ES2712709T3 - Células madre mesenquimales de médula ósea con telomerasa de alta actividad, métodos de producción de las mismas y productos farmacéuticos y métodos de tratamiento basados en las mismas - Google Patents

Abstract

Células madre mesenquimales de médula ósea humana aisladas en que las células madre mesenquimales de médula ósea humana aisladas son células madre mesenquimales de médula ósea humana aisladas CD34 +, y en que las células madre mesenquimales de médula ósea humana aisladas CD34 + no forman CFU-F (fibroblastos de unidades de formación de colonias) en cultivos de plástico, pero se adhieren a la matriz extracelular producida por células madre mesenquimales.

Description

DESCRIPCION

Celulas madre mesenquimales de medula osea con telomerasa de alta actividad, metodos de produccion de las mismas y productos farmaceuticos y metodos de tratamiento basados en las mismas

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a celulas madre mesenquimales de la medula osea y, mas especfficamente, a un subconjunto de BMMSC novedosas que tienen una alta actividad de telomerasa, en que dichas BMMSC son para su utilizacion en un metodo para modular el sistema inmunitario de un paciente y metodos para aislar dichas ^b M^m SC.

Antecedentes de la invencion

Las celulas madre mesenquimales de la medula osea (BMMSC) son celulas madre postnatales jerarquicas capaces de auto renovarse y diferenciarse en osteoblastos, condrocitos, adipocitos y celulas neurales (Bianco et al., 2001; Friedenstein et al., 1974; Owen et al., 1988; Pittenger et al., 1999; Prockop et al, 1997).

Debido a la heterogeneidad de las BMMSC, no hay un unico marcador exclusivo que permita el aislamiento de BMMSC, sino que se utiliza una matriz de moleculas celulares para perfilar las BMm Sc . Es ampliamente aceptado que las BMMSC expresan SH2 (CD105), SH3 / SH4 (CD73), integrina pi (CD29), CD44, Thy-1 (CD90), CD71, molecula de adhesion de celulas vasculares-1 (CD 106), molecula de adhesion de celulas leucocitarias activadas (CD166), STRO-1, GD2, molecula de adhesion de celulas de melanoma (CD146), Octamero-4 (Oct4) y antfgeno-4 embrionario especffico de etapa (SSEA4) (Conget et al., 1999; Galmiche et al., 1993; Gronthos et al, 2003; Haynesworth et al., 1992; Martinez et al., 2007; Pittenger et al., 1999; Sacchetti et al., 2007; Shi et al., 2003; Simmons et al., 1991; Sordi et al., 2005). En general, se cree que las BMMSC son negativas para los marcadores de celulas hematopoyeticas, como CD 14 y CD34, con un nivel muy bajo de actividad de telomerasa (Conget et al., 1999; Covas et al, 2008; Galmiche et al., 1993; Haynesworth et al., 1992; Martinez et al, 2007; Pittenger et al., 1995; Sacchetti et al., 2008; Shi et al., 2002, 2003; Sordi et al., 2005). Estudios recientes han implicado que las BMMSC de ratones podrfan expresar las moleculas hematopoyeticas de superficie, CD45 (Chen et al., 2007) y CD34 (Copland et al., 2008).

Se considera que las BMMSC son progenitores de osteoblastos con la capacidad de regenerar componentes de hueso y medula in vivo. Estos hallazgos han llevado a estudios extensos que utilizan BMMSC para la ingenierfa de tejidos mineralizados. La evidencia clfnica parece apoyar la nocion de que el implante de BMMSC puede mejorar la regeneracion de tejido esqueletico basado en celulas (Kwan et al., 2008; Panetta et al., 2009). Recientemente, se ha acumulado evidencia de que las BMMSC producen una variedad de citoquinas y muestran propiedades inmunomoduladoras profundas (Nauta et al., 2007; Uccelli et al., 2007, 2008), quizas al inhibir la proliferacion y la funcion de varias celulas inmunitarias importantes, como las celulas asesinas naturales (NK), celulas dendrfticas, linfocitos T y B (Aggarwal y Pittenger, 2005; Nauta et al., 2007; Uccelli et al., 2007, 2008).

Estas propiedades exclusivas hacen que las BMMSC sean de gran interes para las aplicaciones clfnicas en el tratamiento de trastornos inmunes (Nauta y Fibbe, 2007; Bernardo et al., 2009).

Se cree que las BMMSC se derivan del compartimento estromal de la medula osea, apareciendo inicialmente como grupos adherentes de colonias individuales (unidad de formacion de colonias-fibroblastos [CFU-F]), y posteriormente proliferan en placas de cultivo (Friedenstein et al. 1980). Las BMMSC adherentes son capaces de proliferar y experimentar una diferenciacion osteogenica, lo que proporciona la primera evidencia de CFU-F como precursores del linaje osteoblastico (Friedenstein et al., 1980). Durante mas de 40 anos, el ensayo de CFU-F adherente se ha utilizado como un enfoque eficaz para identificar y seleccionar BMMSC. Hasta la fecha, el ensayo CFU-F ha sido considerado como uno de los estandares de oro para el aislamiento y expansion de BMMSC (Clarke et al., 1989; Friedenstein et al., 1970).

Yamaza et al. (Yamaza et al. (2008) PLOS ONE, vol 3, n° 7, pagina E2615) describe el tratamiento de BMMSC humanas con aspirina e informa sobre un incremento en la actividad de la telomerasa. En otra publicacion, Yamaza et al. (Yamaza et al. (2010), Stem Cell Res. Ther., vol. 1, n° 1, pagina 5) describen la utilizacion de BMMSC humanas adherentes al plastico para el tratamiento de lupus eritematosos sistemicos (SLE) con evidencia de un efecto terapeutico en ratones MLR/Ipr.

Resumen de la invencion

Las celulas madre mesenquimales de la medula osea (BMMSC) son una poblacion heterogenea de celulas precursoras postnatales con la capacidad de diferenciarse en multiples tipos de celulas y ofrecer tratamientos alternativos para una variedad de enfermedades. Hemos demostrado que el ensayo de CFU-F adherente estandar recopila la mayorfa de las BMMSC, pero distintas subpoblaciones de BMMSC se mantienen en la suspension de cultivo.

Un aspecto de la presente invencion esta dirigido a nuevos subconjuntos de BMMSC con un potencial terapeutico mejorado, tal como se define en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a metodos para aislar las nuevas BMMSC de la presente invencion, tal como se define en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

Otro aspecto de la presente invencion incluye celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas que tienen una alta actividad de telomerasa, tal como se define en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. La actividad alta de la telomerasa se define mas ampliamente como una poblacion de BMMSC que tienen mayor actividad de la telomerasa que las BMMSC regulares, pero preferiblemente el subconjunto aislado de las BMMSC humanas tiene una actividad de la telomerasa al menos dos veces mas alta que las BMMSC regulares. Las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas de la invencion son CD34 .

Las celulas madre mesenquimales de la medula osea humana aisladas de acuerdo con la presente invencion incluyen: (1) BMMSC aisladas derivadas de celulas no adherentes en el cultivo de plastico (en lo sucesivo, denominadas "tBMMSC"); (2) BMMSC CD34 aisladas, preferentemente, BMMSC C^d 34 / ^c D73 ; y (3) CD-BMMS-BMMSC humanas que han sido tratadas con un agente de induccion de telomerasa (por ejemplo, TAT-BMMSC).

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas de acuerdo con la presente invencion. Adicionalmente, la composicion farmaceutica puede comprender ademas un vehfculo.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere al aislamiento de tBMMSC de una poblacion heterogenea de celulas precursoras postnatales. Las tBMMSC son capaces de adherirse a las placas recubiertas con matriz de celulas extracelular (MEC) y mostrar las caracterfsticas de las celulas madre mesenquimales con distincion con respecto a las celulas hematopoyeticas tal como lo demuestra la coexpresion de CD73 o CD105 con CD34, formando un grupo de colonias unicas en las ECM y no logran diferenciarse en el linaje de celulas hematopoyeticas.

En el presente documento tambien se describe un metodo para convertir BMMSC CD 34 - regulares en tBMMSC mediante el tratamiento de BMMSC con telomerasa, incluida la aspirina y sus compuestos relacionados con una estructura qufmica similar.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a BMMSC de la invencion para su utilizacion en metodos para modular el sistema inmune. Los metodos de la presente invencion implican administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas de acuerdo con la presente invencion.

En formas de realizacion preferentes, la presente invencion se refiere a las BMMSC para su utilizacion en metodos para modular el lupus eritematoso sistemico (SLE) a traves de, sin limitarse por la teorfa, altos niveles de produccion de oxido nftrico (NO). Dichos metodos incluyen administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas de acuerdo con la presente invencion. Esta alta produccion de NO en las celulas madre mesenquimales de la medula osea humana aisladas de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, tBMMSC, esta regulada positivamente por la actividad de la telomerasa junto con la senalizacion de Wnt / beta-catenina. Ademas, mostramos que las tBMMSC inducidas por el activador de la telomerasa tambien exhiben una funcion inmunomoduladora significativamente mejorada, lo que sugiere una viabilidad de inducir BMMSC inmunoactivadas para mejorar las terapias basadas en celulas para los trastornos inmunes.

Estos y otros aspectos de la presente invencion se describen con referencia a las figuras, descripcion, ejemplos y otras divulgaciones tal como se describe en el presente documento.

Breve descripcion de las figuras.

La Figura 1 muestra que las tBMMSC son capaces de adherirse a una placa de cultivo recubierta con ECM. (A) El modelo hipotetico indica que todas las celulas nucleares (ANC) de medula osea se sembraron a 15 x 106 en placas de cultivo de 10 cm y se incubaron durante 2 dfas en el medio de cultivo regular a 37 °C con 5% de CO2, y posteriormente las celulas no adheridas de la suspension de cultivo se trasplantaron a ratones inmunocomprometidos por via subcutanea utilizando fosfato tricalcico de hidroxi apatito (HA) como vehfculo durante 8 semanas. El hueso recien formado (B) por los osteoblastos (flechas abiertas) y el tejido conjuntivo asociado (C) se detectaron en estos trasplantes de celulas no adheridas mediante tincion con H&E. Ampliacion original; X 200. Barra = 100 pm. (B) Modelo hipotetico de aislamiento de tBMMSC. Las ANC primarias se sembraron a 15 x 106 en placas de cultivo de 10 cm, las BMMSC normalmente se adhieren a las placas de plastico dentro de los 2 dfas, sin embargo, una pequena parte de las BMMSC en las ANC primarias no se adhirieron a las placas de cultivo y permanecieron en la suspension celular. Las suspensiones celulares que contenfan BMMSC no adheridas putativas se recogieron y se transfirieron a las placas cultivadas recubiertas con ECM producida por BMMSC con la generacion de agrupaciones de colonias individuales (CFU-F). Estas BMMSC unidas a ECM (tBMMSC) se subcultivaron en placas de cultivo de plastico regulares para experimentos adicionales. (C) El numero de CFU-F adheridas al plastico generadas a partir de 1.5 x 106 ANC de medula osea completa es mas de 7 veces mayor que la derivada de tBMMSC adherentes a BMMSC-ECM. (D) El analisis citometrico de flujo indica que las tBMMSC expresan altos niveles de marcadores de celulas madre mesenquimales CD73 (81.8%), Sca-1 (87.74%), Oct4 (40.7%) y SSEA4 (24.56%) en comparacion con las BMMSC regulares (CD73: 70.8%, Sca-1: 52.16%, Oct4: 14.08%). Sin embargo, parece que las tBMMSC y las BMMSC expresan un nivel similar de SSEA-4. (E) Las tasas de proliferacion de SSEA4 tBMMSC y BMMSC regulares se evaluaron mediante el ensayo de incorporacion de BrdU durante 24 horas. El numero de celulas positivas se indico como un porcentaje del numero total de cada poblacion. El porcentaje de celulas positivas aumenta significativamente en tBMMSC en comparacion con el grupo de control. (F) Las tBMMSC muestran un aumento significativo en las duplicaciones de la poblacion en comparacion con las BMMSC regulares.

