ES2749615T3 - Isoforma del receptor II de TGF-beta - Google Patents

Abstract

Una isoforma del receptor II de TGF beta, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2 donde la SEQ ID Nº 2 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº 12.

Description

DESCRIPCIÓN

Isoforma del receptor II de TGF-beta

La presente invención se refiere a una isoforma del receptor II de TGF- p, polinucleótidos que la codifican, vectores, células transformadas, péptidos y de fusión, método y usos. Más específicamente se refiere a una isoforma del receptor II de TGF beta que comprende una secuencia de alrededor de 80 aminoácidos y carece del dominio transmembrana; en donde la isoforma es agonista de TGFp-1. La isoforma comprende a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 12. La isoforma puede tener la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 2 o secuencias que tienen al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID N° 2 donde la SEQ ID N° 2 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N° 12.

ANTECEDENTES

El Factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p) es abundante en la matriz ósea y se ha demostrado que regula la actividad de los osteoblastos y osteoclastos in vitro e in vivo. Las células mesenquimales estromales derivadas de tejido adiposo (ASC) son precursoras de los osteoblastos, adipoblastos y condroblastos. Por lo tanto, se enfocaron los estudios a la secreción de las citoquinas por parte de las ASC que tienen un efecto profundo en el remodelamiento óseo, tales como Tgf-p1, Osteoprotegerina (OPG) y Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF).

Las concentraciones de TGF-p1 son altas en hueso subcondral de seres humanos con osteoartritis. Las altas concentraciones de TGF-p1 indujeron la formación de agolpamientos de células mesenquimales estromales positivas en nestina (MSC), conduciendo a la formación de islotes osteoides de la médula acompañados por altos niveles de angiogénesis (Zhen G, et al. Nat Med. 19:704-12, 2013). Se ha hallado que la expresión transgénica de TGF-p1 activo en células osteoblásticas indujo osteoartritis, mientras que la inhibición de la actividad TGF-p, por medio de un receptor TpRIl dominante negativo, en hueso subcondral, atenuó la degeneración de cartílago articular conduciendo a menos desarrollo de osteoartritis. También se ha informado que los ratones que expresan un receptor dominante negativo de tipo II de TGF-p (TpRII-DN) en osteoblastos, muestran una respuesta a TGF-p disminuida en los osteoblastos y mayor volumen óseo, demostrando que el TGF-beta endógeno actúa directamente sobre los osteoblastos para regular el remodelamiento óseo, la estructura y las propiedades bioquímicas (Filvaroff, E. et al. Development, 126: 4267-4279, 1999). Además, el TGF-p también regula la osteoclastogénesis y la supervivencia de los osteoclastos, en parte a través de la inducción de la osteoprotegerina (OPG), una proteína que se sabe que inhibe la formación y la función de los osteoclastos (Thirunavukkarasu K, et al. J. Biol. Chem. 276: 36241-36250, 2001.).

Los ratones transgénicos que sobreexpresan el receptor dominante negativo de TGF-p de tipo II (dnTgfbr2) en tejido esquelético exhiben degeneración esquelética progresiva (Buckwalter JA, et al. Clin Orthop Relat Res 423: 7-16, 2004.). Los condrocitos articulares en la zona superficial del tejido cartilaginoso se hacen hipertrófico con mayor expresión de colágeno de tipo X. Se ha observado pérdida de proteoglicano y degradación progresiva de tejido cartilaginoso en ratones de 6 meses de edad que se parecen en gran medida a la osteoartritis (OA) humana (similar a OA) (Serra R, et al. J Cell Biol 139: 541-552, 1997.). La señalización por TGF-p tiene un rol crítico no solo en la regulación de la homeostasis de los condrocitos durante la destrucción del cartílago, sino también en la manipulación del comportamiento de las células ósea subcondrales durante la formación de osteofitos, otra característica de la OA (van der Kraan PM, et al. Osteoarthr Cartilage 15: 237-244, 2007.).

Además se exploró el rol de la señalización por TGF-p en la formación de osteofitos mediante estudios de bloqueo usando inhibidores específicos de TGF-p. Varios grupos demostraron que la ablación de la actividad endógena de TGF-p, por sobreexpresión intraarticular del dominio extracelular soluble de receptor de TGF-p de tipo II o Smad7, suprime la formación de osteofitos en modelos murinos experimentales de OA (Scharstuhl A, et al. J Immunol 169: 507-514, 2002). Estas observaciones demuestran claramente que TGF-p tiene un rol dominante en la inducción de los osteofitos, al menos en modelos murinos de OA.

In vivo, TGF-p1 también induce angiogénesis (Madri JA, et al. J Cell Biol. 106:1375-1384, 1988; Roberts AB, Proc Natl Acad Sci U S A. 83:4167-4171, 1986; Yang EY, et al. J Cell Biol. 111:731-741, 1990.). En la OA, los altos niveles de TGF-p1 también están acompañados por altos niveles de angiogénesis. El Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) es un potente mitógeno, morfógeno y motógeno para una variedad de células principalmente epiteliales. La expresión incrementada del sistema HGF/ receptor de HGF en cartílago osteoartrítico, sugiere un rol regulatorio en la homeostasis y la patogénesis del cartílago de articulación humana (Pfander D, et al. Osteoarthritis Cartilage. 7:548-59, 1999).

Estudios previos han demostrado que el TGF-p puede promover la angiogénesis y la invasión tumoral a través de la estimulación de la expresión de HGF (Chu SH, et al. J Neurooncol. 85:33-38, 2007; Lewis MP, et al. Br J Cancer. 90:822-832, 2004)). Por el contrario, también se ha demostrado que el TGF-p inhibe la transcripción de HGF, potencialmente a través de la unión al elemento inhibitorio de TGF-p localizado aproximadamente 400 pb corriente arriba del sitio de comienzo de la transcripción del HGF (Liu Y, et. al. J Biol Chem. 269:4152-4160, 1994; Plaschke-Schlütter A, et al. J Biol Chem. 270:830-836, 1995), y la abrogación de este efecto conduce al desarrollo de cáncer (Cheng N, et al. Cancer Res. 67:4869-4877, 2007).

Los antibióticos de quinolonas (QN) tales como la Ciprofloxacina (CPFX) se usaron ampliamente en la práctica clínica debido a su amplio espectro de actividad antibacteriana y su alto grado de biodisponibilidad. No se aprobaron para su uso en niños y adolescentes debido a sus efectos tóxicos sobre el cartílago de las articulaciones de los animales inmaduros (Cuzzolin L, et al. Expert Opin Drug Saf 1:319-24, 2002.). Las quinolonas, administradas sistémicamente, causan artropatía y tendinopatía cuando se dan durante la fase de crecimiento (Sendzik J, et al. Int J Antimicrob Agents 33:194-200, 2009.). Se informó que la Ciprofloxacina disminuye el espesor del cartílago articular del cóndilo femoral, inhibe la proliferación de condrocitos cultivados y la secreción de proteoglicanos solubles en una en forma dependiente de la concentración y del tiempo en ratas jóvenes (Li, P. et al. Arch. Pharmacol. Sin. 25: 1262-1266, 2004.).

