 12 anadiendo 240 ml de NaOH al 15 %. Se continuo agitando durante 60 minutos adicionales y se acidifico la mezcla a pH 2,8 con 260 ml de HCl ac. al 15 %. Se obtuvieron aproximadamente 800 ml de disolucion transparente final que contema 6,4 g de dalbavancina (rendimiento = 76 %).

Los analisis de HPLC mostraron que el perfil del producto obtenido es comparable al obtenido con los otros procedimientos de fabricacion.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de dalbavancina en la fabricacion de un medicamento para su uso en un metodo para tratar una infeccion bacteriana en un humano que lo necesita, comprendiendo el metodo:

administrar dosis terapeuticamente eficaces de dalbavancina inicial y posteriores en un portador farmaceuticamente aceptable al paciente,

en el que cada dosis esta separada por de cinco a diez dfas y en el que la cantidad de la dosis inicial es de 500 mg a 5000 mg, y en el que la cantidad de la dosis inicial es al menos aproximadamente dos veces la cantidad de dalbavancina contenida en la dosis posterior.

2. Uso de dalbavancina en la fabricacion de un medicamento para su uso en un metodo para tratar una infeccion bacteriana en un humano que lo necesita, comprendiendo el metodo:

en el que cada dosis esta separada por aproximadamente una semana y en el que la cantidad de la dosis inicial es de 1000 mg y la cantidad de cada dosis posterior es de 500 mg.

3. Uso segun la reivindicacion 1, en el que cada dosis esta separada por de cinco a diez dfas y en el que la cantidad de la dosis inicial es de 500 mg a 5000 mg y la cantidad de cada dosis posterior es de 250 mg a 2500 mg.

4. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el metodo administrar una sola dosis posterior.

5. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el metodo administrar multiples dosis posteriores.

6. Uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la infeccion bacteriana es una infeccion de piel y tejido blando.

7. Uso segun la reivindicacion 3, en el que la infeccion bacteriana es una infeccion de piel y tejido blando.

8. Uso segun la reivindicacion 7, en el que la infeccion bacteriana es una infeccion de piel y tejido blando complicada.

9. Uso segun la reivindicacion 7, en el que la infeccion bacteriana es una infeccion de piel y tejido blando sin complicaciones.

10. Composicion farmaceutica que comprende:

dalbavancina; y

un estabilizador, en la que el estabilizador comprende manitol y lactosa.

11. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 10, en la que la razon en peso de manitol:lactosa:dalbavancina es de 1:1:4.

12. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 10, en la que la composicion farmaceutica tiene un pH de aproximadamente 3 a 5.

13. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 10, en la que la composicion farmaceutica tiene un pH de aproximadamente 4,5.

14. Composicion farmaceutica que comprende:

dalbavancina; y

un estabilizador, en la que el estabilizador comprende manitol a un pH de 3-5.

15. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 14, en la que el pH es de aproximadamente 3,5.

16. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 14, en la que la razon en peso de manitol:dalbavancina es de 1:2.

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