ES2718192T3 - Sistema vector inmunoestimulante novedoso - Google Patents

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Andrea Miegel
Carolin Biermann-Fleischhauer
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Description

DESCRIPCIÓN
Sistema vector inmunoestimulante novedoso
Campo técnico
La presente divulgación se refiere generalmente al campo de la inmunología y más específicamente al campo de la inmunoterapia. En particular, la presente divulgación se refiere a un sistema vector novedoso para inmunoestimulación y a métodos de uso del mismo en inmunoterapia. El sistema vector novedoso se caracteriza por uno o más vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican el ligando de 4-1BB (ligando 4-1BBL, CD137), IL-12 de cadena sencilla (scIL-12) e IL-2.
Antecedentes
El sistema inmunitario proporciona los medios para reconocer y destruir invasores extraños, tales como bacterias o virus, así como también células dañadas, enfermas o anormales del cuerpo, incluso células de cáncer. Los actores primarios en las respuestas del sistema inmunitario incluyen macrófagos y células citolíticas naturales, que proporcionan un nivel de protección inmunitaria general no específica. Otros tipos de células, que incluyen linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos B actúan contra dianas específicas. Las respuestas inmunitarias incluyen respuestas humorales, en donde las células B producen anticuerpos específicos de antígeno, y respuestas mediadas por célula en donde los antígenos o células que llevan antígenos se reconocen y se destruyen por diversos tipos de células T utilizando una diversidad de mecanismos diferentes. Las respuestas inmunitarias mediadas por célula, que incluyen una respuesta de CTL, se consideran clave para la eliminación de células de tumor y células infectadas con virus. Generalmente se cree que la capacidad natural del sistema inmunitario para detectar y destruir células anormales impide el desarrollo de muchos cánceres. No obstante, algunas células de cáncer han desarrollado estrategias para evadir la destrucción por el sistema inmunitario. Por ejemplo, existen varios mecanismos diferentes que pueden usar las células de cáncer para suprimir las respuestas inmunitarias. También pueden experimentar cambios genéticos que llevan a la pérdida de antígenos asociados con el cáncer, haciéndolas menos “visibles” para el sistema inmunitario. Se aplican consideraciones similares con respecto a diferentes virus, que también han adoptado estrategias de evasión inmunitaria, produciendo una falla del sistema inmunitario del hospedador para controlar una infección vírica.
La meta de la inmunoterapia es superar estas barreras de una respuesta inmunitaria eficaz. Las terapias biológicas basadas en inmunoterapia restauran o aumentan la actividad de componentes específicos del sistema inmunitario o contrarrestan señales inmunosupresoras producidas por las células de cáncer o durante enfermedades infecciosas víricas. Las células de tumor, entre otras, son destruidas por CTL de una manera específica de antígeno. De esta manera, los agentes que promueven la activación de células T e imparten fuertes propiedades citolíticas e inflamatorias son candidatos ideales para aumentar la inmunidad específica de tumor.
Se siguen requiriendo nuevas formas de terapia y una ruta principal de agentes inmunoterapéuticos se basa en la tecnología de transferencia génica. La terapia génica ha sido establecida como una forma para suministrar terapia inmunitaria. Hace 20 años se propusieron originalmente los virus y vectores víricos no replicantes como agentes anticancerosos, usando, entre otras cosas, realizaciones de activación inmunitaria (por ejemplo, IL-2) (véase, por ejemplo, Crofts y Krimsky, 2005, Hum Gene Ther. 16: 169-177). El documento WO 2004/035799 describe un vector adenovírico que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican IL-12 de cadena sencilla (scIL-12), el ligando de la proteína 4-1BB coestimulante (4-1BBL) e IL-2, para terapia génica en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer.
La presente divulgación se refiere a una inmunoterapia novedosa basada en vector que representa una mejora sobre los enfoques de terapia génica anteriores, eficaz para convertir un microambiente inmunitario inactivo en activo y tratar así el cáncer y las infecciones víricas.
Sumario de la divulgación
La presente divulgación proporciona un vector que comprende secuencias de ácido nucleico de genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (scIL-12) e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2, 3, con la condición de que el gen que codifica scIL-12 no está en la posición 1. La presente divulgación también proporciona métodos y usos del vector novedoso para convertir un microambiente inmunitario inactivo en activo, tratando así el cáncer o enfermedades infecciosas. Los métodos y composiciones de la presente divulgación incluyen la construcción y verificación del vector vírico reivindicado que provoca una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas e infecciones víricas para potenciar o estimular la inmunidad contra el cáncer y las infecciones víricas.
Los aspectos de la divulgación incluyen:
1. Vector que comprende secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (scIL-12) e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2, 3, con la condición de que el gen que codifica scIL-12 no está en la posición 1.
2. El vector del punto 1, en donde el vector es uno cualquiera de un vector adenovírico, un vector de virus adenoasociado, un vector lentivírico, un vector retrovírico, un vector de virus de herpes simple, un vector de poxvirus, un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector de nanopartícula y ADN desnudo.
3. El vector del punto 2, en donde el vector de ARN comprende ribonucleótidos modificados insertados.
4. El vector de uno cualquiera de los puntos 1-3, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL es ADNc humano, la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica scIL-12 es ADNc humano y/o la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica IL-2 es ADNc humano.
5. El vector de uno cualquiera de los puntos 1-4, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL muestra una homología o identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (Figura 13), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína 4-1BBL capaz de unirse específicamente a células T, preferentemente células T activadas.
6. El vector de uno cualquiera de los puntos 1-4, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica IL-2 muestra una homología o identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 (Figura 14), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína IL-2 que tiene actividad inmunoestimulante.
7. El vector de uno cualquiera de los puntos 1-4, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica scIL-12 muestra una homología o identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 (Figura 15), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína scIL-12 que tiene actividad inmunoestimulante.
8. El vector de uno cualquiera de los puntos 1-7, en donde las secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican scIL-12 e IL-2 están localizadas secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL.
9. El vector del punto 8, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica IL-2 está localizada secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL, y la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica scIL-12 está localizada secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2.
10. El vector del punto 8 o 9, en donde un promotor está localizado secuencia arriba de la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL, pero no secuencia arriba de las secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican scIL-12 y/o IL-2.
11. El vector de uno cualquiera de los puntos 8-10, en donde las secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican 4-1BBL, sclL-12 e IL-2 están enlazadas por sitios internos de entrada al ribosoma (IRES).
12. Partícula de virus que comprende el vector de uno cualquiera de los puntos 1-11.
13. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el vector de uno cualquiera de los puntos 1-11.
14. Una célula de cáncer o una célula inmunitaria, transducida o transfectada con el vector de uno cualquiera de los puntos 1-11 o la partícula de virus del punto 12.
15. Una composición que comprende el vector de uno cualquiera de los puntos 1-11, la partícula de virus del punto 12, el polinucleótido del punto 13 o la célula de cáncer o la célula inmunitaria del punto 14.
16. Un medicamento que comprende el vector de uno cualquiera de los puntos 1-11, la partícula de virus del punto 12, el polinucleótido del punto 13 o la célula de cáncer o la célula inmunitaria del punto 14.
17. El vector de uno cualquiera de los puntos 1-11, la partícula de virus del punto 12, el polinucleótido del punto 13, la célula de cáncer o la célula inmunitaria del punto 14, la composición del punto 15 o el medicamento del punto 16, para su uso en el tratamiento del cáncer, una infección vírica o un trastorno del sistema inmunitario. 18. El vector para su uso de acuerdo con el punto 17, la partícula de virus para su uso de acuerdo con el punto 17, el polinucleótido para su uso de acuerdo con el punto 17, la célula de cáncer o la célula inmunitaria para su uso de acuerdo con el punto 17, la composición para su uso de acuerdo con el punto 17 o el medicamento para su uso de acuerdo con el punto 17, en donde el cáncer es uno cualquiera de cáncer de mama, cáncer de próstata, linfoma, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de colon, melanoma, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, carcinoma cerebral primario, cáncer de cabeza-cuello, glioma, glioblastoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón de células no microcíticas, carcinoma de cabeza o cuello, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células microcíticas, tumor de Wilms, carcinoma cervical, carcinoma testicular, carcinoma de vejiga, carcinoma pancreático, carcinoma de estómago, carcinoma de colon, carcinoma prostático, carcinoma genitourinario, carcinoma tiroideo, carcinoma esofágico, mieloma, mieloma múltiple, carcinoma adrenal, carcinoma de células renales, carcinoma endometrial, carcinoma de la corteza adrenal, insulinoma pancreático maligno, carcinoma carcinoide maligno, coriocarcinoma, micosis fungoide, hipercalcemia maligna, hiperplasia cervical, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia granulocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia de células peludas, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, policitemia vera, trombocitosis esencial, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, sarcoma de tejido blando, mesotelioma, sarcoma osteogénico, macroglobulinemia primaria y retinoblastoma.
19. El vector de uno cualquiera de los puntos 1-11, la partícula de virus del punto 12, la composición del punto 13 o el medicamento del punto 14 para su uso en la prevención o el tratamiento de metástasis del cáncer.
20. El vector para su uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 17-19, caracterizado por que el sistema vector está presente a una concentración de no más de 1x1011 ivp (partículas víricas infecciosas), preferentemente no más de 1x1010 ivp, más preferentemente no más de 1x109 ivp, incluso más preferentemente no más de 1x107 ivp o 1x106 ivp por dosis unitaria.
21. La partícula de virus para su uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 17-19, caracterizado por que la partícula de virus está presente a una concentración de no más de 1x1011 ivp, preferentemente no más de 1x1010 ivp, más preferentemente no más de 1x109 ivp, incluso más preferentemente no más de 1x107 ivp o 1x106 ivp por dosis unitaria.
22. Una combinación de proteínas que comprende el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla (scIL-12), en donde la cantidad de 4-1BBL es más alta que la cantidad de scIL-12 e IL-2.
Los detalles de uno o más aspectos de la divulgación se exponen en los dibujos acompañantes y la descripción que sigue. Otros rasgos, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos y de las reivindicaciones.
Las reivindicaciones adjuntas a esta descripción definen la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una comparación de la expresión transgénica de IL-12, IL-2 y 4-1BBL y la respuesta de IFN-Y de lm01 murino y humano. Los números de MOI (multiplicidad de infección) se indican entre [corchetes]; “m” = murino; “hu” = humano.
La Figura 2 muestra un mapa esquemático de genes del plásmido lanzadera pE1.1 lm02. Los ADNc de los tres genes terapéuticos de 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla de humano están organizados en una construcción tricistrónica enlazada por sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y son manejados por un promotor de citomegalovirus (CMV). La poliadenilación del transcrito es inducida por una señal derivada de SV40. El casete de expresión de lm02 se ilustra como un plásmido de transferencia precursor basado en el plásmido pE1.1, adecuado para la subclonación en un plásmido que lleva, por ejemplo, ADN de vector adenovírico.
La Figura 3 muestra una comparación de la expresión transgénica y la respuesta de IFN-y de lm02 y el vector temprano lm01. Los números de MOI (multiplicidad de infección) se indican [corchetes]. Los puntos datos indicados son la media de cuatro donadores individuales, cada uno con cuatro duplicados.
La Figura 4 muestra una comparación de lm02 y lm01 en un modelo basado en tejido de vejiga. “T” = tejido de tumor de vejiga; “B” = tejido de vejiga normal.
La Figura 5 muestra una comparación de lm02 y lm01 a diferentes escalas de dosis. La dosis ivp significa dosis de partículas víricas infecciosas. “T” = tejido de tumor de vejiga; “B” = tejido de vejiga normal.
La Figura 6 muestra una gráfica de calor que ilustra la activación de tipos de células inmunitarias en un cocultivo de células de carcinoma de vejiga RT-4 humanas con PBMC humanas. Las filas posteriores muestran los tipos de células inmunitarias básicas y activadas (“act”). Se usaron como controles células RT-4 sin vector (“control”) y células transducidas con un vector adenovírico vacío (“Ad0”). Th = células T cooperadoras; Tc = células T citotóxicas (células T CD8+); PC = células plasmáticas; NK = células citolíticas naturales; mono = monocitos; DC = células dendríticas; neutro = neutrófilos.
La Figura 7 muestra un examen histológico después de marcación con hematoxilina y eosina de muestras estimuladas con lm02 o Ad0 o sin tratamiento como control. A: Tejido de tumor de vejiga sin cultivo; B = Tejido de tumor de vejiga, 108 ivp de Ad0, 6 días después del tratamiento; C: Tejido de tumor de vejiga, 108 ivp de lm02, 6 días después del tratamiento.
La Figura 8 muestra un examen histológico después de marcación con hematoxilina y eosina de muestras estimuladas con o sin lm02. Panel superior: tejido de tumor urotelial sin cultivo, panel inferior: tejido de tumor de vejiga estimulado con 108 ivp de lm02, 6 días después del tratamiento.
La Figura 9 muestra un análisis de células diana y el mecanismo de incorporación por microscopía de transmisión electrónica. Panel 1: vista general (imagen derecha); detalle (A): incorporación de partícula sin vesícula en un tipo de célula desconocido; detalle (B): color blanco: incorporación de partícula vesicular en una célula de morfología de célula de Langerhans /macrófago /célula dendrítica. Panel 2: vista general (B); detalle (A): incorporación de partícula adenovírica vesicular en una célula de morfología de célula de Langerhans /macrófago /célula dendrítica. Panel 3: vista general (B); detalle (A): incorporación de partícula adenovírica por una estructura vesicular fuerte en una célula de morfología de linfocito. Panel 4: vista general (B); detalle (A): incorporación de partícula adenovírica sin vesícula en una célula de morfología de fibroblasto. Panel 5: vista general (B); detalle (A): grupos grandes de partículas adenovíricas sin vesícula tomadas por un tipo de célula diana desconocido. Panel 6: vista general: partículas adenovíricas sin recubrimiento de vesícula (flechas blancas) entre abundantes estructuras vesiculares en una célula diana con características morfológicas de una célula epitelial o tumoral; detalle (A): Figura de endocitosis temprana de una partícula adenovírica unida a la membrana plasmática; detalle (B): pinocitosis de una partícula adenovírica en una vesícula grande que también contiene otras estructuras no víricas.
La Figura 10 muestra una comparación de la expresión diferencial en muestras de vejiga normal y tumor de vejiga. lm02 significa el vector adenovírico descrito en el ejemplo 2; Ad0 significa vector adenovírico vacío usado como control; n = número de muestras de vejiga/tumor.
La Figura 11 muestra el examen de diferentes transfectantes en cultivo celular. GFP = proteína fluorescente verde. CAR = Receptor de Coxsackie-Adenovirus; MOI = multiplicidad de infección (partículas víricas infecciosas por célula diana).
La Figura 12 muestra los efectos del sulfato de protamina sobre la expresión transgénica e inducción de IFN-y. lm02 significa el vector adenovírico descrito en el ejemplo 2; Ad0 = vector adenovírico vacío usado como control; ivp = partículas víricas infecciosas; “T” = tejido de tumor de vejiga; “B” = tejido de vejiga normal.
La Figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de 4-1BBL (CD137L) humano.
La Figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de IL-2 humana.
La Figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de Il-12 de cadena sencilla (scIL-12) de humano que comprende las subunidades p40 y p35 de IL-12 humana enlazadas por un enlazador. La secuencia enlazadora se muestra en negrita y subrayada en los SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente.
La Figura 16 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las subunidades de 35 kDa y 40 kDa de IL-12 humana.
La Figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 11) del vector promiscuo hu pE1.1 lm02 representado en la Figura 2. La secuencia de nucleótidos tiene un total de 7.845 pb. El promotor c Mv , 4-1BBL humana, EMCV IRES, IL-2 humana, PV IRES, scIL-12 humana y SV40polyA se pueden identificar en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 de la siguiente manera: promotor CMV: pb 484-1.059; 4-1BBL humana: pb 1.080-1.844; EMCV IRES: pb 1.885-2.388; IL-2 humana: pb 2.409-2.870; PV IRES: pb 2.914-3.545; sclL-12 humana: subunidad p40 pb 3.581-4.564, enlazador pb 4.565-4.609, subunidad p35 pb 4.610-5.203; y SV40polyA: pb 5.271-5.510.
La Figura 18 muestra una vista general esquemática y la secuencia de nucleótidos del casete de expresión que comprende CMV, 4-1BBL humana, EMCV IRES, IL-2 humana, PV IRES, scIL-12 humana y SV40polyA contenidos en el plásmido lanzadera hu pE1.1 lm02 representados en la Figura 2 y en SEQ ID NO: 11 (Figura 17), respectivamente.
