ES2742724T3 - Producción de factor X funcional y completamente procesado en un sistema de expresión de mamífero que secreta furina - Google Patents

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Abstract

Célula transformada que comprende: una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una furina humana, tal que la célula transformada expresa y secreta furina funcional en un sobrenadante de cultivo; en la que la furina se secreta a una concentración de 50 U/ml a 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante de 36 a 78 horas, y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un factor X.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de factor X funcional y completamente procesado en un sistema de expresión de mamífero que secreta furina
Campo
Se divulgan en el presente documento sistemas de expresión, células transformadas y métodos relacionados con los mismos, para la expresión de factor X recombinante activo y completamente procesado en presencia de furina. Antecedentes
El factor X de coagulación humano (FX), FX activado (FXa) y variantes de los mismos, se usan como agentes terapéuticos en trastornos de coagulación de la sangre que incluyen, pero no se limitan a, hemofilia y enfermedad de von Willebrand. El FX, una serina proteasa dependiente de la vitamina K, se sintetiza como una proteína precursora de cadena única en el retículo endoplasmático, con la posterior escisión de furina proteolítica intracelular en el aparato de Golgi antes de la secreción por la célula productora en el torrente circulatorio, o en el medio de cultivo en caso de expresión recombinante. Tres sitios de escisión de furina en FX son responsables del procesamiento proteolítico de FX apropiado. La forma madura de FX es una molécula de dos cadenas unidas a disulfuro, que consiste en una cadena ligera y una pesada, formada después de la escisión de la proteína precursora. Las modificaciones adicionales de la molécula incluyen la y-carboxilación de la cadena ligera y la glicosilación ligada a O o N del péptido de activación que está unido a la cadena pesada.
Además de FX, los factores de coagulación dependientes de la vitamina K adicionales que albergan el sitio de reconocimiento de consenso Arg-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO:4) son sustratos de la endoproteasa furina expresada de manera ubicua, también conocida como enzima de escisión de residuos de aminoácido básica combinada (PACE). El procesamiento proteolítico adecuado de proteínas recombinantes de la cascada de la coagulación está dañado en sistemas de expresión de cultivo celular debido a limitaciones del procesamiento intracelular a alta expresión de rendimiento. De manera similar al factor de von Willebrand y al factor IX de coagulación (FIX) que muestran un procesamiento proteolítico insuficiente a tasas de expresión altas en células de mamífero recombinantes, la secreción de FX en clones celulares de CHO de baja producción se caracteriza por FX completamente procesado, mientras que los clones de alta producción comprenden FX de cadena única no procesado y múltiples formas no procesadas de cadena ligera de FX, además de las especies de cadena ligera y pesada de F x procesadas de manera correcta. Los tipos y grados de cadena ligera de FX no procesado varían entre clones celulares individuales y en condiciones de cultivo celular diferentes tales como densidad celular. Es necesaria coexpresión de furina in vivo o incubación de furina in vitro después del cultivo celular adicional para mantener la maquinaria proteolítica de la furina endógena, facilitando la escisión de la proteína intacta.
La coexpresión de furina es indispensable para la expresión de FX completamente procesado a alto rendimiento. Sin embargo, hasta la fecha no se ha informado de un nivel umbral de furina que asegure un porcentaje alto de FX procesado intacto en sistemas de cultivo celular. Los niveles altos de furina son tóxicos, por tanto deben equilibrarse los niveles de expresión de furina mediante sistemas de expresión en mamíferos que producen FX entre niveles que sean tóxicos, pero potencialmente procesan el 100% de la proteína precursora de FX, y aquellos que sean demasiado bajos, dando como resultado cultivos celulares sanos en los que se produce FX procesado subóptimo.
Sumario
Se divulga en el presente documento un sistema para expresar furina y un factor X humano (FX) en la misma línea celular y proporcionando así una concentración de furina crítica en el sobrenadante de cultivo para la generación de FX completamente procesado y completamente activo, manteniendo la viabilidad del cultivo.
Por tanto, se divulga en el presente documento una célula transformada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una furina humana, de manera que la célula transformada expresa y secreta furina funcional en un sobrenadante de cultivo, en la que la furina funcional se secreta a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas. En la invención, las células transformadas comprenden además una secuencia de nucleótidos que codifica para el factor X. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica para furina humana y la secuencia de nucleótidos que codifica para el factor X están en diferentes vectores de expresión. En otra realización, la secuencia de nucleótidos que codifica para furina humana y la secuencia de nucleótidos que codifica para el factor X están en el mismo vector de expresión.
Se divulga también un sistema de expresión de proteína eucariota que comprende una línea celular adecuada para la expresión de proteínas de mamífero; un primer vector de expresión adaptado para la expresión de furina humana por la línea celular, en el que el primer vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de furina humana; y un segundo vector de expresión adaptado para la expresión de una proteína por la línea celular, en el que el segundo vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína escindible por furina y que muestra un motivo Arg-(Lys/Arg)-Arg, en el que la línea celular es capaz de secretar furina funcional en el sobrenadante de cultivo a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas. Se divulga también un sistema de expresión de proteína eucariota que comprende una línea celular adecuada para la expresión de proteínas de mamífero; un primer vector de expresión adaptado para la expresión de furina humana y una proteína escindible por furina, y que muestra un motivo Arg-(Lys/Arg)-Arg, por la línea celular, en el que el primer vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de furina humana y una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína escindible por furina, en el que la línea celular es capaz de secretar furina funcional en el sobrenadante de cultivo a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica para furina humana y la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína están en diferentes vectores de expresión. En otro aspecto la secuencia de nucleótidos que codifica para furina humana y la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína están en el mismo vector de expresión.
Se proporciona una célula transformada que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una furina humana y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un FX humano, de manera que la célula transformada expresa y secreta furina funcional y FX en un sobrenadante de cultivo, en la que la furina se secreta a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas y al menos el 85% de FX está completamente procesado. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica para furina humana y la secuencia de nucleótidos que codifica para el FX están en diferentes vectores de expresión. En otra realización, la secuencia de nucleótidos que codifica para furina humana y la secuencia de nucleótidos que codifica para el FX están en el mismo vector de expresión.
