ES2717600T3 - Microorganismo productor de diamina y método para producir diamina usando el mismo - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismo productor de diamina y método para producir diamina usando el mismo
[Campo técnico]
La presente descripción se refiere a un microorganismo para producir diamina y a un método para producir diamina usando el mismo.
[Técnica antecedente]
Las aminas biógenas (BA) son compuestos nitrogenados que se producen principalmente por la descarboxilación de aminoácidos o por la aminación y transaminación de aldehídos y cetonas. Estas aminas biógenas son compuestos de bajo peso molecular y se sintetizan en el metabolismo de microorganismos, plantas y animales y, por lo tanto, las aminas biógenas se conocen como componentes que se encuentran con frecuencia en estas células. En particular, las aminas biógenas son poliaminas tales como espermidina, espermina, putrescina o 1,4-butanodiamina y cadaverina.
En general, la putrescina es una materia prima importante para la producción de poliamina nylon-4,6 que se produce haciendo reaccionar la putrescina con ácido adípico. La putrescina generalmente se produce por una síntesis química que implica la conversión de propileno en acrilonitrilo y en succinonitrilo.
Como método de producción de putrescina usando un microorganismo, se ha informado de un método para producir putrescina a una alta concentración por transformación de E. coli y Corynebacterium (publicación de patente Internacional número WO06/005603; publicación de patente Internacional número WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95, 169-178., 2012). Además, se han realizado estudios activamente sobre transportadores de putrescina en células de E. coli, levadura, plantas y animales (K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506-512, 2010).
Mientras tanto, la cadaverina es un compuesto de diamina de olor desagradable producido por hidrólisis de proteínas durante la putrefacción de tejidos animales. La cadaverina tiene la fórmula química de NH2(CH2)5NH2, que es similar a la de putrescina.
La cadaverina sirve como un componente de polímeros tales como poliamida o poliuretano, agentes quelantes u otros aditivos. En particular, se sabe que la poliamida, que tiene un mercado global anual de 3,5 millones de toneladas, se prepara por policondensación de cadaverina o ácido succínico, por lo que la cadaverina ha recibido mucha atención como un compuesto industrialmente útil.
Cadaverina es una diamina que se encuentra en algunos microorganismos (Tabor y Tabor, MicrobiolRev., 49:81-99, 1985). En la bacteria gram-negativa E. coli, la cadaverina se biosintetiza a partir de L-lisina por la L-lisina descarboxilasa. El nivel de cadaverina en E. coli está regulado por la biosíntesis, la degradación, la captación y la exportación de cadaverina (Soksawatmaekhin et al., MolMicrobiol., 51:1401-1412, 2004).
Un método para la producción de cadaverina o N-acetilcadaverina, en un microorganismo (Corynebacterium), que tiene una mayor actividad exportadora de cadaverina y una disminución de la actividad polipeptídica de formación de N-acetilcarbonina, se ha descrito en las publicaciones de patente Internacional número WO 2013/093737 y número WO 2012/114256.
[Divulgación]
[Problema técnico]
Los presentes inventores han hecho esfuerzos intensos para investigar una proteína que tiene la capacidad de exportar diamina, tal como putrescina o cadaverina, para mejorar la productividad de diamina en un microorganismo que tiene la productividad de diamina. Como resultado, encontraron que una proteína derivada de Corynebacterium efficiens o una proteína que tiene una alta homología de secuencia de aminoácidos con la misma tiene una actividad de exportación de diamina, y esta proteína se introduce en un microorganismo para producir diamina para mejorar su actividad, lo que da como resultado un aumento notable en la capacidad de exportar diamina tal como putrescina
y cadaverina, completando de este modo la presente invención.
[Solución técnica]
Un objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo para producir diamina.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir diamina, que incluye las etapas de (i) cultivar el microorganismo para producir diamina para obtener un cultivo celular; y (ii) recuperar la diamina del microorganismo cultivado o del cultivo celular.
[Mejor modo]
En un aspecto para lograr los objetos anteriores, la presente invención proporciona un microorganismo para producir diamina, en el que se introduce o se mejora la actividad de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
Como se usa en el presente documento, el término "diamina" se refiere colectivamente a un compuesto que tiene dos grupos amina, y ejemplos específicos de la misma pueden incluir putrescina y cadaverina. La putrescina es tetrametilendiamina que puede producirse a partir de la ornitina como precursor. La cadaverina se denomina 1,5 pentanodiamina o pentametilendiamina, que puede producirse a partir de la lisina como un precursor. Dichas diaminas son compuestos de aplicación industrial que sirven como materias primas valiosas para la síntesis de polímeros tales como poliamina nylon, poliamida o poliuretano.
Como se usa en el presente documento, el término "proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6" es una proteína que se encuentra en Corynebacterium efficiens, y también denominada CE2495. Se investigó que esta proteína conserva una alta homología con una proteína de membrana de Corynebacterium, NCgl2522. En una forma de realización de la presente invención, la proteína CE2495 se identifica como una proteína putativa que está implicada en la exportación de diamina en una cepa que tiene productividad de diamina, aumentando de este modo notablemente la productividad de la diamina.
En este caso, la proteína CE2495 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 puede ser una proteína que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. En el polinucleótido que codifica la proteína CE2495, sin embargo, pueden hacerse diversas modificaciones en la región codificante con la condición de que no cambien la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado desde la región codificante, debido a la degeneración del codón o considerando los codones preferidos por un organismo en el que se expresará la proteína. Por lo tanto, la proteína CE2495 puede codificarse por diversas secuencias de nucleótidos, así como por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.
Otras proteínas involucradas en el transporte de diamina son las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24, pero sin limitación a las mismas.
Por ejemplo, la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 es una proteína que se encuentra en Corynebacterium ammoniagenes, y también se denomina HMPREF0281_01446. Se investigó que esta proteína conserva un 59% de homología con una proteína de membrana de Corynebacterium, NCgl2522 y un 61% de homología con CE2495 de Corynebacterium efficiens. En una forma de realización de la presente invención, se investigó que la proteína HMPREF0281_01446 presenta actividad de exportación de diamina en una cepa que tiene productividad de diamina, aumentando de este modo notablemente la productividad de la diamina.
La proteína HMPREF0281_01446 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 22 puede ser una proteína que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21.
Además, la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 es una proteína que se encuentra en Corynebacterium lipophiloflavum, y también denominada HMPREF0298_0262. Se investigó que esta proteína conserva un 52% de homología con una proteína de membrana de Corynebacterium, NCgl2522 y un 56% de homología con CE2495 de Corynebacterium efficiens. En una forma de realización de la presente invención, se investigó que la proteína HMPREF0298_0262 presenta actividad de exportación de diamina en una cepa que tiene productividad de diamina, aumentando de este modo notablemente la productividad de la diamina.