Descripción detallada de la divulgación
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” y “el/la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a “un antígeno” incluye una pluralidad de tales antígenos, y la referencia a “una célula” o “la célula” incluye la referencia a una o más células y equivalentes de las mismas (por ejemplo, pluralidad de células) conocidas para los expertos en la materia, y así sucesivamente. Similarmente, la referencia a “un compuesto” o “una composición” incluye una pluralidad de tales compuestos o composiciones y se refiere a uno o más compuestos o composiciones, respectivamente, a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. El término “aproximadamente”, al hacer referencia a un número o escala numérica, significa que el número o escala numérica referida es una aproximación dentro de la variabilidad experimental (o dentro del error experimental estadístico) y por lo tanto el número o escala numérica puede variar entre un 1 % y un 15 % del número o escala numérica indicada. La frase “que comprende” (y términos relacionados tales como “comprende” o “que tiene” o “que incluye”) no pretende excluir que otras realizaciones, por ejemplo, una realización de cualquier composición de materia, composición, método o proceso o similares, descritas en el presente documento, pueden “consistir en” o “consistir esencialmente en” las características descritas.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado entendido comúnmente por el experto en la materia a la que pertenece esta divulgación. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los que en el presente documento se describen en la práctica de los métodos y composiciones divulgadas, se describen en el presente documento los métodos, dispositivos y materiales ejemplares.
La frase “secuencias de codón optimizado” se refiere en general a secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para una especie hospedadora particular reemplazando cualquier codón que tiene una frecuencia de uso menor de aproximadamente un 20 %. Las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para su expresión en una especie de hospedador dada, por eliminación de secuencias de poliadenilación espurias, eliminación de señales de corte y empalme de exón/intrón, eliminación de repeticiones de tipo transposón u optimización del contenido de GC, además de la optimización del codón, se denominan en el presente documento “secuencias de expresión mejorada”.
La frase “región promotora” se usa en el presente documento en su sentido común para hacer referencia a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en donde la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante secuencia abajo (en dirección 3'). La secuencia reguladora puede ser homóloga o heteróloga a la secuencia de gen deseado. Por ejemplo, pueden utilizarse una amplia gama de promotores que incluyen un promotor vírico o de mamífero como se describe en el presente documento. El promotor está orientado con respecto a una secuencia de ADN de tal manera que es capaz de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN.
El término “secuencia de ácido nucleico regulador” se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de transcripción, dominios reguladores secuencia arriba, orígenes de replicación, potenciadores y similares que, colectivamente, proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No es necesario que estén presentes todas estas secuencias de control, siempre que la secuencia codificante seleccionada sea susceptible de ser replicada, transcrita y traducida en una célula hospedadora apropiada. Un experto en la materia puede identificar fácilmente una secuencia de ácido nucleico regulador en las bases de datos y materiales públicos. Además, el experto en la materia puede identificar una secuencia reguladora que sea aplicable para el uso deseado, por ejemplo, in vivo, ex vivo o in vitro.
Las expresiones “colocado operativamente”, “enlazado operativamente”, “bajo el control” y “bajo el control de transcripción” significan que un promotor está en una localización y/u orientación funcional correcta con respecto a una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción o la expresión de esa secuencia. Un promotor puede o no usarse en conjunto con un “potenciador”, que se refiere a una secuencia reguladora de acción cis implicada en la activación de transcripción de una secuencia de ácido nucleico.
El documento WO 2004/035799 describe un vector adenovírico que comprende una construcción de expresión que comprende los genes para IL-12 de cadena sencilla (scIL-12) de ratón/humano, ligando de 4-1BB (4-1BBL) e IL-2 en este orden, en una orientación 5' a 3', esto es, el gen que codifica scIL-12 en la posición 1, el gen que codifica 4-1BBL en la posición 2 y el gen que codifica IL-2 en la posición 3. Esta construcción de expresión se muestra en la Figura 1 del documento WO 2004/035799 y el vector correspondiente se denominó “Ad-3”. En la presente divulgación, el código de vector interno para dicho vector anterior “Ad-3” es “lm01”, véase también el Ejemplo 1 de la presente divulgación.
La expresión transgénica de scIL-12, 4-1BBL e IL-2 de lm01 murino y humano ha revelado que el grado de expresión de los transgenes varía claramente entre las especies murino y humano, como se muestra en el ejemplo 1 y la figura 1 de la presente divulgación. Notablemente, la expresión de lm01 que lleva los genes de scIL-12 humana, 4-1BBL humana e IL-2 humana (“lm01 humano” o “hu lm01”) resultó en un aumento notable de IL-12 en comparación con la expresión de lm01 que lleva los genes de scIL-12 de ratón, 4-1BBL de ratón e IL-2 de ratón (“lm01 de ratón” o “m lm01”). De esta manera, a pesar de la misma arquitectura de vector de lm01 de ratón y humano con respecto a la organización del orden de los genes de scIL-12, 4-1BBL e IL-2, se observaron diferencias notables en el grado de expresión de los transgenes. Al menos algunas de estas diferencias en la expresión transgénica entre lm01 de ratón y humano eran completamente inesperadas.
El vector proporcionado por la presente divulgación comprende una arquitectura nueva con respecto a los tres genes que codifican scIL-12, 4-1BBL e IL-2. En particular, el vector proporcionado por la presente divulgación comprende un casete de expresión, en donde los tres genes que codifican scIL-12, 4-1BBL e IL-2 están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen que codifica scIL-12 no esté en la posición 1. Esta arquitectura de vector novedosa proporciona, entre otras cosas, una mayor expresión de 4-1BBL en comparación con la disposición de los mismos genes en lm01 humano, concurrentemente con una disminución de IL-12. Sorprendentemente, se ha descubierto que esta arquitectura de vector novedosa da lugar a un aumento en la respuesta de IFN-y (véase el Ejemplo 3 y la Figura 3 de la presente divulgación). Los efectos sorprendentes proporcionados por el vector novedoso de la presente divulgación han resultado particularmente beneficiosos para la inmunoterapia de pacientes que requieren de dicha terapia. Específicamente, se ha mostrado que el vector de la presente divulgación es particularmente eficaz para convertir un microambiente inmunitario inactivo en activo, tratando así el cáncer o las infecciones víricas. Por lo tanto, el vector de la presente divulgación es particularmente adecuado para su uso en la inmunoterapia del cáncer. Por ejemplo, las Figuras 4 y 5 de la presente divulgación muestran que el vector de la presente divulgación exhibe un efecto mejorado de inmunoestimulación en el microambiente de tumor en comparación con el vector anterior lm01, como se explica en los Ejemplos 4 y 5 correspondientes. Adicionalmente, un análisis de transcriptoma ha mostrado que el perfil de expresión del gen terapéutico del vector de la presente divulgación es único y superior, en particular superior sobre el vector anterior lm01 (véase el Ejemplo 6 y las Tablas 1 y 2). Además, como se muestra en la Figura 6, el análisis de la expresión génica de la activación de los tipos de células inmunitarias principales ha mostrado que la activación de células T cooperadoras y células T citotóxicas (células T CD8+) por el vector de la presente divulgación es superior a la activación de las mismas células inmunitarias con el vector anterior lm01 (véase el Ejemplo 7).
El vector novedoso de la presente divulgación comprende tres genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sc-IL12) e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' de tal manera que el gen que codifica sclL-12 no está en la posición más secuencia arriba de dichos tres genes. De esta manera, el vector novedoso de la presente divulgación comprende tres genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sc-IL12) e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen que codifica scIL-12 no está en la posición 1. Más específicamente, el vector comprende secuencias de ácido nucleico de genes que codifican 4-1BBL, sc-IL12 e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1. Más específicamente, el vector comprende secuencias de ácido nucleico de genes que codifican 4-1BBL, sc-IL12 e IL-2, en donde dichas secuencias de ácido nucleico de dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1.
En diversos aspectos de la presente divulgación, el vector novedoso comprende una construcción de expresión (o casete de expresión) que comprende tres genes (más específicamente secuencias de ácido nucleico de tres genes) que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sc-IL12) e IL-2, en donde dichos genes están organizados en el casete de expresión de tal manera que el gen que codifica sclL-12 no está en la posición más secuencia arriba del casete de expresión. La posición más secuencia arriba del casete de expresión puede describirse más específicamente como la posición del extremo 5' del casete de expresión. También, la posición más secuencia arriba del casete de expresión puede describirse más específicamente como la posición inmediatamente secuencia abajo de un promotor que regula la transcripción de los tres genes del casete de expresión. El promotor puede ser un promotor que es parte del casete de expresión o un promotor secuencia arriba del casete de expresión. La organización de los tres transgenes (esto es, los tres genes que codifican 4-1BBL, sc-IL12 e IL-2) del casete de expresión puede describirse más específicamente en el sentido de que las secuencias de ácido nucleico de dichos tres genes están organizadas en orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1,2 y 3, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1 de los tres genes del casete de expresión.
En diversos aspectos de la presente divulgación, el vector novedoso de la presente divulgación comprende una construcción de expresión (o casete de expresión) que comprende tres genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sc-IL12) e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1. Más específicamente, el vector comprende una construcción de expresión (o casete de expresión) que comprende secuencias de ácido nucleico de genes que codifican 4-1BBL, sc-IL12 e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1. Más específicamente, el vector comprende una construcción de expresión (o casete de expresión) que comprende secuencias de ácido nucleico de genes que codifican 4-1BBL, sc-IL12 e IL-2, en donde dichas secuencias de ácido nucleico de dichos genes están organizadas en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1. En diversos aspectos, el casete de expresión o construcción de expresión de la presente divulgación comprende un promotor. El promotor puede describirse más específicamente como un promotor que regula la transcripción del casete de expresión (o construcción de expresión). En diversos aspectos, el casete de expresión comprende un promotor que está localizado secuencia arriba (o en el extremo 5') del casete de expresión (o secuencia arriba del extremo 5' del casete de expresión).
Como se describe en el presente documento, la “posición 1” de la oración condicional arriba mencionada puede describirse más específicamente como la posición 1 de dicho orden secuencial 1, 2 y 3.
En diversos aspectos, la organización de los tres genes que codifican sclL-12, 4-1BBL e IL-2 en una orientación 5' a 3', significa la organización de los tres genes que codifican sclL-12, 4-1BBL e IL-2 en orientación 5' a 3' con respecto al casete de expresión o construcción de expresión de la presente divulgación que comprende los tres genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sc-IL12) e IL-2. De esta manera, la orientación 5' a 3' se refiere a la orientación 5' a 3' del casete de expresión (o construcción de expresión) o el promotor del casete de expresión.
En diversos aspectos distintos de la presente divulgación, la organización de los tres genes que codifican sclL-12, 4-1BBL e IL-2 en orientación 5' a 3' significa la organización de los tres genes que codifican sclL-12, 4-1BBL e IL-2 en la orientación 5' a 3' con respecto a un promotor que no es parte del casete de expresión (o construcción de expresión) de la divulgación, pero que está localizado secuencia arriba del casete de expresión (o construcción de expresión), esto es, secuencia arriba del extremo 5' del casete de expresión (o construcción de expresión). En este punto, la orientación 5' a 3' se refiere a la orientación 5' a 3' del promotor secuencia arriba del extremo 5' del casete de expresión (o construcción de expresión). El promotor localizado secuencia arriba del casete de expresión (o secuencia arriba del extremo 5' del casete de expresión) puede describirse más específicamente como el promotor que regula la transcripción del casete de expresión (o construcción de expresión).
También, la orientación 5' a 3' puede referirse a la orientación 5' a 3' del promotor secuencia arriba de ese gen de los tres transgenes de la presente divulgación (esto es, que codifican sclL-12, 4-1BBL e IL-2), que está en la posición más secuencia arriba de dichos tres transgenes.
El vector proporcionado por la presente divulgación comprende una arquitectura nueva con respecto a los tres genes que codifican sclL-12, 4-1BBL e IL-2, que también puede describirse en el sentido de que dichos tres genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1, en donde dicha posición 1 es secuencia abajo de un promotor, en particular secuencia abajo de un promotor para la expresión de dichos tres genes. De esta manera, con respecto al casete de expresión (o construcción de expresión) de la presente divulgación que comprende los tres genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sc-IL12) e IL-2, dichos tres genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen que codifica sclL-12 no está en la posición 1, en donde dicha posición 1 es secuencia abajo de un promotor, en particular secuencia abajo de un promotor para la transcripción/expresión de dicho casete de expresión (o construcción de expresión).
Como se describe en el presente documento, “localizado secuencia arriba” puede describirse más específicamente como “localizado directamente secuencia arriba”. Además, “localizado en el extremo 5'” o “localizado secuencia arriba del extremo 5'” pueden describirse más específicamente como “localizado en el extremo 5' del sitio de iniciación de transcripción” o “localizado secuencia arriba del extremo 5' del sitio de iniciación de transcripción”. El vector novedoso de la presente divulgación es capaz de expresar los genes (o secuencias de ácido nucleico de los genes) que codifican 4-1BBL, sc-IL12 e IL-2. De esta manera, más específicamente, el vector novedoso de la presente divulgación es un vector de expresión, incluso más específicamente un vector de expresión recombinante. El vector novedoso de la presente divulgación proporciona una expresión de 4-1BBL más alta en comparación con la expresión de sclL-12 e IL-2. Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona un sistema vector que comprende uno o más vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican al menos el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sclL-12) e IL-2, en donde el sistema vector proporciona una expresión de 4-1BBL más alta en comparación con la expresión de sclL-12 e IL-2. La expresión más alta de 4-1BBL se regula por diferente fuerza de promotor de los promotores que regulan la transcripción de los tres transgenes. Los dichos uno o más vectores son vectores de expresión capaces de expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican 4-1BBL, sclL-12 e IL-2. Más específicamente, los vectores de expresión son vectores de expresión recombinantes. El sistema vector novedoso de la presente divulgación es capaz de expresar los genes (o secuencias de ácido nucleico de los genes) que codifican 4-1BBL, sc-IL12 e IL-2. De esta manera, más específicamente, el sistema vector novedoso de la presente divulgación es un sistema vector de expresión que comprende uno o más vectores de expresión, incluso más específicamente un sistema vector de expresión recombinante que comprende uno o más vectores de expresión recombinante.
El uno o más vectores del vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación pueden ser uno cualquiera de un vector adenovírico, un vector de virus adenoasociado, un vector lentivírico, un vector retrovírico, un vector de virus de herpes simple, un vector de poxvirus, un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector de nanopartícula y ADN desnudo, o una combinación de los mismos.
En diversos aspectos de la divulgación, el uno o más vectores del vector/sistema vector novedoso son vectores víricos. Los vectores víricos pueden ser vivos, atenuados, condicionales de replicación o deficientes de replicación, y también pueden ser un vector vírico competente de replicación no patógeno (defectuoso).
En ciertos aspectos de la presente divulgación, el uno o más vectores del vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación se seleccionan de genoma de vector retrovírico, genoma de vector lentivírico, genoma de vector de poxvirus, genoma de vector de virus vacuna, genoma de vector de adenovirus, genoma de vector de virus adenoasociado, genoma de vector de virus de herpes, genoma de vector de virus alfa, ADN plasmídico y ARN. Deseablemente se incorporan características de seguridad del vector vírico, por ejemplo deficiencia de integración. En ciertas realizaciones, la deficiencia de integración puede conferirse por elementos del genoma del vector pero también pueden derivar de elementos del sistema de empaquetamiento (por ejemplo, una proteína integrasa no funcional que puede no ser parte del genoma del vector pero que puede suministrarse en trans).
En diversas realizaciones, el uno o más vectores del vector/sistema vector novedoso de la divulgación son vectores replicativos. Preferentemente, los vectores replicativos son vectores víricos replicantes, más preferentemente vectores adenovíricos replicantes. En diversas realizaciones distintas, el uno o más vectores del vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación son vectores no replicativos, preferentemente vectores víricos no competentes de replicación, más preferentemente vectores adenovíricos no competentes de replicación.
Si el uno o más vectores del vector/sistema vector novedoso de la divulgación son vectores de ARN, estos pueden comprender ribonucleótidos modificados insertados.
Los vectores víricos ejemplares de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores de poxvirus, vectores de virus vacuna, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores de virus de herpes y vectores de virus alfa. Preferentemente, el vector vírico es un vector adenovírico.
En ciertas realizaciones, un vector de adenovirus o vector de virus adenoasociado puede usarse para expresar los tres genes, ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (sclL-12) e IL-2. Se han descrito varios sistemas de vector de adenovirus y métodos para administrar los vectores (véase, por ejemplo, Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:6188-93).
Los vectores retrovíricos pueden incluir aquellos basados en virus de leucemia murina (MuLV), virus de leucemia de gibón (GaLV), retrovirus ecotrópicos, virus de inmunodeficiencia de simio (VIS), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos.
En ciertos aspectos, el uno o más vectores del vector/sistema vector novedoso de la divulgación son un vector retrovírico, preferentemente un vector lentivírico. Los vectores lentivíricos basados en genoma adecuados para terapia génica humana incluyen los basados en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1), VIH-2, virus de inmunodeficiencia felina (VIF), virus de anemia infecciosa equina, virus de estomatitis vesicular (VSV), y virus de inmunodeficiencia de simio (VIS).
