ES2714365T3

ES2714365T3 - Composiciones acelulares de matriz tisular para reparación de tejidos

Info

Publication number: ES2714365T3
Application number: ES15197130T
Authority: ES
Inventors: Rick T Owens; Wendell Sun
Original assignee: LifeCell Corp
Current assignee: LifeCell Corp
Priority date: 2007-07-10
Filing date: 2008-07-09
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2028-07-09
Also published as: ZA201000943B; CA2693613C; DK3473260T3; EP3011962B1; EP2162142B1; AU2008275072B2; US20100272782A1; WO2009009620A3; ES2563071T3; US10406260B2; AU2008275072A1; EP2162142A2; US20160317707A1; EP3473260A1; EP3473260B1; JP2010533042A; EP2162142A4; EP3011962A1; CA2693613A1; ES2840251T3

Abstract

Un método de producción de una composición de malla biocompatible, comprendiendo el método: a) incubar una pluralidad de fragmentos de una matriz dérmica de tejido acelular (ATM) en una solución ácida para crear una suspensión homogénea de fragmentos de ATM hinchados, en el que la solución ácida tiene un pH menor que 3,0 y no produce desnaturalización irreversible sustancial de las fibras de colágeno en la ATM, en el que comprende un tejido dérmico del que se han eliminado todas, o prácticamente todas, las células viables; b) aplicar la suspensión homogénea a un sustrato de malla biocompatible sintética para crear un sustrato de malla recubierto; y c) secar el sustrato de malla biocompatible sintética seco para formar una composición sintética recubierta.

Description

DESCRIPCION

Composiciones acelulares de matriz tisular para reparacion de tejidos

Campo tecnico

Esta invencion se refiere al diseno genetico de tejidos, y mas particularmente a un material que puede ser implantado en, o injertado en, sujetos vertebrados para reparacion o mejora de tejidos defectuosos o deteriorados.

Antecedentes

Los organismos multicelulares, con inclusion de los mairnferos, estan constituidos por tejidos, es decir, agregados organizados de grupos de celulas especializados de forma y funcion similares. En muchos tipos de tejidos, las celulas estan rodeadas tambien por una matriz extracelular (ECM), una mezcla compleja de carbohidratos y protemas que proporciona soporte y anclaje para las celulas. Cuando los tejidos se deterioran, debe tener lugar de manera oportuna una serie ordenada de eventos fisiologicos para que se produzca una regeneracion satisfactoria del tejido. Los primeros eventos, denominados como la fase inflamatoria, incluyen coagulacion de la sangre asf como la llegada al sitio de la herida de celulas que eliminan bacterias, residuos y tejido deteriorado. Mas tarde, citoblastos circulantes migran al sitio de la lesion y se diferencian en tipos de celulas espedficos de tejido. Por ultimo, las celulas diferenciadas comienzan a producir y depositar ECM nueva.

La reparacion con exito del tejido defectuoso o deteriorado depende en parte de proporcionar condiciones que permitan la regeneracion celular apropiada y que minimicen la probabilidad de infeccion durante el proceso de reparacion.

El documento US 2003/225355 divulga un material compuesto poroso que comprende una malla de polipropileno que esta cubierta por ambas caras por una matriz dermica de tejido acelular o con un coprecipitado criodesecado de una dispersion de colageno bovino en acido acetico y condroitina-6-sulfato. La malla esta prevista para su uso en la reparacion de heridas, por ejemplo, defectos o hernias abdominales.

Sumario

Los inventores han descubierto que fragmentos de una matriz dermica de tejido acelular (ATM), hinchada en una solucion acida, puede secarse para producir una composicion biocompatible de reparacion de tejidos. En realizaciones preferidas, la suspension de ATM en solucion acida se calienta a temperaturas moderadamente elevadas antes del secado. Tales composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden proporcionar un medio de reparacion de tejidos multiples defectuosos o deteriorados al tiempo que minimizan la promocion de adhesiones o infeccion.

Mas espedficamente, se proporciona un metodo de produccion de una composicion de malla biocompatible de acuerdo con la reivindicacion independiente 1. El metodo incluye: a) incubar una pluralidad de fragmentos de una matriz dermica de tejido acelular (ATM) en una solucion acida para crear una suspension homogenea de fragmentos de ATM hinchados, en el que la solucion acida tiene un pH menor que 3,0 y no produce una desnaturalizacion irreversible sustancial de fibras de colageno en la ATM; en el que la ATM comprende un tejido dermico del que se han eliminado todas, o practicamente todas, las celulas viables; b) aplicar la suspension homogenea a un sustrato de malla sintetica biocompatible para crear un sustrato de malla sintetica recubierto; y c) secar el sustrato de malla sintetica biocompatible recubierto para formar una composicion de malla sintetica biocompatible. Los pasos (a) y (b) pueden realizarse simultaneamente.

La ATM incluye la dermis de la que se han eliminado todas, o practicamente todas, las celulas viables. La ATM puede estar hecha de tejido humano o tejido de marnffero no humano. El mam^era no humano puede ser un cerdo. En un aspecto, el mam^era no humano puede estar disenado geneticamente de modo que carezca de la expresion de restos de a-1,3-galactosilo. El mam^era no humano puede carecer de un gen de a-1,3-galactosiltransferasa funcional. Los fragmentos de ATM pueden ser partfculas de ATM.

El pH de la solucion acida puede ser inferior a aproximadamente 3,0. El pH puede ser de aproximadamente 1,0 a 3,0, de aproximadamente 2,0 a 3,0 o de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5. El pH puede ser aproximadamente 1,4. En otro aspecto, la solucion acida puede ser una solucion que comprende un acido seleccionado del grupo constituido por acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido carbonico, acido dtrico, acido clorddrico, acido lactico, acido tanico, acido fosforico, y acido sulfurico. La solucion acida puede incluir acido acetico 0,1 M. La solucion acida puede incluir acido clorddrico 0,04 M.

En un aspecto, la etapa de incubacion puede realizarse durante un periodo de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 12 horas. La etapa de incubacion puede tener lugar durante un periodo de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 horas, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 5 horas. La etapa de incubacion puede tener lugar durante un periodo de aproximadamente 3 horas.

En un aspecto, la incubacion, el secado, o la incubacion y el secado pueden realizarse a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 42°C. La temperatura puede ser de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C, de aproximadamente 25°C a aproximadamente 35°C, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C, o de aproximadamente 37°C a aproximadamente 42°C. La temperatura puede ser aproximadamente 37°C. La temperatura puede ser aproximadamente 25°C.

En un aspecto, el sustrato de malla puede ser sustancialmente no absorbible. En otro aspecto, el sustrato de malla puede ser absorbible. La malla absorbible puede ser un polfmero seleccionado del grupo constituido por polihidroxialcanoato, acido poliglicolico, acido poli-1-lactico, acido polilactico/poliglicolico (PLGA), poliglactina 910 y carboximetilcelulosa.

El polfmero puede incluir poli-4-hidroxibutirato. El sustrato de malla es un sustrato sintetico; el sustrato sintetico puede incluir polipropileno.

En otro aspecto, el secado puede incluir secado en una atmosfera de nitrogeno o liofilizacion.

En otro aspecto, el metodo de produccion de una composicion de malla biocompatible puede incluir: a) incubar una pluralidad de fragmentos de una matriz dermica acelular de porcino durante aproximadamente 3 horas a una temperatura de aproximadamente 37°C en una solucion de acido acetico 0,1 M para crear una suspension homogenea de fragmentos hinchados, en el que la solucion acida tiene un pH de aproximadamente 2,6 y no produce desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibras de colageno en la matriz dermica acelular de porcino; b) aplicar la suspension homogenea a un sustrato de malla de polipropileno biocompatible para crear un sustrato de malla recubierto; y c) secar el sustrato recubierto en una atmosfera de nitrogeno para formar una composicion de malla.

En otra realizacion, la invencion proporciona una composicion de malla biocompatible producida por a) incubacion de una pluralidad de fragmentos de una ATM dermica en una solucion acida para crear una suspension homogenea de fragmentos de ATM hinchados, en donde la solucion acida tiene un pH menor que 3,0 y no causa desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibras de colageno en la ATM; b) aplicar la suspension homogenea a un sustrato de malla biocompatible para crear un sustrato de malla recubierto; y c) secar el sustrato recubierto para formar una composicion de malla. Los pasos (a) y (b) pueden realizarse simultaneamente.

La ATM es, o incluye, la dermis de la que se han eliminado todas, o practicamente todas, las celulas viables. La ATM puede estar hecha de tejido humano o tejido de mairnfero no humano. El mairnfero no humano puede ser un cerdo. En algunas realizaciones, el mairnfero no humano puede estar disenado geneticamente de tal modo que carezca de restos de a-galactosilo. El mairnfero no humano puede carecer de un gen de a-1,3-galactosiltransferasa funcional. Los fragmentos de ATM pueden ser partfculas de a Tm .

El pH de la solucion acida puede ser inferior a aproximadamente 3,0. El pH puede ser de aproximadamente 1,0 a menos de 3,0, de aproximadamente 2,0 a menos de 3,0 o de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5. El pH puede ser aproximadamente 1,4. En otro aspecto, la solucion acida puede ser una solucion que comprende un acido seleccionado del grupo constituido por acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido carbonico, acido dtrico, acido clorhndrico, acido lactico, acido tanico, acido fosforico, y acido sulfurico. La solucion acida puede incluir acido acetico 0,1 M. La solucion acida puede incluir acido clorhndrico 0,04 M.

En un aspecto, la etapa de incubacion puede realizarse durante un periodo de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 12 horas. La etapa de incubacion puede tener una duracion de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 horas. La etapa de incubacion puede tener una duracion de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6 horas o de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 5 horas. La etapa de incubacion puede tener lugar durante un periodo de aproximadamente 3 horas.

En un aspecto, la incubacion, el secado, o la incubacion y el secado pueden efectuarse a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 42°C. La temperatura puede ser de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C, de aproximadamente 25°C a aproximadamente 35°C, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C, o de aproximadamente 37°C a aproximadamente 42°C. La temperatura puede ser aproximadamente 37°C. La temperatura puede ser aproximadamente 25°C.

En un aspecto, el sustrato de malla puede ser sustancialmente no absorbible. En otro aspecto, el sustrato de malla puede ser absorbible. La malla absorbible puede ser un polfmero seleccionado del grupo constituido por polihidroxialcanoato, acido poliglicolico, acido poli-1-lactico, acido polilactico/poliglicolico (PLGA), poliglactina 910 y carboximetilcelulosa. El polfmero puede incluir poli-4-hidroxibutirato. El sustrato de malla es un sustrato sintetico; el sustrato sintetico puede incluir polipropileno.

En otra realizacion, se proporciona una composicion de malla biocompatible. La composicion incluye un sustrato de malla recubierto, en el que el recubrimiento del sustrato de maya incluye una suspension de ATM dermica seca. En un aspecto, la composicion incluye una suspension de ATM que incluye una pluralidad de fragmentos de una matriz dermica de tejido acelular (ATM) hinchados en una solucion acida, en el que la solucion acida tiene un pH menor que 3,0 y no produce una desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibras de colageno de la ATM, y en el que los fragmentos de ATM se incuban a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 42°C.

El pH de la solucion acida es inferior a aproximadamente 3,0. El pH puede ser de aproximadamente 1,0 a menos de 3,0. aproximadamente 2,0 a menos de 3,0 o de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5. El pH puede ser aproximadamente 1,4. En otro aspecto, la solucion acida puede ser una solucion que comprende un acido seleccionado del grupo constituido por acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido carbonico, acido cftrico, acido clorhndrico, acido lactico, acido tanico, acido fosforico, y acido sulfurico. La solucion acida puede incluir acido acetico 0,1 M. La solucion acida puede incluir acido clorhndrico 0,04 M.

En un aspecto, la etapa de incubacion puede realizarse durante un periodo de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 12 horas. La etapa de incubacion puede tener una duracion de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 horas. La etapa de incubacion puede tener una duracion de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6 horas o de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 5 horas. La etapa de incubacion puede tener una duracion de aproximadamente 3 horas.

En otra realizacion, la invencion proporciona la composicion de malla biocompatible de la invencion para su uso en un metodo de mejora o reparacion de un organo o tejido. El metodo incluye a) identificar un sujeto mairnfero que tiene un organo o tejido que precisa mejora o reparacion; y b) colocar cualquiera de las composiciones biocompatibles de malla anteriormente descritas en el interior o en la superficie del organo o tejido. El sujeto mairnfero puede ser humano. El organo o tejido receptor puede seleccionarse del grupo constituido por tejido de la pared abdominal, musculo abdominal, y tejido de musculatura lisa. El sujeto puede tener un defecto que precisa reparacion seleccionado del grupo constituido por una hernia inguinal, una hernia femoral, una hernia ventral, una hernia abdominal, una hernia incisional, una hernia de hiato, una hernia de diafragma, una hernia umbilical, debilidad fascial en el torax, debilidad fascial en la pared abdominal, y prolapso de organo pelvico.

En los metodos, composiciones, y artfculos de fabricacion anteriormente descritos, las realizaciones citadas pueden combinarse en cualquier combinacion deseada.

A no ser que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que es entendido comunmente por una persona con experiencia ordinaria en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria en la practica o los ensayos de la presente invencion, se describen a continuacion metodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, con inclusion de las definiciones. Adicionalmente, los materiales, metodos, y ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se exponen en los dibujos que se acompanan y la descripcion que sigue. Otras caractensticas, objetos y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripcion y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Descripcion detallada

Los materiales y metodos proporcionados en esta memoria pueden utilizarse para producir una composicion biocompatible de reparacion de tejidos que puede implantarse en un organo o tejido deteriorado o defectuoso para facilitar la reparacion del organo o tejido deteriorado o defectuoso. Como se utiliza en esta memoria, una composicion "biocompatible" es una que tiene la capacidad de soportar la actividad celular necesaria para la regeneracion completa o parcial del tejido, pero no estimula una respuesta inflamatoria o inmunologica local o sistemica significativa en el hospedador. Como se utiliza en esta memoria, una "respuesta inflamatoria o inmunologica local o sistemica significativa en el hospedador" es una respuesta inflamatoria o inmunologica local o sistemica que previene parcial o completamente la regeneracion del tejido por una composicion de la invencion.

I. Componentes de la Composicion

La composicion de la invencion se produce por hinchamiento de fragmentos de ATM en una solucion acida seguido por secado de la suspension de fragmentos de ATM hinchados resultantes, preferiblemente sobre una superficie, o ambas superficies, de un sustrato de malla. Se contempla tambien el recubrimiento de dispositivos medicos implantables con las composiciones proporcionadas en esta memoria con objeto de atenuar una respuesta de tejido extrano. Ejemplos de dispositivos adecuados incluyen, sin limitacion, articulaciones artificiales, injertos vasculares, valvulas artificiales, marcapasos cardiacos, desfibriladores cardiacos, estimuladores musculares, estimuladores neurologicos, implantes cocleares, dispositivos de monitorizacion, bombas de farmaco y dispositivos de asistencia al ventnculo izquierdo.

