ES2712736T3 - Anticuerpos anti-Axl y sus usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:2 en la región H-CDR1, la SEQ ID NO:3 en la región H-CDR2 y la SEQ ID NO:4 en la región H-CDR3; y una región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:6 en la región L-CDR1, la SEQ ID NO:7 en la región L-CDR2 y la SEQ ID NO:8 en la región L-CDR3, en donde dicho anticuerpo se une al dominio extracelular de Axl en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:9, en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:10 y en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:11.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos anti-AxI y sus usos

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a anticuerpos anti-AxI y sus usos en metodos diagnosticos y terapeuticos.

Antecedentes de la invencion

Axl pertenece a la subfamilia TAM de receptor de tirosina quinasas (RTK) que tambien incluyen Tyro3 y Mer. Los receptores TAM se caracterizan por una combinacion de dos dominios tipo inmunoglobulina y repeticiones dobles de fibronectina tipo III en la region extracelular y un dominio de quinasa citoplasmatico. Los ligandos para los receptores TAM son Gas6 (gen 6 espedfico de la detencion del crecimiento) y la protema S, dos protemas dependientes de la vitamina K que muestran 43 % de identidad de secuencia de aminoacidos y comparten estructuras de dominio similares. Cada protema tiene un dominio Gla N-terminal que contiene 11 restos de acido g-carboxiglutamico, seguido de cuatro modulos tipo factor de crecimiento epidermico (EGF), y una estructura tipo globulina fijadora de la hormona sexual (SHBG) C-terminal que consiste en dos dominios G de laminina tandem. El dominio SHBG es tanto necesario como suficiente para la union y activacion del receptor TAM, mientras que el dominio Gla une los fosfolfpidos de la membrana negativamente cargados y juega un importante papel en la fagocitosis mediada por TAM de las celulas apoptoticas. La activacion y la senalizacion de TAM ha estado implicada en las respuestas celulares multiples incluyendo la supervivencia, proliferacion, migracion y adhesion celular.

La desregulacion de Axl o su ligando Gas6 estan implicada en la patogenesis de una diversidad de canceres humanos. Se ha publicado que la sobreexpresion de Axl en una amplia serie de canceres humanos (de pulmon, prostata, mama, gastrico, pancreatico, de ovario, tiroides, canceres sangumeos, carcinoma celular renal asf como glioblastoma...) y esta asociada con la invasividad, metastasis y prognosis negativa. Estos descubrimientos sugieren que Axl puede estar implicada en la regulacion de multiples aspectos de la tumorigenesis incluyendo el crecimiento, invasion y angiogenesis tumoral y, por tanto, representa un objetivo para la intervencion terapeutica en cancer especialmente para el desarrollo de terapia anti-cancer metastatico y para otro tratamiento de cancer multiple incluyendo el tratamiento de la resistencia a farmaco.

Por consiguiente, se han descrito anticuerpos monoclonales anti-Axl para su uso en el tratamiento de canceres. Por ejemplo, las publicaciones en relacion con los anticuerpos anti-Axl incluyen los documentos WO2009/063965, WO2009/062690 y WO2011/014457.

Otros papeles de Axl dependientes o no de sus ligandos tales como la inhibicion de las funciones inmunes, la activacion de la agregacion de plaquetas y las inductoras de la infeccion vmca (como ejemplo, la absorcion del virus del Ebola y Lassa es fomentada por Axl) destacan el potencial de Axl como objeto terapeutico para otras aplicaciones distintas de la oncologfa.

Compendio de la invencion

La presente invencion esta definida en las reivindicaciones. La presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl, comprendiendo una region variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:2 en la region H-CDR1, la SEQ ID NO:3 en la region H-CDR2 y la SEQ ID NO:4 en la region H-CDR3; y una region variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:6 en la region L-CDR1, la SEQ ID NO:7 en la region L-CDR2 y la SEQ ID NO:8 en la region L-CDR3. Dicho anticuerpo monoclonal se une al dominio extracelular de Axl por las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones:

El termino “Axl” tiene su significado general en la tecnica y se refiere a la Axl humana. Axl tambien es conocida como “Ark”, “Tyro-7”, “ufo” o “jtk11”.

El termino “anticuerpo anti-Axl” se refiere a un anticuerpo dirigido a Axl.

Segun la presente invencion, “anticuerpo” o “inmunoglobulina” tiene el mismo significado, y se usara igualmente en la presente invencion. El termino “anticuerpo” como se usa en el presente documento se refiere a moleculas de inmunoglobulina y partes inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union a antfgeno que se une inmunoespedficamente a un antfgeno. Por definicion, el termino anticuerpo abarca no solamente las moleculas de anticuerpo completas, sino tambien fragmentos del anticuerpo asf como variantes (incluyendo derivados) de los anticuerpos y los fragmentos del anticuerpo. En anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas estan ligadas una con otra por enlaces disulfuros y cada cadena pesada esta ligada a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera, lambda (1) y kappa (k). Hay cinco clases de cadena pesada principales (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molecula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA y IgE. Cada cadena contiene distintos dominios de secuencia. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, colectivamente referidos como CH). Las regiones variables de tanto las cadenas ligeras (VL) como las pesadas (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de union al antfgeno. Los dominios de la region constante de las cadenas ligeras (CL) y pesadas (CH) confieren propiedades biologicas importantes tales como la asociacion de cadena de anticuerpo, secrecion, movilidad transplacental, union complemento, y union a receptores Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las partes variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinacion al anticuerpo y el determinante antigenico. Los sitios de combinacion con el anticuerpo estan compuestos de restos que principalmente son de regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR). Ocasionalmente, los restos de las regiones no hipervariables o estructurales (FR) influyen en la estructura de dominio completa y, por lo tanto, en el sitio de combinacion. Las regiones determinantes de la complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoacidos que definen juntas la afinidad y especificidad de union de la region Fv natural de un sitio de union de inmunoglobulina nativo. Las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, denominadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Un sitio de union a antfgeno, por lo tanto, incluye seis CDR, comprendiendo el conjunto de CDR de cada una de la region V de una cadena pesada y una ligera. Las regiones estructurales (FR) se refieren a secuencias de aminoacidos interpuestas entre las CDR.

El termino “anticuerpo quimerico” se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio VH y un domino VL de un anticuerpo derivado del anticuerpo 20G7-D9, y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano.

Segun la invencion, el termino “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que tiene la region estructural variable y regiones constantes de un anticuerpo humano pero retiene las CDR del anticuerpo 20G7-D9.

El termino “Fab” indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de union a antfgeno, en el que aproximadamente una mitad del extremo N-terminal de la cadena H y la cadena L entera, entre los fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, papama, se unen juntas a traves de un enlace disulfuro.

El termino “F(ab')2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de union a antfgeno, el cual es ligeramente mayor que el Fab unido por un enlace disulfuro de la region bisagra, entre los fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, pepsina.

El termino “Fab” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de union a antfgeno, el cual se obtiene cortando un enlace disulfuro de la region bisagra del F(ab')2.

Un polipeptido Fv de cadena sencilla (“scFv”) es un heterodfmero VH::VL covalentemente ligado que normalmente se expresa a partir de una fusion genica que incluye genes codificantes de VH y VL ligados por un codificante peptido conector. “dsFv” es un heterodfmero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes se pueden formar cualquiera de los dos espontaneamente por asociacion de scFv monovalentes, o se pueden generar acoplando scFv monovalentes por un peptido conector, tal como sc(Fv)2 divalente.

El termino “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequenos con dos sitios de union a antfgeno, tales fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipeptido (VH-VL). Usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios estan forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antfgeno.

Por “purificado” y “aislado” se quiere decir, cuando se refiere a un anticuerpo segun la invencion o a una secuencia de nucleotidos, que la molecula indicada esta presente en ausencia sustancial de otras macromoleculas biologicas del mismo tipo. El termino “purificado” como se usa en el presente documento preferiblemente quiere decir que esta presente al menos el 75 % en peso, mas preferiblemente al menos 85 % en peso, mas preferiblemente aun al menos 95 % en peso, y lo mas preferiblemente al menos 98 % en peso, de las macromoleculas biologicas del mismo tipo. Una molecula de acido nucleico “aislada” que codifica un polipeptido particular se refiere a una molecula de acido nucleico que esta basicamente libre de otras moleculas de acido nucleico que no codifican el polipeptido; sin embargo, la molecula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan de manera perjudicial a las caractensticas basicas de la composicion.

Anticuerpos de la invencion:

La presente invencion proporciona anticuerpos anti-Axl aislados o sus fragmentos. En particular, los inventores han planteado un anticuerpo anti-AxI murino (20G7-D9) que produce hibridoma. Los inventores han clonado y caracterizado el dominio variable de las cadenas ligeras y pesadas de dicho mAb 20G7-D9 y, por tanto, han determinado el dominio de las regiones determinates de la complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo como se describe en la Tabla 1:

Por lo tanto, la invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl, que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:2 para H-CDR1, la SEQ ID NO:3 para H-CDR2 y la SEQ ID NO:4 para H-CDR3.

La invencion tambien se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl, que comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:6 para L-CDR1, la SEQ ID NO:7 para L-CDR2 y la SEQ ID NO:8 para L-CDR3. El anticuerpo monoclonal de la invencion, puede comprender una cadena pesada en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:2 para H-CDR1, la SEQ ID NO:3 para H-CDR2 y la SEQ ID NO:4 para H-CDR3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:6 para L-CDR1, la SEQ ID NO:7 para L-CDR2 y la SEQ ID NO:8 para L-CDR3.

En particular, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal anti-Axl que comprende:

- una region variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:2 en la region H-CDR1, la SEQ ID NO:3 en la region H-CDR2 y la SEQ ID NO:4 en la region H-CDR3; y

- una region variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:6 en la region L-CDR1, la SEQ ID NO:7 en la region L-CDR2 y la SEQ ID NO:8 en la region L-CDR3.

En una realizacion particular, la region variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene el conjunto de secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:1 y/o la region variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:5.

En otra realizacion, el anticuerpo monoclonal de la invencion es un anticuerpo quimerico, preferiblemente un anticuerpo de raton/humano quimerico. En particular, dicho anticuerpo quimerico de raton/humano puede comprender los dominios variables del anticuerpo 20G7-D9 como se definieron anteriormente.