Se divulga también un sistema de expresión de proteína eucariota que comprende una línea celular adecuada para la expresión de proteínas de mamífero; un primer vector de expresión adaptado para la expresión de furina humana por la línea celular, en el que el primer vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de furina humana; y un segundo vector de expresión adaptado para la expresión de FX por la línea celular, en el que el segundo vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para FX, en el que la línea celular es capaz de secretar furina funcional en el sobrenadante de cultivo a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas.
Además se divulga un sistema de expresión de proteína eucariota que comprende una línea celular adecuada para la expresión de proteínas de mamífero; un primer vector de expresión adaptado para la expresión de furina humana y FX, en el que el primer vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de furina humana y una secuencia de nucleótidos que codifica para FX, en el que la línea celular es capaz de secretar furina funcional en el sobrenadante de cultivo a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas. Se divulga también un método de preparación de una proteína recombinante que comprende transfectar una línea celular adecuada para la expresión de proteínas de mamífero con un primer vector de expresión adaptado para la expresión de furina humana por la línea celular, en el que el primer vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de furina humana; y transfectar la línea celular con un segundo vector de expresión adaptado para la expresión de una proteína por la línea celular, en el que el segundo vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que muestra un motivo Arg-(Lys/Arg)-Arg; en el que la línea celular transfectada con los vectores de expresión primero y segundo expresa y secreta furina humana funcional a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante entre aproximadamente 40 y aproximadamente 80 horas o entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas. En un aspecto, la línea celular se transfecta con el primer vector de expresión y el segundo vector de expresión sustancialmente de manera simultánea. En otro aspecto, la línea celular se transfecta con el primer vector de expresión y se obtienen células que secretan niveles estables de furina antes de transfectar la línea celular con el segundo vector de expresión. En aún otro aspecto, la línea celular se transfecta con el segundo vector de expresión y se obtienen células que secretan niveles estables de la proteína antes de transfectar la línea celular con el primer vector de expresión.
En un aspecto, la proteína es factor de von Willebrand, factor II, factor IX, factor X, proteína C, proteína S o proteína Z. En la invención, la proteína es factor X.
Se divulga también un método de preparación de una proteína recombinante que comprende transfectar una línea celular adecuada para la expresión de proteínas de mamífero con un primer vector de expresión adaptado para la expresión de furina humana por la línea celular, en el que el primer vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de furina humana; y transfectar la línea celular con un segundo vector de expresión adaptado para la expresión de FX por la línea celular, en el que el segundo vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de FX; en el que la línea celular transfectada con los vectores de expresión primero y segundo expresa y secreta furina humana funcional a una concentración de aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas. En una realización, la línea celular se transfecta con el primer vector de expresión y el segundo vector de expresión sustancialmente de manera simultánea. En otra realización, la línea celular se transfecta con el primer vector de expresión y se obtienen células que secretan niveles estables de furina antes de transfectar la línea celular con el segundo vector de expresión. En aún otra realización, la línea celular se transfecta con el segundo vector de expresión y se obtienen células que secretan niveles estables de la proteína antes de transfectar la línea celular con el primer vector de expresión.
En otra realización, las células son capaces de secretar furina funcional en el sobrenadante de cultivo a una concentración de al menos aproximadamente 50 a aproximadamente 60 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas y en la que al menos el 90% de FX está completamente procesado. En otra realización, las células son capaces de secretar furina funcional en el sobrenadante de cultivo a una concentración de al menos aproximadamente 90 a aproximadamente 100 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas y en la que al menos el 95% de FX está completamente procesado.
Se divulga también un FX recombinante producido por una célula transformada divulgada en el presente documento. Además se proporciona un FX recombinante producido por un sistema de expresión divulgado en el presente documento.
Se proporciona también un FX recombinante producido por un método divulgado en el presente documento.
Se proporciona también un sistema de expresión para FX recombinante adaptado para secretar furina en un sobrenadante de cultivo a una concentración de entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 300 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas.
Se proporciona también un método de producción de FX completamente procesado y maduro que comprende un sistema de expresión que secreta furina en un sobrenadante de cultivo a una concentración de entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 300 U/ml después del cultivo durante entre aproximadamente 36 y aproximadamente 78 horas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A representa el vector de expresión RCL.012-74.pD3H-Furina y la figura 1B representa la secuencia de nucleótidos del vector (SEQ ID NO:1). La secuencia de furina humana está subrayada y los codones de iniciación y de terminación están doblemente subrayados.
La figura 2 representa la secuencia de nucleótidos de furina humana (SEQ ID NO:2). Los codones de iniciación y de terminación están doblemente subrayados.
La figura 3 representa la secuencia de aminoácidos de furina humana (SEQ ID NO:3).
La figura 4 representa el grado de factor X completamente procesado (FX) en cultivos. La cuantificación densitométrica se llevó a cabo mediante inmunotransferencia de tipo Western de FX en condiciones reductoras y se tiñó con un anticuerpo policlonal anti-FX. Los clones (ID de clon de 42 a 52) mostraron hasta 4 especies de FX con intensidades de píxel variantes que incluyen la cadena única de FX no procesado (caja 1, 5, 9, etc.), la cadena pesada de FX (caja 2, 6, 10, etc.), la cadena ligera de FX que contiene propéptido no procesado (caja 3, 7, 11, etc.) y la cadena ligera de FX procesado (caja 4, 8, 12, etc.). La intensidad de píxel de las cajas 45-48 se determinó para la resta de fondo.
La figura 5 representa la concentración de furina secretada y el porcentaje de FX completamente procesado/FX total en el cultivo. Existe una relación dosis-respuesta entre la concentración de furina secretada en el sobrenadante de cultivo celular (determinada con un ensayo de actividad de furina) y el % de FX completamente procesado/FX total (determinado mediante cuantificación densitométrica de las respectivas bandas en las inmunotransferencias de tipo Western).