La proteína HMPREF0298_0262 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 puede ser una proteína
que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23.
El término "homología", como se usa en el presente documento con respecto a una secuencia, se refiere a la identidad con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos dada, y la homología puede expresarse como un porcentaje. En la presente invención, una secuencia de homología que tiene una actividad idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos dada se expresa como "% de homología". Por ejemplo, la homología se puede identificar utilizando un programa de software estándar que calcula los parámetros de puntuación, identidad y similitud, específicamente BLAST 2.0, o comparando secuencias en un experimento de hibridación Southern en condiciones rigurosas de acuerdo con lo definido. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., 1989, infra), y se determina mediante un método conocido por los expertos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, el término "microorganismo para producir diamina" se refiere a un microorganismo preparado proporcionando productividad de diamina para una cepa parental que no tiene productividad de diamina o un microorganismo que tiene productividad de diamina endógena. Específicamente, el microorganismo que tiene productividad diamina puede ser un microorganismo que tenga productividad de putrescina o cadaverina.
El "microorganismo que tiene productividad de putrescina" puede ser, pero sin limitación, un microorganismo en el que la actividad de la acetilglutamato sintasa que convierte glutamato en N-acetilglutamato, ornitina acetiltransferasa (ArgJ) que convierte acetil ornitina en ornitina, acetilglutamato cinasa (ArgB) que convierte acetil glutamato en N-acetilglutamil fosfato, acetil-gamma-glutamil-fosfato reductasa (ArgC) que convierte acetil glutamil fosfato en N-acetil glutamato semialdehído, o acetilornitina aminotransferasa (ArgD) que convierte acetil glutamato semialdehído en N-acetilornitina, se mejora en comparación con su actividad endógena, con el fin de mejorar la ruta biosintética de glutamato a ornitina, y la productividad de la ornitina que se usa como un precursor para la biosíntesis de la putrescina aumenta, pero sin limitarse a lo mismo.
Además, el microorganismo que tiene productividad de putrescina puede ser un microorganismo que se modifica para que tenga actividad de ornitina carbamoil transferasa (ArgF) implicada en la síntesis de arginina a partir de ornitina, una proteína (NCgl1221) involucrada en la exportación de glutamato, y/o una proteína (NCgl469) implicada en la acetilación de putrescina más débil que su actividad endógena, y/o se modifica para introducirse con la actividad de la ornitina descarboxilasa (ODC).
Aquí, como ejemplos no limitantes, la acetil gamma glutamil fosfato reductasa (ArgC) puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, la acetilglutamato sintasa o la ornitina acetiltransferasa (ArgJ) pueden tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, la acetil glutamato cinasa (ArgB) puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y la acetilornitina aminotransferasa (ArgD) puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Sin embargo, las secuencias de aminoácidos de proteínas enzimáticas respectivas no están particularmente limitadas a las mismas, y las enzimas pueden ser proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que tienen un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, o más preferiblemente un 95% o más de homología con las mismas, siempre que tengan actividades de las enzimas respectivas.
Además, como ejemplos no limitantes, la ornitina carbamoil transferasa (ArgF) puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, la proteína involucrada en la exportación de glutamato puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, y la ornitina descarboxilasa (ODC) puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Sin embargo, las secuencias de aminoácidos de proteínas enzimáticas respectivas no están limitadas a las mismas, y las enzimas pueden ser proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que tienen un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más, o particularmente, preferiblemente un 97% o más de homología con las mismas, siempre que tengan actividades de las enzimas respectivas.
Mientras tanto, el "microorganismo que tiene productividad de cadaverina" puede ser, pero sin limitación, un microorganismo preparado mediante la introducción o la mejora adicional de la actividad de la lisina descarboxilasa (LDC) en un microorganismo que tiene productividad de lisina. Por ejemplo, el microorganismo puede ser uno que tenga una mayor productividad de lisina para aumentar la producción de cadaverina. Un método para mejorar la productividad de la lisina puede realizarse mediante un método conocido que sea predecible para los expertos en la técnica.
La lisina descarboxilasa es una enzima que cataliza la conversión de lisina en cadaverina, y su actividad se introduce o se mejora, produciendo de este modo eficazmente la cadaverina.
La lisina descarboxilasa puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, pero sin limitación particularmente a la misma. La enzima puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, o más preferiblemente un 95% o más de homología con la misma, siempre que tenga la actividad anterior.
Como se usa en el presente documento, el término "producción" es un concepto que incluye la liberación extracelular de diamina, por ejemplo, la liberación de diamina en un medio de cultivo, así como la producción de diamina dentro de un microorganismo.
Mientras tanto, el término "introducción de actividad proteica", como se usa en el presente documento, significa que un microorganismo que no tiene proteína endógena está dotado externamente de una actividad de la proteína, y por ejemplo, puede realizarse mediante la introducción de un gen foráneo. Además, el término "aumento de la actividad proteica" significa que el estado activo de la proteína conservada o introducida en el microorganismo se mejora, en comparación con su estado activo intrínseco.
Los ejemplos no limitantes de la introducción o mejora de la actividad proteica pueden incluir la mejora de la actividad de la propia proteína presente en un microorganismo debido a la mutación para lograr efectos más allá de las funciones endógenas, y/o la mejora en la actividad génica endógena de la proteína presente en el microorganismo, la amplificación del gen endógeno por factores internos o externos, aumento en el número de copias del gen, aumento de la actividad por introducción adicional de un gen foráneo o reemplazo o modificación de un promotor, pero sin limitación a lo mismo.
