ES2712805T3

ES2712805T3 - Productos farmacéuticos antiinflamatorios

Info

Publication number: ES2712805T3
Application number: ES12799815T
Authority: ES
Inventors: Angelo Consalvo; Nozer Mehta; Mauro Perretti; Jesmond Dalli
Original assignee: ResoTher Pharma AS
Current assignee: ResoTher Pharma AS
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: EP3533457B1; US10072055B2; WO2012174397A2; DK2720707T3; EP2720707B1; CN103764669A; BR112013032088B1; EP3533457A1; PL2720707T3; BR112013032088A2; AU2012271453A1; CA2839298A1; AU2012271453B2; JP6069663B2; EP2720707A2; US20150315256A1; US9102753B2; WO2012174397A3; JP2014519526A; EP2720707A4

Abstract

Un polipéptido que consiste en 47-50 aminoácidos, donde una región de 47 aminoácidos consecutivos tiene al menos un 90 % de identidad con los residuos 2-48 de SEQ ID NO: 1, donde el residuo del polipéptido correspondiente al residuo 25 de SEQ ID NO:1 no es valina.

Description

DESCRIPCION

Productos farmaceuticos antiinflamatorios

CAMPO

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a compuestos antiinflamatorios que tienen una homologfa estructural definida con la anexina 1 humana, a composiciones farmaceuticas de los mismos, y a tratamientos medicos y usos de estos compuestos y composiciones como agentes antiinflamatorios.

ANTECEDENTES

La superfamilia Anexina consiste en 13 protemas de union a fosfolfpidos de calcio con una homologfa biologica y estructural significativa. Las anexinas se dividen estructuralmente en un dominio central altamente conservado y un dominio N-terminal variable. La anexina 1 (ANXA1, 37 kDa) es una protema antiinflamatoria que inhibe la extravasacion de leucocitos polimorfonucleares (PMN) transportados en sangre en el tejido circundante. La protema se une al receptor FPR2 (o FPR-L1), donde inicia una cascada de eventos de senalizacion. Despues de un estfmulo inflamatorio, se produce la migracion de leucocitos polimorfonucleares (PMN) transportados en sangre en el tejido circundante. La transmigracion o extravasacion de PMN esta regulada por mediadores tales como moleculas de adhesion, citocinas y proteasas, que controlan los procesos proinflamatorios y antiinflamatorios. El potencial disruptivo de los PMN es alto y potencialmente autodanino. Por lo tanto, el control de la extravasacion de PMN y la respuesta inflamatoria es importante.

Para fines terapeuticos como agente antiinflamatorio, la protema anexina 1 completa tiene numerosas desventajas con respecto a los fragmentos funcionales o versiones modificadas de los mismos. El gran tamano de la protema hace que sea mas diffcil de administrar mediante tecnicas que son posibles con un polipeptido mas pequeno (por ejemplo, por via transdermica o transmucosa). Para su uso en el tratamiento de la inflamacion de los ojos, se espera que una molecula mas pequena penetre mejor en el epitelio corneal. Ademas, la susceptibilidad a la degradacion proteolftica es una preocupacion particular para todos los productos farmaceuticos peptfdicos, en especial los grandes y especialmente si se contempla la administracion oral (preferida por muchos pacientes).

Se ha demostrado que algunos derivados de anexina 1 que carecen de regiones significativas en el lado N-terminal del polipeptido carecen de actividad significativa en algunos ensayos de inflamacion y liberacion de mediadores, mientras que la N-acetil anexina 1 N-terminal de longitud completa (2-26) se considero biologicamente activa en varios sistemas. Se ha demostrado que varios peptidos derivados principalmente de la porcion N-terminal unica de la protema Anexina 1 poseen propiedades antiinflamatorias.

Uno de los peptidos de la anexina A1 estudiados mas ampliamente es el peptido Ac2-26, que imita los aminoacidos 2 a 26 de la region N-terminal de 54 aminoacidos. Al igual que el fragmento Ac1-188 (y la protema nativa), tiene una acetilacion N-terminal para aumentar su estabilidad y, posiblemente, su semivida. Se ha demostrado que la anexina 1 y su peptido N-terminal (Ac2-26) ejercen la mayor parte de su accion antiinflamatoria a traves del receptor FPR2/Lipoxina A4 (FPR2/Alx). In vivo, se ha demostrado que el peptido Ac2-26 ejerce un efecto antiinflamatorio en modelos de reperfusion de isquemia miocardica (I/R), I/R del mesenterio, peritonitis por glucogeno y bolsa de aire de IL1, donde se informo que redujo significativamente el reclutamiento de neutrofilos al sitio de la lesion/inflamacion. Las propiedades antiinflamatorias de este peptido no se limitan solo a los modelos agudos de inflamacion. En un modelo de artritis, se demostro que la administracion intraarticular del peptido Ac2-26 reduce la gravedad de la enfermedad a traves de una reduccion en el reclutamiento de neutrofilos.

Versiones mas cortas del peptido Ac2-26, tales como los peptidos Ac2-12 y Ac2-6, tambien se ha demostrado que provocan cierto grado de efectos antiinflamatorios en modelos agudos de inflamacion. El trabajo realizado por varios laboratorios ha demostrado que un peptido derivado de una region completamente independiente del extremo N-terminal de la protema Anexina A1, mas precisamente los aminoacidos 247-253 - en la tercera repeticion de la region central de la protema - denominada como antiflamina-2 (AF2), tambien posee propiedades antiinflamatorias. RESUMEN

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a productos farmaceuticos antiinflamatorios, y mas particularmente a polipeptidos, a composiciones farmaceuticas que comprenden los polipeptidos, y a metodos para tratar o prevenir la inflamacion. Los productos farmaceuticos antiinflamatorios de la presente descripcion tienen cualidades que incluyen, pero sin limitacion, buena eficacia antiinflamatoria, estabilidad y/o facilidad de administracion, como se detalla en el presente documento.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO:4.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO:5.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO:7.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO:8.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO:9.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 10.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO:11.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 13.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 14.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 15.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 16.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene 47-50 aminoacidos e incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que tiene al menos un 90 por ciento de identidad con los residuos 2-48 de la SEQ ID NO: 1, donde el residuo 24 del polipeptido corresponde al residuo 25 de la SEQ ID NO: 1, y donde el residuo 24 del polipeptido no es valina. En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa del polipeptido tiene al menos un 94 por ciento de identidad con los residuos 2 48 de la SEQ ID NO: 1. En una realizacion de la presente divulgacion, la region de homologfa del polipeptido es 100 % identica a los residuos 2-23 de la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene 25-26 aminoacidos e incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que tiene al menos un 90 por ciento de identidad con los residuos 2-26 de la SEQ ID NO: 1, donde el residuo 10 del polipeptido corresponde al residuo 11 de la SEQ ID NO: 1, donde el residuo 10 del polipeptido es cualquier aminoacido excepto alanina, y donde el residuo 21 del peptido es cualquier aminoacido excepto valina.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene 37-45 aminoacidos y que incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que es 100 % identica a los residuos 12-24 de la SEQ ID NO: 1, y 100 % identica a los residuos 26-48 de la SEQ ID NO:1, donde cualquier residuo 14 del polipeptido corresponde al residuo 25 de la SEQ ID NO: 1 y no es valina, o donde el residuo 21 del polipeptido corresponde al residuo 25 de la SEQ ID NO: 1 y no es valina.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene 47-50 aminoacidos y que incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que es 100 % identica a los residuos 2-48 de la SEQ ID NO: 1, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C-terminal.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene de 37 a 51 residuos de aminoacidos y que incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que es al menos un 90 % identica a la SeQ ID NO: 2, donde la region de homologfa del polipeptido tiene al menos una de las siguientes caractensticas: (a) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 1 de la SEQ ID NO: 2 no es alanina, (b) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 12 de la SEQ ID NO: 2 no es valina, (c) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 15 de la SEQ ID NO: 2 no es valina, o (d) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 26 de la SEQ ID NO: 2 no es valina.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene 47-48 aminoacidos y al menos un 90 % de identidad con los residuos 1-48 de la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene de 47 a 51 residuos de aminoacidos y que incluye dentro de su estructura molecular una region de 47 residuos de aminoacidos que es un 100 % identica a los residuos 2-48 de la anexina 1 humana.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene de 49 a 51 residuos de aminoacidos y que incluye dentro de su estructura molecular una region de 47 residuos de aminoacidos que es un 100 % identica a los residuos 2-48 de la anexina 1 humana.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene al menos un 96 % de identidad con la SEQ ID NO: 11, donde el resto 10 no es alanina o el resto 21 no es valina. En algunas realizaciones de la presente divulgacion, ni el residuo 10 es alanina ni tampoco el residuo 21 es valina.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 11, donde el resto 10 no es alanina o el resto 21 no es valina. En algunas realizaciones de la presente divulgacion, ni el residuo 10 es alanina ni tampoco el residuo 21 es valina.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, se proporciona un metodo para tratar o prevenir la inflamacion que comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento o prevencion una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido antiinflamatorio de la presente divulgacion.

