ES2740124T3 - Terapia de bacteriófagos - Google Patents

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Abstract

Composición farmacéutica que comprende: (i) al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva; y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable; para su uso en el tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal, en la que la composición comprende al menos una de la cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P1, la cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P2, la cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I- 4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P3, la cepa de bacteriófagos P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P4, la cepa de bacteriófagos P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P5, la cepa de bacteriófagos P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P6, la cepa de bacteriófagos P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P8 y la cepa de bacteriófagos CLB_P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4675 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos CLB_P2,

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia de bacteriófagos
Campo de la invención
La presente invención se encuentra en el campo de la terapia de bacteriófagos para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales.
Antecedentes
Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias mediante interacción específica.
La enfermedad de Crohn (EC), también conocida como enteritis regional, es una enfermedad inflamatoria de los intestinos que puede afectar a cualquier parte del tubo digestivo desde la boca hasta el ano, provocando una amplia variedad de síntomas. Provoca principalmente dolor abdominal, diarrea, vómitos o pérdida de peso, pero también puede provocar complicaciones fuera del tubo digestivo tales como erupciones cutáneas, artritis, inflamación de los ojos, cansancio y falta de concentración.
Aunque todavía se desconoce la causa exacta de EC, una combinación de factores ambientales y predisposición genética parece provocar la enfermedad. Se cree que EC es una enfermedad autoinmunitaria, en la que el sistema inmunitario del organismo ataca al tubo digestivo, provocando inflamación; se clasifica como un tipo de enfermedad inflamatoria intestinal (EII).
En pacientes con EC, se observa expresión anómala de la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 6 (CEACAM6) en la superficie apical del epitelio ileal y las lesiones ileales de EC se colonizan por Escherichia coli adherente-invasiva patógena (AIEC).
No existe cura farmacéutica o quirúrgica conocida para la enfermedad de Crohn. En particular, ni EII en general ni EC en particular pueden tratarse con antibióticos (que se dirigen a combatir E. coli patógena). Las opciones de tratamiento se limitan a controlar los síntomas, mantener la remisión y prevenir recaídas.
Dogan et al., Inflammatory Bowel Diseases (enero de 2013), vol. 19, n.° 1, págs. 141-150 es un estudio científico que examina el tratamiento de la enfermedad de Crohn con antibióticos eficaces contra E. coli.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: (i) al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva; y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable; para el tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal (EII).
La presente divulgación proporciona además un método de tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal que comprende administrar a un sujeto que lo necesita al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva tratando de ese modo al sujeto.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención también usa una cepa de bacteriófagos CLB_P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4675 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
Para el propósito de la presente invención, una variante de una cepa de bacteriófagos se considera que tiene la misma actividad lítica que dicha cepa de bacteriófagos si actúa al menos “+” contra al menos una de las cepas de AIEC LF82, 07081, 07082, 07076 y 06075 en el “ensayo in vitro de la infectividad de bacteriófagos en cepas de AIEC” descrito en el ejemplo 3 a continuación. En una realización preferida, una variante se considera que tiene la misma actividad lítica si actúa al menos “+” contra las cinco cepas de AIEC LF 82, LF 06075, LF 07076, Lf 07081 y LF 07082 (las cepas de AIEC LF 06075, LF 07076, LF 07081 y LF 07082 también se abrevian en el presente documento como 06075, 07076, 07081 y 07082, respectivamente). Estas cepas de AIEC las ha depositado la Université Lille 2 - Droit et Santé, 42 Rue Paul Duez, 59000 Lille (Francia) en la Colección Nacional Francesa en el Instituto Pasteur bajo los números de registro CNCM I-4712 (LF 82), CNCM I-4713 (LF 06075), CNCM I-4714 (LF 07076), CNCM I-4715 (LF 07081) y CNCM I-4716 (LF 07082).
Para el propósito de la presente invención, una variante de una de las cepas de bacteriófagos P1 a P6, P8 y CLB_P2 se considera que tiene las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos si tiene al menos una identidad de secuencia del 80% en al menos el 70% de la longitud, preferiblemente al menos una identidad de secuencia del 90% en al menos el 80% de la longitud y más preferiblemente identidad de secuencia completa en al menos el 90% de la longitud (tal como se determina mediante el algoritmo BLAST) con la proteína de cápside principal de bacteriófago wV8 (para las variantes de P1 a P6) o bacteriófago RB69 (para las variantes de P8) o bacteriófago JS98 (para las variantes de CLB_P2), tal como se describe a continuación en la sección “Identificación de proteínas de la cápside principales”.
En una realización adicional de la presente divulgación, una variante de un bacteriófago tiene la misma actividad lítica que el bacteriófago. En una realización de la presente invención, una variante de un bacteriófago tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que el bacteriófago.
Descripción detallada de la invención
La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: (i) al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva; y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable; para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria intestinal.
La presente divulgación proporciona además un método de tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal que comprende administrar a un sujeto que lo necesita al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva tratando de ese modo al sujeto.
Una “cepa de Escherichia coli adherente-invasiva (AIEC)” tal como se usa en el presente documento debe entenderse que hace referencia a una cepa de E. coli que tiene un potencial de invasión medio igual a o mayor del 0,1% en un cultivo celular de la línea de células intestinales I-407, En otras palabras, una cepa de AIEC tiene la capacidad de invadir un cultivo de células intestinales de I-407 con un índice de invasión igual o superior al 0,1% del inóculo original (tomado como el 100%), cuando se somete a prueba según el ensayo de invasión descrito a continuación en la sección “Ensayo de invasión” (véase también Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421).
Ejemplos no limitativos de cepas de AIEC son LF82, LF82SK (depositadas por la Université d'Auvergne, 49 Boulevard Frangois Mitterand, 63001 Clermont-Ferrand (Francia) en la Colección Nacional Francesa en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4723), aquellos indicados en la tabla 1 a continuación en el presente documento y aquellos indicados en la siguiente lista de elementos (véase Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421, especialmente la página 417, tabla 2): LF31, LF71, LF123, LF138, LF9, LF15, LF28, LF50, LF65, LF119, LF128, LF130, LF73, LF100, LF110, LF134, LF105, LF49-2, LB11 y LF45-2, En una realización, la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva es LF82, 07081, 07082, 07076 ó 06075, en particular LF82,
En una realización, la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva está presente en el colon del sujeto. En otra realización, la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva está presente en el íleo del sujeto. En aún otra realización, la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva está presente en una o más partes del intestino (delgado y/o grueso) del sujeto.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En una realización, la al menos una cepa de bacteriófagos es CLB_P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4675 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
En un aspecto, se prevé que la composición farmacéutica comprenda más de una cepa de bacteriófagos, también denominado “un cóctel de bacteriófagos”. El cóctel de bacteriófagos de la presente invención comprende cualquier combinación de dos o más de P1, P2, P3, P4, P5, P6, P8 y CLB_P2 y variantes de las mismas que tienen la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas. Preferiblemente, los bacteriófagos en un cóctel de bacteriófagos destinado para el tratamiento de un sujeto específico o grupo de sujetos se seleccionarán basándose en la cepa de AIEC o cepas de AIEC identificadas y seleccionadas para el combate.
