ES2677367T3 - Anticuerpos anti-Axl y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2 en la región H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la región H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la región H-CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 6 en la región L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la región L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la región L-CDR3, en el que dicho anticuerpo se une al dominio extracelular de Axl en la secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID NO: 10.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos anti-AxI y usos de los mismos Sector de la tecnica

La presente invencion se refiere a anticuerpos anti-AxI y a usos de los mismos en metodos de diagnostico y terapeuticos.

Estado de la tecnica

Axl pertenece a la subfamilia TAM de tirosina quinasas receptoras (RTK, receptor tyrosine kinases) que tambien incluye Tyro3 y Mer. Los receptores TAM se caracterizan por una combinacion de dos dominios de tipo inmunoglobina y repeticiones dobles de fibronectina de tipo III en la region extracelular y un dominio de quinasa citoplasmatico. Los ligandos de los receptores TAM son Gas6 (la protema espedfica del gen 6 de la detencion del crecimiento) y la protema S, dos protemas dependientes de la vitamina K que muestran un 43 % de identidad de secuencias de aminoacidos y comparten estructuras de dominios similares. Cada protema tiene un dominio Gla N- terminal que contiene 11 restos de acido g-carboxiglutamico, seguidos de cuatro modulos de tipo factor de crecimiento epidermico (EGF, epidermal growth factor), y una estructura de tipo globulina de union a la hormona sexual (SHBG, sex hormone-binding globlin) C-terminal que consiste en dos dominios de laminina G en tandem. El dominio de la SHBG es tanto necesario como suficiente para la union y activacion del receptor TAM, mientras que el dominio Gla une los fosfolfpidos de membrana cargados negativamente y desempena un papel importante en la fagocitosis mediada por TAM de celulas apoptoticas. La activacion y senalizacion de TAM ha estado implicada en multiples respuestas celulares incluida la supervivencia, proliferacion, migracion y adhesion celular.

La regulacion erronea de Axl o su ligando Gas6, esta implicada en la patogenesis de una variedad de canceres humanos. La sobreexpresion de Axl se ha presentado en una amplia gama de canceres humanos (de pulmon, de prostata, de mama, gastrico, pancreatico, de ovario, de tiroides, canceres de sangre, carcinoma de celulas renales asf como glioblastoma...) y esta asociada a invasividad, metastasis y pronostico negativo. Estos hallazgos sugieren que Axl puede intervenir en la regulacion de multiples aspectos de tumorogenesis incluyendo el crecimiento, la invasion y la angiogenesis tumoral y por lo tanto representa una diana para la intervencion terapeutica en cancer, especialmente para el desarrollo de terapia contra el cancer metastasico y para otros tratamientos multiples de cancer incluido el tratamiento de la resistencia a los farmacos.

Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales anti-Axl se han descrito para el uso en el tratamiento de canceres. Por ejemplo, las publicaciones relativas a los anticuerpos anti-Axl incluyen los documentos WO2009/063965, WO2009/062690 y WO2011/014457.

Otras funciones de Axl dependientes o no de sus ligandos, tal como la inhibicion de las funciones inmunitarias, la activacion de la agregacion plaquetaria y la induccion de infecciones vmcas (como ejemplo, la captacion de los virus del Ebola y Lassa esta promovida por Axl) resaltan el potencial de Axl como diana terapeutica para otras aplicaciones diferentes a la oncologfa.

Objeto de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones. La presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl, que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID No: 2 en la region H-CDR1, la SEQ ID No: 3 en la region H-CDR2 y la SEQ ID No: 4 en la region H-CDR3; y una region variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6 en la region L-CDR1, la SEQ ID NO: 7 en la region L-CDR2 y la SEQ ID NO: 8 en la region L-CDR3. Dicho anticuerpo monoclonal se une al dominio extracelular de Axl por medio de, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones:

El termino "Axl" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a Axl humano. Axl se conoce tambien como "Ark", "Tyro- 7", "ufo" o "jtk11".

La expresion "anticuerpo anti-Axl" se refiere a un anticuerpo dirigido contra Axl.

De acuerdo con la presente invencion, "anticuerpo" o "inmunoglobulina" tienen el mismo significado y se usaran de manera similar en la presente invencion. El termino "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a moleculas de inmunoglobulina y a porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union al antfgeno que se unen inmunoespedficamente a un antfgeno. Como tal, el termino anticuerpo no solo incluye moleculas completas de anticuerpo, sino tambien fragmentos de

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anticuerpos, asf como variantes (incluidos derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas se enlazan entre s^ por enlaces disulfuro y cada cadena pesada se enlaza a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (1) y kappa (k). Existen cinco clases (o isotipos) principales de cadena pesada que determinan la actividad funcional de una molecula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene distintos dominios de secuencia. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CHI, CH2 y CH3, denominados conjuntamente CH). Las regiones variables de las cadenas tanto ligera (VL) como pesada (VH), determinan el reconocimiento de union con el antigeno y la especificidad del mismo. Los dominios de la region constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH), confieren propiedades biologicas importantes tales como la asociacion de cadenas de anticuerpos, la secrecion, la movilidad transplacentaria, la union al complemento y la union a receptores Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinacion del anticuerpo y el determinante antigenico. Los sitios de combinacion del anticuerpo estan compuestos por restos que son principalmente de las regiones determinantes de complementariedad (CDR, complementarity determining regions) o hipervariables. Ocasionalmente, los restos de regiones marco conservadas (FR, framework) o no hipervariables, influyen en la estructura de dominio global y por lo tanto en el sitio de combinacion. Las Regiones Determinantes de Complementariedad o CDR, se refieren a secuencias de aminoacidos que definen en conjunto la afinidad de union y la especificidad de la region Fv natural de un sitio de union a inmunoglobulina nativa. Cada una de las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tiene tres CDR, denominadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Un sitio de union al antfgeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una region V de cadena ligera y pesada. Las regiones marco conservadas (FR), se refieren a secuencias de aminoacidos interpuestas entre las CDR.

La expresion "anticuerpo quimerico" se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado del anticuerpo 3E3E8, y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano.

De acuerdo con la invencion, la expresion "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que tiene una region marco conservada variable y regiones constantes de un anticuerpo humano pero que conserva las CDR del anticuerpo 3E3E8.

El termino "Fab" representa un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de union al antfgeno, en el que aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena H (pesada) y toda la cadena L (ligera), entre los fragmentos obtenidos tratando la IgG con una proteasa, papama, se enlazan entre sf a traves de un enlace disulfuro.

El termino "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de union al antfgeno, que es ligeramente mas grande que el Fab unido mediante un enlace disulfuro de la region bisagra, entre los fragmentos obtenidos tratando la IgG con una proteasa, pepsina.

El termino "Fab'" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de union al antfgeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la region bisagra del F(ab')2.

Un polipeptido Fv monocatenario ("scFv", single chain Fv) es un heterodfmero VH::VL enlazado covalentemente, que se expresa normalmente a partir de una fusion genica que incluye genes que codifican VH y VL enlazados por un enlazador que codifica el peptido. Un "dsFv" es un heterodfmero de VH:: VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes se pueden formar espontaneamente por asociacion de scFV monovalentes, o se pueden generar acoplando los scFv monovalentes mediante un enlazador peptfdico, tal como un sc(Fv)2 divalente.

El termino "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequenos con dos sitios de union a antfgeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptfdica (VH-VL). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antfgeno.

Por "purificado" y "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un anticuerpo de acuerdo con la invencion o a una secuencia de nucleotidos, que la molecula indicada esta presente en la ausencia sustancial de otras macromoleculas biologicas del mismo tipo. El termino "purificado", como se usa en el presente documento, significa que hay un porcentaje de macromoleculas biologicas del mismo tipo preferentemente de al menos 75 % en peso, mas preferentemente de al menos 85 % en peso, aun mas preferentemente de al menos 95 % en peso, y de manera mas preferente de al menos 98 % en peso. Una molecula de acido nucleico "aislada" que codifica un polipeptido particular se refiere a una molecula de acido nucleico que carece sustancialmente de otras moleculas de acido nucleico que no codifican el polipeptido; sin embargo, la molecula puede incluir algunas bases o fracciones adicionales que no afectan perjudicialmente a las caractensticas basicas de la composicion.

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Anticuerpos de la invencion:

La presente invencion proporciona anticuerpos anti-AxI aislados o fragmentos de los mismos. En particular, los inventores han construido un hibridoma productor de anticuerpos anti-Axl murinos (3E3E8). Los inventores han clonado y caracterizado el dominio variable de las cadenas ligera y pesada de dicho mAb 3E3E8, y por lo tanto han determinado el dominio de las regiones determinates de complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo segun se describe en la Tabla 1:

Dominios del mAb 3E3E8

Secuencia

VH

Q VQLKESGPGLV APS QSLSITCS VSGFS LTN Y A VHWVKQPPGKGLE

WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLRISKDNSKSQVFFKMNSLQTDDTA MYYCARYYGSSLYPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:l)

H-CDR1

NYAVH (SEQ ID NO:2)

H-CDR2

VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO:3)

H-CDR3

YYGSSLYPMDY (SEQ ID NO:4)

VL

DrVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPG QSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTVFTLRISGVEAEDVGVYY CMQHLEYPWTFGGGTELEIK (SEQ ID NO:5)

L-CDR1

RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID NO:6)

L-CDR2

RMSNLA (SEQ ID NO:7)

L-CDR3

MQHLEYPWT (SEQ ID NO:8)

Por lo tanto, la invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl, que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H-CDR3.

La invencion tambien se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl, que comprende una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 para L-CDR3.

El anticuerpo monoclonal de la invencion, puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H-CDR3 y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 para L-CDR3.

En particular, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal anti-Axl que comprende:

- una region variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2 en la region H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la region H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la region H-CDR3; y

- una region variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 6 en la region L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la region L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la region L-CDR3.

En una realizacion particular, la region variable de cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 1 y/o la region variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 5.

En otra realizacion, el anticuerpo monoclonal de la invencion es un anticuerpo quimerico, preferentemente un anticuerpo quimerico humano/de raton. En particular, dicho anticuerpo quimerico de raton/ser humano puede comprender los dominios variables del anticuerpo 3E3E8 segun se ha definido anteriormente.

En otra realizacion, el anticuerpo monoclonal de la invencion es un anticuerpo humanizado. En particular, en dicho anticuerpo humanizado, el dominio variable comprende regiones marco conservadas aceptoras humanas y,

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opcionalmente, un dominio constante humano, cuando este presente, y CDR donantes no humanas, tales como CDR de raton segun se ha definido anteriormente.

La invencion proporciona ademas fragmentos anti-AxI dirigidos contra Axl de dichos anticuerpos que incluyen, pero sin limitacion, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.

La invencion proporciona ademas anticuerpos o fragmentos anti-Axl que se unen a secuencias de aminoacidos SEQ ID NO: 9 y sEq ID NO: 10 en la parte extracelular de Axl.

mAb 3E3E8

Secuencia de Axl humano (epftopo)

dominio 1 de FN3

NLHLVSR (SEQ ID NO:9)

dominio 2 de FN3

VLMDIGLRQEVTLE (SEQ ID NO:10)

En otro aspecto, la invencion se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

Metodos para producir los anticuerpos de la invencion:

Los anticuerpos anti-Axl de la invencion se pueden producir por cualquier tecnica conocida en la materia, tal como, sin limitacion, cualquier tecnica qmmica, biologica, genetica o enzimatica, en solitario o en combinacion.