La formación de agrupamientos de condrocitos es una característica de todos los modelos mecánicos y químicos de OA (Moriizumi T, et al. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol. 51:461-474, 1986; van der Kraan PM, et al. Am J Pathol. 135:1001-1014, 1989). Los animales con artropatía por quinolona mostraron cavidades en la zona media del cartílago articular que contiene condrocitos necróticos. Después de 14 días, muchas de las lagunas en las áreas de los defectos contenían agrupamiento de condrocitos. Con un tratamiento de 14 días y permitiendo un periodo de recuperación de 14 días, se depositó matriz territorial alrededor de los condrocitos individuales dentro de los agrupamientos, indicando que en las articulaciones inmaduras hay un cierto grado de reparación espontanea por parte de las células de los agrupamientos (Sharpnack DD, et al. Lab Anim Sci. 44:436-442, 1994.). Se ha demostrado que el TGF-p1 se activa en el hueso subcondral en respuesta a una carga mecánica alterada en un modelo de osteoartritis en ratón por corte transversal del ligamento cruzado anterior (ACLT) (Zhen G, et al. Nat Med. 19:704-12, 2013). Además, se halló que el CPFX aumenta la producción de TGF-p1 por parte de células HT-29 y se canceló el efecto antiproliferativo cuando se bloquea el TGF-p1 (Bourikas LA, et al. Br J Pharmacol. 157:362-70, 2009.).

Las células mesenquimales estromales derivadas de tejido adiposo (hASC) expresan citoquinas tales como IL-6, GM-CSF y ligando de Flt3 (Tholpady SS, et al. Clin Plast Surg 33: 55-62, 2006; Katz AJ, et al. Stem Cells. 23:412-23, 2005; Schafer A, et al. Stem Cells 25:818-827, 2007). Estas citoquinas se regulan por TGF-p1 ya sea negativamente (GM-CSF, SCF y Flt3-ligando) (Jacobsen SE, et al. J Immunol. 151:4534-4544, 1993; Jacobsen SE, et al. Blood. 87:5016-5026, 1996) o bien positivamente (IL-6, TPO) (Ramsfjell V, et al. J Immunol. 158:5169-5177, 1997.). Recientemente, se ha demostrado que la sobreexpresión de un mutante dominante negativo del receptor humano de TpRIl (TpRII-DN) en células de mamífero es muy eficaz para bloquear la acción de TGF-p1 (19). Este mutante, basado en la isoforma A del receptor, es capaz de unirse a TGF-p1 pero la señalización se altera debido a la ausencia del dominio serina/treonina quinasa. Se ha demostrado que el TpRIIA-DN altera la señalización mediada por TGF-p1 lo que permite el estudio del comportamiento de los diferentes tipos de células en ausencia del efecto paracrino o autocrino de la citoquina (Fan X, et al. The Journal of Immunology 168: 755-762, 2002.).

Se conocen varios documentos que divulgan diferentes receptores TGF-p1, quiméricos, proteínas de fusión, dominios, por ejemplo, el documento de patente EP0975771, WO 2008/157367, US 2006/0247198, US 6001969 y WO 94/09815.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

Se provee una isoforma aislada soluble del receptor de TGF beta II que comprende una secuencia de alrededor de 80 aminoácidos y carece del domino transmembrana; en donde la isoforma estaría actuando como agonista de TGFp-1. En una realización preferida la secuencia de aminoácidos de la isoforma tiene un al menos 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 2. La isoforma comprende en su secuencia el péptido divulgado en la SEQ ID N° 12.

Se provee un polinucleótido que codifica a una isoforma soluble del receptor de TGF beta II que tiene en una realización preferida al menos 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 1. En otra realización preferida el polinucleótido comprende además una secuencia Kozak.

Se provee un péptido de fusión que comprende una isoforma del receptor de TGF beta II fusionada a un ligando. En una realización preferida la isoforma es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2 donde la SEQ ID N° 2 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N° 12 y el ligando es el Fc de una imnunoglobulina.

Se provee un anticuerpo que se une a la isoforma soluble del receptor de TGF beta II. En una realización preferida el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N° 12.

Se provee un método de tratamiento de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-p, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite la isoforma soluble del receptor de TGF beta.

Se provee un método de tratamiento de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-p, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite un anticuerpo que se une a la isoforma soluble del receptor de TGF beta II. En una realización preferida el anticuerpo reconoce y se une a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N° 12. Las enfermedades asociadas pueden seleccionarse de cualquier desorden relacionado a la desregulación de las señales de TGF-p, tales como cancer, fibrosis y enfermedades cardiovasculares; defectos metabólicos y musculoesqueleticos, mutaciones en TpRII (gen TGFBR2), por ejemplo, síndrome de Loeys-Dietz syndrome (LDS), síndrome de Marfan de tipo 2 (MFS2), o diferentes aneurismas (FtAa d ).

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra un diagrama esquemático del receptor TpRii indicando los dominios extracelulares (ECD), transmembrana (TMD) e intracelular (ICD). Los recuadros FP y RP indican los cebadores directo y reverso usados para amplificar el ADNc de TpRii por RT-PCR.

La figura 2 muestra en un gel los resultados de la digestión de los plásmidos recombinantes conteniendo las dos isoformas ya descritas del TpRii humano (A y B) y la nueva descrita por los inventores, TpRII-SE, obtenida por RT-PCR a partir de linfocitos de humano.

La figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias parciales del ADNc de las dos isoformas conocidas de TpRii (A y B), y la divulgada en la presente solicitud (TpRN-SE); las secuencias de ADNc incluyen el codón de inicio (ATG) y el último nucleótido que codifica para el dominio transmembrana (TMD); la barra gris oscura indica la eliminación adicional encontrada en el exónes II y III de TpRN-SE.

La figura 4 muestra los alineamientos de la secuencia predicha parcial de la proteína que pertenece a las isoformas A y B del TpRii de humano, y el TpRN-SE; los recuadros de color gris claro unidos muestran los residuos involucrados en puentes disulfuro críticos para el enlace receptor-ligando (C54-C71, C61-C67); los recuadros de color gris oscuro muestran los residuos fundamentales para la interacción con TGF-p (D55, i76, E142).

En la figura 5 se muestran los resultados de la detección por RT-PCR de las diferentes isoformas de TpRii (A, B y SE) en diferentes tipos de células de humano; HT1080 (fobrosarcoma), A549 (adenocarcinoma de pulmón), CaCo-2 (adenocarcinoma colorectal), Hep3B (carcinoma hepático), Jurkat (leucemia de células T aguda), 293T (células epiteliales de riñón embrionario inmortalizadas con el antígeno T grande del virus SV40), HEK-293 (células epiteliales de riñón embrionario inmortalizadas con adenovirus), EBV-LCL (línea celular linfoblastoidea inmortalizada con el virus Epstein-Barr), y hASC (células mesenquimales estromales provenientes de tejido adiposo humano). La figura 6 muestra los resultados obtenidos por citometría de flujo mostrando los gráficos de pureza celular de monocitos (CD14+), células B (CD19+) y células T (CD3+) separadas por inmunopurificación.

