ES2733084T3 - Antígenos de Chlamydia - Google Patents

Abstract

Una proteína para su uso en terapia para la infección por Chlamydia, en la que la proteína comprende: a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95 % o mayor con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

Description

DESCRIPCIÓN

Antígenos de Chlamydia

Campo técnico

La presente invención está en el campo de las proteínas de Chlamydia trachomatis y sus usos.

Antecedentes de la técnica

El desarrollo de vacunas se ha identificado como algo esencial para controlar la infección por C. trnchomatis. Las vacunas contra C. trnchomatis parecen provocar inmunidad protectora de linfocitos T y / o linfocitos B en la mucosa del tracto genital.

La inmunidad protectora contra C. trnchomatis parece depender de una respuesta inmunitaria mediada por células polarizadas Th1, en particular en linfocitos CD4+ que secretan IFNy. Por ejemplo, la depleción de linfocitos T CD4 en ratones da como resultado la pérdida de la inmunidad protectora, y la transferencia adoptiva de linfocitos T CD4+ específicos de -Chlamydia confiere protección contra la exposición a C. trnchomatis. Además, estudios recientes informan de que la infección por C. trnchomatis en ratones induce una respuesta inmunitaria protectora de CD4-Th1, lo que indica que los antígenos principales de Chlamydia se procesan y se presentan a través de la vía del MHC de clase II (Brunham RC y Rey-Ladino J (2005), Nat Rev Immunol 5: 149-1611; Su H y Caldwel1HD (1995), Infect Immun 63: 3302-3308).

Aunque los linfocitos B y los anticuerpos no tienen un papel decisivo en la resolución de la infección primaria, es probable que sean importantes para aumentar la respuesta protectora de linfocitos T efectores y para ser necesarios para controlar la reinfección con varios mecanismos, tales como la opsonización y neutralización mediadas por anticuerpos.

Dado que es probable que la protección inmunitaria contra la infección por C. trnchomatis esté mediada por la inmunización con proteínas de C. trachomatisque son dianas de los linfocitos T CD4+ y que son capaces de inducir respuestas de linfocitos B, la identificación de tales proteínas es importante.

Anteriormente, en el documento WO07 / 110700 se han descrito composiciones inmunogénicas que comprende diferentes antígenos de Chlamydia. Los antígenos de Chlamydia también se han descrito en el documento WO 99/028475 para la detección y / o identificación de Chlamydia trachomatis.

Por tanto, es un objetivo de la invención proporcionar antígenos adicionales para su uso en las vacunas contra Chlamydia.

Divulgación de la invención

La invención proporciona una proteína para su uso en terapia para la infección por Chlamydia, en la que la proteína comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95 % o mayor con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o

(c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a una proteína de la invención, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína o anticuerpo de la invención, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

La invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de la invención, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

La invención también proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico o vector de la invención, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

La invención también proporciona una composición que comprende una proteína, anticuerpo, molécula de ácido nucleico, vector o célula huésped de la invención, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

La invención también proporciona un procedimiento para diagnosticar la infección por Chlamydia in vitro, que comprende:

(a) elevar un anticuerpo contra una proteína que comprende

(i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95 % o mayor con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o

(iii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64;

(b) poner en contacto el anticuerpo de la etapa (a) con una muestra biológica sospechosa de estar infectada con Chlamydia en ciertas condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo-antígeno; y

(c) detectar dichos complejos, en el que la detección de dicho complejo es indicativa de infección por Chlamydia.

En el presente documento también se divulgan antígenos de Chlamydia para su uso en el tratamiento, prevención y / o diagnóstico de la infección por Chlamydia. En particular, en el presente documento se desvelan uno o más de los antígenos siguientes (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30) de C. trachomatis para el tratamiento, prevención o diagnóstico de la infección por Chlamydia (y, en particular, la infección por C. trachomatis): CT153, CT601, CT279, CT443, CT372, CT456, CT381, C^t255, CT341, CT716, CT745, CT812, CT869, CT387, CT166, CT175, CT163, CT214, CT721, CT127, CT043, CT823, CT600, CT711, CT114, CT480, CT089, CT734 y CT016, por ejemplo, uno o más de CT153, CT601, CT279, CT443, CT372, CT456, CT381, CT255, CT341, CT716 y CT745.

En particular, la invención proporciona proteínas de la invención para su uso en el tratamiento y prevención de la infección por Chlamydia (y, en particular, la infección por C. trachomatis). La inmunización con las proteínas puede, preferentemente, inducir una respuesta mediada por linfocitos Th1 CD4+ específica contra Chlamydia.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT733" y se anota como una proteína hipotética de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT153" y se anota como MACPF / complejo de ataque a la membrana (MAC) / perforina de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT601" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT279" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT443" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT372" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT456" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT381" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 40 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT255" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT341" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT716" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46 respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT745" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SE ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT387" de C. trachomatis y se anota como proteína hipotética. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 50, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT812" de C. trachomatis y se anota como proteína polimórfica de la membrana externa. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 52, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT869" de C. trachomatis y se anota como proteína polimórfica de la membrana externa. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT166" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 56, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT175" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 155 y la SEQ ID NO: 156, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT163" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 159 y la SEQ ID NO: 160, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT214" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 163 y la SEQ ID NO: 164, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT721" de C. trachomatis. En otra realización de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la proteína comprende la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 167 y la SEQ ID NO: 168, respectivamente. Esta proteína también se conoce como "CT127" de C. trachomatis.

En algunas realizaciones, la proteína es una variante de una proteína como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la proteína puede comprender una o más mutaciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones) en la secuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 136, 140, 156, 160, 164 o 168, por ejemplo, en la secuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 40, 42, 44 o 46. Las mutaciones preferentes son aquellas que no producen un cambio conformacional significativo en la proteína, de forma que la proteína de la invención retenga la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria contra la proteína de Chlamydia de tipo salvaje. Las proteínas que tienen las secuencias presentadas en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 y 56 son proteínas de tipo salvaje.

En algunas realizaciones, la una o más mutaciones se presentan en la parte N-terminal de la proteína, por ejemplo, entre los restos 1 y 20 de la proteína, entre los restos 21 y 40, entre los restos 41 y 60, entre los restos 1 y 60 o entre los restos 1 y 40 de la proteína. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones se presentan en la parte C-terminal de la proteína, por ejemplo, entre los 20 restos en C-terminal de la proteína, entre los restos 21 y 40 del extremo C, entre los restos 41 y 60 del extremo C; entre los restos 1 y 60 del extremo C o entre los restos 1 y 40 del extremo C de la proteína.

Preferentemente, las secuencias de aminoácidos contienen menos de veinte mutaciones (por ejemplo, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1). Cada mutación implica, preferentemente, un solo aminoácido y es, preferentemente, una mutación puntual. Cada una de las mutaciones puede ser de manera independiente una sustitución, una inserción o una deleción. Las mutaciones preferentes son sustituciones de un solo aminoácido. Las proteínas también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) deleciones de un solo aminoácido en relación con las secuencias de la Chlamydia. Las proteínas también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con las secuencias de Chlamydia. Las deleciones, sustituciones o inserciones pueden encontrarse en el extremo N-terminal y/o C-terminal o pueden encontrarse entre los dos extremos. Por lo tanto, un truncamiento es un ejemplo de una deleción. Los truncamientos pueden implicar una deleción de hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C (por ejemplo, 1-10, 11-40, 41-70, 71-100 o más aminoácidos).

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser en uno cualquiera de los demás diecinueve aminoácidos de origen natural. Preferentemente, una mutación por sustitución es una sustitución conservadora. Como alternativa, una mutación por sustitución es una sustitución no conservadora. Normalmente, una sustitución conservativa se define como una sustitución que introduce un aminoácido que tiene propiedades químicas lo suficientemente similares, por ejemplo, que tiene una cadena lateral relacionada (por ejemplo, se puede reemplazar un aminoácido básico, cargado positivamente por otro aminoácido básico, cargado positivamente), a fin de preservar la estructura y la función biológica de la molécula. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante en la actividad biológica. Otros ejemplos de sustituciones conservadoras que se pueden usar en la invención se presentan en la Tabla 1.

TABLA 1

continuación

Ejemplos de sustituciones no conservadoras que pueden ussarse en la invención incluyen la sustitución de un aminoácido polar no cargado con un aminoácido no polar, la sustitución de un aminoácido no polar por un aminoácido polar no cargado, la sustitución de un aminoácido ácido por un aminoácido básico y la sustitución de un aminoácido básico por un aminoácido ácido.

Las mutaciones también se pueden introducir paa mejorar la estabilidad, por ejemplo, la inserción de enlaces disulfuro (van den Akker y col. Protein Sci., 1997, 6:2644-2649). Por ejemplo, la proteína puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene la identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 136, 140, 156, 160, 164, y 168, por ejemplo, de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 40, 42, 44 y 46. El grado de identidad de la secuencia es, preferentemente, superior al 50 % (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más). Estas proteínas incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. La identidad entre proteínas se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una búsqueda afín de huecos con parámetros de penalización de apertura de hueco = 12 y penalización de extensión de hueco = 1.

La proteína de Chlamydia de la invención puede comprender uno o más derivados de aminoácidos. Por "derivado de aminoácido" se entiende un aminoácido o entidad química similar a un aminoácido diferente de uno de los 20 aminoácidos naturales codificados genéticamente. En particular, el derivado de aminoácido puede contener restos alquilo no sustituidos, lineales, ramificados o cíclicos, y pueden incluir uno o más heteroátomos. Los derivados de aminoácidos pueden obtenerse de novo u obtenerse de fuentes comerciales (Calbiochem-Novabiochem AG; Bachem).

En algunas realizaciones, la proteína variante es una proteína homóloga de C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. muridarum o C. suis.

La invención proporciona además una proteína que comprende o consiste en un fragmento de una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma. En el presente documento se desvela una proteína que comprende o consiste en un fragmento de una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 136, 140, 156, 160, 164 o 168, por ejemplo, de una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 40, 42, 44 o 46, o un fragmento de una variante de la misma. El fragmento debe contener al menos n aminoácidos consecutivo de la proteína y, dependiendo de la secuencia particular, n es 6 o más (por ejemplo, 8, 11, 16, 31, 51, 76, 121, 181,231,281, 331, 381,431,440, 445, 446, 481, 531, 581, 631, 681, 731,781,801, 806, 808 o más). El fragmento es n-1 aminoácido o menos de longitud, en el que n = el número de aminoácidos en la proteína de longitud completa (por ejemplo, n-5, n-20, n-50, n-110, n-180, n-240, n-310, n-380, n-445, n-515, n-595, n-675, n-745, n-785, n-800 aminoácidos o menos de longitud). Preferentemente, el fragmento uno o más epítopos de la proteína. Preferentemente, uno o más de los epítopos se encuentran en un epítopo del MHC de clase II, por ejemplo, un epítopo de linfocitos T CD4+. En algunas realizaciones, el fragmento comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 64. En el presente documento también se desvela un fragmento que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166 y 170. En el presente documento se desvela una proteína que comprende o consiste en un fragmento de una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos citada en la SEQ ID NO: 122. La Tabla 3 a continuación muestra qué fragmentos corresponden a qué secuencias de longitud completa.

TABLA 3

continuación

La proteína de la invención, por ejemplo, la proteína variante o el fragmento, es, preferentemente, inmunogénica.

El término "inmunogénico" en el contexto de "una variante inmunogénica" y "fragmento inmunogénico", se utiliza para indicar que la proteína es capaz de provocar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta mediada por células y/o de anticuerpos, contra la proteína de Chlamydia de tipo salvaje de la que deriva, por ejemplo, cuando se usa para inmunizar a un sujeto (preferentemente, un mamífero, más preferentemente, un ser humano o un ratón). Por ejemplo, la proteína de la invención (por ejemplo, la variante o fragmento) es, preferentemente, capaz de estimular in vitro las células CD4+ IFNy+ en esplenocitos purificados de ratones infectados con C. trachomatisvivos a un nivel comparable al de la proteína de Chlamydia de tipo salvaje. La proteína de la invención conserva, preferentemente, la capacidad de provocar anticuerpos que reconocen la proteína de tipo salvaje. Por ejemplo, la proteína de la invención provoca, preferentemente, anticuerpos que pueden unirse y, preferentemente, neutralizar la actividad de la proteína de tipo salvaje. En una realización adicional, la proteína de la invención puede provocar anticuerpos que pueden neutralizar la infectividad y/o virulencia de Chlamydia. En algunas realizaciones, los anticuerpos son capaces de reaccionar de forma cruzada con la proteína de la invención y la proteína de tipo salvaje, pero sin otra proteína homóloga (por ejemplo, de otra especie de Chlamydia). En otras realizaciones, los anticuerpos tienen reactividad cruzada con la proteína de tipo salvaje y con proteínas homólogas de otras especies de Chlamydia. En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen reactividad cruzada con la proteína de tipo salvaje y con proteína homóloga de otros organismos (por ejemplo, de E. coli o H.influenzae). Los ratones inmunizados con la proteína de la invención y la proteína de Chlamydia de tipo salvaje muestran, preferentemente, títulos de anticuerpos específicos de antígeno similares. Los títulos y las especificidades de los anticuerpos pueden medirse utilizando procedimientos estándar disponibles en la técnica. Otros procedimientos para probar la inmunogenicidad de proteínas son bien conocidos en la técnica.

Por ejemplo, la variante o fragmento es capaz, preferentemente, de provocar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta mediada por células y/o de anticuerpos, contra la proteína de Chlamydia de tipo salvaje. En una realización, el fragmento es capaz de estimular in vitro células CD4+ IFNy+ en esplenocitos purificados de ratones infectados con C. trachomatis vivas a un nivel comparable al de la proteína de Chlamydia de tipo salvaje y / o conserva la capacidad de provocar anticuerpos que reconocen la proteína de tipo salvaje.

Preferentemente, la variante o el fragmento es capaz de inducir una respuesta mediada por las células CD4-Th1 específicas contra la proteína de Chlamydia de tipo salvaje.

Las proteínas de la invención pueden, por supuesto, prepararse por diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir del huésped nativo, purificación de cultivo celular, síntesis química etc.) y en varias formas (por ejemplo, nativas, fusiones, glucosiladas, no glucosiladas, lipidadas, no lipidadas, fosforiladas, no fosforiladas, miristoiladas, no miristoiladas, monoméricas, multiméricas, en partículas, desnaturalizadas, etc.). En general, las proteínas de fusión recombinantes de la presente invención se preparan como una proteína de fusión a GST y / o una proteína de fusión marcada con His.

Las proteínas de la invención se preparan, preferentemente, en forma purificada o sustancialmente purificada (es decir, sustancialmente libres de proteínas de la células huésped y/u otras proteínas de Chlamydia) y, generalmente, son al menos aproximadamente un 50 % puras (en peso) y normalmente al menos aproximadamente un 90 % puras, es decir, menos de aproximadamente el 50 % y, más preferentemente, menos de aproximadamente el 10 % (por ejemplo, 5 %) de una composición está formada por otros polipéptidos expresados. Por lo tanto, los antígenos en las composiciones se separan del organismo completo con el que se expresa la molécula.

Aunque la expresión de las proteínas de la invención puede tener lugar en Chlamydia, la invención usa, preferentemente, un huésped heterólogo. El huésped heterólogo puede se procariota (por ejemplo, una bacteria) o eucariota. Es, preferentemente, E. coli, pero otros huéspedes adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Micobacterias (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc.

El término "polipéptido" o "proteína" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por medio de intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse en forma de cadenas individuales o de cadenas asociadas.

La invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia -P-Q- o -Q-P-, en los que: -P- es una secuencia de aminoácidos, como se ha definido anteriormente y -Q- no es una secuencia como se ha definido anteriormente, es decir, la invención proporciona proteínas de fusión. En los casos en los que el codón del extremo N-terminal de -P- no es ATG, pero este codón no está presente en el extremo N-terminal de un polipéptido, puede traducirse como el aminoácido estándar para ese codón en lugar de como Met. En los casos en los que este codón se encuentre en el extremo N-terminal de un polipéptido, sin embargo, se traducirá como Met. Los ejemplos de restos -Q- incluyen, pero sin limitación, marcadores de histidina (es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), proteína de unión a maltosa o glutatión S-transferasa (GST).

Las proteínas de la invención se pueden unir a un soporte sólido. Pueden comprender un marcador detectable (por ejemplo, un marcador radioactivo o fluorescente, o un marcador de biotina).

Anticuerpos

Las proteínas de la invención inducen anticuerpos que se pueden usar como una vacuna capaz de neutralizar la actividad de los CE infecciosos. Como alternativa, los anticuerpos se pueden usar en un procedimiento in vitro para el diagnóstico de la infección por Chlamydia. Por lo tanto, la invención proporciona anticuerpos para su uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de la infección por Chlamydia. Preferentemente, la infección es por C. trachomatis, pero, como alternativa, puede ser por C. psittaci, C. pecorum, C. muridarum o C. suis.

El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de las mismas que son capaces de unirse a un antígeno. Estos incluyen moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) (Winter y col., (1991) Nature 349: 293-99; documento US 4.816.567); fragmentos F(ab')2 y F(ab) y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes (Inbar y col., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69:2659-62; Ehrlich y col., (1980) Biochem 19:4091-96); moléculas Fv de cadena única (sFv) (Huston y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5897-83); construcciones de fragmentos de anticuerpo diméricas y triméricas; minicuerpos (Pack y col., (1992) Biochem 31, 1579-84; Cumber y col., (1992) J. Immunology 149B, 120-26); moléculas de anticuerpos humanizados (Riechmann y col., (1988) Nature 332, 323-27; Verhoeyan y col., (1988) Science 239, 1534-36; y el documento GB 2.276.169); y cualquier fragmento funcional obtenido de dichas moléculas, así como los obtenidos por procedimientos no convencionales como la expresión en fagos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los procedimientos para obtener anticuerpos monoclonales se conocen bien en la técnica. Se prefieren anticuerpos humanizados o completamente humanos.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse por cualquier medio adecuado. El anticuerpo puede incluir un marcador detectable.

También se proporciona un procedimiento para preparar anticuerpos que comprende inmunizar a un mamífero (tal como un ratón o un conejo) con una proteína de la invención y obtener anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, los antisueros policlonales se pueden obtener introduciendo sangre del animal inmunizado en un recipiente de vidrio o plástico, incubando la sangre a 25 °C durante una hora, seguido de incubación a 4 °C durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, 1.000 g durante 10 minutos). Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando el procedimiento estándar de Kohler y Milstein [Nature (1975) 256:495-96], o una modificación del mismo, o mediante cualquier procedimiento adecuado.