La Figura 2 muestra que las tBMMSC expresan CD34 y poseen una alta actividad de telomerasa. (A) El analisis por citometrfa de flujo mostro que las BMMSC regulares no expresan CD34, pero son positivas para la tincion del anticuerpo CD45 (21.35%). Sin embargo, las tBMMSC expresan tanto CD34 (23.37%) como Cd45 (31.22%). (B) El analisis de citometrfa de flujo tambien mostro que las tBMMSC CD34 fueron positivas a la tincion de anticuerpos anti CD73 (13.8%) y Oct4 (13.41%). Ninguno de los grupos de tincion se utilizo como controles negativos. (C, D) El analisis de transferencia Western indica que las tBMMSC expresan CD34 y las moleculas de superficie mesenquimal CD73 y CD105. En contraste, las BMMSC regulares solo expresan CD73 y CD105 (C). Las tBMMSC expresan CD34 en el paso 1-5 (D). Se utilizo p-actina como control de carga de la muestra. BMC: medula osea entera ANC. (E, F) La inmunotincion confirma que las tBMMSC son doblemente positivas para CD34 / CD73 (triangulo, E) y CD34 / CD105 (triangulos, F). Las BMMSC regulares son negativas para la tincion del anticuerpo CD34 y solo positivas para la tincion del anticuerpo anti CD73 (E) y CD 105 (F). Barra = 100 pm (G) Las tBMMSC tienen un nivel de actividad de telomerasa significativamente mas alto que las BMMSC. Se utilizaron celulas HEK293T (293T) como control positivo y se utilizaron celulas HEK293T inactivas por calor (H.I.) como control negativo medido por un kit ELISA Tele TAGGG Telomerase PCR. (H) La transferencia Western verifica que las tBMMSC expresan la transcriptasa inversa (TERT) de la telomerasa y las BMMSC son negativas para la tincion de anticuerpos anti TERT. (I) Hay un 3.77% de celulas que son doblemente positivas para la tincion de anticuerpos anti CD34 y CD73 en ANC de medula osea completa, estas celulas CD34 / CD73 se pueden separar de la medula osea usando un clasificador de citometrfa de flujo. (J) Las celulas CD34 / CD73 forman CFU-F en cultivos BMMSC-ECM a una frecuencia similar a la de las tBMMSC. (K) CD34 / CD73 Las BMMSC muestran una mayor actividad de la telomerasa que las BMMSC regulares. Las celulas HEK293T se utilizaron como control positivo (293T) y las celulas HEK293T inactivas por calor se utilizaron como control negativo (H.I.) medido por un kit de ELISA Telo TAGGG Telomerase PCR. (L) Las BMMSC CD34 / CD73 * tambien muestran una produccion significativa de NO en comparacion con las BMMSC regulares. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. Barras de escala = 50 pm. *** P <0,001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 3 muestra que el tratamiento con aspirina eleva la expresion de CD34 en BMMSC. (A) El analisis citometrico de flujo indico que la BMMSC tratada con aspirina (TAT-BMMSC) muestra una expresion positiva de CD34 cuando se compara con la expresion negativa de CD34 en una BMMSC regular (BMMSC). Los niveles de expresion de CD45 en TAT-BMMSC fueron mas bajos que en BMMSC y tBMMSC. (B) Las TAT-BMMSC expresan niveles altos significativos de Scall, Oct4 y CD34 en comparacion con BMMSC, pero a un nivel mucho mas bajo que las tBMMSC. Sin embargo, las TAT-BMMSC expresan un nivel mucho menor de CD45 en comparacion con las tBMMSC y BMMSC regulares. (C) El analisis de transferencia Western mostro que las tBMMSC y las BMMSC tratadas con aspirina expresan CD34, pero las BMMSC no se expresan para CD34. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. ** P <0.01; *** P <0.005. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 4 muestra la diferenciacion hematopoyetica de las tBMMSC. (A) Las BMMSC, las tBMMSC y las BMMSC tratadas con aspirina se cultivaron en una placa de cultivo de baja adhesion de 35 mm (2 x 104 / placa) en medio de diferenciacion hematopoyetica con o sin eritropoyetina (EPO; 3U / mL) durante 7 dfas. Se utilizaron celulas de medula osea y celulas de medula osea completas con linaje negativo (celulas de Linaje) como controles positivos. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. (B) Los ratones que recibieron BMMSC regulares (BMMSC, n = 5) o PBS sin celulas (Control, n = 8) no pudieron sobrevivir mas alla de 14 dfas. El grupo completo de infusion de celulas de la medula osea (celulas BM completas, n = 3) es un grupo de control positivo con supervivencia durante los 110 dfas posteriores a la irradiacion. Las tBMMSC pueden prolongar la vida util de los ratones irradiados con dosis letales (tBMMSC, n = 10). Curvas de supervivencia de Kaplan-meier.

La Figura 5 muestra que las tBMMSC muestran propiedades inmunomoduladoras reguladas al alza. (A) Los niveles de NO en el sobrenadante de tBMMSC y el cultivo regular de BMMSC (cada 0.2 x 106 / pocillo en una placa de 24 pocillos) fueron significativamente mayores en el grupo de tBMMSC tratado con INF-y (25 ng / ml) / IL-1 p (5 ng / ml) que en las BMMSC regulares. (BJ) Las celulas de bazo activadas por anticuerpos (SP) anti-CD3 y anti-CD28 (cada una de 1 pg / ml) (1 x 10 6 / camara) en las camaras superiores se cocultivaron con o sin tBMMSC o BMMSC regulares (1 x 10 5 / camara) en la camara inferior utilizando un sistema de transferencia de pocillos. Tres dfas despues del co-cultivo, se analizo la viabilidad celular de las celulas SP activadas utilizando un kit 8 de recuento de celulas (B-D). El cultivo de tBMMSC mostro una reduccion significativa en la viabilidad celular de las celulas SP activadas en comparacion con las celulas cultivadas sin BMMSC (BMMSC-) y con las BMMSC regulares (B). Los efectos de la reduccion de la viabilidad de las celulas del bazo mediante tBMMSC, pero no las BMMSC regulares, se eliminaron en los grupos tratados con L-NMMA inhibidor general de NOS (1 mM) (C) y tratados con (0.2 mM) 1400W de inhibidor especffico de iNOS (D). Tres dfas despues del co-cultivo, las celulas SP activadas en la camara superior se tineron para detectar celulas apoptoticas tal como se describe en Materiales y Metodos (E-J). Tanto las tBMMSC como las BMMSC regulares fueron capaces de inducir una cantidad significativa de celulas apoptoticas tempranas de Anexina V (+) y celulas apoptoticas tardfas y muertas de Anexina V (+) 7AAD (+) (H) en comparacion con los grupos de control negativos (BMMSC-). Parece ser que las tBMMSC tienen un efecto mas significativo que las BMMSC regulares en la induccion de celulas apoptoticas tempranas (E) y tardfas (H). Tanto L-NMMA como 1400W fueron capaces de abolir las celulas anexas de Annexin V (+) (F, I) y Annexin V (+) 7AAD (G, J) inducidas por tBMMSC y BMMSC (G, J). Parece que el tratamiento con 1400W tiene una inhibicion mas significativa en la apoptosis temprana inducida por tBMMSC de las celulas SP activadas (G). (K, M) Se co-cultivaron celulas activadas de C^d4 CD4 (1 x106 / pocillo) y tBMMSC o BMMSC regulares (cada una de 0.1 x 106 / pocillo) en presencia de TGFU1 (2 ng / ml) e IL-2 (2 ng / ml) con o sin inhibidor de NOS durante 3 dfas. Las celulas flotantes se tineron para celulas reguladoras CD4 CD8-CD25 FoxP3 T (Treg). Las tBMMSC mostraron un efecto significativo en la regulacion al alza de las celulas T reguladoras de Foxp3 (Treg) (K). Sin embargo, los tratamientos con L-NMMA y 1400W dieron como resultado la abolicion de la regulacion al alza inducida por tBMMSC de Treg (L, M). Los resultados fueron representativos de, al menos, tres experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 6 muestra que las tBMMSC mostraron un efecto terapeutico superior en ratones MRL / lpr similares a SLE. (A) Un modelo hipotetico que muestra que se infundieron tBMMSC o BMMSC regulares de ratones C3H / HeJ en la vena de la cola de ratones MRL/lpr de 10 semanas de edad (0.1 x106 celulas / 10 g de peso corporal de raton). (B) El tratamiento con tBMMSC y BMMSC recupera el trastorno de la membrana basal inducida por LES y el crecimiento excesivo de las celulas de mesangio en glomerular (G) (tincion con H&E). (C) Los niveles de protefna en la orina se evaluaron 2 semanas despues de la infusion de BMMSC. Tanto las tBMMSC como las BMMSC fueron capaces de reducir los niveles de protefna en la orina en comparacion con el grupo de MRL / lpr. Sin embargo, las tBMMSC ofrecieron una reduccion mas significativa de los niveles de protefna en la orina en comparacion con las BMMSC regulares. (D, E) ELISA cuantifico que los niveles de anticuerpos anti dsDNA IgG e IgM aumentaron significativamente en la sangre periferica de ratones MRL/lpr cuando se compararon con el nivel no detectable (N.D.) en los controles (C3H). Los tratamientos con tBMMSC y BMMSC pudieron reducir los niveles de anti dsDNA IgG e IgM, pero los tBMMSC muestran un efecto de tratamiento superior al de BMMSC en la reduccion del nivel de IgG de dsDNA (D). (F) Los tratamientos con tBMMSC y BMMSC pudieron reducir significativamente el anticuerpo antinuclear (ANA) en ratones MRL / lpr, que aumento significativamente en comparacion con el control (n = 6). Pero las tBMMSC mostraron un mejor efecto en la reduccion de los niveles de ANA en comparacion con el tratamiento con BMMSC. (G) Los tratamientos con tBMMSC y BMMSC pudieron aumentar el nivel de albumina en comparacion con el nivel en ratones MRL / lpr, que disminuyeron significativamente en comparacion con el control (n = 6). Los tratamientos con tBMMSC se muestran mas efectivos para elevar el nivel de albumina en suero en comparacion con el grupo tratado con BMMSC. (H) El analisis citometrico de flujo mostro que la cantidad de Tregs CD25 Foxp3 en los linfocitos CD4 T de la sangre periferica MRL / lpr se redujo en comparacion con el control. Los tratamientos con BMMSC y tBMMSC elevaron el numero de Treg. Parece que las tBMMSC indujeron una elevacion mas significativa de los niveles de Treg que las BMMSC. (I) La citometrfa de flujo revelo que los ratones MRL / lpr tenfan un nivel significativamente mayor de linfocitos -T IFNg CD4 IL17 (celulas Th17) en el bazo en comparacion con el grupo de control. Las celulas Th17 disminuyeron notablemente en los grupos tratados con BMMSC y tBMMSC. El tratamiento con tBMMSC indujo una reduccion mas significativa de las celulas Th17 que con las BMMSC. Los resultados fueron representatives de seis experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 7 muestra que la produccion de oxido nftrico por BMMSC esta regida por la senalizacion de telomerasa y la Wnt / beta-catenina. (A, B) Se cultivo tBMMSC con inhibidor de telomerasa III (1 pM) durante una semana. La actividad de la telomerasa (A) y la produccion de NO (B) se redujeron significativamente en el grupo de tratamiento con inhibidores de la telomerasa. Se utilizaron celulas 293 T y muestras inactivadas por calor como control positivo y negativo, respectivamente. (C-E) Las BMMSC regulares se cultivaron con aspirina o inhibidor de telomerasa III (Telo I, 1 pM) durante una semana. La aspirina puede elevar la actividad de la telomerasa (C), la expresion de la transcriptasa inversa (TERT) de la telomerasa (D) y la produccion de NO (E) en las BMMSC. En contraste, el inhibidor de la telomerasa III reduce la actividad de la telomerasa (C) y la produccion de NO (E). (F) En el grupo de tratamiento con aspirina, se anadio un inhibidor de Wnt, DKK1 (DKK, 10 ng / ml) a los cultivos de BMMSC durante tres dfas (DKK-TAT), lo que llevo a una reduccion significativa de los niveles de NO en comparacion con el grupo de aspirina (TAT). (G) El analisis de transferencia Western mostro que DKK1 puede reducir los niveles de p -catenina activa. El tratamiento con aspirina (TAT) puede bloquear parcialmente la regulacion a la baja inducida por DKK1 de la expresion de beta-catenina activada. (H) El tratamiento con DKK1 pudo abolir la actividad de la telomerasa inducida por aspirina (TAT) en las BMMSC (DKK-TAT). (I) Cuando las BMMSC se cultivaron con el activador de la senalizacion de beta catenina Chiron, a 1 y 10 pM durante 1 semana, la produccion de NO en BMMSC aumento significativamente de una manera dependiente de la dosis segun lo medido por el kit NO / Nitrito / Nitrato Total. (J) El analisis de transferencia Western confirmo que el tratamiento con Chiron induce una expresion regulada al alza de beta-catenina en las BMMSC. (K) El tratamiento con Chiron es capaz de inducir una alta actividad de la telomerasa, que es bloqueada por el inhibidor de la telomerasa III (Telo i-Chiron) cuando se usa antes de la induccion de Chiron. Las celulas 293T y la muestra inactivada por calor se utilizaron como control positivo y negativo respectivamente. (L) La alta produccion de NO inducida por Chiron puede ser bloqueada por el tratamiento con inhibidor de telomerasa III. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 8 muestra que las BMMSC tratadas con aspirina mostraron un efecto terapeutico mejorado en ratones MSL / lpr similares a SLE. (A) Los niveles de protefna en la orina se evaluaron 2 semanas despues de la infusion de BMMSC. Tanto las BMMSC como las BMMSC tratadas con aspirina (TAT) (TAT-BMMSC) fueron capaces de reducir los niveles de protefnas en la orina en comparacion con el grupo MRL / lpr. Sin embargo, TAT-BMMSC ofrecio una reduccion mas significativa de los niveles de protefna en la orina en comparacion con las BMMSC regulares cuando se infundieron las 0.1 x 106 o 0.01 x 106 celulas sistemicamente. Parece que las 0.01 x 106 BMMSC no lograron reducir el nivel de protefna en la orina en comparacion con los ratones MRL / lpr. (B, C) ELISA cuantifico que los niveles de anticuerpos anti dsDNA IgG e IgM aumentaron significativamente en la sangre periferica de ratones MRL / lpr en comparacion con los controles (C3H). Los tratamientos con TAT-BMMSC y BMMSC pudieron reducir los niveles de anti dsDNA IgG e IgM, pero las TAT-BMMSC muestran un efecto de tratamiento superior al de BMMSC para reducir los niveles de dsDNA IgG e IgM. Las TAT-BMMSC del grupo de infusion de 0.01 x 106 celulas fue capaz de reducir significativamente los niveles de anti dsDNA IgG e IgM. (D) Los tratamientos con TAT-BMMSC y BMMSC pudieron reducir significativamente el anticuerpo antinuclear (ANA) en ratones MRL / lpr, que aumento significativamente en comparacion con el control (C3H). Pero el grupo de infusion de 0.01 x 106 celulas TAT-BMMSC mostro un mejor efecto en la reduccion de los niveles de ANA en comparacion con el tratamiento con BMMSC. (E) El analisis ELISA mostro que los tratamientos con TAT-BMMSC y BMMSC pudieron reducir los niveles sericos de IL17 en comparacion con el nivel alto en ratones MRLlpr. Sin embargo, las TAT-BMMSC del grupo de infusion de 0.01 x 106 celulas mostro un efecto mas eficaz en la reduccion del nivel de IL17 en suero cuando se comparo con el grupo tratado con BMMSC. (F) La citometrfa de flujo revelo que los ratones MRL / lpr tenfan un nivel significativamente mayor de linfocitos IFNg-T CD4 IL17 (celulas Th17) en el bazo en comparacion con el grupo de control (C3H). Las celulas Th17 disminuyeron notablemente en los grupos tratados con TAT-BMMSC y BMMSC.

