JPH0630586B2 - グルコアミラ−ゼ遺伝子 - Google Patents

グルコアミラ−ゼ遺伝子

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JPH0630586B2
JPH0630586B2 JP59264964A JP26496484A JPH0630586B2 JP H0630586 B2 JPH0630586 B2 JP H0630586B2 JP 59264964 A JP59264964 A JP 59264964A JP 26496484 A JP26496484 A JP 26496484A JP H0630586 B2 JPH0630586 B2 JP H0630586B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リゾプス属由来のグルコアミラーゼ遺伝子及
びその遺伝子が組込まれた新規な組換えベクターならび
にそのベクターにより形質転換された微生物に関する。
（従来技術） グルコアミラーゼ遺伝子のクローニングについては、ア
スペルギルス。ニガー由来のもの ［The EMBO Journal Vol.3 no.5 pp1097-1102,(1984)］
およびアスペルギルス・アワモリ由来のもの［Yeast Ge
netics and MolecuLar Biology Abstracts p142(198
4)］がすでに報告されている。
グルコアミラーゼ（EIC 3.2.1.3）は、α−1,4-グルコ
シド鎖を非還元末端から加水分解し、またα−1,6-グル
コシド鎖も分解する酵素で、アスペルギルス属、リゾプ
ス属、ムコール属糸状菌などの分泌する酵素であり、グ
ルコースの製造、グリコーゲンやデンプンの定量に用い
られる。特に糖質原料からアルコールの製造における糖
化剤として用いられている。近年、リゾプス属起源のグ
ルコアミラーゼは、他の菌由来のものに比べて生デンプ
ンにも強く使用することから注目されており、無蒸煮法
あるいは低温蒸煮法によるアルコール製造に最適なもの
である（特開昭５７−１０２１８９号および特開昭５１
−６１６８８合参照）。
しかしがらら、リゾプス属では、麹式培養によらないと
高活性を得ることができないから液体培養で生産される
アスペルギルス属由来の酵素に比べて、酵素の生産コス
トひいてはアルコール製造のコストが上昇するという問
題がある。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、安価なかつアルコール製造に適したグルコア
ミラーゼの生産を可能ならしめること、および穀類等の
糖質原料から無蒸煮法又は低温蒸煮法によるアルコール
製造のため、酵母での遺伝子発現が可能なグルコアミラ
ーゼ遺伝子、特にリゾプス属の糸状菌由来のグルコアミ
ラーゼ遺伝子を提供すること、さらに上記遺伝子の組込
まれたベクターならびにそのベクターにより形質転換さ
れた酵母等の微生物、特に液体培養可能な微生物を提供
することを目的とする。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、リゾプス属に属する糸状菌からグルコア
ミラーゼ遺伝子を初めて単離および構造決定し、次いで
この遺伝子から大腸菌や酵母中で発現可能なベクターを
作成し、大腸菌や酵母の形質転換体を得、これが実際に
グルコアミラーゼを生産すること、さらにこの形質転換
体が生でんぷん又は低温蒸煮でんぷんから、直接アルコ
ールを生産しうることを確認した。本発明はこれらに基
づきなされたものである。
本発明の遺伝子を得るための糸状菌は、リゾプス属に属
するものでグルコアミラーゼを生産するものであれば、
いずれの種でもよく、リゾプス・オリザエ（Rhizopus o
ryzae）、リゾプス・フオルモサエンシス（Rhizopus fo
rmosaensis）、リゾプス・ヤバニカス（Rhizopus javan
icus）、リゾプス・サイランデンシス（Rhizopus thail
andensis）などがあげられる。特にリゾプス・オリザエ
に属するSAM 0034〔微工研菌寄第７９６０号（FFRMP-79
60）；本菌株は昭和６０年（１９８５年１０月２３日に
国際寄託に移管され、受託番号：微工研条寄第９２９号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−９２９）が付与れている〕は、生澱
粉分解に適したグルコアミラーゼを生産することが本発
明者らによつて確認されている。
なおＳＡＭ0034の細菌学的性質は次のとおりである。
培養所見（バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地、２８℃、培
養） 培養１日目でコロニーは直径５−５、５mm）、コロニー
は白色、コロニーの裏面も白色、培養２日目でコロニー
はプレート（直径９cm）の全面にひろがる。コロニーは
成熟とともに灰色になる。
葡萄枝は無色又は黄かつ色、仮根はかつ色、胞子のう柄
は一般に仮根から生じるが、葡萄枝から直接生じること
もある。胞子のう柄は単生または群生、胞子のう枝が二
又に分岐することもある。長さ２２０−１２００μｍ、
胞子のうは球形ないし亜球形、暗かつ色、直径６０−１
５０μｍ、柱軸は球形ないし亜球形、胞子のう胞子は球
形、亜球形又は多角形、表面に筋がある。５−１５×３
−７μｍ。厚膜胞子は亜球形又は円筒形、６−１３×４
−９μｍ、接合胞子は観察できなかつた。３７℃で生育
可能。
以上、胞子のう胞子が柱軸を持つ暗かつ色の胞子のう中
に形成され、更に胞子のう柄がかつ色であり、また仮根
を持つことから、本発明の菌株（ＳＡＭ−0034）はRhiz
opus属に属する真菌であると考えられる。そこでInui,
T.,Y.Takeda 、&H.Iizuka,1965.Taxonomical Studies on
gnus Rhizopus.Journal of Ceneral and Applied Micr
obiology,Vol.11,Supplement,121 pp.Zycha,H.,R.Siepm
ann and G.Linnemann,1969.Mucorales.Eins Beschreibu
ng aller Gattungen und Arten dieser Pilzgruppe.335
pp.Verlag von J.Cramer.Lehre.Domsch,K.H.,W.Gams an
d T.-H,Anderson,1980.Compendium of Soil Fungi.Vol.
I.859pp.Academic Press.London.に準拠して既知のＲｈ
ｉｚｏｐｕｓ属の種類と菌学的性質を比較すると、本菌
株は、３７℃で生育可能であり、胞子のう胞子の表面に
筋があり、胞子のう柄が長さ２２０−１２００μｍ、胞
子のうが直径６０−１５０μｍ、胞子のう胞子が５−１
５×３−７μｍであることから、本菌株をRhizopus ory
zaeと同定した。
グルコアミラーゼ遺伝子 本発明のグルコアミラーゼ遺伝子は第１図の〔〕内に示
す塩基配列を有する。グルコアミラーゼ遺伝子の単離
は、リゾプス属のm-RNAより調製したc-DNAとして得る
か、またはリゾプス属の染色体DNAから例えばクリエー
ルらの方法（Cryer etal,Method in Cell Biology,Vol.
12,p39-44(1975)〕によつて分離し選択することができ
る。
後者の方法は、通常イントロンの配列を含有しており、
そのまま、大腸菌や酵母を宿主とする場合は発現できな
い。これらの宿主中で発現できる遺伝子を得るには、mR
NAからのcDNAの一部と染色体からの遺伝子のイントロン
を含まない配列部分のDNAをハイブリツドさせる方法に
よつても得ることができる。両者を組み換える際に、一
方又は両方のDNA部分に適当な制限酵素切断部位が存在
しない場合は、インビトロミユータジエネシスの手法を
用いることにより適当な制限酵素部位を作成しハイブリ
ツドさせることが可能である。
かくして得られる本発明のグルコアミラーゼ遺伝子は、
第１図の〔〕内のアミノ酸配列をコードするDNAのみな
らず、これと同等の酵素活性を有するアミノ酸に対応す
る塩基配列も包含する。
リゾプス属由来のグルコアミラーゼ構造遺伝子は、第１
図のＮ末端から２６−６０４番目のアミノ酸配列をコー
ドするDNAであり、または、同図に付した塩基配列番号
１９０−１９６２に相当する。アミノ酸配列のＮ末端か
ら１−２５番に相当する部分は、シグナルペプチドに対
する領域であり、宿主の細胞外への分泌に関与するもの
である。即ち、実際にこのシグナルペプチドをコードす
る領域を用いて、酵母により以下述べるようにグルコア
ミラーゼを生産させた場合、グルコアミラーゼの９０％
以上は培地中に分泌された。さらに分泌されたグルコア
ミラーゼを通常の方法で精製後、Ｎ末端のアミノ酸配列
を調べたところ、２６番目のアミノ酸から始まってお
り、酵母においてもシグナルペプチドとして機能してい
ることが示唆されている。
従つて、次式のアミノ酸配列： ＮＥＴ ＧＬＮ ＬＥＵ ＰＨＥ ＡＳＮ ＬＥＵ Ｐ
ＲＯ ＬＥＵ ＬＹＳ ＶＡＬ ＳＥＲ ＰＨＥ ＰＨ
Ｅ ＬＥＵ ＶＡＬ ＬＥＵ ＳＥＲ ＴＹＲ ＰＨＥ
ＳＥＲ ＬＥＵ ＬＥＵ ＶＡＬ ＳＥＲ ＡＬＡ をコードするシグナル配列および各種蛋白質性物質をコ
ードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ発現ベクターにより、
適当な宿主を形質転換して、インターフエロン、リンフ
オカイン、インターロイキン２のような蛋白質性物質を
細胞外に分泌させることが可能である。
上述のグルコアミラーゼ遺伝子を単離する好適な方法の
例を以下述べる。グルコアミラーゼの生産菌であるリゾ
プス属に属する糸状菌から全DNAを単離する。
単離の方法は、クリエールの方法（先述）を改変した方
法による。まず、リゾプスを胞子形成させ、その胞子を
集める。これを破砕し、その後クリエールの方法に従つ
て処理し、最後にゲル過を行なう。ついでこのDNAを
制限酵素Hind IIIを用いて消化し、公知のベクターpBR3
22のHind IIIサイトにクローニングし、リゾプスの遺伝
子ライブラリーを大腸菌に作成する。ライブラリーとし
て取得するにはアンピシリン耐性の形質転換体を得れば
良い。
次いで実施例で述べる様なグルコアミラーゼDNA検出用
のプローブ（DNAオリゴマー）を作成し、コロニーハイ
ブリダゼーションを行ない、このプローブとハイブリダ
イスするコロニーを増殖させ、プラスミドDNAを抽出す
る。
本発明の遺伝子は、適当なプラスミドベクターに組込ん
で、酵母、枯草菌などの微生物中で発現させることによ
り、リゾプス属グルコアミラーゼやアルコールの製造に
使用される。本発明はこのようなプラスミドベクター及
びこのベクターを含む酵母、枯草菌などの微生物にも関
する。
なお、微生物内でグルコアミラーゼを発現せしむるため
に、遺伝子組み変えにより、プロモーター領域および／
またはテール領域（３′末非翻訳部分）として形質転換
微生物に適したものを使用することが好ましい（特開昭
５８−１４６２８１号参照）。例えば酵母内で発現させ
るために、特開昭５９−７４９８６号および特開昭５９
−７４９８８号に記載された、グリセルアルデヒド−３
−フオスフエイトデハイドロゲナーゼ遺伝子（GAP-DH）
のプロモーター領域（PGAP）テール領域（TGAP）、抑制
性酸性フオスフアターゼ遺伝子（PHO5）のプロモーター
領域（Ppho5）および３−フオスフオグリセロキナーゼ
（PGK）のプロモーター領域（PPGK）を後記実施例に示
す如く利用できるが、これらを本発明の遺伝子とともに
組込まれたプラスミドベクターおよび該ベクターで形質
転換された微生物は、本発明の好ましい態様である。
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
(a)i)DNAの調製とクローニング グルコアミラーゼ生産菌リゾプス・オリザエから全DNA
を単離した。DNAの単離は、酵母で用いられているクリ
エールらの方法（Cryer etal,Method in Cell Biology,
vol 12,39-44,(1975)）を改変して行なった。薄く切つ
たじやが芋をオートクレーブで滅菌後、その上にリゾプ
ス・オリザエの菌体を増殖させ胞子を形成させた。それ
らの胞子を集め、０．１５Ｍ NaCl-0.05MEDTA溶液に懸
濁し、ガラス球を用いた細胞破砕装置ダイノミルを用い
て１５秒間処理により菌体を破砕した。その後の操作
は、クリエールらの方法に従つたが、最後にバイオラド
社のバイオゲルA5mゲルを用いてゲル過を行ない全DNA
を単離した。このDNAを制限酵素HindIIIを用いて消化
し、pBR322のHind IIIサイトにクローニングし、リゾプ
スの遺伝子ライブラリーを大腸菌WA802株に作製した。
大腸菌の形質転換は常法を用いた。ライブラリーとして
アンピリシン耐性形質転換体を取得した。
ii)形質転換体の選択及びグルコアミラーゼ遺伝子の特
性決定 形質転換体の選択は、ニトロセルロース紙を用いた通
常コロニーハイブリダイゼーシヨンと呼ばれる方法で行
なつた。はじめにグルコアミラーゼDNA検出用のプロー
ブを作製する為、精製したリゾプスのグルコアミラーゼ
を各種プロテアーゼで分解し、生成したペプチドを分離
精製した。それらのペプチドについてアミノ酸分析と一
次構造の決定を常法に従つて行なつた。その結果、部分
構造としてSsp-Leu-Thr-Trp-Ser-His-Ala-Serからなる
アミノ酸配列を得た。同時にこのグルコアミラーゼのＮ
末端のアミノ酸配列は、Ala-Ser-Ile-Proであり、さら
にＣ末端はAla-Alaである事も見い出した。次いで目的
のプローブ作成のため、前述のアミノ酸配列の一部に対
応するThr-Trp-Ser-His-Alaの部分について、そのアミ
ノ酸に対応するコドンから、5′-ACNTGGTCNCAQGC-3′の
１４個の塩基からなる３２種の合成DNAオリゴマーをト
リエステル固相法により合成した。ここでＮは任意の塩
基、ＱはピリミジンのＴあるいはＣを示す。これらのDN
Aオリゴマーを［r-32p〕ATPとT4−ポリヌクレオチジル
キナーゼを用いて標識し、グルコアミラーゼ遺伝子の検
出用プローブとして用いた。コロニーハイブリダイゼー
シヨンの方法によつてこれらのプローブとハイブリダイ
ズする大腸菌の形質転換体コロニーを増殖させ、プラス
ミドDNAを抽出した。抽出物を各種制限酵素で処理した
のちアガロース電気泳動を行ない、DNAフラグメントの
解析を行なつた。その結果、前記プローブとハイブリダ
イズするコロニーにおいて、プラスミドに挿入されたDN
A断片は4.3Kbからなり、BamHI,KpnI,MluIおよびSacIで
一ケ所切断され、さらにDraIで２カ所、BglIIで３カ所
切断されるが、AccI、BalI、ClaI、EcoRI、HpaI、PstI、PvuI
I、ScaIおよびXhoIでは切断されないことが判明した。こ
の断片を持つプラスミドをpRGA39と命名した。
(b)i)RNAの調製とcDNAのクローニング リゾプス・オリザエの気中菌糸から全RNAを単離した。
これにはグアニジウムチオシアネートの使用を含む公知
の手順を用いた。オリゴーdTセルロースクロマトグラフ
イを用い全RNAからポリアデニル化RNAをｍ−RNA分画と
して分取した。このｍ−RNAを用い岡山−バーグ法（Oka
yama,H.& Berg,P.,Mol.Cell.Biol.2'nn161(1982)）によ
りcDNAの遺伝子ライブラリーを大腸菌WA802中に作製し
た。
ii)形質転換体の選択及びグルコアミラーゼcDNAの特性
決定 目的酵素のc-DNAを有する形質転換体の選択は、前述の
コロニーハイブリダイゼーシヨンの方法で行なつた。グ
ルコアミラーゼcDNA検出用のプローブとして前記(a)ii)
で得たグルコアミラーゼ遺伝子の2.0kb DraI断片を用い
た。この断片を［α−32P〕dCTP、DNAポリメラーゼＩ及
びDNAアーゼＩを使用するニツクトランスレーシヨン法
によつて標識し、グルコアミラーゼcDNA検出用のプロー
ブとして用いた。このプローブとハイブリダイズする形
質転換体コロニーを増殖させ、プラスミドDNAを抽出し
た。各種制限酵素で処理したのち、アガロース電気泳動
を行ないDNAフラグメントの解析を行なつた。プローブ
とハイブリダイズするコロニーはプラスミドに挿入され
たDNA断片は、1.7kbの大きさであつた。このプラスミド
をpCGA２３９と命名した。
(c)DNA配列解析 プラスミドpRGA３９及びpCGA２３９から各種制限酵素を
用いて分解し、アガロースゲルでDNA断片を単離し、組
換えフアージＭ１３を用いたダイオキシ法により塩基配
列を決定した。pRGA３９の解析の結果この遺伝子には、
数十bpからなるイントロンが４カ所存在する事が確認さ
れた（第２図にイントロンの存在部位を示す）。また、
pCGA２３９は完全長のグルコアミラーゼに対応するcDNA
ではなく、アミノ酸にして約５０個欠けたものであつ
た。pRGA-39およびpCGA239の遺伝子地図の比較を第４図
に示した。
(d)発現用グルコアミラーゼDNAの構築 クローン化されたcDNAは、完全長ではない。そこでpCGA
239とpRGA39を組み換えることにより、グルコアミラー
ゼのプロモーター（リゾプス由来）を持つ完全長のcDNA
を作製した。その際、組み換えに利用できる適当な制限
酵素サイトがこれらのプラスミド中に存在しないため新
しく、インビトロ−ミユータジエネシスの方法でSalIの
サイトをpCGA239及びpRGA39の同じところに新しく作
り、組み換えを行つた（第５図参照）。インビトロ−ミ
ユータジエネシスの方法は、モリナガらの方法（Morina
ga,Y.,etal,BIO/TECHNOLOGY2,636-639(1984)）に従つ
た。
こうして得られたプラスミドpCGA439は、SalIのサイト
を作製したためにＮ末から５３番目のアミノ酸コドンが
本来のリジンからアスパラギン酸に変わつている。そこ
で再びインビトロ−ミユータジエネシスの方法を用い
て、本来の塩基配列に戻つた完全長のグルコアミラーゼ
DNAを含むプラスミドpCGA449を得た。プラスミドpCGA44
9は、工業技術院微生物工業技術研究所にSAM0039の表示
名でブタペスト条約の下に寄託され、受託番号FERM BP-
673が付与されている。
pCGA449中の完全長グルコアミラーゼDNAは、第２図にお
ける矢印左部分と第３図における矢印右部分が結合した
ものである。
(e)酵母における発現ベクターの構築 前記(d)で得たpCGA449を酵母で効率良く発現させるため
特開昭６１−５６０７７号に開示された酸性ホスフアタ
ーゼのプロモーター（Ppho5）を有するpYGIELm 212か
ら、ECORI-SalIで切り出される約8.3kbの断片を用い
た。このEcoRI-SalIサイトにpCGA449を組み込む為にpCG
A449のPvuIIサイトをXhoIリンカーを用いてXhoIサイト
に変更し、プラスミドpCGA450を作製した（第６Ａ
図）。このプラスミドをXhoIおよびEcoRIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で、2.2kbの断片を分離し、T4-DN
Aリガーゼを用いて前述の8.3kb EcoRI-SalI断片にライ
ゲーシヨンし、この結果得られたPpho5をプロモーター
として含むプラスミドをpYGA2149と命名した。このプラ
スミドを大腸菌WA802株中で増殖させて分離した（第６
Ａ図参照）。pYGIFLm212の発現プロモーターPpho5とグ
リセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のプロモータ
ーPGAP:特開昭５９−７４９８６号参照）に変えたプラ
スミドpYGIFLm222を作製し（第６Ｂ図）上と全く同じ方
法でpYGA2249を作製し（図示せず）、プラスミドを分離
した。
さらにpCGA449の代りにpCGA469を用いて同様の操作によ
りpYGIFLm212からpYGA2169（第６Ａ図右下）／pYGIFLm2
22からpYGA2269（図示せず）を作製し、プラスミドを分
離した。その際、pYGIFLm222は、pYGIFLm212(Escherich
iacoli SBM274 FERM P-7727；本菌株は昭和６３年（１
９８８年）１２月２６日に国際寄託に移管され、受託番
号：微工研条寄第２２１６号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２１
６）が付与されている）と特開昭５９−７４９８６号に
開示されたプラスミドpYgap 87(SBM151 FERM BP-382)を
用いて作製した（第６Ｂ図参照）。すなわち、pYGIFLm2
12中唯一のBamHIサイトをBamHIで開裂後、DNAポリメラ
ーゼＩによりフイルインし、HindIIIリンカーを用いてH
ind IIIサイトに変更したプラスミドpYGIFLm212Hを作製
した。またpYgap87のグリセロアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素の構造遺伝子開始コドンATGの直前にインビ
トロミユータジエネシスによりEcoRIのサイトを作り、
プラスミドpYgap87Eを作製した。pYGIFLm212HをEcoRIで
切断しさらにHind IIIで部分的に切断後アガロースゲル
電気泳動で8.0kbの断片を分離した。またpYgap87EをEco
RIとHindIIIで切断後アガロースゲル電気泳動で1.1kbの
断片を分離し、pYGIFLm212Hの8.0kbの断片とライゲーシ
ヨン後大腸菌を形質転換してプラスミド、pYGIFLm222を
得た。
(f)酵母におけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現 前述のプラスミドpYGA2149を用い酵母，Saccharomyces
cerevisiae XS-30-2A〔MATa,leu2,his3,trpl,ura3〕お
よびXS-30-2B〔MATα,leu2,his3,trp1,ura3〕を計算転
換し、トリプトフアンの栄養要求性で形質転換体を選択
した。形質転換は、LiCl2を用いてイトウらの方法（It
o,H.,etal,J.Bacteriol.,153,163-168(1983)）で行なつ
た。得られた形質転換株を５ｍのYEPD培地（１％酵母
エキス，２％ポリペプトン、２％グルコース）に一白金
耳植菌後48時間後に、サンプリングを行なつた。エツペ
ンドルフチユーブにて10000rpm５分間の遠心分離により
上清とペレツトに分け、その上清を用いてグルコアミラ
ーゼの活性を測定した。グルコアミラーゼ活性の測定は
可溶でんぷん溶液（1.0％可溶でんぷん−20mM酢酸緩衝
液pH5.0)800μに前述の上清200μを加え37℃で反応
後の遊離グルコースの量で求めた。グルコースの量はグ
ルコスタツト（藤沢薬品）を用いて定量した。活性は、
２時間反応で測定したところXS-30-2A中の、pYGA2149で
は、0.004ｕ／ｍ、XS-30-2B中のpYGA2149では、0.008
ｕ／ｍとなり酵母の性により２倍の差があつた（第７
図参照）。１ユニツトは、１分間に１μｍｏｌｅのグル
コースを遊離する活性とした。
pYGA2149を含まない酵母では、上清に活性は認められな
かつた。
さらにプロモータとしてPGAPを利用している場合その活
性は0.40μ／ｍとなり、50〜100倍のグルコアミラー
ゼ活性が出現した。またプロモーターとして酸性ホスフ
アターゼ遺伝子のプロモーターPpho5を利用した場合グ
ルコアミラーゼ活性は、培地中のリン酸濃度に影響され
出現した。たとえば、通常のYPD培地で30℃48時間培養
後におけるこの菌のグルコアミラーゼ活性は０である
が、硫酸マグネシウムとアンモニア水を用いてYPD中の
リン酸を除いた培地〔Rubin,G.M.Eur.J.Biochem.41,197
-202,(1974)〕ではPGAPの場合と同程度のグルコアミラ
ーゼ活性が出現する。培養後の上清について、SDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行なつた場合、グルコア
ミラーゼ蛋白は、全菌体外蛋白質の50％以上である。
さらにそれらの活性がリゾプス由来のグルコアミラーゼ
によるものである事を免疫学的手法により確認した。精
製したグルコアミラーゼを用い、ウサギによる抗体を作
製した。この抗体を用い通常ウエスタンブロツテイング
と呼ばれる方法で検出した。これには、前述の活性を測
定した48時間培養後の上清1.5ｍを濃縮して用いた。
その３分の１量を10％ポリアクリルアミド電気泳動し、
泳動後、ゲル中のたんぱく質を電気泳動的にニトロセル
ロース紙上に移動させ、固定した。こうして得られた
ニトロセルロース紙を酵素逸脱実験法の手法を用いパ
ーオキシダーゼの反応で検出した。その結果リゾプスの
グルコアミラーゼと分子量的にほぼ同じ位置にグルコア
ミラーゼの抗体と反応するバンドが存在し、たしかに、
リゾプス由来のグルコアミラーゼが酵母により発現して
いる事を確認した。その結果を第８図に示した。
(g)でんぷんを炭素源とした場合の増殖 酵母XS-30-2B株についてpYGA2149の有無について炭素源
を変えた場合の増殖について検討した。XS-30-2BをYEPD
培地で、XS-30-2B〔pYGA2149〕を１％カザミノ酸及びウ
ラシルを含む最少培地（0.67%Difco Yeast nitrogene b
ase,2%グルコース）で24時間30℃で振とう培養し前培と
した。500ｍの坂口フラスコにTPP培地または、YPS培
地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン，２％可溶性澱
粉）を100ｍ作製し、オートクレーブ滅菌後30℃にて
前培溶液を１ｍ加え、その後の増殖を660nmの吸光度
によつて比較した。その結果、プラスミドpYGA2149を保
持しないXS-30-2B株は、YPS培地では、ほとんど増殖し
ないが、pYGA2149を保持する株は、YPS培地でもYPD培地
と同程度の増殖速度で増殖しうる。この事実は、明らか
にXS-30-2B〔pYGA2149〕がグルコアミラーゼ生産し、澱
粉を分解して利用している結果である（第９図参照）。
(h)形質転換酵母によるアルコールの生産 i)可溶性澱粉を用いたアルコール発酵 培地はYPS（１％酵母エキス，２％ポリペプトン，１
％，２％または５％可溶性澱粉）200ｍを500ｍマイ
ヤー中で121℃，15分間オートクレーブ滅菌したものを
用いた。
酵母は次のものを使用した： XS-30-2B（グルコアミラーゼ遺伝子を持たぬコントロ
ール） XS-30-2B〔pYGA2149で形質転換〕 この酵母はリゾプスのプロモーターを持つ。
XS-30-2B〔pYGA2169で形質転換〕 この酵母はPpho5プロモーターを持つ。
XS-30-2B〔pYGA2269で形質転換〕 この酵母はPGAPプロモーターを持つ。
酵母は前々培を得るため、１％カザミノ酸、ウラシル、
アデニンを含む最少培地５ｍに１白金耳植菌し、28℃
で20時間振とう培養した。次いでこの前々培をYPD培地
に２％植菌し、28℃で24時間静置培養して前培とした。
但し、の酵母については、Ppho5を誘導するために低
リン酸YPD培地で培養した。この前培をYPS培地に５％植
菌し、28℃で静置培養してエタノールの生産を調べた。
なおの酵母については低リン酸YPS培地で行つた。各
酵母について１、２および５％の澱粉でのエタノールの
生産並びに酵母の増殖を測定した。その結果を次表１お
よび２に示す。
ii)低温蒸煮法(LTC)によるアルコール発酵 粉砕とうもろこし140gを仕込水402ｍ中に加え、さら
にα−アミラーゼ製剤（ターマミル）0.5gを増粘防止剤
として、メタ重亜硫酸カリ160ppmを殺菌剤として添加
し、80℃〜82℃に５分間保持した後急冷した。
酵母の前々培および前培はi)と同じ菌を用いて同様に行
ない、この前培を酒母として上記低温蒸煮でんぷんに加
え、28℃で培養した。培養は、他の成分を添加しないも
の、カザミノ酸、ウラシル、アデニンを補つたもの、お
よび更に0.4％グルコールを加えたものの３水準につい
て行い、CO2減少量による発酵の進行状態およびアルコ
ール生成量を調べた。コントロールは、リゾプスグルコ
アミラーゼを通常量で用いた非形質転換酵母の場合も調
べた。結果を表３、表４および第10図に示す。これらの
結果から判るとおり、本発明の酵母によれば、リゾプス
グルコアミラーゼ製剤を添加することなく、無蒸煮又は
低温蒸煮でんぷんから直接アルコールを製造することが
可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のグルコアミラーゼのイントロンを含ま
ない構造遺伝子の塩基配列をジグナルピプチド領域とと
もに示す図であり、 第２図はリゾプス・オリザエの染色体DNAよりクローニ
ングしたグルコアミラーゼ遺伝子のDNA塩基配列を示す
図であり、 第３図はリゾプス・オリザエのm-RNAより得たcDNAをク
ローニングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＣ末端側の塩
基配列を示す図であり、 第４図は、リゾプス・オリザエの染色体DNAよりクロー
ニングしたグルコアミラーゼ遺伝子と、リゾプス・オリ
ザエのm-RNAより調製したグルコアミラーゼ遺伝子との
比較図であり、 第５図、第６Ａ図および第６Ｂ図は、第４図の二つの遺
伝子を組合せて、プラスミドベクター中にて、イントロ
ンのない完全長のcDNAを構成し、さらに酵母中で効率良
く発現させるために、プロモーター及びテールを組込む
方法を示す一連の流れ図であつて、第５図はpCGA469に
到るまでの図、第６Ａ図はpYGA2149およびpYGA2169に到
るまでの図、そして第６Ｂ図はpYGIFLm222に到るまでの
図であり、 第７図は、形質転換酵母によるグルコアミラーゼの生産
を示すグラフであり、 第８図は、形質転換酵母の生産したグルコアミラーゼの
電気泳動図であり、 第９図は、でんぷんを炭素源とした場合の形質転換酵母
の増殖曲線グラフであり、 第１０図は、形質転換酵母によるアルコールの生産を示
すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:845） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 柴野 裕次 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社応用微生物研究所内 (72)発明者 吉栖 肇 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社応用微生物研究所内

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列（Ｉ）をコードするＤ
    ＮＡを含むグルコアミラーゼ構造遺伝子：
  2. 【請求項２】下記の塩基配列（II）で表される特許請求
    の範囲第１項記載のグルコアミラーゼ構造遺伝子：
  3. 【請求項３】リゾプス・オリザエ由来のシグナルペプチ
    ドを上流に持つ下記のアミノ酸配列（III）をコードす
    る特許請求の範囲第１項記載のグルコアミラーゼ構造遺
    伝子：
  4. 【請求項４】下記の塩基配列（IV）で表される特許請求
    の範囲第３項記載のグルコアミラーゼ構造遺伝子：
  5. 【請求項５】下記のアミノ酸配列（Ｉ）をコードするＤ
    ＮＡを含むグルコアミラーゼ構造遺伝子を有する組換え
    ベクター：
  6. 【請求項６】下記の塩基配列（II）で表されるグルコア
    ミラーゼ構造遺伝子を有する特許請求の範囲第５項記載
    の組換えベクター：
  7. 【請求項７】リゾプス・オリザエ由来のシグナルペプチ
    ドを上流に持つ下記のアミノ酸配列（III）をコードす
    るグルコアミラーゼ構造遺伝子を有する特許請求の範囲
    第５項または第６項記載の組換えベクター：
  8. 【請求項８】下記の塩基配列（IV）で表されるグルコア
    ミラーゼ構造遺伝子を有する特許請求の範囲第７項記載
    の組換えベクター：
  9. 【請求項９】ｐＣＧＡ４４９、ｐＣＧＡ４６９、ｐＹＧ
    Ａ２１６９、ｐＹＧＡ２１４９、ｐＹＧＡ２２４９およ
    びｐＹＧＡ２２６９からなる群から選択される、特許請
    求の範囲第８項記載の組換えベクター。
  10. 【請求項１０】下記のアミノ酸配列（Ｉ）をコードする
    ＤＮＡを含むグルコアミラーゼ構造遺伝子を有する組換
    えベクターにより形質転換された微生物：
  11. 【請求項１１】下記の塩基配列（II）で表されるグルコ
    アミラーゼ構造遺伝子を有する組換えベクターにより形
    質転換された特許請求の範囲第１０項記載の微生物：
  12. 【請求項１２】リゾプス・オリザエ由来のシグナルペプ
    チドを上流に持つ下記のアミノ酸配列（III）をコード
    するグルコアミラーゼ構造遺伝子を有する組換えベクタ
    ーにより形質転換された特許請求の範囲第１０項または
    第１１項記載の微生物：
  13. 【請求項１３】下記の塩基配列（IV）で表されるグルコ
    アミラーゼ構造遺伝子を有する組換えベクターにより形
    質転換された、特許請求の範囲第１２項記載の微生物：
  14. 【請求項１４】ｐＣＧＡ４４９、ＰＣＧＡ４６９、ｐＹ
    ＧＡ２１６９、ｐＹＧＡが２１４９、ｐＹＧＡ２２４９
    およびｐＹＧＡ２２６９からなる群から選択される組換
    えベクターにより形質転換された、特許請求の範囲第１
    ３項記載の微生物。
  15. 【請求項１５】宿主微生物が、大腸菌、酵母または枯草
    菌である、特許請求の範囲第１０項ないし第１４項のい
    ずれか１項に記載の微生物。
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