ES2746567T3 - Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos a fijarse sobre unas partículas magnéticas, comprendiendo el procedimiento: - una fase (106) de mezcla de la muestra con las partículas magnéticas; - una fase (110) de aspiración de la mezcla desde un pocillo en un cono de pipeta (20) tubular que comprende una punta (21) destinada al pipeteo de líquido; - una fase de captura (112) de las partículas magnéticas sobre una pared interna del cono de pipeta (20); * aplicando un primer campo magnético (16) al cono de pipeta (20), siendo dicho campo apto para atraer y mantener las partículas magnéticas en una zona predeterminada del cono de pipeta (20), denominada de "captura" por encima de la punta de esta; * y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de mezcla contenida en el cono de pipeta (20) en un pocillo (62); - al menos una fase (114, 116) de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta (20): * expulsando la mezcla contenida en el cono de pipeta (20); y * aplicando desde un pocillo (62) que contiene una solución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la solución de lavado en el cono de pipeta (20); - una fase (118) de migración de las partículas magnéticas sobre la pared interna del cono de pipeta (20), desde la zona de captura hasta la punta (21) del cono de pipeta (20), realizando un desplazamiento relativo del cono de la pipeta (20) con respecto al primer campo magnético (16); - y una fase (120) de transferencia de dichas partículas magnéticas que ha migrado a la punta (21) del cono de pipeta (20) en un pocillo de recuperación (69) que contiene una solución.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la extracción de componentes contenidos en una solución utilizando partículas magnéticas.
La invención encuentra aplicación particularmente en el campo de la preparación de muestras biológicas, especialmente en la implementación de diagnósticos in vitro, mediante la captura de analitos de origen biológico (ácidos nucleicos, microorganismos, proteínas, péptidos, etc.) presentes en una solución.
Estado de la técnica
Originalmente desarrollada para la extracción de ácidos nucleicos presentes en una muestra biológica, y descrita en el documento US 5234809, la tecnología “BOOM®” consiste en introducir en una muestra líquida unas partículas magnéticas capaces de enlazarse con unos componentes de interés, después en separar las partículas magnéticas de la muestra con la ayuda de uno o varios imanes. Las partículas así capturadas pueden entonces sufrir un tratamiento ulterior, por ejemplo para liberar sus componentes en una solución de recuperación. Como consecuencia de la eficacia de esta técnica, se han desarrollado y comercializado numerosos dispositivos, especialmente para el ADN y el ARN, etc.), tanto unos dispositivos manuales (por ejemplo, el NucliSENS-miniMAG® de la solicitante) como dispositivos automatizados (NucliSENS-easyMAG® de la solicitante). Estos dispositivos automatizados sufren, no obstante, diversas limitaciones.
Una primera limitación se refiere a su polivalencia y su tamaño. En efecto, estos dispositivos son, generalmente, unos dispositivos automatizados pesados y voluminosos que están diseñados para realizar una secuencia de tratamiento no modificable por el usuario. Un dispositivo automatizado está así diseñado para un único tipo de extracción, por ejemplo, diseñado para la purificación de ácidos nucleicos, pero es incapaz de realizar una inmunoconcentración magnética.
Una segunda limitación se refiere a los circuitos de inyección y de aspiración de los diferentes líquidos utilizados durante la extracción. Al ser importante el número de líquidos, esto implica unos circuitos también numerosos y/o complejos. Además, debido a posibles contaminaciones, estos circuitos de inyección/aspiración deben limpiarse regularmente, lo que implica dejar fuera de servicio los dispositivos.
Una tercera limitación se refiere a las operaciones de agitación que se realizan para obtener la homogeneidad de la muestra que comprende las partículas magnéticas antes de su captura, para maximizar la captura por estos últimos de los analitos de interés o para lavar eficazmente las partículas magnéticas. Este tipo de agitación necesita habitualmente unos mecanismos complejos, por ejemplo, a base de imanes móviles que ponen en movimiento las partículas magnéticas.
La cuarta limitación se refiere a los diferentes líquidos utilizados durante la extracción. Habitualmente, las etapas de realización de la extracción se realizan en uno o a partir de un solo recipiente. De hecho, este recipiente fija un volumen idéntico para todos los líquidos en juego (por ejemplo la muestra, las diferentes soluciones de lavado, la solución de elución, etc.), lo que limita la eficacia global del proceso de extracción. En efecto, algunos tratamientos (por ejemplo, el lavado) necesitan grandes volúmenes para ser totalmente eficaces, mientras que otros tratamientos se limitan a un pequeño volumen de líquido (por ejemplo, la elución).
Descripción de la invención
El objetivo de la presente invención es proponer un procedimiento de extracción de componentes en una muestra líquida con la ayuda de partículas magnéticas que ofrece una gran libertad en la elección de los volúmenes líquidos, en particular hasta 10 ml, utilizados durante la extracción.
Para este fin, la invención tiene por objeto un procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos para fijarse sobre unas partículas magnéticas, comprendiendo el procedimiento:
- una fase de mezcla de la muestra con las partículas magnéticas;
- una fase de aspiración de la mezcla desde un pocillo en un cono de pipeta tubular que comprende una punta destinada al pipeteo de líquido;
- una fase de captura de las partículas magnéticas sobre una pared interna del cono de pipeta:
* aplicando un primer campo magnético al cono de pipeta, siendo dicho campo apto para atraer y mantener las partículas magnéticas en una zona predeterminada del cono de pipeta, denominada de “captura”, por encima de la punta de esta;
* y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en un pocillo;
- al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta:
* expulsando la mezcla contenida en el cono de pipeta; y
* aplicando desde un pocillo que contiene una solución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la solución de lavado en el cono de pipeta;
- una fase de migración de las partículas magnéticas sobre la pared interna del cono, desde la zona de captura hasta la punta del cono de pipeta, realizando un desplazamiento relativo del cono de la pipeta con respecto al primer campo magnético;
- y una fase de transferencia de dichas partículas magnéticas que ha migrado a la punta del cono de pipeta en un pocillo de recuperación que contiene una solución.
En otras palabras, la invención se aprovecha de un cono de pipeta en el que pueden realizarse unos ciclos de aspiración y expulsión introduciendo su punta en un pocillo. Gracias a tales ciclos, es posible capturar la totalidad de las partículas presentes en una muestra de volumen muy superior al del volumen, es decir el cono, en el que se realiza la extracción. Es asimismo posible hacer pasar en el cono un volumen acumulado de líquido muy superior al volumen de la muestra en sí, ajustando el número de ciclos de aspiración y de expulsión. De la misma manera, el volumen de la o de las soluciones de lavado utilizadas, llegado el caso, durante la extracción, puede ser muy superior al volumen del cono. La fase de migración permite, por su parte, localizar las partículas magnéticas en una porción del cono, la punta, que puede sumergirse en un pocillo de volumen muy reducido. El volumen de la solución de recuperación puede, por lo tanto, ser pequeño si es necesario. El volumen de la solución de recuperación es así independiente del volumen de la muestra y del volumen del cono de pipeta en el que se realiza la extracción. Gracias a la invención, es posible, en consecuencia, optimizar cada volumen de líquido utilizado, y así optimizar la extracción.
Además, gracias a la geometría de los conos en forma de tubo y de los ciclos de aspiración expulsión, se obtiene una agitación eficaz de la muestra en los conos, agitación, por ejemplo, realizada antes de la captura, así como un lavado eficaz, y esto sin recurrir a mecanismos de tipo imanes móviles. Además, los inventores han observado que se obtiene un lavado eficaz en el cono al mismo tiempo que las partículas se capturan en la pared del cono de pipeta. Se puede utilizar un gran volumen de solución de lavado, lo que aumenta aún más la eficacia del lavado. De hecho, todas las etapas de la extracción (agitación, captura, lavado, transferencia a una solución de recuperación) pueden realizarse en el cono de pipeta.