En otra realizacion, el monoclonal de la invencion es un anticuerpo humanizado. En particular, en dicho anticuerpo humanizado, el dominio variable comprende regiones estructurales aceptadoras humanas, y opcionalmente el dominio constante humano donde esta presente, y CDR donantes no humanas, tales como CDR de raton como se definieron anteriormente.

La invencion proporciona ademas fragmentos anti-Axl dirigidos a Axl de dichos anticuerpos que incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

La invencion proporciona ademas anticuerpo o fragmented de anti-AxI que se unen a las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 en la parte extracelular de Axl.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.

Metodos de produccion de los anticuerpos de la invencion:

Los anticuerpos Anti-Axl de la invencion se pueden producir por cualquier tecnica conocida en la tecnica, tal como, sin limitacion, cualquier tecnica qmmica, biologica, genetica o enzimatica, o bien sola o en combinacion.

Conociendo la secuencia de aminoacidos de la secuencia deseada, un experto en la tecnica facilmente puede producir dichos anticuerpos, por tecnicas estandar para la produccion de los polipeptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar usando el metodo bien conocido de la fase solida, preferiblemente usando un aparato de smtesis peptfdica comercialmente disponible (tal como el producido por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos de la invencion se pueden sintetizar mediante tecnicas de ADN recombinante bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden obtener como productos de expresion de ADN despues de la incorporacion de secuencias de ADN que codifican los anticuerpos en los vectores de expresion y la introduccion de tales vectores en hospedadores eucariotas y procariotas adecuados que expresaran los anticuerpos deseados, a partir de los cuales se pueden aislar mas tarde usando tecnicas bien conocidas.

Por consiguiente, un objetivo adicional de la invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que codifican un anticuerpo de acuerdo con la invencion. Mas particularmente, la secuencia de acidos nucleicos codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo de la invencion.

Generalmente, dicho acido nucleico es una molecula de ADN o ARN, la cual se puede incluir en cualquier vector adecuado, tal como un plasmido, cosmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector vmco.

Los terminos “vector”, “vector de clonacion” y “vector de expresion” quieren decir el vehteulo por el que se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen foraneo) en una celula hospedadora, para transformar el hospedador y fomentar la expresion (por ejemplo, transcripcion y traduccion) de la secuencia introducida.

Asf, un objetivo adicional de la invencion se refiere a un vector que comprende un acido nucleico de la invencion. Tales vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para provocar o dirigir la expresion de dicho anticuerpo tras la administracion a un sujeto. Ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresion para la celula animal incluyen promotor y potenciador temprano de SV40 (Mizukami T. y col. 1987), promotor LTR y potenciador del virus de la leucemia de raton de Moloney (Kuwana Y y col. 1987), promotor (Mason JO y col, 1985) y potenciador (Gillies SD y col. 1983) de la cadena H de la inmunoglobulina y similares.

Se puede usar cualquier vector de expresion para la celula animal, siempre que se pueda insertar y expresar un gen que codifica la region C del anticuerpo humano. Ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji H y col.

1990), pAGE103 (Mizukami T y col. 1987), pHSG274 (Brady G y col. 1984), pKCR (O'Hare K y col. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H y col. 1990) y similares.

Otros ejemplos de plasmidos incluyen los plasmidos replicantes que comprenden un origen de replicacion, o plasmidos integrativos, tales como por ejemplo pUC, pcADN, pBR y similares.

Otros ejemplos de vector vmco incluyen vectores adenovmcos, retrovmcos, del virus del herpes y vectores de AAV. Tales virus recombinantes se pueden producir por tecnicas conocidas en la tecnica, tales como por transfeccion de celulas de empaquetamiento o por transfeccion transitoria con plasmidos o virus auxiliares. Ejemplos tfpicos de celulas de empaquetamiento de virus incluyen celulas PA317, celulas PsiCRIP, celulas GPenv+, celulas 293, etc. Se pueden encontrar protocolos detallados para la produccion de tales virus recombinantes deficientes en replicacion, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5.882.877, US 6.013.516, US 4.861.719, US 5.278.056 y WO 94/19478.

Un objetivo adicional de la presente invencion se refiere a una celula hospedadora que se ha sometido a transfeccion, infectado o transformado por un acido nucleico y/o un vector segun la invencion.

El termino “transformacion” quiere decir la introduccion de un gen “foraneo” (es decir, extrmseco o extracelular), secuencia de ADN o ARN a una celula hospedadora, de manera que la celula hospedadora expresara el gen o secuencia introducida para producir una sustancia deseada, generalmente una protema o enzima codificada por el gen o la secuencia introducida. Una celula hospedadora que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha “transformado”.

Los acidos nucleicos de la invencion se pueden usar para producir un anticuerpo de la invencion en un sistema de expresion adecuado. El termino “sistema de expresion” quiere decir una celula hospedadora y vector compatible bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresion de una protema codificada por ADN foraneo portado por el vector e introducido a la celula hospedadora.

Los sistemas de expresion comunes incluyen celulas hospedadoras de E. coli y vectores plasmidos, celulas hospedadoras de insecto y vectores de Baculovirus, y celulas hospedadoras y vectores de mamffero. Otros ejemplos de celulas hospedadoras incluyen, sin limitacion, celula procariotas (tales como bacterias) y celulas eucariotas (tales como celulas de levadura, celulas mamfferas, celulas de insecto, celulas vegetales, etc.). Ejemplos espedficos incluyen E. coli, Levaduras de Kluyveromyces o Saccharomyces, lmeas celulares mamfferas (por ejemplo, celulas Vero, celulas CHO, celulas 3T3, celulas COS, etc.) asf como cultivos celulares mamfferos primarios o establecidos (por ejemplo, producidos de linfoblastos, fibroblastos, celulas embrionarias, celulas epiteliales, celulas nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos tambien incluyen la celula SP2/0-Ag14 de raton (ATCC CRL1581), celula P3X63-Ag8.653 de raton (ATC^c CRL1580), celula CHO en la que un gen de deshidrofolato reductasa (mas adelante referido como “gen de DHFR”) es defectuoso (Urlaub G y col.; 1980), celula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662, mas adelante referida como “celula YB2/0"), y similares.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo de produccion de una celula hospedadora recombinante que expresa un anticuerpo segun la invencion, comprendiendo dicho metodo las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un acido nucleico recombinante o un vector como se ha descrito anteriormente en una celula hospedadora competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la celula hospedadora recombinante obtenida y (iii), opcionalmente, seleccionar las celulas que expresan y/o secretan dicho anticuerpo. Tales celulas hospedadoras recombinantes se pueden usar para la produccion de anticuerpos de la invencion.

En otra realizacion particular, el metodo comprende las etapas de:

(i) cultivar el hibridoma 20G7-D9 bajo condiciones adecuadas para permitir la expresion del anticuerpo 20G7-D9; y

(ii) recuperar el anticuerpo expresado.

Los anticuerpos de la invencion se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencional tales como, por ejemplo, protema A-Sefarosa, cromatograffa por hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, o cromatograffa de afinidad.

En una realizacion particular, el anticuerpo quimerico humano de la presente invencion se puede producir obteniendo secuencias nucleicas que codifican los dominios VL y VH como se ha descrito previamente, construyendo un vector de expresion de anticuerpo quimerico humano insertandolas en un vector de expresion para la celula animal que tiene genes que codifican Ch del anticuerpo humano y CL del anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresion en una celula animal.

Como dominio de CH de un anticuerpo quimerico humano, puede ser cualquier region que pertenece a la inmunoglobulina humana, pero aquellos de clase IgG son adecuados y tambien se puede usar uno cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Tambien, como CL de un anticuerpo quimerico humano, puede ser cualquier region que pertenezca a Ig, y se pueden usar aquellas de la clase kappa o la clase lambda.

Los metodos para la produccion de anticuerpos quimericos implican ADN recombinante convencional y las tecnicas de transfeccion genica son bien conocidas en la tecnica (Vease Morrison SL y col. (1984) y los documentos de patente US5.202.238; y US5.204.244).

El anticuerpo humanizado de la presente invencion se puede producir obteniendo secuencias de acidos nucleicos que codifican los dominios de CDR, como se ha descrito previamente, construyendo un vector de expresion de anticuerpo humanizado insertandolas en un vector de expresion para la celula animal que tiene genes que codifican (i) una region constante de la cadena pesada identica a la de un anticuerpo humano y (ii) una region constante de la cadena ligera identica a la de un anticuerpo humano, y expresando los genes introduciendo el vector de expresion en una celula animal.

El vector de expresion del anticuerpo humanizado puede ser o bien de un tipo en el que un gen que codifica una cadena pesada del anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera del anticuerpo existe en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tandem). Respecto a la facilidad de construccion de un vector de expresion de anticuerpo humanizado, la facilidad de introduccion en las celulas animales, y el equilibrio entre los niveles de expresion de las cadenas H y L del anticuerpo en las celulas animales, se prefiere el vector de expresion del anticuerpo humanizado del tipo tandem (Shitara K y col., 1994). Ejemplos del vector de expresion del anticuerpo humanizado tipo tandem incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 y similares.

Los metodos para la produccion de anticuerpos humanizados basados en el ADN recombinante convencional y las tecnicas de transfeccion genica son bien conocidos en la tecnica (Vease, por ejemplo, Riechmann L. y col. 1988; Neuberger MS y col, 1985). Los anticuerpos se pueden humanizar usando una diversidad de tecnicas conocidas en la tecnica incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicacion PCT WO91/09967; patentes americanas N.° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), recubrimiento o revestimiento (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka GM y col. (1994); Roguska MA. y col. (1994)), e intercambio de cadena (patente americana N.° 5.565.332). Tambien se conoce la tecnologfa de ADN recombinante general para la preparacion de tales anticuerpos (vease la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

El Fab de la presente invencion se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona espedficamente con Axl con una proteasa, papama. Tambien, el Fab se puede producir insertando ADN que codifica Fab del anticuerpo en un vector para el sistema de expresion procariota, o para el sistema de expresion eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (como sea apropiado) para expresar el Fab.

El F(ab')2 de la presente invencion se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona espedficamente con Axl con una proteasa, pepsina. Tambien, el F(ab')2 se puede producir uniendo el Fab' descrito mas adelante por un enlace tioeter o un enlace disulfuro.

El Fab' de la presente invencion se puede obtener tratando F(ab')2 que reacciona espedficamente con Axl con un agente de reduccion, ditiotreitol. Tambien, el Fab' se puede producir insertando ADN que codifica el fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresion para procariota, o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (como sea apropiado) para llevar a cabo su expresion.

