ES2744834T3 - Nanopartículas degradables multifuncionales con control sobre el tamaño y las funcionalidades - Google Patents

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Abstract

Método de preparación de una nanopartícula degradable, que comprende la etapa de hacer reaccionar un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta la estructura representada por una fórmula (I):**Fórmula** en la que Z es O, S o NR, en la que R es H, alquilo o arilo, y en la que m y n son, independientemente, números enteros no negativos, con un dinucleófilo que presenta una estructura X-RL-X', en la que X y X' son, independientemente, OH, SH, NH2 o NHR, en la que R es H, alquilo o arilo, y en la que RL se selecciona de entre entre alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alcoxileno sustituido o no sustituido, y ésteres sustituidos o no sustituidos, produciendo de esta manera una nanopartícula degradable que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida o no sustituida representada por una fórmula:**Fórmula** en la que m y m' son independientemente números enteros comprendidos entre 0 y 6, en la que n y n' son independientemente números enteros comprendidos entre 0 y 2, en la que Z y Z' son independientemente O o NR, en la que R es H o alquilo C1 a C6, en la que Y e Y' son, independientemente, O, S o NR, en la que R es H o alquilo C1 a C6 alquilo, y en la que RL se selecciona de entre alquilo sustituido o no sustituido, y alcoxileno sustituido o no sustituido, y en la que la nanopartícula presenta un tamaño de partícula comprendido entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 850 nm.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas degradables multifuncionales con control sobre el tamaño y las funcionalidades.
Antecedentes
Las nanopartículas biodegradables han recibido una atención creciente como andamiajes versátiles de administración de fármacos para potenciar la eficacia de los terapéuticos. Sin embargo, la efectividad de la administración puede verse influida por el tamaño y morfología de las partículas, ya que estos parámetros pueden afectar mucho a la función y destino biológicos del material [Zweers, M. L. T.; Grijpma, D. W.; Engbers, G. H. M.; Feijen, J., J. Controlled Release 87, 252-254, 2003]. Las partículas dispersadas estrechamente resultan altamente preferentes para la utilización en aplicaciones de administración o detección con respecto a la monitorización y predicción de su comportamiento, ya que muestran una respuesta más constante a estímulos externos [Lubetkin, S.; Mulqueen, P.; Paterson, E. Pesti. Sci. 55:1123-1125, 1999].
Una desventaja de los métodos convencionales es la irreproducibilidad del tamaño y forma de las partículas, y que éstas pueden verse profundamente influidas por el estabilizador y solvente utilizados [Kumar, M. N. V. R.; Bakowsky, U.; Lehr, C. M., Biomaterials 25, 1771-1777, 2004]. Otra desventaja importante de las nanopartículas biodegradables convencionales, basadas en poli(£-caprolactona) y otros poliésteres alifáticos, es la falta de grupos funcionales colgantes, los cuales pueden dificultar la modificación de las propiedades físicoquímicas, mecánicas y biológicas [(a) Riva, R.; Lenoir, S.; Jerome, R.; Lecomte, P. Polymer 46, 8511-8518, 2005; (b) Sasatsu, M.; Onishi, H.; Machida, Y. Inter. J. Pharm. 317:167-174, 2006]. La disponibilidad de grupos funcionales es un medio deseable de adaptar las propiedades de una partícula, incluyendo la hidrofilicidad, tasa de biodegradación y bioadhesión.
Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de métodos y composiciones que superen dichas deficiencias y que proporcionen eficazmente nanopartículas degradables funcionalizadas con reproducibilidad del tamaño y forma de las partículas.
Sumario
La presente invención se refiere a nanopartículas y nanopartículas funcionalizadas, y a métodos de producción de las mismas. En particular, la presente invención divulga nanopartículas degradables, nanopartículas funcionalizadas y métodos de producción de las mismas según las reivindicaciones 1 a 15.
Se dan a conocer polímeros que comprenden por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida por la fórmula (I):
Figure imgf000002_0001
en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; en el que m es un número entero entre 0 y 6; en el que m es un número entero entre 0 y 2; y en el que el residuo monómero comprende menos de aproximadamente 10% en peso del residuo monómero de halógeno seleccionado de cloro, bromo y yodo.
Se dan a conocer además polímeros que comprenden residuos monómeros seleccionados de dos o más de un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura opcionalmente sustituida representada por la fórmula (I), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura opcionalmente sustituida representada por la fórmula (II):
Figure imgf000003_0001
en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, en el que m1 es un número entero entre 0 y 6, y en el que n1 es un número entero entre 0 y 2, y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa por la fórmula (III):
Figure imgf000003_0002
en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que n3 es un número entero entre 0 y 2. Se dan a conocer además polímeros que comprenden por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa por la fórmula (IV):
Figure imgf000003_0003
en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, en el que Y es O, S o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente, en el que m es un número entero entre 0 y 6, y en el que m es un número entero entre 0 y 2, y uno o más de entre: un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (II), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (III), anteriormente. Se divulgan además polímeros que comprenden por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa por la fórmula (V):
Figure imgf000004_0001
en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente, en el que m1 es un número entero entre 0 y 6, y en el que n1 es un número entero entre 0 y 2, y uno o más de entre: un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (I), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (III), anteriormente.
Se dan a conocer además métodos de preparación de un polímero, que comprenden la etapa de copolimerización de una mezcla de dos o más de un monómero funcionalizado con alqueno, que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente, representada por la fórmula (VI):
Figure imgf000004_0002
en la que Z es o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, en el que m es un número entero entre 0 y 6, en el que m es un número entero entre 0 y 2; un monómero funcionalizado con propargilo que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (II), anteriormente, y un monómero funcionalizado con ceto que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (III), anteriormente.
Se dan a conocer además métodos de preparación de un polímero funcionalizado con epóxido, que comprenden la etapa de oxidar un polímero que presenta por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (VI).
Se dan a conocer métodos de entrecruzamiento de un polímero que comprenden la etapa de hacer reaccionar un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero seleccionado de un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (I), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (II), anteriormente, con un entrecruzante que presenta la estructura representada por la fórmula X-RL-X', en la que X y X' son, independientemente, N3, OH, SH, NH2 o NHR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente.
Se dan a conocer además métodos para funcionalizar un polímero, que comprenden la etapa de hacer reaccionar un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estruct
opcionalmente que se representa por la fórmula (I), anteriormente, con un nucleófilo que presenta la estructura representada por la fórmula X-R1, en la que X es OH, SH, NH2 o NHR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; y en el que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende 1 a 24 átomos de carbono.
Se dan a conocer además métodos de funcionalización de un polímero que comprenden la etapa de hacer reaccionar un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (II), anteriormente, con una azida que presenta la estructura representada por la fórmula N3-R1, en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende 1 a 24 átomos de carbono.
Se dan a conocer además métodos de funcionalizar un polímero que comprende las etapas de hacer reaccionar un monómero funcionalizado con ceto que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (III) anteriormente, con una amina que presenta una estructura representada por la fórmula H2N- R1, en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono, y reducir la imina resultante.
Se dan a conocer además métodos para funcionalizar un polímero, que comprenden la etapa de hacer reaccionar un residuo monómero funcionalizado con nucleófilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (VII):
Figure imgf000005_0001
en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; en el que m es un número entero entre 0 y 6, en el que m es un número entero entre 0 y 2; en el que Y e Y' son, independientemente, O, S o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente, con un electrófilo que presenta una estructura representada por la fórmula E-R1, en la que 'E' es una fracción electrofílica, y en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono.
Un aspecto de la presente invención divulga nanopartículas poliméricas degradables que comprenden por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente representada por la fórmula (VIII):
Figure imgf000006_0001
en la que m y m' son, independientemente, números enteros entre 0 y 6, en el que n y n' son, independientemente, números enteros entre 0 y 2, y en el que Z y Z' son, independientemente, O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, en el que Y e Y' son, independientemente, O, S o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente, en el que la nanopartícula presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 850 nm.
Se dan a conocer además nanopartículas poliméricas degradables que comprenden por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa por la fórmula (IX):
Figure imgf000007_0001
en la que m1 y m1' son, independientemente, números enteros entre 0 y 6, en el que n1 y n1' son, independientemente, números enteros entre 0 y 2, y en el que Z y Z' son, independientemente, O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente, en el que la nanopartícula presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 850 nm.
Según un aspecto particular de la presente invención se proporciona un método para preparar las nanopartículas degradables de la presente invención, comprendiendo el método la etapa de añadir un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura representada por la fórmula (I), anteriormente, a una solución de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica:funcionalidad epóxido) que presenta la estructura X-RL-X', en la que X y X' son, independientemente, OH, SH, NH2 o NHR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido o no sustituido, y alcoxileno sustituido o no sustituido, produciendo de esta manera nanopartículas.
Se dan a conocer además métodos para preparar una nanopartícula degradable, que comprenden la etapa de añadir un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta la estructura representada por la fórmula (II), anteriormente, a una solución de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 equivalentes molares de una bis-azida (fracción azida: funcionalidad alquino) que presenta la estructura N3-R1--N3 , en la que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente. Se dan a conocer además métodos para controlar el tamaño de partícula durante la preparación de una nanopartícula degradable, que comprenden la etapa de añadir un polímero funcionalizado con epóxido a una solución de un entrecruzante dinucleofílico, en el que la estequiometría del entrecruzante se selecciona para proporcionar un tamaño de partícula deseado.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan además métodos para funcionalizar una nanopartícula polimérica degradable que comprenden por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícula de 5 nm a aproximadamente 850 nm. Según un aspecto particular de la presente invención, los métodos comprenden la etapa de hacer reaccionar una nanopartícula degradable que comprende por lo menos un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícu aproximadamente 850 nm, con un nucleófilo que presenta una estructura representada por la fórmula a -k 1, en la que A es OH, SH, NH2 o NHR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; y en el que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. Según otro aspecto particular de la presente invención, los métodos para funcionalizar una nanopartícula comprenden la etapa de hacer reaccionar una nanopartícula que comprende por lo menos un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícula de 5 nm a aproximadamente 850 nm; con una azida que presenta la estructura representada por la fórmula N3-R1, en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. Según otro aspecto particular de la presente invención, los métodos para funcionalizar una nanopartícula comprende las etapas de hacer reaccionar una nanopartícula que comprende por lo menos un monómero funcionalizado con ceto que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (III), anteriormente, con una amina que presenta la estructura representada por la fórmula H2N-R1, en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende 1 a 24 átomos de carbono, y reducir la imina resultante. Se dan a conocer además métodos para funcionalizar una nanopartícula que comprenden la etapa de hacer reaccionar una nanopartícula que comprende por lo menos un residuo monómero funcionalizado con nucleófilo, que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (VII), anteriormente, en la que Y e Y' son, independientemente, O, S o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente, con un electrófilo que presenta la estructura representada por la fórmula E-K1, en la que E es una fracción electrofílica, y en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende 1 a 24 átomos de carbono.
Según un aspecto de la presente invención se proporciona un método para preparar nanopartículas degradables, que comprende la etapa de hacer reaccionar un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta la estructura representada por la fórmula (A):
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en la que Z es O, S o NR, en la que R es H, alquilo o arilo, y en el que m y n son, independientemente, números enteros no negativos, presentando un dinucleófilo la estructura X-Rl-X', en la que A y A' son, independientemente, OH, SH, NH2 o NHR, en la que R es H, alquilo o arilo, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, alcoxileno sustituido o no sustituido, y ésteres sustituidos o no sustituidos, produciendo de eta manera una nanopartícula polimérica degradable que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta la estructura sustituida opcionalmente que se representa por la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícula de 5 nm a aproximadamente 850 nm.
Se dan a conocer además polímeros funcionalizados y nanopartículas funcionalizadas y métodos de preparación y utilización de los mismos.
Se dan a conocer además métodos de administración intracelular que comprenden administrar en un sujeto una cantidad eficaz de una nanopartícula divulgada.
Se dan a conocer además métodos para la preparación de un medicamento para la administración de un agente biológicamente activo, un agente farmacéuticamente activo y/o una fracción para la obtención de imágenes, que comprende combinar por lo menos un polímero divulgado o por lo menos una nanopartícula divulgada, con un portador farmacéuticamente aceptable.
Se dan a conocer además usos de un polímero divulgado o de una nanopartícula divulgada para la administración de un agente biológicamente activo, un agente farmacéuticamente activo y/o una fracción para la obtención de imágenes.
Se divulgan además composiciones farmacéuticas: que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más polímeros dados a conocer y/o una o más nanopartículas dadas a conocer farmacéuticamente aceptable para la administración en un sujeto, por ejemplo, un mamífero.
Se divulgan composiciones farmacéuticas para el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de trastornos oftálmicos, comprendiendo las composiciones una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más polímeros dados a conocer y/o una o más nanopartículas dadas a conocer y un portador farmacéuticamente aceptable para la administración en un sujeto, por ejemplo, un mamífero. En un aspecto, las composiciones pueden administrarse transcornealmente.
Breve descripción de las figuras
Las figuras adjuntas, que se incorporan y constituyen una parte de la presente especificación, ilustran varios aspectos y junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención.
La figura 1 muestra precursores lineales multifuncionales de poliéster con una entidad entrecruzante de epóxido.
La figura 2 muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés) de nanopartículas AB; (1) 2 equivalentes de amina; (2) 5 equivalentes de amina; (3) 8 equivalentes de amina. La figura 3 muestra el incremento polinomial del diámetro de nanopartícula (nm) con el incremento del entrecruzante diamina; (■) nanopartículas de ABD; (♦ ) nanopartículas de AB; (•) nanopartículas de ABC. La figura 4 muestra la superposición de RMN 1H para nanopartículas de poli(vl-evl) con entrecruzamiento creciente.
La figura 5 muestra el incremento polinomial del diámetro de nanopartícula (nm) con el incremento de entrecruzante diamina para (♦ ) las nanopartículas de AB de la figura 3.
La figura 6 muestra el incremento polinomial del diámetro de nanopartícula (nm) con el incremento de entrecruzante diamina para (■) las nanopartículas de ABD de la figura 3.
La figura 7 muestra el incremento polinomial del diámetro de nanopartícula (nm) con el incremento de entrecruzante diamina para (• las nanopartículas de ABC de la figura 3.
La figura 8 muestra el incremento polinomial del diámetro de nanopartícula (nm) con el incremento de entrecruzante diamina para nanopartículas AB de poli(vl-evl) (2% evl) (■).
La figura 9 muestra el incremento polinomial del diámetro de nanopartícula (nm) con el incremento de entrecruzante diamina para nanopartículas AB de poli(vl-evl) (7% evl) (♦).
La figura 10 muestra el incremento polinomial del diámetro de nanopartícula (nm) con el incremento de entrecruzante diamina para nanopartículas AB de poli(vl-evl) (19% evl) (♦).
La figura 11 muestra una representación esquemática de las estructuras de FD-1 y FD-2.
La figura 12 muestra el curso temporal de internalización de (a) FD-1 y (b) FD-2 en fibroblastos NIH-3T3 a 37°C. La concentración de conjugado era de 10 pM.
La figura 13 muestra el efecto de la temperatura sobre la internalización de (a) FD-1 y (b) FD-2. Se incubaron células endoteliales microvasculares humanas (HMEC, por sus siglas en inglés) con conjugados (10 pM) durante 2.5 min a 4°C o a 37°C.
La figura 14 muestra el efecto de la temperatura sobre la internalización de (a) FD-1 y (b) FD-2. Las células HMEC se incubaron con conjugados (1 pM) durante 30 min a 4°C o a 37°C.
La figura 15 muestra experimentos de control: (a) se incubaron las células HMEC con conjugados de FITC libres (10 pM) durante 60 min a 37°C, (b) las células HMEC se incubaron con FD-2 guanidinilado protegido con Boc (10 pM) durante 60 min a 37°C.
Las figuras 6A y 6B muestran un esquema sintético ejemplar para la preparación de FD-1, FD-2 e intermediarios de los mismos.
La figura 17 muestra una micrografía de una colección de puntos cuánticos orgánicos formados mediante el pliegue de la cadena intramolecular. Los diversos puntos se representan en las imágenes con diferentes colores como una función de la fracción funcional seleccionada.
La figura 18 muestra una representación esquemática de un esquema sintético para preparar ios diversos tipos de puntos cuánticos orgánicos dados a conocer.
La figura 19 muestra una representación esquemática de un esquema sintético para preparar puntos cuánticos orgánicos de tipo ABA.
La figura 20 muestra una representación esquemática de la composición de un precursor de punto cuántico orgánico de tipo ABA, un copolímetro tribloque ABA.
La figura 21 muestra una representación esquemática de un punto cuántico orgánico y su aplicabilidad como sonda biológica y/o un vehículo de administración de fármaco.
La figura 22 muestra un esquema para reacciones de acoplamiento de derivados bencociclobuteno.
La figura 23 muestra una síntesis ejemplar de monómero bencociclobuteno Q4.
La figura 24 muestra una síntesis ejemplar de poliestireno lineal funcionalizado con benzociclobuteno, Q8. La figura 25 muestra un gráfico de la variación de peso molecular de la macromolécula final, Mw, con la concentración total de grupos BCB en solución (los círculos representan una estrategia de dilución ultraelevada; los cuadrados representan una estrategia de adición continua; I representa que se ha producido un gel insoluble) (polímero lineal de partida, Mw=95,000, PDI=1.11).
La figura 26 muestra una representación esquemática del pliegue intramolecular del polímero lineal Q8 para proporcionar la nanopartícula Q9.
La figura 27 muestra una comparación del espectro de RMN 1H Para (a) el polímero lineal de partida, 8, 80/20 Sty/BCB, Mw=95,000, PDI=1.12, y la nanopartícula resultante 9, Mw=65,000, PDI=1.10.
La figura 28 muestra una superposición de registros de GPC para (a) el polímero lineal de partida, Q8, Mw=105000, PDI=1.12, y las nanopartículas Q9 con (a) incorporación de BCB 0% molar, (b) incorporación de BCB 5% molar, (c) incorporación de BCB 10% molar, (d) incorporación de BCB 20% molar y (e) incorporación de BCB 25% molar.
La figura 29 muestra la variación en el porcentaje de reducción del peso molecular para las nanopartículas Q9 con el % molar de unidades de BCB en el polímero lineal de partida Q8 para las series de 44 K (b), 110 K (9) y 230 K (b).
La figura 30 muestra una representación esquemática del pliegue intramolecular de un polímero lineal a base de acrilato de n-butilo aleatorio, Q10, que proporciona la nanopartícula Q11.
La figura 31 muestra un esquema de la formación y pliegue intramolecular del copolímero en bloque PEG-b-PSt/BCB, Q15, que proporciona un copolímero de híbrido lineal-nanopartícula, Q16.
La figura 32 muestra registros de GPC para (a) el poli(etilenglicol)-b-poli(estireno-co-benzociclobuteno) inicial, Q15 (Mw=95,000, PDI=1.11) y (b) el híbrido final de nanopartícula-copolímero en bloque lineal, Q16, (Mw) 52,000, PDI=1.09).
La figura 33 muestra un esquema de nanopartículas multimodales ejemplares.
La figura 34 muestra un esquema de una síntesis ejemplar de precursores lineales de ABA-copolímero tribloque antes y después del pliegue de cadenas.
La figura 35 muestra un esquema que ilustra la conjugación de los materiales dendriméricos dados a conocer con los materiales de punto cuántico orgánico dados a conocer (conjuación con conector cortable):
La figura 36 muestra una preparación ejemplar de una nanopartícula orgánica entrecruzada.
La figura 37 muestra una conjugación ejemplar de un material dendrimérico divulgado con una nanopartícula orgánica entrecruzada divulgada.
La figura 38 muestra un esquema que ilustra un sistema de administración divulgado (p.ej., la administración génica).
La figura 39 ilustra la preparación de un sistema de administración divulgado (p.ej., la administración génica).
La figura 40 muestra micrografías que muestran la localización mitocondrial de los sistemas de administración dados a conocer (p.ej., de administración génica).
La figura 41 muestra micrografías que muestran la incorporación de un sistema de administración divulgado (p.ej., de administración génica) en células endoteliales.
La figura 42 muestra la flexibilidad del ensamblaje de los sistemas de administración dados a conocer.
La figura 43 muestra micrografías de células HeLa expuestas a FD-1 10 pM durante 1 h, fijadas con paraformaldehído al 3.3%, teñidas con Mitotracker® Red 580 FM 100 nM. Las regiones iluminadas muestran la penetración celular (izquierda), la localización mitocondrial (centro) y el solapamiento (derecha).
La figura 44 muestra micrografías de células HeLa expuestas a FD-2 20 pM durante 1 h, fijadas con paraformaldehído al 3.3%, teñidas con Mitotracker® Red 580 FM 100 nM. Las regiones iluminadas muestran la penetración celular (izquierda), la localización mitocondrial (centro) y el solapamiento (derecha).
La figura 45 muestra micrografías que demuestran el transporte intercelular de un conjugado de fluoróforo aprotinina-transportador (FD-1, ilustrado) al interior de células HAEC.
La figura 46 muestra micrografías que demuestran el transporte intercelular de un conjugado de aprotininafluoróforo-transportador (FD-2) al interior de células HAEC.
La figura 47 muestra micrografías que demuestran la ausencia de incorporación (es decir, ningún transporte intercelular al interior de las células HAEC) de un conjugado de control de aprotinina-fluoróforo (ilustrado). La figura 48 muestra varias estrategias químicas para la unión de fracciones de transporte a diversos grupos funcionales de proteína (p.ej., amina, tiol, carbonilo).
La figura 49 presenta estrategias para el desarrollo de vacunas mediante la incorporación de aprotinina mediante la conjugación con proteínas funcionalizadas con carbonilo (p.ej., residuos de tirosina) mediante reacción de Mannich.
La figura 50 ilustra la incorporación de fluoróforos mediante la conjugación con proteínas funcionalizadas con carbonilo (p.ej., residuos de tirosina) mediante reacción de Mannich.
La figura 51 ilustra la incorporación de fracciones de transportador mediante la conjugación con proteínas funcionalizadas con carbonilo.
La figura 52 muestra el análisis de TEM de las nanopartículas (225.6 nm) producidas mediante el entrecruzamiento de poli(vl-evl-avl-opd) (ABbD).
La figura 53 muestra la distribución de tamaños de partícula medida mediante análisis dinámico de dispersión lumínica de nanopartículas “en un solo reactor” (272.3 ± 23.3 nm) producidas a partir del entrecruzamiento de poli(vl-evl-avl-opd) (ABbD).
La figura 54 muestra un esquema de una reacción de intercambio de tiol con un anticuerpo IgG para formar un bioconjugado IgGMT.
La figura 55 muestra imágenes de microscopía de la incorporación de IgGMT en células HEp-2 durante 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h y un experimento de control negativo (CN) con IgG marcadas con Alexa Fluor® 568. La figura 56 muestra imágenes de microscopía de células HEp-2 infectadas con VSR durante 24 h, lavadas y captadas en imagen 48 h después de la infección para la fluorescencia de GFP (c). Células HEp-2 infectadas por VSR durante 24 h, incubadas durante 30 min con IgGMT y captadas en imagen tras 48 h para la fluorescencia de GFP (a) y Alexa Fluor® 568 de IgGMT (b), imágenes fusionadas (a) y (b) (a b fusionados). La figura 57 muestra imágenes de microscopía de células HEp-2 infectadas por VSR durante 24 h, incubadas durante 30 min con IgGMT y captadas en imagen inmediatamente para la fluorescencia verde de GFP (a) y la fluorescencia roja del conjugado IgGMT (b), imágenes fusionadas de (a) y (b) (a b fusionados). Células HEp-2 infectadas por VSR durante 24 h, incubadas durante 30 min con IgGMT y captadas en imagen tras 48 h para la fluorescencia de GFP (a) y Alexa Fluor® 568 del conjugado IgGMT (b), imágenes fusionadas (a) y (b) (a b fusionados).
La figura 58 muestra los resultados para el transporte dirigido de nanopartículas-péptidos guiados por radiación en un modelo de tumor de carcinoma pulmonar de Lewis.
La figura 59 muestra un esquema para la administración de una sustancia biológica activa.
La figura 60 muestra imágenes de microscopía de fluorescencia de partes del ojo de una rata tras la administración de un bioconjugado de nanopartícula que comprende un agente de captación de imágenes. Se explican ventajas adicionales de la invención en parte en la descripción siguiente, y en parte resultarán evidentes a partir de la descripción o podrán aprenderse mediante la práctica de la invención. Las ventajas de la invención se identificarán y conseguirán mediante los elementos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que tanto la descripción general anterior y la descripción detallada a continuación son sólo ejemplares y explicativas y no limitativas de la invención, según las reivindicaciones. Descripción
La presente invención podrá entenderse más fácilmente haciendo referencia a la descripción detallada siguiente de la invención y los ejemplos incluidos en la misma.
Antes de dar a conocer y describir los presentes compuestos, composiciones, artículos, sistemas, dispositivos y/o métodos, debe entenderse que no se encuentran limitados a métodos sintéticos específicos a menos que se indique lo contrario, o a reactivos particulares, a menos que se indique lo contrario, ya que estos pueden, evidentemente, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria presenta el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y que no pretender ser limitativa. Aunque también pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales ejemplares.
Las publicaciones comentadas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su exposición antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no posee el derecho de anteceder a dicha publicación en virtud de invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas en la presente memoria pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que pueden requerir una confirmación independiente.
A. Definiciones
Tal como se utiliza en la memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” o “la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a “un grupo funcional”, “un alquilo” o “un residuo” incluye mezclas de dos o más de dichos grupos funcionales, alquilos o residuos, y similares.
Los intervalos pueden expresarse en la presente memoria como entre “aproximadamente” un valor particular y/o “aproximadamente” otro valor particular. En el caso de que se exprese dicho intervalo, otro aspecto incluye entre un valor particular y/o el otro valor particular. De manera similar, en el caso de que se expresen valores como aproximaciones, mediante la utilización del antecedente “aproximadamente”, se entenderá que el valor particular forma otro aspecto. Se entenderá además que los extremos de cada uno de los intervalos son significativos en relación al otro extremo, e independientemente del otro extremo. Se entiende además que existe un número de valores dados a conocer en la presente memoria, y que cada valor también se divulga en la presente memoria como “aproximadamente” ese valor particular además del valor mismo. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer el valor “10”, entonces también se divulga “aproximadamente 10”. Se entiende además que cada unidad entre dos unidades particulares también se divulga. Por ejemplo, en el caso de que se den a conocer 10 y 15, entonces 11, 12, 13 y 14 también se han divulgado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “opcional” u “opcionalmente” se refiere a que el suceso o circunstancia seguidamente indicado puede producirse o no producirse y que la descripción incluye casos en los que dicho suceso o circunstancia se produce y casos en los que no se produce.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” se refiere a la gestión médica de un paciente con la intención de curar, mejorar, estabilizar o evitar una enfermedad, condición patológica o trastorno. Dicho término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejora de una enfermedad, condición patológica o trastorno, e incluye además el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido a la eliminación de la causa de la enfermedad, condición patológica o trastorno asociado. Además, dicho término incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para el alivio de los síntomas y no la curación de la enfermedad, condición patológica o trastorno; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad asociada, condición patológica o trastorno, y el tratamiento de soporte, es decir, el tratamiento utilizado para complementar otra terapia específica dirigida a la mejora de la enfermedad, condición patológica o trastorno asociado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “prevenir” o “prevención” se refiere a impedir, evitar, obviar, anticipar, detener o dificultar la incidencia de algo, especialmente mediante acción |
entiende que donde se utiliza en la presente memoria reducir, inhibir o evitar, a menos que se indique específicamente lo contrario, también se divulga expresamente la utilización de los otros dos términos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “administrar” y “administración” se refieren a cualquier método de provisión de una preparación farmacéutica en un sujeto. Dichos métodos son bien conocidos por el experto en la materia y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, la administración oral, la administración transdérmica, la administración mediante inhalación, la administración nasal, la administración tópica, la administración intravaginal, la administración oftálmica, la administración intraaural, la administración intracerebral, la administración rectal y la administración parenteral, incluyendo inyectable, tal como la administración intravenosa, la administración intraarterial, la administración intramuscular y la administración subcutánea. La administración puede ser continua o intermitente. Puede administrarse una preparación terapéuticamente; es decir, se administra para tratar una enfermedad o condición existente. Además, puede administrarse una preparación profilácticamente; es decir, se administra para la prevención de una enfermedad o condición.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “sujeto” se refiere a una diana de administración. El sujeto de los métodos dados a conocer en la presente memoria puede ser un vertebrado, tal como un mamífero, un pez, un ave, un reptil o un anfibio. De esta manera, el sujeto de los métodos dados a conocer en la presente memoria puede ser un ser humano, primate no humano, caballo, cerdo, conejo, perro, oveja, cabra, vaca, gato, cobaya o roedor. El término no se refiere a ninguna edad o sexo en particular. De esta manera, se pretende que estén cubiertos sujetos adultos y neonatos, así como fetos, sean masculinos o femeninos. Un paciente se refiere a un sujeto afectado por una enfermedad o trastorno. El término “paciente” incluye sujetos humanos y veterinarios.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad que resulta suficiente para conseguir un resultado deseado o que presenta un efecto sobre síntomas no deseados, pero que resulta generalmente insuficiente para provocar efectos secundarios adversos. El nivel de dosis eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores, entre ellos el trastorno bajo tratamiento y la gravedad del trastorno, el compuesto específico utilizado, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y dieta del paciente, el momento de la administración, la vía de administración, la tasa de excreción del compuesto específico utilizado, la duración del tratamiento, los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico utilizado y factores similares bien conocidos de la técnica médica. Por ejemplo, se encuentra perfectamente comprendido en los conocimientos del experto en la materia iniciar con dosis de un compuesto a niveles inferiores a los necesarios para alcanzar el efecto deseado y gradualmente incrementar la dosis hasta conseguir el efecto deseado. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede dividirse en múltiples dosis con fines de administración. En consecuencia, las composiciones monodosis pueden contener tales cantidades o submúltiples de las mismas para alcanzar la dosis diaria. La dosis puede ser ajustada por el médico individual en el caso de cualesquiera contraindicaciones. Las dosis pueden variar y pueden administrarse en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días. Puede encontrarse una guía en la literatura de las dosis apropiadas para clases dadas de productos farmacéuticos. Puede administrarse una preparación en una “cantidad diagnósticamente eficaz”, es decir, una cantidad eficaz para el diagnóstico de una enfermedad o condición. Además, puede administrarse una preparación en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, es decir, una cantidad eficaz para el tratamiento de una enfermedad o condición. Además, puede administrarse una preparación en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, es decir, una cantidad eficaz para la prevención de una enfermedad o condición.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles, así como polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles inmediatamente antes de la utilización. Entre los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados se incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo, mediante la utilización de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante la utilización de surfactantes. Dichas composiciones pueden contener además adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. El bloqueo de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes, tales como monoestearato de aluminio y gelatina, que retrasan la absorción. Las formas de depósito inyectable se preparan mediante la formación de matrices de microcápsulas del fármaco en polímeros biodegradables, tales como poliláctido-poliglicólido, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Dependiendo de la proporción de fármaco a polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado, puede controlarse la tasa de liberación de fármaco. Las formulaciones de depósito inyectable también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales. Las formulación pueden esterilizarse mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención bacteriana o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o suspenderse en agua estéril u otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de la utilización. Entre los portadores inertes adecuados pueden incluirse azúcares, tales como lactosa. Deseablemente, por lo menos 95% en peso de las partículas del ingrediente activo presentan un tamaño de partícula efectivo en el intervalo de 0.01 a 10 micrómetros.
Tal como se utilizan en la presente memoria, la expresión “agente biológicamente activo” o “agente bioactivo” se refiere a un agente que es capaz de proporciona un efecto biológico, fisiológico o terapéutico local o sistémico en el sistema biológico en el que se aplica. Por ejemplo, el agente bioactivo puede actuar controlando la infección o inflamación, potenciando el crecimiento celular y la regeneración de tejidos, controlando el crecimiento tumoral, actuando como un analgésico, estimulando la unión anticélula y potenciando el crecimiento óseo, entre otras funciones. Entre otros agentes bioactivos adecuados pueden incluirse agentes antivíricos, hormonas, anticuerpos o proteínas terapéuticas. Entre otros agentes bioactivos se incluyen profármacos, que son agentes que no son biológicamente activos al administrarlos pero que, tras la administración en el sujeto, se convierten en agentes bioactivos mediante metabolismo o algún otro mecanismo. Adicionalmente, las composiciones pueden contener combinaciones de dos o más agentes bioactivos. Se entiende que puede utilizarse un agente biológicamente activo en relación a la administración en diversos sujetos, por ejemplo en seres humanos (es decir, la administración médica) o en animales (es decir, la administración veterinaria).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “agente farmacéuticamente activo” incluye un “fármaco” o una “vacuna”, y se refiere a una molécula, grupo de moléculas, complejo o sustancia administrado en un organismo con fines diagnósticos, terapéuticos, preventivos, médicos o veterinarios. Dicho término incluye farmacéuticos, tratamientos, remedios, nutracéuticos, cosmecéuticos, agentes biológicos, dispositivos, diagnósticos y anticonceptivos humanos y animales administrados externa e internamente por vía tópica, localizada y sistémica, incluyendo preparaciones útiles en el cribado, prevención, profilaxis, curación, bienestar, detección, obtención de imágenes, diagnóstico, terapia, cirugía, monitorización, cosmética, prostética, estudios forenses clínicos y veterinarios, y similares. Dicho término puede utilizarse además en referencia a terapéuticos o remedios agricéuticos, del lugar de trabajo, militares, industriales y ambientales, que comprenden moléculas seleccionadas o secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas capaces de reconocer receptores celulares, receptores membranales, receptores hormonales, receptores terapéuticos, microbios, virus o dianas seleccionadas que comprenden o son capaces de entrar en contacto con plantas, animales y/o seres humanos. Dicho término también puede incluir específicamente ácidos nucleicos y compuestos que comprende ácidos nucleicos que producen un efecto bioactivo, por ejemplo ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Entre los agentes farmacéuticamente activos se incluyen las categorías dadas a conocer en la presente memoria y ejemplos específicos. No se pretende que la categoría se encuentre limitada por los ejemplos específicos. El experto ordinario en la materia también reconocerá otros numerosos compuestos que se encuentran comprendidos dentro de las categorías y que resultan útiles. Entre los ejemplos se incluyen un radiosensibilizador, la combinación de un radiosensibilizador y un quimioterapéutico, un esteroide, una xantina, un broncodilatador beta-2-agonista, un agente antiinflamatorio, un agente analgésico, un antagonista de calcio, inhibidores del enzima conversor de la angiotensina, un beta-bloqueante, un agonista alfa activo centralmente, un antagonista alfa-1, un agente anticolinérgico/antiespasmódico, un análogo de vasopresina, un agente antiarrítmico, un agente antiparquinsoniano, un agente antiangina/antihipertensor, un agente anticoagulante, un agente antiplaquetario, un sedante, un agente ansiolítico, un agente peptídico, un agente biopolimérico, un agente antineoplásico, un laxante, un agente antidiarreico, un agente antimicrobiano, un agente antifúngico, una vacuna, una proteína o un ácido nucleico. El agente farmacéuticamente activo puede ser coumarina, albúmina, bromolidina, esteroides tales como betametasona, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona, budesónido, hidrocortisona y derivados de hidrocrotisona farmacéuticamente aceptables, xantinas tales como teofilina y doxofilina, broncodilatadores beta-2-agonistas tales como salbutamol, fenterol, clenbuterol, bambuterol, salmeterol, fenoterol; agentes antiinflamatorios, incluyendo agentes antiinflamatorios antiasmáticos, agentes antiinflamatorios antiartritis y agentes antiinflamatorios no esteroidos, entre los ejemplos de los cuales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, sulfuros, mesalamina, budesónido, salazopirina, diclofenac, sales diclofenac farmacéuticamente aceptables, nimesúlido, naproxeno, acetominofeno, ibuprofeno, cetoprofeno y piroxicam; agentes analgésicos, tales como salicilatos; bloqueantes de los canales del calcio, tales como nifedipina, amlodipina y nicardipina; inhibidores del enzima conversor de la angiotensina, tales como captopril, hidrocloruro de benzepril, fosinopril sodio, trandolapril, ramipril, lisinopril, enalapril, hidrocloruro de quinapril e hidrocloruro de moexipril; beta-bloqueantes (es decir, agentes bloqueantes beta-adrenérgicas), tales como hidrocloruro de sotalol, maleato de timolol, hidrocloruro de esmolol, carteolol, hidrocloruro de propanolol, hidrocloruro de betaxolol, sulfato de penbutolol, tartrato de metoprolol, succinato de metoprolol, hidrocloruro de acetbutolol, atenolol, pindolol y fumarato de bisoprolol; agonistas alfa-2 activos centralmente, tales como clonidina; antagonistas alfa-1, tales como doxazosina y prazosina; agentes anticolinérgicos/antiespasmódicos, tales como hidrocloruro de diciclomina, hidrobromuro de escopolamina, glicopirrolato, bromuro de clidinio, flavoxato y oxibutinina; análogos de vasopresina, tales como vasopresina y desmopresina; agentes antiarrítmicos, tales como quinidina, lidocaína, hidrocloruro de tocainida, hidrocloruro de mexiletina, digoxina, hidrocloruro de verapamilo, hidrocloruro de propafenona, acetato de flecainida, hidrocloruro de procainamida, hidrocloruro de moricizina y fosfato de disopiramida; agentes antiparquinsonianos, tales como
Dopa/Carbidopa, selegilina, dihidroergocriptina, pergólido, lisúrido, apomorfina y bromocriptina; agentes antiangina y agentes antihipertensores, tales como mononitrato de isosórbido, dinitrato de isosórbido, propanolol, atenolol y verapamilo; agentes anticoagulantes y antiplaquetarios, tales como coumadina, warfarina, ácido acetilsalicílico y ticlopidina; sedantes, tales como benzodiazepinas y barbitúricos; agentes ansiolíticos, tales como lorazepam, bromazepam y diazepam; agentes peptídicos y biopoliméricos, tales como calcitonina, leuprólido y otros agonistas de LHRH, hirudina, ciclosporina, insulina, somatostatina, protirelina, interferón, desmopresina, somatotropina, timopentina, pidotimod, eritropoyetina, itnerleuquinas, melatonina, CSF de granulocitos/macrófagos y heparina; agentes antineoplásicos, tales como etopósido, fosfato de etopósido, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, vincristina, doxorrubicina, cisplatino, hidroxiurea, leucovorina calcio, tamoxifeno, flutamida, asparaginasa, altretamina, mitotano e hidrocloruro de procarbazina; laxantes, tales como concentrato de senna, casantranol, bisacodilo y picosulfato sódico; agentes antidiarreicos, tales como hidrocloruro de difenoxina, hidrocloruro de loperamida, furazolidona, hidrocloruro de difenoxilato y microorganismos; vacunas, tales como vacunas bacterianas y víricas; agentes antimicrobianos, tales como penicilinas, cefalosporinas y macrólidos, agentes antifúngicos, tales como derivados imidazólicos y triazólicos, y ácidos nucleicos, tales como secuencias de ADN codificantes de proteínas biológicas y oligonucleotidos antisentido. Se entiende que puede utilizarse un agente farmacéuticamente activo en relación a la administración en diversos sujetos, por ejemplo en seres humanos (es decir, la administración médica) o en animales (es decir, la administración veterinaria).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “trastornos oftálmicos” y/o “condiciones oftálmicas” se refiere a enfermedades, condiciones y/o trastornos oftálmicos, incluyendo, aunque sin limitación, los asociados a la cámara anterior del ojo (es decir, hifema, sinequia), la coroide (es decir, desprendimiento coroidal, melanoma coroidal, síndromes de coroidopatía multifocal), la conjuntiva (es decir, conjuntivitis, penfigoide cicatricial, complicaciones de Bleb filtrante, melanoma conjuntival, fiebre faringoconjuntival, pterigión, carcinoma de células escamosas conjuntival), trastornos del tejido conectivo (es decir, espondilitis anquilosante, pseudoxantoma elástico, abrasión o edema corneal, dermoide limbal, queratitis de distrofia del cristalino, queratoconjuntivitis, queratocono, queratopatía, megalocórnea, úlcera corneal), trastornos dermatológicos (es decir, ecrodermatitis enteropática, dermatitis atópica, rosácea ocular, soriasis, síndrome de Stevens-Johnson), trastornos endocrinos (es decir, apoplejía hipofisaria), trastornos extraoculares (es decir, parálisis del nervio abducens, síndrome de Brown, síndrome de Duane, esotropia, exotropia, parálisis del nervio oculomotor), trastornos hematológicos y cardiovasculares (es decir, arteritis de células gigantes, hipertensión, leucemias, sídnrome isquémica ocular, enfermedad de células falciformes), enfermedades infecciosas (es decir, actinomicosis, botulismo, VIH, difteria, Escherichia coli, tuberculosis, manifestaciones oculares de la sífilis), presión intraocular (es decir, glaucoma, hipotonía ocular, síndrome de Posner-Schlossman), el iris y el cuerpo ciliar (es decir, aniridia, prolapso del iris, xantogranuloma juvenil, melanoma de cuerpos ciliares, melanoma del iris, uveítis), el sistema lacrimal (es decir, alacrima, síndrome del ojo seco, tumores de la glándula lacrimal), el cristalino (es decir, cataratas, lente ectópica, descentrado o dislocación de la lente intraocular), el párpado (es decir, blefaritis, dermatocalasis, distiquiasis, ectropión, coloboma de párpado, síndrome del ojo fláccido, triquiasis, xantelasma), trastornos metabólicos (es decir, gota, hiperlipoproteinemia, síndrome oculocerebrorenal), trastornos neurológicos (es decir, parálisis de Bell, diplopia, esclerosis múltiple), oftalmológicos generales (es decir, ojo rojo, cataratas, degeneración macular), el nervio óptico (es decir, miningioma, neuritis óptica, neuropatía óptica, papiledema), la órbita (es decir, celulitis orbitaria, dermoide orbitaria, tumores orbitarios), facomatosis (es decir, ataxia-telangiectasia, neurofibromastosis-1), presbiopia, la pupila (es decir anisoria, síndrome de Homer), trastornos refractivos (es decir, astigmatismo, hiperopia, miopia), la retina (es decir, enfermedad de Coats, enfermedad de Eales, edema macular, retinitis, retinopatía) y la esclerótida (es decir, episclerisis, escleritis).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fracción de obtención de imágenes” se refiere a cualesquiera grupos o sustancias químicos útiles para aplicaciones de captación de imágenes, tal como son conocidas por el experto en la materia. Entre los ejemplos de agentes de obtención de imágenes se incluyen radioconjugados, citotoxinas, citoquinas, gadolinio-DTPA o un punto cuántico, óxido de hierro y óxido de manganeso. Puede proporcionarse un agente de obtención de imágenes en forma nanoparticulada o en forma microparticulada. Opcionalmente, un agente de obtención de imágenes comprende nanopartículas de gadolinio-DTPA y óxido de hierro (magnetita), como agentes de contraste de imágenes de resonancia magnética (IRM) específicos. Además, un agente de obtención de imágenes puede comprender por lo menos un pigmento del infrarrojo cercano a base de una porfirina y/o una ftalocianina. Ver Ghoroghchian et al., Near-infrared-emissive polymersomes: Self-assembled soft matter for in vivo optical imaging, PNAS, vol. 102, n° 8, 2922-2927, 2005.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “punto cuántico orgánico” se refiere a un compuesto generalmente a base de carbono que presenta una estructura global generalmente de tipo partícula y que comprende una fracción funcional generalmente central. Puede prepararse un punto cuántico orgánico mediante el pliegue de cadenas intramoleculares. Además, puede prepararse un punto cuántico orgánico a partir de un copolímero en bloque que comprende por lo menos dos fracciones reactivos y por lo menos una fracción funcional.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “polímero” se refiere a un compuesto orgánico de peso molecular relativamente elevado, natural o sintético, cuya estructura puede representarse median pequeña repetitiva, el monómero (p.ej., polietileno, caucho, celulosa). Los polímeros sintéticos se Torman típicamente mediante polimerización por adición o condensación de monómeros.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “copolímero” se refiere a un polímero formado a partir de dos o más unidades repetitivas diferentes (residuos monómeros). A título de ejemplo no limitativo, un copolímero puede ser un copolímero alternante, un copolímero aleatorio, un copolímero en bloque o un copolímero injertado. También se encuentra contemplado que diversos segmentos de bloque de un copolímero en bloque puedan ellos mismos comprender copolímeros.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “oligóimero” se refiere a un polímero de peso molecular relativamente bajo en el que el número de unidades repetitivas es de dos a diez, por ejemplo de dos a ocho, de dos a seis, o de dos a cuatro. Una colección de oligómeros puede presentar un número medio de unidades repetitivas de aproximadamente dos a aproximadamente diez, por ejemplo de aproximadamente dos a aproximadamente ocho, de aproximadamente dos a aproximadamente seis, o de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “residuo reactivo” se refiere a una fracción (p.ej., un residuo monómero) capaz de experimentar una reacción química a una temperatura de reacción y/o en respuesta a un estímulo para formar un intermediario reactivo. Un residuo reactivo puede ser una fracción capaz de experimentar una reacción de entrecruzamiento intramolecular para proporcionar el pliegue de cadenas intramoleculares.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “grupo polimerizable” se refiere a un grupo (es decir, una funcionalidad química) capaz de experimentar una reacción de polimerización a una temperatura de polimerización y/o en respuesta a un iniciador de polimerización para formar un polímero o un oligómero. Opcionalmente, la reacción de polimerización es una polimerización de radicales (p.ej., una polimerización de vinilo). Se entiende que pueden utilizarse catalizadores en relación a la reacción de polimerización. Se encuentra contemplado que puedan utilizarse opcionalmente grupos polimerizables en reacciones de crecimiento escalonado o de crecimiento de cadena. Entre los grupos polimerizables ejemplares se incluyen residuos de compuestos de vinilo, estirilo, acriloilo, metacriloilo, arilo y heteroarilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “intermediario reactivo” se refiere a una especie química formada a partir de una fracción reactivo y en respuesta a un estímulo y/o a una temperatura de reacción y capaz de experimentar una reacción química adicional (p.ej., entrecruzamiento9 con otro intermediario reactivo. Dos intermediarios reactivos pueden experimentar una reacción de entrecruzamiento para proporcionar el pliegue de las cadenas intramoleculares.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fracción o-quinoide” se refiere a un intermediario reactivo formado a partir de, por ejemplo, una fracción benzociclobuteno, una temperatura de reacción y/o en respuesta a un estímulo. Una fracción o-quinoide puede presentar la estructura general:
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Se entiende que puede proporcionarse una fracción reactiva capaz de formar una fracción o-quinoide en forma de, por ejemplo, un residuo o en forma de un grupo colgante en un copolímero. Opcionalmente, una fracción oquinoide puede sustituirse adicionalmente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fracción funcional” se refiere a una fracción (p.ej., un residuo monomérico) capaz de llevar a cabo una función, por ejemplo una función de obtención de imágenes o una función de administración de fármaco. Puede proporcionarse una fracción funcional en una parte generalmente central de un punto cuántico orgánico. Una fracción funcional puede comprender una fracción semiconductora, una fracción de obtención de imágenes y/o una fracción de administración de fármaco.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “estímulo” se refiere a una condición o suceso externo que es capaz de actuar sobre una especie reactiva, por ejemplo una fracción reactiva, para producir un intermediario reactivo, por ejemplo una fracción o-quinoide. Un estímulo puede referirse a la temperatura (es decir, un estímulo térmico), una especie química (es decir, un estímulo químico), tal como un radical o un incremento o reducción del pH, o la luz (es decir, un estímulo electromagnético) o una mezcla de los mismos.