De acuerdo con los aspectos descritos en el presente documento, un polipeptido de la presente divulgacion se puede usar en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de la inflamacion. En una realizacion de la presente divulgacion, el medicamento incluye uno o mas excipientes, diluyentes o vehfculos farmaceuticamente aceptables.

En una realizacion de la presente divulgacion, una composicion farmaceutica de la presente divulgacion incluye, pero sin limitacion, una composicion en forma de comprimido o capsula que comprende al menos un acido farmaceuticamente aceptable, donde el acido esta presente en el comprimido o capsula en una cantidad que, si el comprimido o la capsula se anadieran a 10 mililitros de una solucion acuosa 0,1 M de bicarbonato de sodio, sena suficiente para reducir el pH de la solucion a no mas de 5,5. Otras preferencias para las formas de dosificacion se exponen a continuacion.

Tanto el uso veterinario como humano se contemplan dentro del alcance de la presente descripcion. Se espera que las dosis analizadas en el presente documento sean las mismas para uso humano y veterinario, excepto que se puede realizar un ajuste proporcional en funcion del peso relativo del animal al que se administraran los productos farmaceuticos de la presente descripcion.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las realizaciones descritas actualmente se explicaran adicionalmente con referencia a los dibujos adjuntos, en los que las estructuras similares se mencionan con numeros similares en todas las diversas vistas. Los dibujos que se muestran no estan necesariamente a escala, sino que se hace hincapie, generalmente, en ilustrar los principios de las realizaciones descritas actualmente.

La Figura 1A y la Figura 1B muestran el analisis de Western blotting que compara la potencia de activacion de p ERK a traves del receptor FPR2 para cinco polipeptidos de la presente descripcion en relacion con Ac-ANAX1(2-26)-OH. La Figura 1A es una transferencia representativa para p-ERK y t-ERK. La Figura 1B muestra resultados de densitometna que relacionan p-ERK con los niveles de t-ERK.

Las Figuras 2A-2C son una serie de graficos que informan datos del analisis de la camara de flujo para determinar la capacidad inhibitoria de cinco polipeptidos de la presente descripcion y Ac-ANAX1(2-26)-OH para reducir la interaccion de PMN a una monocapa HUVEC activada. La Figura 2A muestra la cuantificacion del grado de interaccion PMN con las HUVEC como captura de PMN. La Figura 2B muestra la cuantificacion del grado de interaccion PMN con las HUVEC como adhesion de PMN. La Figura 2C muestra la cuantificacion del grado de interaccion PMN con las HUVEC como rodamiento.

La Figura 3A y la Figura 3B son una serie de graficos de barras que comparan los efectos antiinflamatorios de tres polipeptidos de la presente descripcion frente a un control solo de vefnculo. La Figura 3A muestra el recuento celular y la Figura 3^bmuestra los efectos cuando se tuvieron en cuenta las celulas GR1 ve.

Las Figuras 4A-4C son una serie de graficos de barras que informan el porcentaje de inhibicion proporcionado por tres polipeptidos de la presente descripcion, a diferentes concentraciones, en tres parametros diferentes (captura -Figura 4A; rodamiento - FIG. 4B; y adhesion - Figura 4C).

La Figura 5 es una serie de graficos de barras que informan la capacidad de tres polipeptidos de la presente descripcion, a diferentes concentraciones, para imitar una propiedad de la anexina A1 para inducir la fagocitosis de celulas apoptoticas.

La Figura 6 es una serie de graficos de barras que muestran la capacidad de un polipeptido de la presente descripcion, a diferentes concentraciones, para reducir el riesgo de lesion por reperfusion en relacion con un control solo de vefnculo.

La Figura 7 es una serie de graficos de barras que muestran la capacidad de dos polipeptidos de la presente descripcion, a diferentes concentraciones, para reducir el riesgo de lesion por reperfusion en relacion con un control solo de vefnculo.

La Figura 8 es un grafico logantmico de la degradacion a lo largo del tiempo de tres polipeptidos de la presente descripcion, UGP022 (SEQ ID NO:5), UGP025 (SEQ ID NO:7) y UGP026 (SEQ ID NO:8) en presencia de PR3, una proteasa implicada en la escision in vivo de la anexina 1.

La Figura 9 es un grafico logantmico de la degradacion a lo largo del tiempo de tres polipeptidos de la presente descripcion, UGP022 (SEQ ID NO:5), UGP025 (SEQ ID NO:7) y UGP026 (SEQ ID NO:8) en presencia de HNE, una proteasa implicada en la escision in vivo de la anexina 1.

DESCRIPCION DETALLADA

La invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realizacion que no este dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invencion.

En la lista de secuencias adjunta:

La SEQ ID NO: 1 son los primeros 50 aminoacidos de la anexina 1 humana.

La SEQ ID NO:2 son los aminoacidos 11-48 de la anexina 1 humana, modificados con variables que pueden ser cualquier aminoacido de origen natural en las posiciones 11, 22, 25 y 36 (con respecto a la anexina 1) que son equivalentes a las posiciones 1, 12, 15 y 26 de la SEQ ID NO:2.

La SEQ ID NO:3 es casi identica a la SEQ ID NO:2, diferenciandose solamente en que la SEQ ID NO:3 omite el primer residuo de la SEQ ID NO:2.

La SEQ ID NO:4 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, UGP021. UGP021 tiene 50 aminoacidos de longitud. UGP021 es los aminoacidos 2-50 de la anexina 1 humana, donde la posicion 50 del polipeptido es glicina. En una realizacion de la presente descripcion, UGP021 se denomina ANXA1(2-50) Gly51-OH. La SEQ ID NO:5 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, UGP022. UGP022 tiene 49 aminoacidos de longitud. UGP022 es los aminoacidos 2-50 de la anexina 1 humana, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C. En una realizacion de la presente descripcion, UGP022 se denomina ANXA1(2-50)-NH2. La SEQ ID NO:6 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, UGP024. UGP024 tiene 49 aminoacidos de longitud. UGP024 es los aminoacidos 2-50 de la anexina 1 humana. En una realizacion de la presente descripcion, UGP024 se denomina ANXA1(2-50)-OH.

SEQ ID NO:7 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, UGP025. UGP025 tiene 47 aminoacidos de longitud. UGP025 es los aminoacidos 2-48 de la anexina 1 humana, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C, y donde el residuo 24 del polipeptido es leucina en lugar del correspondiente residuo 25 de SEQ ID NO:1 que es valina. En una realizacion de la presente descripcion, UGP025 se denomina Leu25-ANXA1(2-48)-NH2.