El scFv de la presente invencion se puede producir obteniendo ADNc que codifica los dominios VH y VL como se ha descrito previamente, construyendo ADN que codifica scFv, insertando el ADN dentro de un vector de expresion para procariota, o un vector de expresion para eucariota y, a continuacion, introduciendo el vector de expresion en un procariota o eucariota (como sea apropiado) para expresar el scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, se puede usar una tecnologfa bien conocida llamada injerto de CDR, la cual implica seleccionar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) a partir de un fragmento scFv donante, e injertarlas sobre una region estructural del fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (vease, por ejemplo, los documentos WO98/45322; WO 87/02671; US5.859.205; US5.585.089; US4.816.567; EP0173494).

Se contempla(n) modificacion(es) de secuencia de aminoacidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Se sabe que cuando un anticuerpo humanizado se produce injertando simplemente solamente las CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en las FR de la VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de union a antfgeno se reduce en comparacion con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoacido de la VH y VL del anticuerpo no humano, no solamente en CDR sino en FR, estan directamente o indirectamente asociados con la actividad de union a antfgeno. Por lo tanto, la sustitucion de estos restos de aminoacido con diferentes restos de aminoacido derivados de las FR de la VH y VL del anticuerpo humano reducina la actividad de union. Para resolver el problema, en los anticuerpos injertados con CDR humana, los intentos tienen que ser realizados para identificar, entre las secuencias de aminoacidos de la FR de la VH y VL de los anticuerpos humanos, un resto de aminoacido que esta directamente asociado con la union al anticuerpo, o que interacciona con un resto de aminoacido de CDR, o que conserva la estructura tridimensional del anticuerpo y que esta directamente asociado con la union al antfgeno. La actividad de union a antfgeno reducida se podna incrementar reemplazando los aminoacidos identificados con los restos de aminoacido del anticuerpo original derivado de un animal no humano.

Las modificaciones y los cambios se pueden realizar en la estructura de los anticuerpos de la presente invencion, y en las secuencias de ADN que los codifica, y todavfa obtienen una molecula funcional que codifica un anticuerpo con las caractensticas deseables.

En la realizacion de los cambios en las secuencias amino, se puede considerar el mdice hidropatico de los aminoacidos. La importancia del mdice hidropatico de los aminoacidos en conceder la funcion biologica interactiva sobre una protema es en general entendida en la tecnica. Se acepta que el caracter hidropatico relativo de los aminoacidos contribuye a la estructura secundaria de la protema resultante, la cual poco a poco define la interaccion de la protema con otras moleculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antfgenos y similares. A cada aminoacido se ha asignado un mdice hidropatico segun su hidrofobicidad y caractensticas de carga estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). Un objetivo adicional de la presente invencion tambien abarca las variantes conservadoras de la funcion de los anticuerpos de la presente invencion.

Las “variantes conservadoras de la funcion” son aquellas en las que un resto de aminoacido dado en una protema o enzima se ha cambiado sin alterar la conformacion general y la funcion del polipeptido, incluyendo, pero no limitado a, reemplazamiento de un aminoacido con uno que tiene propiedades similares (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial de union a hidrogeno, acidas, basicas, hidrofobas, aromaticas, y similares). Los aminoacidos distintos a los indicados como conservados pueden diferir en una protema de manera que el porcentaje de similitud de protema o secuencia de aminoacidos entre cualquiera de las dos protemas de funcion similar puede variar y puede ser, por ejemplo, del 70 % al 99 % determinado segun un esquema de alineamiento tal como por el metodo de agrupamiento, en donde la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Una “variante conservadora de la funcion” tambien incluye un polipeptido que tiene al menos 60 % de identidad de aminoacidos determinado por los algoritmos BLAST o FASTA, preferiblemente al menos 75 %, mas preferiblemente al menos 85 %, mas preferiblemente al menos 90 %, e incluso mas preferiblemente al menos 95 %, y que tiene las mismas propiedades o funciones o basicamente similares que la protema nativa o parental con la que se compara.

Dos secuencias de aminoacidos son “basicamente homologas” o “basicamente similares” cuando mas del 80 %, preferiblemente mas del 85 %, preferiblemente mas del 90 % de los aminoacidos son identicos, o mas de aproximadamente 90 %, preferiblemente mas del 95 %, son similares (funcionalmente identicas) por toda la longitud de la secuencia mas corta. Preferiblemente, las secuencias similares u homologas se identifican por alineamiento usando, por ejemplo, el programa “pileup” de GCG (Genetics Computer Group, manual de programa para el paquete de GCG, Version 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los algoritmos de comparacion de secuencia tales como BLAST, FASTA, etc.

Por ejemplo, ciertos aminoacidos pueden estar sustituidos con otros aminoacidos en una estructura proteica sin perdida apreciable de actividad. Puesto que la capacidad interactiva y la naturaleza de una protema definen la actividad funcional biologica de la protema, se pueden realizar ciertas sustituciones de aminoacidos en una secuencia de protema, y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, mientras que no obstante obtienen una protema con propiedades similares. Por tanto, se contempla que se pueden realizar diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invencion, o las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos anticuerpos, sin perdida apreciable de su actividad biologica.

Se conoce en la tecnica que ciertos aminoacidos pueden estar sustituidos con otros aminoacidos que tienen un mdice o puntuacion hidropatica similar y todavfa dan como resultado una protema con similar actividad biologica, es decir, todavfa obtienen una protema funcionalmente equivalente biologica.

Como se perfilo anteriormente, las sustituciones de aminoacidos, por lo tanto, en general se basan en la relativa similitud de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoacidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamano y similares. Sustituciones ilustrativas que toman diversas de las anteriores caractensticas en consideracion son bien conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende:

- una H-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO:2, - una H-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO:3, - una H-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO:4, - una L-CDR1 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO:6, - una L-CDR2 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO:7, - una L-CDR3 que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad con la secuencia expuesta como SEQ ID NO:8, y - que se une espedficamente a Axl con basicamente la misma afinidad que un anticuerpo que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende la SEQ ID NO:2 para H-CDR1, la ^s E^q ID NO:3 para H-CDR2 y la SEQ ID NO:4 para HCDR3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende la SEQ ID NO:6 para L-CDR1, la SEQ ID NO:7 para LCDR2 y la SEQ ID NO:8 para L-CDR3, y mas preferiblemente con basicamente la misma afinidad que el anticuerpo anti-Axl murino 20G7-D9.

Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un anticuerpo que se une al dominio 2 tipo inmunoglobulina, dominio 1 de FN3 y dominio 2 de FN3 de la parte extracelular de Axl (secuencias de aminoacidos de epttopo de Axl SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11).

Dichos anticuerpos se pueden analizar para la union espedfica por cualquier metodo conocido en la tecnica. Muchos formato(s) de ensayo de union competitivo diferente se pueden usar para la preclasificacion (binning) de epftopo. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivo que usan tecnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos tipo “sandwich”, ensayos de inmunoprecipitacion, ensayos con precipitina, ensayos con precipitina de difusion en gel, ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proterna A, y ensayos de fijacion de complemented Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel y col., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., Nueva York). Por ejemplo, el BIACORE® (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) es uno de una diversidad de formatos de ensayo de resonancia por plasmones superficiales que se usan de manera rutinaria para paneles de preclasificacion de epftopo de anticuerpos monoclonales. Ademas, se pueden realizar los ensayos de bloqueo cruzado rutinarios tales como aquellos descritos en “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988.

Los anticuerpos modificados por ingeniena de la invencion incluyen aquellos en los que las modificaciones se han realizado a restos de la region estructural dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Generalmente tales modificaciones de la region estructural se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un planteamiento es “retromutar” uno o mas restos de la region estructural a la correspondiente secuencia de la lmea germinal. Mas especfticamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutacion somatica puede contener restos de la region estructural que difieren de la secuencia de la lmea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar comparando las secuencias de la region estructural del anticuerpo con las secuencias de la lmea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Para volver las secuencias de la region estructural a su configuracion de la lmea germinal, las mutaciones somaticas se pueden “retromutar” a la secuencia de la lmea germinal mediante, por ejemplo, mutagenesis dirigida a sitio o mutagenesis mediada por PCR. Tales anticuerpos “retromutados” tambien pretenden estar abarcados por la invencion. Otro tipo de modificacion de la region estructural implica la mutacion de uno o mas restos dentro de la region estructural, o incluso dentro de una o mas regiones CDR, para separar los epftopos del linfocito T para de ese modo reducir la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este planteamiento tambien se refiere como “desinmunizacion” y se describe a mas detalle en la publicacion de patente americana N.° 20030153043 de Carr y col.

Ademas de o alternativamente a las modificaciones realizadas dentro de las regiones estructurales o CDR, los anticuerpos de la invencion se pueden modificar por ingeniena para incluir modificaciones dentro de la region Fc, generalmente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como semivida del suero, fijacion del complemento, union a receptor Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente de anftgeno. Ademas, se puede modificar qmmicamente un anticuerpo de la invencion (por ejemplo, se puede unir uno o mas restos qrnmicos al anticuerpo) o se pueden modificar para alterar su glicosilacion, de nuevo para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describen a mas detalle mas adelante. La numeracion de los restos en la region Fc es la del mdice EU de Kabat.

En una realizacion, la region bisagra de CHI se modifica de modo que el numero de restos de cistema en la region bisagra esta alterada, por ejemplo, incrementada o disminuida. Este planteamiento se describe mas en el documento de patente americana N.° 5.677.425 de Bodmer y col. El numero de restos de cistema en la region bisagra de CHI esta alterada, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realizacion, se muta la region bisagra de Fc de un anticuerpo para disminuir la semivida biologica del anticuerpo. Mas especfticamente, se introducen una o mas mutaciones de aminoacidos en la region interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra de Fc de modo que el anticuerpo ha alterado la union de la proterna A estafilococica (SpA) en relacion con la union de SpA dominio bisagra de Fc. Este planteamiento se describe a mas detalle en el documento de patente americana N.° 6.165.745 de Ward y col.

En otra realizacion, el anticuerpo se modifica para incrementar su semivida biologica. Diversos planteamientos son posibles. Por ejemplo, se pueden introducir una o mas de las siguientes mutaciones: T252L, T254s , T256F, como se describe en el documento de patente americana N.° 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para incrementar la semivida biologica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la region CL o CHI para contener un epftopo de union a receptor salvaje tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una region Fc de una IgG, como se describe en las patentes americanas N.° 5.869.046 y 6.121.022 de Presta y col.