Un residuo de una especie química, tal como se utiliza en la especificación y reivindicaciones final una fracción que es el producto resultante de la especie química en un esquema de reacción particular o la formulación o producto químico consecuente, con independencia de si la fracción se obtiene de hecho a partir de la especie química. De esta manera, un residuo etilenglicol en un poliéster se refiere a una o más unidades de -OCH2CH2O- en el poliéster, con independencia de si se utilizó etilenglicol para preparar el poliéster. De manera similar, un residuo ácido sebácico en un poliéster se refiere a una o más fracciones - CO(CH2)8CO- en el poliéster, con independencia de si el residuo se obtuvo haciendo reaccionar ácido sebácico o un éster del mismo para obtener el poliéster.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “sustituido” se encuentra contemplado que incluye todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. Entre los sustituyentes permisibles se incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, y aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Entre los sustituyentes ilustrativos se incluyen, por ejemplo, los indicados posteriormente. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más e iguales o diferentes de los compuestos orgánicos apropiados. Para los fines de la presente exposición, los heteroátomos, tales como nitrógeno, pueden presentar sustituyentes de hidrógeno y/o cualesquiera sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos indicados en la presente memoria que satisfagan las valencias de los heteroátomos. La presente exposición no se pretende que se encuentre limitada en modo alguno a los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. Además, las expresiones “sustitución” o “sustituido con” incluyen el caso implícito de que dicha sustitución se realiza de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitución resulta en un compuesto estable, p.ej., un compuesto que no experimenta espontáneamente transformación, tal como mediante reorganización, ciclización, eliminación, etc.
En la definición de diversos términos, "A1," "A2," "A3," y "A4" se utilizan en la presente memoria como símbolos genéricos para representar diversos sustituyentes específicos. Estos símbolos pueden ser de cualquier sustituyente, no limitados a los dados a conocer en la presente memoria, y en el caso de que se defina que son determinados sustituyentes en un caso, pueden, en otro caso, definirse como algún otro sustituyente.
El término “alquilo” tal como se utiliza en la presente memoria es un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado de 1 a 24 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, tbutilo, n-pentilo, isopentilo, s-pentilo, neopentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y similares. El grupo alquilo también puede encontrarse sustituido o no sustituido. El grupo alquilo puede sustituirse con uno o más grupos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, alquilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo, alcoxi, amino, éter, haluro, hidroxi, nitro, sililo, sulfo-oxo o tiol, tal como se indica en la presente memoria. Un grupo “alquilo inferior” es un grupo alquilo que contiene entre uno y seis átomos de carbono.
Durante toda la especificación, “alquilo” se utiliza generalmente para referirse a grupos alquilo no sustituidos y a grupos alquilo sustituidos; sin embargo, también se hace referencia específica a los grupos alquilo sustituidos en la presente memoria mediante la identificación del sustituyente o sustituyentes específicos en el grupo alquilo. Por ejemplo, la expresión “alquilo halogenado” se refiere específicamente a un grupo alquilo que ha sido sustituido con uno o más haluros, p.ej., flúor, cloro, bromo o yodo. El término “alcoxialquilo” se refiere específicamente a un grupo alquilo que está sustituido con uno o más grupos alcoxi, tal como se indica posteriormente. El término “alquilamino” se refiere específicamente a un grupo alquilo que está sustituido con uno o más grupos amino, tal como se indica posteriormente, y similares. En el caso de que se utilice “alquilo” en un caso y un término específico tal como “alcohol alquílico” se utilice en otro caso, no pretende implicar que el término “alquilo” no se refiere también a términos específicos tales como “alcohol alquílico” y similares.
Esta práctica también se utiliza para otros grupos indicados en la presente memoria. Es decir, aunque un término tal como “cicloalquilo” se refiere a fracciones cicloalquilo tanto no sustituidas como sustituidas, las fracciones sustituidas pueden, además, identificarse específicamente en la presente memoria; por ejemplo, un cicloalquilo sustituido particular puede denominarse, p.ej., “alquilcicloalquilo”. De manera similar, un alcoxi sustituido puede denominarse específicamente, p.ej., “alcoxi halogenado”, un alquenilo sustituido particular puede ser, p.ej., un “alcohol alquenílico”, y similares. Nuevamente, la práctica de utilizar un término general, tal como “cicloalquilo”, y un término específico, tal como “alquilcicloalquilo”, no pretende implicar que el término general no incluye también el término específico.
El término “cicloalquilo” tal como se utiliza en la presente memoria es un anillo a base de carbono no aromático compuesto de por lo menos tres átomos de carbono. Entre los ejemplos de grupos cicloalquilo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, norbornilo y similares. El término “heterocicloalquilo” es un tipo de grupo cicloalquilo tal como se ha definido anteriormente y se encuentra incluido dentro del significado del término “cicloalquilo”, donde por lo menos uno de los átomos de carbono del anillo se sustituye por un heteroátomo tal como, aunque sin limitarse a ellos, nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo. El grupo cicloalquilo y el grupo heterocicloalquilo pueden encontrarse sustituidos o no sustituidos. El grupo cicloalquilo y el grupo heterocicloalquilo pueden sustituirse con uno o más grupos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, alquilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo, alcoxi, amino, éter, haluro, hidroxi, nitro, sililo, sulfooxo o tiol tal como se indican en la presente memoria.
La expresión “grupo polialquileno” tal como se utiliza en la presente memoria es un grupo que presenta dos o más grupos CH2 unidos entre sí. El grupo polialquileno puede representarse por la fórmula -(CH2)a-, donde "a" es un número entero entre 2 y 500.
Los términos “alcoxi” y “alcoxilo” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a un grupo alquilo o cicloalquilo unidos mediante un enlace éter; es decir, un grupo “alcoxi” puede definirse como -OA1 en el que A1 es alquilo o cicloalquilo tal como se ha definido anteriormente. "Alcoxi" incluye además polímeros de grupos alcoxi tal como se ha indicado anteriormente; es decir, un alcoxi puede ser un poliéter, tal como -OA1-OA2 o -OA1-(OA2)a-OA3, en el que "a" es un número entero entre 1 y 200, y A1, A2 y A3 son grupos alquilo y/o cicloalquilo.
El término “alquenilo” tal como se utiliza en la presente memoria es un grupo hidrocarburo entre 2 y 24 átomos de carbono con una fórmula estructural que contiene por lo menos un doble enlace carbono-carbono. Estructuras asimétricas tales como (A1A2)C=C(A3A4) pretende incluir isómeros tanto E como Z. Lo anterior puede suponerse en fórmulas estructurales en la presente memoria en las que se encuentra presente un alqueno asimétrico, o puede indicarse explícitamente mediante el símbolo de enlace C=C. El grupo alquenilo puede sustituirse con uno o más grupos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, aldehído, amino, ácido carboxílico, éster, éter, haluro, hidroxi, cetona, azida, nitro, sililo, sulfo-oxo, o tiol sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria.
El término “cicloalquenilo” tal como se utiliza en la presente memoria es un anillo a base de carbono no aromático compuesto de por lo menos tres átomos de carbono y que contiene por lo menos un doble enlace carbono-carbono, es decir, C=C. Entre los ejemplos de grupos cicloalquenilo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclopentadienilo, ciclohexenilo, ciclohexadienilo, norbornenilo y similares. El término “heterocicloalquenilo” es un tipo de grupo cicloalquenilo tal como se ha definido anteriormente y se encuentra incluido dentro del significado del término “cicloalquenilo”, donde por lo menos uno de los átomos de carbono del anillo se sustituye por un heteroátomo tal como, aunque sin limitarse a ellos, nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo. El grupo cicloalquenilo y el grupo heterocicloalquenilo pueden encontrarse sustituidos o no sustituidos. El grupo cicloalquenilo y el grupo heterocicloalquenilo pueden sustituirse con uno o más grupos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, aldehído, amino, ácido carboxílico, éster, éter, haluro, hidroxi, cetona, azida, nitro, sililo, sulfo-oxo, o tiol sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria.
El término “alquinilo” tal como se utiliza en la presente memoria es un grupo hidrocarburo de 2 a 24 átomos de carbono con una fórmula estructural que contiene por lo menos un triple enlace carbono-carbono. El grupo alquinilo puede encontrarse no sustituido o sustituido con uno o más grupos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, aldehído, amino, ácido carboxílico, éster, éter, haluro, hidroxi, cetona, azida, nitro, sililo, sulfo-oxo o tiol sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria.
El término “cicloalquinilo tal como se utiliza en la presente memoria es un anillo a base de carbono no aromático compuesto de por lo menos siete átomos de carbono y que contiene por lo menos un triple enlace carbonocarbono. Entre los ejemplos de grupos cicloalquinilo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cicloheptinilo, ciclooctinilo, ciclononinilo y similares. El término “heterocicloalquinilo” es un tipo de grupo cicloalquinilo tal como se ha definido anteriormente y se encuentra incluido dentro del significado del término “cicloalquinilo”, donde por lo menos uno de los átomos de carbono del anillo se sustituye por un heteroátomo tal como, aunque sin limitarse a ellos, nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo. El grupo cicloalquinilo y el grupo heterocicloalquinilo pueden encontrarse sustituidos o no sustituidos. El grupo cicloalquinilo y el grupo heterocicloalquinilo pueden sustituirse con uno o más grupos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, aldehído, amino, ácido carboxílico, éster, éter, haluro, hidroxi, cetona, azida, nitro, sililo, sulfo-oxo, o tiol sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria.
El término “arilo” tal como se utilice en la presente memoria es un grupo que contiene cualqueir grupo aromático a base de carbono, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, benceno, naftaleno, fenilo, bifenilo, fenoxibenceno y similares. El término “arilo” incluye además “heteroarilo”, que se define como un grupo que contiene un grupo aromático que presenta por lo menos un heteroátomo incorporado dentro del anillo del grupo aromático. Entre los ejemplos de heteroátomos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. De manera similar, la expresión “no heteroarilo”, que también se encuentra incluida en el término “arilo”, define un grupo que contiene un grupo aromático que no contiene un heteroátomo. El grupo arilo puede encontrarse sustituido o no sustituido. El grupo arilo puede encontrarse no sustituido o sustituido con uno o más grupos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, aldehído, amino, ácido carboxílico, éster, éter, haluro, hidroxi, cetona, azida, nitro, sililo, sulfo-oxo o tiol sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria. El término “biarilo” es un tipo específico de grupo arilo y se encuentra incluido en la definición de “arilo”. Biarilo se refiere arilo que se unen entre sí mediante una estructura de anillos fusionados, tal como en naftaleno, o se unen mediante uno o más enlaces carbono-carbono, tal como en bifenilo.
El término “aldehído” tal como se utiliza en la presente memoria se representa por la fórmula -C(O)H. Durante toda la presente especificación, “C(O)” es la notación abreviada para un grupo carbonilo, es decir, C=O.
Los términos “amina” o “amino” tal como se utilizan en la presente memoria se representan por la fórmula NA1A2A3 , en la que A1, A2 y A3 pueden ser, independientemente, hidrógeno o grupo alquilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo tal como se indica en la presente memoria.
La expresión “ácido carboxílico” tal como se utiliza en la presente memoria se representa por la fórmula -C(O)OH.
El término “éster” tal como se utiliza en la presente memoria se representa por la fórmula -OC(O)A1 o -C(O)OA1, en la que A1 puede ser un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria. El término “poliéster” tal como se utiliza en la presente memoria se representa por la fórmula (A1O(O)C-A2-C(O)O)a- o -(A1O(O)C-A2-OC(O))a-, en la que A1 y A2 pueden ser, independientemente, un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido independientemente indicado en la presente memoria, y “a” es un número entero entre 1 y 500. “Poliéster” es el término utilizado para referirse a un grupo que se produce mediante la reacción entre un compuesto que presenta por lo menos dos grupos ácido carboxílico con un compuesto que presenta por lo menos dos grupos hidroxilo.
El término “éter” tal como se utiliza en la presente memoria se representa por la fórmula A1OA2, en la que A1 y A2 pueden ser, independientemente, un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente indicado en la presente memoria. El término “poliéter” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula -(A1O-A2O)a-, en la que A1 y A2 pueden ser, independientemente, un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido independientemente indicado en la presente memoria, y “a” es un número entero entre 1 y 500. Entre los ejemplos de grupos poliéter se incluyen óxido de polietileno, óxido de polipropileno y óxido de polibutileno.
El término “haluro” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a los halógenos flúor, cloro, bromo y yodo.
El término “heterociclo”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a sistemas de anillos aromáticos o no aromáticos monocíclicos y multicíclicos en los que por lo menos uno de los elementos del anillo es diferente de carbono. Entre los heterociclos se incluyen piridina, pirimidina, furano, tiofeno, pirrol, isoxazol, isotiazol, pirazol, oxazol, tiazol, imidazol, oxazol, incluyendo 1,2,3-oxadiazol, 1,2,5-oxadiazol and 1,3,4-oxadiazol, tiadiazol, incluyendo 1,2,3-tiadiazol, 1,2,5-tiadiazol y 1,3,4-tiadiazol, triazol, incluyendo 1,2,3-triazol, 1,3,4-triazol, tetrazol, incluyendo 1,2,3,4-tetrazol y 1,2,4,5-tetrazol, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, triazina, incluyendo 1,2,4-triazina y 1,3,5-triazina, tetrazina, incluyendo 1,2,4,5-tetrazina, pirroldina, piperazina, morfolina, tetrahidropirano, tetrahidrofurano, dioxano y similares.
El término “hidroxilo” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula -OH.
El término “cetona” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula A1C(O)A2, en la que A1 y A2 pueden ser, independientemente, un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria.
El término “azida” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula -N3.
El término “nitro” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula -NO2.
El término “nitrilo” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula -CN.
El término “sililo” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula -SiA1A2A3 , en la que A1, A2 y A3 pueden ser, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria.
El término "sulfo-oxo" tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante las fórmulas -S(O)A1, -S(O)2A1, -OS(O)2A1, o -OS(O)2OA1, en las que A1 puede ser hidrógeno o un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria. Durante toda la especificación, "S(O)" es una notación abreviad término "sulfonilo" se utiliza en la presente memoria para referirse al grupo sulfo-oxo que se representa mediante la fórmula -S(O)2A1, en la que A1 puede ser hidrógeno o un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria. El término “sulfona” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula A1S(O)2A2, en la que A1 y A2 pueden ser, independientemente, un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria. El término “sulfóxido” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula A1S(O)A2, en la que A1 y A2 pueden ser, independientemente, un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, tal como se indica en la presente memoria.
El término “tiol” tal como se utiliza en la presente memoria se representa mediante la fórmula -SH.
La expresión “residuo orgánico” define un residuo que contiene carbono, es decir, un residuo que comprende por lo menos un átomo de carbono, e incluye, aunque sin limitación, grupos, residuos o radicales que contienen carbono definidos anteriormente en la presente memoria. Los residuos orgánicos pueden contener diversos heteroátomos, o unirse a otra molécula mediante un heteroátomo, incluyendo oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo o similar. Entre los ejemplos de residuos orgánicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, alquilo o alquilo sustituido, alcoxi o alcoxi sustituido, grupos de amida, amino monosustituido o disustituido, etc. Los residuos orgánicos preferentemente pueden comprender 1 a 18 átomos de carbono, 1 a 15 átomos de carbono, 1 a 12 átomos de carbono, 1 a 8 átomos de carbono, 1 a 6 átomos de carbono o 1 a 4 átomos de carbono. Además, un residuo orgánico puede comprender 2 a 18 átomos de carbono, 2 a 15 átomos de carbono, 2 a 12 átomos de carbono, 2 a 8 átomos de carbono, 2 a 4 átomos de carbono o 2 a 4 átomos de carbono.
Un sinónimo muy próximo del término “residuo” es el término “radical”, que tal como se utiliza en la especificación y reivindicaciones finales, se refiere a un fragmento, grupo o subestructura de una molécula indicada en la presente memoria, con independencia de cómo se prepare la molécula. Por ejemplo, un radical 2,4-tiazolidindiona en un compuesto particular presenta la estructura
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con independencia de si se utiliza tiazolidindiona para preparar el compuesto. En algunas realizaciones, el radical (por ejemplo, un alquilo) puede modificarse adicionalmente (es decir, alquilo sustituido) uniendo al mismo uno o más “radicales sustituyentes”. El número de átomos en un radical dado no resulta crucial para la presente invención, a menos que se indique lo contrario en otros sitios en la presente memoria.
“Radical orgánico”, tal como se define y utiliza la expresión en la presente memoria, contiene uno o más átomos de carbono. Un radical orgánico puede presentar, por ejemplo, 1 a 26 átomos de carbono, 1 a 18 átomos de carbono, 1 a 12 átomos de carbono, 1 a 8 átomos de carbono, 1 a 6 átomos de carbono o 1 a 4 átomos de carbono. Además, un radical orgánico puede presentar 2 a 26 átomos de carbono, 2 a 18 átomos de carbono, 2 a 12 átomos de carbono, 2 a 8 átomos de carbono, 2 a 6 átomos de carbono o 2 a 4 átomos de carbono. Los radicales orgánicos con frecuencia presentan hidrógeno unido a por lo menos algunos de los átomos de carbono del radical orgánico. Un ejemplo de un radical orgánico que no comprende átomos inorgánicos es un radical 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftilo. En algunas realizaciones, un radical orgánico puede contener 1 a 10 heteroátomos inorgánicos unidos al mismo o en el mismo, incluyendo halógenos, oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo y similares. Entre los ejemplos de radicales orgánicos se incluyen, aunque sin limitación, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, amino monosustituido, amino disustituido, aciloxi, ciano, carboxi, carboalcoxi, alquilcarboxamida, alquilcarboxamida sustituida, dialquilcarboxamida, dialquilcarboxamida sustituida, alquilsulfonilo, alquilsulfinilo, tioalquilo, tiohaloalquilo, alcoxi, alcoxi sustituido, haloalquilo, haloalcoxi, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, radicales heterocíclicos o heterocíclicos sustituidos, en los que los términos se definen en otros sitios en la presente memoria. Entre unos cuantos ejemplos no limitativos de radicales orgánicos que incluyen heteroátomos se incluyen radicales alcoxi, radicales trifluorometoxi, radicales acetoxi, radicales dimetilamino y similares.
“Radical inorgánico”, tal como se define y utiliza el término en la presente memoria, no contiene átomos de carbono y, por lo tanto, comprende únicamente átomos diferentes del carbono. Los radicales inorgánicos comprenden combinaciones unidas de átomos seleccionados de hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, silicio, fósforo, azufre, selenio y halógenos tales como flúor, cloro, bromo y yodo, que pueden encontrarse presentes individualmente o unidos entre sí en sus combinaciones químicamente estables. Los radicales inorgánicos presentan 10 o menos, o preferentemente uno a seis o uno a cuatro átomos inorgánicos tal como se ha indicado anteriormente unidos entre sí. Entre los ejemplos de radicales inorgánicos se incluyen, aunque sin limitación, amino, hidroxi, halógenos, nitro, tiol, sulfato, fosfato y radicales inorgánicos comúnmente conoc Los radicales inorgánicos no presentan unidos a ellos elementos metálicos de la tabla periódica (tales como los metales alcalinos, metales alcalino-térreos, metales de transición, metales lantánidos o metales actínidos), aunque tales iones metálicos en ocasiones pueden servir como catión farmacéuticamente aceptable para radicales inorgánicos aniónicos, tales como un sulfato, fosfato o radical inorgánico aniónico similar. Los radicales inorgánicos no comprenden elementos metaloides, tales como boro, aluminio, galio, germanio, arsénico, estaño, plomo o telurio, o elementos gases nobles, a menos que se indique específicamente lo contrario en la presente memoria.
Los compuestos indicados en la presente memoria pueden contener uno o más dobles enlaces y, de esta manera, potencialmente dan lugar a isómeros cis/trans (E/Z), así como otros isómeros conformacionales. A menos que se indique lo contrario, la invención incluye la totalidad de tales posibles isómeros, así como mezclas de tales isómeros.
A menos que se indique lo contrario, una fórmula con enlaces químicos mostrada sólo como líneas continuas y no como cuñas o líneas discontinuas contempla cada posible isómero, p.ej., cada enantiómero y diastereómero, y una mezcla de isómeros, tal como una mezcla racémica o escalémica. Los compuestos indicados en la presente memoria pueden contener uno o más centros asimétricos y, de esta manera, potencialmente dan lugar a diastereómeros e isómeros ópticos. A menos que se indique lo contrario, la presente incluye la totalidad de todos los posibles diastereómeros posibles, así como sus mezclas racémicas, sus enantiómeros resueltos sustancialmente puros, todos los posibles isómeros geométricos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. También se encuentran incluidas mezclas de estereoisómeros, así como estereoisómeros específicos aislados. Durante el curso de los procedimientos sintéticos utilizados para preparar tales compuestos, o durante la utilización de procedimientos de racemización o epimerización conocidos por el experto en la materia, los productos de tales procedimientos pueden ser una mezcla de estereoisómeros.
Se dan a conocer los componentes que deben utilizarse para preparar las composiciones de la invención, así como las composiciones mismas que deben utilizarse en los métodos dados a conocer en la presente memoria. Estos y otros materiales se dan a conocer en la presente memoria, y se entiende que, en donde se dan a conocer combinaciones, subgrupos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, aunque la referencia específica a cada una de las diversas combinaciones individuales y colectivas y la permutación de estos compuestos no puede darse a conocer explícitamente, cada uno se encuentra específicamente contemplado e indicado en la presente memoria. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer y comente un compuesto particular y se comenten varias modificaciones que pueden realizarse en varias moléculas, incluyendo los compuestos, se encuentra contempladas específicamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del compuesto y las modificaciones que resultan posibles, a menos que se indique específicamente lo contrario. De esta manera, en el caso de que se dé a conocer una clase de moléculas A, B y C, así como una clase de moléculas D, E y F, y un ejemplo de una molécula de combinación, se divulga A-D, aunque cada uno no se recite individualmente, cada uno se encuentra individual y colectivamente contemplado, es decir, las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F se consideran dadas a conocer. De manera similar, también se divulga cualquier subgrupo o combinación de ellos. De esta manera, por ejemplo, se consideraría divulgado el subgrupo de A-E, B-F y C-E. Este concepto se aplica a todos los aspectos de la presente solicitud, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, las etapas en los métodos de preparación y utilización de las composiciones de la invención. De esta manera, en el caso de que exista una diversidad de etapas adicionales que pueden llevarse a cabo, se entiende que puede llevarse a cabo cada una de estas etapas adicionales con cualquier realización específica o combinación de realizaciones de los métodos de la invención. Se entiende que las composiciones dadas a conocer en la presente memoria presentan determinadas funciones. En la presente memoria se dan a conocer determinados requisitos estructurales para llevar a cabo las funciones dadas a conocer, y se entiende que existe una diversidad de estructuras que pueden realizar la misma función que están relacionadas con las estructuras dadas a conocer y que estas estructuras típicamente conseguirán el mismo resultado.
B. Polímeros
Se entiende que los polímeros dados a conocer pueden utilizarse en relación a las nanopartículas dadas a conocer y métodos dados a conocer. A menos que se indique lo contrario, las estructuras dadas a conocer pueden utilizarse en relación a los métodos dados a conocer, los polímeros dados a conocer y las nanopartículas dadas a conocer.
1. Polímeros funcionalizados con epóxido
En la presente memoria se comenta un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I), anteriormente, y en el que el residuo monómero comprende menos de aproximadamente 10% en peso del residuo monómero de halógeno seleccionado de cloro, bromo y yodo. Opcionalmente, el residuo monómero puede comprender menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4 aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1% de naiogeno seleccionado de cloro, bromo y yodo, en peso del residuo monómero. Opcionalmente, un polímero funcionalizado con epóxido puede comprender además por lo menos un residuo monómero seleccionado de un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente; un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (XI):
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en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que n2 es un número entero entre 0 y 2, y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente.
Opcionalmente, Z es O. Es decir, el residuo polímero puede ser un residuo poliéster. Opcionalmente, el polímero es un poliéster. Opcionalmente, el polímero es un co-poliéster.
Opcionalmente, la Z es NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6. Opcionalmente, el residuo polímero puede ser un residuo poliamida. Opcionalmente, el polímero es una poliamida. Opcionalmente, el polímero es una copoliamida. El alquilo opcionalmente puede sustituirse adicionalmente. R puede ser alquilo C1 a C6, C2 a C6, C1 a C5, C2 a C5, C1 a C4, C2 a C4, C1, C2, C3, C4, C5 o C6.
Se dan a conocer polímeros que comprenden por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida por la fórmula (IV), anteriormente.
Opcionalmente, el polímero comprende además por lo menos un residuo monómero seleccionado de un monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente; un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (XI), anteriormente; y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente.
Opcionalmente, el polímero comprende una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VIII), anteriormente.
Opcionalmente, m puede ser un número entero entre 0 y 6, entre 1 y 6, entre 0 y 5, entre 1 y 5, entre 0 y 4, entre 1 y 4, entre 0 y 3, entre 1 y 3, entre 0 y 2, entre 1 y 2, 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Opcionalmente, m' puede ser un número entero entre 0 y 6, entre 1 y 6, entre 0 y 5, entre 1 y 5, entre 0 y 4, entre 1 y 4, entre 0 y 3, entre 1 y 3, entre 0 y 2, entre 1 y 2, 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Opcionalmente, m1 puede ser un número entero entre 0 y 6, entre 1 y 6, entre 0 y 5, entre 1 y 5, entre 0 y 4, entre 1 y 4, entre 0 y 3, entre 1 y 3, entre 0 y 2, entre 1 y 2, 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Opcionalmente, n puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n' puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n1 puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n2 puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n3 puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2.
RL puede seleccionarse de alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente. Entre los alquilos adecuados se incluyen radicales orgánicos divalentes seleccionados de etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, dodecilo, hexadecilo y alquilo superior. Entre los alcoxilenos adecuados se incluyen radicales orgánicos seleccionados de grupos que presentan una estructura por la fórmula:
Figure imgf000022_0002
Entre los alcoxilenos adecuados adicionales se incluyen radicales orgánicos seleccionados de grupos que presentan una estructura por la fórmula:
Figure imgf000023_0001
Entre los alcoxilenos adecuados adicionales se incluyen un radical orgánico divalente que presenta la estructura por la fórmula:
Figure imgf000023_0002
que puede derivarse de 2,2-(etilén-dioxi)bis(etilamina).
Los polímeros y copolímeros típicamente presentan un peso molecular medio en número (Mn) de entre aproximadamente 3500 y 4800 daltons con una polidispersidad estrecha de aproximadamente 1.17 a aproximadamente 1.27. Se entiende que el peso molecular puede ser superior o inferior y que el experto en la materia podrá manipular fácilmente las condiciones de reacción para conseguir un peso molecular deseado diferente.
2. Polímeros multifuncionales
Opcionalmente, un polímero puede ser un polímero multifuncional. Es decir, el polímero comprende residuos monómeros seleccionados de dos o más de un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente.
Opcionalmente, el residuo monómero funcionalizado con epóxido se encuentra presente y comprende menos de aproximadamente 10% en peso del residuo monómero de halógeno seleccionado de cloro, bromo y yodo. Opcionalmente, el residuo monómero puede comprender menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1% de halógeno seleccionado de cloro, bromo y yodo, en peso del residuo monómero.
Opcionalmente, el polímero comprende además por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa mediante la fórmula (XI), anteriormente.
Opcionalmente, un polímero comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (IV), y uno o más de entre:
un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente. Opcionalmente, el polímero comprende además por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa mediante la fórmula (XI), anteriormente. Opcionalmente, dicho por lo menos un residuo monómero presentan una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VIII), anteriormente.
Opcionalmente, m puede ser un número entero entre 0 y 6, entre 1 y 6, entre 0 y 5, entre 1 y 5, entre 0 y 4, entre 1 y 4, entre 0 y 3, entre 1 y 3, entre 0 y 2, entre 1 y 2, 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Opcionalmente, m' puede ser un número entero entre 0 y 6, entre 1 y 6, entre 0 y 5, entre 1 y 5, entre 0 y 4, entre 1 y 4, entre 0 y 3, entre 1 y 3, entre 0 y 2, entre 1 y 2, 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Opcionalmente, m1 puede ser un número entero entre 0 y 6, entre 1 y 6, entre 0 y 5, entre 1 y 5, entre 0 y 4, entre 1 y 4, entre 0 y 3, entre 1 y 3, entre 0 y 2, entre 1 y 2, 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Opcionalmente, m1' puede ser un número entero entre 0 y 6, entre 1 y 6, entre 0 y 5, entre 1 y 5, entre 0 y 4, entre 1 y 4, entre 0 y 3, entre 1 y 3, entre 0 y 2, entre 1 y 2, 0,1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Opcionalmente, n puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n' puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n1 puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n1' puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n2 puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2. Opcionalmente, n3 puede ser un número entero entre 0 y 2, entre 1 y 2, entre 0 y 1, o 0, 1 o 2.
RL puede seleccionarse de alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente. Entre los alquilos adecuados se incluyen radicales orgánicos divalentes seleccionados de etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, dodecilo, hexadecilo y alquilo superior. Entre los alcoxilenos adecuados se incluyen radicales orgánicos seleccionados de grupos que presentan una estructura por la fórmula:
Figure imgf000024_0001
Entre los alcoxilenos adecuados adicionales se incluyen radicales orgánicos seleccionados de grupos que presentan una estructura por la fórmula:
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Entre los alcoxilenos adecuados adicionales se incluyen un radical orgánico divalente que presenta una estructura por la fórmula:
Figure imgf000024_0003
que puede derivarse de 2,2-(etilén-dioxi)bis(etilamina) o 2,2-(etilén-dioxi)bis(etilazida).
Opcionalmente, un polímero puede comprender por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (V), anteriormente, y uno o más de entre: un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente. Opcionalmente, el residuo monómero funcionalizado con epóxido se encuentra presente y comprende menos de aproximadamente 10% en peso del residuo monómero de halógeno seleccionado de cloro, bromo y yodo.
Opcionalmente, el polímero comprende además por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa mediante la fórmula (XI), anteriormente.
Opcionalmente, por lo menos un residuo monómero presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (IX), anteriormente.
Opcionalmente, por lo menos un residuo monómero presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula:
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en la que m1 y m' son, independientemente, números enteros entre 0 y 6; en el que n1 y n' son, independientemente, número enteros entre 0 y 2; y en el que Z y Z' son, independientemente, O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; y en el que Y' es O, S, o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente.
C. Nanopartículas degradables
Se entiende que las nanopartículas dadas a conocer pueden utilizarse en relación a los polímeros dados a conocer y métodos dados a conocer. A menos que se indique lo contrario, las estructuras dadas a conocer pueden utilizarse en relación a los métodos dados a conocer, los polímeros dados a conocer y las nanopartículas dadas a conocer.
En un aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula polimérica degradable que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VIII), anteriormente, en la que la nanopartícula presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 850 nm, que se comenta en la presente memoria. Según un aspecto particular de la presente invención, la nanopartícula comprende además por lo menos un residuo monómero seleccionado de un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente; un residuo monómero funcionalizado con ceto que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente; y un residuo monómero funcionalizado que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (XI), anteriormente.
Según un aspecto particular de la presente invención, la nanopartícula comprende además por lo menos un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula
Figure imgf000026_0001
Según un aspecto particular de la presente invención, la nanopartícula comprende además por lo menos un residuo monómero funcionalizado que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula
Figure imgf000026_0002
en la que X es OH, SH, NH2 o NHR, en la que R es H o alquilo C1 a C6, y en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono.
Opcionalmente, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
Opcionalmente, la nanopartícula comprende además por lo menos un residuo monómero funcionalizado con nucleófilo que presenta una estructura opcionalmente sustituida que se representa mediante la fórmula (VII), anteriormente.
Opcionalmente, la nanopartícula comprende además por lo menos un residuo monómero funcionalizado que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula:
en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. Opcionalmente, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
Según un aspecto particular de la presente invención, la nanopartícula comprende además por lo menos un residuo monómero funcionalizado que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula
Figure imgf000027_0001
en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. Opcionalmente, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
D. Métodos
Se entiende que los métodos dados a conocer pueden utilizarse en relación a los polímeros dados a conocer y nanopartículas dadas a conocer. A menos que se indique lo contrario, las estructuras dadas a conocer pueden utilizarse en relación a los métodos dados a conocer, los polímeros dados a conocer y las nanopartículas dadas a conocer.
1. Métodos de producción de polímero
Para resolver las deficiencias de las composiciones de nanopartículas y métodos convencionales, se resolvió la disponibilidad de nuevos poliésteres funcionales que permiten enfoques de modificación ortogonal. Además, se dan a conocer estrategias de entrecruzamiento de cadenas controlado para obtener nanopartículas diferentes en una diversidad de dimensiones nanoscópicas. En contraste con la investigación de técnicas de emulsificación en solvente [Hans, M. L.; Lowman, A. M. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 6, 319-327, 2002.] o los métodos de emulsificación-difusión [Kallinteri, P.; Higgins, S.; Hutcheon, G. A.; St. Pourcain, C. B.; Garnett, M. C. Biomacromolecules 6, 1885-1894, 2005] que requieren surfactantes o sales, los métodos y composiciones dados a conocer implican técnicas de entrecruzamiento controlado.