Ejemplos no limitativos de enfermedades inflamatorias intestinales son enfermedad de Crohn (EC), colitis ulcerosa (CU), enfermedad inflamatoria intestinal crónica (EII crónica) tal como pero sin limitarse a colitis microscópica, enfermedad celíaca y vasculitis. En una realización, la EII es EC o CU. En otra realización, la enfermedad inflamatoria intestinal es la recidiva de lesiones ileales después de la cirugía (tal como cirugía para la extirpación de al menos una parte del intestino delgado en un paciente con EC). La recidiva puede medirse mediante el índice de Rutgeerts.
En una realización, la EII no está provocada por una infección bacteriana. Esta realización se basa en la observación de que EII es una enfermedad autoinmunitaria que no se considera generalmente una enfermedad bacteriana. En cambio, una infección bacteriana puede ser concomitante con la EII, pero no es necesariamente el agente causal.
Esta observación se suma al sorprendente hallazgo de la presente invención, concretamente el aplicar la terapia de bacteriófagos para el tratamiento de una enfermedad que no está provocada por bacterias.
Por ese motivo, puede haber, como ejemplo, cepas de AIEC en familiares de sujetos que padecen una EII, aunque estos familiares no padecen esta enfermedad. Asimismo, también pueden encontrarse cepas de AIEC en sujetos que no padecen EII ni están emparentados con sujetos que padecen EII, tal como también puede observarse a partir de la tabla 1 a continuación.
“Tratar” tal como se usa en el presente documento debe entenderse que abarca una disminución en uno o más síntomas característicos de la enfermedad; una disminución en la tasa de progresión de la enfermedad; recuperación de la enfermedad, cura de la enfermedad, mantenimiento de la remisión y profilaxis tales como prevención de recaídas.
Un “sujeto” tal como se usa en el presente documento puede ser un sujeto macho o hembra. Un sujeto puede ser un ser humano o cualquier otro mamífero.
La dosis y la pauta de administración de una composición farmacéutica de la invención dependerá necesariamente del efecto terapéutico que ha de lograrse (por ejemplo tratamiento de EII) y puede variar con las cepas de bacteriófagos particulares en la composición, la vía de administración, y la edad y el estado del sujeto individual al que va a administrársele el medicamento.
Es probable que una dosificación para humanos contenga una dosis de bacteriófago entre 104 y 1011 unidades formadoras de placa (ufp). La dosis deseada puede presentarse como una dosis al día o como múltiples subdosis administradas en intervalos apropiados.
En el contexto de la presente invención el término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a portadores, cargas o diluyentes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente usados para formular composiciones farmacéuticas para administración a animales o humanos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender además agentes auxiliares farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Los agentes auxiliares, también denominados componentes accesorio, abarcan aquellos convencionales en la técnica tales como, pero sin limitarse a agentes formadores de matriz, espesantes, aglutinantes, lubricantes, agentes de ajuste del pH, agentes protectores, potenciadores de la viscosidad, agentes de absorción capilar, disgregantes, incluyendo disgregantes no efervescentes y efervescentes, tensioactivos, antioxidantes, agentes humectantes, colorantes, agentes aromatizantes, agentes enmascaradores del sabor, edulcorantes, conservantes y así sucesivamente. Además de ser farmacéuticamente aceptables, los agentes auxiliares deben ser “aceptables” en el sentido de que son compatibles con los demás componentes de la composición, incluyendo el bacteriófago.
Las composiciones farmacéuticas y vías de administración incluyen aquellas adecuadas para o por medio de administración oral (incluyendo bucal, sublingual e intraorbital), rectal, nasal, tópica (incluyendo transdérmica), ocular, ótica, vaginal, bronquial, pulmonar o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, intrapleural, intravesicular e intratecal) o administración por medio de un implante. La composición farmacéutica o vía de administración puede adaptarse para proporcionar un efecto seleccionado como objetivo de cepa de bacteriófagos de la invención. En una realización específica, una composición farmacéutica de la invención se administra por vía oral. Las composiciones pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. Tales métodos incluyen la etapa de asociar una cepa de bacteriófagos de la invención con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más agentes auxiliares.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades de dosificación separadas (formas de dosificación) tales como pastillas, comprimidos, grageas o cápsulas, o como polvo o gránulos, o como disolución o suspensión. La composición farmacéutica también puede presentarse como bolo o pasta. Las composiciones pueden procesarse adicionalmente para dar un supositorio o enema para administración rectal.
Para administración parenteral, las composiciones adecuadas incluyen inyecciones estériles acuosas y no acuosas. Las composiciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o dosis múltiples, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que sólo requiere la adición de portador líquido estéril, por ejemplo agua, antes de su uso.
Para administración transdérmica, por ejemplo, pueden contemplarse geles, parches o aerosoles.
Las composiciones o formulaciones adecuadas para administración pulmonar, por ejemplo, por inhalación nasal, incluyen brumas o polvos finos que pueden generarse por medio de insufladores, nebulizadores o aerosoles presurizados dosificadores.
La presente divulgación incluye además un kit que comprende una composición farmacéutica de la invención e instrucciones para el uso de la composición para un uso tal como se describió anteriormente en el presente documento, opcionalmente junto con material de acondicionamiento.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
La presente invención proporciona además una cepa de bacteriófagos P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
Ejemplos
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la invención tal como se reivindica.
Métodos
Ensayo de invasión
Se usó la línea celular Intestine-407 (I-407) derivada de íleo y yeyuno embrionario humano como modelo de células epiteliales intestinales no diferenciadas. Se adquirió de Flow Laboratories (Flow Laboratories Inc., Mc Lean, VA). Se sembraron células Intestine-407 en placas de cultivo tisular de 24 pocillos (Polylabo, Estrasburgo, Francia) a una densidad de 4.105 células/pocillo y se incubaron durante 20 horas. Se lavaron las monocapas celulares dos veces con PBS (pH 7,2). Se midió la invasión bacteriana de células epiteliales usando el ensayo de protección con gentamicina (Falcow et al. (1987), Rev. Infect. Dis. 9 (supl. 5):S450-455). Se inoculó cada monocapa en 1 ml del medio de cultivo celular que carece de antibióticos con una multiplicidad de infección de 10 bacterias por célula epitelial. Después de un periodo de incubación de 3 horas a 37°C con el 5% de CO2 , se lavaron las monocapas 3 veces con PBS. Se añadió medio de cultivo celular nuevo que contenía 100 |ig/ml de gentamicina (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora para destruir bacterias extracelulares antes de la lisis de las monocapas con Triton X-100 al 1% (Sigma) en agua desionizada. Esta concentración de Triton X-100 no tuvo efecto sobre la viabilidad bacteriana durante al menos 30 minutos. Se diluyeron las muestras y se sembraron en placas de agar Mueller-Hinton para determinar el número de unidades formadoras de colonias. Se expresaron todos los resultados de la capacidad invasiva de E. coli con la línea celular Intestine-407 como porcentaje de bacterias intracelulares en comparación con el inóculo inicial, tomado como el 100%. Se realizaron todos los ensayos al menos 3 veces en experimentos diferenciados.