En diversos aspectos, el vector es ADN plasmídico o ADN cosmídico. El ADN plasmídico o ADN cosmídico que contiene uno o más polinucleótidos que codifican al menos 4-1BBL, sclL-12 e IL-2 Como se describe en el presente documento, se construye fácilmente usando las técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Típicamente, el vector puede construirse en forma de plásmido que después puede transfectarse a una línea celular de empaquetamiento o productora. El plásmido comprende generalmente secuencias útiles para la replicación del plásmido en la bacteria. Tales plásmidos se conocen bien en la técnica. Además, los vectores que incluyen un origen de replicación procariótico también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable, tal como resistencia a un fármaco.
En un aspecto, se proporcionan vectores de expresión recombinante que comprenden una secuencia de polinucleótido que codifica al menos 4-1BBL, sclL-12 e IL-2, que inducen una respuesta inmunitaria en una enfermedad infecciosa o cáncer. Para dirigir la expresión de 4-1BBL, sclL-12 e IL-2, las secuencias de polinucleótido codificantes de cada vector deben incluir al menos una secuencia de control de expresión apropiada (también llamada una secuencia o característica de expresión reguladora) que se enlaza operativamente con una o más secuencias de polinucleótido codificantes. Los elementos de control de expresión de que pueden usarse para regular la expresión de los polipéptidos codificados son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, potenciadores, guías y otras secuencias reguladoras.
Como se describe en el presente documento, el vector de expresión puede comprender al menos una secuencia reguladora de expresión (secuencia de control de expresión). En ciertos aspectos, cuando el vector de expresión comprende un genoma de vector vírico, se desea la expresión de 4-1BBL, sclL-12 e IL-2 en células diana particulares. Típicamente, por ejemplo en un vector vírico, la secuencia de polinucleótido que codifica 4-1BBL, sclL-12 o IL-2 está localizada entre las secuencias 5' LTR y 3' LTR. Además, la secuencia o secuencias de nucleótidos codificantes preferentemente están enlazadas en una relación funcional con otras secuencias o características genéticas o reguladoras, por ejemplo secuencias reguladoras de transcripción que incluyen promotores o potenciadores que regulan la expresión de los genes que codifican 4-1BBL, sclL-12 e IL-2 de una manera particular. Con respecto a las construcciones de vector vírico, un promotor/potenciador “interno” es uno que está localizado entre las secuencias 5' LTR y 3' LTR en el vector vírico y está enlazado operativamente a la secuencia de polinucleótido codificante de interés. El promotor/potenciador interno puede ser cualquier promotor, potenciador o combinación promotor/potenciador conocida que aumenta la expresión de un gen con el cual está en una relación funcional. Una “relación funcional” y “enlazado operativamente” significan, sin limitación, que la secuencia está en la localización y orientación correctas con respecto al promotor o potenciador, de tal manera que la secuencia de interés será expresada cuando el promotor o potenciador haga contacto con las moléculas apropiadas. En ciertos casos, las secuencias reguladoras de transcripción útiles son aquellas que están altamente reguladas con respecto a la actividad, tanto temporal como espacialmente. La elección de un promotor/potenciador interno se basa en el patrón de expresión deseado de los tres genes, 4-1BBL, sclL-12 e IL-2, y las propiedades específicas de los promotores/potenciadores conocidos. De esta manera, el promotor interno puede ser constitutivamente activo. Ejemplos no limitativos de promotores constitutivos que pueden usarse incluyen el promotor CMV. En varias realizaciones de la divulgación, el vector/sistema vector novedoso comprende un promotor/potenciador interno, que proporciona una expresión de 4-1BBL más alta en comparación con sclL-12 e IL-2. Se han identificado y caracterizado muchos potenciadores de los genomas víricos y de genomas de mamífero (véase por ejemplo, las bases de datos públicamente disponibles, tales como GenBank).
Típicamente, los potenciadores son elementos de ADN de acción cis, habitualmente de longitud de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero y de virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia de polinucleótido que codifica el gen de interés, pero preferentemente se localiza en un sitio 5' desde el promotor. Un potenciador puede usarse en combinación con un promotor heterólogo. El experto en la materia será capaz de seleccionar el potenciador apropiado basándose en el patrón de expresión deseado de 4-1BBL, sclL-12 e IL-2.
En diversos aspectos, el promotor puede ser un promotor específico de tejido. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de células diana. Además, los promotores se pueden seleccionar para permitir la expresión inducible de 4-1BBL, scIL-12 o IL-2. Se conocen en la técnica varios sistemas para expresión inducible, que incluyen el sistema responsivo a tetraciclina, el sistema operador-represor lac, y también promotores responsivos a una variedad de cambios ambientales o fisiológicos, que incluyen choque térmico, iones de metal, interferones, hipoxia, esteroides y radiación. También puede usarse una combinación de promotores para obtener la expresión deseada de cada uno de los tres genes que codifican 4-1BBL, sclL-12 e IL-2. El experto en la materia será capaz de seleccionar un promotor basándose en el patrón de expresión deseado de las secuencias de polinucleótido en el organismo o el tejido diana o célula diana de interés.
Como se describe en el presente documento, el vector de expresión, que incluye un genoma de vector vírico, puede comprender al menos un promotor responsivo de ARN polimerasa II o III. Este promotor se puede enlazar operativamente a la secuencia o secuencias de polinucleótido que codifican al menos 4-1BBL, sclL-12 o IL-2, y también se pueden enlazar a una secuencia de terminación. Además, se puede incorporar más de un promotor de ARN polimerasa II o III. Los promotores de ARN polimerasa II y III son muy conocidos para el experto en la materia.
Para el suministro de un vector de expresión recombinante, que incluye un genoma de vector vírico, a una célula diana o tejido diana particular para inducir una respuesta inmunitaria mediada por célula, usualmente el genoma del vector contendrá un promotor que es reconocido por la célula diana o tejido diana y que se enlaza operativamente a la secuencia o secuencias de interés, componentes víricos (cuando el vector es un vector vírico), y otras secuencias expuestas en el presente documento.
Los promotores pueden ser inducibles, constitutivos, temporalmente activos o específicos de tejido. Los promotores inducibles son herramientas útiles en ingeniería genética porque la expresión de genes a los que se enlazan operativamente se puede encender o apagar, por ejemplo en un tejido particular. Los promotores inducibles se pueden agrupar como promotores regulados químicamente y promotores regulados físicamente. Los promotores regulados químicamente típicos incluyen, sin limitación, promotor regulado por esteroide (por ejemplo, un promotor basado en el receptor de glucocorticoide (GR) de rata, promotor basado en el receptor estrogénico (ER) humano), promotores regulados por metal (por ejemplo, promotores basados en el gen de metalotioneína), y promotores relacionados con patogénesis (por ejemplo, promotores basados en proteína relacionada con patógeno (PR) de Arabidopsis y maíz). Los promotores regulados físicamente típicos incluyen, sin limitación, promotores regulados por temperatura (por ejemplo promotores de choque térmico) y promotores regulados por la luz (por ejemplo, promotor SSU de soya). Otros promotores ejemplares son muy conocidos para el experto en la materia.
En diversos aspectos, puede usarse el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano SV40 y la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous. También se contempla el uso de otros promotores de fago celular o bacteriano de virus o mamífero, que son muy conocidos en la técnica para obtener la expresión de polinucleótidos. El experto en la materia será capaz de seleccionar un promotor apropiado basándose en las circunstancias específicas. Se describen en la técnica muchos promotores diferentes, igual que los métodos para enlazar operativamente el promotor a la secuencia de polinucleótido por expresar. Pueden usarse tanto secuencias de promotor nativas como muchos promotores heterólogos para dirigir la expresión en una célula de empaquetamiento y una célula diana o tejido diana. Los promotores heterólogos se usan típicamente porque por lo general permiten una mayor transcripción y rendimientos más altos de la proteína deseada en comparación con el promotor nativo. El promotor se puede obtener, por ejemplo, de los genomas de virus tales como el virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalorivus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de simio 40 (SV40). El promotor también puede ser, por ejemplo, un promotor heterólogo de mamífero, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, un promotor de choque térmico o el promotor asociado normalmente con la secuencia nativa, siempre que tales promotores sean compatibles con la célula diana o tejido diana. En una realización, el promotor es el promotor vírico natural en un sistema de expresión vírica. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de células de tumor.
Los vectores de expresión también pueden contener las secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran frecuentemente en las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADN o ADNc eucarióticos o víricos, y son muy conocidas en la técnica.
El vector/sistema vector novedoso de la divulgación puede codificar adicionalmente uno o más inmunógenos que incluyen, sin limitación, inmunógenos de un virus oncogénico (por ejemplo, EBV, HPV, HBV, HCV, HTLV y KSHV) y antígenos asociados a tumor. Preferentemente, el antígeno asociado a tumor es un antígeno asociado a tumor de cáncer de vejiga, cáncer hepático, carcinoma de células de Merkel, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, mesotelioma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer de ovario. Más preferentemente, el antígeno asociado a tumor es de cáncer de vejiga. En ciertas realizaciones, el antígeno asociado a tumor es cualquiera de p53, Ras, c-Myc, A-Raf, B-Raf, C-Raf, NY-ESO-1, LAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, CT7, CT10, GAGE, IMP3, antígeno T BK, MART-1, DAM-6, NA88-A, Gp100, PSA, PSM, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, MUC1, MUC2, receptores TRK, PRAME, P15, SART-1, SART-2, SART-3, antígeno de tumor de Wilms (WT1), AFP, CEA, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, RAGE, 707-AP, BCR-ABL, factor regulador de interferón 4 (IRF4), transductor 1 de señal de calcio asociado con tumor (TACSTD1), TACSTD2, tirosina-quinasas receptoras, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), tirosina-quinasas citoplásmicas, familia src, factor nuclear kappa B (NF-kB), receptores Notch, c-Met, quinasas reguladas por señal extracelular (ERK), PMSA, PR-3, MDM2, mesotelina, carcinoma de células renales 5T4, SM22-alfa, STEAD, hTERT, puntos de ruptura de translocación de sarcoma, EpCAM, NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógeno, ciclina B1, My CN, BORiS, proteína de esperma 17, SSX2, B7h3, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2 y antígeno 1 relacionado con fos. En otra realización, se proporciona un método en la presente en donde el antígeno asociado a tumor se selecciona de un antígeno de cáncer de vejiga. En una realización, el antígeno de cáncer de vejiga es cualquiera de CTA, NY-ESO-1, LAGE-1, MAGE-A1, mAg E-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, CT7, CT10, GAGE, PRAME; BAGE; RAGE, SAGE, HAGE, MPHOSPH1, DEPDCI, IMP3 y MAGE-A, y antígeno T BK.
Cuando el vector de expresión es un genoma de vector vírico, el genoma de vector vírico puede construirse típicamente en una forma de plásmido que puede ser transfectada en una línea celular de empaquetamiento o productora para la producción de la construcción del genoma de vector vírico. En general, el plásmido comprende secuencias útiles para la replicación del plásmido en la bacteria. Estos plásmidos son muy conocidos en la técnica. Además, los vectores que incluyen un origen de replicación procariótico también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable, tal como resistencia a fármaco. Como será entendido por los expertos en la materia, se puede modificar convenientemente una secuencia codificante para aumentar su expresión en un hospedador particular. El código genético es redundante con 64 codones posibles, pero la mayoría de los organismos utilizan preferentemente un subgrupo de estos codones. Los codones que se utilizan más frecuentemente en una especie se denominan codones óptimos, y los que no se utilizan muy frecuentemente se clasifican como codones raros o de poco uso. Los codones se pueden sustituir para reflejar el uso de codón preferido del hospedador, un proceso denominado algunas veces “optimización de codón” o “control para sesgo de codón de especie”. Se pueden preparar secuencias de codón optimizado que contienen los codones preferidos por un hospedador procariótico o eucariótico particular, por ejemplo para aumentar la velocidad de traducción o para producir transcritos de ARN recombinante que tienen las propiedades deseadas, tales como vida media prolongada, en comparación con los transcritos producidos por una secuencia no optimizada. En varias realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican al menos 4-1BBL, sclL-12 o IL-2 son de codón optimizado para su expresión en humanos. En realizaciones preferidas de la presente divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL es ADNc humano (gen humano de 4-1BBL), la secuencia de ácido nucleico que codifica sclL-12 es ADNc humano (gen humano de sclL-12), y/o la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2 es ADNc humano (gen humano de IL-2).
En diversos aspectos, la secuencia o secuencias de ácido nucleico del vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación son secuencias de ADNc. Las secuencias de ácido nucleico de los genes de 4-1BBL, sclL-12 o IL-2 contenidas en el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación pueden considerarse como secuencias de ácido nucleico heterólogo. Las frases secuencia o secuencias secuencias de ácido nucleico y polinucleótido o polinucleótidos pueden usarse en el presente documento intercambiablemente. Como se describe en el presente documento, el término “secuencia de ácido nucleico” puede abarcar secuencias de ácido nucleico tanto de cadena sencilla como de cadena doble. En varias realizaciones, una secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN.
En diversos aspectos, el vector es un vector de ADN. En diversos aspectos, el vector es un vector de ARN. El vector novedoso de la presente divulgación puede describirse más específicamente como un vector circular, incluso más específicamente como un vector de expresión circular. Como se describe en el presente documento, el término “vector” puede abarcar vectores tanto de cadena sencilla como de cadena doble que incluyen, sin limitación, vectores de ADN de cadena sencilla y cadena doble.
Como se describe en el presente documento, las secuencias de ácido nucleico de genes que codifican 4-1BBL abarcan secuencias de ácido nucleico que codifican variantes de 4-1BBL, en particular las variantes de 4-1BBL que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 (Figura 13). Estas secuencias variantes se describen más abajo en mayor detalle. Similarmente, las secuencias de ácido nucleico de genes que codifican IL-2 abarcan secuencias de ácido nucleico que codifican variantes de IL-2, en particular las variantes de IL-2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 Figura 14). Estas secuencias variantes se describen más abajo en mayor detalle. También, las secuencias de ácido nucleico de genes que codifican scIL-12 abarcan secuencias de ácido nucleico que codifican variantes de scIL-12, en particular las variantes de scIL-12 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 (Figura 15). Estas secuencias variantes se describen más abajo en mayor detalle.
En diversos aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico (del gen) que codifica 4-1BBL comprende: (i) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de ácido nucleico es de codón optimizado para su expresión en humano; (ii) la secuencia de ácido nucleico (del gen) que codifica IL-2 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de ácido nucleico es de codón optimizado para su expresión en humano, o (iii) la secuencia de ácido nucleico (del gen) que codifica scIL-12 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia de ácido nucleico es de codón optimizado para su expresión en humano.
4-1BB es un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). CD137 es la designación para 4-1BB de acuerdo con la nomenclatura c D. En la presente divulgación, los términos CD137 y 4-1BB pueden usarse intercambiablemente. Por consiguiente, los términos ligando de 4-1BB (4-1BBL) y CD137 también pueden usarse intercambiablemente en la presente divulgación. En diversas realizaciones de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL (o ligando de CD137) muestra al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (Figura 13), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína 4-1BBL capaz de unirse específicamente a células T activadas, preferentemente células cooperadoras CD4+ y células T CD8+. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL muestra al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (Figura 13), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína 4-1BBL capaz de unirse específicamente a células T activadas, preferentemente células cooperadoras CD4+ y células T CD8+. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL muestra al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (Figura 13), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína 4-1BBL capaz de unirse específicamente a células T activadas, preferentemente células cooperadoras CD4+ y células T c D8+. Incluso más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL muestra al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 (Figura 13), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína 4-1BBL capaz de unirse específicamente a células T activadas, preferentemente células cooperadoras CD4+ y células T CD8+. En ciertas realizaciones, las variantes de 4-1BBL anteriormente descritas exhiben la misma especificidad de unión a las células T, preferentemente células cooperadoras CD4+ y células T CD8+, que la 4-1BBL nativa codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 1 (Figura 13). En una realización particularmente preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL comprende (o consiste en) la secuencia de SEQ ID NO: 1 (Figura 13). En varias realizaciones preferidas, la secuencia variante de la secuencia de ácido nucleico de 4-1BBL humana descrita en la presente no es una secuencia de nucleótidos que codifica 4-1BBL de ratón. De esta manera, en varias realizaciones preferidas, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL de origen de ratón.
En diversos aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica Il-2 muestra al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 (Figura 14), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína IL-2 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2 muestra al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 (Figura 14), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína IL-2 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2 muestra al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 (Figura 14) , en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína IL-2 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2 muestra al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 (Figura 14), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína IL-2 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. En ciertas realizaciones, las variantes de IL-2 anteriormente descritas exhiben la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la IL-2 nativa codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 3 (Figura 14). En una realización particularmente preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2 comprende (o consiste en) la secuencia de SEQ ID NO: 3 (Figura 14). En varias realizaciones preferidas, la secuencia variante de la secuencia de ácido nucleico de IL-2 humana descrita en la presente no es una secuencia de nucleótidos que codifica IL-2 de ratón. De esta manera, en varias realizaciones preferidas, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2 de origen de ratón.