Puede proporcionarse una entidad de entrecruzamiento limpia y no tóxica a partir de grupos epóxido que reaccionan con dinucleófilos (p.ej., diaminas) para formar grupos -OH de alcano. Aunque se ha utilizado esta unidad de entrecruzamiento para formar micropartículas basadas en acrilato [Burke, S. K.; Slatopolsky, E. A.; Goldberg, D. I., Nephrol. Dial. Transplant. 12, (8), 1640-1644, 1997], en ningún caso se ha investigado la formación de nanopartículas degradables debido a la falta de precursores lineales adecuados.
La entidad epóxido para la formación de nanopartículas entrecruzadas discretas puede integrarse mediante polimerización de un copolímero lineal de peso molecular bajo, Ab, con grupos alilo colgantes. Ver la figura 1. Los grupos alilo colgantes representan valiosos intermediarios a muchos grupos funcionales y pueden incorporarse en el esqueleto del polímero mediante copolimerización de a-alil-6-valerolactona, (b), y 6-valerolactona disponible comercialmente, (A), mediante polimerización de apertura de anillos (PAA). [Parrish, B.; Quansah, J. K.; Emrick, T. J. Polym. Sci. Parte A: Polym. Chem. 40:1983-1990, 2002]. Con la copolimerización, los grupos alilo colgantes pueden oxidarse mediante una oxidación de Baeyer-Villiger con ácido metacloroperbenzoico (m-CPBA) para convertir los dobles enlaces en anillos epóxido, que entonces se convierten en un grupo de acoplamiento en la preparación de las nanopartículas. [(a) Mecerreyes, D.; Miller, R. D.; Hedrick, J. L.; Detrembleur, C.; Jerome, R. J. Polym. Sci. Parte A: Polym. Chem. 38:870-875, 2000. (b) Latere, J.P.; Lecomte, P.; Dubois, P.; Jérome, R. Macromolecules 35, 7857-7859, 2002]. El artículo de F "Functionalization of poly(epsilon-caprolactone) by pendant hydroxyl, carboxylic acid and epoxide groups by atom transfer radical addition", Polymer, páginas 8511-8518, 8 de septiembre de 2005, describe la funcionalización de una cadena poliéster biodegradable (poli(£-caprolactona) con grupos hidroxilo, ácido carboxílico y epóxido. Para introducir grupos funcionales adicionales en la nanopartícula, pueden sintetizarse monómeros adicionales, por ejemplo a-propargil-8-valerolactona, (C), y 2-oxepán-1,5-diona, (D). A continuación, estos monómeros pueden copolimerizarse individualmente con (B) y 8-valerolactona, (A), de una manera similar a Ab, dando lugar a poliésteres lineales con funcionalidades propargilo o ceto adicionales, respectivamente. Para incrementar el número de funcionalidades que permiten enfoques de modificación ortogonal, se copolimerizaron (C) y (D) juntos con (b) y 8-valerolactone (A), tal como se resume en la figura 1. Los copolímeros se obtuvieron típicamente en intervalos de peso molecular de 3500 a 4800 Da con polidispersidades estrechas, de 1.17 a 1.27. En la presente memoria se comenta un método para preparar un polímero, que comprende la etapa de copolimerizar una mezcla de dos o más de un monómero funcionalizado con alqueno que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VI), anteriormente; un monómero funcionalizado con propargilo que proporciona un residuo sustituido opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente, y un monómero funcionalizado con ceto que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente.
Opcionalmente, la mezcla comprende además por lo menos un monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (XI), anteriormente.
Opcionalmente, el monómero funcionalizado con alqueno se encuentra presente y el método comprende además la etapa de oxidar el polímero resultante para proporcionar un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I), anteriormente. Opcionalmente, el monómero funcionalizado con alqueno se encuentra presente y presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula:
Figure imgf000028_0001
Opcionalmente, el monómero funcionalizado con propargilo se encuentra presente y presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula:
Figure imgf000028_0002
Opcionalmente, el monómero funcionalizado con ceto se encuentra presente y presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula:
Figure imgf000029_0001
Opcionalmente, el monómero que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (XI) presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula:
Figure imgf000029_0002
En la presente memoria se comenta un método para preparar un polímero funcionalizado con epóxido que comprende la etapa de oxidar un polímero que presenta por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VI), anteriormente.
Opcionalmente, el polímero comprende además por lo menos un residuo monómero seleccionado: la fórmula (II), anteriormente; la fórmula (XI), anteriormente, y la fórmula (III), anteriormente.
Opcionalmente, por lo menos un residuo monómero presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VI), anteriormente, en el que Z es O. Por ejemplo, opcionalmente, m es 1 y n es 0, proporcionando una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula:
Figure imgf000029_0003
Opcionalmente, el polímero funcionalizado con epóxido presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I).
2. Métodos de entrecruzamiento
Se comenta en la presente memoria un método para entrecruzar un polímero que comprende la etapa de hacer reaccionar un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero seleccionado de un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I), anteriormente, y un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente, con un entrecruzante que presenta la estructura por la fórmula X-RL-X', en la que X y X' son, independientemente, N3, OH, SH, NH2 o NHR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente.
Opcionalmente, los grupos conectores pueden ser compuestos bis-nucleofílicos (p.ej., diamina) óxidos de alquileno (p.ej., diamino poli(óxido de etileno)) y/o alquilos (p.ej., 1,8-diaminooctano; jeiaminas) y sus derivados.
Opcionalmente, los grupos conectores pueden ser tioles. Por ejemplo, el dinucleófilo puede presentar una estructura X-RL-X', en la que X y X' son, cada uno, SH, en el que R es H o alquilo C1 a C6, y en la que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente, alcoxileno sustituido opcionalmente y ésteres sustituidos opcionalmente.
Entre los tioles adecuados para el entrecruzamiento se incluyen análogos monotiol y ditiol de compuestos derivados de óxidos de alquileno (p.ej., diamino poli(óxidos de etileno)) y/o alquilos (p.ej., 1,8-diaminooctano, jefaminas) y sus derivados. Entre otros ditioles adecuados para el entrecruzamiento se incluyen:
Figure imgf000030_0001
Una reacción de entrecruzamiento ejemplar, un producto ejemplar del mismo, se muestra a continuación:
Figure imgf000030_0002
Opcionalmente, el entrecruzante reacciona con dos cadenas de polímero. Opcionalmente, X-RL-X' reacciona con dos residuos monómero funcionalizados con epóxido. Opcionalmente, X-RL-X' reacciona con dos residuos monómero funcionalizados con propargilo. Opcionalmente, X-RL-X' reacciona con un residuo monómero funcionalizado con epóxido y un residuo monómero funcionalizado con propargilo. Opcionalmente, X=X'.
Opcionalmente, X=X'=NH2. Opcionalmente, RL comprende dos o más residuos de óxido de etilenc trimetileno. Opcionalmente, X-RL-X' es 2,2-(etilén-dioxi)bis(etilamina). Opcionalmente, X=X'=N3.
Opcionalmente, el polímero comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante una fórmula (I), anteriormente, y en la que X=X'=NH2. Opcionalmente, el polímero y el entrecruzante se hacen reaccionar en una proporción de aproximadamente 1:1 (polímero:entrecruzante). Opcionalmente, el polímero y el entrecruzante se hacen reaccionar en una proporción de aproximadamente >1:1 (polímero:entrecruzante) para proporcionar un polímero con exceso de funcionalización con epóxido. Opcionalmente, el polímero y el entrecruzante se hacen reaccionar en una proporción de aproximadamente <1:1 (polímero:entrecruzante) para proporcionar un polímero con exceso de funcionalización con amino.
Opcionalmente, el polímero comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente, y en la que X=X'=NH3. Opcionalmente, el polímero y el entrecruzante se hacen reaccionar en una proporción de aproximadamente 1:1 (polímero:entrecruzante). Opcionalmente, el polímero y el entrecruzante se hacen reaccionar en una proporción de aproximadamente >1:1 (polímero:entrecruzante) para proporcionar un polímero con exceso de funcionalización con alquino. Opcionalmente, el polímero y el entrecruzante se hacen reaccionar en una proporción de aproximadamente <1:1 (polímero:entrecruzante) para proporcionar un polímero con exceso de funcionalización con azida.
Opcionalmente, el polímero comprende además por lo menos un monómero funcionalizado con ceto, proporcionando un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente.
Opcionalmente, el polímero comprende además por lo menos un monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (XI), anteriormente.
3. Métodos de funcionalización de polímeros
Se comenta en la presente memoria un método para funcionalizar un polímero, que comprenden la etapa de hacer reaccionar un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I), anteriormente, con un nucleófilo que presenta la estructura por la fórmula X-R1, en la que X es OH, SH, NH2 o NHR, en el que R es H o alquilo C1 a C6; y en el que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende 1 a 24 átomos de carbono.
Entre los radicales orgánicos adecuados para la utilización como R1 se incluyen radicales orgánicos monovalentes sustituidos o no sustituidos seleccionados de etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, dodecilo, hexadecilo y alquilos superiores. El alquilo puede ser lineal o ramificado y puede ser cíclico o acíclico. Opcionalmente, R1 puede comprender un alcoxileno sustituido opcionalmente. Entre los alcoxilenos adecuados se incluyen radicales orgánicos monovalentes sustituidos o no sustituidos seleccionados de grupos
Figure imgf000031_0001
en la que R3 comprende alquilo C1 a C6.
Opcionalmente, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes, proporcionando de esta manera un método conveniente para funcionalizar el polímero con uno o más agentes biológicamente activos, agentes farmacéuticamente activos y/o fracciones de obtención de imágenes mediante una reacción de sustitución nucleofílica. Es decir, R1 puede comprender por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes. Opcionalmente, R1 puede comprender por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes. Opcionalmente, R1 puede unirse covalentemente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
Un método para funcionalizar un polímero puede comprender opcionalmente la etapa de hacer reaccionar un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente, con una azida que presenta la estructura por la fórmula N3-R1, en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. Opcionalmente, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
Un método para funcionalizar un polímero puede comprender opcionalmente las etapas de hacer reaccionar un monómero funcionalizado con ceto que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), con una amina que presenta una estructura por la fórmula H2N-R1, en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono, y reducir la imina resultante. Opcionalmente, la etapa de reacción y la etapa de reducción se llevan a cabo simultáneamente. Opcionalmente, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
Un método para funcionalizar un polímero puede comprender opcionalmente la etapa de hacer reaccionar un residuo monómero funcionalizado con nucleófilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VII), anteriormente, con un electrófilo que presenta la estructura por la fórmula E-R1, en la que E es una fracción electrofílica, y en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono.
Opcionalmente, Y' es NH2 o NHR. Opcionalmente, en la que Y=Y'. Opcionalmente, la fracción electrofílica se selecciona de entre haluro de alquilo, pseudohaluro de alquilo y derivado carboxilo. Opcionalmente, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
4. Métodos de producción de nanopartículas
La formación de nanopartículas en dimensiones de tamaño controlado puede realizarse a partir de polímeros lineales que contienen grupos epóxido colgantes que se entrecruzan con 2,2'-(etilén-dioxi)bis(etilamina). Para evaluar la formación de partículas bajo condiciones controladas, se estudiaron reacciones en las que los equivalentes de entrecruzante diamina se incrementaron linealmente con respecto a los grupos epóxido reactivos de los polímeros.
Para conseguir un grado elevado de entrecruzamiento entre las cadenas de poliéster individuales, la solución de polímero con las entidades epóxido colgantes puede añadirse gota a gota a una solución bajo reflujo de diferentes equivalentes de dinucleófilo (p.ej., diamina) en diclorometano. En esta estrategia, la amina difuncional se encuentra en amplio exceso durante la adición (13 ml/min) de la solución de polímero lineal (0,5 M) y, de esta manera, proporciona reacciones de entrecruzamiento óptimas (Tabla 1; tamaño de partícula informado en nm de diámetro mediante dispersión de luz dinámica (DLS, por sus siglas en inglés) en relación a proporciones de amina variables).
Tabla 1: dimensiones de tamaño de partícula (nm)
Am ina/1 Epóxido Diámetro (nm) Diámetro (nm) Diámetro (nm)
Poli(vl-evl) Poli(vi-evl-opd) Poli(vl-evl-pvl)
ÁB ABD ABC
1 30.71 ±2.21 34.29± 3.22 21.40 ± 2.90
o 5806 ± 6.20 63,46± 7.68 41.70 l 5.36
3 82 1 ± 5.7.3 118.3 ± 13.6 114.9 ±8.9
4 115.6 ±25.4 164.9± 65.7 148.3 ± 25.2
5 255.7 ± 60.3 292.7 ± 80.3 186.1 é 37.5
6 342.2 ± 52.2 341.0 ± 86.6 253.9 ± 41.4
S 425.1 ± 100 525.0 ± 100 472,1 ± 103.1
10 725 1 ± 94.3 S00.0± 135 675.0 ± 126.1
Amina/1 Epóxido Diámetro (nm)
Figure imgf000033_0001
PDf I^ ínr
Nanopartículas AB,3 (g.'molf {kg/mol)á
t 30.71 ± 2.21 3403 1.16 60.5 ± 3.5
9 5 S.00 *6.20 3445 1.16 81.5 ± 4.6
3 82.61 ± 5.73 3544 1.17 96.1 ± 4.9
4 115.6 ± 12.5 3S60 L IS 112 ± 6
S 255.7 ± 26.9 4005 LIS 187 ± 8
ó 342.2 ± 42.2 4267 1.21 222 ± 11
8 425.1 ± 44.6 4470 1.21 32S ± 15
10 725.1 ±94.3 4X87 1.22 525 ± 2S
La primera prueba se utilizó con polímero (AB) e implemento 1 a 10 equivalentes de funcionalidades amina a la entidad de entrecruzamiento con epóxido colgante. Las partículas resultantes se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), que proporciona el tamaño real, y mediante dispersión de luz dinámica (DLS), para obtener el diámetro hidrodinámico como medida representativa de la partícula bajo condiciones fisiológicas. Se muestran en la figura 2 micrografías de nanopartículas representativas. También se encuentra contemplado que pueda seleccionarse la estequiometría de la reacción para utilizar más de diez (10) equivalentes, proporcionando de esta manera micropartículas, materiales para el uso en ingeniería de tejidos y biogeles en aplicaciones y dispositivos médicos.
Tal como se ilustra en la figura 3, el tamaño de partícula se incrementa en tendencia polinómica a medida que se incrementan los equivalentes de amina. Por ejemplo, dos equivalentes de amina rindieron partículas de 58 nm y cinco equivalentes produjeron partículas con dimensiones de 255 nm (Tabla 1). Se encontró que los polímeros lineales sintetizados que contenían funcionalidades adicionales (ABC y ABD) respondían de la misma manera a las condiciones controladas de entrecruzamiento de cadenas intermoleculares, tal como con el polímero (AB) de la prueba original, y se obtuvieron nanopartículas bien definidas (Tabla 1). Tal como se muestra en la figura 4, la caracterización de las partículas con r Mn 1H confirmó la formación de nanopartículas para cada prueba con un incremento de las señales a 3.5 y 2.89 ppm, correspondiente a protones vecinos de la amina secundaria del conector polietilenglicol (PEG) después de un suceso de entrecruzamiento con éxito. En particular, se observó un desplazamiento de la resonancia de 2.86 a 2.89 ppm debido al cambio de amina primaria a amina secundaria después del entrecruzamiento. En consecuencia, el incremento continuo de equivalentes de entrecruzante amina no sólo se extiende al tamaño de partícula, sino que también introduce funcionalidades amina adicionales conectadas a un conector PEG corto que se encuentran disponibles para estrategias de modificación adicionales.
En un aspecto particular, la presente invención se refiere a un método para preparar una nanopartícula degradable, que comprende la etapa de añadir un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura por la fórmula:
Figure imgf000034_0001
en la que Z es O o NR, en el que R es H o alquilo C1 a C6, en el que m es un número entero entre 0 y 6, y en el que n es un número entero entre 0 y 2; a una solución de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica:funcionalidad epóxido) que presenta la estructura X-RL-X', en la que X y X' son independientemente OH, SH, NH2 o NHR, en la que R es H o alquilo C1 a C6, y en el que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente. En un aspecto adicional, el residuo monómero comprende menos de aproximadamente 10% en peso del residuo monómero de halógeno seleccionado de cloro, bromo y yodo. En un aspecto adicional, Z es O.
En un aspecto, la solución comprendía desde aproximadamente 1 equivalente molar de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presentaba un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 55 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 1 equivalente molar de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 55 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 2 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 3 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 120 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 4 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 110 nm a aproximadamente 170 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 5 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 175 nm a aproximadamente 300 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 6 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 250 nm a aproximadamente 350 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 8 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 400 nm a aproximadamente 550 nm. En un aspecto adicional, la solución comprende entre aproximadamente 10 equivalentes molares de un dinucleófilo (fracción nucleofílica: funcionalidad epóxido) y la nanopartícula resultante presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 650 nm a aproximadamente 850 nm. También se encuentra contemplado que la estequiometría de la reacción pueda seleccionarse para utilizar más de diez (10) equivalentes molares, proporcionando de esta manera tamaños de partícula mayores.
En la presente memoria se divulga además un método para preparar una nanopartícula degradable que comprende la etapa de añadir un polímero que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura por la fórmula:
en la que Z es O o NR, en la que R es H o alquilo C1 a C6, en el que m1 es un número entero entre o y 6, y en ei que n1 es un número entero entre 0 y 2, a una solución de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 equivalentes molares de una bis-azida (fracción azida:funcionalidad alquino) que presenta la estructura N3-RL-N3, en la que RL se selecciona de entre alquilo sustituido opcionalmente y alcoxileno sustituido opcionalmente. El residuo monómero comprende menos de aproximadamente 10% en peso del residuo monómero de halógeno seleccionado de cloro, bromo y yodo. En un aspecto adicional, Z es O.
En la presente memoria se comenta un método para controlar el tamaño de partícula durante la preparación de una nanopartícula degradable, que comprende la etapa de añadir un polímero funcionalizado con epóxido a una solución de un entrecruzante dinucleofílico, en el que la estequiometría del entrecruzante (proporción de fracción nucleofílica:funcionalidad epóxido) se selecciona para proporcionar un tamaño de partícula deseado según uno o más de los gráficos mostrados en figura 5 - figura 10.
5. Métodos de funcionalización de nanopartículas
En un aspecto, la invención se refiere a un método para preparar una nanopartícula degradable, que comprende funcionalizar una nanopartícula, comprendiendo la etapa de hacer reaccionar una nanopartícula que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícula de entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 850 nm, comprendiendo además por lo menos un residuo monómero funcionalizado con epóxido que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (I), anteriormente, con un nucleófilo que presenta la estructura por la fórmula X-R1 , en la que X es OH, SH, NH2 o NHR, en la que R es H o alquilo C1 a C6, y en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. En un aspecto adicional, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes. En un aspecto, la invención se refiere a un método para preparar una nanopartícula degradable, que comprende funcionalizar una nanopartícula, comprendiendo la etapa de hacer reaccionar una nanopartícula que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícula de entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 850 nm, comprendiendo además por lo menos un residuo monómero funcionalizado con propargilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (II), anteriormente, con una azida que presenta la estructura por la fórmula N3-R1 , en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. En un aspecto adicional, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para preparar una nanopartícula degradable, que comprende funcionalizar una nanopartícula, comprendiendo las etapas de hacer reaccionar una nanopartícula que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícula de entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 850 nm, comprendiendo además por lo menos un monómero funcionalizado con ceto que proporciona un residuo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (III), anteriormente, con una amina que presenta la estructura por la fórmula H2N-R1 , en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono, y reducir la imina resultante. En un aspecto adicional, la etapa de reacción y la etapa de reducción se llevan a cabo simultáneamente. En un aspecto adicional, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para preparar una nanopartícula degradable que comprende funcionalizar una nanopartícula que comprende la etapa de hacer reaccionar una nanopartícula que comprende por lo menos un residuo monómero que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VIII), anteriormente, y que presenta un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 850 nm, que comprende además por lo menos un residuo monómero funcionalizado con nucleófilo que presenta una estructura sustituida opcionalmente que se representa mediante la fórmula (VII), anteriormente, con un electrófilo que presenta la estructura por la fórmula E-R1 , en la que E es una fracción electrofílica, y en la que R1 es un radical orgánico sustituido opcionalmente que comprende entre 1 y 24 átomos de carbono. En un aspecto adicional, Y' es NH2 o NHR. En un aspecto adicional, Y=Y'. En un aspecto adicional, la fracción electrofílica se selecciona de entre haluro de alquilo, pseudohaluro de alquilo y derivado de carboxilo. En un aspecto adicional, R1 se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes.
6. Métodos de degradación de nanopartículas
En la presente memoria se comenta un método para degradar una nanopartícula degradable, que comprende someter la nanopartícula a condiciones de reacción suficientes para hidrolizar un éster. Opcii
condiciones son condiciones biológicas. Opcionalmente, las condiciones implican la exposición a una esterasa. Opcionalmente, las condiciones existen dentro de un organismo.
En la presente memoria se comenta un método para degradar un polímero degradable, que comprende someter el polímero a condiciones de reacción suficientes para hidrolizar un éster. Opcionalmente, el polímero degradable es un polímero divulgado o un producto de un método divulgado.
7. Métodos de administración intracelular
En la presente memoria se comenta un método de administración intracelular que comprenden administrar en un sujeto una cantidad eficaz de una nanopartícula dadivulga. Opcionalmente, la nanopartícula se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes. Opcionalmente, el método comprende además la etapa de degradar la nanopartícula.
En la presente memoria se comenta un método de administración intracelular que comprende administrar una cantidad eficaz de un polímero divulgado o producto de un método divulgado en un sujeto. Opcionalmente, el polímero o producto de un método divulgado se sustituye adicionalmente con por lo menos un agente biológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de obtención de imágenes. Opcionalmente, el método comprende además la etapa de degradar el polímero o producto de un método divulgado.
E. Polímeros funcionalizados y nanopartículas
Opcionalmente, las nanopartículas dadas a conocer pueden funcionalizarse con, por ejemplo, compuestos dendriméricos. Es decir, puede producirse un conjugado de nanopartícula-dendrímero. Opcionalmente, la nanopartícula puede ser un punto cuántico orgánico divulgado mediante pliegue de cadenas intramoleculares. Opcionalmente, la nanopartícula puede ser una nanopartícula degradable divulgada. Opcionalmente, el dendrímero puede ser una composición de administración intracelular divulgada.
Tal como se divulga en la presente memoria, determinadas nanopartículas pueden portar funcionalidades electrofílicas (p.ej., cetona). Puede introducirse una funcionalidad vinilsulfonilo en las nanopartículas dadas a conocer. De esta manera, se preparó una fracción conectora vinilsulfonilo que podía unirse en un procedimiento de aminación reductora a grupos ceto de la partícula. La síntesis de dicho conector aparece en el esquema 1. Se entiende que la cadena alquilo puede homologarse mediante selección de reactivos apropiados.
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Esquema 1. Síntesis de conector SVEC (vinilsulfomlo-carbonato de etilo) y unión a la partícula
La fracción vinilsulfonilo reacciona fácilmente con un nucleófilo (p.ej., un tiol) para formar un enlace covalente, funcionalizando adicionalmente de esta manera una nanopartícula. Estos conectores pueden utilizarse para unir péptidos que se marcan con moléculas de pigmento en el punto focal del péptido u otros grupos amina del péptido. Los grupos tiol de las cisteínas pueden utilizarse para la unión a la función vinilc vinilsulfonilo. Además, el grupo tiol en el punto focal de los transportadores moleculares dendrmcos dados a conocer puede unirse al grupo vinilsulfonilo (o alilo), permitiendo de esta manera unir un transportador a cualquier nanopartícula post-modificada.
Puede utilizarse la misma reacción para unir péptidos que no están marcados con pigmento. En tales casos, la partícula puede marcarse con pigmento o no marcarse.
Los péptidos (u otras aminas) también pueden unirse directamente mediante el extremo amino-terminal del péptido al grupo ceto mediante aminación reductora. Ver el esquema 2. En éste, resulta preferente que el péptido contenga únicamente un grupo amina. Antes de llevar a cabo la aminación reductora, la partícula puede marcarse con un pigmento que se añade a la funcionalidad amina de la partícula. Después de la reacción, pueden inhibirse los pigmentos residuales de manera que no interfieran con la aminación reductora siguiente.
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E s q u e m a 2. Unión de péptido con grupo tiol integrado de cisternas con partícula modificada con conector
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Esquema 3. Unión de pigmento Alexa Fluor a grupos amina libres de la partícula (éster de NHS a amina) y desactivación de las aminas residuales antes de la aminación reductora de aminas de péptidos (compuestos bioactivos) en los grupos ceto de la partícula
Pueden construirse sistemas similares con partículas de reacciones de entrecruzamiento intramolecular. La sustitución de N-BED por un equivalente óxido de etileno potencia la solubilidad del sistema.
Otro enfoque puede permitir la formación de conjugados de nanopartícula-dendrímero implica la unión directa de fracciones funcionalizadas con nucleófilo (p.ej., péptidos o composiciones de administración intracelular dadas a conocer) a una función alílica en las nanopartículas degradables dadas a conocer. Tal como se muestra en el esquema 4, la unión directa de un tiol con un polímero o nanopartícula funcionalizado con alilo puede evitar la utilización del conector SVEC divulgado.
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Esquema 4. Síntesis de precursor lineal de ABdD funcionalizado con aillo
Puede proporcionarse una función alílica en nanopartículas degradables dadas a conocer mediante la oxidación incompleta de funcionalidades epóxido, tal como se muestra en el esquema 5a.
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Esquema 5a. Precursor lineal.
Pueden prepararse todavía otros ejemplos de precursores lineales según el esquema 5b.
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Esquema 5b. Precursor lineal
De esta manera, se encuentra disponible una funcionalidad alilo para la funcionalización y permite condiciones muy suaves para la unión de péptidos y otras fracciones que contienen grupos nucleofílicos (p.ej., tiol). Los grupos alilo de precursores lineales Ab pueden conservarse parcialmente mediante oxidación parcial al epóxido que resulta necesario para el entrecruzamiento a la nanopartícula al polímero lineal AbB. Esta reacción química también es compatible con el precursor lineal ABD que contiene grupo ceto con AbBD.
La formación de nanopartículas no participa en la reacción de entrecruzamiento y, por lo tanto, se encuentra disponible para la modificación adicional. El grupo alilo es inerte bajo las condiciones utilizadas durante el procedimiento de entrecruzamiento. La reacción de entrecruzamiento se ilustra en el esquema 6.
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Esquema 6. Formación de nanopartículas a partir de precursor lineal de ABbD funcionalizado con aillo con dlaminas
Nuevamente, el grupo tiol del punto focal del transportador molecular dendrítico puede unirse al grupo alilo. Una ventaja de dicha unión es que no requiere ningún otro agente. Lo anterior puede permitir que el transportador se una a cualquier nanopartícula ya post-modificada debido a las condiciones suaves de reacción.
Con el fin de seguir el sistema de administración de fármaco y estudiar la incorporación en los tejidos, una fracción de obtención de imágenes (p.ej., una molécula de pigmento, tal como rodamina y otro pigmento) que presenta funcionalidad para reaccionar con aminas tales como éster de NH o isotiocianatos, puede unirse a los grupos amina libres que resultan de la reacción de entrecruzamiento, tal como se muestra en el esquema 7. Los grupos alilo o todos los demás grupos introducidos no resultan afectados.
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E s q u e m a 7. Formación de nanopartícula a partir de precursor lineal de ABbD funcionalizado con alilo con diaminas
A continuación, los grupos alilo pueden hacerse reaccionar con grupos tiol del punto focal del transportador dendrítico, tal como se ilustra en el esquema 8, proporcionando de esta manera nanopartículas degradables múltiplemente funcionalizadas.
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Esquema 8a. Formación de nanoparticula a partir de precursor lineal de ABbD funcionalizado con aillo con diaminas
El número de transportadores moleculares unidos a la partícula puede seleccionarse modificando la estequiometría de los reactivos añadidos a los grupos alilo. Puede llevarse a cabo la misma reacción con grupos tiol unidos a péptidos. Se ha encontrado que temperaturas elevadas tales como 37°C aceleran la reacción pero no destruyen el péptido.
Además, puede unirse una nanopartícula a un transportador molecular dendrítico divulgado mediante una estrategia ejemplar mostrada en el esquema 8b.
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La nanopartícula de la reacción de pliegue de cadenas intramoleculares puede hacerse reaccionar con la óxido de etileno amina N-Boc disponible comercialmente. La amina puede desprotegerse mediante corte con ácido con HCl o ácido fórmico. Algunas de las aminas libres pueden marcarse con pigmento mediante reacción de éster de NH o reacción de tioisocianuro. A continuación, puede conectarse una fracción SVEC mediante u éster de NH. Después de la reacción se desactivan los grupos amina residuales. Los grupos tiol se unen a los grupos de vinilsulfona de SVEC. Los grupos tiol del transportador molecular también pueden unirse de la misma manera que los péptidos, tal como se muestra en el esquema 9a.
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Esquema 9a. Union del peptido de transporte dirigido al sistema de SVEC
Otro ejemplo de unión de un péptido a un núcleo de nanopartícula se muestra en el esquema 9b.
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Esquema 9b. Union del peptido de transporte dirigido a un sistema de nanoparticulas.
Las fracciones de obtención de imágenes (p.ej., pigmentos o fracciones DOTA) que pueden funcionar como unidades terapéuticas y de rastreo también pueden unirse mediante una funcionalidad nucleofílica, tal como se muestra posteriormente.
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Esquema 10. Funcionalizacion de puntos cuánticos orgánicos mediante pliegue de cadenas intramoleculares
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Tampon PBS (pH 7.3)
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o con
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Esquema 11. Desproteccion de triflato con base y unión de SVEC seguido de la desproteccion del conector acihidrazona
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Esquema 12a. DOTA en lugar de pigmento.
Puede funcionalizarse una nanopartícula divulgada, con un pigmento para la obtención de imágenes del ojo en un sujeto. Por ejemplo, dicho método puede llevarse a cabo convenientemente mediante el esquema 12b.
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Esquema 12b. Síntesis para administración de reactivos de obtención de imágenes en el ojo
para pruebas.
Puede utilizarse una reacción química análoga para preparar un sistema de administración de fármaco, que comprende una molécula de fármaco que se une a un conector sensible al pH e incluye un conector hidrazida y doxorrubicina. La síntesis se ilustra en los esquemas 13-15.
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Esquema 15. Union de unidad de transporte dirigido; también c-RGD
Se preparo un nuevo c-RGD que podía unirse a las nanoparticulas y utilizarse para el transporte dirigido de los sistemas de administración dados a conocer (ver el esquema 16).
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La síntesis del c-RGD que contiene amina libre y unidad tiol para la unión a SVEC de la partícula del pliegue de cadenas intramoleculares y el SVEC o el grupo alilo de las partículas de poliéster se detalla en el esquema 17.
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ii eactvo
Esquema 17. Síntesis de C-RGD
La unión del transportador molecular a la maleimida de la partícula de pliegue de cadenas intramoleculares también se ha investigado para crear un sistema que transporte péptidos a una localización intracelular y a través de barreras biológicas. Ver el esquema 18.
También se han investigado modificaciones adicionales de los sistemas de conjugado de nanopaniculadendrímero. Ver los esquemas 19-20. Las modificaciones dadas a conocer, así como transformaciones análogas, resultan en una colección de compuestos disponibles para la utilización en el transporte intracelular.
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Esquema 19. Unión de fracciones dendríticas a puntos cuánticos orgánicos
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Esquema 20. Modificación adicional de puntos cuánticos orgánicos funcionalizados con dendrímero
F. Preparación de un medicamento
Se proporciona además un método para la preparación de un medicamento, tal como un medica
administración de un agente biológicamente activo, un agente farmacéuticamente activo y/o una fracción para la obtención de imágenes, que comprende combinar por lo menos un polímero divulgado o por lo menos una nanopartícula divulgada, con un portador farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica se refiere opcionalmente a una composición para prevenir y/o tratar trastornos oftálmicos.
G. Usos
Se proporcionan además usos de los polímeros, nanopartículas y productos dados a conocer, tales como el uso de un polímero divulgado o de una nanopartícula divulgada para administrar un agente biológicamente activo, un agente farmacéuticamente activo y/o una fracción de obtención de imágenes. Los compuestos, composiciones y conjugados dados a conocer y la síntesis práctica de los mismos proporcionan enfoques para aplicaciones en el tratamiento del cáncer y la administración de fármacos a través de barreras biológicas, tales como la córnea, tejidos, piel y la barrera hematoencefálica.
Dichos polímeros degradables encuentran aplicación en tecnologías de liberación controladas que deben penetrar en tejidos y membranas celulares. De esta manera, los conjugados de nanopartícula-dendrímero que comprenden una nanopartícula degradable divulgada y una composición de administración intracelular divulgada pueden contener y administrar terapéuticos, desde moléculas pequeñas a péptidos, proteínas y anticuerpos de mayor tamaño.
En la presente memoria se comenta la utilización de un polímero divulgado o una nanopartícula divulgada para la administración transcorneal de un agente biológicamente activo, un agente farmacéuticamente activo y/o una fracción de obtención de imágenes.
Muchas regiones del ojo se encuentran relativamente inaccesibles a agentes administrados por vía sistémica. Por ejemplo, los agentes administrados por vía oral pasan por el hígado antes de alcanzar tejidos sensibles a estrógenos. Debido a que el hígado contiene enzimas que pueden inactivar el agente; el agente que finalmente alcanza el tejido diana para el tratamiento puede resultar virtualmente ineficaz. Además, la administración sistémica presenta el riesgo de producir efectos secundarios no deseables. También puede resultar problemático administrar un agente biológicamente activo, un agente farmacéuticamente activo y/o una fracción de obtención de imágenes en el ojo mediante procedimientos invasivos, tales como la inyección. Todavía adicionalmente, el cumplimiento del paciente puede ser bajo en casos de administración invasiva.
Como resultado, la administración de fármaco tópica sigue siendo la ruta preferente de administración en el ojo. Existe una diversidad de factores que afectan a la absorción de fármacos en el ojo. Entre estos factores se incluyen: el volumen instilado del fármaco, la frecuencia de administración de fármaco instilado, la estructura e integridad de la córnea, el nivel de proteínas en las lágrimas, el nivel de enzimas en las lágrimas, el drenaje lacrimal y la tasa de renovación de las lágrimas, así como la tasa de adsorción y absorción de un fármaco por la conjuntiva, esclerótica y párpados. Un modo potencial de reducir o incluso eliminar efectos secundarios sistémicos es mejorar el transporte dirigido ocular que permitiría la utilización de dosis reducidas del agente biológicamente activo en la formación del fármaco oftálmico.
Una barrera importante a la penetración ocular de fármacos es la córnea. La córnea está compuesta de tres capas: un epitelio rico en lípidos, un soma pobre en lípidos y un endotelio rico en lípidos. Por lo tanto, un agente debe poseer un equilibrio lipofílico-hidrofílico para una adecuada penetración transcorneal y, de esta manera, biodisponibilidad ocular (Akers, H.J., "Ocular bioavailability of topically applied ophthalmic drugs," Am Pharm, NS23:33-36, 1983)
De esta manera, los compuestos dados a conocer pueden proporcionar propiedades físicoquímicas mejoradas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, una biodisponibilidad ocular favorable y una fácil penetración transcorneal.
Además, los compuestos dados a conocer pueden tratar y/o proteger frente a diversas enfermedades oculares. Es decir, los compuestos dados a conocer pueden utilizarse para diagnosticar, prevenir y/o tratar trastornos oftálmicos. Los compuestos dados a conocer preferentes pueden resultar eficaces para tratar y/o evitar enfermedades asociadas al daño intraocular que amenaza la visión debido a predisposiciones fisiopatológicas. Entre los compuestos dados a conocer preferentes se incluyen los que tratan la infección retiniana, el glaucoma y/o la degeneración macular.
H. Composiciones farmacéuticas
En la presente memoria se comentan composiciones farmacéuticas que comprenden las composiciones dadas a conocer. Es decir, puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más polímeros dados a conocer y/o uno o más productos
divulgado y/o uno o más nanopartículas dadas a conocer y/o portadores farmacéuticamente aceptaDles para la administración en un mamífero. Opcionalmente, el polímero o polímeros dados a conocer y/o uno o más productos de un método divulgado y/o la nanopartícula o nanopartículas dadas a conocer se sustituyen adicionalmente con por lo menos un agente Diológicamente activo, por lo menos un agente farmacéuticamente activo y/o por lo menos una fracción de oDtención de imágenes.
Las composiciones farmacéuticas: dadas a conocer pueden comprender además otros compuestos terapéuticamente activos, los cuales habitualmente se aplican en el tratamiento de las condiciones patológicas anteriormente indicadas. Se entiende que las composiciones dadas a conocer pueden utilizarse en los métodos de utilización dados a conocer.
I. Kits
Se proporcionan además kits relacionados con las composiciones dadas a conocer, por ejemplo un kit que comprende por lo menos un polímero divulgado, por lo menos una nanopartícula divulgada o por lo menos un producto de un método divulgado. Se entiende que los kits dados a conocer pueden utilizarse en relación a los métodos de utilización dados a conocer.
Se proporcionan además micropartículas y/o redes más grandes, para la utilización como materiales para la ingeniería de tejidos y Diogeles en dispositivos médicos.
Otros aspectos y realizaciones de la invención son tal como se dan a conocer en las reivindicaciones.
J. Parte experimental
Los ejemplos siguientes se proporcionan a fin de proporcionar al experto ordinario en la materia una exposición y descripción completas de cómo los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en la presente memoria se preparan y se evalúan, y pretenden ser meramente ejemplares de la invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números (p.ej., cantidades, temperatura, etc.), aunque deben tomarse en consideración algunos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso; la temperatura se expresa en °C y la presión es igual o aproximadamente igual a la atmosférica.
1. Métodos de caracterización
Los espectros de RMN 1H se obtuvieron de un espectrómetro de transformada de Fourier Bruker AC300, con CDCl3 en TMS como el solvente. Los espectros de RMN 13C se obtuvieron de un espectrómetro de transformada de Fourier Bruker AC400, con CDCh como el solvente.
Se llevó a cabo cromatografía de permeación en gel (GPC, por sus siglas en inglés) en un cromatógrafo Waters dotado de un detector de índice de refracción Waters 2414, un detector de absorbancia de A dual Waters 2481, una bomba de HPLC binaria Waters 1525 y cuatro columnas Waters de 5 mm (300 mm x 7.7 mm) conectadas en serie de tamaño de poro creciente (100, 1000, 100,000 y 1,000,000 Á, respectivamente). Todas las tandas se llevaron a cabo con tetrahidrofurano (THF) como el eluyente a un caudal de 1 ml/min.
Para la dispersión de luz dinámica (DLS), se utilizó un instrumento Zetasizer Nano Series con un sistema de goniómetro compacto CGS-3 de Malvern Instruments (Malvern Zetasizer Nanoseries, Malver, Reino Unido) a un ángulo fijo de 90° a 25°C, calculando la media de tres mediciones. Las partículas se diluyeron con tolueno hasta una concentración de 5-6 mg/ml, que proporcionó el número deseado de pulsos a fin de obtener una buena relación de señal a ruido.
Se prepararon muestras para la obtención de imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) mediante la disolución de 0.5 mg de nanopartículas en 1 ml de isopropanol y 0.3 ml de acetonitrilo. Las muestras se sonicaron durante 5 min y se tiñeron con 2 gotas de ácido fosfotúngstico al 3%. Se prepararon rejillas con carbono aplicando una gota de partículas dispersadas sobre una rejilla de malla de cobre ultradelgada de tipo carbono A400 (Ted Pella, Inc., Redding, CA) y secando a temperatura ambiente. Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión Philips CM20T funcionando a 200 kV en modo de campo brillante para obtener micrografías de TEM de las nanopartículas poliméricas.
Las muestras se centrifugaron a 600 rpm en una centrífuga International modelo CS de International Equipment Company (Boston, MA).
