ES2749211T3 - Variantes de glucoamilasa - Google Patents
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Abstract
Variante de una enzima glucoamilasa (GA) original, donde la variante difiere de la enzima original en que tiene una o una combinación de sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) 470 seleccionadas del grupo que consiste en: K, S, A, C, E, F, G, I, L, M, N, Q, R, V y W; y/o (b) 468 seleccionadas del grupo que consiste en: A, E, D, G, H, I, 5 K, L, M, N, P, Q, R, T y W; y/o (c) 466 seleccionadas del grupo que consiste en: D, K, M, R, Y, C, P, T, W, A, E, F, H, L, N, S, I, V y Q; y (d) 472 seleccionadas de entre el grupo que consiste en: R, D, I, M, Q, S y Y, donde la posición de cada sustitución de aminoácido se corresponde con la SEQ ID NO:3, y donde la variante de GA tiene una actividad de hidrólisis del almidón; presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4; y presenta al menos una propiedad mejorada con respecto a la enzima GA original seleccionada de entre: (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión, con la condición de que la variante no sea la SEQ ID NO: 737 del documento WO 2013/181760 A1.
Description
DESCRIPCIÓN
Variantes de glucoamilasa
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] La presente solicitud reivindica prioridad y las ventajas de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/911,760, presentada el 4 de diciembre de 2013.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] La presente exposición se refiere en general a variantes de enzimas amilasas, en concreto variantes de glucoamilasa (GA). También se describen los ácidos nucleicos que codifican las variantes de GA, las composiciones que incluyen las variantes de GA, los métodos para producir las variantes de GA, y los métodos de utilización de las variantes de GA.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] Las fermentaciones industriales utilizan, mayormente, glucosa como materia prima para la producción de una multitud de proteínas, enzimas, alcoholes y otros productos químicos finales. Normalmente, la glucosa es el producto del procesamiento de almidón, que es, de manera tradicional, un proceso enzimático de dos etapas que cataliza la ruptura del almidón, que implica la licuefacción y la sacarificación. Durante la licuefacción, el almidón granular insoluble se suspende en agua, se gelatiniza con calor y se hidroliza mediante una alfa-amilasa termoestable. Durante la sacarificación, las dextrinas solubles producidas en la licuefacción se hidrolizan de manera adicional mediante glucoamilasas, produciendo un jarabe con un nivel elevado de glucosa que contiene más de un 95 % de glucosa.
[0004] Las glucoamilasas son carbohidrasas que actúan en exo, capaces de hidrolizar los enlaces glucosídicos lineares y ramificados del almidón (por ejemplo, amilosa y amilopectina) para producir azúcares fermentables a partir del almidón (por ejemplo, un sustrato de almidón licuado por enzimas). Los azúcares fermentables, por ejemplo, los azúcares de bajo peso molecular, tales como glucosa, pueden, a continuación, convertirse en fructosa mediante otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa); cristalizarse; o utilizarse en fermentaciones para producir numerosos productos finales (p. ej., alcoholes, glutamato monosódico, ácido succínico, vitaminas, aminoácidos, 1,3-propanodiol y ácido láctico).
[0005] En vista del papel central de las glucoamilasas en la generación de glucosa a partir de almidón, sería ventajoso en la técnica proporcionar variantes de glucoamilasas (GA) con propiedades mejoradas para esta conversión. Algunos ejemplos de propiedades mejoradas de las variantes de GA incluyen, pero sin carácter limitativo: solubilidad, actividad hidrolítica, termoestabilidad, actividad del pH, estabilidad del pH, actividad de productos de reversión reducida, y estabilidad química.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0006] La presente invención proporciona una variante de una enzima glucoamilasa original tal como se expone en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona polinucleótidos, vectores, células hospedadoras, métodos, composiciones, y sobrenadantes de cultivos celulares, todo ello expuesto en las reivindicaciones. La presente exposición también presenta («proporciona») un número de otros aspectos y modos de realización tal como se describe a continuación en el presente documento que pueden facilitar la comprensión de la presente invención, que está definida por las reivindicaciones.
[0007] La presente exposición describe variantes de enzimas glucoamilasas (GA) aisladas que presentan una actividad de hidrólisis del almidón, ácidos nucleicos que codifican tales enzimas GA, células hospedadoras que contienen polinucleótidos que codifican enzimas g A (por ejemplo, células hospedadoras que expresan las enzimas GA), composiciones que contienen la enzima GA y métodos para producir y utilizar las mismas.
[0008] Por consiguiente, los aspectos de la presente exposición proporcionan variantes de una enzima GA original, donde la variante tiene una actividad de hidrólisis del almidón; presenta al menos un 60 % (por ejemplo, al menos un 80 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4; y presenta al menos una propiedad mejorada con respecto a la enzima GA original seleccionada de entre: (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión.
[0009] En determinados modos de realización, la variante de GA tiene al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos 8, al menos 9 o más propiedades mejoradas (seleccionadas de la lista anterior) en comparación con la enzima GA original.
[0010] En determinados modos de realización, una variante de GA tiene una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos, en comparación con la GA original, mientras que en otros modos de realización, la variante de GA es una variante combinatoria que presenta más de una sustitución, deleción o inserción de aminoácido en
comparación con la GA original. Una variante de GA combinatoria puede tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más sustituciones, deleciones y/o inserciones.
[0011] En determinados modos de realización, una variante de GA tiene pocas mutaciones, donde «pocas» hace referencia a de 1 a 10 mutaciones (por ejemplo, de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con una enzima GA original).
[0012] En determinados modos de realización, una variante de GA presenta una o más sustituciones altamente combinables que pertenecen al Grupo A tal como se define en el presente documento (véanse la sección de Ejemplos a continuación).
[0013] En determinados modos de realización, una variante de GA presenta una o más sustituciones altamente combinables que pertenecen al Grupo B tal como se define en el presente documento, donde la variante puede presentar además una o más sustituciones de aminoácidos que pertenecen al Grupo A.
[0014] En determinados modos de realización, una variante de GA presenta una o más sustituciones altamente combinables que pertenecen al Grupo C tal como se define en el presente documento, donde la variante puede presentar además una o más sustituciones de aminoácidos que pertenecen al Grupo A o al Grupo B.
[0015] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta una sustitución de aminoácido en al menos un sitio que presenta una puntuación de productividad de 4 tal como se define en el presente documento (véase la sección de Ejemplos a continuación y la Tabla 8).
[0016] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta una sustitución de aminoácido en al menos un sitio que presenta una puntuación de productividad de 3, donde la variante puede presentar además una sustitución adicional en un sitio que tenga una puntuación de productividad de 4.
[0017] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta una sustitución de aminoácido en al menos un sitio que presenta una puntuación de productividad de 2, donde la variante puede presentar además una sustitución adicional en un sitio que tenga una puntuación de productividad de 3 o 4.
[0018] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta una sustitución de aminoácido en al menos un sitio que presenta una puntuación de productividad de 1, donde la variante puede presentar además una sustitución adicional en un sitio que tenga una puntuación de productividad de 2 o 3 o 4.
[0019] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácido que tiene una puntuación de idoneidad de variante de ++++ tal como se define en el presente documento (véase la sección de Ejemplos a continuación y la Tabla 8).
[0020] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácido que tiene una puntuación de idoneidad de variante de +++, donde la variante puede presentar además al menos una sustitución adicional que tenga una puntuación de idoneidad de variante de ++++.
[0021] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácido que tiene una puntuación de idoneidad de variante de ++, donde la variante puede presentar además al menos una sustitución adicional que tenga una puntuación de idoneidad de variante de +++ o ++++.
[0022] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácido que tiene una puntuación de idoneidad de variante de +, donde la variante puede presentar además al menos una sustitución adicional que tenga una puntuación de idoneidad de variante de ++ o +++ o ++++.
[0023] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácido que tiene una puntuación de idoneidad de variante de , donde la variante puede presentar además al menos una sustitución adicional que tenga una puntuación de idoneidad de variante de + o ++ o +++ o ++++.
[0024] En determinados modos de realización, la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácido que pertenece a una de las categorías de puntuación de productividad específica/puntuación de idoneidad de variante de A a T tal como se expone a continuación en la Tabla 1:
Tabla 1: Categorías de variantes de GA
[0025] Las posición de aminoácido específica y las sustituciones para cada categoría pueden identificarse en la Tabla 8 del Ejemplo 3 del presente documento. Por ejemplo, una variante de GA puede tener al menos una sustitución o una combinación de sustituciones (es decir, una variante de GA combinatoria) seleccionadas de las siguientes, cada una de las cuales pertenece a la categoría A (la numeración de los aminoácidos se basa en la forma madura de la HgGA mostrada en la SEQ ID NO:3; cabe destacar que se contemplan las posiciones correspondientes en GA de otros organismos, tal como se expondrá a continuación con más detalle): K41E;
P60Q; L97C, H, I o N; N100A, L o R; T107C, D, E, M o N; T245F o W; L300A, C, D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V,W o Y; R308V; K334A, E, F, R o Y; S342K, M, P, R o V; Y364H, I, L, M, N, S o V; G374A o Y; S402F, K o M;
T406E; N410A o D; G466Q; L467A, F, S o V; V468D, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T o W; P470A, C, E, F, G, I, L, M, N, Q, R, V o W; S471A, H, I, N o V; V476I o W; A477V; Q480F; S483H o L; T484F, L o S; K505H o P; Q506C;
A522C o D; T544R; G587R; T599Q o S; N600K; y T604F, G o L.
[0026] Entre los ejemplos de variantes de GA expuestos en el presente documento se incluyen, pero sin carácter limitativo, los siguientes:
1. Una variante de una enzima GA original, donde la variante de GA presenta una actividad de hidrólisis del almidón; presenta al menos un 60 % (por ejemplo, al menos un 80 %) de identidad de secuencia con los aminoácidos de la SEQ ID NO:4; y presenta al menos una propiedad mejorada con respecto a la enzima GA original seleccionada de entre: (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión; donde la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: T35, K41, P60, L97, N100, T107, A175, K183, E229, T245, G263, P293, E294, N299, L300, R308, K334, S342, Y364, I367, V369, Q373, G374, S382, V393, S394, T397, K400, S402, T406, N407, V409, N410, A411, A414, 1461, G466, L467, V468, P469, P470, S471, V476, A477, K478, S479, Q480, S483, T484, P503, K505, Q506, A522, T544, N556, G587, A589, T599, N600, T604, S607, P609, A31, I37, N46, K57, D85, L105, K171, K179, S184, P213, A221, T239, Q250, L252, N260, S261, K262, N264, E274, A295, A325, K328, A366, Y368, N371, K372, I376, S380, V381, P384, R387, V390, S391, T395, G396, S399, S401, S403, F405, I408, A448, D462, W472, S475, S486, A491, S511, S515, A524, V537, S538, A540, W541, G542, V551, P552, K561, A562, T564, L565, N573, A585, V590, Q591, V597, G601, 1603, D608, 1613, T614, S620, S632, A32, V33, N38, T39, T74, H99, T104, N111, K118, Q121, 1164, Q168, 1174, G177, S180, T181, V190, K191, A198, L227, L233, Q236, D238, E240, A243, A248, V251, Q255, Y275, N290, F291, D292, G296, D298, T301, F302, A311, A315, S319, G329, A331, Q332, V345, A360, D365, W370, T379, F386, L389, S392, Y398, K413, A416, D417, S429, A434, K443, A460, R463, R464, A465, R473, L481, T493, S499, S501, V531, R536, V548, N550, A553, L554, G555, D558, T559, S560, S572, D574, S578, K584, S588, I595, K596, K602, W605, E606, R611, S612, S619, V629, D34, P42, I43, K47, A50, N55, A58, A62, A64, I68, S72, R73, D75, P77, T83, L90, S96, G98, Y101, T103, 1109, Q110, V113, S115, V122, S123, S126, T128, F129, A146, T148, E150, A165, L166, Y169, A170, A182, V185, P188, L194, T197, F206, F218, S222, H224, A226, Y232, L237, P249, Q256, A257, F258, W259, Y265, V267, S268, G272, G273, S277, D280, A281, I284, A286, S287, Q303, S306, E307, H313, Y316, D318, N322, V336, A337, N348, A355, N356, A359, L363, S375, T377, V378, L383, F385, D388, T404, E421, V422, A424, K425, Y426, A432, N440, S446, T451, F457, R487, I488, V495, A496, A497, F502, S504, A513, P516, P520, T521, S527, V529, T532, N534, E535, T539, E543, I545, V547, G549, K571, L576, I579, I583, T586, Y592, Y594, G622, Q627, T628, N630, y D631, donde la posición de cada sustitución de aminoácido corresponde a la SEQ ID NO:3.
2. La variante de GA tal como se ha expuesto en el punto 1 anterior donde la al menos una sustitución de aminoácido se selecciona de la Tabla 8.
3. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 y 2 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T35 seleccionada del grupo que consiste en: A, P, C, F, K, L, Q, R, W, Y y H.
4. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 3 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K41 seleccionada del grupo que consiste en: C, S, T, W, D, H, L, N, P, R y E.
5. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 4 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P60 seleccionada del grupo que consiste en: V, G, H, M, R, I, W, F, T y Q.
6. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 5 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L97 seleccionada del grupo que consiste en: A, G, Q, E, T, V, F, C, H, I y N.
7. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 6 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N100 seleccionada del grupo que consiste en: P, E, V, C, I, M, Q, T, F, G, K, S, W, Y, A, L y R.
8. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 7 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T107 seleccionada del grupo que consiste en: A, W, Y, H, G, I, S, V, K, C, D, E, M y N.
9. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 8 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A175 seleccionada del grupo que consiste en: F, E, H, K, M, N, Q, R, S, T, V y C.
10. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 9 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K183 seleccionada del grupo que consiste en: H, E, I, Q, R, V, Y, D, F, T y W.
11. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 10 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E229 seleccionada del grupo que consiste en: A, D, G, M, T, W, I, L, Y, C, F, K y V.
12. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 11 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T245 seleccionada del grupo que consiste en: L, C, I, R, H, M, Q, S, V, Y, F y W.
13. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G263 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, E, H, L, Q, R, S, T y Y.
14. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 13 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P293 seleccionada del grupo que consiste en: T, A, C, E, F, G, H, L, R, S, Y y Q.
15. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 14 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E294 seleccionada del grupo que consiste en: D, G, I, K, L, M, N, S, V, W, A y C.
16. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 15 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N299 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, E, G, L, Q, T, V, P, R y S.
17. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 16 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L300 seleccionada del grupo que consiste en: I, K, N, A, C, D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V, W y Y.
18. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 17 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R308 seleccionada del grupo que consiste en: I, F, L, A, D, E, G, H, K, M, Q, T, W y V.
19. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 18 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K334 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, I, L, T, W, D, V, A, E, F, R y Y.
20. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 19 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S342 seleccionada del grupo que consiste en: G, L, T, W, Y, C, E, F, N, Q, K, M, P, R y V.
21. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 20 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y364 seleccionada del grupo que consiste en: E, R, W, G, Q, H, I, L, M, N, S y V.
22. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 21 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I367 seleccionada del grupo que consiste en: G, E, F, K, L, M, S, V, W y Y.
23. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 22 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V369 seleccionada del grupo que consiste en: F, Q, C, I, K, L, N, S, T, Y, A, E, G y M.
24. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q373 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, F, G, L, N, R, S, T, C, H, K y V.
25. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 24 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G374 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, F, K, R, T, V, W, C, L, M, P, S, A y Y.
26. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 25 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S382 seleccionada del grupo que consiste en: D, H, C, P, Q, E, G, N, T y V.
27. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 26 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V393 seleccionada del grupo que consiste en: A, W, E, G, T, Y, F, H, I, L y N.
28. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 27 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S394 seleccionada del grupo que consiste en: F, G, H, I, N, A, C, D, L, M, P y Y.
29. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 28 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T397 seleccionada del grupo que consiste en: A, G, F, L, Q, V, W, Y, K y R.
30. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 29 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K400 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P.
31. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 30 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S402 seleccionada del grupo que consiste en: D, I, N, P, T, W, R, F, K y M.
32. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 31 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T406 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P.
33. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 32 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N407 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P.
34. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V409 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P.
35. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 34 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N410 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P.
36. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 35 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A411 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P.
37. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 36 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A414 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P.
38. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 37 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición 1461 seleccionada del grupo que consiste en: C, F, G, K, M, S, T, V, Y, N, Q y R.
39. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 38 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G466 seleccionada del grupo que consiste en: D, K, M, R, Y, C, P, T, W, A, E, F, H, L, N, S, I, V y Q.
40. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 39 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L467 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, Q, T, W, D, H, N, Y, A, F, S y V.
41. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 40 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V468 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, D, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T y W.
42. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 41 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P469 seleccionada del grupo que consiste en: R, C, H, T, V, G, N, S, E, I, Q y W.
43. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 42 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P470 seleccionada del grupo que consiste en: K, S, A, C, E, F, G, I, L, M, N, Q, R, V y W.
44. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 43 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S471 seleccionada del grupo que consiste en: D, C, M, E, G, P, Q, L, A, H, I, N y V.
45. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 44 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V476 seleccionada del grupo que consiste en: A, D, E, G, H, N, S, L, M, P, Q, Y, R, T, I y W.
46. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 45 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A477 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, I, K, Q, R, M, W, S y V.
47. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 46 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K478 seleccionada del grupo que consiste en: E, I, P, R, S, T, Y, F, Q y V.
48. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 47 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S479 seleccionada del grupo que consiste en: A, G, L, M, N, Q, R, T, Y, F, I y K.
49. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 48 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q480 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, D, T, V, H, I, L, M y F.
50. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 49 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S483 seleccionada del grupo que consiste en: F, P, W, Y, A, I, K, N, R, T, H y L.
51. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 50 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T484 seleccionada del grupo que consiste en: I, M, V, K, P, Q, Y, F, L y S.
52. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 51 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P503 seleccionada del grupo que consiste en: A, D, F, G, L, M, N, Q, R, S, T, V y Y.
53. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 52 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K505 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, G, N, T, M, S, V, H y P.
54. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 53 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q506 seleccionada del grupo que consiste en: A, F, L, N, P, S, E, M, T, V, Y y C.
55. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 54 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A522 seleccionada del grupo que consiste en: E, P, N, T, V, Y, L, R, K, C y D.
56. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 55 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T544 seleccionada del grupo que consiste en: P, A, I, L, M, N, S, Y, G, K, V y R.
57. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 56 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N556 seleccionada del grupo que consiste en: P, A, G, H, I, M, S, T, W, D, E, L, V y Y.
58. La variante de GAtal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 57 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G587 seleccionada del grupo que consiste en: D, F, I, N, Q, T, Y, C, P, L y R.
59. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 58 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A589 seleccionada del grupo que consiste en: C, D, K, L, M, R, E, Q, T y V.
60. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 59 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T599 seleccionada del grupo que consiste en: M, C, E, R, D, K, L, V, Y, A, F, P, Q y S.
61. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 60 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N600 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, M, Q, R, W, Y, P, V y K.
62. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 61 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T604 seleccionada del grupo que consiste en: K, M, S, Y, A, D, H, I, Q, R, F, G y L.
63. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 62 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S607 seleccionada del grupo que consiste en: W, L, Y, G, I, Q, V, A, H, M y N.
64. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 63 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P609 seleccionada del grupo que consiste en: K, L, N, Q, R, T, V, Y, A, G y W.
65. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 64 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A31 seleccionada del grupo que consiste en: I, T, Y, F, L y Q. 66. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 65 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I37 seleccionada del grupo que consiste en: G, M, A, S, C y T.
67. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 66 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N46 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, P, V, C y S.
68. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 67 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K57 seleccionada del grupo que consiste en: E, S, A, C, I, V, T, Q y R.
69. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 68 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D85 seleccionada del grupo que consiste en: N, Y, L, S, C, G, M, E y V.
70. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 69 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L105 seleccionada del grupo que consiste en: M, R, T, I, F y Y.
71. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 70 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K171 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, H, R, V y W.
72. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 71 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K179 seleccionada del grupo que consiste en: D, P, H, L, Q, R y W.
73. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 72 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S184 seleccionada del grupo que consiste en: A, I, M, L, C, F, V y R.
74. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 73 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P213 seleccionada del grupo que consiste en: A, M, N, H, Q y R.
75. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 74 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A221 seleccionada del grupo que consiste en: M, R, S, I, L y T.
76. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 75 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T239 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, F, M, V, I y R.
77. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 76 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q250 seleccionada del grupo que consiste en: D, F, H, M, Y y E.
78. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 77 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L252 seleccionada del grupo que consiste en: H, A, I, N, S, M y V.
79. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 78 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N260 seleccionada del grupo que consiste en: C, H, R, T, F, S y W.
80. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 79 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S261 seleccionada del grupo que consiste en: E, F, K, T, W y Y.
81. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 80 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K262 seleccionada del grupo que consiste en: H, M, P, R, V, W y C.
82. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 81 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N264 seleccionada del grupo que consiste en: A, F, P, Q, V y E.
83. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 82 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E274 seleccionada del grupo que consiste en: V, D, I, L, Q y F.
84. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 83 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A295 seleccionada del grupo que consiste en: F, G, V, W, Y, D y N.
85. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 84 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A325 seleccionada del grupo que consiste en: E, C, F, L, P y Q.
86. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 85 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K328 seleccionada del grupo que consiste en: C, L, Q, W, E, F y R.
87. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 86 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A366 seleccionada del grupo que consiste en: Q, C, M, V, G, S y T.
88. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y368 seleccionada del grupo que consiste en: E, H, K, T, W y M.
89. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 88 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N371 seleccionada del grupo que consiste en: C, L, M, D, Q, R, Y y A.
90. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 89 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K372 seleccionada del grupo que consiste en: C, D, F, S, L, N y Q.
91. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 90 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I376 seleccionada del grupo que consiste en: C, T, V, Y, A, F, L y M.
92. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 91 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S380 seleccionada del grupo que consiste en: A, F, K, L, Q, R, W y Y.
93. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 92 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V381 seleccionada del grupo que consiste en: F, G, K, M, N, S, A, C y Q.
94. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 93 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P384 seleccionada del grupo que consiste en: D, F, S, Y, E, T y V.
95. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 94 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R387 seleccionada del grupo que consiste en: C, I, Q, Y, G, L y K.
96. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 95 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V390 seleccionada del grupo que consiste en: H, I, K, Y, F, L y R.
97. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 96 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S391 seleccionada del grupo que consiste en: N, H, L, F, I y R.
98. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 97 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T395 seleccionada del grupo que consiste en: K, Q, R, V, Y, F y L.
99. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G396 seleccionada del grupo que consiste en: E, L, Q, R, Ky V.
100. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 99 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S399 seleccionada del grupo que consiste en: Q, T, R, W, K y C.
101. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 100 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S401 seleccionada del grupo que consiste en: H, T, A, Y, P y Q.
102. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 101 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S403 seleccionada del grupo que consiste en: I, P, W, Y, A y V.
103. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 102 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F405 seleccionada del grupo que consiste en: A, H, W, Y, N y S.
104. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 103 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I408 seleccionada del grupo que consiste en: Q, A, T, V, S y Y.
105. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 104 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A448 seleccionada del grupo que consiste en: F, P, T, N, I y Q.
106. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 105 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D462 seleccionada del grupo que consiste en: H, A, E, F, I, L, S, M y T.
107. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 106 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición W472 seleccionada del grupo que consiste en: R, D, I, M, Q, S y Y.
108. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 107 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S475 seleccionada del grupo que consiste en: K, N, Q, E, F, I, R y L.
109. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 108 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S486 seleccionada del grupo que consiste en: V, T, Y, D, G, K, L, I y M.
110. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 109 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A491 seleccionada del grupo que consiste en: H, I, L, M, Y, K, R y V.
111. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 110 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S511 seleccionada del grupo que consiste en: I, W, H, K, L y N.
112. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S515 seleccionada del grupo que consiste en: D, M, N, T, A, I, K y V.
113. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 112 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A524 seleccionada del grupo que consiste en: F, L, N, Q, R, T, W, S y Y.
114. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 113 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V537 seleccionada del grupo que consiste en: M, T, A, C, K y R.
115. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 114 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S538 seleccionada del grupo que consiste en: G, A, C, K, Q, R, T y F.
116. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 115 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A540 seleccionada del grupo que consiste en: Y, E, F, L, T, V, W y M.
117. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 116 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición W541 seleccionada del grupo que consiste en: A, I, L, R, V y Y.
118. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 117 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G542 seleccionada del grupo que consiste en: D, A, M, N, K y R.
119. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 118 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V551 seleccionada del grupo que consiste en: S, N, F, K, L, Q y Y.
120. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 119 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P552 seleccionada del grupo que consiste en: A, G, I, K, M, N, Y y R.
121. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 120 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K561 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, G, I, L, N, P, Q y R.
122. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 121 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A562 seleccionada del grupo que consiste en: I, K, L, Y, C, G, V y S.
123. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 122 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T564 seleccionada del grupo que consiste en: N, L, M, S, K y R.
124. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L565 seleccionada del grupo que consiste en: E, H, M, Q, S, T y V.
125. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 124 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N573 seleccionada del grupo que consiste en: G, E, F, H, I, Y y A.
126. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 125 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A585 seleccionada del grupo que consiste en: D, F, S, T, W, Y y N.
127. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 126 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V590 seleccionada del grupo que consiste en: W, A, G, P, S, I y L.
128. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 127 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q591 seleccionada del grupo que consiste en: L, Y, C, R, P, S y T.
129. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 128 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V597 seleccionada del grupo que consiste en: R, L, M, Q, S, W, F y K.
130. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 129 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G601 seleccionada del grupo que consiste en: E, I, R, A, H, N, P, Q y M.
131. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 130 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I603 seleccionada del grupo que consiste en: Q, T, Y, A, K, F, L, N y P.
132. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 131 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D608 seleccionada del grupo que consiste en: L, P, R, T, E, F y I.
133. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 132 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición 1613 seleccionada del grupo que consiste en: A, F, L, S, T y V.
134. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T614 seleccionada del grupo que consiste en: L, M, Q, V, Y y S.
135. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 134 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S620 seleccionada del grupo que consiste en: D, M, Q, E, H, P y R.
136. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 135 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S632 seleccionada del grupo que consiste en: L, C, D, E, G y T.
137. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 136 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A32 seleccionada del grupo que consiste en: S, T, E y Q.
138. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 137 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V33 seleccionada del grupo que consiste en: L, P y I.
139. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 138 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N38 seleccionada del grupo que consiste en: G, F, H, K y I.
140. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 139 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T39 seleccionada del grupo que consiste en: E, K, L y Q.
141. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 140 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T74 seleccionada del grupo que consiste en: D, I, K y V.
142. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 141 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición H99 seleccionada del grupo que consiste en: G, A, M, V y Y.
143. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 142 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T104 seleccionada del grupo que consiste en: V, D y E.
144. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 143 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N111 seleccionada del grupo que consiste en: F, M, D, Q y H.
145. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 144 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K118 seleccionada del grupo que consiste en: M, L, F y Y.
146. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q121 seleccionada del grupo que consiste en: V, L y T.
147. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 146 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición 1164 seleccionada del grupo que consiste en: K, V y A.
148. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 147 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q168 seleccionada del grupo que consiste en: H, A, L y Y.
149. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 148 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición 1174 seleccionada del grupo que consiste en: V, F y Y.
150. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 149 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G177 seleccionada del grupo que consiste en: D, H, K y S.
151. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 150 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S180 seleccionada del grupo que consiste en: A, C y F.
152. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 151 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T181 seleccionada del grupo que consiste en: A, S y W.
153. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 152 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V190 seleccionada del grupo que consiste en: A, I, M y L.
154. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 153 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K191 seleccionada del grupo que consiste en: V, W y R.
155. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 154 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A198 seleccionada del grupo que consiste en: Y, C, G y S.
156. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 155 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L227 seleccionada del grupo que consiste en: A, C y I.
157. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 156 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L233 seleccionada del grupo que consiste en: T, V y M.
158. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q236 seleccionada del grupo que consiste en: W, F, D, N y Y.
159. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 158 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D238 seleccionada del grupo que consiste en: L, Q y R.
160. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 159 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E240 seleccionada del grupo que consiste en: Q, W y P.
161. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 160 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A243 seleccionada del grupo que consiste en: G, H, R y P.
162. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 161 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A248 seleccionada del grupo que consiste en: G, C y S.
163. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 162 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V251 seleccionada del grupo que consiste en: L, Q y R.
164. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 163 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q255 seleccionada del grupo que consiste en: E, G, L y S.
165. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 164 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y275 seleccionada del grupo que consiste en: E, G, L y S.
166. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 165 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N290 seleccionada del grupo que consiste en: E, I, Q y V.
167. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 166 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F291 seleccionada del grupo que consiste en: Y, L y M.
168. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 167 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D292 seleccionada del grupo que consiste en: F, C y S.
169. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G296 seleccionada del grupo que consiste en: L, P, Q y V.
170. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 169 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D298 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, I y N.
171. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 170 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T301 seleccionada del grupo que consiste en: A, I, C y L.
172. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 171 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F302 seleccionada del grupo que consiste en: G, M y W.
173. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 172 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A311 seleccionada del grupo que consiste en: R, C, G, M y V.
174. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 173 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A315 seleccionada del grupo que consiste en: G, C, E, M y Q.
175. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 174 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S319 seleccionada del grupo que consiste en: N, M y Q.
176. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 175 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G329 seleccionada del grupo que consiste en: T, C y D.
177. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 176 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A331 seleccionada del grupo que consiste en: V, K, L, R y M.
178. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 177 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q332 seleccionada del grupo que consiste en: V, W, E, L y P.
179. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 178 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V345 seleccionada del grupo que consiste en: I, Q y K.
180. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 179 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A360 seleccionada del grupo que consiste en: C, G y S.
181. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 180 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D365 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, Q y R.
182. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 181 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición W370 seleccionada del grupo que consiste en: S, T, V, F y M.
183. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 182 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T379 seleccionada del grupo que consiste en: E, H, N, Q y R.
184. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 183 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F386 seleccionada del grupo que consiste en: H, L, T, V y W.
185. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 184 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L389 seleccionada del grupo que consiste en: A, Q, S y T.
186. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 185 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S392 seleccionada del grupo que consiste en: Y, I y P.
187. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y398 seleccionada del grupo que consiste en: N, Q, F, L y H.
188. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 187 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K413 seleccionada del grupo que consiste en: T, E, F, L y R.
189. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 188 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A416 seleccionada del grupo que consiste en: C, G y S.
190. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 189 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D417 seleccionada del grupo que consiste en: N, T, E y Q.
191. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 190 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S429 seleccionada del grupo que consiste en: D, G, M, T y A.
192. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 191 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A434 seleccionada del grupo que consiste en: F, S, W y Y.
193. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 192 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K443 seleccionada del grupo que consiste en: I, M, L y H.
194. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 193 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A460 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, M y T.
195. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 194 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R463 seleccionada del grupo que consiste en: A, K y M.
196. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 195 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R464 seleccionada del grupo que consiste en: F, V, H y K.
197. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 196 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A465 seleccionada del grupo que consiste en: I, W, M, R y Y.
198. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 197 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R473 seleccionada del grupo que consiste en: T, C y M.
199. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 198 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L481 seleccionada del grupo que consiste en: F, H, R y C.
200. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 199 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T493 seleccionada del grupo que consiste en: C, S, V y Q.
201. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S499 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, H, N y M.
202. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 201 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S501 seleccionada del grupo que consiste en: V, A, I y Q.
203. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 202 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V531 seleccionada del grupo que consiste en: S, T, A y C.
204. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 203 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R536 seleccionada del grupo que consiste en: C, Q, L, Y y H.
205. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 204 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V548 seleccionada del grupo que consiste en: F, M y T.
206. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 205 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N550 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, M, S y T.
207. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 206 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A553 seleccionada del grupo que consiste en: E, K, P, Q y Y.
208. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 207 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L554 seleccionada del grupo que consiste en: M, V y T.
209. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 208 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G555 seleccionada del grupo que consiste en: K, A y H.
210. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 209 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D558 seleccionada del grupo que consiste en: F, L, Q y R.
211. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 210 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T559 seleccionada del grupo que consiste en: E, G, I y L.
212. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 211 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S560 seleccionada del grupo que consiste en: F, A, K, M y V.
213. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 212 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S572 seleccionada del grupo que consiste en: P, E, L, V y K.
214. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D574 seleccionada del grupo que consiste en: I, M, N y Y.
215. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 214 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S578 seleccionada del grupo que consiste en: F, A y C.
216. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 215 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K584 seleccionada del grupo que consiste en: F, T y V.
217. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 216 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S588 seleccionada del grupo que consiste en: H, L, P y Y.
218. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 217 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I595 seleccionada del grupo que consiste en: G, M, T y L.
219. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 218 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K596 seleccionada del grupo que consiste en: D, E y N.
220. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 219 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K602 seleccionada del grupo que consiste en: D, I, R y F.
221. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 220 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición W605 seleccionada del grupo que consiste en: T, Y y F.
222. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 221 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E606 seleccionada del grupo que consiste en: G, K y Q.
223. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 222 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R611 seleccionada del grupo que consiste en: S, N y H.
224. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 223 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S612 seleccionada del grupo que consiste en: C, E, W, F y H.
225. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 224 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S619 seleccionada del grupo que consiste en: L, E y Q.
226. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 225 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V629 seleccionada del grupo que consiste en: C, S, I, M y Q.
227. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 226 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D34 de M.
228. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 227 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P42 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q. 229. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I43 de V.
230. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 229 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K47 de R.
231. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 230 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A50 seleccionada del grupo que consiste en: D y N. 232. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 231 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N55 de D.
233. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 232 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A58 de C.
234. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 233 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A62 de H.
235. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 234 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A64 de P.
236. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 235 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I68 de V.
237. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 236 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S72 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q. 238. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 237 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R73 de M.
239. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 238 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D75 seleccionada del grupo que consiste en: H y R. 240. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 239 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P77 de D.
241. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T83 de V.
242. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 241 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L90 seleccionada del grupo que consiste en: I y P. 243. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 242 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S96 seleccionada del grupo que consiste en: A e Y. 244. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 243 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G98 seleccionada del grupo que consiste en: Y y F. 245. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 244 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y101 de F.
246. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 245 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T103 seleccionada del grupo que consiste en: Q y V.
247. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 246 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición 1109 seleccionada del grupo que consiste en: T y A.
248. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 247 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q110 seleccionada del grupo que consiste en: E y C.
249. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 248 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V113 seleccionada del grupo que consiste en: E y L.
250. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 249 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S115 de A.
251. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V122 de L.
252. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 251 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S123 seleccionada del grupo que consiste en: A y P.
253. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 252 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S126 de A.
254. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 253 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T128 de V.
255. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 254 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F129 de L.
256. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 255 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A146 de P.
257. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 256 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T148 seleccionada del grupo que consiste en: L y M.
258. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 257 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E150 seleccionada del grupo que consiste en: P y R.
259. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 258 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A165 de S.
260. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 259 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L166 seleccionada del grupo que consiste en: M y C.
261. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 260 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y169 seleccionada del grupo que consiste en: E y F.
262. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 261 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A170 seleccionada del grupo que consiste en: C e I.
263. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 262 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A182 de V.
264. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 263 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V185 seleccionada del grupo que consiste en: N y Q.
265. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P188 de K.
266. La variante de GAtal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 265 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L194 de I.
267. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 266 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T197 seleccionada del grupo que consiste en: A y G.
268. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 267 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F206 de Y.
269. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 268 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F218 de W.
270. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 269 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S222 seleccionada del grupo que consiste en: M y Q.
271. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 270 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición H224 de A.
272. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 271 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A226 de S.
273. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 272 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y232 de F.
274. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 273 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L237 de I.
275. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 274 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P249 de D.
276. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 275 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q256 de F.
277. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 276 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A257 seleccionada del grupo que consiste en: G y F.
278. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F258 de N.
279. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 278 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición W259 de Y.
280. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 279 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y265 de W.
281. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 280 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V267 seleccionada del grupo que consiste en: K y R.
282. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 281 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S268 de C.
283. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 282 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G272 de C.
284. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 283 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G273 de H.
285. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 284 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S277 de T.
286. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 285 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D280 de V.
287. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 286 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A281 de L.
288. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 287 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I284 seleccionada del grupo que consiste en: L y V. 289. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 288 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A286 seleccionada del grupo que consiste en: L y T.
290. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 289 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S287 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q.
291. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 290 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q303 de E.
292. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 291 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S306 de C.
293. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E307 seleccionada del grupo que consiste en: D y P.
294. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 293 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición H313 de Y.
295. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 294 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y316 de W.
296. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 295 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D318 de M.
297. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 296 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N322 seleccionada del grupo que consiste en: H y C.
298. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 297 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V336 seleccionada del grupo que consiste en: C y I.
299. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 298 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A337 de S.
300. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 299 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N348 de G.
301. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 300 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A355 seleccionada del grupo que consiste en: S y C.
302. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 301 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N356 de S.
303. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A359 seleccionada del grupo que consiste en: G y S.
304. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 303 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L363 seleccionada del grupo que consiste en: A y V.
305. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 304 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S375 seleccionada del grupo que consiste en: A y L.
306. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 305 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T377 seleccionada del grupo que consiste en: S y A.
307. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 306 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V378 seleccionada del grupo que consiste en: L y T.
308. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 307 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L383 seleccionada del grupo que consiste en: C y N.
309. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 308 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F385 de L.
310. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 309 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D388 seleccionada del grupo que consiste en: A y C.
311. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 310 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T404 de Q.
312. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 311 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E421 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q.
313. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 312 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V422 de F.
314. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A424 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q.
315. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 314 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K425 seleccionada del grupo que consiste en: M y R.
316. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 315 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y426 de F.
317. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 316 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A432 seleccionada del grupo que consiste en: D y S.
318. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 317 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N440 de D.
319. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 318 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S446 de G.
320. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 319 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T451 de S.
321. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 320 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F457 de A.
322. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 321 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición R487 de S.
323. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 322 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I488 de V.
324. La variante de GAtal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 323 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V495 de I.
325. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 324 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A496 de P.
326. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A497 seleccionada del grupo que consiste en: Q y S.
327. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 326 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición F502 de I.
328. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 327 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S504 de T.
329. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 328 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición A513 seleccionada del grupo que consiste en: D y G.
330. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 329 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P516 seleccionada del grupo que consiste en: E y A.
331. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 330 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición P520 de V.
332. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 331 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T521 seleccionada del grupo que consiste en: W y S.
333. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 332 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición S527 de F.
334. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 333 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V529 de W.
335. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 334 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T532 seleccionada del grupo que consiste en: W y Y.
336. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N534 seleccionada del grupo que consiste en: D y E.
337. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 336 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E535 de Q.
338. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 337 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T539 de S.
339. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 338 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición E543 seleccionada del grupo que consiste en: C y I. 340. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 339 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I545 de V.
341. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 340 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición V547 seleccionada del grupo que consiste en: A y C. 342. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 341 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G549 de A.
343. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 342 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición K571 seleccionada del grupo que consiste en: R y T. 344. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 343 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición L576 de K.
345. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 344 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I579 de M.
346. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición I583 de M.
347. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 346 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T586 seleccionada del grupo que consiste en: L y R. 348. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 347 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y592 de H.
349. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 348 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Y594 seleccionada del grupo que consiste en: M y H.
350. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 349 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición G622 seleccionada del grupo que consiste en: P y W.
351. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 350 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición Q627 seleccionada del grupo que consiste en: E y A.
352. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 351 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición T628 de L.
353. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 352 anteriores y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición N630 de C.
354. La variante de GA tal como se ha expuesto en cualquiera de los puntos 1 a 353 anteriores, y que presenta una sustitución de aminoácido en la posición D631 seleccionada del grupo que consiste en: Q, y S.
[0027] En algunos modos de realización, la GA original es una GA fúngica, por ejemplo, una GA fúngica filamentosa. En algunos modos de realización, la glucoamilasa original se obtiene de una cepa de Trichoderma (por ejemplo, T. reesei, T. longibrachiatum, T. strictipilis, T. asperellum, T. konilangbra, T. citrinoviride, T. pseudokoningii y T. hazianum), una cepa de Aspergillus (por ejemplo, A. aculeatus, A. niger, A. nidulans, A. kawachi, A. awamori, A. clavatus, A. terreus, A. fumigates, y A. orzyae), una cepa de Talaromyces (por ejemplo, T. emersonii, T. thermophilus, y T. duponti), una cepa Trametes (por ejemplo, Trametes cingulata), una cepa Hypocrea (por ejemplo, H. gelatinosa, H. orientalis, H. vinosa, H. jecorina, H. schweinitzii, y H. citrina), una cepa de Fusarium (por ejemplo, F. oxysporum, y F. roseum), una cepa de Humicola (por ejemplo, H. grisea, H. insolens y H. lanuginose), una cepa de Saccharomycopsis (por ejemplo, S. fibuligera), Scytalidium thermophilum, Podospora anderina, o sus respectivas formas homólogas anamorfas, teleomorfas u holomorfas. En
determinados modos de realización, la GA original presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, por ejemplo, al menos un 95 % de identidad de secuencia. En determinados modos de realización, la GA fúngica original es GA de Humicola grísea (HgGA, la SEQ ID NO:4 muestra la forma madura, véase la Figura 1). Los residuos de aminoácidos en una enzima GA derivada de cualquiera de los hongos filamentosos anteriores que se corresponden con los residuos de aminoácidos de la HgGA pueden determinarse utilizando algoritmos de alineamiento tal como se expone en la sección de definiciones a continuación.
[0028] En algunos modos de realización, la glucoamilasa original es una glucoamilasa bacteriana. Por ejemplo, el polipéptido puede obtenerse de una cepa bacteriana gram positiva tal como Bacillus (p. ej., B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, B. stearothermophilus, B. subtilis y B. thuringiensis) o una cepa de Streptomyces (p. ej., S. lividans).
[0029] Los aspectos de la invención objeto incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una variante de una Ga original tal como se describe en el presente documento. El polinucleótido aislado puede estar presente en un vector, por ejemplo, en un vector de expresión o un vector para la propagación del polinucleótido. El vector puede estar presente en una célula hospedadora para propagar el vector y/o que expresa la variante de GA codificada tal como se describe en el presente documento. La célula hospedadora puede ser cualquier célula que sea de utilidad en la propagación de la variante de polinucleótido de GA y/o la expresión de la variante de GA codificada, por ejemplo, una célula bacteriana, una célula fúngica, etc. Entre los ejemplos de tipos de células fúngicas adecuadas que pueden emplearse se incluyen células fúngicas filamentosas, por ejemplo, células de Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum, Penicillium, Humicola, Humicola insolens, Humicola grisea, Chrysosporium, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Gliocladium, Aspergillus, Fusarium, Neurospora, Hypocrea, Emericella, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, y Aspergillus nidulans. De manera alternativa, la célula hospedadora fúngica puede ser una célula de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cervisiae, Saccharomycopsis fibuligera, Schizzosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Kluveromyces lactus, Candida utilis, Candida albicans, Pichia stipitis, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, o Debaryomyces polymorphus. En un aspecto concreto, una célula hospedadora adecuada puede incluso ser una que sea un microorganismo etanológeno que incluye, por ejemplo, una Zymomonas mobilis o un etanológeno de levadura modificados.