Ácidos nucleicos

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína o anticuerpo de la invención. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención preferentemente comprende o consiste en la SEQ ID NO:1. En el presente documento se desvela una secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 135, 139, 155, 159, 163 o 167, por ejemplo, de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 39, 41, 43 o 45. En el presente documento también se desvela una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención que comprende o consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 y 133. La invención también proporciona ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que tienen identidad de secuencia con tales secuencias de nucleótidos de la invención. La identidad entre secuencias se determina, preferentemente, mediante el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman como se ha descrito anteriormente. Dichos ácidos nucleicos incluyen aquellos que utilizan codones alternativos para codificar el mismo aminoácido.

La invención también proporciona un ácido nucleico que puede hibridar con un ácido nucleico de la invención. Las reacciones de hibridación pueden llevarse a cabo en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación ampliamente conocida y publicada.en la técnica (por ejemplo, página 7.52 de Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C, 55 °C y 68 °C; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x Ss C, 1 x SSC, 0,1 x SSC (siendo SSC NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida del 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.707.829, Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col. eds., 1987) Supplement 30, Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148 y documento WO 94/03622, etc.).

El ácido nucleico puede ser utilizado en las reacciones de hibridación (por ejemplo, transferencias Northern y Southern, o en micromatrices de ácidos nucleicos o "chips de genes") o en reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, NASBA, TMA) etc.

En el presente documento también se desvela un ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo, para antisentido o sondado o para su uso como cebadores). En una realización, el ácido nucleico es complementario a la longitud total del ácido nucleico descrito anteriormente.

El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede marcarse, por ejemplo, con un marcador radioactivo o fluorescente. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico va a usarse como cebador o sonda, por ejemplo en PCR, LCR o TMA.

La expresión "ácido nucleico" incluye, en general, una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN. También incluye análogos de ADN o ARN, tales como aquellos que contienen esqueletos modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o fosforotioatos) o bases modificadas. Por lo tanto, la invención incluye ARNm, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. EN los casos en los que el ácido nucleico de la invención adopta la forma de ARN, puede tener o no un remate 5'.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, monocatenarios, bicatenarios, vectores, cebadores, sondas etc.). A menos que se especifique o requiera otra cosa, cualquier realización de la invención que utiliza un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias que conforman la forma bicatenaria. Los cebadores y las sondas son por lo general monocatenarios, al igual que los ácidos nucleicos antisentido.

Los ácidos nucleicos de la invención se preparan, preferentemente, en una forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libres de ácidos nucleicos naturales, particularmente de otros ácidos nucleicos de Chlamydia o de células huésped), siendo en general al menos aproximadamente un 50 % puros (en peso) y normalmente, al menos aproximadamente un 90 % puros.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo, por síntesis química (por ejemplo, síntesis de fosforamidita de a Dn ) en su totalidad o en parte, mediante digestión de ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), mediante unión de ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas), procedentes de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc. La invención proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o expresión) y células huésped transformadas con tales vectores. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser parte de un vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñada para la transducción / transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de clonación", que están diseñados para el aislamiento, la propagación y la replicación de los nucleótidos insertados, "vectores de expresión", que están diseñados para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula hospedadora, "vectores víricos", que están diseñados para dar como resultado la producción de un virus recombinante o una partícula pseudovírica o "vectores lanzadera", que comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferidos son plásmidos.

También se proporciona una célula huésped y un ácido nucleico de la invención. Una "célula hospedadora" incluye una célula individual o un cultivo celular, que puede ser o ha sido el receptor de ácido nucleico exógeno. Las células huésped incluyen la progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en la complementaria del ADN total) a la célula parental original debido un cambio y/o mutación natural, accidental o deliberado. Las células huésped incluyen células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con el ácido nucleico de la invención, por ejemplo, con un vector de la invención.

Cuando un ácido nucleico es ADN, se apreciará que "U" en una secuencia de ARN será reemplazado por "T" en el ADN. De manera similar, cuando un ácido nucleico es ARN, se apreciará que "T" en una secuencia de ADN será reemplazada por "U" en el ARN.

El término "complemento" o "complementario", cuando se usa en relación con ácidos nucleicos, se refiere al emparejamiento de bases de Watson-Crick. Por lo tanto, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U) y el complemento de T (o U) es A. También es posible usar bases tales como I (la purina, inosina), por ejemplo, para complementar a las pirimidinas (C o T).

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar, por ejemplo: para producir polipéptidos; como sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como cebadores o sondas de ADN monocatenario; o como oligonucleótidos formadores de triple cadena.

Se desvela también en el presente documento un procedimiento para producir un ácido nucleico de la invención, en el que el ácido nucleico se sintetiza en su totalidad o en parte usando medios químicos.

Para determinadas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos tienen, preferentemente, 24 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 60, 120, 240, 390, 540, 720, 900, 1200, 1320, 1500, 1800, 2100, 2400, 2415 nucleótidos o más).

Para determinadas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos tienen, preferentemente, como máximo 2430 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 2427, 2394, 2250, 2034, 1450, 1300, 1150, 1000, 850, 700, 500 nucleótidos o menos).

Los cebadores y sondas desvelados en el presente documento y otros ácidos nucleicos utilizados para la hibridación tienen, preferentemente, entre 10 y 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos).

Composiciones inmunogénicas y medicamentos

La proteína, anticuerpo y / o ácido nucleico o medicamento pueden estar en forma de una composición. Estas composiciones pueden ser adecuadas como composiciones inmunogénicas (por ejemplo, vacunas) o como reactivos de diagnóstico.

Preferentemente, la composición es una composición inmunogénica. Es particularmente ventajoso usar una proteína de la invención en una composición inmunogénica, tal como una vacuna. También se prevé que la composición inmunogénica pueda comprender un ácido nucleico que codifique una proteína de la invención, de modo que la proteína se genera in vivo.

Una composición inmunogénica de la invención comprende una proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector y / o célula huésped según la invención. Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas. Cuando la composición inmunogénica es para su uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un lactante) o un adolescente; donde la composición inmunogénica es para su uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una composición inmunogénica destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc.

En algunas realizaciones, la composición inmunogénica es para el tratamiento o la prevención de la infección por Chlamydia o una afección asociada (por ejemplo, tracoma, ceguera, cervicitis, enfermedad inflamatoria pélvica, esterilidad, embarazo ectópico, dolor pélvico crónico, salpingitis, uretritis, epididimitis, neumonía infantil, pacientes infectados con carcinoma cervical de células escamosas y / o infección por VIH, etc.), preferentemente, infección por C. trachomatis. La composición inmunogénica puede ser eficaz contra C. pneumoniae.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas en una cantidad inmunológicamente eficaz de la proteína de la invención, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y físico del individuo que se vaya a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico tratante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de pruebas habituales.

Los antígenos en la composición estarán normalmente presentes a una concentración de al menos 1 pg/ml cada uno.

En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para generar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.

El tratamiento de dosificación puede ser una pauta en una sola dosis o una pauta en múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En una pauta multidosis, las diversas dosis pueden administrarse por vías iguales o diferentes, por ejemplo, un cebado parenteral y un refuerzo mucosal, un cebado mucosal y un refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán típicamente al menos con 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En algunas realizaciones, se proporcionan tres o más dosis (por ejemplo, tres, cuatro o cinco) dosis. En algunas realizaciones, se administran tres dosis por vía intramuscular a intervalos de 2 semanas, por ejemplo, tres dosis de 10-20 |jg de cada proteína, a intervalos de 2 semanas, administradas por vía intramuscular.

El pH de una composición inmunogénica está, preferentemente, entre 6 y 8, preferentemente de aproximadamente 7. El pH se puede mantenerse por medio del uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o apirógena. La composición puede ser isotónica con respecto a los seres humanos.

Las composiciones inmunogénicas de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido) o por vía mucosa, tal como rectal, oral (por ejemplo, comprimido, nebulizador), vaginal, tópica, transdérmica (véase, por ejemplo, el documento WO99 / 27961) o transcutánea (véanse, por ejemplo, los documentos WO02 / 074244 y WO02 / 064162), intranasal (véase, por ejemplo, el documento WO03 / 028760), ocular, auditiva, pulmonar u otra administración mucosal.

Las infecciones por Chlamydia afectan a diversas áreas del cuerpo y, por lo tanto, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, también se pueden preparar vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada). La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, en forma de pomada, crema o polvo. La composición se puede preparar para administración oral, por ejemplo en forma de un comprimido o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, en forma de un inhalador, usando un polvo fino o un spray. La composición puede prepararse en forma de un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como gotas.

En el presente documento también se desvela un dispositivo de administración precargado con una composición inmunogénica de la invención.

En el presente documento también se desvela un kit que comprende un primer componente y un segundo componente, en el que ni el primer componente ni el segundo componente es una composición de la divulgación como se describe en el presente documento, pero en el que el primer componente y el segundo componente pueden combinarse para proporcionar una composición de la invención como se describe en el presente documento. El kit puede incluir adicionalmente un tercer componente que comprende uno o más de lo siguiente: instrucciones, jeringuilla u otro dispositivo de suministro, adyuvante o solución de formulación farmacéuticamente aceptable.

Una composición como la descrita anteriormente se puede usar alternativamente y / o adicionalmente para el diagnóstico de infección por Chlamydia.

Combinaciones con otros antígenos

La eficacia terapéutica o diagnóstica de un antígeno de Chlamydia se puede mejorar combinando con un antígeno de Chlamydia diferente. Por ejemplo, la inmunogenicidad de una proteína de la invención puede mejorarse combinándola con otra proteína de la invención o con otro antígeno conocido de Chlamydia. Por tanto, la invención incluye una composición inmunogénica que comprende antígenos de Chlamydia, comprendiendo dicha combinación una proteína de la invención en combinación con uno o más antígenos de Chlamydia adicionales. El uno o más antígenos de Chlamydia adicionales que están presentes en la composición pueden estar en forma de una proteína o ácido nucleico o cualquier otra forma adecuada. Una proteína de la invención se puede combinar con una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más) proteínas diferentes de la invención y / o con una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más) de otros antígenos conocidos de Chlamydia. Por ejemplo, se proporciona una composición inmunogénica que comprende dos o más proteínas (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más) de la invención. Como alternativa y/o adicionalmente, las proteínas de la invención pueden proporcionarse en la composición en forma de sus correspondientes ácidos nucleicos, vectores, células huésped, etc. También se proporciona una proteína o ácido nucleico de la invención para un uso como se ha descrito anteriormente, en el que la proteína o ácido nucleico es para su uso en combinación con uno o más antígenos de Chlamydia adicionales (o sus ácidos nucleicos codificantes). El uno o más antígenos adicionales (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más antígenos adicionales) se pueden administrarse simultáneamente, por separado o secuencialmente con la proteína o el ácido nucleico de la invención, por ejemplo como una preparación combinada.

Asimismo, los anticuerpos de la invención se pueden usar en combinación con uno o más anticuerpos específicos de uno o más antígenos adicionales de Chlamydia para su uso en el diagnóstico de infecciones por Chlamydia.

En una realización, uno o más de los antígenos de Chlamydia adicionales se seleccionan de entre los antígenos presentados en la Tabla 2, o sus variantes. Por ejemplo, uno o más (por ejemplo, todos) de los antígenos adicionales se seleccionan de los antígenos de Chlamydia trachomatis enumerados en la Tabla 2, pero, como alternativa o adicionalmente, pueden seleccionarse de los antígenos de Chlamydia pneumoniae enumerados en la Tabla 2. En algunas realizaciones, el uno o más (por ejemplo, todos) de los antígenos adicionales se seleccionan entre los antígenos de Chlamydia trachomatis y / o los antígenos de Chlamydia pneumoniae enumerados en la Tabla 2 y CT387, CT812, CT869, CT166, CT175, CT163, CT214, CT721 y CT127. En una realización, uno o más de los uno o más antígenos adicionales se seleccionan de CT372, CT443, CT043, CT153, CT279, CT601, CT711, CT114, CT480, CT456, CT381, CT089, CT734, CT016, CT600, CT823, CT387, CT812, CT869, CT166, CT175, CT163, CT214, CT721 y CT127 (o sus variantes), por ejemplo, de CT372, CT443, CT043, CT153, CT279, CT601, CT711, CT114, CT480, CT456, CT381, CT089, CT734, CT016, CT600 y CT823. Estos antígenos adicionales se enumeran en la Tabla 2 y sus secuencias se exponen en la sección "Secuencias" que sigue a la Tabla 2. En una realización, una o más proteínas de la invención se combinan con CT089. En otra realización, una o más proteínas de la invención se combinan con CT089 y CT381 (o sus variantes). En algunas realizaciones, se usa el fragmento C-terminal de CT812 "CT812C" (por ejemplo, una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:122 o un fragmento o variante de la misma) en lugar de CT812 de longitud completa. En algunas realizaciones, se usan las siguientes combinaciones de antígenos (o sus variantes): CT733+CT601, CT733+CT279, CT733+CT443, CT733+CT372, CT733+CT456, CT733+CT381. En el presente documento también se desvelan las siguientes combinaciones de antígenos (o sus variantes): CT153+CT601, CT153+CT279, CT153+CT443, CT153+CT372, CT153+CT456, CT153+CT381, CT601+CT443, CT601+CT372, CT601+CT456, CT601+CT381, CT279+CT443, CT279+CT372, CT279+CT456, CT279+CT381, CT443+CT372, CT443+CT456, CT443+CT381, CT372+CT456, CT372+CT381, CT387+CT812+CT869, CT387+CT812C+CT869. Estas combinaciones se pueden usar en ausencia de cualquier otro antígeno de Chlamydia o en presencia de uno o más antígenos de Chlamydia adicionales. Las combinaciones particularmente preferidas son: (i) CT733+CT153; (ii) CT279+CT601 CT733+CT153; y (vii) CT823+CT733+CT043+CT456. En el presente documento también se desvelan las siguientes: (i) CT279+CT601; (ii) CT372+CT443; (iii) CT456+CT381; (iv) CT279+CT601+CT372+CT443; (v) CT387+CT812+CT869; y (vi) CT387+CT812C+CT869 (o sus variantes).

Las serovariantes humanas ("serovars") de C. trachomatis se dividen en dos biovariantes ("biovars"). Las serovars A-K provocan infecciones epiteliales principalmente en el tejido ocular (A-C) o el tracto urogenital (D-K). Las serovars L1, L2 y L3 son los agentes del linfogranuloma venéreo invasivo (LGV). En algunas realizaciones, uno o más de los antígenos de Chlamydia adicionales pueden, por ejemplo, ser de cualquiera de las serovars A-K o L1, L2 o L3. Uno o más de los antígenos de Chlamydia adicionales es, preferentemente, de la serovar D de C. trachomatis u otro serotipo epidemiológicamente prevalente.

En algunas realizaciones, uno o más de los antígenos de Chlamydia adicionales es un antígeno homólogo de C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. muridarum o C. suis.

En algunas realizaciones, TC0551 (el homólogo de C. muridarum de CT279) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. C. muridarum es la cepa adaptada para ratón de Chlamydia trachomatis. Aunque C. muridarum no es un patógeno humano, la infección por C. muridarum de ratones imita fenotípicamente muchos aspectos de la infección por C. trachomatis en seres humanos y se usa a menudo para medir las respuestas inmunoprotectoras contra C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0890 (el homólogo de C. muridarum de CT601) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0651 (el homólogo de C. muridarum de CT372) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0727 (el homólogo de C. muridarum de CT443) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0106 (el homólogo de C. muridarum de CT733) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0431 (el homólogo de C. muridarum de CT153) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0660 (el homólogo de C. muridarum de CT381) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0741 (el homólogo de C. muridarum de CT456) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0210 (el homólogo de C. muridarum de CT823) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0666 (el homólogo de C. muridarum de CT387) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. TC0666 está anotado como una proteína hipotética. En algunas realizaciones, TC0197 (el homólogo de C. muridarum de CT812) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. TC0197 se anota como proteína de membrana polimórfica de las proteínas de la familia D. En algunas realizaciones, TC0261 (el homólogo de C. muridarum de CT869) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. TC0261 se ha anotado como proteína de membrana polimórfica de las proteínas de la familia E / F. En algunas realizaciones, TC0313 (el homólogo de C. muridarum de CT043) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0889 (el homólogo de C. muridarum de CT600) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones, TC0210 (el homólogo de C. muridarum de CT823) se utiliza en lugar de la proteína de C. trachomatis. En algunas realizaciones en las que la composición comprende un único antígeno de Chlamydia, se usa el homólogo de C. muridarum en lugar del único antígeno de C. trachomatis. En algunas realizaciones en las que la composición comprende una combinación de antígenos de Chlamydia, el homólogo de C. muridarum se usa en lugar de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) o todos los antígenos de C. trachomatis.

Las combinaciones ventajosas de la invención son aquellas en las que dos o más antígenos (por ejemplo, dos, tres o cuatro antígenos) actúan sinérgicamente. Por lo tanto, la protección contra la Chlamydia lograda por su administración combinada supera la esperada por la mera adición de su eficacia protectora individual.

En algunas realizaciones, el uno o más antígenos de Chlamydia adicionales pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que es una variante de un antígeno de la Tabla 2 (es decir, tiene una identidad del 50 % o más (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con una secuencia presentada en la Tabla 2); y / o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de una secuencia presentada en la Tabla 2 o de una variante de un antígeno de la Tabla 2, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 350, 450, 550, 650, 750, 780, 800 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de una secuencia presentada en la Tabla 2. Preferentemente, el epítopo es un epítopo del MHC de clase II, por ejemplo, un epítopo de linfocitos T CD4+. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y / o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de una secuencia presentada en la Tabla 2, mientras retiene al menos un epítopo de una secuencia presentada en la Tabla 2. Otros fragmentos omiten de uno o más dominios de proteínas. Cuando un antígeno de Chlamydia adicional comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia completa de la Tabla 2 (por ejemplo, cuando comprende una secuencia con menos de 100 % de identidad de secuencia, o cuando es un fragmento de la misma), se prefiere en cada caso individual que el antígeno adicional de Chlamydia pueda provocar un anticuerpo que reconozca una proteína que tenga la secuencia completa del antígeno de la Tabla 2 de la que deriva.

En algunas realizaciones, la combinación de dos o más antígenos de Chlamydia se proporciona como una preparación combinada para la administración simultánea, separada o secuencial. La invención también proporciona así un kit que comprende una proteína de la invención y uno o más antígenos adicionales para la administración simultánea, separada o secuencial.

