ES2743825T3 - Proteínas beta-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con estabilidad aumentada y actividad catalítica retenida aumentada - Google Patents
Proteínas beta-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con estabilidad aumentada y actividad catalítica retenida aumentada Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína ß-glucocerebrosidasa recombinante, variante, que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos: , SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 16, o un fragmento funcional de las mismas.
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas beta-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con estabilidad aumentada y actividad catalítica retenida aumentada
Campo técnico
El campo de esta invención incluye proteínas que son útiles en terapia de remplazo enzimático para diversas enfermedades de almacenamiento lisosómico. Estas enfermedades de almacenamiento lisosómico incluyen enfermedad de Gaucher.
Antecedentes
La p-glucocerebrosidasa es una enzima lisosómica soluble que funciona en la superficie de la membrana luminal a través de interacciones con Saposina C y fosfolípidos aniónicos para hidrolizar el glucolípido glucosilceramida. La pglucocerebrosidasa es particularmente importante en macrófagos tisulares para descomponer y reciclar las membranas de células dañadas y patógenos absorbidos. Como la glucosilceramida es la molécula precursora principal para más de 300 glucolípidos y gangliósidos que están implicados en numerosas rutas celulares importantes y cascadas de señalización, es esencial mantener el intricado equilibrio para estas diversas moléculas lipídicas.
La enfermedad de Gaucher está causada por una deficiencia en p-glucocerebrosidasa que provoca la acumulación de glucosilceramida. La enfermedad de Gaucher se manifiesta en si misma a través de diversos síntomas clínicos incluyendo anemia, trombocitopenia, hepatoesplenomegalia y anormalidades esqueléticas. La enfermedad de Gaucher se clasifica en tres categorías basadas en la implicación neurológica: tipo 1 (no neuronopática); tipo 2 (neuronopática aguda); y tipo 3 (neuronopática crónica). No existe cura conocida para la enfermedad de Gaucher, pero la terapia de remplazo enzimático (ERT), que suplementas la p-glucocerebrosidasa deficiente y la terapia de reducción de sustrato que inhibe la síntesis de glucosilceramida son tratamientos aprobados para esta enfermedad. Otros enfoques terapéuticos tales como chaperonas farmacológicas de moléculas pequeña y moduladores del plegamiento proteico también se están evaluando como tratamientos potenciales de esta enfermedad. De estos enfoques de tratamiento, ERT es el tratamiento clínico más establecido y eficaz para los síntomas viscerales de la enfermedad de Gaucher. La imiglucerasa (p-glucocerebrosidasa recombinante; Cerezyme™, Genzyme Corp.™) se desarrolló y aprobó por la FDA en 1994 para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher y es actualmente la norma asistencial para esta enfermedad.
Aunque ERT con Cerezyme™ está ampliamente considerado como el tratamiento más eficaz, esta enzima lisosómica no es estable a pH neutro y 37°C. De hecho, la inmensa mayoría del fármaco se inactiva irreversiblemente en la sangre poco después de infusión intravenosa. Solamente la pequeña fracción que retiene actividad catalítica y se internaliza en los macrófagos diana confiere el efecto terapéutico completo. Por tanto, sería ventajoso desarrollar una enzima p-glucocerebrosidasa más estable que no sea tan susceptible a inactivación desde la etapa de producción proteica a través de las condiciones fisiológicas que se encontrarían tras su introducción en un sujeto humano que lo necesite. Las proteínas p-glucocerebrosidasa son conocidas y, por ejemplo, la base de datos UniProt contiene la secuencia de la proteína p-glucocerebrosidasa bovina (n.° de acceso Q2KHZ8); la proteína p-glucocerebrosidasa porcina se describe por Statil et al., Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, 138 (2004) 377-383 y comparada con la secuencia de la proteína humana y O'Neill et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 86 (2009) 5049-5053 compara los genes murino y humano de p-glucocerebrosidasa y las secuencias deducidas de aminoácidos. Liou et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 4242-4253 se refiere a análisis de p-glucocerebrosidasas variantes que causan la enfermedad de Gaucher. El documento WO01/49830 y el documento US 2002/0127219 se refieren a enzimas lisosómicas modificadas, incluyendo p-glucocerebrosidasa. Las enzimas modificadas están pretendidas para proporcionar mejora de las enfermedades de almacenamiento lisosómico e incluyen al menos un sitio de glucosilación introducido. Para introducir un sitio de N-glucosilación en un polipéptido GCB precursor, el polipéptido puede contener una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución a un resto de asparagina. La sustitución puede conducir a un aumento en la actividad GCB en comparación con el tipo silvestre.
Sumario
Se proporcionan en este documento proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes caracterizadas por tener estabilidad aumentada respecto a p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. También se proporcionan en este documento proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes caracterizadas por retener más actividad catalítica respecto a p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Se describen además en este documento proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes que pueden tener variaciones de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 316, 317, 321 y 145.
Se describen en este documento métodos de preparación de las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes caracterizadas por retener más actividad catalítica respecto a p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Se describen adicionalmente en este documento composiciones que comprenden las proteínas pglucocerebrosidasa recombinantes, variantes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se describen en este documento composiciones que comprenden las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes y un tampón farmacéuticamente aceptable.
Se describen en este documento proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes que tienen uno o más remplazos de los aminoácidos en la región del bucle1 de la proteína, el uno o más remplazos de aminoácidos caracterizados por tener una conformación de cadena lateral que aumenta el orden cerca del sitio activo de la proteína. Se describen adicionalmente en este documento proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes que tienen uno o más remplazos del aminoácido en una hélice a cerca del sitio activo (a6) de la proteína, el uno o más remplazos de la cadena lateral del aminoácido caracterizado por tener una conformación de cadena lateral que estabiliza esta hélice y extrae el bucle1 adyacente desde el sitio catalítico y tiene una conformación abierta y activa. También se proporcionan en este documento proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes que tienen uno o más remplazos de aminoácido en la región de enrollamiento aleatorio entre la lámina beta (p2) y una hélice a (a2), el uno o más remplazos de las cadenas laterales del aminoácido caracterizado por tener una conformación de cadena lateral que facilita mejores interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para estabilidad mejorada.
Se describen en este documento métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal, administrando al sujeto que lo necesite una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante, caracterizada por tener una estabilidad incrementada en comparación con p-glucocerebrosidasa recombinante de tipo salvaje. También se describen en este documento métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal , administrando a un sujeto que lo necesite una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante, caracterizada porque retiene una estabilidad catalítica incrementada en comparación con p-glucocerebrosidasa recombinante de tipo salvaje. También se describen en este documento métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal , administrando a un sujeto que lo necesite una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante, caracterizada por tener una actividad específica incrementada en comparación con p-glucocerebrosidasa recombinante de tipo salvaje. También se describen en este documento métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal , administrando a un sujeto que lo necesite una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante,que tiene una variación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 316, 317, 321 y 145. También se describen en este documento métodos para tratar la enfermedad de Gaucher, administrando a un sujeto que lo necesite una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante.
También se proporcionan en este documento compuestos que comprenden una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
También se proporcionan en este documento proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes caracterizadas como capaces de una expresión aumentada respecto a p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre.
También se describen en este documento métodos de preparación de un compuesto que comprende una proteína pglucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. También se describen en este documento métodos de preparación de un ácido nucleico que codifica una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
Breve descripción de los dibujos
Los aspectos anteriores y otros aspectos de la presente invención son evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención cuando se considera junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos las realizaciones que son actualmente preferidas, entendiéndose, sin embargo, que la invención no está limitada a los instrumentos especificados descritos. Los dibujos no están necesariamente dibujados a escala. En los dibujos:
La Figura 1 (A) muestra mediciones de actividad enzimática para comparar la expresión relativa de proteínas pglucocerebrosidasa recombinantes, variantes con la enzima de tipo silvestre secretada en medio de cultivo celular a partir de un experimento típico de transfección transitoria después de 48 h; (B) muestra un análisis de transferencia de Western para comparar las cantidades relativas de proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes, secretadas y la proteína GlcCerasa de tipo silvestre en medio de cultivo celular después de transfección transitoria. La Figura 2 muestra la estabilidad de proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con la modificación
H145L, la modificación H145F, las modificaciones F316A/L317F, la modificación K321N, la modificación K321A, las modificaciones F316A/L317F/K321N y las modificaciones H145L/K321N en comparación con la proteína pglucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre a pH 7,5 y 37°C; y
La Figura 3 muestra la estabilidad de la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las modificaciones F316A/L317F en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre a pH 8 y 37°C.