[0030] Entre los aspectos de la presente invención se incluyen métodos para producir una variante de GA que incluye cultivar una célula hospedadora que contiene un polinucleótido que codifica una variante de GA en un medio de cultivo celular adecuado en condiciones adecuadas para expresar (o producir) la variante de GA a partir del polinucleótido, por ejemplo, donde el polinucleótido que codifica la variante de GA está presente en un vector de expresión (es decir, donde el polinucleótido que codifica una variante de GA está ligado de forma operativa a un promotor que conduce la expresión de la variante de GA en la célula hospedadora). En determinados modos de realización, el método incluye además aislar la variante de GA producida.
[0031] Entre los aspectos de la presente invención se incluyen también composiciones que contienen una variante de GA tal como se describe en el presente documento. Algunos ejemplos de composiciones adecuadas incluyen, pero sin carácter limitativo, composiciones que comprenden un sustrato de almidón (por ejemplo, almidón licuado de maíz, grano, trigo, tapioca, etc.) y la variante de GA.
[0032] Entre los aspectos de la presente invención se incluyen métodos para hidrolizar un sustrato de almidón que comprende poner en contacto el sustrato con una variante de GA tal como se describe en el presente documento. En determinados modos de realización, la variante de GA se proporciona como una composición libre de células, mientras que en otros modos de realización, la variante de GA se proporciona como una composición de célula hospedadora en la que la célula hospedadora expresa la variante de GA. Por tanto, determinados modos de realización de los métodos para hidrolizar un sustrato de almidón incluyen poner en contacto el sustrato con una célula hospedadora que contiene un vector de expresión de una variante de GA. El método puede ser un proceso de conversión de almidón, un proceso de fermentación de alcohol, un proceso directo de almidón a glucosa, o un proceso de fermentación y sacarificación simultáneas.
[0033] Entre los aspectos de la presente invención se incluyen composiciones de sobrenadantes de cultivos celulares que contienen una variante de GA tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un sobrenadante de un cultivo celular obtenido mediante el cultivo de una célula hospedadora que contiene un polinucleótido que codifica una variante de GA en un medio de cultivo adecuado en condiciones adecuadas para expresar la variante de GA del polinucleótido y secretar la variante de GA en el sobrenadante del cultivo celular. Dicho sobrenadante del cultivo celular puede incluir otras proteínas y/o enzimas producidas por la célula hospedadora, incluyendo proteínas y/o enzimas expresadas de manera endógena y exógena. Dicho sobrenadante del medio de cultivo puede utilizarse tal como está, con un procesamiento de postproducción mínimo o nulo, lo que puede incluir normalmente filtración para eliminar restos celulares, procedimientos para matar células, y/o ultrafiltración u otras etapas para enriquecer o concentrar las enzimas que se encuentran en el mismo. A dichos sobrenadantes se les suele hacer referencia en el presente documento como «caldos enteros» (o cualquier equivalente gramatical).
[0034] Las variantes de GA pueden producirse mediante la coexpresión con una o más de otras enzimas o productos de proteínas, por ejemplo, una alfa-amilasa. De manera alternativa, las variantes de GA pueden producirse sin otras enzimas o productos de proteínas. En este último caso, la variante de GA opcionalmente puede mezclarse físicamente con una o más de otras enzimas o productos de proteínas para formar una composición de enzimas que es útil para una aplicación concreta, por ejemplo, al hidrolizar sustrato de almidón para generar glucosa.
[0035] También se contemplan otras composiciones que contienen una variante deseada de GA, así como métodos para utilizar tales composiciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0036]
Las Figuras 1A y 1B muestran una secuencia de ADNc recombinante (línea superior) (SEQ ID NO:2) y una secuencia de aminoácidos de origen natural (línea inferior) (SEQ ID NO:3) de la glucoamilasa de Humicola grísea (HgGA) de longitud completa. La secuencia señal está subrayada.
La Figura 2 es una representación esquemática del plásmido genómico pEntry-HgGA (véase el Ejemplo 2). La Figura 3 es una representación esquemática del plásmido de ADNc optimizado sintético pEntry-HgGA utilizado para construir librerías de SEL y variantes combinatorias (véase el Ejemplo 2).
La Figura 4 es una representación esquemática del vector de destino pTTTpyrG13 utilizado con la tecnología Gateway® LR (véase el Ejemplo 2).
La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido de expresión para HgGA genómico (pTTTpyrG13-HgGA) (véase el Ejemplo 2).
La Figura 6 es una representación esquemática del plásmido de expresión para HgGA sintética optimizada (pTTTpyrG13-HgGA) (véase el Ejemplo 2).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0037] La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia utilizando solo las siguientes definiciones y ejemplos.
[0038] A menos que se definan de otra forma en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entienden habitualmente los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. Singleton, et al., Dictionary of microbiology and molecular biology, 2a Ed., John Wiley & Sons, Nueva York (2007), y Hale & Marham, t He Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto en la materia un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente exposición. Aunque en la práctica o en el ensayo de la presente invención se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, se describen los métodos y los materiales preferidos. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Salvo que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en una orientación de amino a carboxi. Se dirige a los profesionales en concreto a Green & Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012, y Ausubel FM et al., 1993, para las definiciones y términos del ámbito de especialización. Ha de entenderse que la presente invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos concretos descritos, puesto que estos pueden variar.
[0039] Los encabezamientos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modos de realización de la invención que se pueden tomar como referencia a la memoria en general. Por consiguiente, los términos que se definen inmediatamente a continuación se definen de forma más completa con referencia a la memoria en su conjunto.
I. DEFINICIONES
[0040] El término «secuencia de aminoácidos» es sinónimo de los términos «polipéptido», «proteína» y «péptido», y se utilizan indistintamente. En los casos en los que dichas secuencias de aminoácidos muestran actividad, se puede hacer referencia a estas como una «enzima». Se emplean los códigos convencionales de una letra o de tres letras para los residuos de aminoácidos, con secuencias de aminoácidos estando presentes en la orientación habitual amino-carboxi terminal (es decir, N^C).
[0041] El término «ácido nucleico» abarca ADN, ARN, heterodúplex, y moléculas sintéticas capaces de codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, y pueden presentar modificaciones químicas. Los términos «ácido nucleico» y «polinucleótido» se utilizan indistintamente. Dado que el código genético está degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto, y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos concreta. Por tanto, la presente exposición contempla todas las posibles variantes de secuencias de
nucleótidos, que codifican una variante de aminoácido o GA de la misma, las cuales son todas posibles dada la degeneración del código genético. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácido nucleico se presentan en orientación 5' a 3'.
[0042] Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos a las que se les hace referencia en el presente documento como «de origen no natural» son aquellas que no se encuentran en la naturaleza, es decir, son producto de la síntesis o manipulación humana.
[0043] «Glucoamilasa», o «GA», o «enzima GA» o «polipéptido GA», tal como se entienden en el presente documento, se definen como la clase de amiloglucosidasa de enzimas (EC 3.2.1.3, glucoamilasa, a-1, 4-D-glucano glucohidrolasa). Estas son exoenzimas que catalizan la liberación de D-glucosa desde los extremos no reductores de almidón y polisacáridos y oligosacáridos relacionados. Las enzimas también son capaces de hidrolizar enlaces a-1, 6 y a-1,3, aunque a un ritmo por lo general mucho más lento que la hidrólisis de enlaces a-1, 4.
[0044] Una «variante» de una enzima, proteína, polipéptido, ácido nucleico o polinucleótido tal como se entiende en el presente documento significa que la variante se deriva de un polipéptido original o ácido nucleico original (por ejemplo, nativo, natural u otro ácido nucleico o polipéptido original definido) que incluye al menos una modificación o alteración en comparación con la original. Por tanto, una variante puede presentar unas pocas mutaciones en comparación con una original, donde «pocas» significa de 1 a 10 mutaciones. Por ejemplo, a una variante que presenta de 1 a 10 sustituciones de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO:4 se le puede hacer referencia como una variante de HgGA que presenta unas pocas sustituciones. Las alteraciones/modificaciones pueden incluir una sustitución de un residuo de ácido nucleico/aminoácido en el original para un residuo de ácido nucleico/aminoácido diferente en uno o más sitios, la deleción de un residuo de ácido nucleico/aminoácido (o una serie de residuos de ácidos nucleicos/aminoácidos) en el original en uno o más sitios, la inserción de un residuo de ácido nucleico/aminoácido (o una serie de residuos de ácidos nucleicos/aminoácidos) en el original en uno o más sitios, el truncamiento de secuencias de aminoácidos amino y/o carboxi terminales o secuencias de ácido nucleico de 5' a 3', y cualquier combinación de los mismos. Una variante de enzima HgGA según los aspectos de la invención retiene una actividad de hidrólisis del almidón pero puede tener una propiedad alterada en algún aspecto específico, por ejemplo, una propiedad mejorada. Por ejemplo, una variante de enzima HgGA puede tener un pH óptimo alterado, una termoestabilidad mejorada, una hidrólisis mejorada de uno o más sustratos (por ejemplo, DP2 (p. ej., maltosa), DP7 (p. ej., maltohepatosa), panosa, y/o pululano) o una combinación de los mismos. En determinados modos de realización, la variante de enzima HgGA contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % a la SEQ ID NO:4, o un fragmento activo enzimáticamente de la misma.
[0045] Las «variantes combinatorias» son variantes que comprenden dos o más mutaciones, p. ej. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más sustituciones, deleciones y/o inserciones.
[0046] Una secuencia de enzimas, polipéptidos o polinucleótidos «original» o «parental» (por ejemplo, una «enzima HgGA original»), o equivalentes de los mismos, tal como se entiende en el presente documento, hace referencia a una secuencia de enzimas, polinucleótidos o polipéptidos que se utilizó como punto de partida o molde para diseñar una variante de polinucleótido, polipéptido o enzima. Nótese además que las palabras «original» o «parental» se utilizan de manera intercambiable en este contexto. Una «enzima HgGA original», tal como se entiende en el presente documento hace referencia a un polipéptido que en su forma madura comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO:4, incluyendo secuencias de aminoácidos que presentan al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %,83 %, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4 (que proporciona la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la GA natural de Humicola grísea) o una variante alélica o un fragmento de la misma que presente actividad de hidrólisis del almidón.
[0047] El término «natural» se refiere a una secuencia de ácido nucleico o polipéptidos de origen natural, es decir, uno que no incluya una variación hecha por el ser humano.
[0048] El término «heterólogo» cuando se utiliza para hacer referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran normalmente en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico normalmente se produce de manera recombinante, presentando dos o más secuencias, por ejemplo, de genes sin relación, dispuestos para hacer un ácido nucleico nuevo funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificadora de otra fuente. De manera similar, un polipéptido heterólogo normalmente hará referencia a dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, un polipéptido de fusión).
[0049] El término «recombinante», cuando se utiliza con referencia a, p. ej., una célula o ácido nucleico, polipéptido, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, polipéptido o vector se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico o polipéptido heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o polipéptido
nativos, o que la célula se deriva de una célula modificada de dicha forma. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se expresan anormalmente de otro modo, se subexpresan o no se expresan en absoluto. Una composición «recombinante» requiere la manipulación por parte de un ser humano y por tanto excluye los productos de la naturaleza.
[0050] Los términos «aislado» o «purificado» como se utilizan en el presente documento se refieren a un ácido nucleico o polinucleótido que se elimina del entorno en el que se produce de manera natural. En general, en una muestra de ácido nucleico o polipéptido purificado o aislado, el ácido(s) nucleico(s) o polipéptido(s) de interés está(n) presente(s) en una concentración relativa o absoluta incrementada en comparación con el entorno en el que se producen de manera natural. En algunos ejemplos, un ácido nucleico o polinucleótido aislado o purificado se genera de manera sintética.
[0051] El término «enriquecido» cuando describe un componente o un material de una composición (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido) significa que el componente o material está presente en una concentración relativamente aumentada en dicha composición, en comparación con la composición de partida a partir de la que se generó la composición enriquecida. Por ejemplo, una composición (o muestra) de GA enriquecida es una en la que la concentración relativa o absoluta de GA está aumentada en comparación con el producto de fermentación inicial del organismo hospedador.
[0052] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «promotor» se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de un gen en dirección 3'. El promotor será en general adecuado para la célula hospedadora en la que se está expresando el gen diana. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de traducción y transcripción (también denominadas «secuencias de control»), es necesario para expresar un gen determinado. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción incluyen, pero sin carácter limitativo, secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y de detención de la transcripción, secuencias de inicio y detención de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. Un promotor «constitutivo» es un promotor que está activo en la mayoría de condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor «inducible» es un promotor que está activo según la normativa medioambiental o de desarrollo. Un ejemplo de promotor inducible útil en la presente invención es el promotor T. reesei (H. jecorina) cbhl que está depositado en el GenBank con el Número de acceso D86235. En otro aspecto el promotor es un promotor de xilanasa o cbh II de H. jecorina. Entre los ejemplos de promotores adecuados se incluye el promotor de los genes de glucoamilasa de A. awamori o A. niger (Nunberg, J. H. et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 2306-2315; Boel, E. et al. (1984) EMBO J. 3, 1581-1585), el gen de carboxil proteasa de Mucor miehei, el gen de glucoamilasa I de Hypocrea jecorina (Shoemaker, S. P. et al. (1984) solicitud de patente europea n.° EPO0137280A1), el gen trpC de A. nidulans (Yelton, M. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474; Mullaney, E. J. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199, 37-45) el gen alcA de A. nidulans (Lockington, R. A. et al. (1986) Gene 33, 137-149), el gen tpiA de A. nidulans (McKnight, G. L. et al. (1986) Cell 46, 143-147), el gen amdS de A nidulans (Hynes, M. J. et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3, 1430-1439), el gen xln1 de H. jecorina, el gen cbh2 H. jecorina, el gen eg1 de H. jecorina, el gen eg2 de H. jecorina, el gen eg3 de H. jecorina, y promotores eucarióticos superiores como el promotor temprano SV40 (Barclay, S. L. & E. Meller (1983) Molecular and Cellular Biology 3, 2117-2130).
[0053] Un ácido nucleico está «ligado de forma operativa» cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que codifica un líder secretor, es decir, un péptido señal, está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificadora si se posiciona de manera que facilite la traducción. En general, «operativamente unido» significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si no existen estos sitios, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional. Por tanto, el término «ligado de forma operativa» hace referencia a un enlace funcional entre una secuencias de control de expresión de ácido nucleico (como un promotor, o una matriz de sitios de unión del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la secuencias de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
[0054] Los términos «secuencia señal», «péptido señal», «secuencia secretora», «péptido secretor», «secuencia señal secretora», «péptido señal secretor» y similares se refieren a una secuencia peptídica que, como un componente de un polipéptido mayor, dirige el polipéptido mayor a través de una ruta de secreción de una célula en la que se sintetiza, así como los ácidos nucleicos que codifican tales péptidos. En general, el polipéptido (o proteína) mayor se escinde normalmente para retirar el péptido señal/secretor durante el tránsito a través de la ruta de secreción, donde a la forma escindida del polipéptido (es decir, la forma sin el péptido señal/secretor) se le suele hacer referencia en el presente documento como la «forma madura» del polipéptido. Por ejemplo, la SEQ ID NO:3 proporciona la secuencia de aminoácidos de la GA de H. grisea (HgGA) con el péptido señal (es
decir, HgGA de longitud completa) mientras que la SEQ ID NO:4 proporciona la secuencia de aminoácidos de HgGA sin el péptido señal (es decir, HgGA madura).
[0055] Como se utiliza en el presente documento, el término «vector» se refiere a un constructo de ácido nucleico diseñado para la transferencia entre células hospedadoras diferentes. Un «vector de expresión» se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogo en una célula extraña. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están comercialmente disponibles. La selección de vectores de expresión adecuados está dentro del conocimiento de los expertos en la materia.
[0056] Por consiguiente, un «casete de expresión» o «vector de expresión» es un constructo de ácido nucleico generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácidos nucleicos especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico concreto en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plastidial, virus, o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, la parte del casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico para ser transcrita y un promotor.
[0057] Como se utiliza en el presente documento, el término «plásmido» se refiere a un constructo de ADN bicatenario circular que forma un elemento genético autorreplicante extracromosómico cuando está presente en muchas bacterias y algunos eucariotas. Pueden emplearse plásmidos para cualquiera de un número de propósitos diferentes, por ejemplo, como vectores de clonación, vectores de propagación, vectores de expresión, etc.
[0058] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «marcador de selección» hace referencia a una secuencia nucleotídica o un polipéptido codificado en el mismo que es capaz de la expresión en células y donde la expresión del marcador de selección en células confiere la habilidad de diferenciarse de las células que no expresan el marcador de selección. En determinados modos de realización, un marcador de selección permite que una célula lo exprese para crecer en presencia de un agente selectivo correspondiente, o en condiciones de crecimiento selectivas correspondientes. En otros modos de realización, un marcador de selección permite que una célula lo exprese para ser identificada y/o aislada de células que no lo expresen gracias a una característica física, por ejemplo, por diferencias en la fluorescencia, la inmunorreactividad, etc.
[0059] En general, las moléculas de ácido nucleico que codifican la variante de HgGA se hibridarán, en condiciones de rigurosidad moderada a alta, a la secuencia de origen natural proporcionada en el presente documento como la SEQ ID NO:1 (gen HgGA nativo) o la SEQ ID NO:2 (región codificadora de la proteína de HgGA). No obstante, en algunos casos se emplea una secuencia de nucleótidos que codifica HgGA que posee una utilización de codón sustancialmente diferente, mientras que la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos que codifica HgGA tiene la secuencia de aminoácidos igual o sustancialmente igual que la de la enzima nativa. Por ejemplo, la secuencia codificadora se puede modificar para facilitar la expresión más rápida de HgGA en un sistema concreto de expresión procariota o eucariota, de conformidad con la frecuencia con la que el hospedador utiliza un codón concreto (al que se le suele hacer referencia como «optimización de codón»). Te'o, et al. (2000), por ejemplo, describe la optimización de genes para la expresión en hongos filamentosos. A tales secuencias de ácido nucleico se les suele hacer referencia como «degeneradas» o «secuencias degeneradas».
[0060] Se considera que una secuencia de ácido nucleico «puede hibridarse de forma selectiva» con una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias se hibridan de forma específica mutuamente en condiciones de lavado e hibridación de rigurosidad moderada a elevada. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) de la sonda o el complejo de unión a ácidos nucleicos. Por ejemplo, la «rigurosidad máxima» aparece normalmente a aproximadamente Tm-5 °C (5 °C por debajo de la Tm de la sonda); la «rigurosidad alta» a aproximadamente 5-10 °C por debajo de la Tm; la «rigurosidad intermedia» o «moderada» a aproximadamente 10-20 °C por debajo de la Tm de la sonda; y la «rigurosidad baja» a aproximadamente 20-25 °C por debajo de la Tm. Funcionalmente, las condiciones de rigurosidad máxima se pueden utilizar para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; mientras que las condiciones de rigurosidad elevada se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente 80 % o más de identidad de secuencia con la sonda.
[0061] Las condiciones de hibridación de moderada y elevada rigurosidad se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al, 1989, Capítulos 9 y 11, yen Ausubel, F.M., et al, 1993). Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridación aproximadamente a 42 °C en formamida al 50 %, 5X SSC, 5X solución Denhardt, SDS al 0,5 % y 100 pg/ml ADN portador desnaturalizado seguido de lavar dos veces 2X SSC y SDS al 0,5% a temperatura ambiente y dos veces adicionales en 0,1X SSC y SDS al 0,5 % a 42 °C.
[0062] Como se utilizan en el presente documento, los términos «transformada», «establemente transformada» o «transgénica» con referencia a una célula significan que la célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.
[0063] Como se utiliza en el presente documento, el término «expresión» se refiere al proceso por el cual se produce un polipéptido en función de la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso por lo general incluye tanto transcripción como traducción.
[0064] El término «introducido», en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa «transfección» o «transformación» o «transducción» e incluye referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota en la que la secuencia de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plastidio o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado).
[0065] Por el término «célula hospedadora» se entiende una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o la transcripción y/o la transcripción y la traducción (expresión) del constructo de expresión. Las células hospedadoras utilizadas en la presente invención pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levaduras, plantas, insectos, anfibios o mamíferos. En determinados modos de realización, las células hospedadoras son hongos filamentosos.
[0066] Cuando una posición de aminoácido (o residuo) en un primer polipéptido se considera que es «equivalente» a una posición de aminoácido en un segundo polipéptido relacionado, significa que la posición de aminoácido del primer polipéptido se corresponde con la posición indicada en un segundo polipéptido relacionado por uno o más de (i) alineamiento de secuencia primaria (véase la descripción del alineamiento de la secuencia y la identidad de secuencia a continuación); (ii) homología de secuencia estructural; o (iii) propiedad funcional análoga. Por tanto, una posición de aminoácido en una primera enzima GA (o una variante de la misma) puede identificarse como «equivalente» (u «homóloga») a una posición de aminoácido en una segunda enzima Ga (o incluso múltiples enzimas GA diferentes).
[0067] Alineamiento de secuencia primaria: Pueden determinarse posiciones de aminoácidos equivalentes utilizando metodologías de alineamiento de secuencias primarias de aminoácidos, muchas de las cuales se conocen en la técnica. Por ejemplo, al alinear las secuencias primarias de aminoácidos de dos o más enzimas GA diferentes, es posible designar un número de posición de aminoácido de una enzima GA como equivalente al número de posición de otra de las enzimas GA alineadas. De esta manera, el sistema de numeración que se origina de la secuencia de aminoácidos de una enzima GA (por ejemplo, la enzima HgGA indicada en la SEQ ID NO: 3) puede utilizarse para identificar residuos de aminoácidos equivalentes (u homólogos) en otras enzimas GA.
[0068] Homología de secuencia estructural: Además de determinar las posiciones de aminoácido «equivalentes» utilizando alineamientos de secuencias primarias, las posiciones de aminoácidos «equivalentes» también pueden definirse al determinar la homología al nivel de una estructura terciaria y/o secundaria. Por ejemplo, para una glucoamilasa cuya estructura terciaria se haya determinado mediante cristalografía de rayos X, pueden definirse residuos equivalentes como aquellos para los que las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácido concreto de una glucoamilasa están dentro de 0,13 nm y preferiblemente 0,1 nm tras el alineamiento con la HgGA (N en N, CA en CA, C en C, y O en O). El alineamiento se consigue después de haber orientado y posicionado el mejor modelo para proporcionar el máximo solapamiento de coordenadas atómicas de átomos de proteína distintos a hidrógeno de la glucoamilasa en cuestión con respecto a la HgGA. El mejor modelo es el modelo cristalográfico que proporcione la mayor resolución disponible. Cuando dos o más modelos diferentes presenten una misma resolución, se utiliza el modelo con el factor R más bajo para datos de difracción experimental, utilizando la siguiente ecuación.
[0069] Propiedad funcional análoga: Los residuos de aminoácidos equivalentes en un primer polipéptido que son análogos funcionalmente a un residuo específico de un segundo polipéptido relacionado (por ejemplo, una primera glucoamilasa y HgGA) se definen como aquellos aminoácidos del primer polipéptido que pueden adoptar una conformación de tal forma que bien alteran, modifican o contribuyen a la estructura del polipéptido, la unión de sustrato o la catálisis de forma definida y atribuida a un residuo específico del segundo polipéptido relacionado. Cuando se ha obtenido una estructura terciaria mediante cristalografía de rayos X para el primer polipéptido, los residuos de aminoácidos del primer polipéptido que son análogos funcionalmente al segundo polipéptido ocupan una posición análoga hasta el punto de que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo determinado puedan no cumplir los criterios de equivalencia de acuerdo con la ocupación de una posición homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo quedan con 0,13 nm de los correspondientes átomos de la cadena lateral del segundo polipéptido.
[0070] El término «propiedad mejorada» o «rendimiento mejorado» y similares con respecto a una variante de una enzima (por ejemplo, una variante de GA) se define en el presente documento como una característica o actividad asociada con una variante de enzima que está mejorada en comparación con su respectiva enzima original. Entre las propiedades mejoradas se incluyen, pero sin carácter limitativo, una termoestabilidad mejorada o un perfil de actividad dependiente de la temperatura alterado, una actividad o estabilidad mejorada en un pH o
en un intervalo de pH deseado, una especificidad de sustrato mejorada, una especificidad del producto mejorada, y una estabilidad mejorada en presencia de un químico u otro componente en una etapa de proceso de conversión de almidón, etc. La mejora del rendimiento puede determinarse utilizando un ensayo(s) concreto(s) incluyendo, pero sin carácter limitativo: (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión,
[0071] El término «termoestabilidad mejorada» con respecto a una variante de proteína (por ejemplo, una variante de GA) se define en el presente documento como una variante de enzima que muestra una retención de una fracción mayor de actividad enzimática tras un periodo de incubación a una temperatura elevada en relación con la enzima original. Dicha variante puede mostrar o no un perfil de actividad térmica alterada en relación con la original. Por ejemplo, una variante puede tener una habilidad mejorada para redoblarse tras la incubación a una temperatura elevada en relación con la original.
[0072] Por «especificidad del producto mejorada» se hace referencia a una variante de enzima que muestra un perfil de producto alterado en comparación con la enzima original, en la que el perfil del producto alterado de la variante se mejora en una aplicación determinada en comparación con la original. Un «perfil de producto» se define en el presente documento como una composición química de los productos de la reacción producidos por la enzima de interés.
[0073] Por «especificidad de sustrato mejorada» se hace referencia a una variante de enzima que se dirige a un sustrato específico (o clase de sustrato) para la hidrólisis de una manera diferente a la enzima original, de manera que la variante presenta un rendimiento mejorado en una aplicación determinada en comparación con la original.
[0074] Por «estabilidad química mejorada» se hace referencia a una variante de enzima que muestra una retención de la actividad enzimática tras un periodo de incubación en presencia de un producto o productos químicos que reducen la actividad enzimática de la enzima original bajo las mismas condiciones. Las variantes con una estabilidad química mejorada son más capaces de catalizar una reacción en presencia de dichos productos químicos en comparación con la enzima original.
[0075] Un «intervalo de pH», en lo relativo a una enzima, se refiere al intervalo de valores de pH en los que la enzima muestra actividad catalítica.
[0076] Los términos «pH estable» y «estabilidad de pH», en lo relativo a una enzima, están relacionados con la capacidad de la enzima para retener actividad en un intervalo amplio de valores de pH para un período de tiempo predeterminado (p. ej., 15 min, 30 min, 1 hora).
[0077] Tal como se utiliza en el presente documento, «almidón» se refiere a cualquier material formado por los carbohidratos de polisacáridos complejos de plantas, formado por amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H1üO5)x, donde «X» puede ser cualquier número. En concreto, el término se refiere a cualquier material a base de plantas incluyendo, aunque sin carácter limitativo, granos, hierbas, tubérculos y raíces y más concretamente trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvados, mandioca, mijo, patata, boniato y tapioca. «Almidón granular» se refiere a almidón sin cocinar (crudo), que no ha sido sometido a gelatinización, donde «gelatinización de almidón» significa solubilización de una molécula de almidón para formar una suspensión viscosa.
[0078] «Grado de polimerización» (DP, por sus siglas en inglés) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido determinado. Entre los ejemplos de DP1, se encuentran los monosacáridos, como la glucosa y la fructosa. Entre los ejemplos de DP2, se encuentran los disacáridos, como la maltosa y la sacarosa. El DP7 se refiere a polímeros con siete unidades de anhidroglucopiranosa.
[0079] Según se utiliza en el presente documento, la «hidrólisis de almidón» y términos similares hace referencia a la escisión de enlaces glucosídicos con la adición de moléculas de agua. Así, las enzimas que presentan «actividad de hidrólisis de almidón» catalizan la escisión de enlaces glucosídicos con la adición de moléculas de agua.
[0080] Según se utiliza en el presente documento, «azúcares fermentables» se refiere a sacáridos que son capaces de ser metabolizados en condiciones de fermentación. Normalmente, estos azúcares se refieren a glucosa, maltosa y maltotriosa (DP1, DP2 y DP3).
[0081] Tal como se utiliza en el presente documento, «contenido total de azúcar» se refiere al contenido total de azúcar presente en una composición de almidón.
[0082] Un «porcentaje de identidad de secuencia» o equivalentes gramaticales significa que una secuencia concreta presenta al menos un cierto porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos a los que se encuentran en una secuencia de referencia específica utilizando un algoritmo de alineamiento. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul,
et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (<www(punto)ncbi(punto)nlm(punto) nih(punto)gov>). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden con o cumplen alguna puntuación de umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Estas coincidencias de palabras iniciales próximas actúan como puntos de partida para encontrar pares de secuencias de alta puntuación más largos que las contengan. Las coincidencias de palabras se expanden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las dos secuencias que se comparan hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabras se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X a partir de un valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa es cero o inferior; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, expectación (E) de 10, M'5, N'-4, y una comparación de ambas cadenas.
[0083] El algoritmo BLAST realiza a continuación un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría al azar. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos se considera similar a una proteasa si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de la secuencia de aminoácidos de prueba con respecto a una secuencia de aminoácidos de proteasa es inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01 y siendo lo más preferible inferior a aproximadamente 0,001.
[0084] También pueden emplearse algoritmos de alineamiento para identificar un residuo (o residuos) de aminoácidos en una primera secuencia de aminoácidos (por ejemplo, HgGA) que se corresponde con un residuo (o residuos) de aminoácido en una segunda secuencia de aminoácidos (por ejemplo, enzimas GA homólogas de otras especies, por ejemplo, GA de T. reesei).
[0085] Cuando surjan cuestiones del porcentaje de identidad de secuencia o los residuos de aminoácidos correspondientes entre dos secuencias, regirá el alineamiento utilizando el algoritmo CLUSTAL W con parámetros por defecto. Véase Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Los parámetros por defecto del algoritmo CLUSTAL W son:
Penalización por apertura de hueco: 10,0
Penalización por extensión de hueco: 0,05
Matriz de peso de proteína: BLOSUM series
Matriz de peso de ADN: IUB
% de retraso de secuencias divergentes: 40
Distancia de separación de hueco: 8
Peso de transiciones de ADN: 0,50
Listar residuos hidrofílicos: GPSNDQEKR
Usar matriz negativa: OFF
Alternar penalizaciones específicas por residuos: ON
Alternar penalizaciones hidrofílicas: ON
Alternar penalización por separación de extremo de hueco OFF.
II. BIOLOGIA MOLECULAR
[0086] Los modos de realización de la invención objeto proporcionan la expresión de una enzima glucoamilasa (o una combinación de enzimas glucoamilasa) de ácidos nucleicos que codifican glucoamilasas bajo el control de un promotor funcional en una célula hospedadora de interés, por ejemplo, un hongo filamentoso. Por tanto, esta invención depende de un número de técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Se han señalado anteriormente textos básicos que dan a conocer ejemplos de métodos adecuados de genética recombinante.
[0087] En la presente exposición, se contempla cualquier método conocido en la técnica que pueda introducir mutaciones en un polipéptido/ácido nucleico original.
[0088] La presente invención se refiere a la expresión, la purificación y/o el aislamiento y la utilización de variantes de enzimas GA. Estas enzimas se preparan mediante métodos recombinantes utilizando cualquiera de un número de genes de glucoamilasa conocidos en la técnica (por ejemplo, el gen de glucoamilasa de H. grísea que comprende la SEQ ID NO:1 o una secuencia recombinante mostrada en la SEQ ID NO:2). Puede utilizarse cualquier método conveniente para introducir mutaciones, incluyendo la mutagénesis de sitio dirigido. Tal como se ha indicado anteriormente, las mutaciones (o variaciones) incluyen sustituciones, adiciones, deleciones o truncamientos que se corresponderán con uno o más cambios aminoacídicos en la variante de GA expresada. De nuevo, la mutagénesis de sitio dirigido y otros métodos para incorporar cambios de aminoácidos en proteínas expresadas a nivel de ADN pueden encontrarse en numerosas referencias, por ejemplo, Green & Sambrook, et al. 2012 y Ausubel, et al.
[0089] El ADN que codifica una variante de secuencia de aminoácidos de una GA original se prepara mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin carácter limitativo, la preparación mediante mutagénesis de sitio dirigido (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR y mutagénesis por inserción de un casete de un ADN preparado anteriormente que codifica la enzima g A original.
[0090] La mutagénesis de sitio dirigido es un método que puede emplearse para preparar las variantes de sustitución. Esta técnica se conoce bien en la técnica (véase, p. ej., Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985) y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA 82:488 (1987)). En resumen, al llevar a cabo la mutagénesis de sitio dirigido del ADN, el ADN inicial se altera hibridando en primer lugar un oligonucleótido que codifica la mutación deseada en una cadena simple de dicho ADN inicial. Después de la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena completa, utilizando el oligonucleótido hibridado como cebador, y utilizando la cadena simple del ADN inicial como plantilla. De esta manera, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el ADN bicatenario resultante.
[0091] La mutagénesis por PCR también es adecuada para realizar variantes de secuencias de aminoácidos de la GA original. Véase Higuchi, en PCR Protocols, pp.177-183 (Academic Press, 1990); y Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989). En resumen, cuando se utilizan pequeñas cantidades de ADN plantilla como material inicial en una PCR, se pueden utilizar cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en un ADN plantilla para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia de la plantilla solo en las posiciones en las que los cebadores difieren de la plantilla.
[0092] Otro método para preparar variantes, la mutagénesis por inserción de un casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al., Gene 34:315-323 (1985). El material inicial es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN del polipéptido inicial que ha de ser mutado. Se identifica el codón o los codones en el ADN inicial que ha(n) de mutarse. Debe haber un único sitio de endonucleasa de restricción en cada lado del sitio o de los sitios de mutación identificados. Si no existen dichos sitios de restricción, se pueden generar utilizando el método de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlos en localizaciones apropiadas en el ADN del polipéptido inicial. El ADN plasmídico se corta en estos sitios para linealizarlo. Un oligonucleótido bicatenario que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción, pero que contiene la mutación o las mutaciones deseadas, se sintetiza utilizando procedimientos estándar, donde las dos cadenas del oligonucleótido se sintetizan por separado y después se hibridan juntas utilizando técnicas estándar. Este oligonucleótido bicatenario se denomina casete. Este casete está diseñado para que tenga extremos 5' y 3' compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de manera que se puede ligar directamente al plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de ADN mutada.
[0093] De manera alternativa, o adicional, se puede determinar la secuencia de aminoácidos deseada que codifica una variante de glucoamilasa deseada, y se puede generar sintéticamente una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha variante de secuencia de aminoácidos.
[0094] La(s) glucoamilasa(s) deseada(s) preparada(s) de esta manera se pueden someter a modificaciones adicionales, dependiendo a menudo del uso pretendido de la glucoamilasa. Dichas modificaciones pueden implicar la alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, la fusión a un polipéptido(s) o heterólogo(s) y/o modificaciones covalentes.
III. VARIANTES DE POLIPÉPTIDOS DE GA Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LAS MISMAS
[0095] Las glucoamilasas (GA) son producidas mediante numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Muchas glucoamilasas fúngicas se secretan de la célula, por ejemplo, de cepas de Aspergillus (Svensson et al., Carlsberg Res. Commun. 48: 529-544 (1983); Boel et al., EMBO J. 3: 1097-1102 (1984); Hayashida et al., Agric. Biol. Chem. 53: 923-929 (1989); documento de patente estadounidense n.° 5,024,941; documento de patente estadounidense n.° 4,794,175y documento de patente WO 88/09795); Talaromyces (documento de patente estadounidense n.° 4,247,637; documento de patente estadounidense n.° 6,255,084; y documento de patente estadounidense n.° 6,620,924); Rhizopus (Ashikari et al., Agric. Biol. Chem. 50: 957-964 (1986); Ashikari et al., App. Microbio. Biotech. 32: 129-133 (1989) y documento de patente estadounidense n.° 4,863,864); Humicola (documento de patente WO 05/052148 y documento de patente estadounidense n.°
4,618,579); y Mucor (Houghton-Larsen et al., Appl. Micrnbiol. Biotechnol. 62: 210-217 (2003)). Muchos de los genes que codifican estas enzimas se han clonado y expresado en células de levadura, fúngicas y/o bacterianas.
[0096] En el mercado, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (p.ej., para producir glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón). Las glucoamilasas se utilizan para producir edulcorantes de maíz ricos en fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos. En general, las glucoamilasas pueden utilizarse y se utilizan habitualmente con alfa-amilasas en procesos de hidrolización de almidón para hidrolizar almidón a dextrinas y, a continuación, a glucosa. La glucosa puede utilizarse directamente; convertirse en fructosa mediante otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa); cristalizarse; o utilizarse en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol, 1,3-propanodiol y ácido láctico).
[0097] Las glucoamilasas consisten en hasta tres dominios estructurales distintos, un dominio catalítico de aproximadamente 450 residuos que está conservado de forma estructural en todas las glucoamilasas, generalmente seguido de una región de enlace que consiste en entre 30 y 80 residuos que están conectados a un dominio de unión a almidón (SBD, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 100 residuos (al que también se le hace referencia como dominio de unión a carbohidratos, o CBD, por sus siglas en inglés). La estructura de la glucoamilasa Trichoderma reesei (TrGA) con las tres regiones intactas se determinó con la resolución Angstrom 1.8. Véase los documentos de patente WO 2009/048488y WO 2009/048487. Mediante la utilización de las coordenadas determinadas, la estructura se alineó con las coordenadas del dominio catalítico de la glucoamilasa de cepa de Aspergillus awamoriX100, que se determinó previamente (Aleshin, A.E., Hoffman, C. Firsov, L.M., y honzatko, R.B. «Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100». J. Mol. Biol. 238: 575-591 (1994)). La estructura de los dominios catalíticos de estas dos glucoamilasas se solapa muy cerca y es posible identificar residuos equivalentes a partir de esta superposición estructural. También se cree que todas las glucoamilasas comparten la estructura básica.
[0098] Dada la estructura conocida y la relación de función de las glucoamilasas, se han creado y caracterizado con éxito variantes de glucoamilasa que presentan propiedades alteradas. Algunas variantes muestran propiedades mejoradas en comparación con las glucoamilasas originales. Algunos ejemplos de propiedades mejoradas incluyen un aumento de la termoestabilidad y de la actividad específica. Algunos métodos para fabricar y caracterizar variantes de GA de T. reesei con propiedades alteradas se han descrito en el documento WO 2009/067218.
[0099] En el presente documento se describen variantes de enzimas GA. Las variantes de enzimas GA presentan una o más mutaciones, tal como se expone en el presente documento, con respecto a una enzima GA original, donde la enzima GA original presenta al menos un 60 % (es decir, un 60 % o más) de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO:4, incluyendo al menos un 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, hasta e incluyendo un 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO:4. Las variantes de enzimas GA (es decir, que presentan una o más mutaciones) pueden presentar al menos un 60 % (es decir, un 60 % o más) de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO:4, incluyendo al menos un 61 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4. En algunos modos de realización, la GA original se selecciona de entre: una cepa de Trichoderma (por ejemplo, T. reesei, T. longibrachiatum, T. strictipilis, T. asperellum, T. konilangbra, T. citrinoviride, T. pseudokoningii y T. hazianum), una cepa de Aspergillus (por ejemplo, A. aculeatus, A. niger, A. nidulans, A. kawachi, A. awamori, A. clavatus, A. terreus, A. fumigates, y A. orzyae), una cepa de Talaromyces (por ejemplo, T. emersonii, T. thermophilus, y T. duponti), una cepa Trametes (por ejemplo, Trametes cingulata), una cepa Hypocrea (por ejemplo, H. gelatinosa, H. orientalis, H. vinosa, H. jecorina, H. schweinitzii, y H. citrina), una cepa de Fusarium (por ejemplo, F. oxysporum, y F. roseum), una cepa de Humicola (por ejemplo, H. grisea, H. insolens y H. lanuginose), una cepa de Saccharomycopsis (por ejemplo, S. fibuligera), Scytalidium thermophilum, Podospora anderina, o sus respectivas formas homólogas anamorfas, teleomorfas u holomorfas. En algunos casos la GA original es GA de Humicola grisea (HgGA). Además, la variante de enzima GA presenta actividad de hidrólisis del almidón (o un fragmento de variante de GA que presenta actividad de hidrólisis del almidón) donde, en determinados modos de realización, la variante de GA presenta una propiedad mejorada, en comparación con la GA original (tal como se detalla en el presente documento). La secuencia de aminoácidos para la forma de longitud completa natural (SEQ ID NO:3) y la forma madura (SEQ ID NO:4) de la HgGA se muestra en la Figura 1.
[0100] Los aspectos de la presente exposición proporcionan variantes de una enzima GA original, donde la variante presenta una actividad de hidrólisis del almidón, presenta al menos un 60 % (por ejemplo, al menos un 80 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, y presenta al menos una propiedad mejorada con respecto a la enzima GA original seleccionada de entre: (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad
hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión.
[0101] En determinados modos de realización, la variante de GA tiene al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos 8, al menos 9 o más propiedades mejoradas (seleccionadas de la lista anterior) en comparación con la enzima GA original. En determinados modos de realización, una variante de enzima GA comprende una mutación de aminoácido en una o más posiciones de aminoácido en la HgGA (tal como se indica en la SEQ ID NO:3). Como determinadas enzimas GA originales de conformidad con los aspectos de la invención pueden no tener los mismos aminoácidos que la HgGA de origen natural, las posiciones de aminoácido que se corresponden con los residuos indicados anteriormente también pueden designarse o bien solo por el número de posición (por ejemplo, la posición de aminoácido 35, tal como se indica en la Tabla 8) o con un prefijo «X» (por ejemplo, la posición de aminoácido X35). Cabe destacar que las tres maneras de designar las posiciones de aminoácido que se corresponden con un residuo de aminoácido específico en HgGA son intercambiables (es decir, X35, T35, y el aminoácido 35).
[0102] El alineamiento de las secuencias de aminoácidos para determinar la homología puede determinarse preferiblemente utilizando un «algoritmo de comparación de secuencias». El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda de un método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), mediante inspección visual o MOE de Chemical Computing Group, Montreal Canadá. Véase también la descripción de «porcentaje de identidad de secuencia» proporcionada en la sección de Definiciones anterior.
