ES2744479T3

ES2744479T3 - Agentes medicinales novedosos y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2744479T3
Application number: ES15713906T
Authority: ES
Inventors: Angelica Loskog
Original assignee: Lokon Pharma AB
Current assignee: Lokon Pharma AB
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2020-02-25
Anticipated expiration: 2035-04-07
Also published as: WO2015155174A1; JP6524208B2; CN106459991B; CN106459991A; JP2017512504A; NZ724775A; CA2940928A1; RU2739073C2; EP3129398B1; EP3129398A1; US10973875B2; US20170189480A1; CA2940928C; RU2016142370A3; AU2015243562A1; AU2015243562B2; PT3129398T; DK3129398T3; PL3129398T3; RU2016142370A

Abstract

Secuencia de nucleótidos que codifica para, desde 5' hasta 3', una proteína transmembrana OD - (L) -TD - ED en la que OD es un dominio de oligomerización seleccionado del grupo que consiste en una cremallera de isoleucina y un dominio de trimerización de fibritina T4, L es un ligador, que está presente opcionalmente, TD es un dominio transmembrana derivado de CD154 o de cualquier proteína transmembrana tipo II, y ED es un dominio extracelular de CD154 con la condición de que la secuencia de nucleótidos no comprenda SEQ ID NO: 16, es decir una secuencia que puede codificar para la región intracelular de CD154, ni la región intracelular de CD40.

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes medicinales novedosos y usos de los mismos

Campo de invención

La presente invención se refiere a un compuesto TMZ-CD154 novedoso y a un método para tratar enfermedades en las que se usa la molécula TMZ-CD154 novedosa. En particular, TMZ-CD154 se usa para modificar las respuestas inmunitarias en pacientes con enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario tales como cáncer y enfermedad infecciosa. La presente invención también se refiere a un método para activar células con TMZ-CD154 in vitro o bien antes de usar las células activadas para terapia o bien con fines de diagnóstico.

Antecedentes de la invención

Durante las últimas décadas, la tecnología de transferencia de genes ha estado bajo una extensa investigación en el tratamiento de, por ejemplo, cáncer. En 2012, Glybera se convirtió en el primer tratamiento de terapia génica aprobado para uso clínico. Glybera compensa la deficiencia de lipoproteína lipasa administrando una copia intacta del gen de la lipoproteína lipasa humana (LPL) incorporado en el vector viral del serotipo 1 del virus adenoasociado (AAV1).

El objetivo de la terapia génica es introducir un gen funcional/terapéutico en una célula diana tal como una célula tumoral.

El documento WO 2012/038607 describe un método para producir CD40L en una célula y aumentar la respuesta inmunitaria específica del tumor y la apoptosis en un sujeto. CD40L (también denominado ligando CD40, CD154 o gp39) es una proteína transmembrana tipo II que pertenece a la familia del factor de necrosis tumoral.

El documento WO 02/36769 describe una quimera CD40L-CD40. A diferencia de la secuencia de nucleótidos de la presente invención, la quimera contiene una región de señalización intracelular de otra proteína mientras que la presente invención carece de capacidad de señalización intracelular.

Blaser et al. (Clin. Inmunology 2005, 117, 231 -237) y Hsu et al. (Journal of Biological Chemistry, 1997, 272, 911 -915) describen CD40L que se produce de manera natural, que en el caso de Blaser et al. se demuestra que una mutación conduce a una proteína disfuncional. Hsu et al. describen que CD40L que se produce de manera natural puede escindirse para liberar el dominio extracelular. Sin embargo, el CD40L liberado no es estable como trímero.

Los documentos WO 94/10308 y WO 2007/120368 se refieren a moléculas CD40L multiméricas solubles que no se retienen en la membrana plasmática, sino que se liberan de la célula o se usan como moléculas producidas recombinantes para el uso sistémico en pacientes. Una comparación de estas moléculas solubles con TMZ-CD154 de la presente invención muestra que TMZ-CD154 proporciona una señal de activación más fuerte, probablemente porque se retiene en la membrana plasmática.