Según un modo de realización, el desplazamiento del primer campo magnético consiste en desplazar el cono de pipeta paralelamente a un eje longitudinal de dicho cono, y conservar constante el primer campo magnético, permaneciendo el eje longitudinal del cono de pipeta a igual distancia del primer campo magnético durante el desplazamiento del cono de pipeta.
En otras palabras, la migración de las partículas se puede llevar a cabo de manera simple, desplazando el cono de pipeta con respecto, por ejemplo, a un imán permanente.
Según un modo de realización, la fase de transferencia comprende:
- la colocación de la punta del cono de pipeta en el pocillo de recuperación;
- y la aplicación de un segundo campo magnético desde el fondo del pocillo de recuperación a fin de hacer migrar al pocillo de recuperación las partículas magnéticas contenidas en la punta del cono de pipeta.
En particular, el segundo campo magnético se produce por un imán posicionado parcial o totalmente debajo de la punta del cono de pipeta. El primer campo magnético aplicado al cono de pipeta se desactiva durante la aplicación del segundo campo magnético.
En otras palabras, el segundo campo magnético permite atraer simplemente las partículas al pocillo de recuperación, lo que aumenta la velocidad de recuperación de las partículas magnéticas en el pocillo de recuperación, así como el número de partículas recuperadas. Además, el segundo campo magnético captura automáticamente las partículas magnéticas en el pocillo de recuperación. Por ejemplo, si la solución de recuperación es un eluyente, los componentes unidos a las partículas se han liberado y un técnico puede pipetear directamente la solución que está desprovista de partículas magnéticas.
Según una variante preferida, la fase de transferencia comprende la desactivación del primer campo magnético seguida de la aplicación de ciclos de aspiración y de expulsión de la solución del pocillo de recuperación en la punta del cono de pipeta, comprendiendo dicha aplicación:
- una primera fase de aplicación de los ciclos a una primera frecuencia;
- seguida de una segunda fase de aplicación de los ciclos a una segunda frecuencia, inferior a la primera frecuencia. La primera fase permite disgregar eficazmente el cúmulo de partículas capturadas sobre el cono de pipeta, también denominado “sedimento” y así resuspender las partículas en la solución de recuperación. La segunda fase permite continuar agitando la solución sin impedir la migración de las partículas bajo el efecto del campo magnético. Esto permite aumentar aún más la velocidad de recuperación y el número de partículas recuperadas en el pocillo de recuperación. Además, si la solución es un eluyente, cuya función es liberar los componentes capturados por las partículas magnéticas, estos ciclos tienen por efecto agitar las partículas en el eluyente, lo que aumenta la eficacia del eluyente, en particular durante la utilización de una solución de elución en la desconexión de los analitos de las partículas magnéticas sin etapa de calentamiento.
Según un modo de realización, el procedimiento comprende, previamente a la fase de captura, una fase de agitación de la mezcla contenida en el cono de pipeta por la aplicación de al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de dicha mezcla en el cono de pipeta. Debido a la geometría del cono, de forma tubular, es posible obtener un gran flujo volumétrico generado por la sección del cono, y, en consecuencia, una agitación eficaz. Además, existen grandes turbulencias en el cono generadas naturalmente por el flujo del líquido, turbulencias que aumentan la eficacia de la agitación. Ventajosamente, se prevé un accesorio desechable en el cono para incrementar este efecto.
Según un modo de realización, el procedimiento comprende, previamente a la fase de transferencia, al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta:
- desactivando el campo magnético;
- aplicando desde un pocillo que contiene una solución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la solución de lavado en el cono de pipeta;
- aplicando una segunda fase de captura sobre una pared interna del cono de pipeta:
* aplicando el primer campo magnético al cono de pipeta
* y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en el pocillo que contiene la solución de lavado.
Según un modo de realización, el procedimiento comprende, previamente a la fase de transferencia, al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta:
- aspirando la solución de lavado en dicho cono de pipeta;
- después modulando el primer campo magnético aplicado a las partículas magnéticas para capturar estas sobre la pared interna del cono de pipeta;
- y después expulsando el líquido de lavado del cono de pipeta.
En otras palabras, la modulación del campo magnético induce a una reorganización del sedimento de partículas capturado sobre la pared del cono. Especialmente, el sedimento puede cambiar de forma, extenderse, deslizarse o también “rodar” en la pared del cono de pipeta. Esta reorganización del residuo permite aumentar aún más la eficacia del lavado, máxime cuando esta reorganización puede llevarse a cabo conjuntamente con unos ciclos de aspiración y de expulsión de la solución de lavado.
En particular, la modulación del primer campo magnético se realiza:
- desplazando el cono de pipeta paralelamente a un eje longitudinal de dicho cono, y conservando constante el primer campo magnético;
- y/o haciendo desplazar los imanes separados los unos de los otros delante de las partículas capturadas.
En otras palabras, la modulación se obtiene simplemente, por ejemplo, por un técnico que hace deslizar una barra de imanes o por un dispositivo automatizado que pone un mecanismo simple de translación de una barra de imanes.
Según un modo de realización, el volumen del cono de pipeta es al menos diez veces superior al volumen del pocilio de recuperación. Según un modo de realización, el volumen de la mezcla es al menos tres veces superior al volumen del cono de pipeta.
Según un modo de realización, los componentes pertenecen al grupo formado por los ácidos nucleicos simple hebra o doble hebra (ADN y/o ARN), de los microorganismos, de las proteínas, y de los péptidos. Los componentes están constituidos de cualquier otro tipo de molécula en función de la funcionalización dada a las partículas magnéticas. El objetivo de la presente invención es también proponer un dispositivo para la implementación del procedimiento que se acaba de describir, que sea poco voluminosa y de uso sencillo para un técnico de laboratorio.
Para este fin, la invención tiene también por objeto un porta-pipeta que comprende:
- un zócalo;
- un rebaje formado en el zócalo apto para alojar de manera amovible un soporte de pocillo;
- un soporte de pipeta que comprende un primer alojamiento en el que se puede insertar, ventajosamente de manera amovible, una pipeta equipada de al menos un cono de pipeta tubular que comprende una punta destinada al pipeteo de líquido, abriéndose el primer alojamiento sobre el rebaje del zócalo, siendo el soporte de pipeta móvil en translación con respecto al zócalo según una dirección paralela a un eje de los conos de pipeta y móvil entre una primera posición en la que la punta de cada cono de pipeta está alojada en un pocillo del soporte de pocillo y al menos una segunda posición en la que dicha punta está fuera de dicho pocillo;
- un segundo alojamiento apto para alojar de manera amovible una pieza imantada, enfrentándose el segundo alojamiento a cada uno de los conos de pipeta en una posición por encima de la punta de este cuando el soporte de pipeta está en la primera posición, y enfrentándose el segundo alojamiento a la punta del cono de pipeta cuando el soporte de pipeta está en la segunda posición.
En otras palabras, el porta-pipeta recibe una pipeta y el técnico realiza las etapas del procedimiento de extracción, subiendo/bajando la pipeta, especialmente para hacer migrar el sedimento de partícula a la punta del o de los conos de pipeta, introduciendo unos pocillos (en forma de placa, de barra, etc.) en el zócalo, y accionando la pipeta.