Matrices de tejido acelulares

Como se utiliza en esta memoria, una "matriz de tejido acelular" ("ATM") es una estructura derivada de tejido que esta hecha a partir de cualquiera de una amplia gama de tejidos que contienen colageno por eliminacion de todas, o sustancialmente todas las celulas viables y, preferiblemente, todas las celulas muertas detectables, componentes subcelulares y/o residuos generados por celulas muertas o moribundas. Como se utiliza en esta memoria, una "matriz acelular" es una matriz que: (a) esta hecha de cualquiera de una amplia gama de tejidos basados en colageno; (b) es acelular; y (c) retiene las funciones biologicas y estructurales que tiene el tejido u organo nativo a partir del cual se ha producido. Las funciones biologicas retenidas por las matrices incluyen el reconocimiento de celulas y la fijacion de celulas asf como la capacidad de soportar la propagacion de celulas, proliferacion de celulas, y diferenciacion de celulas. Tales funciones se proporcionan mediante protemas de colageno no desnaturalizadas (por ejemplo, colageno tipo I) y una diversidad de moleculas distintas de colageno (por ejemplo, protemas que sirven como ligandos para moleculas tales como receptores de integrinas, moleculas con alta densidad de carga tales como glicosaminoglicanos (por ejemplo, hialuronano) o proteoglicanos, u otras adhesinas). Las funciones estructurales retenidas por matrices acelulares utiles incluyen mantenimiento de la arquitectura histologica, mantenimiento de la red tridimensional de los componentes del tejido y caractensticas ffsicas tales como resistencia, elasticidad, y durabilidad, porosidad definida, y retencion de macromoleculas. La eficiencia de las funciones biologicas de una matriz acelular puede medirse, por ejemplo, por su capacidad para soportar la proliferacion celular, y es al menos un 50% (por ejemplo, al menos: 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5%; 100%; o mas de 100%) de las del tejido u organo nativo del que esta hecha la matriz acelular. Adicionalmente, la integridad de la membrana basal en las matrices acelulares, segun se mide por microscopia electronica y/o inmunohistoquímica, es al menos un 70% de la del tejido u organo nativo a partir del cual se ha producido la matriz acelular. Como se utiliza en esta memoria, una ATM que carece de "sustancialmente de todas las celulas viables" es una ATM en la cual la concentracion de celulas viables es menor que 1 % (por ejemplo, menor que: 0,1%; 0,01%; 0,001%; 0,0001%; 0,00001%; 0,000001%; o 0,0%) de la existente en el tejido u organo a partir del cual se ha producido la ATM. Las ATM utiles para la invencion carecen tambien preferentemente sustancialmente de celulas muertas y/o residuos celulares que puedan estar presentes despues de la destruccion de las celulas en la ATM. Una ATM "que carece sustancialmente de celulas muertas y/o residuos celulares" es una que contiene menos de 10% (a saber, menos de: 8%; 5%; 1%; 0,1%; 0,001%; 0,0001%; o menos) de las celulas muertas y/o residuos celulares presentes en la ATM despues de un proceso de eliminacion de celulas.

Las ATM producidas a partir de dermis se denominan en esta memoria, en algunos casos, como "matrices dermicas acelulares" ("ADM").

La ATM de la invencion puede tener o carecer de una membrana basal epitelial. La membrana basal epitelial es una lamina delgada de matriz extracelular contigua con el aspecto basilar de las celulas epiteliales. Las laminas de celulas epiteliales agregadas forman un epitelio. Asf, por ejemplo, el epitelio de la piel se conoce como la epidermis, y la membrana basal epitelial de la piel esta comprendida entre la epidermis y la dermis. La membrana basal epitelial es una matriz extracelular especializada que proporciona una funcion de barrera y una superficie de fijacion para las celulas de tipo epitelial; sin embargo, no aporta papel estructural o biomecanico significativo alguno al tejido subyacente (por ejemplo, la dermis). Componentes singulares de membranas basales epiteliales incluyen, por ejemplo, laminina, colageno tipo VII y nidogeno. La organizacion singular temporal y espacial de la membrana basal epitelial distingue la misma de, por ejemplo, la matriz dermica extracelular. En algunas realizaciones, la presencia de la membrana basal epitelial en una ATM podna ser desventajosa en el sentido de que la membrana basal epitelial puede contener una diversidad de componentes espedficos de especie que podnan suscitar la produccion de anticuerpos, y/o fijarse a anticuerpos preformados, en receptores de injerto xenogenos de la matriz acelular. Adicionalmente, la membrana basal epitelial puede actuar como barrera para la difusion de celulas y/o factores solubles (por ejemplo, quimioatrayentes) y la infiltracion celular. Su presencia en una ATM puede retardar asf significativamente la formacion de tejido nuevo a partir de la ATM en un animal receptor. Como se utiliza en esta memoria, una ATM que "carece sustancialmente" de una membrana basal epitelial es una matriz de tejido acelular que contiene menos de 5% (por ejemplo, menos de: 3%; 2%; 1%; 0,5%; 0,25%; 0,1%; 0,01%; 0,001%; o incluso menos de 0,001%) de la membrana basal epitelial que tiene el tejido no procesado correspondiente del cual se ha derivado la ATM.

Las ATM retienen los atributos biologicos y estructurales de los tejidos a partir de los cuales se han producido, con inclusion del reconocimiento celular y fijacion de celulas asf como la capacidad para soportar la diseminacion celular, la proliferacion celular, y la diferenciacion celular. Tales funciones se proporcionan mediante protemas de colageno no desnaturalizadas (por ejemplo, colageno tipo I) y una diversidad de moleculas distintas de colageno (por ejemplo, protemas que sirven como ligandos para moleculas tales como receptores de integrinas, moleculas con alta densidad de carga tales como glicosaminoglicanos (por ejemplo, hialuronano) o proteoglicanos, u otras adhesinas). Las funciones estructurales utiles retenidas por a Tm incluyen mantenimiento de la arquitectura histologica, mantenimiento de la red tridimensional de los componentes de tejido y caractensticas ffsicas tales como resistencia, elasticidad, y durabilidad, porosidad definida, y retencion de macromoleculas. La eficiencia de las funciones biologicas de una ATM puede medirse, por ejemplo, por la capacidad de la ATM para soportar la proliferacion de celulas (por ejemplo, celulas epiteliales) y es al menos 30% (por ejemplo, al menos: 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5%; 100%; o mas de 100%) de la correspondiente al tejido u organo nativo a partir del cual se produce la ATM. No es necesario que la ATM este hecha de tejido que sea identico al tejido hospedador circundante, sino que debena simplemente ser susceptible de remodelacion por las celulas invasoras o infiltrantes tales como celulas diferenciadas del tejido hospedador relevante, citoblastos tales como citoblastos del tallo mesenquimatico, o celulas progenitoras. De acuerdo con la presente invencion, la ATM se produce a partir de la dermis.

Una ATM util para la invencion puede estar hecha opcionalmente de un tejido basado en colageno del propio receptor. Adicionalmente, si bien una ATM se habra producido por lo general a partir de uno o mas sujetos de la misma especie que el receptor de la composicion de reparacion de tejidos, este no es necesariamente el caso. Asf, por ejemplo, una ATM puede haberse producido a partir de un tejido de porcino y utilizarse para producir una composicion de reparacion de tejidos que puede implantarse en un paciente humano. Las especies que pueden servir como receptores de una composicion de reparacion de tejidos y donantes de tejidos u organos para la produccion del componente ATM de la composicion de reparacion de tejidos pueden incluir, sin limitacion, mairnferos, tales como humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, babuinos, o chimpances), cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, perros, gatos, conejos, cobayos, jerbos, hamsteres, ratas, o ratones. Ademas, pueden utilizarse razas diferentes de animales de una misma especie (por ejemplo, lechones de Yucatan o cerdos Yorkshire).

De particular interes como donantes son animales (por ejemplo, cerdos y vacas) que se han disenado geneticamente para carecer del resto terminal galactosa-a-1,3-galactosa. Para descripciones de animales apropiados, veanse la solicitud estadounidense publicada N.° 2005/0028228 A1 y la patente de Estados Unidos N.° 6.166.288, tambien en tramitacion con la presente. Un problema importante de xenotrasplante en animales receptores (por ejemplo, humanos) que no expresan la enzima UDP-galactosa: p-D-galactosil-1,4-N-acetil-D-glucosaminida-a-1,3-galactosiltransferasa (a-1,3-galactosil-transferasa; "a-GT") que cataliza la formacion de la estructura del disacarido terminal, galactosa a-1,3-galactosa ("a-gal"), es el rechazo hiperagudo de xenoinjertos en tales receptores. Este rechazo es en gran parte, si no exclusivamente, debido a la accion de anticuerpos espedficos para el epftopo a-gal en la superficie de las celulas del xenoinjerto. Se han obtenido animales transgenicos no humanos (por ejemplo, cerdos y vacas) que carecen, o carecen sustancialmente, de a-GT funcional y por tanto carecen, o carecen sustancialmente tambien, de epttopos a-gal.

Los metodos de produccion de animales transgenicos no humanos y, en particular animales transgenicos sometidos a alteracion genica, son bien conocidos en la tecnica. Los metodos de produccion de animales no humanos sometidos a alteracion genica implican, por ejemplo, incorporacion de una forma que ha sufrido alteracion de un gen de interes en la lmea germinal de un sujeto de una especie no humana. El gen puede sufrir alteracion genica de tal modo que no fabrique cantidad alguna de un producto protemico (por ejemplo, a-GT) o fabrique un producto protemico que carezca de la actividad, o carezca sustancialmente de la actividad de la protema nativa. Como se utiliza en esta memoria, una protema a-GT "que carece sustancialmente de actividad de a-GT" es una protema a-GT que tiene menos de 5% (por ejemplo, menos de: 4%; 2%; 1%; 0,1%; 0,01%; 0,001%; o incluso menos de 0,001%) de la capacidad de la a-GT de tipo natural para generar epftopos a-gal. Los metodos de alteracion de genes y, en particular, el gen a-GT, se conocen en la tecnica e implican generalmente el proceso conocido como recombinacion homologa. En este proceso, una o ambas copias de un gen de tipo natural de interes pueden alterarse por insercion de una secuencia en el gen o genes de tipo natural tal que no se produce transcrito alguno del gen o genes; o se produce un transcrito a partir del cual no se traduce protema alguna; o se produce un transcrito que dirige la smtesis de una protema que carece, o carece sustancialmente, de la actividad funcional de la protema de interes. Tales construcciones incluyen tfpicamente la totalidad o parte de la secuencia genomica del gen de interes y contienen, dentro de dicha estructura genomica, una secuencia que alterara la expresion del gen de interes de una de las maneras descritas anteriormente. La secuencia utilizada para alterar la expresion del gen puede ser una secuencia que codifica una protema que confiere resistencia a antibioticos (por ejemplo, resistencia a neomicina) en celulas diana que han incorporado la construccion a sus genomas. Una secuencia codificante de este tipo facilita la seleccion in vitro de celulas que han incorporado la construccion genetica a sus genomas. Metodologfas adicionales de seleccion de farmacos conocidas en la tecnica pueden utilizarse para seleccionar celulas en las que se ha producido recombinacion entre la construccion y al menos una copia del gen diana.

En algunos metodos de generacion de animales no humanos sometidos a alteracion genica, pueden utilizarse como celulas diana celulas humanas totipotentes (es decir, celulas capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas de un embrion). Tales celulas incluyen, por ejemplo citoblastos embrionarios (ES) (en la forma de linajes de celulas ES) u ovulos fertilizados (oocitos). Una poblacion de celulas ES en la cual al menos una copia del gen de interes ha sufrido alteracion puede inyectarse en blastocistos no humanos apropiados y los blastocistos inyectados pueden implantarse en madres adoptivas no humanas. Alternativamente, los ovulos no humanos fertilizados inyectados con la construccion de alteracion genica de interes pueden implantarse en las madres adoptivas no humanas. Ademas, los oocitos no humanos implantados en madres adoptivas no humanas pueden ser los que se han enucleados y recibido una inyeccion con nucleos de celulas ES alteradas genicamente con exito [Campbell et al. (1996) Nature 380: 64-66]. La descendencia resultante que contiene la mutacion procedente de tales madres adoptivas no humanas puede identificarse y, a partir de estos animales fundadores, pueden producirse linajes animales distintos utilizando metodos de reproduccion y seleccion conocidos por los expertos en la tecnica.

Pueden producirse tambien animales transgenicos no humanos estandar y que han sufrido alteracion genica utilizando celulas somaticas (por ejemplo, fibroblastos fetales) como celulas diana para la alteracion genica. Tales celulas crecen mucho mas rapidamente y se manipulan con facilidad mucho mayor in vitro que, por ejemplo, las celulas ES, facilitando con ello los procedimientos de alteracion genica y seleccion celular subsiguiente de genes que han sufrido alteracion. Una vez que se ha seleccionado in vitro un linaje de celulas somaticas con genes que han sufrido alteracion, los nucleos procedentes de las celulas somaticas de genes que han sufrido alteracion pueden incorporarse a celulas totipotentes no humanas (por ejemplo, celulas ES u oocitos), que se manipulan luego como se ha descrito arriba. Los metodos para trasplante nuclear son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen tecnicas tales como, por ejemplo, fusion celular o trasplante nuclear.

Muy comunmente, los procedimientos de alteracion genica dan como resultado la alteracion de un solo alelo de un gen de interes. En estos casos, los animales transgenicos no humanos seran heterocigoticos para el gen alterado. La reproduccion de tales heterocigotos y los procedimientos de seleccion apropiados familiares para los especialistas en la tecnica pueden utilizarse luego para derivar animales no humanos que son homocigoticos para el gen alterado. Naturalmente, tales procedimientos de reproduccion no son necesarios cuando el procedimiento de alteracion genica arriba descrito haya dado como resultado la alteracion de ambos alelos del gen de interes.

Como alternativa al uso de animales disenados geneticamente, pueden utilizarse tratamientos enzimaticos espedficos para eliminacion de la galactosa-a-1,3-galactosa terminal. El tratamiento enzimatico de ATM con una a-1,3-galactosidasa puede realizarse utilizando una glicosidasa espedfica que tenga actividad a-1,3-galactosidasa, por ejemplo, a-1,3-galactosidasa de los granos de cafe. Esta enzima puede derivarse de fuentes naturales o producirse utilizando el sistema de expresion de Pichia pastoris o cualquier otro sistema recombinante capaz de producir una a-1,3-galactosidasa funcional.

Para la produccion de una composicion de reparacion de tejidos, se utiliza generalmente ATM en la forma de fragmentos (es decir, partfculas, hebras o fibras) (vease mas adelante). La ATM puede producirse por cualquiera de una diversidad de metodos. Todo lo que se requiere es que las etapas utilizadas en su produccion den como resultado matrices con las propiedades biologicas y estructurales anteriormente descritas. Los metodos particularmente utiles de produccion incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos Nums. 4.865.871; 5.366.616; 6.933.326 y las solicitudes estadounidenses publicadas Nums. 2003/0035843 A1, y 2005/0028228 A1, tambien en tramitacion con la presente.

Resumidamente, los pasos implicados en la produccion de una ATM incluyen generalmente recoger el tejido de un donante (por ejemplo, un cadaver humano o cualquiera de los mairnferos enumerados anteriormente), tratamiento qmmico a fin de estabilizar el tejido y evitar la degradacion bioquímica y estructural junto con, o seguido por, separacion de las celulas en condiciones que preservan analogamente la funcion biologica y estructural. La ATM puede tratarse opcionalmente con un agente de criopreservacion y criopreservarse y, opcionalmente, liofilizarse, una vez mas, en las condiciones necesarias para mantener las propiedades biologicas y estructurales descritas de la matriz. Despues de congelacion o liofilizacion, el tejido puede fragmentarse, por ejemplo, pulverizarse o micronizarse para producir una ATM particulada en condiciones similares de preservacion de funciones. Todos los pasos se llevan a cabo generalmente en condiciones asepticas, preferiblemente esteriles.

A continuacion se resume un metodo ilustrativo de produccion de ATM, que se describe con mayor detalle en la patente de Estados Unidos N.° 5.366.616.

Despues de la extraccion del donante, el tejido se dispone en una solucion estabilizadora inicial. La solucion estabilizadora inicial detiene y previene la degradacion osmotica, hipoxica, autolftica, y proteolttica, protege contra la contaminacion microbiana, y reduce el deterioro mecanico que puede ocurrir con tejidos que contienen, por ejemplo, componentes de musculatura lisa (por ejemplo, vasos sangumeos). La solucion estabilizadora contiene generalmente un tampon apropiado, uno o mas antioxidantes, uno o mas agentes oncoticos, uno o mas antibioticos, uno o mas inhibidores de proteasas, y en algunos casos, un relajante de la musculatura lisa.

El tejido se dispone luego en una solucion de procesamiento para separar las celulas viables (por ejemplo, celulas epiteliales, celulas endoteliales, celulas de musculatura lisa, y fibroblastos) de la matriz estructural sin deteriorar el complejo de la membrana base o la integridad biologica y estructural de la matriz de colageno. La solucion de proceso contiene generalmente un tampon apropiado, sal, un antibiotico, o uno o mas detergentes, uno o mas agentes para prevenir la reticulacion, uno o mas inhibidores de proteasas, y/o una o mas enzimas.