La SEQ ID NO:8 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, UGP026. UGP026 tiene 49 aminoacidos de longitud. UGP026 es los aminoacidos 2-50 de la anexina 1 humana, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C, y donde el residuo 24 del polipeptido es leucina en lugar del correspondiente residuo 25 de SEQ ID NO:1 que es valina. En una realizacion de la presente descripcion, UGP026 se denomina Leu25-ANXA1(2-50)-NH2.

La SEQ ID NO:9 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, UGP027. UGP027 tiene 44 aminoacidos de longitud. UGP027 es los aminoacidos 5-48 de la anexina 1 humana, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C, y donde el residuo 21 del polipeptido es leucina en lugar del correspondiente residuo 25 de SEQ ID NO:1 que es valina. En una realizacion de la presente descripcion, UGP027 se denomina Leu25-ANXA1(5-48)-NH2.

La SEQ ID NO:10 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, UGP028. UGP028 tiene 37 aminoacidos de longitud. UGP028 es los aminoacidos 12-48 de la anexina 1 humana, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C, y donde el residuo 14 del polipeptido es leucina en lugar del correspondiente residuo 25 de SEQ ID NO:1 que es valina. En una realizacion de la presente descripcion, UGP028 se denomina Leu25-ANXA1(12-48)-NH2.

La SEQ ID NO:11 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion. La SEQ ID NO: 11 tiene 25 aminoacidos de longitud. La SEQ ID NO: 11 es los aminoacidos 2-26 de la anexina 1 humana, modificados con variables que pueden ser cualquier aminoacido de origen natural en el residuo 10 y 21 del polipeptido (que son equivalentes a las posiciones 11 y 22 de SEQ ID NO:1).

La SEQ ID NO:12 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, Pep57. Pep57 tiene 25 aminoacidos de longitud. Pep57 es los aminoacidos 2-26 de la anexina 1 humana, donde el residuo 10 del polipeptido es leucina en lugar del correspondiente residuo 11 de SEQ ID NO:1 que es alanina, donde el residuo 21 del polipeptido es leucina en lugar del correspondiente residuo 22 de SEQ ID NO:1 que es valina, y donde el residuo 1 del polipeptido esta acilado. En una realizacion de la presente descripcion, Pep57 se denomina Leu11,22-Ac-ANAX1(2-26)-OH.

La SEQ ID NO:13 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, Pep59. Pep59 tiene 25 aminoacidos de longitud. Pep59 es los aminoacidos 2-26 de la anexina 1 humana, donde el residuo 10 del polipeptido es acido aspartico en lugar del correspondiente residuo 11 de SEQ ID NO: 1 que es alanina, donde el residuo 21 del polipeptido es acido aspartico en lugar del correspondiente residuo 22 de SEQ ID NO:1 que es valina, y donde el residuo 1 del polipeptido esta acilado. En una realizacion de la presente descripcion, Pep59 se denomina Asp11,22-Ac-ANAX1(2-26)-OH.

La SEQ ID NO:14 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, Pep84. Pep84 tiene 25 aminoacidos de longitud. Pep84 es los aminoacidos 2-26 de la anexina 1 humana, donde el residuo 10 del polipeptido es metionina en lugar del correspondiente residuo 11 de SEQ ID NO:1 que es alanina, donde el residuo 21 del polipeptido es metionina en lugar del correspondiente residuo 22 de SEQ ID NO:1 que es valina, y donde el residuo 1 del polipeptido esta acilado. En una realizacion de la presente descripcion, Pep84 se denomina Met11,22-Ac-ANAX1(2-26)-OH.

La SEQ ID NO:15 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, Pep60. Pep60 tiene 25 aminoacidos de longitud. Pep60 es los aminoacidos 2-26 de la anexina 1 humana, donde el residuo 10 del polipeptido es acido glutamico en lugar del correspondiente residuo 11 de SEQ ID NO:1 que es alanina, donde el residuo 21 del polipeptido es acido glutamico en lugar del correspondiente residuo 22 de SEQ ID NO:1 que es valina, y donde el residuo 1 del polipeptido esta acilado. En una realizacion de la presente descripcion, Pep60 se denomina Glu11,22-Ac-ANAX1(2-26)-OH.

La SEQ ID NO:16 es una realizacion de un polipeptido de la presente descripcion, Pep83. Pep83 tiene 25 aminoacidos de longitud. Pep83 es los aminoacidos 2-26 de la anexina 1 humana, donde el residuo 10 del polipeptido es isoleucina en lugar del correspondiente residuo 11 de SEQ ID NO:1 que es alanina, donde el residuo 21 del polipeptido es isoleucina en lugar del correspondiente residuo 22 de SEQ ID NO:1 que es valina, y donde el residuo 1 del polipeptido esta acilado. En una realizacion de la presente descripcion, Pep83 se denomina Ile11,22-Ac-ANAX1(2-26)-OH.

Excepto cuando se indique otra cosa, o sea evidente a partir del contexto, las dosis en el presente documento se refieren al peso de los compuestos activos no afectados por excipientes, diluyentes, vetnculos u otros ingredientes farmaceuticos, aunque dichos ingredientes adicionales se incluyen deseablemente, como se analiza con mas detalle a continuacion. Cualquier forma de dosificacion (capsula, comprimido, inyeccion o similares) comunmente utilizada en la industria farmaceutica para la administracion de agentes activos peptfdicos es apropiada para su uso en el presente documento, y los terminos "excipiente", "diluyente" o "vetnculo" incluyen dichos principios no activos como se incluyen tfpicamente, junto con los principios activos en dicha forma de dosificacion en la industria. Una forma de dosificacion oral se analiza mas detalladamente a continuacion, pero no debe considerarse el modo exclusivo de administrar los agentes activos de la presente descripcion. En algunas realizaciones de la presente descripcion, puede utilizarse una mezcla de dos o mas de los agentes activos polipeptfdicos de la presente descripcion en la misma composicion farmaceutica o forma de dosificacion.

Como se usa en el presente documento, el termino "polipeptido" se refiere a un poKmero de aminoacidos y no se limita a una longitud espedfica de la molecula. El termino incluye peptidos, oligopeptidos y protemas. El termino "polipeptido" tambien incluye modificaciones del polipeptido, por ejemplo, amidaciones, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, ciclaciones y similares. Dentro de la definicion se incluyen, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), polipeptidos con enlaces sustituidos, asf como otras modificaciones conocidas en la tecnica, ambas de origen natural y sinteticas. El polipeptido puede producirse mediante cualquier smtesis de polipeptidos conocida en la tecnica, incluyendo, pero sin limitacion, smtesis qmmica o mediante tecnicas de ADN recombinante.

Como se usa en el presente documento, el termino "porcentaje de identidad" se refiere a la secuencia de aminoacidos sin tener en cuenta si un aminoacido dado esta modificado con un sustituyente adicional (distinto de un aminoacido adicional). Por ejemplo, la cistema se considera identica a la acetilcistema para este fin. Asimismo, para este fin, una cistema que ha formado un puente disulfuro con otra cistema se considerana identica a una cistema que no ha formado tal puente. Como apreciaran los expertos en la tecnica, los peptidos que tienen una pluralidad de residuos de cistema frecuentemente forman un puente disulfuro entre dos de tales residuos de cistema. Todos estos peptidos expuestos en el presente documento se definen como incluyendo opcionalmente uno o mas de dichos puentes disulfuro. Como se usa en el presente documento, el termino "Porcentaje de identidad" tambien contempla diferencias en el tamano del peptido. Por ejemplo, un peptido de 34 residuos que por lo demas es identico a un peptido de 33 residuos (a excepcion de su aminoacido adicional) se considera en el presente documento como un 97 % identico al peptido de 33 residuos.

