RS59046B1

RS59046B1 - Terapija bakteriofagima

Info

Publication number: RS59046B1
Application number: RS20190924A
Authority: RS
Inventors: Pascal Danglas; Laurent Debarbieux
Original assignee: Ferring Bv; Pasteur Institut
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2019-08-30
Also published as: EA201591979A1; BR112015027269B1; MX366497B; CN105407872A; PH12015502500B1; HUE056968T2; EP2991633A1; US20160143965A1; JP6543615B2; CN105407872B; DK3563837T5; SG11201508897QA; US11040078B2; SA515370073B1; CA2910539A1; EP3563837A1; HK1221164A1; ES2740124T3; HRP20211860T1; EP3563837B1

Description

Opis

PODRUČJE PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak je u području terapije bakteriofagima za upotrebu u lečenju zapaljenskih oboljenja creva.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Bakteriofagi su virusi koji inficiraju bakterije specifičnom interakcijom.

[0003] Kronova bolest (CD), takođe poznata i kao regionalni enteritis, je zapaljensko oboljenje creva koje može uticati na bilo koji deo gastrointestinalnog trakta od usta do anusa, što dovodi do različitih simptoma. To prvenstveno dovodi do bola u abdomenu, dijareje, povraćanja ili gubitka težine, ali takođe može dovesti do komplikacija izvan gastrointestinalnog trakta, poput osipa na koži, artritisa, zapaljenja oka, umora i nedostatka koncentracije.

[0004] Iako tačan uzrok CD još uvek nije poznat, čini se da do ove bolesti dovodi kombinacija sredinskih faktora i genetske predispozicije. Smatra se da je CD autoimuno oboljenje, tokom kojeg telesni imuni sistem napada gastrointestinalni trakt, što dovodi do zapaljenja; klasifikuje se kao tip zapaljenskog oboljenja creva (IBD).

[0005] Kod CD pacijenata, abnormalna ekspresija karcinoembrionalnog molekula 6 ćelijske adhezije povezanog sa antigenom (CEACAM6) se uočava na apikalnoj površini ilealnog epitela, a ilealne lezije CD se kolonizuju od strane patogene adherentno-invazivne Escherichia coli (AIEC).

[0006] Ne postoji poznat farmaceutski ili hirurški lek za Kronovu bolest. Određenije, ni IBD uopšteno rečeno ni CD određenije ne mogu se lečiti antibioticima (što ima za cilj borbu protiv patogene E. coli). Opcije za lečenje su ograničene na kontrolisanje simptoma, održavanje remisije i sprečavanje recidiva.

[0007] Dogan et al., Inflammatory Bowel Diseases (January 2013), Vol.19, No.1, p.141-150 je naučna studija u kojoj se ispituje lečenje Kronove bolesti pomoću antibiotika koji su efektivni protiv E. coli.

SAŽETAK PRONALASKA

[0008] Predmet ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata: (i) najmanje jedan soj bakteriofaga koji može da proizvede litičku infekciju u adherentno-invazivnom soju Escherichia coli; i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač; za lečenje zapaljenskog oboljenja creva (IBD).

[0009] Ovaj opis dalje obezbeđuje postupak lečenja zapaljenskog oboljenja creva koji obuhvata davanje subjektu kojem je to potrebno najmanje jednog soja bakteriofaga koji može da proizvede litičku infekciju u adherentno-invazivnom soju Escherichia coli čime se subjekat leči.

[0010] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0011] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0012] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0013] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0014] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0015] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0016] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0017] Ovaj pronalazak takođe koristi soj bakteriofaga CLB_P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4675 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

[0018] U svrhu ovog pronalaska, smatra se da varijanta soja bakteriofaga ima istu litičku aktivnost kao navedeni soj bakteriofaga ako sprovodi najmanje „+“ protiv najmanje jednog od AIEC sojeva LF82, 07081, 07082, 07076 i 06075 u „In vitro analizama infektivnosti bakteriofaga u AIEC sojevima“ opisanim u Primeru 3 u nastavku. U poželjnom primeru izvođenja, smatra se da varijanta ima istu litičku aktivnost ako sprovodi najmanje „+“ protiv svih pet AIEC sojeva LF 82, LF 06075, LF 07076, LF 07081 i LF 07082 (AIEC sojevi LF 06075, LF 07076, LF 07081 i LF 07082 se takođe ovde skraćuju kao 06075, 07076, 07081 i 07082, respektivno). Ovi AIEC sojevi su deponovani u Université Lille 2 - Droit et Santé, 42 Rue Paul Duez, 59000 Lille (Francuska) pri Francuskoj nacionalnoj zbirci u Institut Pasteur pod pristupnim brojevima CNCM 1-4712 (LF 82), CNCM 1-4713 (LF 06075), CNCM 1-4714 (LF 07076), CNCM 1-4715 (LF 07081) i CNCM 1-4716 (LF 07082).

[0019] U svrhu ovog pronalaska, smatra se da varijanta jednog od sojeva bakteriofaga P1 do P6, P8 i CLB_P2 ima iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga ako ima najmanje 80% identiteta sekvence na najmanje 70% dužine, poželjno najmanje 90% identiteta sekvence na najmanje 80% dužine i još poželjnije kompletan identitet sekvence na najmanje 90% dužine (kao što se utvrđuje BLAST algoritmom) sa velikim kapsidnim proteinom bakteriofaga wV8 (za varijante od P1 do P6) ili bakteriofaga RB69 (za varijante od P8) ili bakteriofaga JS98 (za varijante od CLB_P2), kao što je opisano u nastavku u odeljku „Identifikacija velikih kapsidnih proteina“.

[0020] U daljem primeru izvođenja ovog opisa, varijanta bakteriofaga ima istu litičku aktivnost kao i bakteriofag. U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, varijanta bakteriofaga ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao bakteriofag.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Ovaj pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

Predmet ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata: (i) najmanje jedan soj bakteriofaga koji može da proizvede litičku infekciju u adherentno-invazivnom soju Escherichia coli; i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač; za lečenje zapaljenskog oboljenja creva.