Un tampon apropiado puede ser un tampon organico, por ejemplo acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES), acido 3-(N-morfolina)propanosulfonico (MPOS) y acido N-2-hidroxietilpiperazina-N1-2-etano-sulfonico (HEPES). Alternativamente, un tampon bajo en sal o fisiologico, con inclusion de fosfato, bicarbonato y acetato-citrato, puede ser mas apropiado en ciertas aplicaciones. Las sales pueden incluir sales fisiologicas comunes tales como cloruro de sodio o cloruro de potasio. Los antibioticos pueden incluir, por ejemplo, penicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, bacitracina, y vancomicina. Adicionalmente, pueden emplearse agentes antifungicos, que incluyen anfotericina-B, nistatina, y polimixina. Los detergentes adecuados incluyen, sin limitacion, por ejemplo, desoxicolato de sodio, Triton-X-100™ (Rohm & Haas, Filadelfia, PA); monooleato de polioxietilen-(20)-sorbitan (Tween 20); monooleato de polioxietilen-(80)-sorbitan (Tween 80); 3-[(3-cloramidopropil)-dimetilamino]-1-propano-sulfonato; octil-glucosido; y dodecil-sulfato de sodio. Los agentes que inhiben o previenen la formacion de reticulaciones pueden incluir acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido ascorbico y otros agentes de barrido de radicales libres. Los ejemplos de inhibidores de proteasas utiles incluyen, sin limitacion, N-etilmaleimida (NEM), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), acido etilenglicol-bis (2-aminoetil eter)-N,N,N1,N1-tetraacetico (EGTA), leupeptina, cloruro de amonio, aumento del pH, y aprotinina. Los ejemplos de enzimas utiles incluyen, sin limitacion, dispasa II, tripsina, y termolisina. En algunas realizaciones, puede incluirse en la solucion de procesamiento un agente de equilibrio osmotico para proporcionar un equilibrio osmotico coloidal entre la solucion y el tejido, previniendo asf la difusion de proteoglicanos endogenos del tejido a la solucion. El agente de equilibrio osmotico puede ser, por ejemplo, sin limitacion, un proteoglicano, por ejemplo, sulfato de condroitina, sulfato de heparina, o sulfato de dermatano, o un polfmero, por ejemplo, dextrano o polivinilpirrolidona (PVP), o un aminoacido, por ejemplo, glicina o valina.

El tratamiento del tejido tiene que realizarse con una solucion de procesamiento que contenga principios activos en una concentracion y durante un periodo de tiempo tales que, despues del procesamiento, el tejido retenga los atributos biologicos y estructurales del tejido nativo no procesado (vease la descripcion anterior de ATM).

Despues de la eliminacion de las celulas, el tejido puede congelarse (es decir, criopreservarse) y opcionalmente, liofilizarse. Antes de la congelacion, el tejido puede incubarse en una solucion de criopreservacion. Esta solucion contiene generalmente uno o mas crioprotectores a fin de minimizar el deterioro por los cristales de hielo de la matriz estructural que podna ocurrir durante la congelacion. Los ejemplos de crioprotectores utiles se proporcionan en la patente de Estados Unidos N.° 5.336.616. Si el tejido debe liofilizarse, la solucion contendra tambien generalmente uno o mas componentes de proteccion en seco, a fin de minimizar el deterioro estructural durante el secado, y puede incluir una combinacion de un disolvente organico y agua que no experimente expansion ni contraccion durante la congelacion. Los agentes crioprotectores y protectores en seco pueden ser las mismas una o mas sustancias. Si el tejido no se va a liofilizar, se puede congelar poniendolo (en un recipiente esterilizado) en un congelador a aproximadamente -80°C, o por inmersion del mismo en nitrogeno lfquido esteril, seguido por almacenamiento a una temperatura inferior a -160°C hasta su utilizacion. La muestra puede descongelarse antes de su uso mediante, por ejemplo, inmersion de una vasija esteril no permeable (vease mas adelante) que contiene la muestra en un bano de agua a aproximadamente 37°C o dejando que el tejido vuelva a la temperatura ambiente en condiciones ambientales.

Si el tejido debe congelarse y liofilizarse, despues de incubacion en la solucion de criopreservacion, el tejido puede envasarse en el interior de una vasija esteril que es permeable al vapor de agua pero impermeable a las bacterias, por ejemplo, una bolsa permeable al vapor de agua o un vial de vidrio. Un lado de una bolsa preferida esta constituido por una membrana porosa de grado medico Tyvek®, un producto comercializado de DuPont Company de Wilmington, DE. Esta membrana es porosa al vapor de agua e impermeable a las bacterias y el polvo. La membrana Tyvek® se sella termicamente a una lamina impermeable estratificada de polietileno, dejando un lado abierto, formando de este modo una bolsa de dos lados. La bolsa abierta se esteriliza por irradiacion (por ejemplo, irradiacion y) antes de su utilizacion. El tejido se coloca asepticamente (por el lado abierto) en la bolsa esteril. El lado abierto se sella luego termicamente en condiciones asepticas para cerrar la bolsa. El tejido envasado se protege posteriormente contra la contaminacion microbiana mediante etapas de procesamiento posteriores.

La vasija que contiene el tejido se enfna a baja temperatura a un regimen especificado que sea compatible con la formulacion crioprotectora espedfica a fin de minimizar el deterioro por la congelacion. Vease la patente de Estados Unidos N.° 5.336.616 para ejemplos de protocolos de enfriamiento apropiados. El tejido se seca luego a baja temperatura en condiciones de vado, de tal modo que el vapor de agua se elimina secuencialmente de cada fase de cristales de hielo.

Una vez completado el secado de las muestras en la vasija permeable al vapor de agua, el vado del aparato de liofilizacion se revierte con un gas inerte seco tal como nitrogeno, helio o argon. Mientras se mantiene en el mismo ambiente gaseoso, la vasija semipermeable se coloca en el interior de una vasija impermeable (es decir, impermeable al vapor de agua asf como a los microorganismos) (por ejemplo, una bolsa) que se sella ulteriormente, por ejemplo, por calor y/o presion. En el caso de una muestra de tejido que se ha congelado y secado en un vial de vidrio, el vial se sella a vado con un tapon inerte apropiado y el vado del aparato de secado se revierte con un gas inerte antes de la descarga. En cualquier caso, el producto final se sella hermeticamente en una atmosfera gaseosa inerte. El tejido liofilizado puede guardarse en condiciones refrigeradas hasta su fragmentacion o, si se desea, rehidratacion.

Los fragmentos de ATM son partfculas (material particulado), fibras, o hebras.

La ATM particulada tiene una forma generalmente esferica o incluso irregular, siendo la dimension maxima no mayor que 1000 micrometros. Una ATM particulada puede producirse a partir de cualquiera de las ATM no particuladas descritas anteriormente por cualquier proceso que de como resultado la preservacion de las funciones biologicas y estructurales anteriormente descritas y, en particular, debena minimizar el deterioro de las fibras de colageno, con inclusion de extremos de fibra cizallados.

Un metodo apropiado para producir ATM particulada se describe en la patente de Estados Unidos N.° 6.933.326. El proceso se describe brevemente a continuacion con respecto a una ATM dermica liofilizada (matriz dermica acelular; ADM).

La ADM puede cortarse en tiras (utilizando, por ejemplo, un reticulador Zimmer provisto de una rueda cortante "continua" ininterrumpible). Las tiras largas resultantes se cortan seguidamente a longitudes de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 2 cm. Un homogeneizador y una sonda homogeneizadora esterilizada (por ejemplo, un homogeneizador Lab-Teck Macro disponible de OMNI International, Warrenton, VA) se ensambla y se enfna a temperaturas criogenicas (a saber, aproximadamente -196°C hasta aproximadamente -160°C) utilizando nitrogeno lfquido esteril que se vierte en la torre del homogeneizador. Una vez que el homogeneizador ha alcanzado una temperatura criogenica, se anaden trozos de ADM cortados a la torre de homogeneizacion que contiene el nitrogeno lfquido. El homogeneizador se activa luego a fin de fracturar criogenicamente las piezas de ADM. El tiempo y la duracion de la etapa de fracturacion criogenica dependen del homogeneizador utilizado, el tamano de la camara de homogeneizacion, y la velocidad y el tiempo en que se hace funcionar el homogeneizador, y son facilmente determinables por una persona con experiencia en la tecnica. Como alternativa, el proceso de criofracturacion puede realizarse en un criomolino enfriado a una temperatura criogenica.

La ATM criofracturada particulada se clasifica, opcionalmente por tamanos de partfcula, mediante lavado del producto de la homogeneizacion con nitrogeno lfquido esteril por medio de una serie de tamices metalicos que se han enfriado tambien a una temperatura criogenica. Generalmente es util eliminar las partfculas grandes indeseables con un tamiz que tenga un tamano de poro relativamente grande antes de pasar a uno (o mas) tamices con un tamano de poro mas pequeno. Una vez aisladas, las partfculas pueden liofilizarse para asegurar que cualquier humedad residual que pueda haberse absorbido durante el fraccionamiento se elimine. El producto final es un polvo (usualmente blanco o blanquecino) que tiene generalmente un tamano de partfcula de aproximadamente 1 micrometro a aproximadamente 900 micrometres, aproximadamente 30 micrometres a aproximadamente 750 micrometres, o aproximadamente 150 a aproximadamente 300 micrometros.

Los fragmentos de ATM pueden ser tambien fibras o hebras. Tales fibras o hebras no debenan ser generalmente mayores que 5 cm (por ejemplo, no mayores de: 4,5 cm; 4,0 cm; 3,5 cm; 3,0 cm; 2,5 cm; 2,0 cm; 1,5 cm; 1,0 cm; 0,5 cm; 0,25 cm; 0,1 cm; 0,05 cm; o 0,02 cm) de longitud y no mayores que 3 mm (por ejemplo, no mayores de: 2,5 mm; 2,0 mm; 1,5 mm; 1,0 mm; 0,5 mm; 0,2 mm; 0,1 mm; 0,05 mm; 0,02 mm; o 0,01 mm) en su punto mas ancho. Los metodos de produccion de fibras y hebras a partir de ATM congelada o liofilizada seran evidentes para las personas expertas en la tecnica e incluyen corte tanto manual como mecanico de la ATM congelada o liofilizada.

Una ATM liofilizada muy adecuada se produce a partir de dermis humana por LifeCell Corporation (Branchburg, NJ) y se comercializa en forma de pequenas laminas como AlloDerm®. LifeCell Corporation comercializa tales laminas como laminas rectangulares con dimensiones de, por ejemplo, 1 cm x 2 cm, 3 cm x 7 cm, 4 cm x 8 cm, 5 cm x 10 cm, 4 cm x 12 cm, y 6 cm x 12 cm. El crioprotector utilizado para congelar y secar AlloDerm® es una solucion de maltodextrina al 35% y etilendiaminotetraacetato (EDTA) 10 mM. Asf, el producto secado final contiene aproximadamente 60% en peso de ATM y aproximadamente 40% en peso de maltodextrina. LifeCell Corporation produce tambien un producto analogo a partir de dermis de porcino (designado XenoDerm™M) que tiene las mismas proporciones de ATM y maltodextrina que AlloDerm®. Adicionalmente, LifeCell Corporation comercializa una matriz dermica acelular particulada producida por criofracturacion de AlloDerm® (como se ha descrito arriba) bajo el nombre Cymetra®. El tamano de partfcula de Cymetra® esta comprendido en el intervalo de aproximadamente 60 micrometros a aproximadamente 150 micrometros como se determina por masa. Las partreulas de ATM particulada o pulverizada (en polvo) seran menores que 1,0 mm en su dimension mayor. Los trozos de ATM con dispersiones mayores que estas son matrices acelulares no particuladas.

Sustratos de malla

De acuerdo con la invencion, la composicion biocompatible para reparacion de tejidos puede incluir un sustrato de malla.

Puede utilizarse cualquier sustrato de malla biocompatible sintetico, por ejemplo, una malla quirurgica. Los sustratos de malla quirurgica son materiales tejidos multifilamento que estan disponibles en muchas formas y se han producido a partir de una diversidad de materiales sinteticos y naturales. Las mallas pueden clasificarse ampliamente conforme a la estructura del filamento, el tamano de poro y el peso. La estructura de los filamentos puede ser de fibras monofilamento, multifilamento o multifilamento formadas a partir de materiales monofilamento. Los tamanos de poro pueden estar comprendidos de aproximadamente 200 n a aproximadamente 5000. Los tamanos de poro pequenos, por ejemplo, 1000 p o menores, son tfpicos de mallas de peso elevado, mientras que los tamanos de poro mas pequenos, por ejemplo, mayores que 1000 p son caractensticos de mallas ligeras. El peso de malla se expresa como g/m2, teniendo las mallas pesadas densidades de aproximadamente 80-100 g/m2, en tanto que las mallas ligeras tienen densidades en el intervalo de 25-45 g/m2.

El sustrato de malla puede estar hecho de un material no absorbible, un material absorbible o un material que sea una combinacion de materiales no absorbibles y absorbibles. "Material absorbible" se define en esta memoria como cualquier material que puede degradarse en el cuerpo de un receptor mairnfero por procesos enzimaticos o celulares endogenos. Dependiendo de la composicion particular del material, los productos de degradacion pueden reciclarse por caminos metabolicos normales o excretarse por uno mas sistemas organicos. Naturalmente, un "material no absorbible" es uno que no puede ser degradado en el cuerpo de un receptor m a i^e ro por procesos enzimaticos o celulares endogenos.

Los polfmeros utilizados para producir mallas no absorbibles incluyen polipropileno, poliester, a saber, poli(tereftalato de etileno), o politetrafluoretileno (PTFE). Los ejemplos de mallas de propileno disponibles comercialmente incluyen polipropileno/pTFE: Marlex ™(CR Bard, Inc., Cranston RI), Visilex® ^{( C r}Bard, Inc., Cranston RI), PerFix® Plug (CR Bard, Inc., Cranston RI), Kugel™ Hernia Patch (CR Bard, Inc., Cranston RI), 3DMax® (CR Bard, Inc., Cranston RI), Prolene™ (Ethicon, Inc., Somerville, NJ), Surgipro™ (Autosuture, U.S.Surgical, Norwalk, ^{C t ) ,}Prolite™ (Atrium Medical Co., Hudson, NH), Prolite Ultra™ (Atrium Medical Co., Hudson, NH), Trelex™ (Meadox Medical, Oakland, NJ), y Parietene® (Sofradim, Trevoux,Francia). Los ejemplos de mallas poliester disponibles comercialmente incluyen Mersilene™ (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) y Parietex® (Sofradim, T revoux, Francia). Los ejemplos de mallas de PTFE disponibles comercialmente incluyen Goretex® (W.L.Gore & Associates, Newark, DE), Dualmesh® (W.L.Gore & Associates, Newark, DE), Dualmesh® Plus (W.L.Gore & Associates, Newark, DE), Dulex® (CR Bard, Inc., Cranston RI), y Reconix® (CR Bard, Inc., Cranston RI).

Las mallas absorbibles estan disponibles tambien de fuentes comerciales. Los polfmeros de utilidad para producir mallas absorbibles pueden incluir acido poliglicolico (Dexon™, Syneture™, U.S.Surgical, Norwalk, CT), acido poli-1-lactico, poliglactina 910 (Vicryl™, Ethicon, Somerville, N.J.), o derivados de polihidroxialcanoato tales como poli-4-hidroxibutirato (Tepha, Cambridge, MA).

