RS55405B1 - Varijantni, rekombinantni proteini beta-glukocerebrozidaze sa povećanom stabilnošću i povećanom zadržanom katalitičkom aktivnošću - Google Patents

Varijantni, rekombinantni proteini beta-glukocerebrozidaze sa povećanom stabilnošću i povećanom zadržanom katalitičkom aktivnošću

Info

Publication number
RS55405B1
RS55405B1 RS20161010A RSP20161010A RS55405B1 RS 55405 B1 RS55405 B1 RS 55405B1 RS 20161010 A RS20161010 A RS 20161010A RS P20161010 A RSP20161010 A RS P20161010A RS 55405 B1 RS55405 B1 RS 55405B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
glucocerebrosidase
wild
glccerase
variant
recombinant
Prior art date
Application number
RS20161010A
Other languages
English (en)
Inventor
Hung Do
Original Assignee
Amicus Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amicus Therapeutics Inc filed Critical Amicus Therapeutics Inc
Publication of RS55405B1 publication Critical patent/RS55405B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

TEHNIČKA OBLAST
[0001]Oblast ovog pronalaska uključuje proteine koji su korisni u terapiji zamene enzima kod različitih lizozomalnih bolesti taloženja. U lizozomalne bolesti taloženja spada Gošeova bolest.
OSNOVA
[0002]p-glukocerebrozidaza je rastvorni lizozomski enzim koji funkcioniše na površini luminalne membrane putem interakcija sa saposinom C i anjonskim fosfolipidima, i hidrolizuje glikolipid glukozilceramid. P-glukocerebrozidaza je naročito značajna u tkivnim rnakrofagima, za raskidanje i recikliranje membrana progutanih oštećenih ćelija i patogena. Posto je molekul glukozilceramida primarni prekursor za više od 300 glikolipida i gangliozida koji učestvuju u mnogobrojnim važnim ćelijskim putevima i biohemijskim kaskadama, od suštinskog je značaja da sc održi složena ravnoteža ovih različitih lipidnih molekula.
[0003]Gošeovu bolest izaziva nedostatak p-glukocerebrozidaze, što ima za rezultat nakupljanje glukozilceramida. Gošeova bolest se ispoljava kroz različite kliničke simptome, uključujući anemiju, trombocitopeniju, hepatosplenomegaliju i anomalije skeleta. Gošeova bolest je podeljena u tri kategorije, na osnovu neuroloških poremećaja: tip 1 (bez neuroloških poremećaja); tip 2 (akutni neurološki poremećaji) i tip 3 (hronični neurološki poremećaji). Nije poznat lek za Gošeovu bolest, ali terapija zamene enzima (ERT), kojom se nadoknađuje nedostatak p-glukocerebrozidaze, i terapija redukcijom supstrata, kojom se inhibira sinteza glukozilceramida, predstavljaju odobrenu terapiju za ovu bolest. Drugi terapeutski pristupi, kao što su mali molekuli kao farmakološki pratioci i modulatori savijanja proteina, takođe se procenjuju kao moguća terapija za ovu bolest. Od ovih terapeutskih pristupa, ERT predstavlja najprihvaćenije i najefikasnije kliničko lečenje za visceralne simptome Gošeove bolesti. Imigluceraza (rekombinantna P-glukocerebrozidaza; Cerezvme™. Genzvme Corp.™) razvijena je i odobrena od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 1994. godine za lečenje Gošeove bolesti, i sada predstavlja standardnu terapiju za ovu bolest.
[0004}Dok se Cerezvme™ ERT uobičajeno smatra najefikasnijim lečenjem. ovaj lizozomski enzim nije stabilan na neutralnom pH i na 37°C. U stvari, najveći deo ieka se ireverzibilno inaktivira u krvi ubrzo nakon intravenske infuzije. Samo mala frakcija koja zadržava katalitičku aktivnost i koja biva uključena u ciljne makrofage, nosi celokupni terapeutski efekat. Stoga bi bilo povoljno da se razvije stabilniji enzim [3-glukocerebrozidaza. koji nije toliko podložan inaktivaciji, od faze proizvodnje proteina do fizioloških uslova na koje bi naišao nakon uvođenja u ljudskog pacijenta kada se ukaže potreba.
[0005|Proteini p-glukocerebrozidaze su poznati i. na primer. UniProt baza podataka sadrži
sekvence goveđeg proteina P-glukocerebrozidaze (pristupni broj Q2KHZ8); svinjski protein p-glukocerebrozidaze je opisan u radu Statil et al. Comparative Biochemistrv and Phvsiologv. Part B, 138 (2004) 377-383 i upoređen sa sekvencom humanog proteina, a u radu O'Neill et£.1, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 86 (2009) 5049-5053 dato je poređenjc mišjih i ljudskih gena p-glukocerebrozidaze, i utvrđene su sekvence aminokiselina.
[0006|Liou et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 4242-4253 se odnosi na analizu varijantnih p-glukocerebrozidaza koje izazivaju Gošeovu bolest.
[0007]WO01/49830 i US 2002/0127219 se odnose na modifikovane lizozomske enzime, uključujući p-glukocercbrozidazu. Modifikovani enzimi imaju za cilj poboljšanje kod lizozomalnih bolesti taloženja, i sadrže bar jedno uvedeno mesto glikozilacije. Da bi se uvelo mesto N-glikozilacije u matični GCB polipeptid. polipeptid može da sadrži jednu ili više supstituisanih aminokiselina, na primer supstitucija na asparaginskom ostatku. Supstitucija može da dovede do povećanja GCB aktivnosti u poređenju sa divljini tipom.
REZIME
[0008)Ovde su dati varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze okarakterisani time što imaju povećanu stabilnost u odnosu na divlji tip rekombinantne p-glukocerebrozidaze. Ovde su takođe dati varijantni. rekombinantni proteini fi-gi ukocerebrozidaze okarakterisani time što zadržavaju veću kataiitičku aktivnost u odnosu na
divlji tip rekombinantne P-glukocerebrozidaze. Varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze imaju mutaciju izabranu od: F316A i 1.317F: H145L;
H145F;
H145L. F316Ai L317F;
K321A:i
K321V;
u odnosu na sekvencu aminokiselina ID BR. SEKV: 1.
|0009|Ovde su takođe opisani postupci za dobijanje varijantnih. rekombinantnih proteina li-gi ukocerebrozidaze okarakterisanih time što zadržavaju veću katalitičku aktivnost u odnosu na divlji tip rekombinantne P-glukocerebrozidaze. Ovde su nadalje opisane smeše koje sadrže varijantne, rekombinantne proteine P-glukocerebrozidaze i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovde su takođe date smeše koje sadrže varijantne, rekombinantne proteine p-glukocerebrozidaze i farmaceutski prihvatljiv pufer.
[0010]Ovde su opisani varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze koji imaju zamenjene aminokiseline A i F u položajima 316 i 317 u oblasti petlje 1 proteina, pri čemu zamenjene aminokiseline imaju konformaciju bočnog niza okarakterisanu time što povećava uređenost u blizini aktivnog mesta proteina. Ovde su nadalje opisani varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze koji imaju zamenjene aminokiseline A, V ili N u položaju 321 u ot-spirali u blizini aktivnog mesta proteina (a6). pri čemu je bočni niz zamenjene aminokiseline okarakterisan time što ima konformaciju bočnog niza koja stabilizuje ovu spiralu i odvlači susednu petlju 1 od katalitičkog mesta. i ima otvorenu i aktivnu konformaciju. Ovde su takođe opisani varijantni. rekombinantni proteini |3-glukocerebrozidaze koji imaju zamenjene aminokiseline L ili F u položaju 145 u oblasti nasumične spirale između beta-ploče ( p2) i ct-spirale (a2). pri čemu je bočni niz zamenjeneE.minokiseline okarakterisan time što ima konformaciju bočnog niza koja olakšava bolje interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura u cilju poboljšavanja stabilnosti.
[0011JOvde je dat varijantni, rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze koji je opisan u gornjem tekstu za lečenje lizozomalne bolesti taloženja, naznačeno time što lizozomalna bolest taloženja može biti Gošeova bolest.
|0012jOvde su nadalje opisana jedinjenja koja sadrže varijantni. rekombinantni protein (3-glukocerebrozidaze okarakterisan time što sadrži jednu od sledećih sekvenci aminokiselina: ID BR. SEKV: 2.1D BR. SEKV: 4. ID BR. SEKV: 5, ID BR. SEKV: 6. ID BR. SEKV: 7. 1D
BR. SEKV: 8, ID BR. SEKV: 9. ID BR. SEKV: 10. ID BR. SEKV: 11, ID BR. SEKV: 12. ID BR. SEKV: 13. ID BR. SEKV: 14. ID BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16.
[0013] Ovde su takođe dati varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze koji su okarakterisani time što su sposobni za povećanu ekspresiju u odnosu na divlji tip rekombinantne p-glukocerebrozidaze.
[0014] Ovde su takođe dati postupci za pripremu jedinjenja koje sadrži varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze okarakterisan time što sadrži jednu od sledećih sekvenci aminokiselina: ID BR. SEKV: 2. ID BR. SEKV: 4. ID BR. SEKV: 5. ID BR.
SEKV: 6, ID BR. SEKV: 7, ID BR. SEKV: 8. ID BR. SEKV: 9. ID BR. SEKV: 10. ID BR.
SEKV: i 1, ID BR. SEKV: 12, ID BR. SEKV: 13. ID BR. SEKV: 14. ID BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16. Ovde su takođe dati postupci za pripremu nukleinske kiseline za šifrovanje varijantnog. rekombinantnog proteina p-glukocerebrozidaze okarakterisanog time što sadrži jednu od sledećih sekvenci aminokiselina: ID BR. SEKV: 2, ID BR. SEKV: 4, ID
BR. SEKV: 5. ID BR. SEKV: 6. ID BR. SEKV: 7. ID BR. SEKV: 8. ID BR. SEKV: 9. ID
BR. SEKV: 10, ID BR. SEKV: 11. ID BR. SEKV: 12. ID BR. SEKV: 13. ID BR. SEKV: 14. ID BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0015] Prethodni i drugi aspekti predmetnog pronalaska su očigledni iz sledećeg detaljnog opisa pronalaska kada se razmatraju istovremeno sa pratećim crtežima. U svrhu ilustrovanja pronalaska, na crtežima su prikazana otelotvorenja koja su trenutno poželjna, imajući u vidu da pronalazak ipak nije ograničen na specifična priložena sredstva. Crteži ne moraju biti u odgovarajućoj razmeri. Na crtežima: Slika 1 (A) prikazuje merenja enzimske aktivnosti da bi se uporedila relativna ekspresija varijantnih, rekombinantnih proteina p-glukocerebrozidaze u odnosu na divlje enzime koji se izluče u medijum ćelijskih kultura u tipičnom eksperimentu tranzijentne transfekcije nakon 48 h: (B) prikazuje vestern blot analizu, da bi se uporedili relativni odnosi izlučenih varijantnih, rekombinantnih proteina [3-glukocerebrozidaze i proteina divljeg tipa GlcCeraze u medijum ćclijske kulture nakon tranzijentne transfekcije. Slika 2 prikazuje stabilnost varijantnih, rekombinantnih proteina |3-glukocerebrozidaze sa H145L modifikacijom, H145F modif<i>kacijom, F316A/L317F modifikacijom, K321N modifikacijom, K321 A modifikacijom. F316A/L317F/K321N modifikacijama i H145L/K321N modifikacijama u odnosu na protein divljeg tipa fi-gi ukocerebrozidaze na pH 7.5 i 37°C; i Slika 3 prikazuje stabilnost varijantnog. rekombinantnog proteina (3-glukocerebrozidaze sa F316A/L317F modifikacijama u odnosu na protein divljeg tipa (3-glukocerebrozidaze na pH 8 i 37°C.
DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH OTELOTVORENJA
[0016]Predmetna tema može lakše da se shvati upućivanjem na sledeći detaljan opis i njegovim povezivanjem sa pratećim slikama i primerima. koji čine sastavni deo ovog pronalaska.