Los antígenos de Chlamydia usados en la invención pueden estar presentes en la composición como polipéptidos separados individuales. Como alternativa, la combinación puede estar presente como polipéptido híbrido en el que dos o más (es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más) de los antígenos se expresan como una sola cadena polipeptídica. Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales: en primer lugar, puede complementare un polipéptido que pueda ser inestable o que se exprese mal solo añadiendo un compañero híbrido adecuado que solvente el problema; en segundo lugar, la fabricación comercial se simplifica, ya que solo es necesario usar una expresión y purificación para producir dos polipéptidos que sean antigénicamente útiles. Pueden mezclarse entre sí diferentes polipéptidos híbridos en una sola formulación. En dichas combinaciones, un antígeno de Chlamydia trachomatis puede estar presente en más de un polipéptido híbrido y / o como un polipéptido no híbrido. Se prefiere, sin embargo, que un antígeno esté presente como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambos.

Los polipéptidos híbridos pueden representarse por la fórmula NH²-A-{-X-L-}ⁿ-B-COOH, en los que: al menos una X es una secuencia de aminoácidos de una proteína de Chlamydia según la invención como se ha descrito anteriormente; L es una secuencia de aminoácidos de enlazador opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.). Normalmente, n es 2 o 3.

En caso de que un resto -X- tenga una secuencia de polipéptido líder en su forma de tipo silvestre, esta puede incluirse u omitirse en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, se eliminarán los péptidos líder, salvo para los del resto -X- ubicado en el extremo N-terminal de la proteína híbrida, es decir, se conservará el polipéptido líder de X¹, pero los péptidos líder de X² ... Xⁿ se omitirán. Esto es equivalente a eliminar todos los péptidos líder y usar el péptido líder de X¹ como resto -A-.

Para cada n apariciones de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos enlazadora -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 el híbrido puede ser NH²-X¹-L¹-X²-L²-COOH, NH²-X¹-X²-COOH, NH²-X¹-L¹-X²-COOH, NH²-X¹-X²-L²-COOH, etc. Las secuencias de aminoácidos enlazadoras -L- normalmente serán cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, enlazadores de poliglicina (es decir, que comprenden Glyⁿ en la que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y marcadores de histidina (es decir, Hisⁿ en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de aminoácidos enlazadoras adecuadas. Un enlazador útil es GSGGGG, formándose el dipéptido Gly-Ser a partir de un sitio de restricción de SamHI, ayudando de este modo a la clonación y la manipulación y siendo el tetrapéptido (Gly)⁴ un enlazador de poliglicina típico.

-A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, 40 aminoácidos o menos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, marcadores de histidina, es decir, Hisⁿ en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de aminoácidos N-terminales adecuadas. En caso de que X¹ carezca de su propia metionina N-terminal, -A es, preferentemente, un oligopéptido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina en N-terminal.

-B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden marcadores de histidina, es decir, Hisⁿ donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas. Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de C-terminales adecuadas.

En los casos en los que se usan polipéptidos híbridos, los antígenos individuales dentro del híbrido (es decir, restos -X- individuales) pueden ser de una o más cepas. Cuando n=2, por ejemplo, X² puede ser de la misma cepa que X¹ o de una cepa diferente. Cuando n=3, las cepas pueden ser (i) X-ⁱ =X²=X³ (ii) X-ⁱ =X²^X³ (iii) X #X ²=X³ (iv) X #X ²^X³ o (v) X-f X3*X2, etc.

La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido de la invención. Además, la invención proporciona un ácido nucleico que puede hibridar con este ácido nucleico, preferentemente en condiciones de "alta rigurosidad" (por ejemplo, 65 °C en una solución 0,1 x SSC, de SDS al 0,5 %).

Otros componentes de la composición

Por lo tanto, las composiciones pueden ser farmacéuticamente aceptables. Normalmente incluirán componentes además de los antígenos, por ejemplo, incluirán típicamente uno o más vehículos o excipientes farmacéuticos. Una discusión exhaustiva de tales componentes está disponible en Remington The Science and Practice of Pharmacy.

Las composiciones se administrarán generalmente a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, las composiciones pueden haber estado en forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, después se cargan y se distribuyen y administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de uso. Por lo tanto, una composición de la invención puede estar seca, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservantes, tales como timerosal o 2-fenoxietanol. Se prefiere, sin embargo, que la vacuna se encuentre sustancialmente libre (es decir, que tenga menos de 5 |jg/ml) de material de mercurio, por ejemplo, libre de timerosal. Se prefieren especialmente las vacunas que no contienen mercurio. Se prefieren particularmente las vacunas sin conservantes.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10 ± 2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente, entre 240-360 mOsm/kg y más preferentemente, se encontrará en el intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Los tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición estará generalmente entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente apirógena que contiene, por ejemplo, <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis y preferentemente, <0,1 UE por dosis. La composición está preferentemente libre de gluten.

La composición puede incluir material para una sola inmunización o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit "multidosis"). En las disposiciones multidosis, se prefiere la inclusión de un conservante. Como alternativa (o además) de incluir un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para la extracción de material.

Las vacunas para humanos se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque se puede administrar una media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a los niños.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, descritos con más detalle más adelante.

Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" desveladas en la patente de Estados Unidos n.° 6355271). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., tomando las sales cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.). Se prefiere la adsorción a estas sales. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular en forma de una partícula de una sal metálica [documento WO00/23105]. Se pueden usar los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan solo por conveniencia, ya que tampoco es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase el capítulo 9 de Vaccine Design... (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867X. Plenum). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes "hidróxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que generalmente son al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Pueden obtenerse por precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal.

Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se observa en micrografías electrónicas de transmisión) es típica de los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pi de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es típicamente aproximadamente 11, es decir, el propio adyuvante tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Se han indicado capacidades de adsorción de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para los adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen en general una relación molar de PO^Al de entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y más preferentemente 0,95+0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO^Al de entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio generalmente será en partículas (por ejemplo, morfología de tipo placas como se observa en las micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo, aproximadamente 5-10 pm) después de cualquier adsorción de antígeno. Se han indicado capacidades de adsorción de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para los adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución del fosfato por el hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar según las condiciones de reacción y la concentración de los reactivos usados para preparar la sal por precipitación. El PZC también se altera cambiando la concentración de iones de fosfato libres en la solución (más fosfato = más PZC ácido) o añadiendo un tampón como un tampón de histidina (hace que el PZC sea más básico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invención tendrán generalmente un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, aproximadamente 5,7. Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar las composiciones de la divulgación pueden contener un tampón (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y libres de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuoso libres, por ejemplo, presentes en una concentración entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más preferentemente aproximadamente de 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio. La invención puede usar una mezcla de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una relación en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente es, preferentemente, inferior a 10 mg/ml, por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferente es entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

Los fosfatos de aluminio son particularmente preferidos, particularmente en composiciones que incluyen un antígeno sacárido de H. influenzae, y un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4 / Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. Se puede usar la adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio, por ejemplo, entre 50 y 100 |jg de Al3+ por conjugado por dosis. Cuando hay más de un conjugado en una composición, no todos los conjugados tienen que ser adsorbidos.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión oleosa adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [Capítulo 10 de Vaccine Design ... (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867X. Plenum; véase también el documento WO90 / 14837] (5 % de escualeno, 0,5 % de Tween 80 y 0,5 % de Span 85, formulado en partículas submicrónicas usando un microfluidizador). También se puede usar el adyuvante completo de Freund (c Fa ) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA).

Se conocen diversos adyuvantes de emulsión de aceite en agua, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el aceite o los aceites y el tensioactivo o los tensioactivos biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión generalmente tienen menos de 5 pm de diámetro, e idealmente tienen un diámetro inferior al micrómetro, logrando estos pequeños tamaños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotitas con un tamaño inferior a 220 nm, ya que pueden someterse a esterilización por filtración.

La emulsión puede comprender aceites tales como los de un animal (como el pescado) o una fuente vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nueces. El aceite de jojoba se puede usar por ejemplo obtenido del grano de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede usar el aceite de otros granos de cereales como el trigo, la avena, el centeno, el arroz, el teff, el triticale y similares. Los ésteres de glicerol de ácidos grasos de 6-10 carbonos y el 1,2-propanodiol, aunque no se producen de forma natural en los aceites de semillas, pueden prepararse por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales adecuados a partir de los aceites de nueces y semillas. Las grasas y los aceites de la leche de mamífero son metabolizables y, por tanto, pueden usarse en la práctica de esta invención. Los procedimientos de separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena, como el espermaceti, ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en el presente documento. Un número de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado, insaturado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferente en el presente documento. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también es un aceite preferente. Los aceites de pescado, incluidos el escualeno y el escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o pueden obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica. Otros aceites preferentes son los tocoferoles (véase a continuación). Se pueden usar mezclas de aceites.

Los tensioactivos se pueden clasificar por su 'HLB' (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferentes de la divulgación tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La invención se puede usar con tensioactivos, que incluyen, pero sin limitaciones: los tensioactivos de los ésteres de polioxietileno sorbitán (comúnmente denominados Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP) y/u óxido de butileno (OB), comercializados con el nombre comercial DOWFAX™, como los copolímeros de bloques lineales OE/OP; los octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiílo) repetitivos, siendo octoxinol-9 (Triton X-100 o toctilfenoxipolietoxietanol) de particular interés; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630 / NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie Tergitol™ NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleílo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), tal como el trioleato de sorbitán (SPAN 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos preferentes para incluir en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Se pueden usar mezclas de tensioactivos, por ejemplo mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilensorbitano tal como monooleato de polioxietilensorbitano (Tween 80) y un octoxinol, tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietileno sorbitán y/o un octoxinol.

Las cantidades preferentes de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de polioxietileno sorbitán (tales como Tween 80) de 0,01 a 1 %, en particular aproximadamente 0,1 %; octil o nonilfenoxi polioxietanoles (como Triton X-100 u otros detergentes de la serie Triton) de 0,001 a 0,1 %, en particular 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) de 0,1 a 20 %, preferentemente 0,1 a 10 % y en particular 0,1 a 1 % o aproximadamente 0,5 %. Los adyuvantes de emulsión preferidos tienen un tamaño de gota promedio de <1 pm, por ej. <750 nm, < 500 nm, < 400 nm, < 300 nm, < 250 nm, < 220 nm, < 200 nm, o menor. Estos tamaños de gotita pueden lograrse oportunamente mediante técnicas tales como microfluidización.

Los adyuvantes de emulsión de aceite en agua específicos útiles con la invención incluyen, pero sin limitación: • Una emulsión submicrónica de escualeno, Tween 80, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente el 0,5% de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,5% de Span 85. En términos de peso, estas relaciones se convierten en 4,3 % de escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como "MF59" (documento WO90 / 14837, Podda y Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203, Podda (2001) Vaccine 19: 2673­ 2680; como se describe con más detalle en el Capítulo 10 de Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) y el capítulo 12 de Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan). La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones de citrato, por ejemplo, tampón de citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y Tween 80. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo, al 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10 % de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0,3 a 3 % de Tween 80, y la relación en peso de escualeno:tocoferol es preferentemente <1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y Tween 80 pueden estar presentes en una relación de volumen de aproximadamente 5:2. Una emulsión de este tipo se puede fabricar disolviendo Tween 80 en PBS para obtener una solución al 2 %, luego mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), luego microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrónicas, por ejemplo, con un diámetro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo, Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación de masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("Pluronic™ L121"). La emulsión puede formularse en solución salina tamponada con fosfato, a pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de administración útil para los dipéptidos de muramilo y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" (Allison y Byars (1992) Res Immunol 143:519-25) (0,05-1 % de Thr-MDP, 5 % de escualano, 2,5 % de Pluronic L121 y 0,2 % de polisorbato 80). También se puede usar sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" (Hariharan y col. (1995) Cancer Res 55:3486-9) (5 % de escualeno, 1,25% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrofílico de éter alquílico de polioxietileno (por ejemplo, éter cetoestearílico de polioxietileno (12) y un tensioactivo no iónico hidrófobo (por ejemplo, un éster de sorbitán o éster de manida, tal como monooleato de sorbitán o "Span 80"). La emulsión es, preferentemente, termorreversible y/o tiene al menos el 90 % de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño inferior a 200 nm (documento US-2007/014805). La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltósido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglicósido. Dichas emulsiones pueden ser liofilizadas.

• Una emulsión del documento US-2007 / 014805.f escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care (Suli y col. (2004) Vaccine 22(25-26):3464-9). La concentración final (peso) de estos componentes en las vacunas adyuvadas es 5 % de escualeno, 4 % de poloxámero 105 (poliol plurónico) y 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido caprílico/cáprico).

• Una emulsión que tiene de 0,5-50 % de un aceite, 0,1-10 % de un fosfolípido y 0,05-5 % de un tensioactivo no iónico. Como se describe en el documento WO95/11700, los componentes de fosfolípidos preferentes son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños de gotita de submicrónicos son ventajosos.

• Una emulsión submicrónica de aceite en agua de un aceite no metabolizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como la lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tales como QuilA saponina, colesterol, un conjugado saponina-lipófilo (como GPI-0100, descrito en la patentes de Estados Unidos 6.080.725, producido por la adición de amina alifática a la desacilsaponina a través del grupo carboxilo del ácido glucurónico), bromuro de dimetidiocitadecilaminio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina. • Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) se asocian como micelas helicoidales (documentos WO2005/097181).

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipofílico no iónico y un tensioactivo hidrofílico no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno) (documento WO2006/113373).

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrofílico no iónico y un tensioactivo lipófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno) (Wu y col. (2004) Antiviral Res. 64(2):79-83).

En algunas realizaciones, una emulsión se puede mezclar con el antígeno de manera extemporánea, en el momento de la entrega, y por lo tanto, el adyuvante y el antígeno se pueden mantener por separado en una vacuna embalada o distribuida, lista para la formulación final en el momento de su uso. En otras realizaciones, una emulsión se mezcla con antígeno durante la fabricación y, por lo tanto, la composición se embala en forma líquida adyuvada. El antígeno generalmente estará en una forma acuosa, de modo que la vacuna se prepare finalmente mezclando dos líquidos. La relación de volumen de los dos líquidos para mezclar puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5) pero generalmente es de aproximadamente 1:1. Cuando se dan concentraciones de componentes en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son típicamente para una composición no diluida, y la concentración después de la mezcla con una solución de antígeno disminuirá de este modo. En los casos en los que se vaya a preparar una composición de manera extemporánea antes de su uso (por ejemplo, cuando se presenta un componente en forma liofilizada) y se presenta en forma de kit, el kit puede comprender dos viales o puede comprender una jeringuilla precargada y un vial, usándose los contenidos de la jeringuilla para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.

Cuando una composición incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los a-, p-, y-, 6-, £- o ^-tocoferoles, pero se prefieren los a-tocoferoles. El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se pueden usar tanto D-atocoferol como DL-a-tocoferol. Los tocoferoles se incluyen ventajosamente en vacunas para su uso en pacientes ancianos (por ejemplo, de 60 años o más) porque se ha informado que la vitamina E tiene un efecto positivo en la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes (Han y col. (2005) Impact of Vitamin E on Immune Function and Infectious Diseases in the Aged at Nutrition, Immune functions and Health EuroConference, París, 9-10 de junio de 2005). También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones (documento US-6630161). Un a-tocoferol preferente es DL-a-tocoferol, y la sal preferente de este tocoferol es el succinato. Se ha descubierto que la sal de succinato coopera con ligandos relacionados con TNF in vivo.

C. Formulaciones de saponina (capítulo 22 de Vaccine Design... (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867X. Plenum)

Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glicósidos de esterol y glicósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso las flores de una amplia gama de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol de Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvantes. La saponina también se puede obtener en el mercado de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como Stimulon™.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Las fracciones purificadas específicas que usan estas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, Qh-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se describe en el documento US 5.057.540. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como el colesterol (documento WO96 / 33739).

Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISIS) (capítulo 23 de Vaccine Design... (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867^x . Plenum). Los ISCOM también incluyen típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede usarse en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen con más detalle en Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203; Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680; Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X); Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan; Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25; Hariharan y col. (1995) Cancer Res 55:3486-9; documento US-2007/014805; Suli y col. (2004) Vaccine 22(25-26):3464-9; documento WO95/11700; patente de Estados Unidos 6.080.725; documento WO2005/097181; documento WO2006/113373; Han y col. (2005) Impact of Vitamin E on Immune Function and Infectious Diseases in the Aged at Nutrition, Immune functions and Health EuroConference, París, 9-10 de junio de 2005; documento US-6630161; documento US 5.057.540; documento WO96/33739; documento EP-A-0109942; y documento WO96 / 11711. Opcionalmente, los ISCOMS pueden carecer de detergente adicional (documento WO00 / 07621).

Una revisión del desarrollo de adyuvantes a base de saponina se puede encontrar en Barr y col. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271 and Sjolanderet y col. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338. D. Virosomas y partículas similares a virus

Los virosomas y partículas similares a virus (VLP) también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Generalmente no son patógenos, no se replican y generalmente no contienen ninguno del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas procedentes del virus de la gripe (como HA o NA), virus de la hepatitis B (como las proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus de Sindbis, rotavirus, y virus de la enfermedad del pie y de la boca, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos Qp (como las proteínas de la cubierta), fagos de GA, fagos fr, fagos AP205 y Ty (como la proteína Ty de retrotransposón p1). Las VLP se tratan adicionalmente en Niikura y col. (2002) Virology 293:273-280; Lenz y col. (2001) J Immunol 166:5346-5355; Pinto y col. (2003) J Infect Dis 188:327-338; Gerber y col. (2001) J Virol 75:4752-4760; y los documentos WO03/024480 y WO03/024481. Los virosomas se analizan más a fondo en, por ejemplo, Gluck y col. (2002) Vaccine 20:B10-B16.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacáridos (LPS) enterobacterianos, derivados de lípidos A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas ADP-ribosilación y derivados desintoxicados de los mismos.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen lípido A monofosforilado (MPL) y MPL 3 des-O-acilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla del lípido A monofosforilado 3 des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. En el documento EP-A-0689454 se desvela una forma de "partícula pequeña" preferida de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado. Dichas "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0,22 |jm (documento US-6630161). Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de lípidos A monofosforilados, tales como derivados de aminoalquilglucosaminidafosfato, por ejemplo, RC-529 (Johnson y col. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278; y Evans y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229).

Los derivados de lípidos A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. OM-174 se describe, por ejemplo, en Meraldi y col. (2003) Vaccine 21:2485-2491 y Pajak y col. (2003) Vaccine 21:836-842.

Oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para usar como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citosina no metilada unida por un enlace de fosfato a una guanosina). También se ha demostrado que los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) son inmunoestimulantes.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Kandimalla y col. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400, los documentos WO02 / 26757 y WO99 / 62923 desvelan posibles sustituciones análogas, por ejemplo, sustitución de guanosina por 2'-desoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se analiza con más detalle en Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835; McCluskie y col. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185; documento WO98/40100; documento US 6.207.646; documentos US 6.239.116 y US 6.429.199.