Conociendo la secuencia de aminoacidos de la secuencia deseada, un experto en la materia puede producir facilmente dichos anticuerpos, mediante tecnicas estandar para la produccion de polipeptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar usando un metodo de fase solida bien conocido, usando preferentemente un aparato de smtesis de peptidos disponible en el comercio (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Como alternativa, los anticuerpos de la invencion se pueden sintetizar mediante tecnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden obtener como productos de ADN despues de la incorporacion de secuencias de ADN que codifican los anticuerpos, en vectores de expresion y la introduccion de dichos vectores en hospedadores eucariotas o procariotas adecuados que expresaran los anticuerpos deseados, a partir de los cuales se pueden aislar despues usando tecnicas bien conocidas.

Por consiguiente, un objetivo adicional de la invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invencion. Mas particularmente, la secuencia de acidos nucleicos codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo de la invencion.

Normalmente, dicho acido nucleico es una molecula de ADN o ARN, que se puede incluir en cualquier vector adecuado, tal como un plasmido, un cosmido, un episoma, un cromosoma artificial, un fago o un vector vmco.

Las expresiones "vector", "vector de clonacion" y "vector de expresion", significan el vetnculo mediante el cual una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extrano) se puede introducir en una celula hospedadora, para transformar de esta manera el hospedador y promover la expresion (por ejemplo, transcripcion y traduccion) de la secuencia introducida.

Por lo tanto, un objetivo adicional de la invencion se refiere a un vector que comprende un acido nucleico de la invencion.

Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, un potenciador, un terminador y elementos similares, para provocar o dirigir la expresion de dicho anticuerpo despues de la administracion a un sujeto. Como ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresion para una celula animal, se incluye el promotor y potenciador temprano de SV40 (Mizukami T. et al.1987), El promotor y potenciador de LTR del virus de la leucemia de Moloney en ratones (Kuwana Y et al. 1987), el promotor (Mason JO et al. 1985) y potenciador (Gillies SD et al. 1983) de la cadena H de la inmunoglobulina y similares.

Se puede usar cualquier vector de expresion para una celula animal, siempre que se pueda insertar y expresar un gen que codifique la region C de los anticuerpos humanos. Como ejemplos de vectores adecuados se incluyen pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) y similares.

Otros ejemplos de plasmidos incluyen plasmidos de replicacion que comprenden un origen de replicacion, o plasmidos integradores, tales como, por ejemplo, pUC, pcDNA, pBR y similares.

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Otros ejemplos de vectores vmcos incluyen vectores adenovmcos, retrovfficos, de herpes virus y de AAV. Dichos virus recombinantes se pueden producir mediante tecnicas bien conocidas en la materia, tal como transfectando celulas de empaquetamiento o mediante transfeccion transitoria con plasmidos o virus auxiliares. Como ejemplos ffpicos de celulas de empaquetamiento vmco se incluyen celulas PA317, celulas PsiCRIP, celulas GPenv+, celulas 293, etc. Protocolos detallados para producir dichos virus recombinantes, defectuosos para la replicacion, se pueden encontrar, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5.882.877, US 6.013.516, US 4.861.719, US 5.278.056 y WO 94/19478.

Un objetivo adicional de la presente invencion se refiere a una celula hospedadora que se ha transfectado, infectado o transformado por un acido nucleico y/o un vector de acuerdo con la invencion.

El termino "transformacion" significa la introduccion de un gen "extrano" (es decir, extrmseco o extracelular), secuencia de ADN o ARN, en una celula hospedadora, de tal manera que la celula hospedadora expresara el gen o la secuencia introducidos para producir una sustancia deseada, normalmente una protema o enzima codificada por el gen o la secuencia introducidos. Una celula hospedadora que recibe y expresa el ADN o ARN introducidos ha sido "transformada".

Los acidos nucleicos de la invencion se pueden usar para producir un anticuerpo de la invencion en un sistema de expresion adecuado. La expresion "sistema de expresion" significa una celula hospedadora y un vector compatible en condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresion de una protema codificada por un ADN extrano llevado por el vector e introducido en la celula hospedadora.

Los sistemas de expresion comunes incluyen celulas hospedadoras y vectores plasmfdicos de E. coli, celulas hospedadoras de insectos y vectores de Baculovirus, y celulas hospedadoras y vectores de mairnfero. Otros ejemplos de celulas hospedadoras incluyen, sin limitacion, celulas procariotas (tales como bacterias) y celulas eucariotas (tales como celulas de levadura, celulas de mam^era, celulas de insecto, celulas vegetales, etc.). Ejemplos espedficos E. coli, levaduras de Kluyveromyces o Saccharomyces, lmeas celulares de mam^era (por ejemplo, celulas Vero, celulas CHO, celulas 3T3, celulas COS, etc.) asf como cultivos celulares de mam^era primarios o establecidos (por ejemplo, producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, celulas embrionarias, celulas epiteliales, celulas nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos tambien incluyen celulas SP2/0-Ag14 de raton (ATCC CRL1581), celulas P3X63-Ag8. 653 de raton (ATcC cRl1580), celulas ChO en las que un gen de dihidrofolato reductasa (en lo sucesivo denominado "gen DHFR") es defectuoso (Urlaub G et al; 1980), celulas YB2/3HL. P2. G11.16Ag. 20 de rata (ATCC CRL1662, en lo sucesivo denominada "celula YB2/0") y similares.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para producir una celula hospedadora recombinante que expresa un anticuerpo de acuerdo con la invencion, comprendiendo dicho metodo las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un acido nucleico recombinante o un vector, segun se ha descrito anteriormente, en una celula hospedadora competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la celula hospedadora recombinante obtenida y (iii), opcionalmente, seleccionar las celulas que expresen y/o secreten dicho anticuerpo. Dichas celulas hospedadoras recombinantes se pueden usar para la produccion de los anticuerpos de la invencion.

En otra realizacion particular, el metodo comprende las etapas de:

(i) cultivar el hibridoma 3E3E8 en condiciones adecuadas para permitir la expresion del anticuerpo 3E3E8; y

(ii) recuperar el anticuerpo expresado.

Los anticuerpos de la invencion se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, protema A-Sepharose, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.

En una realizacion particular, el anticuerpo quimerico humano de la presente invencion se puede producir obteniendo secuencias nucleicas que codifican los dominios VL y VH como se ha descrito anteriormente, construyendo un vector de expresion de anticuerpo quimerico humano insertandolo en un vector de expresion de celulas animales que tiene genes que codifican el CH del anticuerpo humano y el CL del anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresion en una celula animal.

El dominio CH de un anticuerpo quimerico humano puede ser cualquier region que pertenezca a la inmunoglobulina humana, aunque las de la clase de IgG son adecuadas y se puede usar tambien una cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase de IgG, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Ademas, como el CL de un anticuerpo quimerico humano puede ser cualquier region que pertenezca a la Ig, y se pueden usar las de la clase kappa o lambda.

En la materia se conocen bien metodos para producir anticuerpos quimericos que implican tecnicas convencionales de ADN recombinante y de transfeccion de genes (Vease Morrison SL. et al. (1984) y los documentos de patente US5.202.238; y US5.204.244).

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El anticuerpo humanizado de la presente invencion se puede producir obteniendo secuencias de acidos nucleicos que codifican dominios de la cDr, como se ha descrito anteriormente, construyendo un vector de expresion de anticuerpo humanizado insertandolo en un vector de expresion de celulas animales que tiene genes que codifican (i) una region constante de cadena pesada identica a la de un anticuerpo humano y (ii) una region constante de cadena ligera identica a la de un anticuerpo humano y expresando los genes introduciendo el vector de expresion en una celula animal.

El vector de expresion de anticuerpo humanizado puede ser de un tipo en el que existe un gen que codifica una cadena pesada de anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera de anticuerpo en vectores distintos o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tandem). Con respecto a la facilidad de construccion de un vector de expresion de anticuerpo humanizado, la facilidad de introduccion en celulas animales, y el equilibrio entre los niveles de expresion de las cadenas H y L del anticuerpo en las celulas animales, se prefiere el vector de expresion de anticuerpo humanizado del tipo tandem (Shitara K et al. 1994). Como ejemplos de vectores de expresion de anticuerpos humanizados de tipo tandem se incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 y similares.

En la materia se conocen bien metodos para producir anticuerpos humanizados basados en tecnicas convencionales de ADN recombinante y de transfeccion de genes (Vease, por ejemplo, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de tecnicas conocidas en la materia que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicacion de PCT WO91/09967; Patentes de Estados Unidos n.° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), rebarnizado o rechapado (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)), y reordenamiento de cadenas (Patente de Estados Unidos n.° 5.565.332). Tambien se conoce la tecnologfa de ADN recombinante general para la preparacion de dichos anticuerpos (vease la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

El Fab de la presente invencion se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona espedficamente con Axl con una proteasa, la papama. Ademas, el Fab se puede producir insertando ADN que codifica el Fab del anticuerpo en un vector para el sistema de expresion procariota, o para el sistema de expresion eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (segun sea apropiado) para expresar el Fab.

El F(ab')2 de la presente invencion se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona espedficamente con Axl con una proteasa, la pepsina. Ademas, el F(ab')2 se puede producir uniendo el Fab' descrito a continuacion por medio de un enlace tioeter o un enlace disulfuro.

El Fab' de la presente invencion se puede obtener tratando el F(ab')2 que reacciona espedficamente con Axl con un agente reductor, el ditiotreitol. Ademas, el Fab' se puede producir insertando ADN que codifica el fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresion para procariota, o en un vector de expresion para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (segun sea apropiado) para llevar a cabo su expresion.

El scFv de la presente invencion se puede producir obteniendo el ADNc que codifica los dominios VH y VL como se ha descrito anteriormente, construyendo aDn que codifica scFv, insertando el ADN en un vector de expresion para procariota, o en un vector de expresion para eucariota, y despues introduciendo el vector de expresion en un procariota o eucariota (segun sea apropiado) para expresar el scFv. Para generar un fragmento de scFv humanizado, se puede usar una tecnologfa muy conocida denominada injerto de CDR, que implica seleccionar las regiones determinantes de complementariedad (CDR) a partir de un fragmento de scFv donante, e injertarlas en una region marco conservada del fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (veanse, por ejemplo, los documentos W098/45322; WO 87/02671; US5.859.205; US5.585.089; US4.816.567; EP0173494).

Se contempla la modificacion o las modificaciones de las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Se sabe que cuando se produce un anticuerpo humanizado simplemente injertando solo las CDR en el VH y VL de un anticuerpo procedente de un animal no humano en las FR del VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de union al anrtgeno se reduce en comparacion con la del anticuerpo original procedente de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoacidos del VH y VL del anticuerpo no humano, no solo en las CDR sino tambien en las FR, se asocian directa o indirectamente con la actividad de union al anrtgeno. De este modo, la sustitucion de estos restos de aminoacidos con diferentes restos de aminoacidos procedentes de las FR del VH y VL del anticuerpo humano, reducina la actividad de union. Para resolver el problema, en anticuerpos injertados con CDR humana, se ha intentado identificar, entre las secuencias de aminoacidos de la FR del VH y VL de anticuerpos humanos, un resto de aminoacido que este asociado directamente con la union al anticuerpo, o que interactue con un resto de aminoacido de la CDR, o que conserve la estructura tridimensional del anticuerpo y que este directamente asociado con la union al anrtgeno. La actividad reducida de union al anrtgeno, podna incrementarse sustituyendo los aminoacidos identificados por restos de aminoacidos del anticuerpo original procedente de un animal no humano.

Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invencion, y en las

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secuencias de ADN que los codifican, y seguir obteniendo una molecula funcional que codifica un anticuerpo con las caractensticas deseables.

Al realizar cambios en las secuencias de aminoacidos, se puede considerar el mdice hidropatico de los aminoacidos. La importancia del mdice hidropatico de los aminoacidos para conferir funcion biologica interactiva en una protema se entiende generalmente en la materia. Se acepta que el caracter hidropatico relativo del aminoacido contribuye a la estructura secundaria de la protema resultante, que a su vez define la interaccion de la protema con otras moleculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antfgenos y similares. A cada aminoacido se le asigna un mdice hidropatico basandose en sus caractensticas de hidrofobicidad y de carga, estas son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Un objetivo adicional de la presente invencion tambien incluye variantes conservadoras de las funciones de los anticuerpos de la presente invencion.