{0017|Takođe. kao što su upotrebljeni u specifikaciji koja obuhvata priložene patentne zahteve, oblici za jedninu uključuju množinu, a upućivanje na određenu brojnu vrednost uključuje makar tu posebnu vrednost. osim ako kontekst jasno ne pokazuje drugačije. Termin „.više", kao što je ovde upotrebljen, znači više od jednog. Kada je izražen opseg vrednosti. drugo otelotvorenje uključuje vrednosti od jedne posebne vrednosti i/ili do druge posebne vrednosti. Slično tome, kada su vrednosti izražene aproksimativno, ako ispred stoji reć ..oko", podrazumeva se da posebna vrednost predstavlja drugo otelotvorenje. Svi opsezi su inkluzivni i mogu da se kombinuju.
[0018]Priloženi su primeri sa ciljem da pomognu daljem razumevanju pronalazaka. Specifični upotrebljeni materijali, protokoli i uslovi su dati kao dodatna ilustracija pronalazaka, i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje razumnog obima pronalaska.
[0019]Ukoliko nije drugačije napomenuto, navedene osobine varijantnog, rekombinantnog proteina |3-glukocerebrozidaze su date u odnosu na osobine varijantnog. rekombinantnog proteina P-glukocerebrozidaze divljeg tipa ( ID BR. SEKV: 1). Ovde je ..GlcCeraza"skraćenica za p-glukocerebrozidazu. Svi brojevi aminokiselina su relativni u odnosu na ID BR. SEKV: 1. Tako položaj 145 označava 145. aminokiselinu koja se nalazi u ID BR. SEKV: 1. Osim toga, varijantni, rekombinantni proteini P-glukocerebrozidaze koji su ovde opisani takođe uključuju funkcionalne fragmente ili njihove derivate. {0020]Ovde .,pH oko neutralnog"treba da obuhvati pH vrednosti koje se obično smatraju fiziološkim pH vrednostima (tj. pH oko 7.5 na 37°C).
[0021 ] Pogodni varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze mogu se okarakterisati time što imaju sličnu ili povećanu ekspresiju proteina i sekreciju u medijum
ćelijske kulture u odnosu na varijantne. rekombinantne proteine P-glukocerebrozidaze divljeg tipa u toku proizvodnje ćelijske kulture i proteina. Pogodni varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze mogu se okarakterisati time što imaju povećanu stabilnost u odnosu na rekombinantne proteine p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini imaju povećanu
stabilnost pod fiziološkim uslovima. a ti fiziološki uslovi mogu biti in vivo. Nadalje, ovi proteini takođe mogu da se okarakterišu time što imaju povećanu stabilnost pri uslovima oko neutralnog pH i na oko 37°C. Ta povećana stabilnost može da se prati pri uslovima oko neutralnog pH i na oko 37°C u periodu od oko tri sata. Povećana stabilnost se zadržava u medij umu ćelijske kulture, i može da se zadrži unutar ćelija. Ovi proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost u lizozomu. i u lizozomu uslovi mogu biti pH oko 5 i temperatura oko 37°C. Ovi proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost koja se karakleriše smanjenom proteolitičkom degradacijom i smanjena proteolitička degradacija može da se dešava u ćelijama. Nadalje, smanjena proteolitička degradacija može biti u lizozomu u ćelijama. Ti proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost pod uslovima koji nisu fiziološki, kao u puferskim rastvorima u toku prečišćavanja proteina. Ovi puterski rastvori mogu da imaju pH veći od oko 7 ili pH manji od oko 3 u toku prečišćavanja proteina. Ti puterski rastvori takođe mogu da sadrže organske rastvarače ili haotropne soli. Ti proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost u puferskim rastvorima na temperaturama koje se kreću od oko 2°C do oko 37°C. Nadalje, ti proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost u puferskim rastvorima na temperaturama koje se kreću od oko 2°C do oko 8°C. Ti proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost u puferskim rastvorima na temperaturama od oko 20°C. Ti proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost nakon ciklusa zamrzavanja i otapanja, ili rekonstitucije nakon liofilizacije. Ti proteini takođe mogu da imaju povećanu stabilnost u puferu za formulaciju leka. kao što je fiziološki rastvor.
[0022] Pogodni varijantni, rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze mogu da se okarakterišu time što zadržavaju veću kalalitičku aktivnost u odnosu na rekombinantni! P-glukocerebrozidazu divljeg tipa. Ovi proteini su zadržali više katalitičke aktivnosti u fiziološkim uslovima. i veća zadržana katalitička aktivnost može biti in vivo. Nadalje, ovi proteini takođe mogu da se okarakterišu time što su zadržali veću katalitičku aktivnost pri uslovima oko neutralnog pH i na oko 37°C. Ta veća zadržana katalitička aktivnost može da se prati pri uslovima oko neutralnog pH i na oko 37°C. u periodu od oko dva sata. Ovi proteini su zadržali više katalitičke aktivnosti u medijumu ćelijske kulture, i veća zadržana katalitička aktivnost može biti unutar ćelija. Nadalje, ovi proteini mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost u lizozomu. i u lizozomu uslovi mogu biti pH oko 5 i temperatura oko 37°C. Ovi proteini takođe mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost koja se karakteriše smanjenom proteolitičkom degradacijom i smanjena proteolitička degradacija može da se dešava u ćelijama. Nadalje, smanjena proteolitička degradacija može biti u lizozomu u ćelijama. Ti proteini takođe mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost pod uslovima koji nisu fiziološki, kao u puferskim rastvorima u toku prečišćavanja proteina. Ovi puferski rastvori mogu da imaju pH veći od oko 7 ili pH manji od oko 3 u toku prečišćavanja proteina. Ti puferski rastvori takođe mogu da sadrže organske rastvarače ili haotropne soli. Ti proteini takođe mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost na temperaturama koje se kreću od oko 2°C do oko 37°C. Nadalje, ti proteini takođe mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost na temperaturama koje se kreću od oko 2°C do oko 8°C. Takođe. ti proteini mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost na temperaturi oko 20°C. Ti proteini takođe mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost nakon ciklusa zamrzavanja i otapanja, ili rekonstitucije nakon liofilizacije. Ti proteini takođe mogu da imaju veću zadržanu katalitičku aktivnost u puferu za formulaciju leka. kao što je fiziološki rastvor.
[0023]Varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze mogu da imaju varijaciju ili varijacije aminokiselina: (1) F316A i L317F; ili (3) H145L: ili (4) H145F: ili (5) F316A. L317F i K321N; ili (6) K321A; ili (7) K321V; (8) F316A. L317F i K321A; ili (9) F316A.
L317F i
K321V; ili (10) H145L. F316A i L317F: ili (11) H145L i K321N: ili (12) H145L i K321 A: ili (13) H145L i K321V. Neki od tih proteina mogu se okarakterisati time što imaju sličnu ili povećanu ekspresiju proteina i sekreciju u medijum ćelijske kulture u odnosu na varijantne. rekombinantne proteine p-glukocerebrozidaze divljeg tipa u toku proizvodnje ćelijske kulture i proteina. Ovi proteini se takođe mogu okarakterisati time što imaju povećanu slabiInost u odnosu na rekombinantne proteine P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Nadalje, ovi proteini takođe mogu da se okarakterišu time što imaju povećanu stabilnost pri fiziološkim uslovima.
i ti uslovi su pH oko neutralnog, i temperatura od oko 37°C. Ovi proteini se takođe mogu okarakterisati time što zadržavaju veću katalitičku aktivnost u odnosu na rekombinantne proteine p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Katalitička aktivnost može da se meri nakon inkubacije pri uslovima oko neutralnog pH i na oko 37°C, u periodu od oko dva sata. Ovi proteini se takođe mogu okarakterisati time što zadržavaju veću katalitičku aktivnost u fiziološkim uslovima. Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijama aminokiselina F316A i L317F ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar dvostruko duže nego kod rekombinantne p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijom aminokiselina K321N ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar trostruko duže nego kod rekombinantne P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijom aminokiselina K321A ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar trostruko duže nego kod rekombinantne p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijom aminokiselina K321V ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar 1.4 puta duže nego kod rekombinantne P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijom aminokiselina Hl45L ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar 3 puta duže nego kod rekombinantne P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijom aminokiselina H145F ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar 2 puta duže nego kod rekombinantne p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijama aminokiselina F316A. L317F i K321N ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar 3 puta duže nego kod rekombinantne P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Varijantni. rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze sa varijacijama aminokiselina H145L. F316A i 1,317F ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar 2 puta duže nego kod rekombinantne P-glukocerebrozidazc divljeg tipa. Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijama aminokiselina H145L i K321N ima produženo prividno poluvreme eliminacije, koje je bar 3 puta duže nego kod rekombinantne p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. To produženo prividno poluvreme eliminacije može da se meri nakon inkubacije pri uslovima oko neutralnog pH i na temperaturi od oko 37°C. u periodu od oko dva sata.
PRIMER 1
Reagensi
[0024]Fluorogeni supstrat 4-metilumbeliferil-p-D-glukozida (4MUG) nabavljen je od kompanije Research Products International (Mt. Prospect, IL). DNA Gel Extraction i Miniprep DNA® kompleti su nabavljeni od kompanije QIAGEN S) (Valencia. C'A). PureYield Maxiprep DNA kit™ je nabavljen od kompanije Promega™ (Mađison. Wl). Ukoliko nije drugačije naglašeno, hemikalije su od kompanije Sigma™ <St. Louis, MO). Fugene-HD™ reagens za transfekciju je nabavljen od kompanije Roche™ (Indianapolis. IN). pEF6/V5-HisA™ ekspresioni vektor sisara. Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM). leta! bovine serum (fetalni goveđi serum. FBS) i drugi reagensi za kulturu tkiva su nabavljeni od kompanije Invitrogen™ (Carlsbad. CA). cDNK humane p-glukocerebrozidaze divljeg tipa (NM 000157.3) nabavljena je od kompanije Origene™ (Rockville. MD). Restrikcione enđonukleaze. Phusion-HF™ DNK polimeraza. T4 DNK ligaza. antarktik fosfataza (Antarctic phosphatase), hemijski kompetentne ćelije E. coli (DH5a ćelije) i endoglikozidaze PNGaseF i EndoH su nabavljene od kompanije New England Biolabs™ (Ipsvvich. MA). Humane embrionske ćelije bubrega (transformisane pomoću T-antigena; HEK293T) nabavljene su od kompanije ATCC™.
Testovi
|0025]Varijantni, rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze i varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze divljeg tipa testirani su putem tranzijentne ekspresije na humanoj ćelijskoj liniji (HEK293T) da bi se procenila ekspresija proteina. Reporterski sistem za ispitivanje katalitičke aktivnosti varijantnih. rekombinantnih proteina P-glukocerebrozidaze ili varijantnih, rekombinantnih proteina P-glukocerebrozidaze divljeg tipa bila je sposobnost za hidrolizu fluorogenog supstrata 4-MU-p-glukoze na pH oko 5.2 i na oko 37°C. Stabilnost ovih varijantnih. rekombinantnih proteina P-glukocerebrozidaze i prečišćenih varijantnih, rekombinantnih proteina p-glukocerebrozidaze divljeg tipa ispitana je praćenjem zadržavanja katalitičke aktivnosti svakog proteina nakon inkubacije na pH oko neutralnog i na oko 37°C tokom perioda od oko 3 sala. Uslovi ovih eksperimenata su osmišljeni tako da podsećaju na okolinu koja bi postojala u toku davanja intravenske infuzije proteina P-glukocerebrozidaze pacijentu, prilikom terapije zamene enzima.