La figura 6 representa un análisis de la dosis de furina y de FX completamente procesado. Los datos (círculos) con promedio específico de células (líneas oscuras) y de población (líneas claras) predijeron el FX completamente procesado/FX total (%) como una función de la concentración de furina con el modelo Emáx.
Las figuras 7A-D representan una prueba de validación del modelo Emáx. La figura 7A representa el error residual de respuesta frente a la respuesta predicha donde los puntos de datos están dispersos de manera simétrica alrededor de cero, indicando una tendencia no sistemática. La figura 7B representa un gráfico Q-Q normal para los errores residuales indicando que la suposición de errores distribuidos normal mantenidos como puntos de datos están dispersos alrededor de la línea de identidad. La figura 7C representa el error residual de respuesta frente a la línea celular donde los puntos de datos están dispersos de manera simétrica alrededor de cero, indicando una tendencia no sistemática. La figura 7D representa los valores observados y predichos representados los unos con los otros indicando un buen ajuste de los datos como los puntos de datos están dispersos de manera simétrica alrededor de la línea de identidad.
La figura 8 representa un modelo nulo para someter a prueba la hipótesis de que el grado de procesamiento de FX es independiente de la concentración de furina. Los datos (círculos) y el modelo nulo ajustado con las ordenadas en el origen que suponen solo que el FX procesado es independiente de la concentración de furina (ajustes promedios específicos de células y de población como líneas oscuras y claras, respectivamente).
La figura 9 representa una curva dosis-respuesta y concentraciones mínimas de furina calculadas para producir el90% y el 95% de FX procesado. El promedio de población predicho de FX completamente procesado/FX total (%) como una función de la concentración de furina (línea negra) junto con las concentraciones de furina que proporcionan el 90% y el 95% de FX completamente procesado/FX total obtenido mediante optimización numérica del modelo ajustado.
Descripción detallada
Se proporcionan en el presente documento células transformadas, sistemas de expresión eucariotas, métodos para producir proteínas recombinantes y proteínas recombinantes preparados mediante los métodos, todos dirigidos a la expresión de furina y de factor X (FX) en la misma línea celular, y proporcionando así una concentración de furina crítica en el sobrenadante de cultivo para la generación de FX completamente procesado y maduro, manteniendo la viabilidad del cultivo.
Es común a las células transformadas, los sistemas de expresión eucariotas y los métodos para la producción de proteínas recombinantes la capacidad de la célula huésped de producir niveles de furina recombinante consistentes. La furina es necesaria para la escisión de determinadas proteínas de mamífero, incluyendo el FX, desde una forma de proteína precursora a una forma completamente procesada, madura. Las bajas concentraciones de furina en el sobrenadante de cultivo del sistema de expresión dan como resultado la acumulación de formas de la proteína que contienen propéptido y otras parcialmente procesadas o no. Las concentraciones de furina que son demasiado altas dan como resultado el crecimiento deteriorado de las células huésped y finalmente la muerte celular.
Tal como se usa en el presente documento, el término “furina” incluye furina de cadena completa así como cualquier fragmento de furina capaz de la escisión del sitio de reconocimiento de consenso Arg-X-Lys/Arg-Arg. Las formas truncadas activas de furina se conocen en la técnica y son adecuadas para su uso en la presente divulgación. Los ejemplos no limitativos de fragmentos de furina adecuados pueden encontrarse en el documento U.S. 6.210.926 y en Preininger et al., (Cytotechnology 30:1-15, 1999).
Además, dentro del alcance de la presente divulgación se encuentran variantes de la furina y proteínas del factor X divulgadas en el presente documento. Por ejemplo, podrían realizarse cambios conservativos de aminoácidos , que aunque alteran la secuencia primaria de la proteína o del péptido, normalmente no alteran su función. Las sustituciones conservativas de aminoácidos normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; y lisina, arginina; fenilalanina, tirosina.
Se incluyen también proteínas de fusión u otras modificaciones, o FX que ha aumentado la semivida después de la administración a un sujeto. Los ejemplos de tales serán fusiones con un dominio Fc de inmunoglobulina, un dominio de albúmina, un polipéptido recombinante extendido (XTEN) (véase el documento US 8.673.860), secuencias poli Glu o poli Asp, transferrina o polipéptidos que contienen PAS (Pro Ala Ser) unidos a la secuencia de FX.
Las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluyen derivatización química in vivo o in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación o carboxilación. Se incluyen también modificaciones de glicosilación, por ejemplo, aquellas producidas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales; por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan a la glicosilación, por ejemplo, enzimas de mamífero que glicosilan o que desglicosilan. Se abarcan también secuencias que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Las proteínas también pueden modificarse químicamente después de la purificación con polímeros biocompatibles solubles en agua, por ejemplo, polietilenglicol, ácido polisiálico o hidroxietilalmidón.
Se incluyen también polipéptidos que se han modificado usando técnicas de biología molecular comunes de manera que se mejora su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad. Los análogos de tales polipéptidos incluyen aquellos que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos que se producen de manera natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos que se producen de manera no natural. Los péptidos de la divulgación no se limitan a productos de cualquiera de los procedimientos a modo de ejemplo específicos enumerados en el presente documento.
La divulgación en el presente documento se dirige generalmente a sistemas, células transformadas, vectores de expresión y métodos para producir al menos una proteína de mamífero recombinante que se procesa después de la traducción mediante furina (una proteína de mamífero que requiere furina recombinante ). La proteína de mamífero es uno o más de factor de von Willebrand, factor II, factor IX, factor X, proteína C, proteína S o proteína Z. En la invención, la proteína es FX.
La concentración de furina en el sobrenadante de cultivo se selecciona como diana dentro de un intervalo óptimo para la producción de proteínas completamente procesadas, maduras, manteniendo la viabilidad del cultivo después de un periodo definido de cultivo. Por tanto, una concentración útil de furina en un sobrenadante de cultivo para la producción de una proteína de mamífero completamente procesada, madura está entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 400 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 350 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 300 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 250 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 200 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 175 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 150 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 125 U/ml, o entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 100 U/ml. En una realización, la concentración de furina en el sobrenadante de cultivo no es menos de 50 U/ml.