2. Materiales
Los reactivos químicos se obtuvieron de Aldrich (Milwaukee, WI), EMD Alfa-Aesar, Fisher Scientific, y Across y
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3. S í n t e s is d e A - A L I L - A - V A L E R O L A C T O N A ( A V L ) ( B )
U n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 500 m l, d o t a d o d e b a r r a d e a g i t a c ió n , s e s e l ló c o n u n s e p t o , s e p u r g ó c o n n i t r ó g e n o d u r a n t e 30 m in y s e e n f r ió e n u n b a ñ o d e h ie lo s e c o / a c e t o n a . S e a ñ a d ió a l m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o u n a s o l u c ió n d e d i i s o p r o p i l a m i n a d e l i t i o ( 2 , 0 M e n T H F / h e p t a n o / e t i l b e n c e n o , 33 m l, 66 m m o l e s ) . S e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n p u r g a d a c o n n i t r ó g e n o d e 8 - v a le r o l a c t o n a ( 5.43 m l, 60 m m o l e s ) e n T H F ( 60 m l ) m e d ia n t e j e r i n g a d u r a n t e 1.5 h . D e s p u é s d e 30 m in a d i c i o n a le s d e a g i t a c ió n , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e b r o m u r o d e a l i lo ( 6.21 m l, 72 m m o l e s ) e n h e x a m e t i l f o s f o r a m id a ( 12.51 m l, 72 m m o l e s ) m e d ia n t e j e r i n g a d u r a n t e 30 m in . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó h a s t a - 40 ° C u t i l i z a n d o u n b a ñ o d e h ie lo s e c o / a c e t o n a y s e a g i t ó d u r a n t e 3 h . L a r e a c c ió n s e d e s a c t i v ó c o n s o l u c ió n d e N H 4C l e n e x c e s o y s e c a l e n t ó h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . E l p r o d u c t o e n b r u t o s e la v ó d o s v e c e s c o n s o l u c ió n h ip e r s a l i n a , s e s e c ó c o n s u l f a t o d e m a g n e s i o a n h id r o y s e c o n c e n t r ó c o n u n e v a p o r a d o r r o t a t o r io . L a c r o m a t o g r a f í a d e c o l u m n a u t i l i z a n d o C H 2C h p r o p o r c io n ó u n p r o d u c t o a m a r i l l o v is c o s o . R e n d im ie n t o : 3 , 4262 g ( 41 % ) . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : 5.7 ( m , 1 H , H 2C = C H - ) , 5.08 ( m , 2 H , H 2C = C H - ) , 4.28 ( m , 2 H , - C ( O ) O C H 2- ) , 2 .53 - 2 .58 ( m , 2 H , H 2C = C H C H 2- ) , 2.27 ( m , 1 H , H 2C = C H C H 2C H - ) , 2.06 ( m , 1 H , H 2C = C H C H 2C H C H 2- ) , 1.89 ( m , 2 H , C ( O ) O C H 2C H 2- ) , 1.55 ( m , 1 H , H 2C = C H C H 2C H C H 2- ) ; R M N 13 C ( 400 M H z , C D C la , p p m ) 8 : 173.8 ( - C ( O ) O - ) , 135.0 ( H 2C = C H - ) , 117.4 ( H 2C = C H - ) , 68.4 ( - C ( O ) O C H 2- ) , 39.2 ( H 2C = C H C H 2 C H - ) , 35.4 ( H 2C = C H C H 2- ) , 24 .0 ( - C H 2C H 2C H 2- ) , 21 .9 ( - C H 2 C H 2C H 2- ) -
4. S í n t e s is d e c o p o l í m e r o P O L I ( V L - A V L ) ( A B )
U n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 3 c u e l lo s d e 50 m l, d o t a d o d e b a r r a d e a g i t a c ió n , s e s e l ló c o n d o s s e p t o s y u n a e n t r a d a d e g a s e s . S e e v a c u ó e l m a t r a z y s e r e l l e n ó c o n n i t r ó g e n o t r e s v e c e s . S e p r e p a r a r o n s o l u c io n e s m a d r e d e e t a n o l ( E t O H ) 1.7 M e n T H F y 2 - e t i l h e x a n o a t o d e e s t a ñ o ( I I ) ( S n ( O c t ) 2 ) 3 .7 x 10 '2 M e n T H F s e p r e p a r a r o n e n m a t r a c e s p u r g a d o s c o n N 2. S e a g r u p a r o n s o l u c io n e s d e E t O H ( 0.32 m l, 5 .410 x 10 '1 m m o l e s ) y S n ( O c t ) 2 ( 0.30 m L , 1 .12 x 10 '2 m m o l e s ) e n e l m a t r a z d e 50 m l p u r g a d o c o n n i t r ó g e n o . T r a s a g i t a r la m e z c la d u r a n t e 30 m in , s e a ñ a d ió a - a l i l - 8 - v a le r o l a c t o n a ( 1 .16 g , 8.32 m m o l e s ) y 8 - v a le r o l a c t o n a ( v l , 2.5 g , 24 .97 m m o le s ) . E l r e c ip i e n t e d e r e a c c ió n s e a g i t ó e n u n b a ñ o d e a c e i t e a 105 ° C d u r a n t e 48 h . S e e x t r a jo e l m o n ó m e r o r e s id u a l y c a t a l i z a d o r m e d ia n t e d i á l i s i s c o n m e m b r a n a d e d i á l i s i s S p e c t r a / P o r ® ( M W C O = 1000 ) f r e n t e a C H 2C h , p r o p o r c io n a n d o u n p o l í m e r o m a r r ó n d o r a d o . R e n d im ie n t o : 3 , 2398 g ( 88 % ) . M w = 4834 D a , P D I = 1.17 ; R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : 5.7 ( m , H 2C = C H - ) , 5.09 ( m , H 2C = C H - ) , 4.09 ( m , - C H 2- O - ) , 3.65 ( m , C H 3C H 2O - ) , 2.35 ( m , v l , - C H 2C H 2C ( O ) O - , a v l , H 2C = C H C H 2C H - , H 2C = C H C H 2C H - ) , 1.68 ( m , a v l & v l , - C H C H 2C H 2- ) , 1.25 ( t , C H 3C H 2O - ) ; R M n 13 C ( 400 M H z , C D C la , p p m ) 8 : 174.6 ( a v l , - C ( O ) - ) , 172.7 ( v l , - C ( O ) - ) , 134.6 ( H 2C = C H - ) , 116.4 ( H 2C = C H - ) , 63.3 , 44.3 , 35.9 , 33.1 , 27.5 , 25.9 , 23.6 , 20.9.
5. S í n t e s is d e A - P R O P A R G I L - A - V A L E R O L A C T O N A ( P V L ) ( C )
U n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 250 m l, d o t a d o d e b a r r a d e a g i t a c ió n , s e s e l ló c o n u n s e p t o , s e p u r g ó c o n n i t r ó g e n o d u r a n t e 30 m in y s e e n f r ió e n u n b a ñ o d e h ie lo s e c o / a c e t o n a . S e a ñ a d ió a l m a t r a z u n a s o l u c ió n d e d i i s o p r o p i l a m i n a d e l i t i o ( 2 , 0 M e n T H F / h e p t a n o / e t i l b e n c e n o , 22 m l, 44 m m o le s ) . S e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n p u r g a d a c o n n i t r ó g e n o d e 8 - v a le r o l a c t o n a ( 3.62 m l, 40 m m o l e s ) e n T H F ( 40 m l ) m e d ia n t e j e r i n g a d u r a n t e 1.5 h . D e s p u é s d e 30 m in a d i c i o n a le s d e a g i t a c ió n , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e b r o m u r o d e p r o p a r g i lo ( 4.34 m l, 48 m m o l e s ) e n h e x a m e t i l f o s f o r a m id a ( 8.4 m l, 48 m m o l e s ) m e d ia n t e j e r i n g a d u r a n t e 20 m in . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó h a s t a - 30 ° C u t i l i z a n d o u n b a ñ o d e h ie lo s e c o / a c e t o n a y s e a g i t ó d u r a n t e 3 h . L a r e a c c ió n s e d e s a c t i v ó c o n s o l u c ió n d e N H 4C l e n e x c e s o y s e c a l e n t ó h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . E l p r o d u c t o e n b r u t o s e la v ó d o s v e c e s c o n s o l u c ió n h i p e r s a l i n a , s e s e c ó c o n s u l f a t o d e m a g n e s i o a n h id r o y s e c o n c e n t r ó c o n u n e v a p o r a d o r r o t a t o r io . L a c r o m a t o g r a f í a d e c o l u m n a u t i l i z a n d o C H 2C l2 p r o p o r c io n ó u n p r o d u c t o a m a r i l l o v is c o s o . R e n d im ie n t o : 2 , 8194 g ( 50 , 6 % ) . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : 4.35 ( m , 2 H , - C ( O ) O C H 2- ) , 2 .69 ( m , 2 H , - C ( O ) C H C H 2C E C H ) , 2.53 ( m , 1 H - C ( O ) C H C H 2C e C H ) , 2.29 ( m , 1 H , - C H C H 2C H 2- ) , 2.05 ( s , 1 H , H C E C C H 2- ) , 1.96 ( m , 2 H , - C H C H 2C H 2- ) , 1.74 ( m , 1 K - C H C H 2C H 2- ) ; R M N 13C ( 400 M H z , C D C h , p p m ) 8 : 172.8 , 80.8 , 70.1 , 68.5 , 38.5 , 23.8 , 21.7 , 20.4.
6 . S í n t e s is d e c o p o l í m e r o P O L I ( V L - A V L - P V L ) ( A B C )
U n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 3 c u e l lo s d e 50 m l, d o t a d o d e b a r r a d e a g i t a c ió n , s e s e l ló c o n d o s s e p t o s y u n a entrada de gases. Se evacuó el matraz y se rellenó con nitrógeno tres veces. Se prepararon sol de etanol (EtOH) 1.7 M en THF y Sn(Oct)2 3.7x10-2 M en THF en matraces purgados con N2. Se agruparon soluciones de etanol (0.21 ml, 3.69x10-1 mmoles) y Sn(Oct)2 (0.20 ml, 5.41x10-3 mmoles) en el matraz de 50 ml purgado con nitrógeno. Tras agitar la mezcla durante 30 min, se añadió a-alil-8-valerolactona (0.8 g, 5.7 mmoles), 8-valerolactona (1.26 g, 12.6 mmoles) y a-propargil-8-valerolactona (0.63 g, 4.6 mmoles). El recipiente de reacción se agitó en un baño de aceite a 105°C durante 48 h. Se extrajo el monómero residual y catalizador mediante diálisis con membrana de diálisis Spectra/Por® (MWCO=1000) frente a CH2Ch, proporcionando un polímero marrón dorado. Rendimiento: 2,25 g (84%). Mw = 3500 Da, pDI = 1.26; RMN 1H (300MHz, CDCh/TMS, ppm) 8: 5.71 (m, H2C=CH-), 5.03 (m, H2C=CH-), 4.08 (m, -CH2O-), 3.65 (m, CH3CH2O-), 2.55 (m, pvl, -C(O)CH-, -CHCH2CECH), 2.45 (m, -CH2CECH), 2.34 (m, vl, -CH2CH2C(O)O-, avl, H2C=CHCH2CH-, H2C=CHCH2CH-), 2.02 (m, pvl, -CeCH), 1.68 (m, pvl, avl & vl, -CHCH2CH2-), 1.259 (t, CH3CH2O-); RMN 13C (400MHz, CDCla , ppm) 8: 174.6, 172.7, 133.6, 117.2, 80.7, 69.9, 63.3, 44.3, 35.9, 33.1, 27.5, 25.9, 23.6, 20.9.
7. Síntesis de 2-OXEPÁN-1,5-DIONA (OPD) (D)
Un matraz de fondo redondo de 100 ml, dotado de barra de agitación, se cargó con 1,4-ciclohexanodiona (2.0 g, 17.84 mmoles) y ácido 3-cloroperoxibenzoico (4.5 g, 26.08 mmoles). Se añadió diclorometano (22 ml) y la mezcla de reacción se agitó y se sometió a reflujo durante 3 h a 40°C. La mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se secó con MgSO4 anhidro. Se eliminó el solvente mediante evaporación rotatoria. El producto en bruto se lavó tres veces con éter dietílico frío (100 ml para cada lavado) y se secó al vacío a temperatura ambiente. Rendimiento: 1,4814 g (64,7%). RMN 1H (300MHz, CDCl/TMS, ppm) 8: 4.4 (t, 2H, -C(O)OCH2CH2C(O)-), 2.84 (dd, 2H, -CH2C(O)O-), 2.72 (m, 4H, -CH2C(O)CH2-); RMN 13C (400MHz, CDCla , ppm) 8: 204.9 (-C(O)-), 173.3 (-C(O)O-), 63.3 (-CH2O-), 44.7(-OCH2CH2C(O)-), 38.6 (-C(O)CH2CH2C(O)-), 27.9 (-CH2C(O)O-).
8. Síntesis de copolímero POLI(VL-AVL-OPD) (ABD)
A un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 50 ml, dotado de barra de agitación, condensador, purga de nitrógeno y septos, 2-oxepán-1,5-diona (0.6987 g, 5.45 mmoles) y tolueno seco (4 ml). La mezcla se agitó en un baño de aceite a 70°C para disolver el monómero. Tras la disolución, se añadieron 8-valerolactona (1.5 g, 14.98 mmoles), a-alil-8-valerolactona (0.9546 g, 6.81 mmoles), etanol absoluto (0.0205 g, 4.4 x10' 1 mmoles) y Sn(Oct)2 (0.0119 g, 2.73x10' 2 mmoles) al reactor y la mezcla se calentó durante 48 h a 110°C. Se eliminaron el monómero residual y el catalizador mediante diálisis con la membrana de diálisis Spectra/Por® (MWCO=1000) frente a CH2Cl2 , proporcionando un polímero marrón dorado. Rendimiento: 2,6894 g (85%). Mw = 4858 Da, p Di = 1.27; RMN 1H (300MHz, CDCh/TMS, ppm) 8: 5.72 (m, H2C=CH-), 5.06 (m, H2 C=CH-), 4.34 (m, -CH2CH2C(O)CH2CH 2O-), 4.08 (m, -CH2 O-), 3.67 (m, -OCH 2CH3), 2.78 (m, opd,-OC(O)CH2CH 2C(O)CH2-), 2.58 (m, opd, -OC(O)CH2CH2C(O)CH2-), 2.34 (m, vl, -CH2CH2C(O)O-, avl, H2C=CHCH2CH-, H2C=CHCH2CH-), 1.66 (m, avl y vl, -CHCH2CH2-), 1.25 (t, -CH2CH3); RMN 13C (400MHz, CDCh, ppm) 8: 204.9, 175.2, 173.7, 173.2, 135.0, 117.0, 63.9, 44.8, 36.4, 33.6, 28.0, 26.3, 21.3.
9. Síntesis de copolímero POLI(VL-AVL-PVL-OPD) (ABCD)
A un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 25 ml, dotado de una barra de agitación, se añadió 2-oxepán-1,5-diona (0.2626 g, 2.05 mmoles) y el matraz se selló con dos septos y una entrada de gases. Se evacuó el matraz y se rellenó con argón tres veces. Se añadió tolueno seco (1.25 ml) y la mezcla se agitó en un baño de aceite a 70°C para disolver el monómero. Tras la disolución, se añadieron Sn(Oct)2 (0.0018 g, 4.41x10' 3 mmoles en 0.15 ml de tolueno seco), etanol absoluto (12.8 pl, 2.22x10' 1 mmoles), 8-valerolactona (0.62 g, 6.2 mmoles), aalil-8-valerolactona (0.38 g, 2.69 mmoles) y a-propargil-8-valerolactona (0.38 g, 2.73 mmoles). La temperatura del baño de aceite se incrementó a 105°C y la mezcla se agitó durante 50 h. Se eliminaron el monómero residual y el catalizador mediante diálisis con la membrana de diálisis Spectra/Por® (MWCO=1000) frente a CH2Ch, proporcionando un polímero marrón dorado. Rendimiento: 1,31 g (80%). Mw = 3525 Da, PDI = 1.27; RMN 1H (300MHz, CDCh/TMS, ppm) 8: 5.86 (m, H2C=CH-), 5.09 (m, H2C =CH-), 4.34 (m, opd, -CH2CH2C(O)CH2CH2O-), 4.08 (m, avl, pvl y vl, -CH2O-), 3.65 (m, -OCH2CH3), 2.74 (m, opd, -OC(O)CH-2CH2C(O)-), 2.60 (m, opd, -CH2CH2C(O)CH2CH2-, pvl, -OC(O)CH-, -CHCH2CECH), 2.50 (m, CHCH2CECH), 2.34 (m, vl, -CH2CH2C(O)O-, avl, H2C=CHCH2CH-, H2C=CHCH2CH-), 2.02 (m, HCEC-), 1.68 (m, pvl, avl & vl,-CHCH2CH2-), 1.25 (m, -CH2CH3).
10. Procedimiento general para la oxidación de copolímeros
En un matraz de fondo redondo de 200 ml, dotado de barra de agitación, se disolvió poli(vl-avl) (2.7389 g, 6.12 mmoles) en 37 ml de CH2Cl2. A esta solución se añadió lentamente ácido 3-cloroperoxibenzoico (2.0903 g, 12.11 mmoles). La mezcla se agitó durante 72 h a temperatura ambiente y después se concentró mediante un evaporador rotatorio. El producto en bruto se disolvió en una cantidad mínima de THF (5 ml) y se vertió en un matraz de fondo redondo que contenía 1 l de éter dietílico. La solución se mantuvo durante la noche a 0°C y se obtuvo un sólido blanco. Se eliminó la solución mediante decantación y el sólido se secó al vacío, obteniendo poli(vl-evl). Rendimiento: 1,9467 g (71%). RMN 1H (300MHz, CDCh /TMS, ppm) 8: El cambio significativo puede la desaparición de los protones alílicos a 5.7 y 5.09 ppm y la aparición de pequeños picos de res en 2.96, 2.75 y 2.47 ppm debido a la formación del anillo epóxido. Todos los demás aspectos del espectro eran similares.
11. Procedimiento general para la formación de nanopartículas
En un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 100 ml dotado de barra de agitación, condensador y septos, se añadió una solución de 2,2'-(etilén-dioxi)dietilamina (39.3 pl, 2.68x10-4 moles) en 27.6 ml de C^Ch. Se añadió gota a gota una solución de poli(vl-evl) (0.1330 g, Mw= 4834 Da, PDI=1.17) disuelta en CH2Ch (0.18 ml) mediante una bomba peristáltica a un caudal de 13 ml/min con agitación vigorosa. La mezcla se calentó bajo reflujo durante un total de 12 h. Se eliminó la diamina residual mediante diálisis con tubos de diálisis plegados SnakeSkin® (MWCO=10,000) frente a diclorometano. RMN 1H (300MHz, CDCh/TMS, ppm) 8: El cambio significativo fue la desaparición de los protones de epóxido en 2.96, 2.75 y 2.47 ppm y la aparición de señales en 3.5 y 2.89 ppm correspondientes a los protones vecinos de la amina secundaria del conector PEG después del entrecruzamiento. Todos los demás aspectos del espectro eran similares.
12. Determinación del contenido de amina
Las nanopartículas pueden titularse con un ácido fuerte para determinar el contenido de amina. Tal como se muestra en la tabla 2, se titularon varias muestras de nanopartículas de poli(vl-evl) (AB) con ácido perclórico para determinar los porcentajes en peso (% en peso) de amina primaria y amina secundaria en las tres muestras que se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión. Las tres muestras (mostradas en la tabla 2) tituladas presentaban las dimensiones de tamaño siguiente según la DLS: 58.06, 255.7 y 425.1 nm.
Tabla 2: correlación entre tamaño de partícula y contenido de amina
Figure imgf000059_0002
13. Nanopartículas formadas mediante copolimerización
Aunque las nanopartículas se preparan típicamente con un único tipo de polímero o copolímero, también se han producido con éxito nanopartículas a partir de una mezcla de poli(vl-evl-pvl) y poli(vl-evl-opd). Se tabulan dichas nanopartículas en la tabla 3.
Tabla 3: Nanopartículas formadas de dos polímeros
Figure imgf000059_0003
14. Modificación del contenido de comonómero
Las propiedades de las nanopartículas pueden ajustarse adicionalmente mediante la incorporación de diferentes porcentajes de epoxi-8-valerolactona (evl) en el esqueleto del polímero. Los datos resumidos en la tabla 4, posteriormente, muestran las nanopartículas preparadas a partir de poli(vl-evl) lineal con 2% de evl, 7% de evl y 19% de evl. Estos datos muestran que, a medida que el % de evl se reduce hasta 2% en el polímero lineal, pueden obtenerse nanopartículas más pequeñas. A medida que el % de evl se incrementa hasta 19%, las nanopartículas resultantes son más grandes, aunque presentan una desviación pequeña en comparación con las nanopartículas más grandes preparadas a partir de poli(vl-evl) con 7% de evl.
Tabla 4: Efecto de la modificación del contenido de comonómero
Figure imgf000059_0001
La relación entre la estequiometría de la reacción y el tamaño de partícula para diversos contenidos de monómero se ilustra adicionalmente en la figura 8 - figura 10.
15. Adición de etilendiamina 2-VINILSULFONIL-ETIL carbonato a nanopartículas de ABD (POLI(VL-EVL-OPD)) En un matraz de fondo redondo de 100 ml dotado de barra de agitación, se disolvieron nanopartículas ABD (0.0846 g, 2.45x10'4 mmoles) en 12.5 ml de CH2Ch. A dicha solución se añadió etilendiamina 2-(vinilsulfonil)-carbonato de etilo en metanol (0.0152 g en 69 j l de metanol, 5.89x10'2 mmoles). Se disolvió cianoborohidruro sódico (0.0111 g, 1.76x10'1 mmoles) en 12.5 ml de metanol y se añadió al matraz de fondo redondo. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH 6.5 con NaOH acuoso 1 M y HCl 1 M. La mezcla se agitó durante 25 h a temperatura ambiente y después se dializó con tubos de diálisis plegados SnakeSkin® (MWCO=10,000) frente a diclorometano/metanol 1:1. Se observó la unión con éxito del conector mediante la aparición de las señales 6.7 ppm y 6.9 ppm (RMN1H, 300 MHz CDCh/TMS) debido a los protones de vinilo del conector.
16. Unión de GV-13-ALEXAFLUOR 750 a nanopartículas ABD
En un vial pequeño dotado de una barra de agitación se disolvieron nanopartículas de conector modificado (L-ABD) (29.9 mg) en 800 j l de tampón PBS (pH 7.2) y 700 j l de dimetilformamida. A dicha solución se añadieron 251 j l de GV-13-Alexafluor (0.44 mg en 150 j l de tampón PBS y 26.5 j l de DMF) al vial mediante una micropipeta. Tras 45 min de agitación a temperatura ambiente, se añadió GV-13 (2.08 mg, 1.9x10'3 mmoles) disuelto en 200 j l de tampón PBS. La mezcla de reacción se agitó durante 24 h en un vaso cubierto con aluminio. La mezcla resultante se purificó con tubos concentradores (MWCO=10,000) para eliminar el exceso de GV-13 y GV-13-Alexafluor. El producto purificado se concentró mediante evaporador rotatorio. Se observó la unión con éxito del péptido y el pigmento por la presencia de un color azul brillante debido al pigmento. La RMN 1H también mostraba la presencia del péptido.
Parte general. Se obtuvieron reactivos comerciales de proveedores comerciales (Aldrich, EMD, Alfa-Aesar, Fisher Scientific y Across) y se utilizaron sin purificación adicional. Se llevó a cabo TLC analítica en placas Merck comerciales recubiertas con gel de sílice GF254 (0.24 mm de grosor) y los puntos se localizaron con luz UV (254 y 366 nm). El gel de sílice para la cromatografía flash era Merck Kieselgel 60 (malla de 230-400, ASTM) o de 60 A de Sorbent Technologies (40 a 63 jm, grado técnico). Se obtuvo MAL-dPeg™4-t-boc-hidrazida de Quanta Biodesign, Ltd. (Powell, OH) y se utilizó sin modificación. El pigmento Cy3 NHS y las columnas de desalado PD-10 se recibieron de GE Healthcare (Piscataway, NJ). Las membranas de diálisis de éster de celulosa (CE, por sus siglas en inglés) Spectra/Por® Biotech (1,000 MWCO) se obtuvieron de Spectrum Laboratories, Inc. (Rancho Domínguez, CA). Los tubos de diálisis plegados SnakeSkin® (MWCO de 10,000) se obtuvieron de Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).
Instrumentación: Las muestras se centrifugaron a 600 rpm en una centrífuga International modelo CS de International Equipment Company (Boston, MA). Se llevó a cabo cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) con un HPLC Varian Prostar. Los productos se eluyeron utilizando un gradiente de solventes (solvente A=TfA al 0.05%/H2O; solvente B=TFA al 0.05%/CH3c N). Se llevó a cabo resonancia magnética nuclear en espectrómetros de transformada de Fourier Bruker AC300 y AC400 utilizando solventes deuterados y el pico de solvente como referencia. Se llevó a cabo cromatografía de permeación en gel en tetrahidrofurano (THF) con el eluyente a un caudal de 1 ml/min en un cromatógrafo Waters dotado de cuatro columnas Waters de 5 mm (300 mm x 7.7 mm) conectadas en serie con tamaño de poro creciente (100, 1000, 100,000 y 1,000,000 A respectivamente). Se utilizó un detector de absorbancia de A dual Waters 2487 y un detector de índice de refracción 2414. Se llevó a cabo dispersión de luz dinámica en un instrumento Malvern Zetasizer Nanoseries con un sistema de goniómetro compacto CGS-3.
17. Síntesis de compuesto 1
A una solución de dimetoxietano (40 ml) se añadió MeNO2 (11.37 ml, 200 mmoles) seguido de Triton B (2 ml). La mezcla se calentó a 67°C y después se añadió acrilato de terc-butilo (91.83 ml, 620 mmoles) para mantener la temperatura a 75°C. Al iniciarse la reducción de la temperatura, se añadió Triton B adicional (1 ml). Tras completar la adición, se calentó la solución para mantener la temperatura a 75°C durante 2 horas. Se eliminó el solvente al vacío y el residuo se disolvió en CHCh y la solución orgánica resultante se lavó con HCl al 10%, solución hipersalina y se secó sobre Na2SO4 anhidro. La eliminación del solvente al vacío proporcionó un sólido en bruto que se purificó adicionalmente mediante recristalización a partir de EtOH, obteniendo un cristal incoloro (rendimiento de 95%). RMN 1H (CDCl3): 81.44 (s, CH3, 27H), 2.21 (m, CH2, 12H). RMN 13C (CDCl3): 27.93 (CH3), 29.68 (CH2CO), 30.22 (CCH2), 81.02 (CCH3), 92.09 (CNH2), 170.97 (CO2).
18. Síntesis de compuesto 2
Una solución de compuesto 1 (6.0 g, 0.0135 moles) en una mezcla de etanol (140 ml) y diclorometano (20 ml) se añadió a una botella de hidrogenación de Parr. A continuación, se añadieron 4 gramos de níquel de Raney. La mezcla se hidrogenó a 50 psi y temperatura ambiente. La reacción se monitorizó mediante cromatografía de capa fina (TLC) hasta desaparecer el material de partida. El catalizador se filtró cuidadosamente a través de Celite y se eliminó el solvente al vacío, rindiendo un sólido en bruto. El residuo se disolvió en diclc
lavó con NaHCO3 saturado y agua, y después se secó sobre Na2SO4 anhidro. La eliminación del diclorometano proporcionó un sólido blanco (93%). RMN 1 H (CDCh ): 81.44 (s, CH3, 27H), 1.95 (t, CH2, 6H), 2.43 (t, RMN 13C (CDCh ): 27.98 (CH3), 29.46 (CH2CO), 31.47 (CCH2), 56.99 (CNH2), 80.96 (CCH3), 172.30 (CO2).
19. Síntesis de compuesto 4
A una solución de compuesto 3 (0.65 g, 2.35 mmoles) en 50 ml de THF seco, se añadieron los reactivos siguientes: 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0.96 g, 7.10 mmoles), DCC (1.46 g, 7.10 mmoles) y después 2 (3.54 g,
8.5 mmoles). La solución se agitó a temperatura ambiente y la reacción se monitorizó mediante TLC. Tras 40
horas, se filtró el precipitado blanco y la solución se concentró, rindiendo un residuo en bruto. Se purificó el
producto mediante cromatografía de columna (gel de sílice, hexano:acetato de etilo=3:2), rindiendo un sólido
blanco ((85%). RMN 1 H (CDCh ): 81.44 (m, CH3, 81H), 1.95 (m, CH2, 18 H), 2.21 (m, CH2 , 30H), 6.20 (s, RMN 13C (CDCla): 28.04, 29.74, 29.85, 31.28, 57.56, 80.69, 92.47, 170.46, 172.76.
20. Síntesis de compuesto 5
Una solución de compuesto 4 (1.47 g, 1 mmoles) en 15 ml de ácido fórmico se agitó a temperatura ambiente
durante la noche. Tras concentrar la solución, se añadió tolueno y la solución se evaporó para eliminar cualquier
residuo de ácido fórmico, proporcionando un sólido blanco (100%). RMN 1 H (DMSO): 81.81 (m, CH2, 18 H), 2.11
(m, CH2, 30H), 7.29 (s, NH, 3H), 12.10 (br, COOH); RMN 13C (DMSO): 28.03, 29.03, 30.08, 56.41, 93.31, 170.43,
174.42.
21. Síntesis de compuesto 6
A una solución de compuesto 5 (2.12 g, 0,0022 moles) en DMF (30 ml), se añadió HOBt (2.68 g, 0,0198 moles) y
DCC (4.09 g, 0,0198 moles). La mezcla se enfrió a 0°C con un baño de hielo-agua. A continuación, una solución
de N-Boc-etilendiamina (3.49 g, 0,0218 moles) en DMF (5 ml) se añadió gota a gota a 0°C. La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 h. A continuación, se filtró la solución y se añadieron 200 ml
de diclorometano y se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y agua. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4
anhidro y se evaporó, rindiendo un residuo en bruto. El producto se purificó mediante cromatografía de columna
(se eluyó en primer lugar con metanol al 2% en diclorometano, seguido de metanol al 6% en diclorometano,
seguido de metanol al 10% en diclorometano), obteniendo un sólido blanco (51%). RMN 1 H (CD3OD): 81.44 (m,
CH3, 81H), 1.80-2.10 (m, CH2, 48 H), 3.0-3.2 (m, CH2 , 36H), 6.20 (m, NH, 3H), 6.46 (m, NH, 8H), 7.71(m, NH,
8H); RMN 13C (CD3OD): 28.40, 31.24, 31.44, 31.80, 32.09, 40.66, 40.97, 59.14, 80.13, 94.42, 158.48, 173.48,
175.91. Dicho sólido blanco se disolvió seguidamente en 40 ml de 1,4-dioxano. A 0°C, se añadieron 40 ml de HCl
4 M a la solución bajo atmósfera de Ar y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La eliminación del
solvente proporcionó un sólido blanco como la sal HCl desprotegida (100%). RMN 1 H (D2O): 81.70-2.15 (m, CH2,
48 H), 3.30 (m, CH2, 18H), 3.36 (m, CH2, 18H); RMN 13C (D2O): 27.61, 27.98, 28.86, 35.11, 37.41, 56.29, 92.01,
171.84, 174.98. 1,53 g (0,92 mmoles) de la sal HCl resultante se disolvió en 80 ml de metanol. A 0°C, se
añadieron 3.5 ml de Et3N a la solución, seguido de la adición de N,N'-diBoc-N”-triflilguanidina (4.2 g,
10.73 mmoles). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Tras la eliminación del solvente, el
residuo se disolvió en diclorometano y se lavó con agua, HCl 1 N, NaHCO3 saturado y agua. La capa orgánica se
secó sobre Na2SO4 anhidro y se separó al vacío. El producto residuo se purificó mediante cromatografía de
columna (eluido con metanol al 2% en diclorometano, seguido de metanol al 10% en diclorometano), proporcionando un sólido blanco (90%) como compuesto 6. RMN 1 H (CD3OD): 8 1.45 (m, CH3, 81H), 1.51 (m,
CH3, 81H), 1.90-2.25 (m, CH2 , 48 H), 3.30-3.52 (m, CH2, 36H); RMN 13C (CD3OD): 28.37, 28.67, 31.32, 31.67,
32.06, 39.74, 41.24, 59.02, 80.23, 84.35, 94.31, 153.91, 157.737, 164.38, 173.33, 175.87.
22. Síntesis de compuesto 7
A una solución de compuesto 5 (1.2, 0,001245 moles), se añadió HOBt (1.514 g, 0,0112 moles) y DCC (2.311 g,
0,0112 moles) en 20 ml de DMF. A continuación, se disolvió N-Boc-1,6-diaminohexano (2.66 g, 0,0123 moles) en
5 ml de DMF gota a gota a 0°C. A continuación, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 48 h.
Seguidamente, la solución se filtró y se añadieron 200 ml de diclorometano, y se lavó con HCl 1 N, NaHCO3
saturado y agua. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó, rindiendo un residuo en bruto. El
producto se purificó mediante cromatografía de columna (se eluyó en primer lugar con metanol al 2% en diclorometano, seguido de metanol al 5% en diclorometano, seguido de metanol al 10% en diclorometano), obteniendo un sólido blanco (45%). RMN 1 H (CD3OD): 81.2 -1.6 (m, CH3, CH2, 153H), 1.80-2.10 (m, CH2 , 48 H),
3.0-3.2 (m, CH2, 36H); RMN 13C (CD3OD): 27.54, 28.85, 30.37, 30.90, 31.28, 31.60, 32.14, 40.58, 41.24, 59.13,
79.30, 94.30, 158.49, 173.50, 175.56. Dicho sólido blanco se disolvió seguidamente en 40 ml de 1,4-dioxano. A
0°C, se añadieron 40 ml de HCl 4 M a la solución bajo atmósfera de Ar y se agitó a temperatura ambiente
durante 1 h. La eliminación del solvente proporcionó un sólido blanco como la sa1HCl desprotegida (100%). RMN
1 H (D2O): 8 1.10-1.60 (m, CH2, 72 H), 1.7-2.2 (m, CH2, 48H), 3.30 (m, CH2 , 18H), 3.36 (m, CH2, 18H). 0,838 g
(0,385 mmoles) de la sal HCl resultante se disolvió en 80 ml de metanol. A 0°C, se añadieron 1.45 ml de Et3N a
la solución, seguido de la adición de N,N'-diBoc-N”-triflilguanidina (1.765 g, 4.51 mmoles). La solución se agitó a
temperatura ambiente durante 24 h. Tras la eliminación del solvente, el residuo se disolvió en diclc
lavó con agua, HCl 1 N, y agua. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se separó al vacio. t l producto residuo se purificó mediante cromatografía de columna (eluido con metanol al 2% en diclorometano, seguido de metanol al 10% en diclorometano), proporcionando un sólido blanco (90%) como compuesto 7. RMN 1 H (CD3OD): RMN 1 H de 9 (CD3OD): 81.15 -1.55 (m, 234H), 1.70-2.15 (m, CH2, 48 H), 3.29-3.30 (m, CH2, 36H); RMN 13C (CD3OD): 27.70, 27.62, 28.33, 28.67, 30.08, 30.33, 31.30, 31.60, 40.48, 40.62, 41.27, 54.5, 59.14, 80.25, 84.40, 154.22, 157.49, 164.53, 173.50, 175.53.
23. Sintesis de compuestos 8 y 9
Se disolvió el compuesto 6 (o 7, 0.10 mmoles) en 40 ml de etanol y se transfirió a una botella de hidrogenación que contenía 5 g de catalizador de níquel de Raney. La solución se hidrogenó a temperatura ambiente a 65 psi y se monitorizó mediante TLC. t l catalizador se filtró a través de Celite. Se eliminó el solvente al vacío, proporcionando un sólido blanco 8 o 9 (80%). RMN 1 H de 8 (CD3OD): 81.46 (m, CH3, 81H), 1.51 (m, CH3, 81H), 1.90-2.25 (m, CH2, 48 H), 3.30-3.55 (m, CH2, 36H); RMN 13C (CD3OD): 28.37, 28.67, 31.40, 31.76, 39.76, 41.27, 54.0, 58.86, 80.32, 84.37, 153.97, 157.81, 164.4, 175.61, 176.02. RMN 1 H de 9 (CD3OD): 8 1.20 - 1.70 (m, 234H), 1.85-2.40 (m, CH2, 48 H), 3.10-3.50 (m, CH2 , 36H); RMN 13C (CD3OD): 27.01, 27.18, 28.27, 28.53, 29.42, 29.71, 30.15, 30.88, 31.19, 40.03, 41.23, 54.3, 58.21, 79.93, 83.84, 153.62, 156.65, 163.83, 175.77.
24. Síntesis de compuesto FD-1
Se añadió FITC (0.14 g, 0.36 mmoles), disuelto en 1 ml de DMF, a una solución de compuesto 8 (0.23 g, 0.066 mmoles) en una mezcla de DMF y diclorometano. La solución se enfrió a 0°C, a la que se añadió Et3N (0.092 ml, 0.66 mmoles). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Tras la eliminación de DMF al vacío, el residuo se disolvió en diclorometano y se lavó con HCl 1 N y agua. La capa de diclorometano se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró, obteniendo un sólido amarillo. RMN 1 H (CD3OD): 8 1.46 (m, CH3, 81H), 1.51 (m, CH3, 81H), 1.90-2.25 (m, CH2 , 48 H), 3.30-3.55 (m, CH2 , 36H), 6.52-6.72 (br, 4H), 7.15 (br, 1H), 7.5 (br, 2H), 7.72 (br, 1H), 8.4 (br, 1h ). t l sólido amarillo resultante (200 mg, 0.052 mmoles) se disolvió en 10 ml de 1,4-dioxano. A 0°C, se añadieron 10 ml de HCl 4 M en dioxano a la solución bajo protección de Ar y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Tras la evaporación del solvente al vacío, se disolvió el producto en agua y se filtró el precipitado insoluble. La eliminación de agua rindió un sólido amarillo en bruto, que se purificó adicionalmente mediante RP-HPLC utilizando un gradiente de solventes (solvente A=TFA al 0.05%/H2O; solvente B=TFA al 0.05%/CH3CN), obteniendo el compuesto 10. RMN 1 H (D2O): 81.85-2.30 (m, CH2 , 48 H), 3.10-3.30 (m, CH2 , 36H), 6.9 (br, 2H), 7.10-7.2 (m, 3H), 7.4 (s, 2H), 7.5 (br, 1H), 8.1 (s, 1H).
25. Síntesis de compuesto FD-2
Se añadió FITC (0.016 g, 0.0376 mmoles), disuelto en 1 ml de DMF, a una solución de compuesto 9 (0.050g, 0.0125 mmoles) en una mezcla de DMF y diclorometano (1:1). La solución se enfrió a 0°C, a la que se añadió Et3N (12 |jl). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Tras la eliminación de DMF al vacío, el residuo se disolvió en diclorometano y se lavó con HCl 1 N y agua. La capa de diclorometano se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró, obteniendo un sólido. Se disolvió el producto en metanol y se purificó mediante diálisis con membranas Spectro®Por Biotech RC (MWCO=3500). Tras la eliminación del metanol, se obtuvo un sólido amarillo. RMN 1 H (CD3OD): 8 1.20 - 1.7 (m, CH3, CH2 , 234H), 1.89-2.30 (m, CH2, 48 H), 3.10-3.40 (m, CH2 , 36H), 6.52-6.72 (br, 4H), 7.15 (br, 1H), 7.5-7.72 (br, 3H), 8.1 (br, 1H). t l sólido amarillo resultante (200 mg, 0.052 mmoles) se disolvió en 10 ml de 1,4-dioxano. A 0°C, se añadieron 10 ml de HCl 4 M en dioxano a la solución bajo protección de Ar y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se separó el precipitado y se secó al vacío. t l sólido amarillo obtenido se disolvió en agua y se liofilizó, rindiendo el compuesto 11. RMN 1 H (D2O): 81.1 - 1.50, (m, CH2 , 72H), 1.50-2.20 (m, CH2 , 48 H), 3.10-3.30 (m, CH2 , 36H), 6.5-6.7 (br, 6H), 7.10 (m, 1H), 7.5 (br, 3H).