Descripción detallada de realizaciones ilustrativas
La presente materia puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación a las figuras adjuntas y ejemplos, que forman una parte de la descripción.
Además, como se usa en la memoria descriptiva incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "uno", "una" y "el", "la" incluyen el plural, y referencias a un valor numérico particular incluyen al menos ese valor particular, salvo que el contexto estipule claramente otra cosa. El término "pluralidad", como se usa en este documento, significa más de uno. Cuando se expresa un intervalo de valores, otra realización incluye desde el valor particular y/o hasta el otro valor particular. Asimismo, cuando se expresan valores como aproximaciones, mediante el uso del precedente "aproximadamente", se entiende que el valor particular forma otra realización. Todos los intervalos son inclusivos y combinables.
Se proporcionan ejemplos para ayudar a comprender adicionalmente las invenciones. Los materiales particulares usados, protocolos y condiciones pretenden ser adicionalmente ilustrativos de las invenciones y no deben interpretarse como limitantes del alcance razonable de las mismas.
Salvo que se indique de forma diferente, las propiedades de la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante se establecen respecto a las propiedades de la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1). En este documento, "GlcCerasa" es una abreviatura usada para p-glucocerebrosidasa. Todos los números de aminoácido son respecto a la SEQ ID NO: 1. Por tanto, la posición 145 sería el 145° aminoácido que existe en la SEQ ID NO: 1. Además, las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes descritas en este documento también incluyen fragmentos funcionales o derivados de las mismas.
En este documento, se entiende que "pH aproximadamente neutro" incluye los pH que se consideran normalmente pH fisiológicos (es decir, un pH de aproximadamente 7,5 a 37°C).
Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes adecuadas pueden caracterizarse por tener expresión proteica y secreción en medio de cultivo celular similar o aumentada respecto a proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, de tipo silvestre durante cultivo celular y producción proteica. Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes adecuadas pueden caracterizarse por tener estabilidad aumentada respecto a proteínas pglucocerebrosidasa recombinantes, de tipo silvestre. Estas proteínas tienen estabilidad aumentada a condiciones fisiológicas y esas condiciones fisiológicas pueden ser in vivo. Además, estas proteínas también pueden caracterizarse por tener estabilidad aumentada en condiciones de aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C. Esta estabilidad aumentada puede controlarse en condiciones de aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C durante un periodo de aproximadamente tres horas. La estabilidad aumentada se retiene en medio de cultivo celular y puede retenerse dentro de las células. Estas proteínas también pueden tener estabilidad aumentada dentro del lisosoma y dentro del lisosoma las condiciones pueden ser de aproximadamente pH 5 y aproximadamente 37°C. Estas proteínas también pueden tener estabilidad aumentada que se caracteriza por degradación proteolítica reducida y la degradación proteolítica reducida puede suceder en las células. Además, la degradación proteolítica reducida puede ser en el lisosoma en las células. Estas proteínas también pueden tener estabilidad aumentada a condiciones no fisiológicas tales como en soluciones tamponantes durante la purificación de proteínas. Estas soluciones tamponantes pueden tener un pH mayor de aproximadamente 7 o un pH menor de aproximadamente 3 durante la purificación de proteínas. Estas soluciones tamponantes también pueden contener disolventes orgánicos o sales caotrópicas. Estas proteínas también pueden tener estabilidad aumentada en soluciones tamponantes a temperaturas que varían de aproximadamente 2°C a aproximadamente 37°C. Además, estas proteínas también pueden tener estabilidad aumentada en soluciones tamponantes a temperaturas que varían de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. Además, estas proteínas pueden tener estabilidad aumentada en soluciones tamponantes a una temperatura de aproximadamente 20°C. Estas proteínas también pueden tener estabilidad aumentada después de ciclos de congelación-descongelación o reconstitución después de liofilización. Estas proteínas también pueden tener estabilidad aumentada en un tampón de formulación de fármacos tal como solución salina.
Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes adecuadas pueden caracterizarse por retener más actividad catalítica respecto a p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas tienen más actividad catalítica retenida en condiciones fisiológicas y la mayor actividad catalítica retenida puede ser in vivo. Además, estas proteínas también pueden caracterizarse por tener más actividad catalítica retenida en condiciones de aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C. Esta mayor actividad catalítica retenida puede controlarse
a condiciones de aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C durante un periodo de aproximadamente dos horas. Estas proteínas tienen más actividad catalítica retenida en medio de cultivo celular y la mayor actividad catalítica retenida puede ser dentro de las células. Además, estas proteínas pueden tener más actividad catalítica retenida dentro del lisosoma y dentro del lisosoma las condiciones pueden ser de aproximadamente pH 5 y aproximadamente 37°C. Estas proteínas también pueden tener más actividad catalítica retenida que se caracteriza por degradación proteolítica reducida y la degradación proteolítica reducida puede existir en las células. Además, la degradación proteolítica reducida puede ser en el lisosoma en las células. Estas proteínas también pueden tener más actividad catalítica retenida en condiciones no fisiológicas tales como en soluciones tamponantes durante la purificación proteica. Estas soluciones tamponantes pueden tener un pH mayor de aproximadamente 7 o un pH menor de aproximadamente 3 durante la purificación proteica. Estas soluciones tamponantes también pueden contener disolventes orgánicos o sales caotrópicas. Estas proteínas también pueden tener más actividad catalítica retenida a temperaturas que varían de aproximadamente 2°C a aproximadamente 37°C. Además, estas proteínas pueden tener también más actividad catalítica retenida a temperaturas que varían de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. Además, estas proteínas pueden tener más actividad catalítica retenida a una temperatura de aproximadamente 20°C. Estas proteínas también pueden tener más actividad catalítica retenida después de ciclos de congelación-descongelación o reconstitución después de liofilización. Estas proteínas también pueden tener más actividad catalítica retenida en un tampón de formulación de fármacos tal como solución salina.
Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes pueden tener también una variación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 316, 317, 321 y 145. Esta proteínas pueden tener la variación o variaciones de aminoácidos: (1) f316A y L317F; o (2) K321N; o (3) H145L; o (4) H145F; o (5) F316A, L317F, y K321N; o (6) K321A; o (7) K321V; (8) F316A, L317F, y K321A; o (9) F316A, L317F, y K321V; o (10) H145L, F316A, y L317F; o (11) H145L y K321N; o (12) H145L y K321A; o (13) H145l y K321V. Algunas de estas proteínas también pueden caracterizarse por tener expresión proteica y secreción en medio de cultivo celular similar o aumentada respecto a proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, de tipo silvestre durante cultivo celular y producción proteica. Estas proteínas también pueden caracterizarse por tener estabilidad aumentada respecto a pglucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden caracterizarse por tener estabilidad aumentada a condiciones fisiológicas y estas condiciones son de aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C. Estas proteínas también pueden caracterizarse por retener más actividad catalítica respecto a p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La actividad catalítica puede medirse después de incubación a condiciones de aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C durante un periodo de aproximadamente dos horas. Estas proteínas también pueden caracterizarse por retener más actividad catalítica a condiciones fisiológicas. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos F316A y L317F tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 2 veces más larga que pglucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido K321N tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 3 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido K321A tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 3 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína pglucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido K321V tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 1,4 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido H145L tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 3 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido H145F tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 2 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos F316A, L317F, y K321N tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 3 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína pglucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos H145L, F316A, y L317F tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 2 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos H145L y K321N tiene una semivida aparente prolongada de al menos aproximadamente 3 veces más larga que p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Esta semivida aparente prolongada puede medirse después de incubación a condiciones de aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C durante un periodo de aproximadamente dos horas.