Las mallas compuestas, es decir, mallas que incluyen a la vez materiales absorbibles y no absorbibles pueden producirse a partir de combinaciones de los materiales anteriormente descritos o de materiales adicionales. Los ejemplos de mallas compuestas disponibles comercialmente incluyen polipropileno/PTFE: Composix® (CR Bard, Inc., Cranston RI), Composix® E/X (CR Bard, Inc., Cranston RI), y Ventralex® (CR Bard, Inc., Cranston RI); polipropileno/celulosa: Proceed™ (Ethicon, Inc., Somerville, NJ); polipropileno/Seprafilm®: Sepramesh® (Genzyme, Cambridge, MA), Sepramesh® IP (Genzyme, Cambridge, MA); polipropileno/Vicryl: Vypro™ (Ethicon, Somerville, N.J.), Vypro™ II (Ethicon, Somerville, N.J.); polipropileno/Monocryl(poliglecaprona): Ultrapro® (Ethicon, Somerville, N.J.); y poliester/colageno: Parietex® Composite (Sofradim, Trevoux, Francia).

II. Preparacion de la composicion de reparacion de tejidos

La composicion biocompatible de reparacion de tejidos proporcionada en esta memoria se produce por hinchamiento de fragmentos de ATM en una solucion acida para crear una suspension homogenea de partfculas hinchadas de ATM, y la suspension se seca para producir un pelfcula de colageno o estructura semejante a una esponja. Tfpicamente, el volumen ocupado por los fragmentos de ATM hinchados es mayor con relacion al volumen ocupado por la misma masa de fragmentos de ATM que no se han hinchados. En algunas realizaciones, el hinchamiento puede realizarse a temperaturas moderadamente elevadas. La ATM puede encontrarse en la forma de fragmentos, es decir, partfculas, fibras o hebras. Antes del hinchamiento, la ATM puede lavarse para eliminar cualquier crioprotector residual. Las soluciones utilizadas para lavado pueden ser cualquier solucion fisiologicamente compatible; soluciones de lavado muy adecuadas son, por ejemplo, agua desionizada o destilada, o solucion salina tamponada con fosfato (PBS).

La ATM puede hincharse en cualquier solucion acida que mantenga los fragmentos de ATM como una suspension homogenea, y no de como resultado una desnaturalizacion sustancial irreversible de las fibras de colageno en la ATM. Como se define en esta memoria, una suspension homogenea de partfculas de ATM es una en la cual las partfculas de ATM estan distribuidas uniformemente en un medio lfquido y no contiene partfculas que sean mayores que aproximadamente 1000 p de tamano, por ejemplo, mayores que aproximadamente 950 p, aproximadamente 975 p, aproximadamente 1000 p, aproximadamente 1025 p, aproximadamente 1050 p, aproximadamente 1075 p, aproximadamente 1100 p o mayores. Como se utiliza en esta memoria, "desnaturalizacion sustancial irreversible" se refiere en general a la disociacion de las fibrillas de colageno en sus subfibrillas y/o moleculas de colageno constituyentes, tales que las subfibrillas y/o moleculas de colageno sean sustancialmente incapaces de replegarse y volver a ensamblarse en fibrillas de colageno nativas. Como se utiliza en esta memoria, en las subfibrillas y/o moleculas de colageno que son "sustancialmente incapaces de replegarse y volver a ensamblarse en fibrillas de colageno nativas", no mas de 30% (por ejemplo, no mas de: 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0,1%; 0,01%; o menos) de las subfibrillas y/o moleculas de colageno son capaces de replegarse y volver a ensamblarse en fibrillas de colageno nativas. La fibrilla de colageno nativa es un haz de muchas subfibrillas, cada una de las cuales es a su vez un haz de microfibrillas. Una microfibrilla consiste en moleculas de colageno enrolladas helicoidalmente, cada una de las cuales consiste en tres cadenas de polipeptido helicoidales. Esta disposicion de las moleculas de colageno en las fibrillas de colageno da como resultado una periodicidad de formacion de bandas caractensticas de 64-67 nm. Tfpicamente, las fibrillas de colageno desnaturalizadas irreversiblemente carecen, o carecen sustancialmente, de la periodicidad de formacion de bandas encontrada en la fibrilla de colageno nativa. La desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibrillas de colageno puede monitorizarse por cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica incluyendo, por ejemplo, pero sin limitacion, microscopfa electronica de transmision, microscopfa electronica de barrido, y microscopfa de fuerza atomica, o por metodos bioqmmicos o enzimaticos, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida o susceptibilidad de escision enzimatica por colagenasa, pepsina o proteinasa K. Asf, la ATM puede hincharse en cualquier solucion acida que no de como resultado una perdida sustancial de la periodicidad de formacion de bandas.

Se apreciara que el tipo de acido, la concentracion del acido, la duracion del tiempo de hinchamiento, y la temperatura de hinchamiento pueden ajustarse para conseguir el hinchamiento optimo de la ATM. Por ejemplo, ATM de fuentes diferentes, por ejemplo, especies diferentes de mairnfero o variedades o razas diferentes de la misma especie, pueden requerir condiciones diferentes de hinchamiento a fin de conseguir un hinchamiento optimo sin desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibrillas de colageno en la ATM.

Un acido es una molecula de actua como donante de protones y por tanto aumenta la concentracion de H+ de una solucion. Los acidos que ceden facilmente protones al agua son acidos fuertes, mientras que los que tienen solo una ligera tendencia a ceder protones son acidos debiles. Un mdice util de la concentracion de iones H+ en una solucion es la escala de pH; una solucion acuosa con un pH menor que 7 se considera acida. De acuerdo con la invencion, los fragmentos de ATM pueden hincharse en cualquier solucion acuosa que tenga un pH inferior a 3,0, por ejemplo, 2,8, 2,6, 2,4, 2,2, 2,0, 1,8, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,0 e inferior. "Aproximadamente" indica que el pH puede variar en hasta 0,2 unidades de pH por encima o por debajo del valor indicado. Los ejemplos de acidos utiles incluyen acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido carbonico, acido cftrico, acido clorhidrico, acido lactico, acido fosforico, acido sulfurico, acido tanico y acido tricloroacetico. Puede utilizarse tambien cualquier combinacion de dos o mas acidos.

La concentracion espedfica de acido dependera en parte de la fuerza relativa del acido, requiriendo los acidos mas fuertes, por ejemplo, acido clorhfdrico o acido sulfurico, menores concentraciones, y requiriendo los acidos mas debiles, por ejemplo, acido acetico, acido dtrico, y acido lactico concentraciones mayores. Asf, la concentracion y el lfmite inferior del de pH para la incubacion variaran de un acido a otro. En algunas realizaciones, el acido es un acido volatil, es decir, un acido que se evapora facilmente a las temperaturas y presiones normales. Las concentraciones y los valores de pH apropiados son los que no dan como resultado una desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibras de colageno de la ATM (vease anteriormente).

Un acido muy adecuado es el acido acetico. El acido acetico puede utilizarse a concentraciones comprendidas en el intervalo entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 250 mM, por ejemplo, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375,400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, o 600 mM. Otro acido adecuado es acido clorhfdrico (HCl). El HCl puede utilizarse a concentraciones comprendidas en el intervalo entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 200 mM, por ejemplo, 25, 40, 50, 60, 80, 100, 175, y 200 mM. "Aproximadamente" indica que la concentracion del acido puede variar hasta un 10% por encima o por debajo del valor indicado. Asf, por ejemplo, una concentracion de acido acetico de "aproximadamente " 50 mM puede incluir, por ejemplo, 45 mM, 46mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, o 55 mM.

La ATM puede hincharse en acido durante cualquier periodo de tiempo requerido para producir una suspension homogenea de fragmentos de ATM. La ATM puede hincharse, por ejemplo durante aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 horas o mas. "Aproximadamente" indica que el tiempo de hinchamiento puede variar en hasta 0,2 horas por encima o por debajo del valor indicado. Asf, un tiempo de hinchamiento de "aproximadamente" 3 horas puede incluir, por ejemplo, 2,8 horas, 2,85 horas, 2,90 horas, 2,95 horas, 3,0 horas, 3,05 horas, 3,10 horas, 3,15 horas, o 3,20 horas.

La concentracion final de ATM en la solucion acida puede ser cualquier concentracion que se hinche uniformemente y que de como resultado una suspension homogenea de fragmentos de ATM. Las propiedades de hinchamiento pueden variar conforme a la procedencia del tejido del que se derivo la ATM; en general, las concentraciones utiles (p/v) para la ATM derivada de porcino pueden variar de aproximadamente 0,1% por ejemplo, 0,08%, 0,085%, 0,09%, 0,1%, 0,15% hasta aproximadamente 4%, por ejemplo, aproximadamente 3,8%, 3,85%, 3,9%, 4,0%, 4,05%, 4,1%, 4,15%, o 4,2%. Una concentracion adecuada para la ATM derivada de porcino es 0,5%. La extension del aumento en volumen de los fragmentos de ATM puede medirse recogiendo los fragmentos de ATM por centrifugacion y determinando el volumen ocupado por los sedimentos antes y despues del periodo de hinchamiento (vease Ejemplo 1). El cambio de volumen puede ser en veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces o mas con relacion a la ATM antes del hinchamiento con acido. La extension del hinchamiento variara de una ATM a otra, y de una especie a otra. Por regla general, pero no necesariamente, se utilizan condiciones de hinchamiento que dan como resultado un hinchamiento maximo de la ATM. Despues del hinchamiento, los fragmentos de ATM ocuparan un volumen al menos 1,2 veces mayor que el ocupado antes del hinchamiento. Por ejemplo, los fragmentos pueden ocupar un volumen que es 1,2 veces, 1,5 veces, 1,8 veces, 2,0 veces, 3,0 veces, 4,0 veces, 5,0 veces, 6,0 veces, 7,0 veces, 8,0 veces, 9,0 veces, 10,0 veces, 11,0 veces, 12,0 o mas veces mayor que el volumen ocupado antes del hinchamiento. Puede utilizarse cualquier metodo conocido en la tecnica para ensayar la extension del hinchamiento, con inclusion, por ejemplo, sin limitacion, de la medida directa del volumen ocupado por la ATM, o medidas indirectas tales como cambios en densidad, viscosidad o dispersion de la luz de la solucion de ATM.

La suspension homogenea de los fragmentos de ATM puede someterse a temperaturas moderadamente elevadas con relacion a la temperatura ambiente. Como se define en esta memoria, la temperatura ambiente es de aproximadamente 23°C hasta aproximadamente 27°C, por ejemplo, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C o 27°C. Como se define en esta memoria, "temperaturas moderadamente elevadas" incluyen temperaturas que van de aproximadamente 28°C hasta aproximadamente 42°C, por ejemplo, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, 40 °C, 41°C, o 42 °C. La ATM puede someterse a temperaturas moderadamente elevadas antes de la etapa de hinchamiento en acido, simultaneamente al paso de hinchamiento en acido, o despues de la etapa de hinchamiento en acido. "Aproximadamente" indica que la temperatura puede variar en hasta 2°C por encima o por debajo del valor citado. Asf, una temperatura de "aproximadamente" 30°C puede incluir, por ejemplo, 28,0 °C, 28,5 °C, 29,0 °C, 2,95 °C, 30,0 °C, 30,5 °C, 31,0 °C, 31,5 °C, o 32,0 °C. La suspension homogenea de los fragmentos de ATM puede someterse a una temperatura moderadamente elevada durante, por ejemplo, aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 o mas horas. "Aproximadamente" indica que el tiempo de hinchamiento puede variar en hasta 0,2 horas por encima o por debajo del valor indicado. Asf, un tiempo de hinchamiento de "aproximadamente" 3 horas puede incluir, por ejemplo, 2,8 horas, 2,85 horas, 2,90 horas, 2,95 horas, 3,0 horas, 3,05 horas, 3,10 horas, 3,15 horas, o 3,20 horas.

Una vez que la ATM se ha hinchado en acido y se ha sometido a temperaturas elevadas, se usa para formar una composicion de pelfcula dermica biocompatible. Para formar la composicion de malla biocompatible, la solucion homogenea de ATM puede aplicarse a una malla biocompatible de tal modo que la malla tejida se impregne con la solucion. Pueden utilizarse cualesquiera metodos para recubrimiento de materiales de malla que retengan las propiedades biocompatibles de la malla recubierta. Por ejemplo, la ATM hinchada puede verterse o extrudirse en un recipiente y los materiales de malla anadirse a y/o integrarse en la suspension de ATM. Alternativa o adicionalmente, la ATM hinchada puede depositarse sobre la malla por aerosolizacion, pulverizacion, centrifugacion o filtracion. Puede utilizarse cualquier recipiente conocido por los expertos en la tecnica, por ejemplo, una capsula plana de polipropileno o poliestireno. Alternativa o adicionalmente, los materiales de malla pueden disponerse en un molde de tamano apropiado y recubrirse por vertido o extrusion de la ATM hinchada sobre la malla. La malla recubierta puede secarse luego y, opcionalmente, el proceso de recubrimiento y secado puede repetirse una, dos, tres, o mas veces.

En general, la malla puede sumergirse en la solucion de ATM hasta una profundidad de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,0 cm que depende, en parte, de la magnitud de hinchamiento de la ATM hinchada y el espesor de recubrimiento deseado. Mas espedficamente, la malla puede recubrirse con de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg de peso seco de ATM por cm2 de malla. Asf, la malla puede recubrirse con 5,0, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, o 10,0 mg de ATM por cm2 de malla. Dependiendo de cuantas veces se repita el proceso de recubrimiento, el recubrimiento de ATM sobre la malla puede ser de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 mm de espesor. El espesor del recubrimiento puede variar dependiendo de la aplicacion propuesta. Asf, recubrimientos mas finos pueden ser mas adecuados para mallas que deban enrollarse e insertarse, por ejemplo, por medio de un trocar, mientras que pueden utilizarse recubrimientos mas gruesos para mallas que deban aplicarse directamente a un tejido en necesidad de reparacion.

La composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede secarse por cualquier metodo conocido en la tecnica que de como resultado la retencion de las funciones biologicas y ffsicas de la composicion de reparacion de tejidos. Los metodos de secado incluyen, sin limitacion, por ejemplo, secado al aire, secado en atmosfera de, o con una corriente de, gas inerte (por ejemplo, nitrogeno o argon). La temperatura de secado puede ser la temperatura ambiente, por ejemplo, aproximadamente 25°C, o puede ser una temperatura que es moderadamente elevada con relacion a la temperatura ambiente, por ejemplo 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C o 44°C. Alternativamente, la composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede liofilizarse. La liofilizacion es un metodo rutinario utilizado en la tecnica (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nums. 4,619,257; 4,676,070; 4,799,361; 4,865,871; 4,964,280; 5,024,838; 5,044,165; 5,154,007; 6,194,136; 5,336,616; 5,364,756; y 5,780,295), estando disponible equipo adecuado de fuentes comerciales tales como Labconco (Kansas City, MI, EE. UU.). La liofilizacion implica la eliminacion de agua u otro disolvente de un producto congelado por un proceso denominado sublimacion. La sublimacion se produce cuando un lfquido congelado (solido) pasa directamente al estado gaseoso sin pasar por la fase lfquida. Los expertos en la tecnica son perfectamente conocedores de las diferentes metodologfas de liofilizacion disponibles en la tecnica [vease, por ejemplo, "A Guide a Freeze-drying for the Laboratory" - una publicacion de servicio para la industria por Labconco, (2004); y Franks (1994) Proc. Inst. Refrigeration. 91: 32-39]. La liofilizacion puede realizarse por cualquiera de una diversidad de metodos, que incluyen, por ejemplo, los metodos de colector, lotes, o a granel.

En algunas realizaciones, las moleculas de la ATM (por ejemplo, moleculas de colageno), con sustratos de malla, pueden reticularse químicamente (por ejemplo, unirse covalentemente) consigo mismas y/o, con el sustrato de malla. Los agentes qrnmicos de reticulacion pueden ser homobifuncionales (tiene lugar la misma reaccion química en cada extremo del enlazador) o heterobifuncionales (tienen lugar reacciones qrnmicas diferentes en los extremos del enlazador). Las qrnmicas disponibles para tales reacciones de union incluyen, pero sin caracter limitante, reactividad con grupos sulfhidrilo, amino, carboxilo, diol, aldetndo, cetona, u otros grupos reactivos utilizando qrnmicas electrofilas o nucleofilas, asf como reticuladores fotoqmmicos que utilizan radicales alquilo o azido aromatico o carbonilo. Los ejemplos de agentes qrnmicos de reticulacion incluyen, sin limitacion, aldetndo glutarico, carbodiimidas, bisdiazobencidina, y ester N-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida. Los reticulantes qrnmicos estan disponibles ampliamente de fuentes comerciales (por ejemplo, Pierce Biotechnology (Rockford, IL); Invitrogen (Carlsbad, CA); Sigma-Aldrich (St.Louis, MO); y US Biological (Swampscott, MA)). Los reactivos de reticulacion particularmente adecuados incluyen clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDAC) y N-hidroxisulfosuccinimida (NHS).