26. ejemplos FD-1 y FD-2
A título de ejemplos de los compuestos, se diseñaron y sintetizaron dos dendrímeros de tipo Newkome marcados fluorescentemente no peptídicos, diferenciados en un espaciador alquilo variado con fracciones terminales guanidina. La evaluación de la internalización en células de mamífero utilizando fibroblastos NIH-3T3 y células endoteliales microvasculares humanas (HMtC, por sus siglas en inglés) mostró que la longitud del espaciador en la generación de extremos de los dendrímeros puede afectar a la dirección de las moléculas de carga más exactamente en compartimientos subcelulares específicos (p.ej., núcleo o citosol). Dicha dirección puede resultar particularmente ventajosa para la administración intracelular controlada de moléculas de carga bioactivas en localizaciones diana.
Los dos conjugados ejemplares de FITC-dendrímero se encontró que eran altamente solubles en agua y se investigaron adicionalmente para su capacidad de traslocarse a través de la membrana celular. Se evaluó la internalización de FD-1 y FD-2 en células de mamífero utilizando dos líneas celulares diferentes y un método descrito anteriormente [Futaki, S.; Nakase, I.; Suzuki, T.; Youjun, Y.; Sugiura, Y. Biochemistry, 41, 7925, 2002] con fibroblastos NIH-3T3 y HMEC (células endoteliales microvasculares humanas) y un micros Zeiss LSM 510. La figura 12 muestra el curso temporal de incorporación de FD-1 y FD-2 en fibroblastos n ih -313 a 37°C. Se observó claramente fluorescencia dentro de las células 2.5 min después de la adición de conjugados al medio, lo que es comparable a la tasa de incorporación de péptido Tat. [Futaki, S.; Nakase, I.; Suzuki, T.; Youjun, Y.; Sugiura, Y. Biochemistry 41, 7925, 2002.; Vivés, E.; Brodin, P.; Lebleu, B. J. Biol. Chem. 272, 16010, 1997. Además, el grado de internalización se incrementó de una manera dependiente del tiempo de incubación y se observó que después de sólo 10 min, la intensidad de fluorescencias de las células tratadas con FD-2 era prácticamente de saturación. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de las células tratadas con FD-1 no se aproximó a la saturación hasta puntos temporales posteriores (45 min ~ 2 h). Adicionalmente, FD-1 y FD-2 mostraron patrones diferentes de localización subcelular, ya que FD-1 aparentemente se concentraba en el núcleo, mientras que FD-2 aparentemente se concentraba en el citosol. Sin deseo de restringirse a ninguna teoría, se cree que la longitud del espaciador en la generación de extremos del dendrímero no sólo puede controlar la tasa de incorporación [Wender, P. A.; Kreider, E.; Pelkey, E. T.; Steinman, L.; Rothbard, J. B.; VanDeusen, C. L. Org. Lett. 7, 4815, 2005] sino que también regula la localización subcelular de la molécula y su carga putativa. Por ejemplo, los niveles de incorporación de FD-2 aparentemente eran generalmente más fuertes que los de FD-1 después del mismo tiempo de incubación a la misma concentración. Por lo tanto, el dendrímero con un espaciador hexilo cruza la membrana celular más rápidamente que la molécula con una cadena de etilo. Por otra parte, los patrones de localización también pueden controlarse a partir de la longitud del espaciador. FD-1 con el espaciador corto aparentemente se localiza en todas partes en la célula, aunque se encuentra altamente concentrado en el núcleo. Sin embargo, FD-2, con su espaciador más largo, se observó que residía principalmente en el citosol. Estas características de traslocación de los andamiajes dendríticos guanidinilados como portadores pueden resultar importantes para el transporte intracelular de moléculas de carga a compartimientos subcelulares específicos (p.ej., citosol o núcleo). Por ejemplo, un enfoque de traslocación que no sature el núcleo puede resultar altamente atractivo, ya que puede ser tanto menos tóxico como podría proporcionar cargas con diana citosólica con mayor precisión en el transporte, y por lo tanto, mayor eficacia. Sin restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que los patrones de incorporación diferentes de FD-1 y FD-2 se deben a la presencia de una cadena espaciadora hexilo en FD-2 que resulta en una mayor hidrofobicidad del conjugado completo en comparación con FD-1. Adicionalmente, se llevó a cabo la incorporación de los conjugados de FD-1 y FD-2 por HMEC. La entrada de los dos conjugados en HMEC mostró un patrón de internalización similar al observado en fibroblastos.
En experimentos de control, las células tratadas con FITC libre y FITC-dendrímero guanidinilado protegido con Boc mostró una fluorescencia nula o extremadamente débil, respectivamente. Por lo tanto, el grupo guanidino desempeña un papel importante en la permeabilidad celular de estas moléculas, mientras que la longitud de la cadena espaciadora determina tanto la tasa de incorporación diferencial como los patrones de localización subcelular. Aunque el mecanismo de traslocación de Tat sigue sin entenderse, se ha demostrado que la tasa de incorporación no depende de la temperatura. [Futaki, S.; Nakase, I.; Suzuki, T.; Youjun, Y.; Sugiura, Y. Biochemistry 41, 7925, 2002.; Vivés, E.; Brodin, P.; Lebleu, B. J. Biol. Chem. 272, 16010, 1997. Lo anterior indica que la endocitosis no desempeña un papel crucial en el proceso de traslocación. La evaluación del efecto de la temperatura sobre la internalización de FD-1 y FD-2 indica que los dos conjugados son capaces de introducirse en las células no sólo a 37°C, sino también a 4°C, incluso a una concentración de dendrímero más baja (1 j M) (ver las figuras 3 y 4, en contraste con los experimentos de control, tal como se muestran en la figura 15). No se observó ninguna reducción significativa de la intensidad de fluorescencia de las células tratadas con FD-1 o FD-2, indicando que el procedimiento de incorporación no se produce mediante endocitosis.
27. Síntesis de dendrímero B11
Un matraz de fondo redondo de tres cuellos se secó a la llama bajo argón, al que se añadió secuencialmente nitrotriácido B3 (3.192 g, 0.0115 mmoles), 1-hidrobenzotriazol (HOBt) (5.609 g, 0.0415 moles), DCC (8.560 g, 0.0415 moles) y 100 ml de THF. Tras 2 horas de activación, se añadió aminotriéster B2 (17.216 g, 0,0415 moles). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 40 h y el producto en bruto se purificó mediante cromatografía flash de columna, eluyendo en primer lugar con hexano/acetato de etilo (10:1) y después con hexano/acetato de etilo (3:2), rindiendo dendrímero B11 (15.91 g, 94.1%). RMN 1H (400 MHz, CdCI3): 8 = 1.44 (m, CH3 , 81 H), 1.95 (m, CH2, 18 H), 2.21 (m, CH2, 30 H), 6.20 (s, NH, 3 H); RMN 13C (400 MHz, CDCI3): 8 = 28.04, 29.74, 29.85, 31.28, 57.56, 80.69, 92.47, 170.46, 172.76.
28. Síntesis de dendrímero B12
Una solución de B11 (10.0 g, 0.0 moles) en 150 ml de etanol absoluto en presencia de 8 gramos de níquel de Raney se hidrogenó a 60 psi de hidrógeno a temperatura ambiente durante 24 h. La suspensión se filtró cuidadosamente a través de Celite y la eliminación del solvente bajo presión reducida rindió B12 (9.86 g, 98.5%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD): 8 = 1.44 (m, CH3, 81 H), 1.61 (m, CH2, 6 H), 1.95 (m, CH2, 12 H), 2.21 (m, CH2, 30 H); RMN 13C (400 MHz, CD3OD): 8= 28.42, 30.24, 30.47, 32.02, 36.24, 53.53, 58.37, 81.18, 173.96, 175.39.
29. Síntesis de B25
A una solución agitada a temperatura ambiente de ácido 6-bromohexanoico (2.0 g, 0.0102 mole DMF se añadió NaN3 (1.30 g, 0.020 moles). La mezcla de reacción se calentó y se agitó a 85°C durante 5 h. iras eliminar el DMF, se añadió DCM para disolver el residuo. La mezcla se lavó con HCl 0.1 N y se secó sobre NaSO4 anhidro. La eliminación del solvente proporcionó un aceite en bruto que se purificó mediante cromatografía flash de columna, eluyendo en primer lugar con DCM y después con acetato de etilo/DCM (3:7), rindiendo B25 (1.67 g, 69.07%). RMN 1H (400 MHz, MeOD): 8 = 1.38-1.49 (m, CH2, 2H), 1.54-1.70 (m, CH2, 4 H), 2.32 (t, CH2 , 2 H), 3.30 (t, CH2, 2 H); RMN 13C (400 MHz, MeOD): 8 = 25.57, 27.32, 29.62, 34.72, 52.27, 177.38.
30. Síntesis de dendrímero B13
A una solución bajo agitación de B25 (1.29 g, 8.22 mmoles) en THF anhidro (50 ml) se añadió DCC (1.70 g, 8.22 mmoles) y HOBt (1.112 g, 8.22 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 2 h, después se añadió dendrímero B12 (9.86 g, 6.85 mmoles) y la solución resultante se agitó durante 40 h. Después de la filtración y eliminación del THF, el producto se purificó mediante cromatografía flash de columna, eluyendo con hexano/acetato de etilo (1:1), rindiendo B13 (8.50 g, 78.53%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD): 8 = 1.44 (m, CH3, CH2 , 83 H), 1.95 (m, CH2 , 18 H), 2.21 (m, CH2, 32 H), 3.30 (m, CH2, 2 H); RMN 13C (400 MHz, CD3OD): 8 = 26.47, 27.47, 28.43, 29.62, 30.35, 30.61, 32.07, 32.23, 37.56, 52.28, 58.63, 58.77, 81.54, 174.21, 175.35, 175.66.
31. Síntesis de dendrímero B14
A una solución bajo agitación a 0°C de nona-amina B5 (4.06 g, 2.43 mmoles) en metanol/acetonitrilo (25 ml/15 ml) se añadió trietilamina (6.87 g, 68.0 mmoles) y trifluoroacetato de etilo (9.32 g, 65.6 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 1 h y después a temperatura ambiente durante la noche. Se eliminó el solvente al vacío y el residuo se introdujo en acetato de etilo y la solución orgánica resultante se lavó con HCl 1 N y solución hipersalina y se secó sobre NaSO4 anhidro. La eliminación del solvente al vacío proporcionó un sólido en bruto que se purificó mediante cromatografía flash (gradiente de EtOAc/metanol), rindiendo un sólido (3.02 g, 56.3%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD): 8 = 1.85-2.10 (m, CH2 , 18 H), 2.11-2.35 (m, CH2 , 30 H), 3.24-3.48 (m, CH2, 36 H); RMN 13C (400 MHz, CD3OD): 8= 31.08, 31.26, 31.75, 32.01, 39.42, 40.42, 58.93, 94.33, 111.74, 115.54, 119.33, 123.13, 158.57, 159.06, 159.55, 160.04, 173.57, 176.14. El sólido blanco resultante (1.0 g, 0.453 mmoles) se disolvió en etanol (45 ml) y se transfirió a un recipiente de hidrogenación que contenía catalizador de níquel de Raney (5 g) y la suspensión se agitó a 80 psi de hidrógeno a 50°C durante 48 h. Tras la filtración a través de Celite, se eliminó el solvente bajo presión reducida, proporcionando B14 en forma de un sólido blanco (0.964 g, 97.7%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD): 8 = 1.67 (m, CH2 , 6 H), 986 (m, CH2, 12 H), 2.188 (m, CH2 , 30 H), 3.30-3.55 (m, CH2, 36 H); RMN 13C (400 MHz, CD3OD) 8 = 31.20, 32.11, 36.17, 39.38, 40.52, 54.06, 58.80, 111.79, 115.53, 119.36, 123.10, 158.58, 159.04, 159.50, 160.1 1, 175.55, 176.24.
32. Síntesis de dendrímero B15
A una solución bajo agitación de ácido 6-heptinoico (0.3022 g, 2.40 mmoles) en THF anhidro (50 ml) se añadió DCC (0.4952 g, 2.40 mmoles) y HOBt (0.3245 g, 2.40 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 2 h, después se añadió dendrímero B14 (1.0432 g, 0.48 mmoles) y la solución resultante se agitó durante 40 h. Después de la filtración y eliminación del THF, el producto se purificó mediante cromatografía flash de columna, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo/metanol, rindiendo B15 (0.620 g, 56.57%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD): 8 = 1.53 (m, CH2 , 2 H), 1.71 (m, CH2, 3 H), 1.890-2.5 (m, CH2 , 50 H), 3.30 (m, CH2, 36 H); RMN 13C (400 MHz, CD3OD): 8 = 18.81, 26.14, 29.43, 31.27, 31.80, 37.37, 39.35, 40.43, 58.83, 59.05, 69.95, 83.4, 111.74, 115.57, 119.37, 123.13, 158.55, 159.07, 159.53, 159.99, 175.60, 176.25.
33. Síntesis de dendrímero B16
Se disolvió dendrón de azida B13 (100 mg, 0.044 mmoles) y dendrón de alquino B15 (70 mg, 0.044 mmoles) en THF/H2O (4:1) y DIPEA (0.017 g, 0.132 mmoles, 3 equiv.) seguido de Cu(PPh3)3Br (0.0042g, 0.0044 mmoles). La mezcla de reacción se introdujo en un reactor de microondas (Biotage) y se irradió a 120°C durante 20 min. Tras completar la reacción, se eliminó el THF y el residuo se introdujo en DCM. Se lavó la capa orgánica con agua una vez y se secó sobre Na2SO4 anhidro. RMN 1H de B16 (400 Mhz , CD3OD): 8 = 1.43 (m, CH3, 81 H), 1.71 (m, CH2 , 8 H), 1.890-2.5 (m, CH2, 96 H), 2.71 (m, CH2 , 2 H), 3.30 (m, CH2, 36 H), 4.38 (m, CH2 , 2 H), 7.75 (s, 1 H).
34. Síntesis de B17 y B18
Se agitó el “Bow-Tie” B16 en ácido fórmico durante la noche a temperatura ambiente. Tras evaporar el solvente bajo presión reducida, se añadió tolueno y se concentró al vacío para eliminar cualquier residuo de ácido fórmico, proporcionando un no ácido blanco (100%). A una solución del sólido resultante anterior en DMF, se añadió HOBt y DCC y la solución se enfrió a 0°C, se añadió gota a gota N-Boc-etilendiamina o N-Boc-hexildiamina y la mezcla se agitó durante 48 h a temperatura ambiente, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en diclorometano y la solución orgánica resultante se lavó secuencialmente con HCl 1 N, agua y se secó sobre Na2SO4 anhidro. Se evaporó el solvente bajo presión reducida y el residuo en bruto se purificó mediante cromatografía flash de columna, rindiendo B17 o B18.
35. S í n t e s is d e B 19 y B 20
S e a ñ a d ió c a r b o n a t o p o t á s i c o a B 17 o B 18 e n m e t a n o l / a g u a , la m e z c la s e a g i t ó a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e d u r a n t e 6 h . E l p r o d u c t o e n b r u t o s e p u r i f i c ó m e d ia n t e d iá l i s i s f r e n t e a m e t a n o l c o n m e m b r a n a s d e c e l u lo s a r e g e n e r a d a S p e c t r a ® P o r B io t e c h ( M W C O = 3500 ) d u r a n t e 24 h , p r o p o r c io n a n d o B 19 o B 20.
36. S í n t e s is d e B 21 Y B 22
B 19 o B 20 a n t e r i o r m e n t e s e d i s o lv i ó a c o n t i n u a c ió n e n 1 , 4 - d io x a n o y la s o l u c ió n s e e n f r ió a 0 ° C . S e a ñ a d ió H C l 4 M e n d i o x a n o y s e a g i t ó d u r a n t e 1 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a e l im in a c i ó n d e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c i d a p r o p o r c io n ó u n s ó l id o b la n c o . L a s a l H C l r e s u l t a n t e s e d i s o lv i ó e n m e t a n o l y la s o l u c ió n s e e n f r ió a 0 ° C . S e a ñ a d ió E t 3N , s e g u id o d e N , N - d i B o c - N " - t r i f l i l g u a n i d i n a y la m e z c la s e a g i t ó d u r a n t e 24 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , T r a s e v a p o r a r e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , s e d i s o l v i ó e l r e s id u o e n d i c l o r o m e t a n o y la s o l u c ió n s e la v ó c o n H C l 1 N y a g u a , y s e s e c ó s o b r e N a 2S O 4 a n h id r o . T r a s e l im in a r e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , s e p u r i f i c ó e l p r o d u c t o e n b r u t o m e d ia n t e d i á l i s i s f r e n t e a m e t a n o l c o n m e m b r a n a s d e c e l u lo s a r e g e n e r a d a S p e c t r a ® P o r B io t e c h ( M W C O = 3500 ) d u r a n t e 24 h , p r o p o r c io n a n d o B 21 o B 22.
37. S í n t e s is d e B 23 Y B 24
B 21 o B 22 s ó l id o r e s u l t a n t e s e d i s o lv i ó e n 1 , 4 - d io x a n o y la s o l u c ió n s e e n f r ió a 0 ° C . S e a ñ a d ió H C l 4 M e n d i o x a n o y la s o l u c ió n s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . S e s e p a r ó e l p r e c ip i t a d o m e d ia n t e f i l t r a c ió n y s e s e c ó , p r o p o r c io n a n d o u n p r o d u c t o e n b r u t o . S e r e d is o lv ió e l s ó l id o e n a g u a y s e s e p a r ó e l p r e c ip i t a d o i n s o lu b le m e d ia n t e f i l t r a c ió n y e l f i l t r a d o s e d i a l i z ó f r e n t e a a g u a c o n m e m b r a n a s d e é s t e r d e c e l u lo s a S p e c t r a ® P o r B io t e c h ( M W C O = 1000 ) d u r a n t e 48 h y s e l i o f i l i z ó , r in d i e n d o B 23 o B 24 s o l u b le e n a g u a .
38. C o m p u e s t o Q 6
3 - C a r b o x a ld e h í d o b i c i c l o [ 4 , 2 , 0 ] o c t a - 1 , 3 , 5 - t r i e n o o 4 - c a r b o x a l d e h í d o b e n z o c i c l o b u t e n o , Q 6 . A u n m a t r a z d e 500 m l s e a ñ a d ie r o n 50 m l d e T H F s e c o , v i r u t a s d e M g ( 2.88 g , 120 m m o l e s ) y 1 , 2 - d ib r o m o e t a n o ( 4 g o t a s ) . A c o n t in u a c ió n , la m e z c la s e c a l e n t ó b a jo r e f l u jo d u r a n t e 15 m in . S e a ñ a d ió 4 - b r o m o b e n z o c i c l o b u t e n o , 5 ,11 ( 20.0 g , 109 m m o l e s ) e n 25 m l d e T H F m e d ia n t e u n e m b u d o d e in t r o d u c c i ó n , p a r a f o r m a r e l r e a c t i v o d e G r i g n a r d . T r a s la a d i c ió n y e n j u a g u e d e l e m b u d o d e in t r o d u c c i ó n c o n 25 m l d e T H F s e c o , la m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 45 m in a d i c i o n a le s b a jo r e f lu jo , p r o p o r c io n a n d o u n a s o l u c ió n v e r d e - m a r r ó n . A c o n t in u a c ió n , la m e z c la d e r e a c c ió n s e e n f r ió a 0 ° C , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a D M F ( 15 m l, 210 m m o l e s ) a la s o l u c ió n y la m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó b a jo r e f l u jo d u r a n t e 15 m in . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e v e r t i ó s o b r e 150 g d e h ie lo , s e a c i d i f i c ó a p H , y s e n e u t r a l i z ó c o n s o l u c ió n d e N a H C O 3 s a t u r a d a . E l p r o d u c t o e n b r u t o s e e x t r a jo c o n a c e t a t o d e e t i l o , la f a s e o r g á n i c a s e f i l t r ó p o r C e l i t e y la e v a p o r a c ió n d e l s o l v e n t e p r o p o r c io n ó e l p r o d u c t o e n b r u t o . E l p r o d u c t o s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e c o l u m n a u t i l i z a n d o é t e r d ie t í l i c o a l 10 % / h e x a n o c o m o s o l v e n t e s d e e l u c ió n y s e p u r i f i c ó f i n a l m e n t e m e d ia n t e d e s t i l a c ió n d e K u g e l r o h r ( 145 ° C , 0 , 5 m m ) , p r o p o r c io n a n d o e l a l d e h í d o Q 6 ( 11 , 7 g , 81 , 2 % ) e n f o r m a d e u n l í q u id o in c o lo r o ; IR 3000 - 2800 , 1690 , 1598 , 1216 , 1067 y 827 c m -1; R M N 1H ( 400 M H z , C D C la ) 5 9 .9 ( s , 1 H , C H O ) , 7 .6 5 ( d d , 1 H , J = 7 .4 H z , J ' = 1 .2 H z , A r H ) , 7 . 5 0 ( s , 1 H , A r H ) , 7 .1 4 ( d d , 1 H , J = 7 .4 H z , J ' ) 1 .2 H z , A r H ) , 3 . 1 5 ( s , 4 H , C H 2 ) ; R M N 13C ( 1 0 0 M H z , C D C la ) 5 1 92 .28 , 1 53 .69 , 1 46 .57 , 13 5 .4 , 1 30 .2 6 , 1 22 .89 , 122.81 , 29 .97 y 29.23. A n a l . C a lc . p a r a C g H a O ; C , 81 , 8 ; H 6 , 10. O b s e r v a d o : C , 81 , 7 ; H , 5 , 94.
39. C o m p u e s t o Q 4
3 - E t e n i l b i c i c l o [ 4 , 2 , 0 ] o c t a - 1 , 3 , 5 - t r i e n o o 4 - v in i l b e n z o c i c l o b u t e n o , Q 4. A u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 500 m l s e a ñ a d ió ( P h ) 3P C H 3B r ( 24 .3 g , 68.1 m m o le s ) , 110 m l d e T H F s e c o y la s o l u c ió n s e e n f r i ó a - 78 ° C , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a n - B u L i ( 2.5 M e n h e x a n o , 26 .4 m l, 66 m m o l e s ) y la m e z c la d e r e a c c ió n s e d e jó q u e s e c a l e n t a s e h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a s o l u c ió n a m a r i l l o - n a r a n j a s e e n f r ió a - 78 ° C y e l a l d e h í d o 6 ( 7.16 g , 54.2 m m o le s ) , d i lu i d o e n 34 m l d e T H F s e c o , s e a ñ a d ió le n t a m e n t e . L a m e z c la s e c a l e n t ó h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e y s e c o n t in u ó la a g i t a c ió n d u r a n t e 2 h . L a r e a c c ió n s e t r a t ó s e c u e n c ia l m e n t e c o n N H 4C l s a t u r a d o y s o l u c ió n s a t u r a d a d e N a H C O 3, y e l p r o d u c t o e n b r u t o s e f i l t r ó p o r C e l i t e , s e la v ó c o n é t e r d i e t í l i c o / h e x a n o ( 1 : 1 ) y s e e v a p o r ó a s e q u e d a d ( s in c a lo r ) , p r o p o r c io n a n d o e l p r o d u c t o e n b r u t o . L a p u r i f i c a c ió n a d i c io n a l m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e c o l u m n a u t i l i z a n d o é t e r d i e t í l i c o a l 5 % / h e x a n o c o m o s o l v e n t e d e e lu c ió n , s ig u ió la d e s t i l a c ió n d e K u g e l r o h r ( 75 ° C , 1.0 m m ) , p r o p o r c io n a n d o e l d e r i v a d o e s t i r e n o p u r o Q 4 e n f o r m a d e u n l í q u id o in c o lo r o ( 5.50 g , 78 % ) ; IR 2925 , 1 62 7 , 147 3 , 989 , 901 y 8 2 9 c m '1; R M N 1H ( 4 0 0 M H z , C D C h ) 5 7 .26 ( d , 1 H , J = 7 .4 H z , A r H ) , 7 .20 ( s , 1 H , A r H ) , 7 .0 4 ( d , 1 H , J = 7 .4 H z , A r H ) , 6 .7 4 ( d d , 1 H , J = 1 7 .5 H z , J ' = 1 0 .8 H z , C H ) , 5 .7 0 ( d , 1 H , J = 17 .5 H z , C H 2 ), 5 . 2 0 ( d , 1 H , J = 10.8 H z , C H 2 ) , 3.19 ( s , 4 H , C H 2 ); R M N 13C ( 100 M H z , C D C l 3 ) a 146.09 , 145.75 , 137.94 , 136.69 , 125.71 , 122.58 , 119.90 , 112.38 , 29 .52 y 29.35. A n a l . C a lc . p a r a C 10H 10 ; C , 92 , 2 ; H 7 , 80. O b s e r v a d o : C , 92 , 0 ; H , 8 , 03. 40. C o p o l í m e r o a l e a t o r i o d e Q 4 y e s t i r e n o , Q 8.
E l in i c i a d o r a l c o x ia m in a , Q 7 ( 32 .5 m g , 0.1 m m o l e s ) , Q 12 d i s u e l t o e n e s t i r e n o ( 10.4 g , 100 m o le s ) y 4 -v i n i l b e n z o c i c l o b u t e n o , Q 4 ( 3.25 g , 25 .0 m m o l e s ) s e a ñ a d ie r o n a u n a a m p o l la d e v id r i o c o n u n a b a r r a d e
Figure imgf000066_0001
44. P r o c e d im ie n t o g e n e r a l p a r a la f o r m a c i ó n d e n a n o p a r t í c u la s , Q 9
E n u n m a t r a z d e t r e s c u e l lo s d e 500 m l d o t a d o d e u n t e r m ó m e t r o in t e r n o , c o n d e n s a d o r y s e p t o , s e c a l e n t a r o n 120 m l d e é t e r b e n c í l i c o a 250 ° C b a jo a r g ó n . S e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e l p o l í m e r o l in e a l f u n c io n a l i z a d o c o n b e n z o c i c l o b u t e n o ( B C B ) , Q 8 ( 4.00 g , M n = 108000 ; P D I = 1.15 , 7.5 % m o la r d e B C B ) , d i s u e l t o e n é t e r b e n c í l i c o ( 40 m l) , m e d ia n t e u n a b o m b a p e r i s t á l t i c a a a p r o x . 12.8 m l / h a g i t a n d o v ig o r o s a m e n t e b a jo a r g ó n . T r a s la a d i c ió n , la m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 1 h a d i c io n a l , s e d e s t i l ó e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c i d a , y e l p r o d u c t o e n b r u t o r e s t a n t e s e d i s o lv i ó e n d i c l o r o m e t a n o y s e p r e c ip i t ó e n m e t a n o l . L o a n t e r i o r p r o p o r c io n ó la s n a n o p a r t í c u la s , Q 9 , e n f o r m a d e s ó l id o i n c o lo r o ( 3.76 g , r e n d i m i e n t o d e 94 % ) . R M N 1H ( 400 M H z , C D C h ) . E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la d e s a p a r ic ió n d e lo s p r o t o n e s d e l b e n z o c i c l o b u t e n o a l i f á t i c o e n 3.05 a l f o r m a r s e la s n a n o p a r t í c u la s e n t r e c r u z a d a s ; t o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s .
45. C o m p u e s t o Q 20
S í n t e s i s d e 2 , 2 - d ió x i d o d e 5 - v in i l - 1 , 3 - d ih i d r o - b e n z o ( c ) t i o f e n o , Q 20. B a jo la s c o n d ic io n e s c lá s ic a s d e la r e a c c ió n d e H e c k , s e t r a n s f o r m ó e l 2 , 2 - d ió x i d o d e 5 - b r o m o - 1 , 3 - d ih id r o - b e n z o ( c ) t i o f e n o c o n P P h 3, P d ( O A c ) 2 , T E A , y v i n i l t r im e t i l s i l a n o a 90 ° C e n D M F . E l p r o d u c t o e n b r u t o s e e x t r a jo c o n C H 2C h y s e c o n c e n t r ó . L a d e s p r o t e c c i ó n e n C H 2C h / T F A p r o p o r c io n ó e l p r o d u c t o p u r o t r a s la p u r i f i c a c ió n m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a f la s h ( C H 2C h ) c o n e l e v a d o s r e n d i m i e n t o s .
S e p r e p a r a r o n lo s c o m p u e s t o s Q 22 a Q 26 s ig u ie n d o lo s p r o c e d i m i e n t o s s ig u ie n t e s , t a l c o m o s e in d ic a e s q u e m á t i c a m e n t e d e s p u é s .
Figure imgf000067_0001
46. C o m p u e s t o Q 22
4 - b r o m o - 1 , 2 - b i s ( b r o m o m e t i l ) b e n c e n o ( Q 22 ) . A u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 1000 m l s e a ñ a d ió 4 - b r o m o - o -x i l e n o ( 21 ) ( 0.0811 m o le s , 15.00 g ) , N B S ( 0 .0426 m o le s , 7.580 g ) , 2 , 2 ' - a z o b i s - i s o b u t i r o n i t r i l o ( 0 .00405 m o le s , 0 .6650 g ) y 500 m l d e C C l4. A c o n t in u a c ió n , la m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó b a jo r e f l u jo d u r a n t e 1 h . D e s p u é s d e e s t e t i e m p o , s e a ñ a d ió o t r a c a n t id a d d e N B S y A I B N y s e r e p i t ió la o p e r a c i ó n c u a t r o v e c e s e n t o t a l . S e s e p a r ó e l p r e c ip i t a d o m e d ia n t e f i l t r a c ió n d e la m e z c la d e r e a c c ió n c a l i e n t e y s e c o n c e n t r ó e l f i l t r a d o . E l m a t e r i a l e n b r u t o s e c r i s t a l i z ó a p a r t i r d e h e x a n o s , f o r m a n d o c r i s t a le s b la n c o s ( 23 g , 93 % ) . R M N 1H ( 300 M H z , C D C h ) 8 7.53 ( d , 1 H , A r H , J = 2 .0 H z ) , 7 .4 4 ( d d , 1 H , A r H , J = 8 .1 H z , J = 2 . 0 H z ) , 7 .2 4 ( d , 1 H , A r H , J = 8 .1 0 ) , 4 . 6 0 ( d , 4 H , C H 2, J = 4 .2 0 H z ) .
47. C o m p u e s t o Q 23
5 - b r o m o - 1 , 3 - d i h id r o - 2 - b e n z o [ c ] t i o f e n o ( Q 23 ) . A la s o l u c ió n b a jo a g i t a c ió n d e N a 2S 9 H 2O ( 0.0502 m o l , 12.043 g ) e n 800 m l d e e t a n o l s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e 4 - b r o m o - 1 , 2 - b i s ( b r o m o m e t i l ) b e n c e n o ( 0.0418 m o le s , 14.334 g ) e n 200 m l d e e t a n o l a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s 20 h , s e f i l t r ó u n a m e z c la d e r e a c c ió n b l a n c a t u r b ia y s e c o n c e n t r ó a u n v o l u m e n d e 200 m l. A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ie r o n 250 m l d e a c e t a t o d e e t i l o y la s o lu c ió n o r g á n i c a s e la v ó 3 x c o n a g u a ( 125 m l ) y 1 x c o n s o l u c ió n h i p e r s a l i n a ( 125 m l) . L a f a s e o r g á n i c a s e s e c ó s o b r e M g S O 4 a n h id r o y s e c o n c e n t r ó . E l p r o d u c t o e n b r u t o p r o p o r c io n ó u n a c e i t e a m a r i l l o y s e u t i l i z ó s in p u r i f i c a c ió n a d i c io n a l . R M N 1H ( 300 M H z , C D C h ) 8 7.38 ( s , 1 H , A r H ) p p m 7.32 ( d d , 1 H , J = 1 .8 H z , J = 8.1 H z , A r H ) p p m 7.11 ( d , 1 H , J = 8.1 H z , A r H ) p p m 4.21 ( d d , 1 H , J = 1.8 H z , J = 8.5 H z ) .
48. C o m p u e s t o Q 24
5 - b r o m o - 1 , 3 - d ih id r o - 2 - b e n z o [ c ] t i o f e n o - 2 , 2 d ió x id o ( Q 24 ) . E l 5 - b r o m o - 1 , 3 - d ih id r o b e n z o [ c ] t i o f e n o e n b r u t o ( Q 21 ) d e la r e a c c ió n a n t e r io r , 7.815 g , s e d i s o lv i e r o n e n 5.00 m l d e á c i d o a c é t i c o g l a c ia l y s e e n f r ia r o n e n u n b a ñ o d e h ie lo . D i c h a s u s p e n s ió n s e a ñ a d ió g o t a a g o t a a 11 m l d e á c i d o p e r a c é t i c o f r í o e n f r ia d o s c o n u n b a ñ o d e h ie lo . T r a s c o m p le t a r la a d i c ió n , s e d e jó q u e la r e a c c ió n s e c a l e n t a s e h a s t a la T A y s e f o r m ó u n p r e c ip i t a d o b la n c o d u r a n t e la n o c h e . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e f i l t r ó y e l p r e c ip i t a d o s e la v ó c o n e t a n o l f r í o . E l p r o d u c t o e n b r u t o e r a u n p r e c ip i t a d o a m a r i l l o p á l id o y s e u t i l i z ó s in n in g u n a p u r i f i c a c ió n a d i c io n a l . S e o b s e r v ó u n r e n d i m i e n t o t í p i c o d e 3.749 g p a r a la r e a c c ió n . R M N 1H ( 300 M H z , C D C la ) p p m 7.36 ( d d , 1 H , J = 9.8 H z , J = 92 .9 H z ) ( m , A r H ) , 4.34 ( d , 1 H , J = 13 .0 H z ) ( d , C H 2 ). R M N 13C ( 400 M H z , C D C h ) p p m 133.604 , 132.549 , 130 .559 , 129.570 , 127.999 , 123.088 , 57.017 , 56.914.
49. C o m p u e s t o Q 25
Figure imgf000067_0002
A r H ) , 6.83 ( d , 1 H , C H ) , 6.51 ( d , 1 H , C H ) , 4.37 ( s , 4 H , C H 2 ), 0.16 ( s , 9 H , C H 3); R M N 13C ( 400 M 142.03 , 139.20 , 131.84 , 131.61 , 130.59 , 126.95 , 126.14 , 123.59 , 56.95 , 56.86 , - 1.03 , - 1.36.
50. C o m p u e s t o Q 26
2 , 2 - D ió x id o d e 5 - v i n i l - 1 , 3 - d ih i d r o - b e n z o [ c ] t i o f e n o ( Q 26 ) . S e p r e p a r ó u n a s o l u c ió n a l 60 % ( p ) d e á c id o t r i f l u o r o a c é t i c o e n c lo r u r o d e m e t i le n o y s e a ñ a d ió a l p r o d u c t o e n b r u t o Q 25. S e d e jó la r e a c c ió n b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e 14 h , m o m e n t o e n q u e s e d i l u y ó c o n C H 2C h y s e la v ó 3 x c o n 500 m l d e a g u a . L a f a s e o r g á n i c a s e s e c ó s o b r e M g S O 4, s e f i l t r ó y s e c o n c e n t r ó . A c o n t in u a c ió n , s e p u r i f i c ó e l p r o d u c t o e n b r u t o m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e c o l u m n a u t i l i z a n d o u n s is t e m a d e g r a d i e n t e d e 4 :1 h e a n o s : a c e t a t o d e e t i l o s e g u id o d e h e x a n o s : a c e t a t o d e e t i l o 3 : 2. E l p r o d u c t o p u r o Q 26 s e a i s ló e n f o r m a d e u n o s p o l v o s a m a r i l l o p á l id o ( 0.91 g , 93.2 % ) . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C la ) p p m 7.39 ( d , 1 H , J = 8 .1 H z , A r H ) p p m 7.33 ( s , 1 H , A r H ) p p m 7.26 ( d , 1 H , J = 8 .1 H z , A r H ) p p m 6 .69 ( d d , 1 H , J = 10 .9 H z , J = 17.6 H z , = C H ) p p m 5.77 ( d , 1 H , J = 17.6 H z , = C H 2 ) p p m 5.32 ( d , 1 H , J = 10.9 H z , = C H 2 ) p p m 4.35 ( s , 1 H , C H 2 ); R M N 13C ( 400 M H z , C D C la ) : 8 138.11 , 130.14 , 126.47 , 125.90 , 123.26 , 115.21 , 56.63 , 56.54
51. S í n t e s is d e c a r b o x i l a t o d e b e n c e n o d i a z o n i o
S e d i s o lv i ó á c i d o a n t r a n í l i c o ( 10 .0 g , 72.9 m m o l e s ) y u n a s o l u c ió n d e á c i d o t r i f l u o r o a c é t i c o ( 60.7 m g , 0.532 m m o l e s ) e n 6 m l d e T H F s e d i s o lv i ó b a jo a g i t a c ió n e n 73.1 m l d e t e t r a h i d r o f u r a n o e n u n v a s o d e p lá s t i c o . L a s o l u c ió n s e e n f r ió a 0 ° C y s e a ñ a d ió g o t a a g o t a n i t r i t o d e is o a m i lo ( 16.0 m l, 119.6 m m o l e s ) d u r a n t e u n p e r io d o d e 1 - 2 m in u t o s . S e d e jó q u e la m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t a s e h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e y s e a g i t ó d u r a n t e 1 - 1.5 h . S e f o r m ó u n p r e c ip i t a d o d e c o l o r r o jo la d r i l l o y s e c o n v i r t i ó le n t a m e n t e e n e l p r o d u c t o p a r d o . T r a s f i n a l i z a r s e , s e r e c o g i ó e l p r o d u c t o m e d ia n t e f i l t r a c ió n p o r s u c c i ó n e n u n e m b u d o d e B u c h n e r d e p l á s t i c o y s e la v ó e n e l e m b u d o c o n t e t r a h i d r o f u r a n o f r í o h a s t a q u e lo s r e s t o s d e la v a d o e r a n in c o lo r o s . A c o n t in u a c ió n , s e la v ó e l p r o d u c t o c o n 1 , 2 - d i c l o r o e t a n o p a r a d e s p la z a r e l t e t r a h i d r o f u r a n o . E l p r o d u c t o h ú m e d o c o n s o l v e n t e s e u t i l i z ó s in p u r i f i c a c ió n a d i c io n a l .
52. S í n t e s is d e a c e t a t o d e b e n z o c i c l o b u t e n i l o
E n u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 1000 m l, s e d i s o lv i ó b e n c e n o d i a z o n i o - 2 - c a r b o x i l a t o b a jo a g i t a c ió n e n u n a c a n t id a d m í n i m a d e 1 , 2 - d ic l o r o e t a n o . S e a ñ a d ió g o t a a g o t a a c e t a t o d e v in i lo ( 40.4 m l, 437 .4 m m o l e s ) a la s o l u c ió n y la r e a c c ió n s e c a l e n t ó a 80 ° C . L a r e a c c ió n s e s o m e t ió a r e f l u jo d u r a n t e 4 h y r in d ió u n a c e i t e n a r a n j a q u e s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e c o lu m n a , e l u y e n d o c o n u n s is t e m a d e s o l v e n t e s d e d i c l o r o m e t a n o : h e x a n o s 1 :1 ( 0.515 g , 4.36 % ) . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h ) 8 7.35 - 7.14 ( m , 4 H , A r H ) , 5.91 ( d , 1 H , J = 4.4 H z , C H ) , 3.66 ( d d , 1 H , J = 4.6 H z , J = 14.5 H z , C H 2 ), 3.22 ( d , 1 H , J = 14.5 H z , C H 2 ).
53. H i d r ó l i s i s d e a c e t a t o d e b e n z o c i c l o b u t e n i l o
U n a m e z c la d e a c e t a t o d e b e n z o c i c l o b u t e n i l o ( 0.515 g , 3.18 m m o le s ) , N a 2C O 3 ( 0 .337 g , 3.18 m m o le s ) , m e t a n o l ( 2.79 m l ) y a g u a ( 5.58 m l) s e a g i t ó v i g o r o s a m e n t e d u r a n t e la n o c h e . L a s o l u c ió n s e e x t r a jo c o n é t e r d i e t í l i c o ( 3 x 200 m l ) y la f a s e o r g á n i c a s e la v ó c o n a g u a ( 3 x 400 m l) y s e s e c ó c o n M g S O 4 y s e c o n c e n t r ó . E l a c e i t e n a r a n ja r e s u l t a n t e s e r e c r i s t a l i z ó a p a r t i r d e p e n t a n o , r in d i e n d o c r i s t a le s b la n c o s . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h ) 8 7.33 - 7 .14 ( m , 4 H , A r H ) , 5.30 ( d d d , 1 H , J = 1.7 H z , J = 4.4 H z , J = 8.8 H z , C H ) , 3.63 ( d d , 1 H , J = 4.4 H z , J = 14.4 H z , C H 2 ), 3.05 ( d d , 1 H , J = 1.3 H z , J = 14.1 H z , C H 2 ); R M N 1 H ( 400 M H z , C D C ta ) 8 7.33 - 7 .14 ( m , 4 H , A r H ) , 5.30 ( d d , 1 H , J = 4.4 H z , J = 6 .6 H z , C H ) , 3.63 ( d d , 1 H , J = 4.5 H z , J = 14.3 H z , C H 2 ), 3.05 ( d , 1 H , J = 14.3 H z , C H 2 ).