"Las variantes conservadoras de las funciones" son aquellas en las que se ha cambiado un resto de aminoacido dado en una protema o enzima sin alterar la conformacion y funcion generales del polipeptido, incluyendo, pero sin limitacion, la sustitucion de un aminoacido por uno que tenga propiedades similares (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial de union a hidrogeno, acidas, basicas, hidrofobas, aromaticas y propiedades similares). Los aminoacidos distintos de los indicados como conservados, pueden diferir en una protema de tal manera que el porcentaje de similitud de secuencias de aminoacidos o protemas entre dos protemas de funcion similar puede variar y puede ser, por ejemplo, del 70 % al 99 % segun se determina de acuerdo con un esquema de alineacion tal como por el Metodo Cluster, en el que la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Una "variante conservadora de las funciones" tambien incluye un polipeptido que tiene al menos un 60 % de identidad de aminoacidos segun se determina mediante los algoritmos BLAST o FASTA, preferentemente al menos un 75 %, mas preferentemente al menos un 85%, todavfa preferentemente al menos un 90 %, e incluso mas preferentemente un 95 %, y que tiene las mismas o sustancialmente similares propiedades o funciones que la protema nativa o precursora con la que se compara.

Dos secuencias de aminoacidos son "sustancialmente homologas" o "sustancialmente similares" cuando mas del 80 %, preferentemente mas del 85 %, preferentemente mas del 90 % de los aminoacidos son identicos, o mas de aproximadamente el 90 %, preferentemente mas del 95 %, son similares (funcionalmente identicos) con respecto a la longitud completa de la secuencia mas corta. Preferentemente, las secuencias similares u homologas se identifican por alineamiento usando, por ejemplo, el programa pileup de GCG (Genetics Computer Group, Manual de Programa para el Paquete GCG, Version 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los algoritmos de comparacion de secuencias tal como BLAST, FASTA, etc.

Por ejemplo, determinados aminoacidos se pueden sustituir por otros aminoacidos en una estructura de protema sin perdida apreciable de actividad. Puesto que la capacidad y la naturaleza interactivas de una protema definen la actividad funcional biologica de la protema, en una secuencia proteica se pueden realizar determinadas sustituciones de aminoacidos, y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, mientras que, sin embargo, se obtiene una protema con propiedades similares. Por lo tanto, se contempla que puedan realizarse varios cambios en las secuencias de anticuerpos de la invencion, o secuencias correspondientes de ADN que codifican dichos anticuerpos, sin perdida apreciable de su actividad biologica.

En la materia se sabe que determinados aminoacidos se pueden sustituir por otros aminoacidos que tengan una puntuacion o un mdice hidropatico similar y que aun dan como resultado una protema con actividad biologica similar, es decir, se sigue obteniendo una protema biologica funcionalmente equivalente.

Por lo tanto, como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoacidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoacido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamano y similares. Los expertos en la materia conocen bien cuales son las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta varias de las caractensticas anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende:

- una H-CDR1 que tiene al menos un 90 % o 95 % de identidad con la secuencia que se muestra como SEQ ID NO: 2,

- una H-CDR2 que tiene al menos un 90 % o 95 % de identidad con la secuencia que se muestra como SEQ ID NO: 3,

- una H-CDR3 que tiene al menos un 90 % o 95 % de identidad con la secuencia que se muestra como SEQ ID NO: 4,

- una L-CDR1 que tiene al menos un 90 % o 95 % de identidad con la secuencia que se muestra como SEQ ID

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NO: 6,

- una L-CDR2 que tiene al menos un 90 % o 95 % de identidad con la secuencia que se muestra como SEQ ID NO: 7,

- una L-CDR3 que tiene al menos un 90 % o 95 % de identidad con la secuencia que se muestra como SEQ ID NO: 8, y

- que se une espedficamente a Axl sustancialmente con la misma afinidad que un anticuerpo, que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende SEQ ID NO: 2 para H-CDR1, SEQ ID NO: 3 para H- CDR2 y SEQ ID NO: 4 para H- CDR3 y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende SEQ ID NO: 6 para L-CDR1, SEQ ID NO: 7 para L- CDR2 y SEQ ID No: 8 para L-CDR3, y mas preferentemente sustancialmente con la misma afinidad que el anticuerpo anti-Axl murino, 3E3E8.

Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un anticuerpo que se une al dominio 1 de FN3 y al dominio 2 de FN3 de la parte extracelular de Axl (secuencias de aminoacidos del epftopo de Axl SEQ ID NO: 9 y SEQ ID: 10).

La union espedfica de dichos anticuerpos se puede ensayar por cualquier metodo conocido en la materia. Para el agrupamiento de epftopos se pueden usar muchos formatos de ensayo de union competitivos diferentes. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero sin limitacion, sistemas de ensayo competitivos que usan tecnicas tales como transferencia Western, radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos de tipo "sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, ensayos de precipitina, ensayos de precipitina de difusion en gel, ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de protema A, y ensayos de fijacion al complemento. Dichos ensayos son habituales y muy conocidos en la materia (vease, por ejemplo, Ausubel et al., eds., 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., Nueva York). Por ejemplo, el BIACORE® (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) es uno de una variedad de formatos de ensayo de resonancia de plasmon superficial que se usa habitualmente en paneles de agrupamiento de epftopos de anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, se pueden llevar a cabo ensayos habituales de bloqueo cruzado, tales como los descritos en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988.

Los anticuerpos de la invencion disenados por ingeniena genetica, incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los restos de la region marco conservada dentro del VH y/o del VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Tfpicamente, tales modificaciones en la region marco conservada se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es "retromutar" uno o mas restos de la region marco conservada en la correspondiente secuencia de la lrnea germinal. Mas espedficamente, un anticuerpo que se ha sometido a una mutacion somatica puede contener restos de la region marco conservada que difieren de la secuencia de la lrnea germinal de la que procede el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar comparando las secuencias marco conservadas del anticuerpo con las secuencias de la lrnea germinal de la que procede el anticuerpo. Para reestablecer las secuencias de la region marco conservada a su configuracion de la lrnea germinal, las mutaciones somaticas se pueden "retromutar" a la secuencia de la lrnea germinal, por ejemplo, mediante mutagenesis dirigida o mutagenesis mediada por PCR. Tambien se pretende incluir en la invencion tales anticuerpos "retromutados". Otro tipo de modificacion en la region marco conservada implica mutar uno o mas restos en la region marco conservada o incluso en una o mas regiones CDR, para eliminar los epftopos de linfocitos T para reducir de este modo la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque se denomina tambien "desinmunizacion" y se describe con mas detalle en la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 20030153043 por Carr et al.

Ademas, o como alternativa a las modificaciones realizadas en la region marco conservada o en las regiones CDR, los anticuerpos de la invencion se pueden modificar por ingeniena genetica para que incluyan modificaciones en la region Fc, tfpicamente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijacion al complemento, la union al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente del antfgeno. Asimismo, un anticuerpo de la invencion se puede modificar qmmicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o mas grupos qmmicos al anticuerpo) o se puede modificar para alterar su glucosilacion, para alterar de nuevo una o mas propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con mas detalle a continuacion. La numeracion de los restos en la region Fc es la del mdice de EU de Kabat.

En una realizacion, la region bisagra de CHI se modifica de tal manera que el numero de restos de cistema en la region bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente de Estados Unidos n.° 5.677.425 de Bodmer et al. El numero de restos de cistema en la region bisagra de CHI se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realizacion, la region bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biologica del anticuerpo. Mas espedficamente, se introducen una o mas mutaciones de aminoacidos en la region de la interfaz de los dominios CH2-CH3 del fragmento bisagra de Fc de manera que el anticuerpo tiene deteriorada la union de la protema A estafilococica (SpA) en relacion con la union de la SpA con el dominio bisagra de Fc natural. Ward et al. describen este enfoque con mas detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6.165.745.

En otra realizacion, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biologica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o mas de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como describe

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Ward en la patente de Estados Unidos n.° 6.277.375. Como alternativa, para aumentar la semivida biologica, El anticuerpo se puede alterar en la region CHI o CL para que contenga un epftopo de union al receptor de rescate extrafdo de dos bucles de un dominio CH2 de una region Fc de una IgG, tal como describen Presta et al en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.869.046 y 6.121.022.

En otras realizaciones mas, la region Fc se altera sustituyendo al menos un resto de aminoacido por un resto de aminoacido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden sustituir uno o mas aminoacidos por un resto de aminoacido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero conserve la capacidad de union al antigeno del anticuerpo precursor. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con mas detalle en las patentes de Estados Unidos n.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.

En otra realizacion, uno o mas aminoacidos seleccionados de restos de aminoacidos, se pueden sustituir por un resto de aminoacido diferente, de manera que el anticuerpo tenga una union a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o anulada. Este enfoque se describe con mas detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6.194.551 de Idusogie et al.

En otra realizacion, se alteran uno o mas restos de aminoacidos para alterar de este modo la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicacion de PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

En otra realizacion mas, la region Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, siglas del ingles antibody dependent cellular cytotoxicity) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fc, modificando uno o mas aminoacidos. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicacion de PCT Wo 00/42072 de Presta. Ademas, los sitios de union en la IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn, se han mapeado y se han descrito variantes con union mejorada (vease Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276: 6591-6604, WO2010106180).

En otra realizacion mas, se modifica la glucosilacion de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilacion). La glucosilacion se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o mas sitios de glucosilacion en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden generar una o mas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado la eliminacion de uno o mas sitios de glucosilacion de la region marco conservada variable para eliminar de este modo la glucosilacion en ese sitio. Dicha aglucosilacion puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Tal enfoque se describe con mas detalle en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al.

Adicionalmente, o como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilacion alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado o no fucosilado, que tenga, o no, cantidades reducidas de restos fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras GlcNAc bisectoras aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glucosilacion alterada aumentan la capacidad de los anticuerpos para mediar en la ADCC. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una celula hospedadora con maquinaria de glucosilacion alterada. En la tecnica se han descrito celulas con maquinaria de glucosilacion alterada, y se pueden usar como celulas hospedadoras en las que expresar los anticuerpos recombinantes de la invencion para producir de este modo un anticuerpo con glucosilacion alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang et al. describe una lmea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal lmea celular presentan hipofucosilacion o estan desprovistos de restos de fucosilo. Por lo tanto, en una realizacion, los anticuerpos de la invencion se pueden producir por expresion recombinante en una lmea celular que presente o no un patron de hipofucosilacion, por ejemplo, en una lmea celular de mairnfero con expresion deficiente del gen FUT8 que codifica la fucosiltransferasa. La publicacion de PCT WO 03/035835 de Presta, describe una variante de la lmea celular CHO, celulas Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a hidratos de carbono enlazados a Asn(297), que tambien da como resultado la hipofucosilacion de los anticuerpos expresados en esa celula hospedadora (vease tambien Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La Publicacion de PCT wO 99/54342 de Umana et al. describe lmeas celulares modificadas por ingeniena genetica, para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoprotemas (por ejemplo, la beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que los anticuerpos expresados en las lmeas celulares modificadas por ingeniena genetica presentan estructuras GlcNac bisectoras aumentadas que dan como resultado una actividad aumentada de los anticuerpos para mediar en la ADCC (vease tambien Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180). Eureka Therapeutics describe adicionalmente celulas CHO de mam^era modificadas por ingeniena genetica, capaces de producir anticuerpos con un patron de glucosilacion de mam^era alterado desprovisto de restos de fucosilo (http: //www. eurekainc. com/a&bou- tus/companyoverview. html). Como alternativa, los anticuerpos de la invencion se pueden producir en levaduras u hongos filamentosos modificados por ingeniena genetica para el patron de glucosilacion de tipo mai^ero y capaces de producir anticuerpos carentes de fucosa como patron de glucosilacion (vease, por ejemplo, el documento EP1297172B1).