En otras realizaciones mas, la region Fc se altera reemplazando al menos un resto de aminoacido con un resto de aminoacido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, un o mas aminoacidos se pueden reemplazar con un diferente resto de aminoacido de modo que el anticuerpo tiene una afinidad alterada por un ligando efector pero conserva la capacidad de union a anftgeno del anticuerpo parental. El ligando efector al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este planteamiento se describe a mas detalle en las patentes americanas N.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter y col.

En otra realizacion, se pueden reemplazar uno o mas aminoacidos seleccionados de los restos de aminoacido con un resto de aminoacido diferente de modo que el anticuerpo tiene la union a C1q alterada y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) reducida o suprimida. Este planteamiento se describe a mas detalles en la patente americana N.° 6.194.551 de Idusogie y col.

En otra realizacion, se alteran uno o mas restos de aminoacido para de ese modo alterar la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemented Este planteamiento se describe mas en la publicacion PCT WO 94/29351 de Bodmer y col.

En otra realizacion mas, la region Fc se modifica para incrementar la capacidad del anticuerpo de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fc modificando uno o mas aminoacidos. Este planteamiento se describe mas en la publicacion PCT WO 00/42072 de Presta. Ademas, los sitios de union sobre IgGI humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con union mejorada (vease Shields, R.L. y col., 2001 J. Biol. Chen. 276:6.591­ 6.604, el documento WO2010106180).

En otra realizacion mas, se modifica la glicosilacion de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antigeno. Tales modificaciones de carbohidrato se pueden conseguir, por ejemplo, alterando uno o mas sitios de glicosilacion dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o mas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado la eliminacion de uno o mas sitios de glicosilacion de la region estructural variable para eliminar de ese modo la glicosilacion en ese sitio. Tal aglicosilacion puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Tal planteamiento se describe a mas detalle en las patentes americanas N.° 5.714.350 y 6.350.861 de Co y col.

Ademas o alternativamente, se puede producir un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilacion, tal como un anticuerpo hipofucosilado o no fucosilado que tiene cantidades reducidas de o no tiene restos fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras GIcNac de biseccion incrementadas. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilacion alterada incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidrato se pueden conseguir, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una celula hospedante con la maquinaria de glicosilacion alterada. En la tecnica se han descrito celulas con la maquinaria de glicosilacion alterada y se pueden usar como celulas hospedadoras en las que se expresan anticuerpos recombinantes de la invencion para producir de ese modo un anticuerpo con glicosilacion alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang y col. describe una lmea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, el cual codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en tal lmea celular presentan hipofucosilacion o estan desprovistos de restos fucosilo. Por lo tanto, en una realizacion, los anticuerpos de la invencion se pueden producir por expresion recombinante en una lmea celular la cual presenta patron de hipofucosilacion o no fucosilacion, por ejemplo, una lmea celular mairnfera con expresion deficiente del gen FUT8 que codifica fucosiltransferasa. La publicacion PCT WO 03/035835 de Presta describe una lmea celular CHO variante, celulas Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos ligados a Asn(297), dando como resultado tambien la hipofucosilacion de los anticuerpos expresados en esa celula hospedadora (vease, tambien, Shields, R.L. y col., 2002 J. Biol. Chem. 277:26.733­ 26.740). La publicacion PCT WO 99/54342 de Umana y col. describe lmeas celulares modificadas por ingeniena para expresar glicosil transferasas modificantes de glicoprotema (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las lmeas celulares modificadas por ingeniena presentan estructuras GlcNac de biseccion incrementadas que dan como resultado actividad ADC^c incrementada de los anticuerpos (vease tambien Umana y col., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180). Eureka Therapeutics describe ademas celulas mai^eras CHO modificadas por ingeniena genetica capaces de producir anticuerpos con patron de glicosilacion de mai^ero alterada desprovisto de restos fucosil (http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html). Alternativamente, los anticuerpos de la invencion se pueden producir en levaduras u hongos filamentosos modificados por ingeniena para el patron de glicosilacion tipo mai^ero y capaces de producir anticuerpos que carecen de fucosa como patron de glicosilacion (vease, por ejemplo, el documento EP1297172B1).

Otra modificacion de los anticuerpos en el presente documento que se contempla por la invencion es la pegilacion. Un anticuerpo se puede someter a pegilacion para, por ejemplo, incrementar la semivida biologica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para someter un anticuerpo a pegilacion, el anticuerpo, o fragmento del mismo, generalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un ester reactivo o derivado de aldehfdo de PEG, bajo condiciones en las que uno o mas grupos PEG llegan a estar unidos al anticuerpo o fragmento del anticuerpo. La pegilacion se puede llevar a cabo por una reaccion de acilacion o una reaccion de alquilacion con una molecula de PEG reactiva (o un polfmero soluble en agua reactivo analogo). Como se usa en el presente documento, el termino “polietilenglicol” se pretende que abarque cualquiera de las formas de PEG que se han usado para someter a derivatizacion otras protemas, tales como mono (C1-C10) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a someterse a pegilacion es un anticuerpo anglicosilado. Los metodos para pegilacion de protemas son conocidos en la tecnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invencion. Vease, por ejemplo, el documento EP O 154316 de Nishimura y col. y el documento EP 0401 384 de Ishikawa y col.

Otra modificacion de los anticuerpos que es contemplada por la invencion es un conjugado o una fusion proteica de al menos la region de union a antfgeno del anticuerpo de la invencion con protema de suero, tal como albumina de suero humano o un fragmento de la misma para incrementar la semivida de la molecula resultante. Tal planteamiento esta descrito, por ejemplo, en Ballance y col. documento EP0322094.

Otra posibilidad es una fusion de al menos la region de union a antfgeno del anticuerpo de la invencion con las protemas capaces de union a protemas de suero, tal como albumina de suero humano para incrementar la semivida de la molecula resultante. Tal planteamiento esta descrito, por ejemplo, en Nygren y col., documento EP 0486525.

Inmunoconjugados:

Un anticuerpo de la invencion se puede conjugar con un marcador detectable para formar un inmunoconjugado anti-Axl. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisotopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimatico, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Los metodos de produccion y deteccion de tales inmunoconjugados detectablemente marcados son bien conocidos por los expertos en la tecnica, y se describen mas adelante a mas detalle.

El marcador detectable puede ser un radioisotopo que se detecta por autorradiograffa. Los isotopos que son particularmente utiles para el fin de la presente invencion son 3H, 125I, 131I, 35S y 14C.

Los inmunoconjugados anti-Axl tambien se pueden marcar con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo fluorescentemente marcado se determina exponiendo el inmunoconjugado a luz de la apropiada longitud de onda y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcacion fluorescente incluyen isotiocianato de fluorescema, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldelddo y fluorescamina.

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-Axl se pueden marcar detectablemente acoplando un anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado con marcador quimioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el trascurso de una reaccion qmmica. Ejemplos de compuestos de marcacion quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un ester de acridinio aromatico, un imidazol, una sal de acridinio y un ester de oxalato.

Igualmente, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar los inmunoconjugados anti-Axl de la presente invencion. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biologicos en los que una protema catalftica incrementa la eficacia de la reaccion quimioluminiscente. La presencia de una protema bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son utiles para marcar incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Alternativamente, se pueden marcar de manera detectable los inmunoconjugados anti-Axl uniendo un anticuerpo monoclonal anti-Axl a una enzima. Cuando el conjugado anti-Axl-enzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto enzimatico reacciona con el sustrato para producir un resto qmmico que se puede detectar, por ejemplo, por medios espectrofotometricos, fluorometricos o visuales. Ejemplos de enzimas que se pueden usar para marcar de manera detectable inmunoconjugados poliespedficos incluyen p-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Los expertos en la tecnica conoceran otros marcadores adecuados que se pueden emplear de acuerdo con la presente invencion. La union de los restos marcadores a anticuerpos monoclonales anti-Axl se puede conseguir usando tecnicas estandar conocidas en la tecnica. La metodologfa tfpica a este respecto esta descrita por Kennedy y col., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs y col., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih y col., Int'l J. Cancer 46:1.101, 1990; Stein y col., Cancer Res. 50:1.330, 1990; y Coligan, supra.

Ademas, la conveniencia y la versatilidad de la deteccion inmunoqmmica se puede aumentar usando anticuerpos monoclonales anti-Axl que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina (vease, por ejemplo, Wilchek y col. (eds.), "Avidin-Biotin Technology," Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer y col., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).)

Los metodos para la realizacion de inmunoensayos estan bien establecidos (vease, por ejemplo, Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays," en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology," en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).)

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un conjugado anticuerpo monoclonal anti-Axl-farmaco. Un “conjugado anticuerpo monoclonal anti-Axl-farmaco” como se describe en el presente documento se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-Axl segun la invencion conjugado con un agente terapeutico. Tales conjugados anticuerpo monoclonal anti-Axl-farmaco producen efectos clmicamente beneficiosos sobre las celulas que expresan Axl cuando se administran a un sujeto, tal como, por ejemplo, un sujeto con un cancer que expresa Axl, generalmente cuando se administra solo pero tambien en combinacion con otros agentes terapeuticos.

En realizaciones tipicas, un anticuerpo monoclonal anti-AxI se conjuga con un agente citotoxico, de modo que el conjugado anticuerpo-farmaco resultante ejerce un efecto citotoxico o citostatico sobre una celula que expresa Axl (por ejemplo, una celula cancerosa que expresa Axl) cuando es absorbida o internalizada por la celula. Restos particularmente adecuados para la conjugacion con anticuerpos son agentes quimioterapeuticos, enzimas convertidoras de profarmaco, isotopos radioactivos o compuestos, o toxinas. Por ejemplo, se puede conjugar un anticuerpo monoclonal anti-Axl con un agente citotoxico tal como un agente quimioterapeutico o una toxina (por ejemplo, un agente citostatico o citocida tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria.

Clases utiles de agentes citotoxicos incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas, conectores de surco menor de ADN, inhibidores de la replicacion de ADN, agentes de alquilacion (por ejemplo, complejos de platino tales como cis-platina, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinuclear y carboplatino), antraciclinas, antibioticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluorinadas, ionoforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, compuestos de preformacion, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiacion, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de vinca, o similares.