Generalmente, la reticulacion puede llevarse a cabo por hidratacion de la malla recubierta o pelfcula dermica seca directamente en una solucion de un reactivo de reticulacion. Alternativamente, reactivos de reticulacion que son activos a pH acido pueden anadirse a la ATM hinchada con acido antes de verter la ATM sobre la malla o aplicarla directamente al sustrato. La duracion de la reaccion de reticulacion puede variar conforme al agente de reticulacion que se utilice, la concentracion de reactivo, la procedencia de la ATM, el tipo de sustrato de malla, la temperatura de reaccion y la resistencia a la traccion deseada.

Opcionalmente, las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden someterse a tratamientos a fin de disminuir la biocarga. Se espera que este proceso reduzca el nivel de microorganismos infecciosos en las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos. Como se utiliza en el presente documento, un proceso utilizado para inactivar o destruir "sustancialmente todos" los microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos (incluidas las levaduras), y/o virus en las composiciones biocompatibles para reparacion de tejidos es un proceso que reduce el nivel de microorganismos en las composiciones biocompatibles para reparacion de tejidos en al menos 10 veces (por ejemplo, al menos: 100 veces; 1.000 veces; 104 veces; 105 veces; 106 veces; 107 veces; 108 veces; 109 veces; o incluso 1010 veces) en comparacion con el nivel de las composiciones biocompatibles para reparacion de tejidos antes del proceso. Puede utilizarse cualquier metodo estandar de ensayo para determinar si el proceso ha sido satisfactorio. Estos ensayos pueden incluir tecnicas que miden directamente el crecimiento microbiano, por ejemplo el cultivo de muestras de frotis en medios de cultivo artificiales, o metodos de deteccion molecular, tales como PCR cuantitativa.

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden exponerse a haces de rayos y, x, e, y/o ultravioleta (longitud de onda de 10 nm a 320 nm, por ejemplo, 50 nm a 320 nm, 100 nm a 320 nm, 150 nm a 320 nm, 180 nm a 320 nm, o 200 nm a 300 nm) a fin de reducir o eliminar el nivel de bacterias y/u hongos viables y/o virus infecciosos. Mas importante que la dosis de radiacion a la que se exponen las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos es la dosis absorbida por las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos. Aunque para composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos mas gruesas la dosis absorbida y la dosis de exposicion estaran generalmente proximas, en las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos mas finas la dosis de exposicion puede ser mayor que la dosis absorbida. Adicionalmente, si se administra una dosis de radiacion particular a una tasa de dosificacion baja durante un periodo de tiempo largo (por ejemplo, dos a 12 horas), se absorbe mas radiacion que si se administra a una tasa de dosis alta durante un periodo de tiempo corto (por ejemplo, 2 segundos a 30 minutos). El experto en la tecnica conocera el modo de ensayar si, para una composicion biocompatible de reparacion de tejidos particular, la dosis absorbida es significativamente menor que la dosis a la que se exponen las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos y como tener en cuenta dicha discrepancia en la seleccion de una dosis de exposicion. Las dosis absorbidas apropiadas de irradiacion con haces y, x, o e pueden ser 6 kGy - 45 kGy, por ejemplo, 8 kGy - 38 kGy, 10 kGy - 36 kGy, 12 kGy - 34 kGy. Asf, la dosis de irradiacion con haces y, x, y/o e puede ser, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, o 34 kGy.

Los componentes de las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos, la ATM fragmentada y la malla biocompatible, mezclados o separados, pueden irradiarse (a cualquiera de las dosis anteriores) en cualquier etapa de la preparacion de la composicion biocompatible de reparacion de tejidos. Adicionalmente, la irradiacion de la composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede ser la segunda o incluso la tercera exposicion de los componentes de la composicion biocompatible de reparacion de tejidos a irradiacion. Asf, por ejemplo, la ATM fragmentada y la malla biocompatible pueden irradiarse por separado, mezclarse para formar la composicion de malla biocompatible y, despues de ello, la composicion de malla biocompatible puede irradiarse.

Generalmente, la composicion biocompatible de reparacion de tejidos se rehidrata antes del injerto o implantacion. Alternativamente, la composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede insertarse o implantarse sin rehidratacion previa; en este caso, la rehidratacion ocurre in vivo. Para la rehidratacion, la composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede incubarse en cualquier solucion biologicamente compatible, por ejemplo, solucion salina normal, solucion salina tamponada con fosfato, lactato de Ringer o medio de cultivo de celulas estandar. La composicion biocompatible de reparacion de tejidos se incuba en una solucion durante un tiempo suficiente para que la composicion biocompatible de reparacion de tejidos se hidrate por completo o recupere sustancialmente la misma cantidad de agua que contiene la mezcla a partir de la cual se preparo la composicion biocompatible de reparacion de tejidos. Generalmente, el tiempo de incubacion en la solucion de rehidratacion sera de aproximadamente quince segundos a aproximadamente una hora, por ejemplo, de aproximadamente cinco minutos a aproximadamente 45 minutos, o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos. "Aproximadamente" indica que el tiempo de incubacion puede variar en hasta un 20% por encima o por debajo del valor citado. Asf, un tiempo de incubacion de "aproximadamente " 30 minutos puede incluir, por ejemplo, 24 minutos, 25 minutos, 26 minutos, 27 minutos, 28 minutos, 29 minutos, 30 minutos, 31 minutos, 32 minutos, 33 minutos, 34 minutos, 35 minutos, o 36 minutos. La solucion de rehidratacion puede reemplazarse opcionalmente con solucion nueva tantas veces como se desee. La temperatura de las incubaciones sera generalmente la temperatura ambiente (por ejemplo, la de la sala) o puede ser de aproximadamente 15°C a aproximadamente 40°C, por ejemplo, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 35°C. "Aproximadamente" indica que la temperatura puede variar en hasta 2°C por encima o por debajo del valor citado. Asf, una temperatura de "aproximadamente " 30°C puede incluir, por ejemplo, 28,0 °C, 28,5 °C, 29,0 °C, 2,95 °C, 30,0 °C, 30,5 °C, 31,0 °C, 31,5 °C, o 32,0 °C. La vasija que contiene la composicion biocompatible de reparacion de tejidos y la solucion de rehidratacion puede agitarse suavemente durante la incubacion, en caso deseado. Despues de la rehidratacion, la composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede conformarse o recortarse ulteriormente en una forma adecuada para implantacion en un sitio particular.

III. Reparacion de tejidos y organos

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos descritas en esta memoria pueden utilizarse para tratar cualquiera de una amplia gama de trastornos en los cuales es necesaria mejora o reparacion de tejidos. Los defectos tisulares pueden surgir de diversas dolencias medicas, que incluyen, por ejemplo, malformaciones congenitas, lesiones traumaticas, infecciones, y resecciones oncologicas. Asf, las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden utilizarse para reparar defectos en cualquier tejido blando, por ejemplo tejidos que conectan, soportan, o rodean otras estructuras y organos del cuerpo. Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden utilizarse tambien como soporte de una reparacion osea (por ejemplo, como un injerto de periostio para soportar hueso o un injerto articular para estimular la reparacion de cartflago. El tejido blando puede ser cualquier tejido no oseo. El tejido blando puede ser tambien tejido epitelial, que cubre el exterior del cuerpo y reviste los organos y cavidades en el interior del cuerpo. Los ejemplos de tejido epitelial incluyen, pero sin caracter limitante, epitelios escamosos simples, epitelios escamosos estratificados, epitelios cuboidales, o epitelios columnares.

El tejido blando puede ser un tejido conjuntivo, que funciona para generar y soportar otros tejidos. Un ejemplo de tejido conjuntivo es tejido conjuntivo blando (conocido tambien como tejido conjuntivo areolar). El tejido conjuntivo blando, que funciona para fijar los epitelios a tejidos subyacentes y para mantener los organos en su sitio, es el tipo de tejido conjuntivo mas ampliamente distribuido en los vertebrados. Se puede encontrar en la piel bajo la hoja de la dermis; donde el epitelio se une a otros tejidos; bajo el tejido epitelial de todos los sistemas del organismo que tienen aberturas externas; en el interior de las membranas mucosas de los sistemas digestivo, respiratorio, reproductor, y urinario; y rodeando los vasos sangumeos y los nervios. El tejido conjuntivo blando recibe su nombre de la "textura" blanda de sus fibras componentes entre las que se incluyen fibras de colageno, fibras elasticas (fibras largas, estirables a modo de hebra compuestas de la protema elastina) y fibras reticulares (fibras ramificadas constituidas por uno o mas tipos de fibras de colageno muy finas). El tejido conjuntivo puede ser tambien tejido conjuntivo fibroso, tal como tendones, que fijan musculos a huesos, y ligamentos, que unen los huesos entre sf en las articulaciones. El tejido conjuntivo fibroso esta compuesto fundamentalmente de fibras de colageno estrechamente compactadas, disposicion que maximiza la resistencia a la traccion. El tejido blando puede ser tambien tejido muscular. El tejido muscular incluye: musculo esqueletico, que es responsable de los movimientos voluntarios; musculo blando, que se encuentra en las paredes del tracto digestivo, las arterias de la vejiga y otros organos internos; y musculo cardiaco, que forma la pared contractil del corazon.

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden utilizarse para reparar tejidos blandos en muchos sistemas organicos diferentes que cumplen una gama de funciones fisiologicas en el cuerpo. Estos sistemas organicos pueden incluir, pero sin caracter limitante, el sistema muscular, el sistema genitourinario, el sistema gastroenterologico, el sistema tegumentario, el sistema circulatorio y el sistema respiratorio. Las composiciones son particularmente utiles para reparaciones de tejido conjuntivo, con inclusion de la fascia, una capa especializada que rodea musculos, huesos y articulaciones, del torax y la pared abdominal y para reparacion y reforzamiento de debilidades tisulares en anatoirna urologica, ginecologica y gastroenterologica.

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos son muy adecuadas para la reparacion de hernias. Una hernia es la protrusion del contenido de una cavidad del cuerpo fuera de la cavidad del cuerpo en la que se encuentra normalmente contenido. Estos contenidos estan encerrados a menudo en la membrana delgada que reviste el interior de la cavidad del cuerpo; a la membrana y su contenido juntos se hace referencia como un "saco hernial". Muy comunmente, las hernias se desarrollan en el abdomen, cuando un adelgazamiento en la pared abdominal se expande en un orificio o defecto localizado a traves del cual se produce la protrusion intestinal. Estas debilidades de la pared abdominal ocurren tfpicamente en localizaciones de adelgazamiento natural de la pared abdominal, es decir, en sitios en los que existen aberturas naturales que permiten el paso de canales para vasos sangumeos que se extienden desde el abdomen a las extremidades y otros organos. Otras areas de posible debilidad son sitios de cualquier c io ^ a abdominal previa. Habitualmente, el tejido graso entra en primer lugar en una hernia, pero puede ir seguido de un segmento de intestino u otro organo intraabdominal. Si un segmento de organo interno queda atrapado en el interior del saco hernial de tal modo que el suministro de sangre al organo se dificulte, el paciente se encuentra en riesgo de complicaciones graves que incluyen bloqueo intestinal, gangrena, y muerte. Las hernias no se curan espontaneamente y a menudo aumentan de tamano a lo largo del tiempo, por lo que es necesaria la reparacion quirurgica para corregir la afeccion. En general, las hernias se reparan por reinsercion del saco hernial de nuevo en la cavidad del cuerpo seguido por reparacion del tejido muscular debilitado.

Existen muchas clases de hernias. Con la excepcion de las hernias inguinales y escrotales, que estan presentes unicamente en los varones, las hernias pueden encontrarse en sujetos de cualquier edad o sexo. Ejemplos de hernias incluyen: hernias inguinales directas, en las cuales el intestino puede aflorar en el canal inguinal a traves de la pared posterior del canal inguinal; hernias inguinales indirectas, en las cuales el intestino puede aflorar en el canal inguinal a traves de una debilidad en el apice del canal inguinal; hernias femorales, en las cuales el contenido abdominal penetra en el area debil creada por la etapa de los vasos sangumeos femorales a las extremidades inferiores; hernias escrotales, en los cuales el contenido del intestino aflora en el escroto; hernia de Spigel, en la cual la hernia ocurre a lo largo del borde del musculo recto abdominal; hernia obturadora, en la cual el contenido del abdomen (por ejemplo intestino u otros organos abdominales) penetran en el canal obturador, hernias lumbares, por ejemplo, hernia de Petit, en la cual la hernia se produce a traves del triangulo de Petit, el triangulo lumbar inferior, y hernia de Grynfeltt, en la cual la hernia se produce a traves del triangulo de Grynfeltt-Lesshaft, el triangulo lumbar superior; hernia de Richter, en la cual solo una pared lateral del intestino llega a estrangularse; hernia de Hesselbach, en la cual la hernia se produce a traves del triangulo de Hesselbach, hernia en pantalon, en la cual el saco hernial penetra en ambos lados de los vasos epigastricos inferiores para dar una hernia inguinal directa o indirecta combinada; hernia de Cooper; hernia epigastrica (en la cual la hernia ocurre entre el ombligo y la parte inferior de la caja toracica en la lmea media del abdomen); hernias de diafragma o de hiato, por ejemplo hernia de Bochdalek y hernia de Morgagni, en las cuales una porcion del estomago penetra a traves del hiato diafragmatico del esofago; y hernia umbilical, en la cual la protrusion es a traves del ombligo.

En contraste con las hernias de origen congenito, existen tambien hernias de incision, conocidas tambien como hernias ventrales o recurrentes, en el abdomen en el area de una cicatriz quirurgica antigua. Las hernias de incision tienen un mayor riesgo de reproducirse despues de reparacion quirurgica que las hernias congenitas. Ademas, en el caso de hernias recurrentes multiples, es decir hernias que reaparecen despues que se han realizado dos o mas reparaciones, la probabilidad de reparacion con exito disminuye con cada procedimiento subsiguiente.

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden utilizarse para tratar otras afecciones medicas que son resultado de debilidad tisular. Una condicion para que las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos sean utiles se da en la reparacion de los prolapsos de organo. El prolapso es una afeccion en la cual un organo, o parte de un organo, se cae o se desliza fuera de su sitio. El prolapso es tfpicamente resultado de una debilidad tisular que puede estar causada por factores congenitos, traumatismo o enfermedad. El prolapso de organos pelvicos puede incluir prolapso de uno o mas organos dentro del cinturon pelvico; la debilidad tisular debida a embarazo, parto y alumbramiento es una causa comun de la afeccion en las mujeres. Ejemplos de organos implicados en prolapso de organos pelvicos incluyen la vejiga (cistocele), que puede colapsar en la vagina; la uretra, que puede colapsar en la vagina; el utero, que puede prolapsar en la vagina; el intestino delgado (enterocele), que puede prolapsar contra la pared de la vagina; el recto (rectocele), que puede prolapsar contra la pared de la vagina; y el prolapso vaginal, en el cual una porcion del canal vaginal puede penetrar a traves de la abertura de la vagina. Dependiendo del organo implicado y la gravedad del prolapso, las pacientes con prolapso organico pelvico pueden experimentar dolor durante el acto sexual, frecuencia urinaria, incontinencia urinaria, infeccion del tracto urinario, deterioro renal, y estrenimiento. Los remedios incluyen opciones tanto no quirurgicas como quirurgicas; en casos graves, puede ser necesaria reconstruccion de los tejidos del suelo pelvico, es decir, las fibras musculares y el tejido conjuntivo que abarcan el area bajo la pelvis y proporcionan soporte a los organos pelvicos, por ejemplo, la vejiga, los intestinos inferiores, y el utero (en las mujeres).