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Otra modificacion de los anticuerpos que contempla la invencion en el presente documento, es la pegilacion. Se puede pegilar un anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la semivida biologica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o un fragmento del mismo, reacciona normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un ester reactivo o un derivado de aldetudo de PEG, en condiciones en las que uno o mas grupos de PEG se unen al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. La pegilacion se puede llevar a cabo mediante una reaccion de acilacion o una reaccion de alquilacion con una molecula de PEG reactiva (o un polfmero reactivo analogo y soluble en agua). Tal como se usa en el presente documento, el termino "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras protemas, tales como mono (C1- C10) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. En la materia se conocen metodos para pegilar protemas y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invencion. Vease, por ejemplo, el documento EP O 154 316 de Nishimura et al. y el documento EP 0 401 384 de Ishikawa et al.

Otra modificacion de los anticuerpos que se contempla en la invencion, es un conjugado o una fusion de protemas de al menos la region de union al antfgeno del anticuerpo de la invencion, con una protema serica, tal como seroalbumina humana o un fragmento de la misma, para aumentar la semivida de la molecula resultante. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Ballance et al.documento EP0322094.

Otra posibilidad es una fusion de al menos la region de union al antfgeno del anticuerpo de la invencion, con protemas capaces de unirse a protemas sericas, tal como seroalbumina humana, para aumentar la semivida de la molecula resultante. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Nygren et al., documento EP 0 486 525.

Inmunoconjugados:

Un anticuerpo de la invencion se puede conjugar con un marcador detectable para formar un inmunoconjugado anti- Axl. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisotopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimatico, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Los expertos en la materia conocen bien metodos de fabricacion y deteccion de dichos inmunoconjugados marcados de manera detectable y se describen a continuacion con mas detalle.

El marcador detectable puede ser un radioisotopo que se detecta por autorradiograffa. Los isotopos que son particularmente utiles para los fines de la presente invencion son 3H, 125I, 131I, 35S y 14C.

Los inmunoconjugados anti-Axl tambien se pueden marcar con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado con fluorescencia se determina exponiendo el inmunoconjugado a la luz de la longitud de onda adecuada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos marcadores fluorescentes incluyen isotiocianato de fluorescema, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldetudo y fluorescamina.

Como alternativa, los inmunoconjugados anti-Axl se pueden marcar de manera detectable acoplando un anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado etiquetado con un compuesto quimioluminiscente, se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reaccion qmmica. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes incluyen luminol, isoluminol, un ester de acridinio aromatico, un imidazol, una sal de acridinio y un ester de oxalato.

De manera similar, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar inmunoconjugados anti-Axl de la presente invencion. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en los sistemas biologicos en los que una protema catalttica aumenta la eficacia de la reaccion quimioluminiscente. La presencia de una protema bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son utiles para el marcado incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Como alternativa, los inmunoconjugados anti-Axl se pueden marcar de manera detectable enlazando un anticuerpo monoclonal anti-Axl con una enzima. Cuando el conjugado de anti-Axl/enzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, la fraccion enzimatica reacciona con el sustrato para producir una fraccion qmmica que se puede detectar, por ejemplo, por medios espectrofotometricos, fluorometricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar para marcar inmunoconjugados poliespedficos de manera detectable, incluyen p-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Los expertos en la materia conoceran otros marcadores adecuados que se pueden emplear de acuerdo con la presente invencion. La union de las fracciones del marcador con anticuerpos monoclonales anti-Axl, se puede lograr usando tecnicas estandar conocidas en la materia. La metodologfa tfpica a este respecto la describen Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int'l J. Cancer 46: 1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50: 1330, 1990; y Coligan, citados anteriormente.

Ademas, la conveniencia y versatilidad de la deteccion inmunoqmmica puede potenciarse usando anticuerpos monoclonales anti-Axl que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina. (Vease, por ejemplo, Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology, "Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al.,

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"Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology, " en Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).)

Los metodos para llevar a cabo los inmunoensayos estan bien establecidos. (Vease, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays, " en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter y Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology, " en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch y Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).)

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un conjugado de farmaco/anticuerpo monoclonal anti-Axl. Un "conjugado de farmaco/anticuerpo monoclonal anti-Axl" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-Axl de acuerdo con la invencion conjugado con un agente terapeutico. Tales conjugados de farmaco/anticuerpo monoclonal anti-Axl producen efectos clmicamente beneficiosos en celulas que expresan Axl cuando se administra a un sujeto, tal como, por ejemplo, un sujeto con un cancer que expresa Axl, normalmente cuando se administra solo pero tambien en combinacion con otros agentes terapeuticos.

En realizaciones tfpicas, un anticuerpo monoclonal anti-Axl se conjuga con un agente citotoxico, de tal manera que el conjugado de farmaco/anticuerpo resultante, ejerce un efecto citotoxico o citostatico en una celula que expresa Axl (por ejemplo, una celula cancerosa que expresa Axl) cuando la celula lo capta o lo internaliza. Las fracciones particularmente adecuadas para la conjugacion con anticuerpos son agentes quimioterapeuticos, enzimas convertidoras de profarmacos, isotopos o compuestos radioactivos, o toxinas. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-Axl se puede conjugar con un agente citostatico o citocida, tal como un agente quimioterapeutico o una toxina (por ejemplo, un agente citostatico o citocida, tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina difterica).

Las clases utiles de agentes citotoxicos incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auriestatinas, aglutinantes del surco menor del ADN, inhibidores de la replicacion del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino, tales como, cisplatino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino), antraciclinas, antibioticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizantes de quimioterapia, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluoradas, ionoforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, compuestos preformadores, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizantes de la radiacion, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasas, alcaloides de la vinca o similares.

Agentes citotoxicos individuales incluyen, por ejemplo, un androgeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5- azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065 (Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982), clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinosido de citidina, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, dacarbazina, docetaxel, doxorrubicina, un estrogeno, 5-fluordesoxiuridina, fosfato de etoposido (VP-16), 5- fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbazina, estreptozotocina, tenoposido (VM-26), 6-tioguanina, tiotepa, topotecan, vinblastina, vincristina y vinorelbina.

Agentes citotoxicos particularmente adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), aglutinantes del surco menor del ADN (por ejemplo, enediinas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de la vinca, cC-1065, SN-38 (7-etil-10-hidroxi- camptotema), topotecan, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina,

combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolido, eleuterobina y mitoxantrona.

En determinadas realizaciones, un agente citotoxico es un agente quimioterapeutico convencional, tal como, por ejemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalan, alcaloides de la vinca, metotrexato, mitomicina C o etoposido. Ademas, agentes fuertes, tales como analogos de CC- 1065, caliqueamicina, maitansina, analogos de dolastatina 10, rizoxina y palitoxina, se pueden enlazar a un anticuerpo que exprese anti-Axl.

En variaciones espedficas, el agente citotoxico o citostatico es auristatina E (tambien conocida en la tecnica como dolastatina-10) o un derivado de la misma. Normalmente, el derivado de auristatina E es, por ejemplo, un ester formado entre auristatina E y un cetoacido. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar auristatina E con acido paraacetil benzoico o acido benzoilvalerico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados de auristatina tfpicos incluyen AFP (dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproma-fenilalanina-p-fenilendiamina), MMAF (dovalina-valina-dolaisoleunina-dolaproma-fenilalanina), y MAE (monometil auristatina E). La smtesis y estructura de la auristatina E y sus derivados se describe en la publicacion de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20030083263; publicaciones de patentes internacionales n.° WO 2002/088172 y WO 2004/010957; y patentes de Estados Unidos n.° 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744;

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En otras variaciones, el agente citotoxico es un agente de union del surco menor del ADN. (Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.130.237). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el agente de union del surco menor es un compuesto CBI. En otras realizaciones, el agente de union del surco menor es una enediina (por ejemplo calicheamicina).

En determinadas realizaciones, un conjugado de farmaco/anticuerpo comprende un agente antitubulina. Los ejemplos de agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, taxanos por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alcaloides de la vinca por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina) y dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de la bacatina, analogos de taxano (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolido y eleuterobina. En algunas realizaciones, el agente citotoxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, en realizaciones espedficas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; vease tambien Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131, 1992).

En otras realizaciones, el agente citotoxico es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (por ejemplo, azotioprina o micofenolato de mofetilo), un inhibidor de la dihidrofolato reductasa (por ejemplo, metotrexato), aciclovir, ganciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavirina, azidotimidina, arabinosido de citidina, amantadina, didesoxiuridina, yododesoxiuridina, poscarnet o trifluridina.

En otras realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-Axl se conjuga con una enzima convertidora de profarmacos. La enzima convertidora de profarmacos puede fusionarse de manera recombinante con el anticuerpo o conjugarse qmmicamente con el mismo usando metodos conocidos. Son ejemplos de enzimas convertidoras de profarmacos, carboxipeptidasa G2, p-glucuronidasa, penicilina-V-amidasa, penicilina-G-amidasa, p-lactamasa, p-glucosidasa, nitrorreductasa y carboxipeptidasa A.

Se conocen bien tecnicas para conjugar agentes terapeuticos con protemas, y en particular con anticuerpos. (Vease, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, "en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery, "en Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2a ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, " en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, " en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58. Vease tambien, por ejemplo, la publicacion de PCT WO 89/12624. )

Usos diagnosticos:

Un objetivo adicional de la invencion se refiere a un anticuerpo anti-Axl de la invencion para diagnosticar y/o controlar una enfermedad cancerosa y otras enfermedades en las que los niveles de Axl se modifican (aumentan o disminuyen).

En una realizacion preferida, los anticuerpos de la invencion se pueden marcar con una molecula o sustancia detectable, tal como una molecula fluorescente, una molecula radioactiva o cualquier otro marcador conocido en la materia tal y como se han descrito anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo de la invencion se puede marcar con una molecula radioactiva mediante cualquier metodo conocido en la materia. Por ejemplo, las moleculas radioactivas incluyen, pero sin limitacion, atomos radiactivos para estudios de gammagraffa, tales como, 1123, 1124, In111, Re186, Re188. Los anticuerpos de la invencion se pueden marcar tambien con un marcador de espm para la formacion de imagenes por resonancia magnetica nuclear (RMN) (tambien conocida como formacion de imagenes por resonancia magnetica, irm), tal como yodo-123, yodo-131, indio-Ill, fluor- 19, carbono-13, nitrogeno-15, oxfgeno- 17, gadolinio, manganeso o hierro. Despues de la administracion del anticuerpo, se detecta la distribucion del anticuerpo en el paciente. Los expertos en la materia conocen metodos para detectar la distribucion de cualquier marcador espedfico y se puede usar cualquier metodo apropiado. Algunos ejemplos no limitantes incluyen, tomograffa computarizada (CT), tomograffa de emision de positrones (PET), formacion de imagenes mediante resonancia magnetica (IRM), fluorescencia, quimioluminiscencia y sonograffa.

Los anticuerpos de la invencion pueden ser utiles para diagnosticar y estadificar enfermedades cancerosas asociadas a la sobreexpresion de Axl (por ejemplo, en radioimagenes). Las enfermedades cancerosas asociadas a la sobreexpresion de Axl incluyen normalmente, pero sin limitacion, cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon microdtico, cancer de pulmon no microdtico, cancer gastrico, cancer pancreatico, tumores de celulas gliales, tal como, glioblastoma y neurofibromatosis, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de tffgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, melanoma, cancer colorrectal, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glandulas salivales, cancer de rinon, cancer renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, sarcomas, canceres hematologicos (leucemias), astrocitomas, y varios tipo de cancer

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de cabeza y cuello u otras enfermedades hiperproliferativas que expresen o sobreexpresen Axl.