El aumento en el número de copias del gen puede realizarse, pero sin limitación particularmente, uniendo operativamente el gen a un vector o integrándolo en el genoma de la célula huésped. Específicamente, el número de copias del polinucleótido en el genoma de la célula huésped puede aumentarse introduciendo en la célula huésped el vector que está unido operativamente al polinucleótido que codifica la proteína de la presente invención y se replica y funciona independientemente de la célula huésped, o introduciendo en la célula huésped el vector que está unido operativamente al polinucleótido y es capaz de integrar el polinucleótido en el genoma de la célula huésped. Como se usa en el presente documento, la "modificación de la secuencia reguladora de la expresión para aumentar la expresión del polinucleótido" puede realizarse, pero particularmente sin limitación, mediante la inducción de una modificación en la secuencia reguladora de la expresión a través de la deleción, inserción, sustitución no conservativa o conservativa de la secuencia de nucleótidos, o una combinación de las mismas, para mejorar adicionalmente la actividad de la secuencia reguladora de la expresión, o reemplazando la secuencia reguladora de la expresión con una secuencia de nucleótidos que tiene una actividad más fuerte. La secuencia reguladora de la expresión incluye, pero sin limitación particularmente, un promotor, una secuencia de operador, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma, y una secuencia que regula la terminación de la transcripción y la traducción. Como se usa en el presente documento, el reemplazo o modificación de un promotor, aunque sin limitación particularmente, puede realizarse mediante el reemplazo o la modificación con un promotor más fuerte que el promotor original. Un promotor heterólogo fuerte en lugar del promotor original puede estar unido aguas arriba de la unidad de expresión del polinucleótido, y los ejemplos del promotor fuerte pueden incluir un promotor CJ7, un promotor lysCP1, un promotor EF-Tu, un promotor groel, un promotor aceA o aceB, y específicamente, un promotor derivado de Corynebacterium, un promotor lysCP1 o un promotor CJ7 está unido operativamente al polinucleótido que codifica la enzima, de manera que su velocidad de expresión pueda aumentar. Aquí, el promotor lysCP1 es un promotor mejorado a través de la sustitución de la secuencia de nucleótidos de la región de promotor del polinucleótido que codifica aspartato cinasa y aspartato semialdehído deshidrogenasa (documento WO 2009/096689). Además, el promotor CJ7 es un promotor fuerte derivado de Corynebacterium ammoniagenes (Patente coreana 0620092 y documento WO 2006/065095).
Además, la modificación de una secuencia polinucleotídica en el cromosoma, aunque sin limitación particularmente, puede realizarse induciendo una mutación en la secuencia reguladora de la expresión a través de la deleción, inserción, sustitución no conservativa o conservativa de la secuencia polinucleotídica, o una combinación de las mismas con el fin de mejorar adicionalmente la actividad de la secuencia de polinucleótidos, o reemplazando la secuencia con una secuencia de polinucleótidos que se modifica para tener una actividad más fuerte.
Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una construcción de ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada, que está unida operativamente a una secuencia
reguladora de la expresión apropiada para expresar la proteína deseada en una célula huésped adecuada. La secuencia reguladora puede incluir un promotor que puede iniciar la transcripción, una secuencia de operador opcional para regular la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma de ARNm adecuado, y una secuencia que regula la terminación de la transcripción y la traducción. Una vez que el vector se introduce en la célula huésped adecuada, puede replicarse o funcionar independientemente del genoma huésped, y puede integrarse en el propio genoma.
El vector utilizado en la presente invención no está particularmente limitado, siempre que sea capaz de replicarse en la célula huésped, y se puede usar cualquier vector conocido en la técnica. Los ejemplos de vectores convencionales pueden incluir un plásmido, cósmido, virus y bacteriófago natural o recombinante. Por ejemplo, pueden usarse pWE15, M13, AMBL3, XMBL4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, y Charon21A como un vector de fago un vector cosmídico. Pueden usarse el tipo pBR, el tipo pUC, el tipo pBluescriptII, el tipo pGEM, el tipo pTZ, el tipo pCL y el tipo pET como un vector plasmídico. Un vector útil en la presente invención no está particularmente limitado, y puede usarse cualquier vector de expresión conocido. Preferiblemente, se pueden usar los vectores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, o pCC1BAC.
Además, el polinucleótido que codifica la proteína endógena deseada en el cromosoma puede reemplazarse por un polinucleótido mutado usando un vector para la inserción cromosómica bacteriana. La inserción del polinucleótido en el cromosoma se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, recombinación homóloga. Dado que el vector de la presente invención puede insertarse en el cromosoma mediante recombinación homóloga, puede incluir además un marcador de selección para confirmar la inserción cromosómica. El marcador de selección es para seleccionar las células que se transforman con el vector, es decir, para confirmar la inserción del polinucleótido deseado, y el marcador de selección puede incluir marcadores que proporcionan fenotipos seleccionables, tales como resistencia a fármacos, auxotrofia, resistencia a agentes citotóxicos o expresión de proteínas de superficie. Solo las células que expresan el marcador de selección pueden sobrevivir o mostrar diferentes fenotipos en el entorno tratado con el agente selectivo, y por lo tanto, se pueden seleccionar las células transformadas.
Como se usa en el presente documento, el término "transformación" significa la introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula huésped de tal manera que la proteína codificada por el polinucleótido se expresa en la célula huésped. Siempre que el polinucleótido transformado pueda expresarse en la célula huésped, puede integrarse y ubicarse en el cromosoma de la célula huésped, o existir de manera extracromosómica. Además, el polinucleótido incluye ADN y ARN que codifican la proteína diana. El polinucleótido puede introducirse en cualquier forma, siempre que pueda introducirse en la célula huésped y expresarse en la misma. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en la célula huésped en forma de un casete de expresión, que es una construcción génica que incluye todos los elementos necesarios para su expresión autónoma. Típicamente, el casete de expresión incluye un promotor unido operativamente al polinucleótido, las señales de terminación de la transcripción, los sitios de unión al ribosoma, o las señales de terminación de la traducción. El casete de expresión puede tener la forma de un vector de expresión autorreplicable. Además, el polinucleótido según está puede introducirse en la célula huésped y unirse operativamente a secuencias requeridas para la expresión en la célula huésped.
Además, como se usa en el presente documento, el término "unido operativamente" significa un enlace funcional entre una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína deseada de la presente invención y una secuencia de promotor que inicia y media la transcripción de la secuencia de polinucleótidos.
Además, el microorganismo que tiene productividad de diamina puede ser un microorganismo, en el que la actividad de la diamina acetiltransferasa se debilita en comparación con la actividad endógena, con el fin de aumentar la producción de diamina.
Como se usa en el presente documento, el término "diamina acetiltransferasa" es una enzima que cataliza la transferencia de un grupo acetilo de acetil-CoA a diamina, y puede ilustrarse por NCgl1469 de Corynebacterium glutamicum o SpeG de E. coli, pero su nombre puede diferir dependiendo de la especie de un microorganismo que tiene productividad de diamina. NCgl1469 puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12, y SpeG puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, pero la secuencia puede diferir dependiendo de la especie del microorganismo. La proteína puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga un 80% o más, preferiblemente un 90 o más, o más preferiblemente un 95% o más, o particularmente preferiblemente un 97% o más de homología con la misma, siempre que tenga la actividad de diamina acetiltransferasa.
Dado que la diamina acetiltransferasa convierte la diamina en acetil-diamina (por ejemplo, N-Ac-putrescina o N-Accadaverina), la productividad de la diamina puede aumentar al debilitar su actividad, en comparación con la actividad endógena.