La secuencia CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT (Kandimalla y col. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (parte 3):654-658). La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como una ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como una ODN CpG-B. Los ODN de CpG-A y CpG-B se analizan en Blackwell y col. (2003) J Immunol 170:4061-4068; Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65; y documento WO01 / 95935. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos CpG pueden unirse en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véanse, por ejemplo, Gluck y col. (2002) Vaccine 20:B10-B16; Kandimalla y col. (2003) BBRC 306:948-953; Bhagat y col. (2003) BBRC 300:853-861; y documento WO03 / 035836.

Un adyuvante CpG útil es CpG7909, también conocido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpG1826. Como alternativa, o además, del uso de secuencias CpG, pueden usarse secuencias TpG (documento WO01/22972) y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulante puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, como se desvela en Pajak y col. (2003) Vaccine 21:836-842) y/o puede tener una composición nucleotídica con >25 % de timidina (por ejemplo, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC, como se desvela en Pajak y col. (2003) Vaccine 21:836-842) y/o puede tener una composición nucleotídica con >25 % de citosina (por ejemplo, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes típicamente comprenderán al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimulantes se conoce como IC-31™ (Schellack y col. (2006) Vaccine 24:5461-72). Por lo tanto, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos uno (y preferentemente múltiples) motivos CpI (es decir, una citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferentemente múltiples) secuencia(s) del tripéptido Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia de 26 unidades 5'-(IC) 13-3'. El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de 11 unidades KLKLLLLKLK.

Toxinas bacterianas de ribosilación de ADP y derivados destoxificados de las mismas se pueden usar como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína deriva de E. coli (enterotoxina "LT" termolábil de E. coli), cólera ("CT") o tos ferina ("PT"). El uso de toxinas ribosilantes de ADP destoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en el documento WO95 / 17211 y como adyuvantes parenterales en el documento WO98 / 42375. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación desintoxicante; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT desintoxicado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y sus derivados desintoxicados, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en Beignon y col. (2002) Infect Immun 70:3012-3019; Pizza y col. (2001) Vaccine 19:2534-2541; Pizza y col. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461; Scharton-Kersten y col. (2000) Infect Immun 68:5306-5313; Ryan y col. (1999) Infect Immun 67:6270-6280; Partidos y col. (1999) Immunol Lett 67:209-216; Peppoloni y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293; y Pine y col. (2002) J Control Release 85:263-270.

Un mutante de CT útil es CT-E29H (Tebbey y col. (2000) Vaccine 18:2723-34). La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ribosilantes de ADP expuestas en Domenighini y col. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.

F. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen citocinas, tales como las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (documento WO99/40936), etc.) (documento WO99; 44636), interferones (por ejemplo, interferón-Y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferente es IL-12.

G. Bioahdesivos y mucoadhesivos

Los bioadhesivos y mucoadhesivos también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado (Singh y col. (2001) J Cont Release 70:267-276) o mucoadhesivos, tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También se pueden usar como adyuvantes en la invención chitosano y derivados del mismo (documento WO99/27960).

H. Micropartículas

Las micropartículas también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula de ~ 100 nm a ~ 150 pm de diámetro, más preferentemente, de ~200 nm a ~30 pm de diámetro y, de la forma más preferente, de ~500 nm a ~10 pm de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicolida) son preferentes, se tratan opcionalmente para tener una superficie con carga negativa (por ejemplo, con SDS) o una superficie con carga positiva (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de Vaccine Design... (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.) Ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en los documentos US 6.090.406; US 5.916.588; y EP-A-0626169.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno (documento WO99/52549). Dichas formulaciones incluyen además tensioactivos de éster de polioxietileno sorbitán en combinación con un octoxinol (documento WO01/21207), así como tensioactivos ésteres o éteres alquílicos de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional, tal como un octoxinol (documento WO01/21152). Los éteres de polioxietileno preferentes se seleccionan de entre el siguiente grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietileno-9-esteorilo, éter de polioxietileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo y éter de polioxietileno-23-laurilo.

K. Fosfacenos

Se puede usar un fosfazeno, tal como poli[di(carboxilatosfenoxi)fosfazeno] ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en Andrianov y col. (1998) Biomaterials 19:109-115 y Payne y col. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196. L. Péptidos muramílicos

Ejemplos de péptidos muramílicos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no m Dp ), y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE). M. Compuestos de imidazoquinolona.

Los ejemplos compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen ("R-837") (documentos US 4.680.338; US 4,988,815), Resiquimod ("R-848") (documento WO92 / 15582), y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales clorhidrato). Se pueden encontrar más detalles sobre las imidazoquinolinas inmunoestimuladoras en Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577; Wu y col. (2004) Antiviral Res. 64 (2): 79-83; Vasilakos y col. (2000) Cell Immunol. 204 (1): 64-74; patentes de Estados Unidos 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5482936, 5494916, 5525612, 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 6660735, 6660747, 6664260, 6664264, 6664265, 6667312, 6670372, 6677347, 6677348, 6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000 y 6924293; y Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.

N. Ureas sustituidas

Las ureas sustituidas útiles como adyuvantes incluyen compuestos de fórmula I, II o III, o sales de los mismos:

cómo se define en el documento WO03 / 011223, tales como "ER 803058", "ER 803732", "ER 804053", "ER 804058", "ER 804059", "ER 804442", "ER 804680", "ER 804764", ER 803022 o "ER 804057", por ejemplo:

O. Adyuvantes adicionales

Otros adyuvantes que se pueden usar con la invención incluyen:

• Un derivado de aminoalquil glucosaminida fosfato, tal como RC-529 (Johnson y col. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278; Evans y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229).

• Un compuesto de tiosemicarbazona, tales como los desvelados en el documento WO2004 / 060308. Los procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos activos también se describen en Bhagat y col. (2003) BBRC 300:853-861. Las tiosamicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

Un compuesto de triptantrina, tales como los desvelados en el documento WO2004 / 064759. Los procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos activos también se describen en la documento WO03/035836. Las tiosamicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

Un análogo de nucleósido, como: (a) isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

y profármacos de las mismas; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos desvelados en los documentos US 6.924.271, US2005/0070556 y US 5,658,731, oxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (patente de Estados Unidos 5.011.828).

Los compuestos desvelados en la documento WO2004/87153, que incluyen: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indoldiona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobencimidazol quinolinona (ABIQ) (documentos US 6.605.617, WO02 / 18383), compuestos de hidraftalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol (documento WO2004 / 018455), compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina y compuestos de benzazol (documento WO03 / 082272).

Los compuestos que contienen lípidos unidos a una estructura acíclica que contiene fosfato, tal como el antagonista de TLR4 E5564 (Wong y col. (2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42; documento US2005/0215517). Un polímero de polioximonio (Dyakonova y col., 2004) Int Immunopharmacol 4 (13): 1615-23; documento FR-2859633) u otro derivado de polietileno-piperazina N-oxidado.

Metil inosina 5'-monofosfato ("MIMP") (Signorelli y Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3 (8): 1177-86).

Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilado (documento WO2004 / 064715), tal como uno que tiene la fórmula:

en la que R se selecciona de entre el grupo que comprende hidrógeno, grupos acilo, alquilo (por ejemplo, cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo lineales o ramificados, insustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3- epi-casuarina, 7- epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina, etc.

Un ligando CD1d, tales como una a-glicosilceramidas (De Libero et al, Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496; patente de Estados Unidos 5.936.076; Oki et al, J. Clin. Investig., 113: 1631-1640; documento US2005/0192248; Yang y col., Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43: 3818-3822; documento WO2005/102049; Goff et al, J. Am. Chem., Soc., 2004, 126: 13602-13603; documento WO03 / 105769), por ejemplo, agalactosilceramida), fitoesfingosina que contiene a-glicosilceramidas, OCH, KRN7000 ((2S, 3S, 4R)-1-O-(a-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanotriol), CRONY-101,3"-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

Una inulina gamma (Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6:559-80) o derivado de la misma, tal como algamulina.

Combinaciones de adyuvantes

La invención puede también comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados con anterioridad. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes composiciones adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua (documento WO99 / 11241); (2) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) (documento WO94/00153); (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) (documento WO98/57659); (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y / o emulsiones de aceite en agua (solicitudes de patente europea 0835318, 0735898 y 0761231); (6) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80™ al 0,4 %, polímero de bloque pluronic L121 al 5 % y thr-MDP, ya esté microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula. (7) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL). En algunas realizaciones se usa una combinación de una toxina (por ejemplo, LTK63) y un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, CpG). En algunas realizaciones, se usa una combinación de una emulsión (por ejemplo, montanida) y un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, CpG).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de Vaccine Design, (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.

Se prefiere particularmente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio y los antígenos normalmente se adsorben a estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones adyuvantes preferidas incluyen combinaciones de los adyuvantes Th1 y Th2, tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector frente a la temperatura. Este componente puede ser particularmente útil en composiciones adyuvadas (especialmente aquellas que contienen un adyuvante mineral, tal como una sal de aluminio). Como se describe en el documento WO2006/110603, puede añadirse un agente protector contra la temperatura líquido a una composición de vacuna acuosa para reducir su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación por debajo de 0 °C. Por lo tanto, la composición puede almacenarse a menos de 0 °C, pero por encima de su punto de congelación, para inhibir la desintegración térmica. El agente protector contra la temperatura también permite congelar la composición a la vez que impide la aglomeración de los adyuvantes de sales minerales tras la congelación y descongelación y también pueden proteger a la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo, por encima de 40 °C. Pueden mezclarse una vacuna acuosa de partida y el agente protector contra la temperatura líquido de tal forma que el agente protector contra la temperatura líquido forma un 1-80% en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores contra la temperatura adecuados han de ser seguros para su administración a seres humanos, fácilmente miscibles/solubles en agua y no han de dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (PEG). Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular medio en el intervalo de 200-20.000 Da. En una realización preferida, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 300 Da ("PEG-300").

La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: (i) una o más proteínas de la invención; y (ii) un agente protector de temperatura. Esta composición se puede preparar mezclando (i) una composición acuosa que comprende una o más proteínas de la invención, con (ii) un agente protector de la temperatura. Después, puede almacenarse la mezcla, por ejemplo, a menos de 0 °C, a 0-20 °C, a 20-35 °C, a 35-55 °C o más. Puede almacenarse en forma líquida o congelada. La mezcla puede estar liofilizada. La composición puede o no puede formularse de forma alternativa mezclando (i) una composición desecada que comprende una o más proteínas de la invención, con (ii) una composición líquida que comprende el agente protector contra la temperatura. Por lo tanto, puede usarse el componente (ii) para reconstituir el componente (i).

Las composiciones de la invención pueden provocar una respuesta inmunitaria mediada por células y una respuesta inmunitaria humoral. Preferentemente, esta respuesta inmunitaria inducirá anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente tras la exposición a Chlamydia.

Dos tipos de linfocitos T, linfocitos CD4 y CD8, en general, se considera necesario para iniciar y / o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral IFN^y y TNF-p. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor de CD8 y se citan habituales como linfocitos T citotóxicos (CTL). Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en moléculas de la clase I del MHC.

Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor de CD4 y se citan comúnmente como linfocitos T colaboradores. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas del MHC de clase II. Tras la interacción con una molécula MHC de clase II, las células CD4 pueden secretar factores como las citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T colaboradores o los linfocitos CD4+ pueden dividirse adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: los fenotipos TH1 y TH2, que difieren en su función efectora y de citocinas.

Las células TH1 activadas potencian la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de CTL específicos de antígeno) y por lo tanto, son particularmente valiosos en la respuesta a infecciones intracelulares. Las células TH1 pueden secretar uno o más de IL-2, IFN^y y TNF-p. Una respuesta inmunitaria TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales mediante la activación de macrófagos, células NK (citolíticas naturales) y linfocitos T citotóxicos CD8 (CTL). Una respuesta inmunitaria TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria mediante la estimulación del crecimiento de linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados por TH1 pueden secretar IgG2a.

Las células TH2 activadas potencian la producción de anticuerpos y por lo tanto, son valiosos para responder a infecciones extracelulares. Las células TH2 activadas pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para la protección futura.

Una respuesta inmunitaria potenciada puede incluir uno o más de una respuesta inmunitaria TH1 potenciada y una respuesta inmunitaria TH2.

Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un aumento en los CTL, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH1 (tal como IL-2, IFN^y y TNF-p), un aumento en los macrófagos activados, un aumento en la actividad de NK o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH1 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

Puede desencadenarse una respuesta inmunitaria TH1 usando un adyuvante de TH1. Por lo general, un adyuvante de TH1 provocará niveles aumentados de producción de IgG2a en relación con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para su uso en la invención pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas pseudovíricas, derivados no tóxicos del lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como los oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes TH1 preferentes para su uso en la invención. Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (tales como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH2 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG1.

Puede desencadenarse una respuesta inmunitaria TH2 usando un adyuvante de TH2. Por lo general, un adyuvante de TH2 provocará niveles aumentados de producción de IgG1 en relación con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite y toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio, son adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en la invención.

Preferentemente, la invención incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Preferentemente, dicha composición desencadena una respuesta TH1 y una respuesta TH2 potenciadas, es decir, un aumento en la producción tanto de IgG1 como de IgG2a en relación con la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante TH1 y TH2 provoca un aumento de las respuestas inmunitarias TH1 y/o t H2 en relación con la inmunización con un solo adyuvante (es decir, en relación con la inmunización con un adyuvante TH1 solo o a la inmunización con un adyuvante TH2 solo).

La respuesta inmunitaria puede ser uno o ambos de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona uno o ambos de una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada. Preferentemente, La respuesta inmunitaria incluye un aumento en la producción de IgG1 y / o IgG2 y / o IgGA.

La invención se utiliza, preferentemente, para provocar inmunidad sistémica y / o mucosa. La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y una mucosal. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona uno o ambos de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y una respuesta inmunitaria mucosa mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosal es una respuesta inmunitaria TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

Procedimientos de tratamiento y administración de la vacuna

La invención también proporciona una proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición de la invención para su uso en un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición de la invención. La respuesta inmunitaria es, preferentemente, protectora y, preferentemente, implica inmunidad mediada por anticuerpos y/o células. El procedimiento puede generar una respuesta reforzadora.

La invención también proporciona una proteína o combinación, como se ha definido anteriormente, para su uso como un medicamento, por ejemplo, para su uso para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La invención también proporciona el uso de una proteína o combinación de la invención en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Al generar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, el mamífero puede estar protegido contra la infección por Chlamydia. Más particularmente, el mamífero puede estar protegido contra Chlamydia trachomatis. La invención es efectiva contra Chlamydia de varios serotipos diferentes, pero puede ser particularmente útil en la protección contra la enfermedad producida por la infección por Chlamydia por cepas en la serovar D.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la invención también proporciona un ácido nucleico, proteína, anticuerpo, vector o célula huésped de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento (por ejemplo, una vacuna). En una realización, la proteína, el ácido nucleico o el anticuerpo se usa para el tratamiento o la prevención de la infección por Chlamydia (preferentemente, C. trachomatis) en un mamífero. La invención también proporciona un ácido nucleico, proteína o anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento, prevención o diagnóstico de la infección por Chlamydia (preferentemente, infección por C. trachomatis) en un paciente (preferentemente, un mamífero), que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico, proteína o anticuerpo de la invención.

Preferentemente, el ácido nucleico, la proteína o el anticuerpo de acuerdo con la invención es para el tratamiento o prevención de la infección por Chlamydia o una afección asociada (por ejemplo, tracoma, ceguera, cervicitis, enfermedad inflamatoria pélvica, esterilidad, embarazo ectópico, dolor pélvico crónico, salpingitis, uretritis, epididimitis, neumonía infantil, carcinoma cervical de células escamosas, etc.), preferentemente, infección por C. trachomatis. La composición inmunogénica puede ser, adicional o alternativamente, eficaz contra C. pneumoniae. El mamífero es preferentemente un ser humano. Cuando la vacuna es para su uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para su uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc. Así, un paciente humano puede tener menos de 1 año de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad o al menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos que van a recibir las vacunas están pasando por la pubertad, son adolescentes, personas sexualmente activas, ancianos (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad y, preferentemente, >65 años de edad), niños (por ejemplo, < 5 años), pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Las vacunas no son adecuadas solo para estos grupos, sin embargo, y pueden usarse más generalmente en una población.

Las vacunas producidas mediante la invención pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario o centro de vacunación) que otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna para el virus del papiloma humano, tal como Cervarix™ o Gardasil™; una vacuna contra el tétanos, la difteria y la tos ferina acelular, tal como TDaP, DTaP o Boostrix™; una vacuna contra la rubéola, tal como MMR; o una vacuna contra la tuberculosis, tal como el BCG. Los ejemplos de otras vacunas que la vacuna producida por la invención se puede administrar sustancialmente al mismo tiempo son una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la varicela, una vacuna contra el MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tos ferina, una vacuna contra DTP, una vacuna conjugada contra H.influenzae de tipo b, una vacuna contra poliovirus inactivada, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada meningocócica (tal como una vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna contra el virus sincitial respiratorio, etc.

En una realización preferida, la proteína de la invención se usa para producir anticuerpos capaces de neutralizar la actividad de la proteína de Chlamydia de tipo salvaje, por ejemplo, de una o más de Chlamydia CT733 de tipo salvaje, CT153, CT601, CT279, CT443, CT372, CT456, CT381, CT255, CT341, CT716, CT745, CT387, CT812, CT869, CT166, CT175, CT163, CT214, CT721, CT127, CT043, CT600 y / o CT823 por ejemplo, de una o más de Chlamydia CT733 de tipo salvaje, CT153, CT601, CT279, CT443, CT372, CT456 y/o CT381. Los anticuerpos neutralizantes se pueden usar como vacuna capaz de neutralizar la actividad de una proteína nativa de Chlamydia expresada por CE infecciosos. En una realización, la proteína de la invención se usa para provocar anticuerpos que pueden neutralizar la infectividad y/o virulencia de Chlamydia. Por lo tanto, la invención proporciona también los anticuerpos de la invención para neutralizar las proteínas de Chlamydia de tipo salvaje y / o la infectividad y / o virulencia de Chlamydia.

La divulgación también proporciona el uso de un ácido nucleico, proteína, o anticuerpo de la invención en la fabricación de: (i) un medicamento para tratar o prevenir la infección bacteriana; y (ii) un reactivo que puede producir anticuerpos contra las bacterias. Dicha bacteria es, preferentemente, una Chlamydia, por ejemplo, Chlamydia trachomatis o Chlamydia pneumoniae, pero es, preferentemente, Chlamydia trachomatis.