Morris A E et al. (Journal of Biological Chemistry, American Society for Biochemistry and Molecular Biology, vol. 274, n.° 1, 1 de enero, 1999) describen la incorporación de un motivo de cremallera de isoleucina en CD40L soluble. CD154 es una molécula transmembrana que puede trimerizarse tras unirse al receptor CD40. La unión conduce a la estimulación recíproca de las células CD154 positivas y CD40 positivas. CD154 también puede escindirse y secretarse, pero luego actúa como monómero CD154 soluble (sCD154). La unión a membrana o sCD154 activa las células dendríticas (DC) para convertirse en células que presentan antígenos eficientes y activar las denominadas respuestas inmunitarias de tipo Th1 con células efectoras tales como células T y linfocitos citolíticos naturales (NK). La respuesta inmunitaria de tipo Th1 desempeña un papel crucial en la inmunidad tumoral y es, por tanto, la esencia de la inmunoterapia tumoral activa. CD154 puede inducir apoptosis en células tumorales CD40 positivas mediante medios no completamente establecidos. Sin embargo, algunos informes reivindican que se debe a la activación de caspasa-9 dependiente de la ruta TRAF3-JNK, mientras que otros estudios implican una producción auto o paracrina de ligandos de muerte que pueden inducir la activación de caspasa-8 (Loskog y Eliopoulos, Semin Inmunol 2009). CD40 no tiene dominios de muerte en su cola, dando lugar a múltiples explicaciones. La inducción de apoptosis se ha mostrado más potente si CD154 está unido a membrana, lo que puede deberse a la trimerización de este sistema receptor/ligando tras la unión. CD154 se ha usado como molécula soluble en ensayos clínicos que reclutan pacientes con cáncer, pero la exposición sistémica puede dar como resultado enzimas hepáticas aumentadas, lo que no se ha observado cuando CD154 se ha administrado de manera local en una metástasis tumoral, por ejemplo mediante el uso de transferencia génica del serotipo 5 adenoviral (Vonderheide JCO, 2001; Malmstrom et al. CCR 2010). CD154 de longitud completa también se ha usado en virus oncolíticos (Fernandes et al. CCR 2009; Gomes et al. CCR 2009; Terada et al. g T 2006; Diaconu et al. CR 2012) y se ha sometido a prueba su seguridad en pacientes (Pesonen et al. CR 2012). La molécula CD154 expresada en células T mediante ingeniería genética puede dar como resultado enfermedad linfoproliferativa (Brown et al. Nat Med 1998). Por tanto, los vectores que transfieren el gen CD154 de longitud completa y que tienen la capacidad de infectar células que pueden reaccionar de tal manera pueden provocar toxicidad adversa inesperada.

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un derivado de CD154, que mantenga las propiedades beneficiosas con respecto a la apoptosis y la supresión tumoral, pero que no presente una toxicidad adversa no deseada.

Breve descripción de la invención

El presente inventor ha desarrollado un derivado de CD154 trimerizado unido a membrana que carece de los dominios de señalización intracelular. El derivado es un inmunomodulador más fuerte que el monómero CD154 correspondiente, no dará lugar a señalización de CD154 interna y no dará lugar a toxicidad sistémica mediada por CD154.

Descripción de TMZ-CD154

Esta invención se refiere a una forma de CD154 diseñada por ingeniería genética en la que el dominio extracelular y transmembrana de CD154 se fusiona con un dominio de oligomerización (figura 1). El CD154 diseñado por ingeniería genética retendrá una forma unida a membrana con un dominio extracelular funcional pero no contendrá dominios de señalización intracelular. En cambio, el dominio de oligomerización oligomerizará el CD154 diseñado por ingeniería genética traducido y el complejo de proteína permanecerá unido a membrana.

Como ejemplo, se ha producido una molécula CD154 trimerizada que contiene una cremallera de isoleucina unida a membrana denominada TMZ-CD154. TMZ-CD154 forma moléculas oligomerizadas, preferiblemente trimerizadas, de CD154 que carecen del dominio intracelular y se localiza en la membrana celular. TMZ-CD154 expresada en células da como resultado una detección robusta de la molécula en la superficie celular y una secreción mínima de la molécula comparable con CD154 de tipo natural. Las células que expresan TMZ-CD154 activan las células dendríticas (DC) tal como se muestra mediante una expresión uniforme de CD83 y una producción alta de IL12. La producción de IL12 es tan alta como la de CD154 de tipo natural y mayor que si las DC se estimulan con moléculas CD154 multiméricas solubles que demuestran el beneficio de una región transmembrana que retiene TMZ-CD154 en la membrana. Además, la señalización de CD154 en células que expresan CD154 tras el ligamiento de CD40 está escasamente definida pero puede inducir un estado proliferativo en células T que expresan CD154. Por tanto, TMZ-CD154 tendrá las propiedades beneficiosas de estimulación de CD154 de células CD40 positivas sin la activación de las rutas de señalización aguas abajo dentro de las células que expresan TMZ-CD154 que puede provocar un crecimiento descontrolado en, por ejemplo, células T diseñadas por ingeniería genética u otros acontecimientos desconocidos dependientes del tipo de célula diseñada por ingeniería genética. Esto es importante especialmente si la molécula se administra a células que pueden afectarse por una señalización interna de CD154 tal como las células T.