[0103] En determinados modos de realización, una variante de enzima GA contiene una sustitución de aminoácido en uno o más sitios que se corresponden con los sitios mostrados en la Tabla 8 para la HgGA (véase el Ejemplo 3; la numeración de aminoácidos está basada en la secuencia de aminoácidos de la HgGA de longitud completa mostrada en la SEQ ID NO:3). Todas las combinaciones posibles de las sustituciones mostradas en la Tabla 8 en los sitios indicados son modos de realización contemplados de la exposición. Entre las variantes se incluyen, pero sin carácter limitativo, las siguientes:
1. Una variante de GA tal como se ha descrito anteriormente (es decir, una variante de GA que presente actividad de hidrólisis del almidón, presenta al menos un 60 % (por ejemplo, al menos un 80 %) de identidad de secuencia con los aminoácidos de la SEQ ID NO:4, y presenta al menos una propiedad mejorada con respecto a la enzima GA original seleccionada de entre (a) a (j) mencionadas anteriormente) donde la variante de GA presenta al menos una sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada del grupo que consiste en: T35, K41, P60, L97, N100, T107, A175, K183, E229, T245, G263, P293, E294, N299, L300, R308, K334, S342, Y364, I367, V369, Q373, G374, S382, V393, S394, T397, K400, S402, T406, N407, V409, N410, A411, A414, 1461, G466, L467, V468, P469, P470, S471, V476, A477, K478, S479, Q480, S483, T484, P503, K505, Q506, A522, T544, N556, G587, A589, T599, N600, T604, S607, P609, A31, I37, N46, K57, D85, L105, K171, K179, S184, P213, A221, T239, Q250, L252, N260, S261, K262, N264, E274, A295, A325, K328, A366, Y368, N371, K372, I376, S380, V381, P384, R387, V390, S391, T395, G396, S399, S401, S403, F405, I408, A448, D462, W472, S475, S486, A491, S511, S515, A524, V537, S538, A540, W541, G542, V551, P552, K561, A562, T564, L565, N573, A585, V590, Q591, V597, G601, I603, D608, 1613, T614, S620, S632, A32, V33, N38, T39, T74, H99, T104, N111, K118, Q121, 1164, Q168, 1174, G177, S180, T181, V190, K191, A198, L227, L233, Q236, D238, E240, A243, A248, V251, Q255, Y275, N290, F291, D292, G296, D298, T301, F302, A311, A315, S319, G329, A331, Q332, V345, A360, D365, W370, T379, F386, L389, S392, Y398, K413, A416, D417, S429, A434, K443, A460, R463, R464, A465, R473, L481, T493, S499, S501, V531, R536, V548, N550, A553, L554, G555, D558, T559, S560, S572, D574, S578, K584, S588, I595, K596, K602, W605, E606, R611, S612, S619, V629, D34, P42, I43, K47, A50, N55, A58, A62, A64, I68, S72, R73, D75, P77, T83, L90, S96, G98, Y101, T103, 1109, Q110, V113, S115, V122, S123, S126, T128, F129, A146, T148, E150, A165, L166, Y169, A170, A182, V185, P188, L194, T197, F206, F218, S222, H224, A226, Y232, L237, P249, Q256, A257, F258, W259, Y265, V267, S268, G272, G273, S277, D280, A281, I284, A286, S287, Q303, S306, E307, H313, Y316, D318, N322, V336, A337, N348, A355, N356, A359, L363, S375, T377, V378, L383, F385, D388, T404, E421, V422, A424, K425, Y426, A432, N440, S446, T451, F457, R487, I488, V495, A496, A497, F502, S504, A513, P516, P520, T521, S527, V529, T532, N534, E535, T539, E543, I545, V547, G549, K571, L576, I579, I583, T586, Y592, Y594, G622, Q627, T628, N630, y D631 (donde la posición de cada sustitución de aminoácido corresponde a la SEQ ID NO:3).
2. La variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35A.
3. La variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35P.
4. La variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35C.
a variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35F.
a variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35K.
a variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35L.
a variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35Q.
a variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35R.
La variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35W.
La variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35Y.
La variante de GA del punto 1 anterior y que presenta una sustitución de T35H.
La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41C. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41S. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41T. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41W. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41D. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41H. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41L. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41N. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41P. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41R. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 12 anteriores y que presenta una sustitución de K41E. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60V. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60G. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60H. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60M. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60R. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60I. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60W. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60F. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60T. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 23 anteriores y que presenta una sustitución de P60Q. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97A. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97G. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97Q. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97E. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97T. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97V. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97F. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97C. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97H. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97I. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 33 anteriores y que presenta una sustitución de L97N. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 44 anteriores y que presenta una sustitución de N100P
87. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 75 anteriores y que presenta una sustitución de A175C.
88. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183H.
89. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183E.
90. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183I.
91. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183Q.
92. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183R.
93. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183V.
94. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183Y.
95. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183D.
96. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183F.
97. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183T.
98. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 87 anteriores y que presenta una sustitución de K183W.
99. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229A.
100. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229D.
101. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229G.
102. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229M.
103. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229T.
104. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229W.
105. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229I.
106. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229L.
107. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229Y.
108. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229C.
109. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229F.
110. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229K.
111. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 98 anteriores y que presenta una sustitución de E229V.
112. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245L.
113. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245C.
114. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245I.
115. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245R.
116. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245H.
117. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245M.
118. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245Q.
119. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245S.
120. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245V.
121. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245Y.
122. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245F.
123. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 111 anteriores y que presenta una sustitución de T245W.
124. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263A.
125. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263C.
126. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263E.
127. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263H.
128. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263L.
129. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263Q.
130. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263R.
131. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263S.
132. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263T.
133. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 123 anteriores y que presenta una sustitución de G263Y.
134. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293T.
135. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293A.
136. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293C.
137. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293E.
138. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293F.
139. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293G.
140. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293H.
141. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293L.
142. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293R.
143. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293S.
144. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293Y.
145. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 133 anteriores y que presenta una sustitución de P293Q.
146. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294D.
147. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294G.
148. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294I.
149. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294K.
150. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294L.
151. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294M.
152. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294N.
153. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294S.
154. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294V.
155. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294W.
156. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294A.
157. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 145 anteriores y que presenta una sustitución de E294C.
158. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299A.
159. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299C.
160. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299E.
161. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299G.
162. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299L.
163. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299Q.
164. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299T.
165. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299V.
166. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299P.
167. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299R.
168. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 157 anteriores y que presenta una sustitución de N299S.
169. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300I.
170. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300K.
171. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de L300N.
172. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300A.
173. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300C.
174. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300D.
175. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300E.
176. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300F.
177. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300G.
178. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300H.
179. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300P.
180. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300Q.
181. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300R.
182. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300S.
183. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300T.
184. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300V.
185. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300W.
186. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 168 anteriores y que presenta una sustitución de L300Y.
187. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308I.
188. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308F.
189. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308L.
190. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308A.
191. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308D.
192. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308E.
193. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308G.
194. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308H.
195. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308K.
196. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de R308M.
197. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308Q.
198. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308T.
199. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308W.
200. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 186 anteriores y que presenta una sustitución de R308V.
201. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334C.
202. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334G.
203. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334I.
204. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334L.
205. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334T.
206. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334W.
207. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334D.
208. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334V.
209. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334A.
210. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334E.
211. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334F.
212. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334R.
213. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 200 anteriores y que presenta una sustitución de K334Y.
214. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342G.
215. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342L.
216. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342T.
217. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342W.
218. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342Y.
219. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342C.
220. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342E.
221. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 213 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de S342F.
222. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342N.
223. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342Q.
224. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342K.
225. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342M.
226. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342P.
227. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342R.
228. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 213 anteriores y que presenta una sustitución de S342V.
229. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364E.
230. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364R.
231. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364W.
232. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364G.
233. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364Q.
234. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364H.
235. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364I.
236. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364L.
237. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364M.
238. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364N.
239. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364S.
240. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 228 anteriores y que presenta una sustitución de Y364V.
241. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367G.
242. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367E.
243. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367F.
244. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367K.
245. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367L.
246. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367M.
247. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367S.
248. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de I367V.
249. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 anteriores y que presenta una sustitución de
250. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 240 an terio res y que presen ta una sustituc ión de I367Y.
251. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de V369F.
252. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369Q.
253. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369C.
254. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369I.
255. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369K.
256. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369L.
257. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369N.
258. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369S.
259. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369T.
260. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369Y.
261. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369A.
262. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369E.
263. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369G.
264. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 250 anteriores y que presenta una sustitución de V369M.
265. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373D.
266. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373E.
267. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373F.
268. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373G.
269. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373L.
270. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373N.
271. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373R.
272. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373S.
273. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373T.
274. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373C.
275. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de
276. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373K.
277. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 264 anteriores y que presenta una sustitución de Q373V.
278. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374D.
279. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374E.
280. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374F.
281. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374K.
282. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374R.
283. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374T.
284. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374V.
285. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374W.
286. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374C.
287. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374L.
288. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374M.
289. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374P.
290. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374S.
291. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374A.
292. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 277 anteriores y que presenta una sustitución de G374Y.
293. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382D.
294. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382H.
295. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382C.
296. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382P.
297. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382Q.
298. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382E.
299. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382G.
300. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de
301. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de S382T.
302. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 292 anteriores y que presenta una sustitución de S382V.
303. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393A.
304. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393W.
305. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393E.
306. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393G.
307. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393T.
308. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393Y.
309. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393F.
310. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393H.
311. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V3931.
312. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393L.
313. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 302 anteriores y que presenta una sustitución de V393N.
314. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394F.
315. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394G.
316. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394H.
317. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394I.
318. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394N.
319. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394A.
320. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394C.
321. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394D.
322. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394L.
323. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394M.
324. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 anteriores y que presenta una sustitución de S394P.
325. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 313 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de S394Y.
326. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397A.
327. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397G.
328. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397F.
329. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397L.
330. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397Q.
331. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397V.
332. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397W.
333. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397Y.
334. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397K.
335. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 325 anteriores y que presenta una sustitución de T397R.
336. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400A.
337. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400E.
338. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400G.
339. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400L.
340. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400R.
341. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400S.
342. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400V.
343. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400W.
variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de
345. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 335 anteriores y que presenta una sustitución de K400P.
346. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402D.
347. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402I.
348. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402N.
349. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402P.
350. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de S402T.
351. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402W.
352. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402R.
353. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402F.
354. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402K.
355. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 345 anteriores y que presenta una sustitución de S402M.
356. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406C.
357. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406A.
358. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406D.
359. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406G.
360. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406H.
361. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406I.
362. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406L.
363. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406N.
364. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406P.
365. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406R.
366. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406S.
367. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406V.
368. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406W.
369. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 355 anteriores y que presenta una sustitución de T406E.
370. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407C.
371. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407G.
372. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407I.
373. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407K.
374. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407L.
375. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407Q.
376. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de N407R.
377. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de N407A.
378. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407P.
379. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407S.
380. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 369 anteriores y que presenta una sustitución de N407W.
381. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409C.
382. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409G.
383. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409H.
384. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409K.
385. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409D.
386. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409E.
387. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409L.
388. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409M.
389. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409R.
390. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409W.
391. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 380 anteriores y que presenta una sustitución de V409Y.
392. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410I.
393. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410G.
394. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410Q.
395. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410Y.
396. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410C.
397. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410F.
398. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410H.
399. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410K.
400. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410L.
401. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de N410P.
402. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410T.
403. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410V.
404. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410W.
405. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410A.
406. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 391 anteriores y que presenta una sustitución de N410D.
407. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411P.
408. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411G.
409. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A4111.
410. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411L.
411. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411N.
412. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411Q.
413. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411R.
414. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411S.
415. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411W.
416. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 406 anteriores y que presenta una sustitución de A411C.
417. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414C.
418. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414F.
419. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414G.
420. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414I.
421. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414P.
422. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414Q.
423. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414S.
424. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414D.
425. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414E.
426. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414R.
427. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de A414T.
428. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 416 anteriores y que presenta una sustitución de A414W.
429. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461C.
430. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461F.
431. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461G.
432. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461K.
433. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461M.
434. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461S.
435. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de 1461T.
436. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461V.
437. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461Y.
438. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461N.
439. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461Q.
440. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 428 anteriores y que presenta una sustitución de I461R.
441. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466D.
442. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466K.
443. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466M.
444. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466R.
445. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466Y.
446. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466C.
447. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466P.
448. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466T.
449. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466W.
450. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466A.
451. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466E.
452. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466F.
453. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466H.
454. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466L.
455. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466N.
456. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de
457. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 an te rio res y que presen ta una sustituc ión de G466I.
458. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de G466V.
459. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 440 anteriores y que presenta una sustitución de G466Q.
460. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467C.
461. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467G.
462. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467Q.
463. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467T.
464. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467W.
465. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467D.
466. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467H.
467. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467N.
468. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467Y.
469. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467A.
470. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467F.
471. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467S.
472. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 459 anteriores y que presenta una sustitución de L467V.
473. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468A.
variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de
475. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468D.
476. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468G.
477. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468H.
478. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468I.
479. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468K.
480. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468L.
481. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468M.
482. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 472 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de
483. La variante de GA de cua lqu ie ra de los puntos 1 a 472 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de V468P.
484. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468Q.
485. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468R.
486. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468T.
487. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 472 anteriores y que presenta una sustitución de V468W.
488. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469R.
489. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469C.
490. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469H.
491. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469T.
492. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469V.
493. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469G.
494. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469N.
495. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469S.
496. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469E.
497. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469I.
498. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469Q.
499. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 487 anteriores y que presenta una sustitución de P469W.
500. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470K.
501. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470S.
502. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470A.
503. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470C.
504. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470E.
505. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470F.
506. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470G.
507. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470I.
508. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de
509. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de P470M.
510. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470N.
511. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470Q.
512. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470R.
513. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470V.
514. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 499 anteriores y que presenta una sustitución de P470W.
515. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471D.
516. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471C.
517. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471M.
518. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471E.
519. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471G.
520. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471P.
521. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471Q.
522. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471L.
523. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471A.
524. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471H.
525. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471I.
526. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471N.
527. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 514 anteriores y que presenta una sustitución de S471V.
528. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476A.
529. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476D.
530. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476E.
531. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476G.
532. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476H.
533. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de V476N.
534. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476S.
535. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476L.
536. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476M.
537. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476P.
538. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476Q.
539. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476Y.
540. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476R.
541. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476T.
542. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476I.
543. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 527 anteriores y que presenta una sustitución de V476W.
544. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477D.
545. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477E.
546. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477I.
547. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477K.
548. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477Q.
549. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477R.
550. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477M.
551. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477W.
552. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477S.
553. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 543 anteriores y que presenta una sustitución de A477V.
554. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478E.
555. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478I.
556. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478P.
557. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478R.
558. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478S.
559. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478T.
560. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de K478Y.
561. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478F.
562. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478Q.
563. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 553 anteriores y que presenta una sustitución de K478V.
564. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479A.
565. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479G.
566. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479L.
567. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479M.
568. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479N.
569. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479Q.
570. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479R.
571. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479T.
572. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479Y.
573. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479F.
574. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479I.
575. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 563 anteriores y que presenta una sustitución de S479K.
576. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480A.
577. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480C.
578. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480D.
579. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480T.
580. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480V.
581. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480H.
582. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480I.
583. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480L.
584. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 anteriores y que presenta una sustitución de Q480M.
585. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 575 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de Q480F.
586. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de S483F.
587. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483P.
588. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483W.
589. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483Y.
590. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483A.
591. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483I.
592. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483K.
593. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483N.
594. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483R.
595. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483T.
596. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483H.
597. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 585 anteriores y que presenta una sustitución de S483L.
598. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484I.
599. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484M.
600. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484V.
601. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484K.
602. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484P.
603. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484Q.
604. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484Y.
605. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484F.
606. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484L.
607. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 597 anteriores y que presenta una sustitución de T484S.
608. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503A.
609. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503D.
610. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503F.
611. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de
612. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503L.
613. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503M.
614. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503N.
615. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503Q.
616. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503R.
617. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503S.
618. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503T.
619. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503V.
620. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 607 anteriores y que presenta una sustitución de P503Y.
621. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505D.
622. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505E.
623. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505G.
624. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505N.
625. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505T.
626. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505M.
627. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505S.
628. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505V.
629. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505H.
630. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 620 anteriores y que presenta una sustitución de K505P.
631. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506A.
632. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506F.
633. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506L.
634. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506N.
635. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506P.
636. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506S.
637. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506E.
638. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506M.
639. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506T.
640. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506V.
641. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506Y.
642. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 630 anteriores y que presenta una sustitución de Q506C.
643. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522E.
644. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522P.
645. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522N.
646. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522T.
647. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522V.
648. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522Y.
649. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522L.
650. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522R.
651. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522K.
652. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522C.
653. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 642 anteriores y que presenta una sustitución de A522D.
654. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544P.
655. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544A.
656. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544I.
657. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544L.
658. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544M.
659. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544N.
660. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544S.
661. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de T544Y.
662. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544G.
663. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544K.
664. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544V.
665. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 653 anteriores y que presenta una sustitución de T544R.
666. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556P.
667. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556A.
668. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556G.
669. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556H.
670. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556I.
671. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556M.
672. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556S.
673. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556T.
674. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556W.
675. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556D.
676. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556E.
677. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556L.
678. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556V.
679. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 665 anteriores y que presenta una sustitución de N556Y.
680. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587D.
681. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587F.
682. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587I.
683. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587N.
684. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587Q.
685. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587T.
686. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587Y.
687. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de G587C.
688. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587P.
689. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587L.
690. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 679 anteriores y que presenta una sustitución de G587R.
691. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589C.
692. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589D.
693. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589K.
694. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589L.
695. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589M.
696. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589R.
697. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589E.
698. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589Q.
699. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589T.
700. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 690 anteriores y que presenta una sustitución de A589V.
701. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599M.
702. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599C.
703. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599E.
704. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599R.
705. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599D.
706. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599K.
707. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599L.
708. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599V.
709. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599Y.
710. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599A.
711. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599F.
712. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599P.
713. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599Q.
714. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 700 anteriores y que presenta una sustitución de T599S.
715. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600A.
716. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600E.
717. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600M.
718. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600Q.
719. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600R.
720. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600W.
721. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600Y.
722. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600P.
723. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600V.
724. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 714 anteriores y que presenta una sustitución de N600K.
725. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604K.
726. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604M.
727. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604S.
728. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604Y.
729. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604A.
730. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604D.
731. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604H.
732. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604I.
733. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604Q.
734. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604R.
735. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604F.
736. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 anteriores y que presenta una sustitución de T604G.
737. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 724 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de T604L.
738. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607W.
739. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607L.
740. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607Y.
741. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607G.
742. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607I.
743. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607Q.
744. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607V.
745. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607A.
746. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607H.
747. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607M.
748. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 737 anteriores y que presenta una sustitución de S607N.
749. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609K.
750. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609L.
751. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609N.
752. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609Q.
753. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609R.
754. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609T.
755. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609V.
756. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609Y.
757. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609A.
758. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609G.
759. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 748 anteriores y que presenta una sustitución de P609W.
760. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 759 anteriores y que presenta una sustitución de A311.
761. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 759 anteriores y que presenta una sustitución de A31T.
762. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 759 anteriores y que presenta una sustitución de A31Y.
763. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 759 anteriores y que presenta una sustitución de A31F.
764. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 759 anteriores y que presenta una sustitución de A31L.
765. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 759 anteriores y que presenta una sustitución de A31Q.
766. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de I37G.
767. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de I37M.
768. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 765 anteriores y que presenta una sustitución de I37A.
769. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de I37S.
770. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 765 anteriores y que presenta una sustitución de I37C.
771. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de I37T.
772. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 771 anteriores y que presenta una sustitución de N46D.
773. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 771 anteriores y que presenta una sustitución de N46E.
774. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 771 anteriores y que presenta una sustitución de N46P.
775. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 771 anteriores y que presenta una sustitución de N46V.
776. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 771 anteriores y que presenta una sustitución de N46C.
777. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 771 anteriores y que presenta una sustitución de N46S.
778. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57E.
779. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57S.
780. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57A.
781. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57C.
782. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57I.
783. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57V.
784. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57T.
785. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57Q.
786. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 777 anteriores y que presenta una sustitución de K57R.
787. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de D85N.
788. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de D85Y.
789. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de D85L.
790. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de D85S.
791. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de D85C.
792. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 786 anteriores y que presenta una sustitución de D85G.
793. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 786 anteriores y que presenta una sustitución de D85M 794. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a anteriores y que presenta una sustitución de D85E.
795. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 786 anteriores y que presenta una sustitución de D85V.
796. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 795 anteriores y que presenta una sustitución de L105M.
797. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 795 anteriores y que presenta una sustitución de L105R.
798. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 795 anteriores y que presenta una sustitución de L105T.
799. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 795 anteriores y que presenta una sustitución de L105I.
800. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 795 anteriores y que presenta una sustitución de L105F.
801. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 795 anteriores y que presenta una sustitución de L105Y.
802. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 801 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de K171C.
803. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 801 anteriores y que presenta una sustitución de K171G.
804. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 801 anteriores y que presenta una sustitución de K171H.
805. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 801 anteriores y que presenta una sustitución de K171R.
806. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 801 anteriores y que presenta una sustitución de K171V.
807. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 801 anteriores y que presenta una sustitución de K171W.
808. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 807 anteriores y que presenta una sustitución de K179D.
809. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 807 anteriores y que presenta una sustitución de K179P.
810. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 807 anteriores y que presenta una sustitución de K179H.
811. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 807 anteriores y que presenta una sustitución de K179L.
812. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 807 anteriores y que presenta una sustitución de K179Q.
813. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 807 anteriores y que presenta una sustitución de K179R.
814. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 807 anteriores y que presenta una sustitución de K179W.
815. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184A.
816. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184I.
817. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184M.
818. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184L.
819. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184C.
820. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184F.
821. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184V.
822. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 814 anteriores y que presenta una sustitución de S184R.
823. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 822 anteriores y que presenta una sustitución de P213A.
824. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 822 anteriores y que presenta una sustitución de P213M.
825. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 822 anteriores y que presenta una sustitución de P213N.
826. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 822 anteriores y que presenta una sustitución de P213H.
827. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 822 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de P213Q.
828. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 822 anteriores y que presenta una sustitución de P213R.
829. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 828 anteriores y que presenta una sustitución de A221M.
830. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 828 anteriores y que presenta una sustitución de A221R.
831. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 828 anteriores y que presenta una sustitución de A221S.
832. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 828 anteriores y que presenta una sustitución de A2211.
833. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 828 anteriores y que presenta una sustitución de A221L.
834. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 828 anteriores y que presenta una sustitución de A221T.
835. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 834 anteriores y que presenta una sustitución de T239A.
836. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 834 anteriores y que presenta una sustitución de T239C.
837. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 834 anteriores y que presenta una sustitución de T239F.
838. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 834 anteriores y que presenta una sustitución de T239M.
839. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 834 anteriores y que presenta una sustitución de T239V.
840. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 834 anteriores y que presenta una sustitución de T239I.
841. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 834 anteriores y que presenta una sustitución de T239R.
842. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 841 anteriores y que presenta una sustitución de Q250D.
843. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 841 anteriores y que presenta una sustitución de Q250F.
844. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 841 anteriores y que presenta una sustitución de Q250H.
845. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 841 anteriores y que presenta una sustitución de Q250M.
846. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 841 anteriores y que presenta una sustitución de Q250Y.
847. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 841 anteriores y que presenta una sustitución de Q250E.
848. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 847 anteriores y que presenta una sustitución de L252H.
849. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 847 anteriores y que presenta una sustitución de L252A.
850. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 847 anteriores y que presenta una sustitución de L252I.
851. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 847 anteriores y que presenta una sustitución de L252N.
852. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 847 anteriores y que presenta una sustitución de L252S.
853. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 847 anteriores y que presenta una sustitución de L252M.
854. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 847 anteriores y que presenta una sustitución de L252V.
855. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 854 anteriores y que presenta una sustitución de N260C.
856. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 854 anteriores y que presenta una sustitución de N260H.
857. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 854 anteriores y que presenta una sustitución de N260R.
858. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 854 anteriores y que presenta una sustitución de N260T.
859. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 854 anteriores y que presenta una sustitución de N260F.
860. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 854 anteriores y que presenta una sustitución de N260S.
861. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 854 anteriores y que presenta una sustitución de N260W.
862. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 861 anteriores y que presenta una sustitución de S261E.
863. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 861 anteriores y que presenta una sustitución de S261F.
864. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 861 anteriores y que presenta una sustitución de S261K.
865. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 861 anteriores y que presenta una sustitución de S261T.
866. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 861 anteriores y que presenta una sustitución de S261W.
867. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 861 anteriores y que presenta una sustitución de S261Y.
868. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 867 anteriores y que presenta una sustitución de K262H.
869. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 867 anteriores y que presenta una sustitución de K262M.
870. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 867 anteriores y que presenta una sustitución de K262P.
871. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 867 anteriores y que presenta una sustitución de K262R.
872. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 867 anteriores y que presenta una sustitución de K262V.
873. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 867 anteriores y que presenta una sustitución de K262W.
874. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 867 anteriores y que presenta una sustitución de K262C.
875. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 874 anteriores y que presenta una sustitución de N264A.
876. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 874 anteriores y que presenta una sustitución de N264F.
877. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 874 anteriores y que presenta una sustitución de N264P.
878. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 874 anteriores y que presenta una sustitución de
879. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 874 anteriores y que presenta una sustitución de N264V.
880. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 874 anteriores y que presenta una sustitución de N264E.
881. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 880 anteriores y que presenta una sustitución de E274V.
882. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 880 anteriores y que presenta una sustitución de E274D.
883. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 880 anteriores y que presenta una sustitución de E274I.
884. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 880 anteriores y que presenta una sustitución de E274L.
885. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 880 anteriores y que presenta una sustitución de E274Q.
886. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 880 anteriores y que presenta una sustitución de E274F.
887. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 886 anteriores y que presenta una sustitución de A295F.
888. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 886 anteriores y que presenta una sustitución de A295G.
889. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 886 anteriores y que presenta una sustitución de A295V.
890. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 886 anteriores y que presenta una sustitución de A295W.
891. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 886 anteriores y que presenta una sustitución de A295Y.
892. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 886 anteriores y que presenta una sustitución de A295D.
893. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 886 anteriores y que presenta una sustitución de A295N.
894. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 893 anteriores y que presenta una sustitución de A325E.
895. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 893 anteriores y que presenta una sustitución de A325C.
896. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 893 anteriores y que presenta una sustitución de A325F.
897. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 893 anteriores y que presenta una sustitución de A325L.
898. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 893 anteriores y que presenta una sustitución de A325P.
899. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 893 anteriores y que presenta una sustitución de A325Q.
900. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 899 anteriores y que presenta una sustitución de K328C.
901. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 899 anteriores y que presenta una sustitución de K328L.
902. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 899 anteriores y que presenta una sustitución de K328Q.
903. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 899 anteriores y que presenta una sustitución de K328W.
904. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 899 anteriores y que presenta una sustitución de K328E.
905. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 899 anteriores y que presenta una sustitución de K328F.
906. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 899 anteriores y que presenta una sustitución de K328R.
907. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 906 anteriores y que presenta una sustitución de A366Q.
908. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 906 anteriores y que presenta una sustitución de A366C.
909. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 906 anteriores y que presenta una sustitución de A366M.
910. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 906 anteriores y que presenta una sustitución de A366V.
911. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 906 anteriores y que presenta una sustitución de A366G.
912. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 906 anteriores y que presenta una sustitución de A366S.
913. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 906 anteriores y que presenta una sustitución de A366T.
914. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 913 anteriores y que presenta una sustitución de Y368E.
915. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 913 anteriores y que presenta una sustitución de Y368H.
916. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 913 anteriores y que presenta una sustitución de Y368K.
917. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 913 anteriores y que presenta una sustitución de Y368T.
918. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 913 anteriores y que presenta una sustitución de Y368W.
919. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 913 anteriores y que presenta una sustitución de Y368M.
920. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371C.
921. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371L.
922. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371M.
923. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371D.
924. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371Q.
925. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371R.
926. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371Y.
927. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 919 anteriores y que presenta una sustitución de N371A.
928. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 927 anteriores y que presenta una sustitución de K372C.
929. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 927 anteriores y que presenta una sustitución de K372D.
930. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 927 anteriores y que presenta una sustitución de K372F.
931. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 927 anteriores y que presenta una sustitución de K372S.
932. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 927 anteriores y que presenta una sustitución de K372L.
933. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 927 anteriores y que presenta una sustitución de K372N.
934. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 927 anteriores y que presenta una sustitución de K372Q.
935. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376C.
936. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376T.
937. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376V.
938. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376Y.
939. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376A.
940. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376F.
941. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376L.
942. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 934 anteriores y que presenta una sustitución de I376M.
943. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380A.
944. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380F.
945. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380K.
946. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380L.
947. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380Q.
948. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380R.
949. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380W.
950. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 942 anteriores y que presenta una sustitución de S380Y.
951. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381F.
952. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381G.
953. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381K.
954. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381M.
955. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381N.
956. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 an terio res y que p resen ta una sustituc ión de V381S.
957. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381A.
958. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381C.
959. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 950 anteriores y que presenta una sustitución de V381Q.
960. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 959 anteriores y que presenta una sustitución de P384D.
961. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 959 anteriores y que presenta una sustitución de P384F.
962. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 959 anteriores y que presenta una sustitución de P384S.
963. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 959 anteriores y que presenta una sustitución de P384Y.
964. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 959 anteriores y que presenta una sustitución de P384E.
965. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 959 anteriores y que presenta una sustitución de P384T.
966. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 959 anteriores y que presenta una sustitución de P384V.
967. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 966 anteriores y que presenta una sustitución de R387C.
968. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 966 anteriores y que presenta una sustitución de R387I.
969. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 966 anteriores y que presenta una sustitución de R387Q.
970. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 966 anteriores y que presenta una sustitución de R387Y.
971. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 966 anteriores y que presenta una sustitución de R387G.
972. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 966 anteriores y que presenta una sustitución de R387L.
973. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 966 anteriores y que presenta una sustitución de R387K.
974. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 973 anteriores y que presenta una sustitución de V390H.
975. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 973 anteriores y que presenta una sustitución de V390I.
976. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 973 anteriores y que presenta una sustitución de V390K.
977. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 973 anteriores y que presenta una sustitución de V390Y.
978. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 973 anteriores y que presenta una sustitución de V390F.
979. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 973 anteriores y que presenta una sustitución de V390L.
980. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 973 anteriores y que presenta una sustitución de V390R.
981. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 980 anteriores y que presenta una sustitución de S391N.
982. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 980 a n te rio res y que p re sen ta una sus titu c ión de S391H.
983. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 980 anteriores y que presenta una sustitución de S391L.
984. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 980 anteriores y que presenta una sustitución de S391F.
985. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 980 anteriores y que presenta una sustitución de S391I.
986. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 980 anteriores y que presenta una sustitución de S391R.
987. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 986 anteriores y que presenta una sustitución de T395K.
988. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 986 anteriores y que presenta una sustitución de T395Q.
989. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 986 anteriores y que presenta una sustitución de T395R.
990. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 986 anteriores y que presenta una sustitución de T395V.
991. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 986 anteriores y que presenta una sustitución de T395Y.
992. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 986 anteriores y que presenta una sustitución de T395F.
993. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 986 anteriores y que presenta una sustitución de T395L.
994. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 993 anteriores y que presenta una sustitución de G396E.
995. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 993 anteriores y que presenta una sustitución de G396L.
996. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 993 anteriores y que presenta una sustitución de G396Q.
997. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 993 anteriores y que presenta una sustitución de G396R.
998. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 993 anteriores y que presenta una sustitución de G396K.
999. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 993 anteriores y que presenta una sustitución de G396V.
1000. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 999 anteriores y que presenta una sustitución de S399Q.
1001. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 999 anteriores y que presenta una sustitución de S399T.
1002. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 999 anteriores y que presenta una sustitución de S399R.
1003. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 999 anteriores y que presenta una sustitución de S399W.
1004. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 999 anteriores y que presenta una sustitución de S399K.
1005. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 999 anteriores y que presenta una sustitución de S399C.
1006. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1005 anteriores y que presenta una sustitución de S401H.
1007. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1005 anteriores y que presenta una sustitución de S401T.
1008. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1005 anteriores y que presenta una sustitución de S401A.
1009. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1005 anteriores y que presenta una sustitución de S401Y.
1010. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1005 anteriores y que presenta una sustitución de S401P.
1011. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1005 anteriores y que presenta una sustitución de S401Q.
1012. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1011 anteriores y que presenta una sustitución de S403I.
1013. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1011 anteriores y que presenta una sustitución de S403P.
1014. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1011 anteriores y que presenta una sustitución de S403W.
1015. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1011 anteriores y que presenta una sustitución de S403Y.
1016. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1011 anteriores y que presenta una sustitución de S403A.
1017. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1011 anteriores y que presenta una sustitución de S403V.
1018. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1017 anteriores y que presenta una sustitución de F405A.
1019. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1017 anteriores y que presenta una sustitución de F405H.
1020. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1017 anteriores y que presenta una sustitución de F405W.
1021. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1017 anteriores y que presenta una sustitución de F405Y.
1022. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1017 anteriores y que presenta una sustitución de F405N.
1023. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1017 anteriores y que presenta una sustitución de F405S.
1024. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1023 anteriores y que presenta una sustitución de I408Q.
1025. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1023 anteriores y que presenta una sustitución de I408A.
1026. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1023 anteriores y que presenta una sustitución de I408T.
1027. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1023 anteriores y que presenta una sustitución de I408V.
1028. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1023 anteriores y que presenta una sustitución de I408S.
1029. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1023 anteriores y que presenta una sustitución de I408Y.
1030. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1029 anteriores y que presenta una sustitución de A448F.
1031. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1029 anteriores y que presenta una sustitución de A448P.
1032. La variante de GA de cualquiera de los puntos 1 a 1029 anteriores y que presenta una sustitución de A448T.
1033. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1029 anteriores y que presenta una sustitución de A448N.
1034. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1029 anteriores y que presenta una sustitución de A448I.
1035. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1029 anteriores y que presenta una sustitución de A448Q.
1036. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462H.
1037. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462A.
1038. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462E.
1039. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462F.
1040. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462I.
1041. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462L.
1042. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462S.
1043. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462M.
1044. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1035 anteriores y que presenta una sustitución de D462T.
1045. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1044 anteriores y que presenta una sustitución de W472R.
1046. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1044 anteriores y que presenta una sustitución de W472D.
1047. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1044 anteriores y que presenta una sustitución de W472I.
1048. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1044 anteriores y que presenta una sustitución de W472M.
1049. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1044 anteriores y que presenta una sustitución de W472Q.
1050. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1044 anteriores y que presenta una sustitución de W472S.
1051. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1044 anteriores y que presenta una sustitución de W472Y.
1052. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475K.
1053. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475N.
1054. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475Q.
1055. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475E.
1056. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475F.
1057. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475I.
1058. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475R.
1059. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1051 anteriores y que presenta una sustitución de S475L.
1060. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486V.
1061. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486T.
1062. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486Y.
1063. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486D.
1064. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486G.
1065. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486K.
1066. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486L.
1067. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486I.
1068. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1059 anteriores y que presenta una sustitución de S486M.
1069. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491H.
1070. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491I.
1071. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491L.
1072. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491M.
1073. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491Y.
1074. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491K.
1075. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491R.
1076. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1068 anteriores y que presenta una sustitución de A491V.
1077. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1076 anteriores y que presenta una sustitución de S511I.
1078. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1076 anteriores y que presenta una sustitución de S511W.
1079. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1076 anteriores y que presenta una sustitución de S511H.
1080. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1076 anteriores y que presenta una sustitución de S511K.
1081. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1076 anteriores y que presenta una sustitución de S511L.
1082. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1076 anteriores y que presenta una sustitución de S511N.
1083. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515D.
1084. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515M.
1085. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515N.
1086. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515T.
1087. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515A.
1088. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515I.
1089. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515K.
1090. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1082 anteriores y que presenta una sustitución de S515V.
1091. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524F.
1092. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524L.
1093. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524N.
1094. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524Q.
1095. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524R.
1096. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524T.
1097. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524W.
1098. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524S.
1099. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1090 anteriores y que presenta una sustitución de A524Y.
1100. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1099 anteriores y que presenta una sustitución de V537M.
1101. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1099 anteriores y que presenta una sustitución de V537T.
1102. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1099 anteriores y que presenta una sustitución de V537A.
1103. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1099 anteriores y que presenta una sustitución de V537C.
1104. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1099 anteriores y que presenta una sustitución de V537K.
1105. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1099 anteriores y que presenta una sustitución de V537R.
1106. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538G.
1107. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538A.
1108. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538C.
1109. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538K.
1110. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538Q.
1111. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538R.
1112. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538T.
1113. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1105 anteriores y que presenta una sustitución de S538F.
1114. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540Y.
1115. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540E.
1116. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540F.
1117. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540L.
1118. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540T.
1119. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540V.
1120. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540W.
1121. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1113 anteriores y que presenta una sustitución de A540M.
1122. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1121 anteriores y que presenta una sustitución de W541A.
1123. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1121 anteriores y que presenta una sustitución de W541I.
1124. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1121 anteriores y que presenta una sustitución de W541L.
1125. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1121 anteriores y que presenta una sustitución de W541R.
1126. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1121 anteriores y que presenta una sustitución de W541V.
1127. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1121 anteriores y que presenta una sustitución de W541Y.
1128. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1127 anteriores y que presenta una sustitución de G542D.
1129. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1127 anteriores y que presenta una sustitución de G542A.
1130. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1127 anteriores y que presenta una sustitución de G542M.
1131. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1127 anteriores y que presenta una sustitución de G542N.
1132. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1127 anteriores y que presenta una sustitución de G542K.
1133. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1127 anteriores y que presenta una sustitución de G542R.
1134. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1133 anteriores y que presenta una sustitución de V551S.
1135. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1133 anteriores y que presenta una sustitución de V551N.
1136. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1133 anteriores y que presenta una sustitución de V551F.
1137. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1133 anteriores y que presenta una sustitución de V551K.
1138. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1133 anteriores y que presenta una sustitución de V551L.
1139. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1133 anteriores y que presenta una sustitución de V551Q.
1140. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1a 1133 anteriores y que presenta una sustitución de V551Y.
1141. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552A.
1142. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552G.
1143. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552I.
1144. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552K.
1145. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552M.
1146. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552N.
1147. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552Y.
1148. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1140 anteriores y que presenta una sustitución de P552R.
1149. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561D.
1150. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561E.
1151. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561G.
1152. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561I.
1153. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561L.
1154. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561N.
1155. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561P.
1156. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561Q.
1157. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1148 anteriores y que presenta una sustitución de K561R.
1158. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562I.
1159. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562K.
1160. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562L.
1161. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562Y.
1162. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562C.
1163. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562G.
1164. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562V.
1165. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1157 anteriores y que presenta una sustitución de A562S.
1166. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1165 anteriores y que presenta una sustitución de T564N.
1167. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1165 anteriores y que presenta una sustitución de T564L.
1168. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1165 anteriores y que presenta una sustitución de T564M.
1169. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1165 anteriores y que presenta una sustitución de T564S.
1170. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1165 anteriores y que presenta una sustitución de T564K.
1171. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1165 anteriores y que presenta una sustitución de T564R.
1172. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1171 anteriores y que presenta una sustitución de L565E.
1173. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1171 anteriores y que presenta una sustitución de L565H.
1174. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1171 anteriores y que presenta una sustitución de L565M.
1175. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1171 anteriores y que presenta una sustitución de L565Q.
1176. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1171 anteriores y que presenta una sustitución de L565S.
1177. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1171 anteriores y que presenta una sustitución de L565T.
1178. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1171 anteriores y que presenta una sustitución de L565V.
1179. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1178 anteriores y que presenta una sustitución de N573G.
1180. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1178 anteriores y que presenta una sustitución de N573E.
1181. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1178 anteriores y que presenta una sustitución de N573F.
1182. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1178 anteriores y que presenta una sustitución de
1183. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1178 anteriores y que presenta una sustitución de N573I.
1184. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1178 anteriores y que presenta una sustitución de N573Y.
1185. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1178 anteriores y que presenta una sustitución de N573A.
1186. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1185 anteriores y que presenta una sustitución de A585D.
1187. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1185 anteriores y que presenta una sustitución de A585F.
1188. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1185 anteriores y que presenta una sustitución de A585S.
1189. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1185 anteriores y que presenta una sustitución de A585T.
1190. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1185 anteriores y que presenta una sustitución de A585W.
1191. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1185 anteriores y que presenta una sustitución de A585Y.
1192. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1185 anteriores y que presenta una sustitución de A585N.
1193. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1192 anteriores y que presenta una sustitución de V590W.
1194. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1192 anteriores y que presenta una sustitución de V590A.
1195. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1192 anteriores y que presenta una sustitución de V590G.
1196. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1192 anteriores y que presenta una sustitución de V590P.
1197. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1192 anteriores y que presenta una sustitución de V590S.
1198. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1192 anteriores y que presenta una sustitución de V590I.
1199. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1192 anteriores y que presenta una sustitución de V590L.
1200. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1199 anteriores y que presenta una sustitución de Q591L.
1201. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1199 anteriores y que presenta una sustitución de Q591Y.
1202. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1199 anteriores y que presenta una sustitución de Q591C.
1203. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1199 anteriores y que presenta una sustitución de Q591R.
1204. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1199 anteriores y que presenta una sustitución de Q591P.
1205. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1199 anteriores y que presenta una sustitución de Q591S.
1206. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1199 anteriores y que presenta una sustitución de Q591T.
1207. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597R.
1208. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597L.
1209. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597M.
1210. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597Q.
1211. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597S.
1212. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597W.
1213. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597F.
1214. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1206 anteriores y que presenta una sustitución de V597K.
1215. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601E.
1216. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601I.
1217. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601R.
1218. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601A.
1219. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601H.
1220. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601N.
1221. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601P.
1222. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601Q.
1223. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1214 anteriores y que presenta una sustitución de G601M.
1224. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603Q.
1225. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603T.
1226. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603Y.
1227. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603A.
1228. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603K.
1229. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603F.
1230. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603L.
1231. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603N.
1232. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1223 anteriores y que presenta una sustitución de I603P.
1233. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1232 anteriores y que presenta una sustitución de D608L.
1234. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1232 anteriores y que presenta una sustitución de D608P.
1235. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1232 anteriores y que presenta una sustitución de D608R.
1236. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1232 anteriores y que presenta una sustitución de D608T.
1237. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1232 anteriores y que presenta una sustitución de D608E.
1238. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1232 anteriores y que presenta una sustitución de D608F.
1239. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1232 anteriores y que presenta una sustitución de D608I.
1240. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1239 anteriores y que presenta una sustitución de I613A.
1241. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1239 anteriores y que presenta una sustitución de I613F.
1242. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1239 anteriores y que presenta una sustitución de I613L.
1243. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1239 anteriores y que presenta una sustitución de I613S.
1244. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1239 anteriores y que presenta una sustitución de I613T.
1245. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1239 anteriores y que presenta una sustitución de I613V.
1246. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1245 anteriores y que presenta una sustitución de T614L.