El porta-pipeta, que es poco voluminoso y transportable, permite además la semi-automatización del procedimiento de extracción cuando se utiliza una pipeta electrónica. Tal pipeta comprende en efecto unos circuitos de aspiración y de expulsión en cada cono de pipeta que lo equipa, y un circuito electrónico a base de microprocesador. Este circuito electrónico controla los circuitos de aspiración/expulsión en función de consignas introducidas por el técnico mediante una interfaz que equipa la pipeta y/o de un ordenador/Tablet/Smartphone conectado a la pipeta (por ejemplo, mediante una conexión inalámbrica de tipo bluetooth), etc. Estas consignas están constituidas, por ejemplo, de instrucciones de ciclos de aspiración/expulsión y/o de una elección de un protocolo particular pregrabado en la pipeta.
Al ser la pipeta electrónica programable, se obtiene además una gran polivalencia en la definición del procedimiento de extracción, que puede adaptarse en función de una captura magnética particular deseada (por ejemplo: purificación de ácidos nucleicos, inmunoconcentración magnética, etc.). Especialmente, se puede registrar en la pipeta un protocolo apropiado para la extracción considerada, siendo el protocolo definido en términos de número de ciclos de aspiración y de expulsión, de encadenamiento de ciclos, de frecuencia de ciclos, de duración entre los ciclos, volúmenes definidos, etc. Se obtiene así un sistema autónomo y semi-automatizado.
Finalmente, los conos de pipeta son extraíbles de la pipeta, y por lo tanto fácilmente reemplazables, sin que la pipeta esté fuera de servicio durante un largo tiempo.
Según un modo de realización, el primer alojamiento comprende una abertura para la inserción y la extracción frontal de la pipeta en el primer alojamiento del soporte de pipeta. La inserción y la extracción frontal de la pipeta y de los conos en posición minimizan el riesgo de tocar el porta-pipeta con las puntas de los conos, y por lo tanto el riesgo de contaminación del porta-pipeta.
Según un modo de realización, el segundo alojamiento se realiza en el zócalo.
En particular, el soporte de pipeta comprende un tercer alojamiento en el que la pieza imantada es apta para alojarse de manera amovible para enfrentarse a cada cono de pipeta en una posición por encima de la punta de dicho cono cuando el soporte de pipeta está en la segunda posición.
En otras palabras, cuando la pieza imantada (por ejemplo, que comprende uno o varios imanes permanentes) está presente en el tercer alojamiento, ésta es solidaria de los conos de pipeta y sigue por lo tanto sus movimientos de translación con respecto al zócalo. Durante tales movimientos, la pieza imantada conserva por lo tanto los sedimentos de partículas magnéticas fijadas en los conos. El técnico puede así, por ejemplo, subir la pipeta para desplazar más fácilmente un soporte de pocillo en el zócalo sin riesgo de desplazar los sedimentos de partículas en los conos.
Según un modo particular, el segundo y el tercer alojamiento se comunican, y el soporte de pipeta comprende unos medios aptos para mantener de manera amovible la pieza imantada en el tercer alojamiento. De esta manera, el técnico puede separar la pieza imantada del soporte de la pipeta que ocupa entonces su lugar automáticamente en el zócalo al caer en el segundo alojamiento. Esta separación tiene lugar especialmente para la operación de migración de las partículas magnéticas a las puntas de los conos.
Según un modo de realización:
- el zócalo comprende al menos una rueda dentada móvil en rotación;
- y el soporte de pipeta comprende una cremallera que coopera con la rueda dentada para trasladar el soporte de pipeta con respecto al zócalo durante la rotación de la rueda dentada.
En particular, el porta-pipeta comprende un dispositivo de bloqueo y de desbloqueo del soporte de pipeta en la primera posición. Especialmente, el porta-pipeta comprende al menos una empuñadura solidaria de la rueda dentada para hacerlo girar y adecuado para fijarse de manera amovible a una empuñadura solidaria de la rueda dentada de otro porta-pipeta, lo que permite por lo tanto aumentar el número de conos de pipeta durante el procedimiento de extracción.
La invención tiene también por objeto un sistema para la extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos para fijarse sobre unas partículas magnéticas, comprendiendo el sistema:
- una pipeta equipada de al menos un cono de pipeta tubular que comprende una punta destinada al pipeteo de líquido y de un circuito de aspiración y de expulsión en cada cono de pipeta;
- al menos un soporte de pocillo;
- un porta-pipeta que comprende:
* un zócalo;
* un rebaje formado en el zócalo apto para recibir de manera amovible cada soporte de pocillo;
* un soporte de pipeta que comprende un primer alojamiento en el que se inserta la pipeta, ventajosamente de manera amovible, estando el primer alojamiento abierto sobre el rebaje del zócalo, siendo el soporte de pipeta móvil en translación con respecto al zócalo según una dirección paralela a un eje de los conos de pipeta y móvil entre una primera posición en la que la punta de cada cono de pipeta está alojada en un pocillo del soporte de pocillo y al menos una segunda posición en la que dicha punta está fuera de dicho pocillo;
* un segundo alojamiento frente a cada uno de los conos de pipeta en una posición por encima de la punta de éste cuando el soporte de pipeta está en la primera posición y enfrentando el segundo alojamiento a la punta del cono de pipeta cuando el soporte de pipeta está en la segunda posición; y
- una pieza imantada alojada de manera amovible en el segundo alojamiento.
Especialmente, el porta-pipeta es conforme al porta-pipeta descrito anteriormente.
La invención tiene también como objetivo proponer un soporte de pocillo para la migración de partículas magnéticas desde unas puntas de conos de pipetas a unos pocillos de recuperación.
A este respecto, la invención tiene también por objeto un soporte de pocillo, que comprende una pieza en la que se forman unos rebajes para la recepción de los pocillos, y al menos un imán frente a cada uno de los rebajes formados en dicha pieza.
Breve descripción de las figuras
La invención se entenderá mejor a partir de la lectura de la descripción siguiente, dada únicamente a título de ejemplo, y realizada en relación con los dibujos anexos, en los que unas referencias idénticas designan unos elementos idénticos, y en los que:
- la figura 1 es una vista en perspectiva de un sistema de extracción según la invención;
- las figuras 2A y 2B son unas vistas de frente y en perspectiva de una pipeta electrónica y de sus conos de pipetas amovibles;
- las figuras 3A y 3B son unas vistas en perspectiva y de frente de un porta-pipeta según la invención;
- las figuras 4A y 4B son una vista de detalle en corte del porta-pipeta de la figura 3, respectivamente según los planos A-A y B-B de la figura 3B;
- la figura 5 es una vista en perspectiva de una placa “deepwell” que comprende unos pocillos;
- las figuras 6A y 6B son unas vistas en perspectiva de una gradilla magnética y de tubos de elución PCR que pueden alojarse en la gradilla;
- la figura 7 es una vista de frente de una pieza imantada según la invención;
- la figura 8 es un organigrama de un procedimiento de extracción según la invención;
- la figura 9 es una fotografía de los conos de pipeta de un sistema según la invención con unos sedimentos de partículas magnéticas colocados aproximadamente a media altura de los conos;
- la figura 10 es una fotografía de estos mismos conos con los sedimentos colocados en las putas de ellos;
- la figura 11 es una fotografía de tubos de elución PCR en los que se han recuperado las partículas magnéticas; - las figuras 12 y 13 ilustran un segundo modo de realización del porta-pipeta según la invención; y
- la figura 14 es una vista en perspectiva de dos sistemas según la figura 1 acoplados al medio de empuñaduras de rotación.
La descripción se realiza en relación con unos planos y fotografías a una escala reducida de un sistema real.