En diversos aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica scIL-12 muestra al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 (Figura 15), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína scIL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica scIL-12 muestra al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 (Figura 15), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína scIL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica scIL-12 muestra al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 (Figura 15) , en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína scIL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Incluso más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica scIL-12 muestra al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 (Figura 15), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína scIL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Como se describe en el presente documento, una proteína se considera una proteína scIL-12 si comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las dos subunidades de la proteína IL-12 nativa como una proteína de fusión. La secuencia de SEQ ID NO: 5 (Figura 15) muestra la secuencia del gen que codifica las subunidades de 40 kDa y 35 kDa de la IL-12 humana, enlazadas por un enlazador. En la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, representada en la Figura 15, la secuencia enlazadora se muestra en negrita. En ciertas realizaciones, las variantes de scIL-12 anteriormente descritas exhiben la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la scIL-12 codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 5 (Figura 15). En un aspecto particularmente preferido, la secuencia de ácido nucleico que codifica scIL-12 comprende (o consiste en) la secuencia de SEQ ID NO: 5 (Figura 15). En diversos aspectos preferidos, una secuencia variante de la secuencia de ácido nucleico de scIL-12 humana descrita en la presente no es una secuencia de nucleótidos que codifica scIL-12 de ratón. De esta manera, en diversos aspectos preferidos, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica scIL-12 de origen de ratón.
En diversos aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) 4-1BBL codifica un polipéptido 4-1BBL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el polipéptido 4-1BBL es capaz de unirse específicamente a células T activadas, preferentemente células T cooperadoras CD4+ y células T CD8+ activadas. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) 4-1BBL codifica un polipéptido 4-1BBL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el polipéptido 4-1BBL es capaz de unirse específicamente a células T, preferentemente células T cooperadoras CD4+ y células T CD8+ activadas. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) 4-1BBL codifica un polipéptido 4-1BBL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el polipéptido 4-1BBL es capaz de unirse específicamente a células T activadas, preferentemente células T CD8+. Incluso más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) 4-1BBL codifica un polipéptido 4-1BBL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el polipéptido 4-1BBL es capaz de unirse específicamente a células T activadas, preferentemente células T cooperadoras CD4+ y células T CD8+ activadas. En ciertas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico variantes de (el gen para) 4-1BBL anteriormente descritas codifican polipéptidos 4-1BBL que exhiben la misma especificidad de unión a las células T, preferentemente células T CD8+, que la 4-1BBL nativa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13). En un aspecto preferido, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) 4-1BBL codifica un polipéptido que comprende (o que consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13).
En diversos aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) IL-2 codifica un polipéptido IL-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde el polipéptido IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) IL-2 codifica un polipéptido IL-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde el polipéptido IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) IL-2 codifica un polipéptido IL-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde el polipéptido IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Incluso más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) IL-2 codifica un polipéptido IL-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde el polipéptido IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. En ciertos aspectos, las secuencias de ácido nucleico variantes de IL-2 anteriormente descritas codifican polipéptidos IL-2 que exhiben la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la IL-2 nativa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14). En un aspecto preferido, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) IL-2 codifica un polipéptido que comprende (o que consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14).
En diversos aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) scIL-12 codifica un polipéptido scIL-12 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde el polipéptido scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) scIL-12 codifica un polipéptido scIL-12 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde el polipéptido scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) scIL-12 codifica un polipéptido scIL-12 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde el polipéptido scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. Incluso más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) scIL-12 codifica un polipéptido scIL-12 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde el polipéptido scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. En ciertas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico variantes de scIL-12 anteriormente descritas codifican polipéptidos scIL-12 que exhiben la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la scIL-12 nativa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15). En un aspecto preferido, la secuencia de ácido nucleico de (el gen para) scIL-12 codifica un polipéptido que comprende (o que consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15).
Como se describe en el presente documento, pueden usarse una o más unidades de expresión poli- o multicistrónica que incluyen dos o tres secuencias de polinucleótido que codifican dos o las tres proteínas, esto es, dos secuencias de polinucleótido que codifican, cada una, al menos (i) 4-1BBL o sclL-12, o (ii) 4-1BBL o IL-2, o (iii) sclL-12 o IL-2; o tres secuencias de polinucleótido que codifican, cada una, al menos 4-1BBL, sclL-12, o 4-1BBL, respectivamente. El uso de vectores (o unidades de expresión) multicistrónicos reduce el número total de moléculas de ácido nucleico requeridas y por lo tanto puede evitar posibles dificultades asociadas con la coordinación de expresión de múltiples genomas de vector. En un vector multicistrónico, los diversos elementos por expresar se pueden enlazar operativamente a uno o más promotores (y otros elementos de control de expresión según sea necesario).
Cuando se usan varios promotores puede observarse inhibición mutua de los promotores. Se pueden obtener tasas de expresión particularmente altas usando vectores que son al menos tricistrónicos, y que además están caracterizados porque contienen sólo un promotor por casete de expresión, y además comprenden una secuencia IRES para cada cistrón que no está localizado inmediatamente secuencia abajo del promotor. Se considera que la combinación de promotores y secuencias IRES (sitios internos de entrada de ribosoma) proporciona una mejor expresión de proteína. El uso de diferentes secuencias IRES puede proporcionar la ventaja adicional de que la frecuencia de recombinación entre estas secuencias se puede minimizar. En varias realizaciones de la presente divulgación, el IRES es de EMCV (virus de encefalomiocarditis). En varias realizaciones de la presente divulgación, el IRES es de PV (poliovirus). En varias realizaciones de la divulgación, el vector/sistema vector novedoso comprende dos IRES entre los tres transgenes, 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 cadena sencilla, en donde un IRES puede ser el EMCV IRES y el otro IRES puede ser el PV IRES. En varias realizaciones de la divulgación, el vector/sistema vector novedoso comprende dos IRES entre los tres transgenes, 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla, en donde ambos IRES pueden ser el EMCV IRES, o ambos IRES pueden ser el PV IRES. Cuando se usan vectores tetracistrónicos, puede ser de utilidad dividirlos en diferentes casetes de expresión. En este caso se prefiere que esté presente un promotor por casete de expresión. La separación en dos casetes de expresión, que muestra preferentemente la distancia máxima posible uno de otro, proporciona la separación espacial de los promotores, reduciendo así la inhibición mutua.
En diversos aspectos, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación comprende los tres genes de 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla organizados en este orden (esto es, 5' a 3', con el gen que codifica IL-2 localizado secuencia abajo del gen que codifica 4-1BBL, y el gen que codifica sclL-12 localizado secuencia abajo del gen que codifica IL-2) en una construcción tricistrónica enlazada por sitios internos de entrada de ribosoma (IRES). Preferentemente, los tres genes son genes de 4-1BBL humana (CD137L), IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana. Más preferentemente, los tres genes son manejados por un promotor de citomegalovirus (CMV), esto es, el sistema vector comprende un promotor CMV secuencia arriba de la construcción tricistrónica que comprende los tres genes de 4-1BBL humana (CD137L), IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana. Más preferentemente, la poliadenilación del transcrito es inducida por una señal derivada de SV40, esto es, el vector/sistema vector novedoso comprende un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo de la construcción tricistrónica que comprende los tres genes de 4-1BBL humana (CD137L), IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana (sclL-12 humana). Más preferentemente, el ADN vector es ADN de vector adenovírico.
De esta manera, en un aspecto preferido, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación comprende un casete de expresión que comprende: (i) los tres genes de 4-1BBL (CD137L) humana, IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana, organizados en este orden (esto es, 5' a 3' con el gen que codifica IL-2 localizado secuencia abajo del gen que codifica 4-1BBL, y el gen que codifica scIL-12 localizado secuencia abajo del gen que codifica IL-2) en una construcción tricistrónica enlazada por sitios internos de entrada al ribosoma (IRES); (ii) un promotor CMV secuencia arriba de la construcción tricistrónica que comprende los tres genes de 4-1BBL (CD137L) humana, IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana; y (iii) un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo de dicha construcción tricistrónica, en donde el vector es un vector adenovírico.
En diversos aspectos, el vector/sistema vector novedoso de la divulgación comprende una construcción de expresión en la que los tres genes de 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla, están organizados como se representa en cualquiera de los incisos (a) a (f) siguientes (Prom. = Promotor):
(a)
Figure imgf000015_0001
(b)
Figure imgf000015_0002
(c)
Figure imgf000015_0006
Figure imgf000015_0003
(e)
Figure imgf000015_0004
(f)
Figure imgf000015_0005
En diversos aspectos, el vector novedoso de la presente divulgación comprende un promotor secuencia arriba de (una construcción de expresión que comprende) los tres genes de 4-1BBL, IL-2 y scIL-12, organizados en el orden que se describe en otra parte de la presente. Preferentemente, el gen de 4-1BBL humana está en la posición 1 de los tres genes del vector novedoso, más específicamente en la posición 1 de la construcción de expresión que comprende dichos tres genes.
En diversos aspectos, el vector novedoso de la presente divulgación comprende un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 (Figura 18), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión del casete de expresión de SEQ ID NO: 12. Preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 (Figura 18), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión del casete de expresión de SEQ ID NO: 12. Más preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 (Figura 18), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión del casete de expresión de SEQ ID NO: 12. Más preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 (Figura 18), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión del casete de expresión de SEQ ID NO: 12. En una realización preferida, el vector novedoso de la presente divulgación comprende un casete de expresión que comprende (o que consiste en) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 (Figura 18).
En diversos aspectos, el vector novedoso de la presente divulgación comprende un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con un casete de expresión de referencia que comprende las siguientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 (Figura 17): (i) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.080-1.844 (4-1BBL humana); (ii) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.885-2.388 (EMCV IRES); (iii) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.409-2.870 (IL-2 humana); (iv) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.914-3.545 (PV IRES); y (v) la secuencia de ácido nucleico de pb 3.581-5.203 (scIL-12 humana que comprende las subunidades p40 y p35 de IL-12 humana enlazadas por un enlazador), en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de expresión de referencia. Preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con dicho casete de expresión de referencia, en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de referencia. Más preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con dicho casete de expresión de referencia, en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de referencia. Más preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con dicho casete de expresión de referencia, en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de referencia. En un aspecto preferido, el vector novedoso de la presente divulgación comprende un casete de expresión que comprende (o que consiste en) las siguientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 (Figura 17): (i) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.080-1.844 (4-1BBL humana); (ii) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.885-2.388 (EMCV IRES); (iii) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.409-2.870 (IL-2 humana); (iv) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.914-3.545 (PV IRES); y (v) la secuencia de ácido nucleico de pb 3.581-5.203 (scIL-12 humana que comprende las subunidades p40 y p35 de IL-12 humana, enlazadas por un enlazador).
En diversos aspectos, el vector novedoso de la presente divulgación comprende un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con un casete de expresión de referencia que comprende las siguientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 (Figura 17): (i) la secuencia de ácido nucleico de pb 484-1.059 (promotor CMV); (ii) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.080-1.844 (4-1BBL humana); (iii) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.885-2.388 (EMCV IRES); (iv) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.409-2.870 (IL-2 humana); (v) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.914-3.545 (PV IRES); (vi) la secuencia de ácido nucleico de pb 3.581-5.203 (scIL-12 humana que comprende las subunidades p40 y p35 de IL-12 humana. enlazadas por un enlazador); y (vii) la secuencia de ácido nucleico de pb 5.271-5.510 (SVpolyA), en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de expresión de referencia. Preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con dicho casete de expresión de referencia, en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de referencia. Más preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con dicho casete de expresión de referencia, en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de referencia. Más preferentemente, el casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con dicho casete de expresión de referencia, en donde la expresión del casete de expresión variante proporciona la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la expresión de dicho casete de referencia. En un aspecto preferido, el vector novedoso de la presente divulgación comprende un casete de expresión que comprende (o que consiste en) las siguientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 (Figura 17): (i) la secuencia de ácido nucleico de pb 484-1.059 (promotor CMV); (ii) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.080-1.844 (4-1BBL humana); (iii) la secuencia de ácido nucleico de pb 1.885-2.388 (EMCV IRES); (iv) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.409-2.870 (IL-2 humana); (v) la secuencia de ácido nucleico de pb 2.914-3.545 (PV IRES); (vi) la secuencia de ácido nucleico de pb 3.581-5.203 (scIL-12 humana que comprende las subunidades p40 y p35 de IL-12 humana. enlazadas por un enlazador); y (vii) la secuencia de ácido nucleico de pb 5.271-5.510 (SVpolyA).
En diversos aspectos, el sistema vector comprende los tres genes de 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla, organizados en tres vectores separados. Preferentemente, los tres genes son genes humanos de 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla. Más preferentemente, cada uno de los tres genes es manejado por un promotor de citomegalovirus (CMV), esto es, cada vector comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de 4-1BBL humana (CD137L), IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana, respectivamente. Aún más preferentemente, la poliadenilación del transcrito es inducida por una señal derivada de SV40, esto es, cada sistema vector comprende un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana (scIL-12 humana), respectivamente. Más preferentemente, el ADN de vector de cada vector separado es ADN de vector adenovírico.
De esta manera, en una realización preferida, el sistema vector comprende tres vectores adenovíricos, cada uno comprende: (i) el gen de 4-1BBL (CD137L) humana, IL-2 humana o IL-12 de cadena sencilla humana; (ii) un promotor CMV secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana; respectivamente; y (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, IL-2 humana e IL-12 de cadena sencilla humana, respectivamente.
En diversos aspectos, el sistema vector comprende los tres genes de 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla, organizados en dos vectores separados. Específicamente, en varias realizaciones, uno de los dos vectores comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) e IL-2, y el otro vector comprende el gen de IL-12 de cadena sencilla. Preferentemente, los genes son genes humanos de 4-1BBL (CD137L), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla. Más preferentemente, los genes son manejados por un promotor de citomegalovirus (CMV), esto es, el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana e IL-2 humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de 4-1BBL (CD137L) humana está localizado secuencia arriba del gen de IL-2 humana, o secuencia arriba del gen de IL-2 humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y el vector que comprende el gen de scIL-12 humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de scIL-12 humana. Más preferentemente, la poliadenilación del transcrito es inducida por una señal derivada de SV40, esto es, cada uno de los dos vectores comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40, esto es, el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana e IL-2 humana comprende un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de IL-2 humana cuando el gen de 4-1BBL (CD137L) humana está localizado secuencia arriba del gen de IL-2 humana, o comprende un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y el vector que comprende el gen de scIL-12 humana comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de scIL-12 humana. Incluso más preferentemente, el ADN de vector de cada vector separado es ADN de vector adenovírico.
De esta manera, en un aspecto preferido, el sistema vector comprende dos vectores adenovíricos, uno que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana e IL-2 humana, y el otro que comprende el gen de scIL-12 humana, en donde: (i) el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana e IL-2 humana comprende además un promotor CMV secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de 4-1BBL (CD137L) humana está localizado secuencia arriba del gen de IL-2 humana, o secuencia arriba del gen de IL-2 humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y en donde el vector que comprende el gen de scIL-12 humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de scIL-12 humana; y (ii) el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana e IL-2 humana comprende además un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de IL-2 humana cuando la secuencia de ácido nucleico de 4-1BBL (CD137L) humana está localizada secuencia arriba del gen de IL-2 humana, o un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y en donde el vector que comprende el gen de scIL-12 humana comprende un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de scIL-12 humana.
En diversos aspectos distintos, el sistema vector comprende dos vectores separados, en donde uno de los dos vectores comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) y de IL-12 de cadena sencilla (scIL-12), y el otro vector comprende el gen de IL-2. Preferentemente, los genes son genes humanos de 4-1BBL (CD137L), scIL-12 e IL-2. Más preferentemente, los genes son manejados por un promotor de citomegalovirus (CMV), esto es, el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana y scIL-12 humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de 4-1BBL (CD137L) humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o secuencia arriba del gen de scIL-12 humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y el vector que comprende el gen de IL-2 humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de IL-2 humana. Más preferentemente, la poliadenilación del transcrito es inducida por una señal derivada de SV40, esto es, cada uno de los dos vectores comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40, esto es, el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana y scIL-12 humana comprende un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de scIL-12 humana cuando el gen de 4-1BBL (CD137L) humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o comprende un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y el vector que comprende el gen de IL-2 humana comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de IL-2 humana. Incluso más preferentemente, el ADN de vector de cada vector separado es ADN de vector adenovírico.
De esta manera, en un aspecto preferido, el sistema vector comprende dos vectores adenovíricos, uno que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana y scIL-12 humana, y el otro que comprende el gen de IL-2 humana, en donde: (i) el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana y scIL-12 humana comprende además un promotor c Mv secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de 4-1BBL (CD137L) humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o secuencia arriba del gen de scIL-12 humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y en donde el vector que comprende el gen de IL-2 humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de IL-2 humana; y (ii) el vector que comprende los genes de 4-1BBL (CD137L) humana y scIL-12 humana comprende además un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de scIL-12 humana cuando el gen de 4-1BBL (CD137L) humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana, y en donde el vector que comprende el gen de IL-2 humana comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de IL-2 humana.