[0022] Ovaj opis dalje obezbeđuje postupak lečenja zapaljenskog oboljenja creva, koji obuhvata davanje subjektu kojem je to potrebno najmanje jednog soja bakteriofaga koji je sposoban da proizvede litičku infekciju u adherentno-invazivnom soju Escherichia coli čime se subjekat leči.

[0023] Pojam „adherentno-invazivni soj Escherichia coli (AIEC)“ kako je ovde upotrebljen treba shvatiti kao da se odnosi na soj E. coli čiji je srednji invazivni potencijal jednak ili veći od 0,1% u ćelijskoj kulturi crevne ćelijske linije I-407. Drugim rečima, soj AIEC ima sposobnost da napadne crevnu ćelijsku kulturu I-407 uz invazivni indeks jednak ili veći od 0,1% originalnog inokuluma (uzeto kao 100%), prilikom testiranja u skladu sa analizom invazivnosti opisanoj u nastavku u odeljku „Analiza invazivnosti“ (takođe pogledati Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421).

[0024] Neograničavajući primeri sojeva AIEC su LF82, LF82SK (koji je deponovan u Université d'Auvergne, 49 Boulevard François Mitterand, 63001 Clermont-Ferrand (Francuska) pri Francuskoj nacionalnoj zbirci u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4723), oni navedeni u Tabeli 1 u nastavku i oni navedeni u sledećoj specifikaciji (cf. Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421, naročito stranica 417, Tabela 2): LF31, LF71, LF123, LF138, LF9, LF15, LF28, LF50, LF65, LF119, LF128, LF130, LF73, LF100, LF110, LF134, LF105, LF49-2, LB11 i LF45-2. U jednom primeru izvođenja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli je LF82, 07081, 07082, 07076 ili 06075, određenije LF82.

[0025] U jednom primeru izvođenja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli je prisutan u debelom crevu subjekta. U drugom primeru izvođenja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli je prisutan u ileumu subjekta. U drugom primeru izvođenja, adherentno-invazivni soj Escherichia coli je prisutan u jednom ili više delova creva (tanko i/ili debelo) subjekta.

[0026] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0027] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0028] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0029] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0030] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4698 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0031] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0032] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0033] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan soj bakteriofaga je CLB_P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4675 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0034] U jednom aspektu, predviđeno je da farmaceutska kompozicija obuhvata više od jednog soja bakteriofaga, što se takođe naziva „koktel bakteriofaga“. Koktel bakteriofaga ovog pronalaska obuhvata bilo koju kombinaciju dve ili više od P1, P2, P3, P4, P5, P6, P8 i CLB_P2 i varijante istih koje imaju istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike. Poželjno, bakteriofagi u koktelu bakteriofaga predviđenom za lečenje konkretnog subjekta ili grupe subjekata biće odabrani na bazi soja AIEC ili sojeva AIEC identifikovanih i odabranih za borbu protiv bolesti.

[0035] Neograničavajući primeri zapaljenskih oboljenja creva su Kronova bolest (CD), ulcerozni kolitis (UC), hronično zapaljensko oboljenje creva (hronični IBD) poput, ali bez ograničenja na mikroskopski kolitis, celijačnu bolest i vaskulitis. U jednom primeru izvođenja, IBD je CD ili UC. U drugom primeru izvođenja, zapaljensko oboljenje creva je ponovno javljanje ilealnih lezija nakon operacije (poput operacije radi uklanjanja najmanje jednog dela tankog creva kod CD pacijenata). Ponovno javljanje se može izmeriti Rutgeertsovim skorom.

[0036] U jednom primeru izvođenja, IBD nije prouzrokovan bakterijskom infekcijom. Ovaj primer izvođenja je zasnovan na zapažanju da je IBD autoimuno oboljenje koje se generalno ne smatra bakterijskim oboljenjem. Umesto toga, bakterijska infekcija može biti konkomitantna sa IBD, ali nije nužno kauzativni agens. Ovo zapažanje je dodatak iznenađujućem otkriću ovog pronalaska, određenije primeni terapije bakteriofagima za lečenje oboljenja koje nije prouzrokovano bakterijom.

[0037] Iz tog razloga, mogu postojati – kao primer – sojevi AIEC među članovima porodice subjekata obolelih od IBD, iako ovi članovi porodice nisu oboleli od ove bolesti. Na isti način, sojevi AIEC se takođe mogu naći kod subjekata koji nisu oboleli od IBD niti su povezani sa subjektima obolelim od IBD, što se takođe može videti iz Tabele 1 u nastavku.

[0038] „Lečenje“ kako je ovde upotrebljeno treba shvatiti tako da obuhvata smanjenje jednog ili više simptoma karakterističnih za ovo oboljenje; smanjenje stope progresije oboljenja; oporavak od oboljenja, izlečenje od oboljenja, održavanje remisije i profilaksu poput sprečavanja recidiva.

[0039] „Subjekat“ kako je ovde upotrebljeno može biti muški ili ženski subjekat. Subjekat može biti ljudsko biće ili bilo koji drugi sisar.

[0040] Doza i režim davanja farmaceutske kompozicije ovog pronalaska nužno će zavisiti od terapeutskog dejstva koje treba dostići (npr. lečenje IBD-a) i može se razlikovati kod određenih sojeva bakteriofaga u kompoziciji, puta davanja i starosti i stanja pojedinačnog subjekta kojem treba davati lek.

[0041] Doza za ljude će verovatno sadržati dozu bakteriofaga između 10<4>i 10<11>jedinica za formiranje plaka (pfu). Željena doza može se predstaviti kao jedna doza po danu ili kao više poddoza koje se daju u odgovarajućim intervalima.

[0042] U kontekstu ovog pronalaska pojam „farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na farmaceutski prihvatljive i netoksične nosače, punioce ili razređivače, koji se definišu kao prenosnici koji se uobičajeno koriste za formulisanje farmaceutskih kompozicija za davanje životinjama ili ljudima.