Ejemplo 1
Reactivos
Se adquirió sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p-D-glucósido (4MUG) de Research Products International (Mt. Prospect, IL). Los kits de extracción de gel de AdN y Miniprep DNA® fueron de QIAGEN® (Valencia, CA). El kit PureYield Maxiprep DNA™ fue de Promega™ (Madison, WI). Salvo que se establezca de otro modo, los agentes químicos fueron de Sigma™ (St. Louis, MO). El reactivo de transfección Fugene-HD™ fue de Roche™ (Indianapolis, IN). El vector de expresión en mamíferos pEF6/V5-HisA™, el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal (FBS) y otros reactivos de cultivo tisular fueron de Invitrogen™ (Carlsbad, CA). El ADNc de pglucocerebrosidasa de tipo silvestre humana (NM_000157.3) se adquirió de Origene™ (Rockville, MD). Las endonucleasas de restricción, la ADN polimerasa Phusion-HF™, la ADN ligasa T4, la fosfatasa Antarctic, las células de E. coli químicamente competentes (células DH5a) y las endoglucosidasas PNGasaF y EndoH se adquirieron todas de New England Biolabs™ (Ipswich, MA). Las células renales embrionarias humanas (transformadas con el antígeno T; HEK293T) fueron de ATCC™.
Ensayos
Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes y la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre se ensayaron todas por expresión transitoria en una línea celular humana (HEK293T) para evaluar la expresión proteica. El sistema indicador para ensayar la actividad catalítica de las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes o la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre fue la capacidad de hidrolizar el sustrato fluorogénico 4-MU-p-glucosa a aproximadamente pH 5,2 y aproximadamente 37°C. La estabilidad de estas proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes y la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada se ensayó controlando la retención de la actividad catalítica de cada proteína después de incubación a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C durante un periodo de aproximadamente 3 horas. Las condiciones en estos experimentos se diseñaron para parecerse al entorno que existiría durante la infusión intravenosa de la terapia de remplazo enzimático con proteína p-glucocerebrosidasa en un paciente.
Más específicamente, pero de ningún a interpretarse como limitante, se sembraron células HEK293T en placas de cultivo tisular de 12 pocillos con 1 ml de medio DMEM suplementado con FBS al 10% y se incubaron a 37°C con una atmósfera de CO2 al 5%. Cuando las células HEK293T alcanzaron el 80-90% de confluencia, el medio consumido se remplazó con 1 ml de medio DMEM/FBS al 10% fresco y cada pocillo se transfectó con 1 gg de ADN plasmídico para proteínas p-glucocerebrosidasa individuales o PBS (para un control negativo transfectado de forma simulada) y 3 gl de reactivo de transfección Fugene-HD de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas se incubaron durante 24-72 horas y se comprobaron diariamente para la expresión de proteína p-glucocerebrosidasa recombinante (secretada en el medio) mediante ensayos de actividad enzimática.
Se evaluó la expresión proteica de p-glucocerebrosidasa (y la secreción en el medio de cultivo celular) por ensayos de actividad enzimática usando medio condicionado de experimentos de transfección transitoria después de 24, 48 o 72 h y el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p-D-glucósido (4-MUG). En resumen, se recogieron 20 gl de medio condicionado de cada muestra en los puntos temporales indicados y se diluyeron con 80 gl de tampón Mcllvane (tampón MI: citrato sódico 50 mM/fosfato sódico (pH 5,2)/Triton X-100 al 0,25% (v/v)/taurocolato sódico al 0,25% (p/v)) en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml. Se hicieron alícuotas de veinticinco gl de cada muestra diluida en pocillos individuales de placas de fondo transparente negro de 96 pocillos (realizado por triplicado) y se añadieron 50 gl de sustrato 4-MUG 6 mM (preparado en tampón MI) a cada pocillo mediante un pipeteador multicanal. Las placas después se precintaron con cinta de cobertura y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las reacciones enzimáticas se detuvieron añadiendo 125 gl de NaOH 0,1 M y la fluorescencia 4-MU liberada se leyó en un lector de placa de fluorescencia usando longitudes de onda de excitación de 355 nm y de emisión de 460 nm, respectivamente. La fluorescencia 4-MU de la muestra transfectada de forma simulada sirvió como control de "fondo" y se sustrajo de todas las muestras de proteína p-glucocerebrosidasa.
Para estimar la cantidad de proteínas p-glucocerebrosidasa ácida de tipo silvestre y variantes presentes en el medio de cultivo celular, los medios de cultivo celular condicionado de experimentos de transfección transitoria se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa usando técnicas convencionales. La membrana después se incubó con tampón de bloqueo: leche desnatada al 4% (p/v) en solución salina tamponada con TRIS 50 mM (pH 7,5)/Tween-20 al 0,1% (v/v) (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. La membrana se incubó posteriormente con anticuerpos policlonales primarios de conejo anti-p-glucocerebrosidasa humana (creados contra un péptido de 19 aminoácidos correspondiente al extremo C-terminal de p-glucocerebrosidasa ácida humana; Sigma G-4171) diluidos 1:2500 en tampón de bloqueo durante 1 h a temp. ambiente o durante una noche a 4°C con agitación. La transferencia después se lavó con TBST a temp. ambiente con agitación y al menos tres cambios de tampón durante 1 h. La transferencia después se incubó con un anticuerpo secundario ligado a enzima (por ejemplo, anticuerpos de carba conjugados con peroxidasa de rábano rusticano anti-conejo) diluidos 1 :10.000 en tampón de bloqueo durante 1 h a temp. ambiente con agitación. La transferencia se lavó con TBST a temp. ambiente con agitación y al menos tres cambios de tampón durante 1 h. La transferencia después se incubó con sustrato de quimioluminiscencia (por ejemplo, Pierce's Supersignal West-Dura Extended Duration Substrate™) durante 5 min a temp. ambiente y se visualizó por un sistema de imágenes o por película para evaluar el nivel de expresión proteica para enzimas pglucocerebrosidasa ácida de tipo silvestre y variantes.
Para evaluar la estabilidad de la proteína p-glucocerebrosidasa, las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes expresadas de forma transitoria y la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada (es decir Cerezyme™) se incubaron en tampón de pH neutro a 37°C y se ensayaron para la actividad enzimática para determinar el grado de pérdida de actividad catalítica durante un periodo de aproximadamente tres horas. En resumen, se recogieron 60 gl de medio condicionado (que contenía proteínas p-glucocerebrosidasa
recombinantes, variantes individuales) después de 24 o 48 h después de la transfección y se añadieron a 420 pl de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5)/Triton X-100 al 0,2% (v/v)/BSA al 0,2% (p/v) en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml. Asimismo, la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada se diluyó en serie hasta 1:12.500 en medio DMEM/FBS al 10% y se añadieron 60 pl de esta muestra proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre diluida a 420 pl de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5)/Triton X-100 al 0,2% (v/v)/BSA al 0,2% (p/v) para obtener una dilución final de 1:100.000. (Esta cantidad de proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre se determinó empíricamente para que contuviera cantidades similares de actividad enzimática a las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes expresadas de forma transitoria). Todas las muestras se incubaron en un baño de agua de 37°C y se retiraron 70 pl de cada muestra en puntos temporales especificados (0, 30, 60, 90, 120 o 180 min) y se añadieron a tubos nuevos de microcentrífuga de 0,5 ml que contenían 20 pl de NaOAc 0,5 M (pH 5,2). Las muestras se mezclaron minuciosamente y se usaron 25 pl de cada muestra diluida para medir la actividad enzimática residual de la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante (por triplicado) como se ha descrito anteriormente. La actividad enzimática inicial (a t = 0 min) se designó como el 100% para cada proteína p-glucocerebrosidasa recombinante mientras que las actividades enzimáticas para todos los puntos temporales posteriores se normalizaron a la actividad inicial para determinar la actividad enzimática residual sobre el curso completo de tiempo. Se usaron los datos de múltiples experimentos (al menos 2 experimentos diferentes) para obtener valores promedio para actividad residual de proteína p-glucocerebrosidasa recombinante para puntos temporales individuales y se representaron en gráfico respecto al tiempo de incubación, como se muestra.