En diversos aspectos distintos, el sistema vector comprende dos vectores separados, en donde uno de los dos vectores comprende los genes de IL-2 y de IL-12 de cadena sencilla (scIL-12), y el otro vector comprende el gen de 4-1BBL (CD137L). Preferentemente, los genes son genes humanos de IL-2, scIL-12 y 4-1BBL (CD137L). Más preferentemente, los genes son manejados por un promotor de citomegalovirus (CMV), esto es, el vector que comprende los genes de IL-2 humana y scIL-12 humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de IL-2 humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o secuencia arriba del gen de scIL-12 humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de IL-2 humana, y el vector que comprende el gen de 4-1BBL (CD137L) humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137) humana. Más preferentemente, la poliadenilación del transcrito es inducida por una señal derivada de SV40, esto es, cada uno de los dos vectores comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40, esto es, el vector que comprende los genes de IL-2 humana y scIL-12 humana comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de scIL-12 humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de IL-2 humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de IL-2 humana, y el vector que comprende el gen de 4-1BBL (CD137L) humana comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana. Incluso más preferentemente, el ADN de vector de cada vector separado es ADN de vector adenovírico.
De esta manera, en una realización preferida, el sistema vector comprende dos vectores adenovíricos, uno que comprende los genes de IL-2 humana y de scIL-12 humana, y el otro que comprende el gen de 4-1BBL (CD137L) humana, en donde: (i) el vector que comprende los genes de IL-2 humana y scIL-12 humana comprende además un promotor CMV secuencia arriba del gen de IL-2 humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o secuencia arriba del gen de scIL-12 humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de IL-2 humana, y en donde el vector que comprende el gen de 4-1BBL (CD137L) humana comprende un promotor CMV secuencia arriba del gen de 4-1BBL (CD137L) humana; y (ii) el vector que comprende los genes de IL-2 humana y scIL-12 humana comprende además un gen que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de scIL-12 humana cuando el gen de IL-2 humana está localizado secuencia arriba del gen de scIL-12 humana, o una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de IL-2 humana cuando el gen de scIL-12 humana está localizado secuencia arriba del gen de IL-2 humana, y en donde el vector que comprende el gen de 4-1BBL (CD137L) humana comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación de SV40 secuencia abajo del gen de 4-1BBL (CD137L) humana.
Para las partículas de virus de la divulgación, las unidades de expresión incluyen, además, una secuencia que codifica una molécula de envoltura/cápside o uno o más factores de maduración necesarios para la producción de la partícula de vector deseada en células de empaquetamiento.
Los elementos de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) se usan para crear mensajes multigénicos, o multi- o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de esquivar el modelo de barrido de ribosoma de la traducción dependiente de tapa 5'-metilada y empiezan la traducción en sitios internos. Los elementos IRES se pueden enlazar a marcos de lectura abiertos heterólogos. Pueden ser transcritos juntos muchos marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes multi- o policistrónicos. Cada componente por expresar en un vector de expresión multicistrónico puede ser separado por un elemento IRES para permitir la expresión separada de las diversas proteínas del mismo promotor. Las herramientas que pueden usarse para separar elementos genéticos en un vector multicistrónico, en particular los elementos IRES, son conocidas en la técnica. La eficacia de un vector multicistrónico particular puede ser determinada fácilmente detectando la expresión de cada uno de los genes, usando los protocolos convencionales.
En diversos aspectos de la presente divulgación, la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican al menos 4-1BBL, scIL-12 e IL-2 están organizadas en un vector en donde la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican scIL-12 e IL-2 están localizadas secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL. Tal vector se considera un vector de expresión multicistrónico. En ciertas realizaciones, el vector de expresión multicistrónico es un vector de expresión tricistrónico que contiene las secuencias de ácido nucleico (de los genes) que codifican 4-1BBL, scIL-12 e iL-2, en donde los genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2, 3, con la condición de que el gen que codifica scIL-12 no está en la posición 1. En diversos aspectos, la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican scIL-12 e IL-2 están localizadas secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL. Preferentemente, en un vector de expresión multicistrónico o tricistrónico, la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2 está localizado secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL, y la secuencia de ácido nucleico que codifica scIL-12 está localizada secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-2. En diversas realizaciones de un vector de expresión multicistrónico o tricistrónico, un promotor está localizado secuencia arriba de la secuencia de ácido nucleico que codifica 4-1BBL, pero no secuencia arriba de la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican scIL-12 y/o IL-2.
En ciertos aspectos de un vector de expresión multicistrónico o tricistrónico, la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican al menos 4-1BBL, scIL-12 y/o IL-2, están enlazadas por sitios internos de entrada al ribosoma (IRES).
En una ejemplificación específica, un genoma de vector vírico comprende: una secuencia de potenciador/promotor, preferentemente una secuencia de potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV); las secuencias R y U5 de una 5' LTR de virus; opcionalmente una secuencia de empaquetamiento; un potenciador interno; un promotor interno; uno o más polinucleótidos que codifican al menos 4-1BBL, sclL-12 o IL- 12; un elemento U3 con una supresión de su secuencia potenciadora; y las secuencias R y U5 de una 3' LTR vírica. La construcción del genoma del vector se puede realizar usando cualquier técnica de ingeniería genética adecuada conocida en la técnica, que incluye, sin limitación, las técnicas estándares de digestión con endonucleasa de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmido y secuenciación de ADN, por ejemplo como se describe en Sambrook et al. (ediciones de 1989 y 2001, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
También pueden usarse vectores construidos para expresión transitoria en células de mamífero. La expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula hospedadora, de tal manera que la célula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles del polipéptido codificado por el polinucleótido del vector de expresión; véase Sambrook et al., supra, p. 16.17-16.22, 1989. Otros vectores y métodos adecuados para adaptación a la expresión de polipéptidos son muy conocidos en la técnica y se adaptan fácilmente a las circunstancias específicas.
Utilizando las enseñanzas en el presente documento provistas y el conocimiento de la técnica, un experto en la materia reconocerá que la eficacia de un sistema de expresión particular se puede probar transfectando células de empaquetamiento con un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína reportera y midiendo la expresión usando una técnica adecuada, por ejemplo, midiendo la fluorescencia de un conjugado de proteína fluorescente verde. Otros genes indicadores adecuados son muy conocidos en la técnica.
La divulgación también contempla que, en ciertas realizaciones, el vector/sistema vector proporcionado por la presente divulgación puede comprender IL-12 nativa en lugar de scIL-12, esto es, puede comprender una secuencia de ácido nucleico (de un gen) que codifica IL-12 nativa. IL-12 es una citocina heterodimérica enlazada por disulfuro compuesta de las dos subunidades p35 y p40 codificadas separadamente. En varias realizaciones, la secuencia de ácido nucleico (de un gen) puede codificar IL-12 humana nativa. Por consiguiente, en varias realizaciones, el vector/sistema vector novedoso proporcionado por la presente divulgación puede comprender tres genes que codifican (i) el ligando de 4-1BB (4-1BBL), (ii) las subunidades p40 y p35 de IL-12, y (iii) IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que los genes que codifican las subunidades IL-12 p35 e IL-12 p40 no están en la posición 1.
En diversos aspectos, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación puede comprender tres genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 nativa e IL-2, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen o genes que codifican las subunidades p35 y p40 de IL-12 no están en la posición 1, en donde el gen o genes que codifican las subunidades p40 y p35 de IL-12 pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y 9 (Figura 16), en donde la secuencia de ácidos nucleicos variante codifica una proteína IL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, el gen o genes que codifican las subunidades p35 y p40 de IL-12 pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y 9 (Figura 16), en donde la secuencia de ácidos nucleicos variante codifica una proteína IL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, el gen o genes que codifican las subunidades p40 y p35 de IL-12 pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y 9 (Figura 16), en donde la secuencia de ácidos nucleicos variante codifica una proteína IL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, el gen o genes que codifican las subunidades p40 y p35 de IL-12 pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología o identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y 9 (Figura 16), en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína IL-12 que tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. En realizaciones particularmente preferidas, el gen o genes que codifican las subunidades p40 y p35 de IL-12 pueden comprender las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y 9 (Figura 16). En ciertas realizaciones, las variantes de las subunidades p35 y p40 de IL-12 anteriormente descritas exhiben la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que las subunidades p35 y p40 de Il-12 codificadas por las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 9.
En diversos aspectos, el gen o genes de las subunidades p40 y p35 de IL-12 codifican un polipéptido que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y 10 (Figura 16), en donde el polipéptido tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, el gen o genes de las subunidades p40 y p35 de IL-12 codifica o codifican un polipéptido que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y 10 (Figura 16), en donde el polipéptido tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, el gen o genes de las subunidades p40 y p35 de IL-12 codifica o codifican un polipéptido que tiene al menos 90 % o 95 % de homología o identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y 10 (Figura 16), en donde el polipéptido tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Incluso más preferentemente, el gen o genes de las subunidades p40 y p35 de IL-12 codifica o codifican un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y 10 (Figura 16).
Preferentemente, una secuencia variante de la secuencia de ácido nucleico de las subunidades p35 y p40 de IL-12 humana como se describe en el presente documento no es una secuencia de nucleótidos que codifica las subunidades p35 y p40 de IL-12 de ratón. De esta manera, preferentemente, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación comprende tres genes, que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), las subunidades p35 y p40 de IL-12 e IL-2, que se describen anteriormente (esto es, en donde dichos genes están organizados en una orientación 5' a 3' en un orden secuencial 1, 2 y 3, con la condición de que el gen o genes que codifican las subunidades p35 y p40 de IL-12 no están en la posición 1), no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica las subunidades p35 y p40 de IL-12 de origen de ratón.
En otro aspecto, se proporcionan partículas de vector. La presente divulgación proporciona partículas de virus que comprenden un sistema vector de la presente divulgación. Una partícula de vector comprende cualquiera de los vectores/sistemas vectores novedosos descritos en la presente que comprenden uno o más vectores que comprenden secuencia o secuencias de polinucleótidos que codifican al menos 4-1BBL, sclL-12 y/o IL-2. También se proporcionan en el presente documento métodos para suministrar un sistema vector de la divulgación que codifica al menos 4-1BBL, sclL-12 y/o IL-2 (descritos en el presente documento) a una célula diana. Tales métodos comprenden poner en contacto (esto es, permitir la interacción) de la célula diana con un vehículo que suministra el sistema vector de la divulgación. En realizaciones particulares, los métodos para suministrar el vector/sistema vector novedoso comprenden poner en contacto la célula administrándole a un sujeto una partícula de vector que comprende un vector/sistema vector novedoso de la divulgación que comprende uno o más vectores que comprenden secuencia o secuencias de polinucleótidos que codifican al menos 4-1BBL, sclL-12 y/o IL-2.
En ciertas realizaciones, la partícula de vector es una partícula de vector vírico y los vectores del vector/sistema vector novedoso es cualquier vector de ARN, un vector de plásmido, un vector de nanopartícula y ADN desnudo. En ciertos aspectos distintos, la partícula de vector es una partícula derivada de bacterias, tales como por ejemplo Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Mycobacterium bovis, Escherichia coli, Shigella spp. y Yersinia spp., y los vectores del sistema vector son cualquiera de un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector de nanopartícula y ADN desnudo.
Las partículas de vector vírico ejemplares incluyen una partícula de vector lentivírico que comprende un genoma de vector lentivírico; una partícula de vector de poxvirus que comprende un genoma de vector de poxvirus; una partícula de vector de virus vacuna que comprende un genoma de vector de virus vacuna; una partícula de vector de adenovirus que comprende un genoma de vector de adenovirus; una partícula de vector de virus adenoasociado que comprende un genoma de vector de virus adenoasociado; una partícula de vector de virus de herpes que comprende un genoma de vector de virus de herpes (por ejemplo, virus de herpes simple I o II); o una partícula de vector de virus alfa que comprende un genoma de vector de virus alfa.
Las partículas de vector (por ejemplo, las partículas de vector vírico descritas en el presente documento) pueden inyectarse in vivo, en particular a un tumor, en donde las partículas proporcionan un efecto inmunoestimulante por expresión de 4-1BBL, sclL-12 e IL-2. La cantidad de partículas víricas es de al menos 3x106 ivp (partículas infecciosas víricas), y puede ser al menos 1x107 ivp, al menos 3x107 ivp, al menos 1 x108 ivp, al menos 3x108 ivp, al menos 1x109 ivp, o al menos 3x109 ivp. A intervalos seleccionados, las células del tejido maligno (tumor) o patógeno diana del receptor pueden usarse para medir la expresión de 4-1BBL, sclL-12 e iL-2, por ejemplo, observando la expresión de un marcador, tal como GFP o luciferasa, si es coexpresado por una secuencia de polinucleótido presente en el sistema vector incluido en la partícula de vector. En particular, las células T de tejido maligno (tumor) o infectado con patógeno diana de los receptores tratados con la partícula de vector se pueden medir para determinar la expresión de 4-1BBL, sclL-12 e IL-2.
La frase “vector adenovírico competente de replicación” se refiere a cualquier vector adenovírico que no es deficiente en ninguna función de gen requerida para la replicación vírica en células o tejidos específicos. El vector debe ser capaz de replicarse y ser empaquetado, pero se puede replicar sólo condicionalmente en células o tejidos específicos.
El adenovirus (Ad) es un virus de ADN grande (aproximadamente 36 kb) que infecta a los humanos pero que presenta una amplia gama de hospedadores. Existen aproximadamente 50 serotipos de adenovirus humanos que se dividen en seis familias basándose en criterios moleculares, inmunológicos y funcionales. En la edad adulta, prácticamente todo humano ha sido infectado con los serotipos de adenovirus más comunes; el efecto principal son los síntomas de tipo resfriado. La infección adenovírica de las células hospedadoras da como resultado que el ADN adenovírico sea mantenido episómáticamente, lo que reduce la posible genotoxicidad asociada con los vectores que se integran. También, los adenovirus son estructuralmente estables y no se ha detectado reordenamiento del genoma después de amplificación exhaustiva.
Los vectores adenovíricos usados en la presente divulgación pueden ser cualquier vector adenovírico adecuado para usarse en un método de tratamiento de un humano o animal. Alternativamente, pueden usarse varios tipos de vectores adenovíricos de acuerdo con la presente divulgación. También se pueden modificar los vectores de cualquier forma conocida en la técnica, por ejemplo por supresión, inserción, mutación o modificación de cualquier área vírica. Los vectores se pueden hacer específicos de tumor con respecto a la replicación. Por ejemplo, el vector adenovírico puede comprender modificaciones en E1, E3 o E4, tales como la inserción de promotores específicos de tumor, supresiones de áreas e inserción de transgenes.
El Ad-5 humano es un serotipo de adenovirus humano que está bien caracterizado genética y bioquímicamente (GenBank M73260; AC_000008). De esta manera, en una realización preferida, el adenovirus es un serotipo Ad5 competente de replicación o un serotipo híbrido que comprende un componente de Ad5. El adenovirus puede ser una cepa de tipo silvestre o puede ser modificado genéticamente para aumentar la selectividad de tumor, por ejemplo atenuando la capacidad del virus para replicarse dentro de células quiescentes normales sin afectar la capacidad del virus para replicarse en células de tumor. Ejemplos no limitativos de adenovirus abarcados por la presente divulgación incluyen Delta-24, Delta-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAdl y H101. En una realización particular, el adenovirus es Delta-24 o Delta-24-RGD. El adenovirus Delta-24 se deriva del adenovirus de tipo 5 (Ad-5) y contiene una supresión de 24 pares de bases dentro de la porción CR2 del gen E1 A. Delta-24-RGD comprende además una inserción de la secuencia RGD-4C. La supresión E1 A aumenta la selectividad del virus por células cancerosas; la secuencia RGD-4C aumenta la infectividad del virus en gliomas.
Adicionalmente, el esqueleto del vector adenovírico puede ser de cualquier serotipo. Además aún, los vectores pueden ser vectores quiméricos, por ejemplo vectores Ad5/3. Como un ejemplo, “vector Ad5/3” se refiere a un vector quimérico que tiene partes de ambos vectores, Ad5 y Ad3.
El adenovirus es un sistema de suministro atractivo y está bien establecido para usarse en la transferencia de genes en varias aplicaciones terapéuticas. El adenovirus entra a la célula hospedadora permisiva por medio de un receptor de superficie celular y después se internaliza.
La ausencia o la presencia de bajos niveles del virus coxsackie y el receptor de adenovirus (CAR) sobre los tipos de tumor pueden limitar la efectividad de los adenovirus. La modificación de la cápside permite la infección de las células diana independientemente del CAR. También, la incorporación adenovírica en el tejido diana se puede mejorar mediante la adición de compuestos policatiónicos de tipo transfectante. Se ha mostrado en el presente documento (véase el ejemplo 10) que la incorporación adenovírica se mejora particularmente usando el transfectante sulfato de protamina. De esta manera, en varias realizaciones, el sulfato de protamina se usa para la transfección de los sistemas de vector de la presente divulgación, preferentemente para la transfección de un sistema vector adenovírico de la divulgación.