Los anticuerpos de la invencion pueden ser utiles para diagnosticar enfermedades distintas de canceres, para las cuales la expresion de Axl aumenta o disminuye (forma de Axl soluble o celular).

Normalmente, dichos metodos de diagnostico implican el uso de una muestra biologica obtenida del paciente. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "muestra biologica" incluye una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto y se pueden usar en un ensayo de diagnostico o de control. Las muestras biologicas incluyen, pero sin limitacion, muestras de sangre y de otros fluidos de origen biologico, muestras de tejidos solidos, tales como espedmenes de biopsia o cultivos tisulares o celulas procedentes de los mismos, y su progenie. Por ejemplo, las muestras biologicas incluyen celulas obtenidas de una muestra tisular extrafda de un individuo que se sospecha que tiene una enfermedad cancerosa asociada a la sobreexpresion de Axl, y en una realizacion preferida de glioma, gastrico, pulmonar, pancreatico, de mama, de prostata, renal, hepatico y de endometrio. Por lo tanto, las muestras biologicas comprenden muestras clmicas, celulas en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, muestras de lfquido biologico y tisulares.

En una realizacion particular, la invencion es un metodo para diagnosticar una enfermedad cancerosa asociada a la sobreexpresion de Axl en un sujeto mediante la deteccion de Axl en celulas del sujeto usando el anticuerpo de la invencion. En particular, dicho metodo de diagnostico puede comprender las etapas que consisten en:

(a) poner en contacto una muestra biologica de un sujeto propenso a sufrir una enfermedad cancerosa asociada a la sobreexpresion de Axl, con un anticuerpo de acuerdo con la invencion, en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con las celulas de la muestra biologica que expresan Axl;

(b) detectar y/o cuantificar dichos complejos, con lo que la deteccion de dichos complejos es indicativa de una enfermedad cancerosa asociada a la sobreexpresion de Axl.

Para controlar la enfermedad cancerosa, el metodo de diagnostico de acuerdo con la invencion, se puede repetir en diferentes intervalos de tiempo, para determinar si la union del anticuerpo con las muestras aumenta o disminuye, con lo que se determina si la enfermedad cancerosa avanza o retrocede.

En una realizacion particular, la invencion es un metodo de diagnostico de una enfermedad asociada a la expresion o a la sobreexpresion de Axl o a la disminucion o al aumento de la forma soluble de Axl, tal como trastornos inmunitarios humanos, con el anticuerpo anti-Axl de la invencion tambien se pueden diagnosticar enfermedades tromboticas (trombosis y aterotrombosis) y cardiovasculares.

Usos terapeuticos:

Los anticuerpos, fragmentos o inmunoconjugados de la invencion, pueden ser utiles para tratar cualquier enfermedad asociada a la expresion de Axl, preferencialmente canceres. Los anticuerpos de la invencion se pueden usar solos o en combinacion con cualquier agente adecuado.

1) el anticuerpo anti-Axl de la divulgacion se puede usar como tratamiento de enfermedades hiperproliferativas asociadas a Axl y/o a la expresion, sobreexpresion o activacion de Gas6. No hay limitaciones particulares en los tejidos tumorales, y los ejemplos incluyen cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon microdtico, cancer de pulmon no microdtico, cancer gastrico, cancer pancreatico, tumores de celulas gliales tal como glioblastoma y neurofibromatosis, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de Idgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, melanoma, cancer colorrectal, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glandulas salivales, cancer de rinon, cancer renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, sarcomas, canceres hematologicos (leucemias), astrocitomas y varios tipos de cancer de cabeza y cuello. Los canceres mas preferentes son glioma, gastrico, pulmon, pancreatico, de mama, de prostata, renal, hepatico y de endometrio.

2) los anticuerpos anti-Axl de la divulgacion son posibles activadores de la respuesta inmunitaria innata y se pueden usar en el tratamiento de trastornos inmunitarios humanos, tal como septicemia, se pueden usar como adyuvantes para la inmunizacion tal como para una vacuna y se pueden usar como agentes antiinfecciosos (contra bacterias, virus, parasitos)

3) el anticuerpo anti-Axl de la invencion puede proteger contra o tratar enfermedades tromboticas tales como trombosis venosa y arterial y aterotrombosis

4) el anticuerpo anti-Axl de la divulgacion puede proteger, impedir o tratar enfermedades cardiovasculares

5) el anticuerpo anti-Axl de la divulgacion pueden impedir o inhibir la entrada de virus tales como los virus de Lassa y Ebola y se puede usar para tratar infecciones vmcas

En cada una de las realizaciones de los metodos de tratamiento descritos en el presente documento, el anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado de farmaco/anticuerpo monoclonal anti-Axl, se administra de manera coherentes con las metodologfas convencionales asociadas a la gestion de la enfermedad o trastorno para los cuales se desea el tratamiento. De acuerdo con la divulgacion del presente documento, a un sujeto que necesita dicho tratamiento se le administra una cantidad eficaz del anticuerpo o conjugado de farmaco/anticuerpo durante un tiempo y en

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condiciones suficientes para impedir o tratar la enfermedad o trastorno.

Por lo tanto, un objetivo de la divulgacion se refiere a un metodo para tratar una enfermedad asociada a la expresion de Axl, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento o inmunoconjugado de la invencion.

En el contexto de la invencion, los terminos "tratar" o "tratamiento", como se usan en el presente documento, significan invertir, aliviar, inhibir el avance de, o impedir el trastorno o afeccion en quienes se aplican dichos terminos, o uno o mas smtomas de dicho trastorno o afeccion.

De acuerdo con la invencion, las expresiones "paciente" o "paciente que lo necesite", hacen referencia a un ser humano afectado o propenso a estar afectado por la enfermedad asociada a la sobreexpresion de Axl.

Por una "cantidad terapeuticamente eficaz" del anticuerpo de la invencion se entiende una cantidad suficiente del anticuerpo para tratar dicho cancer, con una relacion de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico. Sin embargo, se entendera, que el uso diario total de los anticuerpos y de las composiciones de la presente invencion lo decidira el medico tratante dentro del alcance del buen criterio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz para un paciente particular dependera de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se esta tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del anticuerpo espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el genero y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion del anticuerpo espedfico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos usados en combinacion o a la vez con el anticuerpo espedfico empleado; y factores similares bien conocidos en la practica medica. Por ejemplo, es bien sabido dentro de la experiencia de la tecnica, empezar con dosis del compuesto a niveles mas bajos que los requeridos para lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se logre el efecto deseado.

En determinadas realizaciones, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, se usa un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado de farmaco/anticuerpo en combinacion con un segundo agente. Cuando se usa para tratar el cancer, se puede usar un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado de farmaco/anticuerpo de la presente invencion en combinacion con terapias convencionales contra el cancer, tales como, por ejemplo, cirugfa, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, otros agentes terapeuticos utiles para la combinacion de la terapia contra el cancer con un anticuerpo anti-Axl o un conjugado de farmaco/anticuerpo de acuerdo con la presente invencion, incluyen agentes antiangiogenicos. En algunos aspectos, un anticuerpo o conjugado farmaco/anticuerpo de acuerdo con la presente invencion, se coadministra con una citocina (por ejemplo, una citocina que estimula una respuesta inmunitaria contra un tumor).

En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado de farmaco/anticuerpo como se describe en el presente documento, se usa en combinacion con un inhibidor de tirosina quinasa (TKI).

En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado de farmaco/anticuerpo como se describe en el presente documento, se usa con otro anticuerpo monoclonal terapeutico (mAb). Trastuzumab (Herceptin, Roche), Bevacizumab (Avastin, Roche) y Cetuximab (Erbitux, Merck) son tres de estos mAb que han sido aprobados. Otros mAb incluyen, aunque sin limitacion: Infliximab (Remicade, Johnson&Johnson), Rituximab (Rituxan, Roche), Adalimumab (Humira, Abbott) y Natalizumab (Tysabri, Biogen).

Composiciones farmaceuticas:

Para la administracion, el anticuerpo monoclonal anti-Axl o conjugado de farmaco/anticuerpo, se formula como una composicion farmaceutica. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-Axl o un conjugado de farmaco/anticuerpo se puede formular de acuerdo con metodos conocidos para preparar composiciones farmaceuticamente utiles, con lo que la molecula terapeutica se combina en una mezcla con un transportador farmaceuticamente aceptable. Se dice que una composicion es un "transportador farmaceuticamente aceptable" si un paciente receptor puede tolerar su administracion. La solucion salina tamponada con fosfato esteril es un ejemplo de un transportador farmaceuticamente aceptable. Los expertos en la tecnica conocen otros transportadores adecuados. (Vease, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19a ed. 1995)) Las formulaciones pueden incluir ademas uno o mas excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponadores, albumina para impedir la perdida de protemas en las superficies de los viales, etc.

La forma de las composiciones farmaceuticas, la via de administracion, la dosificacion y el regimen dependen, naturalmente, de la afeccion que se vaya a tratar, de la gravedad de la enfermedad, de la edad, del peso y gel genero del paciente, etc.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden formular para una administracion topica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutanea o intraocular y similar.

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Preferentemente, las composiciones farmaceuticas contienen vetnculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion que pueda inyectarse. Estas pueden ser, en particular, soluciones salinas isotonicas, esteriles (fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adicion, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permiten la constitucion de soluciones inyectables.

Las dosis usadas para la administracion se pueden adaptar en funcion de varios parametros, y en particular, en funcion del modo de administracion usado, de la patologfa relevante, o como alternativa, de la duracion deseada del tratamiento.

Para preparar composiciones farmaceuticas, una cantidad eficaz del anticuerpo se puede disolver o dispersar en un transportador o medio acuoso farmaceuticamente aceptable.

Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma ha de ser esteril y ha de ser fluida hasta el punto que pueda inyectarse facilmente. Ha de ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y ha de conservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones de los compuestos activos en forma de base libre o como sales farmaceuticamente aceptables, se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles lfquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.

Se puede formular un anticuerpo de la invencion en una composicion en una forma neutra o en forma de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clortndrico o fosforico, o dichos acidos organicos como acido acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con grupos carboxilo libres tambien pueden proceder de bases inorganicas, tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidroxidos ferricos, y dichas bases organicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.

El transportador tambien puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, usando un revestimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamano de partfculas requerido en el caso de una dispersion y usando tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede efectuarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferente incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse usando en las composiciones agentes que retrasen la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros principios enumerados anteriormente, segun sea necesario, seguido de esterilizacion por filtrado. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diferentes principios activos esterilizados, en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros principios requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos son las tecnicas de secado al vacfo y liofilizacion, que proporcionan un polvo del principio activo mas cualquier principio adicional deseado a partir de una solucion de los mismos previamente esterilizada por filtracion.

Tambien se contempla la preparacion de soluciones mas concentradas, o fuertemente concentradas, para la inyeccion directa, en donde se preve que el uso de DMSO como disolvente de como resultado una penetracion extremadamente rapida, suministrando concentraciones altas de los agentes activos en un area pequena del tumor.

Despues de la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de la dosificacion y en una cantidad tal que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, aunque tambien se pueden emplear capsulas de liberacion de farmaco y similares.

Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion debe tamponarse adecuadamente y el diluyente lfquido se vuelve en primer lugar isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos esteriles que se pueden emplear

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seran conocidos por los expertos en la tecnica a la luz de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosificacion podna disolverse en 1 ml de solucion de NaCl isotonica y anadirse a 1000 ml de lfquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusion propuesto, (vease, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edicion, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Dependiendo de la afeccion del sujeto que se este tratando, sera necesario realizar alguna variacion en la dosificacion. La persona responsable de la administracion, en cualquier caso, determinara la dosis apropiada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la invencion se pueden formular en una mezcla terapeutica para comprender aproximadamente de 0,0001 a 1,0 miligramos, o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o de aproximadamente 0,1 a 1,0, o incluso, aproximadamente 10 miligramos por dosis mas o menos. Se pueden administrar tambien dosis multiples.