Identificación de proteínas de la cápside principales
Se obtuvieron proteínas de viriones hirviendo 60 |il de una suspensión de 1011 ufp/ml de cada bacteriófago durante 10 min. Se ejecutaron 20 |il de la suspensión sobre un gel de poliacrilamida al 4-12% prefabricado. Se tiñó el gel con azul de Coomassie y se extrajeron las bandas principales, se sometieron a digestión con tripsina y se analizaron mediante espectrometría de masas en la planta de microsecuenciamiento del Instituto Pasteur.
Se compararon las masas peptídicas obtenidas con la información en bases de datos de proteínas, permitiendo la identificación de la proteína conocida más próxima, es decir wV8 para P1 a P6 y RB69 para P8 y JS98 para CLB_P2 (véase A. Villegas et al, Virology Journal 2009, 6:41 para la caracterización de wV8 y S. Zuber et al., Journal of Bacteriology 2007, 189:22, 8206 para la caracterización de RB69 y JS 98).
Alineación de la proteína de cápside principal de bacteriófago wV8 con péptidos obtenidos a partir de espectrometría de masas de las proteínas de la cápside principales de bacteriófagos P1 a P6:
wV8 MLTNSEKSRFFLADLTGEVQSIPNTYGYISNLGLFRSAPITQTTFLMDLTDWDVSLLDAVDRDSRKAE
P1 FFLADLTGEVQSIPNTYGYISNLGLFR
P2 SRFFLADLTGEVQSIPNTYGYISNLGLFRSAPITQTTFLMDLTDWDVSLLDAVDR
P3
P4
P5
P6
WV8 TSAPERVRQISFPMMYFKEVESITPDEIQGVRQPGTANELTTEAWRAKKLMKIRTKFDITREFLFMQ
P1 QISFPMMYFKEVESITPDEIQGVRQPGTANELTTEAWR TKFDITREFLFMQ
P2 QISFPMMYFKEVESITPDEIQGVRQPGTANELTTEAWR TKFDITREFLFMQ
P3 QISFPMMYFKEVESITPDEIQGVRQPGTANELTTEAWR TKFDITREFLFMQ
P4 QISFPMMYFKEVESITPDEIQGVRQPGTANELTTEAWR TKFDITREFLFMQ
P5 QISFPMMYFKEVESITPDEIQGVRQPGTANELTTEAWR TKFDITREFLFMQ
P6 QISFPMMYFKEVESITPDEIQGVRQPGTANELTTEAWR TKFDITREFLFMQ
WV8 ALKGKWDARGTLYADLYKQFDVEKKTVYFDLDNPNADIDAAIBELRMHMEDEAKTGTVINGEE1HW
P1 ALK GTLYADLYK KTVYFDLDNPNADIDASIEELR TGTVINGEE1HW
P2 ALK GTLYADLYK TGTVINGEE1HW
P3 ALK GTLYADLYK TVYFDLDNPNADIDASIEELR TGTVINGEE1HW
P4 ALK GTLYADLYK TGTVINGEE1HW
P5 ALK GTLYADLYK TIYFDLDNPNADIDASIEELR TGTVINGEE1HW
P6 ALK GTLYADLYKQFDVEK TIYFDLDNPNADIDASIEELR TGTVINGEE1HW
WV8 VDRLFFSKLVKHPKIRDAYLAQQTPLAWQQITGSLRTGGTDGVQAHMNTFYYGGVKFVQYNGKFKDKR
P1 VDR IRDAYLAQQTPLAWQQITGSLR FVQYNGK
P2 VDRLFFSK IRDAYLAQQTPLAWQQITGSLRTGGTDGVQAHMNTFYYGGVKFVQYNGK
P3 VDR DAYLAQQTPLAWQQITGSLR FVQYNGK
P4 VDR DAYLAQQTPLAWQQITGSLR FVQYNGK
P5 VDR DAYLAQQTPLAWQQITGSLRTGGADGVQAHMNTFYYGGVKFVQYNGK
P6 DAYLAQQTPLAWQQITGSLRTGGADGVQAHMNTFYYGGVK
WV8 GKVHTLVSIDSVAATVGVGHAFPNVSMLGEANNIFEVAYGPCPKMGYANTLGQELYVFEYEKDRDEGI
P1 MGYANTLGQELYVFEYEKDR
P2 MGYANTLGQELYVFEYEKDR
P3
P4
P5
P6
wV8 DFEAHSYMLPYCTRPQLLVDVRSDAKPD
P1 PQLLVDVR
P2 PQLLVDVR
P3 PQLLVDVR
P4 PQLLVDVR
P5 PQLLVDVR
P6 PQLLVDVR
Alineación de la proteína de cápside principal de bacteriófago RB69 con péptidos obtenidos a partir de espectrometría de masas de la proteína de cápside principal de bacteriófago P8:
RB69 : MTTIKTKAQLVDKWKELLEGEGLPEIANSKQAIIAKIFENQEKDFEVSPEYKDEKIAQAFGSFLTEAE
P8 :
RB69 : IGGDHGYNAQNIAAGQTSGAVTQIGPAVMGMVRRAIPNLIAFDICGVQPMNSPTGQVFALRAVYGKDP
P8 :
RB69 : IAAGAKEAFHPMYAPDAMFSGQGAAKKFPALAASTQTKVGDIYTHFFQBTGTVYLQASAQVTISSSAD
P8 : EAFHPMYAPDAMFSGQGAAK
RB69 : DAAKLDAEIIKQMEAGALVEIAEGMATSIAELQEGFNGSTDNPWNEMGFRIDKQVIEAKSRQLKAAYS
P8 : AAYS
RB69 : IELAQDLRAVHGMDADAELSGILATEIMLEINREWDWINYSAQVGKSGMTNI'VGSKAGVFDFQDPID
P8 ; IELAQDLR EWDWINYSAQVGK AGVFDFQDPID
RB69 : IRGARWAGESFKALLFQIDKEAVEIARQTGRGEGNFIIASRNWNVLASVDTGISYAAQGLñSGFNTD
P8 : IR WAGESFK QTGRGEGNFIIASR
RB69 : TTKSVFAGVLGGKYRVYIDQYAKQDYFTVGYKGANEMDAGIYYAPYVALTPLRGSDPKNFQPVMGFKT
P8 : SVFAGVLGGKYRVYIDQYAKQDYFTVGYKGANEMDAGIYYAPYVALTPLR NFQPVMGFKT
RB69 : RYGIGVNPFAESSLQAPGARIQSGMPSILNSLGKNAYFRRVYVKGI
P8 : RYGIGVNPFAESSLQAPGARIQSGMPSILNSLGK
Alineación de la proteína de cápside principal de bacteriófago JS98 con péptidos obtenidos a partir de espectrometría de masas de la proteína de cápside principal de bacteriófago CLB_P2,
JS98: MKKNALVQKWSALLENEALPEIVGASKQAIIAKIFENQEQDILTAPEYRDEKISEAFGSFLTEAEI
CLB_P2:
JS93: GGDHGYDATNIAAGQTSGAVTQIGPAVMGMVRRAIPHLIAFDICGVQPLNNPTGQVFALRAVYGKD
CIiB_P2: AVYGKD
JS98: PIAAGAKEAFHPMYAPNAMFSGQGAAETFEALAASKVLEVGKIYSHFFEATGSAHFQAVEAVTVDA
CLB_P2:PIAAGAK
JS98: GATDAAKLDAAVTALVEAGQLAEIAEGMATSIAELQEGFNGSTDNPWNEMGFRIDKQVIEAKSRQL
CLB_P2:
JS98: KASYSIELAQDLRAVHGMDADAELSGILATEIMLEINREVIDWINYSAQVGKSGMTNTVGAKAGVF
CLB_P2: ASYSIELAQDLR EVIDWINYSAQVGK AGVF
JS98: DFQDPIDIRGARWAGESFKALLFQIDKEAAEIARQTGRGAGNFIIASRNWNVLAAVDTSVSYAAQ
CLB_P2: DFQDPIDIR WAGESFKALLFQIDKEAAEIAR GAGNFIIASR
JS98: GLGQGFNVDTTKAVFAGVLGGKYRVYIDQYARSDYFTIGYKGSNEMDAGIYYAPYVALTPLRGSDP
CLB_P2: AVFAGVLGGKYRVYIDQYAR GSNEMDAGIYYAPYVALTPLR
JS98: KNFQPVMGFKTRYGIGINPFADPAAQAPTKRIQNGMPDITOSLGLNGYFRRVYVKGI
CLB_P2: NFQPVMGFKTRYGIGINPFADPAAQAPTKRIQNGMPDIVNSLGLNGYFR
Ejemplo de referencia 1
Aislamiento de cepas de AIEC
Se aislaron ciento sesenta y seis (166) cepas de Escherichia coli (E. coli) adherente-invasiva, incluyendo la cepa de E. coli LF82 (tabla 1), tal como sigue: se aislaron las cepas de AIEC de heces recientes de pacientes con EC, sus familiares y sujetos de control. Se diluyeron las heces en diluciones de diez veces hasta -9, Cada dilución se sembró en diferentes medios. Tras la incubación, se subcultivaron las colonias, se identificaron y se sometieron a prueba las cepas para determinar la capacidad de invasión.
En detalle, inmediatamente después de la emisión, se introdujeron heces recientes en un envase estéril. Se hizo anaerobia la atmósfera mediante la adición de un Anaerocult® hidratado. Se trataron las muestras el día del muestreo. Se introdujo aproximadamente 1 g de heces en 9 ml de disolución de Ringer de % de concentración cisteinada en tubos tarados; se volvieron a tarar después de la introducción de la muestra para determinar su peso exacto (primera dilución de diez veces). Se realizaron ocho diluciones adicionales de diez veces y se sembró 0,1 ml de cada dilución en diferentes medios no selectivos y selectivos incubados en condiciones apropiadas: agar sangre Columbia (CS) y agar CSH incubados durante una semana en condiciones anaerobias, medio MRS incubado durante 48 h en una atmósfera enriquecida en CO2 , agar McConkey y Cetrimide incubados durante 48 h en aire. Se realizaron todas las incubaciones a 37°C. Después de la incubación, se contaron las colonias, se subcultivaron y se identificaron mediante criterios fenotípicos establecidos.
Se seleccionó un sujeto de control en relación con un paciente con EC de modo que el sujeto de control era del mismo sexo y edad que el paciente con EC y tenía un tamaño de familia similar que el paciente con EC (para tener en cuenta la variación de microflora dentro de una familia).
El protocolo lo aprobó el comité ético local en 2000, Se siguió a los pacientes con el registro EPIMAD, que se organiza bajo un acuerdo entre el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) y el Institut National de Veille Sanitaire (InVS) y también está respaldado por la Frangois Aupetit Association, Lion's Club of Northwestern France, Ferring Laboratories, la Société Nationale Frangaise de Gastroentérologie y Lille University Hospital.
Tabla 1 - Cepas de AIEC
Figure imgf000009_0001
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Figure imgf000012_0001
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McC = agar McConkey (bioMérieux)
Cet = agar Cetrimide (bioMérieux)
CS ana = agar sangre Columbia anaerobia
MRS = agar de Man, Rogosa y Sharp (Oxoid)
CSH = agar Columbia SH
El “nivel de E. coli” se refiere a la cantidad de la cepa AIEC en las heces. “Recuento total” se refiere a todas las especies bacterianas en las heces.
El medio de cultivo CS ana tiene la siguiente composición (por litro de medio):
- 39 g de base de agar sangre Columbia (Oxoid)
- 5 g de glucosa
- 0,3 g de clorhidrato de cisteína
- 5 g de agar
- pH 7,0 ± 0,2
Se esterilizó la mezcla durante 15 minutos a 121°C. Justo antes de la siembra, se añade el 5% de sangre de caballo. El medio de cultivo CSH tiene la siguiente composición (por litro de medio):
- 39 g de base de agar sangre Columbia (Oxoid)
- 3 g de clorhidrato de cisteína
- pH 6,8 ±0,2
Se esterilizó la mezcla durante 15 minutos a 121°C. Justo antes de la siembra, se añaden 2 ml de disolución de citrato de amonio estéril (0,25 g/10 ml agua). Después de la incubación, las bacterias que usan cisteína (y liberan sulfuro) dan como resultado colonias negras en este medio.