[0026]Specifičnije, ali ni na koji način ne treba da se tumači kao ograničavajuće, ćelije HEK293T su zasejane u ploču za ćelijske kulture sa 12 bunarića. sa 1 ml DMEM medijuma uz dodatak 10% FBS, i inkubirane na 37°C u atmosferi sa 5%C02.Kada su HEK293T ćelije dostigle konfluentnost od 80-90%. potrošeni medijum je zamenjen dodatkom 1 ml svežeg medijuma DMEM/10% FBS, i svaki bunarić je transficiran dodatkom 1 ug plazmida DNK za individualne proteine p-glukocerebrozidaze ili PBS (za lažnu transficiranu negativnu kontrolu) i 3 u.I Fugene-HD transfekcionog reagensa. prema protokolu proizvođača. Transficirane ćelije su inkubirane u toku 24-72 sata, i svakodnevno proveravane na ekspresiju rekombinantnog proteina p-glukocerebrozidaze (izlučenog u medijum) putem ispitivanja enzimske aktivnosti.
|0027]Ekspresija proteina p-glukocerebrozidaze (i izlučivanje u medijum ćelijske kulture) procenjena je putem ispitivanja enzimske aktivnosti, uz primenu kondicioniranog medijuma iz eksperimenata tranzijentne transfekcije. nakon 24, 48 ili 72 h. i fluorogenog supstrata 4-metilumbeliferil-p-D-glukozida (4-MUG). Ukratko. 20 pl kondicioniranog medijuma iz svakog uzorka je prikupljano u određenim vremenskim intervalima, i razblaživano sa 80 u.1 Mcllvane pufera (MI pufer: 50 mmol/1 natrij um citrat/natrijum fosfat (pll 5,2)/0.25% (V/V) Triton X-100/0.25% (w/V) natrijum taurohoiat) u kivete za mikrocentrifugu od 0.5 ml. Dvadeset pet ul svakog razblaženog uzorka je preneto kao alikvot u pojedinačne bunariće crnih pločica sa providnim dnom i sa 96 bunarića (urađeno u triplikatu). i po 50 ul 6 mmol/1 4-MUG supstrata (pripremljenog u MI puferu) je dodato u svaki bunarić pomoću
višekanalnog pipetora. Pločice su zatim zapečaćene pokrivnom trakom i inkubirane na 37°C tokom 1 h. Enzimske reakcije su prekinute dodatkom 125\ i\0,1 mol/l NaOH. i fluorescencija oslobođenog 4-MU je očitana na čitaču fluorescentnih ploča na talasnoj dužini ekseitacije od 355 nm i emisionoj talasnoj dužini od 460 nm. Fluorescencija 4-MU iz lažno transficiranog uzorka je bila ..osnovna" kontrola, i oduzimala se od svih uzoraka proteina p-glukocerebrozidaze.
|0028]Da bi se procenila količina proteina P-glukocerebrozidaze. divljeg tipa i varijantnih. koji su prisutni u medijumu ćelijske kulture, kondicionirani medij umi ćelijske kulture iz eksperimenata tranzijentne transfekcije su podvrgnuti elektroforezi na natrijum dodecilsulfai poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE), i preneti na nitroceluloznu membranu pomoću standardnih postupaka. Membrana je zatim inkubiranasa puferom za blokiranju:4% ( w/v) nemasnog mleka u 50 mmol/1 fiziološkom rastvoru puferizovanom TRIS-om (pH 7.5) 0.1%
(v/v) Tween-20 (TBST). tokom 1 h na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Membrana je zatim inkubirana sa zečjim anti-humanim poliklonalnim primamim antitelima p-glukocerebrozidaze (uzgajenim prema peptidu sa 19 aminokiselina koji odgovara C-terminusu humane kisele p-glukocerebrozidaze; Sigma G-41 71) razblaženim 1:2500 upuferu za blokiranje.I h na sobnoj temperaturi ili preko noći na 4°C uz mućkanje. Blot je zatim
ispran TBST-om na sobnoj temperaturi uz mućkanje i bar tri promene pufera tokom 1 h. Blot je zatim inkubiran sa sekundarnim antitelom povezanim sa enzimom (npr. kozja anti-zečja antitela konjugovana sa peroksidazom iz rena) razblaženim 1:10.000 upuferu za blokiranje.1 h na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Blot je ispran TBST-om na sobnoj temperaturi uz mućkanje i bar tri promene pufera tokom 1 h. Blot je zatim inkubiran sa hemiluminescentnim supstratom (npr. Pierce's Supersignal West-Dura Extended Duraiion Substrate™) tokom 5 min na sobnoj temperaturi, i vizualizovan imidžing sistemom ili pomoću tlima, da bi se procenio stepen ekspresije proteina za enzime divljeg tipa i enzime varijantne kisele p-glukocerebrozidaze.
[0029] Da bi se procenila stabilnost proteina p-glukocerebrozidaze. tranzijentno eksprimirani varijantni, rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze i prečišćeni protein divljeg lipa rekombinantne p-glukocerebrozidaze (tj. Cerezvme™) inkubirani su u pH neutralnom puferu na 37°C, i ispitana je njihova enzimska aktivnost da bi se odredio obim gubitka katalitičke aktivnosti tokom perioda od oko tri sata. Ukratko. 60 u! kondicioniranog medijuma (koji je sadržao individualne varijantne, rekombinantne proteine p-glukocerebrozidaze) je prikupljeno nakon 24 ili 48 h nakon transfekcije. i dodato u 420 ul 0.1 mol/l kalij um fosfata (pH7.5)/0,2%(v/v) Triton X-l00/0,2% (vv/v) BSA u kivete za mikroeentrifugu od 0.5 ml. Slično tome. prečišćeni protein divljeg tipa rekombinantne p-glukocerebrozidaze je serijski razblažen do 1:12.500 u DMEM medij umu/10% FBS. i 60 ul ovog razblaženog uzorka proteina divljeg tipa rekombinantne P-glukocerebrozidaze je dodato u 420 ul 0.1 mol/l kalijum fosfata (pH 7.5)/0.2% (v/v) Triton X-100/0.2% (w/v) BSA. da bi se dobilo krajnje razblaženje od 1:100.000. (Ova količina proteina divljeg tipa rekombinantne p-glukocerebrozidaze određena je empirijski, tako da sadrži sličnu količinu enzimske aktivnosti kao tranzijentno eksprimirani rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze). Svi uzorci su inkubirani u vodenom kupatilu, na 37°C. i 70 ul svakog uzorka je uklonjeno u određenim vremenskim intervalima (0. 30. 60. 90, 120 ili 180 min) i prebačeno u nove kivete za mikroeentrifugu od 0,5 ml koje su sadržale 20 pl 0.5 mol/l NaOAc (pH 5.2). Uzorci su dobro promešani, i po 25 ul od svakog razblaženog uzorka je upotrebljeno da se izmeri rezidualna enzimska aktivnost rekombinantnih proteina p-glukocerebrozidaze (u triplikatu) na gore opisani način. Inicijalna enzimska aktivnost (u t = 0 min) označena je sa 100% za svaki rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze, dok su enzimske aktivnosti za sve naredne vremenske intervale normalizovane u odnosu na inicijalnu aktivnost, da bi se odredila rezidualna enzimska aktivnost tokom ukupnog vremenskog perioda. Podaci iz više eksperimenata (bar 2 nezavisna eksperimenta) su upotrebljeni da se dobiju prosečne vrednosti za rezidualnu aktivnost proteina rekombinantne P-glukocerebrozidaze za pojedinačne vremenske intervale, i predstavljeni su na dijagramu, u odnosu na vreme inkubacije, kao što je prikazano.
PRIMER 2
[0030|Ekspresija varijantnih, rekombinantnih proteina P-glukocerebrozidaze sa specifičnom supstitucijom aminokiselina upoređena je sa proteinom rekombinantne P-glukocerebrozidaze divljeg tipa (..GlcCeraza divljeg tipa'*) putem eksperimenata tranzijentne transfekcije koji su gore opisani (slika 1). Kao što se vidi na slici 1 A. varijantni. rekombinantni protein (3-glukocerebrozidaze sa varijacijama F316A i L317F (..GlcCeraza-F316A/I.3I7F"), varijantni. rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze sa varijacijom K321N (..GlcCeraza-K321 N"). varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa varijacijom H145L (..GlcCeraza-H145L"), varijantni. rekombinantni proteini P-glukocerebrozidaze sa varijacijama F316A. L317F i K321N (..GlcCeraza-F316A/L317F/K321N"). varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze sa varijacijama H145L i K321N (..GlcCeraza-F1145L/K321N") tranzijentno su eksprimirani sa divljim tipom GlcCeraze u HEK293T ćelijama. Kondicionirani medijum ćelijske kulture je prikupljen 48 h nakon transfekcije. i testiran na enzimsku aktivnost p-glukocerebrozidaze pomoću fluorogenog supstrata 4-metilumbeliferil-p-D-glukozida (4-MUG). da bi se procenio relativni stepen ekspresije ovih varijantnih enzima GlcCeraza u odnosu na divlji tip GlcCeraze. Ovi rezultati pokazuju da su različite varijante enzima GlcCeraza izražene isto tako dobro ili bolje od divljeg tipa GlcCeraze, što se vidi iz velike izmerene enzimske aktivnosti u medijumu ćelijske kulture. Druge varijante enzima GlcCeraze. uključujući GlcCerazu- HI45F, G!eCerazu-H145L/F316A/L317F/K321N. takođe su bolje eksprimirane od divljeg tipa GlcCeraze (podaci nisu prikazani). GlcCeraza-K321 A i GlcCeraza-H145F/F316A/L317F/K321N su eksprimirane na približno istom stupnju kao divlji tip GlcCeraze, dok je GlcCeraza-K321 V eksprimirana manje efikasno od divljeg tipa GlcCeraze (podaci nisu prikazani).
[0031 ]Količina proteina varijantne GlcCeraze i proteina divljeg tipa p-glukocerebroziđaze koja se nalazi u kondicioniranom medijumu ćelijske kulture procenjena je upotrebom tehnike Western blotting. kao sto je gore opisano. Kao što se vidi sa slike 1B, veće količine proteina GlcCeraze-F316A/L317F i GlcCeraze-K321N su prisutne u kondicioniranom medijumu ćelijske kulture u odnosu na divlji tip GlcCeraze. Ovi podaci dobijeni tehnikom Western blotting u saglasnosti su sa rezultatima enzimske aktivnosti GlcCeraze. i potvrđuju da se
pojedine varijante enzima GlcCeraze eksprimiraju i izlučuju bolje od divljeg tipa GlcCeraze. Slični rezultati su primećeni za drugu varijantu proteina GlcCeraze (podaci nisu prikazani).
PRIMER 3
|0032]Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa F316A i L317F varijacijama (,.GlcCeraza-F316A/L317F") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne P-glukocerebrozidaze (..GlcCeraza divljeg tipa") putem ispitivanja in vitro stabilnosti kao sto je gore opisano. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. Kao što se vidi na slici 1. GlcCeraza-F316A/L317F je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od dva ili tri sata. GlcCeraza-F316A/L317F je zadržala 85% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-F316A/L317F je zadržala 73% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-F316A/L317F je zadržala 50% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-F316A/L317F je zadržala 34% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
|0033]Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7,5 i oko 37°C, u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) za GlcCerazu-F316A/L317F iznosi oko 120 minuta« dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GIcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima. GlcCeraza-F3l6A/L317F je takođe ispitana na pH oko 8 i na oko 37°C. i pokazivala je sličan trend (slika 3). I GlcCeraza-F3 16A/L317F i GlcCeraza divljeg tipa su manje stabilne na pH oko 8 i na oko 37°C. ali ti rezultati potvrđuju da je GlcCeraza-F316A/L317F stabilnija na višem pFl od GlcCeraze divljeg tipa.