Ejemplo 2
Se comparó la expresión de proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con sustituciones específicas de aminoácidos con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando experimentos de transfección transitoria descritos anteriormente (Figura 1). Como puede observarse en la Figura 1A, la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones F316A y L317F ("GlcCerasa-F316A/L317F"), la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321N ("GlcCerasa-K321N"), la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación H145L ("GlcCerasa-H145L"), las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con las variaciones F316A, L317F y K321N ("GlcCerasa-F316A/L317F/K321N"), las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes con las variaciones H145L y K321N ("GlcCerasa-H145L/K321 N") se expresaron de forma transitoria con la GlcCerasa de tipo silvestre en células HEK293T. El medio de cultivo celular condicionado se recogió 48 horas después de la transfección y se ensayó para la actividad enzimática p-glucocerebrosidasa usando el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p-D-glucósido (4-MUG) para evaluar el nivel relativo de expresión de estas enzimas GlcCerasa variantes en comparación con la GlcCerasa de tipo silvestre. Estos resultados demuestran que se expresaban diferentes enzimas GlcCerasa variantes tan bien o mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre, como se evidencia por la mayor actividad enzimática medida en el medio de cultivo celular. También se expresaban otras enzimas GlcCerasa variantes incluyendo GlcCerasa-H145F, GlcCerasa-H145L/F316A/L317F/K321N mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre (datos no mostrados). La GlcCerasa-K321A y GlcCerasa-H145F/F316A/L317F/K321N se expresaban a aproximadamente el mismo nivel que la GlcCerasa de tipo silvestre mientras que la GlcCerasa-K321V se expresaba de forma menor eficaz que la GlcCerasa de tipo silvestre (datos no mostrados).
La cantidad de proteínas GlcCerasa variantes y GlcCerasa de tipo silvestre presente en medio de cultivo celular condicionado se evaluó usando transferencia de Western como se ha descrito anteriormente. Como puede observarse en la Figura 1B, estaban presentes cantidades mayores de proteínas GlcCerasa-F316A/L317F y GlcCerasa-K321N en medio de cultivo celular condicionado que GlcCerasa de tipo silvestre. Estos datos de transferencia de Western son coherentes con los resultados de actividad enzimática GlcCerasa y confirman que ciertas enzimas GlcCerasa variantes se expresan y secretan mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre. Se observaron resultados similares para otras proteínas GlcCerasa variantes (datos no mostrados).
Ejemplo 3
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones F316A y L317F ("GlcCerasa-F316A/L317F") se comparó con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo de estabilidad in vitro descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-F316A/L317F es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de dos o tres horas. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 85% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 73% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 50% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F retenía el 34% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-F316A/L317F es de aproximadamente 120 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales. La GlcCerasa-F316A/L317F se ensayó también a aproximadamente pH 8 y aproximadamente 37°C y presentó una tendencia similar (Figura 3). Tanto la GlcCerasa-F316A/L317F como la GlcCerasa de tipo silvestre eran menos estable a aproximadamente pH 8 y aproximadamente 37°C, pero estos resultados confirman que la GlcCerasa-F316A/L317F es más estable a mayor pH que la GlcCerasa de tipo silvestre.
Ejemplo 4
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321N ("GlcCerasa-K321N") se comparó con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-K321N es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-K321N retenía el 104% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321N retenía el 91% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321N retenía el 76% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321 N retenía el 54% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-K321N es de aproximadamente 180 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 5
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación H145L ("GlcCerasa-H145L") se comparó con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-H145L es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-H145L retenía el 92% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L retenía el 87% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L retenía el 62% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L retenía el 42% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-H145L es de aproximadamente 160 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 6
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación H145F ("GlcCerasa-H145F") se comparó con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 1, la GlcCerasa-H145F es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-H145F retenía el 94% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145F retenía el 80% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145F retenía el 37% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145F retenía el 17% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de
incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-H145F es de aproximadamente 100 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 7
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones F316A, L317F, y K321N ("GlcCerasa-F316A/L317F/K321N") se comparó con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-F316A/L317F/K321N es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-F316A/L317F/K321N retenía el 101% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F/K321N retenía el 91% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F/K321N retenía el 75% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-F316A/L317F/K321N retenía el 52% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa
tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-F316A/L317F/K321N es de aproximadamente 180 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 8
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones H145L, F316A y L317F ("GlcCerasa-H145L/F316A/L317F") se comparó con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. La GlcCerasa-H145L/F316A/L317F es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-H145L/F316A/L317F retenía aproximadamente el 77% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L/F316A/L317F retenía el 80% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L/F316A/L317F retenía el 56% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L/F316A/L317F retenía el 39% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la GlcCerasa-H145L/F316A/L317F es de aproximadamente 135 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 9
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones H145L y K321N ("GlcCerasa-H145L/K321N") se comparó con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre") usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-H145L/K321N es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-H145L/K321N retenía el 89% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L/K321N retenía el 86% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L/K321N retenía el 76% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-H145L/K321N retenía el 62% de su actividad inicial después de 180 minutos
de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones experimentales
retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el
46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 20% de
su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 8% de su
actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente
pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la
GlcCerasa-H145L/K321N es de aproximadamente 180 minutos mientras que la semivida estimada para la
GlcCerasa de tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 10
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321A ("GlcCerasa-K321A") se comparó
con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre")
usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre
fueron idénticas. Como puede observarse en la Figura 2, la GlcCerasa-K321A es significativamente más estable que
la GlcCerasa de tipo silvestre a aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de
tres horas. La GlcCerasa-K321A retenía el 90% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La
GlcCerasa-K321A retenía el 89% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321A
retenía el 68% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321A retenía el 49% de
su actividad inicial después de 180 minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada
en las mismas condiciones experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de
incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minu incubación. La GlcCerasa tipo silvestre retenía 
20% de su actividad inicial después de 120 min incubación. La GlcCerasa 
tipo silvestre retenía 
8% de su actividad inicial después de 180 minu incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente
pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la
GlcCerasa-K321A es de aproximadamente 170 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de
tipo silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Ejemplo 11
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación K321A ("GlcCerasa-K321V") se comparó
con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre purificada ("GlcCerasa de tipo silvestre")
usando el ensayo descrito anteriormente. Las condiciones usadas para las proteínas variantes y de tipo silvestre
fueron idénticas. La GlcCerasa-K321V es significativamente más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre a
aproximadamente pH neutro y aproximadamente 37°C sobre un curso de tiempo de tres horas. La GlcCerasa-K321V
retenía el 74% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321V retenía el 55% de
su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321V retenía el 29% de su actividad inicial
después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa-K321V retenía el 15% de su actividad inicial después de 180
minutos de incubación. Por comparación, la GlcCerasa de tipo silvestre tratada en las mismas condiciones
experimentales retenía el 68% de su actividad inicial después de 30 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo
silvestre retenía el 46% de su actividad inicial después de 60 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre
retenía el 20% de su actividad inicial después de 120 minutos de incubación. La GlcCerasa de tipo silvestre retenía
el 8% de su actividad inicial después de 180 minutos de incubación.
La semivida estimada (definida operativamente en este estudio como el tiempo de incubación a aproximadamente
pH 7,5 y aproximadamente 37°C que provocaba una pérdida del 50% de la actividad enzimática inicial) para la
GlcCerasa-K321V es de aproximadamente 70 minutos mientras que la semivida estimada para la GlcCerasa de tipo
silvestre es de aproximadamente 50 minutos en estas condiciones experimentales.
Los resultados anteriores se resumen en la Tabla 1
Tabla 1
La actividad residual es la cantidad de actividad enzimática que permanece después de la incubación de tres horas y se expresa como el porcentaje de la actividad enzimática inicial (a t=0 min) para cada proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante en el ensayo de estabilidad. Cada proteína p-glucocerebrosidasa recombinante se ensayó en al menos dos experimentos diferentes (indicados por n en la Tabla 1) para determinar las actividades residuales promedio durante el curso de tiempo de tres horas excepto para la GlcCerasa-K321V y la GlcCerasa-H145L/F316A/L317F que se ensayaron solamente una vez. La mejora factorial se refiere al aumento en las semividas aparentes de las proteínas GlcCerasa recombinantes, variantes respecto a la proteína GlcCerasa recombinante, de tipo silvestre purificada.
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante que tiene una variación de aminoácido en la posición 145, 316, 317 o 321 o la GlcCerasa-F316A/L317F, GlcCerasa-K321N, GlcCerasa-K321A, GlcCerasa-K321V, GlcCerasa-H145L, GlcCerasa-H145F, o GlcCerasa-F316A/L317F/K321N o GlcCerasa-F316A/L317F/K321A o GlcCerasa-F316A/L317F/K321V o GlcCerasa-H145L/F316A/L317F o GlcCerasa-H145L/K321N que puede caracterizarse por retener más actividad catalítica respecto a la p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre podrían prepararse en células de levadura, células vegetales, células de mamífero o animales transgénicos usando técnicas de biología molecular y de purificación de proteínas conocidas para los expertos en la materia.