Ejemplo 2
Aislamiento de fagos
Se aislaron fagos de aguas residuales tal como sigue: se filtraron las aguas residuales a 0,2 |im y se mezclaron con un volumen igual de medio Luria-Bertani (LB) 2X. Se inoculó esta mezcla con un cultivo nuevo de cepa LF82 y se incubó en un agitador a 37°C durante la noche. Se añadió cloroformo (volumen 1/10) al matraz y se colocó en un agitador durante una hora. Se centrifugó el medio a 10.000 g durante 10 min. Se recogió 1 ml del sobrenadante y se añadió 1/10 vol. de cloroformo. Después de un breve mezclado por vórtex, se centrifugó el tubo Eppendorf a 7.500 g durante 5 min. Para determinar si estaban presentes fagos en este extracto, se aplicó una gota (10 |il) del sobrenadante en una placa de agar LB y se dejó secar. Al usar un alambre de platino, se sembró la placa en líneas desde la gota a través del resto de la placa para aislar fagos individuales. Se aplicó 1 ml de un cultivo en crecimiento de cepa LF82 para cubrir toda la placa; se retiró el exceso y se incubó la placa a 37°C durante la noche. Se eligieron una o dos placas y se resuspendieron en 200 |il de tampón SM (TrisHCl 10 mM pH7, NaCl 200 mM, gelatina 0,03%). Se añadieron 20 |il de cloroformo en cada tubo y se mezclaron los tubos brevemente por vórtex y se centrifugaron a 7.500 g durante 5 min. Se aplicaron 10 |il del sobrenadante en una placa LB y se dejaron secar y se repitió el procedimiento previo al menos tres veces. Una vez que la mayoría de placas aisladas fue homogénea, se añadieron 10 |il de la última placa resuspendida a 1 ml de cultivo en crecimiento de cepa LF82 a DO 0,1 a 600 nm. Se incubó este tubo de cultivo a 37°C durante de 2 a 4 horas hasta que se produjo la lisis. Después de la adición de 1/10 vol. de cloroformo, se transfirió el cultivo a un tubo Eppendorf, se centrifugó a 7.500 g durante 5 min y se enfrió hasta 4°C, obteniendo de ese modo la reserva primaria. Se mantuvieron varias diluciones de esta reserva a 4°C y se usaron para infectar un volumen mayor de cultivo con el fin de preparar mayores cantidades de fagos. Se obtuvieron siete (7) fagos tal como sigue:
• vB_EcoM_LF82_P1 (antes y después en el presente documento P1) depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694;
• vB_EcoM_LF82_P2 (antes y después en el presente documento P2) depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695;
• vB_EcoM_LF82_P3 (antes y después en el presente documento P3) depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696;
• vB_EcoM_LF82_P4 (antes y después en el presente documento P4) depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697;
• vB_EcoM_LF82_P5 (antes y después en el presente documento P5) depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698;
• vB_EcoM_LF82_P6 (antes y después en el presente documento P6) depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699; y
• vB_EcoM_LF82_P8 (antes y después en el presente documento P8) depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700,
CLB_P2, depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4675, y su aislamiento se describe en detalle en Maura et al. Environmental Microbiology (2012) 14(8), 1844-1854,
Los fagos P1 a P6 pertenecen a la familia de bacteriófagos wV8.
P8 pertenece al a familia de bacteriófagos RB69.
CLB_P2 pertenece a la familia de bacteriófagos JS98.
La clasificación en las familias de bacteriófagos wV8, RB69 y JS98 se realizó basándose en la secuencia de la proteína de cápside principal.
Ejemplo 3
Ensayos in vitro de la infectividad de bacteriófagos en cepas de AIEC
Se llevó a cabo el ensayo de placa al poner en contacto diluciones en serie de disoluciones de bacteriófagos (desde no diluidas hasta una dilución 10"8) con una placa de Petri cuya superficie se recubrió por una bacteria. Después de la incubación durante la noche a 37°C, se contaron las placas. Cuando la bacteria sometida a prueba era el huésped bacteriano (huésped de referencia) usado para aislar bacteriófagos se consideró que el ensayo de placa dio una eficiencia del 100%. Cuando la bacteria sometida a prueba no era el huésped original, entonces los resultados se expresaron por comparación con el huésped de referencia. Un resultado mayor del 80% (+++) significa que la bacteria es un huésped muy eficiente en comparación con el huésped de referencia, mientras que un resultado entre el 0,1 y el 80% (++) significa que la bacteria es un huésped eficiente, y un resultado por debajo del 0,1% (+) pero por encima de 0 significa que la bacteria es un huésped moderadamente eficiente, y finalmente 0 (-) significa que la bacteria es totalmente resistente.
Resultados
La tabla 2 muestra el resultado del espectro del huésped de los 8 fagos (tal como se aislaron/identificaron en el ejemplo 2) en 38 cepas (de las 166 cepas aisladas en el ejemplo 1, tabla 1).
Tabla 2 Cepas sometidas a prueba y eficiencia efectiva de la siembra (EOP) obtenida para cada bacteriófago
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Tabla 3 Número de cepas infectadas por fagos:
Figure imgf000016_0002
Los números indican el número de cepas infectadas por un bacteriófago Ejemplo 4
Replicación in vivo de bacteriófagos en el intestino de ratones
Se evaluó la replicación in vivo de bacteriófagos en el intestino de ratones tal como sigue:
En primer lugar, se modificó por ingeniería genética la cepa LF82 para que portara dos genes de resistencia a antibióticos que confieren respectivamente resistencia a estreptomicina y kanamicina. Esta nueva cepa bacteriana se denominó LF82SK y se verificó que sus propiedades invasivas eran similares a la cepa LF82 original.
Tres (3) grupos de dos (2) ratones cada uno:
Grupo 1: ratones no colonizados fagos
Grupo 2: ratones colonizados por LF82SK
Grupo 3: ratones colonizados por LF82SK fagos
Se añadió estreptomicina (5 g/l) a agua para beber de todos los animales 3 días antes del día 0 y se mantuvo a lo largo del experimento.
En el día 0, se administró LF82SK a los grupos 2 y 3 con el fin de permitir que la cepa colonice el intestino de los ratones.
En el día 4, se administraron 200 |il de un cóctel de bacteriófagos P2 P6 a los grupos 1 y 3 (disolución por sonda nasogástrica 108 ufp/ml) una vez por la mañana y una vez por la tarde. También se añadieron bacteriófagos P2+P6 al agua para beber (108 ufp/ml). En el día 5 por la mañana, se sacrificaron los ratones para evaluar el número de bacterias y bacteriófagos en el íleo y en las heces.
Resultados:
Bacterias (E. coli):
Grupo 1: sin bacterias;
Grupo 2: en el íleo - 106 ufc/g de órgano; en heces - 108 ufc/órgano;
Grupo 3: en el íleo y las heces: todas las bacterias lisadas por fagos.
Fagos:
Grupo 1: en el íleo - 106 ufc/g de órgano; en heces - 107 ufc/órgano;
Grupo 2: sin fagos
Grupo 3: en el íleo - 106 ufc/g de órgano; en heces - 1010 ufc/órgano;
En las heces, hubo 100 veces más fagos en el grupo 3 que en el grupo 1 lo que muestra la multiplicación de los fagos in vivo.
Ejemplo 5
Replicación in vivo de bacteriófagos en el intestino de ratones
Se evaluó la replicación in vivo de bacteriófagos en el intestino de ratones tal como sigue:
se despacharon 12 ratones en tres (3) grupos de cuatro (4) ratones cada uno:
Grupo 1: ratones no colonizados por fagos fagos
Grupo 2: ratones colonizados por LF82SK
Grupo 3: ratones colonizados por LF82SK fagos
Se añadió estreptomicina (5 g/l) a agua para beber de todos los animales 3 días antes del día 0 y se mantuvo a lo largo del experimento.
En el día 0, se administró LF82SK a ratones de los grupos 2 y 3 con el fin de permitir que la cepa colonice el intestino de los ratones.