Como se usa en el presente documento, el término "actividad endógena" se refiere a la actividad de la proteína que posee el microorganismo original en su estado nativo o no desnaturalizado, y "modificado para que tenga actividad debilitada, en comparación con la actividad endógena" significa que la actividad de la proteína se debilita adicionalmente en comparación con la actividad de la proteína correspondiente que posee el microorganismo original en el estado nativo o no desnaturalizado.
El debilitamiento de la actividad de la proteína significa que la actividad de la proteína se reduce, en comparación con una cepa no modificada, o se elimina la actividad. Es posible aplicar un método bien conocido en la técnica al debilitamiento de la actividad de la proteína.
Los ejemplos del método pueden incluir un método para reemplazar el gen que codifica la proteína en el cromosoma por un gen que está mutado para reducir la actividad enzimática o para eliminar la actividad proteica, un método para introducir una mutación en la secuencia reguladora de la expresión del gen que codifica la proteína en el cromosoma, un método para reemplazar la secuencia reguladora de la expresión del gen que codifica la proteína por una secuencia que tiene una actividad más débil, un método para eliminar una parte o la totalidad del gen que codifica la proteína en el cromosoma, un método para introducir un oligonucleótido antisentido que se une de manera complementaria a una transcripción del gen en el cromosoma para inhibir la traducción del ARNm a la proteína, un método para añadir artificialmente una secuencia complementaria a la secuencia SD aguas arriba de la secuencia SD del gen que codifica la proteína para formar una estructura secundaria, impidiendo de este modo el acceso de las subunidades ribosómicas, y un método de ingeniería de transcripción inversa (RTE) para añadir un promotor para la transcripción inversa en el extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF) de la secuencia correspondiente, y combinaciones de los mismos, pero sin limitación particularmente a lo mismo.
En detalle, se puede realizar una eliminación parcial o completa del gen que codifica la proteína introduciendo un vector para la inserción cromosómica en un microorganismo, sustituyendo de este modo el polinucleótido que codifica una proteína diana endógena en el cromosoma con un polinucleótido que tiene una eliminación parcial o un gen marcador. El "parcial" puede variar dependiendo del tipo de polinucleótido, pero se refiere específicamente a de 1 a 300, preferiblemente de 1 a 100, y más preferiblemente de 1 a 50 nucleótidos.
Mientras tanto, el microorganismo de la presente invención es un microorganismo que tiene productividad de diamina, e incluye un microorganismo procariota que expresa la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y ejemplos de los mismos pueden incluir microorganismos que pertenecen a Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomanas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Arcanobacterium sp., Alcaligenes sp. o similares, pero sin limitación a los mismos. El microorganismo de la presente invención es específicamente un microorganismo que pertenece a Corynebacterium sp. o Escherichia sp., y más específicamente, Corynebacterium glutamicum o Escherichia coli, pero sin limitación a los mismos.
Un ejemplo específico puede ser un microorganismo preparado mediante la eliminación de NCgl2522, que es una proteína que tiene actividad de exportación de putrescina, de una cepa productora de putrescina basada en ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum Kc Cm 11240P (Publicación de Patente Coreana 2013-0082478), y después introduciendo CE2495 en el gen de transposón. Por lo tanto, este microorganismo KCCM11240P ANCgl2522 Tn:P(cj7)-CE2495 se designa como CC01-0757, y se deposita bajo el Tratado de Budapest en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) el 15 de noviembre de 2013, con Número de Acceso KCCM11475P.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir diamina, que comprende: (i) cultivar el microorganismo que tiene la diamina putrescina, en el que se introduce o se mejora la actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, para obtener un cultivo celular; y (ii) recuperar la diamina del microorganismo cultivado o el cultivo celular.
La proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, la introducción de la actividad de la proteína, la mejora de la actividad de la proteína, la diamina, y el microorganismo que tiene productividad de diamina son los mismos que se describen anteriormente.
En el método, la etapa de cultivo del microorganismo puede realizarse, aunque sin limitación particularmente,
preferiblemente por cultivo discontinuo, cultivo continuo y cultivo alimentado por lotes conocidos en la técnica. A este respecto, las condiciones de cultivo no están particularmente limitadas, pero se puede mantener un pH óptimo (por ejemplo, pH 5 a 9, preferiblemente pH 6 a 8, y mucho más preferiblemente pH 6,8) usando un producto químico básico (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoniaco) o un producto químico ácido (por ejemplo, ácido fosfórico o ácido sulfúrico). Además, se puede mantener una condición aerobia añadiendo oxígeno o una mezcla de gases que contiene oxígeno a un cultivo celular. La temperatura del cultivo se puede mantener de 20 a 45°C, y preferiblemente de 25 a 40°C, y el cultivo se puede realizar durante aproximadamente 10 a 160 horas. Además, un medio que se utiliza para el cultivo puede incluir azúcar y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasa, almidón y celulosa), aceite y grasa (por ejemplo, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco), ácido graso (por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico), alcohol (por ejemplo, glicerol y etanol), y ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético) individualmente o en combinación como fuente de carbono; compuesto orgánico que contiene nitrógeno (por ejemplo, peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, solución de maíz, polvo de harina de soja, y urea), o un compuesto inorgánico (por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, y nitrato de amonio) individualmente o en combinación como fuente de nitrógeno; dihidrogenofosfato de potasio, fosfato de dipotasio, o una sal que contiene sodio correspondiente a los mismos individualmente o en combinación como fuente de fósforo; otras sustancias esenciales de estimulación del crecimiento, incluyendo sales metálicas (por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro), aminoácidos y vitaminas. En la presente invención, el medio se puede usar como un sinónimo para el líquido de cultivo.
Como se usa en el presente documento, el término "cultivo celular" es un material obtenido cultivando un microorganismo, e incluye el medio, el microorganismo cultivado, y las sustancias liberadas del microorganismo cultivado. Por ejemplo, puede incluirse una fuente de suministro de nutrientes requerida para el cultivo celular, tales como minerales, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos y/u otros componentes generalmente contenidos en el medio de cultivo (o líquido de cultivo) además de la fuente de carbono, y la fuente de nitrógeno. Además, se puede incluir una sustancia deseada o una enzima producida/secretada por las células.
Dado que la diamina producida por el cultivo puede secretarse al medio o permanecer en las células, el cultivo celular puede incluir la diamina que se produce al cultivar el microorganismo.
El método de recuperación de diamina tal como putrescina o cadaverina producida en la etapa de cultivo de la presente invención puede realizarse, por ejemplo, usando un método adecuado conocido en la técnica de acuerdo con un método de cultivo, por ejemplo, cultivo discontinuo, cultivo continuo, o cultivo alimentado por lotes, recogiendo de este modo los aminoácidos deseados del líquido de cultivo.