Por lo tanto, hay un procedimiento para diagnosticar la infección por Chlamydia in vitro, que comprende:

(a) producir un anticuerpo contra una proteína de la invención;

(b) poner en contacto el anticuerpo de la etapa (a) con una muestra biológica sospechosa de estar infectada con Chlamydia en condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo-antígeno; y

(c) detectar dichos complejos, en el que la detección de dicho complejo es indicativa de infección por Chlamydia. Por lo tanto, hay un procedimiento para diagnosticar la infección por Chlamydia in vitro, que comprende: (a) poner en contacto un anticuerpo que se produjo contra una proteína de la invención con una muestra biológica sospechosa de estar infectada con Chlamydia en condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo-antígeno; y (b) detectar dichos complejos, en el que la detección de dicho complejo es indicativa de infección por Chlamydia.

Las proteínas de la invención se pueden usar en inmunoensayos para detectar niveles de anticuerpos (o, a la inversa, los anticuerpos de la invención pueden usarse para detectar niveles de proteína). Se pueden desarrollar inmunoensayos basados en antígenos recombinantes bien definidos para reemplazar los procedimientos de diagnóstico invasivos. Se pueden detectar anticuerpos frente a proteínas en muestras biológicas, que incluyen, por ejemplo, muestras de sangre o suero. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran variación y una variedad de estos son conocidos en la técnica. Los protocolos para el inmunoensayo pueden basarse, por ejemplo, en la competición, o reacción directa, o ensayos de tipo sándwich. Los protocolos también pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos, o puede ser por inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos involucran el uso de un anticuerpo o polipéptido marcado; los marcadores pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o colorantes. También se conocen los ensayos que amplifican las señales de la muestra; ejemplos de los cuales son ensayos que usan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, como los ensayos ELISA.

Los kits adecuados para inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcados apropiados se construyen empaquetando los materiales apropiados, incluyendo las composiciones de la invención, en recipientes adecuados, junto con los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, tampones adecuados, soluciones salinas, etc.) requeridos para la realización del ensayo, así como un conjunto adecuado de instrucciones de ensayo.

Pruebas de eficacia de las composiciones

La eficacia de las composiciones inmunogénicas de la presente invención se puede evaluar en modelos animales in vitro e in vivo antes de la administración al huésped, por ejemplo, ser humano. Por ejemplo, la neutralización in vitro de Peterson et al (1988) es adecuada para probar la composición de la vacuna dirigida a Chlamydia trachomatis. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar la infección porC. trachomatis tras la administración de las composiciones de la invención. Una forma de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunitarias tanto sistémicamente (tal como controlar el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y mucosalmente (tal como controlar el nivel de producción de IgA) contra los antígenos de Chlamydia trachomatis en las composiciones de la invención después de administración de la composición. Típicamente, las respuestas de anticuerpos específicos contra Chlamydia se determinan después de la inmunización pero antes de la exposición, mientras que las respuestas mucosas del cuerpo de anticuerpos específicos de Chlamydya se determinan después de la inmunización y después de la exposición.

Un ejemplo de dicha prueba in vitro se describe a continuación. El antisuero hiperinmune se diluye en PBS que contiene 5 % de suero de cobaya, como fuente de complemento. Chlamydia trachomatis (104 UFI; unidades formadoras de inclusión) se añade a las diluciones de antisueros. Las mezclas antígeno-anticuerpo se incuban a 37 °C durante 45 minutos y se inoculan en monocapas de células Hep-2 o HeLa confluentes duplicadas contenidas en viales de vidrio (por ejemplo, 15 por 45 mm), que se han lavado dos veces con PBS antes de la inoculación. Las células en monocapa se infectan mediante centrifugación a 1000X g durante 1 hora, seguido de incubación estacionaria a 37 °C durante 1 hora. Las monocapas infectadas se incuban durante 48 o 72 horas, se fijan y se tiñen con anticuerpos específico contra Chlamydia, tales como anti-MOMP. Las células portadoras de inclusión se cuentan en diez campos con un aumento de 200X. El título de neutralización se asigna a la dilución que da un 50 % de inhibición en comparación con las monocapas de control / UFI.

Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente divulgación es expresar las proteínas de manera recombinante para la exploración de los sueros o las secreciones mucosas de pacientes mediante inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha desarrollado una respuesta inmunitaria contra la proteína en cuestión. Este procedimiento también puede usarse para identificar antígenos inmunodeficientes y/o epítopos dentro de los antígenos.

También puede determinarse la eficacia de las composiciones de vacuna in vivo exponiendo a modelos animales a la infección por Chlamydia trachomatis, por ejemplo, cobayas o ratones, con las composiciones de vacuna. Por ejemplo, Se pueden realizar estudios de exposición a la composición de vacuna in vivo en el modelo de cobaya de la infección por Chlamydia trachomatis. A continuación se presenta una descripción de un ejemplo de este tipo de abordaje. Cobayas hembra de 450-500 g de peso se alojan en una estancia con control ambiental con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y se inmunizan con composiciones de vacunas a través de diversas vías de inmunización. Después de la vacunación, las cobayas se infectan en el tracto genital con el agente de la conjuntivitis de inclusión de las cobayas (GPIC), que se ha cultivado en células HeLa o McCoy (Rank y col. (1988)). Cada animal recibe aproximadamente 1,4x107 unidades formadoras de inclusión (UFI) contenidas en 0,05 ml de tampón de sacarosafosfato-glutamato, a pH 7,4 (Schacter, 1980). El curso de la infección se controla determinando el porcentaje de células portadoras de inclusión mediante inmunofluorescencia indirecta con antisueros específicos de GPIC, o por frotis teñidos con Giemsa de un raspado del tracto genital (Rank y col. 1988). Los títulos de anticuerpos en el suero se determinan mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Como alternativa, las composiciones de vacunas in vivo se pueden realizar en el modelo murino de Chlamydia trachomatis (Morrison et al 1995). Una descripción de un ejemplo de este tipo de abordaje es la siguiente. Los ratones hembra de 7 a 12 semanas de edad reciben 2,5 mg de depo-provera por vía subcutánea a los 10 y 3 días antes de la infección vaginal. Después de la vacunación, se infecta a los ratones en el tracto genital con 1.500 unidades formadoras de inclusión de Chlamydia trachomatis contenidas en 5 ml de tampón de sacarosa-fosfatoglutamato, a pH 7,4. El curso de la infección se controla determinando el porcentaje de células portadoras de inclusión mediante inmunofluorescencia indirecta con antisueros específicos de Chlamydia trachomatis, o por frotis teñidos con Giemsa de un raspado del tracto genital de un ratón infectado. La presencia de títulos de anticuerpos en el suero de un ratón se determina mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Inmunización con ácido nucleico

Las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente incluyen antígenos de Chlamydia. En todos los casos, sin embargo, los antígenos polipeptídicos pueden sustituirse por ácidos nucleicos (típicamente ADN) que codifican esos polipéptidos, para dar composiciones, procedimientos y usos basados en inmunización con ácido nucleico. La inmunización con ácido nucleico es ahora un campo desarrollado (véase, Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; Strugnell y col. (1997) Immunol Cell Biol 75(4):364-369; Cui (2005) Adv Genet 54:257-89; Robinson y Torres (1997) Seminars in Immunol 9:271-283; Brunham y col. (2000) J Infect Dis 181 Suppl 3:S538-43; Svanholm y col. (2000) Scand J Immunol 51(4):345-53; DNA Vaccination - Genetic Vaccination (1998) eds. Koprowski y col. (ISBN 3540633928); Gene Vaccination: Theory and Practice (1998) ed. Raz (ISBN 3540644288), etc.).

El ácido nucleico que codifica el inmunógeno se expresa in vivo después de la administración a un paciente y el inmunógeno expresado estimula el sistema inmunitario. El principio activo tomará la forma de un vector de ácido nucleico que comprende: (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica el inmunógeno, ligado operativamente al promotor; y opcionalmente (iii) un marcador seleccionable. Los vectores preferidos pueden comprender además (iv) un origen de replicación; y (v) un terminador de la transcripción aguas abajo y operativamente unido a (ii). En general, (i) y (v) será eucariota y (iii) y (iv) será procariota.

Los promotores preferidos son promotores virales, por ejemplo del citomegalovirus (CMV). El vector también puede incluir secuencias reguladoras de la transcripción (por ejemplo, potenciadores) además del promotor y que interacciona funcionalmente con el promotor. Los vectores preferidos incluyen el potenciador / promotor tempranointermedio del CMV y los vectores más preferidos también incluyen el intrón A del CMV. El promotor está unido operativamente a una secuencia aguas abajo que codifica un inmunógeno, de forma que la expresión de la secuencia que codifica el inmunógeno está bajo el control del promotor.

Cuando se usa un marcador, preferentemente funciona en un huésped microbiano (por ejemplo, en un procariota, en una bacteria, en una levadura). El marcador es, preferentemente, un marcador seleccionable procariota (por ejemplo, transcrito bajo el control de un promotor procariota). Por conveniencia, los marcadores típicos son los genes de resistencia a los antibióticos.

El vector de la invención es, preferentemente, un vector episomal o extracromosómico que se replica de forma autónoma, tal como un plásmido.

El vector de la invención comprende, preferentemente, un origen de replicación. Se prefiere que el origen de la replicación esté activo en procariotas pero no en eucariotas.

Por tanto, los vectores preferidos incluyen un marcador procariota para la selección del vector, un origen de replicación procariota, pero un promotor eucariota para conducir la transcripción de la secuencia de codificación del inmunógeno. Por lo tanto, los vectores (a) se amplificarán y seleccionarán en huéspedes procariotas sin expresión de polipéptidos, pero (b) se expresarán en huéspedes eucariotas sin amplificarse. Esta disposición es ideal para vectores de inmunización con ácidos nucleicos.

El vector de la invención puede comprender una secuencia de terminación de la transcripción eucariota aguas abajo de la secuencia de codificación. Estos pueden mejorar los niveles de transcripción. Cuando la secuencia de codificación no tiene la suya, el vector de la invención comprende, preferentemente, una secuencia de poliadenilación. Una secuencia de poliadenilación preferida es de la hormona de crecimiento bovina.

El vector de la invención puede comprender un sitio de clonación múltiple.

Además de las secuencias que codifican el inmunógeno y un marcador, el vector puede comprender una segunda secuencia de codificación eucariota. El vector también puede comprender un IRES aguas arriba de dicha segunda secuencia con el fin de permitir la traducción de un segundo polipéptido eucariota del mismo trascrito que el inmunógeno. Como alternativa, la secuencia de codificación del inmunógeno puede estar aguas abajo de un IRES. El vector de la invención puede comprender motivos de CpG no metilados, por ejemplo, secuencias de ADN no metiladas que tienen en común una citosina que precede a una guanosina, flanqueadas por dos purinas en 5' y dos pirimidinas en 3'. En su forma no metilada, se ha demostrado que estos motivos de ADN son potentes estimuladores de varios tipos de células inmunitarias.

Los vectores pueden administrarse de forma específica. Las técnicas de administración de ADN mediadas por receptores se describen en, por ejemplo, Findeis y col., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou y col. (1994) Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer. ed. Wolff; Wu y col., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu y col., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655; y Wu y col., J. Biol. Chem. (1991) 266:338.

Las composiciones terapéuticas que contienen un ácido nucleico se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia génica. Los intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 |jg a aproximadamente 500 |jg, y de aproximadamente 20 |jg a aproximadamente 100 jig de ADN también pueden usarse durante un protocolo de terapia génica. Los factores, tal como el procedimiento de acción (por ejemplo, para aumentar o inhibir los niveles del producto genético codificado) y la eficacia de la transformación y expresión son consideraciones que afectarán a la dosis requerida para la máxima eficacia. Cuando se desea una mayor expresión en un área más grande de tejido, pueden ser necesarias mayores cantidades de vectores o las mismas cantidades readministradas en un protocolo de administraciones sucesivas o varias administraciones a diferentes porciones de tejido cercanas o adyacentes para efectuar un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación de rutina en ensayos clínicos determinará intervalos específicos para un efecto terapéutico óptimo.

Los vectores pueden administrarse usando vehículos de administración de genes. El vehículo de administración de genes puede ser de origen viral o no viral (véase, en general, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; y Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148).

Los vectores basados en virus para la administración de un ácido nucleico deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los vehículos de ejemplo basados en virus incluyen, pero sin limitación, retrovirus recombinantes (por ejemplo, documentos WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; patente de Estados Unidos 5.219.740; WO 93/11230; WO 93/10218; patente de Estados Unidos 4.777.127; la patente de GB n.° 2.200.651; documento EP-A-0345242; y WO 91/02805), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus del bosque de Semliki (ATCC VR-67); ATCC VR-1247), virus del río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532); también se pueden utilizar híbridos o quimeras de estos virus), vectores de poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela del canario, vaccinia modificada de Ankara, etc.), vectores de adenovirus y vectores de virus adenoasociados (AAV) (por ejemplo, véanse los documentos WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; patente de Estados Unidos 5.219.740; WO 93/11230; WO 93/10218; patente de Estados Unidos 4.777.127; la patente de GB n.° 2.200.651; documento EP-A-0345242; WO 91/02805; WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; y WO 95/00655). También se puede usar administración de ADN unido a adenovirus muertos (Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147).

También se pueden emplear vehículos y procedimientos de administración no virales, que incluyen, aunque no de forma limitativa, ADN policatiónico condensado unido o no unido a un adenovirus muertos solo (por ejemplo, De Libero et al, Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496), ADN unido a ligando (Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985), células vehículo de administración de células eucariotas (patente de Estados Unidos 5.814.482; WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y el documento WO 97/42338) y neutralización de la carga nucleica o fusión con membranas celulares. También se puede emplear ADN desnudo. Los procedimientos de introducción de ADN desnudo a modo de ejemplo se describen en el documento WO 90/11092 y en la patente de Estados Unidos 5.580.859. Los liposomas (por ejemplo, inmunoliposomas) que pueden actuar como vehículos de administración de genes se describen en la patente de Estados Unidos 5.422.120; WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y EP-0524968. Otros enfoques se describen en Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 y Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:11581.

Otra administración no viral adecuada para su uso incluye sistemas de administración mecánica, tal como el abordaje descrito en Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648. Además, la secuencia de codificación y el producto de expresión de la misma se pueden administrar mediante la deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizados o mediante el uso de radiación ionizante (por ejemplo, patente de Estados Unidos 5.206.152 y el documento WO 92/11033). Otros procedimientos convencionales para la administración de genes que pueden usarse para la administración de la secuencia de codificación incluyen, por ejemplo, el uso de pistola de partículas para transferencia de genes manual (patente de Estados Unidos n.° 5.149.655) o el uso de radiación ionizante para la activación de genes transferidos (strugnell y col. (1997) Immunol Cell Biol 75(4):364-369 and Cui (2005) Adv Genet 54:257-89).

La administración de ADN usando micropartículas de PLG {poli (lactida-co-glicolida)} es un procedimiento preferido, por ejemplo, por adsorción a las micropartículas, que se tratan opcionalmente de modo que tengan una superficie cargada negativamente (por ejemplo, tratada con un SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, tratada con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Inmunización con anticuerpos

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para neutralizar la actividad de la proteína de Chlamydia de tipo salvaje. Los anticuerpos contra los antígenos de Chlamydia se pueden usar para la inmunización pasiva (Brandt y col. (2006) J Antimicrob Chemother. 58(6):1291-4. Epub 2006 Oct 26). Por lo tanto, la invención proporciona el uso de anticuerpos de la invención en terapia. La invención también proporciona el uso de dichos anticuerpos para la fabricación de un medicamento. La invención también proporciona un procedimiento para tratar a un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención. Como se ha descrito anteriormente para composiciones inmunogénicas, estos procedimientos y usos permiten que un mamífero esté protegido contra la infección por Chlamydia.

Procedimientos

En el presente documento también se desvelan diversos procedimientos.

Se desvela un procedimiento para producir una proteína de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped de la invención en condiciones que inducen la expresión de la proteína.

Se desvela un procedimiento para producir proteína o ácido nucleico de la invención, en el que la proteína o ácido nucleico se sintetiza en su totalidad o en parte usando medios químicos.

También se desvela un procedimiento para detectar Chlamydia (preferentemente, C. trachomatis) en una muestra biológica, que comprende la etapa de poner en contacto un ácido nucleico de acuerdo con la invención con la muestra biológica en condiciones de hibridación. El procedimiento puede involucrar la amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, etc.) o hibridación (por ejemplo, micromatrices, transferencias, hibridación con sonda en solución etc.).

Se desvela un procedimiento para detectar Chlamydia de tipo salvaje (preferentemente, C. trachomatis), que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo de la invención con una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de uno o más complejos de anticuerpo-antígeno; y (b) detectar dicho(s) complejo(s). Este procedimiento se puede utilizar ventajosamente para diagnosticar la infección por Chlamydia. General

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20a edición, ISBN: 0683306472; Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vol. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997); Ausubel y col. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5a edición (Current Protocols); Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream y col., eds., 1998, Academic Press); y PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2a ed. (Newton y Graham eds., 1997, Springer Verlag) etc.

La numeración "IG" se usa en el presente documento. Un número IG, o "identificador de genInfo", es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por NCBI cuando las secuencias se añaden a sus bases de datos. El número IG no se parece al número de referencia del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para corrección, o para añadir más anotaciones o información), recibe un nuevo número IG. Por lo tanto, la secuencia asociada con un número IG dado nunca se cambia.

En los casos en los que la invención se refiera a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T. Dichos epítopos pueden identificarse empíricamente (por ejemplo, utilizando PEPS^cAⁿ (Geysen y col. (1984) PNAS USA 81:3998-4002; Carter (1994) Methods Mol Biol 36:207-23) o procedimientos similares), o pueden predecirse (por ejemplo, utilizando el índice antigénico de Jameson-Wolf) (Jameson, BA y col.

1988, ^cA^biO^s 4(1):181-186), enfoques basados en matrices (Raddrizzani y Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):179-89), MAPITOPE (Bublil y col. (2007) Proteins 68(1):294-304), TEPITOPE (De Lalla y col. (1999) J. Immunol.

163:1725-29; Kwok y col. (2001) Trends Immunol 22:583-88), redes neurales (Brusic y col. (1998) Bioinformatics 14(2):121-30), OptiMer & EpiMer (Meister y col. (1995) Vaccine 13(6):581-91; Roberts y col. (1996) AIDS Res Hum Retroviruses 12(7):593-610), Ad EpT (Maksyutov y Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3):291-7), Tsites (Feller y de la Cruz (1991) Nature 349(6311):720-1), hidrofilicidad (Hopp (1993) Peptide Research 6:183-190), indice antigénico (Welling y col. (1985) FEBS Lett. 188:215-218) o los procedimientos desvelados en Davenport y col. (1995) Immunogenetics 42:392-297; Tsurui y Takahashi (2007) J Pharmacol Sci. 105(4):299-316; Tong y col. (2007) Brief Bioinform. 8(2):96-108; Schirle y col. (2001) J Immunol Methods. 257(1-2):1-16; y Chen y col. (2007) Amino Acids 33(3):423-8, etc.). Los epítopos son partes de un antígeno que son reconocidos por y se unen a los sitios de unión a antígeno de anticuerpos o receptores de linfocito T y también pueden citarse como "determinantes antigénicos".