Tal como se describe en el presente documento, la presente invención no se limita a TMZ-CD154, sino que otros nucleótidos/proteínas que tienen los componentes básicos esenciales también están dentro del alcance de la invención. Con fines ilustrativos, se usa TMZ-CD154 como ejemplo de los diversos aspectos de la invención:

i) TMZ-CD154 en forma de nucleótido o proteína,

ii) TMZ-CD154 para su uso en medicina,

iii) TMZ-CD154 insertado en vehículos genéticos, células, células artificiales o vehículos naturales o artificiales, iv) TMZ-CD154 insertado en vehículos genéticos, células, células artificiales o vehículos naturales o artificiales para su uso en medicina,

v) TMZ-CD154 o TMZ-CD154 insertado en vehículos genéticos, células, células artificiales o vehículos naturales o artificiales para su uso en el tratamiento de enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad linfoproliferativa, inflamación, inflamación crónica, autoinmunidad o alergia en medicina humana y/o veterinaria,

vi) una composición farmacéutica que comprende TMZ-CD154,

vii) una composición farmacéutica que comprende TMZ-CD154 insertado en vehículos genéticos, células, células artificiales o vehículos naturales o artificiales,

viii) un método para producir TMZ-CD154 en una célula.

Descripción de la invención

Basándose en las observaciones informadas en el presente documento, especialmente en vista de los resultados relativos a TMZ-CD154, la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica para, desde 5’ hasta 3’, una proteína transmembrana

OD-(L)-TD-ED

en la que

OD es un dominio de oligomerización seleccionado del grupo que consiste en una cremallera de isoleucina y un dominio de trimerización de fibritina T4,

L es un ligador, que está presente opcionalmente,

TD es un dominio transmembrana derivado de CD154 o de cualquier proteína transmembrana tipo II, y

ED es un dominio extracelular de CD154

con la condición de que la secuencia de nucleótidos no comprenda SEQ ID NO: 16, es decir una secuencia que puede codificar para la región intracelular de CD154, ni la región intracelular de CD40.

El dominio transmembrana puede derivarse de CD154 o de cualquier proteína transmembrana tipo II.

El dominio extracelular puede seleccionarse de

i) SEQ ID NO: 11, es decir residuos 199-846 de SEQ ID NO: 1,

ii) SEQ ID NO: 11, es decir residuos 199-846 de SEQ ID NO: 1, pero en la que uno o más de los residuos de ácido nucleico 397-420 de SEQ ID NO: 1 se han delecionado o intercambiado con otro ácido nuclei

escisión de la molécula,

iii) SEQ ID NO 12, es decir residuos 127-846 de SEQ ID NO: 3,

iv) SEQ ID NO: 13, es decir residuos 127-844 de SEQ ID NO: 4,

v) SEQ ID NO: 14, es decir residuos 127-844 de SEQ ID NO: 5,

vi) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, el 98% o el 99% con una secuencia definida en cualquiera de i)-v), o

vi) un dominio extracelular de CD154 correspondiente de un mamífero.

La secuencia de nucleótidos de la presente invención contiene tres elementos obligatorios, que desde el extremo 5’ hasta el 3’ proporcionan la estructura OD-TD-ED, y al mismo tiempo carece de señalización intracelular. El dominio extracelular de CD40L se fusionará con una región transmembrana para retenerla en la superficie celular para mejorar la señalización y con un dominio de trimerización para la señalización máxima. Un ligador puede insertarse entre OD y TD.

La intención de TMZ-CD154 es trimerizar CD40L y retenerlo en la membrana plasmática sin conferir señalización intracelular en la célula portadora de TMZ-CD154 tras la interacción con células CD40+. El fin es trasmitir señales, pero no lograr señales recíprocas.

CD40L que se produce de manera natural no mantiene una estructura trimerizada in vivo de manera sólida, lo que debilita la señalización.