El tratamiento con TAT-BMMSC indujo una reduccion mas significativa de las celulas Th17 que los grupos tratados con BMMSC. (G) El analisis de citometrfa de flujo mostro que el numero de CD25 Foxp3 en los linfocitos T CD4 de la sangre periferica MRL / lpr se redujo en comparacion con el control (C3H). Los tratamientos con TAT-BMMSC y BMMSC elevaron el numero de Treg. Parece que las TAT-BMMSC indujeron una elevacion mas significativa de los niveles de Treg que las BMMSC cuando las 0.01 x 106 celulas fueron infundidas sistemicamente. Los resultados fueron representativos de seis experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 9 muestra que la medula osea humana contiene tBMMSC. (A) las tBMMSC humanas (htBMMSC) mostraron una actividad de telomerasa de nivel significativamente alto que las BMMSC (hBMMSC) tal como se midio por medio del kit ELISA Telo TAGGG Telomerase PCE. Las celulas T293 y el calor inactivo (H.I.) se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. (B) Las htBMMSC producen un nivel de NO mayor que el de hBMMSC segun lo evaluado por el kit NO / Nitrito / Nitrato Total. (C) La produccion de kynurenina aumento significativamente en htBMMSC en comparacion con hBMMSC (p <0.005). (D) Cuando hBMMSC o htBMMSC se cocultivaron con celulas T activas, el nivel de kinurenina en el sistema de co-cultivo aumento drasticamente con un aumento mas significativo en el grupo de htBMMSC en comparacion con el grupo de hBMMSC. (E) Los numeros de celulas apoptoticas doble positivas de Anexina V y 7AAD en celulas T activas aumentaron cuando se cultivaron conjuntamente con hBMMSC o htBMMSC. Sin embargo, la tasa de celulas apoptoticas aumento significativamente en el grupo de htBMMSC en comparacion con el grupo de hBMMSC. Los resultados fueron representativos de tres experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** p <0.005. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 10 muestra el numero de CFU-F en cultivos de BMMSC. Las ANC primarias se sembraron a 1 x 106 en placas de cultivo de plastico normales de 6 cm (plastico) o las placas de cultivo recubiertas con ECM producida por BMMSC (ECM) durante 14 dfas. El numero de las CFU-F aumento significativamente en las BMMSC cultivadas en placas recubiertas con ECM. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 11 muestra la diferenciacion multipotente de tBMMSC. (a) La tincion con Rojo Alizarina S y la fosfatasa alcalina (ALP) mostro que las tBMMSC fueron similares a las BMMSC regulares en la diferenciacion osteogenica in vitro. (b) Las tBMMSC o las BMMSC regulares (4 x 106 celulas / trasplante) se transplantaron en ratones inmunocomprometidos utilizando HA / TCP (HA) como vehfculo durante 8 semanas. La formacion osea se detecto en los trasplantes de tBMMSC y BMMSC, evidenciado por la tincion con H&E. DECIR AH; fosfato tricalcico de hidroxiapatita, B; hueso, M; medula osea, C; tejido conectivo; Ampliacion original; X 200. Barra = 50 grp. (c) Las tBMMSC son capaces de formar celulas positivas para Rojo de aceite O y la expresion del ARNm de PPABy2 y LPL tal como se aprecia en las BMMSC regulares mediante tincion con Rojo de aceite O y analisis de RT-PCR, respectivamente. Se utilizo gliceraldehfdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. Barras de escala = 100 pm. 1: control negativo, 2: BMMSC, 3: tBMMSC. (d) La diferenciacion condrogenica se evaluo mediante tincion con azul de Alcian para mucosustancias sulfatadas acidas, tincion de Trichrome de Pollak para colageno y tincion inmunohistoqufmica para colageno tipo II. Las tBMMSC fueron capaces de diferenciarse en condrocitos tal como se observo en las BMMSC regulares. Barra = 50 grp. Los resultados fueron representativos de tres experimentos independientes. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 12 muestra el nivel de NO en tBMMSC. Se cultivaron BMMSC y tBMMSC (2 x 105 / pocillo) durante 3 dfas y se trataron con L-NMMA (1 mM) o 1400W (0.2 mM) durante 3 dfas. (a) El sobrenadante de cultivo recogido se utilizo para medir el nivel de NO. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes, (b) El analisis de transferencia Western mostro que la expresion de iNOS se inhibfa por LNMMA y 1400W. * P <0.05; *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 13 muestra la actividad de los osteoclastos en ratones MRL / lpr tratados con tBMMSC, (a) la tincion con TRAP indico el aumento del numero de celulas TRAP positivas en la epffisis de los femures distales de ratones MRL / lpr en comparacion con el control (C3H). La infusion de tBMMSC y BMMSC dio como resultado una reduccion significativa en el numero de celulas TRAP positivas. Parece que el grupo tBMMSC muestra una reduccion mas significativa del numero de celulas TRAP positivas que el grupo BMMSC, (b, c) ELISA revelo que los ratones MRL / lpr tienen niveles aumentados de RANKL soluble (sRANKL) (b) y telopeptidos C-terminales de colageno de tipo I (CTX) (c) en suero en comparacion con los controles. La infusion de tBMMSC y BMMSC puede reducir significativamente los niveles de sRANKL (B) y CTX (C), pero el grupo tBMMSC mostro una mayor efectividad en la reduccion de los niveles de sRANKL (b) y CTX (c). Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD.

La Figura 14 muestra que las propiedades inmunomoduladoras de las BMMSC estan reguladas por la telomerasa. Las celulas SP (1 x 106 / camara), activadas con anticuerpos anti CD3 (5 gg / mL) y CD28 (2 gg / mL), fueron cocultivadas con o sin BMMSC (0.2 x 106 / camara) utilizando un sistema Trans-well (Corning ) por 3 dfas. Las BMMSC se trataron con un analogo de TAT (TAT, 3 pM) durante 3 dfas antes del co-cultivo. La viabilidad celular de las celulas SP se midio utilizando un kit-8 de recuento de celulas (Dojindo Molecular Technoloies, Gaithersburg, MD). Las celulas apoptoticas se tineron con el kit de deteccion de apoptosis Anexina V-PE I (BD Bioscience) y se analizaron con FACSCalibur (BD Bioscience). Las BMMSC tratadas con analogos de TAT (T^a T-BMMSC) podrfan reducir significativamente la viabilidad de las celulas SP activadas (a) y mejorar la apoptosis temprana (b) y tardfa (c) de las celulas SP activadas en comparacion con las BMMSC regulares. Los resultados fueron representativos de cinco experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. La barra grafica representa la media ± SD. Descripcion detallada de la invencion

Abreviaturas

BMMSC: celulas madre mesenquimales de la medula osea;

CFU-F: unidades formadoras de colonias fibroblasticas;

ECM: matriz de celula extracelular;

Oct-4: Octamero-4;

SSEA-4: antfgeno-4 embrionario especffico de la etapa;

SLE: lupus eritematoso sistemico;

HA / TCP: fosfato tricalcico de hidroxiapatita;

Treg: celulas T reguladoras CD4 CD25 Foxp3 ;

ANC: todas las celulas nucleares.

Definiciones

A menos que se indique lo contrario en el presente documento, todos los terminos utilizados en este documento tienen el significado que los terminos tendrfan para los expertos en la tecnica de la presente invencion. Se dirige especialmente a los profesionales a los libros de texto actuales para las definiciones y terminos de la tecnica. Debe entenderse, sin embargo, que esta invencion no esta limitada a la metodologfa, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. Las celulas individuales y las poblaciones celulares se referiran en el presente documento mediante la utilizacion de un sfmbolo”+” o “-“ para indicar si una determinada celula o poblacion celular expresa o carece de un marcador especffico, por ejemplo, una molecula de CD. Cuando se utiliza en relacion con una sola celula, la utilizacion de un sfmbolo '+' o '-' indica si esa celula expresa o carece del marcador especffico. Por ejemplo, una celula "CD34+", CD31-" es una que expresa CD34, pero no CD31. Cuando se utiliza en relacion con las poblaciones celulares, la utilizacion de un sfmbolo o para indicar si una determinada poblacion celular, o una parte de la misma, expresa la presencia o carencia del marcador especffico.

Tal como se utiliza en el presente documento, las denominadas "BMMSC regulares" son BMMSC que aparecen como agrupaciones de colonias unicas adherentes (fibroblastos formadores de colonias [CFU-F]) en cultivos plasticos regulares, y posteriormente proliferan en placas de cultivos (Friedenstein et al., 1980).

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapeutico como a las medidas profilacticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o disminuir (reducir) la afeccion o trastorno patologico objetivo. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, asf como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno.

Una "cantidad terapeuticamente efectiva" de tBMMC es una cantidad suficiente para llevar a cabo un proposito especfficamente establecido. Una "cantidad efectiva" puede determinarse empfricamente y de manera rutinaria en relacion con el proposito indicado.