La figura 7 muestra los perfiles de RT-PCR de variantes de splicing de TpRii en subconjuntos de leucocitos humanos, tales como granulocitos, linfocitos T (CD3+), linfocitos B (CD19+) y monocitos (CD14+).

La figura 8 muestra los vectores lentivirales bicistrónicos que codifican para el nuevo péptido TpRii-SE y un mutante negativo dominante (DN) del receptor TpRii-A bajo la acción del promotor CMV; como control, se utilizó un vector lentiviral que codifica para eGFP bajo el promotor de CMV. Los nombres completos de los vectores se indican a la izquierda del diagrama. Los nombres abreviados se muestran encima de cada vector.

La figura 9 muestra la sobreexpresión de TpRii-SE en células A549. A): resultados del análisis por citometría de flujo mostrando el porcentaje de células A549 con expresión de eGFP transducidas con un vector lentiviral que codifica para TpRii-SE (Lt-TpRii-SE) y vectores control; B): resultados del RT-PCR mostrando la sobreexpresión de TpRii-SE a nivel del ARNm; C): resultados que muestran la presencia de TpRii-SE sólo en el sobrenadante de células transducidas con Lt-TpRii-SE detectado por transferencia Western con un anticuerpo específico para TpRii que reconoce específicamente el dominio extracelular.

La figura 10 muestra los resultados de los ensayos de proliferación por MTT. A): células A549 no transducidas (UT) y transducidas con Lt-TpRii-SE, Lt-TpRiiA-DN y Lt-eGFP, tratadas con 0,4 nM de TGFp-1 y sin tratar. B): curva de TGFp-1 en células A549 transducidas con un vector lentiviral que codifica para TpRii-SE y sin transducir (UT). *p<0,05; **p<0,01, ***p<0,001.

La figura 11 muestra: A) Los resultados del análisis por citometría de flujo de las células hASC transducidas con vectores lentivirales que codifican para TpRii-SE, TpRiiA-DN, y eGFP; y no transducidas (UT) y B) Histograma representativo que muestra el porcentaje de pureza después de la separación celular.

La figura 12 muestra los resultados del análisis por RT-PCR de las células hASC que muestra la sobreexpresión de TpRiiA-DN, y TpRii-SE, se usó GAPDH como gen de referencia.

La figura 13 muestra los niveles relativos de ARNm de receptores de TpRii (TpRII-A, TpRII-B y TpRII-SE) en células hASC no transducidas (UT) y transducidas con Lt.TpRii-SE.

La figura 14 muestra los niveles de ARNm de los receptores de TpRii en células hASC incubadas en presencia y ausencia de TGFp-1 exógeno.

La figura 15 muestra los niveles de ARNm de las isoformas TpRII-A y TbRII-B en células hASC transducidas con vectores lentivirales (Lt) que codifican para TpRII-SE, y vectores control, eGFP y TbRII-DN, incubadas en presencia y ausencia de TGFp-1.

La figura 16 muestra las imágenes de rayos X de las ratas tratadas con ciprofloxacina (CPFX) e inyectadas intra articularmente en las rodillas con Lt. coTpRII-SE, Lt.eGFP, y medio de cultivo (vehículo). Las flechas blancas indican imágenes radiolúcidas.

La figura 17 muestra un gráfico de las mediciones de los niveles séricos de aspartato transaminasa (AST), en los mismos animales.

La figura 18 muestra el alineamiento de ADNc para comparar los cambios hechos a la TpRII-SE recombinante. Para hacer la coTpRII-SE/Fc (secuencia subrayada), se incluyó al ADNc de TpRII-SE, una secuencia de Kozak (caja de color gris claro) para hacer más eficaz al inicio de la traducción. Además, se han cambiado algunos nucleótidos (cajas de color negro con letras blancas) por optimización de codones, para hacer más eficaz a la traducción en células humanas. Para permitir que el ADNc se fusione en marco con el ADNc del dominio de IgG-Fc humana, se ha eliminado el codón de detención de TpRII-SE (itálicas) y se reemplazó en la construcción nueva por una secuencia de reconocimiento para BglII. Los cebadores usados para amplificar por PCR las secuencias codificantes de Fc de IgG1 humana se muestran en cajas de color gris oscuro.

La figura 19 muestra el alineamiento de proteínas para comparar los cambios hechos a la TpRII-SE recombinante. Se fusionó la coTpRII-Se “en marco” con el dominio Fc de la IgG1 humana. Asterisco: Codón de detención; Caja de color negro: aminoácidos conectores; caja de color gris: dominio Fc.

La figura 20 muestra un diagrama esquemático del vector lentiviral bicistrónico autoinactivante (SIN) que codifica para el casete de fusión coTpRII-SE/Fc junto con el ires eGFP, bajo el control de un promotor CMV interno.

La figura 21 muestra los gráficos de puntos de la citometría de flujo que muestra la eficacia de la transducción de vector de Lt.coTpRII-SE/Fc.ires eGFP y el vector control Lt. eGFP.

La figura 22 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa de productos de RT-PCR con cebadores que amplifican el Fc de IgG1, de ARNm de células A549 transducidas con control, ELt-eGFP y Lt. coTpRII-SE/Fc.

La figura 23 muestra los resultados de una transferencia Western de lisados celulares (CL) y sobrenadantes (SN) de proteínas de células A549 transducidas con control (Mock), Lt.eGFP y Lt. coTpRII-SE/Fc.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se divulga una variante o isoforma del receptor II de TGF beta que se expresa en células de seres humanos que se denomina aquí como TpRII Soluble Endógena (TpRII-SE) y que a diferencia de otras isoformas actuaría como agonista de TGF-b1.

Con el uso de cebadores específicos se ha amplificado, inicialmente por RT-PCR, una región del ARNm de TpRII humano a partir de linfocitos T que solo codifican para los dominios extracelular (ECD) y el dominio transmembrana (TMD) y que excluye el dominio intracelular (ICD) (Figura 1).

Luego de la reacción de PCR, los productos de ADN se clonaron en el plásmido pGEM-T easy. Los plásmidos se digirieron con AgeI y SalI revelando, en un gel de agarosa, la presencia de clones con insertos de tres tamaños diferentes (Figura 2). El clon 2 contenía un inserto de 650 bp. En los clones 3, 7, 8, 11 y 12 el tamaño del inserto era de 580 bp y en los clones 9 y 10 el tamaño reflejaba la presencia de un inserto de 430 bp.

El secuenciamiento del ADN y el alineamiento con BLAST (NCBI) de todos los clones indicó que los clones 3, 7, 8, 11 y 12 (582 bp) eran idénticos a la variante A del receptor II de TGF p humano (TpRII-A). Adicionalmente, el clon 2 (657 bp) presentó un 100% de identidad con la isoforma TpRII-B. El clon 10 (433 bp) fue similar a la secuencia de TpRII-A pero presentando una eliminación adicional de 149 bp. En este clon, las últimas 62 bp que codifican para el exón II y las primeras 88 bp que codifican para el exón III no estaban presentes, TpRII-SE (SEQ ID N° 1) (Figura 3).

El alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha para las tres isoformas (Figura 4) indicó que la eliminación encontrada en el clon 10 genera un corrimiento de marco comenzando en el aminoácido 68, que agrega un codón de detención 13 aminoácidos después de la eliminación generando una isoforma que termina prematuramente y que posee 80 aminoácidos de largo y carece del dominio transmembrana y es la nueva isoforma TpRII-SE (SEQ ID N° 2).

Esta isoforma difiere en 12 aminoácidos en el extremo carboxilo en comparación con las variantes unidas a membrana de TpRII (isoformas A y B). Debido a esto, y de acuerdo a la secuencia predicha de aminoácidos, la isoforma TpRII-SE del clon 10 carece de sitios pivotales para la acción productiva de TGF-p tal como el aminoácido I76 de la SEQ ID N° 3 que contribuye a la unión de ligando-receptor por medio de contacto hidrofóbico; el aminoácido E142 de la SEQ ID N 3 que forma puentes de hidrógeno con R25 de TGF-p aumentando la afinidad y determinando la especificidad de unión y el aminoácido C71 de la SEQ ID N° 3 que forma un puente disulfuro con C54 del mismo receptor (véase la Figura 4) necesario para la unión al ligando y para la señalización ( a modo de referencia, Alain Guimond, et. al., FEBS Letters 515:13-19, 2002). Por lo tanto, la isoterma TpRII-SE carece de la capacidad para unir TGF-p1 con la misma afinidad que presentan las isotermas conocidas. Además, debido a la terminación prematura, la isoterma TpRII-SE carece de la secuencia de aminoácidos que pertenece al dominio transmembrana (TMD), mostrando la presencia en linfocitos T humanos de una nueva isoterma de TpRIl soluble secretada endógenamente.

Tal como se mencionara anteriormente, la nueva isoforma se la denomina como TpRIl Soluble Endógena (TpRII-SE). La isoforma TpRII-SE es diferentes de la isoforma TpRII secretable que ha sido diseñada genéticamente. Esta última es un receptor TpRII artificial con un TpRII-A truncada fusionada a la región Fc de la IgM de humanos y que bloquea los efectos de TGF-p, actuando como antagonista (a modo de referencia, R. J Akhurst. J. Clin. Invest. 109:1533-3610, 2002).

Para determinar el peso molecular teórico de la isoforma TpRII-SE se establecieron modificaciones post-traduccionales (PTM) predichas a partir de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID N° 2), usando diferentes programas de computación (Tabla 1). En este análisis se identificaron tres sitios de glicaciones en K46, K52 y K78 (programa NetGlycate) (Johansen, M. B.; Glycobiology 16:844-853, 2006); tres sitios de fosforilación en S31, S59 e y 73 (programa NetPhos) (Blom, N.; Journal of Molecular Biology 294: 1351-1362, 1999) y un sitio para sumoilación en K46 (programa SUMOplot™, ABGENT, CA, EE.UU.). Por otra parte, en TpRII-SE no se encontraron sitios para sulfonación, C-manosilación, O-GalNAC glicosilación, O-glicosilación, N-glicosilación, miristoilación ni palmitoilación. En este estudio se estimó que el peso molecular de la isoforma TpRII-SE madura era de alrededor de 18,4 kDa.

Tabla 1

Análisis in silico de la secuencia de aminoácidos de TpRII-SE mostrando las modificaciones posteriores a la traducción predichas y el peso molecular con y sin las modificaciones.

Para confirmar si el ARNm de TpRII-SE también estaba presente en otras células humanas diferentes de linfocitos, se amplificaron por RT-PCR usando el mismo conjunto de cebadores diferentes líneas celulares humanas y cultivos primarios (Figura 5). Se puede observar que las líneas celulares derivadas de tumores sólidos humanos, por ejemplo HT1080 (fibrosarcoma), A549 (adenocarcinoma de pulmón), CaCo-2 (cáncer de colon) y Hep3B (carcinoma hepatocelular) solo mostraron la presencia de ARNm de las variantes A y B, pero no de TpRII-SE. Adicionalmente, en el pasaje 6 de un cultivo primario de células Jurkat (leucemia linfoide aguda), células 293T (células de riñón embrionario inmortalizadas con el antígeno T de SV40), células HEK-293 (células de riñón embrionario inmortalizadas con la proteína E1A de adenovirus, EBV-LCL (línea de células linfoblastoides inmortalizadas con el virus Epstein Barr) y ASC (células mesenquimales estromales derivadas de tejido adiposo de humano), se encontró, en todos los casos, ARNm que codificaba para TpRII-SE (Figura 5). La presencia de la isoforma TpRII-SE fue además confirmada por secuenciamiento del ADN.

Para confirmar si TpRII-SE también estaba presente en leucocitos diferentes de linfocitos T, se purificaron granulocitos, monocitos, células B y células T a partir de sangre periférica de seres humanos por gradiente de densidad y posterior inmunopurificacion magnética con anticuerpos monoclonales específicos, hasta una pureza alta (Figura 6). El análisis por RT-PCR mostró que TpRII-SE está presente en todos los subconjuntos de leucocitos, con diferentes niveles de expresión (Figura 7).

Para determinar si TpRII-SE puede ser secretada al medio extracelular, se clonó el ADNc de TpRII-SE corriente abajo del promotor CMV ubicuo en un vector lentiviral bicistrónico autoinactivante (SIN) que también expresa eGFP, como se describe en los ejemplos, para generar el vector Lt-TpRII-SE. Como control se utilizaron dos vectores lentivirales: uno bicistrónico que codifica para un mutante negativo dominante de TpRII junto con eGFP (Lt-TpRIIA-DN) y otro que codifica solo eGFP (Lt-eGFP) también bajo la acción del promotor de CMV (Figura 8).

Con los vectores lentivirales que se muestran en la figura 8 se transdujeron células A549, con una MOI de 50. Setenta y dos horas después de la transducción, se congelaron los sobrenadantes para experimentos posteriores y se midió el porcentaje de células que expresaban eGFP por citometría de flujo (Figura 9A). En las células transducidas con Lt-TpRII-SE y Lt-eGFP, el 68,63% y 65,27% de las células, respectivamente, mostró integración del vector lentiviral como lo demuestra la expresión de e GFP. La RT-PCR de células transducidas con Lt-TpRII-SE reveló la presencia de una banda de 433 bp, indicando la sobreexpresión a nivel del ARNm de la isoforma TpRII-SE (Figura 9B). Se descongelaron los sobrenadantes celulares, y se realizó una transferencia Western Blot tal como se describe en los ejemplos (Figura 9C). Solo se detectó TpRII-SE en el sobrenadante de células A549 transducidas con Lt-TpRII-SE cultivadas en presencia de inhibidores de proteasas.

El peso molecular de TpRII-SE detectado por transferencia Western está de acuerdo del peso molecular predicho, después del agregado de las modificaciones post-tranduccionales (18 kDa) (Tabla 1). Esta es la primera evidencia de que en las células humanas existe una variante o nueva isoforma secretable del receptor TpRII.