Una composición que comprende la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante que tiene una variación de aminoácido en la posición 145, 316, 317 o 321 o la GlcCerasa-F316A/L317F, GlcCerasa-K321 N, GlcCerasa-K321A, GlcCerasa-K321V, GlcCerasa-H145L, GlcCerasa-H145F, o GlcCerasa-F316A/L317F/K321N o GlcCerasa-F316A/L317F/K321A o GlcCerasa-F316A/L317F/K321V o GlcCerasa-H145L/F316A/L317F o GlcCerasa-H145L/K321N y un vehículo farmacéuticamente aceptable podría prepararse usando vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos para los expertos en la materia.
Una composición que comprende la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante que tiene una variación de aminoácido en la posición 145, 316, 317 o 321 o la GlcCerasa-F316A/L317F, GlcCerasa-K321 N, GlcCerasa-K321A, GlcCerasa-K321V, GlcCerasa-H145L, GlcCerasa-H145F, o GlcCerasa-F316A/L317F/K321N o GlcCerasa-F316A/L317F/K321A o GlcCerasa-F316A/L317F/K321V o GlcCerasa-H145L/F316A/L317F o GlcCerasa-H145L/K321N y un tampón farmacéuticamente aceptable podría prepararse usando tampones farmacéuticamente aceptables conocidos para los expertos en la materia.
Ejemplo 12
Como la proteína GlcCerasa es estable a pH ácido y muy eficaz en eliminar el sustrato glucosilceramida acumulado dentro de los lisosomas, se puede desarrollar una ERT con GlcCerasa más estable que puede resistir mejor el entorno desfavorable (pH neutro) para retener su actividad catalítica de modo que se suministre una cantidad mayor de fármaco activo a los lisosomas para una eficacia mejorada. La enzima GlcCerasa puede estabilizarse a aproximadamente pH neutro cuando se une (e inhibe) por el inhibidor enzimático de sitio activo isofagomina (IFG). La estabilidad de la proteína para la GlcCerasa recombinante a aproximadamente pH neutro se mejora significativamente con IFG, como se evidencia por un aumento de hasta Í52C en la temperatura de fusión térmica (Tm). Se cree que el mecanismo de acción para la estabilización de GlcCerasa inducida por IFG resulta de la red extensiva de enlaces de hidrógeno entre IFG y seis restos de sitio activo de GlcCerasa para restringir el desplegamiento del sitio activo y las regiones adyacentes para mantener una conformación de GlcCerasa más estable. Mantener la apropiada estructura de GlcCerasa en el sitio activo y las regiones adyacentes ayuda a la actividad catalítica y la estabilidad global de GlcCerasa. Varias modificaciones diferentes en GlcCerasa pueden ayudar a retener la actividad catalítica y mantener una estructura proteica más estable a aproximadamente pH neutro. En este documento se proporciona la construcción de una serie de diferentes enzimas GlcCerasa con sustituciones específicas de aminoácidos en localizaciones estratégicas dentro de estructuras de bucle cerca del sitio activo para ayudar a formar una región más ordenada cerca del sitio activo que son menos propensas a desenrollarse a aproximadamente pH neutro. Además, en este documento se proporcionan modificaciones en una hélice a cerca del sitio activo que pueden ayudar a mover esta hélice y un bucle adyacente desde el sitio catalítico para mantener una conformación abierta y activa.
Se utilizó una aproximación para generar una serie de enzimas GlcCerasa modificadas que se había predicho que tenían estabilidad proteica superior que la GlcCerasa de tipo silvestre. En primer lugar, se usaron dos estrategias diferentes pero complementarias: (1) modificación de ciertos bucles y hélices cerca del sitio catalíti conformaciones preferidas de GlcCerasa activa sin inhibir realmente la enzima; y (2) modificación de una región de enrollamiento aleatorio que puede potenciar las interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad proteica mejorada.
En un ejemplo, se modificaron varios restos dentro de la región del bucle 1 (posiciones 311-319) para ayudar a formar una región más ordenada cerca del sitio activo que sería menos propensa a desenrollamiento a
aproximadamente pH neutro. Esta variante (GlcCerasa-F316A/L317F) con modificaciones en el bucle 1 demostró ser significativamente más estable que la GlcCerasa a aproximadamente pH 7,5 y 37°C.
En un segundo ejemplo, se modificó una hélice a cerca del sitio activo (a6) que pretendía estabilizar esta hélice y ayudar a extraer un bucle adyacente (bucle1) desde el sitio catalítico para mantener una formación abierta y activa. Por tanto, se generaron enzimas GlcCerasa modificadas que contenían una sustitución de aminoácido en la posición 321 para remplazar un resto cargado de lisina con un resto no cargado dentro de la hélice a6 para promover más interacciones hidrófobas con hélices a y estructuras p adyacentes para estabilizar la proteína. Se analizaron alineaciones de proteínas para enzimas GlcCerasa para diversas especies (Tabla II) y se apreció que un homólogo de GlcCerasa de B. taurus (GlcCerasa de toro; código de acceso DAA31806.1) contenía asparagina en la posición 321 ( Asn). Esto sugiere que la lisina en la posición 321 ( Lys) puede remplazarse potencialmente con un resto de aminoácido diferentes sin anular la actividad catalítica GlcCerasa. La GlcCerasa-K321N retenía aproximadamente el 75% y el 54% de su actividad catalítica original a aproximadamente pH 7,5 y 37°C después de 2 y 3 h, respectivamente. En contraste, la GlcCerasa de tipo silvestre retenía solamente el 21% y el 8% de su actividad inicial en las mismas condiciones. La semivida estimada de la GlcCerasa-K321N fue aproximadamente 3,5 veces más larga que la GlcCerasa de tipo silvestre. Asimismo, la GlcCerasa-K321A retenía aproximadamente el 68% y el 49% de su actividad catalítica original a aproximadamente pH 7 y 37°C después de 2 y 3 h, respectivamente. La semivida estimada de la GlcCerasa-K321A fue aproximadamente 3 veces más larga que la GlcCerasa de tipo silvestre. La GlcCerasa-K321V retenía aproximadamente el 29% y el 15% de su actividad catalítica original a aproximadamente pH 7 y 37°C después de 2 y 3 h, respectivamente. La semivida estimada de la GlcCerasa-K321V fue aproximadamente 1,4 veces más larga que la GlcCerasa de tipo silvestre. Estos datos muestran que retirar un resto de lisina cargado positivamente dentro de la hélice a6 hacía que esta región estuviera más ordenada para limitar el desenrollamiento de esta región para conferir mayor estabilidad proteica de GlcCerasa.
En un tercer ejemplo, se modificó una región de enrollamiento aleatorio entre una lámina beta (p2) y una hélice a (a2) que puede facilitar mejores interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad mejorada. El análisis de alineación de proteínas de enzimas GlcCerasa de diversas especies (Tabla 2) reveló que la posición 145 dentro de este enrollamiento aleatorio era divergente entre las diferentes especies. Un homólogo de B. taurus y de S. scrofa (cerdo) contenían ambos leucina en esta posición mientras que la GlcCerasa murina contiene serina. Por tanto, se sustituyó histidina en la posición 145 (145His) con Leu (H145L) o Phe (H145F) para determinar si estas modificaciones mejorarían la estabilidad de GlcCerasa. La GlcCerasa GlcCerasa-H145L demostró ser más estable que la GlcCerasa de tipo silvestre y retenía el 62% de su actividad inicial después de 2 h y el 42% después de 3 h con una semivida estimada aproximadamente 3 veces más larga que la semivida de la GlcCerasa de tipo silvestre (160 min frente a 50 min). Asimismo, la GlcCerasa H145F retenía aproximadamente el 37% de su actividad inicial después de 2 h y el 17% después de 3 h con una semivida aproximadamente 2 veces más larga respecto a la GlcCerasa de tipo silvestre. Actualmente no se sabe el modo en que estas modificaciones afectaban a la estructura de la GlcCerasa, pero es posible que remplazando un resto cargado parcialmente (145His) con un resto hidrófobo de leucina o fenilalanina se hiciera que esta región estuviera más ordenada para limitar el desenrollamiento de esta región. Como alternativa, estas modificaciones pueden crear un giro y pueden potenciar las interacciones entre estructuras secundarias (por ejemplo, lámina beta p2 y hélice a2).