Una secuencia de nucleótidos según la presente invención puede usarse en terapia génica in vivo, por ejemplo, y tal como se describe en los ejemplos en el presente documento, mediante la inyección intratumoral de un virus que porta la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, el gen TMZ-CD154) es importante eliminar la región intracelular (por ejemplo, de CD40L). La inyección in vivo conducirá a la expresión de la secuencia de nucleótidos en todas las células infectadas incluyendo las células T infiltrantes de tumor, células que pueden expresar de manera natural CD40L, en un tiempo corto durante la activación. La sobreexpresión de CD40L de tipo natural en células T conduce a la proliferación descontrolada de células T y, por tanto, a enfermedades linfoproliferativas en ratones. La eliminación de la región intracelular es importante en cuanto a aspectos de seguridad. TMZ-CD154 no induce la proliferación descontrolada de células T en células T humanas ni tales reacciones adversas que se han observado en ratones tratados con CD40L.

En particular, la invención se refiere a CD40L o un derivado de CD154 que tiene la siguiente estructura:

OD-(L)-TD-ED, en la que OD es un dominio de oligomerización, L es un ligador, que está presente opcionalmente,

Claims

REIVINDICACIONES

i . Secuencia de nucleótidos que codifica para, desde 5’ hasta 3’, una proteína transmembrana

OD -(L) -TD - ED

en la que

OD es un dominio de oligomerización seleccionado del grupo que consiste en una cremallera de isoleucina y un dominio de trimerización de fibritina T4,

L es un ligador, que está presente opcionalmente,

TD es un dominio transmembrana derivado de CD154 o de cualquier proteína transmembrana tipo II, y

ED es un dominio extracelular de CD154

con la condición de que la secuencia de nucleótidos no comprenda SEQ ID NO: 16, es decir una secuencia que puede codificar para la región intracelular de CD154, ni la región intracelular de CD40.
2. Nucleótido según la reivindicación 1, en el que ED, la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 que codifica para el dominio extracelular de CD154, se selecciona de

i) SEQ ID NO: 11, es decir residuos 199-846 de SEQ ID NO: 1,

ii) SEQ ID NO: 11, es decir residuos 199-846 de SEQ ID NO: 1, pero en la que uno o más de los residuos de ácido nucleico 397-420 de SEQ ID NO: 1 se han delecionado o intercambiado con otro ácido nuclei
3. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, en la que TD, la porción de la secuencia de nucleótidos que puede codificar para el dominio transmembrana, se deriva de cualquiera de las secuencias de nucleótidos que pueden codificar para CD154, ligando OX40 humano o CD70 humano, y la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con

i) SEQ ID NO: 17, es decir residuos 127-198 de SEQ ID NO: 1,

ii) SEQ ID NO: 20, es decir dominio transmembrana de ligando OX40 humano, o iii) SEQ ID NO: 22, es decir dominio transmembrana de CD70 humano.
4. Secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que OD, la secuencia de nucleótidos que puede codificar para el dominio de oligomerización, es la cremallera de isoleucina que tiene SEQ ID nO: 23, es decir residuos 10-108 de SEQ ID NO: 1.
5. Secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con S^eQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
6. Combinación de una secuencia de nucleótidos de las reivindicaciones anteriores y una secuencia de nucleótidos que puede codificar para un inmunomodulador.
7. Combinación según la reivindicación 6, en la que la secuencia de nucleótidos que puede codificar para un inmunomodulador es un gen de ligando de 4-1BB, o un gen para un fragmento variable de cadena sencilla anti-IL6R (scFv).
8. Combinación según la reivindicación 7, que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, el 98% o el 100% con SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.
9. Proteína que comprende la estructura

OD-(L)-TD-ED,

en la que

OD es una secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de oligomerización seleccionado del grupo que consiste en una cremallera de isoleucina y un dominio de trimerización de fibritina T4,

L es un ligador, que está presente opcionalmente,

TD es una secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio transmembrana, y