Descripción detallada de la invención
Refiriéndose a las figuras 1 a 7, un sistema 10 de extracción (figura 1) de componentes contenidos en una muestra líquida comprende una pipeta electrónica 12 (figuras 2), un porta-pipeta 14 (figuras 3) en el que se aloja la pipeta 12, uno o varios soportes de pocillos 18a, 18b (figuras 5 y 6) que pueden alojarse cada uno en el porta-pipeta 14, y una primera pieza imantada 16 (figura 7).
La pipeta 12, que es portátil, comprende una hilera de conos de pipetas 20, y un cuerpo 22 en el que están montados los conos 20 (figura 2A). En este cuerpo 20, están alojados un circuito de aspiración/expulsión de líquido en los conos 20 (por ejemplo, un conjunto de pistones accionados por un motor eléctrico), y un circuito electrónico de control del circuito de aspiración/expulsión. El circuito electrónico, que comprende por ejemplo un microprocesador y una o varias memorias informáticas, es programable, y lleva unas instrucciones para la aplicación de uno o varios protocolos de pipeteo, comprendiendo cada protocolo una o varias etapas. El circuito electrónico comprende también una interfaz hombre máquina 24 alojada en una empuñadura 26 del cuerpo 22, comprendiendo la interfaz un conjunto de botones de selección y de navegación 28 y una pantalla de visualización 30 que permite la visualización y la selección de diferentes protocolos de pipeteo grabados. El usuario puede programar especialmente la pipeta electrónica 12, por ejemplo descargando en esta unas instrucciones desde un ordenador conectado a la pipeta 12 a través de una conexión inalámbrica, por ejemplo Bluetooth. El usuario puede también seleccionar, mediante la interfaz 24, un protocolo pregrabado. La pipeta 12 es, por otro lado, apta para aspirar un volumen predefinido de líquido en cada uno de los conos 20, expulsar un volumen predefinido desde cada uno de los conos, y llevar a cabo unos ciclos automáticos de aspiración/expulsión de duración y de frecuencia variable. Como se ilustra más particularmente en la figura 2B, los conos 20, de forma tubular y de eje longitudinal X, son amovibles encajándose en los lóbulos 32 que sobresalen del cuerpo 22, lo que permite su sustitución. Los conos están, por otro lado, constituidos de un material plástico, por ejemplo de polipropileno, que tiene por efecto hacerlos “transparentes” a un campo magnético y permite la captura de partículas magnéticas, como se describirá más en detalle a continuación. Finalmente, cada cono 20 presenta en su extremo abierto de pipeteo un perfil afilado 21, o “punta”. Esta parte 21 tiene una sección reducida en un plano perpendicular al eje X, lo que permite su introducción facilitada en unos recipientes o pocillos como se conoce en sí.
La pipeta electrónica 12 es, por ejemplo, el modelo “VIAFLO II 8 canales” comercializado por la compañía ©INTEGRA Biosciences AG, Suiza, modelo cuyos elementos se describen en las solicitudes de patentes US 2009/071266, US 2009/074622, US2011076205 y US 2008/095671.
El porta-pipeta 14 comprende (figuras 3A y 3B) un zócalo 34 destinado a colocarse sobre un plano de trabajo (por ejemplo una mesa o una banco de laboratorio), así como una parte móvil 36 con respecto al zócalo 34. La parte móvil 36, también denominada “soporte de pipeta” comprende un alojamiento 38 en el que puede insertarse la pipeta 12 de manera amovible y mantenerse inmóvil, como se ilustra en la figura 1. Para la translación del soporte de pipeta 36 con respecto al zócalo 34, el soporte 36 comprende una o varias cremalleras 40, por ejemplo en número de dos, que se engranan con unas ruedas dentadas 42 montadas sobre un eje 44 móvil en rotación y alojado en el zócalo 34. Una o varias varillas 46 se fijan además al soporte 36 (por lo tanto, en el zócalo 34) y se deslizan por unos orificios del zócalo 34 (por lo tato, en el soporte 36), a fin de guiar el soporte 36 en su movimiento de translación. Se fijan además una o dos empuñaduras de rotación 50 al extremo del eje 44 a fin de permitir al usuario girar fácilmente este último según las flechas 52 (figura 1) y por lo tanto hacer subir o bajar el soporte de pipeta 36 tal como se ilustra mediante las flechas 54 (figura 1). El movimiento de translación del soporte de pipeta 36 con respecto al zócalo 34 es por lo tanto paralelo al eje X de los conos 20 cuando la pipeta 12 está colocada en el alojamiento 38 del soporte 36, y por lo tanto paralela a la dirección de la gravedad cuando el zócalo 34 está colocado sobre un plano de trabajo horizontal, de manera que el soporte 36 “sube” o “baja”.
El zócalo 34 está abierto sobre su cara delantera 56 para permitir la introducción y la retirada de los soportes de pocillos 18a, 18b, definiendo así un alojamiento para estos últimos. Este alojamiento está abierto sobre su parte superior para permitir a los conos 20 de la pipeta 12 alcanzar dichos soportes de pocillo cuando la pipeta baja. Así, como se describe más en detalle a continuación, la pipeta 12 puede tomar varias posiciones con respecto al zócalo 34, y por lo tanto con respecto a un soporte de pocillo 18a, 18b alojado en este último. En particular, la pipeta 12 puede tomar una posición en la que las puntas 21 de los conos 20 están en remojo en unos pocillos del soporte 18a, 18b, y al menos una posición en la que las puntas 21 no están en remojo en los pocillos, y están a una distancia de estos últimos a fin de permitir la manipulación de los soportes de pocillos por el usuario y la captura de partículas magnéticas en una posición central de los conos 20.
Refiriéndose a las figuras 5 y 6, los soportes de pocillos pueden tomar varias formas en función de la extracción deseada. Especialmente, un soporte de pocillo es una placa 18a compartimentada (figura 5), habitualmente denominada “microplaca” de tipo “DeepWell”. Este tipo de placa comprende unas hileras 60 de pocillos 52 en las que puede sumergirse la hilera de conos de pipeta 20. Cada hilera 60 puede así recibir un líquido particular utilizado durante la etapa de extracción utilizada por el sistema 10. El paso de una hilera 60 a la otra se realiza entonces simplemente por el usuario que pone en la vertical de los conos de pipetas 20 la hilera 60 particular que contiene el líquido necesario para la etapa que debe llevarse a cabo.
Otro soporte de pocillos, descrito en la figura 6A, está imantado y específicamente diseñado para la migración de partículas magnéticas desde las puntas 21 de los conos de pipetas 20 a los pocillos. El soporte 18b comprende para tal efecto un cuerpo 64 en el que se forma una hilera de alojamiento 66 que puede recibir la hilera de cono de pipeta 20 y en el que está alojada una segunda pieza imantada 68 que comprende uno o varios imanes permanentes, por ejemplo un imán permanente cerca de cada uno de los pocillos 66. La pieza imantada 68 está colocada debajo de los pocillos 66 o frente a sus porciones inferiores, tal como se ilustra. Así, las puntas 21 de los conos de pipetas 20 están colocadas por encima de la pieza imantada 68 cuando dichas puntas están sumergidas en los pocillos 66. Finalmente, el soporte 18b sirve de gradilla magnética que retiene de manera amovible unos tubos 69 en los alojamientos 66, por ejemplo unos tubos de elución PCR tales como se ilustran en la figura 6B, con fines, por ejemplo, de transferencia ulterior del producto de la extracción recuperado en estos.
La primera pieza imantada 16, cuya función es capturar unas partículas imantadas en los conos 20 de una manera descrita más en detalle a continuación, comprende por su parte uno o varios imanes permanentes 72, ventajosamente una hilera de imanes permanentes separados los unos de los otros por unos espacios 74, y aún más ventajosamente un imán permanente frente a cada cono de pipeta 20 cuando la pieza 16 está totalmente alojada en el zócalo 34. La pieza 16 comprende además una empuñadura 76 para un mejor agarre por el usuario.