En los casos en los que se omita un "dominio" del antígeno, esto puede implicar la omisión de un péptido señal, de un dominio citoplasmático, de un dominio transmembrana, de un dominio extracelular, etc.

La expresión "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El término "aproximadamente", en relación con un valor numérico x, es opcional y significa, por ejemplo, x±10 %. Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, el porcentaje de aminoácidos son iguales al comparar las dos secuencias. Pueden determinarse este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., eds., 1987) Suplemento 30. Se determina una alineación preferida mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de hueco afín con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que muestra la capacidad de 20 antígenos seleccionados de C. trachomatis para inducir la producción de IFNy por los linfocitos T CD4+.

La Figura 2a muestra la propagación de bacterias (UFI recuperadas del pulmón) después de la exposición a Chlamydia en ratones a los que se transfirieron adoptivamente linfocitos T CD4+ CE-CM. La Figura 2b muestra la capacidad de varios antígenos de C. muridarum para estimular la línea celular protectora CE-CD4 para producir IFNy.

La Figura 3 es un histograma que muestra el número de linfocitos T CD4+ que producen IFNy, tras la estimulación específica con antígenos recombinantes de C. trachomatis, CT153 y CT733.

La Figura 4 muestra la actividad protectora de TC0106 (homólogo de C. muridarum de CT733) y TC0431 (homólogo de C. muridarum de CT153) como antígenos individuales. El gráfico muestra las UFI / ml medias en ratones BALB / C inmunizados con los dos antígenos y luego expuestos a C. muridarum. Las tres barras son, de izquierda a derecha: adyuvante solo; TC0106 como inmunógeno; y TC0431 como inmunógeno.

La figura 5 muestra la actividad protectora de la combinación TC0106 TC0431. El gráfico muestra las UFI medias por pulmón (Log10) recuperadas de pulmones infectados de ratones inmunizados con la combinación. Las tres barras son, de izquierda a derecha: 103 CE vivos; adyuvante solo; combinación antigénica.

La Figura 6 muestra linfocito T CD4 que producen IFN^y en PBMC de ratones inmunizados con TC0106 TC0431, TC0106, TC0431 y LTK 63 CpG. De izquierda a derecha, las barras representan estimulación con 1) LTK 63, TC0106+TC0431, TC0106, TC0431 (todos los ratones inmunizados con CE); 2) LTK 63, TC0106+TC0431, TC0106 (todos los ratones inmunizados con TC 0106); 3) LTK63, TC0106+TC0431. TC0431 (todos los ratones inmunizados con TC0431); y 4) LTK63 y TC0106 TC0431 (ambos ratones inmunizados con TC0106 TC0431). Muestra que la inmunización con TC0106 (homólogo de CT733 de C. muridarum) y TC0431 (homólogo de CT153 de C. muridarum) provoca una frecuencia significativa de células CD4 / IFN^y específicas. El eje Y muestra la frecuencia en 106 ^c D4.

La Figura 7 es un resumen de los resultados de protección para varias combinaciones y antígenos únicos en el modelo de ratón de exposición intranasal a C. muridarum. Muestra las UFI medias / pulmón de ratones inmunizados por vía intramuscular con antígenos individuales, o combinaciones de antígenos, adyuvados con LTK63 y CpG, luego se expuso por vía intranasal a 103 UFI de C. muridarum.

La Figura 8 es un resumen de los resultados de protección para varias combinaciones de antígenos en el modelo de ratón de exposición intranasal a C. muridarum. Muestra las UFI medias / pulmón (log 10) de C. muridarum recuperadas del pulmón infectado de ratones inmunizados.

La Figura 9 muestra los resultados de la combinación TC0551 TC0651 TC0727 TC0890 en el modelo de ratón de exposición de la bolsa ovárica a C. muridarum. El eje Y muestra UFI / hisopo (log10). Los tres grupos, de izquierda a derecha, son para diferentes antígenos inmunizantes: ovoalbúmina; la combinación; y nMOMP. La Figura 10A muestra los resultados de protección logrados con varias combinaciones de antígenos en el modelo de ratón de exposición intranasal a C. muridarum. La Figura 10B muestra la frecuencia de los linfocitos T CD4+ productores de IFNg inducidos por la vacunación con la combinación antigénica TC0890 TC0551. De izquierda a derecha, las barras representan estimulación con 1) TC0551, TC0890, TC0551 TC0890 (para ratones inmunizados con adyuvante) y 2) TC0551, TC0890, TC0551 TC0890 (para ratones inmunizados con MIX TC0890 TC0551). La Figura 10c muestra linfocitos T CD4 que producen TFNg e IL2/TNF en PBMC de ratones inmunizados con C0106+TC0431 con Ltk63 CpG. De izquierda a derecha, las barras representan estimulación con a) TC0106. TC0431, TC0106+TC0431, CT153 CT733 (todos los ratones inmunizados con adyuvante); 2) TC0106, TC0431, TC0106+TC0431, CT153 CT733 (todos los ratones inmunizados con MIX TC0106 TC0431).

La Figura 11 muestra un análisis de inmunotransferencia de CT601, CT279, CT153 y CT733 en células HeLa infectadas con Ct-EB y C.trachomatis utilizando sus antisueros inmunitarios de ratón específicos.

La figura 12 muestra la actividad protectora de los antígenos TC0313, TC0741, TC0106 y TC0210 administrados solos o en combinación. En 12A a 12D, las barras muestran las UFI medias / pulmón (Log10), con la barra de la izquierda como adyuvante solo (LTK61 CpG) y la barra de la derecha es el antígeno TC. La figura 12E muestra la reducción de UFI con el tiempo (UFI medias/pulmón contra los días después de la exposición) usando la combinación (cuadrados) o el adyuvante solo (rombos).

Las figuras 13A y 13B son histogramas que muestran la respuesta Th1 de CD4 específica de antígeno en ratones BALB/c, después de una infección primaria por C. trachomatis (CT). Los resultados son la media de 4 experimentos independientes. Se muestran dos resultados para cada experimento: ratones no infectados (barra de la izquierda) y ratones infectados primarios (barra derecha). De izquierda a derecha en la Figura 13A, los resultados se refiere a estimulación con CT812C, CT387, CT869, CT166 y CT175. De izquierda a derecha en la Figura 13B, los resultados se refieren a estimulación con MOMP, CT163, CT812, CT812C, CT166, CT869, CT163, CT812, CT214, CT387, CT721, CT127 y CT175. La frecuencia en 105 linfocitos T CD4 se muestra en el eje Y.

La Figura 14 es un histograma que muestra las UFI de C. muridarum recuperadas de pulmones infectados de ratones inmunizados (Día 12 después de la exposición I.N. con 103 UFI). El grupo de inmunización se muestra en el eje X: la barra de la izquierda se refiere a ratones inmunizados con LTK63 CpG; la barra de la derecha se refiere a ratones inmunizados con TC0197+TC0261+TC0666+LTK63+CpG. La u Fi media / pulmón (Log10) se muestra en el eje Y.

La Figura 15 es un histograma que muestra las UFI de C. muridarum recuperadas de pulmones infectados de ratones inmunizados (Día 12 después de la exposición I.N. con 103 UFI). El grupo de inmunización se muestra en el eje X: de izquierda a derecha, los resultados se refieren a ratones inmunizados con i) LTK63+CpG, ii) TC0261+LTK63+CpG, iii) TC0197+LTK63+CpG, y iv) TC0666+LTK63+CpG. La UFI media / pulmón (Log10) se muestra en el eje Y.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Ejemplo 1: Inducción de la población de linfocitos T CD4+ para producir IFN^y

Se han encontrado 20 antígenos que inducen a una población de linfocitos T CD4+ a producir IFN^y (véase la Figura 1). 17 de estos son recién descubiertos (CT016, CT043, CT114, CT153, CT255, CT279, CT341, CT372, CT480, CT600, CT601, CT711, CT716, CT733, CT734. CT745, CT823), mientras que tres antígenos (CT681-MOMP, CT396-Hsp60 y CT587-enolasa) ya se han descrito como dianas de linfocitos T CD4+ (Goodall JC y col., 2001; Hassell AB y col. 1993). Significativamente, algunos antígenos fueron capaces d inducir una frecuencia de linfocitos T respondedores CD4+ específicos de antígenos al menos comparables a lo que se observó con el antígeno de control positivo MOMP.

Los 17 nuevos antígenos son los siguientes:

De estos 17 nuevos antígenos, CT341 puede ser el menos adecuado para su uso en inmunización porque es una proteína de choque térmico.

Ejemplo 2: Caracterización de la especificidad antigénica de líneas celulares protectoras Th1 CD4+ específicas de Chlamydia

La relevancia de los antígenos recién descubiertos para la inmunidad protectora frente a Chlamydia se corroboró además mostrando que eran reconocidos por linfocitos T pertenecientes a una línea celular CD4+/IFNy+ específica de Chlamydia, confiere protección cuando se transfiere de forma adoptiva a ratones receptores intactos. Con este objetivo se ha derivado una línea de linfocitos T CD4+ a corto plazo, producida contra la forma de CE extracelulares de C. muridarum que mostró una capacidad elevada para proteger a ratones intactos a los que se ha transferido de forma adoptiva frente a la exposición a C. muridarum. La línea celular protectora CD4+, que había sufrido solo unos pocos ciclos de expansión, mantuvieron una población de células policlonales con amplia especificidad que debería correlacionar más estrechamente con la respuesta protectora in vivo que las líneas o clones a largo plazo. La línea celular policlonal se analizó para determinar su perfil de reconocimiento antigénico frente a los antígenos de C. muridarum, homólogos de las proteínas inductoras de CD4-Th1 de C. trachomatis. La disección de la especificidad de antígeno de la población policlonal de linfocitos T CD4+ protectores demostró que los antígenos inductores de CD4+/IFN^y+ de Chlamydia identificados durante una infección también son dianas de los linfocitos T CD4+ que desempeñan una parte en el aclaramiento rápido de la bacteria en una respuesta protectora a la infección, en ausencia de anticuerpos.

Las líneas de linfocitos T de Chlamydia derivaron de ratones Balb/c infectados y se verificó su actividad protectora en ratones intactos contra la exposición a C. muridarum. Posteriormente, el perfil de reconocimiento antigénico de los linfocitos T CD4+ de C. muridarum se caracterizó para definir la posible contribución de cada antígeno de C. muridarum en la inducción de linfocitos T CD4+ protectores. Para la preparación de linfocitos T CD4+ específicos de Chlamydia, los linfocitos T CD4+ esplénicos s purificaron de ratones Balb/c donantes previamente infectados por vía intranasal con 103 cuerpos elementales (RB) viables de C. muridarum. Una línea de linfocitos T CD4 que responde a los CE se obtuvo (denominada línea celular CE-CD4+) y se expandió in vitro con una estimulación a corto plazo con CE inactivados por calor. La línea mostró la capacidad de responder a los CE de C. muridarum produciendo IFN^y con una alta frecuencia (datos no mostrados). Para determinar la eficacia de la línea celular CE-CD4+ en la resolución de una infección, se transfirieron adoptivamente 107 linfocitos T CD4+ a 4 ratones con Balb / c receptores intactos. Se expuso a los ratones por vía intranasal 24 horas después de la infusión i.v. de linfocitos T CD4+ a 103 UFI de C. muridarum. El efecto protector de la inmunización adoptiva se evaluó cuantificando el número de UFI recuperados de los pulmones 10 días después de la exposición a Chlamydia. Como se muestra en la Figura 2a, los ratones intactos transferidos adoptivamente con linfocitos T CEB-CM ^c D4+ propagaron 3 Log-io menos UFI en los pulmones 10 días después de la exposición intranasal a 103 UFI de C. muridarum, en comparación con los ratones no tratados (valor de p: 0,008) o ratones que reciben una línea de linfocitos T CD4+ no relacionada. De manera similar, Los linfocitos T CD4+ esplénicos aislados de ratones que resolvieron una infección primaria intravaginal con 105 UFI de C. trachomatis confirieron una reducción significativa de UFI en ratones transferidos de forma adoptiva (datos no mostrados).

Para caracterizar el perfil de reconocimiento de antígenos de los linfocitos T CD4+ de C. muridarum, la mayoría de las proteínas de C. muridarum, el homólogo de las proteínas identificadas como inductores de CD4+ Th1 durante la infección por C. trachomatis (Figura 1), se obtuvo en forma recombinante y se probó su capacidad para estimular la línea protectora de linfocitos T CE-CD4 para producir IFN^y. En este análisis, se excluyó tanto a las proteínas que después de la purificación no habían alcanzado el nivel de pureza/endotoxinas requerido para el ensayo de estimulación de citocinas, o aquellos que, debido a su homología con proteínas bacterianas humanas no eran adecuados para desarrollar una vacuna (por ejemplo, proteínas del choque térmico, enolasa). La línea de linfocitos T CE-CD4+ protectores se estimuló in vitro con un panel de 19 proteínas recombinantes de C. muridarum, incluyendo MOMP. Catorce de ellos eran homólogos de antígenos inductores de CD4+ Th1 identificados en la selección primaria en ratones infectados y 5 eran controles negativos. Como se muestra en la Figura 2b, se descubrió que los 14 antígenos inductores de CD4 probados también eran dianas de la línea de linfocitos T CE-CM CD4+ protectores y capaces de inducir la producción de IFNy en un porcentaje de linfocitos T CD4 al menos 3 veces más altas que la frecuencia de los antígenos de control negativo. Por lo tanto, el patrón de antígenos de linfocitos T reconocido por la línea de linfocitos T CE-CM protectora de Chlamydia es comparable al perfil de reconocimiento de linfocitos T identificados en los ratones infectados con C. trachomatis.

Ejemplo 3: Respuesta de Th1 CD4+ específica de CT733 y CT153 en ratones BALB / c después de la infección primaria por C. trachomatis.

Los esplenocitos de ratones BALB / c infectados primarios y los controles no infectados se recogieron 10 días después de la infección y se estimularon con los antígenos recombinantes libres de LPS CT733 y CT153 (20 mg / ml). Después de 4 horas de estimulación, se añadieron 5 mg / ml de Brefeldina A a las células durante las siguientes 12 horas para bloquear la secreción de citocinas. Después de ello, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron. La expresión intracelular de IFN^y e IL-5 se analizó frente a la expresión en superficie de CD4 de las células viables acotadas y se evaluó mediante citometría de flujo.

El histograma en la Figura 3 muestra el número de linfocitos T CD4 por 105 esplenocitos T CD4+ de ratones infectados primarios (barras de color gris oscuro) y no infectados (barras e color gris claro) que producen IFNy tras una estimulación específica con los antígenos recombinantes de C. trachomatis CT153 y CT733. Los datos se confirmaron en varios experimentos adicionales usando el mismo protocolo.

Los resultados indican que CT733 y CT153 son capaces de inducir frecuencias significativas de células CD4 / IFNy específicas en esplenocitos de ratones Balb / c que se infectaron intravaginalmente con C. trachomatis, lo que sugiere un papel potencial como candidatos antigénicos para estas proteínas.

Ejemplo 4: Actividad protectora de los antígenos individuales TC0106 y TC0431 contra la exposición a C. muridarum.

CT733 y CT153 se probaron en un modelo de ratón de infección por Chlamydia para evaluar sus propiedades protectoras. Esto se realizó adoptando el modelo de ratón de infección pulmonar con la especie Chlamydia muridarum.

Las proteínas de C. muridarum TC0106 y TC0431, homólogas de CT733 y CT153, respectivamente, se clonaron y purificaron, y se usaron para el modelo de ratón.

Se inmunizaron grupos de ratones BALB / c con los antígenos recombinantes TC0106 o TC0431 formulados con adyuvante LTK63 CpG (3 dosis de 15 |jg de proteína a intervalos de 2 semanas, administrados por vía intramuscular). Como control negativo, los ratones se inmunizaron con el adyuvante solamente. Cuatro semanas después de la última inmunización, los animales se infectaron por vía intranasal con 103 UFI de C. muridarum infeccioso. Después de 10 días, La actividad protectora conferida por los dos antígenos se midió contando las UFI infecciosas en el pulmón de animales expuestos.

Como se muestra en la figura 4, cada uno de los dos antígenos (columnas de la parte media y derecha del histograma) pudo reducir significativamente el número de UFI/pulmón en ratones expuestos en comparación con los ratones inmunizados con adyuvante (columna de la izquierda del histograma), lo que indica que tanto TC0106 como TC0431 (y, por tanto, CT733 y CT153) confieren inmunidad protectora frente a la infección por Chlamydia.

Ejemplo 5: Actividad protectora de la combinación de TC0106 ⁺ TC0431 contra la exposición a C. muridarum.

Se inmunizaron grupos de ratones BALB / c (de 10 a 15 ratones) con la combinación de antígenos recombinantes TC0106 TC0431 formulados con adyuvante LTK63 CpG (3 dosis de 10 jg de cada proteína a intervalos de 2 semanas, administrados por vía intramuscular). Como control negativo, los ratones se inmunizaron con el adyuvante solamente. Cuatro semanas después de la última inmunización, se infectó a los animales con 103 UFI de C. muridarum infeccioso. Después de 10 días, La actividad protectora conferida por los dos antígenos se midió contando las UFI infecciosas en el pulmón de animales expuestos. Como control positivo, también se incluyó un grupo de ratones que recibieron una infección por C. muridarum primaria y secundaria (columna izquierda en el histograma de la Figura 5).

Como se muestra en la figura 5, la combinación de antígenos (columna derecha del histograma) fue capaz de reducir significativamente el número de UFI/ pulmón en los ratones expuestos en comparación con los ratones inmunizados con adyuvante (columna central del histograma).

Por lo tanto, la inmunización con CT733 y CT153, tanto solos como combinados, fue capaz de reducir significativamente la carga bacteriana en los pulmones de los ratones expuestos (véanse las Figuras 4 y 5).

Ejemplo 6: exposición de linfocitos Th1 CD4+ en ratones BALB / c después de la inmunización con los antígenos recombinantes TC0431 y TC0106, solos o en combinación.