Ademas de los compuestos formulados para la administracion parenteral, tal como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para administracion oral; capsulas de liberacion temporal; y cualquier otra forma usada actualmente.

En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartfculas para la introduccion de anticuerpos en las celulas hospedadoras. Los expertos en la materia conocen la formacion y el uso de los liposomas y/o nanopartfculas.

Las nanocapsulas pueden generalmente atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimerica intracelular, dichas partfculas ultrafinas (con un tamano de aproximadamente 0,1 pm) se disenan generalmente usando polfmeros capaces de degradarse in vivo. Las nanopartfculas de polialquilcianoacrilato biodegradables que reunen estos requisitos se contemplan para el uso en la presente invencion, y dichas partfculas se pueden elaborar facilmente.

Los liposomas estan formados a partir de fosfolfpidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontaneamente vesfculas bicapa concentricas multilaminares (tambien denominadas vesfculas multilaminares (VML)). Generalmente, las VML tienen diametros de 25 nm a 4 pm. La exposicion a ultrasonido de las VML da como resultado la formacion de vesfculas unilaminares pequenas (VUP) con diametros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solucion acuosa en el nucleo. Las caractensticas ffsicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza ionica y de la presencia de cationes divalentes.

Kits:

Finalmente, la invencion tambien proporciona kits que comprenden al menos un anticuerpo de la invencion. Los kits que contienen anticuerpos de la invencion se utilizan en la deteccion de la expresion de Axl (aumento o disminucion), o en ensayos terapeuticos o diagnosticos. Los kits de la invencion pueden contener un anticuerpo acoplado a un soporte solido, por ejemplo, una placa de cultivo tisular o perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Pueden proporcionarse kits que contengan anticuerpos para la deteccion y cuantificacion de Axl in vitro, por ejemplo, en un ensayo ELISA o en una transferencia Western. Dicho anticuerpo util para la deteccion puede proporcionarse con un marcador, tal como un marcador fluorescente o un radiomarcador.

La invencion se ilustrara adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Experimentos ELISA para investigar la afinidad y la especificidad de anticuerpos monoclonales de raton contra hAxl. Placas revestidas con Axl-Fc humano (h-Axl), Axl-Fc de raton (m-Axl) o Mer-Fc humano (h-Mer), Tyro-3- Fc (h-Tyro-3), se incubaron con anticuerpos anti-Axl (mAb1, mAb2, mAb3, mAb4 o 3E3-E8). Tras el lavado, se anadio anti-IgG de raton conjugado con HRP. 3E3-E8 no reacciono de manera cruzada con h- Tyro-3 o con h-Mer o con m-Axl.

Figura 2: Analisis de citometria de flujo de Axl de superficie celular en A549. Celulas A549 se tineron con anticuerpos monoclonales anti-Axl (mAb1, mAb2, mAb3, mAb4 o 3E3-E8) y anti-IgG de raton conjugado con fluorescema. La tincion con 3E3- E8 da como resultado un cambio de un orden de magnitud y demuestra la sobreexpresion de Axl en la superficie de estas celulas.

Figura 3: Medicion de la afinidad de 3E3-E8 en presencia o no de Gas6 usando BIAcore. (A) Sin Gas6, los indices de asociacion (ka) y los indices de disociacion (kd) se calcularon usando un modelo de union Langmuir sencillo, individualizado. La constante de disociacion de equilibrio (Kd) se obtuvo como resultado de la relacion ka/kd. 3E3-E8 se une a Axl humano con alta afinidad, con una Kd de aproximadamente 1,6 nM. (B) 3E3-E8 no bloquea la union del ligando Gas6 a Axl.

Figura 4: Experimentos ELISA para investigar los efectos del mAb 3E3-E8 sobre la fosforilacion del receptor de Axl. Celulas de cancer pancreatico BXPC3, Capan-1, PANC1 y MIAPaCa-2, se privaron de suero,

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se preincubaron con anticuerpos anti-AxI de raton y se trataron con ligando Gas6. Los lisados celulares se transfirieron a placas de ELISA de tipo sandwich PathScan® Phospho-Axl (PanTyr) (RD Systems, Mineapolis, MN). Comparado con otros anticuerpos, 3E3-E8 fue capaz de bloquear o reducir significativamente la activacion de Axl mediada por Gas6 en las cuatro lmeas celulares como se indica por los niveles de fosforilacion de Axl reducidos en celulas estimuladas por Gas6.

Figura 5: Ensayo de cicatrizacion de heridas/aranazos para investigar los efectos de los anticuerpos anti- Axl de raton sobre la migracion y proliferacion celular. Despues de crecer hasta la confluencia, las celulas A549 se privaron de nutrientes y se laceraron con una punta de pipeta. El anti-Axl de raton 3E3E8, redujo la repoblacion del area despejada mas significativamente que el mAbl, incluso aunque las celulas se tratasen con Gas6.

Figura 6: Ensayo de viabilidad celular para investigar la eficacia antiproliferativa del anti-Axl 3E3-E8.

Celulas de cancer pancreatico Capan-1, PANC1 y MIAPaCa-2 crecieron en un medio y durante 5 dfas se trataron a las concentraciones de mAbl o 3E3-E8 indicadas. La viabilidad celular se midio con MTS. 3E3-E8 inhibe mas el crecimiento de todas las lmeas celulares evaluadas que mAbl y el porcentaje de inhibicion es dependiente de la concentracion.

Figura 7: El anticuerpo monoclonal 3E3-E8 anti-Axl, induce una regulacion negativa rapida del receptor de Axl e inhibe la ruta de Akt. Durante diferentes tiempos, se incubaron celulas Pancl con 100 pg/ml de mAb 3E3-E8. Las celulas se lisaron y las protemas totales se usaron para deteccion mediante transferencia Western. Como se muestra en la Figura 7A, rapidamente, el mAb 3E3-E8, regula negativamente la expresion del receptor de Axl en celulas Pancl. Despues de una hora de incubacion con el mAb 3E3-E8, las celulas se incubaron durante 30 minutos con Gas6 y mediante transferencia Western se analizo la presencia de fosforilacion del receptor de Axl en tirosina 702 (activacion de Axl) y de fosforilacion de Akt en serina 473 (activacion Akt). Tal como se muestra en la Figura 7B, la incubacion del mAb 3E3-E8, conduce a una reduccion en la fosforilacion inducida por Gas6 de las protemas Axl y Akt.

Figura 8: Modelos de xenoinjerto para investigar los efectos de los anticuerpos anti-Axl de raton sobre el cancer de mama triple negativo humano y el cancer pancreatico humano en ratones desnudos. MDA-MB- 231 (celulas de cancer de mama triple negativo) o MIAPaca-2, BXPC3 (celulas de cancer pancreatico), se implantaron en el costado derecho de ratones atfmicos desnudos. Los animales recibieron 300 pg/inyeccion de los anticuerpos anti-Axl de raton. Durante el tratamiento, el crecimiento de los tumores se controlo una vez por semana con un calibrador. En los ratones desnudos, el anticuerpo 3E3-E8 redujo mas el crecimiento global de los tumores triple negativos y pancreaticos que el mAbl (A, B, C) y, en comparacion con el vehmulo o con Gemcitabina, aumento significativamente la supervivencia global en ratones xenoinjertados con celulas BXPC3 de cancer pancreatico (D). En tumores explantados con xenoinjertos de MIAPaca-2 que recibieron dos inyecciones, se observo tambien una expresion negativa drastica del receptor de Axl por el mAb 3E3-E8 (E)

Figura 9: Secuencia del hAxl-hFc y localizacion/secuencia del epftopo del mAb anti-Axl, 3E3-E8. El epftopo del anticuerpo anti-Axl, 3E3-E8, se identifico mediante ensayos de proteolisis limitada usando proteasas de Tripsina o de GluC y analisis de espectrometna de masas MALDI. La figura muestra la composicion del antfgeno (hAxl-hFc) usado en este experimento que esta compuesto por los aminoacidos 33 a 440 del dominio extracelular de Axl fusionado a la parte Fc de la IgG1 humana y etiqueta de histidina. En la secuencia se indica cada uno de los dominios de tipo inmunoglobulina y los dominios de fibronectina 3 de la protema Axl. El Mab 3E3-E8 se une a dos peptidos (epftopo conformacional) localizados en el primer y en el segundo dominios de fibronectina (en la secuencia de la protema, las secuencias estan en un recuadro y se detallan en la tabla).

Figura 10: Representacion de un modelo del ectodominio de Axl humano y localizacion del epftopo del anticuerpo monoclonal anti- Axl de raton, 3E3-E8 y dominio de union a Gas6. La Figura 10A presenta una representacion de tipo dibujo del modelo del dominio extracelular completo de Axl humano con los cuatro dominios marcados. En la figura 10B, se anadio un fragmento de los aminoacidos 305 a 315 de Gas6 como una lamina p gris claro, que ilustra el dominio de union a Gas6 en el dominio 1 de tipo inmunoglobulina de Axl. Finalmente, la figura 10C muestra el epftopo de 3E3-E8 en los dominios 1 y 2 de tipo fibronectina como superficies grises. En primer lugar, esto confirma que las dos partes del epftopo estan localizadas en la superficie externa de cada dominio. En segundo lugar, la figura 10C ilustra tambien que el sitio de interaccion de Gas6 y el epftopo estan situados alejados entre sf en el ectodominio de Axl humano.

Ejemplo:

Ejemplo 1: Generacion de anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton

Mediante inmunizacion secuencial de ratones Balb/c, se desarrollaron anticuerpos monoclonales contra Axl. Se

hiperinmunizaron ratones Balb/c con dominio extracelular de Axl humano (hAxlECD) fusionado al dominio Fc

humano (protema hAxl-hFc; R&D systems). A los ratones Balb/c se les inyecto por via subcutanea 10 pg de hAxl-

hFc soluble los dfas 0,14 y 28 en presencia de adyuvante de Freund completo (primera inyeccion) o incompleto

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(segunda y tercera inyeccion). Las celulas de bazo de los ratones se fusionaron con celulas de mieloma de raton (PX63. Ag8.653; ATCC, Rockville, MD) usando un protocolo descrito anteriormente (Salhi et al. Biochem. J. 2004). Las celulas se cultivaron en placas (105 por pocillo) con medio HAT para la seleccion del hibridoma. Despues de 12 dfas, se recogieron los sobrenadantes y la especificidad de union a Axl (hAxl-hFc o hFc solo) se exploro mediante ensayo inmunoabsorbente directo ligado a enzimas (ELISA). Ocho clones positivos, que presentaban la inmunounion mas alta despues de la segunda ronda de subclonacion por dilucion limitante, se expandieron para la produccion in vitro a gran escala de mAb. Los sobrenadantes acondicionados se purificaron mediante cromatograffa de afinidad de Protema G.

Ejemplo 2: Los anticuerpos monoclonales anti-AxI de raton no reaccionan de manera cruzada con Axl de raton o con otros miembros de la familia de receptores TAM humanos

Ejemplo 2.1: Los anticuerpos monoclonales anti-axl de raton no reaccionan de manera cruzada con Axl de raton o con otros miembros de la familia de receptores TAM humanos segun se determino mediante ELISA

Brevemente, placas revestidas con hAxl-hFc se saturaron con PBS de albumina de suero bovino (BSA) al 1 %, Tween 20 al 0,1 %(PBST).