En la expresión, típicamente se incluirá una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada del transcrito. Se considera que la naturaleza de la señal de poliadenilación no es crucial para la práctica exitosa de la presente divulgación y puede utilizarse cualquiera de estas secuencias. Las realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, convenientes o conocidas por funcionar bien en diversas células diana. También se contempla en el presente documento como un elemento de la construcción de expresión un sitio de terminación de transcripción. Estos elementos pueden servir para aumentar los niveles de mensaje o para minimizar la lectura preliminar del casete en otras secuencias.
En ciertos aspectos de la divulgación, las células infectadas con el vector/sistema vector novedoso de la divulgación pueden identificarse in vitro incluyendo un gen indicador en el sistema vector. En general, un indicador seleccionable es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un indicador seleccionable positivo es aquel en el que la presencia del gen indicador permite su selección, mientras que un indicador seleccionable negativo es aquel en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármaco. Otros tipos de indicadores incluyen indicadores tamizables tales como GFP (proteína fluorescente verde). Las realizaciones de la divulgación pueden utilizar las técnicas actuales de plataforma de vector vírico diseñadas para crear vacunas o construcciones de terapia génica. Los aspectos de la construcción de vector vírico incluyen insertar material genético en un vector vírico y confirmar la construcción mediante la caracterización y secuenciación del ácido nucleico, virus y producto de virus. Después, el vector vírico se hace pasar por una serie de estudios de factibilidad diseñados para evaluar la escalabilidad.
La presente divulgación proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el vector/sistema vector novedoso de la divulgación.
Adicionalmente, la presente divulgación proporciona una composición que comprende el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento. La presente divulgación también proporciona una composición que comprende un polinucleótido divulgado en el presente documento, esto es, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el vector/sistema vector novedoso de la divulgación. Sin desear quedar unido a teoría alguna, el uso del vector/sistema vector novedoso que expresa 4-1BBL, sclL-12 e IL-2 resulta en la producción local de citocinas en o alrededor del tumor, que dirigirá células T citotóxicas específicas de tumor inducidas sistémicamente o localmente al sitio del cáncer. Mediante el efecto inmunoestimulante proporcionado por este mecanismo mejorará mucho la eficacia de la inmunoterapia del cáncer, las infecciones víricas y los trastornos del sistema inmunitario. El efecto inmunoestimulante proporcionado por el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación se muestra en los ejemplos.
La presente divulgación abarca composiciones que comprenden el vector/sistema vector novedoso o partícula de virus divulgada en el presente documento para usarse como un medicamento. La presente divulgación proporciona un medicamento que comprende el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento. La presente divulgación también proporciona un medicamento que comprende un polinucleótido divulgado en el presente documento, esto es, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el vector/sistema vector novedoso de la divulgación.
La presente divulgación abarca el vector/sistema vector novedoso o partícula de virus divulgada en el presente documento para usarse como una vacuna terapéutica, más específicamente para usarse como una vacuna terapéutica para el tratamiento del cáncer o infecciones víricas.
La presente divulgación también proporciona una célula inmunitaria o una célula de cáncer transducida o transfectada con el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento. Dichas células transducidas o transfectadas pueden usarse para terapias ex vivo, en particular terapia del cáncer ex vivo.
Adicionalmente, la presente divulgación proporciona una composición que comprende tal célula inmunitaria o célula de cáncer transducida o transfectada con el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento. Más aún, la presente divulgación proporciona un medicamento que comprende dicha célula inmunitaria o célula de cáncer transducida o transfectada con el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento. En diversas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula T, una célula NK, un tipo de célula de linaje de monocito (macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans, mastocitos), un fibroblasto.
El vector/sistema vector novedoso o las partículas de virus de la presente divulgación pueden usarse en métodos para el tratamiento o mitigación del cáncer, infecciones víricas o trastornos del sistema inmunitario. También, el polinucleótido de la presente divulgación puede usarse en el tratamiento del cáncer, infecciones víricas y/o trastornos del sistema inmunitario. También, la composición o medicamento anteriormente descrito de la divulgación puede usarse en el tratamiento de cánceres, infecciones víricas o trastornos del sistema inmunitario. En diversos aspectos, el vector/sistema vector novedoso o partículas de virus de la divulgación pueden considerarse como agentes activos. También, en diversos aspectos el polinucleótido de la divulgación, esto es, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el vector/sistema vector novedoso de la divulgación, y la célula de cáncer transducida o transfectada con el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento, pueden considerarse como agentes activos. Esto se aplica en particular en el contexto de los tratamientos médicos divulgados en el presente documento.
La presente divulgación proporciona un método para el tratamiento o mitigación del cáncer, una enfermedad infecciosa vírica (infección vírica) o un trastorno del sistema inmunitario, que comprende administrarle a un sujeto que lo requiera una cantidad terapéuticamente eficaz del vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus de la divulgación. La presente divulgación también proporciona un método para el tratamiento o mitigación del cáncer, una enfermedad infecciosa vírica (infección vírica) o un trastorno del sistema inmunitario, que comprende administrarle a un sujeto que lo requiera una cantidad terapéuticamente eficaz de un polinucleótido de la divulgación, esto es, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el vector/sistema vector novedoso de la divulgación. La presente divulgación también proporciona un método para el tratamiento o mitigación del cáncer, una enfermedad infecciosa vírica (infección vírica) o un trastorno del sistema inmunitario, que comprende administrarle a un sujeto que lo requiera una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula inmunitaria o célula de cáncer de la divulgación, esto es, una célula inmunitaria o célula de cáncer transducida o transfectada con el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento. En diversos aspectos, el método de tratamiento o mitigación del cáncer se realiza como terapia ex vivo, que comprende obtener células de cáncer de un paciente, transducir o transfectar las células de cáncer autólogas con un sistema vector o una partícula de virus divulgada en el presente documento, y administrarle al paciente las células de cáncer autólogas transducidas o transfectadas con el vector/sistema vector novedoso o una partícula de virus divulgada en el presente documento. La presente divulgación también proporciona un método para el tratamiento o mitigación del cáncer, una enfermedad infecciosa vírica (infección vírica) o un trastorno del sistema inmunitario, que comprende administrarle a un sujeto que lo requiera una cantidad terapéuticamente eficaz de un medicamento o composición de la divulgación anteriormente descrita.
Como se usa en el presente documento, la frase “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un agente activo, composición o medicamento divulgado en el presente documento, con la cual los efectos dañinos de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, el cáncer o una enfermedad infecciosa) son, al menos, mitigados.
En aspectos preferidos, el cáncer es uno cualquiera de cáncer de mama, cáncer de próstata, linfoma, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de colon, melanoma, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, carcinoma cerebral primario, cáncer de cabeza-cuello, glioma, glioblastoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón de células no microcíticas, carcinoma de cabeza o cuello, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células microcíticas, tumor de Wilms, carcinoma cervical, carcinoma testicular, carcinoma de vejiga, carcinoma pancreático, carcinoma de estómago, carcinoma de colon, carcinoma prostático, carcinoma genitourinario, carcinoma tiroideo, carcinoma esofágico, mieloma, mieloma múltiple, carcinoma adrenal, carcinoma de células renales, carcinoma endometrial, carcinoma de la corteza adrenal, insulinoma pancreático maligno, carcinoma carcinoide maligno, coriocarcinoma, micosis fungoide, hipercalcemia maligna, hiperplasia cervical, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia granulocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia de células peludas, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, policitemia vera, trombocitosis esencial, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, sarcoma de tejido blando, mesotelioma, sarcoma osteogénico, macroglobulinemia primaria y retinoblastoma.
En otros aspectos preferidos, el cáncer es uno cualquiera de melanoma, metástasis de cáncer, adenocarcinoma, tioma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de colon, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de riñón y cáncer pancreático. En realizaciones particularmente preferidas, el cáncer es un cáncer urogenital, preferentemente cáncer de vejiga. En otros aspectos particularmente preferidos, el cáncer es cáncer de hígado. En otros aspectos aun particularmente preferidos, el cáncer es cáncer de piel. Los medios y métodos proporcionados por la presente invención también son particularmente útiles en métodos de tratamiento o prevención de la metástasis del cáncer.
En diversos aspectos, el cáncer comprende uno o más tumores que son accesibles para permitir la inyección directa en o alrededor del tumor de un agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la presente divulgación. En realizaciones particularmente preferidas, el cáncer comprende un tumor sólido o es un tumor sólido. En ciertas realizaciones, el tumor sólido es un carcinoma, un sarcoma o un linfoma. Con respecto a esto, aunque los linfomas se consideran en general tumores líquidos, se pueden formar tumores “sólidos” accesibles en el nódulo linfático y por lo tanto pueden tratarse de acuerdo con los métodos y usos divulgados en el presente documento.
En diversas realizaciones, la enfermedad infecciosa es una enfermedad infecciosa causada por una bacteria patógena. En otros aspectos, la enfermedad infecciosa es una enfermedad infecciosa causada por un virus. En otros aspectos más, la enfermedad infecciosa es una enfermedad infecciosa causada por un parásito, protozoo u hongo patógenos.
Las enfermedades víricas que pueden tratarse, contra las que se puede proteger y/o que se pueden manejar de acuerdo con la presente divulgación, incluyen, sin limitación, las causadas por hepatitis de tipo A, hepatitis de tipo B, hepatitis de tipo C, influenza (por ejemplo, influenza A o influenza B), varicela, adenovirus, herpes simple de tipo I (VHS-I), herpes simple de tipo II (VHS-II), rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus de papiloma, virus de papova, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de paperas, virus de sarampión, virus de rubeola, virus de polio, viruela, virus de Epstein Barr, virus de inmunodeficiencia humana de tipo I (VIH-I), virus de inmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-II), virus del Ébola, virus del Zika, y agentes de enfermedades víricas tales como meningitis vírica, encefalitis, dengue o viruela.
Las enfermedades bacterianas causadas por bacterias que pueden tratarse, contra las que se puede proteger y/o que se pueden manejar de acuerdo con la presente divulgación, incluyen, sin limitación, enfermedad de Lyme, ántrax, tétanos, cólera, plaga, difteria, clamidia y pertussis.
Las enfermedades de protozoo causadas por protozoos que pueden tratarse, contra las que se puede proteger y/o que se pueden manejar de acuerdo con la presente divulgación, incluyen, sin limitación, leishmaniosis y malaria. Las enfermedades parasitarias causadas por parásitos que pueden tratarse, contra las cuales se puede proteger y/o que se pueden manejar de acuerdo con la presente divulgación incluyen, sin limitación, clamidia y rickettsia.
En la presente divulgación, un trastorno del sistema inmunitario se caracteriza por una regulación negativa del sistema inmunitario, en particular una regulación negativa de la respuesta inmunitaria. El vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación permite el control de estos trastornos del sistema inmunitario convirtiendo un microambiente inmunitario inactivo en activo, y tratando así un trastorno del sistema inmunitario.
Similarmente, en la presente divulgación, el cáncer puede caracterizarse por una regulación negativa del sistema inmunitario, en particular una regulación negativa de la respuesta inmunitaria. De esta manera, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación permite el control o tratamiento del cáncer convirtiendo un microambiente de tumor inactivo en activo, y tratando o controlando así el cáncer.
También, en la presente divulgación, una enfermedad infecciosa puede caracterizarse por una regulación negativa del sistema inmunitario, en particular una regulación negativa de la respuesta inmunitaria. De esta manera, el vector/sistema vector novedoso de la presente divulgación permite el control o tratamiento de enfermedades infecciosas convirtiendo un microambiente inmunitario inactivo en activo, y tratando o controlando así las enfermedades infecciosas.
En diversos aspectos de la presente divulgación, el sistema vector está presente en una concentración no mayor de 1 x1011 ivp, preferentemente no mayor de 1x1010 ivp, más preferentemente no mayor de 1x109 ivp, incluso más preferentemente no mayor de 1 x107 o 1x106 ivp por dosis unitaria. Esto se aplica en particular, sin limitación, a los tratamientos médicos divulgados en el presente documento.
Adicionalmente, en diversos aspectos de la presente divulgación, la partícula de virus está presente en una concentración no mayor de 1 x1011 ivp, preferentemente no mayor de 1x1010 ivp, más preferentemente no mayor de 1x109 ivp, incluso más preferentemente no mayor de 1 x107 o 1x106 ivp por dosis unitaria. Esto se aplica en particular, sin limitación, a los tratamientos médicos divulgados en el presente documento.
En diversos aspectos, se administran 5 x 106 ivp (partículas víricas infecciosas) del vector/sistema vector novedoso o partícula de virus de la presente divulgación a un paciente que lo requiera. En diversos aspectos distintos, se administran 5 x 107 ivp del vector/sistema vector novedoso o partícula de virus de la presente divulgación a un paciente que lo requiera. En diversos aspectos distintos se administran 5 x 108 ivp del vector/sistema vector novedoso o partícula de virus de la presente divulgación a un paciente que lo requiera.
En la presente divulgación, los términos “medicamento” o “composición farmacéutica” pueden usarse intercambiablemente. El medicamento o composición farmacéutica pueden estar en cualquier forma, tales como forma sólida, semisólida o líquida, adecuadas para su administración. Una formulación puede ser cualquiera de, sin limitación, una solución, emulsión o suspensión. Los medios y métodos para formular las presentes preparaciones farmacéuticas son conocidos para los expertos en la materia y pueden fabricarse de la manera que es conocida en sí misma. El medicamento (o composición farmacéutica) puede administrarse en combinación con un vehículo, excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son muy conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, aminoácidos, solución tamponada isotónica acuosa estéril y combinaciones de los mismos.
Los agentes activos (por ejemplo, el vector/sistema vector novedoso o partículas víricas), composiciones y medicamentos de la presente divulgación se pueden administrar por vía parenteral. Se pueden preparar soluciones o suspensiones de estos compuestos activos en agua mezclada convenientemente con un agente tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceite. Los aceites ilustrativos son los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite mineral. En general, los vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables, son el agua, solución salina, solución acuosa de dextrosa y azúcares relacionados y glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol. Bajo condiciones comunes de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para prevenir el crecimiento de los microorganismos. Las formulaciones para suministro parenteral y no parenteral de fármacos son conocidas en la técnica y se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 19a edición, Mack Publishing (1995), que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida a tal grado que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.
Los sujetos por tratar de acuerdo con la presente divulgación son los sujetos que están en riesgo de desarrollar, o han desarrollado, cáncer, una enfermedad infecciosa o un trastorno del sistema inmunitario. Estos sujetos incluyen seres humanos y animales no humanos, preferentemente mamíferos o especies de ave. Los sujetos mamíferos ejemplares incluyen, sin limitación, humanos, primates no humanos, perros, gatos, roedores, ganado, caballos, ovejas y cerdos. Los sujetos aviarios ejemplares incluyen, sin limitación, pollos, codornices, pavos, patos o gansos.
Una cantidad eficaz de un agente activo, composición o medicamento terapéutico o preventivo de la divulgación se determina basándose en la meta deseada, por ejemplo estimulación de una respuesta inmunitaria contra un tumor o una enfermedad infecciosa. Los expertos en la materia conocen bien cómo aplicar el suministro génico in vivo y ex vivo. Para vectores víricos, generalmente se preparará una solución de reserva del vector vírico. Dependiendo de la clase de virus y del título obtenible, se le suministrarán a un sujeto al menos aproximadamente, como máximo aproximadamente, o aproximadamente 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 o 1x1012 partículas infecciosas víricas, o cualquier valor o escala intermedia. En otros aspectos, el vector o vectores víricos de acuerdo con la presente divulgación se pueden administrar en una sola administración o en múltiples administraciones. El vector o vectores víricos se pueden administrar a una dosis de 1 x 105 partículas víricas infecciosas (ivp), 5 x 105 ivp, al menos 1 x 106 ivp, 5 x 106 o aproximadamente 5 x 106 ivp, 1 x 107, al menos 1 x 107 ivp, 1 x 108 o aproximadamente 1 x 108 ivp, al menos 1 x 108 ivp, aproximadamente o al menos 5 x 108 ivp, 1 x 109 o al menos 1 x 10 ivp 1 10 o al menos 5 x 10 1 x 10 o 10
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r vp o 1, vectores víricos se pueden administrar a una dosis de entre aproximadamente 107-1013 ivp, entre aproximadamente 108-1013 ivp, entre aproximadamente 108-1012 ivp, o entre aproximadamente 109-1012 ivp.
Un efecto terapéutico puede lograrse con sólo una administración de un agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la presente divulgación. Por otra parte, el tratamiento puede contener varias administraciones.
La dosis eficaz de los vectores depende al menos del sujeto que requiere el tratamiento, el tipo de enfermedad y la etapa de la enfermedad. La dosis puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 1x108 ivp (partículas víricas infecciosas) a aproximadamente 1x1014 ivp, específicamente de aproximadamente 1x109 ivp a aproximadamente 1x1013 ivp, y más específicamente de aproximadamente 5x109 ivp a aproximadamente 1x1012 ivp.