PRIMER 4:
|0034)Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa K321N varijacijom („GlcCeraza-K321N") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne P-glukocerebrozidaze („GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. Kao što se vidi na slici 2. GlcCeraza-K321N je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pFl oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCeraza-K321N je zadržala 104% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-K321N je zadržala 91% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-K321N je zadržala 76% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GleCeraza-K321N je zadržala 54% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
(0035)Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije napH oko 7.5 i oko 37°C, u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) za GlcCerazu-K321N iznosi oko 180 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
PRIMER 5
|0036|Varijantni, rekombinantni protein (3-glukocerebrozidaze sa H145L varijacijom (,.GlcCcraza-H145L") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne [3-glukocerebrozidaze („GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. Kao što se vidi na slici 2, GlcCeraza-H145L je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCeraza-H145L je zadržala 92% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145L je zadržala 87% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145L je zadržala 62% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-H 145L je zadržala 42% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
[0037|Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7,5 i oko 37°C, u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%)
za GlcCerazu-H145L iznosi oko 160 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
PRIMER 6
|0038]Varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa H145F varijacijom („GlcCeraza-H145F") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne p-glukocerebrozidaze (..GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. Kao što se vidi na slici 1. GlcCeraza-H145F je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCeraza-H145F je zadržala 94% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145F je zadržala 80% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-11145F je zadržala 37% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145F je zadržala 17% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
[0039]Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7.5 i oko 37°C. u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) za GlcCerazu-H145F iznosi oko 100 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
PRIMER 7
|0040jVarijantni. rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze sa F316A. L317F i K321N varijacijama (,.GlcCeraza-F3I6A/L317F/K321N") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne p-glukocerebrozidaze (..GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. Kao što se vidi na slici 2. GlcCeraza-F316A/L317F/K321N je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCeraza-F316A/L317F/K321N je zadržala 101% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-F316A/1 317F/K321N je zadržala 91% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-F316A/L3l7F/K321N je zadržala 75% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-F316A/L317F/K321N je
zadržala 52% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
[00411Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7.5 i oko 37°C. u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) za GlcCerazu-F316A/L317F/K32lN iznosi oko 180 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
PRIMER 8
[0042]Varijantni, rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze sa F1145L. F316A i L31 7F varijacijama (..GlcCeraza-H 145L/F316A/L317F") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne P-glukocerebrozidaze (..GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. GlcCeraza-H145L/F316A/L317F je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCcraza-I I145L/F316A/L317F je zadržala 77% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145L/F316A/L317Fje zadržala 80% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-Fl 145L/F316A/L317F je zadržala 56% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-11145L/F316A/L317F je zadržala 39% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
J0043]Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7,5 i oko 37°C. u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) zaGlcCerazu-FI145L/F316A/L317F iznosi oko 135 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
PRIMER 9
|0044]Varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa H145L i K321N varijacijama (..GlcCeraza-H145L/K321N") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne p-glukocerebrozidaze (..GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. Kao što se vidi na slici 2, GlcCeraza-H145L/K321N je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCeraza-H145I,/K321N je zadržala 89% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145L/K321N je zadržala 86% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145L/K321N je zadržala 76% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-H145L/K321N je zadržala 62% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubaci je. GlcCeraza di vljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon i 20 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inici jalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
[0045]Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7,5 i oko 37°C, u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) za GlcCerazu-H145L/K321N iznosi oko 180 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
PRIMER 10
[0046|Varijantni. rekombinantni protein fi-glukocerebroziđaze sa K321A varijacijom (..GlcCeraza-K321 A") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne p-glukocerebrozidaze („GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. Kao što se vidi na slici 2. GlcCeraza-K321A je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCeraza-K321A je zadržala 90% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza-K321 A je zadržala 89% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-K321A je zadržala 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-K321A je zadržala 49% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeg tipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60
minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
(0047)Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7,5 i oko 37°C. u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) za GlcCerazu-K.321 A iznosi oko 170 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
PRIMER 11
[0048]Varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze sa K321A varijacijom (,,GlcCeraza-K321 V") upoređen je sa prečišćenim proteinom divljeg tipa rekombinantne fi-gi ukocerebrozidaze („GlcCeraza divljeg tipa") putem gore opisanog ispitivanja. Uslovi primenjeni za varijantni i protein divljeg tipa bili su identični. GlcCeraza-K321 V je značajno stabilnija od GlcCeraze divljeg tipa na pH oko neutralnog i na oko 37°C u periodu od tri sata. GlcCeraza-K321 V je zadržala 74% svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GIcCeraza-K.321 V je zadržala 55% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza-K321 V je zadržala 29% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza-K.321 V je zadržala 15% svoje inicijalne aktivnosti nakon 1 80 minula inkubacije. U poređenju sa tim. GlcCeraza divljeglipa tretirana pod istim eksperimentalnim uslovima zadržala je 68?/o svoje inicijalne aktivnosti nakon 30 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 46% svoje inicijalne aktivnosti nakon 60 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 20% svoje inicijalne aktivnosti nakon 120 minuta inkubacije. GlcCeraza divljeg tipa je zadržala 8% svoje inicijalne aktivnosti nakon 180 minuta inkubacije.
[0049]Procenjeno poluvreme eliminacije (koje je u ovoj studiji definisano kao vreme inkubacije na pH oko 7,5 i oko 37°C, u kome je inicijalna enzimska aktivnost opala za 50%) za GtcCerazu-K.321 V iznosi oko 70 minuta, dok je procenjeno poluvreme eliminacije za GlcCerazu divljeg tipa oko 50 minuta pod ovim eksperimentalnim uslovima.
[0050)Gornji rezultati su zbirno predstavljeni u tabeli 1
[0051]Rezidualna aktivnost predstavlja količinu enzimske aktivnosti koja preostaje nakon tri sata inkubacije, i izražava se kao procenat inicijalne enzimske aktivnosti (za t=0) za svaki varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze u testu stabilnosti. Svaki rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze je ispitan u najmanje dva odvojena eksperimenta (označeno kao n u tabeli 1) da bi se odredila prosečna rezidualna aktivnost tokom perioda od tri sata, osim GlcCeraze- K321V i GlcCeraze-H 145L/F316A/L317F. koje su ispitane samo jednom. Poboljšanje (kao umnožak) se odnosi na prividno poluvreme eliminacije varijantnih. rekombinantnih proteina P-glukocerebrozidaze u odnosu na prečišćeni protein GlcCeraze divljeg tipa.
[0052|Varijantni, rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze koji ima varijaciju aminokiselina u položaju 145, 316, 317 ili 321, ili GlcCeraza-F316A/L317F. GlcCeraza-K321N, GlcCeraza-K321 A. GlcCeraza-K32l V. GlcCeraza-H145L. GlcCeraza-H 145F. ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321N ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321A ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321V ili GlcCeraza-H145L/F316A/L317F ili GlcCeraza-Hl45L/K32IN. koji može biti okarakterisan time što zadržava veću katalitičku aktivnost u odnosu na rekombinantnu p-glukocerebrozidazu divljeg tipa, može biti napravljen u ćelijama kvasca.
biljnim ćelijama, ćelijama sisara ili transgenih životinja, upotrebom tehnika molekularne biologije i prečišćavanja proteina koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti.
(0053|Smeša koja sadrži varijantni. rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze koji ima varijaciju aminokiseline u položaju 145. 316. 317 ili 321. ili GlcCeraza-F316A/L317F. GlcCeraza-K321N. GlcCeraza-K321A. GlcCeraza-K321 V. GlcCeraza-H 145L. GlcCeraza-H145F, ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321N ili GlcCeraza-F316A 1.317F/K321A ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321V ili GlcCeraza-H 1451. 1316A/L317F ili GlcCeraza-FI145L/K321N, i farmaceutski prihvatljiv nosač, može da se proizvede upotrebom farmaceutski prihvatljivih nosača koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
|0054|Smeša koja sadrži varijantni, rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze koji ima varijaciju aminokiselina u položaju 145, 316. 317 ili 321. ili GlcCeraza-F316A/L317F. GlcCeraza-K321N. GlcCeraza-K.321 A. GlcCeraza-K321V, GlcCeraza-H 145L. GlcCeraza-H145F, ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321N ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321A ili GlcCeraza-F316A/L317F/K321V ili GlcCeraz.a-H145L/F316A/L317F ili GlcCeraza-H145L/K321N. i farmaceutski prihvatljiv pufer, može da se proizvede upotrebom farmaceutski prihvatljivih pufera koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
PRIMER 12
[0055]Pošto je protein GlcCeraze stabilan na kiselom pH. i veoma efikasan u uklanjanju akumuliranog supstrata glukozilceramida u lizozomima. može da se razvije ERT stabilnijom GlcCerazom, koja bolje može da podnese neodgovarajuću sredinu (neutralni pH).2:adržavajući svoju katalitičku aktivnost, tako da se veća količina aktivnog leka isporučuje u lizozome radi bolje efikasnosti. Enzim GlcCeraza može da se stabilizuje na pl l oko neutralnog kada je vezan (i inhibiran) za aktivno mesto enzimskog inhibitora izofagomina
(IFG). Proteinska stabilnost za rekombinaninu GlcCerazu na pH oko neutralnog značajno je poboljšana sa IFG-om, što se vidi na osnovu povećanja temperature topljenja( Trn)i do 15°C. Pretpostavlja se da mehanizam dejstva stabilizacije GlcCeraze indukovane IFG-om proizlazi iz obimne mreže vodoničnih veza između IFG-a i šest ostataka na aktivnom mestu GlcCeraze, čime se sprečava odmotavanje aktivnog mesta i okolnih oblasti, i uspostavlja se stabilnija konformacija GlcCeraze. Održavanje pravilne strukture GlcCeraze na aktivnom rnestu i u okolnim oblastima pomaže katalitičkoj aktivnosti i ukupnoj stabilnosti GlcCeraze. Više različitih modifikacija GlcCeraze može da pomogne da se održi katalitička aktivnost i da se zadrži stabilnija proteinska struktura oko neutralnog pl I. Ovde je data konstrukcija
serije različitih enzima GlcCeraza. sa specifičnim supstitucijama aminokiselina na strateškim rnestima u strukturi petlje, u blizini aktivnog mesta. šio pomaže stvaranju sređenije oblasti u blizini aktivnog mesta. koje je manje sklono odmotavanju oko neutralnog pH. Osim toga. ovde su date modifikacije a-spirale u blizini aktivnog mesta. koje mogu da pomognu da se ova spirala i susedna petlja udalje od katalitičkog mesta. da bi se zadržala otvorena, aktivna kontbrmacija.
[0056]Primenjen je pristup za stvaranje serije modifikovanih enzima GlcCeraza. za koje je predviđeno da će imati bolju stabilnost proteina od GlcCeraze divljeg tipa. Prvenstveno su primenjene dve različite, ali komplementarne strategije: (1) modifikacija pojedinih petlji i spirala u blizini katalitičkog mesta, da bi se imitirale poželjne, aktivne konformacije GlcCeraze bez stvarne inhibicije enzima; i (2) modifikacije oblasti nasumične spirale, koje mogu da povećaju interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura, što doprinosi povećanoj stabilnosti proteina.
10057]U jednom primeru. nekoliko ostataka je modifikovano u oblasti petlje 1 (položaji 311-319). kako bi se formirala uređenija oblast u blizini aktivnog mesta. koja bi bila manje sklona odmotavanju oko neutralnog pH. Pokazalo se da je ova varijanta (GlcCeraza-F316A/L317F) sa modifikacijama u petlji 1 značajno stabilnija od GlcCeraze na pH oko 7.5 i na 37°C.