Agentes citotoxicos individuales incluyen, por ejemplo, un androgeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina, captotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065 (Li y col., Cancer Res. 42:999-1.004, 1982), clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinosido de citidina, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorubicina, decarbazina, docetaxel, doxorubicina, un estrogeno, 5-fluordeoxiuridina, fosfato de etoposido (VP-16), 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, tenoposido (VM-26), 6-tioguanina, tioTEPA, topotecan, vinblastina, vincristina y vinorelbina.

Agentes citotoxicos particularmente adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), conectores de surco menor de ADN (por ejemplo., enediinas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de vinca, c C-1065, SN-38 (7-etil-10-hidroxicamptoteina), topotecan, morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina, y mitoxantrona.

En ciertas realizaciones, un agente citotoxico es un compuesto quimioterapeutico convencional tal como, por ejemplo, doxorubicina, paclitaxel, melfalan, alcaloides de vinca, metotrexato, mitomicina C o etoposido. Ademas, agentes potentes tales como analogos de CC-1065, calicheamicina, maitansina, analogos de dolastatina 10, rizoxina, y palitoxina pueden estar ligados a un anticuerpo anti-expresante de Axl.

En variaciones espedficas, el agente citotoxico o citostatico es auristatina E (tambien conocido en la tecnica como dolastatina-10) o un derivado del mismo. Generalmente, el derivado de auristatina E es, por ejemplo, un ester formado entre auristatina E y un acido ceto. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con acido paraacetilbenzoico o acido bazoilvalerico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados de auristatina tfpicos incluyen AFP (dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina-p-fenilenodiamina), MMAF (dovalina-valina-dolaisoleunina-dolaproina-fenilalanina), y MAE (monometil auristatina E). La smtesis y la estructura de auristatina E y sus derivados se describen en la publicacion de la solicitud de patente americana N.° 20030083263; las publicaciones de patente internacional N.° WO 2002/088172 y WO 2004/010957; y las patentes americanas N.° 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414.

En otras variaciones, el agente citotoxico es un agente de union de surco menor de ADN (vease, por ejemplo la patente americana N.° 6.130.237). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el agente de union de surco menor es un compuesto CBI. En otras realizaciones, el agente de union de surco menor es una enediina (por ejemplo, calicheamicina).

En ciertas realizaciones, un conjugado anticuerpo-farmaco comprende un agente antitubulina. Ejemplos de agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alcaloides de vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, y vinorelbina), y dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, m Ma E, AEB, AEVB). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, analogos de taxano (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimid, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolido, y eleuterobina. En algunas realizaciones, el agente citotoxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, en realizaciones espedficas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; vease tambien Chari y col., Cancer Res. 52:127-131, 1992).

En otras realizaciones, el agente citotoxico es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (por ejemplo, azotioprina o micofenolato mofetil), un inhibidor de dihidrofolato reductasa (por ejemplo, metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, arabinosido de citidina, amantadina, dideoxiuridina, iododeoxiuridina, poscarnet, o trifluridina.

En otras realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-Axl se conjuga con una enzima convertidora de profarmaco. La enzima convertidora de profarmaco se puede fusionar de manera recombinante con el anticuerpo o conjugar qmmicamente con el mismo usando metodos conocidos. Enzimas convertidoras de profarmaco ilustrativas son carboxipeptidasa G2, p-glucuronidasa, penicilina-V-amidasa, penicilina-G-amidasa, p-lactamasa, p-glucosidasa, nitroreductasa y carboxipeptidasa A.

Las tecnicas para conjugar los agentes terapeuticos con las protemas, y en particular con los anticuerpos, son bien conocidas (vease, por ejemplo, Arnon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld y col. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery (Robinson y col. eds., Marcel Deiker, Inc., 2° ed.

1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera y col. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin y col. eds., Academic Press, 1985); y Thorpe y col., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Vease tambien, la publicacion PCT WO 89/12624.)

Usos diagnosticos:

Un objetivo adicional de la invencion se refiere a un anticuerpo anti-Axl de la invencion para diagnosticar y/o hacer un seguimiento de una enfermedad cancerosa y otras enfermedades en las que los niveles de Axl estan modificados (incremento o disminucion).

En una realizacion preferida, los anticuerpos de la invencion se pueden marcar con una molecula o sustancia detectable, tal como una molecula fluorescente, una molecula radiactiva u otros marcadores cualesquiera conocidos en la tecnica descritos anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo de la invencion se puede marcar con una molecula radioactiva por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, las moleculas radioactivas incluyen, pero no se limitan a, atomo radioactivo para los estudios escintigraficos tales como 1123, 1124, In111, Re186, Re188. Los anticuerpos de la invencion tambien se pueden marcar con un marcador de espm para la formacion de imagen por resonancia magnetica nuclear (RMN) (tambien conocida como formacion de imagen por resonancia magnetica, irm), tal como yodo-123, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrogeno-15, oxfgeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Despues de la administracion del anticuerpo, se puede detectar la distribucion del anticuerpo dentro del paciente. Los metodos para detectar la distribucion de cualquier marcador espedfico son conocidos por los expertos en la tecnica y se puede usar cualquier metodo apropiado. Algunos ejemplos no limitantes incluyen, tomograffa computarizada (TC), tomograffa por emision de positrones (TEP), formacion de imagen por resonancia magnetica (IRM), fluorescencia, quimioluminiscencia y sonograffa.

Los anticuerpos de la invencion pueden ser utiles para diagnosticar y determinar la fase de las enfermedades cancerosas asociadas con la sobreexpresion de Axl (por ejemplo, en radioimagen). Las enfermedades cancerosas asociadas con la sobreexpresion de Axl generalmente incluyen pero no se limitan a cancer de celula escamosa, cancer de pulmon de celula pequena, cancer de pulmon de celula no pequena, cancer gastrico, cancer pancreatico, tumores de celula glial tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de tffgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, melanoma, cancer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de la glandula salivar, cancer de rinon, cancer renal, cancer de prostata, cancer vulval, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, sarcomas, canceres hematologicos (leucemias), astrocitomas, y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello u otras enfermedades hiperproliferativas que expresan o sobreexpresan Axl. Los anticuerpos de la invencion pueden ser utiles para diagnosticar enfermedades distintas de los canceres para las que se incrementa o disminuye la expresion de Axl (forma de Axl soluble o celular).

Generalmente, dichos metodos diagnosticos implican el uso de muestra biologica obtenida del paciente. Como se usa en el presente documento el termino “muestra biologica” abarca una diversidad de tipos de muestra obtenidos de un sujeto y se pueden usar en un ensayo diagnostico o de seguimiento. Las muestras biologicas incluyen pero no se limitan a muestras de sangre y otro ffquido de origen biologico, muestras de tejido solidas tales como un especimen de biopsia o cultivos de tejido o celulas derivadas de los mismos, y la progenie de las mismas. Por ejemplo, las muestras biologicas incluyen celulas obtenidas de una muestra de tejido recogida de un individuo sospechoso de tener una enfermedad cancerosa asociada con la sobreexpresion de Axl, y en una realizacion preferida de glioma, gastrico, de pulmon, pancreatico, de mama, prostata, renal, hepatico y endometrial. Por lo tanto, las muestras biologicas abarcan muestras clmicas, celulas en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biologico y muestras de tejido.

En una realizacion particular, la invencion es un metodo de diagnostico de una enfermedad cancerosa asociada con la sobreexpresion de Axl en un sujeto detectando Axl sobre celulas del sujeto usando el anticuerpo de la invencion. En particular, dicho metodo de diagnostico puede comprender las etapas que consisten en:

(a) poner en contacto una muestra biologica de un sujeto probable de padecer una enfermedad cancerosa asociada con la sobreexpresion de Axl con un anticuerpo segun la invencion en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con las celulas de la muestra biologica que expresan Axl;

(b) detectar y/o cuantificar dichos complejos, de ese modo la deteccion de dichos complejos es indicativa de una enfermedad cancerosa asociada con la sobreexpresion de Axl.

Para hacer un seguimiento de la enfermedad cancerosa, el metodo de diagnostico segun la invencion se puede repetir a diferentes intervalos de tiempo, para determinar si la union del anticuerpo a las muestras se incrementa o disminuye, de ese modo se determina si la enfermedad cancerosa progresa o retrocede.

En una realizacion particular, la invencion es un metodo de diagnostico de una enfermedad asociada con la expresion o la sobreexpresion de Axl o la disminucion o incremento de la forma soluble de Axl, tal como trastornos inmunes humanos, enfermedades tromboticas (trombosis y aterotrombosis), y tambien se pueden diagnosticar por el anticuerpo anti-Axl de la invencion enfermedades cardiovasculares.

Usos terapeuticos:

Los anticuerpos, fragmentos o inmunoconjugados de la invencion pueden ser utiles para tratar cualquier enfermedad asociada con la expresion de Axl preferiblemente canceres. Los anticuerpos de la invencion se pueden usar solos o en combinacion con cualquier agente adecuado.

1) El anticuerpo anti-Axl de la descripcion se puede usar como tratamiento de enfermedades hiperproliferativas asociadas con la expresion, sobreexpresion o activacion de Axl y Gas6. No hay limitaciones particulares sobre los tejidos tumorales, y los ejemplos incluyen cancer de celula escamosa, cancer de pulmon de celula pequena, cancer de pulmon de celula no pequena, cancer gastrico, cancer pancreatico, tumores de celula glial tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de hugado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, melanoma, cancer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de la glandula salivar, cancer de rinon, cancer renal, cancer de prostata, cancer vulval, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, sarcomas, canceres hematologicos (leucemias), astrocitomas, y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello. Canceres mas preferibles son glioma, gastrico, de pulmon, pancreatico, de mama, prostata, renal, hepatico y endometrial.

2) El anticuerpo anti-Axl de la descripcion son activadores potenciales de la respuesta inmune innata y se pueden usar en el tratamiento de enfermedades inmunes humanas, tales como sepsis, se pueden usar como adyuvantes para la inmunizacion tal como para vacuna y se pueden usar como agentes antiinfecciosos (frente a bacterias, virus, parasitos).

3) El anticuerpo anti-Axl de la invencion puede proteger o tratar enfermedades tromboticas tales como trombosis venosa y arterial y aterotrombosis.

4) El anticuerpo anti-Axl de la descripcion puede proteger, prevenir o tratar enfermedades cardiovasculares.

5) El anticuerpo anti-Axl de la descripcion puede prevenir o inhibir la entrada de virus tales como los virus de Lassa y del Ebola y se pueden usar para tratar infecciones vmcas.