En otra realización, la concentración útil de furina en el sobrenadante de cultivo para la producción de una proteína de mamífero completamente procesada, madura después de un periodo definido de cultivo está entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 60 U/ml, entre aproximadamente 55 U/ml y aproximadamente 65 U/ml, entre aproximadamente 60 U/ml y aproximadamente 70 U/ml, entre aproximadamente 65 U/ml y aproximadamente 75 U/ml, entre aproximadamente 70 U/ml y aproximadamente 80 U/ml, entre aproximadamente 75 U/ml y aproximadamente 85 U/ml, entre aproximadamente 80 U/ml y aproximadamente 90 U/ml, entre aproximadamente 85 U/ml y aproximadamente 95 U/ml, entre aproximadamente 90 U/ml y aproximadamente 95 U/ml, entre aproximadamente 95 U/ml y aproximadamente 105 U/ml, entre aproximadamente 100 U/ml y aproximadamente 110 U/ml, entre aproximadamente 115 U/ml y aproximadamente 125 U/ml, entre aproximadamente 120 U/ml y aproximadamente 130 U/ml, entre aproximadamente 125 U/ml y aproximadamente 135 U/ml, entre aproximadamente 130 U/ml y aproximadamente 140 U/ml, entre aproximadamente 135 U/ml y aproximadamente 145 U/ml, entre aproximadamente 140 U/ml y aproximadamente 150 U/ml, entre aproximadamente 145 U/ml y aproximadamente 155 U/ml, entre aproximadamente 150 U/ml y aproximadamente 160 U/ml, entre aproximadamente 155 U/ml y aproximadamente 165 U/ml, entre aproximadamente 160 U/ml y aproximadamente 170 U/ml, entre aproximadamente 165 U/ml y aproximadamente 175 U/ml, entre aproximadamente 170 U/ml y aproximadamente 180 U/ml, entre aproximadamente 175 U/ml y aproximadamente 185 U/ml, entre aproximadamente 180 U/ml y aproximadamente 190 U/ml, entre aproximadamente 185 U/ml y aproximadamente 195 U/ml, o entre aproximadamente 190 U/ml y aproximadamente 200 U/ml. En otra realización, la concentración de furina útil en el sobrenadante de cultivo para la producción de una proteína de mamífero completamente procesada, madura después de un periodo definido de cultivo está entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 60 U/ml, o aproximadamente 57 U/ml. En otra realización, la concentración útil de furina en el sobrenadante de cultivo para la producción de una proteína de mamífero completamente procesada, madura está entre aproximadamente 90 U/ml y aproximadamente 100 U/ml, o aproximadamente 96 U/ml.
En otras realizaciones, la concentración útil de furina en el sobrenadante de cultivo para la producción de una proteína de mamífero completamente procesada, madura después de un periodo definido de cultivo es menos de aproximadamente 400 U/ml, menos de aproximadamente 375 U/ml, menos de aproximadamente 350 U/ml, menos de aproximadamente 325 U/ml, menos de aproximadamente 300 U/ml, menos de aproximadamente 275 U/ml, menos de aproximadamente 250 U/ml, menos de aproximadamente 225 U/ml, menos de aproximadamente 200 U/ml, menos de aproximadamente 175 U/ml, menos de aproximadamente 150 U/ml, menos de aproximadamente 125 U/ml, o menos de aproximadamente 100 U/ml.
En otras realizaciones, la concentración útil de furina en el sobrenadante de cultivo para la producción de una proteína de mamífero completamente procesada, madura después de un periodo definido de cultivo es más de aproximadamente 50 U/ml, más de aproximadamente 60 U/ml, más de aproximadamente 70 U/ml, más de aproximadamente 80 U/ml, más de aproximadamente 90 U/ml, más de aproximadamente 100 U/ml, más de aproximadamente 110 U/ml, más de aproximadamente 120 U/ml, más de aproximadamente 130 U/ml, más de aproximadamente 140 U/ml, más de aproximadamente 150 U/ml, más de aproximadamente 160 U/ml, más de aproximadamente 170 U/ml, más de aproximadamente 180 U/ml, más de aproximadamente 190 U/ml, o más de aproximadamente 200 U/ml.
Para los propósitos de la presente divulgación, se generan los niveles de furina en sobrenadantes de cultivo divulgados en el presente documento dentro de un periodo de tiempo de desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 96 horas después del inicio del cultivo (después del cultivo durante de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 96 horas) y refleja los niveles de furina que se acumulan en el sobrenadante de cultivo durante ese periodo. En otras realizaciones, los niveles deseados de furina en sobrenadantes de cultivo se logran dentro de aproximadamente 18 horas a aproximadamente 90 horas, de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 84 horas, de aproximadamente 30 horas a aproximadamente 78 horas, de aproximadamente 36 a aproximadamente 72 horas, de aproximadamente 40 horas a aproximadamente 80 horas, de aproximadamente 42 horas a aproximadamente 68 horas, o de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas después del inicio del cultivo, o después del cultivo para el periodo indicado de tiempo.
Alternativamente, se expresan los niveles de furina en sobrenadantes de cultivo divulgados en el presente documento como una concentración de furina secretada por una cantidad de células por volumen de sobrenadante de cultivo por día. En un ejemplo no limitativo, la concentración de furina se expresa como U/106 células/día. En otra realización, una concentración útil de furina en el sobrenadante de cultivo para la producción de una proteína de mamífero completamente procesada, madura está entre aproximadamente 20 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 25 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 30 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 35 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 40 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 45 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 50 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 55 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 60 U/106 células/día y aproximadamente 75 U/106 células/día, entre aproximadamente 20 U/106 células/día y aproximadamente 70 U/106 células/día, entre aproximadamente 20 U/106 células/día y aproximadamente 65 U/106 células/día, entre aproximadamente 20 U/106 células/día y aproximadamente 60 U/106 células/día, entre aproximadamente 20 U/106 células/día y aproximadamente 55 U/106 células/día, entre aproximadamente 25 U/106 células/día y aproximadamente 55 U/106 células/día, entre aproximadamente 25 U/106 células/día y aproximadamente 50 U/106 células/día, entre aproximadamente 25 U/106 células/día y aproximadamente 45 U/106 células/día, o entre aproximadamente 25 U/106 células/día y aproximadamente 40 U/106 células/día.