Para mostrar la función de la isoforma TpRII-SE se realizaron ensayos funcionales, en donde se usaron células A549 sin transducir, que expresan niveles casi indetectables de TpRII-SE, transducidas con vectores lentivirales que codifican para eGFP sola, o bicistrónicos junto con TpRII-SE o bien el mutante dominante negativo (DN) de la variante de TpRIIA que se sabe que funciona como antagonista de TGF-p1.

Inicialmente se realizaron ensayos de MTT ((3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue) para evaluar si la sobreexpresión de TpRII-SE inhibe o no la proliferación celular en presencia de 0,4 nM de TGFp-1 (Figura 10A). Tal como se puede observar, en presencia de TGFp-1, las células transducidas con TpRII-SE proliferan significativamente menos que las mismas células no tratadas con TGFp-1, y a niveles hallados en las células control no transducidas (UT) y las células transducidas con Lt.eGFP. Estos resultados indican que TpRII-SE no es un antagonista de TGFp-1.

Para verificar si TpRII-SE actúa como un agonista de TGFp-1 se incubaron células A459 ya sea sobreexpresando TpRII-SE o no (células no transducidas o UT) en presencia de concentraciones crecientes de TGFp-1 (Figura 10B). Estos resultados muestran que en las células UT, la proliferación comenzó a disminuir en presencia de 0,2 nM de TGFp-1 en comparación con los valores que se obtienen en ausencia de TGF-b1 .Sin embargo, en las células que sobreexpresan TpRII-SE, la proliferación comenzó a disminuir a una concentración de TGFp-1 de 0,1 nM en comparación con la misma línea celular sin el agregado de TGF-b1. Estos resultados indican que en las células que sobreexpresan TpRII-SE, el TGFp-1 consiguió el mismo efecto que en las células UT pero a la mitad de la concentración, lo que mostraría que la isoforma TpRII-SE actuaría como un agonista.

Para evaluar adicionalmente el rol agonista de la isoforma TpRII-SE, se transdujeron las células hASC con Lt-TpRII-SE, Lt-TpRIIA-DN y Lt.eGFP, a una MOI de 150 como se describe en los ejemplos. Setenta y dos horas después de la transducción se midió el porcentaje de células que expresan eGFP por citometría de flujo (Figura 11A). Para trabajar en experimentos adicionales con poblaciones de células puras, se expandieron células transducidas y se hizo selección celular en un FACSAriaII Cell Sorter (Becton Dickinson, San Jose, CA) a una pureza de células que expresan eGFP mayor de 90% (Figura 11B), indicando que la mayoría de las células sobreexpresan la nueva isoforma.

La RT-PCR llevada a cabo sobre poly A+ ARNm de células hASC transducidas o no transducidas mostró el patrón de la expresión de las isoformas de TpRII que se muestra en la Figura 12. Las células que sobreexpresan TpRII-SE mostraron una banda intensa de 433 pb y una banda débil de 582 pb que refleja el hecho de que la sobreexpresión de TpRII-SE disminuye la expresión de la isoforma TpRII A. De forma similar, cuando se sobreexpresó TpRIIA-DN en las células hASC, no se pudo detectar la expresión de TpRII-SE (433 pb). Finalmente, en las células hASC transducidas con el lentivector que codifica solo para el gen marcador eGFP, se detectó una banda tenue que representa la expresión de TpRII-A, lo que sugiere que la transducción viral “per se" disminuye la expresión de TpRII.

Se cuantificaron además, por RT-qPCR, los niveles de ARNm de las tres isoformas del receptor de TGF-p de tipo II (Figura 13). Se muestra que en las células no transducidas (UT), las variantes unidas a membrana TBRII-A y B fueron las moléculas principales en expresarse y que la expresión de TpRII-SE fue mínima, según lo esperado. Por el contrario, cuando se incrementó la expresión de la nueva isoforma en las células hASC, ambas variantes TpRII-A y B disminuyeron en gran medida debido a un efecto de compensación, que muestra el efecto agonista de la isoforma TpRII-SE.

También se verificó este efecto de compensación mediante adición de TGF-p1 exógeno y análisis de los niveles de ARNm de las variantes de TpRII en células hASC (Figura 14). Se muestra que ante el agregado de TGF-p1, se incrementó TpRII-A y disminuyó TpRII-SE en comparación con las células no tratadas, sugiriendo nuevamente que la isoforma TpRII-SE actúa como un agonista de TGF-p1.

De acuerdo a esto, se mostró que el ARNm de ambos, TpRII-A y TpRII-B, aumentan su expresión en gran medida (40 y 50 veces de incremento, respectivamente) en células que sobreexpresan Lt-TpRII-SE en presencia de concentraciones fisiológicas de TGF-p1 en comparación con los niveles de ARNm producidos en ausencia de TGF-p1 exógena, confirmando adicionalmente el rol por el que TpRII-SE actúa como un agonista de TGF-p1 mediante el aumento de expresión de los receptores unidos a membrana TpRII-A y TpRII-B (Figura 15).

Por otra parte, se midió el efecto de la isoforma TpRII-SE recombinante en un panel de 80 citoquinas secretadas por las células hASCs (Figura 16). Se transdujeron las células con Lt-GFP control, el inhibidor de TGF-p1 Lt. TpRII-DN, y Lt-TpRII-SE, y se incubaron en presencia o ausencia de TGF-p1 exógeno. Los sobrenadantes recolectados se usaron para analizar las citoquinas en un Cytokine Array G5 (Raybiotech, Inc. Norcross, EE.UU.)

Tabla2.

La tabla 2 muestra los resultados obtenidos por arreglos de citoquinas. El incremento o disminución de los niveles de citoquinas se refieren a los niveles secretados por las células transducidas con el vector control Lt.eGFP ya sea en presencia (paracrina) o ausencia (autocrina) de TGF-p1 exógeno. SC: niveles no cambiados con respecto a las células transducidas con el vector control Lt.eGFP. A: ausente en el control de transducción de células. Cajas gris oscuras: disminuido a niveles no detectados o ausente en el sobrenadante de las células transducidas con el vector control Lt.eGFP. Cajas gris claro: citoquinas presentes.

Se muestra que en células ASC que sobreexpresan TpRII-DN con alta concentración de TGF-p1, la secreción de OPG permanece sin cambios respecto a los valores que se obtienen en las células control transducidas con Lt.eGFP, haciendo a las células insensibles al TGF-p1.

Por otro lado, las altas concentraciones de TGF-p1 provocaron una caída importante de la secreción de OPG en las células que sobreexpresen TpRII-SE en comparación con las células control (transducidas con Lt.eGFP). La isoforma TpRII-SE actúa opuestamente al inhibidor de TGF-p1 (TpRII-DN) y favorecería la osteoclastogénesis.

La Tabla 3 resume los resultados obtenidos por otros autores, y en comparación con los resultados divulgados en la presente solicitud sobre el arreglo de citoquinas y la relación con la osteoartritis (OA).

Se muestra que en células que sobreexpresan TpRII-SE, la secreción de HGF está muy aumentada, tanto en presencia (4,16 veces) como en ausencia (7,65 veces) de TGF-p1 exógeno, mientras que en las células que sobreexpresan el mutante dominante negativo TpRII-DN, la secreción de HGF disminuye 1,81 veces o no está, tanto en ausencia y presencia de TGF-p1 exógeno, respectivamente. Estos resultados muestran que la isoforma TpRII-SE está implicada en la regulación positiva de HGF.

El mayor nivel de TGF-p1 actúa diferentemente en animales dependiendo de si las inyecciones se hicieron en modelos normales u osteoartríticos. En animales normales, la inyección de la proteína TGF-p1 o bien de adenovirus TGF-p1 genera mayor síntesis y contenido de proteoglicano y formación de osteofitos. Por otro lado, en los modelos de Osteoartritis(OA) inducida , los incrementos de la vía de TGF ayudan a disminuir el daño de cartílago, de proteoglicano y la formación de osteofitos. Por lo tanto, se analizó el efecto de la isoforma TpII-SE ya sea en ratas jóvenes tratadas con CPFX (24 días de edad) o sin tratar, mediante inyecciones intraarticulares de vectores lentivirales que codifican para una proteína recombinante del receptor TbRII-SE con optimización de codones (co), fusionada al Fragmento constante (Fc) de la inmunoglobulina 1 humana (IgG1) (Lt.coTpRII-SE/Fc) o bien para la proteína fluorescente verde aumentada (Lt.eGFP)

Después de 7 días de inyectado el vector en ratas tratadas con cirpofloxacina (CPFX), solo las articulaciones que sobre expresaron al péptido de fusión o isoforma fusionada coT TpRII-SE/Fc mostraron imágenes radiolúcidas con bordes irregulares en el cóndilo femoral que estarían de acuerdo con geodas intraóseas (Figura 16). Se muestra que coTbRII.SE/Fc podría ejercer daño osteolítico por reabsorción ósea.

Cuando se compararon los niveles séricos de urea, creatinina, proteínas totales, albúmina, fosfatasa alcalina, alanin transaminasa (ALT) y asparatato transaminasa (AST), solo se encontró una diferencia estadísticamente significativa en esta última. Se observó un incremento de los niveles de asparato transaminasa (AST) sólo en el suero de las ratas tratadas con CPFX e inyectadas intraarticularmente con Lt.coTpRII-SE (Figura 17). Las formas mitocondriales y citoplasmáticas de AST se encuentran en todas las células, así la elevación de AST que solo se encontró en las ratas inyectadas con Lt.coTpRII-SE/Fc en combinación con CPFX muestra que coTpRII-SE potencia el efecto de CPFX al daño tisular en músculo, tendones u otros tejidos.

En la presente solicitud se muestra la generación de una nueva proteína TpRII-SE recombinante expresada en células humanas. Se sabe que en la naturaleza la concentración de receptores solubles es muy baja, por lo tanto, para incrementar los niveles de la proteína TpRII-SE recombinante, se optimizó por codones la secuencia codificante original, incluyendo además una secuencia de Kozak (Epoch Biolabs Inc., Texas, EE.UU.) denominada en la presente como coTpRII-SE (SEQ ID N° 4) y codificada por la ^s E^q ID N° 5 (Figura 18). Además, para hacer que la proteína sea más estable in vivo, y para hacer más efectiva su purificación, se ha clonado la región Fc de la IgG1 humana “en marco” corriente debajo de la secuencia codificante de coTpRII-SE para hacer el péptido de fusión coTpRII-Se/Fc, tal como se mencionó anteriormente (SEQ ID N° 6), codificado por la SeQ ID N° 7 (Figura 18 y 19).

Tal como se puede observar, la figura 18 muestra el alineamiento de ADNc para comparar los cambios hechos a la TpRII-SE recombinante. Para hacer la coTpRII-SE/Fc (secuencia subrayada), se incluyó al ADNc de TpRII-SE, una secuencia de Kozak (caja de color gris claro) para hacer más eficaz al inicio de la traducción. Además, se han cambiado algunos nucleótidos (cajas color negro y letras blancas) por optimización de codones, para hacer más eficaz a la traducción. Para permitir que el ADNc se fusione en marco con el ADNc del dominio de IgG-Fc humana, se ha eliminado el codón de detención de TpRII-SE (itálicas) y se reemplazó en la construcción nueva por una secuencia de reconocimiento para BglII. Los cebadores usados para amplificar por PCR las secuencias codificantes de Fc de IgG1 humana se muestran en cajas de color gris oscuro.

Tal como se puede observar, en la figura 19 se muestra el alineamiento de proteínas y se pueden comparar los cambios hechos a la TpRII-SE recombinante. Se fusionó la coTpRII-Se “en marco” con el dominio Fc de la IgG1 humana. Asterisco: Codón de detención; Caja de color negro: aminoácidos conectores; caja de color gris: dominio Fc.

Posteriormente, se insertó el ADNc recombinante de coTpRII-SE/Fc entre los sitios AgeI y EcoRV de un vector lentiviral SIN (Figura 20).

Para verificar la producción de proteína recombinante, se transdujeron células A549 a una MOI=300 ya sea con el vector control Lt.eGFP (93% de células que expresan eGFP) o Lt.coTpRII.SE/Fc (47,53% de células que expresan eGFP) y transducción control (Figura 21).

Para verificar la presencia del ARNm de IgG1 humana en las células transducidas con Lt.coTpRII-SE/Fc, se extrajo el ARNm total de las células con transducción control (vehículo), transducidas con Lt.eGFP y transducidas con Lt.coTpRII-SE/Fc, y se llevaron a cabo ensayos de RT-PCR usando cebadores específicos para la Fc de IgG1 humana (Figura 22). Según lo esperado, el ARNm del dominio Fc de la IgG1 humana se detectó solamente en las células A549 transducidas con Lt.coTpRII-SE/Fc.

Además, para verificar la presencia de la proteína TpRII-SE/Fc tanto en los lisados como en los sobrenadantes celulares, se analizaron por transferencia Western las proteínas totales de lisados y sobrenadantes de células transducidas con Mock, Lt.eGFP y Lt.coTpRII-SE/Fc (Figura 23) usando un anticuerpo monoclonal, que es capaz de detectar sólo a TpRII-SE. De esta forma, se puedo detectar una proteína predicha de casi 50 kD, que incluyó 18 kD de TpRII-SE más 35 kD del dominio Fc de la IgG1 humana, tanto en el sobrenadante como en el lisado celular solo de las células transducidas con Lt.coTpRII-SE/Fc.

Esta invención se encuentra mejor ilustrada según los siguientes ejemplos.

Ejemplos:

Ejemplo 1: aislamiento, clonado y secuenciación de la isoforma TpRII-SE

Se obtuvieron células madre mesenquimales estromales derivadas de tejido adiposo humano (hASC) a partir de 20 g de grasa subcutánea de acuerdo al protocolo descrito por Zuk y col. (Zuk PA, et al. Mol Biol Cell 13:4279-95, 2002) y se cultivaron en presencia de DMEM suplementado con suero humano al 10% y L-glutamina 1%. A partir de células mononucleares de sangre periférica se generaron células linfoblastoides inmortalizadas en virus de Epstein Barr como se describe (Protocols in Immunology) y se cultivaron con medio RPMI. Se cultivaron líneas celulares A459 Humana (adenocarcinoma de pulmón), HT1080 (fibrosarcoma), Caco-2 (carcinoma colorrectal), Hep 3B (carcinoma hepatocelular), Jurkat (leucemia linfoblastoide aguda), HEK293 (riñón embrionario humano), y 293T en DMEM suplementado con FCS 10% y penicilina/estreptomicina 1%. Las células se cultivaron en un incubador de CO² 5% humidificado a 37°C.

Purificación de diferentes subpoblaciones de leucocitos

Se aislaron granulocitos, linfocitos y monocitos a partir de sangre periférica heparinizada por centrifugación en gradiente con Ficoll-Paque™ PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Después de la centrifugación se obtuvieron dos fracciones, una conteniendo granulocitos/eritrocitos y otra con las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Para obtener granulocitos, los eritrocitos se lisaron con KCl 0,6 M. Las PBMC se marcaron con anticuerpos monoclonales anti-CD3+, CD14+ y CD19+ conjugados con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotech) y se separaron usando columnas MS (Miltenyi Biotech) en un imán MiniMACS (Miltenyi Biotech). Las células disponibles se determinaron por exclusión del indicador azul de Tripán y se contaron en un hemocitómetro. La pureza de las subpoblaciones de linfocitos B y T y monocitos se determinó por análisis por citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). Las subpoblaciones celulares homogeneizadas en solución amortiguada para lisis de ARN (SV Total RNA Isolation System, Promega) se almacenaron a -80 °C hasta la extracción del ARN.

Clonado y secuenciación de los fragmentos de PCR.

Los fragmentos de PCR de TpRIl se clonaron por inserción en el plásmido pGEM-T easy (Promega Corporation WI, EE.UU.) de acuerdo a las condiciones establecidas por los fabricantes y transformación en E. coli. Los fragmentos de PCR de las distintas isoformas de TpRII se secuenciaron usando los cebadores directo y reverso M13 en un secuenciador de ADN ABI 3130 (Applied Biosystems Inc, CA, EE.UU.).

Ejemplo 2: Clonado de construcción de la isoforma de fusión TpRII-SE/Fc con optimización de codones (co)

A la secuencia que codifica para TpRII-SE que contiene un sitio AgeI, se le ha realizado una optimización de codones, se eliminó el codón de detención y se incluyó una secuencia Kozak (Epoch Biolabs Inc., Texas, EE.UU.). La secuencia que codifica para Fc de IgG1 de humano ha sido obtenida por RT-PCR a partir de ARNm de sangre entera usando oligonucleótidos específicos como cebadores (directo: 5'AGA TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC 3' (SEQ ID N° 8) y reverso: 5' GAT ^a T^c TTT ACC CGG AGA CAG G 3'(SEQ ID N° 9)), conteniendo un sitio BglII (cebador directo) y EcoRV (cebador reverso), para permitir la fusión en marco a TpRII-SE y al vector lentiviral, respectivamente. La construcción fusión (coTpRII-SE/Fc) de 951 bp AgeI/EcoRV comprende 258 bp de coTpRII-SE fusionado en marco con 693 bp del IgG1-Fc humano.

Ejemplo 3: Vectores lentivirales

El ADNc que codifica para las tres isoformas de TpRII humano se clonó en el vector lentiviral pRRLsin18.cPPT.WPRE, generando los vectores de transferencia pRRLsin18.cPPT.CMV-TpRII-SE.ireseGFP.WPRE, pRRLsin18.cPPT.CMV-TpRII-DN.ireseGFP.WPRE y pRRLsin18.cPPT.CMV-coTpRII-SE/Fc.ireseGFP.WPRE. Los lentivirus seudotipificados con la proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV-G) se generaron por transfección transitoria de los vectores de transfección junto con el plásmido de envoltura (pCMV-VSVG), el plásmido de empaquetamiento (pMDLg/pRRE) y el plásmido Rev (pRSV-REV), en la línea celular 293T, como se describió previamente (R. A. Dewey, et al. Experimental Hematology 34: 1163-1171, 2006). Se recogió el sobrenadante cada 12 horas durante 48 horas y se congeló en alícuotas. Los títulos virales se determinaron por transducción de células A549 (dando como rendimiento 107 partículas infecciosas por mililitro). Como control se usó el vector lentiviral pRRLsin18.cPPT.CMV-eGFP.WPRE.

Ejemplo 4: RT-PCR y RT-qPCR

Se aisló ARN total de diferentes cultivos primarios y se aislaron líneas celulares usando el conjunto de componentes Absolutely RNA (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Se sintetizó ADNc primera hebra por mezcla de 1 |jg de A^r N total libre de ADN, 50 pmoles de cebador p(DT)15 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), desoxirribonucleótido trifosfato 0,5 mM, ditiotreitol 5 mM, y 1 U de transcriptasa reversa Expand (Roche Diagnostics GmbH). Se detectó el ADNc correspondiente a diferentes isoformas del receptor TpRII por amplificación por PCR en presencia de polimerasa de alta fidelidad (Roche Diagnostics GmbH), dNTPS 0,2 mM, y 0,5 jM de cada cebador (directo:5'ACCGGTATGGGTCGGGGGCTGCTC3' (SEQ ID N° 10) y reverso: 5'GTCGACTCAGTAG CAGTAGAAGATG3' (SEQ ID N° 11)) durante 35 ciclos usando las siguientes condiciones para la PCR: 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 95°C.

Se realizó RT-PCR cuantitativa en muestras de ADNc diluido con FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche Applied Science) usando el equipo para PCR en tiempo real Mx3005P™ (Stratagene) de acuerdo a las condiciones de ciclado universales (95°C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos; luego 60°C durante 1 minuto). Todos los resultados se normalizaron al nivel de ARNm de GAPDH y los resultados se analizaron usando el programa de computación MxPro™ QPCR y el programa estadístico de computación Infostat (Di Rienzo J.A., et al. InfoStat versión 2010. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. URL http://www.infostat.com.ar). Ejemplo 5: Bioensayo in vitro para la isoforma TpRII-SE y otras isoformas usando el ensayo de proliferación por MTT Se transdujeron células A549 con vectores lentivirales con una multiplicidad de infección (MOI) de 50 en presencia de polibreno 8 pg/ml. Se midió el porcentaje de células positivas para eGFP en un citómetro FACscalibur (Becton Dikinson).

Las células se recolectaron, se contaron y se inocularon a las concentraciones apropiadas en placas de 96 pocillos usando una pipeta multicanal. Después de 24 horas, se agregó TGF-p1 (10 ng/ml y 20 ng/ml; Sigma) a los pocillos cultivados, y los cultivos se incubaron durante 24 horas y 48 horas a 37°C, bajo la atmósfera de CO²5%. Se agregó solución mTt (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma) con una concentración de 5 mg/ml al medio y las células se incubaron adicionalmente durante 4 horas. Después de reemplazar 100 j l de sobrenadante por 100 j l de DMSO, se determinó la absorbancia de cada pocillo a 540 nm con un fotómetro SEAC (Sirio S) (Italia). El porcentaje de supervivencia celular se definió como la absorbancia relativa de las células tratadas respecto a las no tratadas.

Ejemplo 6: Transducción y citometría de flujo

Se transdujeron las células A549 y hASC con una MOI de 50 y 200 respectivamente, con los distintos vectores lentivirales utilizados en presencia de polibreno 8 jg/ml (Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la transducción, las células se recolectaron, se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) suplementada con suero fetal bovino 10% y se analizó el porcentaje de células positivas para eGFP por citometría de flujo (FACscalibur, BD) Ejemplo 7: Inmunotransferencia de proteínas (transferencia Western)

Para el análisis por transferencia Western, se cargaron 20 pl y 100 pl de sobrenadante celular en geles de SDS-poliacrilamida 10%, se separaron por electroforesis y se transfirieron a membranas de PVDF Immovilon (Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.). La membrana se expuso al anticuerpo primario monoclonal anti-TpRII (clon C-4) (Santa Cruz, Biotechnology) diluido 1/200, o al anticuerpo monoclonal IM 0577 (desprotegido) que tiene la capacidad de detectar específicamente TpRII-SE, diluido 1/500. Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Becton Dickinson GmbH) diluido 1/10000. La detección de proteínas se realizó con los reactivos para detección en transferencia Western Amersham ECL Plus (Amersham Buchler GmbH, Alemania) en un adquisidor de imágenes de modo variable Typhoon 9410, (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia).

Ejemplo 8: Análisis de secuencia de ADN y de proteínas

Se utilizaron las secuencias de ADNc que pertenecen a las diferentes isoformas de TpRIl y se obtuvieron las secuencias de proteína predichas y estadísticas usando el programa de computación EditSeq (DNAstar, Inc. Madison, WI, EE.UU.). Se alinearon las secuencias de ADN y de proteínas predichas que pertenecen al ADNc de TpRII-SE con las isoformas conocidas del receptor de TpRIl de humano (A y B) usando el programa de computación MegAlign (DNASTAR, Inc. Madison, WI, EE.UU.).

Ejemplo 9: Análisis de citoquinas y quimoquinas secretadas por las células hASC

Se usó un conjunto de componentes de arreglo de citoquina/quimoquina G5 (Ray Biotech Inc., Norcross, GA) para detectar un panel de 80 citoquinas secretadas de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Se hicieron crecer hASCs P7 no transducidas o transducidas con vectores lentivirales durante 72 horas en medio suplementado con BSA 0,1%. Se recolectaron los sobrenadantes, se filtraron y se congelaron después de la recolección. Para el análisis de densitometría de los arreglos se usó un adquisidor de imágenes de modo variable Typhoon 9410 (GE Healthcare Life Sciences), y los valores de intensidad de señal se midieron usando el programa de computación para análisis de imágenes ImageQuant TL 7.0 (GE Healthcare Life Sciences). Los datos del microarreglo se analizaron con la herramienta RayBio® Anticuerpo Array Analysis. Se aseguró la buena calidad de los datos y la normalización adecuada usando la normalización por control interno sin señal de fondo. Cualquier aumento mayor o igual a 1,5 veces o disminución menor o igual a 0,65 veces en la intensidad de la señal para un analito único entre muestras o grupos puede considerarse una diferencia que puede medirse y significativa en la expresión, con la condición de que ambos conjuntos de señales estén bien por encima de la señal de fondo (señal de fondo promedio 3 desviaciones estándar, precisión aproximada del 99%).

Ejemplo 10: Generación de anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra el TpRII-SE humano

Los anticuerpos fueron generados por Rheabiotech, Campinas, Brasil. La inmunización de conejos (anticuerpo policlonal) o ratones (anticuerpo monoclonal), se han realizado utilizando un sistema Multiple Antigene Peptide (MAPS) con 8 copias idénticas de un péptido conteniendo los 13 aminoácidos (FSKVHYEGKKKAW) (SEQ ID N° 12), que solo se encontró en TpRII-SE y no en otras variantes de corte y empalme del receptor. El anticuerpo monoclonal IM-0577 se ha desarrollado en ratones y se purificó por cromatografía de afinidad a proteína G. La especificidad de los anticuerpos se evaluó por ELISA indirecto por sensibilización con antígeno a una concentración de 5 pg/ml en solución amortiguada con carbonato 0,2 M, se bloqueó con PBS/BSA y se detectó con diluciones seriales (entre 1:1000 y 1:64000) del anticuerpo específico. La prueba de ELISA se reveló con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) junto con H²O²/OPD como sustrato cromogénico, y se detectó por absorbancia a 492 nM.

Ejemplo 11: Estudio in vivo de daño del cartílago articular por ciprofloxacina (CPFX) y la isoterma TpRII-SE

Se alojaron ratas Wistar macho de 24 días de edad bajo condiciones controladas a 21 ± 1°C con 50% ± 5% de humedad relativa y un esquema constante de luz-oscuridad (luz, de 8 a.m. a 8 p.m.). El alimento y agua corriente se proveyeron ad libitum. Las ratas recibieron clorhidrato de ciprofloxacina en el día 24 por administración oral de 200 mg/kg de peso corporal durante 10 días. Se examinaron las anormalidades clínicas en los animales incluyendo alteraciones en la motilidad y se pesaron durante el período de tratamiento.

En el día 14 después del tratamiento con ciprofloxacina, se inyectaron 50 pl de vectores virales en forma intraarticular con Lt.coTBRII-SE/Fc (2,35 x 106 unidades transductoras TU) o Lt.eGFP (6 x 106 TU). Los animales control sin ciprofloxacina se trataron de igual manera.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una isoforma del receptor II de TGF beta, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2 donde la SEQ ID N° 2 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N° 12.

2. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica a la isoforma de la reivindicación 1.

3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 1.

4. Una célula transformada, caracterizada porque la célula expresa la isoforma de la reivindicación 1.

5. La célula transformada según la reivindicación 4, caracterizada porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.

6. Un péptido de fusión, caracterizado porque comprende la isoforma del receptor II de TGF beta de la reivindicación 1 fusionada a un ligando.

7. El péptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la isoforma comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2.

8. El péptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el ligando es la porción Fc de las inmunoglobulinas.

9. El péptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID No 6.

10. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica el péptido de la reivindicación 6.

11. El polinucleótido, de acuerdo con la reivindicación 10 caracterizado porque comprende la SEQ ID N° 7.

12. Un vector que comprende al menos al polinucleótido de la reivindicación 10.

13. Un anticuerpo, caracterizado porque se une a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N° 12.

14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque es seleccionado del grupo comprendido por anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de los mismos.

15. Uso de la isoforma de la reivindicación 1 para el diagnóstico in vitro de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-^p en mamíferos

16. El uso de la isoforma de la reivindicación 1 para preparar un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-^p .

17. Uso del péptido de fusión de la reivindicación 6 para preparar un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-^p .

18. Uso del vector de la reivindicación 12 para preparar un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-^p .

19. Uso del anticuerpo de la reivindicación 13 para preparar un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-^p .

20. Uso del anticuerpo de la reivindicación 13 para el diagnóstico in vitro de enfermedades asociadas a la desregulación de TGF-^p en mamíferos.