[Efectos ventajosos]
En la presente invención, se demuestra que la proteína CE2495 derivada de Corynebacterium efficiens es una proteína que tiene actividad de exportación de diamina, y la actividad de exportación de putrescina puede mejorarse introduciendo esta actividad proteica en un microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene una ruta sintética de putrescina, pero baja actividad de exportación de putrescina. También se demuestra que la putrescina y la cadaverina pueden aumentarse al mismo tiempo introduciendo esta actividad proteica en E. coli, que tiene las rutas sintéticas de putrescina y cadaverina. Por consiguiente, la diamina puede producirse eficazmente aplicando la proteína CE2495 derivada de Corynebacterium efficiens a un microorganismo que tiene productividad de diamina.
[Modo de la invención]
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los Ejemplos.
Ejemplo de referencia 1. Preparación de microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene productividad de putrescina
Se confirmó que la producción de putrescina se redujo cuando NCgl2522, una permeasa perteneciente a la superfamilia de facilitadores principal (MFS), se eliminó en una cepa productora de putrescina basada en Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Kc Cm 11240P (publicación de patente Coreana número 2013-0082478) y una cepa productora de putrescina basada en Corynebacterium glutamicum ATCC13869 DAB12-a ANCgl1469 (eliminación de argF, eliminación de NCgl1221, introducción de speC de E. coli, sustitución del promotor de operón
arg, eliminación de NCgl1469; designada como DAB12-b, publicación de patente Coreana número 2013-0082478) como microorganismos de Corynebacterium sp. que tienen productividad de putrescina.
También se confirmó que la putrescina se produjo con un alto rendimiento en cepas de Corynebacterium glutamicum preparadas por introducción adicional del gen NCgl2522 en el transposón en KCCM11240P o DAB12-b, o por sustitución del promotor NCgl2522 en el cromosoma con el promotor Cj7 para mejorar la actividad de NCgl2522. Además, la cantidad intracelular de putrescina se midió en la cepa en la que se aumentó la expresión de NCgl2522, y como resultado, se observó una cantidad menor de putrescina, en comparación con la de un grupo de control. Se indica que NCgl2522 tiene la capacidad de exportar putrescina.
En detalle, basándose en la secuencia de nucleótidos del gen que codifica NCgl2522 de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, se usaron un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y 2 para obtener un fragmento de recombinación homóloga de la región N-terminal de NCgl2522 y un par de los cebadores de las SEQ ID NOS: 3 y 4 para obtener un fragmento de recombinación homóloga de la región C-terminal de NCgl2522 como en la siguiente Tabla 1.
T l 1
La PCR se realizó utilizando el ADN genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como plantilla y dos pares de cebadores para amplificar los fragmentos de PCR de las regiones N-terminal y C-terminal, respectivamente. Estos fragmentos de PCR se sometieron a electroforesis para obtener los fragmentos deseados. En este momento, la reacción de PCR se realizó durante 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, hibridación durante 30 segundos a 55°C, y extensión durante 30 segundos a 72°C. El fragmento de la región N-terminal obtenido de este modo se trató con enzimas de restricción, BamHI y SalI, y el fragmento de la región C-terminal obtenida de este modo se trató con enzimas de restricción, SalI y XbaI. Los fragmentos tratados de este modo se clonaron en el vector pDZ tratado con enzimas de restricción, BamHI y XbaI, para construir un plásmido pDZ-1'NCgl2522(K/O).
El plásmido pDZ-1'NCgl2522(K/O) se introdujo en Corynebacterium glutamicum KCCM11240P por electroporación, para obtener un transformante. Después, el transformante se puso en placas y se cultivó en una placa BHIS (37 g/l de infusión de corazón de Braine, 91 g/l de sorbitol y agar al 2%) que contenía kanamicina (25 pg/ml) y X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D-galactósido) para la formación de colonias. De las colonias formadas de este modo, se seleccionaron colonias de color azul como la cepa introducida con el plásmido pD2-1'NCgl2522(K/O).
Las cepas seleccionadas se cultivaron con agitación en medio CM (10 g/l de glucosa, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de extracto de carne de res, 2,5 g/l de NaCl, y 2 g/l de urea, pH 6,8) a 30°C durante 8 horas. Posteriormente, cada cultivo celular se diluyó en serie de 10'4 a 10'10. Después, las muestras diluidas se colocaron en placas y se cultivaron en un medio sólido que contenía X-gal para la formación de colonias. De las colonias formadas de este modo, se seleccionaron las colonias de color blanco que aparecieron a una frecuencia relativamente baja para obtener finalmente una cepa de Corynebacterium glutamicum en la que se eliminó el gen que codificaba NCgl2522 y se debilitó la productividad de la putrescina. La cepa de Corynebacterium glutamicum en la que se debilitó la actividad de exportación de putrescina se designó como KCCM11240P ANCgl2522.
De la misma manera, la PCR se realizó utilizando el ADN genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como plantilla y dos pares de cebadores dados en la Tabla 1 para construir un plásmido pDZ-2'NCgl2522(K/O) por el anterior método descrito. Se construyó una cepa de Corynebacterium glutamicum, en la que se eliminó el gen que codificaba NCgl2522 de la cepa DAB12-b utilizando el vector de acuerdo con el método descrito anteriormente para debilitar la productividad de putrescina. Esta cepa de Corynebacterium glutamicum que tiene la actividad de exportación de putrescina debilitada se designó como DAB12-b ANCgl2522.
Ejemplo 1. Selección de CE2495 de Corynebacterium efficiens
Como se confirmó en el Ejemplo de referencia 1, se encontró que la proteína de membrana NCgl2522 funcionaba para exportar putrescina. Por lo tanto, basándose en la secuencia de aminoácidos de NCgl2522, los presentes
inventores adquirieron genes que tienen homología con el programa BlastP del National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov).
De Corynebacterium sp. además de Corynebacterium glutamicum, se encontró que Corynebacterium efficiens YS-314 tenía CE2495, que muestra un 71% de homología con la secuencia de aminoácidos de NCgl2522. Se obtuvieron su secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) y su secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6).
De la misma manera, se obtuvieron la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 21) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) de HMPREF0281_01446 derivada de Corynebacterium ammoniagenes DSM 20306, 22), que muestra un 59% de homología con la secuencia de aminoácidos de NCgl2522, y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 23) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de HMPREF0298_0262 derivada de Corynebacterium lipophiloflavum DSM 44291, que muestra un 52% de homología con la secuencia de aminoácidos de NCgl2522. La secuencia de aminoácidos de HMPREF0281_01446 y la secuencia de aminoácidos de HMPREF0298_0262 muestran una homología del 61% y el 56% con la secuencia de aminoácidos de CE2495 de Corynebacterium efficiens YS-314, respectivamente, como se muestra en la siguiente Tabla 2.