La concentración de furina en el sobrenadante de cultivo es suficiente para procesar al menos aproximadamente el 75% de la proteína precursora de mamífero a una proteína funcional, madura. La proteína es cualquier proteína traducida como una proteína precursora y procesada en una forma madura, al menos en parte, mediante las acciones de furina. En la invención, la proteína es FX. En una realización, la concentración de furina es suficiente para procesar al menos aproximadamente el 80% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 82% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 84% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 86% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 88% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 90% de la proteína precursora de F x de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 92% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 93% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 94% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 95% de la proteína precursora de F x de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 96% de la proteína precursora de F x de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 97% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 98% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, para procesar al menos aproximadamente el 99% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura, o para procesar el 100% de la proteína precursora de FX de mamífero a una proteína de FX funcional, madura.
Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína precursora” se refiere a una proteína precursora que es inactiva y se convierte en la forma activa mediante escisión y, opcionalmente, otras modificaciones después de la traducción en la célula después de la síntesis.
Por tanto, se proporcionan en el presente documento células transformadas adaptadas para la secreción tanto de furina como de una proteína de mamífero, tal como FX. Las células transformadas pueden ser cualquier célula eucariota adecuada para la secreción de proteínas de mamífero, independientemente de si las células producen furina endógena. Las líneas celulares adecuadas para la generación de las células transformadas incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de embrión humano, células de riñón de primate (por ejemplo, células COS, HEK293), fibroblastos (por ejemplo, fibroblastos murinos) y células de mieloma de ratón (por ejemplo, NSO-GS). Las líneas celulares adecuadas son capaces de un alto nivel expresión de proteínas de mamífero y son capaces de modificaciones después de la traducción, por ejemplo, glicosilación, formación de enlaces disulfuro, fosforilación y y-carboxilación. Los métodos para seleccionar y cultivar células huésped y para inducir que las células huésped expresen un polipéptido se conocen generalmente por el experto en la técnica.
Se divulgan también en el presente documento sistemas de expresión que comprenden células adecuadas para la producción de proteínas de mamífero y al menos un vector de expresión adaptado para la expresión de al menos una proteína de mamífero. Los vectores de expresión eucariotas están disponibles generalmente para la expresión en células de mamífero. Para permitir que la furina y una proteína de mamífero, tal como FX, se expresen según los métodos divulgados en el presente documento, se introducen secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas en una célula eucariota por medio de transfección, transformación o infección con un vector de expresión, mediante lo cual se expresan los polipéptidos. La expresión de la furina y/o las proteínas de mamífero puede ser o bien transitoria o bien estable. Las secuencias de nucleótidos de furina y de mamífero están presentes como un plásmido, o como una parte de un vector de expresión viral o no viral. Los vectores virales particularmente adecuados incluyen, pero no se limitan a, baculovirus, virus vaccinia, adenovirus, citomegalovirus, virus adenoasociados, lentivirus competentes para la replicación (RCL) y virus de herpes. Los ejemplos no limitativos de vectores de expresión eucariotas virales incluyen vectores Rc/CMV, Rc/RSV, RCL y SV40. Los vectores de expresión eucariotas no virales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, virosomas, liposomas, lípidos catiónicos, plásmidos y ADN conjugado con polilisina. Los ejemplos de vectores de expresión de plásmidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, pSLX, pcDNA y otros conocidos por los expertos habituales en la técnica.
En otro aspecto, se divulga en el presente documento un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para furina, una secuencia de nucleótidos que codifica para proteínas de mamífero, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica para FX, o una combinación de las mismas. En una realización, las secuencias tanto de furina como de proteínas se expresan a partir de un vector de expresión único. En otra realización, la secuencia de furina y las secuencias de proteína se expresan a partir de diferentes vectores de expresión. En una realización, si las secuencias de nucleótidos de furina y de proteínas se expresan a partir del mismo vector de expresión, se separan opcionalmente mediante un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Los genes pueden expresarse a partir de uno o más promotores. Además, las secuencias de nucleótidos que codifican para cada proteína pueden orientarse en direcciones opuestas en el plásmido u orientarse en la misma dirección. Los vectores de expresión comprenden además elementos seleccionables y otras secuencias reguladoras para la producción eficaz de proteínas de mamífero tal como se entiende por los expertos habituales en la técnica.
Se divulgan también en el presente documento vectores de expresión que permiten la expresión de furina y otras proteínas de mamífero mediante el uso de intercambio de casetes mediado por recombinasa.
Si la furina y la proteína de mamífero se expresan a partir de diferentes vectores de expresión, entonces los vectores de expresión tendrán marcadores de selección diferentes de manera que pueden seleccionarse las células transformadas con el vector. Tales células seleccionadas podrían aislarse luego y hacerse crecer en cultivos monoclonales.
Los promotores que permiten la expresión constitutiva, regulable, específica de tejido, específica de tipo de célula, específica de ciclo de célula o específica de metabolismo en células eucariotas son adecuados, por ejemplo, para la expresión en células de mamífero. Los elementos regulables son promotores, secuencias activadoras, potenciadores, silenciadores y/o secuencias represoras. Los ejemplos de elementos regulables que permiten la expresión constitutiva en eucariotas son promotores que son reconocidos por la ARN polimerasa III o promotores virales, potenciador del citomegalovirus (VCM), promotor del VCM, promotor del SV40 o promotores de repeticiones terminales largas (RTL), por ejemplo derivadas de MMTV (virus del tumor mamario del ratón) y otro promotor viral y secuencias activadoras que se derivan de, por ejemplo, virus de hepatitis B (VHB), virus de hepatitis C (VHC), virus de herpes simple (VHS), virus del papiloma humano (VPH), virus de Epstein-Barr (VEB), promotores de choque térmico, o virus de inmunodeficiencia humano (VIH). Los ejemplos de elementos regulables que permiten la expresión inducible en eucariotas son el operador tetraciclina en combinación con un represor apropiado. La expresión de las secuencias de nucleótidos de proteínas de mamífero y de furina también puede tener lugar bajo el control de promotores específicos de tejido o específicos de proteína. Los ejemplos no limitativos de promotores específicos de proteína son promotores de genes de FX o promotores de genes de furina.