Para el ensayo de reaccion cruzada, las placas revestidas se incubaron con Axl-Fc humano (h-Axl), Axl-Fc de raton (m-Axl) o Mer-Fc humano (h-Mer), Tyro-3-Fc (h-Tyro-3) durante 1 hora a 37 °C y se lavaron cuatro veces en PBST. Las placas se incubaron con los mAb anti-Axl (2 horas a 37 °C) y se lavaron cuatro veces en PBST. Las placas se incubaron con anti-IgG de raton (Sigma) conjugado con HRP a una dilucion de 1: 2000 en PBST, BSA al 1 % (1 hora a 37 °C). Finalmente, se anadio una solucion de orto-fenilendiamina (Sigma) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad y se midio la absorbancia a 450 nm.

Se demostro la especificidad contra h-Axl, de una manera espedfica de la dosis, de los diez mAb anti-hAxlECD seleccionados (Figura 1).

Ejemplo 2.2: El anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton se une especificamente a celulas que expresan Axl segun se determino mediante FACS

La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-Axl de raton de la invencion, para reconocer espedficamente celulas que expresan Axl, se determino mediante FACS usando tecnicas estandar. Brevemente, se recogieron celulas A549 (numero ATCC: CCL-185), se tineron con anticuerpos monoclonales anti-Axl de raton purificados de la invencion a 4 °C durante 1 hora, se lavaron tres veces en PBS-BSA al 0,1 %, y despues se tineron con anti-IgG de raton (1: 50) (Sigma) conjugado con fluorescema, a 4 °C en la oscuridad durante 45 min. Las muestras se analizaron en un citometro de flujo EPICS (Beckman-Coulter, Fullerton, CA). Tal como se muestra en la figura 2, los anticuerpos monoclonales anti-axl de raton de la invencion se unieron a celulas A549 que expresaban Axl espedficamente.

Ejemplo 2.3: Medicion de la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton evaluado mediante BIACore

Para la determinacion de la afinidad de union de los anticuerpos anti-Axl, se uso una medicion de resonancia de plasmon superficial con un instrumento BIAcore-3000 (BIACORE AB, Uppsala, Suecia). Los experimentos se llevaron a cabo en las instalaciones de la plataforma de Proteomic Imaging and Molecular Interactions (M. Pugniere) situada en el laboratorio. Para medir la afinidad entre los anticuerpos anti-Axl y el hAxl-hFc, se capturaron anticuerpos monoclonales anti-Axl de raton mediante microplacas biodetectoras CM5 revestidas con hAxl-hFc (usando un kit de acoplamiento de amina (BIAcore AB)). Para la medicion de los parametros cineticos, se inyectaron varias concentraciones de mAb anti-Axl (de 2 a 133 nM) en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, tampon de tensioactivo P20 al 0,005 % a 25 °C con un caudal de 50 pl/min. Los indices de asociacion (ka) y los indices de disociacion (kd) se calcularon usando un modelo de union Langmuir sencillo, individualizado (programa informatico BIAcore Evaluation version 3.2). La constante de disociacion de equilibrio (Kd) se calculo como la relacion ka/kd. Tal y como se indica (Figura 3A), El anticuerpo 3E3-E8 mostro una Kd de 1,6x10'9M.

Ejemplo 3: El anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton no bloquea la union de Gas6

Para un estudio de competicion, se inyecto una concentracion de saturacion de Gas6 (625 nM) en microplacas biodetectoras CM5 revestidas con hAxl-hFc (usando un kit de acoplamiento de amina (BIAcore AB)). El anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton (666 nM) se inyecto sin eliminar Gas6. Se llevo a cabo el mismo experimento inyectando en primer lugar el anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton (666 nM) y en segundo lugar Gas6 (625 nM). Los resultados mostraron que 3E3-E8 no competfa con el ligando Gas6 por la union con hAxlECD (Figura 3B).

Ejemplo 4: El anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton de la invencion inhibe la fosforilacion de Axl inducida por ligando in vitro

Se llevaron a cabo experimentos de ELISA para investigar si el anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton de la invencion tema la capacidad de bloquear la fosforilacion de Axl inducida por el ligando Gas6. En resumen, en un

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medio de crecimiento normal, se sembraron celulas BXPC3 (numero ATCC: CRL- 1687), Capan-1 (numero ATCC: HTB-79), PANC1 (numero ATCC: CRL-1469) y MIAPaCa-2 (numero ATCC: CRL- 1420) en placas de 6 pocillos de fondo plano. Al dfa siguiente, el medio de crecimiento se sustituyo por medio sin suero para privar a las celulas durante la noche durante 24 horas. La celulas se preincubaron con 100 pg/ml de anti-Axl monoclonal de raton purificado de la invencion, y despues se trataron con o sin Gas6 250 ng/ml incubado con Gas6 durante 30 min a 37 °C. A continuacion, el medio se elimino, las celulas se lisaron en 50 pl de tampon de lisis (Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCb 1,5 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 % (v/v), glicerol al 10 % (v/v), fluoruro de sodio 100 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM, ortovanadato sodico 1 mM (Sigma)) complementado con inhibidores de fosfatasas y proteasas (Roche Diagnostics, Meylan, Francia) durante 30 min. Se eliminaron los desechos celulares mediante centrifugacion y las concentraciones de protemas se determinaron mediante la reaccion colorimetrica de Bradford. El kit PathScan® Phospho-Axl (PanTyr) de ELISA de tipo sandwich (RD Systems, Minneapolis, MN) se uso segun describio el fabricante para la deteccion del nivel de fosfo-Axl midiendo la absorbancia a 450 nm en un ensayo colorimetrico.

Tal como se muestra en la figura 4, en todas las lmeas celulares de cancer pancreatico, el mAb 3E3-E8 inhibio fuertemente la fosforilacion de Axl inducida por ligando Gas6. Otros mAb no inhibieron o inhibieron ligeramente la fosforilacion de Axl inducida por ligando Gas6 en todas las lmeas celulares de cancer pancreatico.

Ejemplo 5: El anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton de la invencion inhibe la migracion celular

Se llevo a cabo un ensayo de cicatrizacion de heridas observando el proceso de cicatrizacion en el que las celulas en los bordes de la herida artificial migran hacia la zona de la herida. En placas de 24 pocillos, se cultivaron celulas A549 hasta la confluencia o casi la confluencia (>90 %). Se creo un campo de herida en el centro del pocillo usando una punta de pipeta esteril. Las celulas migratorias son capaces de extender protrusiones y finalmente de invadir y cerrar el campo de la herida. Las celulas se aclararon muy cuidadosamente con PBS y se incubaron con anticuerpos monoclonales anti-Axl de raton purificados de la invencion (100 pg/ml) con o sin 100 pg/ml de Gas6. El mdice de migracion celular se determino 24 horas despues del tratamiento usando formacion de imagenes microscopicas. Tal como se muestra en la figura 5, el mAb 3E3-E8 inhibio fuertemente la migracion celular ya que la zona de cicatrizacion era todavfa visible a diferencia de las celulas tratadas con mAb1 o Gas6.

Ejemplo 6: El anticuerpo monoclonal anti-Axl de raton de la invencion inhibe la proliferacion celular

Celulas de cancer pancreatico MIAPaca-2, Capan-1 y PANC1 se sembraron a 4000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con anticuerpos monoclonales anti-Axl de raton (25, 50 o 100 pg/ml) durante 5 dfas. Se realizaron ensayos de proliferacion de celular usando el ensayo de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio). El MTS se reduce por las celulas en un producto de formazan que es soluble en medio de cultivo tisular. La absorbancia del formazan a 490 nm se midio usando un espectrofotometro. Tal como se muestra en la figura 6, el mAb 3E3-E8 inhibio fuertemente la proliferacion de las celulas pancreaticas mientras que con el otro anticuerpo espedfico de Axl (mAb1) se observo una ligera inhibicion.

Ejemplo 7: El anticuerpo monoclonal anti-Axl humano de raton de la invencion regula negativamente la expresion de Axl e inhibe la ruta de akt

Para descifrar el mecanismo implicado en la inhibicion de la migracion celular y la fosforilacion de Axl por el mAb 3E3- E8, se analizaron su efecto directo sobre el receptor de Axl y las rutas de senalizacion corriente abajo (se ha informado que la activacion del receptor de Axl mediante el ligando Gas6 induce varias cascadas de senalizacion clave, en particular la ruta de AKT). La regulacion negativa del receptor de Axl y la fosforilacion del receptor de Axl y de Akt se analizaron mediante transferencia Western en una lmea celular de celulas de cancer pancreatico (celulas Panc-1) tratada con el mAb 3E3-E8.

Una lmea celular de cancer de pancreatico, celulas Panc-1, se colocaron en placas de 6 pocillos (1x106 celulas por pocillo) y se incubaron con 100 ug/ml de 3E3-E8 a 37 °C. Las lmeas celulares recogidas a diferentes puntos temporales se lisaron con tampon (NaCl 150 mM, TRIS 10 mM pH7,4, EDTA 1mM, TRITON X100 al 1 %) que contema fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM, fluoruro de sodio 100 mM, ortovanadato sodico 10 mM y un comprimido de mezcla completa de inhibidores de proteasas (Sigma, St Louis, MO). Despues de disolver en SDS-PAGE al 8 % o al 10 % en condiciones reductoras, las protemas se transfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA) que se saturaron despues en PBS que contema Tween 20 al 0,1 % y leche en polvo desnatada al 5 %. Las membranas se incubaron durante una noche a 4 °C con diluciones apropiadas de anti-AXL humano (R&D systems), anti-fosfo-Axl (Y702) o anti-fosfo-Akt (S473) de Cell Signaling Technology. Las inmunotransferencias se normalizaron usando un anticuerpo dirigido contra GAPDH (Millipore). Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rabano picante (Bio-Rad) y se procesaron para la deteccion de ECL (Amersham) y analisis con G: bOx iChemi (Syngene).

Cuando las celulas se trataron con el mAb 3E3-E8, la expresion de Axl disminuye rapidamente despues de 90 minutos y es casi indetectable despues de 24 horas (Figura 7A). Se observo una induccion de la cantidad de fosfo- Axl y fosfo-Akt cuando las celulas se estimularon con Gas6. Ambas senales se inhibieron drasticamente mediante

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pretratamiento con el mAb 3E3-E8 (Figura 7B).

Ejemplo 8: El anticuerpo monoclonal anti-AxI humano de raton de la invencion, reduce el crecimiento in vivo del cancer de mama triple negativo humano y del cancer pancreatico asociado a la regulacion negativa del receptor de axl

Todos los experimented in vivo se llevaron a cabo en conformidad con las directrices francesas para estudios experimental en animales (Acuerdo n.° C34-172-27). Se adquirieron ratones desnudos aftmicos hembra de seis semanas de vida de Harlan. En el costado derecho de los ratones desnudos aftmicos, se implantaron celulas de cancer de mama triple negativo (5 x 106; MDA-MB-231; numero ATCC: HTB-26) o celulas de carcinoma pancreatico (3,5 x 106, BXPC3; 5x106, MIAPaCa-2). Cuando los tumores alcanzaron un volumen aproximado de 100 mm3, los ratones portadores de tumores se asignaron al azar en distintos grupos de tratamiento. Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales con vehteulo (NaCl al 0,9 %) o solo con anticuerpos monoclonales anti-Axl de raton de la invencion a 300 pg/inyeccion (dos veces por semana durante 4 semanas consecutivas) o con gemcitabina (GEMZAR). Con un calibrador el volumen de los tumores se midio semanalmente. Los resultados para BXPC3 se expresaron tambien mediante una curva de supervivencia modificada de Kaplan-Meier, usando el tiempo que necesito el tumor hasta alcanzar un volumen predefinido de 2.000 mm3. Un retraso medio se definio como el tiempo en el que el 50 % de los ratones tuvieron un tumor que alcanzo el volumen de 2.000 mm3. El mAb anti-hAxl, 3E3-E8, pero no el mAbl, disminuyo el crecimiento tumoral de MDA-MB-231 y de los xenoinjertos pancreaticos (Figura 8A, B, C). Cuando los ratones se trataron con el anticuerpo 3E3-E8, la curva modificada de Kaplan-Meier demostro un retraso de 15 dfas hasta alcanzar el 50 % de supervivencia, cuando se comparo con la de los ratones tratados con NaCl (Figura 8D).