En el zócalo 34 se prevé un alojamiento 78 para la recepción de la pieza imantada 16, colocándose el alojamiento 78 de manera que la pieza 16 esté frente a los conos de pipeta 20 por encima de su punta 21, y preferentemente frente a una zona central 80 a una altura superior al pocillo, cuando las puntas 21 se sumergen en los pocillos mantenidos en un soporte de pocillo. De esta manera, las partículas se capturan en un volumen del cono lo suficientemente grande como para no formar tapones en los conos.
El porta-pipeta 14 comprende también unos medios que permiten controlar la velocidad de elevación del soporte 36. En particular, la cremallera y la rueda dentada están diseñadas para que una media-vuelta (180°) de la rueda 50 permita recorrer el conjunto de la cremallera y un contrapeso 58 integrado en cada una de las empuñaduras 50 de manera descentrada con respecto al eje 44. Estos contrapesos, bajo su peso y el efecto de palanca asociado, generan un par de rotación que pone en rotación el eje 44 limitando al mismo tiempo el par transmitido a mano por el usuario. De manera ventajosa, como se ilustra en la figura 4A, una parte sustancial del eje 44 está formada también de un contrapeso semi-cilíndrico con el mismo objetivo. Esta asistencia mecánica ayuda a levantar el soporte de pipeta, y limita por lo tanto los trastornos musculo-esqueléticos, y utiliza un freno que permite al usuario controlar con más precisión la velocidad de subida y de bajada del soporte 36.
Pueden preverse otros mecanismos de control de la velocidad del soporte 36, especialmente un frenado magnético. Por ejemplo, refiriéndose a la figura 4A, el contrapeso 59 comprende un material imantable (por ejemplo acero o equivalente) y una tercera pieza imantada 80 (paralelepipédica o en forma de arco de círculo concéntrico al eje 44) está alojada en el zócalo 34, preferentemente en el lado opuesto de la pieza imantada 16 frente al eje 44 para no perturbar la extracción. Cuando el contrapeso 59 del eje pasa delante de la pieza imantada 80, el movimiento de rotación del eje 44 se ralentiza debido al par de frenado generado. Esto permite por un lado compensar la fuerza para levantar la pipeta durante la subida (desempeñando el papel de asistencia para el usuario) y, por otro lado, controlar la velocidad de subida de la pipeta cuando se quiere hacer bajar las partículas magnéticas por debajo de los conos de pipeta, como se describirá a continuación.
Se prevé también, ventajosamente, un mecanismo de tope, tal como se ilustra en la figura 4B. En esta variante, una rueda 84 de material deformable (por ejemplo de elastómero) está montada sobre el eje 44 y comprende dos dientes 86, 88. Una protuberancia 82, por ejemplo hemisférica, sobresale por otro lado del zócalo 84 frente a la rueda 84. Cuando el usuario sube la pipeta 12 accionando la rueda 50, el primer diente 86 encuentra la protuberancia 82. Al aumentar el par aplicado a la rueda 50, el diente 86 se pliega, pasa la protuberancia 82, y vuelve a su forma. En esta posición, el diente 86 puede entonces reposar sobre la protuberancia 82, seleccionándose la dureza de este diente para que no se pliegue bajo la acción del peso de la pipeta 12 y del porta-pipeta 36. La pipeta se bloquea así en posición alta, pudiendo por lo tanto el usuario soltar la rueda 50. El segundo diente 88, de mayor dimensión (es decir longitud y/o anchura) necesita para su paso un par mucho mayor, y define así un tope para evitar que el porta-pipeta 36 se desenganche del zócalo 34, salvo que el usuario despliegue una fuerza capaz de romper este diente. En una variante, la protuberancia 82 se sustituye por un tope que comprende una bola montada sobre resorte en un alojamiento del zócalo. La rueda 84 puede realizarse así de un material duro. La acción del primer diente 86 tiene entonces el efecto de empujar la bola hacia su alojamiento, permitiendo así el paso del diente 86.
Se describe ahora un procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra líquida con la ayuda de partículas magnéticas, llevándose a cabo este procedimiento con la ayuda del sistema que se acaba de describir. El procedimiento se basa en la asociación del porta-pipeta, de la pipeta electrónica programable y de conos de pipeta (es decir de un volumen de 1250 pl) a fin de realizar las diferentes etapas de captura, de lavado y de elución de partículas magnéticas para tratar un volumen de muestra por cono de pipeta comprendido entre 1 ml y 5 ml. La captura de las partículas magnéticas se efectúa secuencialmente en los conos de pipeta durante ciclos de aspiración/expulsión sobre el conjunto del volumen de muestra a tratar. A título de ejemplo, se describe en relación con el organigrama de la figura 8 un procedimiento de purificación de ácidos nucleicos virales que utilizan la química NucloSENS®, a saber una extracción de los ácidos nucleicos con la ayuda de partículas de sílice magnéticas.
El procedimiento empieza por una etapa 100 de preparación de las diferentes muestras y reactivos necesarios para la purificación, seguida de dicha purificación en 102.
Especialmente, la preparación 100 consiste, en 104, en mezclar la muestra biológica que comprende unos virus de los cuales se desea extraer los ácidos nucleicos, con un reactivo de lisis química de los virus (por ejemplo el reactivo de lisis “Nuclisens miniMAG” de bioMérieux, de referencia 200292, o el reactivo de lisis “Nuclisens easyMAG” de bioMérieux, de referencia 280130), a razón de dos volúmenes de reactivo de lisis por un volumen de muestra. La mezcla se calienta después durante 30 minutos a 56°C, liberando así los ácidos nucleicos de los virus de una manera en sí misma conocida. En 106 se introducen entonces en la muestra lisada unas partículas de sílice magnéticas, que tienen la propiedad de enlazarse con unos ácidos nucleicos.
La preparación 100 se prosigue, en 108, por el llenado de la microplaca 18a, que tiene unos pocillos 62 de 5 ml, y unos tubos de elución PCR 69 de 0,2 ml de la gradilla magnética 18b de manera que:
- cada pocillo de la primera hilera de la microplaca 18a se llena con la muestra lisada que comprende las partículas de sílice, a continuación “muestra lisada”. El volumen total en cada pocillo de la primera hilera es preferentemente superior a 1,5 ml debido a la utilización de la microplaca Deepwell 5 ml y de los volúmenes manipulados por la pipeta electrónica;
- cada pocillo 66 de la segunda hilera de la microplaca 18a se llena de 1250 pl de tampón de lavado (por ejemplo el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n°2” de bioMérieux de referencia bMx 280131);
- cada pocillo 66 de la tercera hilera de la microplaca 18a se llena de 1250 pl de tampón de lavado (por ejemplo el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n°2” de bioMérieux de referencia bMx 280131);
- cada tubo de elución PCR 69 alojado en la gradilla magnética 18b se llena de un volumen de 100 pl de tampón de elución (por ejemplo el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n°3” de bioMérieux, de referencia 280132).
El usuario coloca entonces:
- la pipeta electrónica 12, con su hilera de conos 20, en el alojamiento 38 del porta-pipeta 14, en posición elevada para permitir la introducción de la placa 18a; y
- la placa 18a en el alojamiento 56 del zócalo 34 con la primera hilera de pocillos que comprende la muestra lisada en la vertical de los conos 20.