[0043] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu dalje obuhvatati farmaceutski prihvatljive pomoćne agense, i opciono druge terapeutske agense. Pomoćni agensi, koji se takođe nazivaju dodatni sastojci, obuhvataju one koji su konvencionalni u ovoj oblasti tehnike poput, ali bez ograničenja na agense koji formiraju matricu, sredstva za zgušnjavanje, vezivna sredstva, lubrikante, agense za podešavanje pH vrednosti, agense za zaštitu, pojačivače viskoznosti, agense za apsorpciju, dezintegrante, uključujući nepenušave i penušave dezintegrante, surfaktante, antioksidanse, agense vlaženja, kolorante, agense za dodavanje arome, agense za maskiranje ukusa, zaslađivače, konzervanse i tako dalje. Pored farmaceutske prihvatljivosti, pomoćni agensi moraju biti „prihvatljivi“ u smislu da su kompatibilni sa drugim sastojcima kompozicije, uključujući bakteriofage.

[0044] Farmaceutske kompozicije i putevi davanja uključuju one koji su pogodni za ili preko oralnog (uključujući bukalno, sublingvalno i intraorbitalno), rektalnog, nazalnog, topikalnog (uključujući transdermalno), okularnog, otičkog, vaginalnog, bronhijalnog, pulmonarnog ili parenteralnog (uključujući subkutano, intramuskularno, intravenozno, intradermalno, intraperitonealno, intrapleuralno, intravezikularno i intratekalno) davanja ili davanja preko implanta. Farmaceutska kompozicija ili put davanja mogu biti prilagođeni da obezbede ciljano dejstvo soja bakteriofaga ovog pronalaska. U konkretnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska se daje oralno. Kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom dobro poznatim u oblasti tehnike farmacije. Takvi postupci uključuju fazu spajanja soja bakteriofaga ovog pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i opciono jednim ili više pomoćnih agenasa.

[0045] Farmaceutske kompozicije pogodne za oralno davanje mogu se predstaviti kao diskretne jedinice doze (oblici doze) poput pilula, tableta, dražeja ili kapsula, ili kao prah ili granule, ili kao rastvor ili suspenzija. Farmaceutska kompozicija može se takođe predstaviti kao bolus ili pasta. Kompozicije se mogu dalje obrađivati u supozitoriji ili klizmi za rektalno davanje.

[0046] Za parenteralno davanje, pogodne kompozicije uključuju vodene i nevodene sterilne injekcije. Kompozicije se mogu predstaviti u posudama za jediničnu ili višestruku dozu, na primer u zaptivenim fiolicama i ampulama, i mogu se čuvati u liofilizovanom stanju, što zahteva jedino dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode, pre upotrebe.

[0047] Za transdermalno davanje, npr. gelovi, flasteri ili sprejovi mogu biti razmatrani.

[0048] Kompozicije ili formulacije pogodne za pulmonarno davanje, npr. nazalnom inhalacijom, uključuju fine prašine ili magle koje se mogu generisati pomoću aerosoli pod pritiskom sa izmerenom dozom, raspršivača ili insuflatora.

[0049] Ovaj opis dalje uključuje komplet koji obuhvata farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska i uputstvo za upotrebu kompozicije za prethodno navedenu upotrebu, opciono zajedno sa materijalom za pakovanje.

[0050] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0051] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4695 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0052] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0053] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0054] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0055] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

[0056] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje soj bakteriofaga P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

PRIMERI

[0057] Ovaj pronalazak se dalje opisuje u sledećim primerima, koji ni na koji način nisu predviđeni da ograniče područje pronalaska prema patentnim zahtevima.

POSTUPCI

ANALIZA INVAZIVNOSTI

[0058] Crevna-407 (1-407) ćelijska linija izvedena iz ljudskog embrionalnog jejunuma i ileuma je upotrebljena kao model nediferenciranih crevnih epitelnih ćelija. Nabavljena je u Flow Laboratories (Flow Laboratories Inc., Mc Lean, VA).

[0059] Crevne-407 ćelije su zasejane u pločicama sa 24 bazenčića (Polylabo, Strazbur, Francuska) pri gustini od 4,105 ćelija/bazenčić i inkubirane tokom 20 sati. Ćelijski monoslojevi su oprani dva puta pomoću PBS (pH 7,2). Bakterijska invazivnost epitelnih ćelija je izmerena pomoću analize zaštite od gentamicina (Falkow et al. (1987), Rev. Infect. Dis.9 (Suppl.5):S450-455). Svaki monosloj je inokuliran u 1 mL medijuma ćelijske kulture bez antibiotika uz višestrukost infekcije od 10 bakterija po epitelnoj ćeliji. Nakon perioda inkubacije od 3 sata na 37°C uz 5% CO2, monoslojevi su oprani 3 puta pomoću PBS. Svež medijum ćelijske kulture koji sadrži 100 µg/mL gentamicina (Sigma, St. Louis, MO) je dodavan tokom 1 sata radi ubijanja ekstracelularnih bakterija pre lize monoslojeva pomoću 1% Triton X-100 (Sigma) u dejonizovanoj vodi. Ova koncentracija Triton X-100 nije imala dejstvo na bakterijsku vijabilnost tokom najmanje 30 minuta. Uzorci su razređeni i stavljeni na Mueller-Hinton ploče za agar kako bi se utvrdio broj jedinica koje formiraju kolonije. Svi rezultati invazivne sposobnosti E. coli sa crevnom-407 ćelijskom linijom izraženi su kao procenat intracelularnih bakterija u poređenju sa početnim inokulumom, uzeto kao 100%. Sve analize su sprovedene najmanje 3 puta u zasebnim eksperimentima.

IDENTIFIKACIJA VELIKIH KAPSIDNIH PROTEINA

[0060] Proteini viriona su dobijeni ključanjem 60 µl suspenzije od 10<11>pfu/ml svakog bakteriofaga tokom 10 min.20 µl suspenzije je delovalo na prethodno izlivenom 4-12% poliakrilamidnom gelu. Gel je obojen kumasijem i velike trake su isečene, podvrgnute digestiji tripsina i analizirane postupkom masene spektrometrije u objektu za mikrosekvenciranje pri Institut Pasteur.

[0061] Dobijene mase peptida su upoređene sa informacijama u bazama podataka proteina, čime se omogućava identifikacija najbližeg poznatog proteina, odnosno wV8 za P1 do P6 i RB69 za P8 i JS98 za CLB_P2 (pogledati A. Villegas et al, Virology Journal 2009, 6:41 za karakterizaciju wV8 i S. Zuber et al., Journal of Bacteriology 2007, 189:22, 8206 za karakterizaciju RB69 i JS 98).