54. U n ió n d e b r o m u r o d e 2 -( B O C - A M I N O ) e t i l o a b e n z o c i c l o b u t e n o l
S e in t r o d u j o h id r u r o s ó d i c o ( 143.15 m g , 3.58 m m o l e s ) e n u n m a t r a z s e c o q u e s e g u id a m e n t e s e s e l ló y s e c a r g ó c o n N 2. S e a ñ a d ió a l m a t r a z u n a s o l u c ió n d e b e n z o c i c l o b u t e n o l ( 400 m g , 3 , 33 m m o l e s ) e n u n a c a n t id a d m í n i m a d e T H F y la s o l u c ió n s e a g i t ó a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e d u r a n t e 30 m in u t o s . A c o n t i n u a c ió n , s e e n f r ió la s o l u c ió n a 0 ° C y s e a ñ a d ió g o t a a g o t a a la r e a c c ió n u n a s o l u c ió n d e b r o m u r o d e 2 -( b o c - a m i n o ) e t i l o ( 1.0 g , 4 .46 m m o l e s ) e n u n a c a n t id a d m í n i m a d e T H F y la s o l u c ió n s e a g i t ó a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e d u r a n t e u n a h o r a . S e s e p a r ó e l p r e c ip i t a d o m e d ia n t e f i l t r a c ió n y e l f i l t r a d o s e d i lu y ó c o n é t e r y s e la v ó c o n a g u a ( 3 x 50 m l) . S e s e c ó la f a s e o r g á n i c a y s e c o n c e n t r ó , r in d i e n d o u n a c e i t e n a r a n ja q u e s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e c o l u m n a u t i l i z a n d o u n s i s t e m a d e s o l v e n t e s H e x : E t O A c 5 : 2 ( 0.44 g , 50.2 % ) .
55. D e s p r o t e c c i ó n d e 2 -( 1 , 2 - D I H I D R O C I C L O B U T A B E N C É N - 1 - I L O X I ) E T I L C A R B A M A T O d e T - B U T I L O
E n u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 200 m l, s e d i s o lv i ó 2 -( 1 , 2 - d i h id r o c i c l o b u t a b e n c é n - 1 - i l o x i l ) e t i l c a r b a m a t o d e t -b u t i l o ( 275 .0 m g , 1.044 m m o l e s ) e n á c i d o f ó r m c ic o y C H 2C h y s e d e j ó b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e 48 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s e v a p o r a r e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , s e a ñ a d ió t o lu e n o y s e c o n c e n t r ó p a r a e l im in a r c u a l q u i e r á c i d o f ó r m ic o r e s id u a l , r in d i e n d o u n a c e i t e v e r d e q u e s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e c o l u m n a u t i l i z a n d o u n s is t e m a d e s o l v e n t e s H e x : E t O A c 5 : 2 , r in d i e n d o e l p r o d u c t o ( 0.023 g , 13.5 % ) .
56. S í n t e s is d e 1 , 2 - B I S ( T R I M E T I L S I L I L ) B E N C E N O
r e d e s t i l a c ió n ( 2.95 g , 5.94 % ) . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C I 3 ) 5 728 ( m , 1 H , A r H ) , 7.16 ( d , 1 H , J = 7.0 ( d , 1 H , J = 6.4 H z , A r H ) , 5.39 ( m , 1 H , C H ) , 3.85 ( d d , 1 H , J = 4 .4 H z , J = 14.7 H z , C H 2 ), 3.45 ( d , 1 H , J = 14 . m z , C H 2). 62. S í n t e s is d e B E N Z O C I C L O B U T E N O L
Figure imgf000070_0001
63. C o p o l í m e r o t r i b l o q u e d e E S T I R E N O - P O L I F L U O R E N O - E S T I R E N O
a . S í n t e s is d e m a c r o in i c i a d o r
Figure imgf000070_0002
A l m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 3 c u e l lo s , e n j u a g a d o c o n a r g ó n ( 30 m in ) s e a ñ a d ió n í q u e l ( 5.080 m m o le s , 1.4000 g ) , 2 , 2 ' - b ip i r i d i l o ( 5 .800 m m o le s , 0.9000 g ) , t o l u e n o s e c o ( 10 m l) , 1 , 5 - c i c l o o c t a d ie n o ( 0.5 m l ) y D M F s e c o ( 12 m l) . L a m e z c la s e c a l e n t ó a 80 ° C b a jo a r g ó n . T r a s 30 m in u t o s , s e i n t r o d u j o i n i c i a d o r a l c o x i l a m i n a b r o m u r a d a ( 0.7750 m m o le s , 0 , 3134 g ) y 2 , 7 - d ib r o m o - 9 , 9 ' - d i - n - h e x i f l u o r e n o ( 2.250 m m o le s , 1.1080 g ) d i s u e l t o e n t o lu e n o s e c o ( 13 m l ) m e d ia n t e j e r i n g a . L a m e z c la s e a g i t ó a 80 ° C d u r a n t e 24 h o r a s e n la o s c u r id a d . T r a s 24 h o r a s , la s o l u c ió n c a l ie n t e p r e c ip i t ó e n 600 m l d e s o l u c ió n d e H C l( c o n c ) :a c e to n a :m e t a n o l e n p r o p o r c ió n 1 : 1 :1. E l p r e c ip i t a d o m a r r ó n o s c u r o r e s u l t a n t e a c o n t in u a c ió n s e f i l t r ó , s e d i s o lv i ó e n d i c lo r o m e t a n o , s e c o n c e n t r ó a l v a c í o y s e r e p r e c ip i t ó c o n 200 m l d e s o l u c ió n d e a c e t o n a : m e t a n o l 1 : 1 .
b . S í n t e s is d e c o p o l í m e r o A - B - A c o n 10 % d e e n t r e c r u z a n t e
S e d i s o lv i ó in i c i a d o r m a c r o m o l e c u l a r ( M = 3000 , n = 0 .060 m m o le s , 180 m g ) , e s t i r e n o ( 90 e q . p o r c a d e n a y 9.72 m m o le s , 1.0123 g ) y e n t r e c r u z a n t e ( 2 , 2 - d i ó x id o d e 5 - v i n i l - 1 , 3 - d ih i d r o - b e n z o [ c ] t i o f e n o ) ( 10 % , 1.08 m m o le s , 0 .2098 g ) e n 0.5 m l d e c lo r o b e n c e n o e n u n a a m p o l l a d e 10 m l. L a a m p o l l a s e d e s g a s i f i c ó , s e s e l ló y s e c a l e n t ó a 124 ° C d u r a n t e 7 a 10 h o r a s . D e s p u é s d e e s t e t i e m p o , e l p o l í m e r o s e p r e c ip i t ó a p a r t i r d e m e t a n o l . E l p r e c ip i t a d o m a r r ó n r e s u l t a n t e s e f i l t r ó , s e la v ó c o n m e t a n o l y s e s e c ó .
c . P r o c e d im ie n t o d e p l ie g u e d e c a d e n a i n t r a m o le c u la r e s p a r a A - B - A
S e d i s o l v i e r o n 0.300 g d e p o l í m e r o e n 50 m l d e é t e r b e n c í l i c o . L a s o l u c ió n d e p o l í m e r o s e a ñ a d ió g o t a a g o t a , 12.4 m l / h , a é t e r b e n c í l i c o a 260 ° C b a jo n i t r ó g e n o . T r a s a ñ a d i r t o d o e l p o l í m e r o , s e e n f r ió la r e a c c ió n y e l é t e r b e n c í l i c o s e d e s t i l ó d e la m e z c la d e r e a c c ió n y e l r e s id u o s e p r e c ip i t ó a p a r t i r d e m e t a n o l .
64. S í n t e s is d e N - B O C - N - T F A - E T I L E N D I A M I N A .
A u n a s o l u c ió n d e N - B o c - e t i l e n d i a m in a ( 5.0 g , 31.2 m m o l e s ) e n 20 m l d e T H F . S e a ñ a d ió t r i f l u o r o a c e t a t o d e e t i l o ( 3.72 m l, 31.2 m m o l e s ) g o t a a g o t a y la r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e . L a s o l u c ió n d e r e a c c ió n s e c o n c e n t r ó , r in d i e n d o u n p r o d u c t o c r i s t a l i n o b la n c o ( 8.0 g , 100 % ) . R M N 1 H ( 400 M H z , C D C h ) 5 1.44 ( s , 9 H , C H 3 ), 3.37 ( d d , 2 H , J = 5.4 H z , J = 10.2 H z , C H 2 ), 3.46 ( d d , 2 H , J = 5.1 H z , J = 10.4 H z , C H 2 ), 5.01 ( s , 1 H , N H ) , 7.85 ( s , 1 H , N H ) ; R M N 13C ( 400 M H z , C D C h ) 5 28.2 , 39.1 , 42.2 , 80.6 , 140.6 , 151.2 , 157.7.
65. D e s p r o t e c c i ó n d e B O C E N N - B O C - N - T F A - E T I L E N D I A M I N A .
S e d i s o lv i ó N - B o c - N - T f a - e t i l e n d ia m i n a ( 8.0 g , 31 .5 m m o l e s ) e n 50 m l d e á c i d o f ó r m ic o y s e a g i t ó d u r a n t e 14 h a t . a . T r a s e v a p o r a r e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , s e a ñ a d ió t o lu e n o y s e c o n c e n t r ó p a r a e l im in a r c u a l q u i e r á c i d o f ó r m ic o r e s id u a l , r i n d i e n d o u n a c e i t e n a r a n ja ( 4.90 g , 99.7 % ) . R M N 1 H ( 400 M H z , M e O D ) 5 2.31 ( s , 2 H , N H 2 ), 3.15 ( t , 2 H , J = 6.1 H z , C H 2 ), 3.61 ( t , 2 H , J = 6 .1 H z , C H 2 ), 8 .35 ( s , 1 H , N H ) ; R M N 13C ( 400 M H z , M e O D ) 5 38.5 , 39.7 , 113.1 , 115.9 , 118.8 , 121.6 , 159.7 , 160.1.
66. U n ió n d e N - T F A - E T I L E N D I A M I N A .
L a s n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 77 m g , 0.00194 m im ó le s ) e n D r i S o lv D M F ( 9.0 m l ) s e a g i t a r o n D a jo a r g ó n a 0 ° C c o n N - m e t i lm o r f o l i n a ( 6.9 m g , 0 .0680 m im ó le s ) s e g u id o d e la a d i c ió n g o t a a g o t a d e c lo r o f o r m a t o d e is o b u t i lo ( 10 .2 m g , 0.0748 m m o l e s ) e n D M F ( 0.5 m l) . T r a s 1.5 h , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e N - T f a -e t i l e n d i a m i n a ( 10 .6 m g , 0.0680 m m o le s ) . L a r e a c c ió n s e d e jó q u e s e c a l e n t a s e h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e y s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e . T r a s la e l im in a c i ó n d e l D M F a l v a c í o , s e d i s o lv i ó e l p r o d u c t o e n m e t a n o l y s e d ia l i z ó f r e n t e a m e t a n o l c o n t u b o d e d i á l i s i s p l e g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) .
67. D e s p r o t e c c i ó n d e M A L - D P E G ™ 4- T - B O C - H I D R A Z I D A .
E n u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 100 m l, s e d i s o l v i ó M A L - d P e g ™ 4 - t - b o c - h id r a z i d a ( 8.8 m g , 135.0 n m o le s ) e n 10.0 m l d e á c id o f ó r m ic o y s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s e v a p o r a r e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , s e a ñ a d ió t o lu e n o y s e c o n c e n t r ó p a r a e l im in a r c u a l q u i e r á c i d o f ó r m ic o r e s id u a l , p r o p o r c io n a n d o M A L - d P e g ™ 4 - h id r a z i d a ( 58.1 m g , 100 % ) .
68. U n ió n d e M A L - D P E G ™ 4- H I D R A Z I D A .
L a s n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 77 , 5 m g , 0.00186 m m o l e s ) e n D r i S o lv D M F ( 9.0 m l) s e a g i t a r o n b a jo a r g ó n a 0 ° C c o n N - m e t i lm o r f o l i n a ( 1.5 m g , 0 .0149 m m o l e s ) s e g u id o d e la a d i c ió n g o t a a g o t a d e c lo r o f o r m a t o d e is o b u t i lo ( 2.2 m g , 0.0164 m m o l e s ) e n D M F ( 0.1 m l) . T r a s 1.5 h , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e M A L - d P e g ™ 4 - -h i d r a z id a ( 8.8 m g , m o l ) . L a r e a c c ió n s e d e j ó q u e s e c a le n t a s e h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e y s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e . T r a s la e l im in a c i ó n d e l D M F a l v a c í o , s e d i s o lv i ó e l p r o d u c t o e n m e t a n o l y s e d ia l i z ó f r e n t e a m e t a n o l c o n t u b o d e d i á l i s i s p le g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) .
69. U n ió n d e c o n e c t o r d i s u l f u r o a t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r d e h e x i lo p r o t e g id o c o n B O C
U n a s o l u c ió n d e t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r p r o t e g id o c o n B o c ( 500 .0 m g , 0.13 m m o le s ) , á c id o 3 - ( p i r i d í n - 2 - i l -d i s u l f a n i l ) p r o p a n o i c o ( 269 .5 m g , 1.25 m m o le s ) , 1 - h id r o x i b e n z o t r i a z o l ( H O B t ) ( 169 .0 m g , 1.25 m m o le s ) , t r i e t i l a m in a ( T E A ) ( 126.7 m g , 1.25 m m o le s ) , h i d r o c lo r u r o d e N - ( 3 - d im e t i l a m i n o p r o p i l ) - N ' - e t i l c a r b o d i im id a ( E D C H C l ) ( 240.0 m g , 1.25 m m o l e s ) e n 10 m l d e D M F D r i S o lv s e a g i t ó d u r a n t e 48 h . S e e l im in ó e l D M F b a jo v a c í o y e l a c e i t e m a r r ó n r e s u l t a n t e s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a d e c o lu m n a , e l u y e n d o c o n u n s i s t e m a d e g r a d i e n t e d e m e t a n o l a l 2 - 10 % e n d i c l o r o m e t a n o ( 160.5 m g , 30.6 % ) . R M N 1H ( 300 M H z , M e O D ) 6 1.33 - 1 .47 ( m , 246 H , C H 2 , C H 3 ), 2.03 ( d , 48 H , J = 65 .3 H z , C H 2 ), 3.15 ( td , 30 H , J = 6.3 H z , J = 12.7 H z , C H 2 ), 3 .29 ( m , 45 H , C H 2 ), 7.42 ( m , 1 H , A r H ) , 7.67 ( d , 1 H , J = 8.2 H z , A r H ) , 7.79 ( d , 1 H , J = 8.1 H z , A r H ) , 8.02 ( s , 1 H , A r H ) .
70. C o r t e d e p u e n t e d i s u l f u r o e n e l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r .
Figure imgf000071_0001
71. U n ió n d e t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r a n a n o p a r t í c u la s .
L a s n a n o p a r t í c u la s ( 77.5 m g , 1.76 * 10 ‘6 m o le s ) e n D M F D r i S o lv ( m l ) s e a g i t a r o n b a jo a r g ó n . E l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r t i o l l i b r e e n D M F s e a ñ a d ió g o t a a g o t a , s e g u id o d e la a d i c ió n d e u n a c a n t id a d c a t a l í t i c a d e N -m e t i lm o r f o l l i n a . T r a s la e l im in a c i ó n d e l D M F a l v a c í o , e l p r o d u c t o s e d i s o l v i ó e n m e t a n o l y s e d i a l i z ó f r e n t e a u n a s o l u c ió n d e m e t a n o l : a g u a 1 : 1 , f i n a l m e n t e d i a l i z a n d o f r e n t e a m e t a n o l p u r o c o n t u b o d e d i á l i s i s p le g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) .
72. D e s p r o t e c c i ó n d e a m in a s p r o t e g id a s c o n t r i f l u o r o a c e t i l o e n p a r t í c u l a s m o d i f i c a d a s .
L a s n a n o p a r t í c u la s ( 142 .0 m g , x m o le s ) s e d i s o l v i e r o n e n u n a s o l u c ió n d e K 2C O 3 a l 10 % d e m e t a n o l : a g u a 5 : 3. S e a ñ a d ió m e t a n o l s e g ú n s e r e q u e r í a p a r a d i s o l v e r p o r c o m p le t o la s p a r t í c u la s . L a r e a c c ió n s e p r o d u jo d u r a n t e la n o c h e a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a r e a c c ió n s e p u r i f i c ó m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o d e d i á l i s i s p l e g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a u n a s o l u c ió n d e m e t a n o l : a g u a 5 : 3 , f i n a l m e n t e d i a l i z a n d o f r e n t e a m e t a n o l p u r o .
73. U n ió n d e F I T C .
Figure imgf000071_0002
74. A d i c i ó n d e c a p e r u z a a a m in a s r e s t a n t e s .
c o r r e s p o n d i e n t e s a lo s p r o t o n e s v e c i n o s d e la a m in a s e c u n d a r ia d e l c o n e c t o r P E G e n t r e c r u z a m i e n t o . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s . P a r a d e m o s t r a r la r e a c t i v id a d d e io s g r u p o s a l i lo c o n t io l e s , e n u n a r e a c c ió n m o d e l o s e a ñ a d ió b e n i l - m e r c a p t a n o a lo s g r u p o s a l i lo . L o s p r e s e n t e s in v e n t o r e s e n c o n t r a r o n u n a e l e v a d a r e a c t i v id a d s in u t i l i z a r n in g ú n o t r o r e a c t iv o . T a m b i é n a ñ a d ie r o n e l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r d e la m is m a m a n e r a .
80. U n ió n d e B E N C I L - M E R C A P T A N O a n a n o p a r t í c u la s d e P O L I ( V L - E V L - A V L - O P D ) ( p r o c e d im ie n t o g e n e r a l p a r a u n i r c o m p u e s t o s f u n c io n a l i z a d o s c o n T I O L , in c lu y e n d o “ t r a n s p o r t a d o r e s m o le c u la r e s ” y p é p t i d o s ) .
E n u n v ia l d o t a d o d e u n a b a r r a d e a g i t a c ió n , s e d i s o l v i e r o n n a n o p a r t í c u la s d e p o l i ( a v l - e v l - v l - o p d ) ( 0 .030 g , 0.0268 m m o l e s ) y b e n c i l - m e r c a p t a n o ( 9.48 m g , 0 .0764 m m o l e s ) e n 0.6 m l d e t o lu e n o . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 72 h a 30 ° C . E l t o l u e n o r e s t a n t e s e e l im in ó a l v a c í o y s e e l im in ó e l b e n c i l - m e r c a p t a n o r e s id u a l m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a d i c lo r o m e t a n o . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o e r a la d e s a p a r ic ió n d e lo s p r o t o n e s d e a l i lo e n 5.72 y 5.06 p p m y la a p a r i c ió n d e s e ñ a le s e n 3.52 p p m y 7.30 p p m c o r r e s p o n d i e n t e s a lo s p r o t o n e s d e l m e t i le n o y e l b e n c e n o , r e s p e c t i v a m e n t e , d e l b e n c i l - m e r c a p t a n o u n id o . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s .
81. U n ió n d e N - B O C - E T I L E N D I A M I N A A 2 - V I N I L S U L F O N I L E T I L - C A R B O N A T O d e s u c c c i n im id i l o ( S V E C ) .
A u n a s o l u c ió n d e S V E C ( 1.03 g , 3.72 m m o l e s ) e n a c e t o n i t r i l o ( 50 m l) , s e a ñ a d ió N - B o c - e t i l e n d i a m in a ( 0.77 m l, 4.86 m m o l e s ) y a g u a ( 50 m l) . S e a ñ a d ió b i c a r b o n a t o s ó d i c o ( 0.4066 g , 4.84 m m o l e s ) y la r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 4 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . S e e l im in ó e l a c e t o n i t r i l o a l v a c í o y la f a s e a c u o s a r e s t a n t e s e d i lu y ó c o n s o l u c ió n h i p e r s a l i n a ( 45 m l) . L a f a s e a c u o s a s e e x t r a jo t r e s v e c e s c o n d i c l o r o m e t a n o ( 90 m l) . S e a g r u p a r o n la s f a s e s o r g á n i c a s , s e la v a r o n c o n s o l u c ió n h ip e r s a l i n a , s e s e c a r o n c o n M g S O 4 y s e c o n c e n t r a r o n a l v a c í o . E l p r o d u c t o e n b r u t o s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a f la s h ( e lu y e n t e : a c e t a t o d e e t i l o ) , p r o p o r c io n a n d o u n s ó l id o b l a n c o c o n u n r e n d i m i e n t o d e 90 % . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : 6.6 ( m , H 2C = C H - ) , 6.4 & 6.17 ( m , H 2C = C H - ) , 4.43 ( t , - C H 2C H 2O C ( O ) - ) , 3.3 ( t , - C H 2C H 2 O C ( O ) - ) , 3.24 ( m , - N H C H 2C H 2 N H C ( O ) - ) , 1.41 ( s , -N H C ( O ) O C ( C H 3 ) a ) .
82. U n ió n d e c o n e c t o r s u l f o n i lo a n a n o p a r t í c u la s d e P O L I ( V L - E V L - O P D ) .
Figure imgf000073_0001
83. P r o c e d im ie n t o g e n e r a l p a r a la u n ió n d e P É P T I D O - A L E X A F L U O R ® 750 a n a n o p a r t í c u la s c o n j u g a d a s c o n c o n e c t o r
E n u n v ia l p e q u e ñ o d o t a d o d e b a r r a d e a g i t a c ió n , s e a ñ a d ió p é p t i d o ( 33 j l d e 0.013 m g / m l d e p é p t i d o e n t a m p ó n f o s f a t o - p H 7.2 ) y A l e x a F l u o r ® 750 ( 26.5 j L d e A l e x a F l u o r ® 20 m g / m L e n d i m e t i l f o r m a m id a ) . L a r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 24 h e n v u e l t o e n p a p e l d e a lu m in io . E n u n v ia l p e q u e ñ o , s e d i s o l v i e r o n n a n o p a r t í c u la s d e p o l i ( v l -e v l - o p d ) ( A B D ) ( 29 .9 m g ) e n 800 j l d e t a m p ó n f o s f a t o ( p H = 7 .2 ) y 700 j l d e d i m e t i l f o r m a m id a . A la s o l u c ió n d e p é p t i d o - A le x a F l u o r ® s e a ñ a d ie r o n 251 j l d e n a n o p a r t í c u la s d i s u e l t a s . T r a s a g i t a r d u r a n t e 45 m in a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , s e a ñ a d ió p é p t i d o a d i c io n a l ( 2 m g , 1 .84 x 10 '6 m o le s ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e p u r i f i c ó u t i l i z a n d o t u b o s c o n c e n t r a d o r e s c o n u n c o r t e d e p e s o m o le c u la r d e 10 , 000 D a .
84. U n ió n d e A L E X A F L U O R ® 750 a n a n o p a r t í c u la s d e P O L I ( V L - E V L - O P D ) .
E n u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 25 m l, s e d i s o l v i e r o n n a n o p a r t í c u la s d e p o l i ( v l - e v l - o p d ) ( 63 .55 m g , 1 .92 x 10 '7 m o le s ) e n 6.4 m l d e t e t r a h i d r o f u r a n o . E l m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o s e s e l ló c o n u n s e p t o d e g o m a y s e p u r g ó c o n a r g ó n . A la s o l u c ió n p u r g a d a s e a ñ a d ió A l e x a F l u o r ® 750 ( 5 m g e n 0.5 m l d e d i m e t i l f o r m a m id a a n h id r a ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 24 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s 24 h , s e a ñ a d ió N - a c e t o x i -s u c c i n im id a ( 50 m g , 0.3 m m o l e s ) p a r a d e s a c t i v a r la s a m in a s n o r e a c c io n a d a s r e s t a n t e s . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la a p a r i c ió n d e lo s p i c o s s ig u ie n t e s : 7.12 , 5.6 , 5.5 , 5.1 , 3.81 , 1.90 p p m . L a e s t r u c t u r a d e A l e x a F l u o r ® 750 n o e s c o n o c id a p ú b l i c a m e n t e . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s .
85. A m in a c ió n r e d u c t o r a g e n e r a l p a r a la u n ió n d e p é p t i d o s a n a n o p a r t í c u la s c o n j u g a d a s c o n A L E X A F L U O R ® E n u n v ia l p e q u e ñ o d o t a d o d e b a r r a d e a g i t a c ió n s e d i s o lv i ó p é p t i d o ( 2.6 m g , 2 .4 x 10 '6 m o le s ) e n 2 m l d e t e t r a h i d r o f u r a n o . A e s t a s o l u c ió n s e a ñ a d ie r o n n a n o p a r t í c u la s c o n j u g a d a s c o n p ig m e n t o ( 0.09 m o le s , e n 0.5 m l d e t e t r a h i d r o f u r a n o ) y N a C N B H 3 ( 2.23 | j l d e N a C N B H 3 1.0 M e n t e t r a h i d r o f u r a n o ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 12 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e p u r i f i c ó m e d ia n t e d iá l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a t e t r a h i d r o f u r a n o . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la a p a r i c ió n d e lo s p i c o s s ig u ie n t e s : 5.2 , 5 , 4.8 , 2.6 , 2.45 , 2.0 , 1.22 a n d 0.89 p p m .
86. U n ió n d e N -( B O C ) - 2 , 2 ( E T I L E N D I O X I ) D I E T I L A M I N A .
U n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 3 c u e l lo s d e 50 m l s e s e c ó a la l l a m a b a jo a r g ó n . L a s n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 27 .6 m g , 0.79 j m o l e s ) s e d i s o lv i e r o n e n D M F D r i S o lv y s e t r a n s f i r i e r o n a l m a t r a z s e l la d o , q u e s e g u id a m e n t e s e s e l ló a 0 ° C m e d ia n t e u n b a ñ o d e h ie lo . S e a ñ a d ió N - m e t i lm o r f o l i n a ( 6.37 m g , 0.063 m m o l e s ) s e g u id o d e c lo r o f o r m a t o d e i s o b u t i lo ( 9 .46 m g , 0 , 0693 m m o l e s ) a la s o l u c ió n e n f r ia d a y s e d e jó q u e s e a c t i v a s e d u r a n t e 1.5 h . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ió N -( b o c ) - 2 , 2 ( e t i l e n d io x i ) d ie t i l a m in a ( 15 .6 m g , 0.063 m m o le s ) , s e r e t i r ó e l b a ñ o d e h ie lo y s e d e jó la r e a c c ió n b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e la n o c h e . L a r e a c c ió n s e c o n c e n t r ó a l v a c í o , s e d i s o lv i ó e l r e s id u o e n M e O H , s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d i a l i z ó f r e n t e a M e O H .
87. D e s p r o t e c c i ó n d e n a n o p a r t í c u la s q u e c o n t ie n e n N -( B O C ) - 2 , 2 ( E T I L E N D I O X I ) D I E T I L A M I N A .
L a s n a n o p a r t í c u la s s e d i s o lv i e r o n e n H C l 2 M / d i o x a n o ( 15 m l) . S e d e jó la r e a c c ió n b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e la n o c h e . L a r e a c c ió n s e d i s o lv i ó e n M e O H / H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d ia l i z ó f r e n t e a M e O H / H 2O .
88. U n ió n d e A L E X A F L U O R 750 ® .
S e p u r g ó t a m p ó n d e P B S ( p H 7.3 ) c o n a r g ó n d u r a n t e 1 h . S e a ñ a d ió A l e x a F l u o r ® 750 ( 3 m g , 2.3 j m o l e s ) e n 0.3 m l d e D M F a u n a s o l u c ió n d e n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 15.8 m g ) e n t a m p ó n d e P B S ( 1.2 m l ) y s e d e ja r o n b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e 24 h . L a r e a c c ió n s e d i lu y ó c o n H 2O , s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d i a l i z a r o n f r e n t e a H 2O .
89. U n ió n d e S V E C .
L a s n a n o p a r t í c u la s s e d i s o l v i e r o n e n 4 m l d e H 2O , s e g u id o d e la a d i c ió n d e b i c a r b o n a t o s ó d i c o ( 2.7 m g , 0 , 0318 m m o l e s ) . A c o n t i n u a c ió n , s e a ñ a d ió S V E C e n 1 m l d e A C N , s e g u id o d e 3 m l a d i c i o n a le s d e A C N . S e d e jó q u e s e p r o d u j e s e la r e a c c ió n d u r a n t e 2 h , m o m e n t o e n q u e s e a ñ a d ió a c e t o x i s u c c in i m i d a ( 127 m g , 0.79 m m o l e s ) c o n e l f in d e d e s a c t i v a r c u a l e s q u i e r a a m in a s r e s t a n t e s . S e d e j ó q u e s e p r o d u j e s e d i c h a r e a c c ió n d u r a n t e 2 h . S e d i lu y ó la r e a c c ió n c o n H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d i a l i z ó f r e n t e a H 2O ( p H 4.5 ) .
90. U n ió n d e p é p t i d o d e t r a n s p o r t e d i r i g id o .
L a s n a n o p a r t í c u la s m o d i f i c a d a s ( 2 m g ) s e d i s o l v i e r o n e n 0.2 m l d e t a m p ó n d e P B S ( p H 7.3 ) y a lo a n t e r io r , s e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n d e G C G G G N H V G G S S V ( 11.4 m g , 0.0105 m m o l e s ) e n 0.4 m l d e t a m p ó n P B S ( p H 7.3 ) . S e d e jó q u e s e p r o d u je s e d i c h a r e a c c ió n d u r a n t e 24 h . S e d i lu y ó la r e a c c ió n c o n H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d ia l i z ó f r e n t e a H 2O .
91. U n ió n d e p é p t i d o d e c o n t r o l .
L a s n a n o p a r t í c u la s m o d i f i c a d a s ( 2 m g ) s e d i s o l v i e r o n e n 0.2 m l d e t a m p ó n d e P B S ( p H 7.3 ) y a lo a n t e r io r , s e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n d e G C G G G S G V S G H N G ( 11 .0 m g , 0.0105 m m o l e s ) e n 0.4 m l d e t a m p ó n P B S ( p H 7.3 ) . S e d e jó q u e s e p r o d u je s e d i c h a r e a c c ió n d u r a n t e 24 h . S e d i lu y ó la r e a c c ió n c o n H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d i a l i z ó f r e n t e a H 2O .
92. U n ió n d e N -( B O C ) - 2 , 2 ( E T I L E N D I O X I ) D I E T I L A M I N A .
U n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 3 c u e l lo s d e 50 m l s e s e c ó a la l l a m a b a jo a r g ó n . L a s n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 27 .6 m g , 0.79 j m o l e s ) s e d i s o lv i e r o n e n D M F D r i S o lv y s e t r a n s f i r i e r o n a l m a t r a z s e l la d o , q u e s e g u id a m e n t e s e s e l ló a 0 ° C m e d ia n t e u n b a ñ o d e h ie lo . S e a ñ a d ió N - m e t i lm o r f o l i n a ( 6.37 m g , 0.063 m m o l e s ) s e g u id o d e c lo r o f o r m a t o d e i s o b u t i lo ( 9 .46 m g , 0 , 0693 m m o l e s ) a la s o l u c ió n e n f r ia d a y s e d e jó q u e s e a c t i v a s e d u r a n t e 1.5 h . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ió N -( b o c ) - 2 , 2 ( e t i l e n d io x i ) d ie t i l a m in a ( 15 .6 m g , 0.063 m m o le s ) , s e r e t i r ó e l b a ñ o d e h ie lo y s e d e jó la r e a c c ió n b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e la n o c h e . L a r e a c c ió n s e c o n c e n t r ó a l v a c í o , s e d i s o lv i ó e l r e s id u o e n M e O H , s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d i a l i z ó f r e n t e a M e O H .
93. D e s p r o t e c c i ó n d e n a n o p a r t í c u la s q u e c o n t ie n e n N -( B O C ) - 2 , 2 ( E T I L E N D I O X I ) D I E T I L A M I N A .
L a s n a n o p a r t í c u la s s e d i s o lv i e r o n e n H C l 2 M / d i o x a n o ( 15 m l) . S e d e jó la r e a c c ió n b a jo a g i t a c ió n d u r a m e la n o c h e . L a r e a c c ió n s e d i s o lv i ó e n M e O H / H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d ia l i z ó f r e n t e a M e O H / H 2O .
94. U n ió n d e a c e t a t o d e 1 , 4 , 7 , 10 - T E T R A A Z A C I C L O D O D E C A N O - 1 , 4 , 7 - T R I S ( A C E T A T O D E T - B U T I L O ) - 10 -S U C C I N I M I D I L O ( D O T A ) .
L a s n a n o p a r t í c u la s s e d i s o lv i e r o n e n D M F , s e g u id o d e la a d i c ió n d e t r i e t i l a m in a ( T E A ) . A d i c h a s o l u c ió n s e a ñ a d ió D O T A y s e d e jó la r e a c c ió n b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e la n o c h e . L a r e a c c ió n s e c o n c e n t r ó a l v a c í o , s e d i s o lv i ó e l r e s id u o e n M e O H / H 2O , s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d ia l i z ó f r e n t e a M e O H / H 2O .
95. D e s p r o t e c c i ó n d e n a n o p a r t í c u la s q u e c o n t ie n e n d o t a p r o t e g id o c o n T - B U T I L O .
L a s n a n o p a r t í c u la s s e d i s o lv i e r o n e n H C l 2 M / d i o x a n o ( 15 m l) . S e d e jó la r e a c c ió n b a jo a g i t a c ió n d u r a n t e la n o c h e . L a r e a c c ió n s e d i s o lv i ó e n M e O H / H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d ia l i z ó f r e n t e a M e O H / H 2O .
96. U n ió n d e S V E C .
L a s n a n o p a r t í c u la s s e d i s o lv i e r o n e n H 2O , s e g u id o d e la a d i c ió n d e b i c a r b o n a t o s ó d i c o . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ió S V E C e n A C N , s e g u id o d e A C N a d i c io n a l . S e d e jó q u e s e p r o d u j e s e la r e a c c ió n d u r a n t e 2 h , m o m e n t o e n q u e s e a ñ a d ió a c e t o x i s u c c in i m i d a c o n e l f in d e d e s a c t i v a r c u a l e s q u i e r a a m in a s r e s t a n t e s . S e d e jó q u e s e p r o d u j e s e d i c h a r e a c c ió n d u r a n t e 2 h . S e d i lu y ó la r e a c c ió n c o n H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d i a l i z ó f r e n t e a H 2O ( p H 4.5 ) .
97. M o d i f i c a c ió n d e A L E X A F L U O R 750 ® .
S e d i s o lv i ó A l e x a F l u o r 750 ® ( 1.43 m g , 1.1 p m o le s ) e n 143 p l d e D M S O y s e a ñ a d ió a c i s t e a m in a ( 0.077 m g , 1.0 p m o l ) e n 30.9 p l d e t a m p ó n d e P B S ( p H 7.5 ) . S e d e jó q u e s e p r o d u j e s e la r e a c c ió n d u r a n t e la n o c h e .
98. U n ió n s im u l t á n e a d e A L E X A F L U O R 750 ® m o d i f i c a d o y p é p t id o .
L a s n a n o p a r t í c u la s m o d i f i c a d a s s e d i s o lv i e r o n e n t a m p ó n d e P B S ( p H 7.3 ) , q u e h a b í a s id o p u r g a d o c o n a r g ó n d u r a n t e 20 m in . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ió A l e x a F l u o r 750 ® m o d i f i c a d o y u n e q u i v a l e n t e d e G C G G G N H V G G S S V y s e d e jó q u e r e a c c io n a s e n d u r a n t e 2 h . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ie r o n 4 e q u iv a l e n t e s a d i c i o n a le s y la r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e . L a s o l u c ió n s e d i lu y ó e n H 2O y s e t r a n s f i r i ó a t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) y s e d ia l i z ó f r e n t e a H 2O .
99. S í n t e s is d e R G D L I N E A L .
S e l l e v ó a c a b o u n a s í n t e s i s e n f a s e s ó l id a d e F m o c t í p i c a p a r a s in t e t i z a r e l p é p t i d o l i n e a l . S e u t i l i z ó u n a r e s in a d e 2 - c lo r o t r i t i l o p r e c a r g a d a c o n c is t e í n a s . C o m o r e a c t i v o d e a c o p la m ie n t o s e u t i l i z ó H O B t : H B T U : D I P E A ( 1 : 1 : 2 ) e n D M F y s e a c o p la r o n d o b le m e n t e a m in o á c id o s . S e u t i l i z ó p i p e r id i n a a l 20 % ( v / v ) e n D M F p a r a d e s p r o t e g e r e l F m o c . S e a c o p ló u n e s p a c ia d o r a m in o - h e x i l o a la s c is t in a s e n la r e s in a , s e g u id o d e á c id o g lu t á m ic o , á c id o a s p á r t i c o , g l ic in a , a r g in in a , f e n i l a l a n in a y f in a l m e n t e , l i s in a .
100. C i c l i z a c ió n d e R G D .
Figure imgf000075_0001
S e u t i l i z ó r e a c t i v o R p a r a d e s p r o t e g e r t o d o s lo s g r u p o s la t e r a le s y s e e s c i n d ió e l p é p t i d o c í c l i c o d e la r e s in a . S e p r e p a r ó r e a c t i v o R m e d ia n t e la c o m b in a c ió n d e 5.4 m l d e T F A , 0.3 m l d e t i o a n i s o l , 0.18 m l d e a n i s o l y 0 .12 m l d e e t a n o d i t i o l . L o a n t e r i o r s e d e jó r e a c c io n a r d u r a n t e 3 h , m o m e n t o e n e l q u e s e s e p a r ó la r e s in a m e d ia n t e f i l t r a c ió n . S e e n f r ió e l s o b r e n a d a n t e a 0 ° C y s e p r e c ip i t ó e l p é p t i d o u t i l i z a n d o é t e r d i e t í l i c o f r í o . S e r e c o g i ó m e d ia n t e c e n t r i f u g a c i ó n y d e s p u é s s e la v ó t r e s v e c e s u t i l i z a n d o é t e r d ie t í l i c o . S e d i s o l v i ó e l p e l le t e n 0.6 m l d e H 2O y 0.4 m l d e A C N c o n t F a a l 0.3 % y s e p u r i f i c ó m e d ia n t e H P L C .
101. S í n t e s is d e N - B O C - N - T F A - E T I L E N D I A M I N A .
A u n a s o l u c ió n d e N - b o c - e t i l e n d i a m i n a ( 5.0 g , 31.2 m im ó le s ) e n 20 m l d e T H F . S e a ñ a d ió T H F t r i f l u o r o a c e t a t o d e e t i l o ( 3.72 m l, 31.2 m m o l e s ) g o t a a g o t a y la r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e . L a s o lu c ió n d e r e a c c ió n s e c o n c e n t r ó , r in d i e n d o u n p r o d u c t o c r i s t a l i n o b l a n c o ( 8.0 g , 100 % ) . R M N 1H ( 400 M H z , C D C h ) 8 1.44 ( s , 9 H , C H 3 ), 3.37 ( d d , 2 H , J = 5.4 H z , J = 10.2 H z , C H 2 ), 3.46 ( d d , 2 H , J = 5 .1 H z , J = 10.4 H z , C H 2 ), 5.01 ( s , 1 H , N H ) , 7.85 ( s , 1 H , N H ) ; R M N 13C ( 400 M H z , C D C la ) 8 28.2 , 39.1 , 42.2 , 80.6 , 140.6 , 151.2 , 157.7.