T l 2
Mientras tanto, los microorganismos de Corynebacterium sp. que tienen genes que muestran homología con NCgl2522, y la homología de los mismos se proporcionan en la siguiente Tabla 3.
T l
Ejemplo 2. Fermentación de putrescina mediante la introducción de CE2495 en una cepa productora de putrescina derivada de Corynebacterium sp.
<2-1> Introducción de CE2495 en el gen de transposón en el cromosoma de la cepa productora de putrescina basada en ATCC13032
Para examinar si la inserción cromosómica del gen CE2495 afecta a la exportación de putrescina en KCCM11240P ANCgl2522 que tenía una actividad reducida de exportación de putrescina que se preparó en el Ejemplo de Referencia 1, se introdujo CE2495 en un gen de transposón mediante el siguiente método.
Como un vector para la transformación, que permite la inserción de un gen en el cromosoma utilizando un gen de transposón de microorganismo de Corynebacterium sp., se usó pDZTn (documento WO 2009/125992), y se usó cj7 (documento WO 2006/65095) como un promotor.
Se amplificó un fragmento génico CE2495 de aproximadamente 1,44 kb utilizando el cromosoma de la cepa de Corynebacterium efficiens YS-314 como plantilla y un par de cebadores de las SEQ ID NOS: 9 y 10 (véase la Tabla 4). En este momento, la reacción de PCR se realizó durante 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, hibridación durante 30 segundos a 55°C, y extensión durante 1 minuto y 30 segundos a 72°C. A continuación, este producto de PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir y purificar una banda del tamaño deseado.
Además, la región de promotor cj7 se obtuvo realizando la PCR para 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, hibridación durante 30 segundos a 55°C, y extensión durante 30 segundos a 72°C usando p117-Pcj7-gfp como plantilla y un par de cebadores de SEQ ID NOs. 7 y 8 (véase la Tabla 4). Un fragmento del gen promotor cj7 se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir y purificar una banda del tamaño deseado.
El vector pDZTn se trató con XhoI y se realizó la clonación por fusión del producto de PCR obtenido anteriormente. Se usó el kit de clonación In-Fusion®HD (Clontech) en la clonación por fusión. El plásmido resultante se designó
como pDZTn-P(cj7)-CE2495.
A continuación, el plásmido pDZTn-P(cj7)-CE2495 se introdujo en Corynebacterium glutamicum KCCM11240P ANCgl2522 descrito en el Ejemplo de referencia 1 por electroporación para obtener un transformante. El transformante se cultivó con agitación en medio CM (10 g/l de glucosa, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de extracto de carne de res, 2,5 g/l de NaCl, y 2 g/l de urea, pH 6,8) (30°C durante 8 horas). Posteriormente, el cultivo celular se diluyó en serie de 10-4 a 10-10. Después, las muestras diluidas se colocaron en placas y se cultivaron en un medio sólido que contenía X-gal para la formación de colonias.
De las colonias formadas, se seleccionaron las colonias de color blanco que aparecían a una frecuencia relativamente baja para obtener finalmente cepas en las que se introdujo el gen que codifica CE2495 mediante un cruce secundario. Las cepas finalmente seleccionadas se sometieron a PCR utilizando un par de cebadores de SEQ ID NO: 7 y 10 para confirmar la introducción del gen que codifica CE2495. Esta cepa mutante de Corynebacterium glutamicum se designó como KCCM11240P ANCgl2522 Tn:P(cj7)-CE2495.
<2-2> Introducción de CE2495 en el gen de transposón en el cromosoma de la cepa productora de putrescina basada en ATCC13869
Para examinar si la inserción cromosómica del gen CE2495 afecta a la exportación de putrescina en DAB12-b ANCgl2522 que tiene una actividad reducida de exportación de putrescina que se preparó en el Ejemplo de referencia 1, se introdujo pDZTn-P(cj7)-CE2495 preparado anteriormente en Corynebacterium glutamicum DAB12-b ANCgl2522 y la cepa, se confirma la introducción de CE2495 en el gen de transposón de la misma manera que en el Ejemplo <2-1>.
Una cepa mutante de Corynebacterium glutamicum seleccionada de este modo se designó como DAB12-b ANCgl2522 Tn:P(cj7)-CE2495.
<2-3> Evaluación de la productividad de putrescina de la cepa productora de putrescina derivada de Corynebacterium sp. introducida con CE2495
Con el fin de confirmar el efecto de la introducción de CE2495 sobre la productividad de la putrescina en la cepa productora de putrescina, se compararon las productividades de putrescina de las cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum preparadas en los Ejemplos <2-1> y <2-2>.
En detalle, se colocaron en placas 6 tipos de mutantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM11240P; KCCM11240P ANCgl2522; KCCM11240P ANCgl2522 Tn:P(cj7)-CE2495; DAB12-b; DAB12-b ANCgl2522; DAB12-b ANCgl2522 Tn:P(cj7)-CE2495) en un medio de placa CM que contenía arginina 1 mM (glucosa al 1%, polipeptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, extracto de carne al 0,5%, NaCl al 0,25%, urea al 0,2%, 100 pl de NaOH al 50%, y agar al 2%, pH 6,8, basado en 1 l), y se cultivaron a 30°C durante 24 horas, respectivamente. Se inoculó 1 bucle de platino de cada cepa cultivada de este modo en 25 ml de medio de titulación (glucosa al 8%, proteína de soja al 0,25%, sólidos de maceración de maíz al 0,50%, (NH4)2SO4 al 4%, KH2PO4 al 0,1%, MgSO4 -7H2O al 0,05%, urea al 0,15%, 100 pg de biotina, 3 mg de clorhidrato de tiamina, 3 mg de ácido pantoténico cálcico, 3 mg de nicotinamida, y CaCO3 al 5%, pH 7,0, basado en 1 l), y después se cultivó con agitación a 30°C y 200 rpm durante 98 horas. Se añadió arginina 1 mM a todos los medios para cultivar las cepas. Se midió la concentración de putrescina en cada cultivo celular, y los resultados se muestran en la siguiente Tabla 5.
T l 1
Como se muestra en la Tabla 5, se encontró que la producción de putrescina aumentaba en los 2 tipos de cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum introducidas por CE2495.
Ejemplo 3. Fermentación de cadaverina por introducción de CE2495 y expresión de lisina descarboxilasa en la cepa productora de lisina derivada de Corynebacterium sp.