[0062] Poravnavanje velikih kapsidnih proteina bakteriofaga wV8 sa peptidima dobijenim postupkom masene spektrometrije velikih kapsidnih proteina bakteriofaga P1 do P6:

[0063] Poravnavanje velikih kapsidnih proteina bakteriofaga RB69 sa peptidima dobijenim postupkom

1

masene spektrometrije velikih kapsidnih proteina bakteriofaga P8:

[0064] Poravnavanje velikih kapsidnih proteina bakteriofaga JS98 sa peptidima dobijenim postupkom masene spektrometrije velikih kapsidnih proteina bakteriofaga CLB_P2.

REFERENTNI PRIMER 1

Izolacija sojeva AIEC

[0065] Sto šezdeset i šest (166) adherentno-invazivnih sojeva Escherichia coli (E. coli), uključujući soj E. coli LF82 (Tabela 1), izolovano je na sledeći način: sojevi AIEC su izolovani iz svežeg fecesa CD pacijenata, članova njihove porodice i kontrolnih subjekata. Feces je razređen u desetostrukom razređenju do -9. Svako razređenje je postavljeno na različitim medijumima. Nakon inkubacije, kolonije su supkultivisane, identifikovane i sojevi su testirani na kapacitet invazivnosti.

[0066] Detaljnije, odmah nakon emisije, svež feces je uveden u sterilnu posudu. Atmosfera je učinjena anaerobnom dodavanjem vlažnog Anaerocult®. Uzorci su tretirani na dan uzorkovanja. Oko 1 g fecesa je uvedeno u 9 mL cisteinovanog 1⁄4 snage Ringerovog rastvora u prethodno izmerene epruvete; ponovo su izmerene nakon uvođenja uzorka kako bi se utvrdila njihova tačna težina (prvo desetostruko razređivanje). Osam sledećih desetostrukih razređivanja je sprovedeno i 0,1 mL svakog razređivanja je postavljeno na različite neselektivne i selektivne medijume inkubirane u odgovarajućim uslovima: kolumbija krvni agar (CS) i CSH agar su inkubirani tokom jedne nedelje u anaerobnim uslovima, MRS medijum je inkubiran tokom 48h u atmosferi obogaćenoj CO2, McConkey agar i agar sa cetrimidom su inkubirani tokom 48h u vazduhu. Sve inkubacije su sprovedene na 37°C. Nakon inkubacije, kolonije su izbrojane, supkultivisane i identifikovane prema utvrđenim fenotipskim kriterijumima.

[0067] Kontrolni subjekat je odabran vis-à-vis CD pacijenta tako da je kontrolni subjekat istog pola i starosti kao i CD pacijent i ima porodicu slične brojnosti kao i CD pacijent (radi uzimanja u obzir varijacije mikroflore unutar porodice).

[0068] Protokol je odobrio lokalni etički odbor 2000. godine. Pacijenti su praćeni prema EPIMAD registru, koji je organizovan prema sporazumu između Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) i Institut National de Veille Sanitaire (InVS) i takođe ga podržava François Aupetit Association, Lion's Club of Northwestern France, Ferring Laboratories, the Société Nationale Française de Gastroentérologie i Lille University Hospital.

Tabela 1 – sojevi AIEC

1

[0069] Medijum CS ana kulture ima sledeću kompoziciju (po litru medijuma):

- 39 g baze kolumbija krvnog agara (Oxoid)

- 5 g glukoze

- 0,3 g cistein hlorohidrata

- 5 g agara

- pH 7,0 ± 0,2

[0070] Mešavina je sterilisana tokom 15 minuta na 121°C. Neposredno pre zasejavanja na pločama, dodato je 5% konjske krvi.

[0071] Medijum CSH kulture ima sledeću kompoziciju (po litru medijuma):

- 39 g baze kolumbija krvnog agara (Oxoid)

- 3 g cistein hlorohidrata

- pH 6,8 ± 0,2

[0072] Mešavina je sterilisana tokom 15 minuta na 121°C. Neposredno pre zasejavanja na pločama, dodato je 2 ml sterilnog rastvora amonijum citrata (0,25 g/10 ml vode). Nakon inkubacije, bakterije koje koriste cistein (i oslobađaju sulfid) dovode do stvaranja crnih kolonija na ovom medijumu.

PRIMER 2

Izolacija faga

1

[0073] Fagi su izolovani iz otpadne vode na sledeći način: otpadna voda je filtrirana na 0,2 µm i pomešana sa jednakom zapreminom medijuma 2X Luria-Bertani (LB). Ova mešavina je inokulirana svežom kulturom soja LF82 i inkubirana u mešalici na 37°C tokom noći. Hloroform (1/10 zapremine) je dodat u flask i stavljen na mešalicu tokom jednog sata. Medijum je centrifugiran na 10,000 g tokom 10 min. Sakupljen je 1 ml supernatanta i dodato je 1/10 zapremine hloroforma. Nakon kratkog mešanja u vorteksu, epruveta po Ependorfu je centrifugirana na 7,500 g tokom 5 min. Za utvrđivanje prisustva faga u ovom ekstraktu kap (10 µl) supernatanta je stavljena na LB ploču za agar i ostavljena je da se osuši. Pomoću platinaste žice ploča je zasejana sa kapi kroz ostatak ploče kako bi se izolovali pojedinačni fagi. Stavljen je 1 ml rastuće kulture soja LF82 kako bi se pokrila celokupna ploča; višak je uklonjen i ploča je inkubirana na 37°C tokom noći. Jedan ili dva plaka su sakupljeni i resuspendovani u 200 µl SM pufera (10 mM TrisHCl pH7, NaCl 200 mM, želatin 0,03%). Dodato je 20 µl hloroforma u svaku epruvetu i epruvete su kratko promešane u vorteksu i centrifugirane na 7,500 g tokom 5 min. Stavljeno je 10 µl supernatanta na LB ploču i ostavljeno je da se osuši, a prethodni postupak je ponovljen najmanje tri puta. Kada je većina izolovanih plakova postala homogena, 10 µl poslednjeg resuspendovanog plaka je dodato u 1 ml rastuće kulture soja LF82 na OD 0,1 na 600 nm. Ova epruveta za kulture je inkubirana na 37°C tokom 2 do 4 sata do lize. Nakon dodavanja 1/10 zapremine hloroforma, kultura je prebačena u epruvetu po Ependorfu, centrifugirana na 7,500 g tokom 5 min i ohlađena na 4°C, čime je dobijen primarni zapat. Nekoliko razređenja ovog zapata je sačuvano na 4°C i upotrebljeno radi inficiranja veće količine kultura u cilju pripreme većih količina faga. Sedam (7) faga je dobijeno na sledeći način:

● vB_EcoM_LF82_P1 (ovde pre i posle P1) koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694;

● vB_EcoM_LF82_P2 (ovde pre i posle P2) koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4695;

● vB_EcoM_LF82_P3 (ovde pre i posle P3) koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4696;

● vB_EcoM_LF82_P4 (ovde pre i posle P4) koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4697;

● vB_EcoM_LF82_P5 (ovde pre i posle P5) koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4698;

● vB_EcoM_LF82_P6 (ovde pre i posle P6) koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4699; i

● vB_EcoM_LF82_P8 (ovde pre i posle P8) koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4700.

[0074] CLB_P2, koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4675, i njegova izolacija je detaljno opisana u Maura et al.

Environmental Microbiology (2012) 14(8), 1844-1854.

2

[0075] Fagi P1 do P6 pripadaju wV8 porodici bakteriofaga.

[0076] P8 pripada RB69 porodici bakteriofaga.

[0077] CLB_P2 pripada JS98 porodici bakteriofaga.

[0078] Klasifikacija u wV8, RB69 i JS98 porodice bakteriofaga je sprovedena na osnovu sekvence velikih kapsidnih proteina.

PRIMER 3

In vitro analize infektivnosti bakteriofaga u sojevima AIEC

[0079] Analiza plaka je sprovedena kontaktom serijskih razređenja rastvora bakteriofaga (od nerazređenih do razređenja 10<-8>) sa Petrijevom šoljom čija površina je pokrivena jednom bakterijom. Nakon inkubacije tokom noći na 37°C, plakovi su prebrojani. Kada je testirana bakterija bila bakterija domaćin (referentni domaćin) upotrebljena za izolaciju bakteriofaga, smatralo se da je analiza plaka pokazala efikasnost od 100%. Kada testirana bakterija nije bila prvobitni domaćin, rezultati su izraženi poređenjem sa referentnim domaćinom. Rezultat veći od 80% (+++) znači da je bakterija veoma efikasan domaćin u poređenju sa referentnim domaćinom, dok rezultat između 0,1 i 80% (++) znači da je bakterija efikasan domaćin, a rezultat ispod 0,1% (+), ali iznad 0 znači da je bakterija umereno efikasan domaćin, i na kraju 0 (-) znači da je bakterija u potpunosti otporna.

Rezultati

[0080] Tabela 2 prikazuje rezultat spektra domaćina 8 faga (izolovanih/identifikovanih u Primeru 2) na 38 sojeva (od 166 sojeva izolovanih u Primeru 1, Tabela 1)

Table 2 Testirani sojevi i efektivna efikasnost zasejavanja na pločama (EOP) dobijena za svaki bakteriofag

Tabela 3 broj sojeva inficiranih od faga:

PRIMER 4

In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa

[0081] In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa je procenjena na sledeći način:

Prvo, soj LF82 je projektovan da prenosi dva antibiotska otporna gena koji respektivno daju otpornost Streptomicinu i Kanamicinu. Ovaj novi soj bakterija je nazvan LF82SK, a njegove invazivne karakteristike su proverene kako bi bile slične prvobitnom soju LF82.

[0082] Tri (3) grupe od po dva (2) miša:

Grupa 1: nekolonizovani miševi fagi

Grupa 2: LF82SK kolonizovani miševi

Grupa 3: LF82SK kolonizovani miševi fagi

2

[0083] Streptomicin (5 g/L) je dodat u vodu za piće svim životinjama 3 dana pre dana 0 i čuvan je tokom eksperimenta.

[0084] Dana 0 LF82SK je dat Grupama 2 i 3 kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0085] Dana 4, 200 µl koktela od P2 P6 bakteriofaga je dato Grupama 1 i 3 (rastvor u kateteru 10<8>pfu/ml) jednom ujutru i jednom popodne. P2+P6 bakteriofagi su takođe dodati u vodu za piće (10<8>pfu/ml). Dana 5 ujutru miševi su žrtvovani radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu i fecesu.

Rezultati:

Bakterije (E. coli):

[0086]

Grupa 1: bez bakterija;

Grupa 2: u ileumu - 10<6>cfu/g organ; u fecesu - 10<8>cfu/organ;

Grupa 3: u ileumu i fecesu: sve bakterije su lizovane od strane faga.

Fagi:

[0087]

Grupa 1: u ileumu - 10<6>pfu/g organa; u fecesu - 10<7>pfu/organ;

Grupa 2: bez faga

Grupa 3: u ileumu - 10<6>pfu/g organa; u fecesu - 10<10>pfu/organ;

[0088] U fecesu je bilo 100 puta više faga u Grupi 3 nego u Grupi 1, što prikazuje multiplikaciju faga in vivo.

PRIMER 5

In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa

[0089] In vivo replikacija bakteriofaga u utrobi miševa je procenjena na sledeći način:

12 miševa je podeljeno u tri (3) grupe od po četiri (4) miša:

Grupa 1: nekolonizovani miševi fagi

Grupa 2: LF82SK-kolonizovani miševi

Grupa 3: LF82SK-kolonizovani miševi fagi

[0090] Streptomicin (5 g/L) je dodat u vodu za piće za sve životinje 3 dana pre dana 0 i čuvan je tokom eksperimenta.

[0091] Dana 0 LF82SK je dat miševima u Grupama 2 i 3 kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0092] Dana 4 bakteriofagi (koktel od P2+P6+P8 na 10<8>pfu/mL svaki) su dodati u vodu za piće u Grupama 1 i 3.

[0093] Dana 5 miševi su žrtvovani radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu i fecesu.100 µl ilealnih homogenata iz tri grupe je uzeto radi ekstrakcije celokupnog DNK pomoću Maxwell® 16 Tissue DNK kompleta za prečišćavanje iz Promega.