[0058]U drugom primeru. a-spirala u blizini aktivnog mesta (a6) modifikovana je da bi se stabilizovala ova spirala i da bi se susedna petlja (petljal) udaljila od katalitičkog mesta. kako bi se održala otvorena, aktivna konformacija. Tako su dobijeni modifikovani enzimi GlcCeraze, koji su sadržali supstituisanu aminokiselinu u položaju 321 da bi se zamenio naelektrisani ostatak lizina nenaelektrisanim ostatkom u spirali a6, kako bi se podržale hidrofobnije interakcije sa susednim u-spiralama i p-strukturama. u cilju stabilizacije proteina. Poravnavanje proteina je analizirano za enzime GlcCeraze različitih vrsta (tabela II), i zapaženo je da homolog GlcCeraze vrsteB. turn us(GlcCeraza bika: pristupni kod DAA31806.1) sadrži asparagin u položaju 321 ( ,:,Asn). To nagoveštava da lizin u položaju 321 (<J2l>Lys) može potencijalno biti zamenjen različitim ostatkom aminokiseline. bez uništavanja katalitičke aktivnosti GlcCeraze. GlcCeraza-K321N je zadržala oko 75% i 54% svoje prvobitne katalitičke aktivnosti na pH oko 7.5 i na 37°C, nakon 2, odnosno 3 h. Nasuprot tome, GlcCeraza divljeg tipa je pod istim uslovima zadržala samo 21%. odnosno 8% svoje inicijalne aktivnosti. Procenjeno poluvreme eliminacije GlcCeraze-K32lN bilo je oko 3,5 puta duže nego kod GlcCeraze divljeg tipa. Slično tome. GlcCeraza-K321A zadržala je oko 68% i 49% svoje prvobitne katalitičke aktivnosti na pH oko 7 i na 37°C. nakon 2 h, odnosno 3 h. Procenjeno poluvreme eliminacije GlcCeraze-K.321 A bilo je oko 3 puta duže nego kod GlcCeraze divljeg tipa. GlcCeraza-K.321 V je zadržala oko 29% i 15% svoje prvobitne katalitičke aktivnosti na pH oko 7 i na 37°C, nakon 2 h, odnosno 3 h. Procenjeno poluvreme eliminacije GlcCeraze-K321 V bilo je oko 1.4 puta duže nego kod GlcCeraze divljeg tipa. Podaci pokazuju da je uklanjanje pozitivno naelektrisanog lizinskog ostatka iz a6 spirale doprinelo da ova oblast bude uređenija. kako bi se ograničilo odmotavanje ove oblasti i postigla veća stabilnost proteina GlcCeraze.
[0059] U trećem primeru. oblast nasumične spirale je modi fi kovana između beta-ploče (|<5>2) i a-spirale (ot2), što može da olakša bolje interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura, kako bi se poboljšala stabilnost. Analiza poravnavanja proteina za enzime GlcCeraze različitih vrsta (tabela 2) pokazuje da je položaj 145 u ovoj nasumičnoj spirali divergentan kod različitih vrsta.B. taurushomolog iS. scrofa(svinja) sadrže leucin na ovom položaju, dok mišja GlcCeraza sadrži serin. Tako. supstituisali smo histidin u položaju 145 (l4:>His) ili sa Leu (H145L) ili sa Phe (H145F). da bismo odredili da li ove modifikacije poboljšavaju stabilnost GlcCeraze. Pokazalo se da je GlcCeraza-H145L. GlcCeraza stabilnija od divljeg tipa GlcCeraze. i zadržala je 62% svoje inicijalne aktivnosti nakon 2 li i 42% nakon 3 h. sa procenjenim poluvremenom eliminacije oko 3 puta dužim od poluvremena eliminacije divljeg tipa GlcCeraze (160 min prema 50 min). Slično tome. GlcCeraza H145F zadržala je oko 37% svoje inicijalne aktivnosti nakon 2 h i 17% nakon 3h, sa približno 2 puta dužim poluvremenom eliminacije od divljeg tipa GlcCeraze. Za sada se ne zna kako su ove modifikacije uticale na strukturu GlcCeraze. ali je moguće daje zamena delimično naelektrisanog ostatka ( l"bHis) hidrofobnim ostatkom leucina ili fenilalanina učinila ovu oblast uređenijom, što ograničava odmotavanje ove oblasti. Alternativno, ove modifikacije mogu da naprave krivinu i da povećaju interakcije između sekundarnih struktura (npr. beta-ploče P2 i spirale a2).
[0060]Podaci o poravnavanju proteina sabrani su u tabeli 2
[0061] Pogodni varijantni, rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline A i F u položajima 316 i 317 u oblasti petlje 1 proteina, pri čemu je jedna ili više zamenjenih aminokiselina okarakterisana time što ima konformaciju bočnog niza koja povećava uređenost u blizini aktivnog mesta proteina. Ovi proteini takođe imaju jednu ili više zamenjenih aminokiselina u oblasti petlje 1 proteina, pri čemu je jedna ili više zamenjenih aminokiselina okarakterisana time što povećava uređenost u blizini aktivnog mesta proteina, okarakterisanog time što je stabilniji u opsegu od oko pH 3 do oko pH 8 u poređenju sa rekombinantnim proteinom p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da imaju jednu ili više zamenjenih aminokiselina A i F u položajima 316 i 317 u oblasti petlje 1 proteina, pri čemu su zamenjene aminokiseline okarakterisane time što imaju konformaciju bočnog niza koja povećava uređenost u blizini aktivnog mesta proteina, okarakterisanog time sto je stabilniji u oblasti pH oko neutralnog u poređenju sa rekombinantnim proteinom P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da imaju jednu ili više zamenjenih aminokiselina A i F u položajima 316 i 317 u oblasti petlje 1 proteina, pri Čemu su zamenjene aminokiseline okarakterisane time što su manje sklone odmotavanju u opsegu od oko pH 3 do oko pH 8 u poređenju sa rekombinantnim proteinom p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline A i F u položajima 316 i 317 u oblasti petlje 1 proteina, pri čemu su zamenjene aminokiseline okarakterisane time što su manje sklone odmotavanju u oblasti pl1 oko neutralnog u poređenju sa rekombinantnim proteinom p-glukocerebrozidaze divljeg tipa.
[0062]Pogodni varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze takode mogu da imaju jednu ili više zamenjenih aminokiselina u a-spirali u blizini aktivnog mesta proteina (ct6), pri čemu jedna ili više zamenjenih aminokiselina imaju konformaciju bočnog niza koja stabilizuje ovu spiralu i odvlači susednu petlju 1 od katalitičkog mesta, i ima otvorenu i aktivnu konformaciju. Ovi proteini takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline A. V ili N u položaju 321 u a-spirali u blizini aktivnog mesta proteina (a6). pri Čemu su zamenjene aminokiseline okarakterisane time što imaju konformaciju bočnog niza koja stabilizuje ovu spiralu i odvlači susednu petlju 1 od katalitičkog mesta. i ima otvorenu i aktivnu konformaciju okarakterisanu time što je stabilnija u opsegu od pH 3 do pH 8 poređenju sa rekombinantnim proteinom p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da se okarakterišu time što imaju otvoreniju konformaciju na pH oko neutralnog u poređenju sa rekombinantnim proteinom p-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takode mogu da imaju zamenjene aminokiseline A i F u položajima 316 i 317 u oblasti petlje 1 proteina, pri čemu su zamenjene aminokiseline okarakterisane time što imaju otvoreniju konformaciju u opsegu od oko pH 3 do oko pH 8 u poređenju sa rekombinantnim proteinom P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline A i F u položajima 316 i 317 u oblasti petlje 1 proteina, pri čemu su zamenjene aminokiseline okarakterisane time što imaju otvoreniju konformaciju oko neutralnog pH u poređenju sa rekombinantnim proteinom p-glukocerebrozidaze divljeg tipa.
[0063]Pogodni varijantni. rekombinantni proteini P-glukocerebrozidaze takode mogu da imaju zamenjene aminokiseline L ili F u položaju 145 u oblasti nasumične spirale između beta-ploče (P2) i a-spirale (a2), pri čemu su bočni nizovi zamenjene aminokiseline okarakterisani time što imaju konformaciju bočnog niza koja olakšava bolje interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura u cilju poboljšavanja stabilnosti. Ovi proteini takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline L ili F u položaju 145 u oblasti nasumične spirale između beta-ploče (P2) i a-spirale (a2). pri čemu su bočni nizovi zamenjene aminokiseline okarakterisani time što imaju konformaciju bočnog niza koja olakšava bolje interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura u cilju poboljšavanja stabilnosti, okarakterisani time što su stabilniji u opsegu od pH oko 3 do pH oko 8 u poređenju sa rekombinantnim proteinom P-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline L ili F u položaju 145 u oblasti nasumične spirale između beta-ploče (p2) i a-spirale (a2). pri čemu su bočni nizovi2:amenjene aminokiseline okarakterisani time što imaju konformaciju bočnog niza koja olakšava bolje interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura u cilju poboljšavanja stabilnosti oko neutralnog pH u poređenju sa rekombinantnim proteinom [5-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline L ili F u položaju 145 u oblasti nasumične spirale između beta-ploče (j32) i u-spirale (a2). pri čemu su bočni nizovi zamenjene aminokiseline okarakterisani time što imaju konformaciju bočnog niza koja olakšava bolje interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura u cilju poboljšavanja stabilnosti u opsegu od pH oko 3 do pH oko 8 u poređenju sa rekombinantnim proteinomP-glukocerebrozidaze divljeg tipa. Ovi proteini takođe mogu da imaju zamenjene aminokiseline L ili F u položaju 145 u oblasti nasumične spirale između beta-ploče (p2) i a-spirale (a2), pri čemu su bočni nizovi zamenjene aminokiseline okarakterisani time što imaju konformaciju bočnog niza koja olakšava bolje interakcije između različitih ostataka i sekundarnih struktura u cilju poboljšavanja stabilnosti oko neutralnog pH u poređenju sa rekombinantnim proteinom P-glukocerebrozidaze divljeg tipa.
[0064]Postupci za lečenje lizozomalne bolesti taloženja takođe mogu đa uključe davanje pacijentima, kojima je to potrebno, varijantnog. rekombinantnog proteina p-glukocerebrozidaze koji ima mutaciju odabranu između: F316A i L317F;
FJ145L;
H145F: H145L. F316A i L317F;
K321A; i
K321V;
u odnosu na sekvencu aminokiselina ID BR. SEKV: 1.
|0065]Varijantni, rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze koji uključuju mutaciju izabranu od: F316A i L317F ili FI145L; mogu dodatno da uključe mutaciju izabranu od K321N. K321A i K32IV, naznačenu time što su mutacije relativne u odnosu na sekvencu aminokiselina ID
BR. SEKV: 1.
Postupci za lečenje lizozomalne bolesti taloženja takođe mogu da uključe postupke za tečenje Gošeove bolesti. Postupci za lečenje mogu biti intravenskom infuzijom, intramuskulamom injekcijom ili drugim putevima unošenja koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
J0066|Pogodna jedinjenja mogu da imaju varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze okarakterisan time što sadrži bilo koju od sledećih sekvenci aminokiselina: ID BR. SEKV: 2. ID BR. SEKV: 4. ID BR. SEKV: 5. ID BR. SEKV: 6, ID
BR. SEKV: 7, ID BR. SEKV: 8. ID BR. SEKV: 9. ID BR. SEKV: 10. ID BR. SEKV: 11. ID
BR. SEKV: 12. ID BR. SEKV: 13. ID BR. SEKV: 14.1D BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16. Pogodna jedinjenja mogu da imaju varijantni. rekombinantni protein |3-glukocerebrozidaze okarakterisan time što sadrži bilo koju od sledećih sekvenci aminokiselina: ID BR. SEKV: 2. ID BR. SEKV: 4. ID BR. SEKV: 5. ID BR. SEKV: 6, ID
BR. SEKV: 7. ID BR. SEKV: 8. ID BR. SEKV: 9. ID BR. SEKV: 10. ID BR. SEKV: 11. ID
BR. SEKV: 12. ID BR. SEKV: 13. ID BR. SEKV: 14, ID BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16.