<3-1> Introducción de CE2495 en el gen de transposón en el cromosoma de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P productor de L-lisina
Para confirmar la actividad de exportación de cadaverina de la proteína CE2495, el gen CE2495 se introdujo en el cromosoma de una cepa productora de lisina KCCM11016P (este microorganismo se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms el 18 de diciembre de 1995 con Número de acceso KFCC10881, y después se depositó en el International Depository Authority bajo el Tratado de Budapest con en Número de acceso KCCM11016P, Patente coreana Número 10-0159812). Se introdujo pDZTn-P(cj7)-CE2495 preparado anteriormente en
Corynebacterium glutamicum
KCCM11016P y la cepa se confirmó por la introducción de CE2495 en el transposón de la misma manera que en el Ejemplo <2-1>.
Una cepa mutante de
Corynebacterium glutamicum
seleccionada de este modo se designó como KCCM11016P Tn:P(cj7)-CE2495.
<3-2> La introducción del gen de lisina descarboxilasa derivada de E. coli en la cepa productora de L-lisina introdujo CE2495
La cepa productora de L-lisina introdujo CE2495, KCCM11016P Tn:P(cj7)-CE2495 que se preparó en el Ejemplo <3 1> se introdujo con el gen de la lisina descarboxilasa derivado de
E. coli
en una forma de plásmido para la producción de cadaverina. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 25) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) de la lisina descarboxilasa ldcC se obtuvieron de la base de datos del NCBI.
Se obtuvo un fragmento del gen ldcC de aproximadamente 2,1 kb realizando una PCR durante 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, hibridación durante 30 segundos a 52°C, y extensión durante 2 minutos a 72°C usando el Cromosoma de la cepa
E. coli
W3110 como plantilla y un par de cebadores de las SEQ ID NOS: 29 y 30 (véase la Tabla 6). Este producto se trató con HindIII y XbaI, y después se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir y purificar una banda del tamaño deseado.
Además, la región de promotor cj7 se obtuvo realizando la PCR para 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, hibridación durante 30 segundos a 55°C, y extensión durante 30 segundos a 72°C usando p117-Pcj7-gfp como plantilla y un par de cebadores de SEQ ID NOs. 27 y 28 (véase la Tabla 6). Un fragmento génico del gen promotor cj7 se trató con KpnI y HindII, y después se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir y purificar una banda del tamaño deseado.
T l
Un fragmento génico que se obtuvo al realizar la electroforesis del vector pECCG117 tratado con KpnI y XbaI (Biotechnology letters vol 13, número 10, pág. 721-726 (1991)) en un gel de agarosa al 0,8% y después al eluir y purificar una banda del tamaño deseado, el fragmento del gen promotor cj7 tratado con KpnI y HindIII, y el fragmento del gen ldcC de lisina descarboxilasa tratado con HindIII y XbaI se clonaron utilizando la ADN ligasa T4 (NEB). El plásmido que codifica lcdc de
E. coli
obtenido por el experimento anterior se designó como pECCG117-Pcj7-ldcC. El vector pECCG117-Pcj7-ldcC preparado o el vector pECCG117 se introdujo en KCCM11016P y KCCM11016P Tn:P(cj7)-CE2495 por electroporación, respectivamente. Los transformantes se colocaron en placas BHIS que contenían 25 pg/ml de kanamicina para la selección. Las cepas seleccionadas fueron designados como KCCM11016P pECCG117, KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC, KCCM11016P Tn:P(cj7)-CE2495 pECCG117, y KCCM11016P Tn:P(cj7)-CE2495 pECCG117-Pcj7-ldcC, respectivamente.
<3-3> Evaluación de la productividad de cadaverina de la cepa productora de lisina derivada de
Corynebacterium sp. que tiene una inserción cromosómica de CE2495 y el gen de la lisina descarboxilasa como plásmido
Para examinar si la introducción de CE2495 en la cepa productora de cadaverina afecta a la producción de cadaverina, se comparó la productividad de cadaverina entre cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum preparadas en el Ejemplo <3-2>.
En detalle, se cultivaron 4 tipos de cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM11016P pECCG117; KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC; KCCM11016P Tn:P(cj7)-CE2495 pECCG117; y KCCM11016P Tn:P(cj7)-CE2495 pECCG117-Pcj7-ldcC) mediante el siguiente método, y la productividad de cadaverina se comparó entre las mismas.
Las cepas mutantes respectivas se pusieron en placas en medio de placa CM (glucosa al 1%, polipeptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, extracto de tercera al 0,5%, NaCl al 0,25%, urea al 0,2%, 100 pl de NaOH al 50% y agar al 2%, pH 6,8, basado en 1 l), y se cultivaron a 30°C durante 24 horas. Cada una de las cepas cultivadas se inoculó en un matraz con aletas deflectoras de 250 ml que contenía 25 ml de medio de siembra (glucosa al 2%, peptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, urea al 0,15%, KH2PO4 al 0,4%, K2HPO4 al 0,8%, MgSO4 -7H2O al 0,05%, 100 pg de biotina, 1000 pg de tiamina HCl, 2000 pg de ácido pantoténico cálcico, y 2000 pg de nicotinamida, pH 7,0, basado en 1 l), y se cultivó con agitación a 30°C y 200 rpm durante 20 horas.
Después, se inoculó 1 ml del cultivo de siembra en un matraz con aletas deflectoras de 250 ml que contenía 24 ml de medio de producción (glucosa al 4%, (NH4)2SO4 al 2%, proteína de soja al 2,5%, sólidos de maceración de maíz al 5%, urea al 0,3%, KH2PO4 al 0,1%, MgSO4 7H2O al 0,05%, 100 pg de biotina, 1000 pg de clorhidrato de tiamina, 2000 pg de ácido pantoténico-cálcico, 3000 pg de nicotinamida, 0,2 g de leucina, 0,1 g de treonina, 0,1 g de metionina y CaCO3 al 5%, pH 7,0, basado en 1 l), y después se cultivó con agitación a 30°C y 200 rpm durante 72 horas.
Después del cultivo, las productividades de cadaverina se midieron por HPLC. Las concentraciones de cadaverina en el cultivo celular de cada cepa se proporcionan en la siguiente Tabla 7.
T l 7
Como se muestra en la Tabla 7, la producción de cadaverina se aumentó en las cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum introducidas por CE2495.
Ejemplo 4. Fermentación de diamina por introducción de proteína con actividad de exportación de diamina en E. coli
<4-1> Preparación de la cepa por introducción de CE2495, HMPREF0281_01446, o HMPREF0298_0262 en W3110
Las actividades de exportación de diamina de la proteína HMPREF0281_01446 derivada de Corynebacterium ammoniagenes DSM 20306 y la proteína HMPREF0298_0262 derivada de Corynebacterium lipophiloflavum DSM 44291, que muestran un 59% y un 52% de homología con NCgl2522, además de CE24952, respectivamente, se examinaron en E. coli.