La extracción 102 empieza por la homogeneización de la muestra lisada. En este sentido, la pieza imantada 16 no se coloca en el zócalo 34 y no interfiere por lo tanto con los conos 20. El usuario gira una de las ruedas 50 a fin de sumergir las puntas 21 de los conos 20 en la hilera de pocillos de la placa 18a que comprende la muestra lisada. Después, selecciona con la ayuda de la interfaz 24 de la pipeta 12 un primer protocolo de pipeteo que comprende al menos una fase de aspiración/expulsión de la muestra lisada en los conos 20, e inicia el protocolo seleccionado. Estas fases (por ejemplo, en número de dos) comprenden cada una al menos un ciclo de aspiración/expulsión (por ejemplo, cinco ciclos) seguido de una duración de espera de varios minutos, por ejemplo 5 minutos. En el sentido de la invención, un ciclo de aspiración y de expulsión consiste en llenar al menos en tres cuartas partes, por ejemplo completamente, los conos y después vaciarlos completamente, salvo que se especifique de otra manera por el programa.
Una vez terminada la homogeneización, los conos 20 se vacían y sus puntas 21 se sumergen en los pocillos que contienen la muestra lisada. La purificación 102 se continúa con la captura, en 112, de las partículas de sílice de la muestra lisada sobre la pared interna de los conos 20. Para ello, el usuario coloca la pieza imantada 16 en el alojamiento 78 del zócalo 34, selecciona con la ayuda del interfaz 24 de la pipeta 12 un segundo protocolo de pipeteo y después inicia el protocolo seleccionado. El segundo protocolo comprende una pluralidad de ciclos de aspiración/espera/expulsión, por ejemplo una decena de ciclos, separándose una aspiración de una expulsión de algunos segundos, por ejemplo una decena de segundos. En cada aspiración y en cada expulsión, una parte de las partículas contenidas en la muestra lisada se captura en la pared de los conos de pipeta gracias al campo magnético producido por la pieza imantada 16. Las partículas magnéticas, y por lo tanto también sus ácidos nucleicos relacionados, se capturan así en forma de sedimentos de partículas 100 frente a la pieza imantada 16, y preferentemente en una zona central a media altura de los conos 20, como se ilustra en la figura 9.
Una vez terminada la captura, habiéndose expulsado la muestra lisada completamente de los conos 20 y estando la pieza imantada 16 todavía en su sitio, la purificación 102 se continúa con una primera etapa de lavado 114. Con este fin el usuario levanta el porta-pipeta 14 (por lo tanto, sube la pipeta 12) a fin de liberar la placa 18a de los conos 20, alinea la segunda hilera de la placa 18a con la hilera de cono 20 y después recoloca el porta-pipeta (por lo tanto, hace bajar la pipeta) a fin de sumergir las puntas 21 de los conos en los pocillos de la placa 18a. El usuario selecciona después, con la ayuda de la interfaz 24, un tercer protocolo de pipeteo que comprende al menos una fase de aspiración/expulsión de la muestra lisada en los conos 20, después inicia el protocolo seleccionado. El tercer protocolo es, por ejemplo, idéntico al primer protocolo. El paso repetido del tampón de lavado sobre los sedimentos de partículas permite así lavar estos últimos. Esta etapa de lavado se completa ventajosamente, o se implementa de manera conjunta, con una modulación del campo magnético que captura las partículas sobre los conos. Por ejemplo, el usuario hace subir y bajar la pipeta 12, lo que tiene el efecto de desplazar los sedimentos de partículas sobre los conos, o bien la pieza imantada 16 comprende un tren de imanes permanentes y el usuario hace deslizar en un movimiento de vaivén la pieza imantada 16 de su alojamiento 78, de manera que la intensidad y las líneas de campos magnéticos que capturan los sedimentos varían, conservando al mismo tiempo las partículas capturadas sobre los conos. La modulación del campo magnético tiene así el efecto de reorganizar los sedimentos durante el lavado, y aumentar la eficacia de éste.
Se realiza después un segunda lavado en 116 con la ayuda del tampón de lavado de la tercera hilera de la placa 18a. Por ejemplo, los conos se vacían completamente del primer tampón de lavado, y después se realiza un segundo lavado idéntico al primer lavado.
Tras este segundo lavado, se realiza una etapa de migración 118 de los sedimentos de partículas 200 a las puntas 21 de los conos 20. En este sentido, los conos 20 permanecen preferiblemente llenos del segundo tampón de lavado para facilitar el deslizamiento de los sedimentos 200 y permanecen alineados con la segunda hilera de la placa 18a. El usuario gira entonces una de las ruedas 50 para hacer subir la pipeta 12. Al ser la pieza imantada 16 solidaria del zócalo 34, los sedimentos permanecen inmóviles con respecto a esta última y migran hacia las puntas 21 deslizándose por las paredes de los conos 20 a medida que sube la pipeta. El usuario detiene la subida de la pipeta 12 una vez que los sedimentos 200 estén en las puntas 21, como se ilustra en la figura 10, a una distancia media de algunos milímetros, por ejemplo 8 mm, de los extremos de los conos. En esta posición, el usuario selecciona e inicia después con la ayuda de la interfaz 24 la expulsión del tampón de lavado contenido en los conos 20 en los pocillos de la placa 18a. Opcionalmente, una de las fases de lavado, o una fase de lavado suplementaria consiste en retirar la pieza imantada a fin de liberar las partículas magnéticas y realizar un lavado, agitando al mismo tiempo las partículas en la solución de lavado por ciclos de aspiración y de expulsión. Las partículas se capturan después de nuevo sustituyendo la pieza imantada y procediendo a unos ciclos de aspiración y expulsión tal como se han descrito anteriormente.
La purificación 102 se termina por una etapa 120 de transferencia en los tubos de elución PCR 69 de las partículas magnéticas presentes en las puntas 21 de los conos 20. Para este fin, el usuario levanta el porta-pipeta 14, retira la placa 18a, coloca la gradilla magnética 18b en el alojamiento 56 a fin de alinear los tubos PCR 69 con la hilera de conos 20, vuelve a poner el porta-pipeta 14 y retira la pieza imantada 16 del zócalo 14 a fin de liberar las partículas magnéticas capturadas de los conos. Una vez sumergidas las puntas 21 en los tubos 69, el usuario selecciona, con la ayuda de la interfaz 24, un cuarto protocolo de pipeteo, y después inicia el protocolo seleccionado. Una primera variante de este protocolo consiste en unos ciclos de aspiración y de expulsión del tampón en las puntas 21 de los conos 20, lo que permite la resuspensión de las partículas magnéticas rompiendo los sedimentos de partículas. Por otro lado, la frecuencia seleccionada para los ciclos permite, en cada expulsión en los tubos 69, que una parte de las partículas magnéticas sea capturada en los tubos 69 gracias al campo magnético de la pieza imantada 68 alojada en la gradilla 64. Además, estos ciclos permiten “aclarar” las puntas 21 para recuperar las partículas que adhieren en las paredes de los conos. En una segunda variante del protocolo, unos ciclos de aspiración y de expulsión se realizan en primer lugar a una frecuencia más elevada, a fin de agitar más vigorosamente el tampón y las partículas, y por lo tanto obtener una homogeneización acelerada que facilite la transferencia a los tubos de elución 69. La etapa de transferencia se termina por la expulsión completa del tampón de elución en los tubos 69. Bajo el efecto del campo magnético de la gradilla 64, las partículas magnéticas se separan entonces definitivamente del tampón de elución, como se ilustra en la figura 11. El usuario puede así recuperar los tubos 69 para un tratamiento ulterior, en particular la elución de los ácidos nucleicos por calentamiento, de manera en sí mismo conocida.