Como se usa en el presente documento, la referencia a "inflamacion" o "respuesta/enfermedad inflamatoria" se refiere a cualquier respuesta o enfermedad inflamatoria, que incluye, pero sin limitacion, inflamacion del ojo, gota, artritis gotosa, artritis reumatoide, asma, lesion o dano por reperfusion, ictus, infarto de miocardio, choque septico, o un trastorno inflamatorio de la piel, tal como psoriasis o eccema.

Cualquier preferencia indicada en el presente documento puede usarse en combinacion con cualquier otra preferencia indicada en el presente documento, excepto cuando se desprenda de un contexto que podna producirse una inconsistencia.

Los solicitantes han descubierto algunas ventajas significativas en analogos mas largos con homologfa sustancial con los residuos 2-48 o 2-50 de la anexina 1 humana, especialmente polipeptidos que tienen de 37-51 residuos e incluyen una region de homologfa sustancial con los residuos 11-48 de la anexina 1 humana, especialmente una region de homologfa sustancial con la SEQ ID NO: 2.

En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa del polipeptido de la presente descripcion correspondiente con la SEQ ID NO:2 tiene al menos una (y en algunas realizaciones de la presente descripcion, mas) de las siguientes caractensticas: (a) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 1 de SEQ ID NO: 2 es arginina, (b) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 12 de SEQ ID NO: 2 es lisina, (c) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 15 de SEQ ID NO: 2 es leucina, o (d) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 26 de SEQ ID NO: 2 es lisina. En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa es al menos un 94 % identica a la SEQ ID NO: 2, y en algunas realizaciones de la presente descripcion, un 100 % identica.

En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa del polipeptido correspondiente a la SEQ ID NO:2 difiere de la SEQ ID NO:2 en que el polipeptido correspondiente al residuo 15 de la SEQ ID NO:2 no es valina, y en algunas realizaciones de la presente descripcion es leucina.

En una realizacion de la presente descripcion, cuando un polipeptido de la presente descripcion tiene 47-48 aminoacidos y al menos un 90 % de identidad con los residuos 1-48 de SEQ ID NO:1, el polipeptido tiene al menos una (y en algunas realizaciones de la presente descripcion, mas) de las siguientes caractensticas: (a) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 11 de SEQ ID NO:1 no es alanina (y en algunas realizaciones de la presente descripcion es arginina), (b) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 22 de SEQ ID NO:1 no es valina (y en algunas realizaciones de la presente descripcion es lisina), (c) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 25 de SEQ ID NO:1 no es valina (y en algunas realizaciones de la presente descripcion es leucina), o (d) el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 36 de SEQ ID NO:1 no es valina (y en algunas realizaciones de la presente descripcion es lisina).

Aunque los peptidos de la presente descripcion pueden existir en forma de acido libre, en algunos polipeptidos de la presente descripcion, el aminoacido C-terminal esta amidado. En una realizacion de la presente descripcion, dicha amidacion contribuye a la eficacia y/o biodisponibilidad del peptido. En una realizacion de la presente descripcion, un polipeptido amidado C-terminal de la presente descripcion, tal como la SEQ ID NO: 5, muestra mejores resultados in vitro que con un precursor de acido libre, tal como la SEQ ID NO: 4. Sin la intencion de quedar ligado a la teona, es posible que dichos polipeptidos sean mas estables porque el grupo amida confiere cierta resistencia a la accion de las carboxipeptidasas.

Los peptidos de la presente descripcion se pueden acetilar en el extremo N, especialmente con respecto a los analogos de la Anexina 1 (2-26), tal como el polipeptido de la SEQ ID NO:11. En una realizacion de la presente descripcion, los residuos 10 y 21 de la SEQ ID NO:l1 se seleccionan independientemente de acido aspartico, lisina, metionina, leucina, isoleucina y acido glutamico. En una realizacion de la presente descripcion, los residuos 10 y 21 de la SEQ ID NO:11 se seleccionan independientemente de leucina, acido aspartico, metionina, isoleucina y acido glutamico. En una realizacion de la presente descripcion, los residuos 10 y 21 de la SEQ ID NO:11 se seleccionan independientemente de leucina, acido aspartico y metionina. En una realizacion de la presente descripcion, los aminoacidos en las posiciones 10 y 21 de la SEQ ID NO: 11 son identicos.

Como se describe en el presente documento, el peptido UGP021 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 4) y el peptido UGP024 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 6) se encuentra que son mas potentes que Ac-ANXA1(2-26)-OH y ANXA1 de longitud completa. Estos peptidos, UGP021 y UGP024, han sido evaluados por su capacidad para inhibir las interacciones neutrofilo-endotelio usando un ensayo de camara de flujo y se han ensayado in vivo utilizando un modelo de inflamacion de bolsa de aire del raton. Inesperadamente, se encontro que el peptido UGP022 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 5) (amida C-terminal) es mas potente que el peptido UGP021 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 4) o el peptido UGP024 (SEQ ID NO: 6) de la presente descripcion en estos ensayos.

En un intento por mejorar la potencia y aumentar la semivida del peptido UGP022 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 5), se realizo una serie de digestiones in vitro de PR3 y HNE. Los principales sitios de escision para ambas serinas proteasas escindieron el peptido UGP022 de la presente descripcion en Ala 10 (Ala11 con relacion a la Anexina 1) y Val 21 (Va122 con relacion a la Anexina 1), sin embargo, Val 35 (Val36 con relacion a la Anexina 1) solo se escindio por HNE. Inesperadamente, ambas proteasas escindieron el peptido UGP022 de la presente descripcion en Val 24 (Val25 en relacion con la Anexina 1). Este sitio de escision no se cree que haya sido identificado en la bibliograffa.

Se prepararon dos analogos de Leu24 (Leu25 en relacion con la anexina 1), el peptido UGP025 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 7) y el peptido UGP026 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 8). Se demostro que ambos peptidos, UGP025 y UGP026, eran mas resistentes a PR3 y HNE que el peptido UGP022 de la presente descripcion (SEQ ID NO: 5).

Las pruebas de degradacion de tres polipeptidos de la presente descripcion, UGP022 (SEQ ID NO:5), UGP025 (SeQ ID NO:7) y UGP026 (SEQ ID NO:8) en presencia de PR3, una proteasa implicada en la escision in vivo de anexina 1, indico una mejor estabilidad para los polipeptidos con sustitucion de leucina en la posicion 24 con respecto a un polipeptido que carece de esa caractenstica. La posicion 24 corresponde a la posicion 25 de la anexina 1 porque todos los polipeptidos ensayados carecen de metionina en la posicion 1 de la anexina natural. Un polipeptido de 47 residuos supero a un polipeptido de 49 residuos por lo demas identico. Se obtuvieron resultados similares en pruebas de degradacion en presencia de HNE.

De las variantes peptfdicas Ac2-26 probadas, se observo que tres peptidos de la presente descripcion conducen a una senalizacion corriente abajo a traves de la familia de receptores FPR, concretamente, el peptido Pep57 de la presente descripcion, el peptido Pep59 de la presente descripcion y el peptido Pep84 de la presente descripcion. Se demostro que Pep57 y Pep84 inhibieron significativamente las interacciones PMN-HUVEC en el modelo de camara de flujo con una actividad de hasta 10 pM. Cuando se probaron in vivo, en el modelo de bolsa de aire, ambos peptidos mostraron propiedades antiinflamatorias al inhibir significativamente la infiltracion de leucocitos, inhibiendo Pep84 esta lectura inflamatoria en mayor medida.