En otra serie de experimentos, se explantaron xenoinjertos de MIAPaca-2 tratados con el mAb 3E3-E8 o con el mAb de isotipo IgG1 murino irrelevante (Px), despues de dos inyecciones de tratamiento con mAb, y se usaron para la deteccion por transferencia Western de receptores de Axl (mAb anti-Axl, R&D systems) o protema de control GAPDH (anti-GAPDH, Millipore). El tratamiento con el mAb 3E3-E8 indujo una disminucion notable de la expresion de Axl en los tumores (Figura 8E).

Ejemplo 9: El epftopo del anticuerpo monoclonal anti-Axl humano de raton es un epftopo conformacional compuesto por 2 peptidos, uno localizado en el dominio 1 de la fibronectina 3 y otro en el dominio 2 de la fibronectina 3 de Axl humano

Para definir las estructuras del epftopo, se llevaron a cabo ensayos de proteolisis limitada de un complejo de anticuerpo/anrtgeno inmovilizado. Para mapear el epftopo de 3E3-E8, el hAxl-hFc se unio por afinidad al anticuerpo monoclonal 3E3-E8 inmovilizado en condiciones fisiologicas. Despues, se llevo a cabo una serie de escisiones enzimaticas proteolfticas (serina proteasa Tripsina y endoproteinasa GluC) para eliminar los restos de hAxl-Fc que estan desprotegidos por el 3E3-E8. Despues de la elucion, los restos protegidos, es decir, el epftopo de 3E3-E8, se identificaron basandose en sus pesos moleculares, segun se determino por el analisis MALDI-MS de los peptidos que se unieron por afinidad al anticuerpo inmovilizado.

El anticuerpo monoclonal 3E3-E8 (250 pg) se acoplo a ProMag Magnetics Microsphere PMC3N (Bangs Laboratories) durante 1 hora a temperatura ambiente de acuerdo con los procedimientos del proveedor. Se incubaron 50 pg de complejo de microperlas de 3E3-E8 con 50 pg del anrtgeno hAxl-hFc (R&D system) y se dejaron unirse durante 90 minutos a 4 °C. El anrtgeno libre se elimino mediante tres lavados con tampon. El complejo inmunitario de 3E3-E8 y hAxl-hFc se digirio a 37 °C con 0,35 pg de Tripsina o GluC durante 2h15. El sobrenadante se separo por centrifugacion (2000 g, 4 °C, 3 min) y se desecho. Las microperlas asociadas con los restos protegidos por 3E3-E8 y hAxl-hFc se lavaron tres veces con tampon. Se dejo proceder la disociacion durante 40 min a temperatura ambiente usando TFA (acido trifluoroacetico) al 0,1 %. Se obtuvieron espectros mediante espectrometrta de masas MALDI (ABSCIEX MALDI 4800 con un Laser Nd/YAG a 355 nm, 200 Hz, 20 kV para la fuente de tension, tiempo de extraccion de 250 ns) con la suma de 1500 disparos laser. La matriz usada para la muestra fue acido a- ciano-4-hidroxicinamico (CHCA) a 5 mg/ml. En la Figura 9 se muestra la composicion de la secuencia del anrtgeno hAxl-hFc (R&D system) y la secuencia del epftopo del anticuerpo 3E3-E8 identificado. El anticuerpo monoclonal 3E3-E8 de raton se une a un epftopo en conformacion 3D compuesto por 2 peptidos, uno posicionado en el dominio 1 de la fibronectina de tipo III (secuencia: "NLHLVSR") y otro posicionado en el dominio 2 de la fibronectina de tipo III (secuencia: "VLMDIGlRqEvTlE").

Ejemplo 10: El epftopo del anticuerpo monoclonal anti-Axl humano de raton se expone al area superficial del disolvente accesible y se localiza estructuralmente lejos del sitio de interaccion de gas6

El modelo del dominio extracelular de la protema Axl humana se construyo en 2 etapas. En primer lugar, los dominios de tipo inmunoglobulina (dominio 1 y 2) se extrajeron de la estructura cristalografica disponible en el Protein Data Bank (banco de datos de protemas) con el codigo 2C5D. Esta estructura representa un complejo de Axl/Gas6 en el que los dos dominios de tipo inmunoglobulina del ectodominio de Axl estan entrecruzados por el primer dominio de tipo laminina G de Gas6. Desafortunadamente, los dos dominios de Axl de fibronectina de tipo III (FN3) todavfa no se han cristalizado, y por lo tanto necesitaron ser modelizados. El modelo se construyo mediante

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modelado por homologfa usando como molde la estructura 3D de FN3 en tandem A77-A78 desde la cadena A de la protema titina humana (id. de PDB: 3LPW). Despues del alineamiento, las secuencias de las dos protemas comparten una identidad del 22,8 %. Finalmente, los dominios de tipo inmunoglobulina y los dominios de fibronectina de tipo III se enlazaron entre sf entre la leucina 224 y la prolina 225, modificando los angulos diedros para minimizar el impedimento esterico entre las cadenas laterales de los dos dominios.

El epftopo del anticuerpo anti-Axl de raton, 3E3-E8, asf como los dominios de union a Gas6 se identificaron despues en este modelo del ectodominio completo de Axl humano. Este modelo demuestra la localizacion espedfica de los dos sitios antigenicos localizados en la superficie reconocidos por 3E3-E8 en Axl (Figura 10). Este modelo demostro tambien que el epftopo de 3E3-E8, compuesto por los 2 peptidos (el primero en el dominio 1 de FN3 y el segundo en el dominio 2 de FN3 de Axl), esta localizado lejos del sitio de union al ligando (sitio de union a Gas6 que esta localizado en el dominio 1 de tipo IgG) de acuerdo con los estudios de competicion realizados (ejemplo 3; Figura 3B).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> INSERM ORIBASE PHARMA

<120> ANTICUERPOS ANTI-AXL Y USOS DE LOS MISMOS <130> BIO11082 ROBERT / MC <160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> cadena VH <400> 1

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Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Ser lie Thr Cys Ser Val 20

Ala Val His Trp Val Arg Gin Pro 35 40

Gly Val lie Trp Ala Gly Gly Ser 50 55

Ser Arg Leu Arg lie Ser Lys Asp 65 70

Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp 85

Arg Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Tyr 100

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115

Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 10 15

Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 45

Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 60

Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 75 80

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 90 95

Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110

<210>2 <211>5 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> H-CDR1 <400>2

Asn Tyr Ala Val His 1 5

<210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> H-CDR2 <400> 3

Val lie Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 15 10 15

<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

<220>

<223> H-CDR3 <400> 4

Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Tyr Pro Met Asp Tyr 15 10

<210> 5 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> cadena VL <400> 5

Asp lie Val Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Ser Val Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Arg lie 65 70 75 80

Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu lie Lys

100 105 110

<210>6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> L-CDR1 <400> 6

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210>7 <211>6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> L-CDR2 <400> 7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Arg Met Ser Asn Leu Ala 1 5

<210>8 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> L-CDR3 <400> 8

Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Trp Thr 1 5

<210> 9 <211>7 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> epttopo FN3D1 <400> 9

Asn Leu His Leu Val Ser Arg 1 5

<210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> epttopo FN3D2 <400> 10

Val Leu Met Asp lie Gly Leu Arg Gin Glu Val Thr Leu Glu 15 10

<210> 11 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> hAxl-hFc <400> 11

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad por Axl o un fragmento de union al antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2 en la region H-CDR1, SEQ ID NO: 3 en la region H-CDR2 y SEQ ID NO: 4 en la region H-CDR3; y una region variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 6 en la region L-CDR1, SEQ ID NO: 7 en la region L-CDR2 y SEQ ID NO: 8 en la region L-CDR3, en el que dicho anticuerpo se une al dominio extracelular de Axl en la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 10.
2. 2. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de union al antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la region variable de cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 1.
3. 3. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de union al antfgeno de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la region variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 5.
4. 4. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de union al antfgeno de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3, en el que la region variable de cadena pesada de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 1 y la region variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra como SEQ ID NO: 5.
5. 5. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 4 que es un anticuerpo quimerico, preferentemente un anticuerpo quimerico humano/de raton.
6. 6. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1 que es un anticuerpo humanizado.
7. 7. Un fragmento de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos.
8. 8. Una secuencia de acidos nucleicos que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal o su fragmento de union al antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9. Un vector que comprende un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 8.
10. 10. Una celula hospedadora que comprende un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 8 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 9.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo o su fragmento de union al antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. 12. El anticuerpo o su fragmento de union al antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como un farmaco.
13. 13. El anticuerpo o su fragmento de union al antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de enfermedades cancerosas asociadas con la sobreexpresion de Axl.
14. 14. El anticuerpo o su fragmento de union al antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el diagnostico de enfermedades cancerosas asociadas con la sobreexpresion de Axl.

    imagen1

    10

    rH

    imagen2

    (uiuost?) oa

    O

    Figura 1

    %de

    X

    (0

    imagen3

    imagen4

    Figura 2

    imagen5

    imagen6

    imagen7

    imagen8

    3BXPC3 SSCapan-1 Q PA NCI PMiaPaCa-2

    imagen9

    Figura 4

    imagen10

    Gas6

    mAbl

    3E3E8

    Figura 5

    CO

    cn

    imagen11

    HD 50 jig/ml ■ 100 Hg/ml

    mAbl

    imagen12

    T

    imagen13

    ED 50 JLig/ml

    100 jLtg/ml

    imagen14

    imagen15

    Capan-l

    PANC1

    imagen16

    imagen17

    imagen18

    imagen19

    ........ '

    .........'......... »

    Figura 8E

    GAPDH

    Composicion de hAxl-hFc

    Axl humano

    DIEGRMD IgGl humana etiaueta de 6 His

    (Gtu33-Pro440)

    (Prol00-Lys330)

    33

    EESPFVGN PGMITGARC-L TOTLRCQLQV QCIEP^EVHWL RDGCILELAL STQTQYPLGE DECDDWIWS QLRITSLQLS

    dominio 1 de tipo

    DTGQYCCLVF LGH.QT£'VSQP GYYGLEG1PY PLLEPEGRTV AANTPFKLSC QAOGPPEPVD GLWLQGAVP1 ATAPGHGPQR

    dominio 2 de tipo

    ST.HVPGT.NKT SSFSCFAHNA KGVTTSR^AT TTVTAQQRRN LHLVSF.QPTE LEVAWTPGLS GTYPLTHCTL QAVLSNDGMG

    dominio 1 de FNIII

    IQAGEPDPPE EPLTSQASVP PHQLRIGSLH PHTPYHIRVA CTSSQGPSSW THWLPVETPE GVPI GPPENI SATRNGSQAF

    VKWQF.PRA RL QGTU.GYKIiA VQGQ: j I PhjvTT Ml): G: .KQRVT LF|l,QGDGSV5 AI/rVGVAAY T AAGDGPL5I.P VPT.RAAR I > V K 44q dominio 2 de FNIII

    EPSTPAFSWP DTFGRYDPYS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV

    DGVEVHNAKT KPREEQYNSP YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT

    KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH FAT HNHYTQK

    SLSLSPGKHH HHHH

    Epftopo 3E3-E8

    NLHLVSR (FNIII-1: 230-23 6)

    VIA1DICLRQE,VTLF| (FNIII-2 : 373-392)

    Figura 9

    imagen20