Un "vehfculo" o "vehfculos", tal como se utiliza en el presente documento, incluye vehfculos, excipientes o estabilizadores farmaceuticamente aceptables que no son toxicos para la celula o el mamffero que se expone al mismo en las dosis y concentraciones empleadas. El vehfculo fisiologicamente aceptable puede ser una solucion tamponada de pH acuoso esteril. Los ejemplos de vehfculos fisiologicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico; polipeptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); protefnas, como la albumina serica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos como por ejemplo polivinilpirrolidona; aminoacidos como por ejemplo glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como por ejemplo EDTA; alcoholes de azucar como por ejemplo manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal como el sodio; y / o tensioactivos no ionicos.

Un aspecto de la presente invencion esta dirigido a subconjuntos unicos de celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas que tienen una alta actividad de telomerasa. La actividad alta de la telomerasa se define mas ampliamente como una poblacion de BMMSC que tienen mayor actividad de la telomerasa que las BMMSC regulares, pero preferentemente el subconjunto aislado de las BMMSC humanas tiene una actividad de la telomerasa al menos dos veces mas alta que las BMMSC regulares. Las BMMSC humanas aisladas que tienen una alta actividad de telomerasa de acuerdo con la presente invencion se caracterizan generalmente por tener una expresion de CD34 y no formar CFU-F (firbroblastos de unidades formadoras de colonias) en cultivos en plastico, pero que se adhieren a matrices extracelulares producidas por celulas madre mesenquimales. En su sentido mas amplio, el termino "aislado" cuando se utiliza en relacion con una poblacion de celulas de interes, significa que la poblacion de celulas esta al menos parcialmente aislada de otros tipos de celulas u otro material celular con el que se produce naturalmente en el tejido de origen (por ejemplo, medula osea). En otra forma de realizacion, las celulas madre aisladas tambien estan sustancialmente libres de moleculas solubles, que se producen naturalmente.

Las celulas madre mesenquimales de la medula osea humana aisladas de acuerdo con la presente invencion incluyen: (1) BMMSC humanas aisladas derivadas de celulas no adherentes en el cultivo de plastico (en lo sucesivo, denominadas "tBMMSC"); (2) BMMSC CD34 aisladas, preferentemente, BMMSC CD34 / CD73 ; y (3) BMMSC CD 34 - humanas que se han tratado con un agente de induccion de telomerasa (por ejemplo, TAT-BMMSC). Todas las BMMSC en la presente invencion son BMMSC humanas.

La medula osea humana utilizable en relacion con la presente invencion puede obtenerse generalmente desde el interior del hueso humano. Preferentemente, la medula osea es medula osea posnatal. Habitualmente se utilizan todas las celulas nucleadas de la medula osea. Lo mas preferiblemente, se utiliza la medula osea derivada de todas las celulas nucleares (ANCs) de femures y tibias tal como se describe en el presente documento.

Los tipos de celulas especfficos descritos e identificados en este documento pueden aislarse a partir de las celulas recolectadas empleando tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, como, por ejemplo, pero sin limitarse a, la centrifugacion en gradiente de densidad, la separacion magnetica de celulas, la citometrfa de flujo, la separacion de celulas de afinidad o las tecnicas de adhesion diferencial. En una forma de realizacion preferente, las celulas madre de la presente invencion se pueden purificar, por ejemplo, mediante citometrfa de flujo (por ejemplo, analisis FACS), tal como se describe a continuacion. Las BMMSC con alto contenido de telomerasa descritas en el presente documento experimentaran una expansion ex vivo de acuerdo con metodos conocidos para que las BMMSC enriquezcan los numeros de celulas para la regeneracion de tejidos o las terapias sistemicas.

TBMMSC aisladas

Las tBMMSC generalmente se afslan a partir de una poblacion heterogenea de celulas precursoras postnatales. Las tBMMSC aisladas se caracterizan generalmente como BMMSC humanas que no pueden formar agrupaciones de colonias unicas (CFU-F) en cultivos de plastico, pero son capaces de adherirse a la ECM producida por celulas madre mesenquimaticas y muestran una mayor expresion de la telomerasa en relacion con las BMMSC humanas normales. Las tBMMSC muestran caracterfsticas de celulas madre mesenquimales con distincion a las celulas hematopoyeticas tal como lo demuestra la coexpresion de CD73 o CD105 con CD34. Las tBMMSC no consiguen diferenciarse en el linaje de celulas hematopoyeticas.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para aislar tBMMSC que comprende: cultivar una muestra de medula osea derivada de todas las celulas nucleares en un sustrato de plastico; eliminar las celulas que no se adhieren al sustrato de plastico; cultivar las celulas eliminadas en un medio recubierto con BMMSC-ECM; y recolectar colonias formando celulas unidas en el medio BMMSC-ECM.

Mas especfficamente, las tBMMSC pueden producirse y aislarse de la siguiente manera: las ANC primarias se siembran en un sustrato plastico, por ejemplo, placas de cultivo de plastico. Las tBMMSC en las ANC primarias no se adhieren a las placas de cultivo y permanecen en la suspension celular. Las suspensiones celulares que contienen tBMMSC putativasa no unidas se recolectan y transfieren a placas cultivadas recubiertas con matriz extracelular (ECM) producida por BMMSC, lo que da como resultado la generacion de agrupaciones de colonias individuales (CFU-F). Estas BMMSC unidas a eCm (tBMMSC) se subcultivan de acuerdo con metodos conocidos en cultivos plasticos regulares. El analisis citometrico de flujo tfpico indica que las tBMMSC expresan altos niveles de marcadores de celulas madre mesenquimales CD73 (por ejemplo, aproximadamente el 80%), Sca-1 (por ejemplo, aproximadamente el 90%) y Oct4 (por ejemplo, aproximadamente el 40%) en comparacion con las BMMSC regulares (CD73: por ejemplo, aproximadamente 70%, Sca-1: aproximadamente 50%, Oct4: aproximadamente 14%). Sin embargo, parece que las tBMMSC y las BMMSC expresan un nivel similar de SSEA-4.

Las tBMMSC expresan CD34 y poseen una alta actividad de telomerasa en relacion con las BMMSC regulares. Tal como se describe en el presente documento, las BMMSC regulares no expresan CD34, pero son positivas para CD45 (alrededor del 20%). Sin embargo, las tBMMSC expresan tanto CD34 (alrededor del 25%) como CD45 (alrededor del 30%). El analisis de transferencia Western indica que las tBMMSC expresan CD34 y las moleculas de superficie mesenquimal CD73 y CD105. En contraste, las BMMSC regulares solo expresan CD73 y CD105. Las tBMMSC tambien tienen niveles significativamente mas altos de actividad de la telomerasa que las BMMSC regulares.

Para garantizar la pureza de las tBMMSC, se prefiere aislar y purificar sustancialmente las tBMMSC que expresan un marcador conocido por expresarse en BMMSC regulares seleccionadas del grupo que consiste en STRO-1, CD29, CD73, CD90, CD105, CD146, Octamero-4 (Oct4), y antfgeno-4 embrionario especffico de etapa (SSEA4). En una forma de realizacion preferente, la tBMMSC SSEA4 puede aislarse y purificarse mediante tecnicas generalmente conocidas por los expertos en la materia, como por ejemplo FACS inmune. Una muestra de celulas madre de tBMMSC es "sustancialmente pura" cuando esta al menos al 80%, o al menos al 90%, o al menos al 95%, y, en ciertos casos, al menos el 99% esta libre de celulas distintas de las celulas de interes. Asf, por ejemplo, una muestra de celulas madre tBMMSC SSEA4 es "sustancialmente pura" cuando es de al menos el 80%, o al menos el 90%, o al menos el 95%, y, en ciertos casos, al menos el 99% libre de celulas distintas de tBMMSC SSEA4 . La pureza se puede medir mediante cualquier metodo apropiado, por ejemplo, mediante clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) u otros ensayos que distinguen los tipos de celulas.

BMMSC CD34 humanas aisladas

Las BMMSC CD34 son distintas de las BMMSC regulares en terminos de tener una actividad de telomerasa elevada y unos niveles altos del marcador de celulas madre mesenquimales anterior, Oct4, junto con un aumento de la funcion inmunomoduladora. El mecanismo que puede contribuir a la funcion inmunomoduladora regulada al alza se asocia con una alta produccion de NO en tBMMSC (Ren et al., 2008) y un alto nivel de Treg impulsado por NO (Niedbala et al., 2007), que parece estar regido por la actividad de la telomerasa junto con la senalizacion Wnt / beta-catenina. Sin limitarse a la teorfa, se cree que esta es la razon por la que las tBMMSC tienen un efecto terapeutico superior en el tratamiento de ratones con SLE.

Las BMMSC CD34 aisladas no consiguen formar CFU-F en cultivos plasticos, pero son capaces de adherirse a la ECM producida por celulas madre mesenquimales y de diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos de ratones C3H / HeJ y C57BL / 6J. Las BMMSC CD34 coexpresan marcadores de celulas madre mesenquimales CD73 y CD105. Ademas, las BMMSC CD34 son distintas de las HSC debido a que no pueden diferenciarse en el linaje de celulas hematopoyeticas in vitro y no pueden rescatar a los ratones irradiados con dosis letales.

Preferentemente, las BMSSC humanas aisladas son doble positivas para CD34 y al menos otro marcador conocido por expresarse en BMMSC regulares seleccionadas del grupo que consiste en STRO-1, CD29, CD73, CD90, CD105, CD146, Octamero-4 (Oct4) y antfgeno-4 embrionario especffico de la etapa (SSEA4). Preferiblemente, las BMMSC son tanto CD34 como ^c D73 . Preferentemente, las ^b M^mSC CD34 aisladas son sustancialmente puras. Una muestra de BMMSC CD34 es "sustancialmente pura" cuando esta al menos al 80%, o al menos al 90%, o al menos al 95%, y, en ciertos casos, al menos el 99% esta libre de celulas distintas de las celulas de interes. Asf, por ejemplo, una muestra (poblacion) de BMMSC CD34 es "sustancialmente pura" cuando es al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, y, en ciertos casos, al menos 99 % libre de celulas distintas de BMMSC CD34 . La pureza se puede medir por cualquier metodo apropiado, por ejemplo, por clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), u otros ensayos que distinguen los tipos de celulas.

Tal como se describe en el presente documento, aproximadamente el 4% de las celulas BMMSC humanas son doble positivas para CD34 y CD73 en ANC de medula osea completa. Estas celulas CD34 / CD73 se pueden clasificar y aislar de la medula osea utilizando tecnicas convencionales, como un clasificador de citometrfa de flujo. La utilizacion de la citometrfa de flujo para aislar BMMSC CD34 / CD73 de la medula osea completa ofrece un enfoque practico para aislar y recoger tBMMSC para uso terapeutico clfnico. Las celulas CD34 / CD73 se pueden clasificar y aislar a partir de tBMMSC y de BMMSC regulares que han sido tratadas con un agente de induccion de telomerasa tal como se describe en el presente documento. Preferentemente, las BMMSC CD34 / CD73 son "sustancialmente puras." Un grupo de BMMSC CD34 / CD73 son "sustancialmente puras" cuando es al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, y, en ciertos casos, al menos 99% libres de celulas distintas de BMMSC CD34 / CD73 .

Las celulas CD34 / CD73 forman CFU-F en cultivos de BMMSC-ECM a una frecuencia similar a la de las tBMMSC. Los BMMSC CD34 / CD73 tambien muestran una mayor actividad de la telomerasa que los BMMSC regulares. Los BMMSC CD34 / CD73 tambien muestran un aumento significativo en la produccion de NO en comparacion con los BMMSC regulares.

CD34- BMMSC tratadas con un agente de induccion de telomerasa.

En el presente documento tambien se describe un metodo para aumentar la actividad de la telomerasa en celulas madre mesenquimales de medula osea humana CD34- que comprende: poner en contacto celulas madre mesenquimales de medula osea humana con una cantidad eficaz de un agente inductor de telomerasa. Las BMMSC CD 34 - pueden ser, por ejemplo, BMMSC regulares. Tal como se define en el presente documento, un grupo de BMMSC es CD34 - si menos de aproximadamente el 1% del grupo es CD34

La actividad de la telomerasa de las BMMSC CD 34 - puede aumentarse agregando una cantidad efectiva de agente de induccion de telomerasa al medio de cultivo. Un agente de induccion de telomerasa preferido es la aspirina, pero los analogos estructurales y funcionales de la aspirina pueden ser sustituidos. Las condiciones de cultivo pueden ser determinadas apropiadamente por los expertos en la materia mediante la medicion de los niveles de actividad de la telomerasa tal como se describe en el presente documento. Cuando se utiliza aspirina, se agrega preferiblemente al medio de cultivo a aproximadamente 2 ug / ml a aproximadamente 50 pg / ml durante aproximadamente 1 semana. El cultivo en estas condiciones da como resultado un aumento significativo del nivel de actividad de la telomerasa en BMMSC.