Rezultati:

Bakterije (E. coli):

[0094]

Grupa 1: bez bakterija;

Grupa 2: u ileumu - 3.2·10<6>cfu/g organa; u fecesu - 1.2·10<9>cfu/g fecesa;

Grupa 3: u ileumu i fecesu: sve bakterije su lizovane od strane faga.

Fagi:

[0095]

Grupa 1: u ileumu - 1.4·10<6>pfu/g organa; u fecesu - 5.2·10<6>pfu/g fecesa;

Grupa 2: bez faga

Grupa 3: i ileumu -2.6·10<6>pfu/g organa; u fecesu -1.0·10<9>pfu/g fecesa;

[0096] U fecesu, bilo je 200 puta više faga u Grupi 3 nego u Grupi 1, što prikazuje multiplikaciju faga in vivo.

[0097] DNK ekstrahovan iz ilealnih delova je upotrebljen za sprovođenje kvantitativnog PCR pomoću dva skupa prajmera. Jedan skup prajmera (SEQ ID NO: 30-31) je služio da amplifikuje DNK iz „svih bakterija“ prisutnih u uzorku, dok je drugi skup (SEQ ID NO: 32-33) upotrebljen da amplifikuje konkretno DNK iz „E. coli“ bakterija. Nakon normalizacije, rezultati su izraženi kao odnos E. coli i svih bakterija.

Grupa 1: qPCR amplifikacije su bile uspešne kod svih prajmera bakterija, ali ne kod E. coli prajmera. Ovaj odnos nije se mogao izračunati.

Grupa 2: qPCR amplifikacije su bile uspešne kod oba skupa prajmera. Prosečan odnos je bio 0,6 (60% svih bakterija bile su E. coli bakterije).

2

Grupa 3: qPCR amplifikacije su bile uspešne kod oba skupa prajmera. Prosečan odnos je bio 0,1 (10% svih bakterija bile su E. coli bakterije). Napominjemo da je kod jednog miša prikazan odnos od 0,4, dok su kod ostala tri bile prikazane mnogo niže vrednosti (0,06; 0,0002; 0,002).

[0098] Posledica ovoga bila je da su bakteriofagi bili u mogućnosti da smanje nivo ilealne kolonizacije bakterije LF82 najmanje jednim redom veličine kod tri od četiri miša.

PRIMER 6

In vivo analiza infektivnosti bakteriofaga

[0099] Dva koktela faga su odabrana za testiranje divljeg tipa (WT) miševa i CEACAM6 miševa inficiranih sojem LF82 E. coli izolovanog od CD pacijenata.

[0100] Kod WT miševa i kod CEACAM6 miševa inficiranih sojem LF82 E. coli izolovanog od CD pacijenata, bakteriofagi se daju miševima oralno kateterom u CMC. Ova vrsta davanja ima mnogo prednosti: poznata količina davanja bakteriofaga i neposredna neutralizacija kiselosti želuca. Fagi se daju miševima na dnevnom nivou tokom celokupne studije.

- Miševi su žrtvovani 5 dana nakon davanja LF82.

- Glavni kriterijumi: kvantifikacija LF82 u ilealnoj i crevnoj adherentnoj flori miševa.

- Sporedni kriterijumi:

∘ Procena težine

∘ Konzistentnost stolice.

∘ Prisustvo krvi u stolici (makro i bio)

- Luminalna flora (konvencionalna flora LF82 fagi)

∘ Pri žrtvovanju: Makroskopska i histološka ispitivanja, adherentna ilealna i crevna flora LF82 fagi,

∘ Pri žrtvovanju: Makroskopska i histološka ispitivanja, adherentna ilealna i crevna flora LF82 fagi.

[0101] Prate se biološki parametri zapaljenja, a pratražuje se translokacija bakteriofaga u mezenterijalnim limfnim čvorovima (MLN), jetri i slezini.

[0102] Prate se zapaljenski markeri (MPO, pro-zapaljenski citokini IL-6, IL-12 i antizapaljenski citokini IL-10). Pretražuje se translokacija bakteriofaga i AIEC u MLN, jetri i slezini.

[0103] Nastavak eliminacije bakteriofaga se odvija u stolici miševa koji primaju koktel bakteriofaga bez soja LF82.

2

PRIMER 7

In vivo analiza koktela faga na soju LF82.

[0104] In vivo replikacija bakteriofaga (koktel od P2+P6+P8+CLB_P2) u utrobi miševa je procenjena na sledeći način:

20 miševa je podeljeno u dve (2) grupe od po deset (10) miševa:

Grupa 1: LF82SK-kolonizovani miševi

Grupa 2: LF82SK-kolonizovani miševi fagi

[0105] Streptomicin (5 g/L) je dodat u vodu za piće za sve životinje 3 dana pre dana 0 i čuvan je tokom eksperimenta.

[0106] Dana 0 LF82SK je dat miševima u obe grupe kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0107] Dana 3 bakteriofagi (koktel od P2+P6+P8+CLB_P2 na 10<8>pfu/mL svaki) su dati miševima u Grupi 2 preko katetera.

[0108] Dana 4 i 7, 5 miševa u svakoj grupi je žrtvovano radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu, debelom crevu i fecesu.100 µl ilealnih i crevnih homogenata iz dve grupe je uzeto radi ekstrahovanja celokupnog DNK pomoću Maxwell® 16 Tissue DNK kompleta za prečišćavanje iz Promega.

Rezultati:

Nivo LF82 u stolici:

[0109] Dana 4 i 7 nivoi LF82 su bili:

u grupi 1: 710<9>; 110<9>cfu/g

u grupi 2: 810<7>; 510<8>cfu/g

Nivoi faga u stolici:

[0110] Dana 4 i 7 nivoi faga su bili:

u grupi 1: nijedan

u grupi 2: 510<9>; 610<9>pfu/g

[0111] U prisustvu koktela faga nivo LF82 u stolici je bio značajno niži nego u njihovom odsustvu, što pokazuje da je koktel faga mogao da inficira LF82 u utrobi miševa.