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos son utiles tambien en reparaciones del sistema gastrointestinal. Las afecciones esofagicas que precisan reparacion incluyen, pero sin caracter limitante, rotura traumatica del esofago, por ejemplo smdrome de Boerhaave, smdrome de Mallory-Weiss, trauma asociado con perforacion iatrogenica esofagica que puede ocurrir como complicacion de un procedimiento endoscopico o insercion de un tubo de alimentacion o cirugfa no relacionada con ello; reparacion de defectos esofagicos congenitos, por ejemplo, atresia esofagica; y reseccion esofagica oncologica.

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden utilizarse para reparar tejidos que no se han reparado nunca o pueden utilizarse para reparar tejidos que se han tratado una o mas veces con composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos o con otros metodos conocidos en la tecnica, o pueden utilizarse junto con otros metodos de reparacion de tejidos que incluyen sutura, injerto de tejido, o materiales sinteticos de reparacion de tejidos.

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden aplicarse a un sujeto que precisa tratamiento utilizando metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden: (a) envolverse alrededor de un tejido que esta deteriorado o que contiene un defecto; (b) colocarse sobre la superficie de un tejido que esta deteriorado o tiene un defecto; (c) enrollarse e insertarse en una cavidad, abertura, o espacio en el tejido. Una o mas (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, o mas) de tales reparaciones de tejido biocompatible, apiladas o adyacentes una a otra, pueden utilizarse en cualquier sitio particular. Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos pueden mantenerse en su lugar mediante, por ejemplo, suturas, grapas, ligaduras, o colas o selladores de tejido conocidos en la tecnica. Alternativamente, si, por ejemplo, se compactan con estanqueidad suficiente en un defecto o cavidad, es posible que no se necesite dispositivo de fijacion alguno.

Agentes terapeuticos

Los agentes terapeuticos que favorecen la regeneracion de tejido pueden incluirse en las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos. Estos agentes pueden incluir celulas, factores de crecimiento o agentes terapeuticos de molecula pequena. Estos agentes pueden incorporarse a las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos antes de colocar las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos en el sujeto. Alternativamente, los mismos pueden inyectarse en la composicion biocompatible de reparacion de tejidos ya colocada en un sujeto. Estos agentes pueden administrarse aisladamente o en combinacion. Por ejemplo, una composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede utilizarse para suministrar simultaneamente celulas, factores de crecimiento y agentes terapeuticos de molecula pequena, o para suministrar celulas mas factores de crecimiento, o celulas mas agentes terapeuticos de molecula pequena, o factores de crecimiento mas agentes terapeuticos de molecula pequena.

Naturalmente, la administracion de los agentes arriba mencionados puede ser simple, o multiple, (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 80, 90, 100, o tantas como sean necesarias). En el caso de ser multiple, las administraciones pueden realizarse a intervalos de tiempo facilmente determinables por el experto en la materia. Las dosis de las diversas sustancias y factores pueden variar notablemente conforme a la especie, edad, peso, volumen, y sexo del sujeto, y el experto puede determinarlas con facilidad.

Las celulas viables histocompatibles pueden restablecerse en las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos para producir un injerto aceptado de modo permanente que puede remodelar el hospedador. Las celulas pueden derivarse del receptor propuesto o de un donante alogenico. Los tipos de celulas con las cuales pueden repoblarse las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos incluyen, pero sin caracter limitante, celulas no humanas del tallo embrionario (ESC), celulas adultas o embrionarias del tallo mesenquimatico (MSC), monocitos, celulas del tallo hematopoyetico, celulas epiteliales gingivales, celulas endoteliales, fibroblastos, o celulas del tallo de ligamentos periodontales, procondroblastos, condroblastos, condrocitos, proosteoblastos, osteocitos u osteoclastos. Puede utilizarse cualquier combinacion de dos o mas de estos tipos de celulas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) para repoblar la composicion biocompatible de reparacion de tejidos. Los metodos para aislar tipos espedficos de celulas son bien conocidos en la tecnica. Las celulas del donante pueden utilizarse inmediatamente despues de su recogida o pueden cultivarse in vitro utilizando tecnicas estandar de cultivo de tejido. Las celulas del donante pueden infundirse o inyectarse en la composicion biocompatible de reparacion de tejidos in situ inmediatamente antes de la colocacion de la composicion biocompatible de reparacion de tejidos en un sujeto mairnfero. Las celulas del donante pueden cocultivarse tambien con la composicion de reparacion de tejidos biocompatible utilizando metodos estandar de cultivo de tejido conocidos por los expertos en la tecnica.

Los factores de crecimiento que pueden incorporarse a la composicion biocompatible de reparacion de tejidos incluyen cualquiera de una amplia gama de factores de crecimiento de celulas, factores angiogenicos, factores de diferenciacion, citocinas, hormonas, y quimiocinas conocidas en la tecnica. Los factores de crecimiento pueden ser polipeptidos que incluyen la secuencia completa de aminoacidos de un factor de crecimiento, un peptido que corresponde a solo un segmento de la secuencia de aminoacidos del factor de crecimiento natural, o un peptido que se deriva de la secuencia natural que retiene las propiedades bioactivas del factor de crecimiento natural. Cualquier combinacion de dos o mas de los factores puede administrarse a un sujeto por cualquiera de los medios citados a continuacion. Los ejemplos de factores relevantes incluyen factores de crecimiento de celulas endoteliales vasculares (VEGF) (por ejemplo, VEGF A, B, C, D, y E), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento semejante a insulina (IGF) I e IGF-II, interferones (IFN) (por ejemplo, IFN-a, p, o y), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) (por ejemplo, FGF 1-10), factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de queratinocitos, factores de crecimiento transformante (TGF) (por ejemplo, TGF a o p), factor de necrosis tumoral-a, una interleucina (IL) (por ejemplo, IL-1 a IL-18), Osterix, Hedgehogs (por ejemplo, erizo o desierto), SOX9, protemas morfogeneticas oseas (BMP), en particular, las BMP 2, 4, 6 y 7 (BMP-7 tambien se conoce como OP-1), hormona paratiroidea, calcitonina, prostaglandinas, o acido ascorbico.

Los factores que son protemas pueden suministrarse tambien a un sujeto receptor por administracion al sujeto de: (a) vectores de expresion (por ejemplo, plasmidos o vectores vmcos) que contienen secuencias de acido nucleico que codifican uno cualquiera o mas de los factores arriba indicados que son protemas; o (b) celulas que han sido transfectadas o transducidas (de manera estable o transitoria) con tales vectores de expresion. Dichas celulas transfectadas o transducidas se derivaran preferiblemente de, o seran histocompatibles con, el receptor. Sin embargo, es posible que solo se requiera una corta exposicion al factor y por tanto, es posible que puedan utilizarse tambien celulas histoincompatibles.

Tambien pueden incorporarse farmacos de molecula pequena a la composicion biocompatible de reparacion de tejidos, facilitando as ^ el suministro localizado de farmacos. Las hernias recurrentes pueden ser resistentes a la reparacion, debido, en algunos casos, a colonizacion bacteriana indolente que debilita el sitio de reparacion y retarda la curacion. La administracion sistemica de antibioticos a largo plazo puede ser solo parcialmente eficaz contra tales infecciones subclmicas. La incorporacion de agentes antimicrobianos a la composicion biocompatible de reparacion de tejidos puede proporcionar concentraciones locales elevadas de antibioticos, minimizando con ello el riesgo de efectos adversos asociado con las dosis sistemicas elevadas a largo plazo. Un agente antimicrobiano puede ser un antibiotico. Los ejemplos de antibioticos incluyen, sin limitacion, clases representativas de antibioticos cualesquiera, por ejemplo, 1) aminoglicosidos, tales como gentamicina, kanamicina, neomicina, estreptomicina o tobramicina; 2) cefalosporinas, tales como cefaclor, cefadroxil o cefotaximo; 3) macrolidos, tales como azitromicina, claritromicina, o eritromicina; 4) penicilinas, tales como amoxicilina, carbenicilina o penicilina; 5) peptidos, tales como bacitracina, polimixina B o vancomicina; 6) quinolonas, tales como ciprofloxacino, levofloxacino, o enoxacino; 7) sulfonamidas, tales como sulfametazol, sulfazetidina; o sulfametoxazol; 8) tetraciclinas, tales como doxiciclina, minociclina o tetraciclina; 8) otros antibioticos con mecanismos de accion diversos tales como rifampina, cloranfenicol, o nitrofurantoma. Otros agentes antimicrobianos, por ejemplo, agentes antifungicos y agentes antivmcos pueden incluirse tambien en las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos.

Tambien pueden incluirse agentes quimioterapeuticos en las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos. Los tumores malignos que aparecen en tejidos blandos, incluyendo por ejemplo los tumores de esofago, estomago, colon y vejiga se tratan tfpicamente por reseccion del tumor y administracion sistemica de farmacos antineplasicos. La incorporacion de agentes antineplasicos a las composiciones de reparacion tejidos biocompatibles puede proporcionar altas concentraciones locales de quimioterapia, mitigando con ello la toxicidad asociada con dosis sistemicas elevadas a largo plazo. Los ejemplos de clases de agentes quimioterapeuticos incluyen, sin limitacion, 1) agentes alquilantes, por ejemplo, ciclofosfamida; 2) antraciclinas, por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina; 3) disruptores cicloesqueleticos, por ejemplo, paclitaxel; 4) inhibidores de topoisomerasas, por ejemplo, etoposido; 5) analogos de nucleotidos, por ejemplo, azacitidina, fluorouracilo, gemcitabina; 6) peptidos, por ejemplo, bleomicina; 7) agentes basados en platino, por ejemplo, carboplatino, cisplatino; 8) retinoides, por ejemplo, acido todo-trans-retinoico; y 9) alcaloides de la vinca, por ejemplo, vinblastina o vincristina.

IV. Artfculos de Fabricacion

Las composiciones biocompatibles de reparacion de tejidos proporcionadas en esta memoria pueden estar incluidas en un artfculo de produccion o como un kit. En una realizacion, el kit puede incluir la composicion biocompatible de reparacion de tejidos, material de envasado, o un prospecto que comprende instrucciones para un metodo de tratamiento. El material de envasado puede incluir componentes que promueven la estabilidad y esterilidad a largo plazo de la composicion biocompatible de reparacion de tejidos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Metodos y Materiales

Preparacion de la matriz de tejido acelular (ATM). Se preparo ATM a partir de tejido dermico de porcino proporcionado por minilechones de Yucatan. El tejido dermico de porcino se proceso conforme a los protocolos estandar LifeCell como sigue. Se incubo el tejido en medio RPMI 1640 que contema EDTA 20 mM durante 24 horas a 4°C. Se retiro la epidermis de la piel por incubacion de la muestra de tejido con agitacion suave en una solucion de desepidermizacion (solucion salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 10 mM, Triton X-100 al 0,5%, con lincomicina, vancomicina, polimixina B y cefoxitina) durante 22,5 horas a la temperatura ambiente. La capa epidermica se separo luego ffsicamente de la dermis. Se desecho la epidermis y la dermis se sometio a procesamiento ulterior. Los componentes celulares y los residuos se retiraron por lavado de la dermis en solucion de descelularizacion (HEPES 10 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, desoxicolato de sodio al 2 %) durante 15 minutos, seguido por agitacion suave en un lote reciente de solucion de descelularizacion durante 18 horas a la temperatura ambiente. La dermis se incubo luego en solucion de ADNsa (HEPES 20 mM, pH 7,2, cloruro de calcio 20 mM, cloruro de magnesio 20 mM, y 1 U/ml de ADNsa (Pulmozyme®, Genentech, South San Francisco, CA), seguido por lavado en PBS, EDTA 10 mM, pH 7,2. La dermis tratada con ADNsa se incubo luego en solucion de precongelacion y se liofilizo para producir la ATM en forma de hoja (XenoDerm™). La XenoDerm™ se micronizo utilizando un molino de congelacion Spex-Certiprep. El tamano de partfcula aproximado de la XenoDerm™ micronizada estaba comprendido entre aproximadamente 100 y 200 pm. El material micronizado se utilizo como material de partida en la preparacion de la malla recubierta y las pelfculas dermicas como se describe en los ejemplos que siguen.

Determinacion del contenido en crioprotector de la dermis de porcino micronizada. 100 mg de tejido micronizado se lavaron 3 veces con agua para eliminar el crioprotector soluble. El material lavado se liofilizo y se peso a continuacion. Se determino que la dermis de porcino micronizada estaba constituida aproximadamente por 50% de crioprotector y 50% de matriz de tejido acelular (ATM).

Hinchamiento de la ATM en acido acetico Se determino empmcamente una concentracion util de acido acetico para hinchamiento de una matriz de tejido regenerativa (ATM). 50 mg de dermis de porcino micronizada, que contema 26 mg de ATM, se lavaron 3 veces con agua, y se suspendieron luego en 5 ml de acido acetico a las concentraciones indicadas en la Tabla 1. Las muestras de ATM se incubaron durante 3 horas a la temperature ambiente con mezclado ocasional. Las partfculas de ATM hinchadas se dejaron sedimentar, y se registro el volumen ocupado por la ATM hinchada; despues de ello, se sometieron las muestras a centrifugacion a baja velocidad y se registro el volumen compactado de los sedimentos de ATM. El acido acetico 100 mM (pH aproximado de 2,6) produjo casi el hinchamiento maximo de la ATM, es decir, la magnitud de la diferencia entre volumen hinchado y compactado, como se evaluo por gravedad o centrifugacion (Tabla 1). Para concentraciones menores de acido acetico, el hinchamiento de la ATM no era uniforme, produciendo una suspension no homogenea con grandes partfculas. Los intentos de aumentar la concentracion de ATM a valores mayores que 0,5% de ATM (peso/volumen) dieron como resultado la formacion de una suspension no homogenea que contema numerosas partfculas que no se disipaban ni por adicion de sal (cloruro de sodio 10 mM) ni por aumento del pH (>3,0).

Tabla 1: Hinchamiento de la ATM en acido acetico

La integridad de las fibras de colageno en la ATM hinchada con acido se evaluo por microscopfa electronica de transmision (TEM). Las muestras de dermis humana micronizada (Cymetra™) se rehidrataron en acido acetico 50, 100, 250 o 500 milimolar. Se elimino el acido por lavado en solucion salina al 0,9% y las muestras se prepararon para microscopfa electronica de transmision. Se observo la periodicidad del colageno en fibras de colageno individuales de todas las muestras analizadas, sin diferencia aparente alguna en el patron de formacion de bandas o el tamano de las fibras. Se observo un aumento en la separacion de las fibras de colageno que parecfa proporcional a la concentracion de acido acetico utilizada para rehidratar la Cymetra™.

Ejemplo 2: Preparacion y comparacion de la malla de polipropileno recubierta de pelfcula y recubierta con esponja

Los pasos iniciales en la preparacion de la malla recubierta de pelfcula y recubierta con esponja fueron identicos. En resumen, la ATM se hincho en acido y se vertio sobre malla de polipropileno. El secado de la malla recubierta en una atmosfera de nitrogeno/aire produjo una malla recubierta uniformemente, de aproximadamente 0,5 mm de espesor, que se asemejaba a celofan; este material se denomina como “malla recubierta de pelfcula”. En contraste, la liofilizacion de la malla recubierta dio como resultado un material de baja consistencia, de aproximadamente 2-3 mm de espesor, que se asemejaba a un ovillo de algodon; este material se denomina como “malla recubierta de esponja”. Preparacion de la malla de polipropileno recubierta de pelfcula. Se lavo la ATM (2,5 mg ATM/cm2 de malla de polipropileno) 3 veces en agua para eliminar el crioprotector y las sales residuales, y se hincho luego en acido acetico 100 milimolar a una concentracion final de ATM al 0,5% durante 3 horas a la temperatura ambiente. La malla de polipropileno (malla PROLENE, Ethicon, Inc.) se corto en trozos de aproximadamente 7,5 cm por 2,5 cm, y cada trozo se dispuso individualmente en un solo pocillo (8 cm x 3 cm) de una capsula de poliestireno de 4 pocillos (Nunc, n.° de catalogo 267061). La ATM hinchada con acido se vertio sobre la malla hasta una profundidad de aproximadamente 5 mm y la capsula se incubo durante una noche en atmosfera de nitrogeno. La malla recubierta de pelfcula, una vez seca, se desprendio de la capsula, se hidrato durante 15 minutos en acido acetico 100 milimolar, se invirtio y se transfirio a un recipiente de poliestireno limpio. La ATM hinchada con acido preparada recientemente se vertio de nuevo sobre la malla recubierta de pelfcula, que se seco luego durante una noche en atmosfera de nitrogeno. La malla doblemente recubierta y seca se retiro luego del recipiente de poliestireno.