[0067JPogodni varijantni, rekombinantni proteini P-glukocerebrozidaze takođe mogu biti okarakterisani time što su sposobni za povećanu ekspresiju u odnosu na divlji tip rekombinantne p-glukocerebrozidaze. Ekspresija varijantnog, rekombinantnog proteina (3-glukocerebrozidaze takode može biti povećana najmanje za 10% u odnosu na divlji tip rekombinantne P-glukocerebrozidaze. Ekspresija varijantnog, rekombinantnog proteina {}-glukocerebrozidaze takođe može biti povećana najmanje za 25% u odnosu na divlji tip rekombinantne p-glukocerebrozidaze. Ekspresija varijantnog. rekombinantnog proteina (3-glukocerebrozidaze takođe može biti povećana najmanje za 50% u odnosu na divlji tip rekombinantne p-glukocerebrozidaze. Ekspresija varijantnog, rekombinantnog proteina p-glukocerebrozidaze takođe može biti povećana najmanje za 80% u odnosu na divlji tip rekombinantne P-glukocerebrozidaze. Varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze takođe mogu da budu sposobni za ekspresiju u ćelijama sisara. transgenih životinja ili u ćelijama kvasca. Varijantni. rekombinantni proteini P-glukocerebrozidaze takođe mogu da se eksprimiraju kod ljudi. Varijantni. rekombinantni proteini p-glukocerebrozidaze takođe mogu da se eksprimiraju iz ubačenog gena.
PRIMER 13
(0068)Varijantni, rekombinantni proteini GlcCeraze i GlcCeraze divljeg tipa eksprimirani su u ćelijskoj kulturi prema ranije pomenutim postupcima, da bi se ocenila relativna ekspresija ovih varijantnih enzima GlcCeraze u odnosu na GlcCerazu divljeg tipa. Više različitih varijantnih enzima GlcCeraze je eksprimirano bolje od GlcCeraze divljeg tipa u eksperimentima tranzijentne transfekcije. mereno enzimskom aktivnošću iz kondicioniranog medijuma nakon oko 48 sati posle transfekcije (slika 1). GIcCeraza-F316A/L31 7A je eksprimirana bolje od divljeg tipa GlcCeraze (oko 282%), GlcCeraza-K.321 N je eksprimirana bolje od divljeg tipa GlcCeraze (oko 272%), GlcCeraza-H 145L je eksprimirana bolje od divljeg tipa GlcCeraze (oko 157%), GlcCeraza-F316A/L317A/K321N je eksprimirana bolje od divljeg tipa GlcCeraze (oko 272%). GlcCeraza-H 145L/K321N je eksprimirana bolje od divljeg tipa GlcCeraze (oko 317%). GlcCeraza-K321 A je eksprimirana ekvivalentno divljem tipu GlcCeraze. dok je GlcCeraza-K321 V eksprimirana na nižem stepenu od divljeg tipa (oko 61%) (podaci nisu prikazani).
|0069) Ovde su takođe dati postupci za pripremu jedinjenja koje sadrži varijantni. rekombinantni protein p-glukocerebrozidaze okarakterisan time što sadrži jednu od sledećih sekvenci aminokiselina: ID BR. SEKV: 2. ID BR. SEKV: 4. ID BR. SEKV: 5. ID BR.
SEKV: 6, ID BR. SEKV: 7. ID BR. SEKV: 8. ID BR. SEKV: 9. ID BR. SEKV: 10. ID BR.
SEKV: 11. ID BR. SEKV: 12, ID BR. SEKV: 13. ID BR. SEKV: 14. ID BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16. Ovde su takođe dati postupci za pripremu nukleinske kiseline za Šifrovanje varijantnog, rekombinantnog proteina P-glukocerebrozidaze okarakterisanog time što sadrži jednu od sledećih sekvenci aminokiselina: ID BR. SEKV: 2. ID BR. SEKV: 4. ID
BR. SEKV: 5. ID BR. SEKV: 6. ID BR. SEKV: 7. ID BR. SEKV: 8. ID BR. SEKV: 9. ID
BR. SEKV: 10. ID BR. SEKV: 11, ID BR. SEKV: 12. ID BR. SEKV: 13. ID BR. SEKV: 14. ID BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16.
PRIMER 14
Konstrukcija plazmida za enzime divljeg tipa i modifikovane GlcCeraze
|0070| DNK plazmidi za ekspresiju enzima divljeg tipa i modifikovane GlcCeraze generisani su uz pomoć oligonukleotidnih prajmera (navedenih u tabeli 3) ili minigena sintetičke DNK (<>>400 bp) koji kodiraju fragment GlcCeraze sa specifičnom supstitucijom aminokiselina. Svi prajmeri i minigeni sintetičke DNK (>400 bp) nabavljeni su od kompanije Integrated DNA Technologies™ (Coralville. IA). Humana GlcCeraza divljeg tipa (označena kao pHDlOl) konstruisana je generisanjem cDNK GlcCeraze putem PCR tehnike i ligiranjem u ekspresioni vektor si sara. Ukratko, celokupna cDNK humane GlcCeraze divljeg tipa umnožena je sa svojom prirodnom Kozakovom sekvencom i zaustavnim kodonom. upotrebom prajmera A i B matrice DNK humanog klona cDNK GlcCeraze (Origene™) u dvema identičnim reakcijama sa 50 ul. pomoću Phusion-HF high-fiđelitv DNA polvmerase™ (NEB™) i 200 pmol/1 dNTP. Prajmer A je konstruisan tako da sadrži 5" Bglll i interno restrikciono mesto EcoRl, koje je neposredno prethodilo Kozakovoj sekvenci, dok je prajmer B sadržao
restrikciona mesta 3<*>Nhel i Noti. koja su se nalazila iza zaustavnog kodona, kako bi se omogućilo kloniranje PCR proizvoda u ekspresioni vektor. PCR reakcije su spojene, i rezultujuća količina od -1.6 kilobaza (kb) PCR proizvoda je razdvojena i isečena sa preparativnog gela sa 1% agaroze (w/v). a zatim izolovana pomoću QIAGEN's™ kompleta za ekstrakciju gena. PCR proizvod je zatim đigestiran preko noći sa restrikcionim endonukleazama Bglll i Noti na 37°C. i ponovo prečišćen pomoću QIAGEN*s™ PCR kompleta za čišćenje, prema uputstvu proizvođača. Ekspresioni vektor sisara pEF6/V5-HisA™ je đigestiran sa BamHI i Noti. defosforilovan pomoću antarktik fosfataze (Antarctic phosphatase™) i izolovan pomoću QlAGEN*s™ PCR kompleta za čišćenje. PCR proizvod đigestiran sa Bgl II-NotI (2 u!) vezan je u BamHl-NotI pEF6/V5-HisA™ vektor (1 ul) pomoću T4 DNA ligaze (NEB™). prema uputstvu proizvođača. Hemijski kompetentne ćelijeE. col isu transformisane sa 1 ul iz reakcije vezivanja i zasejane na Luria-Bertani (EB) agar ploče koje su sadržale 100 ug/ml ampicilina. i inkubirane preko noći na 37°C. da bi se formirale odvojene bakterijske kolonije koje su transformisane plazmidom DNK koji je sadržao gen (3-laktamaze, da bi se prenela rezistentnost na ampicilin. Individualne bakterijske kolonije rezistentne na ampicilin su sakupljene i ekspandirane u 4 ml LB bujona (koji je sadržao 100 pg/ml ampicilina) preko noći na 37°C. i narednog dana je izolovana plazmidna DNK pomoću Miniprep™ (OJAGEN™). prema uputstvu proizvođača. Izolovane plazmidne DNK su ispitane pomoću dve različite reakcije restrikcione digestije, primenom EcoRI i Nhel. odnosno BamHI. Izabrana je pravilna plazmidna DNK iz klona 4 (oznaka pHD101.4). i upotrebljena za ponovnu transformaciju kompetentnih ćelijaE. coli,kao što je gore opisano za visok stepen replikacije plazmidne DNK. Zatim je izdvojena kolonija sa LB agar-ampicilinske ploče, i uzgojena u 200 ml LB bujona preko noći na 37°C. a plazmid pHDI01.4 je izolovan pomoću Maxiprep™ (Promega™). Plazmid pHD101.4 (koji kodira cDNK humane GlcCeraze divljeg tipa) proveren je sekvenciranjem DNK. i upotrebljen za konstrukciju drugih enzima GlcCeraza. kao i za eksperimente tranzijentne transfekcije.
[0071JBglll restrikciono mesto je inkorporirano u prajmer 1. tako da je vezivanje PCR proizvoda Bglll-digestirane GlcCeraze za kompatibilno BamHI mesto pEF6/V5-HisA™ vektora eliminisalo BamHI restrikciono mesto u okviru višestrukog mesta za kloniranje, i ovaj modifikovani ekspresioni vektor će se nadalje nazivati pEF6\ Eliminacija ovog BamHI mesta u sastavu pEF6/V5-HisA™ bila je neophodna da bi jedinstveno BamHI mesto u cDNK GlcCeraze moglo da se upotrebi za ubacivanje fragmenata DNK sa specifičnom supstitucijom nukleotida, kako bi se dobili modifikovani enzimi GlcCeraze.
[0072JDa bi se generisala GlcCeraza-F316A/L317F (označena kao pHD105), minigen GlcCeraze koji sadrži ove supstitucije aminokiselina sintetisan je od strane Integrated DNA Technologies™, između prirodnog bočnog 5' BsrGl i 3" BamHI rcstrikcionog mesta. DNK fragment sintetički modifikovane GlcCeraze (-0.5 kb) oslobođenje iz pIDTSMART™ plazmida pomoću BsrGI i BamHI restrikcione digestije. a zatim izolovan na preparativnom gelu sa 1% agaroze, i povezan u okvir( in- frame)pHDlOl .4 koji je prethodno đigestiran sa BsrGI i BamHI i defosforilovan. Jedan mikrolitar iz ove reakcije vezivanja je upotrebljen za transformaciju kompetentnih ćelijaE. coli. iuzorak je obrađen kao sto je gore opisano za pHDlOl. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 5 (označen kao pHD105.5). proveren je sekvenciranjem DNK i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
[0073]Da bi se dobila GlcCeraza-K321N (označena sa pHD109). supstitucija aminokiseline je uvedena pomoću PCR preklapanja. Ukratko. N-terminalni fragment (~1.1 kb) je dobijen pomoću prajmera A i D. i pHD10l.4 kao matrice DNK u PCR reakciji 1. dok je C-terminalni fragment (-0.5 kb) dobijen pomoću prajmera B i C, i pHDl 01.4 matrice u PCR reakciji 2. Ukupna cDNK K321N GlcCeraze je zatim sintetisana u PCR reakciji 3. dodatkom 1 ul iz PCR reakcije A i B, i prajmera 1 i 2. Rezultujući PCR proizvod 3 (~1.6 kb) izolovan je iz preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 3 je ponovo prečišćen, vezan za EcoRI/Notl-đigestirani i defosforilovani pEF6"vektor, i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 3 (označen sa pHDl09.3). proveren je sekvenciranjem DNK i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
[0074]Da bi se dobila GlcCeraza-H 145L (označena sa pHDl 10). supstitucija aminokiseline je uvedena pomoću PCR preklapanja. Ukratko. N-terminalni fragment (~0.55 kb) je dobijen pomoću prajmera A i F. i pFIDlOl .4 matrice DNK u PCR reakciji 4. dok je C-terminalni fragment (~1 kb) dobijen pomoću prajmera B i E. i pHD101.4 matrice u PCR reakciji 5. Ukupna cDNK H145L GlcCeraze je dobijena u PCR reakciji 6, dodatkom 1 ul iz PCR reakcija 4 i 5, i prajmera A i B. Rezultujući PCR proizvod 6 (~1.6 kb) izolovan je iz preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukieazama. PCR proizvod 6 je ponovo prečišćen, vezan za EcoRl/Notl-digestirani i defosforilovani pEF64 vektor, i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 2 (označen sa pHDl 10.2). proveren je sekvenciranjem DNK i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
|0075]Da bi se dobila GlcCeraza-H 145F (označena sa pHDl 11). supstitucija aminokiseline je uvedena pomoću PCR preklapanja. Ukratko. N-terminalni fragment (~0.55 kb) je dobijen pomoću prajmera A i FI. i pFIDl 01.4 matrice DNK u PCR reakciji 7. dok je C-terminalni fragment (~1 kb) dobijen pomoću prajmera B i G. i pFIDl 01.4 matrice u PCR reakciji 8. Ukupna cDNK FI145L GlcCeraze je dobijena u PCR reakciji 9. dodatkom 1 ul iz PCR reakcija 7 i 8, i prajmera A i B. Rezultujući PCR proizvod 9 (- 1.6 kb) izolovan je iz preparativnog 1% agaroza gela kao pre, i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 9 je ponovo prečišćen, vezan za EcoRl/Notl-digestirani i defosforilovani pEF6'vektor, i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 1 (označen sa pHDl 11.1). proveren je sekvenciranjem DNK i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
|0076|Da bi se dobila GlcCeraza-F316A/L317F/K321N (označena sa pHD 112). supstitucija aminokiseline je uvedena u pHD 105.5 pomoću PCR preklapanja. N-terminalni fragment (-1.1 kb) je dobijen pomoću prajmera A i D. i pHDl05.5 matrice DNK u PCR reakciji 10. dok je C-terminalni fragment (-0,5 kb) dobijen pomoću prajmera B i C, i pFID 105.5 matrice u PCR reakciji 11. Ukupna cDNK F316A/L317F/K321N GlcCeraze je dobijena u PCR reakciji 12. dodatkom 1 ul iz PCR reakcija 10 i 11, i prajmera A i B. Rezultujući PCR proizvod 12 (~1,6 kb) izolovan je iz preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti
restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 12 je ponovo prečišćen i vezan za EcoRI/Notl-digestirani i defosforilovani pEF6"vektor na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 7 (označen sa pHDl 12.7), proveren je sekvenciranjem DNK i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
|0077]Da bi se dobila GlcCeraza-H 145L/F316A/L317F (označena sa pHDl 13). supstitucija aminokiseline je uvedena u pHD105.5 pomoću PCR preklapanja. N-terminalni fragment (-0,55 kb) je dobijen pomoću prajmera A i F, i pHD 105.5 matrice DNK u PCR reakciji 13. dok
je C-terminalni fragment (-1 kb) dobijen pomoću prajmera B i E. i pHD105.5 matrice u PCR reakciji 14. Ukupna cDNK Hl 45L/F316A/L317F GlcCeraze je dobijena u PCR reakciji 15. dodatkom 1 ul iz PCR reakcija 13 i 14. i prajmera A i B. Rezultujući PCR proizvod 15 (- 1.6 kb) izolovan je iz preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 15 je ponovo prečišćen i vezan za EcoRI/Notl-digestirani i defosforilovani pEF6'vektor na gore opisani način.