Los datos de alineación de proteínas se resumen en la Tabla 2
Tabla 2
Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes adecuadas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácidos en la región de bucle1 de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que aumenta el orden cerca del sitio activo de la proteína. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácidos en la región de bucle1 de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que aumenta el orden cerca del sitio activo de la proteína que se caracteriza por ser más estable en un intervalo de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8 en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácidos en la región de bucle1 de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que aumenta el orden cerca del sitio activo de la proteína que se caracteriza por ser más estable a aproximadamente pH neutro en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácidos en la región de bucle1 de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de aminoácidos por ser menos propenso a desenrollamiento en un intervalo
de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8 en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácidos en la región de bucle1 de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de aminoácidos por ser menos propenso a desenrollamiento a aproximadamente pH neutro en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre.
Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes adecuadas pueden tener también uno o más remplazos de aminoácidos en la hélice a cerca del sitio activo (a6) de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de cadenas laterales de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que estabiliza esta hélice y extrae el bucle1 adyacente desde el sitio catalítico y tiene una conformación abierta y activa. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácido en la hélice a cerca del sitio activo (a6) de la proteína, caracterizado los uno o más sitios de aminoácidos de remplazo por tener una conformación de cadena lateral que estabiliza esta hélice y extrae el bucle1 adyacente desde el sitio catalítico y tiene una conformación abierta y activa que se caracteriza por ser más estable en un intervalo de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8 en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden caracterizarse por tener una conformación más abierta a aproximadamente pH neutro en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácidos en la región de bucle1 de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de aminoácidos por tener una conformación más abierta en un intervalo de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8 en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácidos en la región de bucle1 de la proteína, caracterizado el uno o más remplazos de aminoácidos por tener una conformación más abierta a aproximadamente pH neutro en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre.
La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante adecuada también puede tener uno o más remplazos de aminoácido en la región de enrollamiento aleatorio entre la lámina beta (p2) y una hélice a (a2), caracterizado el uno o más remplazos de cadenas laterales de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que facilita mejores interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad mejorada. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácido en la región de enrollamiento aleatorio entre la lámina beta (p2) y una hélice a (a2), caracterizado el uno o más remplazos de cadenas laterales de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que facilita mejores interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad mejorada que se caracteriza por ser más estable en un intervalo de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8 en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácido en la región de enrollamiento aleatorio entre la lámina beta (p2) y una hélice a (a2), caracterizado el uno o más remplazos de cadenas laterales de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que facilita mejores interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad mejorada a aproximadamente pH neutro en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácido en la región de enrollamiento aleatorio entre la lámina beta (p2) y una hélice a (a2), caracterizado el uno o más remplazos de cadenas laterales de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que facilita mejores interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad mejorada en un intervalo de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8 en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Estas proteínas también pueden tener uno o más remplazos de aminoácido en la región de enrollamiento aleatorio entre la lámina beta (p2) y una hélice a (a2), caracterizado el uno o más remplazos de cadenas laterales de aminoácidos por tener una conformación de cadena lateral que facilita mejores interacciones entre diferentes restos y estructuras secundarias para una estabilidad mejorada a aproximadamente pH neutro en comparación con la proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre.
Métodos adecuados para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una estabilidad incrementada en comparación con p-glucocerebrosidasa recombinante de tipo silvestre. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal también pueden incluir administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante, caracterizada por conservar una actividad catalítica incrementada en comparación con p-glucocerebrosidasa recombinante de tipo silvestre. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante, caracterizada por tener una actividad específica incrementada en comparación con p-glucocerebrosidasa recombinante de tipo silvestre.
Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante, que tiene una variación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 316, 317, 321 y 145. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína pglucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos 316A y L317F. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido K321N. Métodos para tratar
una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante K321A. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína pglucocerebrosidasa recombinante, variante, con la variación de aminoácidos K321V. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido H145L. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con la variación de aminoácido H145F. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos F316A, L317F y K321N.
Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos H145L, F316A y L317F. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos H145L y K321N. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos H145L y K321A. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína pglucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos H145L y K321A. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también administrar a un sujeto que lo necesita una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante con las variaciones de aminoácidos H145L y K321V. Métodos para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal pueden incluir también métodos para tratar la enfermedad de Gaucher. Métodos de tratamiento pueden ser por infusión intravenosa, por inyección intramuscular o por otras vías de administración conocidas por un experto en la técnica.
Los compuestos adecuados pueden tener una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SeQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. Los compuestos adecuados pueden tener una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes adecuadas también pueden caracterizarse como capaces de una expresión aumentada respecto a la p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La expresión proteica de la p-glucocerebrosidasa recombinante, variante también puede aumentarse en al menos aproximadamente un 10% respecto a la p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La expresión proteica de la p-glucocerebrosidasa recombinante, variante también puede aumentarse en al menos aproximadamente un 25% respecto a la p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La expresión proteica de la pglucocerebrosidasa recombinante, variante también puede aumentarse en al menos aproximadamente un 50% respecto a la p-glucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. La expresión proteica de la p-glucocerebrosidasa recombinante, variante también puede aumentarse en al menos aproximadamente un 80% respecto a la pglucocerebrosidasa recombinante, de tipo silvestre. Las proteínas p-glucocerebrosidasa recombinantes, variantes también pueden ser capaces de expresarse en células de mamífero, animales transgénicos o en células de levadura. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante también puede expresarse en un ser humano. La proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante también puede expresarse a partir de un gen insertado.
Ejemplo 13
Las proteínas GlcCerasa recombinantes, variantes y GlcCerasa de tipo silvestre se expresaron en cultivo celular de acuerdo con métodos mencionados previamente para evaluar la expresión relativa de estas enzimas GlcCerasa variantes en comparación con la GlcCerasa de tipo silvestre. Varias enzimas GlcCerasa variantes diferentes se expresaron mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre en experimentos de transfección transitoria, medido por la actividad enzimática a partir del medio condicionado después de aproximadamente 48 horas después de la transfección (Figura 1). La GlcCerasa-F316A/L317A se expresó mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre (aproximadamente un 282%), la GlcCerasa-K321N se expresó mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre (aproximadamente un 272%), la GlcCerasa-H145L se expresó mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre (aproximadamente un 157%), la GlcCerasa-F316A/L317A/K321N se expresó mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre (aproximadamente un 272%), la GlcCerasa-H145L/K321N se expresó mejor que la GlcCerasa de tipo silvestre (aproximadamente un 317%). La GlcCerasa-K321A se expresó de forma equivalente a la GlcCerasa de tipo silvestre mientras que la GlcCerasa-K321V se expresó a niveles inferiores que el tipo silvestre (aproximadamente un 61%) (datos no mostrados).