Los vectores para la introducción de HMPREF0281_01446 y HMPREF0281_01446 se construyeron de la misma manera que en la construcción de pDZTn-P(cj7)-CE2495 del Ejemplo 2-1.
El gen HMPREF0281_01446 se amplificó utilizando el cromosoma de la cepa de Corynebacterium ammoniagenes DSM 20306 como plantilla y un par de cebadores de las SEQ ID NOS: 31 y 32 (véase la Tabla 8) para obtener un fragmento génico de aproximadamente 1,4 kb.
De la misma manera, el gen HMPREF0298_0262 se amplificó utilizando el cromosoma de la cepa de
Corynebacterium lipophiloflavum DSM 44291 como plantilla y un par de cebadores de las SEQ ID NOS: 33 y 34 (véase la Tabla 8) para obtener un fragmento génico de aproximadamente 1,36 kb.
En este sentido, la PCR se realizó durante 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, hibridación durante 30 segundos a 55°C, y extensión durante 1 minuto y 30 segundos a 72°C. Después, cada uno de los productos de la PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir y purificar una banda del tamaño deseado.
T l 1
Además, la región de promotor cj7 se obtuvo realizando la PCR para 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, hibridación durante 30 segundos a 55°C, y extensión durante 30 segundos a 72°C usando p117-Pcj7-gfp como plantilla y un par de cebadores de SEQ ID NOS: 7 y 8. Un fragmento del gen promotor cj7 se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir y purificar una banda del tamaño deseado.
El vector pDZTn se trató con Xhol y se realizó la clonación por fusión de los productos de PCR obtenidos anteriormente. Se usó el kit de clonación In-Fusion®HD (Clontech) en la clonación por fusión. Los plásmidos resultantes se designaron como pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446 y pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262, respectivamente.
Posteriormente, para examinar si la expresión de CE2495 derivado de Corynebacterium efficiens YS-314, HMPREF0281_01446 derivado de Corynebacterium ammoniagenes, o la proteína Hm PREF0298_0262 derivada de Corynebacterium lipophiloflavum aumenta la producción de putrescina y cadaverina en la cepa de tipo silvestre de E. coli W3110 que tenía una ruta biosintética de putrescina y cadaverina, se introdujo pDZTn-P(cj7)-CE2495, pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446, o pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262 basados en vectores lanzadera de Corynebacterium y E.coli en W3110, respectivamente.
Se usó una solución 2X TSS (Epicentro) para la transformación en E. coli, y el transformante se colocó en placas y se cultivó en una placa LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y agar al 2%, basado en 1 l) que contenía kanamicina (50 pg/ml) para la formación de colonias. Las colonias formadas de este modo se designaron como W3110 pDZTn-P(cj7)-CE2495, W3110 pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446, y W3110 pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262, respectivamente.
<4-2> Comparación de productividad de diamina de E. coli introducido con CE2495, HMPREF0281_01446, o HMPREF0298_0262
Se examinaron las productividades de putrescina y cadaverina de las cepas obtenidas anteriormente.
En detalle, se cultivaron W3110 y W3110 pDZTn-P(cj7)-CE2495, W3110 pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446, o W3110 pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262 de E. coli en medio sólido LB a 37°C durante 24 horas.
Después, cada uno de ellos se cultivó en 25 ml de medio de titulación (2 g de (NH4)2PO4, 6,75 g de KH2PO4 , 0,85 g de ácido cítrico, 0,7 g de MgSO4 -7H2O, 0,5% (v/v) de elemento traza, 10 g de glucosa, 3 g de AMS, y 30 g de CaCO3 , basado en 1 l) a 37°C durante 24 horas. Una solución de metal traza contenía HCl 5 M: 10 g de FeSO4 -7H2O, 2,25 g de ZnSO4 -7H2O, 1 g de CuSO4 -5H2O, 0,5 g de MnSO4 -5H2O, 0,23 g de Na2B4Oy 10H2O, 2 g de CaCl2 -2H2O, y 0,1 g de (NH4)6MozO2 -4H2O por 1 litro.
Se midieron las concentraciones de putrescina y cadaverina producidas a partir de cada cultivo celular, y los resultados se proporcionan en la siguiente Tabla 9.
T l 1
Como se muestra en la Tabla 9, la cepa W3110 pDZTn-P(cj7)-CE2495 introducida por CE2495 mostró altas concentraciones de putrescina y cadaverina en cultivo celular, en comparación con la cepa parental W3110. Además, las producciones de putrescina y cadaverina se aumentaron notablemente en las cepas W3110 pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446 y W3110 pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262 que se introdujeron con HMPREF0281_01446 y HMPREF0298_0262, respectivamente.
Es decir, se confirmó que la diamina en el cultivo celular aumentó notablemente al mejorar la actividad de CE2495 o las proteínas que tenían la SEQ.ID.N.22 y la SEQ.ID.N. 24, lo que sugiere que la capacidad de exportar diamina, tal como putrescina y cadaverina, puede mejorarse al aumentar la actividad de CE2495 o la proteína que tiene una homología de secuencia del 55% o superior.
Como tal, los presentes inventores demostraron que Corynebacterium glutamicum tiene una actividad de CE2495 mejorada preparada introduciendo CE2495 en el transposón del microorganismo de Corynebacterium sp. KCCM11240P ANCgl2522 que tiene una ruta sintética de putrescina, pero la reducción de la actividad de exportación de putrescina ha mejorado la actividad de exportación de putrescina, produciendo de este modo putrescina con un alto rendimiento.
Por consiguiente, esta cepa KCCM11240P ANCgl2522 Tn:P(cj7)-CE2495 se designó como CC01-0757, y se depositó bajo el Tratado de Budapest en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) el 15 de noviembre de 2013, con Número de Acceso KCCM11475P.
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<400> 34
Claims (7)
1. Un microorganismo para producir diamina, en el que la actividad de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 6, SeQ ID NO: 22 o SEQ ID nO: 24, se introduce o se mejora dentro del microorganismo, en comparación con la actividad endógena.
2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que además se debilita la actividad de la diamina acetiltransferasa, en comparación con la actividad endógena.
3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la diamina acetiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 11, 12 y 13.
4. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la diamina es putrescina o cadaverina.
5. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o al género Escherichia.
6. Un método para producir diamina, que comprende:
(i) cultivar el microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para obtener un cultivo de células microbianas; y
(ii) recuperar la diamina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo celular.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la diamina es putrescina o cadaverina.
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