En cada una de las realizaciones de los metodos de tratamiento descritos en el presente documento, el anticuerpo monoclonal anti-Axl o el conjugado anticuerpo monoclonal anti-Axl-farmaco se libera de una manera coherente con las metodologfas convencionales asociadas con el manejo de la enfermedad o trastorno para el que se busca tratamiento. Segun con la descripcion en el presente documento, se administra una cantidad eficaz del anticuerpo o conjugado anticuerpo-farmaco a un sujeto en necesidad de tal tratamiento durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para prevenir o tratar la enfermedad o trastorno.

Por tanto, un objetivo de la descripcion se refiere a un metodo para tratar una enfermedad asociada con la expresion de Axl que comprende administrar un sujeto en necesidad del mismo con una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento o inmunoconjugado de la invencion.

En el contexto de la invencion, el termino “tratar” o “tratamiento”, como se usa en el presente documento, quiere decir revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afeccion a la que tal termino se aplica, uno o mas smtomas de tal trastorno o afeccion.

Segun la invencion, el termino “paciente” o “paciente en necesidad del mismo” esta destinado a un humano afectado o probable que este afectado con enfermedad asociada con la sobreexpresion de Axl.

Por una “cantidad terapeuticamente eficaz” del anticuerpo de la invencion se quiere decir una cantidad suficiente del anticuerpo para tratar dicho cancer, a una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico. Sin embargo, se entendera que el uso diario total de los anticuerpos y las composiciones de la presente invencion sera decidido por el medico que le atiende dentro del alcance del criterio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz espedfico para cualquier paciente particular dependera de una diversidad de factores que incluyen el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del anticuerpo espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la ruta de administracion y la tasa de excrecion del anticuerpo espedfico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos usados en combinacion o simultaneos con el anticuerpo espedfico empleado; y factores similares bien conocidos en las artes medicas. Por ejemplo, es bien conocido dentro de la tecnica el comenzar la dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para conseguir el efecto terapeutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta que se alcance el efecto deseado.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado anticuerpo-farmaco se usa en combinacion con un segundo agente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Cuando se usa para tratar cancer, se puede usar un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado anticuerpo-farmaco de la presente invencion en combinacion con terapias de cancer convencional tales como, por ejemplo, cirugfa, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas. En ciertos aspectos, otros agentes terapeuticos utiles para la terapia del cancer de combinacion con un anticuerpo anti-Axl o conjugado anticuerpo-farmaco de acuerdo con la presente invencion incluyen agentes antiangiogenicos. En algunos aspectos, un anticuerpo o conjugado anticuerpo-farmaco de acuerdo con la presente invencion se administra conjuntamente con una citoquina (por ejemplo, una citoquina que estimula una respuesta inmune frente a un tumor).

En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado anticuerpo-farmaco como se describe en el presente documento se usa en combinacion con un inhibidor de tirosina quinasa (TKI).

En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado anticuerpo-farmaco como se describe en el presente documento se usa en combinacion con otro anticuerpo monoclonal terapeutico (mAb). Trastuzumab (Herceptin, Roche), Bevacizumab (Avastin, Roche) y Cetuximab (Erbitux, Merck) son tres de tales mAb que se han aprobado. Otro mAb incluye, pero no se limita a: Infliximab (Remicade, Johnson&Johnson), Rituximab (Rituxan, Roche), Adalimumab (Humira, Abbott) y Natalizumab (Tysabri, Biogen).

Composiciones farmaceuticas:

Para la administracion, el anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado anticuerpo-farmaco se formula como una composicion farmaceutica. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado anticuerpo-farmaco se puede formular segun metodos conocidos para preparar composiciones farmaceuticamente utiles, de ese modo la molecula terapeutica se combina en una mezcla con un vedculo farmaceuticamente aceptable. Se dice que una composicion es un “vedculo farmaceuticamente aceptable” si su administracion puede ser tolerada por un paciente receptor. La solucion salina tamponada con fosfato esteril es un ejemplo de un vedculo farmaceuticamente aceptable. Otros vedculos adecuados son bien conocidos por los expertos en la tecnica (Vease, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19a ed. 1995)). Las formulaciones ademas pueden incluir uno o mas excipientes, conservantes, solubilizadores, agentes tampon, albumina para prevenir la perdida de protema sobre las superficies vmcas, etc. La forma de las composiciones farmaceuticas, la ruta de administracion, la dosis y el regimen naturalmente depende de la afeccion a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, peso, y sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden formular para una administracion topica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutanea o intraocular y similares.

Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas contienen vedculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion capaz de ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones isotonicas, esteriles, salinas (fosfato monosodico o disodico, sodio, potasio, cloruro de calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adicion, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permiten la constitucion de soluciones inyectables.

Las dosis usada para la administracion se puede adaptar en funcion de diversos parametros, y en particular en funcion del modo de administracion usado, de la patologfa relevante, o alternativamente de la duracion deseada de tratamiento.

Para preparar las composiciones farmaceuticas, se puede disolver o dispersar una cantidad eficaz del anticuerpo en un vedculo farmaceuticamente aceptable o medio acuoso.

Las formas farmaceuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion improvisada de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida hasta el punto de que existe la capacidad de ser inyectada facilmente por jeringuilla. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe estar protegida frente a la accion contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de los microorganismos.

Un anticuerpo de la invencion se puede formular en una composicion en una forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion acida (formadas con los grupos amino libres de la protema) y las cuales se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhndricos o fosforicos, o tales acidos organicos como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien se pueden derivar de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos sodicos, potasicos, amonicos, calcicos o ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.

El vehfculo tambien puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos se puede provocar por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar por el uso en las composiciones de los agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes anteriormente enumerados, como sea requerido, seguido de esterilizacion filtrada. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos anteriormente enumerados. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de las soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de la preparacion son tecnicas de secado en vacfo y liofilizacion que producen un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion filtrada previamente esteril del mismo.

Tambien se contempla la preparacion de mas, o soluciones altamente concentradas para la inyeccion directa, en donde el uso de DMSO como disolvente se preve que de como resultado penetracion extremadamente rapida, liberacion de altas concentraciones de los agentes activos a una pequena area de tumor.

Tras la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la forma farmaceutica y en tal cantidad que es terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una diversidad de formas farmaceuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables anteriormente descrito, pero tambien se pueden emplear capsulas de liberacion de farmaco y similares.

Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion se debena tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente lfquido primero se volvena isotonico con solucion salina o glucosa suficiente. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. Con respecto a esto, los medios acuosos esteriles que se pueden emplear seran conocidos por los expertos en la tecnica en vista de la presente descripcion. Por ejemplo, se podna disolver una dosis en 1 ml de solucion de NaCl isotonica y o bien anadir a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectar en el sitio propuesto de la infusion (vease, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edicion, paginas 1.035-1.038 y 1.570-1.580). Alguna variacion en la dosis ocurrira necesariamente dependiendo de la afeccion del sujeto a tratar. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el individuo.

Los anticuerpos de la invencion se pueden formular dentro de una mezcla terapeutica para comprender aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis mas o menos. Tambien se puede administrar dosis multiple. Ademas de los compuestos formulados para la administracion parenteral, tal como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para la administracion oral; las capsulas de liberacion prolongada; y otra forma actualmente usada.

En ciertas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartfculas para la introduccion de anticuerpos dentro de las celulas hospedadoras. La formacion y el uso de los liposomas y/o nanopartfculas son conocidos por los expertos en la tecnica.

Las nanocapsulas en general pueden atrapar compuestos en una forma estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debido a la sobrecarga polimerica intracelular, tales partmulas ultrafinas (tamano alrededor de 0,1 pm) en general se disenan usando poUmeros capaces de degradarse in vivo. Se contemplan nanopartmulas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requerimientos para su uso en la presente invencion, y tales partmulas se pueden producir facilmente.

Los liposomas se forman a partir de fosfoKpidos que estan dispersos en un medio acuoso y espontaneamente forman vesmulas bicapa concentricas multilamelares (tambien denominadas vesmulas multilamelares (MLV)). MLV en general tienen diametros de 25 nm a 4 pm. La sonicacion de MLV da como resultado la formacion de vesmulas unilamelares pequenas (SUV) con diametros en el intervalo de 200 a 500 A, conteniendo una solucion acuosa en el centro. Las caractensticas ffsicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza ionica y la presencia de cationes divalentes.

Kits:

Finalmente, la invencion tambien proporciona kits que comprenden al menos un anticuerpo de la invencion. Los kits que contienen anticuerpos de la invencion encuentran uso en la deteccion de la expresion de Axl (incremento o disminucion), o en los ensayos terapeuticos o diagnosticos. Los kits de la invencion pueden contener un anticuerpo acoplado a un soporte solido, por ejemplo, una placa de cultivo de tejido o perlas (por ejemplo perlas de sefarosa). Se pueden proporcionar kits que contienen anticuerpos para la deteccion y cuantificacion de Axl in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Se puede proporcionar tal anticuerpo util para la deteccion con un marcador tal como uno fluorescente o un radiomarcador.

La invencion ademas se ilustrara mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se debenan interpretar de ningun modo como limitantes del alcance de la presente invencion.

Leyendas de la figura

Figura 1: Experimentos ELISA para investigar la afinidad y la especificidad de los anticuerpos monoclonales de raton frente a hAxl. Se incubaron placas recubiertas con Axl-Fc humana (h-Axl), Axl-Fc de raton (m-Axl) o Mer-Fc (h-Mer) humana, Tyro-3-Fc (h-Tyro-3) con anticuerpos anti-Axl monoclonales (mAbl, mAb2, mAb3, mAb4 o 20G7-D9). Despues del lavado, se anadio anti-IgG de raton conjugado con HRP. 20G7-D9 no tiene reaccion cruzada con h-Tyro-3 o h-Mer o m-Axl.

Figura 2: Analisis de citometria de flujo de Axl de superficie celular en A549. Se tineron A549 con anticuerpos anti-Axl monoclonales (mAbl, mAb2, mAb3, mAb4 o 20G7-D9) y anti-IgG de raton conjugado con fluorescema. La tincion con 20G7-D9 da como resultado un desplazamiento por un orden de magnitud y demuestra la sobreexpresion de Axl sobre la superficie de estas celulas.