Los experimentos cuyos resultados se indican en la Figura 1A y la Figura 1B se dirigio a determinar cual de los cinco polipeptidos probados activo mejor p-ERK a traves del receptor FPR2, similar a Ac-ANAX1(2-26)-OH, el peptido parental. Las celulas HEK-FPR2 se incubaron juntamente con 10 pM de los nuevos peptidos Ac2-26 durante 8 minutos, despues de lo cual las celulas se lisaron y se resuspendieron en una solucion de lisis celular. Despues, se cargaron 100 ng de protema total en gel de poliacrilamida al 10%. Despues de la electroforesis, la transferencia y el bloqueo, la membrana se sondo primero con un anticuerpo anti p-ERK y luego se separo y resondo con un anticuerpo anti-ERK total. Mientras que la transferencia de t-ERK muestra cantidades iguales de ERK en todas las muestras, se observo que p-ERK activado era mayor con Pep57, 59 y 84, similar a la activacion causada por el Ac2-26 precursor y menor que el segundo control, el peptido W. La Figura 1A es una transferencia representativa para p-ERK y t-ERK y la Figura 1B muestra resultados de densitometna que relacionan p-ERK con los niveles de t-ERK. Los datos presentados como media y SEM de 3 experimentos distintos con ANOVA unidireccional se emplearon para el analisis estadfstico (* = P <0,05 frente a CT).

Las Figuras 2A-2C son una serie de graficos que informan datos del analisis de la camara de flujo para determinar la capacidad inhibitoria de cinco polipeptidos de la presente descripcion y Ac-ANAX1(2-26)-OH para reducir la interaccion de PMN a una monocapa HUVEC activada. Los PMN (5 x 106) se incubaron con 10 pM de los diversos peptidos durante 10 minutos a 37 °C. Los PMN se hicieron fluir despues durante 8 minutos a 1 dina/cm2, antes de cuantificar el grado de interaccion de PMN con las HUVEC, ambas como captura de PMN (Figura 2A), adhesion (Figura 2B) y rodamiento (Figura 2C). Los resultados resaltan el hecho de que solo Pep57, 60 y 84 muestran propiedades inhibitorias en este ensayo. Los datos son la media ± SEM de 3 experimentos independientes (con distintas preparaciones de PMN y HUVEC); * = P <0,05 frente al grupo de CT, datos analizados utilizando ANOVA unidireccional. Pep57 y Pep84 mostraron propiedades inhibitorias similares a las observadas en el peptido Ac2-26 precursor, en lmea con los datos de p-ERK. Pep59, que tambien mostro un potencial de activacion de p-ERK muy alto, no mostro ninguna propiedad inhibitoria en este ensayo, mientras que, por otro lado, Pep60, que no fue tan eficaz para fosforilar ERK, mostro propiedades inhibitorias potentes similares a las mostradas por el peptido Ac2-26 precursor.

La Figura 3A y la Figura 3B son una serie de graficos de barras que comparan los efectos antiinflamatorios de tres polipeptidos de la presente descripcion frente a un control solo de vetnculo. Los ratones recibieron 200 pl i.v. de solucion salina DMSO o una dosis de 50 pg por animal de uno de los tres peptidos derivados de Ac2-26, inmediatamente antes de la inyeccion local de IL-1p de raton en bolsas de aire de 6 dfas. La extension de la migracion celular se determino 4 h mas tarde, despues del lavado de bolsas de aire y la tincion de las celulas migradas con el marcador Gr1. Cuando se contaron las celulas (Figura 3A), se observo que Pep57 y 84 mostraban propiedades antiinflamatorias, y Pep57 perdio este efecto observado cuando se tuvieron en cuenta las celulas GR1 ve (Figura 3B). Los datos son la media ± SEM de 5 ratones por grupo. *P<0,05 frente al grupo de vehfculo (ANOVA unidireccional). Pep57 y Pep84 mostraron potencial inhibitorio en el modelo. Pep84 era el mas potente.

Las Figuras 4A-4C hacen una comparacion directa de las actividades de UGP022, UGP025 y UGP026 en el ensayo de camara de flujo, presentando el grado de inhibicion en los tres parametros bajo analisis (captura (Figura 4A); rodamiento (Figura 4^b) y adhesion (Figura 4C)). Los tres peptidos UGP son capaces de reducir el numero de PMN humanos que interactuan con un endotelio activado, actuando espedficamente a traves del receptor FPR2. Aunque UGP025 es menos activo en las concentraciones mas altas probadas, parece ser ligeramente mas activo en la concentracion de 100 fM en comparacion con el peptido UGP022.

En los ultimos anos, se han atribuido importantes propiedades de resolucion de problemas a la Anexina A1, concretamente, la induccion de fagocitosis de celulas apoptoticas por macrofagos y celulas por igual. Este efecto tambien depende de FPR2 y se comparte con otros mediadores importantes a favor de la resolucion, incluidas las lipoxinas y las resolvinas. Se realizaron experimentos para determinar si UGP022 y los derivados podnan imitar tambien este efecto de la Anexina A1, en vista de la potencia mostrada en una diversidad de ensayos biologicos.

La Figura 5 es una serie de graficos de barras que informan la capacidad de tres polipeptidos de la presente descripcion, a diferentes concentraciones, para imitar una propiedad de la anexina A1 para inducir la fagocitosis de celulas apoptoticas. Se puede observar en la Figura 5 que los tres peptidos (UGP022, UGP025 y UGP026) promovieron la fagocitosis de la PMN apoptotica, mostrando UGP022 la mayor capacidad para inducir este proceso. Con respecto a algunos de los peptidos N-terminales mas largos de la Anexina A1 (por ejemplo, 49 y 47 polipeptidos de residuos), cada uno de UGP021, UGP022 y UGP024 podna activar tanto FPR1 como FPR2, lo que conduce a la fosforilacion de ERK y flujos de calcio intracelular. Se observo que tanto UGP021 como UGP022 posefan afinidad de union al FPR2 en el rango nanomolar, mostrando UGP022 mostrando la afinidad mas alta. Tambien se observo que los tres peptidos poseen actividades antiinflamatorias en un ensayo in vivo de reclutamiento de leucocitos, siendo UGP022, de nuevo, los mas potentes para inhibir el reclutamiento de leucocitos en la bolsa de aire inflamada.

El UGP022 ejercio propiedades antiinflamatorias en PMN humano con una significancia de hasta 1 pM. Se observo que FPR2 mediaba estos efectos de UGP022 en PMN humano. In vivo, UGP022 provoco potentes propiedades antiinflamatorias en la microcirculacion inflamada con una potencia equivalente a la anexina A1 recombinante humana. Estos efectos fueron mediados por el ortologo murino de FPR2. UGP022 presenta potentes propiedades protectoras de tejido en un modelo de raton de lesion miocardica aguda.

UGP025 y UGP026 retienen una mayor afinidad por FPR2 sobre FPR1. UGP25 parece tener una mayor afinidad con FPR2 que UGP026. UGP025 y UGP026 poseen propiedades antiinflamatorias tanto in vitro como in vivo y, de nuevo, UGP025 parece ser mas potente. Se descubrio una propiedad novedosa para estos peptidos, que es el efecto de resolucion favorable sobre la eferocitosis (fagocitosis de celulas apoptoticas). Tal efecto de pro-resolucion de UGP022, UGP025 y UGP026 se produce de una manera dependiente de Fpr2. En lmea con el breve perfil biologico de UGP025 y UGP026, ambos peptidos pueden retener las propiedades protectoras tisulares de UGP022, lo que brinda proteccion cardiaca.