En el modo de realización del porta-pipeta descrito anteriormente, la pieza imantada 16 está alojada en el zócalo 34. Asimismo, cuando el usuario desea avanzar la placa 18a, puede elevar la pipeta lo suficientemente alto para proceder a esta operación. Esto provoca, en cuanto a para la migración de las partículas hacia las puntas, el desplazamiento de los sedimentos 200 en las paredes de los conos 20, lo que presenta la ventaja de “reorganizar” los sedimentos que pueden rodar sobre sí mismos. La eficacia del lavado se ve así reforzada. Por el contrario, esto implica que el usuario tenga cuidado de no elevar nunca demasiado la pipeta a fin de evitar que los sedimentos salgan de los conos. En este sentido, el usuario puede por ejemplo elevar o inclinar el porta-pipeta para conservar los sedimentos a distancia de las aberturas de los conos. Esta opción, que necesita la elevación repetida de un dispositivo cuyo peso puede ser importante, puede provocar, no obstante, a largo plazo unos trastornos musculoesqueléticos. Además, el usuario debe también tener cuidado de no elevar demasiado el porta-pipeta a fin de evitar que los sedimentos salgan de los conos.
Un segundo modo de realización del porta-pipeta según la invención permite la manipulación de las placas 18a, 18b elevando únicamente la pipeta, y por lo tanto evitando levantar el porta-pipeta 14, garantizando al mismo tiempo que los sedimentos de partículas permanezcan a distancia de las puntas 21 de los conos. Este segundo modo de realización, así como las variaciones inducidas sobre el procedimiento que se acaba de describir, se ilustran en las figuras 12 y 13.
Más particularmente, el segundo modo de realización difiere del primer modo de realización por los medios de recepción de la pieza imantada 16 en el porta-pipeta 14. Especialmente, el zócalo 34 comprende el alojamiento 78 para la inserción y la extracción de la pieza imantada 16, como se ha descrito anteriormente, y el alojamiento 78 está abierto en su parte superior 130 para permitir también la inserción y la retirada de la pieza 16 verticalmente en el alojamiento 78. El soporte de pipeta 36 comprende además unos medios para fijar la pieza imantada 16 en la vertical del alojamiento abierto 78, en particular una o varias clavijas 132 de material imantable (por ejemplo de acero) fijados sobre una pared trasera 134 del soporte de pipeta móvil 36 (figura 12C). De esta manera, la pieza imantada 16 es solidaria del soporte móvil 36, y permanece frente a los conos 20 cuando el usuario sube y baja la pipeta (en particular durante fases de lavado), como se ilustra en las figuras 12B a 13A.
Para realizar la migración de los sedimentos 200 a las puntas de los conos 20, el usuario separa la pieza imantada 16 del soporte de pipeta 36, aplicando una simple presión hacia abajo sobre la empuñadura 78 de la pieza 16 y eleva la pipeta 12. La pieza imantada 16 se desengancha de las clavijas 134, y permanece por lo tanto en el alojamiento 78 del zócalo y es, por lo tanto, solidaria del zócalo 34, induciendo la migración de los sedimentos 200 a las puntas 21 de los conos, tal como se ha descrito anteriormente (figuras 13A y 13B). Una vez elevada la pipeta, el usuario sustituye la placa 18a por la gradilla 18b provista de los tubos de elución PCR, retira la pieza imantada 16 y vuelve a bajar la pipeta (figura 13C, tubos 69 no representados). En una variante, el soporte de pipeta 36 puede comprender un alojamiento análogo al alojamiento 78 del zócalo en el que el usuario desliza la pieza imantada, especialmente para las fases de lavado.
Se ha descrito un procedimiento de extracción particular. La presente invención se aplica, no obstante, a cualquier tipo de captura de partículas magnéticas y a cualquier tipo de secuencia de pipeteo. Asimismo, se ha descrito una pipeta que tiene 8 canales de un volumen particular. La pipeta puede comprender un número cualquiera de canales de cualquier volumen en función de la aplicación considerada.
A fin de aumentar el número de muestras tratadas, se pueden acoplar dos sistemas de extracción según la invención, como se ilustra en la figura 14. Por ejemplo, las empuñaduras de rotación 50 pueden encajarse de manera que puedan llevarse a cabo simultáneamente dos extracciones, el usuario sube y baja las pipetas 12 al mismo tiempo. Con este fin, las pipetas pueden también sincronizarse, controlando una pipeta, por ejemplo, la otra pipeta.
Asimismo, se ha descrito un sistema de extracción portátil y semi-automatizado, particularmente adecuado para los laboratorios de análisis que tienen un número limitado de extracciones a realizar a diario. Sin embargo, la invención puede automatizarse. Por ejemplo, la pipeta está integrada en un dispositivo automatizado que comprende unos mecanismos programables de subida y bajada de la pipeta y de movimiento de imán (o de activación/desactivación de electroimanes).
La presente invención responde a una problemática de polivalencia para la utilización de diferentes técnicas de captura magnética (purificación de los ácidos nucleicos, inmunoconcentración magnética, etc.). El sistema según la invención, evolutivo y modulable, permite:
- la realización de etapas de captura/lavado/elución de partículas magnéticas utilizando un sistema autónomo constituido por la asociación de una pipeta electrónica programable y de un soporte que permite la realización de las diferentes etapas antes citadas;
- el tratamiento de un número de muestras de 1 a 8 en función de la configuración de la pipeta electrónica utilizada; - el paralelismo del tratamiento de las muestras en el ámbito definido anteriormente con un sistema semi-automático; - la asociación de 2 sistemas si es necesario aumentar el número de muestras a tratar;
- las etapas de elución pueden realizarse en diferentes tipos de tubos: tubos PCR 0,2 ml, para la recuperación de las partículas de sílice magnéticas cuando se trata de captura de los ácidos nucleicos (por ejemplo química NucliSENS®) o bien tubos de bead-beating en el caso de la recuperación de partículas magnéticas que han servido para la recuperación de patógenos (Inmunoconcentración magnética). Para ese fin, el sistema permite la realización de etapas de captura/concentración de los patógenos sobre las partículas magnéticas y su lisis in situ con la ayuda de bolas de cerámica/cristal (por ejemplo el procedimiento de tipo CapLyse®).

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos a fijarse sobre unas partículas magnéticas, comprendiendo el procedimiento:
- una fase (106) de mezcla de la muestra con las partículas magnéticas;
- una fase (110) de aspiración de la mezcla desde un pocillo en un cono de pipeta (20) tubular que comprende una punta (21) destinada al pipeteo de líquido;
- una fase de captura (112) de las partículas magnéticas sobre una pared interna del cono de pipeta (20);
* aplicando un primer campo magnético (16) al cono de pipeta (20), siendo dicho campo apto para atraer y mantener las partículas magnéticas en una zona predeterminada del cono de pipeta (20), denominada de “captura” por encima de la punta de esta;
* y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de mezcla contenida en el cono de pipeta (20) en un pocillo (62);
- al menos una fase (114, 116) de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta (20): * expulsando la mezcla contenida en el cono de pipeta (20); y
* aplicando desde un pocillo (62) que contiene una solución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la solución de lavado en el cono de pipeta (20);
- una fase (118) de migración de las partículas magnéticas sobre la pared interna del cono de pipeta (20), desde la zona de captura hasta la punta (21) del cono de pipeta (20), realizando un desplazamiento relativo del cono de la pipeta (20) con respecto al primer campo magnético (16);
- y una fase (120) de transferencia de dichas partículas magnéticas que ha migrado a la punta (21) del cono de pipeta (20) en un pocillo de recuperación (69) que contiene una solución.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el desplazamiento del primer campo magnético (16) consiste en desplazar el cono de pipeta (20) paralelamente a un eje longitudinal (X) de dicho cono (20), y en conservar constante el primer campo magnético (16), permaneciendo el eje longitudinal (X) del cono de pipeta a igual distancia del primer campo magnético (16) durante el desplazamiento del cono de pipeta (20).