En determinadas realizaciones, las células se transforman con otra proteína además de furina y de factor X. En una realización, la proteína adicional es vitamina K epóxido reductasa (VKOR). En determinadas realizaciones, la proteína adicional se expresa a partir del mismo vector de expresión tal como uno, o ambos, de furina y de factor X, o la proteína adicional se expresa a partir de un vector de expresión diferente.
Se divulgan también en el presente documento sistemas de expresión que comprenden células huésped y uno o más vectores de expresión adaptados para expresar furina y al menos una proteína de mamífero adicional, por ejemplo, FX.
Se divulgan también en el presente documento métodos de producción de proteínas de mamífero que requieren furina recombinante completamente procesadas, tales como FX. En una realización, se produce una línea celular estable que produce furina recombinante, y posteriormente se transfecta con un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos para al menos el factor X. Las líneas celulares estables que producen furina recombinante pueden establecerse y almacenarse para la transfección con un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos para al menos una proteína de mamífero que requiere furina cuando sea necesario. Alternativamente, pueden transfectarse vectores de expresión para furina y para la proteína de mamífero que requiere furina, tal como FX, en las células huésped dentro de aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 60 minutos, de aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 12 horas, o de aproximadamente 24 horas de cada uno. En otra realización, se transfectan dos o más vectores de expresión en las células huésped sustancialmente de manera simultánea. Para los propósitos de la presente divulgación, sustancialmente de manera simultánea se refiere a cualquier periodo de tiempo que es menos de o igual a 1 hora.
Las células transformadas se seleccionan según los marcadores de selección presentes en el/los vector(es) de expresión para producir conjuntos estables de células transformadas, y luego los conjuntos se clonan opcionalmente para dar lugar a clones estables. Los clones estables producen entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 300 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 400 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 350 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 300 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 250 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 200 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 175 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 150 U/ml, entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 125 U/ml, o entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 100 U/ml de furina en el sobrenadante de cultivo después de aproximadamente de 36 a aproximadamente 78 horas, de aproximadamente 36 a aproximadamente 72 horas, de aproximadamente 40 horas a aproximadamente 78 horas, de aproximadamente 42 horas a aproximadamente 68 horas, o de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas después del inicio del cultivo, o después del cultivo para el periodo indicado de tiempo. Además, los clones estables dan lugar a más del 80% de proteínas de mamífero recombinantes completamente procesadas y activas, tales como FX, de todas las proteínas recombinantes, tales como FX, producidas por las células transformadas.
Se divulga también en el presente documento un sistema de expresión para furina recombinante y FX recombinante que secreta furina en el sobrenadante de cultivo a una concentración acumulada de entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 300 U/ml después de aproximadamente de 36 a aproximadamente 78 horas de cultivo.
Se divulga también en el presente documento un método para producir FX completamente procesado, maduro que comprende el uso de un sistema de expresión que secreta furina en el sobrenadante de cultivo a una concentración acumulada de entre aproximadamente 50 U/ml y aproximadamente 300 U/ml después de aproximadamente de 36 a aproximadamente 78 horas de cultivo.
Se abarcan también en el presente documento proteínas de mamífero recombinantes producidas por los métodos reivindicados y cualquier FX recombinante de mamífero completamente procesado.
Ejemplos
Ejemplo 1. Producción de factor X recombinante completamente procesado y completamente activo mediante niveles de furina definidos
Para la expresión de FX, se usó el plásmido pSLX de expresión de mamífero que contiene o bien FX optimizado para codón humano o bien ambos, Fx optimizado para codón humano y vitamina K epóxido reductasa optimizada para codón humano (FX/VKOR), separados por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Se usaron los constructos para sistemas de expresión de ovario de hámster chino (CHO-S) y CHO-DG44, incluidas la selección de geneticina y la selección de dihidrofolato reductasa (dhfr), respectivamente. Para la expresión de furina, se usó el plásmido de expresión de mamífero pcDNA3.1 que contiene furina de longitud completa humana en combinación con higromicina como marcador de selección (figura 1A).
Inicialmente, se transfectaron líneas celulares derivadas de CHO (CHO-S y CHO-DG44) con los constructos de FX o FX/VKOR para generar conjuntos estables, y posteriormente se sometieron los conjuntos a subclonación para generar clones estables. En una segunda ronda de transfección y subclonación, se supertransfectó un número seleccionado de clones que expresan FX o FX/VKOR cada uno con furina, dando como resultado conjuntos estables y clones estables que expresan FX/furina o FX/VKOR/furina.
Se hicieron crecer las líneas celulares de CHO-S y CHO-DG44 que producen FX recombinante estable en medios libres de componente animal, en matraces de agitación durante aproximadamente de 42 a aproximadamente 72 horas y con números de células iniciales de 0,3x106 ó 0,5x106 células/ml. Se mantuvieron las células CHO-S en medios PowerCHO®-CD (Lonza BioWhittaker) complementados con glutamina 4 mM, 500 |ig/ml de geneticina, 500 |ig/ml de higromicina y 5 |ig/ml de vitamina K1. Se mantuvieron las células CHO-DG44 en medios OptiCHO™-CD (Life Technologies) complementados con glutamina 6 mM, metotrexato (MTX) 500 nM y 5 |ig/ml de vitamina K1. Se analizó el sobrenadante del cultivo celular sembrado mediante inmunotransferencia de tipo Western en condiciones reductoras para determinar la calidad del FX recombinante humano usando un anti-FX policlonal humano de cabra o anti-FX policlonal humano de oveja (Affinity Biologicals). El análisis densitométrico de las inmunotransferencias de tipo Western permitió la cuantificación de las diferentes especies de FX procesado de manera correcta, denominadas FX de cadena pesada (HC) y FX de cadena ligera (LC), y especies de FX escindidas de manera inadecuada, denominadas FX de cadena única (SC) y FX de cadena ligera que contiene propéptido (PP-LC).