Las BMMSC humanas regulares pueden ser tratadas con un agente de induccion de telomerasa para convertirse en BMMSC que tienen una alta actividad de telomerasa con una funcion inmunomoduladora mejorada. Especfficamente, cuando la aspirina se agrega al medio de cultivo a 2.5 pg / ml o 50 pg / ml durante 1 semana, se logro un nivel significativamente mayor de actividad de la telomerasa en BMMSC. Las BMMSC resultantes se denominan en el presente documento como TAT-BMMSC. Las TAT-BMMSC muestran una expresion positiva de CD34 cuando se compara con la expresion negativa de CD34 en BMMSC regulares. Los niveles de expresion de CD45 en TAT-BMMs C fueron mas bajos que en BMMSC y tBMMSC. Las TAT-BMMSC expresan niveles altos significativos de Scall, Oct4 y CD34 en comparacion con las BMMSC, pero a un nivel mucho mas bajo que las tBMMSC. Sin embargo, las TAT-BMMSC expresan un nivel mucho menor de CD45 en comparacion con las tBMMSC y BMMSC regulares. El analisis de transferencia Western mostro que las tBMMSC y las BMMSC tratadas con aspirina expresan CD34, pero las BMMSC no se pueden expresar en CD34.

Aplicaciones terapeuticas de las BMMSC de alta actividad de la telomerasa

Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso de las BMMSC de la presente invencion en el tratamiento de uno o mas trastornos.

En el presente documento se describe tambien un metodo para aumentar la concentracion de NO in vivo, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas de la presente invencion. El NO es un mediador biologico gaseoso con funciones importantes en la funcion de los macrofagos y las celulas T (Sato et al., 2007; Bogdan et al., 2001). iNOS es inducido por IFNy, TNFa, IL-1 a o IL-lp en BMMSC, y los ratones iNOS '- muestran una capacidad reducida para suprimir las funciones de las celulas T (Ren et a1, 2008). Se ha informado de que la NOS endotelial activa junto con el receptor de estrogeno regula de forma cooperativa la expresion de la transcriptasa de la telomerasa humana (hTERT) en el endotelio (Grasselli et al., 2008). En el presente documento describimos el papel funcional de la alta actividad de la telomerasa en la mejora de la actividad inmunomoduladora de las BMMSC a traves de la elevacion de aproximadamente 10pM de produccion de NO y aproximadamente el 5% de regulacion al alza de Treg. La produccion de NO mejorada con telomerasa tambien esta asociada con la senalizacion de Wnt / p -catenina, en la que el inhibidor de Wnt DKK1 puede bloquear la actividad de la telomerasa inducida por el activador de telomerasa y la produccion de NO asociada en BMMSC. Ademas, el activador de Wnt Chiron puede promover la actividad de la telomerasa y la produccion de NO en las BMMSC. El tratamiento previo con inhibidor de la telomerasa puede anular parcialmente la actividad de la telomerasa inducida por el activador Wnt. Estos datos sugieren que la telomerasa junto con la senalizacion Wnt / beta-catenina inducfa la produccion de NO. Por lo tanto, ademas del papel funcional en la participacion en la via de senalizacion Wnt / beta-catenina (Park et al., 2009), la telomerasa tambien colabora con la senalizacion Wnt / beta-catenina para modular la produccion de NO. Tanto la telomerasa como los activadores Wnt / beta-catenina pueden inducir una alta produccion de NO en las BMMSC regulares, lo que lleva a una mejor reduccion de la viabilidad de las celulas SP activadas. Pero solo el tratamiento con activador de telomerasa es capaz de mejorar la apoptosis de las celulas SP activadas. Es posible que otros factores inmunomoduladores tambien contribuyan a la inmuno-modulacion elevada de las tBMMSC.

Otra forma de realizacion de la presente invencion se refiere a las BMMSC de la invencion para su utilizacion en metodos para modular el lupus eritematoso sistemico que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de las celulas madre mesenquimaticas de medula osea humana aisladas de la presente invencion.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "cantidad efectiva" de las BMMSC de la presente invencion, cuando se usa en relacion con una utilizacion medica, es una cantidad de las BMMSC suficiente para llevar a cabo un proposito especfficamente establecido. En general, una "cantidad efectiva" en referencia al tratamiento de una enfermedad o trastorno puede determinarse empfricamente por referenda a los datos y estandares divulgados en el presente documento y de manera rutinaria en relacion con el proposito indicado. Una cantidad efectiva se administra preferiblemente en una sola dosis al paciente; sin embargo, la cantidad efectiva se puede administrar al paciente como una cantidad de dosis durante un perfodo de tiempo. Tal como se describe en el presente documento, la dosis de 0.1x 106 celulas / 10 g de peso corporal es suficiente para tratar ratones SLE en el caso de BMMSC regular. Mediante la utilizacion de BMMS^c de alta actividad de la telomerasa, la dosis se puede reducir a 0.01x 106 celulas / 10 g de peso corporal con efecto terapeutico. Los expertos en la materia pueden aplicar esto al tratamiento de seres humanos utilizando modelos conocidos que relacionan las dosis de raton con el ser humano y utilizando tecnicas conocidas para la optimizacion de dosis.

Tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de composicion farmaceutica que comprende celulas madre mesenquimaticas aisladas de medula osea que tienen una alta actividad de telomerasa en un medio vehfculo. Las composiciones farmaceuticas se utilizan para la administracion de celulas madre mesenquimales de medula osea aisladas que tienen una alta actividad de telomerasa para el tratamiento de acuerdo con cualquiera de los metodos descritos en el presente documento.

En los metodos descritos en el presente documento, las BMMSC de la presente invencion deberfan ser compatibles con el paciente y administrarse en una cantidad terapeuticamente eficaz de las BMMSC. La cantidad terapeuticamente eficaz puede variar desde el numero maximo de celulas que el paciente recibe de forma segura hasta el numero mfnimo de celulas necesarias para lograr el efecto deseado. Un experto en la tecnica puede determinar y optimizar cantidades eficaces de acuerdo con tecnicas conocidas para llevar a cabo el proposito previsto del tratamiento.

La cantidad terapeuticamente efectiva de las BMMSC puede suspenderse en un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Dicho vehfculo puede incluir, entre otros, un medio de cultivo adecuado mas albumina serica al 1%, solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa, agua y combinaciones de los mismos. La formulacion debe ser adecuada para el modo de administracion.

En una forma de realizacion preferente, la preparacion o composicion de BMMSC se formula para la administracion sistemica a seres humanos de acuerdo con los procedimientos para formulaciones farmaceuticas conocidos por los expertos en la materia. Habitualmente, las composiciones para administracion sistemica son soluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Los ingredientes pueden suministrarse por separado o mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un concentrado crioconservado en un recipiente hermeticamente sellado, como por ejemplo una ampolla que indica la cantidad de agente activo.

A la vista de esta memoria descriptiva, una variedad de medios para administrar celulas a sujetos resultara evidente para los expertos en la tecnica. Dichos metodos pueden incluir la administracion sistemica o la inyeccion de las celulas en un sitio objetivo en un sujeto. Las celulas pueden insertarse en un dispositivo de administracion que facilita la introduccion mediante inyeccion o implantacion en los sujetos. Dichos dispositivos de administracion pueden incluir tubos, por ejemplo, cateteres, para inyectar celulas y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una forma de realizacion preferente, los tubos tienen ademas una aguja, por ejemplo, una jeringa, a traves de la cual se pueden introducir las celulas de la invencion en el sujeto en una ubicacion deseada. Las celulas pueden prepararse para su administracion en una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, las celulas pueden estar suspendidas en una solucion o gel. Las celulas pueden mezclarse con un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable en el que las celulas de la invencion permanecen viables. Los vehfculos y diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen solucion salina, soluciones tampon acuosas, disolventes y / o medios de dispersion. La utilizacion de dichos vehfculos y diluyentes es bien conocida en la tecnica. La solucion es preferentemente esteril y fluida, y con frecuencia sera isotonica. Preferentemente, la solucion es estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y se conserva contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares.

Los modos de administracion de las BMMSC humanas aisladas incluyen, pero no se limitan a, inyeccion intravenosa o intraarterial sistemica directamente en el tejido en el sitio de actividad deseado. La preparacion se puede administrar por cualquier via conveniente, por ejemplo, por infusion o inyeccion de bolos y se puede administrar junto con otros agentes biologicamente activos. La administracion es preferentemente sistemica. Puede resultar ventajoso, bajo ciertas condiciones, utilizar un sitio de administracion cercano o mas cercano al sitio de actividad deseado. Cuando la composicion se administra por infusion, se puede dispensar con una botella de infusion que contiene agua o solucion salina de grado farmaceutico esteril. Cuando la composicion se administra por inyeccion, se puede proporcionar una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administracion.

La administracion de las BMMSC de esta invencion se puede realizar en combinacion con uno o mas agentes terapeuticos adicionales que incluyen administracion simultanea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas formas de realizacion y aspectos de la presente invencion y no deben interpretarse como limitativos de su alcance. Aunque dichos ejemplos son tfpicos de los que podrfan utilizarse, alternativamente pueden utilizarse otros procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica. De hecho, los expertos en la tecnica pueden visualizar y producir facilmente formas de realizacion adicionales, basadas en las ensenanzas de este documento, sin experimentacion excesiva.

Metodos experimentales

Animales. Se adquirieron ratones hembra C3H / HeJ, C57BL / 6J y CSMRL-Fas lpr / J en Jackson Lab. Ratones inmunocomprometidos hembra (Beige desnudo / XIDIII desnudo) fueron adquiridos en Harlan. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo los protocolos aprobados por la institucion para la utilizacion de la investigacion con animales (USC # 10874 y 10941).

Anticuerpos. Anti Oct4, SSEA4, p catenina activa y p catenina se adquirieron en Millipore. Se adquirieron anticuerpos anti Sca-1-PE, CD34-PE, CD34-FITC, CD45-PE, CD73-PE, CD4-PerCP, CD8-FITC, CD25-APC, CD3 y CD28 en BD Bioscience. Los anticuerpos anti CD105-PE, Foxp3-PE, IL17-PE e IFN^y-APC se adquirieron ene eBioscience. Los anti CD34, CD73 y CD 105 no conjugados y anti TERT se compraron en Santa Cruz Biosciences. El anticuerpo anti p-actina se adquirio en Sigma.

Aislamiento de celulas madre mesenquimales de medula osea de raton (BMMSC). La suspension unica de medula osea derivada de todas las celulas nucleares (ANC) de femures y tibias se sembro a 15 x 106 en placas de cultivo de 100 mm (Corning) a una temperatura de 37 °C a 5% de CO². Las celulas no adherentes se eliminaron despues de 48 horas y las celulas unidas se mantuvieron durante 16 dfas en medio esencial mfnimo alfa (a-MEM, Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 20% (FBS, Equitech-bio), L-glutamina 2 mM 55 pM 2 mercaptoetanol, 100 U / ml de penicilina y 100 pg / ml de estreptomicina (Invitrogen). Las celulas unidas formadoras de colonias se pasaron una vez para un uso experimental adicional.

Preparacion de placas recubiertas con matriz extracelular (ECM). Las placas recubiertas con ECM se prepararon como se describe en Chen et al. (2007). Brevemente, el 100% de confluencia de BMMSC se cultivo en medio de cultivo con 100 nM L de fosfato de acido ascorbico (Wako Pure Chemical). Despues de 2 semanas, los cultivos se lavaron con PBS y se incubaron con 0.005% de Triton X-100 (Sigma) durante 5-10 minutos a temperatura ambiente para eliminar las celulas. La ECM se trato con ADNasa I (100 unidades / ml; Sigma) durante 1 hora a 37 °C. La ECM se lavo con PBS tres veces y se almaceno en 2 ml de PBS que contenfa 100 U / ml de penicilina, 100 g / ml. De estreptomicina, y 0.25 ug / ml de fungizona (Invitrogen) a 4 °C.