102. D e s p r o t e c c i ó n d e B O C E N N - B O C - N - T F A - E T I L E N D I A M I N A .
S e d i s o lv i ó N - B o c - N - T f a - e t i l e n d ia m i n a ( 8.0 g , 31 .5 m m o l e s ) e n 50 m l d e á c i d o f ó r m ic o y s e a g i t ó d u r a n t e 14 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s e v a p o r a r e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , s e a ñ a d ió t o lu e n o y s e c o n c e n t r ó p a r a e l im in a r c u a l q u i e r á c i d o f ó r m ic o r e s id u a l , r in d i e n d o u n a c e i t e n a r a n j a ( 4.90 g , 99.7 % ) . R M N 1H ( 400 M H z , M e O D ) 8 2.31 ( s , 2 H , N H 2 ), 3.15 ( t , 2 H , J = 6 .1 H z , C H 2 ), 3.61 ( t , 2 H , J = 6.1 H z , C H 2 ), 8.35 ( s , 1 H , N H ) ; R M N 13C ( 400 M H z , M e O D ) 8 38.5 , 39.7 , 113.1 , 115.9 , 118.8 , 121.6 , 159.7 , 160.1.
103. U n ió n d e N - T F A - E T I L E N D I A M I N A .
L a s n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 162 , 3 m g , 4.58 p m o le s ) e n D M F D r i S o lv ( 10.0 m l ) s e a g i t a r o n b a jo a r g ó n a 0 ° C c o n N - m e t i lm o r f o l i n a ( 47.8 m g , 472 .6 p m o le s ) s e g u id o d e la a d i c ió n g o t a a g o t a d e c lo r o f o r m a t o d e i s o b u t i lo ( 71 .0 m g , 519 .8 p m o le s ) e n D M F D r i S o lv ( 0.75 m l) . T r a s 1.5 h , u n a s o l u c ió n d e N - T f A - e t i l e n d ia m i n a ( 73.8 m g , 472 .6 p m o le s ) e n D M F D r i S o l v ( 2.5 m l ) g o t a a g o t a . L a r e a c c ió n s e d e jó q u e s e c a l e n t a s e h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e y s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e . T r a s la e l im in a c i ó n d e l D M F a l v a c í o , s e d i s o l v i ó e l p r o d u c t o e n m e t a n o l y s e d ia l i z ó f r e n t e a m e t a n o l c o n t u b o d e d i á l i s i s p l e g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) . R M N 1H ( 400 M H z , M e O D ) 8 7.61 - 6.45 ( b r m , a r o m á t i c o d e l e n t r e c r u z a n t e ) , 3.15 - 3 .00 ( b r m , N - T f a - e t i l e n d ia m in a ) , 3.00 - 2 .69 ( b r m , e s q u e le t o y N - T f a - e t i l e n d ia m in a ) , 2 .69 - 1 .34 ( b r m , e s q u e le t o ) .
104. D e s p r o t e c c i ó n d e M A L - D P E G ™ 4- T - B O C - H I D R A Z I D A .
E n u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e 100 m l, s e d i s o lv i ó M A L - d P e g ™ 4 - t - b o c - h id r a z i d a ( 127.1 m g , 239 .5 p m o le s ) e n 80.0 m l d e á c i d o f ó r m ic o y s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s e v a p o r a r e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , s e a ñ a d ió t o lu e n o y s e c o n c e n t r ó p a r a e l im in a r c u a l q u i e r á c i d o f ó r m ic o r e s id u a l , p r o p o r c io n a n d o M A L - d P e g ™ 4 - h id r a z i d a ( 103.1 m g , 100 % ) .
105. U n ió n d e M A L - D P E G ™ 4- H I D R A Z I D A .
L a s n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 141 , 1 m g , 3.13 p m o le s ) e n D M F D r i S o lv ( 10.0 m l ) s e a g i t a r o n b a jo a r g ó n a 0 ° C c o n N - m e t i lm o r f o l i n a ( 17.1 m g , 169.1 p m o le s ) s e g u id o d e la a d i c ió n g o t a a g o t a d e c lo r o f o r m a t o d e i s o b u t i lo ( 25 .4 m g , 86.0 p m o le s ) e n D M F D r i S o l v ( 0.7 m l) . T r a s 1.5 h , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e M A L -d P e g ™ 4- - h i d r a z id a ( 103.1 m g , 239 .5 p m o le s ) . L a r e a c c ió n s e d e jó q u e s e c a l e n t a s e h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e y s e a g i t ó d u r a n t e la n o c h e . T r a s la e l im in a c i ó n d e l D M F a l v a c í o , s e d i s o l v i ó e l p r o d u c t o e n m e t a n o l y s e d ia l i z ó f r e n t e a m e t a n o l c o n t u b o d e d i á l i s i s p l e g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) . R M N 1H ( 400 M H z , M e O D ) 8 7.67 - 6.47 ( b r m , a r o m á t i c o d e l e n t r e c r u z a n t e y c o n e c t o r m a le i m i d a ) , 3.89 - 3 .48 ( b r t , c o n e c t o r m a le i m i d a ) , 3.21 - 3.02 ( b r m , N - T f a - e t i l e n d ia m in a ) , 3.02 - 2.69 ( b r m , e s q u e le t o y N - T f a - e t i l e n d ia m in a ) , 2.69 - 1.01 ( b r m , e s q u e le t o ) .
106. H i d r o g e n a c ió n d e G 1.
U n a s o l u c ió n d e G 1 ( 8.36 g , 5.69 m m o l e s ) e n e t a n o l ( 214 m l ) e n u n a b o t e l la d e h i d r o g e n a c i ó n d e P a r r c o n n í q u e l d e R a n e y ( 3.49 g ) s e a g i t ó a 65 p s i d u r a n t e 3 d í a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . S e a ñ a d ió o t r o 1 g d e n í q u e l d e R a n e y a la r e a c c ió n y s e a g i t ó n u e v a m e n t e a 65 p s i d u r a n t e 3 d í a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a r e a c c ió n s e f i l t r ó a t r a v é s d e C e l i t e y s e e l im in ó e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , p r o p o r c io n a n d o e l p r o d u c t o e n b r u t o . S e d i s o lv i ó e l r e s id u o e n a c e t a t o d e e t i l o y d e s p u é s s e la v ó c o n s o l u c ió n s a t u r a d a d e b i c a r b o n a t o s ó d i c o ( 2 x 100 m l ) y s o l u c ió n h i p e r s a l i n a ( 2 x 100 m l ) y d e s p u é s s e s e c ó la c a p a o r g á n i c a s o b r e s u l f a t o s ó d i c o a n h id r o . S e f i l t r ó la s o l u c ió n y s e c o n c e n t r ó b a jo p r e s ió n r e d u c id a , r in d i e n d o a m in a G 1 ( 8.19 g , 93.7 % ) .
107. U n ió n d e P D P O H A G 1.
S e a g i t ó P D P O H ( 91 .46 m g , 4.25 m m o l e s ) e n T H F s e c o ( 100 m l ) b a jo a r g ó n a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e c o n 1 -h i d r o b e n z o t r i a z o l ( H O B t ) ( 68 .90 m g , 5.10 m m o l e s ) y D C C ( 1.05 g , 5.10 m m o l e s ) . T r a s 1 h , s e a ñ a d ió a m in a G 1 ( 7.34 g , 5.10 m m o l e s ) a la s o l u c ió n y s e p r o d u jo la r e a c c ió n d u r a n t e 48 h , d e s p u é s d e la s c u a le s , s e f i l t r ó y s e c o n c e n t r ó b a jo p r e s ió n r e d u c i d a . E l m a t e r i a l e n b r u t o s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a f la s h d e c o lu m n a , e l u y e n d o c o n h e x a n o s : a c e t a t o d e e t i l o 10 : 1 , in c r e m e n t a n d o a a c e t a t o d e e t i l o a l 100 % , p r o p o r c io n a n d o S S - G 1 b l a n c o ( 4.67 g , 67.1 % ) .
108. D e s p r o t e c c i ó n d e S S G 1 m e d ia n t e á c i d o f ó r m ic o .
S e d i s o lv i ó S S G 1 ( 4.67 g , 2 .85 m im ó le s ) b a jo a g i t a c ió n e n á c id o f ó r m ic o ( 100 m l ) y s e p r o d u je t e m p e r a t u r a a m b ie n t e d u r a n t e la n o c h e . T r a s c o m p le t a r s e , s e e l im in ó e l á c id o f ó r m ic o a z e o t r ó p i c a m e n t e c o n t o lu e n o b a jo p r e s ió n r e d u c id a , r in d i e n d o e l p r o d u c t o ( 3.29 g , 100.0 % ) .
109. U n ió n d e N - B O C - 1 , 6 - D I A M I N O H E X A N O A S S G 1.
S e a g i t ó S S G 1 O H ( 3.29 g , 2.91 m m o l e s ) e n T H F a n h id r o ( 100 m l ) b a jo a r g ó n a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e c o n H O B t ( 4.23 g , 31.25 m m o l e s ) y D C C ( 6.45 g , 31 .25 m m o le s ) . T r a s u n a h o r a , s e a ñ a d ió N - b o c - 1 , 6 - d ia m in o h e x a n o ( 6.76 g , 31 .25 m m o l e s ) a la s o l u c ió n y s e p r o d u j o la r e a c c ió n d u r a n t e 48 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s c o m p le t a r la , la s o l u c ió n d e r e a c c ió n s e f i l t r ó p a r a e l im in a r la s a l D C C y s e c o n c e n t r ó e l f i l t r a d o y s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a f la s h d e c o lu m n a , e l u y e n d o c o n m e t a n o l a l 1 % e n d i c lo r o m e t a n o , c r e c ie n d o g r a d u a lm e n t e a m e t a n o l a l 10 % e n d i c lo r o m e t a n o , r in d i e n d o u n s ó l id o b la n c o ( 4.42 g , 52.0 % ) .
E l s ó l id o r e s u l t a n t e s e d i s o lv i ó e n 1 , 4 - d io x a n o ( 20 m l) , la s o l u c ió n s e e n f r ió a 0 ° C y s e a ñ a d ió H C l 4 M e n 1 , 4 -d i o x a n o ( 20 m l ) y la r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 24 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a e l im in a c i ó n d e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n p r o p o r c io n ó u n s ó l id o b la n c o ( 3.55 g , 100 .0 % ) .
110. U n ió n d e r e a c t i v o d e G O O D M A N a S S G 1 L L .
L a s a l H C l d e S S G 1 L L r e s u l t a n t e ( 3.55 g , 1.51 m o le s ) s e d i s o lv i ó e n m e t a n o l ( 50 m l ) y la s o l u c ió n s e e n f r ió a 0 ° C . S e a ñ a d ió t r i e t i l a m in a ( T E A ) ( 3.41 m l, 24.56 m m o le s ) , s e g u id o d e N , N ' - d i b o c - N ” - t r i f l i l g u a n id i n a ( 6.94 g , 17.74 m m o l e s ) y la r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 24 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s la e l im in a c i ó n d e l s o l v e n t e b a jo p r e s ió n r e d u c id a , e l p r o d u c t o e n b r u t o s e p u r i f i c ó m e d ia n t e c r o m a t o g r a f í a f la s h d e c o lu m n a , e l u y e n d o c o n m e t a n o l a l 1 % e n d i c l o r o m e t a n o y c r e c ie n d o g r a d u a lm e n t e a m e t a n o l a l 10 % e n d i c lo r o m e t a n o , r in d i e n d o u n s ó l id o b l a n c o ( 838 .2 m g , 13.13 % ) . R M N 1 H ( 300 M H z , M e O D ) 8 1.33 - 1.47 ( m , 246 H , C H 2 , C H 3 ), 2.03 ( d , 48 H , J = 65.3 H z , C H 2 ), 3.15 ( td , 30 H , J = 6.3 H z , J = 12 .7 H z , C H 2 ), 3.29 ( m , 45 H , C H 2 ), 7.42 ( m , 1 H , A r H ) , 7.67 ( d , 1 H , J = 8.2 H z , A r H ) , 7.79 ( d , 1 H , J = 8 .1 H z , A r H ) , 8.02 ( s , 1 H , A r H ) .
111. C o r t e d e p u e n t e d i s u l f u r o e n e l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r .
E l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r d e h e x i lo c o n e c t o r d i s u l f u r o ( 257 .8 m g , 61.41 p m o le s ) e n D M F D r i S o l v ( 5 m l ) s e a g i t ó b a jo a r g ó n y s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e D L - d i t i o t r e i t o l ( 740 .0 m g , 4.80 m m o l e s ) e n D M F ( 5 m l ) y la r e a c c ió n s e p r o d u j o d u r a n t e 2 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . T r a s e l im in a r e l D M F a l v a c í o , s e p u r i f i c ó la r e a c c ió n u t i l i z a n d o u n a c o l u m n a S e p h a d e x L H - 20 , e l u y e n d o c o n D M F y c o n c e n t r a n d o la s f r a c c i o n e s a l v a c í o n u e v a m e n t e , r in d i e n d o e l p r o d u c t o ( 251 .0 m g , 100 % ) .
112. U n ió n d e t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r a n a n o p a r t í c u la s .
L a s n a n o p a r t í c u la s ( 147 .4 m g , 3.07 p m o le s ) e n D M F D r i S o l v ( 10 .0 m l ) s e a g i t a r o n b a jo a r g ó n y e l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r h e x i lo t i o l l i b r e ( 251.0 m g , 61.41 p m o le s ) e n D M F D r i S o l v ( 10.0 m l ) s e a ñ a d ió g o t a a g o t a , s e g u id o d e la a d i c ió n d e u n a c a n t id a d c a t a l í t i c a d e N - m e t i lm o r f o l in a . T r a s la e l im in a c i ó n d e l D M F a l v a c í o , e l p r o d u c t o s e d i s o l v i ó e n m e t a n o l y s e d i a l i z ó f r e n t e a u n a s o l u c ió n d e m e t a n o l : a g u a 1 : 1 , f i n a l m e n t e d i a l i z a n d o f r e n t e a m e t a n o l p u r o c o n t u b o d e d i á l i s i s p le g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) . R M N 1 H ( 400 M H z , M e O D ) 8 7.55 - 6.21 ( b r m , a r o m á t i c o d e l e n t r e c r u z a n t e ) , 3.85 - 3.49 ( b r t , c o n e c t o r m a le i m i d a ) , 3.22 - 3 .00 ( b r m , N - T f a - e t i l e n d ia m in a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 3 .00 - 2 .70 ( b r m , e s q u e le t o , N - T f a - e t i l e n d ia m in a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 2.70 - 1 .00 ( b r m , e s q u e le t o y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) .
113. D e s p r o t e c c i ó n d e a m in a s p r o t e g id a s c o n t r i f l u o r o a c e t i l o s o b r e p a r t í c u l a s m o d i f i c a d a s .
L a s n a n o p a r t í c u la s ( 142.0 m g , 1.54 p m o le s ) s e d i s o lv i e r o n e n m e t a n o l ( 5.0 m l ) y s e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n a l 10 % d e K 2C O 3 d e m e t a n o l : a g u a 5 : 3 ( 13.0 m l ) a la s o l u c ió n y s e d e jó q u e s e p r o d u j e s e la r e a c c ió n d u r a n t e la n o c h e a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a r e a c c ió n s e p u r i f i c ó m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o d e d i á l i s i s p l e g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a u n a s o l u c ió n d e m e t a n o l : a g u a 5 : 3 , f i n a l m e n t e d ia l i z a n d o f r e n t e a m e t a n o l p u r o y d i a l i z a n d o d e s p u é s f r e n t e a s o l u c ió n d e m e t a n o l : T H F 1.1 , d i a l i z a n d o f i n a l m e n t e f r e n t e a T H F p u r o . R M N 1 H ( 400 M H z , T H F d 8 ) 8 8.26 - 6.53 ( b r m , a r o m á t i c o d e l e n t r e c r u z a n t e ) , 3.94 - 3 .52 ( b r m , c o n e c t o r m a le im id a ) , 3.28 - 3.12 ( b r t, e t i l e n d i a m i n a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 3.12 - 2 .68 ( b r m , e s q u e le t o , e t i l e n d i a m i n a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 2 .68 - 1 .05 ( b r m , e s q u e le t o y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) .
114. U n ió n d e n a n o p a r t í c u la s c o n á c i d o 3 -( P I R I D Í N - 2 - I L D I S U L F A N I L ) P R O P A N O I C O
U n a s o l u c ió n d e á c id o 3 -( p i r i d í n - 2 - i l - d i s u l f a n i l ) p r o p a n o i c o ( 16.8 m g , 77.9 p m o le s ) e n T H F a n h id r o ( 2.5 m l ) s e a g i t ó b a jo a r g ó n a 0 ° C c o n N - m e t i lm o r f o l in a ( 7.88 m g , 77.9 p m o le s ) s e g u id o d e la a d i c ió n g o t a a g o t a d e c lo r o f o r m a t o d e is o b u t i lo ( 11.7 m g , 85.7 p m o le s ) . T r a s 1.5 h , s e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e la s n a n o p a r t í c u la s d e s p r o t e g i d a s ( 111.0 m g , 1.30 p m o le s ) e n T H F a n h id r o ( 35 .0 m l) . S e d e jó q u e la r e a c c ió n s e c a l e n t a s e h a s t a la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e y s e a g i t ó d u r a n t e 24 h . L a r e a c c ió n s e d i lu y ó y s e p u r i f i c ó m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a m e t a n o l , d i a l i z a n d o f i n a l m e n t e f r e n t e a s o l u c ió n d e T H F : M e O H 3 : 1. R M N 1 H ( 400 M H z , T H F d 8) 5 7.58 - 6 .22 ( b r m ,
e n t r e c r u z a m i e n t o y c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 3.87 - 3 .67 ( b r m , c o n e c t o r m a le im id a ) , 3.24 - 3.16 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 3.15 - 3.04 ( b r m , d i a m i n a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 2 .93 - 2 .83 ( b r m , d i a m i n a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 2 .78 - 2 .62 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 2.62 - 1.06 ( b r m , e s q u e le t o ) .
115. U n ió n d e A L E X A F L U O R ® 568.
A u n a s o l u c ió n d e n a n o p a r t í c u la s m u l t i f u n c i o n a l e s ( 10.0 m g , 106.0 n m o le s ) e n D M F D r i S o lv ( 3.0 m l) , s e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n d e A l e x a F l u o r ® 568 ( 3.78 m g , 4.77 j m o l e s ) e n D M S O a n h id r o ( 377.7 j l ) y t r i e t i l a m in a ( 50.0 j l , 358 .7 j m o l e s ) a la s o l u c ió n y s e d e jó q u e s e p r o d u j e s e la r e a c c ió n e n la o s c u r id a d d u r a n t e 24 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a r e a c c ió n s e d i lu y ó c o n T H F y s e p u r i f i c ó m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a H 2O a l 1 % e n T H F , d i a l i z a n d o f i n a l m e n t e f r e n t e a T H F p u r o .
116. A d i c i ó n d e c a p e r u z a a la s a m in a s r e s t a n t e s .
T r a s c o m p le t a r la a d i c ió n d e A l e x a F l u o r 568 a la s n a n o p a r t í c u la s , s e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n d e N -a c e t o x i s u c c in i m i d a ( 47.1 m g , 299 .5 j m o l e s ) e n D M F D r i S o lv ( 1.0 m l ) a la s o l u c ió n d e r e a c c ió n . S e d e jó q u e s e p r o d u j e s e la r e a c c ió n d u r a n t e 3 h a T A . T r a s la e l im in a c i ó n d e l D M F a l v a c í o , s e d i s o lv i ó e l p r o d u c t o e n m e t a n o l y s e d ia l i z ó f r e n t e a m e t a n o l c o n t u b o d e d i á l i s i s p l e g a d o S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) . R M N 1 H ( 400 M H z , M e O D ) 5 1.29 - 2.43 ( b r m , e s q u e le t o y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 2 .59 - 2 .83 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 2.84 - 2 .95 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 2 .98 - 3 .02 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 3.04 - 3 .09 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 3.16 ( b r t , d i a m i n a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 3.67 ( b r t , c o n e c t o r m a le i m i d a ) , 6 .53 - 7 .98 ( b r m , a r o m á t i c o d e l e n t r e c r u z a m i e n t o , c o n e c t o r d i s u l f u r o y F I T C ) .
117. D e s p r o t e c c i ó n d e B o c d e n a n o p a r t í c u la s m o d i f i c a d a s .
L a s n a n o p a r t í c u la s m o d i f i c a d a s ( 30 .0 m g , 434 .0 n m o le s ) s e d i s o lv i e r o n e n 1 , 4 - d io x a n o a n h id r o ( 10 m l ) y s e e n f r i a r o n a 0 ° C . S e a ñ a d ió g o t a a g o t a u n a s o l u c ió n d e H C l 4 M e n 1 , 4 - d io x a n o ( 10 m l ) a la s n a n o p a r t í c u la s b a jo a g i t a c ió n y s e d e jó q u e s e p r o d u j e s e la r e a c c ió n d u r a n t e la n o c h e a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a s o l u c ió n d e n a n o p a r t í c u la s s e d i l u y ó a t r e s v e c e s e l v o l u m e n o r i g i n a l c o n a g u a y s e d i a l i z ó f r e n t e a a g u a e n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) . T r a s c o m p le t a r la d iá l i s i s , la s o l u c ió n a c u o s a s e l i o f i l i z ó , r in d i e n d o u n s ó l id o a m a r i l l o . R M N 1 H ( 400 M H z , D 2O ) 5 1.18 - 2.37 ( b r m , e s q u e le t o y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 2 .71 - 2 .79 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 2.81 - 2.86 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 2.89 - 2 .93 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 2.94 - 2 .99 ( b r m , c o n e c t o r d i s u l f u r o ) , 3.12 ( b r t , d i a m i n a y t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ) , 3.69 ( b r t , c o n e c t o r m a le i m i d a ) , 6.53 - 8.41 ( b r m , a r o m á t i c o d e l e n t r e c r u z a m i e n t o , c o n e c t o r d i s u l f u r o y F I T C ) .
118. S í n t e s i s d e c o p o l í m e r o P O L I ( V L - A V L ) ( A B ) .
Figure imgf000078_0001
A l i n c r e m e n t a r lo s t i e m p o s d e r e a c c ió n d e a p r o x i m a d a m e n t e 24 h a a p r o x i m a d a m e n t e 48 h , lo s t a m a ñ o s d e p a r t í c u l a s e i n c r e m e n t a r o n d e b id o a l c o n s u m o t o t a l d e f r a c c i o n e s a l i lo . S e e n c o n t r ó q u e la r e a c c ió n a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e e r a s u f i c i e n t e . L a a d i c ió n d e i n ic ia d o r e s r a d ic a le s u o t r o s f o t o i n i c i a d o r e s n o in c r e m e n t a b a s ig n i f i c a t i v a m e n t e la c a l id a d d e la s p a r t í c u la s .
120. S í n t e s i s e n u n s o lo r e a c t o r d e n a n o p a r t í c u la s a p a r t i r d e P O L I ( V L - E V L - A V L - O P D ) ( A B B D ) .
E n u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o d e t r e s c u e l lo s d e 25 m l d o t a d o d e b a r r a d e a g i t a c ió n y s e p t o s , s e a ñ a d ió 2 , 2 ' -( e t i l e n d io x i ) d ie t i l a m i n a ( 18 .3 p l , 1 .25 x 10 ‘4 m o le s ) , 17.1 m l d e C H 2C h y u n a s o l u c ió n d e p o l i ( v l - e v l U n a s o l u c ió n d e p o l i ( v l - e v l - a v l - o p d ) , A B b D , ( 0.0781 g , M w = 3500 D a , P D I = 1.29 ) . L a m e z c la s e c a l e n t ó a 44 ° C d u r a n t e 12 h . S e e l im in ó la d i a m i n a r e s id u a l m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d iá l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a d i c lo r o m e t a n o . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la d e s a p a r ic ió n d e lo s p r o t o n e s d e e p ó x id o e n 2.94 , 2.75 y 2.47 p p m y la a p a r i c ió n d e s e ñ a le s e n 3.64 y 2.97 p p m c o r r e s p o n d i e n t e s a lo s p r o t o n e s v e c i n o s d e la a m in a s e c u n d a r ia d e l c o n e c t o r P E G d e s p u é s d e l e n t r e c r u z a m i e n t o . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s . E l a n á l i s i s d e T E M d e la s n a n o p a r t í c u la s r e s u l t a n t e s s e m u e s t r a e n la f ig u r a 52. L a d i s t r ib u c ió n d e lo s t a m a ñ o s d e p a r t í c u la , c o n u n a p o l id i s p e r s id a d in u s u a l m e n t e e s t r e c h a , d e la s n a n o p a r t í c u la s r e s u l t a n t e s s e m u e s t r a e n la f ig u r a 53. P a r a i n c r e m e n t a r lo s t a m a ñ o s d e la s p a r t í c u la s , lo s t i e m p o s d e r e a c c ió n p u e d e n in c r e m e n t a r s e d e a p r o x i m a d a m e n t e 24 h a a p r o x i m a d a m e n t e 48 h .
121. P r o t o c o l o d e l e x p e r i m e n t o d e in c o r p o r a c ió n .
S e e v a lu ó la in c o r p o r a c ió n d e la s n a n o p a r t í c u la s m u l t i f u n c i o n a l e s f l u o r e s c e n t e s , d e la s p a r t í c u l a s d e c o n t r o l n e g a t i v o , y d e F D - 1 y F D - 2 p o r c é l u la s d e m a m í f e r o , u t i l i z a n d o c é l u la s H e L a , c é l u la s d e c á n c e r , c u l t i v a d a s e n m ic r o p i l l o d e 14 m m d e d i á m e t r o n o r e c u b i e r t o s , p l a c a s M a t T e k n ° 1.5 y u n m ic r o s c o p i o c o n f o c a l Z e i s s L S M 510 M E T A . S e c u l t i v a r o n c é l u la s H e L a e n m e d io d e E a g le m o d i f i c a d o p o r D u lb e c c o - b a jo e n g l u c o s a ( D M E M ) ( S ig m a A l d r i c h ) c o m p le m e n t a d o c o n s u e r o d e f e t o b o v in o a l 10 % ( v / v ) ( G i b c o ) y a n t i b i ó t i c o - a n t im ic ó t i c o a l 1 % ( v / v ) ( G ib c o ) . L a s c é l u la s s e t r a t a r o n c o n la s n a n o p a r t í c u la s m u l t i f u n c i o n a l e s , p a r t í c u l a s d e c o n t r o l n e g a t i v o , F D - 1 o F D - 2 d u r a n t e u n a h o r a , s e la v a r o n t r e s v e c e s c o n s o l u c ió n s a l in a t a m p o n a d a c o n f o s f a t o l i b r e d e C a 2 / M g 2 c o n E D T A ( P B S ) , s e f i j a r o n c o n p a r a f o r m a l d e h í d o a l 3.3 % a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e d u r a n t e 10 m in u t o s y s e a n a l i z a r o n m e d ia n t e m ic r o s c o p í a c o n f o c a l .
122. T r a n s p o r t a d o r m o le c u la r b io c o n j u g a d o .
P a r a p r e p a r a r u n t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r c o n j u g a d o c o n a n t i c u e r p o e je m p la r , s e p r e p a r ó u n d e n d r í m e r o G 1 -N e w k o m e q u e c o n t e n í a n u e v e f u n c io n a l i d a d e s t e r m in a le s t - b u t i l o y u n g r u p o d e a m in a p r im a r ia e n e l p u n t o f o c a l , u t i l i z a n d o lo s m é t o d o s d a d o s a c o n o c e r ( f i g u r a 54 ) . L a f u n c io n a l i d a d a m in a s e h iz o r e a c c io n a r c o n á c id o 3 - ( 2 -p i r i d i n i l d i t i o ) p r o p a n o i c o m e d ia n t e r e a c c io n e s d e a c o p la m ie n t o d e a m in a s c o n D C C / H O B t p a r a f o r m a r u n d e n d r í m e r o p r o t e g id o c o n u n n ú c l e o r e a c t i v o . L o s g r u p o s é s t e r d e t - b u t i l o e n la p e r i f e r ia d e l a n d a m i a je d e n d r í t i c o s e d e s p r o t e g i e r o n c o n á c id o f ó r m ic o , p r o p o r c io n a n d o g r u p o s á c id o c a r b o x í l i c o l i b r e s q u e s e a c o p la r o n c o n N -B o c - 1 , 6 - d ia m i n o h e x a n o . T r a s la d e s p r o t e c c i ó n d e lo s g r u p o s p r o t e c t o r e s B o c c o n H C l 2 M e n d i o x a n o , s e t r a n s f o r m a r o n la s a m in a s l i b r e s e n g r u p o s g u a n id i n a c o n N , N - d i B o c - N - t r i f l i l g u a n i d in a y la p o s t e r i o r d e s p r o t e c c i ó n d e lo s g r u p o s B o c u t i l i z a n d o H C l 2 M e n d i o x a n o p r o p o r c io n ó e l c o m p u e s t o d e s e a d o ( E s q u e m a 21 ) .
Figure imgf000080_0001
Esquema 21. Síntesis de precursor de bioconjugado de dendrimero
Figure imgf000080_0002
Figure imgf000081_0001
123. N a n o p a r t í c u l a s d e p o l i é s t e r a d a p t a d a s .
E n e l p r e s e n t e e je m p lo , s e p r e p a r a r o n n a n o p a r t í c u la s d e p o l i é s t e r d e d im e n s io n e s n a n o s c ó p i c a s c o n t r o la d a s m e d ia n t e u n p r o c e d i m i e n t o e n u n s o lo r e a c t o r q u e c o n t e n í a g r u p o s a m in a , c e t o y a l i lo , y s e a d a p t ó a la c o n j u g a c i ó n d e b lo q u e s c o n s t r u c t i v o s b io a c t i v o s , t a l e s c o m o u n t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r d e n d r í t i c o p a r a f a c i l i t a r la in c o r p o r a c ió n c e lu la r , o p é p t i d o s y p i g m e n t o s p a r a l l e v a r a c a b o e l t r a n s p o r t e d i r i g id o y la o b t e n c i ó n d e im á g e n e s . E n v a r i o s e j e m p lo s d e s í n t e s i s d e b i o c o n j u g a d o s , s e d e m u e s t r a la v e r s a t i l i d a d y e s t r a t e g i a s d e u n ió n o r t o g o n a l q u e im p l i c a n r e a c c io n e s d e t i o l - e n o d e a l t o r e n d i m i e n t o b a jo c o n d i c io n e s s u a v e s y r e a c c io n e s d e a m in a c ió n r e d u c t o r a , q u e e v i t a n la in t e g r a c i ó n d e l c o n e c t o r y la s r u t a s p o s t - m o d i f i c a c i ó n m u l t ie t a p a . S e p r e p a r a r o n v a r i o s p r e c u r s o r e s d e n a n o p a r t í c u la s l i n e a l e s s e g ú n e l e s q u e m a 22 .
Figure imgf000082_0001
Esquema 22. P recu rso r lineal
T r a s e l p l ie g u e d e lo s p r e c u r s o r e s l i n e a l e s a n t e r i o r m e n t e in d ic a d o s u t i l i z a n d o m é t o d o s d a d o s a c o n o c e r , la n a n o p a r t í c u la p u e d e f u n c io n a l i z a r s e c o n u n a f r a c c i ó n d e s e a d a . E n c o n t r a s t e c o n la s e s t r a t e g i a s i n f o r m a d a s q u e f o r m a n e n l a c e s a m id a s c o n a n d a m i a je s p o l i é s t e r u t i l i z a n d o la a c t i v a c i ó n d e E D C , q u e t í p i c a m e n t e n o p r e s e n t a n r e n d i m i e n t o s m u y a l t o s y r e q u i e r e n u n g r a n e x c e s o d e p é p t i d o s c a r o s , e n e l p r e s e n t e e j e m p lo , e l e x t r e m o N -t e r m in a l d e la u n i d a d d e t r a n s p o r t e d i r i g i d o ( p . e j . , u n p é p t i d o ) s e h i z o r e a c c io n a r c o n e l g r u p o c e t o y s e in t e g r ó e n e l e s q u e le t o p o l im é r ic o d e la p a r t í c u l a d e p o l i é s t e r d e s a r r o l l a d a . E n u n a r e a c c ió n m o d e lo , s e h a d e m o s t r a d o la a m in a c ió n r e d u c t o r a c o n é x i t o d e N - B o c - e t i l e n d i a m in a c o n g r u p o s c e t o d e la p a r t í c u l a y s e h a n a p l i c a d o e s t a s c o n d i c io n e s d e r e a c c ió n p a r a s o m e t e r a e n s a y o la a d i c ió n d e u n i d a d e s p e p t í d ic a s . E n e l p r e s e n t e e je m p lo , s e s o m e t ió a e n s a y o la s e c u e n c ia d e l p é p t i d o d e t r a n s p o r t e d i r i g id o G C G G G N H V G G S S V y s e s e l e c c io n ó p a r a la r e a c c ió n c o n la n a n o p a r t í c u la A B D , c o n la d i m e n s ió n n a n o s c ó p ic a d e 118 n m p r e p a r a d a a p a r t i r d e l p o l í m e r o p r e c u r s o r l i n e a l A B D c o n 1.5 e q u i v a l e n t e s d e u n i d a d e s d e e n t r e c r u z a m i e n t o 2 , 2 ' - ( e t i l e n d i o x i ) b i s ( e t i l a m in a ) b a jo la s c o n d ic io n e s in d ic a d a s a n t e r i o r m e n t e ( E s q u e m a 22 ) . L o s g r u p o s a m in a d e la n a n o p a r t í c u la e n p r im e r lu g a r r e c ib i e r o n u n a c a p e r u z a d e N - a c e t o x i s u c c in i m i d a y la n a n o p a r t í c u la m o d i f i c a d a y e l p é p t i d o s e s o l u b i l i z a r o n e n t e t r a h i d r o f u r a n o c o n N a C N B H 3 c o m o r e a c t i v o r e d u c t o r .
T r a s la p u r i f i c a c ió n m e d ia n t e d iá l i s i s , la s p a r t í c u l a s m o d i f i c a d a s , 3 , s e c a r a c t e r i z a r o n m e d ia n t e R M N 1H y D L S . E l in c r e m e n t o d e l d i á m e t r o h i d r o d in á m i c o d e 118 ± 10 n m a 120 ± 10 n m in d ic ó la a d i c ió n d e p é p t i d o s a l e s q u e le t o p o l i é s t e r e in v e s t i g a c i o n e s a d i c i o n a le s m e d ia n t e R M N 1H m o s t r a r o n la c o n j u g a c i ó n d e p é p t i d o s c o n lo s p i c o s d e r e s o n a n c ia c a r a c t e r í s t i c o s e n 4.39 y 7.42 p p m . C o n e l a n á l i s i s a d i c io n a l d e d i s p e r s ió n d e lu z e s t á t i c a ( S L S , p o r s u s s ig la s e n in g lé s ) , lo s p r e s e n t e s i n v e n t o r e s p u d ie r o n d e t e r m i n a r la c a n t id a d d e p é p t i d o u n id a a la n a n o p a r t í c u la , q u e s e e s t im ó q u e e r a d e e n t r e 36 y 40 p é p t i d o s u n i d o s p o r p a r t í c u l a
E s t e r e s u l t a d o c o n f i r m a la e f i c i e n c ia d e la s r e a c c io n e s d e a m in a c ió n r e d u c t o r a c o n e l e x t r e m o N - t e r m i n a l d e la s u n i d a d e s p e p t í d ic a s s e l e c c io n a d a s . S in e m b a r g o , la s u n i d a d e s d e t r a n s p o r t e d i r i g id o q u e c o n t ie n e n m á s d e u n g r u p o a m in o p r o p o r c io n a n p r o d u c t o s d e c o n j u g a c i ó n m ix t o s y n e c e s i t a d e s a r r o l l a r s e u n a e s t r a t e g i a a l t e r n a t i v a . P o r e s t e m o t i v o , lo s p r e s e n t e s i n v e n t o r e s q u e r í a n e n c o n t r a r r e a c c io n e s d e t i p o t i o l - e n o q u e s e r e a l i z a s e n e n t r e la s u n id a d e s d e c is t e í n a , i n t e g r a d a s e n la s e c u e n c ia p r ó x im a s a l e x t r e m o N - t e r m in a l , y d o b le e n c o n t r a m o s e n g r u p o s m a le i m i d a , v i n i l s u l f o n a o a l i lo . P a r a i n t e g r a r la p a r e j a d e r e a c c ió n p a r a la s u n i d a d e s q u e c o n t ie n e n t i o l / c i s t e í n a , t a l e s c o m o p é p t i d o s u o l ig o n u c le ó t i d o s , e n la s n a n o p a r t í c u la s , s e s in t e t i z ó u n c o n e c t o r a d e c u a d o q u e s e u n ie s e a la n a n o p a r t í c u la p r e p a r a d a o s e e n c o n t r ó u n m é t o d o q u e e v i t a s e la c o n j u g a c i ó n d e u n a m o lé c u la c o n e c t o r a a f in d e f a c i l i t a r la u n ió n d e e n t id a d e s q u e c o n t u v i e s e n t io l . P o r lo t a n t o , s e e s t u d i ó la in t e g r a c i ó n d e g r u p o s a l i l o e n e l e s q u e le t o p o l i é s t e r eo m o u n i d a d e s f u n c io n a le s c o l g a n t e s q u e y a s e e n c o n t r a r í a n p r e s e n t e s e n e l p r e c u r s o r p o l i é s t e r l i n e a l a n t e s d e la f o r m a c i ó n d e la n a n o p a r t í c u la . L o s g r u p o s a l i lo d i s p o n i b le s q u e p a r t e d e la a - a l i l - 8 - v a le r o l a c t o n a d e lo s p r e c u r s o r e s p o l i é s t e r e s l i n e a l e s s e o x i d a r o n y s e c o n v i r t ie r o n c o m p le t a m e n t e e n g r u p o s e p ó x id o p a r a p r o p o r c io n a r u n i d a d e s q u e s e e n t r e c r u z a s e n c o n la d ia m in a . S in e m b a r g o , c o n la o x i d a c ió n p a r c ia l d e l g r u p o a l i lo , p u d ie r o n c o n s e g u i r s e p r e c u r s o r e s p o l i é s t e r l i n e a l e s q u e c o n t e n í a n u n i d a d e s e p ó x id o y lo s g r u p o s a l i lo r e s t a n t e s . E n la e t a p a s ig u ie n t e , u n p o l i é s t e r A b D l i n e a l q u e s e o x i d ó p a r c ia lm e n t e p a r a c o m p r e n d e r 16 % d e u n id a d e s a l i lo y 1 1 % d e u n id a d e s e p ó x id o s e e n t r e c r u z ó c o n 1.5 e q u i v a l e n t e s d e d ia m in a , u t i l i z a n d o e l n u e v o p r o c e d i m i e n t o d e r e a c c ió n e n u n s o lo r e a c t o r p a r a e x a m in a r la c o m p a t i b i l i d a d d e lo s g r u p o s a l i lo c o n la s c o n d i c io n e s d e f o r m a c i ó n d e n a n o p a r t í c u la s . L a in v e s t i g a c i ó n d e la s p a r t í c u l a s r e s u l t a n t e s c o n D L S m o s t r ó q u e lo s d i á m e t r o s h id r o d in á m i c o s c o r r e s p o n d e n a l t a m a ñ o y s o l u b i l i d a d d e la s p a r t í c u l a s q u e n o c o n t ie n e n n in g ú n g r u p o a l i lo . L o s p i c o s d e r e s o n a n c ia d e a l i lo t o d a v í a s e e n c o n t r a b a n p r e s e n t e s e n lo s e s p e c t r o s d e R M N 1H d e la s p a r t í c u l a s y s e e n c o n t r ó q u e e r a n a n á lo g o s a la s r e s o n a n c ia s d e la s f u n c io n a l i d a d e s a l i lo e n e l p r e c u r s o r l i n e a l .
T r a s u n i r u n a s o n d a f lu o r e s c e n t e , s e u n ió u n p é p t i d o c í c l i c o d i v u lg a d o , t a l c o m o s e m u e s t r a e n e l e s q u e m a 23.
Figure imgf000083_0001
E s q u e m a 23. U n ió n de c - R G D
E n la e t a p a s ig u ie n t e , s e s in t e t i z ó u n a n d a m i a je d e n a n o p a r t í c u la s c o m b in a d o p e p t í d i c o - d e n d r í t i c o s e g ú n e l e s q u e m a 24.