Figura 3: Medicion de la afinidad de 20G7-D9 en presencia o no de Gas6 usando BIAcore. (A) sin Gas6, las tasas de asociacion (ka) y las tasas de disociacion (kd) se calcularon usando un modelo de union de Langmuir uno a uno sencillo. La constante de disociacion de equilibrio (K^d) se derivo como la relacion ka/kd. 20G7-D9 se une a Axl humana con alta afinidad, con una Kd de aproximadamente 53 nM. (B) 20G7-D9 no bloquea la union de ligando Gas6 a Axl.

Figura 4: Experimentos ELISA para investigar los efectos del mAb 20G7-D9 sobre la fosforilacion del receptor de Axl. Celulas de cancer pancreatico BXPC3, Capan-1, PANC1 y MIAPaCa-2 se privaron de suero, se preincubaron con anticuerpos de raton anti-Axl y se trataron con ligando Gas6. Los lisados celulares se transfirieron a placas de ELISA tipo sandwich PathScan® Phospho-Axl (PanTyr) (RD Systems, Minneapolis, MN). En comparacion con otros anticuerpos. 20G7-D9 era capaz de bloquear o reducir significativamente la activacion de Axl mediada por Gas6 en las cuatro lmeas celulares como se indica por los niveles disminuidos de fosforilacion de Axl en celulas estimuladas por Gas6.

Figura 5: Ensayo de cicatrizacion/aranazo de herida para investigar los efectos de los anticuerpos de raton anti-Axl sobre la migracion y proliferacion celular. Despues de cultivarse hasta confluencia, las celulas A549 se privaron de comida y se hirieron con una punta de pipeta. El Anti-Axl de raton 20G7-D9 redujo la repoblacion del area aclarada mas significativamente que el mAbl, aunque las celulas se trataran con Gas6. Figura 6: Ensayo de viabilidad celular para investigar la eficacia antiproliferativa de anti-Axl 20G7-D9. Se cultivaron celulas de cancer pancreatico Capan-1, PANC1 y MIAPaCa-2 en medio y se trataron en las concentraciones indicadas de mAbl o 20G7-D9 durante 5 dfas. Se midio la viabilidad celular por MTS. 20G7-D9 inhibe mas el crecimiento de todas las lmeas celulares ensayadas que el mAbl y el porcentaje de inhibicion es dependiente de la concentracion.

Figura 7: El anticuerpo monoclonal anti-Axl 20G7-D9 induce una rapida regulacion a la baja del receptor de Axl e inhibe la ruta de Akt. Se incubaron celulas en panel con 100 |jg/ml de mAb 20G7-D9 para diferente tiempo. Las celulas se sometieron a lisis y se uso la protema total para detectar por transferencia western. Como se muestra en la Figura 7A, mAb 20G7-D9 regula rapidamente a la baja la expresion del receptor de Axl en celulas Pancl. Despues de una hora de incubacion con mAb 20G7-D9, las celulas se incubaron 30 minutos con Gas6 y se analizo la presencia de fosforilacion del receptor de Axl sobre tirosina 702 (activacion de Axl) y fosforilacion de Akt sobre serina 473 (activacion de Akt) por transferencia Western. Como se muestra en la Figura 7B, la incubacion del mAb 20G7-D9 conduce a una disminucion en la fosforilacion inducida por Gas6 de las protemas Axl y Akt.

Figura 8: Modelos de xenoinjerto para investigar los efectos de los anticuerpos de raton anti-AxI sobre el cancer de mama triple negativo humano y el cancer pancreatico humano en ratones desnudos (nude). Se implantaron MDA-MB-231 (celulas de cancer de mama triple negativo) o MIAPaca-2, BXPC3 (celulas de cancer pancreatico) en el costado derecho de ratones desnudos aftmicos. Los animales recibieron 300 jg/inyeccion de los anticuerpos de raton anti-Axl. Durante el tratamiento, se hizo un seguimiento del crecimiento de los tumores una vez por semana con un calibrador. 20G7-D9 redujo mas el crecimiento general de los tumores pancreaticos y triple negativos en ratones desnudos que mAbl (A, B, C) e incrementa significativamente la supervivencia general en comparacion con el vehmulo o Gemcitabina en ratones xeroinjertados con BXPC3 pancreaticas (D). Sobre los tumores de xenoinjertos de MIAPaca-2 explantados que recibieron dos inyecciones, tambien se observa una expresion a la baja drastica del receptor de Axl por el mAb 20G7-D9 (E).

Figura 9: Secuencia del hAxl-hFc y localizacion/secuencia del epftopo del mAb anti-Axl 20G7-D9. El epftopo del anticuerpo anti-Axl 20G7-D9 se identifico por ensayos de proteolisis limitados usando o bien Tripsina o GluC proteasas y analisis de espectrometna de masas MALDI. La figura muestra la composicion del anftgeno (hAxl-hFc) usado en este experimento que se compone de los aminoacidos 33 a 440 del dominio extracelular de Axl fusionado con la parte Fc de la IgG1 humana y Etiqueta de histidina. Cada uno de los dominios tipo inmunoglobulina y los dominios de fibronectina 3 de la protema Axl estan indicados en la secuencia. mAb 20G7-D9 se une a los tres peptidos (epftopo conformacional) localizados en el domino 2 tipo inmunoglobulina y en los dominios primero y segundo de fibronectina (las secuencias estan enmarcadas en la secuencia de la protema y estan detalladas en la tabla).

Figura 10: Representacion de un modelo del ectodominio de Axl humana y localizacion del epftopo del anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl 20G7-D9 y el dominio de union de Gas6.

La Figura 10A muestra una representacion tipo vineta del modelo del dominio extracelular completo de Axl humana con todos los cuatro dominios marcados. En la Figura 10B, el fragmento de los aminoacidos 305 a 315 de Gas6 se anadio como una lamina p gris clara, ilustrando el dominio de union de Gas6 dentro del dominio 1 tipo inmunoglobulina de Axl. Finalmente, la Figura 10C presenta el epftopo 20G7-D9 dentro del domino 2 tipo inmunoglobulina y los dominios de fibronectina tipo III 1 y 2 como superficies grises. Confirma primero que las tres partes del epftopo estan localizadas sobre la superficie exterior de cada dominio. Segundo, la Figura 10C ilustra tambien que el sitio de interaccion de Gas6 y el epftopo se situan lejos uno de otro en el ectodominio de Axl humana.

Ejemplo

Ejemplo 1: Generacion del anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl

Los anticuerpos monoclonales frente a Axl se desarrollaron por inmunizacion secuencial de ratones Balb/c. Los ratones Balb/c se hiperinmunizaron con el dominio extracelular de Axl humana (hAx1ECD) fusionado con el dominio de Fc humana (protema hAxl-hFc; R&D system). Los ratones Balb/c se inyectaron subcutaneamente con 10 jg de hAxl-hFc soluble los dfas 0, 14 y 28 en presencia de adyuvante, completo de Freund (primera inyeccion) o incompleto (segunda y tercera inyeccion). Las celulas de bazo de los ratones se fusionaron con celulas de mieloma de raton (PX63.Ag8.653; ATCC, Rockville, MD) usando un protocolo previamente descrito (Salhi y col. Biochem. J.

2004). Las celulas se cultivaron en placas (105 por pocillo) con medios HAT para la seleccion de hibridoma. Despues de 12 dfas, los sobrenadantes se recogieron y cribaron para la especificidad de union de Axl (hAxl-hFc o hFc sola) por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Ocho clones positivos, que mostraban la mayor inmunounion despues de la segunda ronda de subclonacion por dilucion limitante, se ampliaron para la produccion in vitro a gran escala de mAb. Los sobrenadantes acondicionados se purificaron por cromatograffa de afinidad de protema G.

Ejemplo 2: Los anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl no tienen reaccion cruzada con Axl de raton u otros miembros de la familia del receptor TAM humano

Ejemplo 2.1: Los anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl no tienen reaccion cruzada con Axl de raton u otros miembros de la familia del receptor TAM humano como se determina por ELISA

En resumen, las placas recubiertas con hAxl-hFc se saturaron con albumina de suero bovino (BSA) al 1 % PBS, Tween 20 al 0,1 % (PBST).

Para el ensayo de la reaccion cruzada, se incubaron placas recubiertas con Axl-Fc (h-AxI) humana, Axl-Fc (m-AxI) de raton o Mer-Fc (h-Mer) humana, Tyro-3-Fc (h-Tyro-3) durante 1 hora a 37 °C y se lavaron cuatro veces en PBST. Las placas se incubaron con mAb anti-Axl (2 horas a 37 °C) y se lavaron cuatro veces en PBST. Las placas se incubaron con anti-IgG de raton conjugado con HRP (Sigma) a una dilucion de 1:2.000 en PBST, BSA al 1 % (1 hora a 37 °C). Finalmente, se anadio una solucion de orto-fenilenodiamina (Sigma) durante 30 min a temperatura ambiente en oscuridad y se midio la absorbancia a 450 nm.

Se demostro la especificidad frente a h-Axl, de una manera espedfica a dosis, de los diez mAb anti-hAxlECD seleccionados (Figura 1).

Ejemplo 2.2: El anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl se une especlficamente a celulas que expresan Axl como se determina por FACS

La capacidad de los anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl de la invencion para reconocer espedficamente celulas que expresan Axl se determino por FACS usando tecnicas estandar. En resumen, se recogieron celulas A549 (numero ATCC: CCL-185), se tineron con anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl purificados de la invencion a 4 °C durante 1 hora, se lavaron tres veces en PBS-BSA al 0,1 % y, a continuacion, se tineron con anti-IgG de raton conjugado con fluorescema (1:50) (Sigma) a 4 °C en oscuridad durante 45 min. Las muestras se analizaron en citometro de flujo EPICS (Beckman-Coulter, Fullerton, CA). Como se muestra en la Figura 2, los anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl de la invencion se unieron espedficamente a celulas A549 que expresaban Axl.

Ejemplo 2.3: Medicion de la afinidad del anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl evaluada por BIACore Para la determinacion de la afinidad de union de los anticuerpos anti-Axl, se uso una medicion por resonancia por plasmones superficiales con un instrumento BIAcore-3000 (BlACORE AB, Uppsala, Suiza). Los experimentos se realizaron en las instalaciones del programa de ”Proteomic Imaging and Molecular Interactions” (M. Pugniere) localizadas en el laboratorio. Para medir la afinidad entre los anticuerpos anti-Axl y hAxl-hFc, se capturaron los anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl por chips biosensores CM5 recubiertos con hAxl-hFc (usando un kit de acoplamiento de amina (BIAcore AB)). Para la medicion de las cineticas, se inyectaron diversas concentraciones de mAb anti-Axl (de 2 a 133 nM) en HePeS 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, tampon P20 tensioactivo al 0,005 % a 25 °C con un caudal de 50 pl/min. Las tasas de asociacion (ka) y las tasas de disociacion (kd) se calcularon usando un modelo de union de Langmuir de uno a uno sencillo (programa informatico BIAcore Evaluation version 3.2). La constante de disociacion de equilibrio (K^d) se calculo como la relacion ka/kd. Como se indico (Figura 3A), 20G7-D9 mostro una K^d de 5,3x10'8 M.