ED es una secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio extracelular de CD154, con la condición de que la secuencia de aminoácidos no comprenda SEQ ID NO: 15, es decir la región intracelular de CD154, ni la región intracelular de CD40.
10. Proteína según la reivindicación 9, en la que el dominio extracelular de CD154 se selecciona de

i) SEQ ID NO: 24,

ii) SEQ ID NO: 24, pero en la que uno o más de los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos MQKGDQNP correspondiente a los residuos de nucleótido 397-420 de SEQ ID NO: 1 se han delecionado o intercambiado con otro aminoácido para evitar la escisión de la molécula, iii) residuos de aminoácido correspondientes a los nucleótidos de SEQ ID NO: 12, es decir residuos 127-846 de SEQ ID NO: 3,

iv) residuos de aminoácido correspondientes a los nucleótidos de SEQ ID NO: 13, es decir residuos 127-844 de SEQ ID NO: 4,

v) residuos de aminoácido correspondientes a los nucleótidos de SEQ ID NO: 14, es decir residuos 127-844 de SEQ ID NO: 5,

vi) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, el 98% o el 99% con una secuencia definida en cualquiera de i)-v), o

vi) un dominio extracelular de CD154 correspondiente de un mamífero.
11. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en la que ED tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% o al menos el 95% para SEQ ID NO: 24.
12. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en la que TD, el dominio transmembrana, se deriva del dominio transmembrana de CD154 o cualquier proteína transmembrana tipo II.
13. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en la que la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio transmembrana tiene al menos una identidad de secuencia del 90%, el 95%, el 98% o el 100% para SEQ ID NO: 18.
14. Proteína según la reivindicación 13, en la que los residuos 14 y/o 16 de SEQ ID NO: 18 se delecionan o sustituyen con otro aminoácido.
15. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 9-14, que tiene al menos una identidad de secuencia del 90%, el 95%, el 98% o el 100% con SEQ ID NO: 2.
16. Vehículo que comprende un nucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho vehículo se selecciona de plásmidos, vectores virales, transposones, células, células artificiales y vehículos artificiales.
17. Vehículo según la reivindicación 16, en forma de virus.
18. Vehículo según la reivindicación 17, en el que el virus es un virus de serotipo 5/35 adenoviral.
19. Vehículo según la reivindicación 17, en el que el virus es un virus de serotipo 5/35 adenoviral que tiene al menos una región/sitio de unión de promotor E2F en el sentido de 5’ del gen E1A, un sitio Sp1 opcional en el sentido de 5’ del gen E1A, una deleción E1AA24, deleciones E3 A6.7K y/o Agp19K, y un casete transgénico con transgén/transgenes que incluye(n) pCMV insertado después de la región génica L5.
20. Vehículo según cualquiera de las reivindicaciones 16-18, que comprende además gen de ligando de 4-1BB o un gen para fragmento variable de cadena sencilla anti-IL6R (scFv).
21. Adenovirus de serotipo 5/35 modificado que contiene un casete transgénico impulsado por el promotor CMV insertado después de la región génica L5 con los transgenes humanos para un ligando CD40 unido a membrana tal como se define en SEQ ID NO: 1 y 4-1BBL de longitud completa y además

i) que tiene sitios de promotor E2F en el sentido de 5’ del gen E1A,

ii) que contiene un sitio Sp-1 en el sentido de 5’ del gen E1A,

iii) una deleción E1A A24, y

iii) E3 A6.7K/gp19K.
22. Secuencia de nucleótidos o combinación de secuencias de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o proteína según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, o vehículo o combinación de vehículos según cualquiera de las reivindicaciones 16-19, o adenovirus transgénico según la reivindicación 20, para su uso en medicina.
23. Secuencia de nucleótidos o combinación de secuencias de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o proteína según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, o vehículo o combinación de vehículos según cualquiera de las reivindicaciones 16-19, o adenovirus transgénico según la reivindicación 20, para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad linfoproliferativa, inflamación, inflamación crónica, autoinmunidad y alergia.
24. Secuencia de nucleótidos o combinación de secuencias de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o proteína según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, o vehículo o combinación de vehículos según cualquiera de las reivindicaciones 16-19, o adenovirus transgénico según la reivindicación 20 en combinación con una sustancia farmacológica seleccionada de agentes anticancerígenos, inmunomoduladores, antivirales, quimioterápicos, citocinas, receptores de citocinas, interleucinas, factores de crecimiento, receptores de factores de crecimiento o anticuerpos para su uso en medicina.

Figura 1

B

Figura 5

293 293-Simu ado 293-TMZ-CD154 Figura 6

Figura 7

Antes

Ccm P'FlTC

C D l07 a

Figura 8

A

Figura 10

BV421-A



Figura 12

Figura 13 Figura 14 Figura 15

Figura 16

Figura 16

Figura 18 Figura 19 Figura 20

Figura 21 A