2

Nivo LF82 u organima:

[0112] Dana 4 nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 1: 100% bakterija su E. coli (LF82)

u ileumu grupe 2: 20% bakterija su E. coli (LF82)

u crevu grupe 1: 40% bakterija su E. coli (LF82)

u crevu grupe 2: 2% bakterija su E. coli (LF82)

Dana 7 nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 1: 100% bakterija su E. coli (LF82)

u ileumu grupe 2: 50% bakterija su E. coli (LF82)

u crevu grupe 1: 25% bakterija su E. coli (LF82)

u crevu grupe 2: 10% bakterija su E. coli (LF82)

Nivo faga u organima:

[0113] Dana 4 nivoi faga su bili:

u ileumu grupe 1: nijedan

u ileumu grupe 2: 710<8>pfu/g

u crevu grupe 1: nijedan

u crevu grupe 2: 510<10>pfu/g

Dana 7 nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 1: nijedan

u ileumu grupe 2: 710<8>pfu/g

u crevu grupe 1: nijedan

u crevu grupe 4: 210<8>pfu/g

[0114] Dana 2 i 5 nivo LF82 je smanjen u ileumu i crevu u grupi tretiranoj od strane faga. Ovo pokazuje da fagi inficiraju LF82 u delovima utrobe, a ne samo u stolici. Konkomitantno, nivo faga dana 7 ostaje podjednako visok kao i dana 2, što pokazuje da fagi mogu trajati nekoliko dana u utrobi nakon jedinstvenog početnog davanja.

PRIMER 8

In vivo analiza infektivnosti bakteriofaga

2

[0115] In vivo analiza infektivnosti bakteriofaga (koktel od P2+P6+P8) kod CEACAM6 miševa inficiranih sa LF82SK je procenjena na sledeći način:

48 miševa je podeljeno u četiri (4) grupe na sledeći način:

Grupa 1: nekolonizovani miševi (8 miševa)

Grupa 2: nekolonizovani miševi fagi (12 miševa)

Grupa 3: LF82SK-kolonizovani miševi (16 miševa)

Grupa 4: LF82SK-kolonizovani miševi fagi (12 miševa)

[0116] DSS (dekstran sulfat) 0,25% je uveden u vodu za piće 3 dana pre dana 0 i čuvan tokom eksperimenta.

[0117] Streptomicin (5mg) je dat oralno putem katetera svim životinjama 1 dan pre dana 0.

[0118] Dana 0 LF82SK je dat miševima u Grupama 3 i 4 kako bi se omogućilo da soj kolonizuje utrobu miševa.

[0119] Dana 1 fagi (koktel od P2+P6+P8 na 10<7>pfu/mL svaki) su jednom dati svakom mišu u Grupama 2 i 4 oralno putem katetera u CMC. Ova vrsta davanja ima mnogo prednosti: poznata količina davanja bakteriofaga i neposredna neutralizacija kiselosti želuca.

[0120] Dana 1, 4 miša u Grupi 3 su žrtvovana radi procene broja bakterija u ileumu, u crevu i u fecesu pre davanja faga.

[0121] Dana 2 respektivno 4, 6, 6 i 6 miševa u Grupama 1, 2, 3 i 4 je žrtvovano radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu, u crevu i u fecesu.

[0122] Dana 5 respektivno 4, 6, 6 i 6 miševa u Grupama 1, 2, 3 i 4 je žrtvovano radi procene broja bakterija i bakteriofaga u ileumu, u crevu i u fecesu.

[0123] 100 µl ilealnih, crevnih i homogenata fecesa iz četiri grupe je uzeto radi ekstrahovanja celokupnog DNK pomoću Maxwell® 16 Tissue DNK kompleta za prečišćavanje iz Promega. Težina, konzistentnost stolice i prisustvo krvi u stolici su praćeni na dnevnom nivou.

DNK ekstrahovan iz ilealnih delova je upotrebljen za sprovođenje kvantitativnog PCR pomoću jednog skupa prajmera (SEQ ID NO: 44-45) radi amplifikovanja specifičnog gena (pMT1) iz LF82. Rezultati su izraženi kao broj kopija ovog gena po gramu tkiva.

LF82 pMT1 F (SEQ ID NO:44) CCATTCATGCAGCAGCTCTTT

LF82 pMT1 R (SEQ ID NO:45) ATCGGACAACATTAGCGGTGT

Rezultati:

[0124] Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti dobijene za svaku grupu miševa.

[0125] U grupi 1, ni LF82 ni fagi nisu detektovani tokom eksperimenta.

2

Nivo LF82 u stolici:

[0126] Dana 1: nivo LF82 u Grupama 3 i 4 je bio 510<9>i 610<9>cfu/g respektivno.

[0127] Dana 2, 3 i 5 nivoi LF82 su bili:

u grupi 3: 310<9>; 510<8>; 510<7>cfu/g

u grupi 4: 510<5>; 510<5>; 510<3>cfu/g

Nivo faga u stolici:

[0128] Dana 2, 3 i 5 nivoi faga su bili:

u grupi 2: 510<5>pfu/g; nije detektovano; nije detektovano

u grupi 4: 110<9>; 110<7>; 510<6>pfu/g

[0129] U prisustvu faga nivo LF82 u stolici je bio značajno niži nego u njihovom odsustvu.

Konkomitantno, nivo faga je bio značajno viši kod miševa kolonizovanih od strane LF82 nego kod miševa oslobođenih od LF82. Oba podatka su potvrdila da fagi mogu inficirati LF82 u utrobi.

Nivo LF82 u organima:

[0130] Dana 2 nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 3: 210<6>kopija pMT1/g

u ileumu grupe 4: 810<4>kopija pMT1/g

u crevu grupe 3: 210<7>kopija pMT1/g

u crevu grupe 4: 110<5>kopija pMT1/g

Dana 5 nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 3: 510<4>kopija pMT1/g

u ileumu grupe 4: 810<4>kopija pMT1/g

u crevu grupe 3: 610<6>kopija pMT1/g

u crevu grupe 4: 210<5>kopija pMT1/g

Nivo faga u organima:

[0131] Dana 2 nivoi faga su bili:

u ileumu grupe 2: nije detektovano

u ileumu grupe 4: 810<5>pfu/g

u crevu grupe 2: 510<4>pfu/g

u crevu grupe 4: 510<6>pfu/g

Dana 5 nivoi LF82 su bili:

u ileumu grupe 2: nije detektovano

u ileumu grupe 4: nije detektovano

u crevu grupe 2: nije detektovano

u crevu grupe 4: 210<4>pfu/g

[0132] Dana 2 nivo LF82 je smanjen u ileumu i crevu u grupi tretiranoj od strane faga. Ovo pokazuje da su fagi inficirali LF82 u delovima utrobe, a ne samo u stolici. Konkomitantno, nivo faga je bio značajno viši kod miševa kolonizovanih od strane LF82 nego kod miševa oslobođenih od LF82.