La administración del agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la presente divulgación se puede realizar mediante cualquier método adecuado conocido para el experto en la materia. En una realización de la divulgación, la administración se realiza por medio de una inyección intratumoral, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administración oral. En otra realización de la divulgación, la administración se realiza por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea, parenteral, intranasal, intratraqueal, percutánea, intraespinal, ocular o intracraneal. También es posible combinar diferentes vías de administración. En una realización preferida, la administración se realiza por medio de una administración intratumoral, esto es, la administración del agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la presente divulgación al tumor.
El agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la presente divulgación también puede usarse junto (de forma simultánea, secuencial o concomitante) con otros agentes terapéuticos o métodos terapéuticos, o una combinación de tratamientos. Por ejemplo, los métodos o usos terapéuticos de la divulgación pueden comprender adicionalmente radioterapia, quimioterapia, administración de otros fármacos, por ejemplo anticuerpos dirigidos a los mecanismos de crecimiento de tumor, dianas del punto de control de las células inmunitarias, vacunas de cáncer o cualquier operación clínica.
Como se describe en el presente documento, se proporcionan métodos y usos para la inmunoestimulación (esto es, inducción, control y/o activación y/o estimulación de los mecanismos de la respuesta inmunitaria en el contexto del tratamiento del cáncer, una enfermedad infecciosa o un trastorno del sistema inmunitario, en particular para atraer o reclutar células inducidas, activadas o estimuladas por la inmunoestimulación a un sitio de interés (por ejemplo, a un tumor o a un sitio mucoso de infección). Las células del sistema inmunitario que están implicadas en una respuesta inmunitaria son referidas en general como células inmunitarias e incluyen linfocitos y células no linfoides, tales como las células accesorias. Los linfocitos son células que reconocen y responden específicamente a antígenos extraños. Las clases principales de linfocitos incluyen linfocitos B (células B), linfocitos T (células T), y células citolíticas naturales (NK), que son linfocitos granulares grandes. Las células B son capaces de producir anticuerpos. Los linfocitos T se subdividen adicionalmente e incluyen células T cooperadoras (células T CD4+) y células T citolíticas o citotóxicas (células T CD8+). Las células cooperadoras secretan citocinas que promueven la proliferación y diferenciación de las células T y otras células que incluyen células B y macrófagos, y reclutan y activan leucocitos inflamatorios. Otro subgrupo de células T, denominadas células T reguladoras o células T supresoras, suprimen activamente la activación del sistema inmunitario e impiden la autorreactividad patológica, esto es, la enfermedad autoinmunitaria.
Se considera que los métodos de inmunoestimulación descritos en el presente documento inducen una respuesta inmunitaria mediada por célula que implica varios tipos de células T. En una respuesta mediada por célula, los diversos tipos de linfocitos T actúan para eliminar un antígeno mediante varios mecanismos. Por ejemplo, las células T cooperadoras que son capaces de reconocer antígenos específicos pueden responder liberando mediadores solubles, tales como citocinas, para reclutar células adicionales del sistema inmunitario para participar en una respuesta inmunitaria. También, las células T citotóxicas son capaces de reconocer específicamente un antígeno y pueden responder uniéndose y destruyendo o dañando una célula o partícula que lleva el antígeno.
Una respuesta inmunitaria en un hospedador o sujeto puede determinarse mediante cualquiera de varios métodos inmunológicos muy conocidos que serán familiares para los expertos en la materia. Como se describe en el presente documento, los métodos y técnicas para determinar la presencia y nivel de una respuesta inmunitaria incluyen, por ejemplo, transferencia de energía fluorescente por resonancia, polarización de fluorescencia, transferencia de energía fluorescente por resonancia resuelta en el tiempo, ensayos de proximidad de centelleo, ensayos de gen indicador, fluorescencia apagada por enzima - sustrato, sustrato de enzima cromogénica y electroquimioluminiscencia, inmunoensayos (tales como los ensayos de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo, inmunotransferencia, inmunohistoquímica y similares), resonancia de plasmón de superficie, ensayos basados en célula, tales como los que usan genes indicadores y ensayos funcionales (por ejemplo, ensayos que miden la función inmunitaria y la responsividad inmunitaria).
Tales ensayos incluyen, pero no necesariamente se limitan a, la determinación in vivo o in vitro de la presencia y nivel de anticuerpos solubles, mediadores solubles tales como citocinas (por ejemplo, IFN-y, IL-2, I L-4, IL-10, IL-12, IL-6, IL-23, TNF-a y TGF-p), linfocinas, quimiocinas, hormonas, factores de crecimiento y similares, así como también otros péptidos pequeños solubles, carbohidratos, mediadores de nucleótido o lípido. Los niveles de citocinas se pueden determinar de acuerdo con los métodos descritos y practicados en la técnica que incluyen, por ejemplo, ELISA, ELISPOT, marcación de citocina intracelular y citometría de flujo, y combinaciones de los mismos (por ejemplo, marcación de citocina intracelular y citometría de flujo).
Los inmunoensayos también incluyen determinar los cambios del estado de activación celular analizando propiedades funcionales o estructurales alteradas de las células del sistema inmunitario, por ejemplo proliferación celular, motilidad alterada, inducción de actividades especializadas tales como expresión génica específica o comportamiento citolítico; maduración celular, tal como la maduración de las células dendríticas en respuesta a un estímulo; alteración en la relación entre una respuesta Th1 y una respuesta Th2; diferenciación celular por las células del sistema inmunitario, que incluye perfiles alterados de la expresión del antígeno de superficie o el inicio de apoptosis (muerte celular programada). También están disponibles otros métodos para medir los marcadores de superficie celular para identificar varias poblaciones de células inmunitarias, tales como, sin limitación, células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, células T de memoria efectoras (Tem), células T de memoria centrales (Tcm) o células T de memoria residentes en tejido (Trm). Los procedimientos para realizar estos ensayos y otros similares se describen en la literatura. Los ensayos de citotoxicidad para determinar la actividad de CTL (o actividad de células T CD8+) se pueden realizar usando cualquiera de varias técnicas y métodos practicados rutinariamente en la técnica.
En realizaciones particulares se observa un aumento de 2-50 veces de células T específicas de antígeno localmente infiltrantes siguiendo los métodos y usos divulgados en el presente documento. En ciertas realizaciones se observa un aumento de 2-40 veces, un aumento de 2-30 veces, un aumento de 2-20 veces, un aumento de 2-10 veces, un aumento de 3-8 veces, un aumento de 4-7 veces o un aumento de 5-6 veces de células T específicas de antígeno localmente infiltrantes (por ejemplo, infiltrantes de tumor). En general, el aumento de células T específicas de antígeno localmente infiltrantes es comparado con el número de células T específicas de antígeno localmente infiltrantes presentes en ausencia de la administración, o comparado con una administración de control apropiada. Se considera que los métodos y usos en el presente documento divulgados proporcionan un aumento de manera estadística, biológica o clínicamente significativa de las células T específicas de antígeno localmente infiltrantes, en comparación con un control apropiado en ausencia de la administración del agente activo, composición o medicamento de la divulgación.
Una muestra biológica se puede obtener del sujeto determinando la presencia y nivel de una respuesta inmunitaria en el sujeto que ha recibido un tratamiento con un agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la divulgación de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento. Una “muestra biológica”, como se usa en el presente documento, puede ser una muestra de sangre (de la que se puede preparar suero o plasma), muestra de aféresis, espécimen de biopsia, espécimen de biopsia de tumor, fluidos corporales (por ejemplo, lavado pulmonar, ascitis, lavados mucosos, fluido sinovial), médula ósea, nódulos linfáticos, explante de tejido, cultivo de órgano o cualquier otro tejido o preparación celular del sujeto, o una fuente biológica.
Con respecto a todos los inmunoensayos y métodos en el presente documento descritos para determinar una respuesta inmunitaria, el experto en la materia también apreciará y entenderá fácilmente qué controles se deben incluir adecuadamente al practicar estos métodos. Las concentraciones de los componentes de reacción, los tampones, la temperatura y el tiempo suficiente para permitir la interacción de los componentes de reacción, pueden ser determinados o ajustados de acuerdo con los métodos que serán familiares para un experto en la materia.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para aumentar las células T en el microambiente de tumor, que comprende administrarle a un sujeto que tiene un tumor un agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la divulgación de acuerdo con los métodos en el presente documento divulgados, induciendo así una respuesta inmunitaria contra el tumor.
Como entiende el experto en medicina, los términos “tratar” y “tratamiento” se refieren al manejo médico de una enfermedad, trastorno o afección de un sujeto (esto es, un paciente). En general, una dosis y régimen de tratamiento apropiado proporcionan el agente activo (por ejemplo, un sistema vector o partícula de virus), composición o medicamento de la divulgación, en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico o profiláctico. El beneficio terapéutico o profiláctico incluye, por ejemplo, un resultado clínico mejorado, tanto tratamiento terapéutico como medidas preventivas o profilácticas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar o retardar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, o prevenir o ralentizar o retardar (disminuir) la expansión o severidad de dicha enfermedad o trastorno. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados del tratamiento de un sujeto incluyen, sin limitación, abatimiento, disminución o alivio de los síntomas que resultan o están asociados con la enfermedad o trastorno tratado; disminuir la ocurrencia de síntomas; mejorar la calidad de vida; prolongar el estado libre de enfermedad (esto es, disminuir la probabilidad o propensión de que un sujeto presente síntomas sobre la base de los cuales se hace el diagnóstico de una enfermedad); disminuir la extensión de la enfermedad; estabilizar (esto es, no empeorar) el estado de la enfermedad; retardar o ralentizar el progreso de la enfermedad; mitigar o paliar el estado patológico; y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable; o supervivencia en general. El “tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si un sujeto no recibiera tratamiento. Los sujetos que requieren tratamiento incluyen los que ya tienen la enfermedad o trastorno, así como también los sujetos propensos a tener, o en riesgo de desarrollar, la enfermedad o trastorno.
Las moléculas de ácido nucleico, que incluyen los sistemas vectores de acuerdo con la presente divulgación, se le pueden suministrar a una célula de acuerdo con cualquiera de varios métodos descritos en la técnica. Tales métodos de suministro conocidos para los expertos en la materia incluyen, pero no se restringen a, encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos tales como polímeros biodegradables; hidrogeles; ciclodextrinas; ácido poli(láctico-glucólico) (PLGA) y microesferas de PLCA; nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o por medio de vectores proteináceos.
La presente divulgación proporciona una combinación de proteínas que comprenden ligando de 4-1 BB (4-1 BBL), IL-2 e IL-12 de cadena sencilla (sclL-12), en donde la cantidad de 4-1 BBL es mayor que la cantidad de sclL-12 e IL-2.
En diversos aspectos, el ligando de 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de homología o identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el ligando de 4-1BB es capaz de unirse específicamente a células T, preferentemente células T cooperadoras CD4+ y células T CD8+ activadas. Preferentemente, el ligando de 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de homología o identidad con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el ligando de 4-1BB es capaz de unirse específicamente a células T, preferentemente células T CD8+. Más preferentemente, el ligando de 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de homología o identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el ligando de 4-1BB es capaz de unirse específicamente a células T, preferentemente células T cooperadoras CD4+ y células T CD8+ activadas. Incluso más preferentemente, el ligando de 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de homología o identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Figura 13), en donde el ligando de 4-1BB es capaz de unirse específicamente a células T, preferentemente células T cooperadoras CD4+ y células T CD8+ activadas. En ciertas realizaciones, las variantes de 4-1BBL anteriormente descritas exhiben la misma especificidad de unión a las células T, preferentemente a células T cooperadoras CD4+ y células T CD8+ activadas, que la 4-1BBL nativa que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 (Figura 13).
En diversos aspectos de la divulgación, la proteína IL-2 muestra al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde la proteína IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, la proteína IL-2 muestra al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde la proteína IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, la proteína IL-2 muestra al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde la proteína IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. Incluso más preferentemente, la proteína IL-2 muestra al menos 95 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14), en donde la proteína IL-2 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+. En ciertas realizaciones, las variantes de IL-2 anteriormente descritas exhiben la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de células T cooperadoras y células T CD8+, que la IL-2 nativa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 14).
En diversos aspectos de la divulgación, la proteína scIL-12 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde la proteína scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. Preferentemente, la proteína scIL-12 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde la proteína scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. Más preferentemente, la proteína scIL-12 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde la proteína scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. Incluso más preferentemente, la proteína scIL-12 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15), en donde la proteína scIL-12 tiene actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+. En ciertos aspectos, las variantes de scIL-12 anteriormente descritas exhiben la misma actividad inmunoestimulante, preferentemente actividad estimulante de monocitos, células T cooperadoras y células T CD8+, que la scIL-12 nativa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (Figura 15).
Como se divulga en el presente documento, una proteína se considera una proteína scIL-12 si comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las dos subunidades p35 y p40 de la proteína IL-12 nativa como una proteína de fusión. Las secuencias de SEQ ID NO: 8 y 10 muestran la secuencia de aminoácidos de las subunidades de 40 kDa y 35 kDa de IL-12 humana. En ciertas realizaciones, las variantes de scIL-12 anteriormente descritas exhiben la misma actividad inmunoestimulante que la scIL-12 nativa codificada por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y 10. Preferentemente, el enlazador de la scIL-12 de la presente divulgación es un enlazador de péptido o polipéptido. La presente divulgación abarca variantes de scIL-12 descritas en la presente en las que, en particular, se modifica la secuencia de enlazador mostrada en negrita en la figura 15 (SEQ ID NO: 5 y 6), específicamente con respecto a la longitud de la secuencia de enlazador. La longitud de la secuencia de aminoácidos del enlazador se puede seleccionar empíricamente o con la guía de información estructural o usando una combinación de los dos enfoques. Los expertos en la materia reconocerán que hay muchas secuencias que varían en longitud o composición que pueden servir como enlazadores, siendo la consideración principal que no sean ni excesivamente grandes ni excesivamente cortas.
El vector/sistema vector novedoso o partículas de virus provistas por la presente divulgación se pueden envasar como kits. Opcionalmente, los kits pueden incluir uno o más componentes tales como instrucciones de uso y administración, dispositivos (por ejemplo, para administrar la composición o composiciones a un sujeto) y reactivos adicionales, y componentes tales como tubos, contenedores, por ejemplo viales y jeringas para practicar los métodos y usos. También se contemplan en el presente documento kits que comprenden un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema vector de la divulgación. También se contemplan en el presente documento, kits que comprenden una célula de cáncer transducida o transfectada con un sistema vector o partícula de virus de la divulgación. También se contemplan en el presente documento kits que comprenden un agente activo, una composición o un medicamento de la divulgación. También se contemplan en el presente documento kits que comprenden el vector /sistema vector vírico novedoso de la divulgación y opcionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica un factor de maduración.
Es de reconocer que la presente invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, géneros y reactivos particulares en el presente documento descritos, y por lo tanto pueden variar. También se ha de reconocer que la terminología usada en la presente únicamente tiene la finalidad de describir realizaciones particulares y no tiene la intención de limitar el alcance de la presente invención.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Otros aspectos y usos serán evidentes para el experto en la materia a la luz de las presentes divulgaciones. Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente como ilustrativos de diversos aspectos de la divulgación y no se deberá considerar que limitan la invención en modo alguno.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión transgénica de IL-12, IL-2 y 4-1 BBL y respuesta de IFN-y de Im01 murino y humano Im01 es un vector adenovírico que comprende una construcción de expresión que comprende los genes humanos para IL-12 de cadena sencilla, 4-1 BBL e IL-2, en el orden mostrado en el siguiente esquema:
Figure imgf000029_0001
La construcción del vector Im01 se describe en el documento WO 2004/035799 con el esquema anterior representado en la Figura 1 del documento WO 2004/035799. El nombre del vector en el documento WO 2004/036799 es “Ad-3”. En la presente divulgación, el código de vector interno para el vector anterior es Im01. Células A549 humanas y células Hepa1-6 murinas se transdujeron una hora con Im01 que lleva los tres genes de humano o ratón, respectivamente, a la multiplicidad de infección (MOI, números que se dan en [corchetes]) indicada. Cuatro horas después de la transducción se añadieron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) o linfocitos de ratón y los sobrenadantes se recolectaron para ensayos de citocina después de 34 horas de cocultivo. Los niveles de citocina se detectaron por ELISA (eBioscience). Las células de tumor se desprendieron y se analizaron por citometría de flujo para determinar la expresión de 4-1 BBL. Como resultado, aunque la arquitectura del vector murino y humano es idéntica, el nivel de expresión de los transgenes varía claramente entre las especies murina y humana en que el Im01 humano muestra una expresión de IL-12 hasta 15 veces más alta que el Im01 murino. En el ámbito clínico, este aumento en los niveles de IL-12 lleva el riesgo de toxicidad y aplicabilidad terapéutica limitada.