1247. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1245 anteriores y que presenta una sustitución de T614M.
1248. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1245 anteriores y que presenta una sustitución de T614Q.
1249. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1245 anteriores y que presenta una sustitución de T614V.
1250. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1245 anteriores y que presenta una sustitución de T614Y.
1251. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1245 anteriores y que presenta una sustitución de T614S.
1252. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1251 anteriores y que presenta una sustitución de S620D.
1253. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1251 anteriores y que presenta una sustitución de S620M.
1254. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1251 anteriores y que presenta una sustitución de S620Q.
1255. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1251 anteriores y que presenta una sustitución de S620E.
1256. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1251 anteriores y que presenta una sustitución de S620H.
1257. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1251 anteriores y que presenta una sustitución de S620P.
1258. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1251 anteriores y que presenta una sustitución de S620R.
1259. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1258 anteriores y que presenta una sustitución de S632L.
1260. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1258 anteriores y que presenta una sustitución de S632C.
1261. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1258 anteriores y que presenta una sustitución de S632D.
1262. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1258 anteriores y que presenta una sustitución de S632E.
1263. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1258 anteriores y que presenta una sustitución de S632G.
1264. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1258 anteriores y que presenta una sustitución de S632T.
1265. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1264 anteriores y que presenta una sustitución de A32S.
1266. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1264 anteriores y que presenta una sustitución de A32T.
1267. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1264 anteriores y que presenta una sustitución de A32E.
1268. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1264 anteriores y que presenta una sustitución de A32Q.
1269. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1268 anteriores y que presenta una sustitución de V33L.
1270. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1268 anteriores y que presenta una sustitución de V33P.
1271. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1268 anteriores y que presenta una sustitución de V33I.
1272. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38G.
1273. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38F.
1274. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38H.
1275. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38K.
1276. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38I.
1277. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de T39E.
1278. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38K.
1279. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38L.
1280. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1271 anteriores y que presenta una sustitución de N38Q.
1281. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1280 anteriores y que presenta una sustitución de T74D.
1282. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1280 anteriores y que presenta una sustitución de T74I.
1283. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1280 anteriores y que presenta una sustitución de T74K.
1284. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1280 anteriores y que presenta una sustitución de T74V.
1285. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1284 anteriores y que presenta una sustitución de H99G.
1286. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1284 anteriores y que presenta una sustitución de H99A.
1287. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1284 anteriores y que presenta una sustitución de H99M.
1288. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1284 anteriores y que presenta una sustitución de H99V.
1289. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1284 anteriores y que presenta una sustitución de H99Y.
1290. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1289 anteriores y que presenta una sustitución de T104V.
1291. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1289 anteriores y que presenta una sustitución de T104D.
1292. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1289 anteriores y que presenta una sustitución de T104E.
1293. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1292 anteriores y que presenta una sustitución de N111F.
1294. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1292 anteriores y que presenta una sustitución de N111M.
1295. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1292 anteriores y que presenta una sustitución de N111D.
1296. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1292 anteriores y que presenta una sustitución de N111Q.
1297. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1292 anteriores y que presenta una sustitución de N111H.
1298. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1297 anteriores y que presenta una sustitución de K118M.
1299. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1297 anteriores y que presenta una sustitución de K118L.
1300. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1297 anteriores y que presenta una sustitución de K118F.
1301. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1297 anteriores y que presenta una sustitución de K118Y.
1302. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1301 anteriores y que presenta una sustitución de Q121V.
1303. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1301 anteriores y que presenta una sustitución de Q121L.
1304. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1301 anteriores y que presenta una sustitución de Q121T.
1305. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1304 anteriores y que presenta una sustitución de I164K.
1306. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1304 anteriores y que presenta una sustitución de I164V.
1307. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1304 anteriores y que presenta una sustitución de I164A.
1308. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1307 anteriores y que presenta una sustitución de Q168H.
1309. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1307 anteriores y que presenta una sustitución de Q168A.
1310. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1307 anteriores y que presenta una sustitución de Q168L.
1311. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1307 anteriores y que presenta una sustitución de Q168Y.
1312. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1311 anteriores y que presenta una sustitución de I174V.
1313. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1311 anteriores y que presenta una sustitución de I174F.
1314. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1311 anteriores y que presenta una sustitución de I174Y.
1315. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1314 anteriores y que presenta una sustitución de G177D.
1316. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1314 anteriores y que presenta una sustitución de G177H.
1317. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1314 anteriores y que presenta una sustitución de G177K.
1318. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1314 anteriores y que presenta una sustitución de G177S.
1319. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1318 anteriores y que presenta una sustitución de S180A.
1320. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1318 anteriores y que presenta una sustitución de S180C.
1321. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1318 anteriores y que presenta una sustitución de S180F.
1322. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1321 anteriores y que presenta una sustitución de T181A.
1323. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1321 anteriores y que presenta una sustitución de T181S.
1324. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1321 anteriores y que presenta una sustitución de T181W.
1325. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1324 anteriores y que presenta una sustitución de V190A.
1326. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1324 anteriores y que presenta una sustitución de V190I.
1327. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1324 anteriores y que presenta una sustitución de V190M.
1328. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1324 anteriores y que presenta una sustitución de V190L.
1329. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1328 anteriores y que presenta una sustitución de K191V.
1330. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1328 anteriores y que presenta una sustitución de K191W.
1331. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1328 anteriores y que presenta una sustitución de K191R.
1332. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1331 anteriores y que presenta una sustitución de A198Y.
1333. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1331 anteriores y que presenta una sustitución de A198C.
1334. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1331 anteriores y que presenta una sustitución de A198G.
1335. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1331 anteriores y que presenta una sustitución de A198S.
1336. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1335 anteriores y que presenta una sustitución de L227A.
1337. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1335 anteriores y que presenta una sustitución de L227C.
1338. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1335 anteriores y que presenta una sustitución de L227I.
1339. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1338 anteriores y que presenta una sustitución de L233T.
1340. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1338 anteriores y que presenta una sustitución de L233V.
1341. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1338 anteriores y que presenta una sustitución de L233M.
1342. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1341 anteriores y que presenta una sustitución de Q236W.
1343. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1341 anteriores y que presenta una sustitución de Q236F.
1344. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1341 anteriores y que presenta una sustitución de Q236D.
1345. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1341 anteriores y que presenta una sustitución de Q236N.
1346. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1341 anteriores y que presenta una sustitución de Q236Y.
1347. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1346 anteriores y que presenta una sustitución de D238L.
1348. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1346 anteriores y que presenta una sustitución de D238Q.
1349. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1346 anteriores y que presenta una sustitución de D238R.
1350. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1349 anteriores y que presenta una sustitución de E240Q.
1351. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1349 anteriores y que presenta una sustitución de E240W.
1352. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1349 anteriores y que presenta una sustitución de E240P.
1353. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1352 anteriores y que presenta una sustitución de A243G.
1354. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1352 anteriores y que presenta una sustitución de A243H.
1355. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1352 anteriores y que presenta una sustitución de A243R.
1356. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1352 anteriores y que presenta una sustitución de A243P.
1357. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1356 anteriores y que presenta una sustitución de A248G.
1358. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1356 anteriores y que presenta una sustitución de A248C.
1359. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1356 anteriores y que presenta una sustitución de A248S.
1360. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1359 anteriores y que presenta una sustitución de V251L.
1361. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1359 anteriores y que presenta una sustitución de V251Q.
1362. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1359 anteriores y que presenta una sustitución de V251R.
1363. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1362 anteriores y que presenta una sustitución de Q255E.
1364. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1362 anteriores y que presenta una sustitución de Q255G.
1365. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1362 anteriores y que presenta una sustitución de Q255L.
1366. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1362 anteriores y que presenta una sustitución de Q255S.
1367. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1366 anteriores y que presenta una sustitución de Y275E.
1368. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1366 anteriores y que presenta una sustitución de Y275G.
1369. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1366 anteriores y que presenta una sustitución de Y275L.
1370. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1366 anteriores y que presenta una sustitución de Y275S.
1371. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1369 anteriores y que presenta una sustitución de N290E.
1372. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1369 anteriores y que presenta una sustitución de N290I.
1373. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1369 anteriores y que presenta una sustitución de N290Q.
1374. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1369 anteriores y que presenta una sustitución de N290V.
1375. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1374 anteriores y que presenta una sustitución de F291Y.
1376. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1374 anteriores y que presenta una sustitución de F291L.
1377. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1374 anteriores y que presenta una sustitución de F291M.
1378. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1377 anteriores y que presenta una sustitución de D292F.
1379. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1377 anteriores y que presenta una sustitución de D292C.
1380. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1377 anteriores y que presenta una sustitución de D292S.
1381. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1380 anteriores y que presenta una sustitución de G296L.
1382. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1380 anteriores y que presenta una sustitución de G296P.
1383. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1380 anteriores y que presenta una sustitución de G296Q.
1384. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1380 anteriores y que presenta una sustitución de G296V.
1385. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1384 anteriores y que presenta una sustitución de D298A.
1386. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1384 anteriores y que presenta una sustitución de D298E.
1387. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1384 anteriores y que presenta una sustitución de D298I.
1388. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1384 anteriores y que presenta una sustitución de D298N.
1389. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1388 anteriores y que presenta una sustitución de T301A.
1390. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1388 anteriores y que presenta una sustitución de T3011.
1391. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1388 anteriores y que presenta una sustitución de T301C.
1392. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1388 anteriores y que presenta una sustitución de T301L.
1393. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1392 anteriores y que presenta una sustitución de F302G.
1394. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1392 anteriores y que presenta una sustitución de F302M.
1395. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1392 anteriores y que presenta una sustitución de F302W.
1396. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1395 anteriores y que presenta una sustitución de A311R.
1397. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1395 anteriores y que presenta una sustitución de A311C.
1398. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1395 anteriores y que presenta una sustitución de A311G.
1399. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1395 anteriores y que presenta una sustitución de A311M.
1400. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1395 anteriores y que presenta una sustitución de A311V.
1401. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1400 anteriores y que presenta una sustitución de A315G.
1402. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1400 anteriores y que presenta una sustitución de A315C.
1403. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1400 anteriores y que presenta una sustitución de A315E.
1404. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1400 anteriores y que presenta una sustitución de A315M.
1405. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1400 anteriores y que presenta una sustitución de A315Q.
1406. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1405 anteriores y que presenta una sustitución de S319N.
1407. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1405 anteriores y que presenta una sustitución de S319M.
1408. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1405 anteriores y que presenta una sustitución de S319Q.
1409. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1408 anteriores y que presenta una sustitución de G329T.
1410. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1408 anteriores y que presenta una sustitución de G329C.
1411. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1408 anteriores y que presenta una sustitución de G329D.
1412. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1411 anteriores y que presenta una sustitución de A331V.
1413. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1411 anteriores y que presenta una sustitución de A331K.
1414. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1411 anteriores y que presenta una sustitución de A331L.
1415. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1411 anteriores y que presenta una sustitución de A331R.
1416. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1411 anteriores y que presenta una sustitución de A331M.
1417. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1416 anteriores y que presenta una sustitución de Q332V.
1418. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1416 anteriores y que presenta una sustitución de Q332W.
1419. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1416 anteriores y que presenta una sustitución de Q332E.
1420. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1416 anteriores y que presenta una sustitución de Q332L.
1421. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1416 anteriores y que presenta una sustitución de Q332P.
1422. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1421 anteriores y que presenta una sustitución de V345I.
1423. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1421 anteriores y que presenta una sustitución de V345Q.
1424. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1421 anteriores y que presenta una sustitución de V345K.
1425. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1424 anteriores y que presenta una sustitución de A360C.
1426. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1424 anteriores y que presenta una sustitución de A360G.
1427. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1424 anteriores y que presenta una sustitución de A360S.
1428. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1427 anteriores y que presenta una sustitución de D365A.
1429. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1427 anteriores y que presenta una sustitución de D365E.
1430. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1427 anteriores y que presenta una sustitución de D365Q.
1431. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1427 anteriores y que presenta una sustitución de D365R.
1432. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1431 anteriores y que presenta una sustitución de W370S.
1433. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1431 anteriores y que presenta una sustitución de W370T.
1434. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1431 anteriores y que presenta una sustitución de W370V.
1435. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1431 anteriores y que presenta una sustitución de W370F.
1436. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1431 anteriores y que presenta una sustitución de W370M.
1437. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1436 anteriores y que presenta una sustitución de T379E.
1438. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1436 anteriores y que presenta una sustitución de T379H.
1439. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1436 anteriores y que presenta una sustitución de T379N.
1440. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1436 anteriores y que presenta una sustitución de T379Q.
1441. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1436 anteriores y que presenta una sustitución de T379R.
1442. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1441 anteriores y que presenta una sustitución de F386H.
1443. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1441 anteriores y que presenta una sustitución de F386L.
1444. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1441 anteriores y que presenta una sustitución de F386T.
1445. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1441 anteriores y que presenta una sustitución de F386V.
1446. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1441 anteriores y que presenta una sustitución de F386W.
1447. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1446 anteriores y que presenta una sustitución de L389A.
1448. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1446 anteriores y que presenta una sustitución de L389Q.
1449. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1446 anteriores y que presenta una sustitución de L389S.
1450. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1446 anteriores y que presenta una sustitución de L389T.
1451. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1450 anteriores y que presenta una sustitución de S392Y.
1452. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1450 anteriores y que presenta una sustitución de S392I.
1453. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1450 anteriores y que presenta una sustitución de S392P.
1454. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1453 anteriores y que presenta una sustitución de Y398N.
1455. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1453 anteriores y que presenta una sustitución de Y398Q.
1456. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1453 anteriores y que presenta una sustitución de Y398F.
1457. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1453 anteriores y que presenta una sustitución de Y398L.
1458. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1453 anteriores y que presenta una sustitución de Y398H.
1459. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1458 anteriores y que presenta una sustitución de K413T.
1460. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1458 anteriores y que presenta una sustitución de K413E.
1461. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1458 anteriores y que presenta una sustitución de K413F.
1462. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1458 anteriores y que presenta una sustitución de K413L.
1463. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1458 anteriores y que presenta una sustitución de K413R.
1464. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1463 anteriores y que presenta una sustitución de A416C.
1465. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1463 anteriores y que presenta una sustitución de A416G.
1466. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1463 anteriores y que presenta una sustitución de A416S.
1467. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1466 anteriores y que presenta una sustitución de D417N.
1468. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1466 anteriores y que presenta una sustitución de D417T.
1469. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1466 anteriores y que presenta una sustitución de D417E.
1470. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1466 anteriores y que presenta una sustitución de D417Q.
1471. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1470 anteriores y que presenta una sustitución de S429D.
1472. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1470 anteriores y que presenta una sustitución de S429G.
1473. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1470 anteriores y que presenta una sustitución de S429M.
1474. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1470 anteriores y que presenta una sustitución de S429T.
1475. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1470 anteriores y que presenta una sustitución de S429A.
1476. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1475 anteriores y que presenta una sustitución de A434F.
1477. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1475 anteriores y que presenta una sustitución de A434S.
1478. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1475 anteriores y que presenta una sustitución de A434W.
1479. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1475 anteriores y que presenta una sustitución de A434Y.
1480. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1479 anteriores y que presenta una sustitución de K443I.
1481. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1479 anteriores y que presenta una sustitución de K443M.
1482. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1479 anteriores y que presenta una sustitución de K443L.
1483. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1479 anteriores y que presenta una sustitución de K443H.
1484. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1483 anteriores y que presenta una sustitución de A460C.
1485. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1483 anteriores y que presenta una sustitución de A460G.
1486. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1483 anteriores y que presenta una sustitución de A460M.
1487. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1483 anteriores y que presenta una sustitución de A460T.
1488. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1487 anteriores y que presenta una sustitución de R463A.
1489. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1487 anteriores y que presenta una sustitución de R463K.
1490. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1487 anteriores y que presenta una sustitución de R463M.
1491. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1490 anteriores y que presenta una sustitución de R464F.
1492. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1490 anteriores y que presenta una sustitución de R464V.
1493. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1490 anteriores y que presenta una sustitución de R464H.
1494. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1490 anteriores y que presenta una sustitución de R464K.
1495. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1494 anteriores y que presenta una sustitución de A465I.
1496. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1494 anteriores y que presenta una sustitución de A465W.
1497. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1494 anteriores y que presenta una sustitución de A465M.
1498. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1494 anteriores y que presenta una sustitución de A465R.
1499. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1494 anteriores y que presenta una sustitución de A465Y.
1500. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1499 anteriores y que presenta una sustitución de R473T.
1501. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1499 anteriores y que presenta una sustitución de R473C.
1502. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1499 anteriores y que presenta una sustitución de R473M.
1503. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1502 anteriores y que presenta una sustitución de L481F.
1504. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1502 anteriores y que presenta una sustitución de L481H.
1505. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1502 anteriores y que presenta una sustitución de L481R.
1506. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1502 anteriores y que presenta una sustitución de L481C.
1507. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1506 anteriores y que presenta una sustitución de T493C.
1508. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1506 anteriores y que presenta una sustitución de T493S.
1509. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1506 anteriores y que presenta una sustitución de T493V.
1510. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1506 anteriores y que presenta una sustitución de T493Q.
1511. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1510 anteriores y que presenta una sustitución de S499A.
1512. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1510 anteriores y que presenta una sustitución de S499C.
1513. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1510 anteriores y que presenta una sustitución de S499H.
1514. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1510 anteriores y que presenta una sustitución de S499N.
1515. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1510 anteriores y que presenta una sustitución de S499M.
1516. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1515 anteriores y que presenta una sustitución de S501V.
1517. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1515 anteriores y que presenta una sustitución de S501A.
1518. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1515 anteriores y que presenta una sustitución de S501I.
1519. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1515 anteriores y que presenta una sustitución de S501Q.
1520. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1519 anteriores y que presenta una sustitución de V531S.
1521. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1519 anteriores y que presenta una sustitución de V531T.
1522. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1519 anteriores y que presenta una sustitución de V531A.
1523. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1519 anteriores y que presenta una sustitución de V531C.
1524. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1523 anteriores y que presenta una sustitución de R536C.
1525. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1523 anteriores y que presenta una sustitución de R536Q.
1526. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1523 anteriores y que presenta una sustitución de R536L.
1527. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1523 anteriores y que presenta una sustitución de R536Y.
1528. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1523 anteriores y que presenta una sustitución de R536H.
1529. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1528 anteriores y que presenta una sustitución de V548F.
1530. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1528 anteriores y que presenta una sustitución de V548M.
1531. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1528 anteriores y que presenta una sustitución de V548T.
1532. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1531 anteriores y que presenta una sustitución de N550C.
1533. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1531 anteriores y que presenta una sustitución de N550G.
1534. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1531 anteriores y que presenta una sustitución de N550M.
1535. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1531 anteriores y que presenta una sustitución de N550S.
1536. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1531 anteriores y que presenta una sustitución de N550T.
1537. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1536 anteriores y que presenta una sustitución de A553E.
1538. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1536 anteriores y que presenta una sustitución de A553K.
1539. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1536 anteriores y que presenta una sustitución de A553P.
1540. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1536 anteriores y que presenta una sustitución de A553Q.
1541. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1536 anteriores y que presenta una sustitución de A553Y.
1542. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1541 anteriores y que presenta una sustitución de L554M.
1543. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1541 anteriores y que presenta una sustitución de L554V.
1544. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1541 anteriores y que presenta una sustitución de L554T.
1545. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1544 anteriores y que presenta una sustitución de G555K.
1546. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1544 anteriores y que presenta una sustitución de G555A.
1547. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1544 anteriores y que presenta una sustitución de G555H.
1548. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1547 anteriores y que presenta una sustitución de D558F.
1549. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1547 anteriores y que presenta una sustitución de D558L.
1550. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1547 anteriores y que presenta una sustitución de D558Q.
1551. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1547 anteriores y que presenta una sustitución de D558R.
1552. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1551 anteriores y que presenta una sustitución de T559E.
1553. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1551 anteriores y que presenta una sustitución de T559G.
1554. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1551 anteriores y que presenta una sustitución de T559I.
1555. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1551 anteriores y que presenta una sustitución de T559L.
1556. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1555 anteriores y que presenta una sustitución de S560F.
1557. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1555 anteriores y que presenta una sustitución de S560A.
1558. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1555 anteriores y que presenta una sustitución de S560K.
1559. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1555 anteriores y que presenta una sustitución de S560M.
1560. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1555 anteriores y que presenta una sustitución de S560V.
1561. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1560 anteriores y que presenta una sustitución de S572P.
1562. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1560 anteriores y que presenta una sustitución de S572E.
1563. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1560 anteriores y que presenta una sustitución de S572L.
1564. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1560 anteriores y que presenta una sustitución de S572V.
1565. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1560 anteriores y que presenta una sustitución de S572K.
1566. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1565 anteriores y que presenta una sustitución de D574I.
1567. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1565 anteriores y que presenta una sustitución de D574M.
1568. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1565 anteriores y que presenta una sustitución de D574N.
1569. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1565 anteriores y que presenta una sustitución de D574Y.
1570. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1569 anteriores y que presenta una sustitución de S578F.
1571. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1569 anteriores y que presenta una sustitución de S578A.
1572. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1569 anteriores y que presenta una sustitución de S578C.
1573. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1572 anteriores y que presenta una sustitución de K584F.
1574. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1572 anteriores y que presenta una sustitución de K584T.
1575. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1572 anteriores y que presenta una sustitución de K584V.
1576. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1575 anteriores y que presenta una sustitución de S588H.
1577. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1575 anteriores y que presenta una sustitución de S588L.
1578. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1575 anteriores y que presenta una sustitución de S588P.
1579. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1575 anteriores y que presenta una sustitución de S588Y.
1580. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1579 anteriores y que presenta una sustitución de I595G.
1581. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1579 anteriores y que presenta una sustitución de I595M.
1582. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1579 anteriores y que presenta una sustitución de I595T.
1583. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1579 anteriores y que presenta una sustitución de I595L.
1584. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1583 anteriores y que presenta una sustitución de K596D.
1585. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1583 anteriores y que presenta una sustitución de K596E.
1586. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1583 anteriores y que presenta una sustitución de K596N.
1587. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1586 anteriores y que presenta una sustitución de K602D.
1588. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1586 anteriores y que presenta una sustitución de K602I.
1589. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1586 anteriores y que presenta una sustitución de K602R.
1590. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1586 anteriores y que presenta una sustitución de K602F.
1591. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1590 anteriores y que presenta una sustitución de W605T.
1592. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1590 anteriores y que presenta una sustitución de W605Y.
1593. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1590 anteriores y que presenta una sustitución de W605F.
1594. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1593 anteriores y que presenta una sustitución de E606G.
1595. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1593 anteriores y que presenta una sustitución de E606K.
1596. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1593 anteriores y que presenta una sustitución de E606Q.
1597. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1596 anteriores y que presenta una sustitución de R611S.
1598. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1596 anteriores y que presenta una sustitución de R611N.
1599. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1596 anteriores y que presenta una sustitución de R611H.
1600. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1599 anteriores y que presenta una sustitución de S612C.
1601. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1599 anteriores y que presenta una sustitución de S612E.
1602. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1599 anteriores y que presenta una sustitución de S612W.
1603. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1599 anteriores y que presenta una sustitución de S612F.
1604. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1599 anteriores y que presenta una sustitución de S612H.
1605. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1604 anteriores y que presenta una sustitución de S619L.
1606. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1604 anteriores y que presenta una sustitución de S619E.
1607. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1604 anteriores y que presenta una sustitución de S619Q.
1608. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1607 anteriores y que presenta una sustitución de V629C.
1609. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1607 anteriores y que presenta una sustitución de V629S.
1610. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1607 anteriores y que presenta una sustitución de V629I
1611. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1607 anteriores y que presenta una sustitución de V629M.
1612. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1607 anteriores y que presenta una sustitución de V629Q.
1613. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1612 anteriores y que presenta una sustitución de D34M
1614. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1613 anteriores y que presenta una sustitución de P42C
1615. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1613 anteriores y que presenta una sustitución de P42Q
1616. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1615 anteriores y que presenta una sustitución de I43V.
1617. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1616 anteriores y que presenta una sustitución de K47R
1618. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1617 anteriores y que presenta una sustitución de A50D.
1619. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1617 anteriores y que presenta una sustitución de A50N
1620. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1619 anteriores y que presenta una sustitución de N55D
1621. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1620 anteriores y que presenta una sustitución de A58C.
1622. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1621 anteriores y que presenta una sustitución de A62H
1623. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1622 anteriores y que presenta una sustitución de A64P.
1624. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1623 anteriores y que presenta una sustitución de I68V.
1625. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1624 anteriores y que presenta una sustitución de S72C.
1626. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1624 anteriores y que presenta una sustitución de S72Q
1627. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1626 anteriores y que presenta una sustitución de R73M
1628. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1627 anteriores y que presenta una sustitución de D75H
1629. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1627 anteriores y que presenta una sustitución de D75R
1630. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1629 anteriores y que presenta una sustitución de P77D.
1631. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1630 anteriores y que presenta una sustitución de T83V.
1632. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1631 anteriores y que presenta una sustitución de
1633. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1631 anteriores y que presenta una sustitución de L90P.
1634. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1633 anteriores y que presenta una sustitución de S96A.
1635. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1633 anteriores y que presenta una sustitución de S96Y.
1636. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1635 anteriores y que presenta una sustitución de G98Y.
1637. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1635 anteriores y que presenta una sustitución de G98F.
1638. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1637 anteriores y que presenta una sustitución de Y101F.
1639. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1638 anteriores y que presenta una sustitución de T103Q.
1640. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1638 anteriores y que presenta una sustitución de T103V.
1641. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1640 anteriores y que presenta una sustitución de 1109T.
1642. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1640 anteriores y que presenta una sustitución de I109A.
1643. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1642 anteriores y que presenta una sustitución de Q110E.
1644. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1642 anteriores y que presenta una sustitución de Q110C.
1645. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1644 anteriores y que presenta una sustitución de V113E.
1646. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1644 anteriores y que presenta una sustitución de V113L.
1647. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1646 anteriores y que presenta una sustitución de S115A.
1648. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1647 anteriores y que presenta una sustitución de V122L.
1649. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1648 anteriores y que presenta una sustitución de S123A.
1650. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1648 anteriores y que presenta una sustitución de S123P.
1651. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1650 anteriores y que presenta una sustitución de S126A.
1652. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1651 anteriores y que presenta una sustitución de T128V.
1653. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1652 anteriores y que presenta una sustitución de F129L.
1654. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1653 anteriores y que presenta una sustitución de A146P.
1655. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1654 anteriores y que presenta una sustitución de T148L.
1656. La variante de GA del cualquiera de os puntos 1 a 1654 anteriores y que presenta una sustitución de T148M.
1657. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1656 anteriores y que presenta una sustitución de E150P.
1658. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1656 anteriores y que presenta una sustitución de E150R.
1659. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1658 anteriores y que presenta una sustitución de A165S.
1660. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1659 anteriores y que presenta una sustitución de L166M.
1661. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1660 anteriores y que presenta una sustitución de L166C.
1662. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1661 anteriores y que presenta una sustitución de Y169E.
1663. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1661 anteriores y que presenta una sustitución de Y169F.
1664. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1663 anteriores y que presenta una sustitución de A170C.
1665. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1663 anteriores y que presenta una sustitución de A170I.
1666. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1665 anteriores y que presenta una sustitución de A182V.
1667. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1666 anteriores y que presenta una sustitución de V185N.
1668. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1666 anteriores y que presenta una sustitución de V185Q.
1669. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1668 anteriores y que presenta una sustitución de P188K.
1670. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1669 anteriores y que presenta una sustitución de L194I.
1671. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1670 anteriores y que presenta una sustitución de T197A.
1672. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1670 anteriores y que presenta una sustitución de T197G.
1673. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1672 anteriores y que presenta una sustitución de F206Y.
1674. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1673 anteriores y que presenta una sustitución de F218W.
1675. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1674 anteriores y que presenta una sustitución de S222M.
1676. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1674 anteriores y que presenta una sustitución de S222Q.
1677. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1676 anteriores y que presenta una sustitución de H224A.
1678. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1677 anteriores y que presenta una sustitución de A226S.
1679. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1678 anteriores y que presenta una sustitución de Y232F.
1680. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1679 anteriores y que presenta una sustitución de L237I.
1681. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1680 anteriores y que presenta una sustitución de P249D.
1682. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1681 anteriores y que presenta una sustitución de Q256F.
1683. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1682 anteriores y que presenta una sustitución de A257G.
1684. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1682 anteriores y que presenta una sustitución de A257F.
1685. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1684 anteriores y que presenta una sustitución de F258N.
1686. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1685 anteriores y que presenta una sustitución de W259Y.
1687. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1686 anteriores y que presenta una sustitución de Y265W.
1688. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1687 anteriores y que presenta una sustitución de V267K.
1689. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1687 anteriores y que presenta una sustitución de V267R.
1690. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1689 anteriores y que presenta una sustitución de S268C.
1691. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1690 anteriores y que presenta una sustitución de G272C.
1692. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1691 anteriores y que presenta una sustitución de G273H.
1693. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1692 anteriores y que presenta una sustitución de S277T.
1694. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1693 anteriores y que presenta una sustitución de D280V.
1695. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1694 anteriores y que presenta una sustitución de A281L.
1696. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1695 anteriores y que presenta una sustitución de I284L.
1697. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1695 anteriores y que presenta una sustitución de I284V.
1698. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1697 anteriores y que presenta una sustitución de A286L.
1699. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1697 anteriores y que presenta una sustitución de A286T.
1700. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1699 anteriores y que presenta una sustitución de S287C.
1701. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1699 anteriores y que presenta una sustitución de S287Q.
1702. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1701 anteriores y que presenta una sustitución de Q303E.
1703. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1702 anteriores y que presenta una sustitución de S306C.
1704. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1703 anteriores y que presenta una sustitución de E307D.
1705. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1703 anteriores y que presenta una sustitución de E307P.
1706. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1705 anteriores y que presenta una sustitución de H313Y.
1707. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1706 anteriores y que presenta una sustitución de Y316W.
1708. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1707 anteriores y que presenta una sustitución de D318M.
1709. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1708 anteriores y que presenta una sustitución de N322H.
1710. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1708 anteriores y que presenta una sustitución de N322C.
1711. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1709 anteriores y que presenta una sustitución de V336C.
1712. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1709 anteriores y que presenta una sustitución de V336I.
1713. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1712 anteriores y que presenta una sustitución de A337S.
1714. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1713 anteriores y que presenta una sustitución de N348G.
1715. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1714 anteriores y que presenta una sustitución de A355S.
1716. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1714 anteriores y que presenta una sustitución de A355C.
1717. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1716 anteriores y que presenta una sustitución de N356S.
1718. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1717 anteriores y que presenta una sustitución de A359G.
1719. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1717 anteriores y que presenta una sustitución de A359S.
1720. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1719 anteriores y que presenta una sustitución de L363A.
1721. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1719 anteriores y que presenta una sustitución de L363V.
1722. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1721 anteriores y que presenta una sustitución de S375A.
1723. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1721 anteriores y que presenta una sustitución de S375L.
1724. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1723 anteriores y que presenta una sustitución de T377S.
1725. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1723 anteriores y que presenta una sustitución de T377A.
1726. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1725 anteriores y que presenta una sustitución de V378L.
1727. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1725 anteriores y que presenta una sustitución de V378T.
1728. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1727 anteriores y que presenta una sustitución de L383C.
1729. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1727 anteriores y que presenta una sustitución de L383N.
1730. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1729 anteriores y que presenta una sustitución de F385L.
1731. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1730 anteriores y que presenta una sustitución de D388A.
1732. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1730 anteriores y que presenta una sustitución de D388C.
1733. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1732 anteriores y que presenta una sustitución de T404Q.
1734. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1733 anteriores y que presenta una sustitución de E421C.
1735. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1733 anteriores y que presenta una sustitución de E421Q.
1736. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1735 anteriores y que presenta una sustitución de V422F.
1737. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1736 anteriores y que presenta una sustitución de A424C.
1738. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1736 anteriores y que presenta una sustitución de A424Q.
1739. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1738 anteriores y que presenta una sustitución de K425M.
1740. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1738 anteriores y que presenta una sustitución de K425R.
1741. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1740 anteriores y que presenta una sustitución de Y426F.
1742. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1741 anteriores y que presenta una sustitución de A432D.
1743. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1741 anteriores y que presenta una sustitución de A432S.
1744. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1743 anteriores y que presenta una sustitución de N440D.
1745. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1744 anteriores y que presenta una sustitución de S446G.
1746. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1745 anteriores y que presenta una sustitución de T451S.
1747. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1746 anteriores y que presenta una sustitución de F457A.
1748. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1747 anteriores y que presenta una sustitución de R487S.
1749. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1748 anteriores y que presenta una sustitución de I488V.
1750. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1749 anteriores y que presenta una sustitución de V495I.
1751. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1750 anteriores y que presenta una sustitución de A496P.
1752. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1751 anteriores y que presenta una sustitución de A497Q.
1753. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1751 anteriores y que presenta una sustitución de A497S.
1754. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1753 anteriores y que presenta una sustitución de F502I.
1755. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1754 anteriores y que presenta una sustitución de S504T.
1756. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1755 anteriores y que presenta una sustitución de A513D.
1757. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1755 anteriores y que presenta una sustitución de A513G.
1758. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1757 anteriores y que presenta una sustitución de P516E.
1759. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1757 anteriores y que presenta una sustitución de P516A.
1760. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1759 anteriores y que presenta una sustitución de P520V.
1761. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1760 anteriores y que presenta una sustitución de T521W.
1762. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1760 anteriores y que presenta una sustitución de T521S.
1763. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1762 anteriores y que presenta una sustitución de S527F.
1764. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1763 anteriores y que presenta una sustitución de V529W.
1765. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1764 anteriores y que presenta una sustitución de T532W.
1766. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1764 anteriores y que presenta una sustitución de T532Y.
1767. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1766 anteriores y que presenta una sustitución de N534D.
1768. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1766 anteriores y que presenta una sustitución de N534E.
1769. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1768 anteriores y que presenta una sustitución de E535Q.
1770. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1769 anteriores y que presenta una sustitución de T539S.
1771. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1770 anteriores y que presenta una sustitución de E543C.
1772. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1770 anteriores y que presenta una sustitución de E543I.
1773. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1772 anteriores y que presenta una sustitución de I545V.
1774. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1773 anteriores y que presenta una sustitución de V547A.
1775. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1773 anteriores y que presenta una sustitución de V547C.
1776. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1775 anteriores y que presenta una sustitución de G549A.
1777. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1776 anteriores y que presenta una sustitución de K571R.
1778. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1776 anteriores y que presenta una sustitución de K571T.
1779. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1778 anteriores y que presenta una sustitución de L576K.
1780. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1779 anteriores y que presenta una sustitución de I579M.
1781. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1780 anteriores y que presenta una sustitución de I583M.
1782. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1781 an terio res y que presen ta una sustituc ión de T586L.
1783. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1781 anteriores y que presenta una sustitución de T586R.
1784. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1783 anteriores y que presenta una sustitución de Y592H.
1785. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1784 anteriores y que presenta una sustitución de Y594M.
1786. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1784 anteriores y que presenta una sustitución de Y594H.
1787. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1786 anteriores y que presenta una sustitución de G622P.
1788. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1786 anteriores y que presenta una sustitución de G622W.
1789. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1788 anteriores y que presenta una sustitución de Q627E.
1790. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1788 anteriores y que presenta una sustitución de Q627A.
1791. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1790 anteriores y que presenta una sustitución de T628L.
1792. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1791 anteriores y que presenta una sustitución de N630C.
1793. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1792 anteriores y que presenta una sustitución de D631Q.
1794. La variante de GA del cualquiera de los puntos 1 a 1792 anteriores y que presenta una sustitución de D631S.
[0104] En determinados modos de realización, una variante de enzima GA contiene una o más sustitución(es) de aminoácidos correspondientes a las sustituciones de la HgGA tal como se expone en las Cohortes de SEL 1 a 10 tal como se muestran en el Ejemplo 3. Las Cohortes de SEL 1 a 10 se clasifican de la siguiente manera (aquí no se enumera cada variante, se enumeran en el Ejemplo 3):
Cohorte de SEL 1 - Variantes de HgGA que presentan un Índice de Rendimiento (PI, por sus siglas en inglés) mejorado en la expresión (PI > 1,2);
Cohorte de SEL 2 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en la termoestabilidad (actividad de hidrólisis de DP7 residual tras 5 min a 63,5 °C / actividad de hidrólisis de DP7 inicial) (PI > 1.2);
Cohorte de SEL 3 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 5,5 (PI > 1,2);
Cohorte de SEL 4 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 6,8 (PI > 1,2);
Cohorte de SEL 5 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP2 (PI > 1,2 en el ensayo Km o el ensayo Vmax);
Cohorte de SEL 6 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de pululano (PI > 1,2);
Cohorte de SEL 7 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de panosa (PI > 1,2);
Cohorte de SEL 8 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de almidón de maíz (PI > 1,2);
Cohorte de SEL 9 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la inhibición de glucosa de la actividad enzimática [mayor proporción de (muestra de inhibición)/(sin muestra de inhibición) en comparación con las de origen natural] (PI > 1,2); y
Cohorte de SEL 10 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la reversión de la glucosa a productos DP2+ (menor reversión, mayor PI) (PI > 1,2).
[0105] Determinadas sustituciones de aminoácidos se incluyen en más de una Cohorte de SEL, y por tanto proporcionan mejoras en más de una propiedad (es decir, al demostrar un resultado mejorado en dos o más de
los ensayos (a) a (j) anteriores). Por tanto, entre los aspectos de la exposición se incluyen sustituciones en una GA correspondientes a las sustituciones de HgGA que se incluyen en más de una Cohorte de SEL 1 a 10 anteriores, incluyendo al menos dos Cohortes de SEL, al menos tres Cohortes de SEL, al menos cuatro Cohortes de SEL, al menos cinco Cohortes de SEL, al menos seis Cohortes de SEL, al menos siete Cohortes de SEL, al menos ocho Cohortes de SEL, o al menos nueve Cohortes de SEL. Un análisis de los elementos de las variantes de HgGA de las Cohortes de SEL enumeradas en el Ejemplo 3 identifica claramente las variantes que pertenecen a múltiples Cohortes de SEL y por tanto tienen más de una propiedad mejorada.
[0106] Las siguientes Tablas 2 a 5 muestran la posible clase funcional de variantes de GA que pertenecen a dos, tres, cuatro o cinco Cohortes de SEL. Cada una de las clases funcionales enumeradas en las Tablas 2 a 5 se llama así por los números de las Cohortes de SEL a las que pertenece cada variante de GA de la clase funcional. Por ejemplo, la clase funcional llamada «2.5.8» es una cuyos elementos de la variante de GA pertenecen a las Cohortes 2, 5 y 8 (y posiblemente más) y de este modo, cada elemento de esta clase funcional presenta (al menos) tres propiedades mejoradas que definen las Cohortes de SEL 2, 5 y 8 (es decir, mejora de la termoestabilidad, de la hidrólisis de DP2, y de la hidrólisis del almidón de maíz). Tal como se ha señalado anteriormente, el listado de variantes de GA que pertenece a cada Cohorte de SEL que se muestra en el Ejemplo 3 puede utilizarse para identificar con claridad qué variante(s) pertenecen a qué clase funcional enumerada en las Tablas 2 a 5 (así como las clases funcionales de variantes de GA que pertenecen a seis, siete, ocho o nueve Cohortes de SEL, que pueden derivarse fácilmente del Ejemplo 3). Cabe destacar que en las Tablas 2 a 5, no se muestran las columnas y las filas en las que podrían haberse enumerado solo combinaciones de Cohortes de SEL duplicadas (es decir, combinaciones que se enumeran en otro lugar de la tabla).
Tabla 2: Clases funcionales de combinaciones de dos Cohortes de SEL
Tabla 3: Clases funcionales de combinaciones de tres Cohortes de SEL (la columna de la izquierda enumera combinaciones de dos de la tabla anterior)
Tabla 4: Clases funcionales de combinaciones de cuatro Cohortes de SEL (la columna de la izquierda enumera combinaciones de tres de la tabla anterior)
Tabla 5: Clases funcionales de combinaciones de cinco Cohortes de SEL (la columna de la izquierda enumera combinaciones de cuatro de la tabla anterior)
Cohorte(s) de SEL 6
[0107] Además de las Cohortes de SEL y clases funcionales anteriores, se identificaron las sustituciones de aminoácidos en la HgGA que tienen un PI para todos los ensayos que es <1,2 y > 0,9 y se categorizaron como la Cohorte de SEL 11. En determinados modos de realización de la exposición objeto, una o una combinación de sustituciones en la Cohorte de SEL 11 son de utilidad al generar variantes de HgGA combinatorias con una o más de las sustituciones identificadas en cualquiera de las Cohortes de SEL 1 a 10 anteriores. En otros modos de realización, pueden estar presentes una o más sustituciones en la Cohorte de SEL 11 en una variante de GA sin sustituciones adicionales seleccionadas de las Cohortes de SEL 1 a 10.