La Figura 6 es una serie de graficos de barras que muestran la capacidad de un polipeptido de la presente descripcion, a diferentes concentraciones, para reducir el riesgo de lesion por reperfusion en relacion con un control solo de vehnculo. Tamano del infarto en ratones C57/Bl6 (~30 g de peso corporal) despues de 25 minutos de isquemia (oclusion de la arteria coronaria descendente anterior izquierda; [LADCA]) y 120 minutos de reperfusion. Se administraron i.v. vefnculo o UGP022 (mas de 5 segundos en bolo) al comienzo de la reperfusion. El area en riesgo se midio despues de la re-oclusion e inyeccion de colorante azul de Evans. El tamano del infarto se determino despues de la tincion NBT del area en riesgo. Los resultados son la media ± SEM de 4 ratones por grupo; ** P <0,01 La Figura 7 es una serie de graficos de barras que muestran la capacidad de dos polipeptidos de la presente descripcion, a diferentes concentraciones, para reducir el riesgo de lesion por reperfusion en relacion con un control solo de vefnculo. Tamano del infarto en ratones C57/Bl6 (~30 g de peso corporal) despues de 25 minutos de isquemia (oclusion LADCA) y 120 minutos de reperfusion. Se administraron i.v. vefnculo, UGP025 (5 |jg) o UGP026 (5 jg ) (mas de 5 segundos en bolo) al comienzo de la reperfusion. El area en riesgo se midio despues de la reoclusion e inyeccion de colorante azul de Evans. El tamano del infarto se determino despues de la tincion NBT del area en riesgo. Los resultados son la media ± SEM de 4 ratones por grupo; ** P <0,01

La Figura 8 es un grafico logantmico de la degradacion a lo largo del tiempo de tres polipeptidos de la presente descripcion, UGP022, UGP025 y UGP026 en presencia de PR3, una proteasa implicada en la escision in vivo de la anexina 1. Se observo una mejor estabilidad para los polipeptidos con sustitucion de leucina en la posicion 24 (correspondiente a la posicion 25 de la anexina 1 porque todos los polipeptidos ensayados carecen de metionina en la posicion 1 de la anexina natural) en relacion con un polipeptido que carece de esa caractenstica. Ademas, un polipeptido de 47 residuos amidado en su extremo C supero a un polipeptido de 49 residuos por lo demas identico amidado en su extremo C.

La Figura 9 es un grafico logantmico de la degradacion a lo largo del tiempo de tres polipeptidos de la presente descripcion, UGP022, UGP025 y UGP026 en presencia de HNE, una proteasa implicada en la escision in vivo de la anexina 1. Se observo una mejor estabilidad para los polipeptidos con sustitucion de leucina en la posicion 24 (correspondiente a la posicion 25 de la anexina 1 porque todos los polipeptidos ensayados carecen de metionina en la posicion 1 de la anexina natural) en relacion con un polipeptido que carece de esa caractenstica. Ademas, un polipeptido de 47 residuos amidado en su extremo C supero a un polipeptido de 49 residuos por lo demas identico amidado en su extremo C.

Se cree que la produccion recombinante de peptidos de la presente descripcion es mas rentable que otras tecnicas conocidas en la tecnica, aunque tambien se pueden usar estas otras tecnicas. Preferiblemente, los peptidos de la presente descripcion estan amidados en su extremo C, aunque tambien se contemplan formas de acido libre. Una tecnica para fabricar versiones amidadas de los peptidos de la presente descripcion es hacer reaccionar precursores (que tienen glicina en lugar del grupo amino C-terminal del producto amidado deseado) en presencia de monooxigenasa de alfa-amidacion de peptidilglicina de acuerdo con tecnicas conocidas donde los precursores se convierten en productos amidados en las reacciones descritas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 4.708.934 y las Publicaciones de Patente Europea N.° 0 308 067 y 0 382 403. Se prefiere la produccion recombinante tanto para el precursor como para la enzima que cataliza la conversion del precursor de la calcitonina de salmon. Dicha produccion recombinante se analiza en Biotechnology, Vol. 11 (1993) pags. 64-70, que describe adicionalmente una conversion de un precursor en un producto amidado. La produccion de productos amidados tambien se puede lograr utilizando el proceso y la enzima de amidacion que se expone por Consalvo et al. en la Patente de Estados Unidos N.° 7.445.911; Miller et al. en la Publicacion de Patente de Estados Unidos N.° 2006/0292672; Ray et al, 2002, Protein Expression and Purification, 26:249-259 ("Ray"); y Mehta, 2004, Biopharm. International, July, pags. 44-46 ("Mehta").

La produccion de los peptidos amidados de la presente descripcion puede proceder, por ejemplo, produciendo un precursor extendido de glicina en E. coli como una protema de fusion soluble con glutation-S-transferasa, o por expresion directa del precursor de acuerdo con la tecnica descrita en la Patente de Estados Unidos N.° 6.103.495. Dicho precursor extendido de glicina tiene una estructura molecular que es identica al producto amidado deseado, excepto en el extremo C (donde el producto termina en -X-NH², mientras que el precursor termina en -X-gly, siendo X el residuo de aminoacido C-terminal del producto). Una enzima de alfa-amidacion descrita en las publicaciones anteriores cataliza la conversion de precursores en producto. Esa enzima se produce de manera recombinante, por ejemplo, en celulas de ovario de hamster chino (CHO), como se describe en los artfculos de Biotechnology and Biopharm. citados anteriormente.

Las formas de acido libre de los agentes peptfdicos activos de la presente descripcion se pueden producir de manera similar, excepto sin incluir una glicina C-terminal en el "precursor", cuyo precursor es, en cambio, el producto peptfdico final y no requiere la etapa de amidacion.

La siguiente descripcion proporciona una realizacion de un metodo de clonacion y expresion de peptidos ANXA1 y analogos de la presente descripcion. Los peptidos ANXA1 y los analogos de la presente descripcion se disenaron para la clonacion y expresion utilizando vectores para la expresion extracelular en E. coli. Los genes disenados se sintetizaron por DNA 2.0 (Menlo Park, CA) utilizando su algoritmo de optimizacion de codones, seguido de modificaciones de aminoacidos individuales mediante PCR en las construcciones senaladas. El diseno del vector para estas construcciones se baso en el vector presentado en Ray, de modo que el gen de interes esta codificado en casetes dobles con cada casete compuesto por promotores duales y una secuencia de senal que precede al gen de interes, y secuencias de terminacion de la transcripcion dual despues de gen de interes.

La construccion de plasmido digenico de cada analogo se uso para transformar la cepa huesped de E. coli patentada por los solicitantes, BLM6L, que tiene el Numero de acceso PTA-5500, dando como resultado cepas de expresion para cada construccion de gen analogo. Estas lmeas celulares recombinantes se cribaron para determinar la resistencia a la kanamicina y el crecimiento a 37 °C en un medio de inoculacion semi-definido, como se describe en Ray; las construcciones de plasmidos se confirmaron con el mapeo de enzimas de restriccion de diagnostico, y los aislados finales se seleccionaron en experimentos en matraz de agitacion para la produccion extracelular del peptido de interes, utilizando un ensayo de AEX-HPLC, descrito en otra parte. Los aislados seleccionados se evaluaron adicionalmente en fermentaciones a escala de banco. Cada fermentacion se realizo como una realizacion en lote de alimentacion limitado por el sustrato, con la induccion de la protema recombinante obtenida utilizando el inductor qmmico, IPTG, que se incorporo a la alimentacion. La fermentacion se ejecuto en condiciones estandar de 32 °C, pH 6,6 y oxfgeno disuelto al 80 % mediante la complementacion con O²en medio como se describe en Ray. Estas fermentaciones se analizaron y, en algunos casos, se recolectaron entre 23 y 31 horas despues de la induccion. Para la purificacion, se acidifico y enfrio la fermentacion; el medio acondicionado se recogio mediante centrifugacion para su procesamiento posterior.