Para la cuantificación de FX, se analizó el sobrenadante de cultivo celular con ELISA para determinar la concentración de FX y con el ensayo cromogénico de FXa usando el veneno de la víbora de Russell (RVV) como activador para determinar la concentración de FX activo. Se calibraron estos ensayos usando FX derivado de plasma (Hifen Biomed). La actividad específica se da en %, dividiendo la concentración de FX activo entre la concentración de FX total multiplicado por 100. Para la cuantificación de furina, se determinó la furina activa en un ensayo fluorogénico de furina calibrado contra un material de referencia de furina (New England Biolabs).
Para el análisis estadístico, se modeló el FX completamente procesado/FX total (%) como una función de la concentración de furina usando el modelo Emáx sobre los conjuntos de transfección de CHO-DG44 (A), los conjuntos de transfección de CHO-S (B), y los clones derivados de células únicas de CHO-S (C). Se usó este modelo para la evaluación estadística de estudios dosis-respuesta. El modelo Emáx usa cuatro parámetros (E0 , Emáx, DE50 y n) para modelar FX como una función de furina tal como sigue:
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donde y se refiere a FX completamente procesado/FX total y x se refiere a la concentración de furina. El parámetro E0 se refiere al efecto basal que corresponde a la respuesta cuando la concentración de furina es cero, Emáx al máximo efecto atribuible a la concentración de furina, DE50 a la concentración de furina que produce la mitad de Emáx, y el parámetro n representa la pendiente (factor de Hill) que determina la pendiente de la curva.
Considerando que FX completamente procesado/FX total alcanza el 100% si la furina alcanza una gran concentración infinita, se modificó el modelo Emáx a una función con tres parámetros que va a estimarse tal como sigue;
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Este modelo se ajustó a los datos teniendo en cuenta la variabilidad entre las tres líneas celulares diferentes usando un modelo de efectos mezclados no lineal permitiendo a los parámetros E0 y n variar entre las diferentes líneas celulares modelando también estos dos parámetros como efectos aleatorios.
Se realizó el diagnóstico del modelo para validar el modelo aplicado. Se realizó una comparación del modelo Emáx ajustado con el modelo nulo usando la prueba de la razón de probabilidad para determinar evidencia estadística para el modelo Emáx que estima el porcentaje de FX completamente procesado del FX total dependiendo de la concentración de furina.
Resultados
Se usó el sistema de expresión heterólogo basado en CHO para FX humano, que comprende conjuntos de transfección de CHO-DG44 (A), conjuntos de transfección de CHO-S (B) y clones derivados de células únicas de CHO-S (C), como base para estudiar el efecto de la expresión de furina sobre el procesamiento de FX humano siguiendo diferentes estrategias de transfección. Los conjuntos de transfección, así como los clones, expresaron de manera adicional VKOR, que no tuvo impacto sobre el estudio.
Después de un periodo de incubación de dos a tres días de cultivo, se sometió el sobrenadante del cultivo celular a una serie de análisis, incluyendo análisis por inmunotransferencia de tipo Western en condiciones reductoras, ensayo de la actividad de furina, ELISA y ensayo RVV (tabla 1). En promedio, los conjuntos y clones de CHO que producen FX revelaron una actividad específica para FX de más del 50%, alcanzando de manera parcial el 100% (tabla 1). Los análisis por inmunotransferencia de tipo Western mostraron que el FX recombinante se procesaba de manera inadecuada a diferentes grados, tal como se muestra mediante dos formas de FX procesadas de manera incompleta (es decir, la cadena ligera de FX que contiene propéptido y la cadena única de FX), además de la cadena ligera de FX libre de propéptido completamente procesada y la cadena pesada de FX (figura 4). Por medio del análisis densitométrico de estas cuatro especies de FX, el porcentaje de FX completamente procesado, es decir, la cadena ligera de FX más la cadena pesada de FX en relación al FX total, osciló entre el 30% y casi el 100% en sobrenadantes de cultivo celular (tabla 1, figura 4). Además, no se observó preactivación, que sería visible ya que la banda de cadena pesada se acortó por el tamaño del péptido de activación que falta. Se evaluó también si la concentración de furina secretada tenía influencia sobre el grado de FX procesado representando estos dos parámetros (figura 5). Tal como se muestra en la figura 5, solo el procesado parcial de FX es factible con concentraciones bajas de furina secretada (<20 U/ml), mientras que niveles altos de furina secretada se correlacionan con un mejor procesado de FX.
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Para entender la influencia de la furina sobre el procesamiento de FX y proporcionar un soporte estadístico de los datos, se modeló el FX completamente procesado del FX total (%) como una función de la concentración de furina usando el modelo Emáx sobre las líneas celulares A, B y C (figura 6). Se proporcionan en las figuras 7A-D cuatro gráficos de diagnóstico del modelo, que indican un buen ajuste del modelo a los datos. Una comparación del modelo Emáx ajustado con el modelo nulo usando la prueba de la razón de probabilidad dio como resultado un valor de p <0,0001, proporcionando evidencia estadística para un porcentaje mayor de FX completamente procesado del FX total dependiendo de una concentración mayor de furina (figura 8), probándose de nuevo la validez de los datos. Basándose en los análisis estadísticos, las concentraciones de furina estimadas que van a producirse por la línea celular de producción, tal como se detecta en el medio de cultivo celular junto con FX dando como resultado un FX completamente procesado del FX total igual o mayor que el 90% e igual o mayor que el 95%, fueron de al menos 57 U/ml y de al menos 96 U/ml, respectivamente (figura 9).