Aislamiento de tBMMSC. Las ANTC derivadas de medula osea se sembraron a 15 x 106 en placas de cultivo de 100 mm y se cultivaron durante 48 horas. El sobrenadante de cultivo se recogio y se centrifugo para obtener BMMSC no adjuntas putativas. Las celulas se sembraron nuevamente en las cifras indicadas en placas recubiertas con ECM. Despues de 48 horas, las celulas flotantes en los cultivos se eliminaron con PBS y las celulas unidas en ECM se mantuvieron durante 14 dfas adicionales. Las celulas unidas formadoras de colonias se pasaron una vez y se subcultivaron en placas de cultivo de plastico regulares para experimentos adicionales. Para algunos analisis de caracterizacion de celulas madre, se recolectaron tBMMSC positivas para SSEA4 utilizando el citometro de flujo FACS Calibur (BD Bioscience) y se expandieron en los cultivos.

Ensayo fibroblastico de unidad de formacion de colonias (CFU-F). Se sembro un millon de celulas de ANC de medula osea en un matraz de cultivo de celulas T25 (Nunc). Despues de 16 dfas, los cultivos se lavaron con PBS y se tineron con solucion de azul de toluidina al 1% en paraformaldehfdo al 2% (PFA). El grupo de celulas que tiene mas de 50 celulas se conto como una colonia bajo microscopfa. El numero de colonias se conto en cinco muestras independientes por cada grupo experimental.

Ensayo de proliferacion celular. La proliferacion de BMMSC y tBMMSC se realizo mediante el ensayo de incorporacion de bromodeoxiuridina (BrdU). Cada poblacion celular (1 x 10 4 celulas / pocillo) se sembro en portaobjetos de camara de 2 pocillos (Nunc) y se cultivo durante 3 dfas. Los cultivos se incubaron con solucion de BrdU (1:100) (Invitrogen) durante 20 horas y se tineron con un kit de tincion de BrdU (Invitrogen). Los numeros de celulas positivos y BrdU se contaron en diez imagenes por sujeto. El ensayo BxdU se repitio en 5 muestras independientes para cada grupo experimental.

Ensayo de duplicacion de la poblacion. En la primera pasada se sembraron 0.5 x 10 6 celulas de BMMSC y pBMMSC en placas de cultivo de 60 mm. Al alcanzar la confluencia, las celulas se pasaron a la misma densidad celular. La duplicacion de la poblacion se calculo en cada pasada segun la ecuacion: log2 (numero de celulas recolectadas / numero de celulas sembradas). Las duplicaciones de la poblacion finita se determinaron mediante la suma acumulativa de los numeros totales generados a partir de cada pasada hasta que las celulas dejaron de dividirse.

Analisis citometrico de flujo de moleculas de superficie de celulas madre mesenquimales. Se incubaron BMMSC o pBMMSC (0.2 x 106) con 1 □g de anticuerpos conjugados con PE o IgG de control de isotipo coincidente (Southern Biotech) a 4 °C durante 45 min. Las muestras se analizaron mediante un citometro de flujo FACS alibur (BD Bioscience). Para el analisis de color dual, las celulas se trataron con anticuerpos conjugados con PE y conjugados con FITC o con IgG de control de isotipo coincidente (cada 1 □g). Las celulas se analizaron en FACS Calibur (BD Bioscience).

Microscopfa inmunofluorescente. Las celulas subcultivadas en portaobjetos de camara de 8 pocillos (Nunc) (2 x 103 / pocillo) se fijaron con PFA al 4%. Las muestras se incubaron con los anticuerpos de raton especfficos o de isotipo coincidente (1: 200) durante la noche a 4 °C, y se trataron con anticuerpos secundarios conjugados con rodamina (1: 300, Jackson ImmunoResearch; Southern Biotechnology). Finalmente, se montaron en un medio de montaje Vectashield que contiene 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories).

Aislamiento de celulas doble positivas CD34 CD73 . Las ANC derivadas de la medula osea se tineron con anticuerpos anti CD34-FITC y anti CD73-PE durante 30 min en hielo en condiciones de oscuridad. Despues del lavado con PBS, las celulas se resuspendieron en el suplemento OPTI-MEM (Invitrogen) con FBS al 2% y antibioticos (100 U / ml de penicilina y 100 pg / ml de estreptomicina) y fueron clasificadas por el clasificador de celulas MOFLO XDP (BECKMAN Coulter). Las celulas dobles positivas clasificadas se sembraron en una placa de 60 mm recubierta con ECM a una densidad de 1 x 106 / placa y se cultivaron para experimentos adicionales.

Ensayo in vivo de formacion osea. Se mezclaron 4.0 x 106 celulas con polvos ceramicos de hidroxiapatita / fosfato tricalcico (HA / TCP) (40 mg, Zimmer Inc.) y se transplantaron por via subcutanea en ratones inmunocomprometidos de 8 semanas de edad. Despues de 8 semanas, los trasplantes se recolectaron, se fijaron en PFA al 4% y a continuacion se descalcificaron con EDTA al 5% (pH 7.4), seguido de la inclusion de parafina. Las secciones de parafina se tineron con hematoxilina y eosina (H&E) y se analizaron con una N1H Image-J. El area de tejido mineralizado recien formado de cinco campos se calculo y se mostro como un porcentaje del area de tejido total. Ensayo de diferenciacion osteogenica in vitro. Las BMMSC y las tBMMSC se cultivaron en condiciones de cultivo osteogenico que contenfa 2 mM de p-glicerofosfato (Sigma), 100 pM de acido 2-fosfato L-ascorbico y 10 nM de dexametasona (Sigma). Despues de la induccion, los cultivos se tineron con alizarina roja o fosfatasa alcalina.

Ensayo de diferenciacion adipogenica in vitro. Para la induccion adipogenica, se anadieron 500 nM de isobutilmetilxantina, 60 pM de indometacina, 500 nM de hidrocortisona, 10 pg / ml de insulina (Sigma), 100 nM de fosfato de acido L-ascorbico al medio de cultivo. Despues de 10 dfas, las celulas cultivadas se tineron con Oil Red-O y las celulas positivas se cuantificaron utilizando una N1H Image-J. El ARN total tambien se aislo de cultivos despues de 10 dfas de induccion para experimentos adicionales.

Analisis de la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). La extraccion del ARN total y la RT-PCR se realizaron de acuerdo con los procedimientos estandar.

Analisis de Transferencia Western. Se utilizaron 20 mg de protefna y se realizaron SDS-PAGE y transferencia Western de acuerdo con los procedimientos estandar. La actina p en la misma membrana sirvio como control de carga.

Tratamiento inhibidor. Las tBMMSC y las BMMSC fueron tratadas con L-NMMA 1 mM (Cayman Chemical) o 1400 W 0.2 mM (Cayman Chemical) para inhibir el NOS o iNOS total, respectivamente. Se utilizaron 50 pg / ml de aspirina (TAT) e inhibidor de la telomerasa III (1 pM; EMD Chemicals) para activar y suprimir la actividad de la telomerasa en BMMSC cultivadas, respectivamente. Se utilizaron CHIRON 99021 (1 o 10 pM; Chiron Corporation) y Dickkopf 1 (DKK1, 10 ng / ml, R&D Systems) como activador e inhibidor para regular los niveles de p catenina en las BMMSC. Medicion de la actividad de la telomerasa. La actividad de la telomerasa se midio utilizando el kit ELISA de PCR para telomerasa TeloTAGGG (Roche).

Medicion de la produccion de oxido nitrico. Las BMMSC (0.2 x 106 / pocillo) se cultivaron en placas de 24 pocillos con o sin citoquinas (IPN^y, 25 ng / ml; IL-1p, 5 ng / ml, R&D Systems) y productos qmmicos (L-NMMA, 1 ml; 1400W, 0.2 mM; aspirina, 50 pg / ml; inhibidor de la telomerasa III, 1 pM; CHIRON 99021, 1 o 10 pM; DKK1, 10 ng / ml) a la concentracion y los dfas indicados. La misma concentracion quimica tambien se utilizo en el tratamiento combinado como DKK y aspirina o inhibidor de la telomerasa y CHIRON99021. El sobrenadante de cada cultivo se recogio y se midio la concentracion de oxido nitrico utilizando el kit de ensayo de parametros de oxido nitrico total y nitrato / nitrito (R & D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo de apoptosis celular y supgrvivencia celular. Se utilizo el sistema Transwell (Corning) para experimentos de co-cultivo. Se sembraron 0.2 x 106 de tBMMSC o BMMSC en cada camara inferior. En las camaras superiores, se cargaron esplenocitos activados (1 x 106 / camara) que habfan sido preestimulados con anticuerpo anti CD3e unido a la placa (5 pg / ml) y anticuerpo anti CD28 soluble (2 pg / ml) durante 3 dfas. Ambas camaras se llenaron con un medio completo que contenfa medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Lonza) con FBS al 10% inactivado por calor, 50 pM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio (Sigma), 1% de amino acido no esencial (Cambrex), L-glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Para medir la viabilidad de los esplenocitos, se uso el kit de recuento de celulas 8 (Dojindo Molecular Technoloies). Para la apoptosis del analisis de esplenocitos, se utilizo el kit de deteccion de apoptosis Anexina V-PE I (BD Bioscience) y se analizo en FACS Calibur (BD Bioscience).

Induccion de Tregs CD4 CD25 Foxp3 In vitro. Se estimulo previamente linfocitos CD4 CD25- T (1 x 106 / pocillo), recogidos por el kit de aislamiento de celulas T reguladoras CD4 CD25 (Miltenyi Biotec) con un anticuerpo anti CD3 unido a la placa (5 pg / ml) y un anticuerpo anti CD28 soluble (2 pg / ml) durante 3 dfas. Estos T linfocitos activados se cargaron en 0.2 x 106 de cultivos de BMMSC o tBMMSC con TFGpl humano recombinante (2 pg / ml) (R&D Systems) e IL2 recombinante de raton (2 pg / ml) (R&D Systems). Despues de 3 dfas, se recogieron las celulas en suspension y se tineron con anticuerpos anti CD4-PerCP, anti CD8a-FITC, anti CD25-APC (cada 1 pg) durante 45 minutos en hielo en condiciones de oscuridad. Y a continuacion las celulas se tineron con el anticuerpo anti Foxp3-PE (1 pg) utilizando el kit de tampon de tincion Foxp3 (eBioscience) para la fijacion y la permeabilizacion celular. Las celulas se analizaron en FACS Calibur (BD Bioscience).

Trasplante alogenico de tBMMSC de raton en ratones MRL / lpr. Bajo anestesia general, se inyectaron BMMSC derivadas de C3H / HeJ o tBMMSC (0.1x 106 celulas / 10 g de peso corporal) en ratones MRL / lpr a traves de la vena de la cola a las 10 semanas de edad (n = 6). En el grupo de control, los ratones MRL / lpr recibieron PBS (n = 5). Todos los ratones se sacrificaron a las 12 semanas de edad para un analisis adicional. La concentracion de protefna en la orina se midio utilizando el ensayo de protefnas Bio-Rad (Bio-Rad,). Coulter LH-750 (BECKMAN Coulter) midio la cantidad de globulos blancos de la sangre periferica.

Medicion de autoanticuerpos, albumina, sRANKL y CTX. Se recogieron muestras de suero de sangre periferica de ratones. Los autoanticuerpos, albumina, sRANKL y CTX se analizaron mediante el metodo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando kits comerciales disponibles (anticuerpos anti-dsDNA, ANA y albumina, diagnostico alfa; sRANKL, R&D Systems; CTX, Nordic Bioscience Diagnostics A / S) de acuerdo con las instrucciones de sus fabricantes. Los resultados fueron promediados en cada grupo. Las diferencias intragrupo se calcularon entre los valores medios.

Tincion de TRAP. Las secciones desparafinadas se volvieron a fijar con una mezcla de 50% de etanol y 50% de acetona durante 10 min. Las soluciones de tincion TRAP se elaboraron recientemente (1.6% de naftol AS-BI fosfato en N, N-dimetilformamida y 0.14% de sal de diazonio LB rojo violeta rapido, 0.097% de acido tartarico y 0.04% de MgCl² en 0.2 M de tampon de acetato de sodio, pH 5.0) y mezclado en 1:10. Las secciones se incubaron en la solucion durante 10 minutos a 37 °C bajo proteccion y se tineron con azul de toluidina. Todos los reactivos para la tincion TRAP se adquirieron en Sigma.