En algunos casos, la malla de ATM recubierta de pelfcula se sometio a un procedimiento de reticulacion. La malla recubierta y seca se incubo durante 3 horas a la temperatura ambiente en acido 4-morfolinetanosulfonico (MES) 100 milimolar, de pH 5,4, clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDAC) 20 mM, N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) 10 mM y lisina 0,5 |j ^{M .}La malla reticulada se lavo en solucion salina y se guardo hidratada antes de su analisis in vitro o in vivo. Preparacion de la malla de polipropileno recubierta de esponja. Se lavo la ATM (2,5 mg ATM/cm2 de malla de polipropileno) 3 veces en agua para eliminar el crioprotector y las sales residuales, y se hincho luego en acido acetico 100 milimolar a una concentracion final de ATM al 5% durante 3 horas a la temperatura ambiente. La malla de polipropileno (malla PROLENE, Ethicon, Inc.) se corto en trozos de aproximadamente 7,5 cm por 2,5 cm, y cada trozo se dispuso individualmente en un solo pocillo (8 cm x 3 cm) de una capsula de poliestireno de 4 pocillos (Nunc, n.° de catalogo 267061). La ATM hinchada con acido se vertio sobre la malla (2,5 mg de ATM/cm2 de malla) hasta una profundidad de aproximadamente 5 mm. La ATM hinchada con acido se vertio sobre la malla, que se liofilizo luego. La malla de poliestireno recubierta de esponja y seca se retiro luego del recipiente de poliestireno.

En algunos casos, la malla de ATM recubierta de esponja se sometio a un procedimiento de reticulacion. La malla recubierta y seca se incubo durante 3 horas a la temperatura ambiente en acido 4-morfolinetanosulfonico (MES) 100 milimolar, de pH 5,4, clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDAC) 20 mM, N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) 10 mM y lisina 0,5 pM. La malla reticulada se lavo en solucion salina y se guardo hidratada antes de su analisis in vitro o in vivo.

La ATM hinchada con acido formo peffculas y esponjas uniformes una vez seca. Cuando se rehidrato con tampones fisiologicos, las peffculas y las esponjas se manteman intactos y conservaban su forma original. Sin tratamiento acido, el tejido micronizado seco no lograba mantener su forma cuando se hidrataba. Biomecanicamente, las peffculas eran mas resistentes (tanto al tacto como por ensayos cuantificables) comparados con las esponjas.

Resistencia a la traccion de las peffculas y las esponjas. Se prepararon peffculas y esponjas exactamente como se ha descrito en los metodos anteriores, excepto que se omitio de las muestras la malla de polipropileno. Las peffculas y las esponjas se rehidrataron y se evaluo su resistencia a la traccion utilizando un modulometro Instron 5865 (Instron Corporation, Norwood, MA.) conforme a las especificaciones del fabricante. Los resultados de este experimento se muestran a continuacion en la Tabla 2. Los valores representan el esfuerzo medio maximo de dos muestras separadas. Las peffculas reticuladas mostraron la mayor resistencia global y toleraron aproximadamente 20-25% del esfuerzo maximo tolerado por la ATM normal liofilizada (Xenoderm™).

Temperatura de desnaturalizacion de la matriz extracelular de peffculas y esponjas. Se evaluo tambien el potencial de la ATM hinchada para mantenerse estable en condiciones fisiologicas por metodos in vitro que inclman, por ejemplo, medida de la temperatura de desnaturalizacion de la matriz extracelular y sensibilidad a la colagenasa de la ATM hinchada con acido. La temperatura de desnaturalizacion de la matriz extracelular se evaluo por calorimetna de barrido diferencial (DSC). Se pusieron muestras hidratadas en bandejas DSC de alto volumen, se sellaron y se analizaron en un equipo DSC Q100 (TA Instruments) utilizando una temperatura de equilibrado de 2 °C con un aumento de 2,5 °C/minuto hasta 95 °C. Las peliculas y las esponjas se prepararon exactamente como se describe en los metodos anteriores, excepto que se omitio de las muestras la malla de polipropileno. Como se indica en la Tabla 3, la reticulacion parecfa aumentar la temperatura requerida para desnaturalizar la matriz de colageno. En contraste, las temperaturas de desnaturalizacion de los peliculas y esponjas no reticuladas eran ligeramente menores que la de la dermis de porcino micronizada a partir de la cual se habfan producido aquellas, lo que indicaba que la organizacion estructural global del colageno en los peliculas y esponjas era similar a la del colageno nativo. Ademas, la temperatura de desnaturalizacion de las peliculas y esponjas era mas alta que la temperatura normal del cuerpo de los mairnferos de 37°C, lo que indicaba que los peliculas y esponjas senan estables en condiciones fisiologicas.

Analisis histologico de la malla de polipropileno recubierta de peffcula y esponja. Se prepararon muestras de malla de polipropileno recubiertas con peffcula y esponja como se ha descrito arriba, se cortaron luego y se tineron con hematoxilina y eosina (H&E). Un material eosinofflico denso rodeaba la malla de polipropileno en las muestras de malla recubiertas con peffcula; en contraste, un retfculo flojo de material eosinofflico rodeaba la malla de polipropileno en las muestras de malla recubiertas con esponja. Los haces de colageno, encontrados ffpicamente en la matriz dermica, no se observaron en las muestras de malla de polipropileno recubiertas con peffcula o esponja, aunque se apreciaban artefactos histologicos asociados con la parafina incluida en la malla, lo que sugena la necesidad de su inclusion en el plastico antes del seccionamiento.

Ejemplo 3: Biocompatibilidad de la malla de polipropileno recubierta de pelfcula y esponja

La biocompatibilidad de la malla recubierta de pelfcula y esponja se evaluo in vivo en un experimento de evolucion temporal utilizando un modelo de rata inmunocompetente. Las muestras de malla recubiertas con pelfcula y esponja, preparadas con y sin reticulacion como se describe en el Ejemplo 2, se implantaron subdermicamente y se retiraron para analisis al cabo de 1, 3 y 5 semanas despues de la implantacion. Las muestras de control inclrnan malla de polipropileno sin recubrir y Xenoderm™ en hoja. Se implantaron tres replicas de cada artfculo de ensayo para cada punto temporal. Los implantes se insertaron en bolsas subdermicas pequenas (4 por rata) creadas en la superficie dorsal de los animales. Despues de la insercion de los artfculos de ensayo, se cerraron las heridas con grapas quirurgicas.

Se realizo el analisis histologico cualitativo de los explantes para evaluar la repoblacion celular, la vascularizacion, la inflamacion y la persistencia de la matriz extracelular implantada. La repoblacion celular y la vascularizacion se valoraron por evaluacion de secciones histologicas con hematoxilina y eosina; la inflamacion se evidencio por la presencia de celulas con nucleos redondos tenidos intensamente; la persistencia de la matriz extracelular se evidencio por una tincion eosinofflica rosada uniforme, caractenstica del citoplasma celular y las protemas de la matriz extracelular.

Los analisis histologicos indicaban que las muestras de control de malla de polipropileno sin recubrimiento exhidan una respuesta fibrotica inflamatoria densa 1 semana despues de la implantacion, que disminma solo ligeramente 3 y 5 semanas despues de la implantacion. El control positivo, XenoDerm™ en hoja que, como se ha descrito arriba, carece de un componente de malla de polipropileno, exhida una respuesta inflamatoria relativamente menor en el sitio de implantacion, con una repoblacion incrementada a lo largo del curso del periodo de tiempo de 5 semanas. Tanto la malla de polipropileno recubierta de esponja como la malla de polipropileno recubierta de esponja reticulada eran fragiles y tendfan a desprenderse durante el procedimiento de implantacion. Se observaron respuestas inflamatorias similares a la observada para las muestras de control de malla de polipropileno sin recubrir, tanto para las muestras de esponja no reticuladas como para las reticuladas, aunque estaban todavfa presentes pequenas areas de matriz extracelular en las ultimas cinco semanas despues de la implantacion. Se observo inflamacion moderada tanto para la malla de polipropileno recubierta de pelfcula como para las muestras de malla de polipropileno recubiertas con pelfcula reticuladas. No obstante, se observo persistencia de matriz extracelular, asf como repoblacion celular, para las muestras de malla de polipropileno recubiertas con pelfcula a lo largo del periodo de tiempo de 5 semanas, en tanto que no se observo evidencia alguna de repoblacion celular para las muestras de malla de polipropileno reticuladas recubiertas de pelfcula. Asf, las preparaciones de malla recubiertas de pelfcula exhidan el grado maximo de biocompatibilidad basadas en la persistencia de la ATM, un nivel de inflamacion relativamente bajo, y la capacidad para repoblarse y revascularizarse.

Ejemplo 4: Preparacion de malla de polipropileno y pelfculas dermicas utilizando un metodo de secado termico

La malla de polipropileno recubierta de pelfcula utilizada en los Ejemplos 7, 10 y 11 y las pelfculas dermicas utilizadas en los Ejemplos 5, 6, 7, 8, y 9 se prepararon como sigue.

Las pelfculas dermicas ilustradas en la presente memoria no forman parte de la invencion reivindicada. Preparacion de la malla de polipropileno recubierta de pelfcula. Las hoja XenoDerm™ liofilizada se micronizo de acuerdo con el metodo descrito anteriormente. La ATM se lavo en agua para eliminar el crioprotector y las sales residuales, y se hincho luego en acido acetico 100 mM a una concentracion final de ATM al 0,5% durante 3 horas. Las temperaturas de hinchamiento estaban comprendidas de 32 a 40°C como se detalla en los Ejemplos espedficos que siguen. La ATM hinchada con acido se vertio en una capsula de poliestireno y la malla de poliestireno (trozos de 7,5 cm x 2,5 cm) se sumergio en la solucion de ATM hasta una profundidad de aproximadamente 1 cm; se utilizaron 0,75 mg de ATM hinchada con acido por cm2 de malla de polipropileno. La malla de polipropileno se recubrio una sola vez. Las muestras se secaron como se indica mas adelante en los Ejemplos 7, 10 y 11. Preparacion de las pelfculas dermicas. Se prepararon pelfculas dermicas, que no conternan malla de polipropileno, como sigue. Las hoja XenoDerm™ liofilizada se micronizo de acuerdo con el metodo descrito anteriormente. La ATM se lavo en agua para eliminar el crioprotector y las sales residuales, y se hincho luego en acido acetico 100 mM a una concentracion final de ATM al 0,5% durante 3 horas. Las temperaturas de hinchamiento estaban comprendidas de 32 a 40°C como se detalla en los Ejemplos espedficos que siguen. La solucion de ATM hinchada con acido se vertio en una capsula de poliestireno hasta una profundidad de aproximadamente 0,5 cm; se utilizaron 0,75 mg de ATM hinchada con acido por cm2 de la capsula de poliestireno. Las muestras se secaron como se indica a continuacion en los Ejemplos 5, 6, 8, y 9.

Ejemplo 5: Temperatura de desnaturalizacion de la matriz extracelular de las pelfculas dermicas.

Se prepararon pelfculas dermicas como se describe en el Ejemplo 4 anterior utilizando ATM que se hada hinchado a la temperatura ambiente; las pelfculas se secaron en atmosfera de nitrogeno a la temperatura ambiente o en un bloque de calentamiento a 33°C, 37°C, o 43°C. Se incluyeron como control positivo pelfculas que se hadan preparado usando el metodo de reticulacion descrito en el Ejemplo 3. Los perfiles de desnaturalizacion de la matriz extracelular de los materiales resultantes se evaluaron por calorimetna de barrido diferencial (DSC). Como se indica en la Tabla 5, las temperaturas de desnaturalizacion de las peKculas secadas a 33°C y 37°C fueron similares a las de pelfculas de control que se hadan secado a la temperatura ambiente, mientras que la temperatura de desnaturalizacion de las pelfculas secados a 43°C era reducida con relacion a los pelfculas de control. La reticulacion pareda aumentar la temperatura requerida para desnaturalizar la matriz de colageno. Estos datos sugenan que, como la temperatura de desnaturalizacion de las pelfculas era mayor que la temperatura corporal normal de los mairnferos de 37°C, las pelfculas senan estables a las temperaturas fisiologicas.

T l : D n r liz i n rmi l li l rmi

Ejemplo 6: Sensibilidad de las pelfculas dermicas a las colagenasas.

El potencial para que el recubrimiento de ATM persista en condiciones fisiologicas se evaluo tambien por medida de la sensibilidad de las pelfculas dermicas a las colagenasas. Optimamente, el recubrimiento de ATM debena persistir lo bastante para permitir la repoblacion celular de la matriz, pero manteniendo lo suficiente la estructura nativa del colageno para permitir la renovacion normal del colageno. Se prepararon pelfculas dermicas como se describe en el Ejemplo 4 anterior utilizando ATM que se hada hinchado a la temperatura ambiente secada en atmosfera de nitrogeno a la temperatura ambiente o sobre un bloque de calentamiento a 33°C, 37°C y 43°C. Algunas pelfculas que se hadan preparado utilizando el metodo de reticulacion descrito en el Ejemplo 3 anterior se incluyeron como controles positivos. Las muestras se digirieron con colagenasa y el porcentaje de colageno remanente en cada muestra, con relacion a la muestra sin digerir, se ensayo despues de 1, 2, 4, 6, y 24 horas de tratamiento con colagenasa. Para la digestion con colagenasa, se pusieron 15-20 mg de pelfcula seca en un tubo Eppendorf. Cada muestra se hidrato en 1 ml de Tris 10 mM, pH 7,4, CaCl25 mM, seguido por la adicion de 0,25 mg de colagenasa (25 pl de una solucion de 10 mg/ml) y se incubo a 37°C. En los momentos indicados, se enfriaron las muestras en hielo y el material insoluble (no digerido) se recogio por centrifugacion. Los sedimentos se secaron luego y se pesaron para determinar el porcentaje de tejido remanente. Como se indica en la Tabla 6, las pelfculas reticuladas eran casi completamente resistentes a la degradacion por las colagenasas. Las pelfculas secadas a temperaturas elevadas paredan ser ligeramente mas sensibles a las colagenasas que las secadas a la temperatura ambiente. El aparente aumento de material en algunos de los ultimos puntos temporales para algunas de las muestras refleja variabilidad en el contenido residual de humedad de los tamanos de muestra pequenos. Estos datos indicaron que el colageno en las pelfculas dermicas era accesible a la colagenasa y no se desnaturalizaba irreversiblemente, lo que sugiere que las fibrillas de colageno en la malla recubierta de ATM estanan sujetas a la renovacion fisiologica normal del colageno.

Tabla 6: Sensibilidad de las pelfculas dermicas a las colagenasas: porcentaje de colageno remanente a lo largo del tiem o.

Los porcentajes se refieren a porcentajes de colageno remanentes en la muestra despues del tratamiento con colagenasa

Ejemplo 7: Biocompatibilidad de la malla recubierta: Evaluacion en un modelo subdermico de rata inmunocompetente Se evaluo el efecto de la temperatura de preparacion sobre la biocompatibilidad de las muestras de malla recubiertas en un modelo subdermico de rata inmunocompetente. Resumidamente, la temperatura de hinchamiento de la ATM y la temperatura de secado de la malla recubierta se modificaron sistematicamente conforme a las condiciones siguientes de la Tabla 7. Se implantaron las muestras de malla recubierta, y los implantes se retiraron y evaluaron histologicamente a intervalos de 1, 3 y 5 semanas despues de la implantacion.