En el día 4, se añadieron bacteriófagos (cóctel de P2+P6+P8 a 108 ufp/ml cada uno) en el agua para beber de los grupos 1 y 3,
En el día 5, se sacrificaron los ratones para evaluar el número de bacterias y bacteriófagos en el íleo y en las heces. Se tomaron 100 |il de homogeneizados ileales de los tres grupos para extraer ADN completo usando el kit de purificación de ADN tisular Maxwell® 16 de Promega.
Resultados:
Bacterias (E. coli):
Grupo 1: sin bacterias;
Grupo 2: en el íleo - 3,2106 ufc/g de órgano; en heces -1 ,2-109 ufc/g de heces;
Grupo 3: en el íleo y las heces: todas las bacterias lisadas por fagos.
Fagos:
Grupo 1: en el íleo -1 ,4-106 ufp/g de órgano; en las heces - 5,2106 ufp/g de heces;
Grupo 2: sin fagos
Grupo 3: en el íleo -2,6106 ufp/g de órgano; en las heces -1,0109 ufp/g de heces;
En las heces, hubo 200 veces más fagos en el grupo 3 que en el grupo 1 lo que muestra la multiplicación de los fagos in vivo.
Se usó ADN extraído de secciones ileales para ejecutar PCR cuantitativa usando dos conjuntos de cebadores. Un conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 30-31) sirvió para amplificar ADN de “todas las bacterias” presentes en la muestra mientras que el segundo conjunto (SEQ iD NO: 32-33) se usó para amplificar ADN específicamente de bacterias “E. coli”. Después de la normalización, los resultados se expresaron como la razón de E. coli frente a todas las bacterias.
Grupo 1: las amplificaciones de qPCR fueron satisfactorias con todos los cebadores de bacterias pero no con los cebadores de E. coli. La razón no pudo calcularse.
Grupo 2: las amplificaciones de qPCR fueron satisfactorias con ambos conjuntos de cebadores. La razón promedio fue de 0,6 (el 60% de las bacterias totales eran bacterias E. coli)
Grupo 3: las amplificaciones de qPCR fueron satisfactorias con ambos conjuntos de cebadores. La razón promedio fue de 0,1 (el 10% de las bacterias totales eran bacterias E. coli). Obsérvese que un ratón presentó una razón de 0,4 mientras que los otros tres presentaron valores mucho más bajos (0,06; 0,0002; 0,002).
En consecuencia, los bacteriófagos fueron capaces de reducir el nivel de colonización ileal de bacterias LF82 en al menos un orden de magnitud en tres ratones de cuatro.
Ejemplo 6
Ensayo in vivo de la infectividad de bacteriófagos
Se seleccionan dos cócteles de fagos para someter a prueba en ratones de tipo natural (WT) y en ratones CEACAM6 infectados con la cepa de E. coli LF82 aislada de los pacientes con EC.
Tanto en ratones WT como en ratones CEACAM6 infectados con la cepa de E. coli LF82 aislada del paciente con EC, se administran bacteriófagos a los ratones mediante sonda nasogástrica oral en CMC. Este tipo de administración tiene muchas ventajas: cantidad conocida de administración de bacteriófagos y neutralización de la acidez gástrica inmediata. Los fagos se administran diariamente a los ratones durante todo el estudio.
- Se sacrifican los ratones a los 5 días después de la administración de LF82.
- Criterios principales: cuantificación de LF82 en flora adherente ileal y colónica de los ratones.
- Criterios secundarios:
Evaluación del peso
Consistencia de las deposiciones.
Presencia de sangre fecal (macro y bio)
- Flora luminal (flora convencional LF82 fagos)
En el sacrificio: exámenes macroscópicos e histológicos, floral ileal y colónica adherente LF82 fagos, En el sacrificio: exámenes macroscópicos e histológicos, floral ileal y colónica adherente LF82 fagos, Se monitorizan los parámetros biológicos de inflamación, y se investiga la translocación de bacteriófagos en los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), hígado y bazo.
Se monitorizan los marcadores de inflamación (MPO, citocinas proinflamatorias IL-6, IL-12 y citocinas antiinflamatorias IL-10). Se investiga la translocación de bacteriófagos y AIEC en MLN, hígado y bazo.
El seguimiento de la eliminación de bacteriófagos tiene lugar en las deposiciones de ratones que reciben el cóctel de bacteriófagos sin la cepa LF82.
Ejemplo 7
Ensayo in vivo de un cóctel de fagos en la cepa LF82.
Se evaluó la replicación de bacteriófagos in vivo (cóctel de P2+P6+P8+CLB_P2) en el intestino de ratones tal como sigue:
se despacharon 20 ratones en dos (2) grupos de diez (10) ratones cada uno:
Grupo 1: ratones colonizados por LF82SK
Grupo 2: ratones colonizados por LF82SK fagos
Se añadió estreptomicina (5 g/l) a agua para beber de todos los animales 3 días antes del día 0 y se mantuvo a lo largo del experimento.
En el día 0, se administró LF82SK a ratones de ambos grupos con el fin de permitir que la cepa colonice el intestino de los ratones.
En el día 3, se administraron bacteriófagos (cóctel de P2+P6+P8+CLB_P2 a 108 ufp/ml cada uno) a ratones del grupo 2 mediante sonda nasogástrica.
En el día 4 y 7, se sacrificaron 5 ratones de cada grupo para evaluar el número de bacterias y bacteriófagos en el íleo, en el colon y en las heces. Se tomaron 100 |il de homogeneizados ileales y colónicos de los dos grupos para extraer ADN completo usando el kit de purificación de ADN tisular Maxwell® 16 de Promega.
Resultados:
Nivel de LF82 en las deposiciones:
En el día 4 y 7 los niveles de LF82 fueron:
en el grupo 1: 7109; 1109 ufc/g
en el grupo 2: 8107; 5108 ufc/g
Nivel de fagos en las deposiciones:
En el día 4 y 7 los niveles de fagos fueron:
en el grupo 1: ninguno
en el grupo 2: 5109; 6109 ufp/g
En presencia del cóctel de fagos, el nivel de LF82 en las deposiciones fue significativamente menor que en su ausencia lo que muestra que el cóctel de fagos era capaz de infectar LF82 dentro del intestino de los ratones.