Histometria. El area del hueso trabecular se midio en secciones oseas con tincion con H&E. Para cuantificar la actividad de los osteoclastos en los huesos, se determino el numero de osteoclastos maduros mediante celulas TRAP positivas adheridas a la superficie del hueso. Cada numero de celulas y area se midio a partir de cinco imagenes representativas por cada muestra utilizando una Imagen-J NIH, seguido de un calculo de las medias. Los datos fueron promedios de las medias en cada grupo experimental. Los resultados fueron mostrados como cada porcentaje indicado.

Rescate de ratones irradiados con dosis letales. En cada grupo, se inyectaron 10 x 106 celulas en 50 ml de PBS o PBS solo como control en la vena de la cola de los ratones receptores 1 dfa despues de la irradiacion letal (8,5 Gy por raton). La fecha de supervivencia de cada raton fue registrada y analizada.

Estadfstica. Se utilizo la prueba t de Student para analizar la diferencia estadfstica. Los valores de p inferiores a 0.05 se consideraron significativos.

Ejemplo 1

Un subconjunto de BMMSC no se adhiere a las placas de cultivo de plastico. pero se adhiere a las placas de cultivo recubiertas con ECM.

Para determinar si un subconjunto de BMMSC permanece en suspension de cultivo. sembramos 15 x 106 celulas nucleares de medula osea (ANC) en condiciones de cultivo plastico regulares durante 2 dfas y posteriormente transplantamos todas las celulas no unidas a ratones inmunocomprometidos por via subcutanea utilizando fosfato de hidroxiapatita tricalcico (HA / TCP) como vehfculo. A las 8 semanas posteriores al trasplante. el hueso recien formado se identifico en los trasplantes mediante tincion con H&E (Figura 1A). lo que sugiere que la suspension de cultivo de BMMSC puede contener celulas con una capacidad de diferenciacion en celulas formadoras de hueso in vivo. La evidencia adicional indico que la matriz extracelular (ECM) producida por las BMMSC (BMMSC-ECM) pueden adherir un mayor numero de CFU-F en comparacion con los cultivos de plastico (Figura 10; Chen et al..

2007). Por lo tanto. recogimos el medio de cultivo 2 dfas despues del cultivo de CFU-F primario y cargamos el medio en placas recubiertas con BMMSC-ECM (Figura 1B). Un subconjunto de BMMSC (llamado tBMMSC) en la suspension fue capaz de adherirse al BMMSC-ECM y formar CFU-F (Figura 1B). a una menor incidencia en comparacion con el numero de CFU-F generadas a partir de BMMSC regulares (Figura 1C). Se encontro que las tBMMSC expresaban marcadores asociados a celulas madre mesenquimales (CD73. antfgeno de celulas madre 1 [Sca-1 ]. Octamero 4 [Oct4] y antfgeno especffico de etapa 4 [SSEA4]) como lo demuestra el analisis de citometrfa de flujo (Figura 1D). Cuando se compararon con las BMMSC regulares. las tBMMSC expresaron niveles significativamente mas altos de Sca-1 (87.74% vs. 52.16% en las BMMSC) y Oct4 (40.7% vs. 14.08% en BMMSC). ambas moleculas de superficie progenitora anteriores para celulas madre mesenquimales. A fin de caracterizar las propiedades de las celulas madre de las tBMMSC. se recopilaron las tBMMSC positivas para SSEA4 y se evaluo su tasa de proliferacion mediante el etiquetado de bromodeoxi uridina (BrdU). Encontramos que las tBMMSC tenfan una tasa de captacion de BrdU significativamente elevada en comparacion con las BMMSC regulares (Figura 1E). Ademas. utilizamos un ensayo de cultivo celular continuo para indicar que SSEA4 tBMMSC adquirio un numero significativamente mayor de duplicacion de la poblacion (Figura 1F). Estos datos implican que las tBMMSC son distintas de las BMMSC regulares en terminos de fijacion. proliferacion y auto renovacion.

Para examinar el potencial de diferenciacion multipotente. revelamos que las tBMMSC son analogas a las BMMSC en la expresion de fosfatasa alcalina (ALP). la acumulacion de nodulos mineralizados en los cultivos inductivos osteogenicos y la regeneracion osea cuando se trasplantan en ratones inmunocomprometidos utilizando HA / TCP como vehfculo (Figuras 11 A. 11B). Ademas. demostramos que las tBMMSC eran similares a las BMMSC regulares en la formacion de celulas positivas al Rojo de aceite O en condiciones inductivas adipogenicas. expresion de gamma receptor activado por proliferador de peroxisoma de genes adipogenicos 2 (PPARy2) y lipoprotefna lipasa (LPL) y diferenciacion en condrocitos bajo condiciones inductivas condrogenicas con expresion de proteoglicano. colageno tricromico positivo y colageno tipo II (Figuras 11C. 11D). Estos datos confirman que las tBMMSC son un nuevo subconjunto de BMMSC no adherentes.

Ejemplo 2

Las tBMMSC Expresan Telomerasa y CD34. pero se distinguen de las Celulas madre hematopoyeticas

Con el fin de caracterizar tBMMSC. se utilizo el analisis de citometrfa de flujo para examinar si tBMMSC expresaba marcadores de celulas hematopoyeticas. Encontramos que el 17.4% de las tBMMSC. pero no las BMMSC regulares. expresaban CD34. un HSC y un marcador de celulas endoteliales (Figura 2A). Las b Mm SC (21.25%) y las tBMMSC (31.22%) expresaron CD45. otro marcador hematopoyetico. en la pasada 2 (Figura 2A). Tanto las BMMSC como las tBMMSC fueron negativas a la tincion del anticuerpo CD11b (no se muestran los datos). excluyendo que las tBMMSC se deriven de las celulas del linaje monocito / macrofago. Es importante destacar que tBMMSC CD 34 coexpreso marcadores asociados con BMMSC (CD73 o Oct4). como lo demuestra el analisis de citometrfa de flujo (Figura 2B). El analisis de transferencia Western confirmo que las tBMMSC expresaban CD34. CD73 y CD105 (Figura 2C). y las BMMSC regulares expresaban CD73 y CD 105. pero carecfan de la expresion de CD34 (Figura 2C). Las tBMMSC muestran una expresion continua de CD34 desde el paso 1 al 5. sin embargo. los niveles de expresion aparecen reducidos despues del paso 3 (Figura 2D). Para verificar aun mas la expresion de CD34 en tBMMSC. usamos doble iramunocitotincion para mostrar que las tBMMSC coexpresan CD34 con los marcadores mesenquimales CD73 y CD105 (Figuras 2e . 2F) y las BMMSC regulares son negativas para la tincion de anticuerpos anti-CD34 (Figuras 2E. 2F). De manera mas interesante. encontramos que las tBMMSC posefan niveles significativamente mas altos de actividad de telomerasa en comparacion con las BMMSC regulares mediante el ensayo de PCR-ELISA y el analisis de transferencia Western (Figuras 2G. 2H). lo que implica que las tBMMSC pueden ser una subpoblacion primitiva de las BMMSC.

A continuacion, utilizamos la citometrfa de flujo para clasificar las celulas doble positivas CD34 y CD73 de ANCs de medula osea y recuperamos un 3.77% de celulas positivas doble (Figura 2I). Estas celulas doble positivas CD34 y CD73 muestran caracterfsticas de celulas madre mesenquimales, incluida la formacion de agrupaciones de colonias individuales (Figura 2J) y la diferenciacion en celulas osteogenicas y adipogenicas (no se muestran los datos), lo que indica un enfoque factible para aislar directamente celulas de tipo tBMMSC de medula espinal. Las BMMSC CD34 / CD73 son analogas a las tBMMSC en terminos de tener un mayor nivel de actividad de telomerasa y una alta produccion de NO en comparacion con las BMMSC regulares (Figuras 2K, 2L).

Para excluir la posible contaminacion por HSC en tBMMSC, utilizamos aspirina (TAT) para elevar el nivel de telomerasa en BMMSC CD34- regulares (Figura 7C). Despues del tratamiento con aspirina, las BMMSC muestran unos niveles mas altos de expresion de Sca-1 y Oct4 en comparacion con las BMMSC, pero a un nivel mas bajo que las tBMMSC (Figura 3A, 3B). Es importante destacar que las BMMSC CD 34 - tratadas con aspirina (TAT) adquieren una expresion de CD34 positiva (Figura 3A). El analisis de transferencia Western confirmo que las BMMSC tratadas con aspirina (TAT) expresan CD34, pero a un nivel mas bajo que las tBMMSC (Figura 3C). Estos datos sugieren que la expresion de CD34 en BMMSC no se debe a la contaminacion por HSC.

En general, se cree que la expresion de CD34 esta asociada con HSC y poblaciones endoteliales. Las HSC pueden diferenciarse en el linaje de celulas hematopoyeticas y rescatar a los sujetos irradiados con dosis letales. Por lo tanto, utilizamos un medio de diferenciacion hematopoyetica para tratar tBMMSC, BMMSC tratadas con aspirina (TAT) y BMMSC regulares y encontramos que todas estas celulas no logran diferenciarse en el linaje de celulas hematopoyeticas tal como se aprecia en celulas de medula osea y celulas de linaje que sirven como controles positivos capaces de formar grupos de colonias (Figura 4A). A continuacion, infundimos tBMMSC sistemicamente para rescatar a ratones irradiados con dosis letales y encontramos que las tBMMSC, pero no las BMMSC regulares, pueden extender la vida util de los ratones irradiados con dosis letales (Figura 4B). Sin embargo, las tBMMSC no pudieron rescatar ratones irradiados con dosis letales, tal como se muestra en el grupo de medula osea (Figura 4B). Estas evidencias experimentales tambien indican que la expresion de CD34 en tBMMSC no se debe a la contaminacion por HSC.

Ejemplo 3

Las tBMMSC poseen funciones inmunomoduladoras superiores a traves de una alta produccion de oxido nitrico (NO).

Recientemente, las propiedades inmunomoduladoras se identificaron como una importante caracterfstica de las celulas madre de las BMMSC, lo que llevo a utilizar BMMSC infundidas sistemicas para tratar una variedad de enfermedades inmunitarias (Nauta et al., 2007; Uccelli et al., 2007, 2008). Aquf encontramos que las tBMMSC mostraron una capacidad significativamente mayor para la produccion de NO en comparacion con las BMMSC regulares cuando se trataron con interferon gamma (iFNy) e interleucina 1 beta (IL-1p) (Figura 5A). Se sabe que el NO desempena un papel crftico en la inmunosupresion mediada por BMMSC (Ren et al., 2008), por lo tanto, evaluamos el papel funcional de la alta produccion de NO en las propiedades inmunomoduladoras asociadas a tBMMSC. Las celulas del bazo (SP) se activaron con la estimulacion de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 dfas y a continuacion se cultivaron conjuntamente con tBMMSC o BMMSC regulares en presencia del inhibidor general de oxido nitrico sintasa (NOS), NG-monometil-L -arginina (L-NMMA), o el inhibidor de NOS inducible (iNOS), 1400W, utilizando un sistema de cultivo Transwell. Se verifico la eficacia de L-NMMA y 1400W para inhibir la produccion de NO en BMMSC (Figura 12). Aunque tanto las tBMMSC como las BMMSC regulares fueron capaces de inhibir la viabilidad celular de las celulas SP activadas, las tBMMSC mostraron una inhibicion marcada de la viabilidad de las celulas SP sobre la de las BMMSC regulares (Figura 5B). Curiosamente, tanto L-NMMA como 1400W fueron capaces de bloquear significativamente la viabilidad celular inducida por las tBMMSC, pero no por las BMMSC regulares, de las celulas SP activadas (Figuras 5C, 5D).