[0108] Tal como se describe a continuación en el Ejemplo 3, un conjunto específico de variantes combinatorias de HgGA se analizaron y se categorizaron en Cohortes de la siguiente manera:
Cohorte de SEL combinatoria 1 - Variantes de HgGA combinatorias que presentan un PI mejorado en la expresión (PI > 1,1): G92T-I164N-Y346W, G92T-E535W, P54D-K328Q, T35S-G92T-T239A-A448V-1461A-K571T, 143F-T239N-N271Q-E535T-K546S, P60Q-F206V, T35S-G92T-T239A, I43D-G92F-Y346W, G92F-E203A-S375D-P552I, A448V-1461A-E543H-A567R-K596I, P60Q-F79V-F206V, K139R-F147N-F206D, T74R-A448V-E535A-E543H-K571R, I43F-T239N-A448V-I461A-K546S-K596I, D75R-K571R, F79V-F147M-N534S-E535W, A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, A448V-I461A-K571R-K596I, I43F-P54D-G92F-K328Q-S375D, I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S, G92F-S375D, W577K-W605K, D75R-G92I-E203F-K571R, G92F-L144F-D462Q-A567R, D75R-G92I-K571R, P60Q-F79V-E203F-F206V, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, K139R-F147N-F206D-P213W-K571F, V422P-D449A-S568R-G569W, D75E-F79D-D449A-S568R, I43F-T239N-N271Q-A448V-I461A-E535T-E543H-K546S-K571R-K596I, y F79T-G92F-S96L-L144F-I164N;
Cohorte de SEL combinatoria 2 - Variantes de HgGA combinatorias que presentan un PI mejorado en la termoestabilidad (actividad de la hidrólisis de DP7 residual tras 5 min a 63,5 °C / actividad de la hidrólisis de DP7 inicial) (PI > 1,1): F79T-G92F-S96L-L144F-I164N, A448V-I461A-E543H-A567R-K596I, A448V-I461A-K571R-K596I, A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, y T35S-G092T-T239A-A448V-I461A-K571T;
Cohorte de SEL combinatoria 3 - Variantes de HgGA combinatorias que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 5,5 (PI > 1,1): I43D-G92F-Y346W, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, G92T-1164N-Y346W, A448V-1461A-E543H-K571R-K596I, A448V-I461A-E543HA567R-K596I, P60Q-F79V-E203F-F206V, T74R-A448V-E535A-E543H-K571R, y A448V-I461A-K571R-K596I;
Cohorte de SEL combinatoria 4 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 6,8 (PI > 1,1): I43D-G92F-Y346W, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, y A448V-I461A-E543H-K571R-K596I;
Cohorte de SEL combinatoria 5 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP2 (PI > 1,1 en el ensayo Km o el ensayo Vmax); A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, T74R-A448V-E535A-E543H-K571R, D75R-K571R, y G92F-L144F-D462Q-A567R;
Cohorte de SEL combinatoria 6 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de pululano (PI > 1,1); A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S, y A448V-I461A-K571R-K596I;
Cohorte de SEL combinatoria 7 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de panosa (PI > 1,1); K139R-F147N-F206D-P213W-K571F, A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, V422P-D449A-S568R-G569W, y T74R-A448V-E535A-E543H-K571R;
Cohorte de SEL combinatoria 8 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de almidón de maíz (PI > 1,1); T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, F79T-G92F-S096L-L144F-I164N, y I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S;
Cohorte de SEL combinatoria 9 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la inhibición de glucosa de la actividad enzimática [mayor proporción de (muestra de inhibición)/(sin muestra de inhibición) en comparación con las de origen natural] (PI > 1,1): D75E-F79D-D449A-S568R, I43F-T239N-N271Q-E535T-K546S, I43F-T239N-N271Q-A448V-I461A-E535T-E543H-K546S-K571R-K596I, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, G92F-L144F-D462Q-A567R, T35S-G92T-T239A, T35S-G92T-T239A-T441L, G92F-E23A-S375D-P552I, P60Q-F79V-E203F-F206V; y
Cohorte de SEL 10 combinatoria - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la reversión de la glucosa a productos DP2+ (menor reversión, mayor PI) (PI > 1,1): D75E-F79D-D449A-S568R, F79T-G92F-S96L-L144F-I164N, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, I43D-G92F-Y346W, V422P-D449A-S568R-G569W, F79V-F147M-N534S-E535W, G92T-I164N-Y346W, P60Q-F79V-E203F-F206V, G92F-L144F-D462Q-A567R, I43F-P54D-G92F-K328Q-S375D, D75R-G92I-E203F-K571R, P60Q-F79V-F206V, D75R-G92I-K571R, G92F-E203A-S375D-P552I, G92F-S375D, D75R-K571R, P60Q-F206V, y I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S.
[0109] Determinadas variantes combinatorias pertenecen a más de una Cohorte de SEL combinatoria, y por tanto proporcionan mejoras en más de una propiedad (es decir, al demostrar un resultado mejorado en dos o más de los ensayos (a) a (j) anteriores). Por tanto, entre los aspectos de la exposición se incluyen variantes de HgGA combinatorias que pertenecen a más de una de las Cohortes de SEL combinatorias 1 a 10 anteriores, incluyendo al menos dos Cohortes de SEL combinatorias, al menos tres Cohortes de SEL combinatorias, al menos cuatro Cohortes de SEL combinatorias, al menos cinco Cohortes de SEL combinatorias, al menos seis Cohortes de SEL combinatorias, al menos siete Cohortes de SEL combinatorias, o al menos ocho Cohortes de SEL combinatorias. Un análisis de las Cohortes de SEL combinatorias enumeradas anteriormente (y en el Ejemplo 3) identifica claramente las variantes combinatorias que pertenecen a múltiples Cohortes de SEL combinatorias y por tanto tienen más de una propiedad mejorada.
[0110] En determinados modos de realización, una variante de enzima GA contiene una o más sustitución(es) de aminoácidos correspondientes a las sustituciones de la HgGA tal como se exponen en las Cohortes de SEL.
[0111] En algunos modos de realización, una variante de conformidad con la exposición comprenderá un fragmento o dominio funcional de una variante de GA. Por ejemplo, una variante de GA de conformidad con aspectos de la presente exposición puede incluir una variante del dominio catalítico de una HgGA original (por ejemplo, del aminoácido 32 a aproximadamente el aminoácido 466 de la SEQ ID NO:3), una variante de la región de enlace de una HgGA original (por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 467 a aproximadamente el aminoácido 526 de la SEQ ID NO:3), una variante del dominio de unión al almidón de una HgGA original (por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 527 a aproximadamente el aminoácido 634 de la SEQ ID NO:3), o variantes de dominios que presentan al menos un 60 % de identidad de secuencia con estos dominios (por ejemplo, que presentan al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 99 % de identidad de secuencia con uno o más de estos dominios). Por tanto, aunque la secuencia completa de una variante de GA puede no tener al menos un 60 % (o más) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, las variantes de GA en las que la variante del dominio de unión al almidón, del de enlace y/o del catalítico presentan al menos un 60 % (o más) de identidad de secuencia con el dominio relevante de la SEQ ID NO:4 se comprenden en aspectos de la presente exposición.
[0112] Las variantes de GA según algunos aspectos de la presente invención también incluyen GA híbridos o quiméricos con, por ejemplo, un dominio de unión al almidón (SBD, por sus siglas en inglés) de una primera GA y un dominio catalítico y/o enlace de una segunda GA, donde al menos uno de los dominios es una variante de un dominio de la respectiva GA original.
[0113] Los polinucleótidos (o ácidos nucleicos) que codifican una variante de enzima GA que presenta una o más mutaciones con respecto a una enzima GA original (por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente) también se proporcionan en el presente documento. En determinados modos de realización, la variante de GA codificada por el polinucleótido objeto presenta al menos un 60 % (es decir, un 60 % o más tal como se especificó anteriormente) de identidad de secuencia de aminoácidos con la HgGA (SEQ ID NO:4). En determinados modos de realización, el polinucleótido que codifica una variante de enzima GA presenta al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87%, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o
incluso al menos un 99 % de identidad/homología con la SEQ ID NO: 1 (excluyendo la parte del ácido nucleico que codifica la secuencia señal) o la SEQ ID NO:2. Se apreciará que, debido a la degeneración del código genético, una pluralidad de ácidos nucleicos puede codificar la misma variante de enzima GA. Además, los ácidos nucleicos que codifican una variante de enzima GA tal como se describe en el presente documento pueden estar modificados para ser de codones optimizados, por ejemplo para mejorar la expresión en una célula hospedadora de interés. En la técnica se conocen algunas técnicas de optimización de codones.
[0114] En determinados modos de realización, el ácido nucleico que codifica una variante de enzima GA hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que codifica (o complementario a un ácido nucleico que codifica) una GA que presenta al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91%, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de identidad/homología con la SEQ ID NO: 1 (excluyendo la parte del ácido nucleico que codifica la secuencia señal) o la SEQ ID NO:2.
[0115] Los ácidos nucleicos pueden codificar una variante de enzima GA «de longitud completa» («fl» o «FL», por sus siglas en inglés), que incluye una secuencia señal (por ejemplo, la SEQ ID NO:3), solo la forma madura de la variante de enzima GA, a la que le falta la secuencia señal (por ejemplo, la SEQ ID NO:4), o una forma truncada de una variante de enzima GA, a la que le faltan porciones del extremo N- y C-terminal de la forma madura pero que mantiene la actividad de la glucoamilasa.
[0116] Un ácido nucleico que codifica una variante de enzima GA puede estar ligado de forma operativa a varios promotores y reguladores en un vector adecuado para la expresión de la variante de enzima GA en una célula(s) hospedadora(s) de interés, tal como se describirá a continuación.
IV. EXPRESIÓN DE VARIANTES DE GA RECOMBINANTES
[0117] Entre los aspectos de la invención objeto se incluyen métodos y composiciones relacionadas con la generación de ácidos nucleicos que codifican variantes de Ga , células hospedadoras que contienen tales ácidos nucleicos, la producción de variantes de GA por dichas células hospedadoras, y el aislamiento, purificación y uso de las variantes de GA.
[0118] De este modo, los modos de realización de la invención proporcionan células hospedadoras que se han transducido, transformado o transfectado con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de GA deseada. Por ejemplo, se transfecta una célula de hongo filamentoso o una célula de levadura con un vector de expresión que tiene un promotor o un fragmento de promotor biológicamente activo o uno o varios (p. ej., una serie) de los potenciadores que funciona en la línea de la célula hospedadora, operativamente unidos a un segmento de ADN que codifica una variante de GA deseada, dicha variante de GA deseada se expresa en la línea celular.
A. Vectores de expresión/constructos de ácidos nucleicos
[0119] Se pueden incorporar fragmentos de polinucleótidos naturales o sintéticos que codifican una variante de GA deseada en vectores o constructos de ácidos nucleicos heterólogos, capaces de la introducción y la replicación en una célula hospedadora de interés (por ejemplo, una célula de levadura o fúngica filamentosa). Los vectores y métodos expuestos en el presente documento son adecuados para utilizarse en células hospedadoras para la expresión de una variante de GA deseada. Puede utilizarse cualquier vector siempre que cumpla las características de expresión/replicación en la(s) célula(s) hospedadora(s) en las que se introduzcan (estando estas características generalmente definidas por el usuario). Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y algunos de estos están disponibles comercialmente. Los vectores de clonación y expresión también se describen en Sambrook et al., 1989, Ausubel FM et al., 1989, y Strathern et al., 1981. Se describen vectores de expresión adecuados para hongos en van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) En: Bennett, J.W. and Lasure, L.L. (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428. La secuencia de ADN adecuada se puede insertar en un plásmido o vector (denominados colectivamente en el presente documento como «vectores») mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción adecuado(s) mediante procedimientos estándar. Se considera que dichos procedimientos y los procedimientos de subclonación relacionados están dentro del alcance del conocimiento de los expertos en la materia.
[0120] Las células hospedadoras recombinantes que comprenden la secuencia codificadora para una variante de GA deseada pueden producirse al introducir un constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende la secuencia codificadora de la variante GA deseada en las células hospedadoras deseadas (por ejemplo, tal como se describe en adelante con más detalle). Por ejemplo, puede insertarse una secuencia codificadora de la variante de GA deseada seleccionada en un vector adecuado de conformidad con técnicas recombinantes conocidas y utilizarse para transformar un hongo filamentoso capaz de la expresión de GA. Tal como se ha destacado anteriormente, debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden utilizar otras
secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o funcionalmente equivalente para clonar y expresar la variante de GA deseada. Por lo tanto, se entiende que dichas sustituciones en la región codificadora están dentro de las variantes de secuencias cubiertas por la presente invención.
[0121] La presente invención también incluye constructos de ácidos nucleicos recombinantes que comprenden una o varias de las secuencias de ácido nucleico que codifican variantes de GA deseadas como se describe anteriormente. Los constructos comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa.
[0122] Los constructos de ácidos nucleicos heterólogos pueden incluir la secuencia codificadora para la variante de GA deseada: (i) de manera aislada; (ii) en combinación con secuencias codificadoras adicionales; tales como secuencias codificadoras de polipéptidos de fusión o de péptido señal, en las que la secuencia que codifica la variante de GA deseada es la secuencia codificadora dominante; (iii) en combinación con secuencias no codificadoras, tales como intrones y elementos de control, tales como elementos promotores y terminadores o regiones 5' y/o 3' no traducidas, eficaces para la expresión de la secuencia codificadora en un hospedador adecuado; y/o (iv) en un vector o medio hospedador en el que la secuencia que codifica la variante de GA deseada es un gen heterólogo.
[0123] En un aspecto de la presente invención, se emplea un constructo de ácido nucleico heterólogo para transferir una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de GA deseada en una célula hospedadora in vitro, por ejemplo en líneas de levadura y de hongos filamentosos establecidos. Puede conseguirse la producción a largo plazo de una variante de GA deseada al generar una célula hospedadora que presente una expresión estable de la variante de GA. Por tanto, se deduce que se puede utilizar cualquier método efectivo para generar transformantes estables en la práctica de la invención.
[0124] Los vectores adecuados están normalmente equipados con una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, sitios de inserción y elementos de control adecuados, tales como secuencias de promotor y de terminación. El vector puede comprender secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, secuencias no codificadoras, tales como intrones y elementos de control, es decir, elementos promotores y terminadores o regiones 5' y/o 3' no traducidas, eficaces para la expresión de la secuencia codificadora en células hospedadoras (y/o en un medio de célula hospedadora o vector en el que normalmente no se expresa una secuencia codificadora de antígeno de proteína soluble modificada), operativamente unidas a la secuencia codificadora. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, muchos de los cuales están disponibles comercialmente y/o se describen en Sambrook, et al., (supra).
[0125] Entre los ejemplos de promotores adecuados se incluyen promotores constitutivos y promotores inducibles, ejemplos de los cuales incluyen un promotor CMV, un promotor SV40 temprano, un promotor RSV, un promotor EF-1a, un promotor que contiene el elemento de respuesta Tet (TRE, por sus siglas en inglés) en el sistema tet-on o tet-off como se describe (ClonTech y BASF), el promotor beta actina y el promotor metalotionina que se pueden regular por incremento mediante la adición de determinadas sales de metales. Una secuencia promotora es una secuencia de ADN que es reconocida por la célula hospedadora concreta con fines de expresión. Está operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de variante de GA. Dicha unión comprende situar el promotor con respecto al codón de iniciación de la secuencia de ADN que codifica la variante de polipéptido de GA en el vector de expresión de manera que el promotor pueda conducir la transcripción/traducción de la secuencia que codifica la variante de GA. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción y la traducción que median en la expresión del polipéptido de variante de GA. Entre los ejemplos se incluyen los promotores de genes que codifican glucoamilasa, alfa-amilasa, o alfaglucosidasa de Aspergillus niger, A awamori o A. oryzae; los genes gpdA o trpC de A. nidulans; los genes cbhl o trp l de Neurospora crassa; los genes que codifican proteinasa aspártica de A. niger o Rhizomucor miehei; los genes que codifican cbhl, cbh2, egll, egl2, u otras celulasas de H. jecorina.
[0126] La elección del marcador seleccionable adecuado dependerá de la célula hospedadora, y en la técnica se conocen bien los marcadores adecuados para diferentes hospedadores. Los genes marcadores seleccionables típicos incluyen argB de A.nidulans o H. jecorina, amdS de A.nidulans, pyr4 de Neurospora crassa o H. jecorina, pyrG de Aspergillus niger o A.nidulans. Ejemplos adicionales de marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero sin carácter limitativo, trpc, trp l, oliC31, niaD o leu2, que se incluyen en constructos de ácido nucleico heterólogo utilizados para transformar una cepa mutante tal como trp-, pyr-, leu- y similares.
[0127] Dichos marcadores seleccionables confieren a los transformantes la capacidad de utilizar un metabolito que normalmente no es metabolizado por los hongos filamentosos. Por ejemplo, el gen amdS de H. jecorina que codifica la enzima acetamidasa, permite que las células transformantes crezcan en acetamida como fuente de nitrógeno. El marcador seleccionable (p. ej., pyrG) puede restaurar la capacidad de una cepa mutante auxotrófica para crecer en un medio mínimo selectivo o el marcador seleccionable (p. ej., olic3l) puede conferir a los transformantes la capacidad de crecer en presencia de un fármaco inhibidor o antibiótico.
[0128] La secuencia codificadora del marcador seleccionable se clona en cualquier plásmido adecuado utilizando métodos generalmente empleados en la técnica. Ejemplos de plásmidos adecuados incluyen pUC18, pBR322,
pRAX y pUC100. El plásmido pRAX contiene secuencias AMA1 de A. nidulans, que posibilitan la replicación en A. niger.
[0129] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la técnica. Dichas técnicas se explican de forma completa en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Freshney, 1987; Ausubel, et al., 1993; y Coligan et al., 1991.
B. Células hospedadoras y condiciones de cultivo para la producción de enzimas GA y variantes de GA
[0130] Después de que se hayan clonado las secuencias de ADN que codifican las variantes de GA en constructos de ADN, se utiliza el ADN para transformar microorganismos. El microorganismo que se va a transformar con el fin de expresar una variante de GA de acuerdo con la presente invención se puede escoger de entre una amplia variedad de células hospedadoras. Las secciones que se exponen a continuación se proporcionan como ejemplos de microorganismos/células hospedadoras, y no pretenden limitar el alcance de células hospedadoras que se pueden emplear en aspectos de práctica de la presente invención.
(i) Hongos filamentosos
[0131] Entre los aspectos de la presente invención se incluyen hongos filamentosos que han sido modificados, seleccionados y cultivados de manera efectiva para dar como resultado una producción o expresión de variantes de GA deseadas en relación con los correspondientes hongos filamentosos parentales no transformados.
[0132] Entre los ejemplos de especies de hongos filamentosos originales que se pueden tratar y/o modificar para la expresión deseada de glucoamilasas se incluyen, aunque sin carácter limitativo, Trichoderma, Penicillium sp., Humicola sp., incluida Humicola insolens; Aspergillus sp., incluida Aspergillus niger, Chrysosporium sp., Myceliophthora sp., Fusarium sp., Hypocrea sp., y Emericella sp.
[0133] Las células que expresan una variante de GA deseada se cultivan en condiciones empleadas normalmente para cultivar la línea fúngica parental. Generalmente, las células se cultivan en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes, tal como se describe en Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 y Ilmen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997. En la técnica se conocen condiciones convencionales de cultivo, p. ej., se incuban cultivos a 28 °C en cultivos con agitador o fermentadores hasta alcanzar niveles deseados de expresión de variantes de GA deseadas.
[0134] Se pueden encontrar condiciones de cultivo para un hongo filamentoso determinado, por ejemplo, en la literatura científica y/o de la fuente de los hongos, tal como la American Type Culture Collection (ATCC). Después de haber establecido el crecimiento fúngico, las células se exponen a condiciones efectivas para provocar o permitir la expresión de una variante de GA deseada modificada.
[0135] En los casos en los que una secuencia que codifica una variante de GA deseada está controlada por un promotor inducible, el agente inductor, por ejemplo, un azúcar, sal metálica o antibiótico, se añade al medio en una concentración efectiva para inducir la expresión de la variante de GA deseada.
[0136] En una forma de realización, la cepa es una cepa de Aspergillus niger, que es una cepa útil para obtener proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que A. niger var awamori dgr246 secreta cantidades elevadas de celulasas secretadas (Goedegebuur et al., Curr. Genet (2002) 41: 89-98). Se conocen otras cepas de Aspergillus niger var awamori, tales como GCDAP3, GCDAP4 y GAP3-4 (Ward et al, 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol.
39:738-743).
[0137] En otra forma de realización, la cepa es una cepa de Trichoderma reesei, que es una cepa útil para obtener proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que RL-P37, descrita por Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53 (1984) secreta cantidades elevadas de enzimas de celulasa. Entre los equivalentes funcionales de RL-P37 se incluye la cepa RUT-C30 (ATCC n.° 56765) y la cepa QM9414 (ATCC n.° 26921) de Trichoderma reesei. Se contempla que estas cepas también serían útiles en la sobreexpresión de la variante GA.
[0138] Cuando se desea obtener una variante de GA en ausencia de actividad de glucoamilasa nativa potencialmente perjudicial, resulta útil obtener una cepa de células hospedadoras en la que se hayan delecionado uno o más genes de glucoamilasa antes de la introducción de un constructo de ADN o plásmido que contenga el fragmento de ADN que codifica la variante deseada de GA. Dichas cepas se pueden preparar de cualquier modo conveniente, por ejemplo, mediante el método dado a conocer en los documentos de patente U.S. 5,246,853 y WO 92/06209. Mediante la expresión de una variante de GA deseada en un microorganismo hospedador al que le falta uno o más genes de glucoamilasa (p. ej., el gen de glucoamilasa endógeno de una célula hospedadora), se simplifican, cuando así se desee, los procedimientos de identificación y posterior purificación.
[0139] La deleción de genes se puede conseguir insertando una forma del gen que se desea delecionar o alterar en un plásmido mediante métodos conocidos en la técnica. El plásmido de deleción se corta a continuación en
un sitio(s) de enzimas de restricción adecuado(s), interno a la región codificadora del gen deseado, y la secuencia codificadora del gen o parte de la misma se sustituye por un marcador seleccionable. Las secuencias de ADN flanqueantes del locus del gen que se ha de delecionar o alterar, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 kb a aproximadamente 2,0 kb, pueden permanecer en cualquier lado del gen del marcador seleccionable. Un plásmido de deleción adecuado tendrá generalmente sitios únicos de enzimas de restricción presentes en el mismo para permitir que se elimine el fragmento que contiene el gen delecionado, incluyendo las secuencias de ADN flanqueantes, y el gen del marcador seleccionable como una única pieza lineal.
[0140] En ciertas formas de realización, puede haber presente más de una copia de ADN que codifica una variante de GA deseada en una cepa hospedadora para facilitar la sobreexpresión de la variante de GA. Por ejemplo, una célula hospedadora puede presentar múltiples copias de una variante de GA que se desee integradas en el genoma o, de manera alternativa, incluir un vector plasmídico que sea capaz de replicarse de manera autónoma en el organismo hospedador.
(ii) Levadura
[0141] La presente invención contempla también la utilización de levaduras como células hospedadoras para la producción deseada de variante de GA. Algunos otros genes que codifican enzimas hidrolíticas se han expresado en diversas cepas de la levadura S.cerevisiae. Estos incluyen secuencias que codifican dos endoglucanasas (Penttila et al., 1987), dos celobiohidrolasas (Penttila et al., 1988) y una beta-glucosidasa de Trichoderma reesei (Cummings y Fowler, 1996), una xilanasa de Aureobasidlium pullulans (Li y Ljungdahl, 1996), una alfa-amilasa de trigo (Rothstein et al., 1987), etc.
(iii) Otros
[0142] Se contempla además que, en algunas formas de realización, se pueden emplear sistemas de expresión en células hospedadoras que no sean células de hongos filamentosos ni células de levaduras, incluidos sistemas de expresión de células de insectos o células bacterianas. Algunas de las células hospedadoras bacterianas pueden ser, por ejemplo, una que sea también un etanológeno, tal como un Zymomonas moblis modificado, que no sea capaz únicamente de expresar la(s) enzima(s)/variante(s) de interés, sino que también sea capaz de metabolizar ciertos azúcares monoméricos y otros azúcares fermentables, convirtiéndolos en etanol. La selección de una célula hospedadora se puede determinar según los deseos del usuario de las variantes de GA descritas en el presente documento, y por tanto no se pretende que esté limitada de ningún modo en ese sentido.
C. Introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica GA deseadas en células hospedadoras [0143] La invención proporciona, además, células y composiciones celulares que han sido modificadas genéticamente para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica variantes de GA deseadas proporcionada de manera exógena. Se puede modificar genéticamente una célula parental o línea celular (es decir, transducirse, transformarse o transfectarse) con un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc., como se describe de manera adicional anteriormente.
[0144] Los métodos de transformación de la presente invención pueden dar lugar a la integración estable de todo o parte del vector de transformación en el genoma de la célula hospedadora. No obstante, también se contempla la transformación que da lugar al mantenimiento de un vector de transformación extracromosómico autorreplicante.
[0145] Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir secuencias de nucleótidos exógenas en células hospedadoras. Estos incluyen la utilización de la transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, biolística, liposomas, microinyección, vectores plasma, vectores virales y cualquiera de los otros métodos conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético exógeno en una célula hospedadora (véase, p. ej., Sambrook et al., supra). En esencia, el procedimiento de modificación genética concreto utilizado debería ser capaz de introducir con éxito un polinucleótido (por ejemplo, un vector de expresión) en la célula hospedadora que sea capaz de expresar la variante de GA deseada.
[0146] Se pueden utilizar muchos métodos de transfección estándar para producir líneas celulares de Trichoderma reesei que expresen grandes cantidades del polipéptido heterólogo. Algunos de los métodos publicados para la introducción de constructos de ADN en cepas de Trichoderma incluyen: Lorito, Hayes, DiPietro & Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu & Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17:169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen & Knowles, 1987, Gene 6: 155-164; para Aspergillus: Yelton, Hamer &Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474; para Fusarium: Bajar, Podila & Kolattukudy, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212; para Streptomyces: Hopwood et al., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido y para Bacillus: Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi & Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138. Puede encontrarse un ejemplo de un proceso de transformación
adecuado para el Aspergillus sp. en Campbell et al. «Improved transformaron efficiency of A.niger using homologous niaD gene for nitrate reductase». Curr. Genet. 16:53-56; 1989.
[0147] Además, los constructos de ácido nucleico heterólogos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucoamilasa deseada se pueden transcribir in vitro, y el ARN resultante se puede introducir en la célula hospedadora mediante los métodos conocidos, por ejemplo, mediante inyección.
D. Análisis para la expresión de proteínas y/o secuencias que codifican ácidos nucleicos de GA [0148] Con el fin de evaluar la expresión de una variante de GA deseada mediante una línea celular que ha sido transformada con un constructo de ácido nucleico que codifica una variante de GA deseada, se pueden llevar a cabo ensayos en el nivel de proteína, el nivel de ARN o mediante el uso de bioanálisis funcionales específicos de la actividad y/o producción de glucoamilasa.
[0149] En general, los ensayos empleados para analizar la expresión de una variante de GA deseada incluyen, pero sin carácter limitativo, la prueba de Northern blot, dot blot (análisis de ADN o ARN), RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) o hibridación in situ utilizando una sonda marcada de forma adecuada (según la secuencia codificante de ácido nucleico) y la prueba de Southern blot convencional y autorradiografía.
[0150] Además, la producción y/o expresión de una variante de GA deseada puede medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante ensayos de la producción, expresión y/o actividad de la glucoamilasa. Tales ensayos se describen, por ejemplo, en Becker et al., Biochem J. (2001) 356:19-30 y Mitsuishi et al., FEBS (1990) 275:135-138. La habilidad de la GA para hidrolizar sustratos solubles aislados e insolubles puede medirse utilizando ensayos descritos en Srisodsuk et al., J. Biotech. (1997) 57:49-57 y Nidetzky & Claeyssens, Biotech. Bioeng. (1994) 44:961-966. Los sustratos para analizar las actividades de la p-glucosidasa, endoglucanasa o glucoamilasa incluyen la celulosa cristalina, papel de filtro, celulosa hinchada de ácido fosfórico, celooligosacáridos, metilumbeliferil lactósido, metilumbeliferil celobiósido, ortonitrofenil lactósido, paranitrofenil lactósido, ortonitrofenil celobiósido, paranitrophenyl celobiósido.
[0151] Además, la expresión de proteínas puede evaluarse mediante métodos inmunológicos, como ELISA, inmunoensayos competitivos, radioinmunoensayos, transferencia Western, ensayos inmunofluorescentes indirecta, y similares. Algunos de estos ensayos pueden llevarse a cabo utilizando reactivos y/o kits disponibles en el mercado diseñados para detectar enzimas GA. Tales inmunoanálisis pueden utilizarse para evaluar de forma cualitativa y/o cuantitativa la expresión de una variante de GA deseada. Los expertos en la técnica conocen los detalles de tales métodos y muchos reactivos para practicar tales métodos están disponibles comercialmente. En determinados modos de realización, puede emplearse un reactivo inmunológico que es específico para una variante de enzima GA deseada pero no su GA original, por ejemplo, un anticuerpo que sea específico para una sustitución de GA o un compañero de fusión de la variante de GA (por ejemplo, una secuencia con etiquetas N- o C-terminales, por ejemplo, una etiqueta hexa-Histidina o una etiqueta FLAG). Por tanto, los aspectos de la presente invención incluyen utilizar una forma purificada de una variante de GA deseada para producir anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para su utilización en varios inmunoensayos. (Véase, p. ej., Hu et al., 1991).
V. MÉTODOS PARA EL ENRIQUECIMIENTO, AISLAMIENTO Y/O PURIFICACIÓN DE UNA VARIANTE DE POLIPÉPTIDO DE GA
[0152] En general, una variante de polipéptido de GA deseada producida en cultivo de células hospedadoras se secreta en el medio (produciendo un sobrenadante de cultivo que contiene una variante de GA) y se puede enriquecer, purificar o aislar, por ejemplo, eliminando los componentes no deseados del medio de cultivo celular. No obstante, en algunos casos, puede producirse una variante de polipéptido de GA deseada en una forma celular (por ejemplo, citoplasmática, periplasmática o asociada de otro modo con la célula) que necesite una recuperación de un homogeneizado/lisado celular. La variante de polipéptido de GA deseada se recoge de las células o de los sobrenadantes de células en los que se produjo mediante la utilización de técnicas que los expertos en la materia emplean de forma rutinaria. Entre los ejemplos se incluyen, pero sin carácter limitativo, filtración (por ejemplo, ultra- o microfiltración), centrifugación, fraccionamiento del gradiente de densidad (por ejemplo, ultracentrifugación del gradiente de densidad), cromatografía de afinidad (Tilbeurgh et al., 1984), métodos cromatográficos de intercambios de iones (Goyal et al., 1991; Fliess et al., 1983; Bhikhabhai et al., 1984; Ellouz et al., 1987), incluyendo intercambio de iones utilizando materiales con alta resolución (Medve et al., 1998), cromatografía de interacción hidrofóbica (Tomaz & Queiroz, 1999), y partición en dos fases (Brumbauer, et al., 1999).
[0153] Aunque a menudo se desea una variante de polipéptido de GA purificada, aislada o enriquecida, en algunos modos de realización, se emplea una célula hospedadora que expresa una variante de polipéptido de GA directamente en un proceso que requiere actividad de glucoamilasa. Por tanto, el enriquecimiento, aislamiento o purificación de la variante de polipéptido de GA deseada no siempre se requiere para obtener una variante de polipéptido de GA que sea de utilidad en un ensayo deseado o un proceso que requiere, o se beneficiaría de la actividad de la glucoamilasa. En uno de estos ejemplos, pueden añadirse células de levadura
que expresan la variante de GA directamente en un proceso de fermentación de manera que la célula de levadura exprese la variante de GA directamente en el caldo de fermentación donde su actividad de glucoamilasa convierte un sustrato no fermentable en azúcares fermentables para que la célula de levadura lo convierta directamente en un producto deseado, por ejemplo, en etanol (véase, por ejemplo, Ilmén et al., «High level secretion of cellobiohydrolases by Saccharomyces cerevisiae», Biotechnology for Biofuels 2011, 4:30).
VI. COMPOSICIONES
[0154] Se contemplan las composiciones que incluyen una variante de GA tal como se exponen en el presente documento. Las variantes de GA que se describen en el presente documento pueden utilizarse en composiciones enzimáticas, incluidas, pero sin carácter limitativo, composiciones de hidrólisis y sacarificación de almidón, composiciones detergentes y de limpieza (p. ej., detergentes para ropa, detergentes lavavajillas y composiciones de limpieza de superficies duras), composiciones de fermentación de alcohol y en composiciones de pienso para animales, por ejemplo. Además, las glucoamilasas variantes pueden utilizarse en aplicaciones de cocción, tal como la producción de pan y pasteles, destilación, atención sanitaria, textil, procesos de conversión de residuos medioambientales, procesamiento de biopulpeo y aplicaciones de conversión de biomasa.
[0155] En algunas formas de realización, se utilizará una composición de enzima que incluye una variante de GA incluida en la exposición (por ejemplo, obtenida en un medio de cultivo o recuperada y purificada del medio de cultivo) junto con cualquiera de las siguientes enzimas o una combinación de estas: alfa-amilasas, proteasas, pululanasas, isoamilasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, ciclodextrina glicotransferasas, lipasas, fitasas, lacasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, xilanasas, enzimas hidrolizantes de almidón granular y otras glucoamilasas.
[0156] En algunas composiciones representativas, una o más variantes de GA tal como se describen en el presente documento se combinarán con una alfa-amilasa, como alfa-amilasas fúngicas (por ejemplo, derivadas de una Trichoderma sp.) o alfa-amilasas bacterianas (por ejemplo, derivadas de un Bacillus sp.), incluyendo variantes, quimeras, e híbridos de las mismas. En determinados modos de realización, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida estable. En determinados modos de realización, la alfa-amilasa es una enzima hidrolizante de almidón granular (GSHE, por sus siglas en inglés). Las alfa-amilasas disponibles en el mercado que se contemplan para su utilización en las composiciones de variantes de GA tal como se describen en el presente documento están disponibles (por ejemplo, de Danisco US Inc. o Novozymes).
[0157] En otros modos de realización, una o más variantes de GA tal como se describen en el presente documento pueden combinarse con otras GA, ya sean variantes o nativas. En algunos modos de realización, las GA de la exposición se combinarán con una o más GA derivadas de cepas de Aspergillus o variantes de las mismas, como A. oryzae, A. niger, A. kawachi, y A. awamori; glucoamilasas derivadas de cepas de Humicola o variantes de las mismas; glucoamilasas derivadas de cepas de Talaromyces o variantes de las mismas, en concreto T. emersonii; glucoamilasas derivadas de cepas de Athelia o variantes de las mismas, en concreto A. rolfsii; glucoamilasas derivadas de cepas de Penicillium o variantes de las mismas, en concreto P. chrysogenum; y glucoamilasas derivadas de cepas de Trichoderma o variantes de las mismas, en concreto T. reesei.
VII. UTILIDAD DE LAS VARAINTES DE GA
[0158] Tal como se ha detallado anteriormente, las GA son enzimas comerciales muy importantes utilizadas en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de sustratos de almidón en azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa, maltosa, maltotriosa, etc.). Las GA se utilizan en procesos para producir edulcorantes de maíz de alta fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos, así como en procesos para la producción directa de glucosa. En general, las glucoamilasas se pueden utilizar, y se utilizan normalmente, con alfa-amilasas en procesos de hidrolización de almidón para hidrolizar almidón a dextrinas y a continuación a glucosa. La glucosa puede utilizarse directamente; convertirse en fructosa mediante otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa); cristalizarse; o utilizarse en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol, 1,3-propanodiol y ácido láctico).
[0159] Dada la importancia comercial de las GA, se puede apreciar que los ácidos nucleicos deseados que codifican la variante de GA deseada, las variantes de polipéptidos de GA deseados, y composiciones que los comprenden, son de utilidad en una amplia variedad de aplicaciones. La propiedad o propiedades mejorada(s) de las variantes de GA deseadas descritas en el presente documento se puede(n) explotar de diversos modos. Por ejemplo, las variantes de GA con un rendimiento mejorado en condiciones de estrés térmico pueden utilizarse para aumentar la actividad de hidrólisis del almidón en un proceso llevado a cabo a altas temperaturas (por ejemplo, temperaturas a las que la GA original tendría un rendimiento pobre), permitiendo que un usuario reduzca la cantidad total de GA empleada (en comparación con la utilización de la GA original). Se pueden explotar otras propiedades mejoradas de las variantes de polipéptidos de GA, incluyendo variantes de Ga que presentan óptimos de pH alterados, una mayor estabilidad o actividad en un pH específico, una mayor actividad específica para un sustrato, y/o un nivel elevado de expresión en una célula hospedadora de interés.
[0160] Una composición de hidrólisis del almidón que contiene una variante de GA deseada tal como se describe en el presente documento es de utilizad en la producción de etanol. El etanol procedente de este proceso se puede utilizar además como un mejorador de octanaje o directamente como un combustible en lugar de gasolina, lo cual resulta ventajoso, puesto que el etanol como fuente de combustible es más ecológico que los productos derivados del petróleo. Se sabe que el uso de etanol mejorará la calidad del aire y posiblemente reducirá los niveles locales de ozono y esmog. Además, la utilización de etanol en lugar de gasolina puede ser de importancia estratégica en la amortiguación del impacto de los cambios repentinos en la energía no renovable y los suministros petroquímicos.
[0161] La sacarificación y fermentación por separado es un proceso por el cual el almidón presente en una materia prima, p. ej., maíz, se convierte en glucosa y, posteriormente, un etanológeno (p. ej., una cepa de levadura) convierte la glucosa en etanol. La sacarificación y fermentación simultánea (SFS) es un proceso por el cual el almidón presente en una materia prima se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, un etanológeno convierte la glucosa en etanol. Por tanto, las variantes de GA de la invención son de utilidad en ambos procesos para la degradación de materia prima que contiene almidón para generar etanol.
[0162] En algunos modos de realización, una variante de GA tal como se describe en el presente documento se expresa en un etanológeno donde la actividad enzimática de la variante de GA expresada por el etanológeno genera glucosa que puede convertirse en etanol por el etanológeno.
[0163] Las variantes de GA descritas en el presente documento se pueden utilizar para generar células hospedadoras para producir productos bioquímicos de interés. De este modo, aspectos de la presente descripción incluyen métodos para producir una sustancia bioquímica mediante la obtención de una célula hospedadora que expresa una variante de GA según se describe en el presente documento y mediante el cultivo de la célula hospedadora en condiciones para producir la sustancia bioquímica de interés. La célula hospedadora puede incluir modificaciones adicionales para fomentar la producción de la sustancia bioquímica deseada, p. ej., para expresar genes homólogos o heterólogos, variantes adicionales de genes, y/o para suprimir o inactivar de otra forma la expresión de uno o más genes endógenos. Entre las sustancias bioquímicas de interés se incluyen, aunque sin carácter limitativo, alcoholes (etanol, metanol, butanol, etc.) y otros compuestos orgánicos, incluyendo moléculas orgánicas volátiles (p. ej., isopreno).
[0164] Es preciso señalar que pueden utilizarse variantes de GA con una termoestabilidad reducida, por ejemplo, en zonas donde se precise neutralizar la actividad enzimática a temperaturas inferiores, de tal forma que otras enzimas que puedan estar presentes permanezcan intactas. Además, las enzimas se pueden utilizar en la conversión limitada de productos celulósicos, por ejemplo, al controlar el grado de cristalización o de longitud de cadena celulósica. Tras alcanzar el grado de conversión que se desee, la temperatura de sacarificación puede aumentar por encima de la temperatura de supervivencia de la variante de GA desestabilizada. Como la actividad de GA es esencial para la hidrólisis de celulosa cristalina, la conversión de celulosa cristalina cesará a la temperatura elevada.
[0165] Un aspecto de la exposición se refiere al uso de la variante de polipéptido de GA de acuerdo con la invención en la producción de una bebida fermentada, como una cerveza. De este modo, entre los aspectos de la presente exposición se incluye un método para proporcionar/producir una bebida fermentada que comprende el paso de poner en contacto una masa de malta y/o un mosto con una variante de polipéptido de GA tal como se describe en el presente documento. Un aspecto adicional se refiere a un método que proporciona una bebida fermentada que comprende los siguientes pasos: (a) preparar una masa de malta, (b) filtrar la masa de malta para preparar un mosto, y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, como cerveza, donde el polipéptido de la variante de GA se añade a: (i) la masa de malta del paso (a) y/o (ii) el mosto del paso (b) y/o (iii) el mosto del paso (c).
[0166] De conformidad con otro aspecto adicional, una bebida fermentada, como cerveza, se produce o proporciona mediante un método que comprende el paso(s) de (1) poner en contacto una masa de malta y/o un mosto con una variante de polipéptido de Ga tal como se describe en el presente documento; y/o (2) (a) preparar una masa de malta, (b) filtrar la masa de malta para obtener un mosto, y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, como cerveza, donde el polipéptido de la variante de GA se añade a: (i) la masa de malta del paso (a) y/o (ii) el mosto del paso (b) y/o (iii) el mosto del paso (c).
[0167] Los aspectos de la exposición también incluyen una bebida fermentada, como una cerveza, producida utilizando una variante de GA tal como se ha descrito anteriormente.
[0168] El término «cerveza» está pensado para incluye cualquier mosto fermentado producido mediante fermentación/destilación de un material vegetal que contiene almidón. A menudo, la cerveza se produce a partir de malta o adjunto, o cualquier combinación de malta y adjunto, como el material vegetal que contiene almidón.
[0169] Según se utiliza en el presente documento, el término «malta» se entiende como cualquier grano de cereal malteado, como cebada malteada o trigo malteado.
[0170] Según se utiliza en el presente documento, el término «adjunto» se refiere a cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar que no sea malta, tal como malta de cebada o de trigo. Como ejemplos de adjuntos, se pueden mencionar materiales tales como sémola de maíz común, sémola de maíz refinada, levadura de cerveza molida, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarillada, trigo, almidón de trigo, cereal torrefacto, copos de cereales, centeno, avena, maíz, patata, tapioca, mandioca y jarabes, tales como jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertido, jarabes de cebada y/o de trigo y similares, que se pueden utilizar como fuente de almidón.
[0171] Según se utiliza en el presente documento, el término «mezcla de granos molidos/pasta» se refiere a una suspensión acuosa de cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar, tal como malta molida, p. ej., que comprende malta de cebada triturada, cebada triturada y/u otro adjunto o una combinación de los mismos, que se mezcla con agua más adelante para separarse en mosto y bagazos.
[0172] Según se utiliza en el presente documento, el término «mosto» se refiere al extracto de licor no fermentado tras la extracción de la malta molida durante la maceración.
[0173] En otro aspecto, la exposición se refiere a un método de preparación/producción de una bebida fermentada, tal como cerveza, que comprende mezclar el polipéptido de la invención con malta o adjunto.
[0174] Entre los ejemplos de cervezas producidas de conformidad con los usos y métodos anteriores (es decir, en los que se utiliza una variante de GA tal como se describe en el presente documento) se incluyen, pero sin carácter limitativo, las siguientes: cerveza de pura malta, cerveza elaborada de acuerdo con el «Reinheitsgebot» o ley de pureza de 1516, cerveza de fermentación alta o ale, India Pale Ale (IPA), cerveza de fermentación baja o lager, cerveza amarga o bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, bebida afín a la cerveza, cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, cerveza negra, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares, pero también bebidas alternativas a base de malta y cereales, tales como bebidas a base de malta con sabor a fruta, por ejemplo, con sabor a cítrico, tal como limón, naranja, lima, o bebidas a base de malta con sabor a bayas, bebidas a base de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron o tequila, o bebidas a base de malta con sabor a café, tal como licor a base de malta con sabor a café y similares.
[0175] Tal como se ha visto anteriormente, las variantes de polipéptido de GA (y los ácidos nucleicos que las codifican) con propiedades mejoradas en comparación con sus enzimas GA originales son de utilidad en la mejora de cualquier número de análisis y procesos que empleen celobiohidrolasas.
EJEMPLOS
[0176] La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos que, de ningún modo, pretenden limitar el alcance de la invención tal como se reivindica. Las figuras adjuntas deben considerarse partes integrales de la memoria y la descripción de la invención.