Nivel de LF82 en órganos:
en el día 4 los niveles de LF82 fueron:
en el íleo del grupo 1: el 100% de las bacterias eran E. coli (LF82)
en el íleo del grupo 2: el 20% de las bacterias eran E. coli (LF82)
en el colon del grupo 1: el 40% de las bacterias eran E. coli (LF82)
en el colon del grupo 2: el 2% de las bacterias eran E. coli (LF82)
en el día 7 los niveles de LF82 fueron:
en el íleo del grupo 1: el 100% de las bacterias eran E. coli (LF82)
en el íleo del grupo 2: el 50% de las bacterias eran E. coli (LF82)
en el colon del grupo 1: el 25% de las bacterias eran E. coli (LF82)
en el colon del grupo 2: el 10% de las bacterias eran E. coli (LF82)
Nivel de fagos en órganos:
en el día 4 los niveles de fagos fueron:
en el íleo del grupo 1: ninguno
en el íleo del grupo 2: 7108 ufp/g
en el colon del grupo 1: ninguno
en el colon del grupo 2: 51010 ufp/g
en el día 7 los niveles de LF82 fueron:
en el íleo del grupo 1: ninguno
en el íleo del grupo 2: 7108 ufp/g
en el colon del grupo 1: ninguno
en el colon del grupo 4: 2108 ufp/g
En el día 2 y 5 el nivel de LF82 se redujo tanto en el íleo como en el colon en el grupo tratado por fagos. Esto muestra que los fagos infectan LF82 en secciones del intestino y no sólo en las deposiciones. De manera concomitante, el nivel de fagos en el día 7 permanece tan alto como en el día 2 lo que muestra que el fago puede durar varios días en el intestino después de una administración inicial única.
Ejemplo 8
Ensayo in vivo de la infectividad de bacteriófagos
Se evaluó el ensayo in vivo de la infectividad de bacteriófagos (cóctel de P2+P6+P8) en ratones CEACAM6 infectados con LF82SK tal como sigue:
se despacharon 48 ratones en tres (4) grupos tal como sigue:
Grupo 1: ratones no colonizados (8 ratones)
Grupo 2: ratones no colonizados fagos (12 ratones)
Grupo 3: ratones colonizados por LF82SK (16 ratones)
Grupo 4: ratones colonizados por LF82SK fagos (12 ratones)
Se introdujo DSS (sulfato de dextrano) al 0,25% en el agua para beber 3 días antes del día 0 y se mantuvo a lo largo del experimento.
Se administró estreptomicina (5 mg) por sonda nasogástrica oral a todos los animales 1 día antes del día 0.
En el día 0, se administró LF82SK a ratones de los grupos 3 y 4 con el fin de permitir que la cepa colonice el intestino de los ratones.
En el día 1, se administraron fagos (cóctel de P2+P6+P8 a 107 ufp/ml cada uno) una vez a cada ratón de los grupos 2 y 4 mediante sonda nasogástrica oral en CMC. Este tipo de administración tiene muchas ventajas: cantidad conocida de administración de bacteriófagos y neutralización de la acidez gástrica inmediata.
En el día 1, se sacrificaron 4 ratones del grupo 3 para evaluar el número de bacterias en el íleo, en el colon y en las heces antes de la administración de fagos.
En el día 2, respectivamente se sacrificaron 4, 6, 6 y 6 ratones de los grupos 1, 2, 3 y 4 para evaluar el número de bacterias y bacteriófagos en el íleo, en el colon y en las heces.
En el día 5, respectivamente se sacrificaron 4, 6, 6 y 6 ratones de los grupos 1, 2, 3 y 4 para evaluar el número de bacterias y bacteriófagos en el íleo, en el colon y en las heces.
Se tomaron 100 |il de homogeneizados del íleo, el colon y las heces de los cuatro grupos para extraer ADN completo usando el kit de purificación de ADN tisular Maxwell® 16 de Promega. Se monitorizaron diariamente el peso, la consistencia de las deposiciones y la presencia de sangre fecal. Se usó ADN extraído de secciones ileales para ejecutar PCR cuantitativa usando un conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 44-45) para amplificar un gen específico (pMT1) de LF82. Los resultados se expresaron como el número de copias de este gen por gramo de tejidos.
LF82 pMT1 F (SEQ ID NO: 44) CCATTCATGCAGCAGCTCTTT
LF82 pMT1 R (SEQ ID NO: 45) ATCGGACAACATTAGCGGTGT
Resultados:
Los valores representan la mediana de valores obtenidos para cada grupo de ratones.
En el grupo 1, no se detectaron ni LF82 ni fagos a lo largo del experimento.
Nivel de LF82 en las deposiciones:
En el día 1: el nivel de LF82 en los grupos 3 y 4 fue de 5109 y 6109 ufc/g resp.
En el día 2, 3 y 5 los niveles de LF82 fueron:
en el grupo 3: 3 109; 5 108;
Figure imgf000021_0001
107 ufc/g
en el grupo 4: 5 105; 5 105;
Figure imgf000021_0002
103 ufc/g
Nivel de fagos en las deposiciones:
En el día 2, 3 y 5 los niveles de fagos fueron:
en el grupo 2: 5105 ufp/g; no detectado; no detectado
en el grupo 4: 1109; 1107; 5106 ufp/g
En presencia de fagos el nivel de LF82 en las deposiciones fue significativamente menor que en su ausencia. De manera concomitante, el nivel de fagos fue significativamente mayor en ratones colonizados por LF82 que en ratones libres de LF82. Ambos datos confirmaron que los fagos pueden infectar LF82 en el intestino.
Nivel de LF82 en órganos:
en el día 2 los niveles de LF82 fueron:
en el íleo del grupo 3: 2106 copias de pMT1/g
en el íleo del grupo 4: 8104 copias de pMT1/g
en el colon del grupo 3: 2107 copias de pMT1/g
en el colon del grupo 4: 1105 copias de pMT1/g
en el día 5 los niveles de LF82 fueron:
en el íleo del grupo 3: 5104 copias de pMT1/g
en el íleo del grupo 4: 8104 copias de pMT1/g
en el colon del grupo 3: 6106 copias de pMT1/g
en el colon del grupo 4: 2105 copias de pMT1/g
Nivel de fagos en los órganos:
en el día 2 los niveles de fagos fueron:
en el íleo del grupo 2: no detectado
en el íleo del grupo 4: 8105 ufp/g
en el colon del grupo 2: 5104 ufp/g
en el colon del grupo 4:5106 ufp/g
en el día 5 los niveles de LF82 fueron:
en el íleo del grupo 2: no detectado
en el íleo del grupo 4: no detectado
en el colon del grupo 2: no detectado
en el colon del grupo 4: 2104 ufp/g
En el día 2, el nivel de LF82 se redujo tanto en el íleo como en el colon en el grupo tratado por fagos. Esto muestra que los fagos infectaron LF82 en secciones del intestino y no sólo en las deposiciones. De manera concomitante, el nivel de fagos fue significativamente mayor en ratones colonizados por LF82 que en ratones libres de LF82.
En el día 5, el nivel de LF82 en el íleo era demasiado débil como para observar una diferencia entre los dos grupos mientras que en muestras de colon el nivel de LF82 estaba todavía reducido en el grupo que recibió fagos en comparación con los grupos que no. De manera concomitante, sólo pudieron detectarse fagos en colon de ratones colonizados por LF82. Esto muestra que el efecto de los de fagos en la reducción de LF82 puede durar varios días después de la administración inicial.
A pesar del alto nivel de colonización de LF82 observado en este experimento, no se observaron signos de colitis en ninguno de los grupos.