En resumen, los datos proporcionan un nivel mínimo definido de furina secretada (al menos de 57 U/ml y al menos de 96 U/ml) en el sobrenadante de cultivo celular que se requiere para el procesamiento de FX suficiente (igual o mayor al 90% e igual o mayor al 95%).
En procesos biotecnológicos que expresan altos niveles de proteína recombinante, podría usarse la sobreexpresión de furina para obtener zimógenos completamente procesados. Con la presente invención, se proporciona por primera vez un mínimo definido de furina secretada garantizando para un procesamiento alto de FX (>57 U/ml para lograr al menos el 90% de FX completamente procesado y >96 U/ml de furina para al menos el 95% de FX completamente procesado). Este hallazgo es particularmente beneficioso para procesos de fermentación que expresan FX, FXa y variantes recombinantes de especies de animal y humano , donde el nivel de furina podría usarse como un indicador para el procesamiento adecuado de la proteína precursora de FX, y como diana para la línea celular y el desarrollo del procedimiento.
A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de componentes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, y etc., usados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones deben entenderse como para modificarse en todas las instancias por el término “aproximadamente”. Tal como se usa en el presente documento, los términos “aproximadamente” y “de manera aproximada” significan dentro del 10 al 15%, preferiblemente dentro del 5 al 10%. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas buscadas que van a obtenerse mediante la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la solicitud de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos informado y aplicando técnicas de redondeo habituales. A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se informan de una manera tan precisa como sea posible. Cualquier valor numérico, sin embargo, contiene de manera inherente determinados errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
Los términos “un”, “uno/una”, “el/los” y referentes similares usados en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se interpretan para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento se pretende que simplemente sirva como un método abreviado de referirse de manera individual a cada valor por separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o de otro modo claramente se contradiga por el contexto. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o expresión a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en el presente documento se pretende que simplemente ilumine mejor la invención y no plantee una limitación en el alcance de la invención que reivindique lo contrario. No debe interpretarse ninguna expresión en la memoria descriptiva como que indica cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.
Las agrupaciones de elementos o realizaciones alternativos de la invención divulgada en el presente documento no deben interpretarse como limitaciones. Cada miembro del grupo podría referirse a y reivindicarse de manera individual o en cualquier combinación con otros miembros del grupo u otros elementos encontrados en el presente documento. Se anticipa que uno o más miembros de un grupo podrían incluirse en, o eliminarse de, un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produzca cualquier tal inclusión o deleción, la memoria descriptiva se considera que contiene el grupo como modificado, cumpliendo así la descripción escrita de todos los grupos Markush usados en las reivindicaciones adjuntas.
Se describen determinadas realizaciones de esta invención en el presente documento, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Por supuesto, se harán evidentes variaciones en estas realizaciones descritas para los expertos habituales en la técnica al leer la descripción anterior. El inventor cuenta

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Célula transformada que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una furina humana, tal que la célula transformada expresa y secreta furina funcional en un sobrenadante de cultivo; en la que la furina se secreta a una concentración de 50 U/ml a 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante de 36 a 78 horas, y
una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un factor X.
2. Célula transformada según la reivindicación 1, en la que la primera secuencia de nucleótidos que codifica para la furina humana y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica para el factor X están en diferentes vectores de expresión o en el mismo vector de expresión.
3. Célula transformada según la reivindicación 2, en la que el vector de expresión es un vector viral o un vector no viral.
4. Célula transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la furina funcional se secreta a una concentración de al menos de 50 a 60 U/ml en el sobrenadante de cultivo, preferiblemente en la que la furina funcional se secreta a una concentración de al menos de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 U/ml en el sobrenadante de cultivo.
5. Célula transformada según la reivindicación 4, en la que al menos el 90% del factor X producido por la célula transformada está completamente procesado, preferiblemente en la que al menos el 95% del factor X producido por la célula transformada está completamente procesado.
6. Célula transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la célula se genera a partir de una línea celular seleccionada del grupo que consiste en células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de embrión humano, células de riñón de primate, fibroblastos y células de mieloma de ratón.
7. Célula transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que además comprende un ácido nucleico que codifica para una vitamina K epóxido reductasa (VKOR) humana.
8. Método de preparar una proteína recombinante que comprende:
transfectar una línea celular adecuada para la expresión de proteínas de mamífero con un primer vector de expresión adaptado para la expresión de furina humana por la línea celular, y un segundo vector de expresión adaptado para la expresión de una proteína por la línea celular, y en el que el segundo vector de expresión incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un factor X;
en el que la línea celular transfectada con el primer y el segundo vector de expresión expresa y secreta una furina humana funcional a una concentración de 50 U/ml a 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante de 36 a 78 horas, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante de 42 a 72 horas.
9. Método según la reivindicación 8, en el que la línea celular se transfecta con el primer vector de expresión y el segundo vector de expresión sustancialmente de manera simultánea.
10. Método según la reivindicación 8, en el que la línea celular se transfecta con el primer vector de expresión y se obtienen células que secretan niveles estables de furina antes de transfectar la línea celular con el segundo vector de expresión, o en el que la línea celular se transfecta con el segundo vector de expresión y se obtienen células que secretan niveles estables de la proteína antes de transfectar la línea celular con el primer vector de expresión.
11. Método de producir factor X completamente procesado y maduro, que comprende cultivar la célula transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para producir el factor X completamente procesado y maduro a partir del sobrenadante de cultivo.
12. Método de producir la célula transformada según la reivindicación 1, comprendiendo el método transfectar una línea celular adecuada para la expresión de proteína de mamífero con un vector de expresión que incluye una primera secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de furina humana y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un factor X, y seleccionar una célula transformada que expresa y secreta una furina humana funcional a una concentración de 50 a 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante de 36 a 78 horas, preferiblemente a una concentración de Ċ
aproximadamente 300 U/ml en el sobrenadante de cultivo después del cultivo durante de 42 a 72 horas.
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