(00781Da bi se dobila GlcCeraza-H 145F/F316A/L317F (označena sa pHDl 14). supstitucija aminokiseline je uvedena u pHD105.5 pomoću PCR preklapanja. N-terminalni fragment (-0.55 kb) je dobijen pomoću prajmera A i H. i pHD105.5 matrice DNK u PCR reakciji 16. dok je C-terminalni fragment (-1 kb) dobijen pomoću prajmera B i G. i pHD105.5 matrice u PCR reakciji 17. Ukupna cDNK H145F/F316A/L317F GlcCeraze je dobijena u PCR reakciji 18. dodatkom 1 pl iz PCR reakcija 16 i 17, i prajmera A i B. Rezultujući PCR proizvod 18 (- 1.6 kb) izolovan je iz preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 18 je ponovo prečišćen i vezan za EcoRI/Notl-digestirani i defosforilovani pEF6'vektor na gore opisani način.
[0079]Da bi se dobila GlcCeraza-H 145L/K321N (označena sa pHDl 15). i pHD 109.3 i pHDl 10.2 su digestirani sa BsrGI i BamHI restrikcionim enzimima, a fragmenti - 0.5 kb od pHDl09.3 i ~ 6,9 kb od pHDl 10.2 (nakon tretiranja antarktik fosfatazom - Antarctic phosphatase) su izolovani pomoću preparativnog 1% agaroza gela. Fragment pFID 109.3 od -0.5 kb (koji sadrži K321N supstituciju aminokiseline) je zatim vezan u okvir plazmida pHDl 10.2 (sadrži H145L modifikaciju) i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 5, proveren je sekvenciranjem DNK i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
|0080|Da bi se dobila GlcCeraza-H 145L/F316A/L317F/K321N (označena sa pHD 116). i pHDl 12.7 i pHDl 10.2 će biti digestirani sa BsrGI i BamHI restrikcionim enzimima, i fragmenti ~ 0,5 kb od pHDl 12.7 i - 6.9 kb od pHDl 10. 2 (nakon tretiranja antarktik fosfatazom - Antarctic phosphatase™) su izolovani pomoću preparativnog 1% agaroza gela. Fragment pHDl 12.7 od -0.5 kb (koji sadrži F316A/L31 7F/K321N supstitucije aminokiseline) će biti vezan u okvir plazmida pHDl 10.2 (sadrži 111451 modifikaciji.) i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK će biti izolovana iz pojedinačnih klonova. i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. da bi se idenlifikovaoIransformisani
bakterijski soj sa ispravnom cDNKGlcCeraze-H 145L/F316A/L317F/K321 A.Izabrani DNK konstrukt će biti proveren sekvenciranjem DNK. i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
(00811Da bi se dobila GlcCeraza-K321 A (označena sa pIIDl 17). supstitucija aminokiseline je uvedena pomoću PCR preklapanja. Ukratko, N-terminalni fragment (- 1.1 kb) je dobijen pomoću prajmera A i J, i pHD101.4 kao matrice DNK u PCR reakciji 19. dok je C-terminalni fragment (-0.5 kb) dobijen pomoću prajmera B i I. i pHDlOl .4 matrice u PCR reakciji 20. PCR proizvodi 19 i 20 su izolovani pomoću preparativnog 1% agaroza gela. i upotrebljeni kao matrica DNK za sintezu ukupnog fragmenta cDNK K321A GlcCeraze u PCR reakciji 21. uz prajmere A i B. Rezultujući PCR proizvod 21 {- 1,6 kb) izolovan je sa preparativnog 1% agaroza gela kao pre, i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 21 je ponovo prečišćen, vezan za EcoRI/Notl-digestirani i defosforilovani pEF6'vektor, i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova. i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 1 (označen sa pHDl 17.1) i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
(0082]Da bi se dobila GlcCeraza-K321 V (označena sa pHDl 18), supstitucija aminokiseline je uvedena pomoću PCR preklapanja. Ukratko. N-terminalni fragment (~1.1 kb) je dobijen pomoću prajmera A i L, i pHDlOl .4 kao matrice DNK u PCR reakciji 22. dok je C-terminalni fragment (-0,5 kb) dobijen pomoću prajmera B i K. i pHDl01.4 matrice u PCR reakciji 23. PCR proizvodi 22 i 23 su izolovani pomoću preparativnog 1% agaroza gela. i upotrebljeni kao matrica DNK za sintezu ukupnog fragmenta cDNK K321A GlcCeraze u PCR reakciji 24, uz prajmere A i B. Rezultujući PCR proizvod 24 (~1.6 kb) izolovan je sa preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 24 je ponovo prečišćen, vezan za EcoRI/Notl-digestirani i defosforilovani pEF6~vektor, i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova. i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. Izabran je klon 7 (označen sa pHDl 18.7) i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
|0083|Da bi se dobila GlcCeraza-F316A/L317F/K321A (označena sa pHDl 19). supstitucija aminokiseline je uvedena u pHD105.5 pomoću PCR preklapanja. N-terminalni fragment (~1.1 kb) će biti dobijen pomoću prajmera A i .1. i pHD105.5 matrice DNK u PCR reakciji 25. dok će C-terminalni fragment (-0,5 kb) biti dobijen pomoću prajmera B i I, i pHD 105.5 matrice u PCR reakciji 26. PCR proizvodi 25 i 26 će biti izolovani pomoću preparativnog 1%
agaroza gela, i upotrebljeni kao matrica DNK za sintezu ukupnog fragmenta cDNK GlcCeraze F316A/L317F/K321A/K321A u PCR reakciji 27. uz prajmere A i B. Rezultujući PCR proizvod 27 (- 1.6 kb) će biti izolovan sa preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 27 će biti ponovo prečišćen i vezan za EcoRI/Notl-digestirani i defosforilovani pEF6' vektor na gore opisani način. Miniprep DNK će biti izolovana iz pojedinačnih klonova. i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. da bi se identifikovao transformisani bakterijski soj sa ispravnom cDNK GlcCeraze-F316A/L317F/K321A. Izabrani DNK konstrukt će biti proveren sekvenciranjem DNK, i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
[0084]Da bi se dobila GIcCeraza-F316A/L317I7K321 V (označena sa pHD120). supstitucija aminokiseline će biti uvedena u pHD105.5 pomoću PCR preklapanja. N-terminaini fragment (-1,1 kb) će biti dobijen pomoću prajmera A i L. i pHD105.5 matrice DNK u PCR reakciji
28, dok će C-terminalni fragment (-0.5 kb) biti dobijen pomoću prajmera B i K, i pHD105.5 matrice u PCR reakciji 29. PCR proizvodi 28 i 29 će biti izolovani pomoću preparativnog 1 % agaroza gela, i upotrebljeni kao matrica DNK za sintezu ukupnog fragmenta cDNK GlcCeraze F316A/L317F/K321A/K321V u PCR reakciji 30. uz prajmere A i B. Rezultujući PCR proizvod 30 (~1,6 kb) će biti izolovan sa preparativnog 1% agaroza gela kao pre. i đigestiran sa EcoRI i Noti restrikcionim endonukleazama. PCR proizvod 30 će biti ponovo prečišćen i vezan za EcoRI/Notl-digestirani i defosforilovani pET6"vektor na gore opisani način. Miniprep DNK će biti izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal, da bi se identifikovao transformisani bakterijski soj sa ispravnom cDNK GlcCeraze-F316A/L317F/K321 V. Izabrani DNK konstrukt će biti proveren sekvenciranjem DNK. i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
[0085[Da bi se dobila GlcCeraza-H145L/K321 A (označena sa pHD121), i pHDl 17.1 i pHDl 10.2 će biti digestirani sa BsrGI i BamFII restrikcionim enzimima, i fragmenti - 0.5 kb od pHDl 17.1 i - 6.9 kb od pHDl 10.2 (nakon tretiranja antarktik fosfatazom - Antarctic phosphatase™) biće izolovani pomoću preparativnog 1% agaroza gela. Fragment pFIDl 17.1 od -0,5 kb (koji sadrži K321A supstituciju aminokiseline) biće vezan u okvir plazmida pHDl 10.2 (sadrži H145L modifikaciju) i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova, i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal, da bi se identifikovao transformisani bakterijski soj sa ispravnom cDNK GlcCeraze-
H145L/K321A. Izabrani DNK konstrukt će biti proveren sekvenciranjem DNK. i upotrebljen za dalju karakterizaciju.
|0086] Da bi se dobila GicCeraza-I II45L/K321V (označena sa pHD122}. ipHDl 1 8.7 i pHD l 10.2 će biti digestirani sa BsrGI i BamHI restrikcionim enzimima, i fragmenti - 0.5 kb od pHDl 18.7 i~6,9 kb od pHDl 10.2 (nakon tretiranja antarktik fosfatazom - Antarctic phosphatase) biće izolovani pomoću preparativnog 1% agaroza gela. Fragment pHDl 18.7 od
-0,5 kb (koji sadrži K321V supstituciju aminokiseline) biće vezan u okvir plazmida pHDl 10.2 (sadrži FI145L modifikaciju) i obrađen na gore opisani način. Miniprep DNK je izolovana iz pojedinačnih klonova. i ispitana restrikcionom digestijom sa EcoRI i Xbal. da bi se identifikovao transformisani bakterijski soj sa ispravnom cDNK GlcCeraze-HI45L/K321V. Izabrani DNK konstrukt će biti proveren sekvenciranjem DNK. i upotrebljen za dalju karakterizaciju.]0087|U tabeli 3 sabrane su gore pomenute sekvence prajmera za konstrukciju modifikovanih enzima GlcCeraza.