[0133] Dana 5 nivo LF82 u ileumu je bio previše slab da bi se videla razlika između dve grupe, dok je kod uzoraka u crevu nivo LF82 bio i dalje smanjen u grupi koja je primila fage u poređenju sa grupama koje nisu. Konkomitantno, mogli smo samo da detektujemo fage u crevu miševa kolonizovanih od strane LF82. Ovo pokazuje da dejstvo faga u smanjenju LF82 može trajati nekoliko dana nakon početnog davanja.

[0134] Uprkos visokom nivou kolonizacije LF82 uočenom u ovom eksperimentu, nije uočen nikakav znak kolitisa u bilo kojoj grupi.

PRIMERI IZVOĐENJA

[0135] Ovaj opis se odnosi i.a na sledeće primere izvođenja:

1. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata:

(i) najmanje jedan soj(eve) bakteriofaga koji može da proizvede litičku infekciju u adherentno-invazivnom soju Escherichia coli; i

(ii) farmaceutski prihvatljiv nosač;

za upotrebu u lečenju zapaljenskog oboljenja creva.

2. Kompozicija prema primeru izvođenja 1, pri čemu adherentno-invazivni soj Escherichia coli je prisutan u jednom ili više delova creva (tankog i debelog) subjekta.

3. Kompozicija prema primeru izvođenja 1, pri čemu adherentno-invazivni soj Escherichia coli je LF82, 07081, 07082, 07076 ili 06075.

4. Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 3, pri čemu zapaljensko oboljenje creva je Kronova bolest.

5. Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 3, pri čemu zapaljensko oboljenje creva je ulcerozni kolitis.

1

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 3, pri čemu zapaljensko oboljenje creva je ponovno javljanje ilealnih lezija nakon operacije, na primer operacije radi uklanjanja najmanje jednog dela tankog creva CD pacijenata.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 6, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4694 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P1.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 7, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4695 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P2.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 8, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P3.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 9, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P4.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 10, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P5.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 11, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4699 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P6.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 12, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu

2

litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P8.

Kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 13, pri čemu kompozicija obuhvata soj bakteriofaga CLB_P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4675 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga CLB_P2.

Postupak lečenja zapaljenskog oboljenja creva, koji obuhvata davanje subjektu kojem je to potrebno najmanje jednog soja bakteriofaga koji može da proizvede litičku infekciju u adherentno-invazivnom soju Escherichia coli čime se subjekat leči.

Postupak prema primeru izvođenja 15, pri čemu je adherentno-invazivni soj Escherichia coli prisutan u jednom ili više delova creva (tankog i debelog) subjekta.

Postupak prema primeru izvođenja 15, pri čemu adherentno-invazivni soj Escherichia coli je LF82, soj opisan u Tabeli 1 u ovom dokumentu ili soj opisan u Tabeli 2 u delu Darfeuille-Michaud et al. (2004), Gastroenterology 127:412-421.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 17, pri čemu zapaljensko oboljenje creva je Kronova bolest.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 18, pri čemu zapaljensko oboljenje creva je ulcerozni kolitis.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 19, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P1.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 20, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4695 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P2.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 21, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P3.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 22, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P4.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 23, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P5.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 24, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4699 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P6.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 25, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga P8.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 26, pri čemu najmanje jedan soj bakteriofaga obuhvata soj bakteriofaga CLB_P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4675 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga CLB_P2.

Postupak prema bilo kom od primera izvođenja 15 do 27, pri čemu davanje je oralno davanje. Soj bakteriofaga P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

Soj bakteriofaga P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

Soj bakteriofaga P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

4

32. Soj bakteriofaga P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

33. Soj bakteriofaga P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

34. Soj bakteriofaga P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

35. Soj bakteriofaga P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4700 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost, poželjno istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao navedeni soj bakteriofaga.

4

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata:

(i) najmanje jedan soj(eve) bakteriofaga koji može da proizvede litičku infekciju u adherentnoinvazivnom soju Escherichia coli; i

(ii) farmaceutski prihvatljiv nosač;

za upotrebu u lečenju zapaljenskog oboljenja creva,

pri čemu ova kompozicija obuhvata najmanje jedan od soja bakteriofaga P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P1, soja bakteriofaga P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P2, soja bakteriofaga P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P3, soja bakteriofaga P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM 1-4697 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P4, soja bakteriofaga P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P5, soja bakteriofaga P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P6, soja bakteriofaga P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4700 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga P8 i soja bakteriofaga CLB_P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4675 ili varijantu istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga CLB_P2.

2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je adherentno-invazivni soj Escherichia coli prisutan u jednom ili više delova creva (tankog i debelog) subjekta.

3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je adherentno-invazivni soj Escherichia coli LF82, 07081, 07082, 07076 ili 06075.

2

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je zapaljensko oboljenje creva Kronova bolest ili ulcerozni kolitis ili ponovno javljanje ilealnih lezija nakon operacije, na primer operacije radi uklanjanja najmanje jednog dela tankog creva kod CD pacijenata.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je ta kompozicija za oralno davanje.

6. Soj bakteriofaga P1 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4694 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

7. Soj bakteriofaga P2 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4695 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

8. Soj bakteriofaga P3 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4696 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

9. Soj bakteriofaga P4 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4697 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

10. Soj bakteriofaga P5 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4698 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

11. Soj bakteriofaga P6 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4699 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

12. Soj bakteriofaga P8 koji je deponovan u Francuskoj nacionalnoj zbirci mikroorganizama u Institut Pasteur pod pristupnim brojem CNCM I-4700 ili varijanta istog, pri čemu ta varijanta ima istu litičku aktivnost i iste fenotipske karakteristike kao i navedeni soj bakteriofaga.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5