Se inmunizaron grupos de ratones BALB / c (10 a 15 ratones) con los antígenos recombinantes TC0431 y TC0106 como antígenos individuales o en combinación (i.m., 10-15 microgramos / dosis, 3 dosis a intervalos de 2 semanas) utilizando adyuvante LTK63 CpG. Diez días después de la tercera dosis de inmunización, los esplenocitos se recogieron y se estimularon con antígenos recombinantes libres de LPS (20 mg / ml). Como control negativo, se incluyeron esplenocitos de ratones inmunizados con adyuvante. Después de 4 horas de estimulación, se añadieron 5 mg / ml de Brefeldina A a las células durante las siguientes 12 horas para bloquear la secreción de citocinas. Después de ello, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron. El IFN^y intracelular se analizó frente a la expresión en superficie de CD4 de las células viables acotadas y se evaluó mediante citometría de flujo. El histograma en la Figura 6 muestra el número de linfocitos T CD4+ por 105 esplenocitos T CD4+ que producen IFN^y por estimulación específica con los antígenos recombinantes en ratones inmunizados con TC0106, TC0431, la combinación de TC0106 TC0431 y ratones inmunizados con adyuvante.

Los resultados indican que la inmunización con estos antígenos provoca una alta frecuencia de linfocitos Th1 CD4 .

Ejemplo 7: Evaluación del efecto protector del antígeno o antígenos de Chlamydia contra la exposición a C. muridarum.

El efecto protector de combinaciones de dos antígenos seleccionados de CT279, CT601, CT372, CT443, CT733, CT153, CT456 y CT381 de C. trachomatis se probaron en el modelo de ratón de C. muridarum utilizando sus homólogos de C muridarum TC0551 (CT279), TC0651 (CT372), TC0727 (CT443), TC0890 (CT601), TC0106 (CT733), TC0431 (CT153), TC0660 (CT381) y TC0741 (CT456). El efecto protector de CT733 y CT153 individualmente también se evaluó.

Los ratones BALB / c se inmunizaron tres veces por vía intramuscular con una combinación de dos antígenos o antígenos individuales con LTK63 CpG como adyuvante. Veinticuatro días después de la inmunización, los ratones se expusieron por vía intranasal a 103 UFI de C. muridarum. Después de 10 días, se recogieron los pulmones, se homogeneizaron y se midió el número de Chlamydias viables (UFI / pulmón). Los datos en la Figura 7 muestran los recuentos medios de UFI / pulmón en ratones inmunizados con antígeno y control inmunizado con adyuvante. De izquierda a derecha, los carriles se refieren a (a) solo adyuvante; (b) TC0551+TC0890 (CT279+CT601); (c) TC0651+TC0727 (CT372+CT443); (d) TC0106+TC0431 (CT733+CT153); (e) TC0660+TC0741 (CT456+CT381); (f) TC0106 (CT733); (g) TC0431 (CT153). Para cada formulación de antígeno, el número de ratones infectados del total de inmunizados se informa en la forma "Inf X / Y", en la que X es el número de ratones infectados e Y es el número total de ratones expuestos. La importancia estadística de inmunizar antígenos (P), se determinó mediante la prueba t de Student.

Se han identificado cuatro combinaciones de dos antígenos que pueden conferir protección contra la exposición intranasal a C. muridarum. Para tres de ellos (TC0431 TC0106; TC0727+TC0651; TC0551+TC0890; homólogos de CT733 CT153; CT443+CT372; CT279 CT601) se ha confirmado protección en un gran número de ratones que usan adyuvante CKP LTK63 (Figura 7). Los experimentos de inmunización con TC0431 y TC0106 (CT153 y CT733) como antígenos individuales indican que los dos antígenos son ambos inmunogénicos individualmente y que cualquiera de los dos antígenos contribuye a la protección de la combinación CT153+CT733 (Figura 7). Recientemente se ha identificado una cuarta combinación de antígenos (TC660 TC0741; homólogos de CT456 y CT381) que muestran protección en un experimento de inmunización (15 ratones) (Figura 7).

Los experimentos se repitieron cuando el protocolo difería del descrito anteriormente en que los ratones se expusieron por vía intranasal a 103 UFI de C. muridarum tres semanas después de la última inmunización. Dado que pueden producirse diferencias en la duración de las infecciones en los animales, la presencia de Chlamydia infecciosas en los pulmones se determina en cada ratón a los 10 y 12 después de la exposición. Los experimentos de inmunización se repitieron al menos tres veces para generar datos de un número estadísticamente significativo de ratones. La Figura 8 muestra el número medio de Chlamydias infecciosas recuperadas del pulmón de ratones inmunizados con cada formulación de antígeno, en la que los datos obtenidos los días 10 y 12 se promediaron. Como se muestra en la figura 8, dos de las cuatro combinaciones probadas en el modelo de ratón, a saber TC0551 (homólogo de CT279, 82,6 % de identidad) TC0890 (homólogo de CT0601, 87,6 % de identidad) y TC0106 (homólogo de CT733, 84,8 % de identidad) TC0431 (homólogo de CT153, 64,6 % de identidad) mostraron un efecto protector estadísticamente significativo en los grupos inmunizados con al reducción de UFI de más de 1 log en comparación con los ratones a los que se inyectó adyuvante (P <0,001). Además, el 20-25% de los animales inmunizados con cualquiera de las dos combinaciones resolvieron completamente la infección los días 10-12, en comparación con el 9 % del grupo adyuvante.

Ejemplo 8: Evaluación de la actividad protectora de la combinación TC0551 ⁺ TC0890 ⁺ TC0106 ⁺ TC0431 contra la exposición a C. muridarum.

Sobre la base del resultado tratado en el ejemplo anterior, se inmunizó a los grupos de ratones con una combinación de cuatro antígenos TC0551 TC0890 TC0106 TC0431 usando el mismo régimen de inmunización que en el Ejemplo anterior. Como se muestra en la figura 8, la combinación de 4 antígenos parecía tener un efecto protector aditivo sobre las combinaciones de 2 antígenos, que muestra una reducción de 2,2 log de propagación de bacterias en el pulmón (P: 0,0003). Además, en el 39 % de los animales se resolvió totalmente la infección, lo que indica una mayor eficacia de esta combinación antigénica para acelerar el aclaramiento bacteriano.

La notable reducción en el número de las Chlamydias viables observado recuperadas de los pulmones de ratones inmunizado es la primera demostración de un alto nivel de protección inducida por la inmunización sistémica con proteínas de Chlamydia recombinantes. Asimismo, cabe destacar que, dado que se usaron formas desnaturalizadas de los antígenos recombinantes, una optimización adicional de la conformación del antígeno podría maximizar su actividad protectora.

Los datos preliminares destinados a identificar si cualquiera de los 4 antígenos recombinantes eran protectores cuando se administraron como antígenos únicos indicaron que se obtenía un nivel más bajo de reducción de UFI (menos de 1 log) con cualquiera de ellos (datos no mostrados). Esto está de acuerdo con la idea de que, en general, los enfoques de vacunación combinatoria son más eficaces a la hora de conferir inmunidad protectora contra un patógeno dado que los enfoques de vacuna única, ya que provocaron respuestas inmunitarias dirigidas a diferentes aspectos del ciclo de desarrollo bacteriano.

Ejemplo 9: Evaluación de la actividad protectora de la combinación TC0551 ⁺ TC0651 ⁺ TC0727 ⁺ TC0890 contra la exposición de la bursa intraovárica con C. muridarum.

El efecto protector de la combinación TC0551 TC0651 TC0727 TC0890 (homólogos de CT279 CT372 CT443 CT601 de C. trachomatis) se probó en el modelo de ratón de exposición de la bursa ovárica con C. muridarum utilizando el adyuvante Montanida CpG. Este modelo se ha descrito anteriormente que evalúa la actividad protectora de MOMp nativo (nMOMP), la proteína de la membrana externa mayor de Chlamydia (Pal S et al, Infect Immun., 73:8153, 2005). En este modelo, la actividad protectora de los antígenos se evalúa contra la progresión de la infección contando la propagación de Chlamydia en frotis vaginales.

Se inmunizó a ratones BALB / c tres veces por vía intranasal con una combinación de los cuatro antígenos o con MOMP, con LTK63 CpG como adyuvante. Como control negativo, también se incluyó a un grupo de ratones inmunizados con ovoalbúmina. Cuatro semanas después de la última inmunización, los ratones recibieron una exposición a C. muridarum en la bursa ovárica y la propagación de Chlamydia se midió contando las UFI en los frotis vaginales de animales infectados.

Los resultados que se muestran en la Figura 9 representan el número de UFI / frotis vaginal a las dos semanas de la exposición. Como se muestra en la figura 9, los ratones que recibieron la combinación de los cuatro antígenos muestran una reducción de la propagación bacteriana en comparación con el grupo de control negativo (ovoalbúmina). Por lo tanto, la combinación redujo la progresión e la infección. De forma interesante, el nivel de protección obtenido con la combinación no difiere significativamente del obtenido con nMOMP, que es el antígeno más protector que se ha identificado hasta ahora. Por lo tanto, esta combinación de cuatro antígenos es una combinación particularmente inmunogénica.

Ejemplo 10: Perfiles de citocinas específicas de antígeno de linfocitos T CD4+ protectores

Dada la importancia de la respuesta CD4-Th1 en la mediación de la protección contra la infección por Chlamydia, se analizó el tipo de respuesta inmunitaria inducida por la vacunación con dos combinaciones antigénicas que provocaron protección en ratones (TC0551 TC0890 y TC0106 TC0431). En particular, se midió la producción simultánea de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno de IFN^y, TNF -a e IL-2, considerando esto como una indicación de funciones efectoras óptimas de linfocitos T CD4+, mejorando posiblemente la protección para vacunas dirigidas a las respuestas de linfocitos T. La valuación del perfil de citocinas inducido en un linfocito T CD4+ específica de un solo antígeno mediante vacunación se realizó mediante análisis citométrico de flujo multiparamétrico (Perfetto SP y col., Nat. Rev.Immunol. 4, 648-655, 2004) en ratones inmunizados. La sangre periférica se recogió 12 días después de la última inmunización con las combinaciones de antígenos TC0551 TC0890 y TC0106 TC0431. Se prepararon PBMC y se evaluó la frecuencia de células CD4+ CD3+ específicas de antígeno productoras de IFNy, IL-2 y TNF mediante tinción intracelular de citocinas y determinación por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 10B, la vacunación con la combinación antigénica TC0551-TC0890 indujo una frecuencia elevada de linfocitos T CD4+ respondedores a TC0551 productoras de IFN^y (93 linfocitos T CD4+ específicos de TC0551 en 105 linfocitos CD4+), mientras que la respuesta al TC0890 fue muy baja, con una frecuencia de 16 linfocitos T respondedores a IFN^y + en 105 linfocitos CD4+. La respuesta a la combinación antigénica utilizada para la inmunización mostró una respuesta incrementada en comparación antígenos individuales, con 132 linfocitos T productores de IFNy en 105 linfocitos CD4 . Además, había una frecuencia predominante de linfocitos T CD4+ multifuncionales, que producían IFN^y y TNF-a o IFN^y / TNF-a / IL-2 simultáneamente. En el grupo control de ratones inmunizados simulados no hubo secreción de citocinas en respuesta a ningún antígeno recombinante utilizado para la estimulación, lo que es indicativo de la especificidad de la respuesta observada en los ratones vacunados. En cuanto a la respuesta de CD4+ a la combinación antigénica TC0106-TC0431 se refiere (Figura 10C), ambos antígenos, TC0106 and TC0431 indujeron una respuesta similar con una frecuencia, respectivamente, de 120 y 98 linfocitos T específicos de antígeno IFNy en 105 CD4+, mientras que la combinación de antígenos mostró una frecuencia de 145 linfocitos T respondedores a IFN^y+ en 105 linfocitos CD4+. El análisis adicional de citocinas producidas simultáneamente con IFN^y mostró que aproximadamente el 50 % de las células IFN^y+ produjeron también TNF-a e IL-2, mientras que aproximadamente el 30 % de ellas produjo TNF-a. En general, estos datos subrayan que las citocinas Th1 producidas por linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos por la vacunación mostraban una diferencia funcional que podría reflejar diferencias en la capacidad para eliminar la infección.

Ejemplo: 11. Análisis de la expresión de antígenos de Chlamydia inductores de CD4+.

A continuación, los inventores investigaron la expresión de CT279 (subunidad C de la NADH-quinona reductasa de translocación de Na(+), CT601 (fosfatasa de la familia de repetición de invasina), CT733 (proteína hipotética) y CT153 (proteína perforina MAC) mediante análisis por inmunotransferencia tanto en Ct-CE como en células HeLa infectadas con C. trachomatis, utilizando sus antisueros inmunitarios de ratón específicos (Figura 11A). Los lisados de proteínas totales de los CE purificados por renografina (correspondientes a aproximadamente 107 CE por carril) mostraron que cada antisuero analizado podía reaccionar con una banda de proteína del peso molecular esperado en ambas muestras de CE, mostrando en general una mayor reactividad frente a los CE de CM. Para el análisis de la expresión del antígeno en células infectadas por Chlamydia, se prepararon extractos de proteínas totales a partir de células Hela 229 en diferentes puntos de tiempo después de la infección (24 - 48 - 72 h) y se probaron por inmunotransferencia.

La cantidad de proteínas de Chlamydia cargadas en el gel se normaliza sobre la base de la expresión de MOMP como se ha descrito. Como se muestra en la Figura 11B, los cuatro antígenos aparecieron en diferentes fases del desarrollo de la Chlamydia.

Por último, los inventores también investigaron la localización celular del antígeno en las células HeLa infectadas mediante microscopia confocal en células Hela infectadas 6, 24, 48 y 72 h después de la infección. Como se muestra en la Figura 11B, la expresión de todos los antígenos se detectó claramente dentro de las inclusiones a las 24 h de la infección y aún era visible a las 72 h. Curiosamente, la tinción de CT153 pareció acumularse en la membrana de inclusión, mientras que las otras proteínas se distribuían de forma homogénea. Dado que CT153 codifica una proteína perforina MAC, perteneciente a una familia de proteínas capaz de romper la membrana celular, la acumulación de esta proteína en la membrana de inclusión podría anticipar su implicación en la salida de Chlamydia de las células infectadas.

El análisis de la respuesta inmunitaria después de la vacunación con las combinaciones ha demostrado que todos los antígenos recombinantes indujeron una respuesta humoral sólida, con la producción de títulos de anticuerpos IgG2a superiores a IgG1, como se esperaba para una respuesta inmunitaria dirigida por Th1. Dado que la resolución de una infección por Chlamydia requiere una respuesta inmunitaria celular de tipo Th1, también se ha investigado la regulación de las células de memoria y efectoras Th1 CD4 después de la vacunación. Las diferencias en el tipo de citocinas producidas por células individuales tienen implicaciones importantes por su capacidad para mediar en las funciones efectoras, son sostenidas como linfocitos T de memoria o ambas cosas. Los linfocitos T CD4+ que solo secretan IFN^y tienen una capacidad limitada para desarrollarse en linfocitos T de memoria en comparación con células doble positivas para IL-2-IFNy (Hayashi N. y col., 2002). Por lo tanto, las vacunas que producen una alta frecuencia de células productoras de ⁱFN^y positivas únicas pueden estar limitadas en su capacidad para proporcionar una protección duradera. Adicionalmente, la mayoría de los linfocitos T CD4+ que producen IL-2, IFNy y TNF se clasifican como células de memoria efectoras, desempeñando un papel esencial en la mediación de la protección contra patógenos intracelulares (Darrah PA y col., 2007). Los inventores demostraron que las linfocitos T CD4+ específicos de antígeno inducidos por inmunización con las combinaciones protectoras eran predominantemente multifuncionales, diferenciándose para asegurar una población de linfocitos Th1 que incluían células efectoras y de memoria. Un equilibrio adecuado de células del linaje Th1 que se puede mantener y aquellas con funciones protectoras inmediatas podría ser la fórmula exitosa para una vacuna eficaz.

Ejemplo 12: Combinación de CT823 + CT733 + CT043 + CT456

Para evaluar la actividad protectora de los antígenos TC0106, TC0313, TC0210, TC0741 y su combinación, se inmunizó a grupos de ratones con los 4 antígenos, ya sea de forma individual o en una combinación de 4 antígenos, utilizando el mismo régimen de inmunización descrito en el Ejemplo 7. La actividad protectora de los antígenos individuales se evaluó midiendo las UFI/pulmón el día 12 después de la infección. La actividad protectora de la combinación de 4 ag se midió 10, 12, 14 días después de la infección, para evaluar la cinética de la eliminación de la infección. Como se muestra en la figura 12, los antígenos individuales confirieron aproximadamente 0,5-1 log de reducción de UFI en el pulmón de animales infectados.

La combinación de cuatro antígenos mostró una propiedad protectora más alta, lo que indica una actividad sinérgica de los cuatro antígenos para conferir protección, provocando una reducción de aproximadamente 4 logs de la propagación bacteriana en el pulmón (P <0,0001) el día 12 y mostrando una tendencia a resolver la infección el día 12. Además, un alto número de ratones (42 %) resolvió totalmente la infección, lo que indica la eficacia de la combinación antigénica en la aceleración del aclaramiento bacteriano.

Ejemplo 13: Evaluación de la antigenicidad de CT812, CT387, CT869, CT166 y CT175

Respuesta de CD4 Tg1 específica de antígeno en ratones BALB / c después de una infección primaria con C.trachomatis (CT

Se evaluó la respuesta CD4 Th1 específica de antígeno en ratones BALB / c después de una infección primaria por C. trachomatis (CT). Los antígenos de C. trachomatis identificados por la caracterización proteómica de la fracción de membrana de células HeLa infectadas por CT se probaron para determinar su capacidad para inducir una respuesta CD4+Th1 específica en ratones que recibieron una infección experimental por CT. Los esplenocitos de ratones BALB / c infectados primarios y los controles no infectados se recogieron 10 días después de la infección y se estimularon con antígenos recombinantes libres de LPS (20 |jg / ml). Después de 4 horas de estimulación, se añadieron 5 jg / ml de Brefeldina A a las células durante las siguientes 12 horas, para bloquear la secreción de citocinas. Después de ello, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron. La expresión de IFN-y intracelular se analizó frente a la expresión en superficie de CD4 de las células viables acotadas se evaluó mediante citometría de flujo. El histograma en la Figura 13A y la Figura 13B muestra el número de linfocitos T CD4+ que producen IFNy, sobre la estimulación específica con antígenos recombinantes de CT por 105 esplenocitos T CD4+ de ratones infectados primarios (barras de la derecha) y no infectados (barras de la izquierda). Los datos son representativos de 4 experimentos diferentes. Tal como se muestra en la Figura 13A, CT812C, CT387, CT869 y CT166 indujeron una frecuencia significativa de células CD4+-IFN^y+ en esplenocitos de animales infectados (Pval <0,05). Como se muestra en la Figura 13B, CT812C (un fragmento C-terminal de CT812) indujo sorprendentemente una mayor frecuencia de células CD4+-IFNy+ en esplenocitos de animales infectados en comparación con la secuencia CT812 de longitud completa.