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la fase (120) de transferencia comprende:
- el desplazamiento de la punta (21) del cono de pipeta (20) en el pocillo de recuperación (69);
- y la aplicación de un segundo campo magnético (68) desde el fondo del pocillo de recuperación (69) a fin de hacer migrar al pocillo de recuperación (69) las partículas magnéticas contenidas en la punta (21) del cono de pipeta (20).
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el segundo campo magnético (68) se produce por un imán posicionado parcial o totalmente debajo de la punta del cono de pipeta.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 o 4, en el que el primer campo magnético aplicado al cono de pipeta se desactiva durante la aplicación del segundo campo magnético.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la fase (120) de transferencia comprende la desactivación del primer campo magnético (16) seguida de la aplicación de ciclos de aspiración y de expulsión de la solución del pocillo de recuperación (69) en la punta (21) del cono de pipeta, comprendiendo dicha aplicación:
- una primera fase de aplicación de los ciclos a una primera frecuencia;
- seguida de una segunda fase de aplicación de los ciclos a una segunda frecuencia, inferior a la primera frecuencia.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, previamente a la fase (112) de captura, una fase de agitación de la mezcla contenida en el cono de pipeta por la aplicación de al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de dicha mezcla en el cono de pipeta.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, previamente a la fase (120) de transferencia, al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta:
- desactivando el campo magnético;
- aplicando desde un pocillo que contiene una solución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la solución de lavado en el cono de pipeta;
- aplicando una segunda fase de captura sobre una pared interna del cono de pipeta:
° aplicando el primer campo magnético al cono de pipeta
° y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en el pocillo que contiene la solución de lavado.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, previamente a la fase (120) de transferencia, al menos una fase de lavado de las partículas sobre la pared interna del cono de pipeta:
- aspirando la solución de lavado en dicho cono de pipeta;
- después modulando el primer campo magnético aplicado a las partículas magnéticas para capturar estas sobre la pared interna del cono de pipeta;
- y después expulsando el líquido de lavado del cono de pipeta.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la modulación del primer campo magnético se realiza:
- desplazando el cono de pipeta paralelamente a un eje longitudinal de dicho cono, y conservando constante el primer campo magnético;
- y/o haciendo desplazar unos imanes espaciados los unos de los otros delante de las partículas capturadas.
11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el volumen del cono de pipeta es al menos diez veces superior al volumen del pocillo de recuperación.
12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el volumen de la mezcla es al menos tres veces superior al volumen del cono de pipeta.
13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes pertenecen al grupo formado por los ácidos nucleicos, los microorganismos, las proteínas y los péptidos.
14. Porta-pipeta (14) que comprende:
- un zócalo (34);
- un rebaje (56) formado en el zócalo (34) y apto para alojar de manera amovible un soporte de pocillos (18a, 18b); - un soporte de pipeta (36) que comprende un primer alojamiento (38) en el que se puede insertar una pipeta (12) equipada de al menos un cono de pipeta tubular (20) que comprende una punta (21) destinada al pipeteo de líquido, estando el primer alojamiento (38) abierto sobre el rebaje (56) del zócalo, siendo el soporte de pipeta (36) móvil en translación con respecto al zócalo (34) según una dirección paralela a un eje (X) de los conos de pipeta (20) y móvil entre una primera posición en la que la punta (21) de cada cono de pipeta está alojada en un pocillo (62, 69) del soporte de pocillos (18a, 18b), y al menos una segunda posición en la que dicha punta (21) está fuera de dicho pocillo (62, 69);
- un segundo alojamiento (78) apto para alojar de manera amovible una pieza imantada (16), enfrentándose el segundo alojamiento (78) a cada uno de los conos de pipeta (20) en una posición por encima de la punta de éste cuando el soporte de pipeta (36) está en la primera posición, y enfrentándose el segundo alojamiento (78) a la punta del cono de pipeta (20) cuando el soporte de pipeta (36) está en la segunda posición.
15. Porta-pipeta según la reivindicación 14, en el que el primer alojamiento (38) comprende una abertura para la inserción y la extracción frontal de la pipeta (12) en el primer alojamiento (38).
16. Porta-pipeta según la reivindicación 14 o 15, en el que el segundo alojamiento (78) está realizado en el zócalo (36).
17. Porta-pipeta según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, que comprende un tercer alojamiento en el soporte de pipeta (36) en el que la pieza imantada (16) es apta para alojarse de manera amovible para enfrentar cada cono de pipeta (20) en una posición por encima de la punta (21) de dicho cono cuando el soporte de pipeta (36) está en la segunda posición.
18. Porta-pipeta según la reivindicación 17, en el que el segundo y el tercer alojamientos se comunican, y en el que el soporte de pipeta comprende unos medios aptos para mantener de manera amovible la pieza imantada en el tercer alojamiento.
19. Porta-pipeta según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que:
- el zócalo (34) comprende al menos una rueda dentada (42) móvil en rotación;
- y el soporte de pipeta comprende una cremallera (40) que coopera con la rueda dentada (42) para trasladar el soporte de pipeta (36) con respecto al zócalo (34) durante la rotación de la rueda dentada.
20. Porta-pipeta según la reivindicación 19, que comprende un dispositivo de bloqueo (y de desbloqueo) del soporte de pipeta (82) al menos en la primera posición.
21. Porta-pipeta según una de las reivindicaciones 19 o 20, que comprende al menos una empuñadura solidaria (50) de la rueda para hacer girar esta y apto para fijarse de manera amovible a una empuñadura solidaria (50) de la rueda dentada de otro porta-pipeta.
22. Sistema para la extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos para fijarse sobre unas partículas magnéticas, comprendiendo el sistema:
- una pipeta (12) equipada de al menos un cono de pipeta tubular (20) que comprende una punta (21) destinada al pipeteo de líquido y de un circuito de aspiración y de expulsión en cada cono de pipeta (20);
- al menos un soporte de pocillo (18a, 18b);
- un porta-pipeta (14) que comprende:
° un zócalo (34);
° un rebaje (56) formado en el zócalo (34) y apto para alojar de manera amovible cada soporte de pocillo;
° un soporte de pipeta (36) que comprende un primer alojamiento (38) en el que se inserta la pipeta (12), estando el primer alojamiento (38) abierto sobre el rebaje (56) del zócalo (34), siendo el soporte de pipeta (36) móvil en translación con respecto al zócalo (34) según una dirección paralela a un eje (X) de los conos de pipeta (12) y móvil entre una primera posición en la que la punta (21) de cada cono de pipeta (36) está alojada en un pocillo (62, 69) del soporte de pocillo (18a, 18b) y al menos una segunda posición en la que dicha punta (21) está fuera de dicho pocillo (62, 69);
° un segundo alojamiento (78) frente a cada uno de los conos de pipeta (20) en una posición por encima de la punta (21) de éste cuando el soporte de pipeta está en la primera posición, y enfrentándose segundo alojamiento a la punta del cono de pipeta cuando el soporte de pipeta está en la segunda posición; y
- una pieza imantada (16) alojada de manera amovible en el segundo alojamiento (78).
23. sistema según la reivindicación 22, en el que el porta-pipeta es conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21.
24. Soporte de pocillo (18b), que comprende una pieza (64) en la que se forman unos rebajes (66) para la recepción de los pocillos (69), y al menos un imán (68) frente a cada uno de los rebajes (66) formados en dicha pieza (64).
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