También se describen en este documento métodos para preparar un compuesto que comprende una proteína pglucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una cualquiera de las siguientes secuencias de
aminoácidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. También se proporcionan en este documento métodos para preparar un ácido nucleico que codifica una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante caracterizada por tener una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
Ejemplo 14
Construcción de plásmidos para enzimas GlcCerasa de tipo silvestre y modificadas
Se generaron plásmidos de ADN para la expresión de enzimas GlcCerasa de tipo silvestre y modificadas usando cebadores oligonucleotídicos (enumerados en la Tabla 3) o minigenes de ADN sintético (>400 pb) que codifican un fragmento de GlcCerasa con sustituciones específicas de aminoácidos. Todos los cebadores y minigenes de ADN sintético se adquirieron de Integrated DNA Technologies™ (Coralville, IA). La GlcCerasa humana de tipo silvestre (denominada como pHD101) se construyó por generación del ADNc de GlcCerasa por PCR y ligamiento en un vector de expresión de mamífero. En resumen, se amplificó el ADNc completo de GlcCerasa humana de tipo silvestre con su secuencia Kozak y codón de parada natural usando los cebadores A y B y el ADN molde del clon de ADNc de GlcCerasa humana (Origene™) en dos reacciones idénticas de 50 pl mediante la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion-HF™ (NEB™) y dNTP 200 pM. El cebador A se construyó para que contuviera un sitio de restricción BglII 5' y un sitio de restricción EcoRI interno que precedía inmediatamente la secuencia Kozak, mientras que el cebador B contenía sitios de restricción NheI y NotI 3' que seguían al codón de parada para posibilitar la clonación del producto de PCR en los vectores de expresión. Las reacciones de PCR se combinaron y el producto resultante de PCR de ~1,6 kilobases (kb) se separó y se escindió de un gel preparativo de agarosa al 1% (p/v) y se aisló usando el kit de extracción de gel de QIAGEN™. El producto de PCR se digirió posteriormente durante una noche con las endonucleasas de restricción BglII y NotI a 37°C y se volvió a purificar usando el kit de limpieza de PCR de QIAGEN™ según las instrucciones del fabricante. El vector de expresión en mamífero pEF6/V5-HisA™ se digirió con BamHI y NotI, se desfosforiló usando fosfatasa Antarctic™ y se aisló usando el kit de limpieza de PCR de QIAGEN™. El producto de PCR digerido con BglII-NotI (2 pl) se ligó en el vector BamHI-NotI pEF6/V5-HisA™ (1 pl) usando ADN ligasa T4 (NEB™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transformaron células de E. coli químicamente competentes con 1 pl de la reacción de ligamiento y se sembraron en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenían 100 pg/ml de ampicilina y se incubaron durante una noche a 37°C para formar distintas colonias bacterianas que se habían transformado con el ADN plasmídico que contenía el gen de la p-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Se picaron colonias bacterianas individuales resistentes a ampicilina y se expandieron en 4 ml de caldo LB (que contenía 100 pg/ml de ampicilina) durante una noche a 37°C y se aisló el ADN plasmídico en el siguiente día por Miniprep™ (QIAGEN™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ADN plasmídicos aislados se comprobaron mediante dos reacciones diferentes de digestión de restricción usando EcoRI y NheI, y BamHI, respectivamente. Se eligió un ADN plasmídico correcto del clon 4 (denominado como pHD101.4) y se usó para volver a transformar células de E. coli competentes como se ha descrito anteriormente para una replicación de alto nivel del ADN plasmídico. Entonces se picó una colonia de la placa de agar LB-ampicilina y se cultivó en 200 ml de caldo LB durante una noche a 37°C y se aisló el plásmido pHD101.4 por Maxiprep™ (Promega™). El plásmido pHD101.4 (que codifica el ADNc de GlcCerasa humana de tipo silvestre) se verificó por secuenciación de ADN y se usó para la construcción de otras enzimas GlcCerasa y para experimentos de transfección transitoria.
Se incorporó un sitio de restricción BglII en el cebador 1 de modo que el ligamiento del producto de PCR de GlcCerasa digerido con BglII en el sitio BamHI compatible del vector pEF6/V5-HisA™ eliminara el sitio de restricción BamHI dentro del sitio de clonación múltiple y este vector de expresión modificado se mencionará como pEF6’ a partir de ahora. La eliminación de este sitio BamHI dentro pEF6/V5-HisA™ era necesaria de modo que pueda utilizarse un sitio BamHI único dentro del ADNc de GlcCerasa para insertar fragmentos de ADN con sustituciones específicas de nucleótidos para generar enzimas GlcCerasa modificadas.
Para generar GlcCerasa-F316A/L317F (denominada como pHD105), se sintetizó un minigén de GlcCerasa que contenía estas sustituciones de aminoácidos por Integrated DNA Technologies™ entre sitios de restricción BsrGI 5' y BamHI 3' flanqueantes naturales. El fragmento de ADN de GlcCerasa modificado sintético (~0,5 kb) se liberó del plásmido pIDTSMART™ por digestión de restricción con BsrGI y BamHI y se aisló posteriormente por gel preparativo de agarosa al 1% y se ligó en fase en pHD101.4 que se había digerido previamente con BsrGI y BamHI y desfosforilado. Se usó un microlitro de esta reacción de ligamiento para transformar células de E. coli competentes y la muestra se procesó como se ha descrito anteriormente para pHD101. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 5 (denominado como pHD105.5) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-K321N (denominada como pHD109), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. En resumen, el fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generó usando los cebadores A y D, y pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 1 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generó usando los cebadores B y C, y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 2. Después se sintetizó el ADNc completo de la K321N
GlcCerasa en la reacción de PCR 3 añadiendo 1 pl de las reacciones de PCR A y B y los cebadores 1 y 2. El producto de PCR resultante 3 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 3 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como se ha descrito anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 3 (denominado como pHD109.3) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L (denominada como pHD110), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~0,55 kb) se generó usando los cebadores A y F y, pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 4 mientras el fragmento C-terminal (~1 kb) se generó usando los cebadores B y E, y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 5. El ADNc completo de H145L GlcCerasa se generó en la reacción de PCR 6 añadiendo 1 pl de las reacciones de PCR 4 y 5 y los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 6 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 6 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 2 (denominado como pHD110.2) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145F (denominada como pHD111), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~0,55 kb) se generó usando los cebadores A y H, y pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 7 mientras el fragmento C-terminal (~1 kb) se generó usando los cebadores B y G, y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 8. El ADNc completo de H145L GlcCerasa se generó en la reacción de PCR 9 añadiendo 1 pl de las reacciones de PCR 7 y 8 y los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 9 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 9 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 1 (denominado como pHD111.1) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-F316A/L317F/K321N (denominada como pHD112), la sustitución de aminoácidos se introdujo en pHD105.5 por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generó usando los cebadores A y D, y pHD105.5 como ADN molde en la reacción de PCR 10 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generó usando los cebadores B y C, y pHD105.5 como molde en la reacción de PCR 11. El ADNc completo de F316A/L317F/K321N GlcCerasa se generó en la reacción de PCR 12 añadiendo 1 pl de las reacciones de PCR 10 y 11 y los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 12 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 12 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado como se ha descrito anteriormente. Se aisló a Dn Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción usando EcoRI y XbaI. El clon 7 (denominado como pHD112.7) se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L/F316A/L317F (denominada como pHD113), la sustitución de aminoácidos se introdujo en pHD105.5 por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~0,55 kb) se generó usando los cebadores A y F, y pHD105.5 como ADN molde en la reacción de PCR 13 mientras el fragmento C-terminal (~1 kb) se generó usando los cebadores B y E, y pHD105.5 como molde en la reacción de PCR 14. El ADNc completo de H145L/F316A/L317F GlcCerasa se generó en la reacción de PCR 15 añadiendo 1 pl de las reacciones de PCR 13 y 14 y los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 15 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 15 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado como se ha descrito previamente.
Para generar GlcCerasa-H145F/F316A/L317F (denominada como pHD114), la sustitución de aminoácidos se introdujo en pHD105.5 por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~0,55 kb) se generó usando los cebadores A y H, y pHD105.5 como ADN molde en la reacción de PCR 16 mientras el fragmento C-terminal (~1 kb) se generó usando los cebadores B y G, y pHD105.5 como molde en la reacción de PCR 17. El ADNc completo de H145F/F316A/L317F GlcCerasa se generó en la reacción de PCR 18 añadiendo 1 pl de las reacciones de PCR 16 y 17 y los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 18 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 18 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado como se ha descrito previamente.