Ejemplo 1
I. Ensayos
[0177] Los siguientes ensayos se utilizaron en los ejemplos descritos a continuación. Los datos de la SEL de HgGA derivados de los ensayos descritos a continuación se emplearon para calcular los valores del índice de rendimiento (PI) para cada variante de HgGA en cada ensayo realizado en esa variante. El PI compara el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la enzima estándar (valor teórico, por ejemplo, para una HgGA no variante) con la misma concentración de polipéptidos. Además, se pueden calcular los valores teóricos por medio de los parámetros de la ecuación de Langmuir de la enzima estándar. Se generó una curva de respuesta a la dosis para la HgGA de origen natural al ajustar los datos con la ecuación de Langmuir con la intercepción (y = ((x*a)/(x+b)) c) y las actividades de las variantes de HgGA se dividieron mediante una actividad calculada de la HgGA natural de la misma placa para producir un PI. Un PI que sea superior a 1 (PI > 1) indica un rendimiento mejorado mediante una variante en comparación con la estándar (p. ej., HgGA natural), mientras que un PI de 1 (PI = 1) identifica una variante con el mismo rendimiento que la estándar, y un PI inferior a 1 (PI < 1) identifica una variante con un peor rendimiento que la estándar.
A. Expresión
A.1. Ensayo de determinación del contenido de proteínas por Bradford
[0178] Se utilizó el ensayo de reactivo de tinte de Bradford (Quick Start) para determinar la concentración de proteínas en muestras en una escala de placas de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés). El producto químico y las soluciones de reactivo utilizadas fueron: Reactivo de tinte de Bradford Quick Start (BIO-RAD Catalog No. 500-0205), y tampón de dilución (50mM NaOAc pH5,0). El equipo usado fue un Biomek FX Robot (Beckman) y un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340). Las m Tp eran de Greiner Bio-one (655101). Se pipetearon doscientos (200) pL de reactivo de tinte de Bradford en cada pocillo de una MTP seguidos de 5 pL de sobrenadante filtrado de cada muestra de HgGA. Tras mezclarlo todo meticulosamente, las MTP se incubaron durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente. El OD de cada muestra se leyó a 595 nm y 450 nm. La
proporción de valores de OD obtenidos proporcionó una medida relativa del contenido proteico de las muestras. Las variantes de las concentraciones se determinaron utilizado la curva de calibración generada mediante las muestras de HgGA de control (en un intervalo de 0 a 3500 ppm).
A.2. Purificación y normalización de enzimas
[0179] Los sobrenadantes filtrados de variantes de HGA expresadas (aproximadamente 500 j L) se transfirieron a placas MTP de filtro (Corning 3505) que contienen cuentas de Sepharose 6B unidas a p-ciclodextrinas (véase a continuación el protocolo empleado para fabricar estas cuentas). Las MTP de filtro se centrifugaron para retirar el líquido de las cuentas y las cuentas se lavaron con 200 j L de 50 mM NaOAc, pH 5,5 (100xg durante 1 min.). Las HgGA ligadas a las cuentas unidas a p-ciclodextrinas se eluyeron al añadir 200 j L de 50 mM NaOAc, pH 5,5 20 mM de a-ciclodextrina 100 mM de NaCl y al recoger el eluyente por la centrifugación (1000xg durante 1 min.) en las MTP de recogida. Se dializaron 210 j L de las muestras de HgGA recogidas en MTP de diálisis (Harvard Apparatus, 10 kDa MWCO) utilizando un tampón de 50 mM NaOAc, pH 5,5 para retirar la aciclodextrina y el NaCl (4°C durante la noche; proporción de 1:100 de muestra:tampón). Las proteínas en las muestras dializadas se cuantifico al leer la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm. El resultado de cuantificación de esta proteína se utilizó para normalizar muestras (por ejemplo, a 50 ppm) para su utilización en determinados ensayos descritos en el presente documento.
Fabricación de una columna de Sepharose 6B unida a p-ciclodextrina (para 50 mL de volumen final de cuentas unidas):
Soluciones y equipo:
[0180]
1. 15 g de p-ciclodextrina (Sigma-Aldrich; CAS n.° 68168-23-0) en 300ml de 0,1M NaOH
2. 125mL de 1M etanolamina
3. 1,5L de 0,1M tampón de acetato pH 4,0 con 0,5M NaCl
4. 1,5L de 0,1M Tris-HCl pH 8 con 0,5M NaCl
5. 45 g de Sepharose™ 6B activada por epoxi (GE Healthcare, Lote: 10021987)
6. Filtro de 0,22 jm (Membrana GP Express p Lu S Cat n.°: SCGPT05RE)
7. Bomba de vacío
8. Agua desmineralizada
[0181] La Sepharose activada por epoxi se lavó con 3L de agua desmineralizada sobre el filtro en bajo flujo. La Sepharose se mezcló con p-ciclodextrina solubilizada en 300 ml de 0,1M NaOH a 45 °C durante 24 horas removiendo suavemente. La Sepharose sometida a reacción se lavó con 3L de agua desmineralizada sobre el filtro en bajo flujo. Los grupos activos restantes se bloquearon con 125 de 1M etanolamina a 45 °C durante 4 horas (o durante toda la noche a 40-50 °C) removiendo suavemente. La Sepharose se lavó con 3L de agua desmineralizada sobre un filtro de 0,22 jm en bajo flujo. La Sepharose se lavó después minuciosamente con al menos tras ciclos de 500 ml de 0,1M de tampón de acetato con pH 4,0 que contiene 0,5M NaCl seguido de un lavado con 500 ml de 0,1M Tris-HCl con pH 8 que contiene 0,5M NaCl. Después de todo esto, la Sepharose se lavó con 500 ml de agua desmineralizada. La Sepharose se lavó después con tampón de carga y la suspensión se vertió en la columna en un movimiento continuo, mientras se minimizaba la introducción de burbujas de aire. El resto de la columna se rellenó inmediatamente con tampón. Se insertó el adaptador en un ángulo en la columna, asegurando que no quedaba aire atrapado bajo la red.
A. 3. Determinación del contenido de proteína por HPLC
[0182] Se utilizó una nueva MTP de 96 pocillos de fondo redondo que contenía 100 j l de aproximadamente 50 ppm por pocillo de muestra normalizada (tal como se ha descrito anteriormente en el A.2) para el método de determinación de proteínas mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se utilizó una HPLC de Agilent 1260 o 1290 (Hewlett Packard) equipada con una columna Acuity Up Lc Be H 125 SEC (Waters) para separar los contaminantes restantes. La muestra se eluyó de la columna utilizando 25 mM de tampón fosfato de sodio, pH 6,8 que contenía 250 mM de cloruro de sodio. La absorbancia se midió a 220 nm, se integró empleando el software ChemStation (Agilent Technologies) y la concentración de proteínas se determinó en función de una curva estándar de proteína de origen natural purificada.
B. Actividad hidrolítica en sustrato DP2 (Maltosa): Ensayos Vma. y Km
[0183] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5.
[0184] Ensayo Vmax: Se combinaron 20 j l del sobrenadante de HgGA normalizado con 40 j l de Reactivo A (25 U/ml de HRp (peroxidasa de rábano rusticano); 62 U/ml de OXYGO® (glucosa oxidasa; Genecor); 50 mM de NaOAc, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005 % (v/v)) y 50 j l de Reactivo Vmax (50 mM de NaAC, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005% (v/v); 3,24 mg/ml de ABTS (ácido 2,2'-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)), 10 mM de maltosa (sustrato DP2)) y se mezcló bien. Se leyó la OD 405 (absorbancia a 405 nm) de manera inmediata y continua
durante 3,5 minutos en el modo cinético. El aumento de la tasa de absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad hidrolítica de la enzima. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
[0185] Ensayo Km: Se combinaron 20 j l del sobrenadante de HgGA normalizado con 40 j l de Reactivo A (25 U/ml de HRP; 62 U/ml de OXYGO® (glucosa oxidasa; Genecor); 50 mM de NaAC, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005 % (v/v)) y 50 j l de Reactivo Km (50 mM de NaAC, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005% (v/v); 3,24 mg/ml de ABTS; 2 mM Maltosa (sustrato DP2)) y se mezcló bien. Se leyó la OD 405 (absorbancia a 405 nm) de manera inmediata y continua durante 3,5 minutos en el modo cinético. El aumento de la tasa de absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad hidrolítica de la enzima. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
C. Actividad hidrolítica en sustrato DP7 (Maltohepatosa) a pH 6,8
[0186] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5. Se combinaron 6 j l del sobrenadante de HgGA normalizado con 40 j l de Reactivo A (25 U/ml de HRp; 62 U/ml de OXYGO® (glucosa oxidasa; Genecor); 50 mM de tampón de sodio-fosfato, pH 6,8; Tw EEN®-80 al 0,005 % (v/v)) y 50 j l de Reactivo B (50 mM de NaOAc, pH 5,5; t W e EN®-80 al 0,005% (v/v); 3,24 mg/ml de ABTS; 6 mM Dp7 (sustrato)) y se mezcló bien. Se leyó la Od 405 (absorbancia a 405 nm) de manera inmediata y continua durante 3,5 minutos en el modo cinético. El aumento de la tasa de absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad hidrolítica de la enzima. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
D. Actividad hidrolítica en sustrato DP7 (Maltohepatosa) a pH 5,5
[0187] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5. Se combinaron 6 j l del sobrenadante de HgGA normalizado con 40 j l de Reactivo A (25 U/ml de HRp; 62 U/ml de OXYGO® (glucosa oxidasa; Genecor); 50 mM de NaOAc, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005 % (v/v)) y 50 j l de Reactivo B (50 mM de NaOAc, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005% (v/v); 3,24 mg/ml de ABTS; 6 mM Dp 7 (sustrato) y se mezcló bien. Se leyó la o D 405 (absorbancia a 405 nm) de manera inmediata y continua durante 3,5 minutos en el modo cinético. El aumento de la tasa de absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad hidrolítica de la enzima. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
E. Actividad hidrolítica en sustrato Panosa (PAN)
[0188] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5. Se combinaron 20 j l del sobrenadante de HgGA normalizado con 40 j l de Reactivo A (25 U/ml de HRP; 62 U/ml de OXYGO® (glucosa oxidasa; Genecor); 50 mM de NaOAc, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005 % (v/v)) y 50 j l de Reactivo B (50 mM de NaOAc, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005% (v/v); 3,24 mg/ml de ABTS; 100 mM panosa (sustrato)) y se mezcló bien. Se leyó la OD 405 (absorbancia a 405 nm) de manera inmediata y continua durante 3,5 minutos en el modo cinético. El aumento de la tasa de absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad hidrolítica de la enzima. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
F. Actividad hidrolítica en sustrato Pululano (PUL)
[0189] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5. Se combinaron 10 j l del sobrenadante de HgGA normalizado con 40 j l de Reactivo A (25 U/ml de HRP; 62 U/ml de OXYGO® (glucosa oxidasa; Genecor); 50 mM de NaOAc, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005 % (v/v)) y 50 j l de Reactivo B (50 mM de NaOAc, pH 5,5; TWEEN®-80 al 0,005% (v/v); 3,24 mg/ml de ABTS; solución de pululano al 4 % (sustrato)) y se mezcló bien. Se leyó la OD 405 (absorbancia a 405 nm) de manera inmediata y continua durante 3,5 minutos en el modo cinético. El aumento de la tasa de absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad hidrolítica de la enzima. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
G. Actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular
[0190] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5. Se combinó 8 jL de cada uno de los sobrenadantes de HgGA normalizados con 80 jL de solución de almidón de maíz al 5 % en una MTP de PCR, se selló, se incubó en una máquina de PCR Tetrad a 55 °C durante 10 minutos. Al final de la incubación, las placas de PCR se enfriaron hasta 4 °C y las reacciones se extinguieron con 20 jL de 0,5 M NaOH. Después se centrifugaron las placas (3000 rpm durante 3 minutos) y se combinaron 10 jL del sobrenadante obtenido con 90 jL de 0,5 M NaOH con pH 5,5. Se combinó 10 jL de la solución extinguida diluida 10 veces con 100 jL de reactivo BCA en una nueva MPT de PCR, se selló y se incubó en una máquina de PCR Tetrad a 95 °C durante 2 minutos. Tras la incubación, 80 jL de la mezcla de reacción se transfirió a una MTP transparente y se leyó la OD a 540 nm inmediatamente.
H. Ensayo de termoestabilidad en sustrato DP7 (Maltohepatosa)
[0191] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5. Se colocaron 50 pL por pocilio del sobrenadante de HgGA normalizado en una MTP de PCR de 96 pocillos, se sellaron, y se incubaron en un termociclador Tetrad2 Peltier (Biorad) a 63,5 °C durante 5 minutos. Al final de la incubación, las placas de PCR se enfriaron hasta 4 °C. Las muestras incubadas en calor se analizaron para observar su actividad hidrolítica de DP7 a pH 5,5, maltohepatosa (DP7) tal como se ha descrito en el punto D anterior. La actividad se comparó con las muestras no incubadas a 63,5 °C para determinar la actividad «residual» (es decir, la actividad que queda tras el tratamiento por calor).
I. Inhibición de glucosa en una reacción de p-nitrofenil-glucopiranosida (p-NPG)
[0192] Los sobrenadantes que contienen enzima HgGA (tal como se ha descrito anteriormente en A.2) se normalizaron a 50 ppm con 50 mM de NaOAc a pH 5,5. Se prepararon dos MTP distintas, con cada una de las dos MTP conteniendo una o más de las siguientes soluciones: (1) 30 pl de 25 mM pNPG (muestra sin inhibición) y (2) 30 pl de 25 Mm pNPG 840 Mm glucosa (DPI) (muestra de inhibición). Se añadió 20 pl a un sobrenadante de HgGA normalizado de 50 ppm a un pocillo de cada MTP (la concentración final en el ensayo de pNPG es de 20 ppm; la concentración final de la glucosa en la reacción (3) es 50 mM). Las MTP se incubaron durante 30 minutos a 50 °C con una agitación de 900 rpm. La reacción se extinguió al añadir 65 pl de 0,2 M solución de cese de reacción de borato y al agitarla durante 30 segundos adicionales. Las muestras se analizaron al leer el OD a 405 nm (OD405) a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) para detectar el p-nitrofenilo liberado por la actividad de la HgGA en el sustrato de p-NPG. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. Se determinó la proporción de (muestra de inhibición)/(muestra sin inhibición). Las variantes que presentan proporciones mayores que la HgGA de origen natural presentan un valor de PI más alto (tal como se describirá a continuación).
J. Actividad de reversión (condensación de la glucosa)
[0193] La actividad de condensación de la glucosa (actividad de reversión) para cada enzima HgGA se evaluó al combinar 87,5 pL de glucosa al 60% (w/v) en 50 mM NaOAc, pH 5,5 con 12,5 pL de cada muestra de HgGA purificada sin normalizar (tal como se describe en el punto A.2 anterior) en MTP y se incubaron con agitación (200 rpm) a 55 °C durante 66 horas. Tras una incubación adicional de las MPT a 20 °C durante 1 hora (con agitación), se añadieron 20 pL de cada muestra a una nueva MTP que contenía 180 pL de solución de 100 mM H2SO4. La glucosa y los productos de reversión (DP2, DP3, y DP4+) se cuantificaron mediante una separación por HPLC en una columna Rezex RFQ-Fast Acid H+ equilibrada previamente con 0,01 N H2SO4 a 80 °C (Tampón de migración: 0,01 N H2SO4 (isocrático); Caudal: 0,9 ml/min; Tiempo del análisis: 4 minutos; Temperatura: 80 °C (columna); Vol. de inyección: 5 pL). Los tiempos de retención esperados de los componentes principales son: glucosa (2,23 min), DP2 (1,79 min), DP3 (1,59 min), H2SO4/DP4+ (1,42 min).
EJEMPLO 2
I. Generación de variantes de HgGA
Construcción de plásmidos y bibliotecas
[0194] Una secuencia de ADN que contenía la región codificante de la glucoamilasa (GH15) de la cepa del hongo filamentoso H. grisea, 473N, ATCC n.° 16453, se amplificó a partir del ADN genómico con los cebadores específicos del gen ampliados con los sitios attB1 y attB2 para permitir que la recombinación de PB de Gateway® se clone en el vector pDonor221 (Invitrogen, EE. UU.). La ADN polimerasa Phusion (Finnzymes OY, Finland) se utilizó para la amplificación por PCR para minimizar los errores de secuencia. El plásmido genómico pEntry-HgGA, tal como se muestra en la Fig. 2, se verificó mediante un análisis de secuencia y fue utilizado por los vendedores como una plantilla para la construcción de bibliotecas de saturación de sitio (SEL, por sus siglas en inglés). Además, una secuencia de ADNc optimizada sintética de HgGA se utilizó para construir unas pocas bibliotecas SEL así como 41 variantes combinatorias (CV, por sus siglas en inglés) (Fig. 3). Las SEL se hicieron para 580 de los 604 posiciones de aminoácido del polipéptido de HgGA maduro. De media, el número de variantes mutantes por cada biblioteca SEL varió, con algunas excepciones, entre 14 y 19. Todas las variantes se recombinaron mediante la tecnología Gateway® LR con el vector de destino pTTTpyrG13 (Fig. 4) resultando en plásmidos de expresión final pTTTpyrG13-HgGA genómico (Fig. 5) y pTTTpyrG13-HgGA optimizado (Fig. 6). Se generaron plásmidos en la cepa de Escherichia coli DH5a, se purificaron, se secuenciaron, se dispusieron de manera individual en MTP de 96 pocillos y se utilizaron para una transformación fúngica tal como se describirá más adelante (véase la sección II, a continuación).
[0195] El vector de expresión contiene las regiones promotora y terminadora de cbhl de T. reesei que permiten una clara expresión inducible de un gen de interés, confiriendo los marcadores selectivos amdS y pyrG de Aspergillus nidulans el crecimiento de transformantes en medio mínimo con acetamida en ausencia de uridina. Los plásmidos se mantienen de manera autónoma en la célula fúngica debido a las regiones teloméricas derivadas de T. reesei. El uso de plásmidos replicativos da como resultado un aumento de las frecuencias de transformación y elude los problemas de la expresión dependiente del locus observados con transformación fúngica integradora.
[0196] Secuencia de nucleótidos de la HgGA genómica (SEQ ID NO:1; los intrones están en cursiva y subrayados):
ATGCAT ACCTT CT CCAAGCT CCT CGT CCTGGGCT CTGCCGT CCAGT CT GCCCT CG GGCGGCCTCACGGCTCTTCGCGTCTCCAGGAACGCGCTGCCGTTGATACCTTCATCAACA CCG AG AAGCCCAT CGCATGG AACAAGCT GCT CGCCAACAT CGGCCCT AACGGCAAAGCC GCTCCCGGTGCCGCCGCCGGCGTTGTGATTGCCAGCCCTTCCAGGACGGACCCTCCTTG T A C G T G G T G G C A T G G A A T G G A C C C A A G A G A C T G G T T T T A G A T G A A A G A G A G T T T C T G C T A A CCGCCACACCCAGACTTCTTCACCTGGACCCGCGATGCCGCCCTGGTCCTCACCGGCAT CAT CG AGT CCCTTGGCCACAACT ACAACACCACCCTGCAG ACCGT CAT CCAGAACT ACGT CGCGTCGCAGGCCAAGCTGCAGCAGGTCTCGAACCCCTCGGGAACCTTCGCCGACGGCT CGGGTCTCGGTGAGGCCAAGTTCAATGTCGACCTCACTGCCTTCACTGGCGAATGGGGTC GCCCTCAGAGGGACGGCCCGCCCCTGCGCGCCATCGCTCTCATCCAGTACGCCAAGTGG CTGATCGCCAACGGCTACAAGAGCACGGCCAAGAGCGTCGTCTGGCCCGTCGTCAAGAA CG AT CT CGCCT ACACGGCCCAGT ACTGG AACG AG ACCGGCTT CG AT CT CTGGG AGG AGG T CCCCGGCAGCT CGTT CTTT ACCAT CGCCAGCT CT C A C A G G G G TG A G TC A TTTA TTG TTC A G T G T T T T C T C A T T G A A T A A T T A C C G G A A T G C C A C T G A C G C C A A A C A G C J C J G A C J G A G G G J GCTT ACCT CGCCGCT CAGCT CGACACCGAGTGCCGCGCCTGCACG ACCGT CGCCCCT CA GGTTCTGTGCTTCCAGCAGGCCTTCTGGAACTCCAAGGGCAACTATGTCGTCTCCAACAG TAA G A T C C C TA C A C C AA C A A A A A A A A T C G A A A A G G A A C G T T A G C T G A C C C T T C T A G T C A AC GGCGGCGAGTATCGCTCCGGCAAGGACGCCAACTCGATCCTGGCGTCCATCCACAACTT CGACCCTGAGGCCGGCTGCGACAACCTGACCTTCCAGCCCTGCAGCGAGCGCGCCCTGG CCAACCAC AAGGCCT AT GT CG ACT CGTT CCGCAACCT CT ACGCCAT CAACAAGGGCAT CG CCCAGGGCAAGGCCGTTGCCGTCGGCCGCTACTCGGAGGATGTCTACTACAACGGCAAC CCGTGGTACCTGGCCAACTTTGCCGCCGCCGAGCAGCTCTACGACGCCATCTACGTGTG G AACAAGCAGGGCT CCAT CACCGT G ACCT CGGT CT CCCT GCCCTT CTT CCGCG ACCTT GT CT CGT CGGT CAGCACCGGCACCT ACT CCAAG AGCAGCT CG ACCTT CACCAACAT CGT CAA CGCCGTCAAGGCCTACGCCGACGGCTTCATCGAGGTGGCGGCCAAGTACACCCCGTCCA ACGGCGCGCT CGCCG AGCAGT ACG ACCGCAACACGGGCAAGCCCG ACT CGGCCGCCG A CCTGACGTGGTCGTACTCGGCCTTCCTCTCGGCCATCGACCGCCGCGCGGGTCTCGTCC CCCCGAGCTGGCGGGCCAGCGTGGCCAAGAGCCAGCTGCCGTCCACCTGCTCGCGCAT
CGAGGTCGCCGGCACCTACGTCGCCGCCACGAGCACCTCGTTCCCGTCCAAGCAGACCC CGAACCCCTCCGCGGCGCCCTCCCCGTCCCCCTACCCGACCGCCTGCGCGGACGCTAG CGAGGTGTACGTCACCTTCAACGAGCGCGTGTCGACCGCGTGGGGCGAGACCATCAAGG TGGTGGGCAACGTGCCGGCGCTGGGGAACTGGGACACGTCCAAGGCGGTGACCCTGTC GGCCAGCGGGTACAAGTCGAATGATCCCCTCTGGAGCATCACGGTGCCCATCAAGGCGA CGGGCT CGGCCGT GCAGT ACAAGT AT AT CAAGGT CGGCACCAACGGG AAG ATT ACTT GG GAGTCGGACCCCAACAGGAGCATTACCCTGCAGACGGCGTCGTCTGCGGGCAAGTGCGC CGCGCAGACGGTGAATGATTCGTGGCGTTAA
[0197] Secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc sintética optimizada de HgGA (SEQ ID NO:2):
ATGCAT ACCTT CT CCAAGCT CCT CGTT CTT GG AT CT GCCGT CCAGT CTGCCCT CGG ACGGCCT CACGGCT CTT CGCGT CT CCAGG AACGCGCTGCCGTT G AT ACATT CAT CAACAC CGAGAAGCCCATTGCATGGAACAAGCTGCTTGCCAACATCGGCCCTAACGGCAAGGCCG CTCCCGGTGCCGCCGCCGGTGTTGTCATTGCCAGCCCTTCCAGGACGGACCCCCCTTAC TTCTTTACCTGGACTCGCGATGCCGCTCTGGTCCTCACCGGCATCATCGAGTCCCTTGGC CACAACT ACAACACCACGCTGCAG ACCGT CAT CCAG AACT ACGT CGCGT CT CAAGCAAAG CTGCAGCAGGTGTCTAACCCCAGCGGAACGTTCGCCGACGGTTCTGGTCTCGGTGAAGC CAAGTT CAAT GT CG ACTT G ACTGCTTT CACT GGCG AATGGGGT CGCCCT CAGCG AG ACGG CCCGCCCCTGCGCGCCATCGCTCTCATCCAGTACGCCAAGTGGCTGATCGCCAACGGTTA CAAGAGCACGGCCAAGAGCGTCGTCTGGCCAGTCGTCAAGAACGATCTCGCCTATACGG CACAATACTGGAACGAGACCGGCTTTGATCTCTGGGAGGAGGTCCCCGGCAGCTCCTTCT TTACAATCGCTAGCTCTCACAGGGCTCTGACTGAGGGTGCTTACCTCGCCGCTCAGCTCG ACACCGAGTGCCGCGCTTGCACGACCGTCGCCCCTCAGGTTCTGTGCTTCCAGCAGGCC TTCTGGAATTCCAAGGGCAACTATGTCGTCTCGAATATCAACGGCGGCGAGTATCGCTCC GGAAAGGACGCCAACTCGATCCTTGCGTCTATCCACAACTTCGACCCTGAGGCAGGCTGT GACAACCTGACCTTCCAGCCCTGCAGCGAACGCGCCCTGGCCAACCACAAGGCTTATGTC GACTCGTTCCGGAACCTCTACGCCATTAACAAGGGCATCGCCCAGGGCAAGGCTGTTGCC GT CGG ACGCT ACT CGG AGG AT GT CT ACT ACAACGGCAACCCGTGGT AT CTT GCCAACTTT GCCGCCGCAGAACAACTCTACGACGCCATCTACGTTTGGAATAAGCAAGGCTCCATCACA GT G ACCT CCGT CT CCTTGCCCTTTTT CAGGG ACTTGGT CT CG AGCGT CAGCACCGGCACT T ACAGCAAG AGCAGCAGCACGTT CACCAACATT GT CAACGCCGT CAAGGCAT ACGCCG AC GGCTTCATTGAGGTGGCGGCCAAGTACACCCCGTCCAACGGCGCGCTCGCCGAGCAGTA CG ACCGT AACACGGGCAAGCCCG ACT CGGCCGCT G ACCT G ACTT GGT CGT ACT CT GCCTT CCTCTCTGCCATTGACCGACGAGCAGGTCTCGTCCCCCCATCCTGGCGGGCCAGCGTTG CCAAG AGCCAGCTGCCAT CCACAT GTT CT CGCAT CG AGGT CGCAGGCACAT AT GT CGCCG CCACG AGCACCT CGTTT CCGT CCAAGCAAACCCCAAACCCCT CCGCGGCGCCCT CCCCG
T CCCCCT ACCCG ACCGCTTGCGCGG ACGCT AGCG AGGT CT ACGTT ACCTT CAACG AGCG A GTGTCGACCGCGTGGGGCGAGACTATCAAGGTGGTGGGCAACGTGCCGGCGTTGGGAAA CTGGGACACGTCCAAGGCGGTGACCCTGTCCGCCAGCGGATACAAGTCGAATGATCCCC T CTGG AGCAT CACGGTGCCCAT CAAGGCT ACGGGCT CCGCCGTGCAGT ACAAGT AT ATT A AGGTCGGCACAAACGGTAAGATTACTTGGGAGTCCGACCCCAATAGGAGCATTACCCTGC AGACGGCGTCGAGCGCTGGCAAGTGCGCAGCGCAGACGGTGAATGATTCGTGGCGTTGA
[0198] Secuencia de aminoácidos de glucoamilasa HgGA de longitud completa (SEQ ID NO:3; el péptido señal putativo está en negrita):
MHTFSKLLVLGSAVQSALGRPHGSSRLQERAAVDTFINTEKPIAWNKLLANIGPNGKA APGAAAGVVIASPSRTDPPYFFTWTRDAALVLTGIIESLGHNYNTTLQTVIQNYVASQAKLQQV SNPSGTFADGSGLGEAKFNVDLTAFTGEWGRPQRDGPPLRAIALIQYAKWLIANGYKSTAKSV VWPVVKNDLAYTAQYWNETGFDLWEEVPGSSFFTIASSHRALTEGAYLAAQLDTECRACTTV APQVLCFQQAFWNSKGNYVVSNINGGEYRSGKDANSILASIHNFDPEAGCDNLTFQPCSERAL ANHKAYVDSFRNLYAINKGIAQGKAVAVGRYSEDVYYNGNPWYLANFAAAEQLYDAIYVWNK QGSITVTSVSLPFFRDLVSSVSTGTYSKSSSTFTNIVNAVKAYADGFIEVAAKYTPSNGALAEQY DRNTGKPDSAADLTWSYSAFLSAIDRRAGLVPPSWRASVAKSQLPSTCSRIEVAGTYVAATST SFPSKQTPNPSAAPSPSPYPTACADASEVYVTFNERVSTAWGETIKVVGNVPALGNWDTSKA VTLSASGYKSNDPLWSITVPIKATGSAVQYKYIKVGTNGKITWESDPNRSITLQTASSAGKCAA QTVNDSWR
[0199] Secuencia de aminoácidos de glucoamilasa HgGA madura (SEQ ID NO:4):
AAVDTFINTEKPIAWNKLLANIGPNGKAAPGAAAGVVIASPSRTDPPYFFTWTRDAALVL TGIIESLGHNYNTTLQTVIQNYVASQAKLQQVSNPSGTFADGSGLGEAKFNVDLTAFTGEWGR PQRDGPPLRAIALIQYAKWLIANGYKSTAKSVVWPVVKNDLAYTAQYWNETGFDLWEEVPGS SFFTIASSHRALTEGAYLAAQLDTECRACTTVAPQVLCFQQAFWNSKGNYVVSNINGGEYRSG KDANSILASIHNFDPEAGCDNLTFQPCSERALANHKAYVDSFRNLYAINKGIAQGKAVAVGRYS EDVYYNGNPWYLANFAAAEQLYDAIYVWNKQGSITVTSVSLPFFRDLVSSVSTGTYSKSSSTF TNIVNAVKAYADGFIEVAAKYTPSNGALAEQYDRNTGKPDSAADLTWSYSAFLSAIDRRAGLVP PSWRAS VAKSQLPSTCS RIEVAGTYVAATSTS FPSKQTPN PS AAPS PS PYPTACADAS EVYVT FNERVSTAWGETIKVVGNVPALGNWDTSKAVTLSASGYKSNDPLWSITVPIKATGSAVQYKYIK VGTNGKITWESDPNRSITLQTASSAGKCAAQTVNDSWR
II. Producción de variantes de polipéptidos de HgGA
Cepas fúngicas, medios de cultivo y transformación
[0200] Utilizando un método PEG-protoplasto (5-10 ul) de las librerías SEL y variantes combinatorias (CV) se transformaron en una cepa de T. reesei delecionada de celulasas principales (Acbhl, Acbh2, Aegll, Aegl2, Aegl3, Abgll, y pyr4-). Todas las transformaciones de alto rendimiento se llevaron a cabo robóticamente en un formato de MTP de 24 pocillos utilizando robots Biomek (Beckman Coulter, EE. UU.). Se recibieron, a través de los proveedores, plásmidos con variantes en MTP de 96 pocillos distribuidos conforme a una disposición predeterminada. Las mezclas de transformación que contenían aproximadamente 1 ^g de ADN y 5x 106 protoplastos en un volumen total de 50 ^l se mezclaron con 200 ul de solución de PEG al 25 %, se diluyeron con
un volumen igual de 1,2 M de sorbitol/10 mM de Tris, pH 7,5/solución de 10 mM de CaCh, se reorganizaron robóticamente en MTP de 24 pocillos y se mezclaron con 1 ml de medio mínimo (MM) de agarosa al 3 % {(20g/L de glucosa, 15 g/L de KH2PO4 , 1 g/L de CaChx2H2O, 1 g/L de MgSO4x7H2O, pH 4,5, 2,5 ml/L de 400X oligoelementos de T. reesei (175 g/L de ácido cítrico, 200 g/L de FeSO4x7H2O, 16 g/L de ZnSO4x7H2O, 3,2 g/L de CuSO4x5H2O, 1,4 g/L de MnSO4xH2O, 0,8 g/L de ácido bórico)} que contenía 1 M de sorbitol y 10 mM de NH4Cl. Tras el cultivo de transformantes, se reunieron esporas de cada pocillo y se reconfiguraron en nuevas MTP de 24 pocillos con MM que contenían 10 mM acetamida para la presión selectiva adicional. Una vez formadas las esporas, se recogieron esporas y se utilizaron para la inoculación de cultivos líquidos en un formato de MTP de 24 pocillos (para el cribado) o bien en frascos de agitación (para estudios de validación) en el siguiente medio de producción: 37 g/l de glucosa, 1 g/l de Sophorose, 9 g/l de casaminoácidos, 10 g/l de (NH4)2SO4, 5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de CaChx2H2O, 1 g/l de MgSO4x7H2O, 33 g/l de ácido 1,4-Piperazinabis(propanosulfónico), pH 5,5, 2,5 ml/l de oligoelementos 400X de T. reesei). Se añadió 1 ml de medio de producción para producir variantes en MTP de 24 pocillos. Para los frascos de agitación, se incrementaron los volúmenes.
[0201] Las placas se cultivaron durante 6 días a 28 °C y con un 80 % de humedad con agitación a 200 rpm. Se cosecharon los sobrenadantes de cultivo por filtración y las variantes de GA se purificaron en b-ciclodextrina ligada a resina de Sepharose 6B activada con epoxi (GE Healthcare). El acoplamiento de la b-ciclodextrina disuelta en 0,1M de NaOH en la matriz se llevó a cabo durante 24 horas a 45 °C con agitación seguida de una etapa de lavado para retirar el exceso de sustrato y del bloqueo de los grupos activos restantes con etanolamina.
Para la purificación de muestras de GA, se cargaron placas de filtrado de 96 pocillos (Corning Art. N.° 3505) que contenían 100 ul de resina de p-ciclodextrina equilibrada con 25 mM de tampón de acetato de Na, pH 4,3, con 200-600 ul de muestras de cultivo, se filtraron, se lavaron con 200 ul del tampón y las muestras de proteína GA unidas a la matriz se eluyeron en 100 ul de 10 mM a-ciclodextrina en el mismo tampón. Para retirar la aciclodextrina, las muestras se desalaron utilizando placas de 96 pocillos Zeba TM Spin (ThemoScientific).
[0202] Se analizó la actividad específica y la termoestabilidad de las muestras de enzimas HgGA purificadas tal como se ha descrito en otra parte (véase, p. ej., las publicaciones de solicitudes de patente estadounidenses US/2011/0020899 y US/2011/0014681).
[0203] Se analizó la expresión de determinadas variantes mediante SDS-PAGE.
EJEMPLO 3
Expresión, actividad y rendimiento de las variantes de HgGA
[0204] Los valores del índice de rendimiento (PI) se determinaron para todas las variantes de HgGA analizadas utilizando los siguientes ensayos (descritos en el Ejemplo 1): (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión.
[0205] Más abajo se incluye un listado de variantes de sustituciones de HgGA que presentan una propiedad mejorada con respecto a la HgGA de origen natural en al menos uno de los ensayos llevados a cabo. Las variantes de HgGA se incluyen en las siguientes Cohortes de SEL (se enumera el ensayo y el límite de PI para cada Cohorte).
[0206] Cohorte de SEL 1 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en la expresión (PI > 1,2): A31T, A31Y, A31L, A31M, A31F, A31K, A31I, A31N, A31Q, A32Q, A32T, A32S, V33H, V33I, V33G, V33C, V33V, D34M, D34A, D34E, D34C, T35A, T35N, T35H, T35P, F36H, F36P, I37P, I37H, I37G, I37M, I37D, I37L, I37C, I37T, N38I, N38G, N38K, N38H, K41E, K41H, K41D, K41L, K41R, K41N, I43G, I43A, I43L, I43S, I43Y, I43I, A44G, A44N, A44L, A44F, A44V, W45Q, W45E, N46S, K47S, K47K, K47Q, L48N, L48Q, L49S, L49N, A50W, A50A, A50D, A50N, A50L, A50F, A50T, A50S, A50M, N51S, P54N, P54G, P54M, K57C, K57I, K57R, K57Q, K57A, K57V, K57W, K57T, K57L, P60H, A62I, A62V, A62T, A62A, A62C, A64A, V67P, I68I, A69C, A69E, S70A, S72C, S72D, S72K, S72Q, S72V, S72G, S72E, R73M, R73S, R73Q, R73N, R73P, T74D, T74L, D75H, D75R, P76P, P76G, P77S, P77C, P77W, Y78A, F79E, F79D, F80T, F80A, F80D, F80Q, F80W, F80R, F80M, F80H, F80F, T81A, T81C, W82N, W82Q, W82L, W82A, W82M, W82E, W82V, W82R, W82F, T83V, T83N, T83T, R84Q, R84C, R84H, R84L, R84P, R84E, D85C, D85N, D85E, D85G, D85P, D85V, D85Y, D85M, D85D, D85L, D85S, D85H, A86G, A87C, L88S, L88L, L88Q, L88W, L88G, V89D, L90A, L90N, L90I, L90P, T91G, I93A, I93Y, I93I, I93R, I93W, I94N, I94S, I94H, I94L, I94A, I94Q, I94I, I94M, I94G, I94V, I94P, I94D, E95I, S96A, L97V, L97R, L97G, L97I, L97C, L97Q, L97P, L97E, L97T, L97A, L97W, L97H, L97N, L97L, L97F, L97S, G98P, H99S, H99G, N100A, N100T, N100L, N100M, N100I, N100R, N100C, N100P, N100N, N100V, N100K, N100F, N100S, N100W, N100Y, N102T, N102Q, N102Y, N102H, N102V, N102A, N102F, N102C, N102I, N102G, N102S, N102K, T104R, T104H, T104V, T104S, T104L, T104G, T104A, L105T, L105R, L105A, L105F, L105M, L105E, L105P, L105Q, L105C, L105K, L105L, L105G, L105I, L105V, Q106K, Q106Y, Q106I, Q106W, T107W, T107S, T107T, T107N, T107E, T107A, T107Y, T107D, T107M, T107C, T107H, T107K, V108C, V108R, V108E, I109E, 11090, I109T, Q110Q, Q110E, Q110D, Q110G, N111D, N111F, N111N, N111M, N111P, N111Q, N111K, N111L, N111R,
N111A, N111H, N111I, N111W, N111V, N111G, Y112W, Y112Y, Y112F, Y112C, V113E, V113L, A114P, A114F, A114M, A114K, A114L, S115G, S115A, S115L, S115E, S115D, S115S, S115R, K118N, K118L, K118M, K118S, K118Y, Q121P, Q121L, Q121V, Q121M, Q121T, Q121A, Q121K, Q121C, V122L, V122T, V122E, V122V, V122N, S123S, S123P, N124T, N124N, N124C, S126M, S126G, S126T, T128V, T128S, G132G, G134S, G134A, G136S, G136A, G136D, G136G, E137S, E137V, E137A, E137M, E137E, E137Q, E137T, E137D, A138N, A138W, A138F, A138C, A138E, A138Q, A138R, A138G, A138T, A138D, A138V, A138S, A138I, A138Y, K139Q, K139A, K139W, K139T, K139V, F140Y, N141Y, N141K, N141G, N141N, N141D, N141W, N141R, N141L, N141T, N141Q, V142P, T145L, F147T, T148N, T148A, E150G, E150S, E150Y, E150F, W151E, W151G, W151N, W151H, W151S, W151L, W151V, W151F, W151T, G152Y, G1521, R153I, R153Q, R153A, R153M, R153V, R153N, R153F, R153R, R153P, R153L, R153S, P154F, Q155L, Q155V, Q155K, Q155R, Q155P, Q155A, Q155M, Q155E, Q155I, Q155T, Q155F, D157A, D157S, D157T, P159C, L161D, I164Q, I164V, A165S, A165D, Y169F, Y169G, Y169E, Y169R, Y169L, Y169T, Y169I, Y169W, K171C, W172Q, W172Y, I174A, I174M, 1174V, I174Y, Y178V, Y178R, S180L, S180C, S180F, S180N, S180A, S180D, T181Q, T181S, T181R, T181A, T181E, T181K, T181W, A182V, K183T, S184R, S184Q, S184V, S184I, S184G, S184M, S184F, S184A, V185F, V190A, V190V, V190L, V190I, V190T, K191E, K191L, K191A, K191W, K191I, K191M, K191Q, K191T, N192N, N192A, D193S, L194M, A195K, A195H, Y196G, T197E, T197T, T197A, T197V, A198A, A198V, Q199S, Q199G, Q199R, Y200R, Y200F, Y200H, Y200Q, W201W, W201S, W201I, W201A, N202Q, N202N, N202V, N202I, N202R, T204L, T204T, T204F, T204K, T204I, T204Q, T204E, T204H, T204N, G205E, G205Q, G205G, G205W, G205C, G205T, F206H, F206R, F206G, F206D, F206I, F206Q, F206T, F206A, F206K, F206E, F206P, F206S, D207G, D207C, D207L, D207A, L208F, L208W, L208S, L208V, L208G, L208M, L208P, L208N, L208E, W209A, E210R, E210E, E210H, E210K, E210Q, E210L, E211S, E211M, E211A, E211Y, E211N, E211T, V212I, G214V, G214S, G214M, G214N, G214I, G214E, S215Q, S215S, S215C, S215D, S215L, S216G, S216E, S216N, S216M, S216C, S216V, S216S, F217F, F218V, F218H, F218N, F218P, F218S, F218L, F218F, F218Y, T219R, T219I, T219E, T219N, I220I, I220K, I220T, I220H, I220S, I220A, A221L, A221S, A221M, S222F, S222L, S222Q, S222R, S222M, S222H, S223Y, S223M, S223V, S223N, S223T, S223I, S223C, T228F, T228S, T228Q, E229M, E229D, E229A, E229W, E229Y, E229G, E229L, E229T, E229H, E229S, E229I, E229F, A235T, Q236D, Q236S, Q236Y, Q236R, Q236L, Q236A, Q236K, Q236M, Q236Q, Q236N, T239R, R242Q, R242S, R242P, R242K, R242W, R242E, R242F, R242M, A243P, A243Q, A243G, A243L, A243R, A243A, A243N, A243D, A243C, A243V, A243K, T245S, T245T, T245M, T245L, T245V, T245H, T245G, T245Q, T245E, T246I, V247A, A248G, P249Y, Q250Q, Q250E, L252V, L252H, L252M, L252L, C253C, C253L, C253H, C253A, C253S, C253R, C253D, C253G, C253Q, C253F, F254E, Q255S, A257G, F258E, N260F, N260S, N260N, S261G, K262C, G263Y, N264E, V266A, V267Y, V267N, V267L, S268Q, S268R, S268T, N269L, N269E, N269W, N269M, N271A, N271T, N271L, N271G, N271P, N271F, N271Q, N271H, N271W, G272L, G273V, G273S, G273Y, G273P, G273C, G273H, E274F, E274V, Y275C, Y275F, Y275V, Y275E, Y275S, Y275L, R276P, S277W, S277F, S277G, S277N, S277L, G278H, G278Y, G278E, G278N, G278V, G278D, G278S, G278W, G278F, G278M, G278K, G278I, K279D, K279N, K279R, A281A, A281G, A281S, A281Y, A281T, A281F, N282I, N282T, N282P, N282E, N282N, N282H, S283E, S283T, S283F, S283Q, L285F, L285M, L285D, L285T, A286T, A286L, H289A, H289E, N290M, F291M, F291L, P293T, E294E, A295D, A295C, G296V, N299S, L300F, T301T, S306C, S306N, S306G, E307H, R308V, R308K, R308M, R308H, R308W, R308Q, R308A, R308I, R308E, R308T, R308G, A309L, A309H, A309C, A309I, L310L, A311R, A311A, A311L, A311K, A311F, N312N, N312T, N312L, N312I, A315G, Y316S, Y316L, Y316F, Y316Y, Y316W, Y316I, V317K, D318M, D318W, D318E, D318N, D318V, D318Q, D318S, D318L, S319N, S319A, S319M, S319V, S319Q, S319H, S319R, S319G, F320F, F320M, N322C, 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Y594H, Y594Y, Y594A, Y594N, Y594E, Y594Q, Y594G, I595T, I595L, I595G, I595M, I595Y, K596D, K596E, K596G, V597W, V597Q, V597E, V597R, V597K, V597V, V597F, T599K, T599S, T599L, T599M, T599Q, T599D, T599P, T599A, T599F, T599E, T599C, T599H, T599R, T599G, N600K, N600V, N600P, G601M, G601E, G601N, G601P, G601R, G601H, G601Q, G601I, K602D, K602F, K602W, I603Y, I603Q, I603N, I603P, I603T, I603I, I603M, I603E, I603F, I603L, T604S, T604F, T604L, T604T, T604G, T604H, T604Q, T604P, T604A, T604R, T604I, T604D, W605T, W605Y, W605K, W605P, W605H, W605E, W605L, W605D, W605A, W605Q, W605F, W605V, E606K, E606I, E606G, E606F, E606V, E606R, E606T, E606H, E606W, E606Q, E606E, S607V, S607W, S607Q, S607H, S607L, S607M, S607N, S607Y, S607A, D608R, D608L, D608P, D608T, P609V, P609D, P609Y, P609R, P609W, P609N, P609T, P609L, P609K, P609Q, R611S, R611E, R611D, R611A, R611Q, R611F, R611H, R611K, R611P, R611V, R611N, R611M, R611W, R6111, S612H, S612F, I613T, I613H, I613S, I613N, 1613V, I613L, I613K, I613A, I613G, I613F, T614G, T614S, L615W, S619Q, S619S, S620P, S620S, S620E, G622W, G622P, G622K, G622H, G622G, A625D, A625A, A626T, Q627R, Q627A, V629Q, V629S, V629N, N630S, D631S, D631Q, D631N, D631T, D631P, S632L y S632G.
[0207] Cohorte de SEL 2 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en la termoestabilidad (actividad de hidrólisis de DP7 residual tras 5 min a 63,5 °C / actividad de la hidrólisis de DP7 inicial) (PI > 1,2): N38D, K41P, N46E, N46D, N46C, A50D, N55D, K57A, K57E, K57S, A58C, A59G, P60V, P60Q, P60I, P60L, P60M, P60R, P60T, P60Y, P60H, A64P, G65K, G65R, G65F, V67K, V67D, I68V, A69E, A69K, A69H, A69L, A69D, A69R, A69F, S70W, S70Y, S72S, D75N, P77D, Y78W, Y78F, Y78K, Y78I, F80P, W82F, W82T, W82H, W82I, W82Q, W82R, W82M, W82G, W82V, W82P, W82L, W82C, W82N, W82E, W82A, T83V, R84W, R84H, R84P, R84S, R84T, R84C, R84V, R84L, R84F, R84D, R84E, A86Y, A86K, A86P, A86F, A86H, A87L, A87K, A87P, V89R, E95K, N100E, N102N, N102Y, N102M, N102G, N102R, N102F, N102W, N102T, N102L, L105I, T107E, T107K, N111D, V113Q, A114G, A114W, S115A, K118F, L119K, Q120W, V122D, S123P, S123D, N124E, N124R, N124H, S126L, S126C, G127P, G127I, F129L, A130E, G132D, G132Q, G132K, G132R, G132I, G132F, G132P, G132V, G132T, G132E, G132N, G134P, G134R, G134H, L135K, E137R, E137P, E137H, E137T, E137K, A138Y, A138L, A138A, K139G, F140P, A146P, T148W, E150P, W151K, W151A, W151C, W151Y, W151R, W151V, W151P, G152N, G152K, G152H, G152S, G152R, G152Q, G152M, G152Y, G152T, G152C, G152W, R153P, Q155S, Q155A, Q155Y, R156W, D157W, D157R, D157F, D157N, D157P, D157I, D157L, G158L, L161P, R162W, R162P, R162H, R162F, A163P, A163R, A165W, L166R, L166C, I167H, I167G, I167M, I167P, I167Q, I167S, A170D, A170N, A170Q, A170H, A170I, K171P, K171W, A175F, A175W, A175C, G177I, G177V, G177W, G177L, G177A, K179D, K179P, A182G, A182S, K183D, K183C, K183F, K183H, K183W, S184S, S184C, S184P, V186K, V186H, V186P, V186R, V186L, V186F, W187V, W187I, W187H, W187Y, W187Q, W187A, W187L, W187F, P188A, P188M, P188C, P188S, P188G, P188Q, P188H, P188K, V190S, V190G, V190F, V190T, V190A, V190C, V190M, D193H, A195A, G205P, F206G, D207F, D207D, D207K, D207I, D207R, D207Y, D207W, D207Q, D207V, D207H, L208R, W209K, W209V, W209C, W209P, W209G, W209S, E210F, E210D, E210L, E210K, E210C, E210M, E210S, E210Y, E210I, E210Q, E210W, E210T, P213R, P213H, P213L, P213V, P213Y, P213Q, P213C, P213M, P213N, S216R, F217N, I220N, R225P, L227A, L227C, L227S, L227T, L227G, L227I, G230E, L233D, L233E, L233S, L233T, L233A, L233Q, L233H, L233M, L233Y, L233W, L233F, A234M, A234G, A234S, Q236W, T239I, E240P, C241W, C241N, C241A, C241G, A243R, C244F, T245F, T245W, T245Y, T245M, T245H, V247C, A248C, A248D, P249E, P249R, F254F, Q255D, Q256C, A257D, S261C, K262I, K262C, N264C, S268C, G272C, G272T, E274F, E274Y, Y275G, D280M, D280T, D280P, A281R, A281L, A281K, I284R, I284V, I284E, L285P, L285L, A286T, N290K, F291G, E294C, E294A, A295L, C297P, C297S, D298P, D298W, D298F, L300K, L300N, T301I, T301V, T301A, F302A, Q303C, Q303P, Q303L, Q303S, Q303E, Q303T, P304G, P304C, P304S, S306K, S306I, S306W, S306N, S306E, S306T, S306Y, S306G, E307K, E307L, E307W, E307F, E307I, E307M, E307R, R308C, R308D, L310P, L310W, L310A, L310Q, L310F, L310S, L310C, A311I, A311S, Y316W, D318D, S319S, S319Q, Y324W, Q332N, V338R, V338W, G339F, G339K, G339P, G339I, G339Q, G339H, G339Y, G339V, G339D, G339N, G339R, G339L, G339E, G339W, G339T, G339C, R340F, R340W, S342P, D344H, D344F, D344M, V345T, N348G, N350I, N350P, N350V, N350W, P351K, P351H, P351R, P351D, P351Q, W352G, W352K, W352V, W352R, L354R, L354Y, L354D, A355C, N356R, N356K, L363Q, I367A, I367G, I367D, V369P, W370V, W370S, W370C, W370T, W370A, W370Q, W370H, N371P, N371L, N371C, N371M, Q373P, G374P, S375P, I376S, I376G, I376Y, I376N, I376H, I376T, I376C, T377V, V378Y, V378F, T379P, T379I, T379W, S382E, S382P, S382Q, F385Q, R387P, V393W, V393H, G396F, Y398R, Y398D, Y398G, Y398S, Y398N, Y398P, Y398Q, Y398K, K400N, S401D, T404A, F405R, F405D, F405K, F405E, F405L, F405T, F405I, F405P, F405Q, F405N, F405S, I408S, I408H, I408K, I408Y, I408G, I408Q, V409W, V409G, V409P, V409M, V409D, V409Y, V409I, V409K, V409R, V409L, V409E, V409H, V409C, V409V, A411P, A411A, A411H, G418F, G418G, F419R, P428I, P428G, G431R, G431L, A432S, A432A, A434Y, A447R, A448P, A448M, T451P, T451W, T451K, T451S, T451Y, T451F, T451L, T451R, W452D, W452A, W452G, W452P, S453R, S453K, S453L, S453I, S453M, S453W, S453Y, I461S, I461G, I461Q, R463M, R464Y, R464F, R464W, R464H, R464L, R464N, R464I, A465D, A465P, G466Q, G466P, G466W, G466V, G466R, G466C, G466I, G466T, G466L, G466K, G466D, G466F, G466H, G466A, G466E, G466Y, L467C, V468N, V468W, V468L, V468H, V468E, V468Q, V468D, V468M, V468K, V468R, V468P, V468I, V468G, P469M, P469E, P469G, P469N, P470V, P470Y, P470S, P470W, P470M, P470C, P470A, P470F, P470K, W472W, R473D, A474C, A474S, V476I, A522G, A522A, A522Q, A522T, A522K, A524M, A524L, A524A, A524R, E528K, S538Y, S538R, S538P, W541R, W541K, W541L, W541M, G542K, G542R, T544R, T544K, G555K, G555R, T564R, T564K, S572F, S572P, A589A, A589Q, A589V, Q591T, Q591Y, V597K, T599R, E606M, S619K, S619E, A626H, V629C y S632T.
[0208] Cohorte de SEL 3 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 5,5 (PI > 1,2): P42M, N51F, P54K, A59Q, A59P, A59V, A59W, P60W, L90D, L90Y, G98F, N111I, N111V, N111K, S115K, S115E, S115N, S123A, P125A, L135T, L135V, F140W, L144H, L144N, Q168H, K191V, K191W, Y196T, Y196W, W201K, L208P, S216A, F218M, F218S, F218Q, T219A, T219M, T219V, T219Q, T219C, A221P, S222F, L227S, L227L, L227Y, L227A, L227G, L227T, E229A, E229K, G230W, G230I, G230L, G230Y, A231K, L233W, L233H, L233Q, L233Y, A234K, L237Q, E240K, E240I, E240L, C244K, C244D, C244P, C244T, C244S, T246F, T246T, T246V, V247G, L252P, F254P, D280P, D280Q, D280H, D280T, D280A, A281V, A281T, S287M, S287V, S287E, S287C, S287Y, H289H, F291G, D292F, D292H, D292L, E294H, A295N, C297Q, C297N, C297G, C297T, C297S, L300Y, Q303L, Q303P, Q303R, C305S, I326R, I326A, N327P, N327F, N327L, N327V, N327Q, N327K, K328C, Q332C, G339A, E343I, E343G, G349N, A359L, A359V, A359Y, A359I, A359N, A360S, L363P, A366Q, P384L, F385G, F385S, F385T, F386Q, G396A, G396V, T397K, Y398V, Y398D, Y398G, Y398H, Y398P, I408K, D417R, A423W, D449K, D449V, D449R, D449I, D449Q, D462T, V468L, V468A, V468H, V468R, P470N, P470F, P470I, P470V, P470C, P470E, W472K, W472N, W472E, W472R, W472G, V476L, V476D, V476H, V476A, V476Q, V476G, V476R, V476P, V476W, V476Y, V476S, A491I, A491H, A491G, Y494V, Y494P, Y519A, A526Q, V529A, S538F, S538T, A540W, A540N, L576A, P609W, N610S, S619A, S619M, S619Q, S620Y, S620R, G622K, A626T y A626R.
[0209] Cohorte de SEL 4 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 6,8 (PI > 1,2): P54W, A59Q, A59P, A59V, A59W, P60W, G98F, N111I, S115H, S123A, P125A, L135T, L144H, L144V, Q168H, K191V, K191W, Y196T, L208P, L227S, L227A, E229A, E229V, G230W, G230I, G230L, A231K, L233H, L233W, L233Y, A234K, E240K, C241F, C244P, C244D, C244K, C244T, P249T, Q256K, D280P, D280Q, D280H, D280T, D280M, D280A, D280Y, A281V, S287M, S287C, S287E, S287V, H289H, D292F, D292A, D292S, E294H, A295N, C297Q, C297N, C297S, C297G, C297T, C297P, L300Y, Q303L, Q303P, Q303R, E307P, D318G, I326R, I326A, I326K, N327P, N327F, N327V, N327L, G329C, G329T, Q332C, A359L, A359V, A359I, A359N, A360S, L363P, A366Q, P384L, F385G, F385S, F386Q, G396A, G396V, T397K, Y398D, Y398H, Y398G, Y398P, S399C, I408K, D449K, D449V, D449R, V468L, V468H, V468A, V468R, P470N, P470I, P470C, P470V, P470F, P470E, A474A, V476H, V476Q, V476A, V476D, V476G, A491I, A491H, Y494V, Y494P, Y519A, A526Q, A526R, A526P, V529A, S538F, A540W, A540N, L576A, P609W, S619A, S619M, S619Q, A626T y A626R.
[0210] Cohorte de SEL 5 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP2 (PI > 1,2 en el ensayo Km o el ensayo Vmax): G53A, G53S, A59Q, A59V, A59P, A59W, P60W, P60G, P60I, P60F, G61P, A62E, A62L, A63P, A63I, A63L, A64V, A64L, A64I, A64T, A64C, P71S, D75E, D75L, D75A, P77D, F79W, T81S, G92T, L97L, G98F, H99K, H99R, N100P, N100I, N100A, N100C, N100G, N100L, N100S, Y101A, N111L, N111I, N111R, N111K, N111A, N111M, S115I, S115P, S115R, S123A, P125A, L135T, L135Q, N141Q, N141N, L144V, L144F, G152D, Q168H, K191V, K191W, N192L, N192C, N192H, N192R, N192A, L194L, L194M, Y196T, T197G, T197A, Q199K, Q199H, L208P, F218W, F218G, S222M, S222V, S222N, S222H, S222Q, L227I, L227A, L227S, E229A, E229C, E229G, E229D, G230W, G230I, G230L, E240L, E240K, C244K, C244P, C244D, C244T, V247A, P249A, P249T, D280P, D280Y, H289H, F291G, D292F, D292A, D292S, D292C, D292H, P293Q, E294H, A295N, C297Q, C297N, C297S, C297G, C297T, C297P, L300Y, Q303P, Q303L, Q303R, D318G, I326R, I326A, I326Y, I326N, I326S, I326G, N327V, N327P, N327F, N327L, K328C, Q332C, E343E, Y353N, Y353W, Y353Y, Y353M, Y353V, Y353I, Y353D, Y353F, Y353T, Y353E, Y353K, N356V, A359L, A359V, A359N, A359I, A359M, A360S, L363P, A366Q, A366V, A366T, I376E, I376I, I376M, P384L, F385G, G396A, G396V, T397K, Y398G, Y398H, A434D, A434M, A434W, D438V, D438Q, A448K, D449K, D449R, D449G, T451A, T451S, F457Q, V468L, V468H, V468A, V468K, V468M, V468R, V468N, V468G, V468D, V468T, V468Q, V468P, P469G, P470I, P470N, P470C, P470F, P470R, P470V, P470L, P470E, P470W, P470A, P470K, P470G, P470Q, V476A, V476L, V476H, V476Q, V476G, V476W, V476D, V476S, V476Y, V476R, V476P, V476V, V476I, V476M, A491H, A491I, A491G, A491N, A491T, A491R, A491M, A491K, A491V, A491P, A491E, A491Y, Y494P, Y494Q, Y494V, Y494T, Y519A, A526Q, A526P, A526K, A526W, A526V, V529A, S538F, S538T, A540W, A540N, K561L, L565W, S572S, S572C, S572I, L576A, P609W, S619A, S619Q, S619H, S620R, S620H, S620D, G622K, A625D, A625N, A626R y T628L.
[0211] Cohorte de SEL 6 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de pululano (PI > 1,2): P54W, P54K, A59Q, A59P, A59V, A59W, P60W, G65S, V66Q, L90D, L90Y, G98F, N111I, S115K, S115P, S115H, S115E, S115R, S115N, Q116L, A117D, Q120T, Q120V, S123A, S123F, S123C, P125A, S133P, L135T, L135N, L135V, L135Q, L144H, L144V, L144N, E150N, Q168H, W187H, V189F, K191V, K191W, N192R, Y196T, L208P, L227G, L227S, L227A, L227N, E229A, E229V, E229M, E229C, G230W, G230I, G230L, G230Y, L233W, L233H, L233S, L233Q, L233Y, A234K, A234R, L237Q, L237T, E240K, E240L, C241F, C244K, C244D, C244P, C244T, C244S, T246W, V247G, P249T, P249A, L252P, F254P, Q256K, Y265T, D280P, D280Q, D280H, D280A, D280T, D280Y, D280M, D280W, L285N, S287M, S287C, S287E, S287V, S287R, H289H, F291G, D292F, D292H, D292S, D292C, D292L, E294H, A295N, C297Q, C297N, C297G, C297S, C297P, C297T, L300Y, Q303P, Q303L, Q303R, P304V, P304S, C305S, E307A, E307D, D318G, I326R, I326G, I326K, I326A, I326N, I326S, I326H, N327P, N327F, N327R, N327L, N327V, N327W, N327Q, K328C, G329T, G329C, G329A, G329M, G329I, G329S, I330Y, I330N, Q332C, E343F, G349W, G349P, G349I, G349Y, G349S, G349M, G349L, G349T, G349V, G349F, G349N, G349C, G349A, Y353K, A355H, A358P, A359L, A359V, A359I, A359N,
A359Y, A360S, E361E, L363S, A366Q, A366V, P384L, F385G, F385S, F385T, F386Q, D388Q, G396A, G396V, T397K, Y398G, Y398P, Y398D, Y398H, Y398S, T404Y, I408K, I408Q, A423W, A434G, D449K, D449V, D449R, D449I, D449L, I461G, V468H, V468A, V468L, V468K, V468M, V468G, V468R, V468T, P470F, P470V, P470I, P470N, P470C, P470R, V476L, V476A, V476H, V476Q, V476D, V476G, V476W, V476S, V476P, V476M, V476R, V476V, V476Y, A491H, A491I, A491T, A491M, A491K, Y494V, Y494P, Y494G, Y494T, Y494Q, K505F, Y519A, P520S, V529A, S538F, A540W, A540N, A553A, S572S, L576A, D608A, P609W, S619A, S619M, S619G, S619Q, S619S y S619H.
r02121 Cohorte de SEL 7 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de panosa (PI > 1,2): L49A, L49S, L49W, L49F, L49R, A50R, I52K, I52G, I52S, I52T, A58K, A59Q, P60W, V66A, V66G, V67M, I68M, P711, P71V, S72T, S72I, S72V, S72E, S72H, S72G, S72F, T81G, A86T, G92T, L97V, L97I, L97L, G98F, H99K, N100P, N100I, N100G, N100A, N100S, N100L, N100V, N100C, N100T, N100K, N111A, S115P, S115R, S115A, S115V, S115I, S115K, S115S, Q120V, S123A, N124V, P125A, L135T, L135N, L135Q, L135F, A138T, K139M, N141V, N141R, V142R, V142L, L144V, K191V, K191W, Y196T, W201K, F206I, L208P, L208Q, V212T, V212S, P213M, P213Y, P213V, P213A, P213Q, G214Y, F218W, F218G, F218Q, S222H, S222M, L227G, L227S, L227I, L227A, G230I, G230L, G230W, A234K, E240L, E240K, C244K, C244P, C244D, C244T, C244V, T246V, V247G, P249T, R276K, D280P, D280W, D280Q, S287M, S287E, S287V, S287C, N290V, F291G, D292F, D292A, D292S, E294H, A295N, C297Q, C297N, C297S, C297G, C297T, C297P, L300Y, Q303P, Q303L, Q303R, D318G, I326R, I326A, I326N, N327P, N327F, N327V, N327L, N327R, K328C, G329T, Q332C, Y341N, Y341H, E343I, E343F, E343G, E343L, E343C, E343K, E343V, E343Y, E343R, E343M, A359L, A359V, A359I, A359N, A360S, L363P, A366Q, P384L, F385G, F385S, G396A, G396V, T397K, Y398G, Y398D, Y398H, Y398P, Y398S, A423W, A434G, D449K, D449R, D449V, D449A, D449G, D449T, T451A, T451S, V468H, V468L, V468A, V468R, V468K, V468M, V468G, V468T, V468N, V468D, V468Q, P470N, P470I, P470F, P470V, P470C, P470R, P470E, P470L, P470A, P470K, P470W, P470Q, P470G, P470S, P470Y, P470M, V476A, V476L, V476H, V476Q, V476I, V476Y, V476G, V476W, V476D, V476S, V476R, V476V, A491H, A491P, A491N, A491I, A491T, A491G, A491R, A491M, A491K, A491Y, A491V, A491E, A491L, A491Q, Y494Q, Y494V, Y494P, A526Q, A526P, V529A, S538F, S538T, A540W, A540N, L576A, P609W, S619A, T628L y S632R.
r0213l Cohorte de SEL 8 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de almidón de maíz (PI > 1,2): N46P, N46F, N51P, G53K, G53E, G53W, G53V, G53Y, G53R, P54F, P54W, P54Y, P54R, P54P, N55R, N55N, N55K, A59Q, A59V, A59P, A59W, A59R, A59K, A59I, A59N, A59H, A59T, P60W, A62Y, A62Q, A62R, A62K, A64Y, A64L, A64P, G65S, V66Q, V66F, V67F, V67T, V67P, I68G, I68Y, D75L, Y78Y, F79R, F79S, A86T, G98F, Y101R, Y101L, N111E, S115W, Q116K, Q116L, Q116R, A117D, A117P, L119W, L119N, L119K, L119Y, Q120N, Q120V, Q120T, Q120G, Q120H, Q120F, Q120S, Q120I, Q120C, Q121D, N124Q, P125A, S126L, G127K, D131P, S133P, L135T, L135N, L135V, L135Q, L135G, L135K, A138P, D143F, L144H, L144R, P159E, P159V, L166K, L166W, A170H, W187H, W187V, W187Q, W187I, W187A, V189Y, V189F, V189R, K191V, K191W, N192R, N192K, D193N, A195V, Y196T, Y196W, T197H, A198Y, Q199W, Q199P, Q199H, L208P, A221D, S222F, H224K, H224Q, R225G, R225W, R225I, R225S, R225D, R225V, L227G, L227N, L227S, L227H, L227T, L227A, L227L, L227Y, E229C, E229V, E229F, E229A, G230W, G230I, G230L, G230Y, G230F, G230E, A231R, A231P, L233H, L233W, L233S, L233Q, L233E, L233Y, L233M, A234K, A234R, A234I, L237T, L237Q, L237W, L237S, L237V, E240K, E240L, C241V, C241W, C241S, C241G, C241N, C241A, C241F, C244K, C244D, C244P, C244Q, C244T, C244G, C244S, T245F, T246G, T246V, T246F, V247G, P249C, P249Y, V251D, L252P, C253P, C253D, C253I, C253Q, F254P, Q256K, N260W, N260V, S261R, N264R, Y265T, S277N, D280P, D280Q, D280Y, S283F, L285Y, L285G, L285N, L285W, S287R, S287E, S287C, H289H, F291G, F291P, D292L, D292F, E294H, A295N, G296E, C297Q, C297N, C297G, C297P, C297S, C297T, C297A, D298R, D298W, D298K, N299P, N299R, L300Y, Q303P, Q303L, Q303R, Q303K, P304V, C305S, C305H, C305P, L310Q, H313R, D318H, I326G, I326H, I326W, I326Y, I326R, I326N, I326P, N327P, N327H, N327W, N327R, N327F, N327L, N327K, N327V, N327D, G329T, G329C, Q332C, A337F, A337W, G339S, G339A, S342Y, S342P, E343I, G349W, G349S, G349N, G349P, G349T, G349C, Y353R, Y353K, A355H, A358P, A358T, A359Y, A359L, A360S, E361E, L363P, A366Q, W370T, W370S, W370C, W370H, W370Q, Q373P, I376G, S382R, S382Y, P384L, F385G, F385S, F386Q, D388Q, D388E, D388R, L389E, L389P, L389L, T397D, T397N, T397K, Y398G, S399C, K400Q, S401V, S402V, S402W, T404Y, F405D, F405P, N407P, I408Q, I408K, V409P, A416F, A416R, A416P, A416Y, A416K, A423H, A423W, G431V, L433H, A434L, D438P, R439V, K443P, D449V, D449K, D449I, D449Q, T451Q, Y454R, F457T, D462T, D462M, D462H, R463D, R463E, R463F, V468A, V468E, P470N, P470I, P470L, P470V, P470R, P470K, P470S, P470G, P470W, P470Y, P470F, P470Q, P470C, S471D, V476L, S483F, S486E, A491I, A491H, A491V, A491Q, A491F, A491P, A491K, Y494V, Y494G, Y494P, Y494T, Y494Q, Y494C, Y494A, V495V, F502M, S504Q, K505F, K505C, Y519A, D525Y, A526Q, A526P, E528F, V529A, V529M, V531T, R536Q, S538F, A540W, A540N, V547D, S572Q, N573A, I579K, Q591S, V597D, S607E, D608A, P609W, I613A, L615S, S619A, S619M, S619D, S620S, A626G, A626T, A626W y Q627R.
[0214] Cohorte de SEL 9 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la inhibición de glucosa de la actividad enzimática [mayor proporción de (muestra de inhibición)/(sin muestra de inhibición) en comparación con las de origen natural] (PI > 1,2): E40C, P42M, N51T, N51V, G53R, A58I, G65E, G65F, G65I, G65K, G65P, G65Q, G65R, G65S, G65V, V67K, I68D, A69G, A69P, A69T, T74P, D75P, P76A, P76E, P76G, P76H, P76K, P76L, P76M, P76S, P76T, P76V, F80A, F80D, F80G, F80L, F80P, F80Q, F80R, F80S, F80T, T83E, T83G,
T83H, T83I, T83L, T83M, T83P, T83Q, T83V, A86C, A86E, A86M, A86N, A86Q, A86W, A87C, L88G, L88M, V89D, V89I, T91P, I93Y, I94K, Y112A, Y112C, Y112E, Y112G, Y112I, Y112L, Y112M, Y112P, Y112V, V113N, Q116Y, L119F, L119K, L119R, N124A, N124G, N124L, N124Q, N124V, P125F, P125K, P125L, P125N, P125Q, P125R, P125T, P125V, P125Y, S126D, S126F, S126G, S126H, S126K, S126P, S126T, S126W, G127A, G127C, G127D, G127F, G127I, G127K, G127L, G127M, G127N, G127P, G127Q, G127R, G127S, G127V, G127W, F129D, F129H, G132H, G132M, G132P, G134E, G134H, G134I, G134L, G134M, G134P, G134R, G134V, G134W, L135A, L135T, L135V, G136D, G136H, G136N, G136Q, G136S, G136T, G136V, E137F, E137H, A138C, A138E, A138F, A138G, A138I, A138L, A138Q, A138S, A138Y, K139A, K139C, K139E, K139P, K139Q, K139S, K139T, K139V, K139W, F140C, F140D, F140E, F140G, F140L, F140N, F140P, F140Q, F140W, F147A, F147G, F147L, F147N, F147P, F147Q, F147R, F147S, F147T, F147V, E150W, W151A, W151C, W151D, W151F, W151G, W151H, W151I, W151L, W151N, W151R, W151V, G152H, G152I, G152R, G152S, G152T, G152V, R153A, R153C, R153D, R153G, R153I, R153L, R153N, R153P, R153S, R153T, R153V, P154R, P154S, P154V, R156A, R156F, R156G, R156H, R156I, R156K, R156L, R156N, R156P, R156Q, R156S, R156T, R156V, R156Y, G158A, G158C, G158N, G158S, G158T, P160I, P160L, P160Q, P160V, P160Y, L161A, L161C, L161F, L1611, L161M, L161Q, L161S, L161T, L161V, L161W, L161Y, I164P, A165Y, L166A, L166D, L166E, L166G, L166I, L166S, L166T, L166V, Y169M, V186A, V186D, V186H, V186L, V186P, V186S, V186T, V186Y, D193A, D193H, D193T, L194V, Y196G, Y196W, T197H, T197L, T197M, Q199P, Y200A, Y200C, Y200E, Y200H, Y200I, Y200N, Y200Q, Y200T, Y200V, W201K, E203G, T204F, T204G, T204Y, G205E, G205F, G205I, G205K, G205L, G205Q, G205S, G205V, G205Y, F206A, F206C, F206D, F206E, F206L, F206M, F206Q, F206R, F206S, F206T, F206W, D207A, D207C, D207E, D207F, D207G, D207H, D207I, D207K, D207M, D207P, D207R, D207S, D207V, L208G, L208T, W209L, W209R, W209V, W209Y, E211C, E211F, E211G, E211H, E2111, E211L, E211M, E211W, E211Y, V212E, V212I, V212M, V212R, G214C, G214D, G214E, G214F, G214I, G214K, G214L, G214N, G214P, G214R, G214S, G214T, G214V, G214W, G214Y, S215C, S215E, S215I, S215K, S215L, S215Q, S215T, S215V, S215W, S215Y, S216C, S216E, S216G, S216L, S216M, S216N, S216Q, S216R, S216T, S216V, S216W, F217V, F218D, F218H, F218I, F218K, F218L, F218M, F218N, F218P, F218T, F218V, F218Y, T219C, T219D, T219E, T219G, T219I, T219L, T219M, T219N, T219P, T219V, T219W, T219Y, I220K, I220P, I220W, A221P, S223D, S223L, S223M, S223N, S223R, S223V, S223W, S223Y, A226Y, L227R, L227W, Y232R, E240N, C244F, C244H, C244R, V247K, V247W, P249C, P249G, P249Q, P249R, V251F, V251M, V251S, F258A, F258C, F258E, F258K, F258L, F258P, S268D, S268E, S268F, S268H, S268M, S268P, S268Q, S268R, S268Y, N269A, N269C, N269E, N269F, N269G, N269I, N269K, N269L, N269M, N269P, N269Q, N269S, N269T, N269V, N269W, N269Y, N271I, N271L, N271T, G272F, G272I, G272L, G272M, G272P, G272Q, G272R, G272V, G273A, G273C, G273D, G273E, G273I, G273L, G273M, G273N, G273P, G273V, G273Y, R276C, R276D, R276E, R276F, R276L, R276M, R276N, R276P, R276Q, R276S, R276T, R276V, R276W, R276Y, G278D, G278E, G278F, G278H, G278I, G278L, G278P, G278T, G278Y, A281F, A281I, A281V, A281W, A281Y, N282A, N282E, N282G, N282H, N282I, N282L, N282M, N282P, N282Q, N282S, N282V, S283R, I284R, I284W, L285A, L285D, L285F, L285R, A286C, A286D, A286H, A286L, A286N, A286Q, A286W, I288G, I288Y, H289F, H289W, S306W, N312R, N312W, F320K, F320P, Y324D, Y324E, Y324K, Y324P, Y324Q, Y324R, Y324W, N327R, K328Y, A337K, G339C, G339D, G339E, G339F, G339H, G339I, G339K, G339L, G339N, G339P, G339Q, G339R, G339V, G339W, R340A, R340C, R340D, R340F, R340G, R340H, R340I, R340K, R340L, R340P, R340T, R340V, R340W, Y341A, Y341G, Y341L, E343P, E343W, D344K, D344V, Y346P, Y347A, Y347G, Y347I, Y347N, Y347Q, Y347R, Y347S, Y347T, Y347V, G349C, G349D, G349F, G349I, G349L, G349M, G349N, G349P, G349R, G349S, G349W, G349Y, N350K, N350L, N350V, P351L, W352M, L354E, L354P, L354S, L354W, A355W, F357R, A358E, A358F, A358I, A358K, A358L, A358M, A358W, A359F, A359F, A359W, A359W, A359Y, A359Y, A360R, A360R, E361F, E361F, R387F, Y398V, S401D, S401L, A414V, D417R, P428H, G431I, G431M, A434I, A434V, D449I, D449R, D449V, T451E, T451M, T451Q, Y454A, Y454E, L458P, A465D, A465E, K478L, A496C, A497T, T500N, Y519H, Y519Q, Y519V, S527H, F533K, P575C, Q591V, Y592K, T599H, E606I, T614E, T614F, S619R, S619W, A625K, V629N, N630F, N630G, N630Q, D631N, W633C, y W633F.
[0215] Cohorte de SEL 10 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la reversión de la glucosa a productos DP2+ (menor reversión, mayor PI) (PI > 1,2): A32Y, N51W, N51R, N51P, I52P, I52R, G53R, G53K, G53P, G53Q, G53W, G53V, G53I, G53D, G53L, G53T, G53Y, G53E, P54Y, P54W, A58I, A58P, A59G, A59P, A59W, A59R, A59K, A59H, A59Q, P60W, P60Y, P60D, G61R, A62H, A62K, A62R, A62N, A62Q, A62F, A62E, A62Y, A62P, G65R, G65L, G65F, G65K, G65T, G65I, G65M, G65V, G65D, G65Y, G65P, G65E, G65C, G65Q, G65W, G65A, V66R, V66H, V66K, V66Y, V66W, V66N, V66D, V66Q, V67H, V67K, V67D, V67G, V67Y, V67E, V67S, I68R, I68K, I68P, I68G, I68W, I68Y, I68A, I68F, I68Q, I68D, I68C, A69E, A69R, A69H, A69K, A69L, A69D, A69F, A69I, A69V, A69T, A69C, A69S, A69G, S70R, S70Y, S70Q, S70K, S70M, S70L, S70I, S70V, S70T, S70W, S70E, S70D, P71R, P71A, P71S, P71L, P71T, S72P, S72L, S72D, T74P, D75P, P76G, P76K, P76M, P76S, P76L, P76A, P76E, P76V, P76T, P76H, P77L, P77V, P77F, Y78A, Y78S, Y78N, Y78T, Y78W, Y78Q, Y78C, Y78K, Y78V, Y78F, Y78I, Y78L, Y78M, F79I, F79G, F79A, F79Q, F79P, F79T, F79C, F80P, F80H, F80I, F80V, F80R, F80L, F80T, F80W, F80S, F80D, T81R, T81W, T81P, T81G, W82E, W82V, W82M, W82Q, W82G, W82L, W82N, W82T, W82F, W82I, W82A, W82H, W82C, W82R, W82Y, T83W, T83R, T83Y, T83H, T83P, T83G, T83Q, R84W, R84Q, R84P, R84E, R84H, R84S, R84C, R84T, R84V, R84M, R84L, R84F, A86P, A86Y, A86K, A86L, A86V, A86I, A86M, A86W, A86D, A86Q, A87F, A87Y, A87L, A87E, L88P, L88C, L88H, L88G, V89R, V89K, V89I, V89D, L90R, I93P, I94K, E95G, L97G, N102Q, N102T, N102H, N102Y, N102F, N102A, N102V, N102I, N102G, N102C, N102S, N102K, N102N, N102R, N102E, N102M, N102W, N102L, Y112R, Y112P,
Y112M, Y112C, S115W, S115F, Q116P, Q116F, Q116W, Q116R, Q116Y, Q116K, L119P, L119R, L119K, L119W, Q120K, Q120W, Q120L, Q120P, Q120R, Q120N, Q120G, Q120H, Q120T, Q120C, Q120V, Q120S, V122D, N124K, N124W, N124H, N124R, N124Y, N124I, N124F, N124L, N124M, N124Q, P125L, P125Y, P125S, P125C, P125H, P125T, S126L, S126P, S126K, S126R, S126H, S126I, S126W, S126E, S126F, S126V, S126D, G127P, G127I, G127R, G127K, G127V, G127N, G127Q, G127W, G127A, G127F, G127L, G127M, G127S, G127C, G127D, F129H, F129R, F129N, F129G, F129T, D131P, G132P, G132E, G132V, G132N, G132T, G132K, G132D, G132R, G132I, G132C, G132W, G132M, G132H, G132S, G132L, S133P, G134R, G134H, G134W, G134M, G134I, G134L, L135R, L135H, L135K, L135W, L135P, L135A, L135N, L135T, L135V, L135S, L135G, L135Q, G136L, G136F, G136I, G136R, G136W, G136K, G136V, G136M, G136T, G136P, G136H, G136Q, G136N, G136D, G136S, E137F, E137R, E137P, E137L, E137H, E137A, E137T, E137W, E137C, E137G, E137I, E137V, E137Q, E137S, E137M, E137K, A138R, A138W, A138D, A138Y, A138K, A138L, A138F, A138H, A138N, A138E, A138C, A138Q, A138I, A138G, K139G, K139P, K139E, F140P, F140E, F140G, F140Q, F140N, F140H, F140D, F140V, F140L, F140C, F140S, F140F, N141P, V142H, V142S, V142Q, V142W, D143P, L144P, L144H, L144W, T145P, A146W, A146Y, F147R, F147P, F147G, F147L, F147K, F147A, F147M, F147H, F147T, F147V, F147Q, F147C, F147I, F147N, G149I, G149V, G149T, G149Y, G149P, G149R, G149L, G149F, E150G, W151K, W151C, W151E, W151A, W151R, W151L, W151T, W151V, W151D, W151P, W1511, W151H, W151F, W151S, W151Y, W151N, W151G, G152H, G152K, G152N, G152D, G152R, R153K, R153H, R153W, R153T, R153C, R153V, R153I, R153S, R153F, R153Y, R153Q, R153N, R153L, R153M, R153G, R153P, R153A, R153D, P154N, P154L, P154Q, P154F, P154R, P154W, P154Y, P154M, P154H, P154K, P154I, P154E, P154T, P154V, P154S, P154C, P154D, Q155K, Q155R, Q155W, Q155P, Q155V, Q155F, Q155Y, Q155G, Q155I, Q155T, Q155L, Q155S, Q155M, Q155D, Q155A, Q155E, R156W, R156F, R156P, R156Y, D157A, D157T, D157S, D157Q, D157Y, D157H, D157L, D157I, D157V, D157N, D157F, D157P, D157M, D157R, D157W, G158H, G158F, G158K, G158R, G158Y, G158L, G158I, G158Q, G158P, G158T, G158V, G158N, G158C, G158A, P159W, P159K, P159R, P159I, P159L, P159M, P159Q, P159V, P159E, P160R, P160K, P160I, P160L, P160Q, P160E, P160Y, L161Y, L161W, R162P, R162H, R162F, R162W, R162K, R162D, R162T, R162I, R162G, A163P, A163R, A163K, A163H, I164K, A165W, A165C, A165Y, A165T, A165K, A165R, L166R, L166K, G177P, S180L, A182D, A182N, A182P, V185L, V186W, V186R, V186V, V186K, V186T, V186I, V186Y, V186M, V186F, V186L, V186A, V186H, V186S, V186E, V186C, V186G, V186N, V189Y, V189F, V189R, N192W, N192Y, N192F, N192R, D193V, D193I, D193M, D193W, D193Y, D193L, D193H, D193R, D193T, D193N, D193Q, D193E, L194T, L194V, Y196K, Y196I, Y196P, Y196M, Y196T, Y196H, T197R, T197Y, T197W, T197K, T197H, T197F, Q199W, Q199P, Q199I, N202W, E203P, G205W, G205P, G205K, G205R, G205L, G205F, G205V, G205E, G205Y, F206G, F206P, F206A, F206S, F206Q, F206R, F206K, F206C, D207K, 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D344M, D344W, D344I, D344T, D344V, D344L, D344K, D344H, D344Y, D344P, D344R, D344Q, D344E, D344F, D344G, D344N, D344C, D344S, V345P, Y346K, Y346P, Y346R, Y346G, Y346A, Y346T, Y346E, Y346V, Y346C, Y346S, Y346L, Y346H, Y346D, Y346I, Y346M, Y346F, Y347P, Y347N, Y347L, Y347R, Y347T, Y347H, Y347D, Y347S, Y347I, Y347G, Y347V, Y347Q, Y347C, Y347M, N348P, G349Q, G349I, G349Y, G349P, G349W, G349V, G349L, G349R, G349F, G349M, G349T, G349S, G349C, G349D, G349N, G349A, N350Y, N350W, N350P, N350V, N350I, N350T, N350F, N350K, N350L, N350A, N350C, N350S, N350H, N350M, N350D, N350E, N350G, P351W, P351R, P351H, P351K, P351D, P351L, P351N, P351Q, P351V, P351F, P351Y, P351M, P351T, P351E, W352R, W352H, W352K, W352E, W352S, W352N, W352G, W352I, W352Q, W352T, W352D, W352C, W352A, W352L, W352M, W352Y, Y353K, Y353R, L354R, L354W, L354Y, L354D, L354H, L354P, L354Q, L354E, L354S, L354T, L354N, L354V, A355R, A355K, A355W, A355P, N356W, N356R, N356K, N356F, N356L, F357R, A358P, A358R, A358A, A358T, A358W, A358S, A359R, A359W, A359F, A359Y, E361D, F386M, S391A, S401L, G418F, F419P, F419R, E421P, A423H, A423W, P428H,
G431R, G431I, L433P, L433H, L433R, L433G, A434I, A434V, A434L, D438P, D438W, D438I, D438V, R439I, R439V, R439W, R439D, N440P, T441P, K443P, S446I, S446Q, S446K, S446E, S446V, S446P, S446R, S446W, S446C, S446F, S446T, S446D, S446A, S446Y, S446N, S446G, A447R, A447N, A447D, A447W, A447M, A447P, A447H, D449W, D449R, D449K, D449V, T451R, T451W, T451Y, T451F, T451P, T451K, T451L, T451M, T451V, T4511, T451D, T451C, W452R, W452H, W452K, W452T, W452S, W452D, W452G, W452P, W452A, W452Q, W452E, W452C, W452V, W452Y, W452M, S453K, S453Y, S453W, S453I, S453L, S453R, S453P, S453H, S453V, S453E, S453D, Y454A, Y454K, R463D, A465D, W472W, W472T, R473S, T484T, A491G, Y494I, Y494S, Y494A, Y494V, Y494Q, Y494T, Y494G, V495P, T500N, A513G, Y519Q, V529R, V529W, V531S, V531A, V531T, S538F, L554L, L554F, Y570G, S572F, P575C, I579G, T586P, S620W, A625K, A626H, A626F, A626E, N630G, N630Q, S632N y S632V.
[0216] Cabe destacar que existen numerosas variantes de HgGA que se incluyen en más de una de las Cohortes de SEL 1 a 10 anteriores. Por tanto, los aspectos de la presente exposición están dirigidos a variantes de HgGA que pertenecen a cualquiera de entre las Cohortes de SEL 2, 3, 4, 5, 6 o más anteriores. Por ejemplo, la variante de HgGA P470F pertenece a las Cohortes de SEL 1 a 8 anteriores.
[0217] Además de las variantes de HgGA en las Cohortes de SEL 1 a 10 anteriores (o combinaciones de las mismas), se identificaron variantes de sustitución HgGA que tenían un PI para ensayos que era menor que 1,2 y mayor o igual que 0,90. Estas variantes de HgGA pertenecen a la Cohorte de SEL 11.
[0218] Cohorte de SEL 11: - variantes de HgGA en las que el PI para todos los ensayos es de <1,2 y > 0,9: A32E, V33P, T35R, T35L, T35W, T35Y, F36F, N38F, T39Q, T39E, T39L, K41C, P42P, P42Q, P42C, W45W, K47R, N51N, G56G, T74K, F79F, R84R, E95E, G98Y, H99M, H99A, T103Q, T104E, T104D, L105Y, T107G, T107V, T107I, 11091, I109A, Q110C, P125P, D143D, F147F, T148M, T148L, Q155Q, P160P, 11641, I164A, L166M, K171R, K171G, 11741, I174F, G177D, G177S, G177G, Y178Y, K179L, K179R, K179Q, K179H, K179W, T181T, S184L, V185Q, W187W, V189V, K191R, L194I, A198C, A198S, L208L, H224H, R225R, A226A, A226S, A231A, Y232F, L233V, Q236F, L237I, L237L, D238R, D238Q, D238L, T239M, T239T, T239A, T239V, T239C, E240Q, E240W, R242R, A243H, C244C, T245C, T245R, T245I, A248S, P249P, P249D, Q250Y, Q250M, L252A, L252N, L252I, Q255E, Q255L, Q256Q, Q256F, A257A, A257F, N260C, S261Y, S261W, S261T, S261K, S261F, K262W, K262R, K262K, K262P, K262V, K262D, K262M, K262H, G263A, G263E, G263H, G263R, G263Q, G263T, N264N, N264P, N264F, N264V, N264A, Y265W, V267K, V267R, S268S, N271N, E274D, E274Q, R276R, S277T, I284I, I288I, N290Q, N290E, N290I, F291Y, F291F, D292D, P293R, P293H, P293F, P293Y, P293G, P293L, P293S, P293E, E294W, E294V, E294N, E294G, E294M, A295V, A295F, G296P, G296L, C297C, D298N, D298I, D298D, D298A, D298E, N299Q, T301L, F302W, Q303Q, E307E, A311V, A311C, A311M, H313Y, H313H, V317V, N322H, N322G, A325L, A325P, A325Q, A325C, A325F, K328W, I330I, D344D, Y364E, D365E, D365Q, I367S, I367L, I367K, I367Y, Y368H, Y368E, Y368W, Y368T, K372S, Q373R, Q373E, Q373L, Q373F, Q373N, Q373G, Q373A, G374E, G374K, G374D, G374F, G374T, G374R, G374V, G374W, V378L, T379H, T379R, T379N, T379T, S380W, V381S, V381K, L383L, P384Y, P384D, F385L, F386L, F386H, F386T, R387R, D388D, D388A, V390K, S394G, S394H, S394I, T395R, T395V, T395Y, G396R, G396E, G396Q, G396L, T397Q, T397W, T397V, T397F, T397Y, T397L, Y398F, Y398L, K400Y, K400V, K400W, S402P, S403W, S403I, S403P, T404Q, T404T, F405Y, F405W, F405F, F405H, N407G, N407I, N407K, N407Q, N407C, N407L, N407R, I408V, I408A, N410Q, N410Y, A411L, A411G, A411S, A411R, A411Q, A411I, A411N, A411W, K413E, K413P, A414I, A414A, A414Q, A414P, A414F, A414C, A414S, A416G, A416A, A416C, D417T, D417N, E421Q, E421C, K425R, G431G, L433L, D438D, R439R, N440N, K443L, T451T, F457F, D462A, R463K, R463R, R464R, L467Q, L467W, L467T, L467G, S471P, S475I, S475F, K478S, K478P, K478E, K478T, K478R, K478Y, S479G, S479N, S479M, S479Q, S479T, S479Y, S479R, Q480L, L481H, L481F, L481R, S483K, S483R, S483T, S483I, S483A, S483N, C485C, S486T, S486Y, R487R, T493T, Y494Y, V495I, S499C, S499H, S499A, K505G, K505N, K505T, K505E, T507T, N509N, S511H, A513A, S515M, S515S, S515T, S515N, Y519Y, T521S, A522R, A522L, T532Y, E535E, R536R, R536L, R536Y, V537V, V537C, V537A, S538A, A540T, A540E, A540V, A540L, W541Y, G542M, E543E, E543C, E543I, T544N, T544A, T544I, T544T, T544L, K546K, V548V, N550N, N550T, V551Q, V551K, V551F, V551L, P552G, P552K, P552N, P552I, P552M, P552Y, A553K, A553Q, A553Y, N556N, N556M, N556W, D558Q, D558R, D558F, D558L, S560K, S560M, S560A, T564L, T564S, T564T, T564M, K571T, S572L, N573E, N573Y, N573H, N573F, N573I, I579M, I583I, K584K, K584F, A585S, A585F, A585D, A585W, A585A, T586R, G587C, G587P, S588L, S588H, A589L, A589C, A589R, A589K, A589D, Q591C, Q591Q, Q591R, K596K, V597M, V597L, T599V, T599Y, N600R, N600E, N600Q, N600M, N600A, N600W, G601G, G601F, K602I, K602R, D608F, D608I, D608E, P609A, P609P, P609G, T614L, T614T, T614Y, T614Q, L615L, S619L, S620Q, S620M, Q627E, T628T, V629M, V629I, N630C, N630R, D631D, S632D, S632E y S632C.
[0219] En determinados modos de realización de la exposición objeto, una o una combinación de sustituciones en la Cohorte de SEL 11 son de utilidad para generar variantes de HgGA combinatorias con una o más de las sustituciones identificadas en cualquiera de las Cohortes de SEL 1 a 10 anteriores.
[0220] Además del análisis anterior, se identificaron posiciones de aminoácidos productivas en HgGA en función de los resultados de los ensayos funcionales. Se describen posiciones productivas como aquellas posiciones dentro de una molécula que son más útiles para fabricar variantes combinatorias que exhiben una característica mejorada, donde la propia posición permite al menos una mutación combinable. Las mutaciones altamente
combinables son mutaciones en cualquier posición de aminoácido que pueden utilizarse para realizar variantes combinatorias. Las mutaciones altamente combinables mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras que no reducen significativamente la expresión, la actividad ni la estabilidad. Las mutaciones altamente combinables pueden agruparse de la siguiente manera:
Grupo A: Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (PI) mínimos relativos a un polipéptido original definido para: (1) expresión, (2) actividad hidrolítica en sustrato DP2, (3) actividad hidrolítica en sustrato DP7 a pH 5,5, (4) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, y (5) termoestabilidad, son mayores o iguales que 0,9, y además, tiene un PI para cualquiera de estos ensayos que es mayor que o igual a 1,0.
Grupo B: Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (PI) mínimos relativos a un polipéptido original definido para: (1) expresión, (2) actividad hidrolítica en sustrato DP2, (3) actividad hidrolítica en sustrato DP7 a pH 5,5, (4) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, y (5) termoestabilidad, son mayores o iguales que 0,8, y además, tiene un PI para cualquiera de estos ensayos que es mayor que o igual a 1,2.
Grupo C: Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (PI) mínimos relativos a un polipéptido original definido para: (1) expresión, (2) actividad hidrolítica en sustrato DP2, (3) actividad hidrolítica en sustrato DP7 a pH 5,5, (4) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, y (5) termoestabilidad, son mayores o iguales que 0,5, y además, tiene un PI para cualquiera de estos ensayos que es mayor que o igual a 1,5.
[0221] Las propiedades de las mutaciones altamente combinables se resumen en la siguiente Tabla.
Tabla 6: Propiedades de PI para cada Grupo de mutaciones altamente combinables
[0222] Las mutaciones combinables preferidas se encuentran en «posiciones productivas», tal como se describe a continuación. En el caso de las presentes enzimas GA, la «actividad» se refiere a actividad de glucoamilasa, que puede medirse según se ha descrito en el presente documento.
[0223] Las posiciones productivas son posiciones de aminoácido que son tolerantes a la sustitución con distintos residuos de aminoácidos, donde las variantes resultantes cumplen un conjunto de criterios de rendimiento para la combinabilidad, tal como se ha expuesto anteriormente. Puede asignarse una Puntuación de productividad a las posiciones productivas de la siguiente manera:
• A las posiciones donde menos del 15 % de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una Puntuación de productividad de «1».
• A las posiciones donde menos del 40%, pero más de o el 15% de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una Puntuación de productividad de «2».
• A las posiciones donde menos del 75%, pero más de o el 40% de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una Puntuación de productividad de «3».
• A las posiciones donde el 75 % o más de las sustituciones en una posición determinada pertenecen a los grupos A, B o C se les da una Puntuación de productividad de «4».
[0224] Las mutaciones en posiciones productivas preferidas son altamente combinables.
[0225] La puntuación de idoneidad se refiere a la habilidad para que una o más mutaciones altamente combinables se utilice para hacer variantes combinatorias, en función de los criterios de rendimiento para la combinabilidad (es decir, A, B y C, tal como se ha expuesto anteriormente) en los que se incluye cada una de las mutaciones. Una puntuación de idoneidad más alta indica una mutación o mutaciones que son más adecuadas para su utilización en la fabricación de variantes combinatorias.
[0226] Las puntuaciones de idoneidad se describen a continuación en la Tabla 7.
Tabla 7: Definiciones de las puntuaciones de idoneidad
[0227] La Tabla 8 muestra la Puntuación de productividad (4, 3, 2 o 1) calculada para cada posición en el polipéptido de HgGA. Para cada posición de HgGA, las variantes se enumeran según la puntuación de idoneidad que han recibido (+, +, ++, +++, o ++++). La numeración de la posición se basa en el polipéptido de HgGA de longitud completa indicado en la SEQ ID NO: 3 (la secuencia señal putativa es del aminoácido 1 al 30, tal como se ha indicado anteriormente).
1
17
1
1
14
14
14
14
14
14
1
11
12
[0228] Tal como se ha indicado anteriormente, cualquier combinación de variantes de la Tabla 8 es de utilidad en aspectos de la presente exposición.
[0229] Además de las variantes de HgGA que presentan una única sustitución, se determinaron los valores del índice de rendimiento (PI) para 41 variantes combinatorias de HgGA específicas utilizando los siguientes ensayos (descritos en el Ejemplo 1): (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión,
[0230] Más abajo se incluye un listado de las variantes combinatorias de HgGA que presentan una propiedad mejorada con respecto a la HgGA de origen natural en al menos uno de los ensayos. Las variantes combinatorias de HgGA se incluyen en las siguientes Cohortes de SEL combinatorias (el ensayo y el límite de PI se enumeran para cada Cohorte combinatoria).
[0231] Cohorte de SEL combinatoria 1 - Variantes de HgGA combinatorias que presentan un PI mejorado en la expresión (PI > 1,1): G92T-I164N-Y346W, G92T-E535W, P54D-K328Q, T35S-G92T-T239A-A448V-I461A-K571T, I43F-T239N-N271Q-E535T-K546S, P60Q-F206V, T35S-G92T-T239A, I43D-G92F-Y346W, G92F-E203A-S375D-P552I, A448V-I461A-E543H-A567R-K596I, P60Q-F79V-F206V, K139R-F147N-F206D, T74R-A448V-E535A-E543H-K571R, I43F-T239N-A448V-I461A-K546S-K596I, D75R-K571R, F79V-F147M-N534S-E535W, A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, A448V-I461A-K571R-K596I, I43F-P54D-G92F-K328Q-S375D, I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S, G92F-S375D, W577K-W605K, D75R-G92I-E203F-K571R, G92F-L144F-D462Q-A567R, D75R-G92I-K571R, P60Q-F79V-E203F-F206V, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, K139R-F147N-F206D-P213W-K571F, V422P-D449A-S568R-G569W, D75E-F79D-D449A-S568R, I43F-T239N-N271Q-A448V-I461A-E535T-E543H-K546S-K571R-K596I, y F79T-G92F-S96L-L144F-I164N.
[0232] Cohorte de SEL combinatoria 2 - Variantes de HgGA combinatorias que presentan un PI mejorado en la termoestabilidad (actividad de la hidrólisis de DP7 residual tras 5 min a 63,5 °C / actividad de la hidrólisis de DP7 inicial) (PI > 1,1): F79T-G92F-S96L-L144F-I164N, A448V-I461A-E543H-A567R-K596I, A448V-I461A-K571R-K596I, A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, y T35S-G092T-T239A-A448V-I461A-K571T.
[0233] Cohorte de SEL combinatoria 3 - Variantes de HgGA combinatorias que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 5,5 (PI > 1,1): I43D-G92F-Y346W, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, G92T-I164N-Y346W, A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, A448V-I461A-E543HA567R-K596I, P60Q-F79V-E203F-F206V, T74R-A448V-E535A-E543H-K571R, y A448V-I461A-K571R-K596I.
[0234] Cohorte de SEL combinatoria 4 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP7 a pH 6,8 (PI > 1,1): I43D-G92F-Y346W, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, y A448V-I461A-E543H-K571R-K596I.
[0235] Cohorte de SEL combinatoria 5 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de DP2 (PI > 1,1 en el ensayo Km o el ensayo Vmax); A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, T74R-A448V-E535A-E543H-K571R, D75R-K571R, y G92F-L144F-D462Q-A567R.
[0236] Cohorte de SEL combinatoria 6 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de pululano (PI > 1,1); A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S, y A448V-I461A-K571R-K596I.
[0237] Cohorte de SEL combinatoria 7 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de panosa (PI > 1,1); K139R-F147N-F206D-P213W-K571F, A448V-I461A-E543H-K571R-K596I, V422P-D449A-S568R-G569W, y T74R-A448V-E535A-E543H-K571R.
[0238] Cohorte de SEL combinatoria 8 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado en un ensayo de hidrólisis de almidón de maíz (PI > 1,1); T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, F79T-G92F-S096L-L144F-I164N, y I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S.
[0239] Cohorte de SEL combinatoria 9 - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la inhibición de glucosa de la actividad enzimática [mayor proporción de (muestra de inhibición)/(sin muestra de inhibición) en comparación con las de origen natural] (PI > 1,1): D75E-F79D-D449A-S568R, I43F-T239N-N271Q-E535T-K546S, I43F-T239N-N271Q-A448V-I461A-E535T-E543H-K546S-K571R-K596I, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, G92F-L144F-D462Q-A567R, T35S-G92T-T239A, T35S-G92T-T239A-T441L, G92F-E23A-S375D-P552I, P60Q-F79V-E203F-F206V.
[0240] Cohorte de SEL 10 combinatoria - Variantes de HgGA que presentan un PI mejorado para la reversión de la glucosa a productos DP2+ (menor reversión, mayor PI) (PI > 1,1): D75E-F79D-D449A-S568R, F79T-G92F-S96L-L144F-I164N, T35S-I43F-P54D-G92F-K328Q-Y346W, I43D-G92F-Y346W, V422P-D449A-S568R-G569W, F79V-F147M-N534S-E535W, G92T-I164N-Y346W, P60Q-F79V-E203F-F206V, G92F-L144F-D462Q-A567R, I43F-P54D-G92F-K328Q-S375D, D75R-G92I-E203F-K571R, P60Q-F79V-F206V, D75R-G92I-K571R, G92F-E203A-S375D-P552I, G92F-S375D, D75R-K571R, P60Q-F206V, y I43F-P54D-T239N-K328Q-K546S.
[0241] Cabe destacar que existen numerosas variantes de HgGA combinatorias que se incluyen en más de una de las Cohortes de SEL 1 a 10 combinatorias anteriores. Por tanto, los aspectos de la presente exposición están dirigidos a variantes de HgGA que pertenecen a cualquiera de entre las Cohorte des SEL 2, 3, 4, 5, 6 o más anteriores. Por ejemplo, la variante de HgGA combinatoria A448V-I461A-E543H-K571R-K596I pertenece a las Cohortes de SEL 1 a 7 anteriores.
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Claims (15)
1. Variante de una enzima glucoamilasa (GA) original, donde la variante difiere de la enzima original en que tiene una o una combinación de sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) 470 seleccionadas del grupo que consiste en: K, S, A, C, E, F, G, I, L, M, N, Q, R
(b) 468 seleccionadas del grupo que consiste en: A, E, D, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R
(c) 466 seleccionadas del grupo que consiste en: D, K, M, R, Y, C, P, T, W, A, E, F, H (d) 472 seleccionadas de entre el grupo que consiste en: R, D, I, M, Q, S y Y,
donde la posición de cada sustitución de aminoácido se corresponde con la SEQ ID NO:3, y
donde la variante de GA tiene una actividad de hidrólisis del almidón; presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4; y presenta al menos una propiedad mejorada con respecto a la enzima
GA original seleccionada de entre: (a) expresión, (b) actividad hidrolítica en un sustrato DP2, (c) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 6,8, (d) actividad hidrolítica en un sustrato DP7 a pH 5,5, (e) actividad hidrolítica en un sustrato de panosa, (f) actividad hidrolítica en un sustrato de pululano, (g) actividad hidrolítica en almidón de maíz (CS) granular, (h) termoestabilidad, (i) inhibición de la glucosa, y (j) actividad de reversión,
con la condición de que la variante no sea la SEQ ID NO: 737 del documento WO 2013/181760 A1.
2. Variante según la reivindicación 1, donde la variante de GA difiere de la enzima original en que presenta una o una combinación de sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) 468 seleccionadas del grupo que consiste en: A, E, D, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T y W; y/o
(b) 466 seleccionadas del grupo que consiste en: D, K, M, R, Y, C, P, T, W, A, E, F, H, L, N, S, I, V y Q; y
(c) 472 seleccionadas del grupo que consiste en: R, D, I, M, Q, S y Y,
donde la posición de cada sustitución de aminoácido se corresponde con la SEQ ID NO:3.
3. Variante de GA según la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, comprendiendo al menos una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada del grupo que consiste en: T35, K41, P60, L97, N100, T107, A175, K183, E229, T245, G263, P293, E294, N299, L300, R308, K334, S342, Y364, I367, V369, Q373, G374, S382, V393, S394, T397, K400, S402, T406, N407, V409, N410, A411, A414, I462, L467, P469, S471, V476, A477, K478, S479, Q480, S483, T484, P503, K505, Q506, A522, T544, N556, G587, A589, T599, N600, T604, S607, P609, A31, I37, N46, K57, D85, L105, K171, K179, S184, P213, A221, T239, Q250, L252, N260, S261, K262, N264, E274, A295, A325, K328, A366, Y368, N371, K372, I376, S380, V381, P384, R387, V390, S391, T395, G396, S399, S401, S403, F405, I408, A448, D462, S475, S486, A491, S511, S515, A524, V537, S538, A540, W541, G542, V551, P552, K561, A562, T564, L565, N573, A585, V590, Q591, V597, G601, I603, D608, 1613, T614, S620, S632, A32, V33, N38, T39, T74, H99, T104, N111, K118, Q121, 1164, Q168, 1174, G177, S180, T181, V190, K191, A198, L227, L233, Q236, D238, E240, A243, A248, V251, Q255, Y275, N290, F291, D292, G296, D298, T301, F302, A311, A315, S319, G329, A331, Q332, V345, A360, D365, W370, T379, F386, L389, S392, Y398, K413, A416, D417, S429, A434, K443, A460, R463, R464, A465, R473, L481, T493, S499, S501, V531, R536, V548, N550, A553, L554, G555, D558, T559, S560, S572, D574, S578, K584, S588, I595, K596, K602, W605, E606, R611, S612, S619, V629, D34, P42,
I43, K47, A50, N55, A58, A62, A64, I68, S72, R73, D75, P77, T83, L90, S96, G98, Y101, T103, 1109, Q110, V113, S115, V122, S123, S126, T128, F129, A146, T148, E150, A165, L166, Y169, A170, A182, V185, P188,
L194, T197, F206, F218, S222, H224, A226, Y232, L237, P249, Q256, A257, F258, W259, Y265, V267, S268, G272, G273, S277, D280, A281, I284, A286, S287, Q303, S306, E307, H313, Y316, D318, N322, V336, A337, N348, A355, N356, A359, L363, S375, T377, V378, L383, F385, D388, T404, E421, V422, A424, K425, Y426, A432, N440, S446, T451, F457, R487, I488, V495, A496, A497, F502, S504, A513, P516, P520, T521, S527, V529, T532, N534, E535, T539, E543, I545, V547, G549, K571, L576, I579, I583, T586, Y592, Y594, G622, Q627, T628, N630 y D631, donde la posición de cada sustitución de aminoácido corresponde a la SEQ ID NO:3, opcionalmente donde la al menos una sustitución de aminoácido adicional se selecciona de la Tabla 8.
4. Variante según la Reivindicación 3, donde la variante de GA comprende una sustitución de aminoácido en la posición:
(a) T35 seleccionada del grupo que consiste en: A, P, C, F, K, L, Q, R, W, Y y H; y/o
(b) K41 seleccionada del grupo que consiste en: C, S, T, W, D, H, L, N, P, R y E; y/o
(c) P60 seleccionada del grupo que consiste en: V, G, H, M, R, I, W, F, T y Q; y/o
(d) L97 seleccionada del grupo que consiste en: A, G, Q, E, T, V, F, C, H, I y N; y/o
(e) N100 seleccionada del grupo que consiste en: P, E, V, C, I, M, Q, T, F, G, K, S, W, Y, A, L y R; y/o (f) T107 seleccionada del grupo que consiste en: A, W, Y, H, G, I, S, V, K, C, D, E, M y N; y/o
(g) A175 seleccionada del grupo que consiste en: F, E, H, K, M, N, Q, R, S, T, V y C; y/o
(h) K183 seleccionada del grupo que consiste en: H, E, I, Q, R, V, Y, D, F, T y W; y/o
(i) E229 seleccionada del grupo que consiste en: A, D, G, M, T, W, I, L, Y, C, F, K y V; y/o
(j) T245 seleccionada del grupo que consiste en: L, C, I, R, H, M, Q, S, V, Y, F y W; y/o
(k) G263 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, E, H, L, Q, R, S, T y Y; y/o
(l) P293 seleccionada del grupo que consiste en: T, A, C, E, F, G, H, L, R, S, Y y Q; y/o
(m) E294 seleccionada del grupo que consiste en: D, G, I, K, L, M, N, S, V, W, A y C; y/o
(n) N299 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, E, G, L, Q, T, V, P, R y S; y/o
(o) L300 seleccionada del grupo que consiste en: I, K, N, A, C, D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V, W y Y; y/o (p) R308 seleccionada del grupo que consiste en: I, F, L, A, D, E, G, H, K, M, Q, T, W y V; y/o
(q) K334 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, I, L, T, W, D, V, A, E, F, R y Y; y/o
(r) S342 seleccionada del grupo que consiste en: G, L, T, W, Y, C, E, F, N, Q, K, M, P, R y V; y/o (s) Y364 seleccionada del grupo que consiste en: E, R, W, G, Q, H, I, L, M, N, S y V; y/o
(t) 1367 seleccionada del grupo que consiste en: G, E, F, K, L, M, S, V, W y Y; y/o
(u) V369 seleccionada del grupo que consiste en: F, Q, C, I, K, L, N, S, T, Y, A, E, G y M; y/o
(v) Q373 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, F, G, L, N, R, S, T, C, H, K y V; y/o
(w) G374 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, F, K, R, T, V, W, C, L, M, P, S, A y Y; y/o (x) S382 seleccionada del grupo que consiste en: D, H, C, P, Q, E, G, N, T y V; y/o
(y) V393 seleccionada del grupo que consiste en: A, W, E, G, T, Y, F, H, I, L y N; y/o
(z) S394 seleccionada del grupo que consiste en: F, G, H, I, N, A, C, D, L, M, P y Y; y/o
(aa) T397 seleccionada del grupo que consiste en: A, G, F, L, Q, V, W, Y, K y R; y/o
(ab) K400 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, G, L, R, S, V, W, Y y P; y/o
(ac) S402 seleccionada del grupo que consiste en: D, I, N, P, T, W, R, F, K y M; y/o
(ad) T406 seleccionada del grupo que consiste en: C, A, D, G, H, I, L, N, P, R, S, V, W y E; y/o eN407 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, I, K, L, Q, R, A, P, S y W; y/o
(af) V409 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, H, K, D, E, L, M, R, W y Y; y/o
(ag) N410 seleccionada del grupo que consiste en: I, G, Q, Y, C, F, H, K, L, P, T, V, W, A y D; y/o (ah) A411 seleccionada del grupo que consiste en: P, G, I, L, N, Q, R, S, W y C; y/o
(ai) A414 seleccionada del grupo que consiste en: C, F, G, I, P, Q, S, D, E, R, T y W; y/o
(aj) 1461 seleccionada del grupo que consiste en: C, F, G, K, M, S, T, V, Y, N, Q y R; y/o
(ak) L467 seleccionada del grupo que consiste en: C, G, Q, T, W, D, H, N, Y, A, F, S y V; y/o
(al) P469 seleccionada del grupo que consiste en: R, C, H, T, V, G, N, S, E, I, Q y W; y/o
(am) S471 seleccionada del grupo que consiste en: D, C, M, E, G, P, Q, L, A, H, I, N y V; y/o
(an) V476 seleccionada del grupo que consiste en: A, D, E, G, H, N, S, L, M, P, Q, Y, R, T, I y W; y/o (ao) A477 seleccionada del grupo que consiste en: D, E, I, K, Q, R, M, W, S y V; y/o
(ap) e K478 seleccionada del grupo que consiste en: E, I, P, R, S, T, Y, F, Q y V; y/o
(aq) S479 seleccionada del grupo que consiste en: A, G, L, M, N, Q, R, T, Y, F, I y K; y/o
(ar) Q480 seleccionada del grupo que consiste en: A, C, D, T, V, H, I, L, M y F; y/o
(ch) K372 seleccionada del grupo que consiste en: C
(ci) I376 seleccionada del grupo que consiste en: C,
(cj) S380 seleccionada del grupo que consiste en: A,
(ck) V381 seleccionada del grupo que consiste en: F,
(cl) P384 seleccionada del grupo que consiste en: D,
(cm) R387 seleccionada del grupo que consiste en:
(cn) V390 seleccionada del grupo que consiste en: H
(co) S391 seleccionada del grupo que consiste en: N
(cp) T395 seleccionada del grupo que consiste en: K,
(cq) G396 seleccionada del grupo que consiste en: E
(cr) S399 seleccionada del grupo que consiste en: Q
(cs) S401 seleccionada del grupo que consiste en: H
(ct) S403 seleccionada del grupo que consiste en: I,
(cu) F405 seleccionada del grupo que consiste en: A,
(cv) I408 seleccionada del grupo que consiste en: Q,
(cw) A448 seleccionada del grupo que consiste en: F
(cx) D462 seleccionada del grupo que consiste en: H T; y/o (cy) S475 seleccionada del grupo que consiste en: K, y/o (cz) S486 seleccionada del grupo que consiste en: V,
(da) A491 seleccionada del grupo que consiste en: H
(db) S511 seleccionada del grupo que consiste en: I,
(dc) S515 seleccionada del grupo que consiste en: D
(dd) A524 seleccionada del grupo que consiste en: F
(de) V537 seleccionada del grupo que consiste en:
(df) S538 seleccionada del grupo que consiste en: G,
(dg) A540 seleccionada del grupo que consiste en: Y
(dh) W541 seleccionada del grupo que consiste en:
(di) G542 seleccionada del grupo que consiste en: D,
(dj) V551 seleccionada del grupo que consiste en: S,
(dk) P552 seleccionada del grupo que consiste en: A,
(dl) K561 seleccionada del grupo que consiste en: D,
(dm) A562 seleccionada del grupo que consiste en: I,
(dn) T564 seleccionada del grupo que consiste en:
(do) L565 seleccionada del grupo que consiste en:
(dp) N573 seleccionada del grupo que consiste en:
(dq) A585 seleccionada del grupo que consiste en:
(dr) V590 seleccionada del grupo que consiste en:
(ds) Q591 seleccionada del grupo que consiste en: L
(dt) V597 seleccionada del grupo que consiste en: R,
(du) G601 seleccionada del grupo que consiste en:
(dv) I603 seleccionada del grupo que consiste en: Q, T, Y, A, K, F, L, N y P; y/o (dw) D608 seleccionada del grupo que consiste en: L, P, R, T, E, F y I; y/o (dx) 1613 seleccionada del grupo que consiste en: A, F, L, S, T y V; y/o
(dy) T614 seleccionada del grupo que consiste en: L, M, Q, V, Y y S; y/o (dz) S620 seleccionada del grupo que consiste en: D, M, Q, E, H, P y R; y/o (ea) S632 seleccionada del grupo que consiste en: L, C, D, E, G y T; y/o (eb) A32 seleccionada del grupo que consiste en: S, T, E y Q; y/o
(ec) V33 seleccionada del grupo que consiste en: L, P y I; y/o
(ed) N38 seleccionada del grupo que consiste en: G, F, H, K y I; y/o
(ee) T39 seleccionada del grupo que consiste en: E, K, L y Q; y/o
(ef) T74 seleccionada del grupo que consiste en: D, I, K y V; y/o
(eg) H99 seleccionada del grupo que consiste en: G, A, M, V y Y; y/o
(eh) T104 seleccionada del grupo que consiste en: V, D y E; y/o
(ei) N111 seleccionada del grupo que consiste en: F, M, D, Q y H; y/o
(ej) K118 seleccionada del grupo que consiste en: M, L, F y Y; y/o
(ek) Q121 seleccionada del grupo que consiste en: V, L y T; y/o
(el) 1164 seleccionada del grupo que consiste en: K, V y A; y/o
(em) Q168 seleccionada del grupo que consiste en: H, A, L y Y; y/o
(en) 1174 seleccionada del grupo que consiste en: V, F y Y; y/o
(eo) G177 seleccionada del grupo que consiste en: D, H, K y S; y/o
(ep) S180 seleccionada del grupo que consiste en: A, C y F; y/o
(eq) T181 seleccionada del grupo que consiste en: A, S y W; y/o
(er) V190 seleccionada del grupo que consiste en: A, I, M y L; y/o
(es) K191 seleccionada del grupo que consiste en: V, W y R; y/o
(et) A198 seleccionada del grupo que consiste en: Y, C, G y S; y/o
(eu) L227 seleccionada del grupo que consiste en: A, C y I; y/o
(ev) L233 seleccionada del grupo que consiste en: T, V y M; y/o
(ew) Q236 seleccionada del grupo que consiste en: W, F, D, N y Y; y/o
(ex) D238 seleccionada del grupo que consiste en: L, Q y R; y/o
(ey) E240 seleccionada del grupo que consiste en: Q, W y P; y/o
(ez) A243 seleccionada del grupo que consiste en: G, H, R y P; y/o
(fa) A248 seleccionada del grupo que consiste en: G, C y S; y/o
(fb) V251 seleccionada del grupo que consiste en: L, Q y R; y/o
(fc) Q255 seleccionada del grupo que consiste en: E, G, L y S; y/o
(fd) Y275 seleccionada del grupo que consiste en: E, G, L y S; y/o
(fe) N290 seleccionada del grupo que consiste en: E, I, Q y V; y/o
(ff) F291 seleccionada del grupo que consiste en: Y, L y M; y/o
(fg) D292 seleccionada del grupo que consiste en: F, C y S; y/o
(fh) G296 seleccionada del grupo que consiste en: L, P, Q y V; y/o
(fi) D298 seleccionada del grupo que consiste en: A, E, I y N; y/o
(fj) T301 seleccionada del grupo que consiste en: (fk) F302 seleccionada del grupo que consiste en: (fl) A311 seleccionada del grupo que consiste en: (fm) A315 seleccionada del grupo que consiste en: (fn) S319 seleccionada del grupo que consiste en: (fo) G329 seleccionada del grupo que consiste en: (fp) A331 seleccionada del grupo que consiste en: (fq) Q332 seleccionada del grupo que consiste en: (fr) V345 seleccionada del grupo que consiste en: (fs) A360 seleccionada del grupo que consiste en: (ft) D365 seleccionada del grupo que consiste en: (fu) W370 seleccionada del grupo que consiste en: (fv) T379 seleccionada del grupo que consiste en: (fw) F386 seleccionada del grupo que consiste en: (fx) L389 seleccionada del grupo que consiste en: (fy) S392 seleccionada del grupo que consiste en: (fz) Y398 seleccionada del grupo que consiste en: (ga) K413 seleccionada del grupo que consiste en: (gb) A416 seleccionada del grupo que consiste en: (gc) D417 seleccionada del grupo que consiste en: (gd) S429 seleccionada del grupo que consiste en: (ge) A434 seleccionada del grupo que consiste en: (gf) K443 seleccionada del grupo que consiste en: (gg) A460 seleccionada del grupo que consiste en: (gh) R463 seleccionada del grupo que consiste en: (gi) R464 seleccionada del grupo que consiste en: (gj) A465 seleccionada del grupo que consiste en: (gk) R473 seleccionada del grupo que consiste en: (gl) L481 seleccionada del grupo que consiste en: (gm) T493 seleccionada del grupo que consiste en: (gn) S499 seleccionada del grupo que consiste en: (go) S501 seleccionada del grupo que consiste en: (gp) V531 seleccionada del grupo que consiste en: (gq) R536 seleccionada del grupo que consiste en: (gr) V548 seleccionada del grupo que consiste en: (gs) N550 seleccionada del grupo que consiste en: (gt) A553 seleccionada del grupo que consiste en: (gu) L554 seleccionada del grupo que consiste en: (gv) G555 seleccionada del grupo que consiste en: (gw) D558 seleccionada del grupo que consiste en:
(gx) T559 seleccionada del grupo que consiste en: (gy) S560 seleccionada del grupo que consiste en: (gz) S572 seleccionada del grupo que consiste en: (ha) D574 seleccionada del grupo que consiste en: (hb) S578 seleccionada del grupo que consiste en: (hc) K584 seleccionada del grupo que consiste en: (hd) S588 seleccionada del grupo que consiste en: (he) I595 seleccionada del grupo que consiste en: (hf) K596 seleccionada del grupo que consiste en: (hg) K602 seleccionada del grupo que consiste en: (hi) W605 seleccionada del grupo que consiste en: (hj) E606 seleccionada del grupo que consiste en: (hk) R611 seleccionada del grupo que consiste en: (hi) S612 seleccionada del grupo que consiste en: (hm) S619 seleccionada del grupo que consiste en: (hn) V629 seleccionada del grupo que consiste en:
(ho) D34 de M; y/o
(hp) P42 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q; y/o
(hq) I43 de V; y/o
(hr) K47 de R; y/o
(hs) A50 seleccionada del grupo que consiste en: D y N; y/o
(ht) N55 de D; y/o
(hu) A58 de C; y/o
(hv) A62 de H; y/o
(hw) A64 de P; y/o
(hx) I68 de V; y/o
(hy) S72 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q; y/o
(hz) R73 de M; y/o
(ia) D75 seleccionada del grupo que consiste en: H y R; y/o
(ib) P77 de D; y/o
(ic) T83 de V; y/o
(id) L90 seleccionada del grupo que consiste en: I y P; y/o
(ie) S96 seleccionada del grupo que consiste en: A y Y; y/o
(if) G98 seleccionada del grupo que consiste en: Y y F; y/o
(ig) Y101 de F; y/o
(ih) T103 seleccionada del grupo que consiste en: Q y V; y/o
(ii) I109 seleccionada del grupo que consiste en: T y A; y/o
(ij) Q110 seleccionada del grupo que consiste en: E y C; y/o
(ik) V113 seleccionada del grupo que consiste en: E y L; y/o
(il) S115 de A; y/o
(im) V122 de L; y/o
(in) S123 seleccionada del grupo que consiste en: A y P; y/o (io) S126 de A; y/o
(ip) T128 de V; y/o
(iq) F129 de L; y/o
(ir) A146 de P; y/o
(is) T148 seleccionada del grupo que consiste en: L y M; y/o (it) E150 seleccionada del grupo que consiste en: P y R; y/o (iu) A165 de S; y/o
(iv) L166 seleccionada del grupo que consiste en: M y C; y/o (iw) Y169 seleccionada del grupo que consiste en: E y F; y/o (ix) A170 seleccionada del grupo que consiste en: C y I; y/o (iy) A182 de V; y/o
(iz) V185 seleccionada del grupo que consiste en: N y Q; y/o (ja) P188 de K; y/o
(jb) L194 de I; y/o
(jc) T197 seleccionada del grupo que consiste en: A y G; y/o (jd) F206 de Y; y/o
(je) F218 de W; y/o
(jf) S222 seleccionada del grupo que consiste en: M y Q; y/o (jg) H224 de A; y/o
(jh) A226 de S; y/o
(ji) Y232 de F; y/o
(jj) L237 de I; y/o
(jk) P249 de D; y/o
(jl) Q256 de F; y/o
(jm) A257 seleccionada del grupo que consiste en: G y F; y/o (jn) F258 de N; y/o
(jo) W259 de Y; y/o
(jp) Y265 de W; y/o
(jq) V267 seleccionada del grupo que consiste en: K y R; y/o (jr) S268 de C; y/o
(js) G272 de C; y/o
(jt) G273 de H; y/o
(ju) S277 de T; y/o
(jv) D280 de V; y/o
(jw) A281 de L; y/o
(jx) I284 seleccionada del grupo que consiste en: L y V; y/o (jx) A286 seleccionada del grupo que consiste en: L y T; y/o (jy) S287 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q; y/o
(jz) Q303 de E; y/o
(ka) S306 de C; y/o
(kb) E307 seleccionada del grupo que consiste en: D y P; y/o (kc) H313 de Y; y/o
(kd) Y316 de W; y/o
(ke) D318 de M; y/o
(kf) N322 seleccionada del grupo que consiste en: H y C; y/o (kg) V336 seleccionada del grupo que consiste en: C y I; y/o (kh) A337 de S; y/o
(ki) N348 de G; y/o
(kj) A355 seleccionada del grupo que consiste en: S y C; y/o (kk) N356 de S; y/o
(kl) A359 seleccionada del grupo que consiste en: G y S; y/o (km) L363 seleccionada del grupo que consiste en: A y V; y/o (kn) S375 seleccionada del grupo que consiste en: A y L; y/o (ko) T377 seleccionada del grupo que consiste en: S y A; y/o (kp) V378 seleccionada del grupo que consiste en: L y T; y/o (kq) L383 seleccionada del grupo que consiste en: C y N; y/o (kr) F385 de L; y/o
(ks) D388 seleccionada del grupo que consiste en: A y C; y/o (kt) T404 de Q; y/o
(ku) E421 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q; y/o (kv) V422 de F; y/o
(kw) A424 seleccionada del grupo que consiste en: C y Q; y/o (kx) K425 seleccionada del grupo que consiste en: M y R; y/o (ky) Y426 de F; y/o
(kz) A432 seleccionada del grupo que consiste en: D y S; y/o (la) N440 de D; y/o
(lb) S446 de G; y/o
(lc) T451 de S; y/o
(ld) F457 de A; y/o
(le) R487 de S; y/o
(lf) I488 de V; y/o
(lg) V495 de I; y/o
(lh) A496 de P; y/o
(li) A497 seleccionada del grupo que consiste en: Q y S; y/o (lj) F502 de I; y/o
(lk) S504 de T; y/o
(ll) A513 seleccionada del grupo que consiste en: D y G; y/o (lm) P516 seleccionada del grupo que consiste en: E y A; y/o
(ln) P520 de V; y/o
(lo) T521 seleccionada del grupo que consiste en: W y S; y/o
(lp) S527 de F; y/o
(lq) V529 de W; y/o
(lr) T532 seleccionada del grupo que consiste en: W y Y; y/o
(ls) N534 seleccionada del grupo que consiste en: D y E; y/o
(lt) E535 de Q; y/o
(lu) T539 de S; y/o
(lv) E543 seleccionada del grupo que consiste en: C y I; y/o
(lw) 1545 de V; y/o
(lx) V547 seleccionada del grupo que consiste en: A y C; y/o
(ly) G549 de A; y/o
(lz) K571 seleccionada del grupo que consiste en: R y T; y/o
(ma) L576 de K; y/o
(mb) I579 de M; y/o
(mc) I583 de M; y/o
(md) T586 seleccionada del grupo que consiste en: L y R; y/o
(me) Y592 de H; y/o
(mf) 44Y594 seleccionada del grupo que consiste en: M y H; y/o
(mg) G622 seleccionada del grupo que consiste en: P y W; y/o
(mh) Q627 seleccionada del grupo que consiste en: E y A; y/o
(mi) T628 de L; y/o
(mj) N630 de C; y/o
(mk) D631 seleccionada del grupo que consiste en: Q y S,
donde la posición de cada sustitución de aminoácido se corresponde con la SEQ ID NO:3
5. Variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la variante de GA tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4.
6. Polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una variante de un polipéptido de GA original según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 6, de manera opcional donde el vector es un vector de expresión.
8. Célula hospedadora que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 6, o el vector o vector de expresión de la reivindicación 7; de manera opcional donde la célula hospedadora es una célula fúngica o una célula bacteriana.
9. Célula hospedadora según la reivindicación 8, donde la célula fúngica es:
(a) una célula fúngica filamentosa seleccionada del grupo que consiste en:
Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum, Penicillium, Humicola, Humicola insolens, Humicola grisea, Chrysosporium, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Gliocladium, Aspergillus, Fusarium, Neurospora, Hypocrea, Emericella, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus,
y
Aspergillus nidulans;
o (b) una célula de levadura, seleccionada de manera opcional del grupo que consiste en:
Saccharomyces cervisiae, Saccharomycopsis fibuligera, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Kluveromyces lactis, Candida utilis, Candida albicans, Pichia stipitis, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii,
y
Debaryomyces polymorphus.
10. Célula hospedadora según la reivindicación 8, donde la célula bacteriana es Zymomonas mobilis.
11. Célula hospedadora según la reivindicación 8, donde la célula hospedadora expresa la variante de un polipéptido de GA original codificada por el polinucleótido aislado, vector o vector de expresión.
12. Método para producir una variante de polipéptido de GA comprendiendo cultivar una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en un medio de cultivo adecuado en condiciones adecuadas para producir la variante, comprendiendo además de manera opcional aislar la variante producida.
13. Composición que comprende una variante de GA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde de manera opcional la composición comprende además un sustrato de almidón.
14. Método para hidrolizar un sustrato de almidón, comprendiendo poner en contacto el sustrato de almidón con una variante de GA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una célula hospedadora según la reivindicación 11, donde de manera opcional el método se selecciona del grupo que consiste en: un proceso de conversión de almidón, un proceso de fermentación de alcohol, un proceso directo de almidón a glucosa, y un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas.
15. Sobrenadante de cultivo celular que comprende una variante de GA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde de manera opcional el sobrenadante de cultivo celular comprende además una o más enzimas adicionales.
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