Ejemplo 3: El anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl no bloquea la union de Gas6

Para el estudio de competicion, se inyecto una concentracion saturante de Gas6 (625 nM) sobre los chips biosensores CM5 con hAxl-hFc (usando un kit de acoplamiento de amina (BIAcore AB)). El anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl (666 nM) se inyecto sin retirar el Gas6. El mismo experimento se realizo inyectando en primer lugar el anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl (666 nM) y en segundo lugar Gas6 (625 nM). Los resultados mostraron que 20G7-D9 no compitio con el ligando Gas6 por hAxlECD (Figura 3B).

Ejemplo 4: El anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl de la invencion inhibe el ligando inducido por la fosforilacion de Axl in vitro

Se realizaron experimentos ELISA para investigar si el anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl de la invencion era capaz de bloquear la fosforilacion de Axl inducida por ligando Gas6. En resumen, se sembraron celulas BXPC3 (numero ATCC: CRL-1687), Capan-1 (numero ATCC: HTB-79), PANC1 (numero ATCC: CRL-1469) y MIAPaCa-2 (numero ATCC: CRL-1420) en medio de crecimiento normal en placas de 6 pocillos de fondo plano. Al dfa siguiente, el medio de crecimiento se reemplazo por medio libre de suero para privar de comida las celulas durante la noche durante 24 horas. Las celulas se preincubaron con 100 pg/l de anti-Axl monoclonal de raton purificado de la invencion y, a continuacion, se trataron con o sin 250 ng/ml de Gas6 incubado con Gas6 durante 30 min a 37 °C. Despues, el medio se separo, las celulas se sometieron a lisis en 50 pl de tampon de lisis (Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl² 1,5 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 (v/v) al 0,1 %, glicerol al 10 % (v/v), fluoruro sodico 100 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM, ortovanadato sodico 1 mM (Sigma)) complementado con inhibidores de fosfatasa y proteasa (Roche Diagnostics, Meylan, Francia) durante 30 min. Los restos celulares se separaron por centrifugacion y las concentraciones proteicas se determinaron por la reaccion colorimetrica de Bradford. El kit de ELISA tipo sandwich PathScan® Phospho-Axl (PanTyr) (RD Systems, Minneapolis, MN) se uso como se describe por el fabricante para la deteccion del nivel de fosfo-Axl midiendo la absorbancia a 450 nm en un ensayo colorimetrico.

Como se muestra en la Figura 4, mAb 20G7-D9 inhibio fuertemente la fosforilacion de Axl inducida por ligando Gas6 en todas las lmeas celulares de cancer pancreatico. Otros mAbs no inhibieron o ligeramente la fosforilacion de Axl inducida por ligando Gas6 en todas las lmeas celulares de cancer pancreatico.

Ejemplo 5: El anticuerpo monoclonal de raton anti-AxI de la invencion inhibe la migracion celular

Se realizo un ensayo de cicatrizacion de herida observando el proceso de cicatrizacion en la que las celulas de los bordes de la herida artificial migran hacia el area de la herida. Las celulas A549 se cultivaron hasta confluencia o cerca de confluencia (>90 %) en placas de 24 pocillos. Se creo un campo de herida en el centro del pocillo usando una punta de pipeta esteril. Las celulas migratorias son capaces de extender protrusiones y finalmente invadir y cerrar el campo de la herida. Las celulas se aclararon muy suavemente con PBS y se incubaron con anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl purificados de la invencion (100 pg/ml) con o sin 100 pg/ml de Gas6. La tasa de migracion celular se determino 24 horas despues del tratamiento usando formacion de imagen microscopica. Como se muestra en la Figura 5, mAb 20G7-D9 inhibio fuertemente la migracion celular ya que el area de curacion era todavfa visible al contrario que las celulas tratadas con mAbl o Gas6.

Ejemplo 6: El anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl de la invencion inhibe la proliferacion celular

Se sembraron celulas de cancer pancreatico MIAPaca-2, Capan-1 y PANC1 a 4.000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl (25, 50 o 100 pg/ml) durante 5 dfas. Los ensayos de proliferacion celular se llevaron a cabo usando el ensayo MST (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio). MST es reducido por las celulas en un producto de formazan que es soluble en medio de cultivo de tejido. La absorbancia del formazan a 490 nm se midio usando un espectrofotometro. Como se muestra en la Figura 6, mAb 20G7-D9 inhibio fuertemente la proliferacion de las celulas pancreaticas mientras que se observo una ligera inhibicion con el otro anticuerpo espedfico a Axl (mAbl).

Ejemplo 7: El anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl humana de la invencion regula a la baja la expresion de Axl e inhibe la ruta de Akt

Para descifrar el mecanismo implicado en la inhibicion de la migracion celular y la fosforilacion de Axl por mAb 20G7-D9, se analizo su efecto directo sobre el receptor de Axl y las rutas de senalizacion corriente abajo (se ha publicado que la activacion del receptor de Axl por ligando Gas6 induce varias cascadas de senalizacion claves particularmente la ruta de Akt). Se analizaron la regulacion a la baja del receptor de Axl y la fosforilacion del receptor de Axl y Akt en una lmea celular de cancer pancreatico (celulas Panc-1) tratadas con 20G7-D9 mAb por transferencia western.

Se colocaron celulas Panc-1, lmea celular de cancer pancreatico, en placa de 6 pocillos (1x106 celulas por pocillo) y se incubaron con 100 pg/ml de 20G7-D9 a 37 °C. Las lmeas celulares recogidas a diferentes momentos se sometieron a lisis con tampon (NaCl 150 nM, TRIS 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, TRITONX100 al 1 %) que contema fluoruro de finilmetilsulfonilo 2 mM, fluoruro sodico 100 mM, ortovanadato sodico 10 mM, y un comprimido de mezcla de inhibidor de proteasa completa (Sigma St Louis, MO). Despues de una resolucion sobre SDS-PAGE al 8 % o 10 % bajo condiciones reductoras, las protemas se transfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA) que, a continuacion, se saturaron en PBS que contema Tween 20 al 0,1 % y leche en polvo desnatada al 5 %. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con diluciones apropiadas de anti-Axl humana (R&D systems), anti-fosfo (Y702) Axl o anti-fosfo (S473) Akt de Cell Signaling Technology. Las inmunotransferencias se normalizaron usando un anticuerpo dirigido a GAPDH (Millipore). A continuacion, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano picante apropiados (Bio-Rad) y se procesaron para la deteccion ECL (Amersham) y el analisis con G:BOX jChemi (Syngene).

Cuando las celulas se trataron con mAb 20G7-D9, la expresion de Axl disminuyo rapidamente despues de 90 minutos y es casi indetectable despues de 24 horas (Figura 7A). Una induccion de la cantidad de fosfo-Axl y fosfo-Akt se observo cuando las celulas se estimularon con Gas6. Ambas senales se inhibieron drasticamente por pretratamiento con mAb 20G7-D9 (Figura 7B).

Ejemplo 8: El anticuerpo monoclonal de raton anti-Axl humana de la invencion reduce el crecimiento in vivo del cancer de mama triple negativo y el cancer pancreatico humanos asociados con la regulacion a la baja del receptor de Axl

Todos los experimentos in vivo se realizaron en conformidad con las directrices francesas para los estudios con animal experimental (Acuerdo n.° C34-172-27). Se compraron ratones desnudos atfmicos hembras de seis semanas de vida de Harlan. Se implantaron celulas de cancer de mama triple negativo (5x106; MDA-MB-231; numero ATCC: HTB-26) o celulas de carcinoma pancreatico (3,5x106, BXPC3; 5x106, MIAPaCa-2) en el costado derecho de los ratones desnudos atfmicos. Los ratones que portaban tumor se distribuyeron al azar en diferentes grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen aproximado de 100 mm3. Los ratones se trataron por inyecciones intraperitoneales con vehmulo (NaCl al 0,9 %) o anticuerpos monoclonales de raton anti-Axl de la invencion solos a 300 pg/inyeccion (dos veces a la semana durante 4 semanas consecutivas) o con gemcitabina (GEMZAR). El volumen del tumor se midio semanalmente con un calibrador. Los resultados para BXPC3 tambien se expresaron por una curva de supervivencia de Kaplan-Meier modificada, usando el tiempo tomado por el tumor para

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:2 en la region H-CDR1, la SEQ ID NO:3 en la region H-CDR2 y la SEQ ID ⁿO:4 en la region H-CDR3; y una region variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:6 en la region L-CDR1, la SEQ ID NO:7 en la region L-CDR2 y la SEQ ID NO:8 en la region L-CDR3, en donde dicho anticuerpo se une al dominio extracelular de Axl en la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:9, en la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:10 y en la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:11.

2. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de union a antigeno segun la reivindicacion 1 en donde la region variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:1

3. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de union a antfgeno segun la reivindicacion 1 en donde la region variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:5.

4. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de union a antfgeno segun las reivindicaciones 2 y 3 en donde la region variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:1 y la region variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:5.

5. El anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 4 que es un anticuerpo quimerico, preferiblemente un anticuerpo de raton/humano quimerico.

6. El anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 1 que es un anticuerpo humanizado.

7. Un fragmento de un anticuerpo monoclonal segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

8. Una secuencia de acido nucleico que codifica una cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo monoclonal o su fragmento de union a antfgeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un vector que comprende un acido nucleico segun la reivindicacion 8.

10. Una celula hospedadora que comprende un acido nucleico segun la reivindicacion 8 o un vector segun la reivindicacion 9.

11. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo o su fragmento de union a antfgeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. El anticuerpo o su fragmento de union a antfgeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como farmaco.

13. El anticuerpo o su fragmento de union a antfgeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de enfermedades cancerosas asociadas con la sobreexpresion de Axl.

14. El anticuerpo o su fragmento de union a antfgeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el diagnostico de enfermedades cancerosas asociadas con la sobreexpresion de Axl.