Figure imgf000084_0001
P a r a e l p r im e r e n f o q u e , p é p t i d o s l i n e a l e s G C G G G N H V G G S S V c o n la u n id a d d e r e c o n o c i m i e n t o H V G G S S V c o n a m in a s p r o t e g id a s d e s p u é s d e la a d i c ió n d e c a p e r u z a d e N - a c e t o x i s u c c in i m i d a , s e c o n j u g a r o n c o n la f u n c io n a l i d a d a l i lo d e u n a n a n o p a r t í c u la A B b D d e 126.6 n m m e d ia n t e e l t i o l d e la u n id a d c i s t e í n a t a l c o m o s e h a c o m e n t a d o a n t e r io r m e n t e . E n u n a r e a c c ió n a c o n t in u a c ió n , s e i n t r o d u j o e l r e a c t i v o d e o b t e n c i ó n d e im á g e n e s A l e x a F l u o r ® 594 p a r a m a r c a r a p r o x i m a d a m e n t e 20 d e la s u n i d a d e s a m in a in c o r p o r a d a s d e la n a n o p a r t í c u la . E n u n a r e a c c ió n d e t i o l - e n o s e c u e n c ia l , s e c o n s i g u i ó la c o n j u g a c i ó n d e 30 m o lé c u la s t r a n s p o r t a d o r a s d e n d r í t i c a s ( E s q u e m a 7 ) , t a l c o m o s e c o n f i r m ó m e d ia n t e e s p e c t r o s c o p í a d e R M N 1 H . L a c o n j u g a c i ó n s e c u e n c ia l d e lo s c o m p u e s t o s b i o a c t i v o s p u e d e s e g u i r s e c o n u n a s u p e r p o s ic ió n d e lo s e s p e c t r o s d e R M N 1H q u e m u e s t r a la a d i c ió n d e , e n p r im e r lu g a r , e l p é p t i d o y lo s g r u p o s a l i l o r e s t a n t e s d e la n a n o p a r t í c u la , y lo s p i c o s c a r a c t e r í s t i c o s d e la m o lé c u la d e t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r e n 2.0 y 3.2 p p m .
S e m o d i f i c ó la s e c u e n c ia d e r e a c c ió n p a r a o b t e n e r u n p r o d u c t o b i o c o n j u g a d o s im i l a r q u e s ó lo s e d i f e r e n c i a b a p o r la u n id a d d e t r a n s p o r t e d i r i g id o p e p t í d ic a . N o s e a ñ a d ie r o n c a p e r u z a s a lo s g r u p o s a m in a d e la u n id a d c - R G D p a r a e v i t a r la i n a c t i v a c ió n d e la u n i d a d d e r e c o n o c i m i e n t o d e a r g in in a s . P o r lo t a n t o , la e s t r a t e g i a d e c o n j u g a c i ó n in c lu í a q u e lo s g r u p o s a m in a d e la n a n o p a r t í c u la e n p r im e r lu g a r s e m a r c a b a n c o n e l p i g m e n t o N H S A l e x a F lu o r , s e g u id o d e la r e a c c ió n d e t i o l - e n o c o n la u n id a d d e t r a n s p o r t e d i r i g id o , t a l c o m o s e m u e s t r a e n e l e s q u e m a 6 . E n la ú l t im a e t a p a , a l ig u a l q u e e n la r e a c c ió n a n t e r io r , s e a ñ a d ió la u n id a d d e t r a n s p o r t a d o r d e n d r í t i c o e n u n a r e a c c ió n s e c u e n c ia l d e t i o l - e n o ( E s q u e m a 25 ) .
Figure imgf000084_0002
E n u n a t e r c e r a y ú l t im a s e c u e n c ia d e r e a c c ió n , lo s p r e s e n t e s i n v e n t o r e s p u d ie r o n d e m o s t r a r o n la v e r s a t i l i d a d d e la s u n i d a d e s f u n c io n a le s p r o p o r c io n a d a s d e la n a n o p a r t í c u la y l l e v a r o n a c a b o u n e n f o q u e d e c o n j u g a c i ó n o r t o g o n a l . S e a ñ a d ie r o n c a p e r u z a s d e N - a c e t o x i s u c c in i m i d a a lo s g r u p o s a m in a l i b r e s d e la n a n o p a r t í c u la c o n la r e a c c ió n d e a m in a c ió n r e d u c t o r a s ig u ie n t e e n t r e e l g r u p o c e t o d e l e s q u e le t o p o l i é s t e r y e l e x t r e m o N - t e r m i n a l d e l p é p t i d o d e t r a n s p o r t e d i r i g id o n o m o d i f i c a d o H V G G S S V . T r a s c o m p le t a r la r e a c c ió n d e a m in a c ió n r e d u c t o r a d e la m is m a m a n e r a q u e s e h a i n d ic a d o p a r a e l c o m p u e s t o 3 , u n a r e a c c ió n d e t i o l e n o e n t r e lo s g r u p o s a l i lo d e la s n a n o p a r t í c u la s y e l g r u p o t i o l d e l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r p u d o c o n s e g u i r la u n ió n d e 30 u n i d a d e s s e g ú n e l a n á l i s i s d e e s p e c t r o s c o p í a d e R M N 1 H . L a c a r a c t e r i z a c ió n f in a l a d i c io n a l d e la s p a r t í c u l a s m o d i f i c a d a s m e d ia n t e d i s p e r s ió n d e lu z e s t á t i c a ( S L S ) d e l n ú m e r o d e p é p t i d o s c o n j u g a d o s p u d o d e t e r m i n a r la a d i c ió n d e 36 p é p t i d o s a la p a r t í c u l a . E n la ú l t i m a e t a p a , e l p i g m e n t o é s t e r d e N H S A l e x a F l u o r s e m o d i f i c ó c o n t i o e t i l a m in a ( E s q u e m a 26 ) p a r a m a r c a r e x c l u s i v a m e n t e la p a r t í c u l a m e d ia n t e u n a r e a c c ió n d e t i o l - e n o p a r a o b t e n e r im á g e n e s d e l s i s t e m a in vitro. E l p i g m e n t o A l e x a F l u o r 5 9 4 d e m o s t r ó s e r e s t a b l e b a jo d i c h a s c o n d ic io n e s , p r o p o r c io n a n d o o t r o e j e m p lo d e la v e r s a t i l i d a d q u í m ic a d e l s is t e m a .
Figure imgf000085_0002
Esquema 26. Síntesis de conjugado NP-P-TM-pigmento, ABbD-NP-594-TM utilizando aminación reductora y química
de tiol-eno
T a b la 6 . R e s u m e n d e c o n j u g a d o s d e n a n o p a r t í c u la s c o n d e f in ic ió n d e l t i p o d e p a r t í c u l a s e g ú n e l p r e c u r s o r p o l im é r ic o l i n e a l3 y p é p t i d o d e t r a n s p o r t e d i r i g id o c o n e c t a d o b: 'c ' p a r a e l e x t r e m o N - t e r m i n a l c o n c a p e r u z a d e l p é p t i d o c o n u n id a d d e r e c o n o c i m i e n t o H V G G S S V m e d ia n t e N - a c e t o x i s u c c in i m i d a y 'c ' p a r a R G D c í c l ic o . c E l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r d e n d r í t i c o s e a b r e v i a c o m o M T y e l n o m b r e d e l c o m p u e s t o s e p r o p o r c io n a e n e l o r d e n d e u n ió n d .
Figure imgf000085_0003
A c o n t in u a c ió n , s e p r o p o r c io n a n lo s p r o c e d i m i e n t o s e x p e r i m e n t a l e s r e le v a n t e s a l e j e m p lo 123.
Figure imgf000085_0001
a m b ie n t e y d e s p u é s s e c o n c e n t r ó m e d ia n t e u n e v a p o r a d o r r o t a t o r io . E l p r o d u c t o e n b r u t o s e d c a n t id a d m í n i m a d e T H F ( 5 m l ) y s e v e r t i ó e n u n m a t r a z d e f o n d o r e d o n d o q u e c o n t e n í a 1 l d e é t e r d ie t r n c o . L a s o l u c ió n s e m a n t u v o d u r a n t e la n o c h e a 0 ° C y s e o b t u v o u n s ó l id o b la n c o . S e e l im in ó la s o l u c ió n m e d ia n t e d e c a n t a c i ó n y e l s ó l id o s e s e c ó a l v a c í o , o b t e n i e n d o A B b D . R e n d im ie n t o : 1 , 2 g ( 71 % ) . M w = 3356 D a , P D I = 1.18. R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S , p p m ) 8 : 5.72 ( m , H 2 C = C H - ) , 5.06 ( m , H 2 C = C H - ) , 4.34 ( m , -C H 2 C H 2 C ( O ) C H 2 C H 2 O - ) , 4.08 ( m , - C H 2 O - ) , 3.67 ( m , - O C H 2 C H 3 ) , 2.96 ( m , p r o t ó n d e e p ó x id o ) , 2.78 ( m , e v l p r o t ó n d e e p ó x id o , o p d , - O C ( O ) C H 2 C H 2 C ( O ) C H 2 - ) , 2.58 ( m , o p d , - O C ( O ) C H 2 C H 2 C ( O ) C H 2 - ) , 2.47 ( p r o t ó n d e e p ó x id o ) , 2.34 ( m , v l , - C H 2 C H 2 C ( O ) O - , a v l , H 2 C = C H C H 2 C H - , H 2 C = C H C H 2 C H - ) , 1.66 ( m , a v l y v l , - C H C H 2 C H 2 -), 1.25 ( t , - C H 2 C H 3 ) .
Figure imgf000087_0001
S í n t e s i s e n u n s o lo r e a c t o r d e n a n o p a r t í c u la s a p a r t i r d e A B b D . A u n a s o l u c ió n d e 2 , 2 ' ( e t i l e n d io x i ) d ie t i l a m i n a ( 26 .2 p l , 0.18 m m o l e s ) e n C H 2C h ( 34.6 m l) , s e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n d e A B b D ( 0.13 g , M w = 3356 D a , P D I = 1.18 ) e n C H 2C l2 ( 0.24 m l) . L a m e z c la s e c a l e n t ó a 44 ° C d u r a n t e 12 h . S e e l im in ó la d i a m i n a r e s id u a l m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p le g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a C H 2C h . R e n d im ie n t o : 0 , 15 g ( 94 % ) . D L S : D H = 126.6 ± 9.3 n m . S L S : M w = 350 , 000. R M N 1 H ( 300 M H z , C D C h / T M S ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la d e s a p a r i c i ó n d e lo s p r o t o n e s d e e p ó x id o e n 2.94 , 2.75 y 2.47 p p m y la a p a r i c ió n d e s e ñ a le s e n 3.54 y 2.97 p p m c o r r e s p o n d i e n t e s a lo s p r o t o n e s v e c i n o s d e la a m in a s e c u n d a r ia d e l c o n e c t o r P E G d e s p u é s d e l e n t r e c r u z a m i e n t o . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e A B b D .
P r o c e d im ie n t o g e n e r a l p a r a la u n ió n d e b e n c i l - m e r c a p t á n a n a n o p a r t í c u la s d e A B b D . A u n a s o l u c ió n d e n a n o p a r t í c u la s d e A B b D ( 15 m g , 0.04 p m o le s ) e n t o lu e n o ( 0.5 m l) , s e a ñ a d ió b e n c i l - m e r c a p t a n o ( 3.5 p l, 29 p m o le s ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 72 h a 35 ° C . E l t o l u e n o r e s t a n t e s e e l im in ó a l v a c í o y s e e l im in ó e l b e n c i l - m e r c a p t a n o r e s id u a l m e d ia n t e d iá l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a C H 2C h . R M N 1 H ( 300 M H z , C D C l / T M S ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la r e d u c c i ó n d e lo s p r o t o n e s d e a l i lo e n 5.72 y 5.06 p p m y la a p a r i c ió n d e s e ñ a le s e n 3.73 p p m y 7.30 p p m , c o r r e s p o n d i e n t e s a lo s p r o t o n e s d e l m e t i le n o y d e l b e n c e n o , r e s p e c t i v a m e n t e , d e l b e n c i l - m e r c a p t a n o u n id o . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e la s n a n o p a r t í c u la s A B b D .
D e s p r o t e c c i ó n d e l t r a n s p o r t a d o r m o le c u la r ( T M ) ( 5 ) ( c o n t r i b u c ió n d e S h a r o n H a m i l t o n ) . A u n a s o l u c ió n d e L L - T M ( 15 m g , 4.56 p m o le s ) e n C H 3O H ( 0.4 m l) , s e a ñ a d ió u n a s o l u c ió n d e D , L - d i t i o t r e i t o l e n C H 3O H ( 0.2 m l) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 3 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . S e e l im in ó e l d i t i o t r e i t o l r e s id u a l m e d ia n t e p u r i f i c a c ió n c o n S e p h a d e x L H - 20. E l p r o d u c t o s e u n ió n in m e d ia t a m e n t e a n a n o p a r t í c u la s d e A B b D .
R e a c c ió n m o d e l o d e u n ió n d e T M a n a n o p a r t í c u la s d e A B b D . A u n a s o l u c ió n d e n a n o p a r t í c u la s d e A B b D ( 15 m g , 0.04 p m o le s ) e n C H 3O H ( 0.2 m l) , s e a ñ a d ió 5 (11 m g , 3.35 p m o le s ) e n C H 3O H ( 0.4 m l) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 72 h a 37 ° C . S e e l im in ó e l 5 r e s id u a l m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a m e t a n o l . R e n d im ie n t o : 31 , 3 m g ( 89 % ) . D L S : D H = 128.9 ± 10.2 n m ; p a r t í c u l a o r ig i n a l , D H = 126 .6 ± 9.3 n m . R M N 1 H ( 300 M H z , C D 3 O D ) 8 : e l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la r e d u c c i ó n d e lo s p r o t o n e s d e a l i lo e n 5.72 y 5.06 p p m y la a p a r i c ió n d e s e ñ a le s e n 2.20 - 1.98 ( C H 2 ) , 1.57 ( C H 2 ) y 1.39 ( C H 2 ) p p m d e b id o a l e s q u e le t o d e n d r í t i c o d e l T M . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e la s n a n o p a r t í c u la s A B b D .
N a n o p a r t í c u l a s A B b D c o n j u g a d o s c o n A l e x a F l u o r ® 594 ( 4 ) . A u n a s o l u c ió n d e n a n o p a r t í c u la s A B b D ( 0.021 g , 0.06 p m o le s ) e n T H F s e c o ( 1.5 m l) , s e a ñ a d ió A l e x a F l u o r ® 594 ( 0.14 m l d e 10 m g / m l d e A l e x a F l u o r ® 594 e n D M F , 1.7 p m o le s ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 24 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . S e e l im in ó e l A l e x a F l u o r ® 594 r e s id u a l m e d ia n t e d iá l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a C H 3O H . R e n d im ie n t o : 15 , 2 m g ( 88 % ) . R M N 1 H ( 300 M H z , C D 3O D ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la a p a r i c ió n d e lo s p i c o s s ig u ie n t e s d e b id o a A l e x a F l u o r ® 594 : 7.14 - 7.20 , 6.78 , 5.48 , 4.48 , 3.62 , 3.43 y 1.24 p p m . R M N 1 H ( 600 M H z , ( C D 3) 2S O ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la a p a r i c ió n d e lo s p i c o s s ig u ie n t e s d e b id o a A l e x a F l u o r ® 594 : 7.52 , 7.47 , 7 .08 , 5.32 , 4.44 , 4.35 , 3.58 , 3.16 , 2.03 y 1.25 p p m . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e la s n a n o p a r t í c u la s A B b D .
U n ió n d e M T a n a n o p a r t í c u la s A B b D c o n j u g a d a s c o n A l e x a F l u o r ® 594 , N P - 594 - M T ( 6 ). A u n a s o l u c ió n d e 4 ( 8 m g , 0.89 p m o le s ) e n C H 3O H ( 0.2 m l) , s e a ñ a d ió 5 ( 7 , 5 m g , 2.27 p m o le s ) e n C H 3O H ( 0.4 m l) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 72 h a 37 ° C . S e e l im in ó e l 5 r e s id u a l m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a C H 3O H . R e n d im ie n t o : 10 , 0 m g ( 91 % ) . D L S : D H = 129 .4 ± 9.8 n m ; p a r t í c u l a 22 , 0 m g ( 81 % ) . D L S : D H = 129 .8 ± 9.6 n m ; p a r t í c u l a o r ig i n a l , D H = 126 .6 ± 9.3 n m . R M N 1H ( 600 M H z E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la r e d u c c i ó n d e lo s p r o t o n e s d e a l i l o e n 5.72 y 4.97 p p m y la a p a r i c ió n d e lo s g r u p o s s ig u ie n t e s d e s e ñ a le s s ig n i f i c a t i v a s : 7.37 , 4.79 , 2.23 y 1.66 p p m d e b id o a c R G D , y 7.25 , 6.55 , 5.31 , 4.44 y 1.23 p p m d e b id o a l A l e x a F l u o r ® 594. T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e la s n a n o p a r t í c u la s A B b D .
U n ió n d e M T a n a n o p a r t í c u la s A B b D - A l e x a F l u o r ® 594 c o n j u g a d a s c o n c R G D , N P - 594 - c R G D - M T ( 12 ) . A u n a s o l u c ió n d e 10 ( 7 , 8 m g , 0.02 p m o le s ) e n D M S O ( 0.1 m l) , s e a ñ a d ió 5 ( 1 , 4 m g , 0.67 p m o le s ) e n C H 3O H ( 0.3 m l) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 48 h a 33 ° C . S e e l im in ó e l 5 r e s id u a l m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a C H 3O H / C H 3C N 1 :1. R e n d im ie n t o : 7 , 6 m g ( 83 % ) . D L S : D H = 131.9 ± 10.6 n m ; p a r t í c u la o r ig i n a l , D H = 126 .6 ± 9.3 n m . R M N 1H ( 600 M H z , ( C D 3) 2S O ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la r e d u c c i ó n d e lo s p r o t o n e s d e a l i l o e n 5.72 y 4.97 p p m y la a p a r i c ió n d e s e ñ a le s e n 3.04 ( C H 2 ) , 2 .98 ( C H 2 ) , 1.98 ( C H 2 ) , 1.75 ( C H 2 ) , 1.41 ( C H 2 ) y 1.35 ( C H 2 ) p p m d e b id o a l e s q u e le t o d e n d r í t i c o d e l T M . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e 1 1 .
N a n o p a r t í c u l a s A B b D c o n j u g a d a s c o n H V G G S S V , N P - H V G G S S V ( 14 ) . A u n a s o l u c ió n d e n a n o p a r t í c u la s A B b D ( 50 .0 m g , 0.14 p m o le s ) e n T H F ( 2 m l) , s e a ñ a d ió N - a c e t o x i s u c c in i m i d a ( 7 m g , 44 .5 p m o le s ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 3 h . S e e l im in ó la N - a c e t o x i s u c c in i m i d a r e s id u a l m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a T H F / C H 3O H 1 :1 , p r o p o r c io n a n d o n a n o p a r t í c u la s A B b D c o n c a p e r u z a d e a m in a , 13. A u n a s o l u c ió n d e 13 ( 50.0 m g , 0 , 14 p m o le s e n 3 m l d e T H F ) , s e a ñ a d ió 1 ( 9.3 m g , 8.57 p m o le s ) d i s u e l t o e n D M S O ( 2 m l ) y N a C N B H 3 ( 17.1 p l , N a C N B H 3 1 , 0 M e n T H F ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 12 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e p u r i f i c ó m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a T H F / C H 3C N 1 :1. R e n d im ie n t o : 43 , 2 m g ( 83 % ) . D L S : D H = 129.7 ± 9.5 n m ; p a r t í c u l a o r ig i n a l , D H = 126.6 ± 9.3 n m . S L S : M w = 391 , 000 ; p a r t í c u l a o r ig i n a l , M w = 350 , 000. R M N 1 H ( 600 M H z , ( C d 3 ) 2 S O , p p m ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la a p a r i c ió n d e lo s p i c o s s ig u ie n t e s : 8.21 , 7.85 , 4.55 , 3.73 y 0.80 p p m d e b id o a l p é p t i d o . T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e la s n a n o p a r t í c u la s A B b D .
A l e x a F l u o r ® 594 t i o l a d o ( 15 ) . A u n a s o l u c ió n d e A l e x a F l u o r ® 594 ( 0.2 m l d e 10 m g / m l d e A l e x a F l u o r ® 594 e n D M F , 2.4 p m o le s ) , s e a ñ a d ió c y s t e a m in a ( 68.4 p l d e 2.5 m g / m l d e c i s t e a m in a e n D M S O , 2.2 p m o le s ) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e a g i t ó d u r a n t e 3 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . E l p r o d u c t o s e u n ió n in m e d ia t a m e n t e a 14.
U n ió n d e T M a n a n o p a r t í c u la s A B b D - A l e x a F l u o r ® 594 c o n j u g a d a s c o n H V G G S S V , N P H V G G S S V - 594 - T M ( 16 ) . A u n a s o l u c ió n d e 14 ( 16 m g , 0.04 p m o le s ) e n D M S O ( 0.2 m l) , s e a ñ a d ió 15 ( 2 m g , 1.95 p m o le s ) e n d M s O ( 0.2 m l ) y 5 ( 2.7 m g , 1.2 p m o le s ) e n C H 3O H ( 0.4 m l) . L a m e z c la d e r e a c c ió n s e c a l e n t ó d u r a n t e 48 h a 33 ° C . S e e l im in ó e l 5 y 15 r e s id u a le s m e d ia n t e d i á l i s i s c o n t u b o s d e d i á l i s i s p l e g a d o s S n a k e S k i n ® ( M W C O = 10 , 000 ) f r e n t e a C H 3O H . R e n d im ie n t o : 18 , 5 m g ( 86 % ) . D L S : D H = 132.1 ± 9.3 n m ; p a r t í c u l a o r ig i n a l , D H = 126 .6 ± 9.3 n m . R M N 1H ( 6 0 0 M H z , ( C D 3) 2S O ) 8 : E l c a m b io s ig n i f i c a t i v o f u e la r e d u c c i ó n d e lo s p r o t o n e s d e a l i lo e n 5 .7 2 y 4 .9 7 p p m y la a p a r i c ió n d e lo s g r u p o s s ig u ie n t e s d e s e ñ a le s s ig n i f i c a t i v a s : 3.08 , 2.99 , 1.97 , 1.79 , 1.43 y 1.34 p p m d e b id o a l e s q u e le t o d e n d r í t i c o d e l T M , y 7.27 , 7.07 , 6.53 , 5.32 , 4.46 , 4.37 y 1.24 p p m d e b id o a A l e x a F l u o r ® 594. T o d o s lo s d e m á s a s p e c t o s d e l e s p e c t r o e r a n s im i la r e s a lo s d e 14.
124. E n c a p s u l a d o d e P A C L I T A X E L e n n a n o p a r t í c u la s d e P O L I 8 V L - E V L - A V L - O P D ) ( A B B D ) .
A u n v a s o d e 150 m l q u e c o n t e n í a D - a - t o c o f e r o l s u c c i n a t o d e p o l i e t i l e n g l i c o l 1000 ( 0.39 g ) d i s u e l t o e n a g u a d e c u l t i v o c e l u la r d e L o n z a ( 78 m l) , s e a ñ a d ió le n t a m e n t e b a jo a g i t a c ió n v ig o r o s a p o l i ( v l - e v l - a v l - o p d ) , A B b D , n a n o p a r t í c u la s ( 0.17 g ) y p a c l i t a x e l ( 34 .0 m g ) d i s u e l t o s e n d i m e t i l s u l f ó x i d o ( 0.75 m l) . L a s o l u c ió n s e d i v id i ó e n d o s t u b o s d e c e n t r í f u g a d e 50 m l. L a s n a n o p a r t í c u la s c a r g a d a s c o n p a c l i t a x e l s e p u r i f i c a r o n m e d ia n t e la a p l i c a c i ó n d e d o s c ic l o s d e c e n t r i f u g a c i ó n ( 8000 r p m d u r a n t e 1 h ) y la r e c o n s t i t u c ió n c o n a g u a d e c u l t i v o c e lu la r . A c o n t in u a c ió n , s e l i o f i l i z ó la s u s p e n s ió n d e n a n o p a r t í c u la s . L a p r o p o r c ió n d e c a r g a d e p a c l i t a x e l p a r a e l e n c a p s u la d o s e d e t e r m i n ó m e d ia n t e N a n o D r o p U V / V is y s e e n c o n t r ó q u e e r a d e 11.34 % .
125 . A d m i n i s t r a c ió n in v ivo d e b i o c o n j u g a d o d e n a n o p a r t í c u la s .
S e s a c r i f i c a r o n c in c o r a t a s S p r a g u e - D a w le y a d u l t a s m e d ia n t e i n h a la c ió n le t a l d e C O 2. E n e l m o m e n t o d e la e u t a n a s i a , s e t r a t a r o n o c h o o jo s d e c u a t r o r a t a s c o n u n a s o l u c ió n d e c o n j u g a d o d e n a n o p a r t í c u la s 2 x 10 '2 M e n u n a p r o p o r c ió n m o la r d e 5 :1 ( p i g m e n t o : t r a n s p o r t a d o r ) h a s t a 15 m in u t o s ; u n a r a t a s i r v i ó d e c o n t r o l d e n o t r a t a m ie n t o . S e d e j ó c a e r la s o l u c ió n c o n u n a m ic r o p ip e t a s o b r e la c ó r n e a y s e i n s t i l a r o n m ú l t i p l e s g o t a s e n s e r ie p a r a m a n t e n e r u n m e n is c o d e lá g r i m a s o b r e la c ó r n e a . L a s r a t a s s e m a n t u v ie r o n e n la o s c u r i d a d e n u n a s a la f r í a d u r a n t e d o s h o r a s d e s p u é s d e l t r a t a m ie n t o y s e s o m e t ie r o n a e n u c le a c i ó n d e l g l o b o c o n e l m u ñ ó n d e l n e r v io ó p t i c o u n id o . S e i n t r o d u j e r o n lo s g lo b o s o c u l a r e s c o n n e r v io s ó p t i c o s u n i d o s e n p a r a f o r m a l d e h í d o a l 4 % h a s t a la in c lu s i ó n e n p a r a f in a . L o s b l o q u e s d e p a r a f in a s e c o r t a r o n e n s e c c i o n e s d e 4 p m y s e t i ñ e r o n c o n p i g m e n t o D A P I t r a d i c i o n a l . L o s p o r t a o b j e t o s s e v i s u a l i z a r o n a u n a m a g n i f i c a c ió n d e 40 x u t i l i z a n d o u n m ic r o s c o p i o d e f l u o r e s c e n c ia d i g i t a l O ly m p u s P r o v i s A X 70 c o n in t e r f a z d ig i t a l c o n u n a c á m a r a C C D s e m ie n f r i a d a p a r a v i s u a l i z a r e l t r a n s p o r t a d o r m a r c a d o c o n A l e x a F l u o r 594. S e r e s t ó la a u t o f l u o r e s c e n c ia d e f o n d o y s e m a n t u v o c o n s t a n t e la c o n f i g u r a c ió n p a r a lo s o jo s d e c o n t r o l y lo s o jo s t r a t a d o s . P a r a s o m e t e r a e n s a y o y o b t e n e r im a g e n d e la r e g ió n o c u l a r d e s e a d a , s e m id i e r o n im á g e n e s d e la m is m a l o c a l i z a c ió n b a jo la lo n g i t u d d e o n d a d e l D A P I c o n la c á m a r a m o n t a d a e n e l m ic r o s c o p i o ( v e r la f ig u r a 60 A - D ) .

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    Figure imgf000091_0001
    e n la q u e m y n s o n , in d e p e n d ie n t e m e n t e , n ú m e r o s e n t e r o s n o n e g a t i v o s ,
    c o n u n d i n u c le ó f i l o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a X - R L- X ' , e n la q u e X y X ' s o n , i n d e p e n d ie n t e m e n t e , O H , S H , N H 2 o N H R , e n la q u e R e s H , a lq u i l o o a r i lo , y e n la q u e R L s e s e l e c c io n a d e e n t r e e n t r e a l q u i l o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u id o , a r i l o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u id o , a l c o x i l e n o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o , y é s t e r e s s u s t i t u i d o s o n o s u s t i t u id o s ,
    p r o d u c i e n d o d e e s t a m a n e r a u n a n a n o p a r t í c u la d e g r a d a b le q u e c o m p r e n d e p o r lo m e n o s u n r e s id u o m o n ó m e r o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u i d a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u la :
    Figure imgf000091_0002
    e n la q u e m y m ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e n ú m e r o s e n t e r o s c o m p r e n d i d o s e n t r e 0 y 6 ,
    e n la q u e n y n ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e n ú m e r o s e n t e r o s c o m p r e n d i d o s e n t r e 0 y 2 ,
    e n la q u e Z y Z ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 ,
    e n la q u e Y e Y ' s o n , i n d e p e n d ie n t e m e n t e , O , S o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 a l q u i l o , y e n la q u e R L s e s e l e c c io n a d e e n t r e a lq u i l o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o , y a l c o x i l e n o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o , y
    e n la q u e la n a n o p a r t í c u la p r e s e n t a u n t a m a ñ o d e p a r t í c u l a c o m p r e n d i d o e n t r e a p r o x i m a d a m e n t e 5 n m y a p r o x i m a d a m e n t e 850 n m .
  2. 2. M é t o d o s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 1 , e n e l q u e la r e a c c ió n e s la a d i c ió n d e l p o l í m e r o q u e c o m p r e n d e p o r lo m e n o s u n r e s id u o m o n ó m e r o q u e p r e s e n t a la e s t r u c t u r a r e p r e s e n t a d a p o r la f ó r m u l a ( I ) :
    Figure imgf000092_0001
    e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , e n la q u e m e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 6 , y e n la q u e n e s u n n ú m e r o e n t e r o e n t r e 0 y 2 ,
    a u n a s o l u c ió n d e 1 a 10 e q u i v a l e n t e s m o la r e s d e u n d i n u c le ó f i l o , f r a c c i ó n n u c l e o f í l i c a : f u n c io n a l i d a d e p ó x id o , q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a X - R L- X ' , e n la q u e X y X ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e O H , S H , N H 2 o N H R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , y e n la q u e R L s e s e l e c c io n a d e e n t r e a lq u i l o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o y a l c o x i l e n o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u id o .
  3. 3. M é t o d o s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 2 , e n e l q u e la r e a c c ió n e s p o n e r e n c o n t a c t o e l p o l í m e r o q u e c o m p r e n d e d i c h o p o r lo m e n o s u n r e s id u o m o n ó m e r o q u e p r e s e n t a la e s t r u c t u r a r e p r e s e n t a d a p o r la f ó r m u l a ( I ) :
    Figure imgf000092_0002
    e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , e n la q u e m e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 6 , y e n la q u e n e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 ,
    c o n u n a s o l u c ió n d e u n e q u i v a l e n t e m o la r d e l d i n u c le ó f i lo .
  4. 4. N a n o p a r t í c u l a d e g r a d a b le q u e c o m p r e n d e p o r lo m e n o s u n r e s id u o m o n ó m e r o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a :
    Figure imgf000093_0001
    e n la q u e m y m ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e n ú m e r o s e n t e r o s c o m p r e n d i d o s e n t r e 0 y 6 ,
    e n la q u e n y n ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e n ú m e r o s e n t e r o s c o m p r e n d i d o s e n t r e 0 y 2 ,
    e n la q u e Z y Z ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 ,
    e n la q u e Y e Y ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e O , S o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , y
    e n la q u e R L s e s e l e c c io n a d e e n t r e a lq u i l o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o y a l c o x i l e n o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o , y e n la q u e la n a n o p a r t í c u la p r e s e n t a u n t a m a ñ o d e p a r t í c u l a c o m p r e n d i d o e n t r e a p r o x i m a d a m e n t e 5 n m y a p r o x i m a d a m e n t e 850 n m ; e s t a n d o la n a n o p a r t í c u la d e g r a d a b le f o r m a d a a p a r t i r d e :
    Figure imgf000093_0002
    e n la q u e Z e s O , S o N R , e n la q u e R e s H , a lq u i l o o a r i lo , y
    e n la q u e m y n s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e n ú m e r o s e n t e r o s n o n e g a t i v o s , y
    b ) p o r lo m e n o s u n d i n u c le ó f i l o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a X - R L- X ' , e n la q u e X y X ' s o n in d e p e n d ie n t e m e n t e - O H , - S H , - N H 2 o - N H R , e n la q u e R e s H , a lq u i l o o a r i lo , y e n la q u e R L s e s e l e c c io n a d e e n t r e a l q u i l o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u id o , a r i l o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u id o , a l c o x i l e n o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u i d o y é s t e r e s s u s t i t u i d o s o n o s u s t i t u id o s ,
  5. 5. N a n o p a r t í c u l a d e g r a d a b le s e g ú n la r e i v i n d i c a c ió n 4 , e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e m e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 6 ; e n la q u e n e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 ; R e s H o a l q u i l o C 1 a C 6 ; y e n la q u e R L s e s e l e c c io n a d e e n t r e a lq u i l o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o y a l c o x i l e n o s u s t i t u id o o n o
    n a n o p a r t í c u la d e g r a d a b le e s t á f o r m a d a a p a r t i r d e u n a s o l u c ió n d e 1 a 10 e q u i v a l e n t e s m o la r e s d e u n d i n u c le ó f i lo , f r a c c i ó n n u c l e o f í l i c a : f u n c io n a l i d a d e p ó x id o , q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a X - R L- X '.
    Figure imgf000094_0001
  6. Z e s O o N R , e n e l q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 ,
    m e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 6 ,
    n e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 , y d i c h o p o r lo m e n o s u n m o n ó m e r o c o m p r e n d e m e n o s d e 10 % e n p e s o d e d i c h o p o r lo m e n o s u n r e s id u o m o n ó m e r o d e h a l ó g e n o s e l e c c io n a d o d e e n t r e c lo r o , b r o m o y y o d o ,
    y e l p o l í m e r o c o m p r e n d e a d e m á s u n o o m á s d e e n t r e :
    a . u n r e s id u o m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n p r o p a r g i lo q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a ( I I ) :
    Figure imgf000094_0002
    e n e l q u e m 1 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 6 , y
    e n e l q u e n 1 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 , y
    Figure imgf000094_0003
    e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , y
    e n la q u e n 3 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 .
  7. 7. M é t o d o o n a n o p a r t í c u la d e g r a d a b le s e g ú n la r e iv i n d i c a c ió n 6 , e n e l q u e e l p o l í m e r o c o m p r e n d e a s i m i s m o u n r e s id u o m o n ó m e r o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a ( X I ) :
    Figure imgf000095_0001
    e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , y
    e n la q u e n 2 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 .
  8. 8. M é t o d o s e g ú n la r e i v i n d i c a c ió n 1 , q u e c o m p r e n d e a s i m i s m o p r e p a r a r e l p o l í m e r o m e d ia n t e u n m é t o d o q u e c o m p r e n d e la s e t a p a s s ig u ie n t e s :
    i. c o p o l im e r i z a r u n a m e z c la d e d o s o m á s d e e n t r e :
    a . u n m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n a lq u e n o q u e p r o p o r c io n a u n r e s id u o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u i d a r e p r e s e n t a d a m e d ia n t e u n a f ó r m u l a ( V I ) :
    Figure imgf000095_0002
    e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 ,
    e n la q u e m e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 6 , y
    e n la q u e n e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 ; y p o r lo m e n o s u n o d e e n t r e :
    b . u n m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n p r o p a r g i lo q u e p r o p o r c io n a u n r e s id u o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a ( I I ) :
    Figure imgf000095_0003
    e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 ,
    e n la q u e m 1 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 6 , y
    e n la q u e n 1 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 , y
    c . u n m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n c e t o q u e p r o p o r c io n a u n r e s id u o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a ( I I I ) :
    Figure imgf000096_0001
    e n la q u e Z e s O o N R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , y
    e n la q u e n 3 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 , y
    Figure imgf000096_0002
    e n la q u e Z , m y n s o n t a l c o m o s e h a d e f in id o a n t e r io r m e n t e , y
    iii. q u e c o m p r e n d e a s i m i s m o u n a e t a p a d e f u n c io n a l i z a c ió n d e l p o l í m e r o .
  9. 9. M é t o d o s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 8 , e n e l q u e e l m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n a l q u e n o e s t á p r e s e n t e y t i e n e u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u la :
    Figure imgf000096_0003
    e n la q u e Z , m y n s o n t a l c o m o s e d e f in e e n la r e i v i n d i c a c ió n 8 , p r e f e r e n t e m e n t e e n la q u e m e s 0 , n e s 1 y Z e s O .
  10. 10. M é t o d o s e g ú n la r e i v i n d i c a c ió n 8 , e n e l q u e e l m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n p r o p a r g i l o e s t á p r e s e n t e y t i e n e u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u i d a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u la :
    Figure imgf000097_0001
    e n la q u e Z , m 1, a n d n 1 s o n t a l c o m o s e d e f in e e n la r e i v i n d i c a c ió n 8 , p r e f e r e n t e m e n t e e n la q u e m 1 e s 0 , n 1 e s 1 , y Z e s O .
  11. 11. M é t o d o s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 8 , e n e l q u e e l m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n c e t o e s t á p r e s e n t e y t i e n e u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u i d a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u la :
    Figure imgf000097_0002
    e n la q u e Z y n 3 s o n t a l c o m o s e d e f in e e n la r e iv i n d ic a c ió n 8 , p r e f e r e n t e m e n t e e n la q u e n 3 e s 1 y Z e s O .
  12. 12. M é t o d o s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 8 , e n e l q u e la m e z c la c o m p r e n d e a s i m i s m o p o r lo m e n o s u n m o n ó m e r o q u e p r o p o r c io n a u n r e s id u o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u i d a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a m e d ia n t e u n a f ó r m u l a ( X I ) :
    Figure imgf000097_0003
    e n la q u e n 2 e s u n n ú m e r o e n t e r o c o m p r e n d i d o e n t r e 0 y 2 .
  13. 13. M é t o d o s e g ú n la r e i v i n d i c a c ió n 12 , e n e l q u e d i c h o p o r lo m e n o s u n m o n ó m e r o q u e p r o p o r c io n a u n r e s id u o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a ( X I ) :
    Figure imgf000097_0004
    p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u la :
    Figure imgf000098_0001
    e n la q u e n 2 y Z s o n t a l c o m o s e d e f in e e n la r e iv i n d ic a c ió n 12 , p r e f e r e n t e m e n t e e n la q u e n 2 e s 1 y Z e s O .
  14. 14. N a n o p a r t í c u l a d e g r a d a b le s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 5 , f o r m a d a a p a r t i r d e u n a s o l u c ió n d e 10 e q u i v a l e n t e s m o la r e s d e u n d i n u c le ó f i lo , f r a c c i ó n n u c le o f í l i c a : f u n c io n a l i d a d e p ó x id o , q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a X - R L- X '.
  15. 15. M é t o d o s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 8 , e n e l q u e la f u n c io n a l i z a c ió n c o m p r e n d e la e t a p a s ig u ie n t e :
    a ) h a c e r r e a c c io n a r :
    Figure imgf000098_0002
    c o n u n n u c l e ó f i l o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a X - R 1, e n la q u e X e s O H , S H , N H 2 o N H R , e n la q u e R e s H o a lq u i l o C 1 a C 6 , y e n la q u e R 1 e s u n r a d ic a l o r g á n i c o s u s t i t u id o o n o s u s t i t u id o q u e c o m p r e n d e e n t r e 1 y 24 á t o m o s d e c a r b o n o , o
    b ) h a c e r r e a c c io n a r :
    Figure imgf000098_0003
    c o n u n a a z i d a q u e p r e s e n t a la e s t r u c t u r a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a N 3- R 1 , e n la q u e R 1 e s u n r a d ic a l o r g á n i c o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u i d o q u e c o m p r e n d e e n t r e 1 y 24 á t o m o s d e c a r b o n o , o
    c ) h a c e r r e a c c io n a r :
    u n m o n ó m e r o f u n c io n a l i z a d o c o n c e t o q u e p r o p o r c io n a u n r e s id u o q u e p r e s e n t a u n a e s t r u c t u r a s u s t i t u id a o n o s u s t i t u id a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u l a ( I I I ) t a l c o m o s e d e f in e e n la r e i v i n d i c a c ió n 8 c o n u n a a m in a q u e p r e s e n t a la e s t r u c t u r a r e p r e s e n t a d a p o r u n a f ó r m u la :
    H 2 N - R 1,
    e n la q u e R 1 e s u n r a d ic a l o r g á n i c o s u s t i t u i d o o n o s u s t i t u i d o q u e c o m p r e n d e e n t r e 1 y 24 á t o m o s d e c a r b o n o , y p o s t e r i o r m e n t e
    r e d u c i r la im in a r e s u l t a n t e .
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