Ademas, el analisis de citometrfa de flujo indico que tanto las tBMMSC como las BMMSC regulares inducen la apoptosis de las celulas SP activadas en el sistema de cultivo Transwell, incluidas las celulas apoptoticas tempranas (Figura 5E) y las celulas apoptoticas tardias y muertas (Figura 5H). Sin embargo, las tBMMSC muestran una capacidad elevada para inducir la apoptosis de celulas SP activadas en comparacion con las BMMSC regulares (Figuras 5E, 5H). Cuando se agregaron L-NMMA y 1400W a los cultivos, el numero de celulas SP apoptoticas tempranas y tardias se redujo significativamente tanto en tBMMSC como en los grupos de BMMSC regulares (Figuras 5F, 5G, 51, 5J). El tratamiento con 1400W dio como resultado una inhibicion significativamente mayor de las celulas SP apoptoticas tempranas en el grupo tBMMSC en comparacion con el grupo BMMSC regular (Figura 5G). Estos datos sugieren que se requiere produccion de NO para la inmunomodulacion mediada por BMMSC. A continuacion, co-cultivamos celulas T nativas con tBMMSC o BMMSC regulares en presencia de IL-2 y factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-pl). Encontramos que las tBMMSC mostraron una regulacion al alza significativa de los niveles de celulas T reguladoras (Tregs) de CD4 CD25 Fox25 en comparacion con las BMMSC regulares (Figura 5K). Tanto L-NMMA como 1400W fueron capaces de inhibir la regulacion positiva inducida por BMMSC y tBMMSC de las Treg, tal como se muestra en el analisis de citometrfa de flujo (Figuras 5L, 5M). El efecto regulador sobre las Treg fue mas significativo en el grupo tBMMSC en comparacion con el grupo BMMSC (Figuras 5L, 5M). Estos datos verificaron ademas el papel del No en el efecto inmunomodulador inducido por tBMMSC.

Ejemplo 4

El trasplante de tBMMSC mejora la funcion de multiples organos en ratones MKL / lpr.

Para examinar las propiedades inmunomoduladoras in vivo de las tBMMSC, se infundieron tBMMSC y BMMSC alogenicas en ratones MRL / lpr a las 10 semanas de edad y se analizo la respuesta al tratamiento a las 12 semanas de edad (Figura 6A). Descubrimos que tanto las tBMMSC como las BMMSC eran capaces de mejorar el trastorno de la membrana basal glomerular inducida por SLE (Figura 6B) y reducir el nivel de protefna en la orina (Figura 6C). Parece que las tBMMSC fueron superiores en comparacion con las BMMSC en terminos de reducir los niveles generales de protefnas en la orina (Figuras 6C). Tal como era de esperar, los ratones MRL / lpr mostraron un aumento notable en los niveles de autoanticuerpos, incluidos los anticuerpos IgG e IgM anti-ADN de doble hebra (dsDNA) (Figuras 6D, 6E) y anticuerpos anti-nucleares (ANA; Figuras 6F) en la sangre periferica. Aunque la infusion de tBMMSC y BMMSC mostro niveles reducidos significativos de dsDNA IgG, anticuerpos IgM y ANA en sangre periferica (Figuras 6D-F), las tBMMSC mostraron un efecto terapeutico superior para reducir los niveles de anticuerpos y ANA de dsDNA IgG cuando se comparo con el grupo de BMMSC (Figuras 6D, 6F). Ademas, la disminucion de los niveles de albumina serica en ratones MRL / lpr se recupero mediante la infusion de tBMMSC y BMMSC (Figura 6G), pero el tratamiento con tBMMSC produce una recuperacion mas significativa que el tratamiento con BM^mS^c (Figura 6G).

A continuacion, utilizamos el analisis de citometrfa de flujo para revelar que las tBMMSC muestran una mayor efectividad en la recuperacion del nivel disminuido de CD4 CD25 Foxp3 Tregs y mayor numero de CD4 ILl7 IFNy- linfocitos T en sangre periferica en comparacion con las BMMSC (Figura 6H, 6I). Ademas, demostramos que las tBMMSC son superiores a las BMMSC en terminos de reducir el numero aumentado de osteoclastos positivos a la fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) en la epffisis distal del femur de ratones MRL / lpr (Figura 13A), unos niveles sericos elevados del ligando NF-kB (sRANKL) soluble, un factor crftico para la osteoclastogenesis (Figura 13B) y los marcadores de resorcion osea de los telopeptidos C-terminales del colageno tipo I (CTX, Figura 13C). Estos datos sugieren que las tBMMSC muestran un efecto terapeutico superior para los trastornos del SLE en comparacion con las BMMSC.

Ejemplo 5

La produccion de NO en BMMSC es Modulada por la Actividad de la Telomerasa Junto con la Senalizacion de Wnt / B-catenina

Dado que se observo una actividad de telomerasa elevada en la produccion de NO en las tBMMSC, es importante aclarar si la actividad de la telomerasa rige la produccion de NO en las tBMMSC. Encontramos que el inhibidor de la telomerasa III es eficaz para inhibir la actividad de la telomerasa y para reducir la produccion de NO en tBMMSC (Figuras 7A, 7B). Tambien se encontraron efectos similares del inhibidor de la telomerasa en las BMMSC regulares (Figura 7C, 7E). En contraste, el tratamiento con aspirina (TAT) conduce a una actividad significativamente elevada de la telomerasa, a la expresion de telomerasa transcriptasa inversa (TERT) y a la produccion de NO en BMMSC (Figura 7C-E). Estos datos implican que la actividad de la telomerasa puede estar asociada con la produccion de NO en las BMMSC.

Recientemente, se ha informado que la telomerasa modula directamente la senalizacion de Wnt / beta-catenina sirviendo como un cofactor en un complejo transcripcional de beta-catenina (Park et al, 2009). Por lo tanto, se evaluo si la produccion de NO asociada a la actividad de la telomerasa en las BMMSC podrfa estar regulada a la baja por el inhibidor de Wnt, Dickkopf 1 (DKK1). De manera interesante, encontramos que DKK1 fue capaz de bloquear significativamente la produccion de NO inducida por la aspirina en las BMMSC cuando se agrego a los cultivos antes del tratamiento con aspirina (TAT) (Figura 7F). La eficacia de DKK1 en la reduccion del nivel de p-catenina activada se confirmo mediante analisis de transferencia Western (Figura 7G). Ademas, encontramos que la aspirina (TAT) fue capaz de bloquear parcialmente la regulacion por disminucion inducida por DKK1 de la beta-catenina activada (Figura 7G). Para examinar el mecanismo por el cual DKK1 inhibe la produccion de NO inducida por aspirina (TAT), demostramos que DKK1 es capaz de bloquear la actividad de la telomerasa inducida por aspirina (TAT) (Figura 7H). Estos datos indican que la produccion de NO impulsada por la telomerasa esta acoplada con la senalizacion Wnt / pcatenina.

A continuacion, determinamos si la senalizacion de Wnt / beta-catenina afecto la produccion de NO en las BMMSC. Utilizamos Chiron 99021 (Chiron) para tratar BMMSC durante 7 dfas y mostramos una elevacion de la beta-catenina activa de una manera dependiente de la dosis (Figura 7I), lo que confirma la eficacia de Chiron como activador de Wnt / beta-catenina. A continuacion, mostramos que el tratamiento con Chiron regulaba al alza la produccion de NO en BMMSC de una manera dependiente de la dosis (Figura 7J), junto con una actividad de telomerasa elevada en BMMSC (Figura 7K). Ademas, mostramos que la actividad de la telomerasa inducida por Chiron y la produccion de NO se podfan bloquear durante 3 dfas de tratamiento previo con inhibidor de la telomerasa III (Figuras 7K, 7L). Estos hallazgos sugieren que la telomerasa y la Wnt / beta-catenina colaboran para mejorar la actividad de la telomerasa e inducen la produccion de NO en las BMMSC.

Ejemplo 6

El tratamiento con aspirina genera BMMSC activadas por inmunomodulacion

Para determinar si la telomerasa afecta las propiedades inmunomoduladoras de las BMMSC regulares, demostramos que la aspirina (TAT) es capaz de promover la reduccion inducida por BMMSC de la viabilidad de las celulas SP activadas y la elevacion de la apoptosis temprana y tardfa de las celulas SP activadas (Figuras 14A-14C) . Estos datos sugieren un potencial de inducir la actividad de la telomerasa en BMMSC regulares para mejorar sus funciones inmunomoduladoras, tal como se aprecia en las tBMMSC.

Con el fin de confirmar el efecto terapeutico de las BMMSC tratadas con aspirina (TAT) (TAT-BMMSC), infundimos 0.1 x 106 o 0.01 x 106 TAT-BMMSC en ratones MRL / lpr a las 10 semanas de edad y se analizo la respuesta al tratamiento a las 12 semanas de edad. Encontramos que tanto las TAT-BMMSC como las BMMSC tratadas con aspirina fueron capaces de reducir el nivel de protema en la orina en comparacion con los ratones MRL / lpr (Figura 8A). Las TAT-BMMSC fueron mas eficaces para reducir los niveles generales de protema en la orina en los grupos 0.1 x 106 y 0.01 x 106 en comparacion con BMMSC. Parece que la infusion de 0.01 x 106 BMMSC no logra reducir significativamente los niveles de protema en la orina (Figuras 8A). Aunque la infusion de TAT-BMMSC y BMMSC mostro niveles reducidos significativos de anticuerpos dsDNA IgG, IgM y ANA en sangre periferica (Figuras 8B-D), las TAT-BMMSC mostraron un efecto terapeutico superior para reducir los anticuerpos dsDNA IgG e IgM y los niveles de ANA en comparacion con el grupo de BMMSC en los grupos de 0.1 x 106 y 0.01 x 106 (Figuras 8B-D). Ademas, ELISA y el analisis de citometna de flujo revelaron que TAT-BMMSC muestra una mayor eficacia en la reduccion de los niveles sericos de IL17 en el grupo de 0.01 x 106 (Figura 8E) y el numero de CD4 IL17 linfocitos T IFNy tanto en 0.1 x 106 como en 0.01 x 106 (Figura 8F) y elevando el nivel de CD4 CD25 Foxp3 Tregs en el grupo 0.01 x 106 en comparacion con BMMSC (Figura 8G). Estos datos indican que el numero de BMMSC en la inmunoterapia podna reducirse significativamente con el tratamiento con activador de telomerasa ex vivo.

Ejemplo 7

La medula osea humana contiene tBMMSC y el tratamiento con aspirina puede inducir que las BMMSC humanas normales se conviertan en tBMMSC con una mejor funcion inmunomoduladora. Cuando se agrego aspirina al medio de cultivo a 2.5 pg / ml o 50 pg / ml durante 1 semana, existe un nivel significativamente mayor de actividad de la telomerasa en las BMMSC.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas en que las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas

son celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas CD34 , y en que las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas CD34 no forman CFU-F (fibroblastos de unidades de formacion de colonias) en cultivos de plastico, pero se adhieren a la matriz extracelular producida por celulas madre mesenquimales.

2. Las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas CD34 de acuerdo con la reivindicacion 1, en que las celulas madre son CD73 .

3. Las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas CD34 de acuerdo con la reivindicacion 1, en que dichas celulas madre son CD105 .

4. Las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas CD34 de acuerdo con la reivindicacion 1, en que dichas celulas madre son capaces de diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos.

5. Las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas CD34 de acuerdo con la reivindicacion 1, en que dichas celulas madre mesenquimales de medula osea tienen una alta actividad de telomerasa y se derivan de celulas no adherentes en cultivo de plastico.

6. Las celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas CD34 de acuerdo con la reivindicacion 5, en que las celulas madre mesenquimales de medula osea son SSEA4 .

7. Un metodo para aislar celulas madre mesenquimales de medula osea con alto contenido de telomerasa que comprende:

cultivar una muestra de medula osea derivada de todas las celulas nucleares en un sustrato de plastico;

eliminar las celulas que no se adhieren al sustrato; cultivar cualquier celula en el medio en una matriz celular extracelular producida por celulas madre mesenquimales (ECM);

recolectar colonias que forman celulas unidas en la matriz celular extracelular producida por celulas madre mesenquimales (ECM).

8. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas que tienen una alta actividad de telomerasa para su utilizacion en un metodo para modular el sistema inmunitario de un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva de dichas celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas.

9. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas para su utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 8, en que dichas celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas son CD34 y preparadas por medio del tratamiento de celulas madre mesenquimales de medula osea humana con una cantidad efectiva de agente inductor de telomerasa.

10. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas para su utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 9, en que dicho agente inductor de telomerasa es aspirina o un compuesto con una estructura qufmica similar a la aspirina.

11. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas para su utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 10, en que dicho agente inductor de telomerasa es aspirina.

12. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas para su utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 11, en que la cantidad efectiva de aspirina se encuentra en el intervalo de 2 microgramos / mililitro a 50 microgramos / mililitro durante una semana.

13. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas para su utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 8, en que el paciente tiene un desorden inmunitario.

14. Celulas madre mesenquimales de medula osea humana aisladas para su utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 8, en que el paciente tiene lupus eritematoso sistemico.