Para generar GlcCerasa-H145L/K321N (denominada como pHD115), se digirieron tanto pHD109.3 como pHD110.2 con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI y el fragmento de ~0,5 kb de pHD109.3 y el fragmento de ~6,9 kb de pHD110.2 (después del tratamiento con fosfatasa Antarctic) se aislaron por gel preparativo de agarosa al 1%. El fragmento de ~0,5 kb de pHD109.3 (que contenía la sustitución de aminoácido K321N) después se ligó en fase en el plásmido pHD110.2 (contiene la modificación H145L) y se procesó como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 5 se eligió, se verificó por secuenciación de ADN y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L/F316A/L317F/K321N (denominada como pHD116), se digerirán tanto pHD112.7 como pHD110.2 con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI y el fragmento de ~0,5 kb de pHD112.7 y el fragmento de ~6,9 kb de pHD110.2 (después del tratamiento con fosfatasa Antarctic™) se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1%. El fragmento de ~0,5 kb de pHD112.7 (que contiene las sustituciones de aminoácidos F316A/L317F/K321N) se ligará en fase en el plásmido pHD110.2 (contiene la modificación H145L) y se procesará como anteriormente. Se aislará ADN Miniprep de clones individuales y se ensayará por digestión de restricción con EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-H145L/F316A/L317F/K321A. La construcción de ADN seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-K321A (denominada como pHD117), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. En resumen, el fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generó usando los cebadores A y J, y pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 19 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generó usando los cebadores B e I, y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 20. Los productos de PCR 19 y 20 se aislaron por gel preparativo de agarosa al 1% y se usaron como ADN molde para sintetizar el fragmento de ADNc completo de K321A GlcCerasa en la reacción de PCR 21 usando los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 21 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 21 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como se ha descrito anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 1 (denominado como pHD117.1) se eligió y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-K321V (denominada como pHD118), la sustitución de aminoácidos se introdujo por PCR solapante. En resumen, el fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generó usando los cebadores A y L, y pHD101.4 como ADN molde en la reacción de PCR 22 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generó usando los cebadores B y K. y pHD101.4 como molde en la reacción de PCR 23. Los productos de PCR 22 y 23 se aislaron por gel preparativo de agarosa al 1% y se usaron como ADN molde para sintetizar el fragmento de ADNc completo de K321A GlcCerasa en la reacción de PCR 24 usando los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 24 (~1,6 kb) se aisló de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digirió con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 24 se volvió a purificar y se ligó en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado y se procesó como se ha descrito anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI. El clon 7 (denominado como pHD118.7) se eligió y se usó para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-F316A/L317F/K321A (denominada como pHD119), la sustitución de aminoácidos se introducirá en pHD105.5 por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generará usando los cebadores A y J, y pHD105.5 como ADN molde en la reacción de PCR 25 mientras el fragmento C-terminal (~0,5 kb) se generará usando los cebadores B e I, y pHD105.5 como molde en la reacción de PCR 26. Los productos de PCR 25 y 26 se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1% y se usarán como ADN molde para sintetizar el fragmento de ADNc completo de F316A/L317F/K321A/K321A GlcCerasa en la reacción de PCR 27 usando los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 27 (~1,6 kb) se aislará de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digerirá con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 27 se volverá a purificar y se ligará en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado como se ha descrito anteriormente. Se aislará ADN Miniprep de clones individuales y se ensayará por digestión de restricción usando EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-F316A/L317F/K321A. La construcción de a Dn seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-F316A/L317F/K321V (denominada como pHD120), la sustitución de aminoácidos se introducirá en pHD105.5 por PCR solapante. El fragmento N-terminal (~1,1 kb) se generará usando los cebadores A y L, y pHD105.5 como ADN molde en la reacción de PCR 28 mientras el fragmento C-terminal (~ 0,5 kb) se generará usando los cebadores B y K, y pHD105.5 como molde en la reacción de PCR 29. Los productos de PCR 28 y 29 se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1% y se usarán como ADN molde para sintetizar el fragmento de ADNc completo de F316A/L317F/K321A/K321V GlcCerasa en la reacción de PCR 30 usando los cebadores A y B. El producto de PCR resultante 30 (~1,6 kb) se aislará de un gel preparativo de agarosa al 1% como anteriormente y se digerirá con endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El producto de PCR 30 se volverá a purificar y se ligará en el vector pEF6' digerido con EcoRI/NotI y desfosforilado como se ha descrito anteriormente. Se aislará ADN Miniprep de clones individuales y se ensayará por digestión de restricción usando EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-F316A/L317F/K321V. La construcción de a Dn seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L/K321A (denominada como pHD121), se digerirán tanto pHD117.1 y pHD110.2 con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI y el fragmento de ~0,5 kb de pHD117.1 y el fragmento de ~6,9 kb de pHD110.2 (después del tratamiento con fosfatasa Antarctic™) se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1%. El fragmento de ~0,5 kb de pHD117.1 (que contiene la sustitución de aminoácido K321A) se ligará en fase en el plásmido pHD110.2 (contiene la modificación H145L) y se procesará como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de
clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y Xbal para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-H145L/K321A. La construcción de ADN seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
Para generar GlcCerasa-H145L/K321V (denominada como pHD122), se digerirán tanto pHD118.7 como pHD110.2 con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI y el fragmento de ~0,5 kb de pHD118.7 y el fragmento de ~6,9 kb de pHD110.2 (después del tratamiento con fosfatasa Antarctic) se aislarán por gel preparativo de agarosa al 1%. El fragmento de ~0,5 kb de pHD118.7 (que contiene la sustitución de aminoácido K321V) se ligará en fase en el plásmido pHD110.2 (contiene la modificación H145L) y se procesará como anteriormente. Se aisló ADN Miniprep de clones individuales y se ensayó por digestión de restricción con EcoRI y XbaI para identificar la cepa bacteriana transformada con el ADNc correcto de GlcCerasa-H145L/K321V. La construcción de ADN seleccionada se verificará por secuenciación de ADN y se usará para caracterización adicional.
La Tabla 3 resume las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente para construir las enzimas GlcCerasa modificadas.
Tabla 3
Secuencias
SEQ ID NO: 1 ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPI QANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFS EEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLK1PLIHRALQL AQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKPLDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHH NVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGE THRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWT DWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRV GLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVWLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSI HTYLWRRQ
SEQ ID NO: 2 ARPCTPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPI Q ANHT GT GLLLTLQPEQKF QKVKGF GGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKS YFS EEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQL AQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKELDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHH NVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDAFAPAKATLGE THRLFPNTMLF ASEACVGSKF WEQS VRLGS WDRGMQY SHSIITNLLYHVV G WT DWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRV GLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVWLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSI HTYLWRRQ
SEQ ID NO: 3
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SEQ ID NO: 4
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SEQ ID NO: 5
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SEQ ID NO: 6
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SEQ ID NO: 7
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SEQ ID NO: 8
ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPI QANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFS EEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLFNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQL AQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHH NVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDAFAPAKATLGE THRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWT DWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRV GLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVWLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSI HTYLWRRQ
SEQ ID NO: 9
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SEQ ID NO: 10
ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPI QANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFS EEGIGYNI1RVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLLNFSLPEEDTKLRIPLIHRALQL AQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHH NVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDAFAPANATLGE THRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWT DWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRV GLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVWLNRSSKDVPLTIRDPAVGFLETISPGYSI HTYLWRRQ
SEQ ID NO: 11
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SEQ ID NO: 12
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SEQ ID NO: 13
ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPI QANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFS EEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQL AQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHH NVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDAFAPAAATLGE THRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHS1ITNLLYHVVGWT DWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRV GLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVWLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSI HTYLWRRQ
SEQ ID NO: 14
ARPCTPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPJ QANHTGTGLLLTLQPEQKFQRVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFS EEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQL AQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHH NVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDAFAPAVATLGE THRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWT DWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRV GLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVWLNRSSRDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSI HTYLWRRQ
SEQ ID NO: 15
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SEQ ID NO: 16
ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPI QANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFS EEGIGYNIIRVPM ASCDFSIRTYT Y ADTPDDF QLLNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQL AQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHH NVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAVATLGE THRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWT DWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRV GLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVWLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSI HTYLWRRQ
Claims (15)
1. Una proteína p-glucocerebrosidasa recombinante, variante, que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos: , SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 16, o un fragmento funcional de las mismas.
2. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 2, o un fragmento funcional de la misma.
3. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 4, o un fragmento funcional de la misma.
4. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 5, o un fragmento funcional de la misma.
5. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 6, o un fragmento funcional de la misma.
6. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 7, o un fragmento funcional de la misma.
7. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 8, o un fragmento funcional de la misma.
8. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 9, o un fragmento funcional de la misma.
9. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 10, o un fragmento funcional de la misma.
10. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 11, o un fragmento funcional de la misma.
11. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 12, o un fragmento funcional de la misma.
12. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 13, o un fragmento funcional de la misma.
13. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 14, o un fragmento funcional de la misma.
14. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 15, o un fragmento funcional de la misma.
15. La proteína de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende SEQ ID NO: 16, o un fragmento funcional de la misma.
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