En una realizacion de la presente descripcion, los peptidos recombinantes se purificaron a partir de 1 l de medio de fermentacion acondicionado. Cada peptido se precipito del medio acondicionado por acidificacion a aproximadamente pH 2 con H²SO⁴2 N. Los sedimentos se recogieron por centrifugacion durante 1 hora a 10.000 rpm. Los sedimentos se resuspendieron en NaH2PO4 25 mM a pH 7,8 durante una noche a 2-8 °C. Las resuspensiones se centrifugaron durante 30 minutos a 10.000 rpm. El pH del sobrenadante se ajusto a 8,5 con NaOH 2 N. Cada sobrenadante de pH ajustado se cargo en una columna de intercambio de aniones Q-Sepharose Big Beads (GE Healthcare) (4,4 x 13,5 cm) equilibrada con TRIS 25 mM pH 8,5. La columna se opero a un caudal de 30 ml/min, y se controlo la absorbancia UV del efluente de la columna a 280 nm. Los peptidos ANXA1 se eluyeron de la columna con TRIS 25 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5. Las fracciones recogidas se seleccionaron mediante AEX-HPLC y RP-HPLC.

La a-amidacion C-terminal (si se requiere) se realizo utilizando monooxigenasa de alfa-amidacion de peptidilglicina recombinante (rPAM). La a-amidacion de los peptidos ANXA1 extendidos con glicina se realizo a 0,5 mg/ml en presencia de TRIS 25 mM a pH 7,0 (JT Baker), CuSO40,5 pM (JT Baker), etanol al 1 %, 125 U/ml de catalasa de aspergius niger (Enzimas BBI), ascorbato 3 mM y 20.000 U/ml de rPAM. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 2-3 horas. Las reacciones se terminaron por congelacion instantanea.

Los resultados de la a-amidacion se cargaron en una columna Amberchrom CG300 (Dow Chemical) RP (1,1 x 13,7 cm) equilibrada con TFA al 0,1 %, MeCN al 2 %. La columna se opero a un caudal de 2,85 ml/min, y se controlo la absorbancia UV del efluente de la columna a 280 nm. La columna se sometio a un gradiente escalonado con TFA al 0,1 %, MeCN al 16 % y TFA al 0,1 %, MeCN al 24 % para eliminar las impurezas. Los peptidos ANXA1 se eluyeron de la columna con TFA al 0,1 %, MeCN al 40 %. Las fracciones recogidas se cribaron mediante AEX-HPLC y RP-HPLC.

Los peptidos ANAX1 se liofilizaron a sequedad utilizando una VirTis Freeze Mobile Consol 1.5 (Gardiner, NY) equipada con un controlador de vado y un condensador externo de hielo seco/acetona. La pureza final de los peptidos ANXA1 fue >95 % evaluada por AEX/RP-HPLC.

La productividad de la pureza y la fermentacion (tttulo) de los peptidos ANAX1 se determinaron mediante AEX-HPLC. La cromatograffa se realizo en una columna Hydrocell QA1500 (BioChrom Labs), 4,6 x 250 mm equilibrada con TRIS 10 mM, MeCN al 25 %, pH 8,0. La separacion se logro utilizando un gradiente lineal del 0 % de A (TRIS 10 mM, MeCN al 25 % pH 8,0) al 20 % de B (TRIS 10 mM, NaCl 0,5 M, MeCN al 25 % pH 8,0) durante 20 minutos. La columna se opero a temperatura ambiente a un caudal de 1,2 ml/min. La absorbancia UV del efluente de la columna se controlo a 220 nm. Los valores de productividad se determinaron basandose en la curva estandar para cada peptido.

La pureza de los peptidos ANAX1 se determino mediante RP-HPLC. La cromatograffa se realizo en una columna Thermo Electron BDS Hypersil C18 (Thermo Fisher Scientific), 4,6 x 250 mm, 5 pm, 120 A equilibrada con TFA al 0,1 %, MeCN al 18 %. La separacion se logro utilizando un gradiente lineal del 20 % de B al 70 % de B (fase movil A: 0,1 % de TFA; fase movil B: 0,08 % de TFA, 90 % de MeCN) durante 20 minutos. La columna se opero a temperatura ambiente a un caudal de 1,2 ml/min. La absorbancia UV del efluente de la columna se controlo a 220 nm.

Se estima que los peptidos de la presente descripcion deben administrarse a una dosis adecuada para mantener los niveles sericos del peptido en pacientes entre 0,1 y 100 nanogramos por mililitro, preferiblemente entre 5 y 50 nanogramos por mililitro. Los niveles sericos pueden medirse mediante tecnicas de radioinmunoensayo conocidas en la tecnica. El medico tratante puede controlar la respuesta del paciente, y despues puede alterar en cierta medida la dosis para dar cuenta del metabolismo y la respuesta del paciente individual.

Los compuestos usados en la presente descripcion se preparan preferiblemente para su uso como productos farmaceuticos. Los polipeptidos pueden administrarse por cualquier via adecuada comunmente utilizada en la industria farmaceutica, incluyendo, pero sin limitacion, la administracion oral, parenteral, intramuscular, transdermica o transmucosa. Las infusiones IV tambien pueden utilizarse en algunas realizaciones de la presente descripcion. Las gotas oculares se pueden utilizar en tratamientos oculares. En algunas realizaciones de la presente descripcion, los polipeptidos pueden administrarse junto con otros agentes antiinflamatorios.

Aunque se pueden usar otros metodos de administracion, un peptido de la presente descripcion puede formularse para administracion oral, por ejemplo, como se expone en la Patente de Estados Unidos N.° 6.086.018, o la Publicacion de Patente de Estados Unidos N.° 2009/0317462. Una forma de dosificacion oral de acuerdo con la presente descripcion se expone (a modo de ejemplo y no de limitacion) en la Tabla 1 a continuacion:

TABLA 1

Mientras que el peptido de la SEQ ID NO: 7 se proporciona como ejemplo, cualquier agente activo peptidico, analizado en el presente documento puede estar sustituido como agente activo. Una combinacion de dos o mas de estos agentes tambien puede estar sustituida.

Un comprimido de la presente descripcion comprende un polipeptido de la presente descripcion y al menos un acido farmaceuticamente aceptable en el que el acido esta presente en el comprimido en una cantidad que, si el comprimido se anadiera a 10 mililitros de una solucion acuosa 0,1 M de bicarbonato de sodio, sena suficiente para reducir el pH de la solucion a no mas de 5,5. Preferiblemente, el acido comprende partfculas de acido que estan recubiertas con un revestimiento protector farmaceuticamente aceptable que no es acido y tiene una solubilidad en agua de al menos un gramo por 100 mililitros de agua a temperatura ambiente. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la superficie exterior del comprimido es un vehfculo protector resistente a los acidos eficaz para transportar el comprimido a traves del estomago de un paciente mientras se evita el contacto entre el polipeptido activo y las proteasas estomacales (por ejemplo, un recubrimiento enterico farmaceutico comun). Se prefiere que dicho comprimido tenga una capa de barrera soluble en agua que separe el acido revestido del vetuculo protector. Donde este presente, la capa de barrera soluble en agua (a) anade al menos un 3 % al peso de la composicion farmaceutica, excluyendo cualquier vetuculo protector de acido, y/o (b) comprende un material que tiene una solubilidad en agua de mas de 11 gramos por 100 mililitros de agua a temperatura ambiente. Preferiblemente, el agente peptfdico y el acido estan en la misma o unica capa de la composicion. La experiencia previa con la administracion oral de peptidos de la tecnica anterior sugiere que la administracion oral como se describe en el presente documento podna proporcionar hasta un 1-5 por ciento de biodisponibilidad.

La administracion puede ser por una dosis diaria unica o por dosis multiples. Independientemente del agente activo que se administre, se prefiere que se utilice una forma de dosificacion unica (por ejemplo, una sola capsula o comprimido cuando se utiliza la administracion oral) en cada administracion porque una sola capsula o comprimido proporciona mejor una liberacion simultanea del agente activo peptfdico, acido (usado como inhibidor de proteasa) y potenciadores de la absorcion. Esto es altamente deseable porque el acido es capaz de reducir mejor el ataque proteolftico indeseable en el agente activo peptfdico cuando el acido se libera en un momento cercano a la liberacion del agente activo.