Los grupos experimentales se designaron de la A a F, y se sometieron a las condiciones siguientes. Las muestras B-F se sumergieron en la suspension de fragmentos de ATM hinchada relevante, y se trataron luego como sigue. Las muestras C y D se prepararon a partir de ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 molar a temperatura ambiente. Despues del recubrimiento, la muestra C se seco a 37°C y la muestra D se seco a 40°C. La muestra E se preparo a partir de ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 molar a 37°C; la muestra F se preparo a partir de ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 M a 40°C. Ambas muestras E y F se secaron a la temperatura ambiente. La muestra B se preparo a partir de ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 m a la temperatura ambiente, se habfa recubierto a la temperatura ambiente y se habfa secado luego a la temperatura ambiente. La muestra A, un control respecto a factores relativos al recubrimiento en general era malla de polipropileno sin recubrir. Todas las muestras se secaron en atmosfera de nitrogeno.

Tabla 7: Diseno ex erimental del estudio de biocom atibilidad

Los explantes se retiraron al cabo de 1, 3 y 5 semanas despues de la implantacion, y se analizaron histologicamente respecto a evidencia de persistencia, repoblacion celular, vascularizacion, e inflamacion utilizando los mismos criterios descritos en el Ejemplo 2. Los analisis histologicos indicaron que todos los materiales recubiertos se manteman intactos durante el periodo completo de implantacion de 5 semanas. Todos los materiales recubiertos estaban repoblados y revascularizados. El nivel de respuesta inflamatoria inducido por las muestras de malla recubiertas (Muestras B-F) parecfa ser relativamente reducido comparado con el inducido por la malla no recubierta (Muestra A). Se observaba solo una inflamacion leve a moderada con todas las muestras de malla recubiertas. Este experimento confirmaba que el tratamiento termico suave de la ATM, que daba como resultado una resistencia biomecanica incrementada de la malla recubierta, no afectaba a la actividad in vivo de las muestras de malla recubierta resultantes.

Ejemplo 8: Analisis bioqmmico de las pelfculas dermicas

Se evaluo el efecto de la temperatura de preparacion sobre la composicion bioquímica de las pelfculas dermicas. Resumidamente, se prepararon pelfculas dermicas, como se describe en el Ejemplo 5, con ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 M bien a temperatura ambiente o 32°C, 37°C, o 40°C; las pelfculas se secaron a la temperatura ambiente. La composicion bioquímica de las pelfculas dermicas resultantes se comparo con la de la ATM micronizada. Analisis del colageno. El contenido de colageno de las pelfculas dermicas se evaluo cuantitativamente, por analisis de hidroxiprolina, y cualitativamente, por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Para el analisis de hidroxiprolina, las pelfculas dermicas se trataron secuencialmente con sal, acido acetico 0,5 M y se digirieron con pepsina y las fracciones solubles de cada uno se analizaron respecto a contenido de hidroxiprolina. El contenido de hidroxiprolina de las fracciones de sal, acido y pepsina se determino despues de hidrolisis en acido clorhndrico 6 N durante 24 horas a 110°C. Las muestras hidrolizadas se diluyeron con agua destilada a una concentracion final de HCl 0,1 N. Se anadio luego tampon de ensayo (45,6 g/l de acetato de sodio trihidratado, 30 g/l de citrato trisodico dihidratado, 4,4 g/l de acido cftrico, 308,4 ml/l de isopropanol y 1,4 % de cloramina T) junto con isopropanol adicional y reactivo de Ehrlich (2 g de para-dimetilamina-benzaldehndo en acido perclorico al 60 % (v/v), isopropanol; 3:13). Las muestras se calentaron a 60°C durante 25 minutos, se dejaron enfriar y se determino la absorbancia a 540 nm. La hidroxiprolina se cuantifico por comparacion de la absorbancia de las muestras de ensayo con la de una curva estandar que utilizaba concentraciones conocidas de hidroxiprolina. El contenido de hidroxiprolina de las fracciones extrafdas se muestra en la Tabla 8. La hidroxiprolina se expresa como porcentaje de hidroxiprolina recuperada total.

T l : Di ri i n hi r xi r lin n l li l rmi

Los datos representados en la Tabla 8 indican que, basandose en la distribucion relativa de hidroxiprolina, todas las muestras de pelfcula dermica exhibfan un aumento en los niveles de colageno extrafble con sal y una disminucion en los niveles de colageno extrafble con acido con relacion a los encontrados en la ATM micronizada. No se observo cambio significativo alguno para el colageno soluble en pepsina. Estos datos indicaban que la destruccion del colageno en la fraccion principal soluble en pepsina no se modificaba significativamente durante el proceso utilizado para crear los pelfculas. El tratamiento acido utilizado para crear las pelfculas parecfa cambiar la distribucion del colageno de la fraccion de extrafble con acido a la extrafble con sal.

El colageno solubilizado con pepsina obtenido a partir de las muestras de pelfcula dermica dermico se analizo por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). La SDS-PAGE se realizo de acuerdo con metodos estandar. Se compararon muestras de colageno tipo I purificado, colageno tipo III purificado, colageno solubilizado con pepsina procedente del material de partida de ATM hidrolizada, y colageno solubilizado con pepsina procedente de pelfculas dermicas preparadas con ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 M a la temperatura ambiente, 32°C, 37°C, o 40°C. No se observaron en ningun caso diferencias cualitativas, tales como, por ejemplo, diferencias debidas a reticulacion o degradacion del colageno, en los perfiles de colageno entre la ATM micronizada y cualquiera de las muestras de pelfcula dermica. La ATM micronizada y las muestras de pelfcula dermica estaban compuestas fundamentalmente de colagenos tipo I y tipo III. Analisis de proteoglicanos (decorina). Se extrajeron los proteoglicanos del material de partida de ATM micronizada y de pelfculas dermicas preparadas con ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 M a la temperatura ambiente, 32°, o 37°C. Los proteoglicanos se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana para inmunotransferencia. La inmunotransferencia se realizo de acuerdo con metodos estandar. La membrana se sondeo con un anticuerpo policlonal espedfico de decorina. En todas las muestras fueron detectables niveles comparables de decorina; no se aprecio evidencia alguna de degradacion o reticulacion. Analisis de glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos se extrajeron del material de partida de ATM micronizada y de pelfculas dermicas preparadas con ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 M a la temperatura ambiente, 32°C, 37°C, o 40°C. Los glicosaminoglicanos se resolvieron por electroforesis en acetato de celulosa conforme a metodos estandar. En todas las muestras fueron detectables acido hialuronico y sulfato de condroitina, y no se observo diferencia cualitativa alguna en los perfiles de glicosaminoglicanos.

Ejemplo 9: Analisis biomecanico de las pelfculas dermicas

Se evaluo el efecto de la temperatura de preparacion sobre las propiedades biomecanicas de las pelfculas dermicas. Resumidamente, se prepararon pelfculas dermicos con ATM que se habfa hinchado en acido acetico 0,1 M a la temperatura ambiente, 32°C, 37°C, o 40°C, como se describe en el Ejemplo 5, se secaron en atmosfera de nitrogeno, y se sometieron tiras de 1 cm de las pelfculas dermicas a ensayos de traccion utilizando una maquina de ensayos Instron 5865 (Instron Corporation, Norwood, MA). Los datos presentados en la Tabla 9 indican que los pelfculas preparados con ATM que se habfa hinchado a temperaturas elevadas teman una resistencia a la traccion mayor con relacion a los pelfculas que se habfan preparado con ATM que se habfa hinchado a la temperatura ambiente. La temperatura optima para alcanzar un maximo en las propiedades biomecanicas era aproximadamente 37°C. Asf, por ejemplo, la tension maxima para las pelfculas preparadas con malla que se habfa hinchado a la temperatura ambiente era 0,017 ± 0,007 MPa; el valor correspondiente para las pelfculas preparadas con malla que se habfa hinchado a 37°C era 0,123 ± 0,009 MPa. El modulo de Young para los pelfculas preparados con malla que se habfa hinchado a la temperatura ambiente era 9,25 ± 0,096 MPa; el valor correspondiente para los pelfculas preparados con malla que se habfa hinchado a 37°C era 46,0 ± 3,00 MPa. La carga maxima para las pelfculas preparadas con malla que se habfa hinchado a la temperatura ambiente era 0,056 ± 0,002 N; el valor correspondiente para los pelfculas preparados con malla que se habfa hinchado a 37°C era 0,0,337 ± 0,024 N. La deformacion porcentual para las pelfculas preparadas con malla que se habfa hinchado a la temperatura ambiente era 21,1 ± 1,0 %; el valor correspondiente para las pelfculas preparadas con malla que se habfa hinchado a 37°C era 49,3 ± 3,5%.

T l : Pr i i m ni l lr l rmi

Ejemplo 10: Analisis in vivo de la malla recubierta en un sistema modelo de hernia de rata

La biocompatibilidad de la malla recubierta se evaluo tambien en un sistema modelo de hernia de rata clrnicamente relevante. Se crearon defectos de escision de espesor total (aproximadamente 1,5 cm x 2,5 cm) en la fascia de la pared ventral abdominal de las ratas. Los defectos se repararon poniendo una malla del artreulo de ensayo de 3 cm x 5 cm (polipropileno o hnbrido) con forma ovalada en posicion de refuerzo y fijando la malla en el borde de la herida mediante suturas. La malla recubierta de pelreula se preparo esencialmente de acuerdo con el metodo descrito en el Ejemplo 5. La ATM se hincho a 37°C y se vertio en capsulas de poliestireno. Se sumergio la malla en la solucion de ATM hasta una profundidad de 0,5 cm; se utilizaron 0,75 mg ATM/cm2 de malla de polipropileno. Para estos experimentos, se recubrio un trozo grande de malla (aproximadamente 11 cm x 18 cm) como se ha descrito arriba, se seco a la temperatura ambiente y se corto luego en pequenos ovalos (3 centimetres x 5 cm) antes de la implantacion). Las muestras no se reticularon.

Se crearon defectos de escision (aproximadamente 1,5 cm x 2,5 cm) en el abdomen de las ratas y se repararon con malla de polipropileno o malla de hernias hnbrida utilizando una tecnica de refuerzo sin tension. Los defectos se crearon por retirada de un trozo de forma ovalada del tejido de fascia utilizando tijeras. Se insertaron los artreulos de malla de ensayo en el defecto y se ligaron en el borde de la herida utilizando 6 suturas espaciadas uniformemente. El estudio utilizo 16 ratas, recibiendo 8 ratas implantes de polipropileno y 8 ratas implantes de malla tnbrida. Se analizaron cinco ratas de cada grupo 4 semanas despues de la implantacion y las 3 ratas restantes 8 semanas despues de la implantacion. Para el analisis, se recogieron explantes y sometieron a evaluacion macroscopica e histologica. El recubrimiento porcentual del area de la superficie fue estimado por un investigador que desconoda la identidad de cada muestra. Se observaron adhesiones omentales extensas despues de inspeccion de los explantes de polipropileno (implicacion aproximada de 65 % del area de la superficie); las adhesiones omentales generadas por los explantes de malla recubiertos implicaban solo aproximadamente 18% del area de la superficie. Adicionalmente, se observaron adhesiones viscerales (hngado e intestino) en dos de los animales reparados con malla de polipropileno, y estaban ausentes en los animales reparados con la malla hnbrida. Se observaron indicadores de una respuesta regenerativa, que inclrna repoblacion de celulas, revascularizacion, inflamacion minima y persistencia del injerto despues del analisis histologico de las muestras de malla hnbrida a las 4 semanas de la implantacion. Todos los artreulos de ensayo recubiertos (con la excepcion de dos muestras que conternan infecciones activas) se caracterizaban por repoblacion con celulas semejantes a fibroblastos, revascularizacion, inflamacion minima y persistencia del recubrimiento biologico. En contraste, los artreulos de ensayo de polipropileno estaban asociados con una mayor respuesta celular alrededor de las fibras de polipropileno consistente con una respuesta agresiva de cuerpo extrano a los artreulos de ensayo de malla implantados.

Ejemplo 11: Preparacion de malla recubierta utilizando ATM procedente de cerdos Yorkshire

Se preparo la ATM de acuerdo con el metodo descrito en el Ejemplo 1, excepto que el tejido dermico procedfa de cerdos Yorkshire. La ATM se micronizo y se lavo luego en agua para eliminar el crioprotector soluble. La ATM micronizada se hincho durante 3 horas a 37°C de acuerdo con el metodo del Ejemplo 1, excepto que el hinchamiento tuvo lugar en HCl 40 mM (pH 1,4) en lugar de acido acetico 100 mM. La malla de polipropileno se recubrio como se describe en el Ejemplo 2 y se seco a la temperatura ambiente.

La biocompatibilidad de la malla recubierta se evaluo en un sistema modelo de hernia de rata como el descrito en el Ejemplo 8. Se observaron indicadores de una respuesta regenerativa, que inclrnan repoblacion de celulas, revascularizacion, e inflamacion minima por analisis histologico de las muestras de malla hnbrida a las 4 semanas despues de la implantacion.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de produccion de una composicion de malla biocompatible, comprendiendo el metodo:

a) incubar una pluralidad de fragmented de una matriz dermica de tejido acelular (ATM) en una solucion acida para crear una suspension homogenea de fragmentos de ATM hinchados, en el que la solucion acida tiene un pH menor que 3,0 y no produce desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibras de colageno en la ATM, en el que comprende un tejido dermico del que se han eliminado todas, o practicamente todas, las celulas viables; b) aplicar la suspension homogenea a un sustrato de malla biocompatible sintetica para crear un sustrato de malla recubierto; y

c) secar el sustrato de malla biocompatible sintetica seco para formar una composicion sintetica recubierta.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los pasos (a) y (b) se realizan simultaneamente.

3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la solucion acida es una solucion que comprende un acido seleccionado del grupo constituido por acido acetico, acido ascorbico, acido borico, acido carbonico, acido dtrico, acido clorhfdrico, acido lactico, acido tanico, acido fosforico, y acido sulfurico.

4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el sustrato de malla biocompatible sintetica es absorbible.

5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el sustrato es un polfmero seleccionado del grupo constituido por polihidroxialcanoato, acido poliglicolico, acido poli-1-lactico, acido polilactico/poliglicolico (PLGA), poliglactina 910, y carboximetilcelulosa, o comprende poli-4-hidroxibutirato.

6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el sustrato de malla biocompatible sintetica comprende polipropileno.

7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el secado comprende secado en atmosfera de nitrogeno o comprende liofilizacion.

8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende adicionalmente incubar la suspension homogenea de ATM a una temperatura de 20°C a 42°C.

9. Una composicion de malla biocompatible que comprende: un sustrato de malla sintetica recubierta, en el que el recubrimiento del sustrato de malla comprende una suspension de ATM seca, en la que la suspension de ATM comprende una pluralidad de fragmentos de ATM dermica hinchados en una solucion acida, en la que la solucion acida tiene un pH menor que 3,0, y no produce desnaturalizacion irreversible sustancial de las fibras de colageno en la ATM, en la que la ATM comprende un tejido dermico del que se ha retirado la totalidad, o practicamente la totalidad, de celulas viables.

10. La composicion de la reivindicacion 9, en la que los fragmentos de ATM se incuban a una temperatura de 30°C a 42°C.

11. La composicion de malla biocompatible de la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10 para su uso en la mejora o reparacion de un organo o tejido en un sujeto mairnfero.

12. La composicion de la reivindicacion 11, en la que el organo o tejido a tratar o reparar se selecciona del grupo constituido por tejido de la pared abdominal, musculo abdominal, y tejido muscular liso.

13. La composicion de la reivindicacion 12 para su uso en la reparacion de un defecto seleccionado del grupo constituido por una hernia inguinal, una hernia femoral, una hernia ventral, una hernia abdominal, una hernia incisional, una hernia de hiato, una hernia de diafragma, una hernia umbilical, debilidad fascial en el torax, debilidad fascial en la pared abdominal, y prolapso de organo pelvico.