Realizaciones
La presente divulgación se refiere, entre otros, a las siguientes realizaciones:
1. Una composición farmacéutica que comprende:
(i) al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva; y
(ii) un portador farmacéuticamente aceptable;
para su uso en el tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal.
2. Una composición según la realización 1, en la que la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva está presente en una o más de las partes del intestino (delgado y grueso) del sujeto.
3. Una composición según la realización 1, en la que la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva es LF82, 07081, 07082, 07076 ó 06075.
4. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en la que la enfermedad inflamatoria intestinal es enfermedad de Crohn.
5. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en la que la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa.
6. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en la que la enfermedad inflamatoria intestinal es recidiva de lesiones ileales después de la cirugía, por ejemplo cirugía para extirpar al menos una parte del intestino delgado en un paciente con EC.
7. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en la que la composición comprende la cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P1.
8. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 7, en la que la composición comprende la cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P2.
9. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 8, en la que la composición comprende la cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P3.
10. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en la que la composición comprende la cepa de bacteriófagos P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P4.
11. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 10, en la que la composición comprende la cepa de bacteriófagos P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P5.
12. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 11, en la que la composición comprende la cepa de bacteriófagos P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P6.
13. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 12, en la que la composición comprende la cepa de bacteriófagos P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P8.
14. Una composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 13 en la que la composición comprende cepa de bacteriófagos CLB_P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4675 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos CLB_P2.
15. Un método de tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal que comprende administrar a un sujeto que lo necesita al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva tratando de ese modo al sujeto.
16. Un método según la realización 15 en el que la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva está presente en una o más de las partes del intestino (delgado y grueso) del sujeto.
17. Un método según la realización 15 en el que la cepa de Escherichia coli adherente-invasiva es LF82, una cepa representada en la tabla 1 en el presente documento o una cepa representada en la tabla 2 de Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421.
18. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 17, en el que la enfermedad inflamatoria intestinal es enfermedad de Crohn.
19. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 18, en el que la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa.
20. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 19, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P1.
21. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 20, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P2.
22. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 21, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P3.
23. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 22, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P4.
24. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 23, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P5.
25. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 24, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P6.
26. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 25, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P8.
27. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 26, en el que la al menos una cepa de bacteriófagos comprende la cepa de bacteriófagos CLB_P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4675 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos CLB_P2,
28. Un método según una cualquiera de las realizaciones 15 a 27, en el que la administración es administración oral.
29. Cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
30. Cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
31. Cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica, preferiblemente la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Composición farmacéutica que comprende:
    (i) al menos una cepa de bacteriófagos capaz de producir una infección lítica en una cepa de Escherichia coli adherente-invasiva; y
    (ii) un portador farmacéuticamente aceptable;
    para su uso en el tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal,
    en la que la composición comprende al menos una de la cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P1, la cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P2, la cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I- 4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P3, la cepa de bacteriófagos P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P4, la cepa de bacteriófagos P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P5, la cepa de bacteriófagos P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P6, la cepa de bacteriófagos P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos P8 y la cepa de bacteriófagos CLB_P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4675 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos CLB_P2,
  2. 2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la cepa de Escherichia coli adherenteinvasiva está presente en una o más de las partes del intestino (delgado y grueso) del sujeto.
  3. 3. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la cepa de Escherichia coli adherenteinvasiva es LF82, 07081, 07082, 07076 ó 06075,
  4. 4. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la enfermedad inflamatoria intestinal es enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa o recidiva de lesiones ileales después de la cirugía, por ejemplo cirugía para la extirpación de al menos una parte del intestino delgado en un paciente con EC.
  5. 5. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición es para administración oral.
  6. 6. Cepa de bacteriófagos P1 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4694 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
  7. 7. Cepa de bacteriófagos P2 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4695 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
  8. 8. Cepa de bacteriófagos P3 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4696 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
  9. 9. Cepa de bacteriófagos P4 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4697 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
  10. 10. Cepa de bacteriófagos P5 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4698 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
  11. 11. Cepa de bacteriófagos P6 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4699 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
  12. 12. Cepa de bacteriófagos P8 depositada en la Colección Nacional Francesa de Microorganismos en el Instituto Pasteur bajo el número de registro CNCM I-4700 o una variante de la misma, en la que la variante tiene la misma actividad lítica y las mismas características fenotípicas que dicha cepa de bacteriófagos.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2799063A1 (en) 2013-04-30 2014-11-05 Ferring B.V. Bacteriophage therapy
CN110402148A (zh) * 2017-03-14 2019-11-01 布莱阿姆青年大学 用噬菌体治疗肥胖症、炎症或代谢病症的方法和组合物
US20220031776A1 (en) * 2017-09-08 2022-02-03 Keio University Bacteriophage for modulating inflammatory bowel disease
CA3101242A1 (en) * 2018-05-23 2019-11-28 Brigham Young University Bacteriophage compositions and kits and related methods
US11986502B2 (en) 2018-05-23 2024-05-21 Optium, LLC Bacteriophage compositions and kits and related methods
IL294166B1 (en) 2019-12-23 2026-06-01 Entasis Therapeutics Inc Managing microbial dysbiosis with tamsulosin
US20220323518A1 (en) * 2021-04-10 2022-10-13 Intron Biotechnology, Inc. Compositions and methods for inhibiting the proliferation of enterotoxigenic bacteroides fragilis
US20220331381A1 (en) * 2021-04-10 2022-10-20 Intron Biotechnology, Inc. Compositions and methods for inhibiting the proliferation of enterotoxigenic bacteroides fragilis
US20220323517A1 (en) * 2021-04-10 2022-10-13 Intron Biotechnology, Inc. Compositions and methods for inhibiting the proliferation of enterotoxigenic bacteroides fragilis
MX2023012454A (es) * 2021-04-22 2023-10-31 Ferring Bv Terapia con bacteriofagos contra escherichia coli adherente-invasiva.
US20250160335A1 (en) * 2023-11-16 2025-05-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Formulation of a lytic bacteriophage cocktail for biocontrol of shiga toxin-producing escherichia coli strains

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020013270A1 (en) * 2000-06-05 2002-01-31 Bolte Ellen R. Method for treating a mental disorder
GB0019721D0 (en) * 2000-08-10 2000-09-27 Regma Biotechnologies Ltd Novel method
EP2377883A1 (en) * 2010-04-15 2011-10-19 Universite d'Auvergne Clermont I Antagonists for the prevention or treatment of inflammatory bowel disease, and more particularly of Crohn's disease
RU2614114C2 (ru) * 2010-09-17 2017-03-22 Текнифар-Индустриа Текника Фармасьютика, С.А Бактериофаги, фаговые пептиды и способы их применения
WO2013045863A1 (fr) * 2011-09-29 2013-04-04 Institut Pasteur Detection de souches e.coli de serotype o104
EP2799063A1 (en) 2013-04-30 2014-11-05 Ferring B.V. Bacteriophage therapy

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