La liberacion casi simultanea se logra mejor administrando todos los componentes de la descripcion como una sola pfldora o capsula. Sin embargo, la descripcion tambien incluye, por ejemplo, dividir la cantidad requerida del principio activo entre dos o mas comprimidos o capsulas que pueden administrarse juntas de manera que juntas proporcionen la cantidad necesaria de todos los ingredientes. La "composicion farmaceutica", como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitacion, una dosis completa apropiada para una administracion particular a un paciente, independientemente de si se recomiendan uno o mas comprimidos o capsulas (u otras formas de dosificacion) en una administracion determinada.

Los peptidos de acuerdo con la presente descripcion tambien pueden administrarse mediante otras tecnicas comunes en la industria con variaciones de dosificacion normales entre modos de administracion. Por ejemplo, es probable que un intervalo de dosis entre 1 y 100 microgramos al dfa (preferiblemente entre 5 y 50 microgramos al dfa) sea adecuado cuando se administra por inyeccion. Naturalmente, el medico tratante debe controlar la respuesta individual del paciente y ajustar la dosis en consecuencia.

En una composicion farmaceutica para inyeccion, el agente activo peptfdico de la presente descripcion esta presente preferiblemente en una concentracion entre 10 microgramos/mililitro y 1000 microgramos por mililitro.

Las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion pueden incluir excipientes, diluyentes o vehfculos farmaceuticos tfpicos, tales como agua, solucion salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, o como alternativa, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH, y similares, pueden estar presentes en dichos vetnculos. Otros ejemplos no limitantes de excipientes incluyen, pero sin limitacion, excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como PBS 0,1 M (pH 7,4), NaHCO30,2 M u otros fluidos farmaceuticamente aceptables. Las composiciones se pueden preparar como inyectables, como soluciones lfquidas o suspensiones. Tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para solucion o suspension en vetnculos lfquidos antes de la inyeccion. La preparacion tambien puede emulsionarse o encapsularse, por ejemplo, en liposomas.

Las composiciones utilizadas como productos farmaceuticos comprenden una cantidad eficaz del compuesto, asf como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, segun sea necesario. Por "cantidad eficaz" se entiende que la administracion de esa cantidad a un individuo ya sea en una dosis unica o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevencion de la inflamacion. Esta cantidad vana dependiendo de la salud, la edad y la condicion ffsica del individuo a tratar, el grupo taxonomico del individuo a tratar (por ejemplo, primates no humanos, primates, etc.) y otros factores comunes que afectan la evaluacion del medico tratante de los requisitos de dosificacion.

En una realizacion de la presente descripcion, un polipeptido de la presente descripcion tiene 47-50 aminoacidos e incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que tiene al menos un 90 % de identidad con los residuos 2-48 de la SEQ ID NO: 1, donde el residuo 24 del polipeptido corresponde al residuo 25 de la SEQ ID NO: 1, y donde el residuo 24 del polipeptido no es valina.

En una realizacion de la presente descripcion, un polipeptido de la presente descripcion tiene 25-26 aminoacidos e incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que tiene al menos un 90 % de identidad con los residuos 2-26 de la SEQ ID NO: 1, donde el residuo 10 del polipeptido corresponde al residuo 11 de la SEQ ID NO: 1, donde el residuo 10 del polipeptido es cualquier aminoacido excepto alanina, y donde el residuo 21 del peptido es cualquier aminoacido excepto valina.

En una realizacion de la presente descripcion, un polipeptido de la presente descripcion tiene 37-45 aminoacidos e incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que es un 100 % identica a los residuos 12-24 de la ^sE^qID NO: 1, y un 100 % identica a los residuos 26-48 de la SEQ ID NO:1, donde cualquier residuo 14 del polipeptido corresponde al residuo 25 de la SEQ ID NO: 1 y no es valina, o donde el residuo 21 del polipeptido corresponde al residuo 25 de la SEQ ID NO: 1 y no es valina.

En una realizacion de la presente descripcion, un polipeptido de la presente descripcion tiene 47-50 aminoacidos e incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que es un 100 % identica a los residuos 2-48 de la s Eq ID NO: 1, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C-terminal.

En una realizacion de la presente descripcion, un polipeptido de la presente divulgacion tiene de 37 a 51 residuos de aminoacido e incluye dentro de su estructura molecular una region de homologfa que es al menos un 90 % identica a la SEQ ID NO: 2, donde la region de homologfa del polipeptido tiene al menos una de las siguientes caractensticas: (a) el residuo 10 del polipeptido correspondiente al residuo 1 de SEQ ID NO: 2 no es alanina, (b) el residuo 21 del polipeptido correspondiente al residuo 12 de SEQ ID NO: 2 no es valina, (c) el residuo 24 del polipeptido correspondiente al residuo 15 de SEQ ID NO: 2 no es valina o (d) el residuo 35 del polipeptido correspondiente al residuo 26 de SEQ ID NO: 2 no es valina. En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa del polipeptido tiene al menos dos de las siguientes caractensticas: (a) el residuo 10 del polipeptido correspondiente al residuo 1 de SEQ ID NO: 2 no es alanina, (b) el residuo 21 del polipeptido correspondiente al residuo 12 de SEQ ID NO: 2 no es valina, (c) el residuo 24 del polipeptido correspondiente al residuo 15 de SEQ ID NO: 2 no es valina o (d) el residuo 35 del polipeptido correspondiente al residuo 26 de SEQ ID NO: 2 no es valina. En una realizacion, la region de homologfa del polipeptido tiene al menos tres de las siguientes caractensticas: (a) el residuo 10 del polipeptido correspondiente al residuo 1 de SEQ ID NO: 2 no es alanina, (b) el residuo 21 del polipeptido correspondiente al residuo 12 de SEQ ID NO: 2 no es valina, (c) el residuo 24 del polipeptido correspondiente al residuo 15 de SEQ ID NO: 2 no es valina o (d) el residuo 35 del polipeptido correspondiente al residuo 26 de SEQ ID NO: 2 no es valina. En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa del polipeptido tiene cada una de las siguientes caractensticas: (a) el residuo 10 del polipeptido correspondiente al residuo 1 de SEQ ID NO: 2 no es alanina, (b) el residuo 21 del polipeptido correspondiente al residuo 12 de SEQ ID NO: 2 no es valina, (c) el residuo 24 del polipeptido correspondiente al residuo 15 de SEQ ID NO: 2 no es valina y (d) el residuo 35 del polipeptido correspondiente al residuo 26 de SEQ ID NO: 2 no es valina. En una realizacion de la presente descripcion, el residuo 24 del polipeptido correspondiente al residuo 15 de SEQ ID NO: 2 no es valina. En una realizacion de la presente descripcion, el residuo 24 del polipeptido correspondiente al residuo 15 de SEQ ID NO: 2 es leucina. En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa del polipeptido es al menos un 94 % identica a la SEQ ID NO: 2. En una realizacion de la presente descripcion, la region de homologfa del

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipeptido que consiste en 47-50 aminoacidos, donde una region de 47 aminoacidos consecutivos tiene al menos un 90 % de identidad con los residuos 2-48 de SEQ ID NO: 1, donde el residuo del polipeptido correspondiente al residuo 25 de SEQ ID NO:1 no es valina.

2. El polipeptido de la reivindicacion 1, donde dicho residuo es leucina.

3. El polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el polipeptido esta amidado en su extremo C.

4. El polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipeptido se selecciona de una de la SEQ ID NO: 7, o la SEQ ID NO: 8.

5. El polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el residuo 1 esta acetilado.

6. El polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende ademas metionina situada antes del residuo 1.

7. Una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. El polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en un metodo para tratar o prevenir la inflamacion que comprende administrar a un paciente que necesita tal tratamiento o prevencion una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido.