ES2862393T3 - Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida - Google Patents

Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida Download PDF

Info

Publication number
ES2862393T3
ES2862393T3 ES16801505T ES16801505T ES2862393T3 ES 2862393 T3 ES2862393 T3 ES 2862393T3 ES 16801505 T ES16801505 T ES 16801505T ES 16801505 T ES16801505 T ES 16801505T ES 2862393 T3 ES2862393 T3 ES 2862393T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
pipette
cone
phase
pipette cone
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16801505T
Other languages
English (en)
Inventor
David Alix
Edgar Minassian
Jean-Claude Raymond
Philippe Wandels
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP16168001.2A external-priority patent/EP3241901B1/fr
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2862393T3 publication Critical patent/ES2862393T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/02—Apparatus for enzymology or microbiology with agitation means; with heat exchange means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
    • B01L3/0217—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids of the plunger pump type
    • B01L3/0231—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids of the plunger pump type having several coaxial pistons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0275—Interchangeable or disposable dispensing tips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5085—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50853—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates with covers or lids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
    • B01L9/523—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips for multisample carriers, e.g. used for microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • B01L9/54—Supports specially adapted for pipettes and burettes
    • B01L9/543—Supports specially adapted for pipettes and burettes for disposable pipette tips, e.g. racks or cassettes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/041—Connecting closures to device or container
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0609—Holders integrated in container to position an object
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos para fijarse sobre unas partículas magnéticas, comprendiendo el procedimiento: - una fase (106) de mezcla de la muestra con las partículas magnéticas; - una fase (110) de aspiración de la mezcla desde un pocillo en un cono de pipeta (20) tubular que comprende una punta (21) destinada al pipeteo de líquido; - una fase de captura (112) de las partículas magnéticas sobre una pared interna del cono de pipeta (20); - aplicando un primer campo magnético (16) al cono de pipeta (20), siendo dicho campo apto para atraer y mantener las partículas magnéticas en una zona predeterminada del cono de pipeta (20), denominada de "captura", por encima de la punta de esta; - y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta (20) en un pocillo (62); - al menos una fase (114, 116) de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta (20): - expulsando la mezcla contenida en el cono de pipeta (20); y - aplicando desde un pocillo (62) que contiene una disolución de lavado, al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado en el cono de pipeta (20); caracterizado por que el procedimiento comprende, además: - una fase (118) de migración de las partículas magnéticas sobre la pared interna del cono de pipeta (20), desde la zona de captura hasta la punta (21) del cono de pipeta (20), realizando un desplazamiento relativo del cono de pipeta (20) con respecto al primer campo magnético (16); - y una fase (120) de transferencia de dichas partículas magnéticas que han migrado a la punta (21) del cono de pipeta (20) en un pocillo de recuperación (69) que contiene una disolución, - al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta, previamente a la fase (120) de transferencia: * desactivando el campo magnético; * liberando las partículas capturadas, aplicando desde un pocillo que contiene una disolución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado en el cono de pipeta; * aplicando una segunda fase de captura sobre una pared interna del cono de pipeta: * aplicando el primer campo magnético al cono de pipeta * aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en el pocillo que contiene la disolución de lavado.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la extracción de componentes contenidos en una disolución utilizando partículas magnéticas.
La invención encuentra aplicación particularmente en el campo de la preparación de muestras biológicas, especialmente en la implementación de diagnósticos in vitro, mediante la captura de analitos de origen biológico (ácidos nucleicos, microorganismos, proteínas, péptidos, etc.) presentes en una disolución.
Estado de la técnica
Originalmente desarrollada para la extracción de ácidos nucleicos presentes en una muestra biológica y descrita en el documento US 5 234 809, la tecnología “BOOM®” consiste en introducir en una muestra líquida unas partículas magnéticas capaces de enlazarse con unos componentes de interés, después en separar las partículas magnéticas de la muestra con la ayuda de uno o varios imanes. Las partículas así capturadas pueden entonces sufrir un tratamiento ulterior, por ejemplo para liberar sus componentes en una disolución de recuperación. Debido a la eficacia de esta técnica, se han desarrollado y comercializado numerosos dispositivos, especialmente para el ADN y el TARN, etc.), tanto dispositivos manuales (por ejemplo NucliSENS-miniMAG® del solicitante) como dispositivos automatizados (NucliSENS-easyMAG® del solicitante). Estos dispositivos automatizados sufren, no obstante, diversas limitaciones.
Una primera limitación se refiere a su polivalencia y a su tamaño. En efecto, estos dispositivos son generalmente unos dispositivos automatizados pesados y voluminosos que están diseñados para realizar una secuencia de tratamientos no modificable por el usuario. Un dispositivo automatizado está así diseñado para un único tipo de extracción, por ejemplo, diseñado para la purificación de ácidos nucleicos, pero es incapaz de realizar una inmunoconcentración magnética.
Una segunda limitación se refiere a los circuitos de inyección y de aspiración de los diferentes líquidos utilizados durante la extracción. Al ser importante el número de líquidos, esto implica unos circuitos también numerosos y/o complejos. Además, debido a posibles contaminaciones, estos circuitos de inyección/aspiración deben limpiarse regularmente, lo que implica dejar fuera de servicio los dispositivos. Una tercera limitación se refiere a las operaciones de agitación que se realizan para obtener la homogeneidad de la muestra que comprende las partículas magnéticas antes de su captura, para maximizar la captura por estas últimas de los analitos de interés o para lavar eficazmente las partículas magnéticas. Este tipo de agitación necesita habitualmente unos mecanismos complejos, por ejemplo, a base de imanes móviles que ponen en movimiento las partículas magnéticas.
La cuarta limitación se refiere a los diferentes líquidos utilizados durante la extracción. Habitualmente, las etapas realizadas para la extracción se realizan en o a partir de un solo recipiente. De hecho, este recipiente fija un volumen idéntico para todos los líquidos en cuestión (por ejemplo la muestra, las diferentes disoluciones de lavado, la disolución de elución, etc.), lo que limita la eficacia global del proceso de extracción. En efecto, algunos tratamientos (por ejemplo el lavado) necesitan grandes volúmenes para ser totalmente eficaces, mientras que otros tratamientos se limitan a un pequeño volumen de líquido (por ejemplo, la elución).
Descripción de la invención
El objetivo de la presente invención es proponer un procedimiento de extracción de componentes en una muestra líquida con la ayuda de partículas magnéticas que ofrece una gran libertad en la elección de los volúmenes líquidos, en particular hasta 10 ml, utilizados durante la extracción.
Para este fin, la invención tiene por objeto un procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos para fijarse sobre partículas magnéticas, comprendiendo el procedimiento:
- una fase de mezcla de la muestra con las partículas magnéticas;
- una fase de aspiración de la mezcla desde un pocillo en un cono de pipeta tubular que comprende una punta destinada al pipeteo de líquido;
- una fase de captura de las partículas magnéticas sobre una pared interna del cono de pipeta;
- aplicando un primer campo magnético al cono de pipeta, siendo dicho campo apto para atraer y mantener las partículas magnéticas en una zona predeterminada del cono de pipeta, denominada de “captura”, por encima de la punta de este;
- y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en un pocilio;
- al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta:
- expulsando la mezcla contenida en el cono de pipeta; y
- aplicando desde un pocillo que contiene una disolución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado en el cono de pipeta;
caracterizado por que el procedimiento comprende además:
- una fase de migración de las partículas magnéticas sobre la pared interna del cono de pipeta, desde la zona de captura hasta la punta del cono de pipeta, realizando un desplazamiento relativo del cono de pipeta con respecto al primer campo magnético;
- y una fase de transferencia de dichas partículas magnéticas que han migrado a la punta del cono de pipeta en un pocillo de recuperación que contiene una disolución,
- al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeteo, previamente a la fase de transferencia:
* desactivando el campo magnético;
* liberando las partículas capturadas aplicando desde un pocillo que contiene una disolución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado en el cono de pipeta;
* aplicando una segunda fase de captura sobre una pared interna del cono de pipeta:
* aplicando el primer campo magnético al cono de pipeta
aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en el pocillo que contiene la disolución de lavado.
En otras palabras, la invención se aprovecha de un cono de pipeta en el que pueden realizarse unos ciclos de aspiración y de expulsión sumergiendo su punta en un pocillo. Gracias a tales ciclos, es posible capturar la totalidad de las partículas presentes en una muestra de volumen muy superior al volumen, es decir el cono, en el que se realiza la extracción. Es incluso posible hacer pasar en el cono un volumen acumulado de líquido muy superior al volumen de la muestra en sí, ajustando el número de ciclos de aspiración y de expulsión. De la misma manera, el volumen de la o de las disoluciones de lavado utilizadas, llegado el caso, durante la extracción, puede ser muy superior al volumen del cono. La fase de migración permite, por su parte, localizar las partículas magnéticas en una porción del cono, la punta, que puede sumergirse en un pocillo de volumen muy reducido. El volumen de la disolución de recuperación puede, por lo tanto, ser pequeño si es necesario. El volumen de la disolución de recuperación es así independiente del volumen de la muestra y del volumen del cono de pipeta en el que se realiza la extracción. Gracias a la invención, es posible, en consecuencia, optimizar cada volumen de líquido utilizado, y así optimizar la extracción.
Además, debido a la geometría de los conos en forma de tubo y de los ciclos de aspiración expulsión, se obtiene una agitación eficaz de la muestra en los conos, agitación realizada, por ejemplo, antes de la captura, así como un lavado eficaz, y esto sin recurrir a mecanismos de tipo imanes móviles. Además, los inventores han observado que se obtiene un lavado eficaz en el cono incluso cuando las partículas se capturan en la pared del cono de pipeta. Se puede utilizar un gran volumen de disolución de lavado, lo que aumenta aún más la eficacia del lavado. De hecho, todas las etapas de la extracción (agitación, captura, lavado, transferencia en una disolución de recuperación) pueden realizarse en el cono de pipeta.
Según un modo de realización, el desplazamiento del primer campo magnético consiste en desplazar el cono de pipeta paralelamente a un eje longitudinal de dicho cono, y conservar constante el primer campo magnético, permaneciendo el eje longitudinal del cono de pipeta a igual distancia del primer campo magnético durante el desplazamiento del cono de pipeta. En otras palabras, la migración de las partículas se puede llevar a cabo de manera simple, desplazando el cono de pipeta con respecto, por ejemplo, a un imán permanente.
Según un modo de realización, la fase de transferencia comprende:
- la colocación de la punta del cono de pipeta en el pocillo de recuperación;
- y la aplicación de un segundo campo magnético desde el fondo del pocilio de recuperación a fin de hacer migrar al pocillo de recuperación las partículas magnéticas contenidas en la punta del cono de pipeta.
En particular, el segundo campo magnético se produce por un imán posicionado parcial o totalmente debajo de la punta del cono de pipeta. El primer campo magnético aplicado al cono de pipeta se desactiva durante la aplicación del segundo campo magnético.
En otras palabras, el segundo campo magnético permite atraer simplemente las partículas al pocillo de recuperación, lo que aumenta la velocidad de recuperación de las partículas magnéticas en el pocillo de recuperación, así como el número de partículas recuperadas. Además, el segundo campo magnético captura automáticamente las partículas magnéticas en el pocillo de recuperación. Por ejemplo, si la disolución de recuperación es un eluyente, los componentes unidos a las partículas se han liberado, y un técnico puede pipetear directamente la disolución que está desprovista de partículas magnéticas.
Según una variante preferida, la fase de transferencia comprende la desactivación del primer campo magnético seguida de la aplicación de ciclos de aspiración y de expulsión de la disolución del pocillo de recuperación en la punta del cono de pipeta, comprendiendo dicha aplicación:
- una primera fase de aplicación de los ciclos a una primera frecuencia;
- seguida de una segunda fase de aplicación de los ciclos a una segunda frecuencia, inferior a la primera frecuencia. La primera fase permite disgregar eficazmente el cúmulo de partículas capturadas sobre el cono de pipeta, también denominado “sedimento”, y así resuspender las partículas en la disolución de recuperación. La segunda fase permite seguir agitando la disolución sin impedir la migración de las partículas bajo el efecto del campo magnético. Esto permite aumentar todavía más la velocidad de recuperación y el número de partículas recuperadas en el pocillo de recuperación. Además, si la disolución es un eluyente, cuya función es liberar los componentes capturados por las partículas magnéticas, estos ciclos tienen por efecto agitar las partículas en el eluyente, lo que aumenta la eficacia del eluyente, en particular durante la utilización de una disolución de elución en la desconexión de los analitos de las partículas magnéticas sin etapa de calentamiento.
Según un modo de realización, el procedimiento comprende, previamente a la fase de captura, una fase de agitación de la mezcla contenida en el cono de pipeta por la aplicación de al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de dicha mezcla en el cono de pipeta. Debido a la geometría del cono, de forma tubular, es posible obtener un gran caudal volumétrico generado por la sección del cono, y, en consecuencia, una agitación eficaz. Además, existen grandes turbulencias en el cono generadas naturalmente por el flujo del líquido, turbulencias que aumentan la eficacia de la agitación. Ventajosamente, se prevé un accesorio desechable en el cono para incrementar este efecto.
Según un modo de realización, el procedimiento comprende, previamente a la fase de transferencia, al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta:
- desactivando el campo magnético;
- liberando las partículas capturadas, aplicando desde un pocillo que contiene una disolución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado en el cono de pipeta;
- aplicando una segunda fase de captura sobre una pared interna del cono de pipeta:
* aplicando el primer campo magnético al cono de pipeta
* y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en el pocillo que contiene la disolución de lavado.
Según un modo de realización, la liberación de las partículas capturadas comprende una fase de aplicación de ciclos para realizar un movimiento de ida y vuelta de un menisco de dicha disolución sobre un sedimento de partículas capturadas en el cono de pipeta, realizándose dicho movimiento de ida y vuelta de dicho menisco en una porción del cono inferior a la longitud total del cono de pipeta.
Más particularmente, la liberación de las partículas capturadas comprende una segunda fase de aplicación de los ciclos para aspirar y expulsar totalmente la disolución de lavado del cono. La frecuencia de aplicación de los ciclos de la segunda fase es inferior a la frecuencia de aplicación de los ciclos de la primera fase.
Especialmente, antes de la liberación de las partículas capturadas, el procedimiento comprende al menos dos fases de lavado implementadas en dos disoluciones de lavado distintas.
Este modo de realización es particularmente ventajoso cuando los componentes contenidos en la muestra biológica son unos ácidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN). Según otro modo de realización, los componentes contenidos en la muestra biológica son microorganismos (por ejemplo bacterias, hongos, levaduras), y en los que el procedimiento comprende una única fase de captura y una única fase de lavado.
En particular, la mezcla de la muestra con las partículas magnéticas tiene un volumen superior a 1 mililitro, y preferentemente superior o igual a 2 mililitros, y en el que el volumen del pocillo de recuperación es inferior o igual a 200 microlitros, y preferentemente inferior o igual a 100 microlitros.
Según un modo de realización, el procedimiento comprende, previamente a la fase de transferencia, al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta:
- aspirando la disolución de lavado en dicho cono de pipeta;
- después modulando el primer campo magnético aplicado a las partículas magnéticas para capturar éstas sobre la pared interna del cono de pipeta;
- y después expulsando el líquido de lavado del cono de pipeta.
En otras palabras, la modulación del campo magnético induce a una reorganización del sedimento de partículas capturado sobre la pared del cono. Especialmente, el sedimento puede cambiar de forma, extenderse, deslizarse o también “rodar” sobre la pared del cono de pipeta. Esta reorganización del sedimento permite aumentar todavía más la eficacia del lavado, y esto tanto más cuanto que esta reorganización puede realizarse conjuntamente con unos ciclos de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado.
En particular, la modulación del primer campo magnético se realiza:
- desplazando el cono de pipeta paralelamente a un eje longitudinal de dicho cono, y conservando constante el primer campo magnético;
- y/o haciendo desplazar los imanes separados los unos de los otros delante de las partículas capturadas.
En otras palabras, la modulación se obtiene simplemente, por ejemplo, por un técnico que hace deslizar una barra de imanes o por un dispositivo automatizado que coloca un mecanismo simple de translación de una barra de imanes. Según un modo de realización, el volumen del cono de pipeta es al menos diez veces superior al volumen del pocillo de recuperación. Según un modo de realización, el volumen de la mezcla es al menos tres veces superior al volumen del cono de pipeta.
Según un modo de realización, los componentes pertenecen al grupo formado de los ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios (ADN y/o ARN), de los microorganismos, de las proteínas, y de los péptidos. Los componentes están constituidos de cualquier otro tipo de moléculas en función de la funcionalización dada a las partículas magnéticas. El objetivo de la presente invención es también proponer un dispositivo para la implementación del procedimiento que se acaba de describir, que sea poco voluminoso y simple de usar por un técnico de laboratorio.
Según la invención, se describe un portapipeta que comprende:
- una base;
- un rebaje formado en la base, apto para alojar de manera amovible un soporte de pocillo;
- un soporte de pipeta que comprende un primer alojamiento en el que se puede insertar, ventajosamente de manera amovible, una pipeta equipada con al menos un cono de pipeta tubular que comprende una punta destinada al pipeteo de líquido, estando abierto el primer alojamiento sobre el rebaje de la base, siendo el soporte de pipeta móvil en translación con respecto a la base según una dirección paralela a un eje de los conos de pipeta y también móvil entre una primera posición, en la que la punta de cada cono de pipeta está alojada en un pocillo del soporte de pocillo, y al menos una segunda posición, en la que dicha punta está fuera de dicho pocillo;
- un segundo alojamiento apto para alojar de manera amovible una pieza imantada, haciendo frente el segundo alojamiento a cada uno de los conos de pipeta en una posición por encima de la punta de este cuando el soporte de pipeta está en la primera posición, y haciendo frente el segundo alojamiento a la punta del cono de pipeta cuando el soporte de pipeta está en la segunda posición.
En otras palabras, el portapipeta recibe una pipeta y el técnico realiza las etapas del procedimiento de extracción, subiendo/bajando la pipeta, especialmente para hacer migrar el sedimento de partícula a la punta del o de los conos de pipeta, introduciendo unos pocillos (en forma de placa, de barra, etc.) en la base, y accionando la pipeta.
El portapipeta, que es poco voluminoso y transportable, permite además la semi-automatización del procedimiento de extracción cuando se utiliza una pipeta electrónica. Tal pipeta comprende, en efecto, unos circuitos de aspiración y de expulsión en cada cono de pipeta que lo equipa, y un circuito electrónico a base de microprocesador. Este circuito electrónico controla los circuitos de aspiración/expulsión en función de las consigas introducidas por el técnico mediante una interfaz que equipa la pipeta y/o de un ordenador/tableta/teléfono inteligente conectado a la pipeta (por ejemplo, mediante una conexión inalámbrica de tipo bluetooth), etc. Estas consignas están constituidas, por ejemplo, de instrucciones de ciclos de aspiración/expulsión y/o de una elección de un protocolo particular pregrabado en la pipeta.
Al ser la pipeta electrónica programable, se obtiene además una gran polivalencia en la definición del procedimiento de extracción, que puede adaptarse en función de una captura magnética particular deseada (por ejemplo: purificación de ácidos nucleicos, inmunoconcentración magnética, etc.). Especialmente, se puede registrar en la pipeta un protocolo apropiado para la extracción considerada, definiéndose el protocolo en términos de número de ciclos de aspiración y de expulsión, de encadenamiento de ciclos, de frecuencia de ciclos, de duración entre los ciclos, volúmenes definidos, etc. Se obtiene así un sistema autónomo y semi-automatizado.
Finalmente, los conos de pipeta son extraíbles de la pipeta, y por lo tanto fácilmente reemplazables, sin que la pipeta esté fuera de servicio durante un largo tiempo.
Según un modo de realización, el primer alojamiento comprende una abertura para la inserción y la extracción frontal de la pipeta en el primer alojamiento del soporte de pipeta. La inserción y la extracción frontal de la pipeta y de los conos en posición minimizan el riesgo de tocar el portapipeta con las puntas de los conos, y por lo tanto el riesgo de contaminación del portapipeta.
Según un modo de realización, el segundo alojamiento se realiza en la base.
En particular, el soporte de pipeta comprende un tercer alojamiento en el que la pieza imantada es apta para alojarse de manera amovible para enfrentarse a cada cono de pipeta en una posición por encima de la punta de dicho cono cuando el soporte de pipeta está en la segunda posición.
En otras palabras, cuando la pieza imantada (por ejemplo, que comprende uno o varios imanes permanentes) está presente en el tercer alojamiento, ésta es solidaria de los conos de pipeta y sigue, por lo tanto, su movimiento en translación con respecto a la base. Durante tales movimientos, la pieza imantada conserva por lo tanto los sedimentos de partículas magnéticas fijadas en los conos. El técnico puede así, por ejemplo, subir la pipeta para desplazar más fácilmente un soporte de pocillo en la base sin riesgo de desplazar los sedimentos de partículas en los conos.
Según un modo particular, el segundo y tercer alojamientos se comunican, y el soporte de pipeta comprende unos medios aptos para mantener de manera amovible la pieza imantada en el tercer alojamiento. De esta manera, el técnico puede separar la pieza imantada del soporte de pipeta que ocupa entonces su lugar automáticamente en la base al caer en el segundo alojamiento. Esta separación tiene lugar especialmente para la operación de migración de las partículas magnéticas a las puntas de los conos.
Según un modo de realización:
- la base comprende al menos una rueda dentada móvil en rotación;
- el soporte de pipeta comprende una cremallera que coopera con la rueda dentada para trasladar el soporte de pipeta con respecto a la base durante la rotación de la rueda dentada.
En particular, el portapipeta comprende un dispositivo de bloqueo y de desbloqueo del soporte de pipeta en la primera posición. Especialmente, el portapipeta comprende al menos una empuñadura solidaria de la rueda dentada para hacerla girar, y adecuada para fijarse de manera amovible a una empuñadura solidaria de la rueda dentada de otro portapipeta, lo que permite por lo tanto aumentar el número de conos de pipeta durante el procedimiento de extracción.
Según la invención, se describe un sistema para la extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos para fijarse sobre partículas magnéticas, comprendiendo el sistema:
- una pipeta equipada de al menos un cono de pipeta tubular que comprende una punta destinada al pipeteo de líquido y de un circuito de aspiración y de expulsión en cada cono de pipeta;
- al menos un soporte de pocillo;
- un portapipeta que comprende:
* una base;
* un rebaje formado en la base, apto para recibir de manera amovible cada soporte de pocillo;
* un soporte de pipeta que comprende un primer alojamiento en el que se inserta la pipeta, ventajosamente de manera amovible, estando el primer alojamiento abierto sobre el rebaje de la base, siendo el soporte de pipeta móvil en translación con respecto a la base según una dirección paralela a un eje de los conos de pipeta y móvil entre una primera posición en la que la punta de cada cono de pipeta está alojada en un pocillo del soporte de pocillo y al menos una segunda posición en la que dicha punta está fuera de dicho pocillo;
* un segundo alojamiento frente a cada uno de los conos de pipeta en una posición por encima de la punta de éste cuando el soporte de pipeta está en la primera posición, y enfrentando el segundo alojamiento a la punta del cono de pipeta cuando el soporte de pipeta está en la segunda posición; y
- una pieza imantada alojada de manera amovible en el segundo alojamiento.
Especialmente, el portapipeta es conforme al portapipeta descrito anteriormente.
Según la invención, se describe un soporte de pocillo para la migración de partículas magnéticas desde unas puntas de conos de pipetas en unos pocillos de recuperación.
A este efecto, la invención tiene también por objeto un soporte de pocillo, que comprende una pieza en la que se forman unos rebajes para la recepción de los pocillos, y al menos un imán frente a cada uno de los rebajes formados en dicha pieza.
Breve descripción de las figuras
La invención se comprenderá mejor a partir de la lectura de la descripción siguiente, dada únicamente a título de ejemplo, y realizada en relación con los dibujos anexos, en los que unas referencias idénticas designan unos elementos idénticos, y en los que:
- la Figura 1 es una vista en perspectiva de un sistema de extracción que permite la realización del procedimiento de extracción según la invención;
- las Figuras 2A y 2B son unas vistas de frente y en perspectiva de una pipeta electrónica y de sus conos de pipetas amovibles;
- las Figuras 3A y 3B son unas vistas en perspectiva y de frente de un portapipeta que permite la realización del procedimiento de extracción según la invención;
- las Figuras 4A y 4B son una vista de detalle en corte del portapipeta de la figura 3, respectivamente según los planos A-A y B-B de la figura 3B;
- la Figura 5 es una vista en perspectiva de una placa “deepwell” que comprende unos pocillos;
- las Figuras 6A y 6B son unas vistas en perspectiva de una gradilla magnética y de tubos de elución PCR que se pueden alojar en la gradilla;
- la Figura 7 es una vista de frente de una pieza imantada;
- la Figura 8 es un organigrama de un procedimiento de extracción según la invención;
- la Figura 9 es una fotografía de los conos de pipeta de un sistema que permite la realización del procedimiento de extracción según la invención con unos sedimentos de partículas magnéticas dispuestos aproximadamente a media altura de los conos;
- la Figura 10 es una fotografía de estos mismos conos con los sedimentos dispuestos en las puntas de estos; - la Figura 11 es una fotografía de tubos de elución PCR en los que se han recuperado las partículas magnéticas; - las Figuras 12 y 13 ilustran un segundo modo de realización del portapipeta que permite la realización del procedimiento de extracción según la invención;
- la Figura 14 es una vista en perspectiva de dos sistemas según la Figura 1 acoplados al medio de empuñaduras de rotación;
- la Figura 15 es una vista esquemática que ilustra el movimiento de ida y vuelta de un menisco de una disolución sobre un sedimento de partículas para soltar este último de la pared de un cono de pipeta.
Salvo para la Figura 15, la descripción se realiza en relación con unos planos y fotografías a escala reducida de un sistema real.
Descripción detallada de la invención
Refiriéndose a las figuras 1 a 7, un sistema 10 de extracción (Figura 1) de componentes contenidos en una muestra líquida comprende una pipeta electrónica 12 (Figura 2), un portapipeta 14 (Figura 3) en el que se aloja la pipeta 12, uno o varios soportes de pocillos 18a, 18b (Figuras 5 y 6) que pueden alojarse cada uno en el portapipeta 14, y una primera pieza imantada 16 (Figura 7).
La pipeta 12, que es portátil, comprende una hilera de conos de pipetas 20, y un cuerpo 22 en el que están montados los conos 20 (Figura 2A). En este cuerpo 20, están alojados un circuito de aspiración/expulsión de líquido en los conos 20 (por ejemplo, un conjunto de pistones accionados por un motor eléctrico), y un circuito electrónico de control del circuito de aspiración/expulsión. El circuito electrónico, que comprende por ejemplo un microprocesador y una o varias memorias informáticas, es programable, y abarca unas instrucciones para la aplicación de uno o varios protocolos de pipeteo, comprendiendo cada protocolo una o varias etapas. El circuito electrónico comprende también una interfaz hombre máquina 24 alojada en una empuñadura 26 del cuerpo 22, comprendiendo la interfaz un conjunto de botones de selección y de navegación 28 y una pantalla de visualización 30 que permite la visualización y la selección de diferentes protocolos de pipeteo grabados. El usuario puede programar, especialmente, la pipeta electrónica 12, por ejemplo descargando en esta unas instrucciones desde un ordenador conectado a la pipeta 12 a través de una conexión inalámbrica, por ejemplo Bluetooth. El usuario puede también seleccionar, mediante la interfaz 24, un protocolo pregrabado. La pipeta 12 es, por otro lado, apta para aspirar un volumen predefinido de líquido en cada uno de los conos 20, expulsar un volumen predefinido desde cada uno de los conos, y llevar a cabo unos ciclos automáticos de aspiración/expulsión de duración y frecuencia variable.
Como se ilustra más particularmente en la Figura 2B, los conos 20, de forma tubular y de eje longitudinal X, son amovibles encajándose en unos lóbulos 32 que sobresalen del cuerpo 22, lo que permite su reemplazo. Los conos están, por otro lado, constituidos de un material plástico, por ejemplo de polipropileno, lo que tiene por efecto hacerlos “transparentes” a un campo magnético y permite la captura de partículas magnéticas, como se describirá más en detalle a continuación. Finalmente, cada cono 20 presenta en su extremo abierto de pipeteo un perfil afilado 21, o “punta”. Esta parte 21 tiene una sección reducida en un plano perpendicular al eje X, lo que permite su introducción facilitada en unos recipientes o pocillos, como ya se conoce en sí.
La pipeta electrónica 12 es, por ejemplo, el modelo “VIAFLO II 8 canaux” comercializado por la compañía ©INTEGRA Biosciences AG, Suiza, modelo cuyos elementos se describen en las solicitudes de patente US 2009/071266, US 2009/074622, US2011076205 y US 2008/095671.
El portapipeta 14 comprende (Figuras 3A y 3B) una base 34, destinada a colocarse sobre un plano de trabajo (por ejemplo una mesa o un banco de laboratorio), así como una parte móvil 36 con respecto a la base 34. La parte móvil 36, también denominada “soporte de pipeta” comprende un alojamiento 38 en el que puede insertarse la pipeta 12 de manera amovible y mantenerse inmóvil, como se ilustra en la Figura 1. Para la translación del soporte de pipeta 36 con respecto a la base 34, el soporte 36 comprende una o más cremalleras 40, por ejemplo dos, que se engranan con unas ruedas dentadas 42 montadas sobre un eje 44 móvil en rotación y alojado en la base 34. Una o varias varillas 46 se fijan además al soporte 36 (por lo tanto, en la base 34) y se deslizan por unos orificios de la base 34 (por lo tanto, en el soporte 36) a fin de guiar el soporte 36 en su movimiento de translación. Se fijan además una o dos empuñaduras de rotación 50 al extremo del eje 44 a fin de permitir al usuario girar fácilmente este último según las flechas 52 (Figura 1) y por lo tanto hacer subir o bajar el soporte de pipeta 36 tal como se ilustra mediante las flechas 54 (Figura 1). El movimiento de translación del soporte de pipeta 36 con respecto a la base 34 es por lo tanto paralelo al eje X de los conos 20 cuando la pipeta 12 está colocada en el alojamiento 38 del soporte 36, y por lo tanto paralela a la dirección de la gravedad cuando la base 34 está colocada en un plano de trabajo horizontal, de manera que el soporte 36 “sube” o “baja”.
La base 34 está abierta sobre su cara delantera 56 para permitir la introducción y la retirada de los soportes de pocillos 18a, 18b, definiendo así un alojamiento para estos últimos. Este alojamiento está abierto en su parte superior para permitir a los conos 20 de la pipeta 12 alcanzar dichos soportes de pocillo cuando la pipeta baja. Así, como se describe más en detalle a continuación, la pipeta 12 puede tomar varias posiciones con respecto a la base 34, y por lo tanto con respecto a un soporte de pocillos 18a, 18b alojado en este último. En particular, la pipeta 12 puede tomar una posición en la que las puntas 21 de los conos 20 están en remojo en unos pocillos de soporte 18a, 18b, y al menos una posición en la que las puntas 21 no están en remojo en los pocillos, y están a una distancia de estos últimos a fin de permitir la manipulación de los soportes de pocilios por el usuario y la captura de partículas magnéticas en una posición central de los conos 20.
En referencia a las Figuras 5 y 6, los soportes de pocillo pueden tomar varias formas en función de la extracción deseada. Espacialmente, un soporte de pocillos es una placa 18a compartimentada (Figura 5), habitualmente denominada “microplaca” de tipo “DeepWell”. Este tipo de placa comprende unas hileras 60 de pocillos 52 en las que puede sumergirse la hilera de conos de pipeta 20. Cada hilera 60 puede así recibir un líquido particular utilizado durante la etapa de extracción utilizada por el sistema 10. El paso de una hilera 60 a otra se realiza entonces simplemente por el usuario que pone en la vertical de unos conos de pipetas 20 la hilera 60 particular que contiene el líquido necesario para la etapa antes de llevarse a cabo.
Otro soporte de pocillos, descrito en la Figura 6A, está imantado y específicamente diseñado para la migración de partículas magnéticas desde las puntas 21 de los conos de pipetas 20 a los pocillos. El soporte 18b comprende para tal efecto un cuerpo 64 en el que se forma una hilera de alojamiento 66 que puede recibir la hilera de cono de pipeta 20, y en el que está alojada una segunda pieza imantada 68 que comprende uno o varios imanes permanentes, por ejemplo un imán permanente cerca de cada uno de los pocillos 66. La pieza imantada 68 está colocada debajo de los pocillos 66 o frente a sus porciones inferiores, tal como se ilustra. Así, las puntas 21 de los conos de pipetas 20 están colocadas por encima de la pieza imantada 68 cuando dichas puntas están sumergidas en los pocillos 66. Finalmente, el soporte 18b sirve de gradilla magnética que retiene de manera amovible unos tubos 69 en los alojamientos 66, por ejemplo unos tubos de elución PCR tales como se ilustran en la figura 6B, con fines, por ejemplo, de transferencia ulterior del producto de la extracción recuperada en estos.
La primera pieza imantada 16, cuya función es capturar unas partículas imantadas en los conos 20 de una manera descrita más en detalle a continuación, comprende uno o varios imanes permanentes 72, ventajosamente una hilera de imanes permanentes separados los unos de los otros por unos espacios 74, y aún más ventajosamente un imán permanente frente a cada cono de pipeta 20 cuando la pieza 16 está totalmente alojada en la base 34. La pieza 16 comprende además una empuñadura 76 para un mejor agarre por el usuario.
En la base 34 se prevé un alojamiento 78 para la recepción de la pieza imantada 16, colocándose el alojamiento 78 de manera que la pieza 16 esté frente a los conos de pipeta 20, por encima de su punta 21, y preferentemente frente a una zona central 80, a una altura superior al pocillo, cuando las puntas 21 se sumergen en los pocillos mantenidos en un soporte de pocillos. De esta manera, las partículas se capturan en un volumen de cono suficientemente grande como para no formar unos tapones en los conos. El portapipeta 14 comprende también unos medios que permiten controlar la velocidad de elevación del soporte 36. En particular, la cremallera y la rueda dentada están diseñadas para que una media-vuelta (180°) de la rueda 50 permita recorrer el conjunto de la cremallera, y un contrapeso 58 integrado en cada una de las empuñaduras 50, de manera descentrada con respecto al eje 44. Estos contrapesos, bajo su peso y el efecto de palanca asociado, generan un par de rotación que pone en rotación el eje 44 limitando al mismo tiempo el par transmitido a mano por el usuario. De manera ventajosa, como se ilustra en la figura 4A, una parte sustancial del eje 44 está formada también de un contrapeso semi-cilíndrico con el mismo objetivo. Esta asistencia mecánica ayuda a levantar el soporte de pipeta, y limita por lo tanto los trastornos musculo-esqueléticos, y utiliza un freno que permite al usuario controlar con más precisión la velocidad de subida y de bajada del soporte 36.
Pueden preverse otros mecanismos de control de la velocidad del soporte 36, especialmente un frenado magnético. Por ejemplo, en referencia a la Figura 4A, el contrapeso 59 comprende un material imantable (por ejemplo acero o equivalente) y una tercera pieza imantada 80 (paralelepipédica o en forma de arco de círculo concéntrico al eje 44) está alojada en la base 34, preferentemente en el lado opuesto de la pieza imantada 16 frente al eje 44 para no perturbar la extracción. Cuando el contrapeso 59 del eje pasa delante de la pieza imantada 80, el movimiento de rotación del eje 44 se ralentiza debido al par de frenado generado. Esto permite, por un lado, compensar la fuerza para levantar la pipeta durante la subida (actuando como asistente para el usuario), y, por otro lado, controlar la velocidad de subida de la pipeta cuando se desea hacer bajar las partículas magnéticas por debajo de los conos de pipeta, como se describirá a continuación.
Se prevé también ventajosamente un mecanismo de tope, tal como se ilustra en la Figura 4B. En esta variante, una rueda 84 de un material deformable (por ejemplo de elastómero) está montada sobre el eje 44 y comprende dos dientes 86, 88. Una protuberancia 82, por ejemplo hemisférica, sobresale por otro lado de la base 84 frente a la rueda 84. Cuando el usuario sube la pipeta 12 accionando la rueda 50, el primer diente 86 encuentra la protuberancia 82. Al aumentar el par aplicado a la rueda 50, el diente 86 se pliega, pasa la protuberancia 82, y retoma su forma. En esta posición, el diente 86 puede entonces reposar sobre la protuberancia 82, seleccionándose la dureza de este diente para que no se pliegue bajo la acción del peso de la pipeta 12 y del portapipeta 36. La pipeta se bloquea así en posición alta, pudiendo entonces el usuario soltar la rueda 50. El segundo diente 88, de mayor dimensión (por ejemplo longitud y/o anchura) necesita para su paso un par mucho mayor, y define así un tope para evitar que el portapipeta 36 se desenganche de la base 34, salvo que el usuario despliegue una fuerza capaz de romper este diente. En una variante, la protuberancia 82 se sustituye por un tope que comprende una bola montada sobre resorte en un alojamiento de la base. La rueda 84 puede realizarse así de un material duro. La acción del primer diente 86 tiene entonces el efecto de empujar la bola hacia su alojamiento, permitiendo así el paso del diente 86.
Se describe ahora un procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra líquida con la ayuda de partículas magnéticas, llevándose a cabo este procedimiento con la ayuda del sistema que se acaba de describir. El procedimiento se basa en la asociación del portapipeta, de la pipeta electrónica programable y de conos de pipeta (por ejemplo, de un volumen de 1250 pl) a fin de realizar las diferentes etapas de captura, de lavado y de elución de partículas magnéticas para tratar un volumen de muestra por cono de pipeta comprendido entre 1 ml y 5 ml. La captura de las partículas magnéticas se efectúa secuencialmente en los conos de pipeta durante ciclos de aspiración/expulsión sobre el conjunto del volumen de muestra a tratar. A título de ejemplo, se describe, en relación con el organigrama de la figura 8, un procedimiento de purificación de ácidos nucleicos virales que utilizan la química NucliSENS®, a saber una extracción de los ácidos nucleicos con la ayuda de partículas de sílice magnéticas.
El procedimiento empieza por una etapa 100 de preparación de diferentes muestras y reactivos necesarios para la purificación, seguida de dicha purificación en 102.
Especialmente, la preparación 100 consiste, en 104, en mezclar la muestra biológica que comprende unos virus de los cuales se desea extraer los ácidos nucleicos, con un reactivo de lisis química de los virus (por ejemplo el reactivo de lisis “Nuclisens miniMAG” de bioMérieux, de referencia 200292, o el reactivo de lisis “Nuclisens easyMAG” de bioMérieux, de referencia 280130), a razón de dos volúmenes de reactivo de lisis por un volumen de muestra. La mezcla se calienta después durante 30 minutos a 56°C, liberando así los ácidos nucleicos de los virus de una manera conocida en sí misma. Se introducen entonces, en 106, en la muestra lisada, unas partículas de sílice magnéticas (por ejemplo unas partículas que tienen un núcleo paramagnético, ferromagnético o ferrimagnético que presentan o no una remanencia, recubierta de una carcasa de sílice), que tienen la propiedad de enlazarse con unos ácidos nucleicos.
La preparación 100 se prosigue, en 108, por el llenado de la microplaca 18a, que tiene unos pocillos 62 de 5 ml, y unos tubos de elución PCR 69 de 0,2 ml de la gradilla magnética 18b de manera que:
- cada pocillo de la primera hilera de la microplaca 18a se llena con la muestra lisada que comprende las partículas de sílice, a continuación “muestra lisada”. El volumen total en cada pocillo de la primera hilera es preferentemente superior a 1,5 ml debido a la utilización de la microplaca Deepwell de 5 ml y de los volúmenes manipulados por la pipeta electrónica; cada pocillo 66 de la segunda hilera de la microplaca 18a se llena de 1250 pl de tampón de lavado (por ejemplo el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n°2” de bioMérieux de referencia bMx 280131);
- cada pocillo 66 de la tercera hilera de la microplaca 18a se llena de 1250 pl de tampón de lavado (por ejemplo, el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n°2” de bioMérieux de referencia bMx 280131);
- cada tubo de elución PCR 69 alojado en la gradilla magnética 18b se llena de un volumen de 100 de tampón de elución (por ejemplo el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n° 3” de bioMérieux, de referencia 280132).
El usuario coloca entonces:
- la pipeta electrónica 12, con su hilera de conos 20, en el alojamiento 38 del portapipeta 14, en posición elevada para permitir la introducción de la placa 18a; y
- la placa 18a en el alojamiento 56 de la base 34 con la primera hilera de pocillos que comprende la muestra lisada en la vertical de los conos 20.
La extracción 102 empieza por la homogeneización de la muestra lisada. En este sentido, la pieza imantada 16 no se coloca en la base 34 y no interfiere, por lo tanto, con los conos 20. El usuario gira una de las ruedas 50 a fin de sumergir las puntas 21 de los conos 20 en la hilera de pocillos de la placa 18a que comprende la muestra lisada. Después, selecciona, con la ayuda de la interfaz 24 de la pipeta 12, un primer protocolo de pipeteo que comprende al menos una fase de aspiración/expulsión de la muestra lisada en los conos 20, e inicia el protocolo seleccionado. Estas fases (por ejemplo dos) comprenden cada una al menos un ciclo de aspiración/expulsión (por ejemplo, cinco ciclos) seguido de un periodo de espera de varios minutos, por ejemplo 5 minutos. En el sentido de la invención, un ciclo de aspiración y de expulsión consiste en llenar al menos tres cuartas partes, por ejemplo completamente, los conos, y después vaciarlos completamente, salvo que se especifique de otra manera por el programa.
Una vez terminada la homogeneización, los conos 20 se vacían, y sus puntas 21 se sumergen en los pocillos que contienen la muestra lisada. La purificación 102 se continúa por la captura, en 112, de las partículas de sílice de la muestra lisada sobre la pared interna de los conos 20. Para ello, el usuario coloca la pieza imantada 16 en el alojamiento 78 de la base 34, selecciona con la ayuda de la interfaz 24 de la pipeta 12 un segundo protocolo de pipeteo y después inicia el protocolo seleccionado. El segundo protocolo comprende una pluralidad de ciclos de aspiración/espera/expulsión, por ejemplo una decena de ciclos, separándose una aspiración de una expulsión por algunos segundos, por ejemplo una decena de segundos. En cada aspiración y en cada expulsión, una parte de las partículas contenidas en la muestra lisada se captura sobre la pared de los conos de pipeta gracias al campo magnético producido por la pieza imantada 16.
Las partículas magnéticas, y por lo tanto también sus ácidos nucleicos relacionados, se capturan así en forma de sedimentos de partículas 100 frente a la pieza imantada 16, y preferentemente en una zona central a media altura de los conos 20, como se ilustra en la figura 9.
Una vez terminada la captura, habiéndose expulsado la muestra lisada completamente de los conos 20, y estando la pieza imantada 16 todavía en su sitio, la purificación 102 se continúa con una primera etapa de lavado 114. Con este fin, el usuario levanta el portapipeta 14 (por lo tanto, sube la pipeta 12) a fin de liberar la placa 18a de los conos 20, alinea la segunda hilera de la placa 18a con la hilera de cono 20 y después recoloca el portapipeta (por lo tanto, hace bajar la pipeta) a fin de sumergir las puntas 21 de los conos en los pocillos de la placa 18a. El usuario selecciona después, con la ayuda de la interfaz 24, un tercer protocolo de pipeteo que comprende al menos una fase de aspiración/expulsión de la muestra lisada en los conos 20, después inicia el protocolo seleccionado. El tercer protocolo es, por ejemplo, idéntico al primer protocolo. El paso repetido del tampón de lavado sobre los sedimentos de partículas permite así lavar estos últimos. Esta etapa de lavado se completa ventajosamente, se implementa de manera conjunta, con una modulación del campo magnético que captura las partículas sobre los conos. Por ejemplo, el usuario hace subir y bajar la pipeta 12, lo que tiene el efecto de desplazar los sedimentos de partículas sobre los conos, o bien la pieza imantada 16 comprende un tren de imanes permanentes y el usuario hace deslizar en un movimiento de ida y vuelta la pieza imantada 16 de su alojamiento 78, de manera que la intensidad y las líneas de campos magnéticos que capturan los sedimentos varían, conservando al mismo tiempo las partículas capturadas sobre los conos. La modulación del campo magnético tiene así el efecto de reorganizar los sedimentos durante el lavado, y aumentar la eficacia de éste.
Se realiza después un segundo lavado en 116 con la ayuda del tampón de lavado de la tercera hilera de la placa 18a. Por ejemplo, los conos se vacían completamente del primer tampón de lavado, y después se realiza un segundo lavado idéntico al primer lavado.
Después de este segundo lavado, se realiza una etapa de migración 118 de los sedimentos de partículas 200 a las puntas 21 de los conos 20. En este sentido, los conos 20 permanecen preferiblemente llenos del segundo tampón de lavado para facilitar el deslizamiento de los sedimentos 200 y permanecen alineados con la segunda hilera de la placa 18a. El usuario gira entonces una de las ruedas 50 para hacer subir la pipeta 12. Al ser la pieza imantada 16 solidaria de la base 34, los sedimentos permanecen inmóviles con respecto a esta última y migran hacia las puntas 21 deslizándose por las paredes de los conos 20 a medida que sube la pipeta. El usuario detiene la subida de la pipeta 12 una vez que los sedimentos 200 estén en las puntas 21, como se ilustra en la Figura 10, a una distancia media de algunos milímetros, por ejemplo 8 mm, de los extremos abiertos de los conos. En esta posición, el usuario selecciona e inicia después, con la ayuda de la interfaz 24, la expulsión del tampón de lavado contenido en los conos 20 en los pocillos de la placa 18a. Opcionalmente, una de las fases de lavado, o una fase de lavado suplementaria consiste en retirar la pieza imantada a fin de liberar las partículas magnéticas y realizar un lavado, agitando al mismo tiempo las partículas en la disolución de lavado por ciclos de aspiración y de expulsión. Las partículas se capturan después de nuevo sustituyendo la pieza imantada y procediendo a ciclos de aspiración y de expulsión tal como se ha descrito anteriormente.
La purificación 102 se termina por una etapa 120 de transferencia en los tubos de elución PCR 69 de las partículas magnéticas presentes en las puntas 21 de los conos 20. Para este fin, el usuario levanta el portapipeta 14, retira la placa 18a, coloca la gradilla magnética 18b en el alojamiento 56 a fin de alinear los tubos PCR69 con la hilera de conos 20, vuelve a depositar el portapipeta 14 y retira la pieza imantada 16 de la base 14 a fin de liberar las partículas magnéticas capturadas de los conos. Una vez sumergidas las puntas 21 en los tubos 69, el usuario selecciona, con la ayuda de la interfaz 24, un cuarto protocolo de pipeteo, y después inicia el protocolo seleccionado. Una primera variante de este protocolo consiste en unos ciclos de aspiración y expulsión del tampón de elución en las puntas 21 de los conos 20, lo que permite la resuspensión de las partículas magnéticas rompiendo los sedimentos de partículas. Por otro lado, la frecuencia seleccionada para los ciclos permite, en cada expulsión en los tubos 69, que una parte de las partículas magnéticas sea capturada en los tubos 69 gracias al campo magnético de la pieza imantada 68 alojada en la gradilla 64. Además, estos ciclos permiten “aclarar” las puntas 21 para recuperar las partículas que se adhieren a las paredes de los conos. En una segunda variante del protocolo, unos ciclos de aspiración y de expulsión se realizan, en primera lugar, a una frecuencia más elevada, a fin de agitar más vigorosamente el tampón y las partículas, y por lo tanto obtener una homogeneización acelerada que facilite la transferencia en los tubos de elución 69. La etapa de transferencia se termina por la expulsión completa del tampón de elución en los tubos 69. Bajo el efecto del campo magnético de la gradilla 64, las partículas magnéticas se separan entonces definitivamente del tampón de elución, como se ilustra en la figura 11. El usuario puede así recuperar los tubos 69 para un tratamiento ulterior, en particular la elución de los ácidos nucleicos por calentamiento, de manera en sí mismo conocida.
En el modo de realización del portapipeta descrito anteriormente, la pieza imantada 16 está alojada en la base 34. Asimismo, cuando el usuario desea avanzar la placa 18a, puede elevar la pipeta lo suficientemente alta para proceder a esta operación. Esto provoca, en cuanto a la migración de las partículas hacia las puntas, el desplazamiento de los sedimentos 200 sobre las paredes de los conos 20, lo que presenta la ventaja de “reorganizar” los sedimentos que pueden rodar sobre sí mismos. La eficacia del lavado se ve así reforzada. Por el contrario, esto implica que el usuario tenga cuidado de no elevar nunca demasiado la pipeta a fin de evitar que los sedimentos salgan de los conos. En este sentido, el usuario puede, por ejemplo, levantar o inclinar el portapipeta para conservar los sedimentos a distancia de las aberturas de los conos. Esta opción, que necesita la elevación repetida de un dispositivo cuyo peso puede ser importante, puede provocar, no obstante, a largo plazo, unos trastornos musculoesqueléticos. Además, el usuario debe tener cuidado también de no elevar demasiado el portapipeta a fin de evitar que los sedimentos salgan de los conos.
Un segundo modo de realización del portapipeta según la invención permite la manipulación de las placas 18a, 18b elevando únicamente la pipeta, y por lo tanto evitando elevar el portapipeta 14, garantizando al mismo tiempo que los sedimentos de partículas permanezcan a distancia de las puntas 21 de los conos. Este segundo modo de realización, así como las variaciones inducidas en el procedimiento que se acaba de describir, se ilustran en las Figuras 12 y 13.
Más particularmente, el segundo modo de realización difiere del primer modo de realización por los medios de recepción de la pieza imantada 16 en el portapipeta 14. Especialmente, la base 34 comprende el alojamiento 78 para la inserción y la extracción de la pieza imantada 16, como se ha descrito anteriormente, y el alojamiento 78 está abierto en su parte superior 130 para permitir también la inserción y la extracción de la pieza 16 verticalmente en el alojamiento 78. El soporte de pipeta 36 comprende además unos medios para fijar la pieza imantada 16 en la vertical del alojamiento abierto 78, en particular uno o varios conectores 132 de material imantable (por ejemplo de acero) fijados sobre una pared trasera 134 del soporte de pipeta móvil 36 (figura 12C). De esta manera, la pieza imantada 16 es solidaria del soporte móvil 36, y permanece frente a los conos 20 cuando el usuario sube y baja la pipeta (en particular durante fases de lavado), como se ilustra en las Figuras 12B y 13A.
Para realizar la migración de los sedimentos 200 a las puntas de los conos 20, el usuario separa la pieza imantada 16 del soporte de pipeta 36, aplicando una simple presión hacia abajo sobre la empuñadura 78 de la pieza 16 y eleva la pipeta 12. La pieza imantada 16 se desengancha de los conectores 134, y permanece por lo tanto en el alojamiento 78 de la base y es, por lo tanto, solidaria de la base 34, induciendo la migración de los sedimentos 200 a las puntas 21 de los conos, tal como se ha descrito anteriormente (Figuras 13A y 13B). Una vez elevada la pipeta, el usuario sustituye la placa 18a por la gradilla 18b provista de los tubos de elución PCR, retira la pieza imantada 16 y vuelve a bajar la pipeta (Figura 13C, tubos 69 no representados). En una variante, el soporte de pipeta 36 puede comprender un alojamiento análogo al alojamiento 78 de la base en el que el usuario desliza la pieza imantada, especialmente para las fases de lavado.
Se ha descrito un procedimiento de extracción particular. La presente invención se aplica, no obstante, a cualquier tipo de captura de partículas magnéticas y a cualquier tipo de secuencia de pipeteo. Asimismo, se ha descrito una pipeta que tiene 8 canales de un volumen particular. La pipeta puede comprender un número cualquiera de canales de cualquier volumen en función de la aplicación considerada.
A fin de aumentar el número de muestras tratadas, se pueden acoplar dos sistemas de extracción según la invención, como se ilustra en la Figura 14. Por ejemplo, las empuñaduras de rotación 50 pueden encajarse de manera que puedan llevarse a cabo simultáneamente dos extracciones, subiendo y bajando el usuario las pipetas 12 al mismo tiempo. Con este fin, las pipetas pueden también sincronizarse, controlando una pipeta, por ejemplo, la otra pipeta.
Asimismo, se ha descrito un sistema de extracción portátil y semiautomatizado, particularmente adecuado para los laboratorios de análisis que tienen un número limitado de extracciones a realizar diariamente. La invención puede, sin embargo, automatizarse. Por ejemplo, la pipeta está integrada a un dispositivo automatizado que comprende unos mecanismos programables de subida y bajada de la pipeta y de movimiento de imán (o de activación/desactivación de electroimanes).
Se han descrito dos lavados en los pocillos de la segunda hilera y de la tercera hilera de la microplaca 18a. El número de lavado puede ser, no obstante, cualquiera. Asimismo, se ha descrito una única etapa de captura de las partículas en los conos. Se pueden prever también una o varias etapas de liberación de las partículas, cada una seguida de una nueva etapa de captura.
Para liberar las partículas, el campo magnético de captura de las partículas se desactiva retirando la pieza imantada 16 de su alojamiento, después se realizan unos ciclos de aspiración/expulsión de un tampón en los conos de pipeta a fin de soltar los sedimentos de partículas de las paredes de los conos y disgregarlos. Tal procedimiento toma más de 10 minutos para separar completamente los sedimentos de las paredes de los conos con una frecuencia de aspiración/expulsión (aspiración y expulsión completa en los conos) de 5 ciclos por minuto. En referencia a la Figura 15, se obtiene una liberación más rápida de un sedimento 200 realizando un movimiento de ida y vuelta sobre el sedimento 200, del menisco 300 que forma el tampón 302 en el cono 20. Especialmente, el ciclo de aspiración/expulsión se ajusta de manera que el menisco 300 realice un recorrido limitado 304 a ambos lados del sedimento 200, a fin de aumentar la frecuencia de paso del menisco sobre el sedimento. Asimismo, la frecuencia de los ciclos de aspiración/expulsión se incrementa para aumentar todavía más dicha frecuencia de paso, en particular una frecuencia de ciclo superior a 2 ciclos por segundos sobre la zona de presencia del sedimento de partículas magnéticas. Aplicando este procedimiento, los sedimentos se separan de los conos en menos de 1 minuto. Los inventores han constatado que es el paso del menisco por un sedimento lo que ayuda a separar este último. En efecto, se han llevado a cabo unos ensayos mezclando rápidamente el tampón en los conos sin hacer pasar los meniscos sobre los sedimentos (es decir un “simple” movimiento de líquido delante de los sedimentos), sin ahorro notable de tiempo. Una vez realizada la fase de liberación de los sedimentos, que tiene también el efecto de disgregar los sedimentos, se lleva a cabo una fase de agitación por aspiración/expulsión completa en los conos (por ejemplo 8 ciclos de aspiración/expulsión por minuto) para terminar de disgregar los sedimentos y homogeneizar el tampón que comprende las partículas. Estos ciclos de aspiración/expulsión completos en los pocillos de las microplacas mezclan un volumen más grande, en un recorrido mayor, lo que facilita la homogeneización del tampón.
Se describirá ahora un procedimiento preferido de extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo ADN y ARN), en particular de origen viral, por ejemplo con la ayuda de partículas de sílice magnéticas. Este procedimiento comprende una fase de liberación de las partículas, por ejemplo tal como se ha descrito anteriormente, seguida de una fase de lavado en un tampón y de recaptura de las partículas. Se obtiene así un ahorro notable de tiempo, así como una extracción mejorada. En particular, este procedimiento comprende, una vez efectuada la etapa de lisis de los virus:
1. una primera etapa de captura de las partículas magnéticas en los conos de pipeta, por ejemplo de la manera descrita anteriormente;
2. seguida de una primera etapa de lavado, y preferentemente de al menos una segunda etapa de lavado, en hileras diferentes de la microplaca llenas de tampones de lavado (por ejemplo el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n° 1” de bioMérieux, de referencia 280130). Cada lavado comprende unos ciclos de aspiración expulsión del tampón de lavado con las partículas capturadas en los conos de pipeta, y dura al menos 15 segundos, preferentemente entre 25 segundos y 35 segundos, por ejemplo 30 segundos, y preferentemente menos de un minuto;
3. al menos una tercera etapa de lavado, en una tercera hilera de la microplaca 18a llena de un tampón (por ejemplo “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n° 2” de bioMérieux, de referencia bMx 280131). Durante esta tercera etapa de lavado, las partículas se liberan retirando el imán, a fin de recolocar las partículas en suspensión, aspirándose/expulsándose el tampón con las partículas en suspensión en los pocillos correspondientes de la microplaca 18a. La tercera etapa de lavado, que comprende preferentemente una fase de paso de meniscos en los sedimentos, tal como se ha descrito anteriormente, tarda algunos minutos, en particular 5 minutos;
4. una segunda etapa de captura de las partículas sobre los conos de pipeta, por ejemplo tal como se ha descrito anteriormente;
5. opcionalmente, una cuarta etapa de lavado, capturándose las partículas en una tercera hilera de la microplaca 18a llena de tampón de lavado (por ejemplo “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n° 2” de bioMérieux, de referencia bMx 280131);
6. una etapa de migración de los sedimentos de partículas en las puntas, seguida de una etapa de transferencia en los tubos (por ejemplo que comprenden un tampón de elución, por ejemplo el “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n° 3” de bioMérieux, de referencia 280132), por ejemplo tal como se ha descrito anteriormente.
Se han descrito unos tampones de lavado de la gama NucliSens, en particular unos tampones de extracción n° 1, n° 2, y n° 3. Más generalmente:
- el tampón de extracción n° 1 es un tampón que favorece la captura de los ácidos nucleicos sobre la sílice, creando unos puentes entre los grupos silanol de la sílice y los grupos fosfato de los ácidos nucleicos. Comprende, por ejemplo, tiocianato de guanidinio, a saber un agente caotrópico tal como se describe en el documento de R. Boom etal. “Rapid and simple method for purification ofi nucleic acids.” Journal of Clinical Microbiology. 1989; 28 (3): 495-503;
- los primero y segundo lavados permiten eliminar los restos residuales de matriz o de microorganismos,
- el tercer y cuarto lavados permiten eliminar las trazas de GuSCN e inhibidores de una amplificación de tipo PCR habitualmente colocados ulteriormente sobre el ADN/ARN capturado por las partículas magnéticas.
- el tampón de elución comprendido en los conos PCR permite retirar cualquier traza de tampón de lavado y estar en las condiciones óptimas para la etapa de elución.
La tabla siguiente compara los resultados obtenidos con el dispositivo según la invención aplicando el protocolo que se acaba de describir (2 primeros lavados seguidos de un tercer lavado con liberación de las partículas) en comparación con los resultados obtenidos con un dispositivo del estado de la técnica, a saber el MiniMag® comercializado por bioMérieux y considerado como un dispositivo de referencia en la extracción de ARN viral. El protocolo para el MiniMag® comprende cuatro etapas de lavado con los tampones de lavado (dos con el tampón “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n° 1” y dos con el tampón “NucliSENS easyMAG Extraction Buffer n° 2”. Para determinar la eficacia de la extracción, se realiza una amplificación PCR en tiempo real (o “q-PCR”) del lisado extraído, y el Ct (“cycle threshold”, que cuantifica un umbral de detección de ácido nucleico en una muestra) de cada muestra medida. Las muestras probadas por duplicado son unas muestras de 25 gramos de frambuesa o de cebolla verde a las que se añade en disolución Mengo virus pure (que corresponde a 500 copias del genoma por 25 gramos) o diluida al 1/10.
Figure imgf000014_0001
Como se puede constatar, la extracción del ARN viral según la invención da unos resultados similares a los obtenidos con la ayuda del MiniMag®. Además, se han llevado a cabo pruebas con diferentes lotes de partículas de sílice magnéticas de calidad diversas. Se ha constatado que la extracción según la invención es sorprendentemente muy firme frente a la calidad de dichas partículas. En particular, se han realizado unas pruebas sobre las mismas muestras con un lote de partículas de menor rendimiento, no comprendiendo la extracción la etapa de liberación/lavado/recaptura tal como se ha descrito anteriormente. En este caso, la tasa de extracción era más baja. Utilizando el procedimiento preferido descrito anteriormente con las partículas defectuosas, se obtuvieron unos resultados similares a los de la tabla anterior.
Se ha descrito una aplicación de la invención para la captura de ácidos nucleicos, por ejemplo ARN y/o ADN que proceden de una lisis realizada previamente a las fases de captura/lavado/migración y transferencia. La invención se aplica también a la captura de microorganismos (por ejemplo bacterias, hongos, levaduras) con la ayuda de partículas magnéticas cuya superficie está funcionalizada para capturar los microorganismos (por ejemplo recubiertas de proteínas de fago o de policationes aptas para tal captura de manera en sí mismo conocida). Las partículas magnéticas con sus microorganismos capturados se transfieren a unos tubos para sufrir después una lisis, por ejemplo mecánica. El lisado obtenido puede ser directamente objeto de un tratamiento, por ejemplo una amplificación por reacción en cadena por polimerasa (por ejemplo una PCR cuantitativa de tipo q-PCR), o purificarse según el procedimiento de extracción de ácidos nucleicos descrito anteriormente.
La invención es particularmente adecuada para la preparación de muestra microbiana para una PCR. En efecto, la muestra sobre la cual se realiza la captura de partículas en los conos de pipeta puede ser de volumen muy grande (por ejemplo varios mililitros) mientras que el volumen final de los tubos a los que se transfieren las partículas pueden ser de volumen muy reducido (por ejemplo inferior o igual a 200 microlitros, incluso inferior o igual a 100 microlitros). Debido al gran volumen de la muestra, se captura un número importante de microorganismo. El paso a un volumen muy reducido final tiene el efecto de concentrar los microorganismos. Así, los inventores han observado que una sola fase de captura desde una muestra de algunos mililitros, seguida de una única etapa de lavado, es suficiente para obtener unos resultados por q-PCR a partir de una lisis realizada en un volumen de 5 microlitros.
Especialmente, se ha realizado un enriquecimiento de matriz alimentaria (solomillo de pollo) en caldo nutritivo durante 5h41, 5°C. Se ha realizado una post-contaminación con una cepa de Salmonella Derby ¡, a un nivel de 10<2> a 10<4>XFU/ml, lo que corresponde a las concentraciones que pueden alcanzarse después del enriquecimiento en presencia de patógeno en la matriz alimentaria (es decir unas concentraciones para las cuales se determina que un lote alimentario no es apto para el consumo). En cada muestra contaminada, se realizan, por duplicado, dos procedimientos, uno según el protocolo estandarizado de captura con el sistema Gene-up® de bioMérieux, Francia, y uno según la invención.
El protocolo del Gene-up® consiste en una etapa de “bead-beating” de la muestra (es decir disrupción mecánica de la pared de bacterias), extrayendo 20 de esta que se colocan en un tubo de bead-beating que contiene 180 de tampones de lavado, seguido de la agitación durante 5 minutos sobre un agitador de microplacas para bead-beating. Se extraen 5 microlitros de la disolución final que después son objeto de una q-PCR.
El procedimiento según la invención consiste en:
1. una etapa de captura específica que pone en contacto 2 ml de muestra con una disolución de proteína de fago biotinilada (2 mg/ml final) por:
a. agitación por aspiración/expulsión en los conos de la pipeta durante 10 min,
b. adición de partículas magnéticas “Hyglos Streptavidin” (50 mí) y agitación por aspiración/expulsión durante 15 minutos (los complejos bacterias-proteínas de fago biotiniladas vienen se adhieren a las partículas magnéticas);
c. colocación del imán para la fase de recogida de las partículas magnéticas en los conos;
d. inicio del ciclo de captura de las partículas magnéticas;
2. una etapa de lavado en los pocilios que contienen la disolución de lavado TST (Tris Saline Tween) con 5 ciclos de aspiración/expulsión;
3. etapa de recogida de las partículas magnéticas en unos tubos de 5 microlitros que son objeto de un tratamiento de bead-beating, siendo objeto después la disolución final de 5 microlitros de una q-PCR. Los resultados obtenidos según el protocolo del Gene-up® y según la invención se resumen en la tabla siguiente:
Figure imgf000015_0001
La ganancia de sensibilidad estimada es de 2 log con respecto al protocolo estándar Gene-up®.
La presente invención responde a una problemática de polivalencia para el uso de diferentes técnicas de captura magnética (purificación de los ácidos nucleicos, inmunoconcentración magnética, etc.). El sistema según la invención, evolutivo y modulable, permite:
- la realización de etapas de captura/lavado/elución de partículas magnéticas utilizando un sistema autónomo constituido por la asociación de una pipeta electrónica programable y de un soporte que permite la realización de las diferentes etapas antes citadas;
- el tratamiento de un número de muestras de 1 a 8 en función de la configuración de la pipeta electrónica utilizada; - la paralelización del tratamiento de las muestras en el ámbito definido anteriormente con un sistema semiautomático;
- la asociación de 2 sistemas si es necesario aumentar el número de muestra a tratar;
- las etapas de elución se pueden realizar en diferentes tipos tubos: tubos PCR 0,2 ml para la recuperación de las partículas de sílice magnéticas cuando se trata de captura de los ácidos nucleicos (por ejemplo química NucliSENS®) o bien tubos de bead-beating en el caso de la recuperación de partículas magnéticas que han servido para la recuperación de patógenos (InmunoConcentración Magnética). Para este fin, el sistema permite la realización de etapas de captura/concentración de los patógenos sobre las partículas magnéticas y sus lisis in situ con la ayuda de bolas de cerámica/virio (por ejemplo procedimiento de tipo CapLyse®).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de extracción de componentes contenidos en una muestra biológica en forma líquida, siendo dichos componentes aptos para fijarse sobre unas partículas magnéticas, comprendiendo el procedimiento:
- una fase (106) de mezcla de la muestra con las partículas magnéticas;
- una fase (110) de aspiración de la mezcla desde un pocillo en un cono de pipeta (20) tubular que comprende una punta (21) destinada al pipeteo de líquido;
- una fase de captura (112) de las partículas magnéticas sobre una pared interna del cono de pipeta (20);
- aplicando un primer campo magnético (16) al cono de pipeta (20), siendo dicho campo apto para atraer y mantener las partículas magnéticas en una zona predeterminada del cono de pipeta (20), denominada de “captura”, por encima de la punta de esta;
- y aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta (20) en un pocillo (62);
- al menos una fase (114, 116) de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta (20): - expulsando la mezcla contenida en el cono de pipeta (20); y
- aplicando desde un pocillo (62) que contiene una disolución de lavado, al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado en el cono de pipeta (20); caracterizado por que el procedimiento comprende, además: - una fase (118) de migración de las partículas magnéticas sobre la pared interna del cono de pipeta (20), desde la zona de captura hasta la punta (21) del cono de pipeta (20), realizando un desplazamiento relativo del cono de pipeta (20) con respecto al primer campo magnético (16);
- y una fase (120) de transferencia de dichas partículas magnéticas que han migrado a la punta (21) del cono de pipeta (20) en un pocillo de recuperación (69) que contiene una disolución,
- al menos una fase de lavado de las partículas capturadas sobre la pared interna del cono de pipeta, previamente a la fase (120) de transferencia:
* desactivando el campo magnético;
* liberando las partículas capturadas, aplicando desde un pocillo que contiene una disolución de lavado al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la disolución de lavado en el cono de pipeta;
* aplicando una segunda fase de captura sobre una pared interna del cono de pipeta:
* aplicando el primer campo magnético al cono de pipeta
* aplicando al menos un ciclo de aspiración y de expulsión de la mezcla contenida en el cono de pipeta en el pocillo que contiene la disolución de lavado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la liberación de las partículas capturadas comprende una fase de aplicación de los ciclos a fin de realizar un movimiento de ida y vuelta de un menisco de dicha disolución sobre un sedimento de partículas capturadas en el cono de pipeta, realizándose dicho movimiento de ida y vuelta de dicho menisco sobre una porción del cono inferior a la longitud total del cono de pipeta.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la liberación de las partículas capturadas comprende una segunda fase de aplicación de los ciclos a fin de aspirar y expulsar totalmente la disolución de lavado del cono.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la frecuencia de aplicación de los ciclos de la segunda fase es inferior a la frecuencia de aplicación de los ciclos de la primera fase.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que previamente a la liberación de las partículas capturadas, se realizan al menos dos fases de lavado en dos disoluciones de lavado distintas.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los componentes contenidos en la muestra biológica son unos ácidos nucleicos.
ES16801505T 2016-05-03 2016-11-25 Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida Active ES2862393T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16168001.2A EP3241901B1 (fr) 2016-05-03 2016-05-03 Procede et systeme extraction magnetique de composants dans un echantillon liquide
EP16180724 2016-07-22
PCT/EP2016/078905 WO2017190816A1 (fr) 2016-05-03 2016-11-25 Procede et systeme extraction magnetique de composants dans un echantillon liquide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2862393T3 true ES2862393T3 (es) 2021-10-07

Family

ID=57396464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16801505T Active ES2862393T3 (es) 2016-05-03 2016-11-25 Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11572553B2 (es)
EP (1) EP3452589B1 (es)
JP (2) JP6861222B2 (es)
KR (1) KR102691492B1 (es)
CN (1) CN109072230B (es)
CA (1) CA3023112C (es)
ES (1) ES2862393T3 (es)
RU (1) RU2721121C1 (es)
WO (1) WO2017190816A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11480565B2 (en) * 2020-06-12 2022-10-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Automated immunoassay
CN118556181A (zh) * 2022-01-18 2024-08-27 生物梅里埃公司 用于磁性提取样本中组分的模块

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US20030012699A1 (en) * 1998-11-18 2003-01-16 Thomas Moore Simultaneous handling of magnetic beads in a two-dimensional arrangement
JP4045475B2 (ja) * 1999-09-06 2008-02-13 東洋紡績株式会社 核酸・蛋白質精製装置
FR2826882B1 (fr) * 2001-07-09 2003-09-12 Bio Merieux Procede de traitement de particules magnetiques et configurations d'aimants permettant la mise en oeuvre de ce procede
JP2003149255A (ja) * 2001-11-15 2003-05-21 Toyobo Co Ltd 直交座標および円筒座標に移動可能な分注装置
US20050239091A1 (en) 2004-04-23 2005-10-27 Collis Matthew P Extraction of nucleic acids using small diameter magnetically-responsive particles
EP1753536B1 (de) 2004-05-10 2008-03-12 Bernd Steinbrenner Vorrichtung zur aufnahme und abgabe von flüssigkeiten
EP1621890A1 (en) * 2004-07-26 2006-02-01 bioMerieux B.V. Device and method for separating, mixing and concentrating magnetic particles with a fluid and use thereof in purification methods
GB2425498A (en) 2005-04-25 2006-11-01 Dynal Biotech Asa A magnetic separation device
DE102005053463A1 (de) * 2005-11-06 2007-05-10 Aj Innuscreen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien
TWI415770B (zh) 2006-01-13 2013-11-21 Universal Bio Research Co Ltd 變形式分注管、變形式分注裝置及變形式分注處理方法
EP1992689B1 (en) * 2006-02-15 2015-03-18 Tosoh Corporation Method for extraction of nucleic acid from biological material
US7998708B2 (en) * 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US7662343B2 (en) 2006-10-24 2010-02-16 Viaflo Corporation Locking pipette tip and mounting shaft
EP2110670A4 (en) * 2007-02-07 2013-03-06 Universal Bio Research Co Ltd DEVICE FOR PARALLEL PROCESSING MAGNETIC PARTICLES WITH MULTIPLE CONTAINER AND METHOD FOR PARALLEL PROCESSING MAGNETIC PARTICLES WITH MULTI-USE CONTAINER
JP2008220260A (ja) 2007-03-13 2008-09-25 Hitachi Metals Ltd 磁性粒子の磁気分離方法
US7540205B2 (en) 2007-09-17 2009-06-02 Viaflo Corp. Electronic pipettor
US8033188B2 (en) 2007-09-17 2011-10-11 Integra Biosciences Corp. Pipettor software interface
US8277757B2 (en) * 2009-09-29 2012-10-02 Integra Biosciences Corp. Pipette tip mounting shaft
WO2011136624A2 (ko) 2010-04-30 2011-11-03 (주)바이오니아 자기장 인가부를 구비한 생물학적 시료 자동정제장치, 생물학적 시료로부터 타겟물질을 추출하는 방법, 그리고 단백질 발현 및 정제 방법
CN102417902A (zh) * 2011-09-16 2012-04-18 广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心 磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒及其提取核酸方法
JP2012152213A (ja) 2012-02-14 2012-08-16 Tamagawa Seiki Co Ltd 液体中の磁性粒子の集合／分散装置
FR2997703B1 (fr) * 2012-11-07 2016-12-30 Biomerieux Sa Procede de traitement d'au moins un echantillon biologique
FR2999012B1 (fr) * 2012-11-30 2017-12-15 Primadiag S A S Module d'attraction magnetique, robot comprenant un tel module, et procede d'utilisation sur billes magnetiques d'un tel module ou d'un tel robot

Also Published As

Publication number Publication date
CA3023112A1 (fr) 2017-11-09
EP3452589B1 (fr) 2021-01-06
US20190316114A1 (en) 2019-10-17
JP2021063811A (ja) 2021-04-22
RU2721121C1 (ru) 2020-05-18
KR20190003728A (ko) 2019-01-09
US20210115433A1 (en) 2021-04-22
US11572553B2 (en) 2023-02-07
CA3023112C (fr) 2023-03-21
US11584926B2 (en) 2023-02-21
JP7482005B2 (ja) 2024-05-13
JP6861222B2 (ja) 2021-04-21
EP3452589A1 (fr) 2019-03-13
CN109072230A (zh) 2018-12-21
JP2019516369A (ja) 2019-06-20
WO2017190816A1 (fr) 2017-11-09
CN109072230B (zh) 2023-07-21
KR102691492B1 (ko) 2024-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5292267B2 (ja) 試料処理装置、試料処理方法及びこれらに使用する反応容器
ES2625468T3 (es) Dispositivo y método para separar, mezclar y concentrar partículas magnéticas con un fluido y uso del mismo en métodos de purificación
US20110009608A1 (en) Automatic refining apparatus, multi-well plate kit and method for extracting hexane from biological samples
US8062846B2 (en) Apparatus for isolating a nucleic acid from a sample
JP3676754B2 (ja) 試料からｄｎａ又はｒｎａを収集するために流体試料内の磁気応答粒子を操作するための装置及び方法
EP2871460B1 (en) Kit for nucleic acid extraction, and nucleic acid extractor
JP2001070827A (ja) 核酸・蛋白質精製装置
CN103923163B (zh) 用于生物活性物质提取仪的工作台系统和方法
JPH08320274A (ja) 分注機を利用した液体処理方法およびその装置
JP2011234671A (ja) 核酸抽出装置
WO2014073218A1 (en) A method of manipulating solid carriers and an apparatus of manipulating solid carriers
ES2862393T3 (es) Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida
ES2746567T3 (es) Procedimiento y sistema de extracción magnética de componentes en una muestra líquida
JP5599488B2 (ja) 試料処理方法
ES2975426T3 (es) Método y aparato para manipular cuentas magnéticas
CN121889214A (zh) 用于处理微粒的方法和装置