Ejemplo 2: Diseño del vector y vista general del estudio
Im02
Se ha diseñado y producido un vector de acuerdo con la presente invención para un estudio de simulación de terapia ex vivo. El vector se basa en un vector adenovírico y se ha denominado Im02 (código de vector interno “Im02”). El Im02 comprende una construcción de expresión que comprende los genes humanos para 4-1 BBL, IL-2 e IL-12 de cadena sencilla (sclL-12), en el orden mostrado en el siguiente esquema:
Figure imgf000029_0002
La Figura 2 muestra un mapa génico esquemático del plásmido lanzadera pE1.1 Im02. El casete de expresión para Im02 se ilustra como un plásmido de transferencia precursor basado en el plásmido pE1.1, adecuado para subclonación en un plásmido que lleva, por ejemplo, ADN de vector adenovírico. Más específicamente, el casete de expresión contenido en el vector adenovírico Im02 es el casete de expresión mostrado en la Figura 18, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12. El vector de la presente invención se ha identificado para inducir mecanismos de defensa inmunitarios contra células de tumor en cáncer de vejiga por modificación multivalente del microambiente inmunitario intratumoral.
Vista general de la cohorte de pacientes
Se eligieron cultivos ex vivo de muestras de biopsia de tumor humano como el modelo de estudio para el sistema vector novedoso. Las muestras se proporcionaron por la Clínica de Urología del Asklepios Hospital, Hamburg-Barmbek. Se analizaron un total de 244 muestras de tumor y 270 biopsias de control de tejido normal de vejiga de 43 pacientes. De ocho pacientes se recolectaron muestras durante resección transuretral (TUR); la parte mayor de las muestras incluidas en el estudio eran de cistectomía. En este estudio, se analizaron tejidos de tumor y vejiga entre una amplia gama de etapas de enfermedad que varían de la etapa temprana a la tardía. Se han analizado las muestras de 16 mujeres y 27 hombres. Los pretratamientos en esta cohorte de pacientes fueron TUR seriada, quimioterapia o terapia anti-androgénica, debido a diagnóstico concomitante de carcinoma de próstata.
Ejemplo 3: Expresión transgénica de 4-1 BBL, IL-2 y sclL-12, y respuesta de IFN-y de Im02 y el vector anterior Im01
Se comparó la expresión transgénica de 4-1 BBL, IL-2 e IL-12, y la respuesta de IFN-y de Im02 (véase el Ejemplo 2) y el vector anterior Im01 (véase el Ejemplo 1).
Células A549 humanas se transdujeron una hora con Im01 o Im02 a la MOI (multiplicidad de infección, esto es, partículas víricas infecciosas por célula diana) indicada en la Figura 3 (los números MOI entre corchetes). Cuatro horas después de la transducción, se añadieron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y los sobrenadantes se recolectaron para ensayos de citocina después de 34 horas de cocultivo. Los niveles de citocina se detectaron por ELISA. Las células de tumor se desprendieron y las células positivas para 4-1 BBL se detectaron por citometría de flujo. Los puntos datos indicados son la media de cuatro donadores individuales, cada uno con cuatro réplicas.
Como se muestra en la Figura 3, la disposición de los genes para 4-1 BBL, IL-2 y sclL-12 en Im02 proporciona una expresión de 4-1 BBL aumentada en comparación con la disposición de los mismos genes en Im01, concurrentemente con una disminución de IL-12, produciendo un aumento en la respuesta de IFN-y.
En particular, la disposición de los genes para 4-1BBL, IL-2 y sclL-12 en Im02 produce un aumento de 1,7 veces de la expresión de 4-1BBL, y un aumento de 1,5 veces en la expresión de IL-2 en promedio, en comparación con la disposición de genes en el vector anterior Im01. Esto se combina con una disminución de 2,6 veces del grado de expresión de IL-12. Con la disposición de los genes en Im02, la proporción molar de IL-2/IL-12 aumentó del 2,5 % al 9,1 % en promedio. Además, la mayor expresión de IL-2 y 4-1 BBL llevó a una inducción de IFN-y 1,4 veces más alta detectada a todas las escalas de dosis, MOI 2.5, 5, 10 y 50.
Im02 proporciona una respuesta de IFN-y que es superior a la de Im01. Como resultado, Im02 muestra un efecto mejorado de inmunoestimulación en comparación con el vector anterior Im01.
Ejemplo 4: Comparación de vectores solos y Im02 y Im01 en un modelo basado en tejido
Se examinaron tratamientos monodosis usando los vectores adenovíricos que expresan sclL-12, IL-2 o 4-1BBL solos, así como también Im02 y Im01 (véase el Ejemplo 1 para mayores detalles de este último).
Para estudiar los efectos de Im02 sobre el microambiente de tumor, se estableció un modelo de simulación de terapia basado en muestras de tejido de tumor no disociado. Se usaron muestras de tejido derivadas de resección transuretral o cistectomía de vejiga.
Los tejidos de tumor de vejiga (“T”) y vejiga normal (“B”) se transdujeron con 108 ivp (partículas de virus infecciosas) de Im02 o Im01. La viabilidad de las muestras de tumor y vejiga se monitorizó en los sobrenadantes del medio de cultivo usando un ensayo enzimático de liberación de LDH. La expresión transgénica y la respuesta de IFN-y se midió por ELISA en el sobrenadante de cultivo el día 6 después de la transducción. Los resultados se muestran en la Figura 4. Incluso a altos grados de expresión de sclL-12 e IL-2 solos, la respuesta de IFN-y es cercana al valor de referencia. Este resultado sugiere la acción cooperativa de los tres genes en el contexto tisular de vejiga y tumor. Adicionalmente, Im02 aumenta la respuesta de IL-2 e IFN-y en comparación con Im01. La Figura 4 muestra un efecto mejorado de Im02 de inmunoestimulación en el microambiente de tumor en comparación con el vector anterior Im01.
Ejemplo 5: Comparación de Im02 y Im01 a diferentes niveles de dosis
Im02 y Im01 (véanse los Ejemplos 2 y 3 para detalles adicionales sobre estos vectores) se compararon a dosis en escala para expresión transgénica y respuesta de IFN-y en el microambiente de tumor.
Las muestras de tumor derivaron de pacientes individuales y se examinó un par igualado de tejidos de tumor de vejiga (“T”) y vejiga normal (“B”) para las escalas de dosis 107y 108 ivp (partículas de virus infeccioso). La expresión se midió el día 6 por ELISA. Los resultados se muestran en la Figura 5. A diferentes escalas de dosis, Im02 proporciona una respuesta de IFN-y que es superior a la de Im01. Como resultado, a escalas de dosis diferentes, Im02 muestra un efecto mejorado de inmunoestimulación en el microambiente de tumor en comparación con el vector anterior Im01.
Ejemplo 6: Perfil de expresión génica para Im02 y Im01
Se ha realizado un análisis de transcriptoma para mostrar el perfil de expresión de gen terapéutico para Im02. En particular, para obtener un perfil comprehensivo de la activación de leucocitos por Im02 y Im01, células de tumor de un experimento de cocultivo con células de tumor y PBMC se transdujeron con Im02, Im01 y Ad0 (vector vacío), y se realizó un análisis de la actividad génica de ARNm (análisis de la expresión del genoma completo lllumina Chip HT12) de los leucocitos. Para este fin, leucocitos periféricos se añadieron al cocultivo después de la transducción. Se usaron como control leucocitos sobre células de tumor no transducidas. Después de 4, 24, 32, 48, 72 y 96 horas, los leucocitos se recolectaron y el ARN se aisló y se purificó. Después de verificación de la calidad, el ARN se transcribió inversamente a ADN complementario (ADNc), se marcó de acuerdo con el protocolo del chip de perlas y se cargó en el chip de perlas HT12 y se hizo un escaneo (Life & Brain, Departamento de Genética Humana de la Universidad de Bonn). Los datos obtenidos se transfirieron al software GenomeStudio (lllumina). Posteriormente, los datos se evaluaron usando el software IPA® (Ingenuity). Se hizo un análisis de núcleo que muestra los procesos regulados diferencialmente. Para obtener una vista general de los procesos regulados, y para ilustrar su significado y el número de moléculas implicado, se realizó un análisis de proceso IPA®. Véanse las Tablas 1 y 2:
T l 1: Im 2 l in r r l m f r m n l 24 h
Figure imgf000031_0001
T l 2: Im 1 l in r r l m f r m n l 24 h
Figure imgf000031_0002
Como resultado, Im02 proporciona una inmunoestimulación que se caracteriza por una “respuesta inmunitaria mediada por célula” que implica 61 genes regulados (véase la Tabla 1, parte inferior) entre los cinco procesos regulados más fuertemente de desarrollo y función del sistema fisiológico (en virtud del significado y número de moléculas implicadas). Para Im01 (véase la Tabla 2, parte inferior), esta función (esto es, “respuesta inmunitaria mediada por célula”) no aparece entre los cinco procesos regulados más fuertemente de desarrollo y función del sistema fisiológico porque en el presente documento sólo son regulados diferencialmente un total de 28 moléculas. Los otros sistemas mencionados en la tabla (como el sistema hematológico, tráfico de células inmunitarias, morfología de tejido y desarrollo de tejido en general), sugieren cambios extensos causados por terapias inmunitarias multivalentes. Lo que se ha hecho evidente del análisis de transcriptoma es que el perfil de expresión de gen terapéutico de Im02 es único y superior, en particular superior sobre el vector anterior Im01.
Los procesos regulados han sido asignados a funciones (celulares) reguladas específicamente usando el software IPA® (Ingenuity Pathway Analysis, Qiagen). Esto permite una información más precisa con respecto a la activación/inactivación de los procesos biológicos.
Como resultado (datos no mostrados), las cinco funciones inducidas más fuertemente son activación de linfocitos, activación de leucocitos mononucleares, citotoxicidad de leucocitos, diferenciación de leucocitos mononucleares y activación de linfocitos T (células T).
Ejemplo 7: Análisis de la expresión génica para la activación de los principales tipos de células inmunitarias La activación de los principales tipos de células inmunitarias durante un transcurso de tiempo de 96 horas se analizó usando el software CELLMIX, que permite analizar datos de expresión génica para la presencia y estado de activación de todos los principales tipos de células inmunitarias. La gráfica de calor de la Figura 6 ilustra la activación de todos los subtipos principales de células inmunitarias de la sangre, excepto las células B (células mononucleares de sangre periférica, PBMC) durante un transcurso de tiempo de 4 días (96 horas) en cocultivo con células de carcinoma RT-4 de vejiga humana. Como se muestra en la Figura 6, la activación de células T cooperadoras y células T citotóxicas por Im02 es superior sobre la activación de las mismas células inmunitarias por Im01.
Ejemplo 8: Resultados del estudio de tejido ex vivo
Perfiles de tejido por histología
La variación de la calidad de tejido y composición celular se monitorizaron en secciones de tejido ya sea después de fijación con formalina e incrustación en parafina o después de congelación y fijación en tejido. La calidad general se evaluó después de tinción con hematoxilina-eosina (HE).
Como se muestra en la Figura 7, Im02 indujo reordenamientos histológicos (C) que no se observaron con un vector de control Ad0 (B), o vectores de genes solos (datos no mostrados). El Im02 indujo alteraciones morfológicas observadas en los tejidos de tumor (Figura 7, panel C) que incluyen el número y distribución de infiltrados de células inmunitarias con respecto a tejidos tratados con Ad0/AdNull de control (panel B) o vectores de genes solos (datos no mostrados).
Adicionalmente, la Figura 8 muestra que Im02 induce reordenamientos histológicos evidentes en la distribución y frecuencia de infiltrados de leucocitos. La flecha del panel inferior de la Figura 8 indica una región de tumor con signos de muerte celular. Estos cambios morfológicos proporcionan evidencia histológica de una respuesta inmunitaria inducida por Im02.
Identificación de tipos de células diana
Se hizo microscopía de transmisión electrónica (TEM) sobre tejidos transducidos con Im02 para identificar, entre otras cosas, el tipo de célula diana de la incorporación de partícula adenovírica, la vía de incorporación, considerada por la presencia y morfología de las membranas de vesícula, y la abundancia de partículas por célula.
El tejido de tumor de una cistectomía se disecó y se transdujo sumergiendo la muestra en 500 pl de medio de cultivo que contenía 108 ivp de Im02 durante 1 hora a 37° C, la incorporación se detuvo por reemplazo de medio con solución de fijación enfriada en hielo que contenía glutaraldehído al 2 %. Después, las muestras de tejido se procesaron mediante los procedimientos convencionales y se tomaron imágenes por medio de un microscopio de transmisión electrónica, proporcionado por Vironova SA, Estocolmo, Suecia.
En el microscopio de transmisión electrónica de tinción positiva, las partículas adenovíricas se identificaron por su tamaño de aproximadamente 80 nm y por la geometría de la partícula. Los resultados se muestran en la Figura 9. Después de una hora de transducción, las partículas adenovíricas Im02 son detectables en una diversidad de tipos de células identificadas por análisis de morfología ultraestructural. La presencia y morfología de las estructuras de vesícula alrededor de las partículas adenovíricas indican el mecanismo de incorporación.
Mediante su morfología individual, se encontraron diferentes tipos de células como células diana en muestras de carcinoma de vejiga, que incluyen células de tumor (no mostradas), células de tejido conectivo (fibroblasto, Panel 4) del estroma de tumor y células inmunitarias. Las partículas adenovíricas se detectaron en células con morfología de linfocitos (Panel 3) y monocitos (Panel 2). En el carcinoma de vejiga, la morfología de monocitos indica la presencia de células de Langerhans, macrófagos o células dendríticas.
De forma importante, este hallazgo es de valor particular para el modo de acción, puesto que se describe que todas estas células inmunitarias diana identificadas experimentan activación y diferenciación a tipos de células efectoras después de transducción con citocinas, mientras que se mostró que la expresión de 4-IBBl sostiene procesos de activación cuando es expresado en células presentadoras de antígeno y en linfocitos, por transducción de señal inversa (Ju et al., 2009, International Immunology, 21 (10), 1135-1144).
Ruta de la incorporación y abundancia: se encontraron partículas adenovíricas en el citoplasma de las células diana en diferentes posiciones y con diferentes medios. La incorporación clásica es mediada después de la unión al receptor de coxsackie y adenovirus, seguido de traslado en vesículas endocíticas.
Se sugiere que esta ruta está activa en el Panel 6A, en donde una partícula está representada en el proceso de formación de vesícula. En el Panel 6B, una partícula adenovírica está localizada en una vesícula grande que también contiene otras estructuras no definidas, sugiriendo una forma de incorporación pinocitótica. En el Panel 3a ,

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Vector que comprende secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican el ligando de 4-1BB (4-1BBL), IL-12 de cadena sencilla (scIL-12) e IL-2, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica IL-2 está localizada secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL y la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica scIL-12 está localizado secuencia abajo de la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica IL-2.
2. El vector de la reivindicación 1, en donde el vector es uno cualquiera de un vector adenovírico, un vector de virus adenoasociado, un vector lentivírico, un vector de virus de herpes simple, un vector de poxvirus, un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector de nanopartícula y ADN desnudo.
3. El vector de la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL es ADNc humano, la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica scIL-12 es ADNc humano y/o la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica IL-2 es ADNc humano.
4. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL muestra una identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína 4-1BBL capaz de unirse específicamente a células T activadas.
5. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica IL-2 muestra una identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína IL-2 que tiene actividad inmunoestimulante.
6. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica scIL-12 muestra una identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia de ácido nucleico variante codifica una proteína scIL-12 que tiene actividad inmunoestimulante.
7. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde un promotor está localizado secuencia arriba de la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica 4-1BBL, pero no secuencia arriba de las secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican scIL-12 y/o IL-2.
8. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde las secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican 4-1BBL, sclL-12 e IL-2 están enlazadas por sitios internos de entrada al ribosoma (IRES).
9. Una célula de cáncer o una célula inmunitaria, transducida o transfectada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8.
10. Un medicamento que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la célula de cáncer o la célula inmunitaria de la reivindicación 9.
11. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, la célula de cáncer o inmunitaria de la reivindicación 9 o el medicamento de la reivindicación 10 , para su uso en el tratamiento del cáncer, de una infección vírica y/o de un trastorno del sistema inmunitario.
12. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o la célula de cáncer o inmunitaria para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o el medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde el cáncer es uno cualquiera de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de próstata, linfoma, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de colon, melanoma, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, carcinoma cerebral primario, cáncer de cabeza-cuello, glioma, glioblastoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células no microcíticas, carcinoma de cabeza o cuello, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células microcíticas, tumor de Wilms, carcinoma cervical, carcinoma testicular, carcinoma de vejiga, carcinoma pancreático, carcinoma de estómago, carcinoma de colon, carcinoma prostático, carcinoma genitourinario, carcinoma tiroideo, carcinoma esofágico, mieloma, mieloma múltiple, carcinoma adrenal, carcinoma de células renales, carcinoma endometrial, carcinoma de la corteza adrenal, insulinoma pancreático maligno, carcinoma carcinoide maligno, coriocarcinoma, micosis fungoide, hipercalcemia maligna, hiperplasia cervical, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia granulocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia de células peludas, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, policitemia vera, trombocitosis esencial, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, sarcoma de tejido blando, mesotelioma, sarcoma osteogénico, macroglobulinemia primaria y retinoblastoma.
13. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la célula de cáncer o inmunitaria de la reivindicación 9 o el medicamento de la reivindicación 10, para su uso en la prevención o el tratamiento de metástasis del cáncer.
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