Actividad protectora de la combinación de TC0197 + TC0261 + TC0666 contra la exposición a C. muridarum El efecto protector de la combinación de los tres antígenos de C. trachomatis CT387 CT812 CT869 se analizó en el modelo de ratón de C. muridarum utilizando sus ortólogos de C. muridarum TC0666, TC0197 y TC0261, respectivamente. TC0197, TC0261 y TC0666 se clonaron y purificaron para estudios de protección en el modelo de ratón de infección intranasal con C. muridarum. Se inmunizaron grupos de ratones BALB / c (16 ratones por grupo) con la combinación de los tres antígenos recombinantes TC0197 TC0261 TC0666 formulados con adyuvante LTK63 CpG (3 dosis de 10 jg de cada proteína, en el intervalo de 2 semanas, administrada por vía intramuscular). Como control negativo, los ratones se inmunizaron con el adyuvante solamente. Cuatro semanas después de la última inmunización, se infectó a los animales con 103 UFI de C. muridarum infeccioso. Después de 12 días, La actividad protectora conferida por los dos antígenos se midió contando las UFI infecciosas en el pulmón de animales expuestos. Como se muestra en la figura 14, la combinación de antígenos TC0197 TC0261 TC0666 pudo reducir significativamente el número de UFI / pulmón en ratones expuestos en comparación con los ratones inmunizados con adyuvante (reducción de 1,4 log de las UFI con Pval <0,05). El hallazgo de que la combinación de TC0197+TC0261+TC0666 puede proteger a os ratones contra la exposición a C. muridarum (Figura 14) proporciona evidencia de que las combinaciones CT812 CT869 CT387 y CT812C CT869 CT387 de C. trachomatis protegen contra la infección por C. trachomatis.

Actividad protectora de TC0197, TC0261 y TC0666 como antígenos individuales contra la exposición a C. muridarum

Se evaluó la actividad protectora de TC0197, TC0261 y TC0666 como antígenos individuales contra la exposición a C. muridarum. Se inmunizaron 3 grupos de ratones BALB / c (16 ratones por grupo) con los tres antígenos recombinantes formulados individualmente con adyuvante LTK63 CpG (3 dosis de 20 jg de cada proteína, en el intervalo de 2 semanas, administrada por vía intramuscular). Como control negativo, los ratones se inmunizaron con el adyuvante solamente. Cuatro semanas después de la última inmunización, se infectó a los animales por vía intranasal (I.N.) con 103 UFI de C. muridarum infeccioso. Después de 12 días, la actividad protectora conferida por los tres antígenos individuales se midió contando las UFI infecciosas en el pulmón de los animales expuestos. Como se muestra en la figura 15, ninguno de los 3 antígenos individuales redujo significativamente al número de UFI / pulmón en ratones expuestos en comparación los ratones inmunizados adyuvantes.

Por lo tanto, la combinación de TC0197 TC0261 TC0666 es capaz de proteger a los ratones contra la exposición a C. muridarum (Figura 14). En particular, la Figura 14 muestra la protección en términos de reducción en el número medio de UFI recuperadas de pulmones de ratones inmunizados frente a controles inmunizados con adyuvante [p = 0,0024]. En cambio, los tres antígenos no son protectores cuando se administran individualmente (Figura 15).

Ejemplo 14: Materiales y procedimientos

Los protocolos experimentales utilizados en los Ejemplos 1, 2, 7 (experimentos repetidos), 8, 10 y 11 se describen con más detalle en este ejemplo.

Cepas bacterianas, cultivos y reactivos Se cultivaron la cepa D/UW-3/CX de la serovar D de Chlamydia muridarum Nigg y Chlamydia trachomatis en monocapas confluentes de células LLCMK2 (ATCC CCL7) o HeLa 229 (ATCC CCL 2.1) en medio mínimo esencial de Earle (EMEM) como se ha descrito (Caldwell y col. (1981) Infect Immun 31: 1161-1176). La purificación de los CE de C. trachomatis y C. muridarum se llevó a cabo mediante centrifugación por gradiente de densidad de Renografina como se ha descrito (Montigiani y col. (2002) Infect Immun 70: 368-379.). Las bacterias se alicuotaron y se almacenaron a -70 °C en tampón de sacarosa fosfato glutamina (SPG) hasta su uso. Cuando se indicó, los CE se inactivaron por calor a 56 °C durante 3 horas.

Se cultivó E. coli DH5a o BL21 (DE3) aeróbicamente en medio de caldo Luria (LB) (Difco) a 37 °C. Cuando fue apropiado, se añadieron ampicilina (100 |jg / ml) e isopropil-beta-D-galactopiranósido (IPTG, 0,5 mM) al medio. A menos que se especifique lo contrario, todos los productos químicos se adquirieron en Sigma. Las enzimas de restricción y las enzimas de modificación de ADN fueron de New England Biolabs. A menos que se indique otra cosa, todos los reactivos y anticuerpos para la tinción intracelular de citocinas se obtuvieron de BD Biosciences Pharmingen. Los reactivos de microscopia confocal fueron de Molecular Probes.

Clonación de genes, expresión de proteínas y preparación de antisueros

Para producir proteínas recombinantes de C. trachomatis y sus homólogos de C. muridarum, los genes se amplificaron por PCR a partir de ADN cromosómico de C. trachomatis y C. muridarum utilizando cebadores específicos hibridando los extremos 5' y 3' de cualquiera de los genes. Los genes se clonaron en el plásmido pET21b+ (Invitrogen) o pGEXKG (Amersham) para expresarlos como una fusión del marcador His C-terminal y como una proteína de doble fusión con la secuencia codificante de la glutatión transferasa N-terminal y un marcador His C-terminal.

La clonación y purificación de las fusiones de His y GST se realizaron como ya se ha descrito (Montigiani y col., 2002). CT0681 y TC0052, que codifican para MOMp de C.trachomatis y C. muridarum, respectivamente (Ct Mo MP y Cm MOMP, respectivamente) se expresaron como fusiones de His y se purificaron a partir de la fracción de proteína insoluble. Con la excepción de TC0313 y TC0210, todas las proteínas de C. muridarum utilizadas en este trabajo se purificaron solo a partir de la fracción de proteína insoluble en forma desnaturalizada.

Para los ensayos de estimulación in vitro de linfocitos T, se prepararon proteínas libres de LPS mediante lavado de proteínas inmovilizadas en columna con tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8, que contiene Triton X114 al 1 % (35 ml) a 4 °C. La cantidad de endotoxina residual se determinó utilizando un kit de análisis de lisado de amebocitos de Limulus (QCL-100, BioWhittaker, Walkerville, MD).

Se generaron y trataron antisueros de ratón como se ha descrito (Montigiani y col., 2002). Cuando se especifica, se usaron sueros de ratones inmunizados con 20 |jg de proteínas contaminantes de E. coli (proteínas purificadas por IMAC de bacterias E. coli que contenían el vector pET21b+ vacío) como control negativo. Se realizó transferencia Western, ELISA y citometría de flujo de CE de C. trachomatis como se ha descrito (Finco y col. (2005) Vaccine 23: 1178-1188.).

Detección de la respuesta CD4-Th1 específica de antígeno en esplenocitos de ratones infectados

Los grupos de ratones BALB / c hembra de 6 semanas de edad adquiridas en Charles River Laboratories (3 ratones / grupo) recibieron un tratamiento hormonal subcutáneo con 2,5 mg de Depo-Provera (acetato de medroxiprogesterona) y, después de cinco días, se inoculó a los ratones por vía intravaginal 15 ul de tampón SPG que contenía 106 de UFI de C. trachomatis. El nivel de infección se analizó 7 días después de la exposición, recogiendo los frotis vaginales y contando las inclusiones de Chlamydia 48 horas más tarde teñidas con anticuerpo anti-Chlamydia conjugado con FITC (Merifluor) utilizando un microscopio UV.

Los frotis se recogieron en 400 j l de SPG y se inocularon en monocapas de células LLCMK2 sembradas en placas de fondo plano de 96 pocillos. Después de 48 horas de incubación, se determinó el número de clamidias infecciosas contando las inclusiones de Chlamydia.

Diez días después de la exposición, se sacrificó a los ratones y se extrajeron los bazos. Los esplenocitos se prepararon mediante homogeneización a través de un filtro de nailon (BD) y los eritrocitos se eliminaron mediante lisis hipotónica en un tampón de lisis Ack (NH4Cl 0,155 M, KHCO3 10 mM, Na2EDTA 0,1 mM) durante 3 minutos a TA, a continuación, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 2x106 células por pocillo y se estimularon con 20 jg / ml de antígeno específico libre de endotoxinas o con 4 jg / ml de CE purificados en presencia de 1 jg / ml de anticuerpo anti-CD28 (BD Biosciences Pharmingen) durante 4 horas a 37 °C. A continuación se añadió Brefeldina A (BFA; Sigma-Aldrich) a una concentración final de 2,5 jg / ml y las células se incubaron durante 16 horas adicionales antes de la tinción intracelular de citocinas. Las células se tiñeron para determinar su viabilidad con LIVE / DEAD® (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las células se fijaron y se permeabilizaron usando el kit de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences Pharmingen) y se tiñeron con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo para la detección de células que expresan CD3, CD4 en la superficie e IFNy e IL-4 intracelulares. Por último, las células se resuspendieron en PBS, 1 % de BSA. Todos los anticuerpos para la tinción de citocinas intracelulares se adquirieron de BD Pharmingen. La adquisición de las muestras se realizó usando un citómetro de flujo BD Canto y los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, Estados Unidos). La expresión intracelular de IFN^y e IL-4 se analizó en células individuales que expresan CD4, previamente acotadas por, la morfología, la expresión de CD3 y la viabilidad. A continuación se recogieron las células y se tiñeron para detectar la expresión en superficie de CD4 y la producción intracelular de IFN^y o IL-4, para investigar las respuestas observadas eran de tipo Th1 (IFN^y) o Th2 (IL-4). Como control negativo, se extrajeron los bazos de los ratones no infectados y se analizaron en paralelo.

Preparación de líneas celulares CD4+Th1 y células presentadoras de antígeno (CPA)

Los esplenocitos se prepararon mediante homogeneización de bazos de ratones Balb/c donantes previamente infectados por vía intranasal con 103 cuerpos elementales (CE) viables de Chlamydia muridarum (C. muridarum) como se ha descrito anteriormente. Después de la centrifugación a 1.200 rpm y la suspensión en tampón Macs (PBS pH 7,2 BSA al 0,5 % y EDTA 2 mM), las células se incubaron con microperlas de CD4 (L3T4) (Milteny Biotec) durante 15 minutos y luego se cargaron en columnas LS. Las células CD4 unidas al imán se recuperaron, se lavaron y se suspendieron en RPMI 1640 complementado con suero fetal bovino al 2,5 % (Hyclone), antibióticos, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM, vitaminas MEM (Gibco) y Betamercaptoetanol 0,5 pM. A continuación, se sembraron las células en placas de 6 pocillos, 107 células/pocillo. Después de la primera estimulación, los CD4 purificados se lavaron dos veces y después se sembraron en placas con CPA como se describe a continuación.

Asimismo, se obtuvo una línea celular CD4+ con C. trachomatis a partir de bazos de ratones Balb / c donantes que se habían infectado previamente por vía intravaginal con 106 cuerpos elementales (CE) viables de Chlamydia trachomatis y se realizó como se ha descrito anteriormente para Chlamydia muridarum.

Las células CD4 se sembraron (6x106 / pocillo) con CPA (2x107 / pocillo) preparadas mediante bazos de ratones sin tratamiento previo. Los esplenocitos se prepararon como se ha descrito anteriormente, después se lavaron dos veces con el medio, se irradiaron con rayos gamma durante 7 minutos, se lavaron nuevamente y se suspendieron en medio.

A continuación, los cultivos se incubaron a 37 °°C en una atmósfera humidificada que contenía un 5 % de CO2. Después de 24 horas, se añadió Aldesleukin proleukin (IL2) a una concentración de 20U / ml.

Modelo de ratón de C. muridarum y C. trachomatis de transferencia adoptiva

En grupos de ratones BALB/c hembra de 6 semanas de edad adquiridas en Charles River Laboratories (4 ratones / grupo), se realizó la transferencia adoptiva mediante administración intravenosa de 107 linfocitos T CD4+ en 100 pl de medio RPMI-1640 (Sigma). Se expuso a los ratones por vía intranasal 24 horas después a 103 UFI de C. muridarum o 105 UFI de C. trachomatis. El efecto de la inmunización adoptiva se evaluó cuantificando el número de UFI recuperadas de los pulmones tomado 10 días después de la exposición a C. muridarum o 6 días después de la prueba de exposición a C. trachomatis, tal como se ha descrito anteriormente.

Caracterización de la línea de linfocitos T CD4+ de C. muridarum

El mismo día de la transferencia adoptiva, se tomó un alícuota de linfocitos T CD4+ purificados para evaluar la capacidad de los antígenos de C. muridarum identificados en la detección de CD4+TH1+ previa que los estimulaban in vitro. Se sembraron 250.000 células / pocillo en placas de 96 pocillos con 106 esplenocitos CD4 de ratón deplecionados como CPA y estimulados con 20 pg / ml de proteínas de C. muridarum, homólogas de las proteínas C. trachomatis identificada como inductores CD4+Th1, en presencia de 1 pg / ml de anticuerpo anti-CD28 (BD Biosciences Pharmingen) durante 3 horas a 37 °C. A continuación, se añadió BFA y se realizó una tinción intracelular como se describe para los esplenocitos.

Modelo de protección de ratón

Grupos de ratones BALB / c hembra de 6 semanas de edad (10-15 ratones / grupo), se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.) con 3 dosis de las combinaciones de antígenos TC0551-TC890 (15 pg/dosis) y TC0106-TC0431(que contiene 10 pg de cada proteína / dosis) los días 1, 15 y 28 se formularon con 5 pg de adyuvante LTK63 (Ryan y col., 2000) 10 pg de CpG (ODN 1826) en 50 pl de PBS. Como control negativo, se incluyeron grupos de ratones que recibieron el adyuvante solo y se trataron en paralelo.

Tres semanas después de la última inmunización, se inoculó a los ratones por vía intranasal (i.n.) 40 pl de tampón SPG que contenía 103 UFI de C. muridarum. La dosis de exposición a Chlamydia administrada a cada ratón se confirmó mediante el cultivo en diluciones seriadas por triplicado de la dosis de inoculación en monocapas de células LLCMK2 sembradas en placas de fondo plano de 96 pocillos. Después de 24 horas de incubación, se determinó el número de clamidias infecciosas contando las inclusiones de Chlamydia. En el período de tiempo entre 10 y 12 días después de la exposición, se sacrificó a los ratones, se aislaron los pulmones y sus homogeneizados se utilizaron para evaluar el crecimiento de Chlamydia.

Análisis de la respuesta CD4-Th1 específica de antígeno en PBMC de ratones

Se aislaron PBMC de ratón de hasta 2 ml de sangre heparinizada, se diluyeron 1/5 en HBSS (solución salina equilibrada de Hank) y se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Lympholite-M (Cedarlane). Se sembraron 106 PBMC por duplicado en placas de 96 pocillos con 106 esplenocitos CD4 de ratón deplecionados como CPA y se estimularon y se tiñeron como se ha descrito anteriormente para los esplenocitos de ratón durante 16 horas. En esta tinción se analizó la expresión de IFN^y, TNFa e IL-2.

Microscopía con focal

Para examinar la localización celular de las proteínas de C. trachomatis después de la infección, las células HeLa (20.000) se sembraron en placas sobre cubreobjetos de vidrio (0,13 mm) y después de 24 horas se infectaron con CE de CT en una proporción de 1:1 como se ha descrito anteriormente. A las 6, 24, 48 y 72 horas de la infección, las células se fijaron en paraformaldehído al 2 % en tampón PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 2 semanas con PBS, las células se permeabilizaron con una solución de 1 % / saponina al 0,1 % de Triton en PBS durante 20 minutos.

Después de lavar y bloquear con PBS que contenía BSA al 1 % (PBS-BSA), las muestras de células se sometieron a anticuerpos y a tinción química. Las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (dilución estándar 1:5000 en PBS-BSA) con antisueros policlonales obtenidos de ratones inmunizados con TC601, TC279, TC733 y TC153, previamente pre-adsorbidos durante la noche a 4 °C en tiras de nitrocelulosa que contenían proteínas totales de células de E. coli BL21. Se utilizaron anticuerpos conjugados anti-ratón Alexa Fluor (Molecular Probes) (excitación a 488) para visualizar la localización de cada antígeno. Se utilizaron yoduro de propidio y faloidina conjugados con el colorante Alexa Fluor A620 (Molecular Probes) para visualizar, respectivamente, el ADN y la actina.

Después de extensos lavados en PBS, las células se montaron con reactivo anti-Fade (Molecular Probes) y se observaron bajo un microscopio confocal de barrido láser (Bio-Rad) con lentes de objetivo de inmersión en aceite 100X.

Se entenderá que la divulgación se ha descrito únicamente a modo de ejemplo.

TABLA 2

continuación

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína para su uso en terapia para la infección por Chlamydia, en la que la proteína comprende:

a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o

b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95 % o mayor con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o

c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

2. Un anticuerpo que se une a una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1 para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

3. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína o anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

4. La molécula de ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.

5. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

6. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico o vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

7. Una composición que comprende una proteína, anticuerpo, molécula de ácido nucleico, vector o célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en terapia para la infección por Chlamydia.

8. La proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición para su uso:

i. como una composición de vacuna;

ii. como producto farmacéutico;

iii. en el tratamiento o prevención de Chlamydia, preferentemente Chlamydia trachomatis; o

iv. en la elevación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

9. Una proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-7, en la que la proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición es para su uso en la producción de anticuerpos que son capaces de neutralizar la infección por Chlamydia.

10. La proteína o el ácido nucleico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la reivindicación 8, en la que la proteína o ácido nucleico es capaz de inducir una respuesta mediada por células CD4+-Th1.

11. La proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición es para su uso en terapia en combinación con uno más antígenos de Chlamydia adicionales o sus ácidos nucleicos codificantes.

12. La proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición de acuerdo para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la combinación comprende:

a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; o

b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; o

c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.

13. La proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que la proteína, anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula huésped o composición y el uno o más antígenos adicionales de Chlamydia o sus ácidos nucleicos codificantes se administran de forma simultánea, por separado o secuencial.

14. Un procedimiento para diagnosticar la infección por Chlamydia in vitro, que comprende:

(a) elevar un anticuerpo contra una proteína que comprende

i. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o

ii. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95 % o mayor con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o

iii. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64;

(b) poner en contacto el anticuerpo de la etapa (a) con una muestra biológica sospechosa de estar infectada con Chlamydia en condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo-antígeno; y

(c) detectar dichos complejos, en el que la detección de dicho complejo es indicativa de infección por Chlamydia.