[0088] Iako je predmetni pronalazak opisan u vezi sa posebnim otelotvorenjem. stručnjacima u ovoj oblasti su očigledne mnoge druge varijacije i modifikacije. Poželjno je stoga da predmetni pronalazak ne bude opisan ovde navedenim predlozima. nego samo priloženim patentnim zahtevima.

Claims (15)

1. Varijantni, rekombinantni protein humane fi-glukocerebrozidaze koji ima mutaciju izabranu od: F316A i L317F: H145L; H145F: H145L. F316Ai L317F: K321A; i K321V: u odnosu na sekvencu aminokiselina ID BR. SEKV: I.
2. Varijantni, rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži mutaciju F316A i L3I7F; ili H145L: i nadalje uključuje mutaciju izabranu od K321N, K321A i K321V, naznačenu time što su mutacije relativne u odnosu na sekvencu aminokiselina ID BR. SEKV: 1.
3. Varijantni. rekombinantni protein humane fi-glukocerebrozidaze prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2. koji ima sekvencu aminokiselina ID BR. SEKV: 2 ili bilo koju od brojeva ID BR. SEKV. 4 do 16.
4. Varijantni, rekombinantni protein humane (i-glukocerebroziđaze prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 3. okarakterisan time što ima povećanu relativnu stabilnost u odnosu na rekombinantnu (3-glukocerebrozidazu divljeg tipa.
3. Varijantni. rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze prema patentnom zahtevu<z->. naznačen time Što je povećana stabilnost pod fiziološkim uslovima.
6. Varijantni, rekombinantni protein humane fi-glukocerebrozidaze prema patentnom zahtevu<z->, naznačen time sto je povećana stabilnost na neutralnom pH i na 37°C.
7. Varijantni, rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 3. okarakterisan time što ima produženo prividno poluvreme eliminacije, bar 2 puta duže u odnosu na rekombinantnu p-glukocerebrozidazu divljeg tipa.
8. Varijantni, rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što je produženo prividno poluvreme eliminacije mereno nakon inkubacije na neutralnom pH i na 37°C u periodu od 3 sata.
9. Varijantni. rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 3, okarakterisan time što zadržava povećanu katalitičku aktivnost u odnosu na rekombinantnu p-glukocerebrozidazu divljeg tipa.
10. Varijantni, rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze prema patentnom zahtevu 9, naznačen time sto je povećana katalitička aktivnost merena nakon inkubacije na neutralnom pH i na 37°C u periodu od 3 sata.
11. Varijantni. rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je povećana katalitička aktivnost zadržana pod fiziološkim uslovima.
12. Smeša koja sadrži varijantni, rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.
13. Smeša koja sadrži varijantni. rekombinantni protein humane P-glukocerebrozidaze iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 11 i farmaceutski prihvatljiv pufer.
14. Varijantni, rekombinantni protein P-glukocerebrozidaze iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 11. za primenu u lečenju lizozomalne bolesti taloženja.
15. Varijantni, rekombinantni protein humane p-glukocerebrozidaze za upotrebu prema patentnom zahtevu 14. naznačen time što je lizozomalna bolest taloženja Gošeova bolest.
RS20161010A 2010-11-08 2011-11-08 Varijantni, rekombinantni proteini beta-glukocerebrozidaze sa povećanom stabilnošću i povećanom zadržanom katalitičkom aktivnošću RS55405B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41133110P 2010-11-08 2010-11-08
US41218010P 2010-11-10 2010-11-10
EP11839428.7A EP2638152B1 (en) 2010-11-08 2011-11-08 Variant, recombinant beta-glucocerebrosidase proteins with increased stability and increased retained catalytic activity
PCT/US2011/059731 WO2012064709A2 (en) 2010-11-08 2011-11-08 Variant, recombinant beta-glucocerebrosidase proteins with increased stability and increased retained catalytic activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55405B1 true RS55405B1 (sr) 2017-04-28

Family

ID=46051505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20161010A RS55405B1 (sr) 2010-11-08 2011-11-08 Varijantni, rekombinantni proteini beta-glukocerebrozidaze sa povećanom stabilnošću i povećanom zadržanom katalitičkom aktivnošću

Country Status (19)

Country Link
US (4) US8962564B2 (sr)
EP (2) EP3144386B1 (sr)
JP (2) JP6073796B2 (sr)
KR (1) KR101901467B1 (sr)
CN (2) CN105296447A (sr)
BR (1) BR112013011152A2 (sr)
CA (1) CA2817011C (sr)
CY (1) CY1118843T1 (sr)
DK (1) DK2638152T3 (sr)
ES (2) ES2604490T3 (sr)
HR (1) HRP20161560T1 (sr)
HU (1) HUE030932T2 (sr)
LT (1) LT2638152T (sr)
PL (1) PL2638152T3 (sr)
PT (1) PT2638152T (sr)
RS (1) RS55405B1 (sr)
SI (1) SI2638152T1 (sr)
SM (1) SMT201600431B (sr)
WO (1) WO2012064709A2 (sr)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020157248A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Oxyrane Uk Ltd Glucocerebrosidase polypeptides
JP7600124B2 (ja) 2019-02-04 2024-12-16 フリーライン セラピューティクス リミテッド ポリヌクレオチド
US20220325265A1 (en) 2019-09-09 2022-10-13 Hoffmann-La Roche Inc. Glucocerebrosidase mutants
JP7830343B2 (ja) * 2020-03-29 2026-03-16 イエダ・リサーチ・アンド・デベロツプメント・カンパニー・リミテツド ゴーシェ病の処置において使用するためのベータ－グルコセレブロシダーゼのバリアント
EP4643868A2 (en) * 2020-07-29 2025-11-05 Spur Therapeutics Limited Mutated beta-glucocerebrosidase with improved stability
US20250145979A1 (en) * 2022-01-31 2025-05-08 Nippon Shokubai Co., Ltd. Protein having glucocerebrosidase activity and method for producing same
JPWO2023145812A1 (sr) * 2022-01-31 2023-08-03
US20250129351A1 (en) * 2022-01-31 2025-04-24 Nippon Shokubai Co., Ltd. Recombinant glucocerebrosidase protein having improved enzyme activity or improved stability
JP2025514645A (ja) 2022-04-12 2025-05-09 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 中枢神経系に対して標的化された融合タンパク質
EP4599052A4 (en) * 2022-10-08 2026-03-04 Lingyi Biotech Co Ltd POLYNUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH GCASE DEFICIENCY
TW202532096A (zh) * 2023-12-08 2025-08-16 美商戴納立製藥公司 經修飾之葡萄糖腦苷脂酶多肽及其使用方法
WO2026006173A1 (en) * 2024-06-24 2026-01-02 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising modified glucocerebrosidase polypeptides and methods thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03503721A (ja) * 1988-12-23 1991-08-22 ジェンザイム　コーポレイション 酵素的に活性な組換えグルコセレブロシダーゼ
ATE138686T1 (de) 1988-12-23 1996-06-15 Genzyme Corp Cho-zellen befähigt enzymatisch aktive rekombinante-glukocerebrosidase zu produzieren
JP2002511851A (ja) * 1997-04-30 2002-04-16 リージェンツ オブ ジ ユニバーシティー オブ ミネソタ 肝細胞の遺伝的病変を修正するためのリコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基のｉｎ ｖｉｖｏでの使用
US6524613B1 (en) 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
JP2002522509A (ja) * 1997-10-29 2002-07-23 ジェンザイム・コーポレイション リソソーム貯蔵疾患治療組成物および方法
US6328958B1 (en) 1998-08-28 2001-12-11 Duke University Deleted adenovirus vectors and methods of making and administering the same
AU2352201A (en) * 1999-12-30 2001-07-16 Maxygen Aps Improved lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
US20020127219A1 (en) * 1999-12-30 2002-09-12 Okkels Jens Sigurd Lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
EP1272620A2 (en) 2000-04-06 2003-01-08 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Expression system for efficiently producing clinically effective glucocerebrosidase
JP2004504016A (ja) * 2000-06-30 2004-02-12 マキシゲン・エイピーエス ペプチド拡張されたグリコシル化ポリペプチド
EP1613264A4 (en) 2003-04-16 2007-08-15 Yeda Res & Dev MEDICAMENT FOR THE TREATMENT OF GAUCHER DISEASE AND METHOD FOR IDENTIFYING IT
US20050265988A1 (en) 2004-03-18 2005-12-01 Byung-Kwon Choi Glycosylated glucocerebrosidase expression in fungal hosts
JP2010525084A (ja) * 2007-04-26 2010-07-22 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド 薬理シャペロンを用いたリソソーム蓄積症治療のための投薬計画
CN104530068B (zh) * 2007-05-22 2017-05-03 阿米库斯治疗学公司 用于制备异法戈明的化合物
US20090148887A1 (en) 2007-11-02 2009-06-11 The Scripps Research Institute Genetically encoded boronate amino acid
MX2010004807A (es) 2007-11-02 2010-08-02 Scripss Res Inst Evolucion dirigida utilizando proteinas que comprenden aminoacidos no naturales.

Also Published As

Publication number Publication date
CN105296447A (zh) 2016-02-03
US20150216950A1 (en) 2015-08-06
SI2638152T1 (sl) 2016-12-30
SMT201600431B (it) 2017-01-10
BR112013011152A2 (pt) 2016-11-29
WO2012064709A2 (en) 2012-05-18
LT2638152T (lt) 2016-12-12
CA2817011A1 (en) 2012-05-18
JP2017099390A (ja) 2017-06-08
JP2014500722A (ja) 2014-01-16
KR101901467B1 (ko) 2018-11-02
US20160184408A1 (en) 2016-06-30
EP2638152B1 (en) 2016-08-31
EP2638152A4 (en) 2014-04-09
US20170157220A1 (en) 2017-06-08
JP6457559B2 (ja) 2019-01-23
CN103314105B (zh) 2015-11-25
KR20140009238A (ko) 2014-01-22
US20130344054A1 (en) 2013-12-26
US9821038B2 (en) 2017-11-21
EP2638152A2 (en) 2013-09-18
US9254313B2 (en) 2016-02-09
PT2638152T (pt) 2016-10-25
US8962564B2 (en) 2015-02-24
WO2012064709A3 (en) 2012-08-02
PL2638152T3 (pl) 2017-02-28
US9566316B2 (en) 2017-02-14
HRP20161560T1 (hr) 2016-12-30
ES2743825T3 (es) 2020-02-20
CA2817011C (en) 2019-04-02
CY1118843T1 (el) 2018-01-10
EP3144386A1 (en) 2017-03-22
ES2604490T3 (es) 2017-03-07
DK2638152T3 (en) 2016-12-12
CN103314105A (zh) 2013-09-18
HUE030932T2 (en) 2017-06-28
JP6073796B2 (ja) 2017-02-01
EP3144386B1 (en) 2019-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS55405B1 (sr) Varijantni, rekombinantni proteini beta-glukocerebrozidaze sa povećanom stabilnošću i povećanom zadržanom katalitičkom aktivnošću
JP6587666B2 (ja) リソソーム貯蔵疾患の処置のための方法および組成物
JP7042263B2 (ja) ファブリー病の治療のための方法および組成物
EP3845651B1 (en) Novel nuclease domain and uses thereof
RS55669B1 (sr) Proizvodnja aktivne visoko fosforilisane ljudske n-acetilglaktozamin-6-sulfataze i njene primene
KR20180127319A (ko) 신경 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물
HK1189624B (en) Variant, recombinant beta-glucocerebrosidase proteins with increased stability and increased retained catalytic activity
RU2845088C2 (ru) Расщепленный с n-конца и/или c-конца растворимый полипептид ph20 и его применение
HK1235826A1 (en) Variant, recombinant beta-glucocerebrosidase proteins with increased stability and increased retained catalytic activity
HK1238680A1 (en) Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
HK40002981B (en) Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
HK40002981A (en) Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
HK1238680B (en) Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
HK1209788B (en) Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases