ES2750199T3 - Métodos para tratar el cáncer - Google Patents

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Abstract

Un inhibidor de EZH2 para usar en el tratamiento del sarcoma epitelioide, en donde el inhibidor de EZH2 es:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable de estos.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para tratar el cáncer.
Campo de la invención
La presente invención generalmente se refiere al campo del tratamiento del cáncer, y en particular, al tratamiento del cáncer asociado con el complejo SWI/SNF (es decir, cáncer mediado por SWI/SNF). Más particularmente, la presente invención proporciona métodos y composiciones que tratan, alivian, previenen, disminuyen o mejoran los síntomas de cáncer asociados con el complejo SWI/SNF.
Antecedentes de la invención
Las enzimas modificadoras de la cromatina asociada a la enfermedad (por ejemplo, EZH2) juegan un papel en las enfermedades tales como trastornos proliferativos, trastornos metabólicos y trastornos sanguíneos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar moléculas pequeñas que sean capaces de modular la actividad de EZH2.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un inhibidor de EZH2 para su uso en el tratamiento del sarcoma epitelioide como se reivindica en las reivindicaciones. Por ejemplo, el cáncer asociado con SWI/SNF se caracteriza por una expresión reducida y/o pérdida de la función del complejo SWI/SNF o uno o más componentes del complejo SWI/SNF.
Por ejemplo, uno o más componentes se seleccionan del grupo que consiste en SNF5, ATRX y ARID1A.
Por ejemplo, la pérdida de función es causada por una mutación de pérdida de función resultante de una mutación puntual, una supresión y/o una inserción.
Por ejemplo, el sujeto tiene una supresión de SNF5.
En la presente descripción se describe un sujeto que tiene una mutación de ATRX seleccionada del grupo que consiste en una sustitución de asparagina (N) por el residuo de lisina (K) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 688 de la SEQ ID NO: 5 (K688N), y una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de metionina (M) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 366 de la SEQ ID NO: 5 (M366I).
Se describe en la presente descripción un sujeto que tiene una mutación de ARID1A seleccionada del grupo que consiste en una mutación sin sentido para el residuo de cisteína (C) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 884 de la SEQ ID NO: 11 (C884*), una sustitución de lisina (K) por el residuo de ácido glutámico (E) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 966 (E966K), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1411 de la SEQ ID NO: 11 (Q1411*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo defenilalanina (F) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1720 de la SEQ ID NO: 11 (F1720fs), una mutación de desplazamiento de marco después del residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1847 de la SEQ ID NO: 11 (G1847fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de cisteína (C) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1874 de la SEQ ID NO: 11 (C1874fs), una sustitución de ácido glutámico (E) por el residuo de ácido aspártico (D) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1957 (D1957E), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1430 de la SEQ ID NO: 11 (Q1430*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de arginina (R) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1721 de la SEQ ID NO: 11 (R1721fs), una sustitución de ácido glutámico (E) por el residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1255 (G1255E), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 284 de la SEQ ID NO: 11 (G284fs), una mutación sin sentido para el residuo de arginina (R) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1722 de la SEQ ID NO: 11 (R1722*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de metionina (M) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 274 de la SEQ ID NO: 11 (M274fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1847 de la SEQ ID NO: 11 (G1847fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo P de tipo silvestre en la posición aminoacídica 559 de la SEQ ID NO: 11 (P559fs), una mutación sin sentido para el residuo de arginina (R) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1276 de la SEQ ID NO: 11 (R1276*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 2176 de la SEQ ID NO: 11 (Q2176fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de histidina (H) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 203 de la SEQ ID NO: 11 (H203fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de alanina (A) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 591 de la SEQ ID NO: 11 (A591fs), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1322 de la SEQ ID NO: 11 (Q1322*), una mutación sin sentido para el residuo de serina (S) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 2264 de la SEQ ID NO: 11 (S2264*), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 586 de la SEQ ID NO: 11 (Q586*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 548 de la SEQ ID NO: 11 (Q548fs), y una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de asparagina (N) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 756 de la SEQ ID NO: 11 (N756fs).
Se describe en la presente descripción un método para tratar o aliviar un síntoma de un cáncer asociado a SWI/SNF en un sujeto que lo necesita mediante (a) la determinación del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores en una muestra obtenida del sujeto; (b) la selección del sujeto que tiene un nivel de expresión disminuido de al menos un gen en la etapa a; y (c) la administración al sujeto seleccionado en la etapa b de una cantidad eficaz de un inhibidor de EZH2, que trata o alivia de esta forma un síntoma de cáncer en el sujeto.
Se describe en la presente un método para tratar o aliviar un síntoma de un cáncer asociado a SWI/SNF en un sujeto que lo necesita mediante (a) la determinación del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de la histona metiltransferasa en una muestra obtenida del sujeto; (b) la selección del sujeto que tiene un nivel de expresión aumentado de al menos un gen en la etapa a; y (c) la administración al sujeto seleccionado en la etapa b de una cantidad eficaz de un inhibidor de EZH2, que trata o alivia de esta forma un síntoma de cáncer en el sujeto.
Por ejemplo, el gen de diferenciación neuronal es CD133, DOCK4 o PTPRK.
Por ejemplo, el gen de inhibición del ciclo celular es CKDN1A o CDKN2A.
Por ejemplo, el gen de supresión tumoral es BIN1.
Por ejemplo, el gen de la vía hedgehog es GLI1 o PTCH1.
Por ejemplo, el gen de la vía myc es MYC.
Por ejemplo, el gen de la histona metiltransferasa es EZH2.
Se describe en la presente descripción un método para inducir la diferenciación neuronal, la inhibición del ciclo celular o la supresión tumoral al poner en contacto una célula con un inhibidor de EZH2. El inhibidor de EZH2 puede estar en una cantidad suficiente para aumentar la expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CDKN2Ay BIN1.
En la presente descripción se describe un método para inhibirla señalización de hedgehog al poner en contacto una célula con un inhibidor de EZH2. El inhibidor de EZH2 puede estar en una cantidad suficiente para reducir la expresión de GLI1 y/o PTCH1.
En la presente invención se describe un método para inducir la expresión génica al poner en contacto una célula con un inhibidor de EZH2. El inhibidor de EZH2 puede estar en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación neuronal, la inhibición del ciclo celular y/o la supresión tumoral. Por ejemplo, el gen puede ser CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CKDN2A o BIN1.
Se describe en la presente invención un método para inhibir la expresión génica al poner en contacto una célula con un inhibidor de EZH2. El inhibidor de EZH2 está en una cantidad suficiente para inhibir la señalización de hedgehog. Por ejemplo, el gen puede ser GLI1 o PTCH1.
Por ejemplo, la célula puede tener pérdida de función de SNF5, ARID1A, ATRXy/o un componente del complejo SWI/SNF. Por ejemplo, la pérdida de función es causada por una supresión de SNF5.
El inhibidor de EZH2 es el Compuesto A que tiene la siguiente fórmula:
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sus estereoisómeros, o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En la descripción, las formas singulares incluyen, además, el plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen más abajo. Las referencias citadas en la presente descripción no se admiten como técnica anterior a la invención reivindicada. En caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos solo son ilustrativos y no están destinados a ser limitantes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B son una serie de análisis de transferencia de membrana de tipo Western de las líneas celulares con SNF5 de tipo silvestre (RD y SJCRH30) y mutante.
Las Figuras 2A-2E son una serie de gráficos que establecen que las líneas celulares A204 (C), G401 (D) y G402 (E) de SNF5 mutante responden selectivamente al compuesto EZH2 (Compuesto E) en comparación con las líneas celulares de tipo silvestre RD (A) y SJCRH30 (B).
Las Figuras 3A-3D son una serie de gráficos de barras que muestran que la línea celular G401 SNF mutante está respondiendo al Compuesto E después de 7 días en agar blando en comparación con las células RD de tipo silvestre. A muestra la línea celular RD (5.000 células/pocillo). B muestra células G401 (5.000 células/pocillo). C muestra células G401 en crecimiento 2D. D muestra células G401 (10.000 células/pocillo).
Las Figuras 4A-4D son cuatro gráficos que muestran que la línea celular G401 SNF5 mutante es sensible al Compuesto A in vitro. La línea celular de tipo silvestre SJCRH30 (A) y RD (C) y la línea celular G401 (B) y A204 (D) de SNF5 mutante se pretrataron durante 7 días con las concentraciones indicadas del Compuesto A y se resembraron el día 0. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo®.
Las Figuras 5A-5D son una serie de gráficos que muestran regresiones duraderas en los xenoinjertos G401 (modelo de tumor rabdoide maligno) con el tratamiento del Compuesto A. (A) Regresiones del tumor inducidas por el compuesto A en las dosis indicadas. (A) Regresiones del tumor inducidas por la administración dos veces al día del compuesto A en las dosis indicadas. Los datos representan los valores promedios ± SEM (n=8). La administración del compuesto se detuvo el día 28. (C) Inhibición del objetivo EZH2 en tejido tumoral del xenoinjerto G401 recogido a partir de una cohorte paralela de ratones el día 21. Cada punto muestra la relación de H3K27Me3 con respecto a H3 total. Las líneas horizontales representan valores promedios grupales. BLLQ = por debajo del límite inferior de la cuantificación. (D, E) Tinción inmunohistoquímica de la metilación de histonas tumorales de muestras tumorales a partir de ratones tratados con vehículo (D) y tratados con el Compuesto A (E) (a 125 mg/kg).
La Figura 6 es un gráfico que muestra las ubicaciones de las mutaciones ATRX identificadas en las líneas celulares SCLC.
La Figura 7A es un gráfico que muestra que las células de cáncer de próstata LNCAP muestran inhibición del crecimiento celular dependiente de la dosis con el tratamiento del Compuesto E in vitro.
La Figura 7B es un gráfico que muestra el valor IC50 del Compuesto E en el día 11 y el día 14 para las células WSU-DLCL2 y LNCAP.
Las Figuras 8A-8C son tres gráficos que establecen que las líneas SCLC mutante ATRX NCI-H446 (A), SW1271 (B) y NCI-H841 (C) están respondiendo al Compuesto E.
Las Figuras 9A-9C son tres imágenes de microscopía que muestran que la línea SCLC NCI-H841 cambia la morfología después del tratamiento con el vehículo (A) o el Compuesto E a una concentración de 4.1E-02 uM (B) o 3.3 uM (C).
Las Figuras 10A-10C son una serie de gráficos que muestran los efectos del Compuesto A sobre la metilación de histona celular global y la viabilidad celular. (A) Estructura química del Compuesto A. (B) Inhibición dependiente de la concentración de los niveles celulares de H3K27Me3 en las células G401 y RD. (C) Inhibición selectiva de la proliferación de las células G401SM^RCSt-suprimidas por el Compuesto A in vitro (medido mediante el contenido de ATP). G401 (paneles a y b) y células RD (paneles c y d) se volvieron a sembrar en las densidades de siembra originales el día 7. Cada punto representa la media para cada concentración (n=3).
Las Figuras 11Ay 11B son una serie de gráficos que muestran el mecanismo bioquímico de los estudios de acción. El valor de IC50del Compuesto A aumenta con el aumento de la concentración de SAM (A) y se afecta mínimamente con el aumento de la concentración de oligonucleosomas (B), lo que indica un mecanismo de acción competitivo de SAM y no competitivo de los nucleosomas.
Las Figuras 12A y 12B son una serie de paneles que demuestran la verificación de la expresión de SMARCB 1 y EZH2 en líneas celulares y la especificidad del Compuesto A para la inhibición de la metilación de las histonas celulares. (A) Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos específicos para SMARCB 1, EZH2 y Actina (control de carga). (B) Inhibición selectiva de la metilación celular de H3K27 en las células G401 y RD. Las células se incubaron con el Compuesto A durante 4 días, y las histonas extraídas con ácido se analizaron mediante inmunotransferencia.
Las Figuras 13Ay 13B son una serie de gráficos de barras que demuestran que el Compuesto A induce el arresto de G-iy apoptosis en las células MRTSM^RCB7-suprimidas. Análisis del ciclo celular (por citometría de flujo) y determinación de apoptosis (por ensayo TUNEL) en células RD (panel A) o G401 (panel B) durante la incubación ya sea con vehículo o Compuesto A 1 pM por hasta 14 días. El arresto de Gise observó a partir del día 7 y se indujo apoptosis a partir del día 11. Los datos representan los valores promedios ± SEM (n=2). Los valores de control DMSO que se muestran son el promedio ± SEM de cada intervalo de tiempo. Las células se dividieron y se volvieron a sembrar en los días 4, 7 y 11 a la densidad de siembra original.
Las Figuras 14A-14B son una serie de gráficos que muestran que el Compuesto A induce cambios en la expresión de genes regulados por SMARCB 1 y la morfología celular. (A) Expresión basal de genes regulados por SMARCB 1 en las células G401SM^RCB7-suprimidas, con relación a las células de control RD (medido por qPCR, n=2). (B) Las células G401 y RD se incubaron con DMSO o con el Compuesto A 1 pM durante 2, 4 y 7 días. La expresión génica se determinó mediante qPCR (n=2) y se expresa con relación al control DMSO de cada intervalo de tiempo. Los paneles a-j corresponden a los genes GLI1, PTCh1, DOCK4, CD133, PTPRK, BIN1, CDKN1A, CDKN2A, EZH2 y MYC, respectivamente. (C) Las células G402 se incubaron ya sea con DMSO (panel izquierdo) o el Compuesto A 1 pM (panel derecho) durante 14 días. Las células se dividieron y se volvieron a sembrar a la densidad de siembra original el día 7.
Las Figuras 15A-15D son series de gráficos que demuestran los pesos corporales, las regresiones tumorales y los niveles plasmáticos en ratones portadores de xenoinjerto G401 tratados con el Compuesto A. (A) Se determinaron los pesos corporales dos veces por semana para los animales tratados con el Compuesto A en un esquema BID durante 28 días. Los datos se presentan como valores promedios ± SEM (n=16 hasta el día 21, n=8 del día 22 al 60). (B) Regresiones tumorales inducidas por la administración dos veces al día (BID) del Compuesto A durante 21 días a las dosis indicadas (valores promedios ± SEM, n=16). * p <0,05, ** p <0,01, medidas repetidas ANOVA, prueba posprueba de Dunnett vs. vehículo. (C) Pesos tumorales de 8 ratones sacrificados el día 21. **** p <0,0001, prueba exacta de Fisher. (D) Se recogió plasma 5 min antes y 3 h después de la dosificación del Compuesto A el día 21, y los niveles de compuesto se midieron por LC-MS/MS. Se sacrificaron los animales y se recogieron los tumores 3 h después de la dosificación el día 21. Se generaron homogeneizados tumorales y se sometieron a análisis por LC-MS/MS para determinar las concentraciones del Compuesto A. Tenga en cuenta que los niveles de compuestos tumorales no pudieron determinarse a partir de todos los animales, especialmente en los grupos de dosis más altas porque los xenoinjertos eran demasiado pequeños el día 21. Los puntos representan los valores para los animales individuales; las líneas horizontales representan los valores promedios del grupo.
Las Figuras 16A-16C son una serie de gráficos que muestran que el Compuesto A erradica los xenoinjertos MRTSM^RCB7-suprimidos en los ratones SCID. (A) Regresiones del tumor inducidas por la administración dos veces al día (BID) del compuesto A durante 28 días en las dosis indicadas. La administración del compuesto se detuvo el día 28 y los tumores se dejaron crecer hasta alcanzar los 2000 mm.3(datos mostrados como valores promedios ± SEM, n=8). (C) Inhibición del objetivo EZH2 en tejido tumoral del xenoinjerto G401 recogido a partir de ratones que se les practicaron la eutanasia el día 21. Cada punto muestra la relación de H3K27Me3 con respecto a H3 total, medido por ELISA. Las líneas horizontales representan los valores promedios de grupo; los símbolos grises son valores fuera de la curva estándar de ELISA. (C) Cambio en la expresión génica en tejido tumoral de xenoinjerto G401 recogido de ratones tratados con el Compuesto A durante 21 días. Los paneles a-d corresponden a los genes CD133, PTPRK, DOCK4 y GLI1, respectivamente. Los datos se presentan como cambio de conformación en comparación con el vehículo ± SEM (n=6, n=4 para el grupo de 500 mg/kg). * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001, vs. vehículo, prueba exacta de Fisher.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los inhibidores de EZH2 pueden tratar eficazmente los cánceres asociados a SWI/SNF que se caracterizan por las expresiones alteradas y/o pérdida de la función de ciertos biomarcadores o genes. Específicamente, los tumores o células tumorales que tienen expresiones alteradas y/o pérdida de función de los biomarcadores o genes seleccionados son sensibles a los inhibidores de EZH2 de la presente invención. En consecuencia, la presente invención proporciona un inhibidor de EZH2 para su uso en el tratamiento del sarcoma epitelioide como se define en las reivindicaciones. Se describe en la presente los métodos para tratar o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EZH2 al sujeto, en particular el tratamiento de cánceres asociados con la expresión alterada y/o la pérdida de la función de ciertos biomarcadores o genes. Por ejemplo, el biomarcador es un componente del complejo sW i/SNF. Por ejemplo, el gen se selecciona del grupo que consiste en los genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición de los genes del ciclo celular, genes supresores de tumores, genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de la histona metiltransferasa.
El complejo SWI/SNF en humanos incluye al menos subunidades centrales evolutivamente conservadas y subunidades variantes. Las subunidades centrales evolutivamente conservadas incluyen SNF5 (también denominada SMARCB1, INI1 o BAF47), SMARCA4 (conocida además como gen 1 relacionado con BRM/sW i2, BRG1), BAF155 y BAF170. Las subunidades variantes incluyen BAF53 (A o B), BAF60 (A, B o C), BAF 57, BAF45 (A, B, C o D). Otras subunidades incluyen ARIDI1A (conocido como SMARCF1), ARID1B, SMARCA2 (conocida además como homólogo de brahma, BRM), ATRX, BAF200, BAF180 (conocida además como PBRM1) y 7 que contienen bromodominio (BRD7). Al menos un componente del complejo SWI/SNF puede ser cualquier componente del complejo, por ejemplo, el componente/subunidad descrito en la presente o conocido en la técnica.
En cualquiera de los métodos presentados en la descripción, el gen de diferenciación neuronal puede ser, pero no se limita a, CD133 (denominado además PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64 o GFAP.
En cualquiera de los métodos presentados en la descripción, el gen de inhibición del ciclo celular puede ser, pero no se limitan a, CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, mlF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, mlTK, MAD2L2, FBXO5, ING4, o TRIM35.
En cualquiera de los métodos presentados en la descripción, el gen supresor de tumores puede ser, pero no se limitan a, BIN1. Como se usa en la presente descripción, el término "gen supresor tumoral" tiene su significado comúnmente entendido en la técnica, es decir, un gen cuya expresión y función normal actúan para suprimir el fenotipo neoplásico o inducir apoptosis, o ambos. En algunas modalidades, los genes supresores de tumores incluyen los genes de inhibición del ciclo celular. Las categorías ilustrativas de supresores tumorales basado en sus funciones incluyen, pero no se limitan a:
(1) genes que inhiben los ciclos celulares;
(2) genes que se acoplan al ciclo celular para dañar el ADN. Cuando hay ADN dañado en la célula, la célula no debe dividirse. Si el daño puede repararse, el ciclo celular puede continuar. Si el daño no puede repararse, la célula debe iniciar la apoptosis (muerte celular programada);
(3) genes que evitan que las células tumorales se dispersen, bloquean la pérdida de contacto mediante inhibición e inhiben la metástasis. Estos genes y sus proteínas codificadas se conocen además como supresores de la metástasis; y (4) proteínas de reparación del a Dn . Las mutaciones en estos genes aumentan el riesgo de cáncer.
En cualquiera de los métodos presentados en la descripción, el gen de la vía de señalización de hedgehog puede ser, pero no se limita a, GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 o SMO.
En cualquiera de los métodos presentados en la descripción, el gen de la vía myc puede ser, pero no se limita a, MYC NMI, NFYC, NFYB, Ciclina T1, tipo-RuvB 1, GTF2I, b Rc A1, invasión de linfoma de células T y proteína inductora de metástasis 1, ACTL6A, PCAF, MYCBP2, MAPK8, Bcl-2, homólogo de la proteína de iniciación de la transcripción del SPT3, SAP130, DNMT3A, madres contra el homólogo decapentapléjico 3, MAX, madres contra el homólogo decapentapléjico 2, MYCBP, HTATIP, ZBTB17, proteína asociada al dominio de transformación/transcripción, TADA2L, PFDN5, MAPK1, TFAP2A, P73, TAF9, YY1, SMARCB1, SMARCA4, mlH1, EP400 o let-7.
En cualquiera de los métodos presentados en la descripción, el gen de la histona metiltransferasa puede ser, pero no se limita a, EZH2.
Los compuestos descritos en la presente inhiben la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 o un mutante de esta y, en consecuencia, los compuestos descritos en la presente son candidatos para tratar o prevenir ciertas afecciones y enfermedades. Se describe en la presente los métodos para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de cáncer o una afección precancerosa. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto descrito en la presente, o una sal, polimorfo, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de este. Los cánceres ilustrativos que pueden tratarse incluyen el sarcoma epitelioide. Alternativamente, los cánceres que se tratan por los compuestos son cánceres no NHL.
Se describe en la presente invención el uso de un compuesto descrito en la presente, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este en el tratamiento del cáncer o precáncer, o, para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de ese tipo de cáncer o precáncer. Los cánceres ilustrativos que pueden tratarse incluyen el sarcoma epitelioide.
Los compuestos descritos en la presente pueden usarse para modular la metilación de las proteínas (por ejemplo, histonas), por ejemplo, para modular la actividad de la enzima histona metiltransferasa o la enzima histona desmetilasa. Los compuestos descritos en la presente pueden usarse in vivo o in vitro para modular la metilación de las proteínas.
Basado en el sorprendente descubrimiento de que la regulación de la mutilación por EZH2 implica la formación de tumores, tumores particulares que tienen la expresión alterada y/o pérdida de la función de biomarcadores/genes seleccionados, los compuestos descritos en la presente son candidatos adecuados para tratar estas enfermedades, es decir, para disminuir la metilación o restaurar aproximadamente a su nivel la metilación en las células normales de contraparte.
Los compuestos descritos en la presente invención pueden inhibir selectivamente la proliferación de las células tumorales o tumores asociados al complejo SWI/SNF (como se muestra en las Figuras 1-9). En consecuencia, se describen en la presente invención los métodos para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de cáncer asociado al complejo SWI/SNF o una afección precancerosa con un compuesto descrito en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este. En la presente se describe el uso de un compuesto descrito en la invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este en el tratamiento del cáncer asociado al complejo SWI/SNF o para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de dicho cáncer.
Se describe en la presente los métodos para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene cáncer a un inhibidor de EZH2. El método incluye las etapas para obtener una muestra (una muestra de ácido nucleico o una muestra de proteína) del sujeto y detectar la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de al menos un componente del complejo SWI/SNF, detectar la expresión y/o función de este componente, y la presencia de dicha expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función indica que el sujeto responde al inhibidor EZH2. El término "muestra" significa cualquier muestra biológica derivada a partir del sujeto, que incluye pero no se limitan a, las células, muestras de tejidos, fluidos corporales (que incluyen, pero no se limitan a, moco, sangre, plasma, suero, orina, saliva y semen), células tumorales y tejidos tumorales. Las muestras pueden proporcionarse por el sujeto bajo tratamiento o prueba. Alternativamente, el médico puede obtener muestras de acuerdo con la práctica habitual en la técnica.
En la presente se describen los métodos para determinar la predisposición de un sujeto a un cáncer o una afección precancerosa mediante la obtención de una muestra del sujeto y detectar la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de al menos un componente del complejo SWI/SNF, y la presencia de la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de función de este tipo indica que el sujeto está predispuesto a (es decir, que tiene mayor riesgo de) desarrollar el cáncer o la afección precancerosa en comparación con un sujeto sin dicha pérdida de función del al menos un componente del complejo SWI/SNF.
El término "predispuesto" como se usa en la presente descripción con relación al cáncer o una afección precancerosa debe entenderse que significa la probabilidad aumentada (por ejemplo, al menos 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 % o más de probabilidad de que un sujeto con expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de al menos un componente del complejo sW i/SNF sufrirá cáncer o una afección precancerosa, en comparación con la probabilidad de que otro sujeto que no tenga expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de al menos un componente del complejo SWI/SNF sufrirá cáncer o una afección precancerosa, en circunstancias en las que otros factores de riesgo (por ejemplo, químico/ambiental, alimentos, antecedentes de tabaquismo, etc.) para tener cáncer o una afección precancerosa son similares entre los sujetos.
"Riesgo" en el contexto de la presente descripción, se relaciona con la probabilidad de que ocurra un evento durante un período de tiempo específico y puede significar el riesgo "absoluto" o el riesgo "relativo" para un sujeto. El riesgo absoluto puede medirse o bien con referencia a la observación real posterior a la medición para la cohorte de tiempo relevante, o con referencia a valores de índice desarrollados a partir de cohortes históricas estadísticamente válidas que se han seguido durante el período de tiempo relevante. El riesgo relativo se refiere a la proporción de riesgos absolutos de un sujeto en comparación con los riesgos absolutos de cohortes de bajo riesgo o un riesgo poblacional promedio, que puede variar según la forma en que se evalúan los factores de riesgo clínicos. Las razones de prevalencia, la proporción de eventos positivos frente a eventos negativos para un resultado de prueba dado, también se usan comúnmente (las prevalencias están de acuerdo con la fórmula p/(1-p) donde p es la probabilidad de evento y (1- p) es la probabilidad del no evento) en la no conversión.
En consecuencia, en la presente descripción se personaliza la medicina, el tratamiento y/o manejo del cáncer para un sujeto mediante el tamizaje genético de la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de al menos un componente del complejo SWI/SNF en el sujeto. Por ejemplo, en la presente invención se describen los métodos para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de cáncer o una afección precancerosa mediante la determinación de la capacidad de respuesta del sujeto a un inhibidor de EZH2 y cuando el sujeto es sensible al inhibidor de EZH2, administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor de EZH2, o una sal, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de este. La capacidad de respuesta se determina obteniendo una muestra del sujeto y detectando la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de función de al menos un componente del complejo sW i/SNF (tales como SNF5, ARID1A o ATRX), y la presencia de la pérdida de función de este tipo indica que el sujeto es sensible al inhibidor EZH2.
En otro ejemplo, en la presente se describen los métodos de manejo del cáncer en un sujeto al determinar periódicamente la predisposición del sujeto a un cáncer o una afección precancerosa. Los métodos incluyen las etapas para obtener una muestra del sujeto y detectar una expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de al menos un componente del complejo SWI/SNF, y la presencia de la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de función de este tipo indica que el sujeto está predispuesto a desarrollar el cáncer o la afección precancerosa en comparación con un sujeto sin la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de función de este tipo de al menos un componente del complejo SWI/SNF.
Para propósitos ilustrativos, los métodos de tratamiento presentados en la descripción incluyen las etapas de (a) recoger una muestra de ácido nucleico o una muestra de proteína de una muestra biológica obtenida de un sujeto, (b) medir el nivel de expresión o el nivel de función de un componente del complejo SWI/SNF en la muestra, (c) medir el nivel de expresión o el nivel de función del componente del SWI/SNF en una muestra de control; (d) comparar el nivel de expresión o el nivel de función del componente medido en la etapa (b) en la muestra de prueba con el nivel de expresión o el nivel de función del componente medido en la etapa (c) en la muestra de control (o un valor de referencia); (e) identificar al sujeto como candidato para el tratamiento cuando el nivel de expresión o el nivel de función del componente medido en la etapa (b) se reduce o pierde (por ejemplo, haploinsuficiencia o pérdida de función) en comparación con el nivel de expresión o el nivel de función del componente medido en la etapa (c); y (f) administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EZH2 al sujeto identificado en la etapa (e) o seleccionar un régimen de tratamiento para el sujeto identificado en la etapa (e). El nivel de expresión o el nivel funcional del componente en la muestra del sujeto se reduce, por ejemplo, 10 %, 25 %, 50 % o 1-, 2-, 5- o más veces en comparación con el nivel de expresión o el nivel funcional del componente en la muestra de control. Cualquier método adecuado conocido en la técnica puede utilizarse para medir el nivel de expresión o el nivel de función del componente del complejo SWI/SNF. En algunas modalidades, el componente es SNF5, ARID1A o ATRX.
Por ejemplo, el sujeto identificado puede tratarse con el tratamiento estándar de atención como se describe en las guías más actuales de la Red Nacional Integral del Cáncer (NCCN).
Por ejemplo, se obtiene una muestra de control a partir de un sujeto sano y normal. Alternativamente, se obtiene una muestra de control de un sujeto que no sufre, no ha sido diagnosticado o no tiene riesgo de desarrollar cáncer asociado con el complejo SWI/SNF.
Se describe en la presente un método para tratar o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto al determinar la capacidad de respuesta del sujeto a un inhibidor de EZH2 y administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor de EZH2 si el sujeto responde al inhibidor de EZH2 y el sujeto tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro y s Nc , cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, leucemia, linfoma, mieloma y/o sarcoma. La capacidad de respuesta de ese tipo se determina obteniendo una muestra del sujeto y detectando la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de función de SNF5, ARID1A y/o ATRX, y la presencia de la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de función indica que el sujeto es sensible al inhibidor de EZH2.
Sin estar unido a ninguna teoría, un compuesto descrito en la presente invención inhibe específicamente la metilación celular de H3K27 que conduce a la destrucción apoptótica selectiva de las células MRT mutantes SMARCB1. Por ejemplo, el tratamiento in vitro de las líneas celulares SMARCB1 -suprimidas con el Compuesto A indujeron fuertes efectos antiproliferativos con valores de IC50 en el intervalo de nM; mientras que las líneas celulares de control (tipo silvestre) mínimamente se afectaron (Figura 10C y tabla 6). Además, el compuesto descrito en la presente invención induce los genes de diferenciación neuronal, inhibición del ciclo celular y supresión tumoral, mientras que suprime la expresión de los genes de la vía hedgehog, MYC y EZH2. Por ejemplo, el tratamiento del Compuesto A de las células G401SMARCB1-suprimidas hasta 7 días indujeron fuertemente la expresión de CD133, DOCK4 y PTPRK e inhibidores del ciclo celular regulados corriente arriba CDKN1A y CDKN2A y el supresor tumoralB/N1, todo de una manera dependiente del tiempo (Figura 14B). Simultáneamente, la expresión de los genes de la vía hedgehog, MYCyEZH2 se redujeron. Debe notar que, las células G402SMARCB1-suprimidas expuestas al Compuesto A durante 14 días asumieron una morfología de tipo neuronal (Figura 14C).
En consecuencia con la presente, se describen los métodos para tratar o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto que lo necesita al (a) la determinar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores en una muestra obtenida del sujeto; (b) seleccionar un sujeto que tiene un nivel de expresión disminuido de al menos un gen en la etapa (a); y (c) administrar al sujeto seleccionado en la etapa (b) una cantidad eficaz de un compuesto descrito en la presente, tratando o aliviando, de este modo, un síntoma de cáncer en el sujeto.
En la presente se describen los métodos para tratar o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto que lo necesita al (a) determinar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de la histona metiltransferasa en un muestra obtenida del sujeto; (b) seleccionar un sujeto que tiene un nivel de expresión aumentado de al menos un gen en la etapa (a); y (c) administrar al sujeto seleccionado en la etapa (b) una cantidad eficaz de un compuesto descrito en la presente, tratando o aliviando, de este modo, un síntoma de cáncer en el sujeto.
Se proporcionan además en la presente invención los métodos para seleccionar una terapia contra el cáncer para un sujeto que lo necesite al (a) determinar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores en un muestra obtenida del sujeto, y (b) seleccionar una terapia contra el cáncer cuando el sujeto tiene un nivel de expresión disminuido de al menos un gen en la etapa (a), donde la terapia contra el cáncer incluye la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto descrito en la presente.
En la presente invención se describen los métodos para seleccionar una terapia contra el cáncer para un sujeto que la necesita al (a) determinar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de la histona metiltransferasa en una muestra obtenida a partir del sujeto, y (b) seleccionar una terapia contra el cáncer cuando el sujeto tiene un nivel de expresión incrementado de al menos un gen en la etapa (a), donde la terapia contra el cáncer incluye la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto descrito en la presente.
En ejemplos meramente ilustrativos, los métodos presentados en la descripción pueden incluir las etapas de (a) recoger un ácido nucleico o una muestra de proteína a partir de una muestra biológica obtenida de un sujeto, (b) medir el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores en la muestra, (c) medir el nivel de expresión del(de los) mismo(s) gen(es) en una muestra de control; (d) comparar el nivel de expresión del gen medido en la etapa (b) en la muestra de prueba con el nivel de expresión del gen medido en la etapa (c) en la muestra de control (o con un valor de referencia); (e) identificar al sujeto como candidato para el tratamiento cuando el nivel de expresión del componente medido en la etapa (b) se reduce en comparación con el nivel de expresión del gen medido en la etapa (c); y (f) administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EZH2 al sujeto identificado en la etapa (e) o seleccionar un régimen de tratamiento para el sujeto identificado en la etapa (e). El nivel de expresión del gen en la muestra del sujeto se reduce, por ejemplo, 10 %, 25 %, 50 % o 1-, 2-, 5- o más veces en comparación con el nivel de expresión del gen en la muestra de control.
En ejemplos meramente ilustrativos, los métodos presentados en la descripción pueden incluir las etapas de (a) recoger un ácido nucleico o una muestra de proteína de una muestra biológica obtenida de un sujeto, (b) medir el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de histona metiltransferasa en la muestra, (c) medir el nivel de expresión del mismo gen en una muestra de control; (d) comparar el nivel de expresión del gen medido en la etapa (b) en la muestra de prueba con el nivel de expresión del gen medido en la etapa (c) en la muestra de control (o con un valor de referencia); (e) identificar al sujeto como candidato para el tratamiento cuando el nivel de expresión del componente medido en la etapa (b) aumenta en comparación con el nivel de expresión del gen medido en la etapa (c); y (f) administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EZH2 al sujeto identificado en la etapa (e) o seleccionar un régimen de tratamiento para el sujeto identificado en la etapa (e). El nivel de expresión del gen en el sujeto de prueba se aumenta, por ejemplo, 10 %, 25 %, 50 % o 1-, 2-, 5- o más veces en comparación con el nivel de expresión del gen en la muestra de control.
El término "nivel de expresión" se refiere al nivel de proteína, ARN o ARNm de un gen particular de interés. Cualquier método conocido en la técnica puede utilizarse para determinar el nivel de expresión de un gen particular de interés. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, ensayos de transcripción inversa y amplificación (como PCR, RT-PCR de ligación o RT-PCT cuantitativa), ensayos de hibridación, transferencia de tipo Northern, transferencia de puntos, hibridación in situ, electroforesis en gel, electroforesis capilar, cromatografía en columna, inmunotransferencia de tipo Western, inmunohistoquímica, inmunotinción o espectrometría de masas. Los ensayos pueden realizarse directamente en muestras biológicas o en proteínas/ácidos nucleicos aislados a partir de las muestras. Es práctica habitual en la técnica relevante llevar a cabo estos ensayos. Por ejemplo, la etapa de medición en cualquier método descrito en la presente incluye poner en contacto la muestra de ácido nucleico a partir de la muestra biológica obtenida del sujeto con uno o más iniciadores que hibridan específicamente con el gen de interés presentado en la descripción. Alternativamente, la etapa de medición de cualquier método descrito en la presente incluye poner en contacto la muestra de proteína de la muestra biológica obtenida del sujeto con uno o más anticuerpos que se unen al biomarcador del interés presentado en la descripción.
Un nivel de expresión disminuido de un gen particular significa una disminución en su nivel de expresión en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, 1500 % o más en comparación con un valor de referencia o el nivel de expresión de este gen medido en una muestra diferente (o anterior) obtenida del mismo sujeto.
Un nivel de expresión aumentado de un gen particular significa un aumento en su nivel de expresión en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, 1500 % o más en comparación con un valor de referencia o el nivel de expresión de este gen medido en una muestra diferente (o anterior) obtenida del mismo sujeto.
Un "nivel/valor de referencia o de valores iniciales" como se usa en la presente descripción puede utilizarse indistintamente y está destinado a ser relativo a un número o valor derivado de los estudios poblacionales, que incluyen sin limitación, aquellos sujetos que tienen un intervalo de edad, estado de enfermedad similar (por ejemplo, etapa), sujetos en el mismo grupo étnico o similar, o con relación a la muestra inicial de un sujeto sometido a tratamiento para el cáncer. Dichos valores de referencia pueden derivarse de los análisis estadísticos y/ o datos de predicción de riesgo de poblaciones obtenidos a partir de algoritmos matemáticos e índices computados de cáncer. Los índices de referencia pueden construirse además y utilizar con el uso de algoritmos y otros métodos de clasificación estadística y estructural.
Se describe en la presente, el valor de referencia o de valores iniciales puede ser el nivel de expresión de un gen particular de interés en una muestra de control derivada de uno o más sujetos sanos o sujetos que no se han diagnosticado con ningún cáncer.
Se describe en la presente, el valor de referencia o de valores iniciales puede ser el nivel de expresión de un gen particular de interés en una muestra obtenida del mismo sujeto antes de cualquier tratamiento contra el cáncer. Se describe en la presente, el valor de referencia o de valores iniciales puede ser el nivel de expresión de un gen particular de interés en una muestra obtenida del mismo sujeto durante un tratamiento contra el cáncer. Alternativamente, el valor de referencia o de valores iniciales es una medición anterior del nivel de expresión de un gen particular de interés en una muestra obtenida previamente del mismo sujeto o de un sujeto que tiene un intervalo de edad, estado de la enfermedad similar (por ejemplo, etapa) al sujeto evaluado.
Se describe en la presente invención, una cantidad eficaz que puede significar una cantidad suficiente para aumentar el nivel de expresión de al menos un gen que disminuye en el sujeto antes del tratamiento o una cantidad suficiente para aliviar uno o más síntomas de cáncer. Por ejemplo, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para aumentar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, 1500 % o más en comparación con un valor de referencia o el nivel de expresión sin el tratamiento de ningún compuesto.
Se describe en la presente invención, una cantidad eficaz que puede significar una cantidad suficiente para disminuir el nivel de expresión de al menos un gen que se incrementa en el sujeto antes del tratamiento o una cantidad suficiente para aliviar uno o más síntomas de cáncer. Por ejemplo, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para disminuir el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la vía hedgehog, MYC y EZH2 en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, 1500 % o más en comparación con un valor de referencia o el nivel de expresión sin el tratamiento de ningún compuesto.
La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá de la talla y peso corporal del sujeto, y la salud; la naturaleza y extensión de la afección; y el método terapéutico seleccionado para la administración. Una cantidad eficaz para una situación dada puede determinarse por experimentación de rutina que está dentro de la experiencia y criterio del médico.
Se describe en la presente un método para determinar la eficacia de un tratamiento contra el cáncer en un sujeto que lo necesita al (a) medir el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores en una muestra obtenida del sujeto, (b) comparar el nivel de expresión de al menos un gen en la etapa (a) con un valor de referencia o una medición anterior, y (c) determinar la eficacia del tratamiento del cáncer basado en la etapa de comparación. Un tratamiento ilustrativo contra el cáncer es administrar un compuesto de la invención al sujeto evaluado.
El tratamiento es efectivo cuando el sujeto evaluado tiene una expresión aumentada de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores 1) en comparación con un valor de referencia o una medición anterior; o 2) durante el período de tiempo monitoreado, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más. Cuando el tratamiento existente no es efectivo, se debe buscar un nuevo tratamiento o una dosificación aumentada del tratamiento existente (por ejemplo, aumentar la dosis del compuesto administrado al sujeto) para el sujeto evaluado.
En la presente invención se describe un método para determinar la eficacia de un tratamiento contra el cáncer en un sujeto que lo necesita al (a) medir el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de histona metiltransferasa en un muestra obtenida a partir del sujeto, (b) comparar el nivel de expresión de al menos un gen en la etapa (a) con un valor de referencia o una medición anterior, y (c) determinar la eficacia del tratamiento del cáncer basado en la etapa de comparación. Un tratamiento ilustrativo contra el cáncer es administrar un inhibidor de EZH2 de la invención al sujeto evaluado.
Por ejemplo, el tratamiento es efectivo cuando el sujeto evaluado tiene una expresión disminuida de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de la histona metiltransferasa 1) en comparación con un valor de referencia o una medición anterior; o 2) durante el período de tiempo monitoreado, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más. Cuando el tratamiento existente no es efectivo, se debe buscar un nuevo tratamiento o una dosificación aumentada del tratamiento existente (por ejemplo, aumentar la dosis del compuesto administrado al sujeto) para el sujeto evaluado.
En cualquier método presentado en la presente, el cáncer es el sarcoma epitelioide.
Como se usa en la presente descripción, el término "capacidad de respuesta" es intercambiable con los términos "receptivo", "sensible" y "sensibilidad", y significa que un sujeto muestra respuestas terapéuticas cuando se administra un inhibidor de EZH, por ejemplo, células tumorales o tejidos tumorales del sujeto sufren apoptosis y/o necrosis, y/o muestran un crecimiento, división o proliferación reducidos. Este término significa además que un sujeto tendrá o tiene una mayor probabilidad, en relación con la población en general, de mostrar las respuestas terapéuticas cuando se administra un inhibidor de EZH, por ejemplo, las células tumorales o los tejidos tumorales del sujeto sufren apoptosis y/o necrosis, y/o muestran un crecimiento, división o proliferación reducidos.
Como se usa en la presente descripción, un "sujeto" es intercambiable con un "sujeto que lo necesita", los cuales se refieren a un sujeto que tiene un trastorno en el que la metilación de proteínas mediada por EZH2 desempeña un papel, o un sujeto que tiene un riesgo aumentado de desarrollar tal trastorno con relación a la población en general. Un sujeto que lo necesita puede ser un sujeto que tiene un trastorno asociado con el complejo SWI/SNF. Un sujeto que lo necesita puede tener una afección precancerosa. Preferentemente, un sujeto que lo necesita tiene cáncer. Un sujeto que lo necesita puede tener cáncer asociado con el complejo SWI/SNF. Un sujeto que lo necesita puede tener cáncer asociado con la pérdida de función en al menos un componente del complejo sW i/SNF. En un aspecto preferido, un sujeto que lo necesita tiene uno o más cánceres seleccionados del grupo que consiste en sarcoma epitelioide.
Como se usa en la presente descripción, un "sujeto" incluye un mamífero. El mamífero puede ser por ejemplo, un mamífero humano o no humano apropiado, tales como primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo, cabra, camello, oveja o un cerdo. El sujeto puede ser también un pájaro o ave. En una modalidad el mamífero es un ser humano. Un sujeto puede ser hombre o mujer.
Un sujeto que lo necesita puede ser uno que no haya sido diagnosticado o identificado previamente como que tiene cáncer o una afección precancerosa. Un sujeto que lo necesita puede ser uno que haya sido diagnosticado o identificado previamente como que tiene cáncer o una afección precancerosa. Un sujeto que lo necesita puede ser además uno que tenga (sufra de) cáncer o una afección precancerosa. Alternativamente, un sujeto que lo necesita puede ser uno que tiene el riesgo de desarrollar dicho trastorno en relación con la población en general (es decir, un sujeto que está predispuesto a desarrollar dicho trastorno con relación a la población en general).
Opcionalmente, un sujeto que lo necesita ya se ha sometido, se somete o se someterá a, al menos a una intervención terapéutica para el cáncer o afección precancerosa.
Un sujeto que lo necesita puede tener cáncer refractario en la terapia más reciente. "Cáncer refractario" significa cáncer que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser resistente al comienzo del tratamiento o puede convertirse en resistente durante el tratamiento. El cáncer refractario se denomina además cáncer resistente. En algunas modalidades, el sujeto que lo necesita tiene recurrencia del cáncer después de la remisión en la terapia más reciente. En algunas modalidades, el sujeto que lo necesita recibió y falló a todas las terapias efectivas conocidas para el tratamiento del cáncer. En algunas modalidades, el sujeto que lo necesita recibió al menos una terapia anterior.
Un sujeto es uno que tuvo, está teniendo o está predispuesto a desarrollar el sarcoma epitelioide.
Se describe en la presente invención, un sujeto que lo necesita puede tener un nivel de expresión disminuido de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de diferenciación neuronal, genes de inhibición del ciclo celular y genes supresores de tumores.
Se describe en la presente invención, un sujeto que lo necesita que puede tener un nivel de expresión incrementado de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes de la vía hedgehog, genes de la vía myc y genes de la histona metiltransferasa.
Se describe en la presente invención, un sujeto que lo necesita que puede tener pérdida de la función de al menos un componente/subunidad del complejo SWI/s Nf . Alternativamente, un sujeto que lo necesita tiene la expresión reducida o haploinsuficiencia de al menos un componente/subunidad del complejo SWI/SNF. En ciertas modalidades, un sujeto que lo necesita tiene pérdida de la función de la subunidad SNF5.
En cualquier método que se describe en la presente, un sujeto que lo necesita puede tener expresión reducida, haploinsuficiencia o pérdida de función de al menos un componente de señalización aguas abajo del complejo SWI/SNF. Dicho componente aguas abajo incluye, pero sin limitarse al, complejo Polycomb (PcG) y sus objetivos.
Como se usa en la presente descripción, el término "pérdida de función" se refiere a una función menor o nula de un producto génico/proteína en comparación con el tipo silvestre. La pérdida de función de un componente complejo SWI/SNF significa que el componente/subunidad o todo el complejo SWI/SNF tiene una función biológica menor o nula en comparación con el componente/subunidad de tipo silvestre o todo el complejo SWI/SNF, respectivamente. La pérdida de función puede ser causada por mecanismos transcripcionales, posteriores a la transcripción o posteriores a la traducción. Por ejemplo, la pérdida de función es causada por la mutación de pérdida de función resultante de una mutación puntual (por ejemplo, una sustitución, una mutación de aminoácidos o una mutación sin sentido), una inserción y/o una supresión en un polipéptido de un componente del complejo SWI/SNF o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de un componente del complejo SWI/SNF. Las mutaciones referidas en la presente descripción son mutaciones somáticas. El término "mutación somática" se refiere a una alteración perjudicial en al menos un alelo genético que no se encuentra en todas las células del cuerpo, sino que solo se encuentra en células aisladas. Como se usa en la presente descripción una característica de las mutaciones somáticas es que se restringen a tejidos particulares o incluso a partes de tejidos o células dentro de un tejido y no están presentes en todo el organismo que alberga los tejidos o células. El término "tipo silvestre" se refiere a un gen o producto genético que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural. Un gen de tipo silvestre es el que se observa con mayor frecuencia en una población y, de ese modo, se diseña arbitrariamente la forma "normal" o "de tipo silvestre" del gen.
En consecuencia, puede detectarse una mutación de pérdida de función o una expresión reducida con el uso de cualquier método adecuado disponible en la técnica. Por ejemplo, puede detectarse una mutación de pérdida de función midiendo la función biológica de un producto génico, como la actividad de remodelación de la cromatina dependiente de ATP del complejo SWI/SNF. Alternativamente, puede determinarse una mutación de pérdida de función detectando cualquier alternancia en una secuencia de ácido nucleico que codifique un componente del complejo SWI/SNF. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un componente del complejo SWI/SNF que tiene una mutación de pérdida de función puede detectarse mediante resecuenciación de genoma completo o resecuenciación de región objetivo (esta última conocida además como resecuenciación dirigida) con el uso de fuentes de ADN e iniciadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) adecuadamente seleccionados de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. El método típicamente y generalmente implica las etapas de purificación del ADN genómico, amplificación por PCR para amplificar la región de interés, secuenciación del ciclo, limpieza de la reacción de secuenciación, electroforesis capilar y/o análisis de datos. Alternativamente o además, el método puede incluir el uso de captura y/o secuenciación del a Dn genómico de región dirigida basada en microarreglos. Los estuches, reactivos y métodos para seleccionar los iniciadores de PCR apropiados y realizar una resecuenciación están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Applied Biosystems, Agilent y NimbleGen (Roche Diagnostics GmbH). Alternativamente o adicionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido SWI/SNF que tiene una mutación de pérdida de función puede detectarse con el uso de una transferencia de tipo Southern de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Opcionalmente, puede detectarse una mutación de pérdida de función midiendo la ausencia de la expresión de un polipéptido componente o midiendo la expresión del polipéptido componente mutante. La detección de la expresión del polipéptido (mutante) puede llevarse a cabo con cualquier inmunoensayo adecuado en la técnica, tal como el análisis de transferencia de tipo Western.
El ácido nucleico humano y la secuencia de aminoácidos de los componentes del complejo SWI/SNF se describieron previamente. Ver, por ejemplo, números de acceso GenBank NP_003064.2, NM_003073.3, NP_001007469.1 y NM_001007468.1 paraSNF5, números de acceso GenBank NM_000489.3, NP_000480.2, NM_138270.2, y NP_612114.1 para ATRX, números de acceso GenBank NP_006006.3, NM_006015.4, NP_624361.1, y NM_139135.2 para ARID1A.
El espectro de mutaciones somáticas hSNF5 en humanos se ha descrito además en Sevenet y otros, Human Molecular Genetics, 8: 2359-2368, 1999.
Un sujeto que lo necesita puede tener la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de SNF5. Por ejemplo, un sujeto puede comprender una supresión de SNF5 en el polipéptido SNF5 o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido SNF5.
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Un sujeto que lo necesita puede tener la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de ATRX. Por ejemplo, un sujeto puede comprender una mutación seleccionada del grupo que consiste en una sustitución de asparagina (N) por el residuo lisina (K) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 688 de la SEQ ID NO: 5 (K688N), y una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de metionina (M) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 366 de la SEQ ID NO: 5 (M366I).
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Un sujeto que lo necesita puede tener la expresión reducida, haploinsuficiencia y/o pérdida de la función de ARID1A. Por ejemplo, un sujeto puede comprender una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación sin sentido para el residuo de cisteína (C) tipo silvestre en la posición aminoacídica 884 de la SEQ ID NO: 11 (C884*), una sustitución de lisina (K) por el residuo de ácido glutámico (E) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 966 (E966K), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1411 de la SEQ ID NO: 11 (Q1411*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de fenilalanina (F) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1720 de la SEQ ID NO: 11 (F1720fs), una mutación de desplazamiento de marco después del residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1847 de la SEQ ID NO: 11 (G1847fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de cisteína (C) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1874 de la SEQ ID NO: 11 (C1874fs), una sustitución de ácido glutámico (E) por el residuo de ácido aspártico (D) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1957 (D1957E), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1430 de la SEQ ID NO: 11 (Q1430*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de arginina (R) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1721 de la SEQ ID NO: 11 (R1721fs), una sustitución de ácido glutámico (E) por el residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1255 (G1255E), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 284 de la SEQ ID NO: 11 (G284fs), una mutación sin sentido para el residuo de arginina (R) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1722 de la SEQ ID NO: 11 (R1722*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de metionina (M) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 274 de la SEQ ID NO: 11 (M274fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glicina (G) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1847 de la SEQ ID NO: 11 (G1847fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo P de tipo silvestre en la posición aminoacídica 559 de la SEQ ID NO: 11 (P559fs), una mutación sin sentido para el residuo de arginina (R) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1276 de la SEQ ID NO: 11 (R1276*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 2176 de la SEQ ID NO: 11 (Q2176fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de histidina (H) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 203 de la SEQ ID NO: 11 (H203fs), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de alanina (A) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 591 de la SEQ ID NO: 11 (A591fs), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 1322 de la SEQ ID NO: 11 (Q1322*), una mutación sin sentido para el residuo de serina (S) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 2264 de la SEQ ID NO: 11 (S2264*), una mutación sin sentido para el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 586 de la SEQ ID NO: 11 (Q586*), una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de glutamina (Q) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 548 de la SEQ ID NO: 11 (Q548fs), y una mutación de desplazamiento de marco en el residuo de asparagina (N) de tipo silvestre en la posición aminoacídica 756 de la SEQ ID NO: 11 (N756fs). "*" utilizado en la presente descripción se refiere a un codón de parada. "fs" utilizado en la presente descripción se refiere a un desplazamiento de marco.
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Se describe en la presente los métodos para inducir la diferenciación neuronal al poner en contacto una célula con un compuesto (es decir, un inhibidor de EZH2) de la invención. Por ejemplo, el compuesto está en una cantidad suficiente para aumentar la expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en CD133 (denominado además PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64 y GFAP.
El término "inducir diferenciación neuronal" como se usa en la presente descripción se refiere a hacer que una célula se desarrolle en una célula del linaje neuronal como resultado de un efecto directo o intencional sobre la célula.
Se describe en la presente los métodos para inducir la inhibición del ciclo celular al poner en contacto una célula con un compuesto de la invención. Por ejemplo, el compuesto está en una cantidad suficiente para aumentar la expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en CKDN1A, CDKN2A, MEN1, Ch Ek 1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, mlF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, mlTK, MAD2L2, FBXO5, ING4, y TRIM35.
El término "inducir la inhibición del ciclo celular" como se usa en la presente descripción se refiere a causar una acumulación o una detención en cualquier fase durante la división y/o duplicación celular.
En la presente se describen los métodos para inducir la supresión tumoral al poner en contacto una célula con un compuesto de la invención. Por ejemplo, el compuesto está en una cantidad suficiente para aumentar la expresión de BIN1 o cualquiera de los supresores tumorales.
El término "inducir la supresión tumoral" puede incluir, pero no se limita a, una reducción en el tamaño de un tumor, una reducción en el volumen del tumor, una disminución en el número de tumores, una disminución en el número de lesiones metastásicas en otros tejidos u órganos distantes desde el sitio del tumor primario, un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe solo el portador, un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población de sujetos no tratados, un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un medicamento que no es un compuesto de la presente invención, una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe solo el portador, una disminución en la tasa de crecimiento tumoral o una disminución en la tasa de recrecimiento tumoral.
Se describe en la presente los métodos para inhibir la señalización de hedgehog al poner en contacto una célula con un compuesto de la invención. Por ejemplo, el compuesto está en una cantidad suficiente para reducir la expresión de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, Sh H, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 y SMO.
La frase "inhibir la señalización de hedgehog" significa que la fuerza de la señalización de hedgehog (intensidad) con un tratamiento compuesto se reduce en al menos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, 1500 % o más en comparación con la fuerza de la señalización de hedgehog (intensidad) sin ningún tratamiento compuesto.
Se describe en la presente los métodos para inducir una expresión génica al poner en contacto una célula con un compuesto de la invención. Por ejemplo, el compuesto está en una cantidad suficiente para inducir diferenciación neuronal, inhibición del ciclo celular y/o supresión tumoral. Dicho gen se selecciona del grupo que consiste en CD133 (denominado además PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64, GFAP, CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, mlF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, mlTK, MAD2L2, FBXO5, ING4, TRIM35, BIN1 y cualquier supresor tumoral.
La frase "inducir una expresión génica" significa que el nivel de expresión de un gen particular de interés aumenta al menos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, 1500 %, o más en comparación con el nivel de expresión de este gen sin ningún tratamiento compuesto.
Se describe en la presente los métodos para inhibir una expresión génica que comprende poner en contacto una célula con un compuesto de la invención. Por ejemplo, el compuesto está en una cantidad suficiente para inhibir la señalización de hedgehog. Dicho gen es GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 o SMO.
La frase "inhibir una expresión génica" significa que el nivel de expresión de un gen particular de interés se reduce en al menos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, 1500 %, o más en comparación con el nivel de expresión de este gen sin ningún tratamiento compuesto.
La diferenciación neuronal, la inhibición del ciclo celular, la supresión tumoral y la inhibición de la señalización de hedgehog pueden determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica.
Como se usa en la presente descripción, una célula se refiere a cualquier célula que puede obtenerse y utilizarse mediante un método descrito en la presente invención. Por ejemplo, puede obtenerse una célula de un cultivo celular. Alternativamente, una célula puede aislarse de un sujeto. Una célula puede además referirse a una célula de un sujeto.
Una célula puede tener pérdida de función de SNF5, ARID1A, ATRX y/o un componente del complejo SWI/SNF. Preferentemente, una célula puede comprender una supresión de SNF5.
Una célula puede ser una célula cancerosa, donde el cánceres el sarcoma epitelioide.
Un cáncer que se va a tratar puede clasificarse de acuerdo con el sistema de clasificación TNM del Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC), donde al tumor (T) se le ha asignado una etapa de TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c o T4d; y donde a los ganglios linfáticos regionales (N) se les ha asignado una etapa de NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b o N3c; y donde a la metástasis distante (M) se le puede asignar una etapa de MX, M0 o M1. Un cáncer que se va a tratar puede clasificarse de acuerdo con una clasificación del Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC) como Etapa I, Etapa IIA, Etapa IIB, Etapa IIIA, Etapa IIIB, Etapa IIIC o Etapa IV. A un cáncer que se va a tratar se le puede asignar un grado de acuerdo con una clasificación de AJCC como Grado GX (por ejemplo, no se puede evaluar el grado), Grado 1, Grado 2, Grado 3 o Grado 4. Un cáncer que se va a tratar puede clasificarse de acuerdo con una clasificación patológica de AJCC (pN) de pNX, pN0, PN0 (I-), PN0(I+), PN0 (mol-), PN0(mol+), PN1, PN1 (mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b o pN3c.
Un cáncer que se va a tratar puede evaluarse mediante citometría de ADN, citometría de flujo o citometría de imagen. Un cáncer que se va a tratar puede tipificarse con 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de células en la etapa de síntesis de la división celular (por ejemplo, en la fase S de la división celular). Un cáncer que se va a tratar puede tipificarse como que tiene una fracción de fase S baja o una fracción de fase S alta.
Como se usa en la presente descripción, una "célula normal" es una célula que no puede clasificarse como parte de un "trastorno de proliferación celular". Una célula normal carece de un crecimiento irregular o anormal, o de ambos, que puede conducir al desarrollo de una afección o enfermedad no deseada. Preferentemente, una célula normal posee mecanismos de control del ciclo celular que funcionan normalmente.
Como se usa en la presente descripción, "poner en contacto a una célula" se refiere a un condición en la cual un compuesto u otra composición de la materia está en contacto directo con una célula o tejido, o está lo suficientemente próxima para inducir un efecto biológico deseado en una célula o tejido.
Como se usa en la presente descripción, "monoterapia" se refiere a la administración de un único compuesto activo o terapéutico a un sujeto que lo necesita. Preferentemente, la monoterapia implicará la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto activo. Por ejemplo, la monoterapia del cáncer con uno de los compuestos de la presente invención, o una sal, polimorfo, solvato, análogo o derivado farmacéuticamente aceptable de este, a un sujeto que necesita tratamiento de cáncer. La monoterapia puede contrastarse con la terapia de combinación, en la que se administra una combinación de múltiples compuestos activos, preferentemente con cada componente de la combinación presente en una cantidad terapéuticamente efectiva. En un aspecto, la monoterapia con un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, es más efectiva que la terapia de combinación para inducir un efecto biológico deseado.
Como se usa en la presente descripción, "que se trata" o "tratar" describe el manejo y cuidado de un paciente con el fin de combatir una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, para aliviar uno o más síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno, o para eliminar la enfermedad, afección o trastorno. El término "tratar" puede incluir además el tratamiento de una célula in vitro o un modelo animal.
Un compuesto descrito en la presente descripción, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, puede usarse además para prevenir una enfermedad, afección o trastorno, o usarse para identificar candidatos adecuados para tales propósitos. Como se usa en la presente descripción, "que previene" o "prevenir" describe la reducción o eliminación de la aparición de los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección o trastorno.
Como se usa en la presente descripción, el término "aliviar" pretende describir un proceso mediante el cual disminuye la gravedad de un signo o síntoma de un trastorno. Es importante destacar que un signo o síntoma puede aliviarse sin ser eliminado. En una modalidad preferida, la administración de composiciones farmacéuticas de la invención conduce a la eliminación de un signo o síntoma, sin embargo, no es necesaria la eliminación. Se espera que las dosificaciones efectivas disminuyan la gravedad de un signo o síntoma. Por ejemplo, un signo o síntoma de un trastorno tal como el cáncer, que puede ocurrir en múltiples ubicaciones, se alivia si la gravedad del cáncer disminuye en al menos una de las múltiples ubicaciones.
Como se usa en la presente descripción, el término "gravedad" pretende describir el potencial del cáncer para transformarse a partir de un estado precanceroso o benigno a un estado maligno. Adicional o alternativamente, la gravedad pretende describir una etapa de cáncer, por ejemplo, de acuerdo con el sistema TNM (aceptado por la Unión Internacional contra el Cáncer (UICc ) y el Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC)) o por otros métodos reconocidos en la técnica. La etapa del cáncer se refiere a la extensión o la gravedad del cáncer, basado en los factores tales como la ubicación del tumor primario, el tamaño del tumor, la cantidad de tumores y la afectación de los ganglios linfáticos (diseminación del cáncer a los ganglios linfáticos). Adicional o alternativamente, la gravedad pretende describir el grado del tumor mediante los métodos reconocidos por la técnica (ver, Instituto Nacional de Cáncer, www.cancer.gov). El grado tumoral es un sistema utilizado para clasificar las células cancerosas en términos de cuán anormales se observan bajo un microscopio y qué tan rápido es probable que el tumor crezca y se propague. Se consideran muchos factores al determinar el grado del tumor, que incluyen la estructura y el patrón de crecimiento de las células. Los factores específicos utilizados para determinar el grado del tumor varían con cada tipo de cáncer. La gravedad describe además un grado histológico, denominado también diferenciación, que se refiere a cuánto se parecen las células tumorales a las células normales del mismo tipo de tejido (ver, Instituto Nacional de Cáncer, www.cancer.gov). Además, la gravedad describe un grado nuclear, que se refiere al tamaño y la forma del núcleo en las células tumorales y el porcentaje de células tumorales que se están dividiendo (ver, Instituto Nacional de Cáncer, www.cancer.gov).
En la presente descripción, la gravedad describe el grado en qué un tumor ha secretado factores de crecimiento, ha degradado la matriz extracelular, se vasculariza, pierde adherencia a los tejidos yuxtapuestos o hace metástasis. Además, la gravedad describe el número de ubicaciones en las qué un tumor primario ha hecho metástasis. Finalmente, la gravedad incluye la dificultad de tratar tumores de diferentes tipos y ubicaciones. Por ejemplo, los tumores inoperables, los cánceres que tienen mayor acceso a múltiples sistemas corporales (tumores hematológicos e inmunológicos) y los que son más resistentes a los tratamientos tradicionales se consideran más graves. En estas situaciones, prolongar la esperanza de vida del sujeto y/o reducir el dolor, disminuir la proporción de células cancerosas o restringir las células a un sistema, y mejorar la etapa del cáncer/grado tumoral/grado histológico/grado nuclear se consideran que alivian un signo o síntoma del cáncer.
Como se usa en la presente descripción, el término "síntoma" se define como una indicación de enfermedad, dolencia, lesión o que algo no está bien en el cuerpo. Los síntomas se perciben o sienten por el individuo que experimenta el síntoma, pero es posible que otros no lo perciban fácilmente. Otros se definen como profesionales no sanitarios.
Como se usa en la presente descripción, el término "signo" se define además como una indicación de que algo no está bien en el cuerpo. Pero los signos se definen como cosas que puede ver un médico, una enfermera u otro profesional de la salud.
El cáncer es un grupo de enfermedades que pueden causar casi cualquier signo o síntoma. Los signos y síntomas dependerán de dónde esté el cáncer, el tamaño del cáncer y cuánto afecta a los órganos o estructuras cercanos. Si un cáncer se propaga (hace metástasis), pueden aparecer síntomas en diferentes partes del cuerpo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una reducción en el tamaño de un tumor. Una reducción en el tamaño de un tumor puede denominarse también "regresión tumoral". Preferentemente, después del tratamiento, el tamaño del tumor se reduce en un 5 % o más en relación con su tamaño antes del tratamiento; con mayor preferencia, el tamaño del tumor se reduce en un 10 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 20 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 30 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 40 % o más; incluso con mayor preferencia, se reduce en un 50 % o más; y con la máxima preferencia, se reduce en más del 75 % o más. El tamaño de un tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El tamaño de un tumor puede medirse como un diámetro del tumor.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una reducción en el volumen de tumor. Preferentemente, después del tratamiento, el volumen del tumor se reduce en un 5 % o más con relación a su tamaño antes del tratamiento; con mayor preferencia, el volumen del tumor se reduce en un 10 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 20 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 30 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 40 % o más; incluso con mayor preferencia, se reduce en un 50 % o más; y con la máxima preferencia, se reduce en más del 75 % o más. El volumen de tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible.
El tratamiento del cáncer produce una disminución en el número de tumores. Preferentemente, después del tratamiento, el número de tumores se reduce en un 5 % o más con relación al número antes del tratamiento; con mayor preferencia, el número de tumor se reduce en un 10 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 20 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 30 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 40 % o más; incluso con mayor preferencia, se reduce en un 50 % o más; y con la máxima preferencia, se reduce en más del 75 %. El número de tumores puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El número de tumores puede medirse contando los tumores visibles a simple vista o con un aumento específico. Preferentemente, el aumento especificado es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.
El tratamiento del cáncer puede provocar una disminución en el número de lesiones metastásicas en otros tejidos u órganos distantes del sitio del tumor primario. Preferentemente, después del tratamiento, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 5 % o más con relación al número antes del tratamiento; con mayor preferencia, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 10 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 20 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 30 % o más; con mayor preferencia, se reduce en un 40 % o más; incluso con mayor preferencia, se reduce en un 50 % o más; y con la máxima preferencia, se reduce en más del 75 %. El número de lesiones metastásicas puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El número lesiones metastásicas puede medirse contando los tumores visibles a simple vista o con un aumento específico. Preferentemente, el aumento especificado es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe solo el portador. Preferentemente, el tiempo promedio de supervivencia aumenta en más de 30 días; con mayor preferencia, en más de 60 días; con mayor preferencia, en más de 90 días; y con la máxima preferencia en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse, por ejemplo, calculando para una población, la duración promedio de supervivencia después del inicio del tratamiento con un compuesto activo. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse además, por ejemplo, calculando para una población, la duración promedio de supervivencia a continuación del completamiento de la primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
Tratar un cáncer resulta en un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población de sujetos no tratados. Preferentemente, el tiempo promedio de supervivencia aumenta en más de 30 días; con mayor preferencia, en más de 60 días; con mayor preferencia, en más de 90 días; y con la máxima preferencia en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse, por ejemplo, calculando para una población, la duración promedio de supervivencia después del inicio del tratamiento con un compuesto activo. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse además, por ejemplo, calculando para una población, la duración promedio de supervivencia a continuación del completamiento de la primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo, solvato, análogo o derivado farmacéuticamente aceptable de este. Preferentemente, el tiempo promedio de supervivencia aumenta en más de 30 días; con mayor preferencia, en más de 60 días; con mayor preferencia, en más de 90 días; y con la máxima preferencia en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse, por ejemplo, calculando para una población, la duración promedio de supervivencia después del inicio del tratamiento con un compuesto activo. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse además, por ejemplo, calculando para una población, la duración promedio de supervivencia a continuación del completamiento de la primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución de la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe solo el portador. El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución de la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población sin tratar. El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en la tasa de mortalidad aumento de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo, o solvato farmacéuticamente aceptable de este. Preferentemente, la tasa de mortalidad disminuye en más del 2 %; con mayor preferencia, en más del 5 %; con mayor preferencia, en más del 10 %; y con la máxima preferencia, en más del 25 %. Una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados puede medirse por cualquier medio reproducible. Una disminución de la tasa de mortalidad de una población puede medirse, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo después del inicio del tratamiento con un compuesto activo. Una disminución de la tasa de mortalidad de una población puede medirse, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo después de una primera ronda del tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede provocar una disminución en la tasa de crecimiento tumoral. Preferentemente, después del tratamiento, la tasa de crecimiento tumoral se reduce en al menos un 5 % con respecto al número antes del tratamiento; con mayor preferencia, la tasa de crecimiento tumoral se reduce en al menos en un 10 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 20 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 30 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos en un 40 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos en un 50 %; incluso con mayor preferencia, se reduce en al menos en un 50 %; y con la máxima preferencia, se reduce en al menos en un 75 %. La tasa de crecimiento del tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. En un aspecto preferido, la tasa de crecimiento del tumor se mide de acuerdo con un cambio en el diámetro del tumor por unidad de tiempo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en el recrecimiento tumoral. Preferentemente, después del tratamiento, el recrecimiento tumoral es menos que el 5 %; con mayor preferencia, el recrecimiento tumoral es menos que el 10 %; con mayor preferencia, es menos que el 20 %; con mayor preferencia, es menor que el 30 %; con mayor preferencia, es menos que el 40 %; con mayor preferencia, es menos que el 50 %; incluso con mayor preferencia, es menos que el 50 %; y con la máxima preferencia, es menos que el 75 %. La tasa de recrecimiento del tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El recrecimiento tumoral se mide, por ejemplo, midiendo un aumento en el diámetro de un tumor después de un encogimiento tumoral previo que siguió al tratamiento. Una disminución en el recrecimiento del tumor se indica por la incapacidad de los tumores de reaparecer después de que el tratamiento se ha detenido.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una reducción en la tasa de proliferación celular. Preferentemente, después del tratamiento, la tasa de proliferación celular se reduce en al menos en un 5 %; con mayor preferencia, en al menos 10 %; con mayor preferencia, en al menos en un 20 %; con mayor preferencia, en al menos 30 %; con mayor preferencia, en al menos 40 %; con mayor preferencia, en al menos 50 %; incluso con mayor preferencia, en al menos 50 %; y con la máxima preferencia, en al menos 75 %. La tasa de proliferación celular puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. En un aspecto preferido, la tasa de proliferación celular se mide, por ejemplo, midiendo el número de células divididas en una muestra de tejido por unidad de tiempo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una reducción en la proporción de células que proliferan. Preferentemente, después del tratamiento, la proporción de células que proliferan se reduce en al menos 5 %; con mayor preferencia, en al menos 10 %; con mayor preferencia, en al menos 20 %; con mayor preferencia, en al menos 30 %; con mayor preferencia, en al menos 40 %; con mayor preferencia, en al menos 50 %; incluso con mayor preferencia, en al menos 50 %; y con la máxima preferencia, en al menos 75 %. La proporción de células que proliferan puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. En un aspecto preferido, la proporción de las células que proliferan se mide, por ejemplo, cuantificando el número de células divididas en relación con el número de células no divididas en una muestra de tejido. En otro aspecto preferido, la proporción de las células que proliferan es equivalente al índice mitótico.
El tratamiento del cáncer puede provocar una disminución del tamaño de un área o zona de proliferación celular. Preferentemente, después del tratamiento, el tamaño de un área o zona de proliferación celular se reduce en al menos 5 % con relación a su tamaño antes del tratamiento; con mayor preferencia, se reduce en al menos 10 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 20 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 30 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 40 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 50 %; incluso con mayor preferencia, se reduce en al menos 50 %; y con la máxima preferencia, se reduce en al menos 75 %. El tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. En un aspecto preferido, el tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse como un diámetro o ancho de un área o zona de proliferación celular.
El tratamiento del cáncer puede provocar una disminución en el número o la proporción de células que tienen una apariencia o morfología anormales. Preferentemente, después del tratamiento, el número de células que tienen una morfología anormal se reduce en al menos 5 % con relación a su tamaño antes del tratamiento; con mayor preferencia, se reduce en al menos 10 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 20 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 30 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 40 %; con mayor preferencia, se reduce en al menos 50 %; incluso con mayor preferencia, se reduce en al menos 50 %; y con la máxima preferencia, se reduce en al menos 75 %. Una apariencia celular o morfología anormal puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. Una morfología celular anormal puede medirse por microscopía, por ejemplo, utilizando un microscopio invertido de cultivo de tejidos. Una morfología celular anormal puede tomar la forma de pleiomorfismo nuclear.
El tratamiento del cáncer puede provocar la muerte celular, y preferentemente, la muerte celular da como resultado una disminución de al menos 10 % en el número de células en una población. Con mayor preferencia, muerte celular significa una disminución de al menos 20 %; con mayor preferencia, una disminución de al menos 30 %; con mayor preferencia, una disminución de al menos 40 %; con mayor preferencia, una disminución de al menos 50 %; con la máxima preferencia, una disminución de al menos 75 %. El número de células en una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse una cantidad de células en una población mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), microscopía de inmunofluorescencia y microscopía óptica. Los métodos para medir la muerte celular son los que se muestran en Li y otros, Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5): 2674-8, 2003. En un aspecto, la muerte celular ocurre por apoptosis.
Como se usa en la presente descripción, el término "selectivamente" significa que tiende a ocurrir con mayor frecuencia en una población que en otra población. Las poblaciones comparadas pueden ser poblaciones celulares. Preferentemente, un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, actúa selectivamente en una célula cancerosa o precancerosa pero no en una célula normal. Preferentemente, un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, actúa selectivamente para modular un objetivo molecular (por ejemplo, una proteína objetivo de metiltransferasa) pero no modula significativamente otra diana molecular (por ejemplo, una proteína no objetivo de metiltransferasa). La invención proporciona además un método para inhibir selectivamente la actividad de una enzima, tal como una proteína de metiltransferasa. Preferentemente, un evento ocurre selectivamente en la población A con relación a la población B si ocurre más de dos veces más frecuentemente en la población A en comparación con la población B. Un evento ocurre selectivamente si ocurre más de cinco veces más frecuentemente en la población A. Un evento ocurre selectivamente si ocurre más de diez veces más frecuentemente en la población A; con mayor preferencia, más de cincuenta veces; incluso con mayor preferencia, más de 100 veces; y con la máxima preferencia, más de 1000 veces más frecuentemente en la población A en comparación con la población B. Por ejemplo, puede decirse que la muerte celular ocurre selectivamente en las células cancerosas si ocurre con más del doble de frecuencia en las células cancerosas en comparación con las células normales.
Un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, puede modular la actividad de un objetivo molecular (por ejemplo, una proteína objetivo de metiltransferasa). La modulación se refiere a estimular o inhibir una actividad de un objetivo molecular. Por ejemplo, un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, modula la actividad de un objetivo molecular si estimula o inhibe la actividad del objetivo molecular en al menos 2 veces con respecto a la actividad del molecular objetivo bajo las mismas condiciones pero sin la presencia de dicho compuesto. Por ejemplo, un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, modula la actividad de un objetivo molecular si estimula o inhibe la actividad del objetivo molecular en al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces con respecto a la actividad del molecular objetivo bajo las mismas condiciones pero solo sin la presencia de dicho compuesto. La actividad de un objetivo molecular puede medirse por cualquier medio reproducible. La actividad de un objetivo molecular puede medirse in vitro o in vivo. Por ejemplo, la actividad de un objetivo molecular puede medirse in vitro mediante un ensayo de actividad enzimática o un ensayo de unión de ADN, o puede medirse la actividad de un objetivo molecular in vivo analizando la expresión de un gen reportero.
Un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, no modula significativamente la actividad de un objetivo molecular si la adición del compuesto no estimula o inhibe la actividad del objetivo molecular en al menos 10 % con respecto a la actividad del molecular objetivo bajo las mismas condiciones pero solo sin la presencia de dicho compuesto.
Como se usa en la presente descripción, el término "selectivo a isoenzimas" significa la inhibición o estimulación preferencial de una primera isoforma de una enzima en comparación con una segunda isoforma de una enzima (por ejemplo, inhibición o estimulación preferencial de una isoenzima alfa de la proteína metiltransferasa en comparación con una isozima beta de la proteína metiltransferasa). Preferentemente, un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, demuestra un mínimo de un diferencial de cuatro veces, preferentemente un diferencial de diez veces, con mayor preferencia un diferencial de cincuenta veces, en la dosis requerida para lograr un efecto biológico. Preferentemente, un compuesto de la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, demuestra este diferencial a través del intervalo de inhibición, y el diferencial se ejemplifica en el IC50 , es decir, una inhibición del 50 %, para un objetivo molecular de interés.
La administración de un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, a una célula o a un sujeto que lo necesita puede dar como resultado una modulación (es decir, estimulación o inhibición) de una actividad de una proteína metiltransferasa de interés.
La detección de la metilación de H3-K27, la formación de H3-K27 trimetilado, la conversión de H3-K27 monometilado a H3-K27 dimetilado, o la conversión de H3-K27 dimetilado a H3-K27 trimetilado pueden realizarse con el uso de cualquier método adecuado. Pueden encontrarse métodos ejemplares en el documento de patenteUS20120071418.
La administración de un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, a una célula o un sujeto que lo necesita da como resultado una modulación (es decir, estimulación o inhibición) de una actividad de un objetivo intracelular (por ejemplo, sustrato). Pueden modularse varios objetivos intracelulares con los compuestos de la presente invención, que incluyen, pero no se limitan a, la proteína metiltrasferasa.
Por ejemplo, una cantidad eficaz de un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, no es significativamente citotóxico para las células normales. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto no es significativamente citotóxica para las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente efectiva no induce la muerte celular en más del 1 0 % de las células normales. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto no afecta significativamente la viabilidad de las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente efectiva no induce la muerte celular en más del 10 % de las células normales. En un aspecto, la muerte celular ocurre por apoptosis.
Poner en contacto una célula con un compuesto descrito en la presente descripción, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, puede selectivamente inducir o activarla muerte celular en células cancerosas. La administración de un compuesto que se describe en la presente o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, a un sujeto que lo necesita, puede selectivamente inducir o activar la muerte celular en células cancerosas. Poner en contacto una célula con un compuesto que se describe en la presente invención, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, puede selectivamente inducir la muerte celular en una o más células afectadas por un trastorno proliferativo celular. Preferentemente, administrar a un sujeto que lo necesita un compuesto que se describe en la presente descripción, o una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este, induce selectivamente la muerte celular en una o más células afectadas por un trastorno proliferativo celular.
Un experto en la técnica puede referirse a los textos de referencia generales para las descripciones detalladas de técnicas conocidas discutidas en la presente descripción o técnicas equivalentes. Estos textos incluyen Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005);Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ra edición), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2000); Coligan y otros, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY. Enna y otros, Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, NY.Fingl y otros, The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975),Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18a edición (1990). Por supuesto, pueden referirse a estos textos al hacer o con el uso de un aspecto de la invención.
El compuesto que puede utilizarse en cualquiera de los métodos presentados en la descripción es:
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(Compuesto A),
sus estereoisómeros, o su sal o solvato farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos que se describen en la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los compuestos que tienen la Fórmula (VII) pueden sintetizarse de acuerdo con el método descrito en los documentos de patente WO 2011/140325;WO 2011/140324; y WO 2012/005805.
Como se usa en la presente descripción, "alquilo", "Ci, C2, C3, C4, C5o C6 alquilo "o" Ci-C6 alquilo" pretende incluir grupos hidrocarbonados C1, C2, C3, C4, C5o C6alifáticos saturados de cadena lineal (lineal) y grupos hidrocarbonados C3, C4, C5 o C6 alifáticos saturados de cadenas ramificadas. Por ejemplo, C1-C6 alquilo pretende incluir los grupos Ci, C2 , C3 , C4 , C5 y C6 alquilo. Los ejemplos de alquilo incluyen, porciones que tienen de uno a seis átomos de carbono, tales como, pero sin limitarse a, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, n-pentilo, s-pentilo o n-hexilo.
En ciertas modalidades, un alquilo de cadena lineal o ramificada tiene seis o menos átomos de carbono (es decir, C1-C6 para cadena lineal, C3-C6 para cadena ramificada), y en otra modalidad, un alquilo de cadena lineal o ramificada tiene cuatro o menos átomos de carbono.
Como se usa en la presente descripción, el término "cicloalquilo" se refiere a un sistema de uno o varios anillos de hidrocarburo no aromático saturado o insaturado (por ejemplo, anillos fusionados, puenteados o espiro) que tiene de 3 a 30 átomos de carbono (por ejemplo, C3-C10). Los ejemplos de cicloalquilos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, y adamantilo. El término "heterocicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico no aromático saturado o insaturado de 3-8 miembros, bicíclico de 7-12 miembros (anillos fusionados, puenteados o espiro), o tricíclico de 11-14 miembros (anillos fusionados, puenteados o espiro) que tiene uno o más heteroátomos (tales como O, N, S o Se), a menos que se especifique de cualquier otra manera. Ejemplos de grupos heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, tetrahidrofuranilo, isoindolinilo, indolinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, triazolidinilo, tetrahirofuranilo, oxiranilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, piranilo, morfolinilo, 1,4-diazepanilo, 1,4-oxazepanilo, 2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptanilo, 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptanilo, 2-oxa-6-azaspiro[3.3]heptanilo, 2,6-diazaspiro[3.3]heptanilo, 1,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]decanilo y similares.
El término "alquilo opcionalmente sustituido" se refiere a alquilo o alquilo no sustituido que tiene sustituyentes designados que reemplazan uno o más átomos de hidrógeno en uno o más carbonos de la cadena principal de hidrocarburos. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o una porción aromática o heteroaromática.
Una porción "arilalquilo" o una "aralquilo" es un alquilo sustituido con un arilo (por ejemplo, fenilmetilo (bencilo)). Una porción "alquilarilo" es un arilo sustituido con un alquilo (por ejemplo, metilfenilo).
Como se usa en la presente descripción, "enlazador de alquilo" pretende incluir grupos hidrocarbonados C1, C2 , C3 , C4 , C5o C6alifáticos divalentes saturados de cadena lineal (lineal) y grupos hidrocarbonados C3 , C4 , C5o C6alifáticos saturados ramificados. Por ejemplo, enlazador C1-Caalquilo pretende incluir grupos enlazadores C1 , C2 , C3 , C4 , C5y C6alquilo. Los ejemplos de enlazador de alquilo incluyen, porciones que tienen de uno a seis átomos de carbono, tales como, pero sin limitarse a, metilo (-CH2-), etilo (-CH2CH2-), n-propilo (-CH2CH2CH2-), i-propilo (-CHCH3CH2-), n-butilo (-CH2CH2CH2CH2-), s-butilo (-CHCH3CH2CH2-), i-butilo (-C(CH3 )2CH2-), n-pentilo (-CH2CH2CH2CH2CH2-), s-pentilo (-CHCH3CH2CH2CH2-) o n-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-).
"Alquenilo" incluye a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble o triple, respectivamente. Por ejemplo, el término "alquenilo" incluye grupos alquenilo de cadena lineal (por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo) y grupos alquenilo ramificados. En ciertas modalidades, un grupo alquenilo de cadena lineal o ramificada tiene seis o menos átomos de carbono en su cadena principal (es decir, C2-C6 para cadena lineal, C3-C6 para cadena ramificada). El término "C2-C6" incluye grupos alquenilo que contienen de dos a seis átomos de carbono. El término "C3-C6" incluye grupos alquenilo que contienen de tres a seis átomos de carbono.
El término "alquenilo opcionalmente sustituido" se refiere a alquenilo o alquenilo no sustituido que tienen sustituyentes designados que reemplazan uno o más átomos de hidrógeno en uno o más átomos de carbono de la cadena principal de hidrocarburos. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, heterociclilo, alquilarilo o una porción aromática o heteroaromática.
"Alquinilo" incluye a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace triple. Por ejemplo, "alquinilo" incluye grupos alquinilo de cadena lineal (por ejemplo, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo, octinilo, noninilo, decinilo) y grupos alquinilo ramificados. En ciertas modalidades, un grupo alquinilo de cadena lineal o ramificada tiene seis o menos átomos de carbono en su cadena principal (es decir, C2-C6 para cadena lineal, C3-C6 para cadena ramificada). El término "C2-C6" incluye grupos alquinilo que contienen de dos a seis átomos de carbono. El término "C3-C6" incluye grupos alquinilo que contienen de tres a seis átomos de carbono.
El término "alquinilo opcionalmente sustituido" se refiere a alquinilo o alquinilo no sustituido que tienen sustituyentes designados que reemplazan uno o más átomos de hidrógeno en uno o más átomos de carbono de la cadena principal de hidrocarburos. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o una porción aromática o heteroaromática.
Otras porciones opcionalmente sustituidas (tales como cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos) incluyen tanto las porciones no sustituidas como las porciones que tienen uno o más de los sustituyentes designados. Por ejemplo, el heterocicloalquilo sustituido incluye aquellos sustituidos con uno o más grupos alquilo, tales como 2,2,6,6-tetrametil-piperidinilo y 2,2,6,6-tetrametil-1,2,3,6-tetrahidropiridinilo.
"Arilo" incluye los grupos con aromaticidad, que incluyen los sistemas "conjugados" o multicíclicos con al menos un anillo aromático y no contiene ningún heteroátomo en la estructura del anillo. Los ejemplos incluyen fenilo, bencilo, 1,2,3,4-tetrahidronaftalenilo, etc.
Los grupos "heteroarilo" son grupos arilo, como se definió anteriormente, excepto que tienen de uno a cuatro heteroátomos en la estructura del anillo, y pueden denominarse además "heterociclos arilo" o "heteroaromáticos." Como se usa en la presente descripción, el término "heteroarilo" pretende incluir un anillo monocíclico estable de 5-, 6- o 7-miembros o heterocíclico aromático bicíclico de 7-, 8-, 9-, 10-, 11- o 12-miembros que consiste en átomos de carbono y uno o más heteroátomos, por ejemplo, 1 o 1-2 o 1-3 o 1-4 o 1-5 o 1-6 heteroátomos, o es decir, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 heteroátomos, seleccionados independientemente del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. El átomo de nitrógeno puede sustituirse o no sustituirse (es decir, N o NR en donde R es H u otros sustituyentes como definidos en la presente descripción). Los heteroátomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden estar oxidados (es decir, N ^O y S(O)p, donde p = 1 o 2). Vale la pena señalar que el número total de átomos de S y O de un heterociclo aromático no es más de 1.
Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, tiazol, isotiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina y similares.
Además, los términos "arilo" y "heteroarilo" incluyen grupos arilo y heteroarilo multicíclicos, por ejemplo, tricíclico, bicíclico, por ejemplo, naftaleno, benzoxazol, benzodioxazol, benzotiazol, benzoimidazol, benzotiofeno, metilendioxifenilo, quinolina, isoquinolina, naftridina, indol, benzofurano, purina, benzofurano, deazapurina, indolizina.
En el caso de los anillos aromáticos multicíclicos, solo uno de los anillos debe ser aromático (es decir, 2,3-dihidroindol), aunque todos los anillos pueden ser aromáticos (por ejemplo, quinolina). El segundo anillo también puede fusionarse o unirse a través de puente.
El anillo cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo puede sustituirse en una o más posiciones del anillo (por ejemplo, el carbono o heteroátomo formador de anillo tal como N) con tales sustituyentes como se describió anteriormente, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonil, alquilaminocarbonil, aralquilaminocarbonil, alquenilaminocarbonil, alquilcarbonil, arilcarbonil, aralquilcarbonil, alquenilcarbonil, alcoxicarbonil, aminocarbonil, alquiltiocarbonil, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluyen alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluyen alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometil, ciano, azido, eterocíclico, alquilarilo, o una porción aromática o heteroaromática. Los grupos arilo y heteroarilo pueden fusionarse o unirse además con anillos alicíclicos o heterocíclicos, que no son aromáticos para formar un sistema multicíclico (por ejemplo, tetralina, metilendioxifenilo).
Como se usa en la presente descripción, "carbociclo" o "anillo carbocíclico" pretende incluir cualquier anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico estable que tenga el número especificado de carbonos, cualquiera de los cuales puede ser saturado, insaturado o aromático. El carbociclo incluye cicloalquilo y arilo. Por ejemplo, un carbociclo de Ca-C-Mpretende incluir un anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico que tiene 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 átomos de carbono. Los ejemplos de carbociclos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclobutenilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, cicloheptenilo, cicloheptilo, cicloheptenilo, adamantilo, ciclooctilo, ciclooctenilo, ciclooctadienilo, fluorenilo, fenilo, naftilo, indanilo, adamantilo y tetrahidronaftilo. Los anillos unidos a través de puentes también se incluyen en la definición de carbociclo, que incluye, por ejemplo, [3.3.0]biciclooctano, [4.3.0]biciclononano, [4.4.0]biciclodecano y [2.2.2]biciclooctano. Un anillo unido a través de puente ocurre cuando uno o más átomos de carbono unen dos átomos de carbono no adyacentes. En una modalidad, los anillos de puentes son uno o dos átomos de carbono. Es de señalar que un puente siempre convierte un anillo monocíclico en un anillo tricíclico. Cuando se une un anillo a través de puentes, los sustituyentes enumerados para el anillo también pueden estar presentes en el puente. Anillos fusionados (por ejemplo, naftilo, tetrahidronaftilo) y espiro anillos también se incluyen.
Como se usa en la presente descripción, "heterociclo" o "grupo heterocíclico" incluye cualquier estructura de anillo (saturada, insaturada o aromática) que contiene al menos un heteroátomo del anillo (es decir, N, O o S). Heterociclo incluye heterocicloalquilo y heteroarilo. Los ejemplos de heterociclos incluyen, pero no se limitan a, morfolina, pirrolidina, tetrahidrotiofeno, piperidina, piperazina, oxetano, pirano, tetrahidropirano, azetidina y tetrahidrofurano.
Los ejemplos del compuesto heterocíclico incluyen, pero no se limitan a: acridinilo, azocinilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, benzoxazolinilo, benzotiazolilo, benzotriazolilo, benzotetrazolilo, benzoisoxazolilo, benzoisotiazolilo, benzoimidazolinilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, carbolinil, cromanilo, cromenilo, cinnolinil, decahidroquinolinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, dihidrofuro[2,3-£)]tetrahidrofuranilo, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, 1H-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, 3H-indolilo, isatioilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, metilenedioxifenilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1.3.4- oxadiazolilo, 1,2,4,- oxadiazol5(4)-ona, oxazolidinilo, oxazolilo, oxindolilo, pirimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenazinila, fenotiazinila, fenoxatinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, piperidonilo, 4-piperidonilo, piperonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo,pirrolidinilo, pirrolinilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrazolilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienooxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo, triazinilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,2,5-triazolilo, 1.3.4- triazolilo y xantenilo.
El término "sustituido," como se usa en la presente descripción, significa que uno o más hidrógenos en el átomo designado se reemplaza con una selección del grupo indicado, siempre que la valencia normal del átomo designado no se exceda, y que la sustitución resulte en un compuesto estable. Cuando un sustituyente es oxo o ceto (es decir, =O), entonces se reemplazan 2 átomos de hidrógeno en el átomo. Los sustituyentes ceto no están presentes en las porciones aromáticas. Los dobles enlaces del anillo, como se usan en la presente descripción, son enlaces dobles que se forman entre dos átomos del anillo adyacentes (por ejemplo, C=C, C=N o N=N). "Compuesto estable" y "estructura estable" significan que indican un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento en un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y la formulación en un agente terapéutico eficaz.
Cuando se muestra que un enlace a un sustituyente cruza un enlace que conecta dos átomos en un anillo, entonces dicho sustituyente puede estar unido a cualquier átomo en el anillo. Cuando se enumera un sustituyente sin indicar el átomo a través del cual dicho sustituyente está unido al resto del compuesto de una fórmula dada, entonces dicho sustituyente puede estar unido a través de cualquier átomo en dicha fórmula. Las combinaciones de sustituyentes y/o variables son permisibles solo si tales combinaciones dan como resultado compuestos estables.
Cuando cualquier variable es decir, R1), aparece más de una vez en cualquier constituyente o fórmula para un compuesto, su definición en cada aparición es independiente de su definición en cada otra aparición. Así, por ejemplo, si se muestra que un grupo se sustituye con 0 - 2 porciones de R1 , entonces el grupo puede sustituirse opcionalmente con hasta dos porciones R1 y R1 en cada aparición se selecciona independientemente de la definición de R1. Además, las combinaciones de sustituyentes y/o variables son permisibles, solo si tales combinaciones dan como resultado compuestos estables.
El término "hidroxi" o "hidroxilo" incluye grupos con un -OH u -O'.
Como se usa en la presente descripción, los términos "halógeno" o "halo" se refieren a flúor, cloro, bromo y yodo. El término "perhalogenado" se refiere generalmente a una porción en donde todos los átomos de hidrógeno se reemplazan por átomos de halógeno. El término "haloalquilo" o "haloalcoxilo" se refiere a un alquilo o alcoxilo sustituido con uno o más átomos de halógeno.
El término "carbonilo" incluye compuestos y porciones que contienen un carbono conectado con un doble enlace a un átomo de oxígeno. Los ejemplos de porciones que contienen un carbonilo incluyen, pero no se limitan a, aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos, amidas, ésteres, anhídridos, etc.
El término "carboxilo" se refiere a -COOH o su éster CrCaalquilo.
"Acilo" incluye las porciones que contienen el radical acilo (R-C(O)-) o un grupo carbonilo. "Acilo sustituido" incluye los grupos acilo donde se reemplazan uno o más de los átomos de hidrógeno, por ejemplo, grupos alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o una porción aromática o heteroaromática.
"Aroilo" incluye las porciones con una porción arilo o heteroaromático unido a un grupo carbonilo. Los ejemplos de grupos aroilo incluyen fenilcarboxi, naftilo carboxi, etc.
"Alcoxialquilo", "alquilaminoalquilo" y "tioalcoxialquilo" incluyen los grupos alquilo, como se describió anteriormente, en donde los átomos de oxígeno, nitrógeno o azufre reemplazan uno o más átomos de carbono de la cadena principal de hidrocarburos.
El término "alcoxi" o "alcoxilo" incluyen los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos y no sustituidos unidos covalentemente a un átomo de oxígeno. Los ejemplos de grupos alcoxi o radicales alcoxilo incluyen, pero sin limitarse a, grupos metoxi, etoxi, isopropiloxi, propoxi, butoxi y pentoxi. Los ejemplos de grupos alcoxi sustituidos incluyen grupos alcoxi halogenados. Los grupos alcoxi puede sustituirse con grupos tales como, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o una porción aromática o heteroaromática. Los ejemplos de grupos alcoxi sustituidos con halógeno incluyen, pero no se limitan a, fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, clorometoxi, diclorometoxi y triclorometoxi.
El término "éter" o "alcoxi" incluye los compuestos o porciones que contienen un oxígeno unido a dos átomos o heteroátomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye "alcoxialquilo", que se refiere a un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido covalentemente a un átomo de oxígeno que está unido covalentemente a un grupo alquilo.
El término "éster" incluye los compuestos o porciones que contienen un carbono o un heteroátomo unido a un átomo de oxígeno que está unido al carbono de un grupo carbonilo. El término "éster" incluye los grupos alcoxicarboxilo tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, butoxicarbonilo, pentoxicarbonilo, etc.
El término "tioalquilo" incluye los compuestos o porciones que contienen un grupo alquilo conectado con un átomo de azufre. Los grupos tioalquilo pueden sustituirse con grupos tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, carboxiácido, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, amino (que incluyen alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, azido, heterociclilo, alquilarilo o porciones aromáticas o heteroaromáticas.
El término "tiocarbonilo" o "tiocarboxi" incluye compuestos y porciones que contienen un carbono conectado con un doble enlace a un átomo de azufre.
El término "tioéter" incluye las porciones que contienen un azufre unido a dos átomos o heteroátomos de carbono. Los ejemplos de tioéteres incluyen, pero no se limitan a alcatioalquilos, alquioalquenilos y alcatioalquinilos. El término "alcatioalquilos" incluye las porciones con un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido a un átomo de azufre que está unido a un grupo alquilo. De manera similar, el término "alcatioalquenilos" se refiere a las porciones en donde un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está unido a un átomo de azufre que está unido covalentemente a un grupo alquenilo; y alcatioalquinilos" se refiere a las porciones en donde un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está unido a un átomo de azufre que está unido covalentemente a un grupo alquinilo.
Como se usa en la presente descripción, "amina" o "amino" se refiere a -NH2no sustituido o sustituido. "Alquilamino" incluye grupos de compuestos en donde el nitrógeno de -NH2está unido al menos a un grupo alquilo. Los ejemplos de grupos alquilamino incluyen bencilamino, metilamino, etilamino, fenetilamino, etc. "Dialquilamino" incluye grupos en donde el nitrógeno de -NH2está unido al menos a dos grupos alquilo adicionales. Los ejemplos de grupos dialquilamino incluyen, pero no se limitan a, dimetilamino y dietilamino. "Arilamino" y "diarilamino" incluyen grupos en donde el nitrógeno está unido al menos a uno o dos grupos arilo, respectivamente. "Aminoarilo" y "aminoariloxi" se refieren a arilo y ariloxi sustituidos con amino. "Alquilarilamino", "alquilaminoarilo" o "arilaminoalquilo" se refiere a un grupo amino que está unido a al menos un grupo alquilo y al menos un grupo arilo. "Alcaminoalquilo" se refiere a un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido a un átomo de nitrógeno que se une además a un grupo alquilo. "Acilamino" incluye grupos en donde el nitrógeno está unido a un grupo acilo. Los ejemplos de acilamino incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido.
El término "amida" o "aminocarboxi" incluye los compuestos o porciones que contienen un átomo de nitrógeno que está unido al carbono de un grupo carbonilo o un tiocarbonilo. El término incluye los grupos "alcanocarboxilo" que incluyen los grupos alquilo, alquenilo o alquinilo unidos a un grupo amino que está unido al carbono de un grupo carbonilo o tiocarbonilo. Incluye además los grupos "arilaminocarboxilo" que incluyen las porciones arilo o heteroarilo unidos a un grupo amino que está unido al carbono de un grupo carbonilo o tiocarbonilo. Los términos "alquilaminocarboxi", "alquenilaminocarboxi", "alquinilaminocarboxi" y "arilaminocarboxi" incluyen las porciones en donde las porciones alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo, respectivamente, se unen a un átomo de nitrógeno que a su vez está unido al carbono de un grupo carbonilo. Las amidas pueden sustituirse con sustituyentes tales como alquilo de cadena lineal, alquilo ramificado, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterociclo. Además, los sustituyentes en los grupos amida pueden sustituirse.
En la presente especificación, la fórmula estructural del compuesto representa un cierto isómero por conveniencia en algunos casos, pero la presente descripción incluye todos los isómeros, tales como isómeros geométricos, isómeros ópticos basados en un carbono asimétrico, estereoisómeros, tautómeros y similares, entendiéndose que no todos los isómeros pueden tener el mismo nivel de actividad. Además, un polimorfismo cristalino puede estar presente para los compuestos representados por la fórmula. Se observa que cualquier forma de cristal, mezcla de forma de cristal, o anhídrido o hidrato de este se incluye en el alcance de la presente invención. Además, el denominado metabolito que se produce por degradación del presente compuesto in vivo se incluye en el alcance de la presente invención.
"Isomerismo" significa los compuestos que tienen fórmulas moleculares idénticas pero que difieren en la secuencia de unión de sus átomos o en la disposición de sus átomos en el espacio. Los isómeros que difieren en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros." Los estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí se denominan "diastereoisómeros", y los estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí se denominan "enantiómeros", o a veces isómeros ópticos. Una mezcla que contiene cantidades iguales de formas enantioméricas individuales de quiralidad opuesta se denomina una "mezcla racémica."
Un átomo de carbono unido a cuatro sustituyentes no idénticos se denomina "centro quiral."
"Isómero quiral" significa un compuesto con al menos un centro quiral. Los compuestos con más de un centro quiral pueden existir ya sea como un diastereómero individual o como una mezcla de diastereómeros, que se denomina "mezcla diastereomérica." Cuando hay presente un centro quiral, un estereoisómero puede caracterizarse por la configuración absoluta (R o S) de ese centro quiral. Configuración absoluta se refiere a la disposición en el espacio de los sustituyentes unidos al centro quiral. Los sustituyentes unidos al centro quiral en cuestión se califican de acuerdo con la Regla de Secuencia de Cahn, Ingold y Prelog. (Cahn y otros, Angew. Chem Enterrar. Edit. 1966, 5, 385; errata 511;Cahn y otros, Angew. Chem 1966, 78, 413;Cahn e Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (Londres), 612;Cahn y otros, Experientia 1956, 12, 81;Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116).
"Isómeros geométricos" se refiere a los diastereómeros que deben su existencia a la rotación impedida alrededor de los enlaces dobles o un enlazador cicloalquilo (por ejemplo, 1,3-ciclobutilo). Estas configuraciones se diferencian en sus nombres por los prefijos cis y trans, o Z y E, que indican que los grupos están en el mismo lado o en el lado opuesto del doble enlace en la molécula de acuerdo con las reglas de Cahn-Ingold-Prelog.
Debe entenderse que los compuestos descritos en la presente pueden representarse como diferentes isómeros quirales o isómeros geométricos. Debe entenderse además que cuando los compuestos tienen formas isoméricas quirales o isoméricas geométricas, todas las formas isoméricas están destinadas a ser incluidas en el alcance de la presente invención, y la denominación de los compuestos no excluye ninguna de las formas isoméricas, entendiéndose que no todos los isómeros pueden tener el mismo nivel de actividad.
Además, las estructuras y otros compuestos discutidos en esta invención incluyen todos los isómeros atrópicos de estos, entendiéndose que no todos los isómeros atrópicos pueden tener el mismo nivel de actividad. "Isómeros atrópicos" son un tipo de estereoisómero en el que los átomos de dos isómeros se disponen de forma diferente en el espacio. Los isómeros atrópicos deben su existencia a una rotación restringida causada por el obstáculo de la rotación de grupos grandes alrededor de un enlace central. Tales isómeros atrópicos suelen existir como una mezcla, sin embargo, como resultado de los avances recientes en las técnicas de cromatografía, es posible separar mezclas de dos isómeros atrópicos en casos seleccionados.
"Tautómero" es uno de dos o más isómeros estructurales que existen en equilibrio y se convierten fácilmente de una forma isomérica a otra. Esta reacción da como resultado la migración formal de un átomo de hidrógeno acompañado de un cambio de dobles enlaces conjugados adyacentes. Los tautómeros existen como una mezcla de un conjunto tautomérico en solución. En soluciones donde es posible la tautomerización, se alcanzará un equilibrio químico de los tautómeros. La relación exacta de los tautómeros depende de varios factores, que incluyen la temperatura, el solvente y el pH. El concepto de tautómeros que son interconvertibles mediante tautomerizaciones se llama tautomería.
De los varios tipos de tautomería que son posibles, dos se observan comúnmente. En el tautomerismo ceto-enol ocurre un desplazamiento simultáneo de electrones y de un átomo de hidrógeno. El tautomerismo de cadena anillo surge como resultado del grupo aldehído (-CHO) en una molécula de la cadena de azúcar que reacciona con uno de los grupos hidroxi (-OH) en la misma molécula para darle una forma cíclica (en forma de anillo) como exhibido por la glucosa.
Los pares tautoméricos comunes son: tautomerismo cetona-enol, amida-nitrilo, lactama-lactima, amida-ácido imídico en anillos heterocíclicos (por ejemplo, en las nucleobases tales como guanina, timina y citosina), amina-enamina y enaminaenamina. Un ejemplo de equilibrio de ceto-enol es entre piridin-2(1H)-onas y los correspondientes piridin-2-oles, como se muestra más abajo.
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piridin-2(1H)-ona piridin-2-ol
Debe entenderse que los compuestos descritos en la presente pueden representarse como diferentes tautómeros diferentes. Debe entenderse, además, que cuando los compuestos tienen formas tautoméricas, todas las formas tautoméricas se destinan a estar dentro del alcance de la invención, y la denominación de los compuestos no excluye ninguna forma de tautómero. Se entenderá que ciertos tautómeros pueden tener un mayor nivel de actividad que otros.
Los términos "polimorfos cristalinos" o "polimorfos" o "formas cristalinas" significan estructuras cristalinas en las que un compuesto (o sal o solvato de este) puede cristalizar en diferentes disposiciones de empaquetamiento de cristales, las cuales tienen la misma composición elemental. Las diferentes formas de cristal suelen tener diferentes patrones de difracción de rayos X, espectros infrarrojos, puntos de fusión, dureza de densidad, forma cristalina, propiedades ópticas y eléctricas, estabilidad y solubilidad. El solvente de recristalización, la velocidad de cristalización, la temperatura de almacenamiento y otros factores pueden provocar que una forma cristalina domine. Los polimorfos cristalinos de los compuestos pueden prepararse por cristalización en diferentes condiciones.
Los compuestos de cualquiera de las Fórmulas descritas en la presente invención incluyen los propios compuestos, así como sus sales o sus solvatos, si corresponde. Se puede formar una sal, por ejemplo, entre un anión y un grupo cargado positivamente (por ejemplo, amino) en un compuesto de benceno sustituido con arilo o heteroarilo. Los aniones adecuados incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, sulfamato, nitrato, fosfato, citrato, metanosulfonato, trifluoroacetato, glutamato, glucuronato, glutarato, malato, maleato, succinato, fumarato, tartrato, tosilato, salicilato, lactato, naftalenosulfonato y acetato (por ejemplo, trifluoroacetato). El término "anión farmacéuticamente aceptable" se refiere a un anión adecuado para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Similarmente, además puede formarse una sal entre un catión y un grupo cargado negativamente (por ejemplo, carboxilato) en un compuesto de benceno sustituido con arilo o heteroarilo. Los cationes adecuados incluyen ion sodio, ion potasio, ion magnesio, ion calcio, y un catión amonio tal como ion tetrametilamonio. Los compuestos de benceno sustituidos con arilo o heteroarilo además incluyen aquellas sales que contienen átomos de nitrógeno cuaternario.
Adicionalmente, los compuestos descritos en la presente descripción, por ejemplo, las sales de los compuestos, pueden existir ya sea en forma hidratada o no hidratada (la anhidra) o como solvatos con otras moléculas de solvente. Los ejemplos no limitantes de hidratos incluyen monohidratos, dihidratos, etc. Los ejemplos no limitantes de solvatos incluyen solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.
"Solvatos" significa formas de adición del solvente que contienen ya sea cantidades estequiométricas o no estequiométricas de solvente. Algunos compuestos tienen una tendencia a atrapar una relación molar fija de moléculas de solvente en el estado sólido cristalino, para formar así un solvato. Si el solvente es agua el solvato formado es un hidrato; y si el solvente es alcohol, el solvato formado es un alcoholato. Los hidratos se forman por la combinación de una o más moléculas de agua con una molécula de la sustancia en la que el agua retiene su estado molecular como H2O.
Como se usa en la presente, el término "análogo" se refiere a un compuesto químico que es estructuralmente similar a otro pero que difiere ligeramente en su composición (como en la sustitución de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en presencia de un grupo funcional particular, o la sustitución de un grupo funcional por otro grupo funcional). Así, un análogo es un compuesto que es similar o comparable en función y apariencia, pero no en la estructura u origen al compuesto de referencia.
Como se define en la presente descripción, el término "derivado" se refiere a los compuestos que tienen una estructura central común, y se sustituyen con varios grupos como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, todos los compuestos representados por la Fórmula (I) son compuestos de benceno sustituidos con arilo o heteroarilo, y tienen la Fórmula (I) como núcleo común.
El término "bioisóstero" se refiere a un compuesto resultante del intercambio de un átomo o de un grupo de átomos con otro átomo o grupo de átomos, ampliamente similar. El objetivo de un reemplazo bioisostérico es crear un nuevo compuesto con propiedades biológicas similares al compuesto original. El reemplazo bioisostérico puede tener una base fisicoquímica o topológica. Los ejemplos de bioisósteros de ácido carboxílico incluyen, pero no se limitan a, acil sulfonimidas, tetrazoles, sulfonatos y fosfonatos. Ver, por ejemplo, Patani y LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996.
La presente descripción pretende incluir todos los isótopos de átomos que aparecen en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio, y los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14.
En la presente descripción se describen métodos para la síntesis de los compuestos de cualquier Fórmula descrita en la presente descripción. Además se describen en la presente descripción métodos detallados para la síntesis de diversos compuestos descritos de acuerdo con los siguientes esquemas como se muestra en los Ejemplos.
A lo largo de la descripción, cuando las composiciones se describen como que tienen, que incluyen o que comprenden componentes específicos, se contempla que las composiciones consisten, además, esencialmente en, o consisten en, los componentes enumerados. Similarmente, cuando los métodos o procesos se describen como que tienen, incluyen o comprenden etapas de proceso específicas, los procesos consisten, además, esencialmente en, o consisten en, las etapas de procesamiento enumeradas. Además, debe entenderse que el orden de las etapas o el orden para realizar ciertas acciones es inmaterial siempre que la invención permanezca operativa. Además, dos o más etapas o acciones pueden llevarse a cabo simultáneamente.
Los procesos sintéticos descritos en la presente descripción pueden tolerar una amplia variedad de grupos funcionales, por lo tanto, pueden usarse diversas materias primas sustituidas. Los procesos generalmente proporcionan el compuesto final deseado en o cerca del final del proceso global, aunque puede ser deseable en ciertos casos convertir además el compuesto en una sal, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de este.
Los compuestos descritos en la presente descripción pueden prepararse de diversas maneras con el uso de materias primas disponibles en el comercio, compuestos conocidos en la literatura, o a partir de intermedios preparados fácilmente, empleando métodos y procedimientos sintéticos estándar conocidos por los expertos en la técnica, o que serán evidentes para el técnico con experiencia a la luz de las enseñanzas en la presente descripción. Los métodos y procedimientos sintéticos estándar para la preparación de moléculas orgánicas y las transformaciones y manipulaciones de grupos funcionales pueden obtenerse de la literatura científica relevante o de los libros de texto estándar en el campo. Aunque no se limita a una o varias fuentes, textos clásicos tales como Smith, M. B., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5ta edición, John Wiley & Sons: Nueva York, 2001;Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3ra edición, John Wiley & Sons: Nueva York, 1999;R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989);L. Fieser y M. Fieser, Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), son útiles y reconocidos libros de texto de síntesis orgánica conocidos por los expertos en la técnica. Las siguientes descripciones de métodos sintéticos se diseñan para ilustrar, pero no limitar, los procedimientos generales para la preparación de compuestos descritos en la presente descripción.
Los compuestos descritos en la presente descripción pueden prepararse convenientemente mediante una variedad de métodos familiares para los expertos en la técnica. Los compuestos descritos en la presente descripción con cualquier Fórmula descrita en la presente descripción pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos ilustrados en los Esquemas 1-10 más abajo, a partir de materias primas disponibles en el comercio o materias primas que pueden prepararse con el uso de procedimientos de literatura. Los grupos Z y R (tales como R2 , R3 , R4 , R6, R7 , Rsy R12) en los Esquemas 1-10 son como se definen en cualquiera de las Fórmulas descritas en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra forma.
Un experto en la técnica notará que, durante las secuencias de reacción y los esquemas sintéticos descritos en la presente descripción, el orden de ciertas etapas puede cambiarse, tal como la introducción y eliminación de grupos protectores.
Un experto en la técnica reconocerá que ciertos grupos pueden requerir protección contra las condiciones de reacción mediante el uso de grupos protectores. Los grupos protectores además pueden usarse para diferenciar grupos funcionales similares en moléculas. Puede encontrar una lista de grupos protectores y cómo introducir y eliminar estos grupos en Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3ra edición, John Wiley & Sons: Nueva York, 1999.
Los grupos protectores preferidos incluyen, pero no se limitan a:
Para una porción hidroxilo: TBS, bencilo, THP, Ac
Para ácidos carboxílicos: éster bencílico, éster metílico, éster etílico, éster alílico
Para aminas: Cbz, BOC, DMB
Para dioles: Ac (x2) TBS (x2), o cuando se toman juntos acetónidos
Para tioles: Ac
Para bencimidazoles: SEM, bencilo, PMB, DMB
Para aldehídos: dialquil acetales tales como dimetoxiacetal o dietil acetilo.
En los esquemas de reacción descritos en la presente descripción, pueden producirse múltiples estereoisómeros. Cuando no se indica ningún estereoisómero particular, se entiende que significa todos los estereoisómeros posibles que podrían producirse a partir de la reacción. Una persona de habilidad ordinaria en la técnica reconocerá que las reacciones pueden optimizarse para dar preferentemente un isómero, o pueden idearse nuevos esquemas para producir un solo isómero. Si se producen mezclas, pueden usarse técnicas tales como cromatografía preparativa de capa fina, HPLC preparativa, HPLC quiral preparativa, o SFC preparativa para separar los isómeros.
Las siguientes abreviaturas se usan en toda la especificación y se definen más abajo:
Ac acetilo
AcOH ácido acético
aq. acuosa
BID o b.i.d. bis in die (dos veces al día)
BOC terc-butoxicarbonilo
Cbz benciloxicarbonilo
CDCl3 cloroformo deuterado
CH2Cl2 diclorometano
DCM diclorometano
DMB 2,4 dimetoxibencilo
DMF N,N-dimetilformamida
DMSO dimetilsulfóxido
EA o EtOAc acetato de etilo
EDC o EDCI N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida
ESI- Electrospray en modo negativo
ESI+ Electrospray en modo positivo
EtOH etanol
H horas
H2O agua
HOBt 1-hidroxibenzotriazol
HCl cloruro de hidrógeno o ácido clorhídrico
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
K2CO3 carbonato potásico
LC/MS o LC-MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
M Molar
MeCN acetonitrilo
Min minutos
Na2CO3 carbonato de sodio
Na2SO4 sulfato de sodio
NaHCO3 bicarbonato de sodio
NaHMDs Hexametildisilazida de sodio
NaOH hidróxido de sodio
NaHCO3 bicarbonato de sodio
Na2SO4 sulfato de sodio
NMR Resonancia Magnética Nuclear
Pd(OH)2 hidróxido de paladio
PMB parametoxibencilo
p.o. per os (administración oral)
ppm partes por millón
HPLC prep cromatografía líquida preparativa de alto rendimiento
PYBOP (Benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato
Rt o RT Temperatura ambiente
TBME metil éterferc-butilo
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
THP tetrahidropirano
En la presente descripción se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de cualquier Fórmula descrita en la presente descripción en combinación con al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una "composición farmacéutica" es una formulación que contiene los compuestos de la presente descripción en una forma adecuada para la administración a un sujeto. En una modalidad, la composición farmacéutica está a granel o en forma de dosificación unitaria. La forma de dosificación unitaria es cualquiera de una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, una tableta, una única bomba en un inhalador de aerosol o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación del compuesto o sal, hidrato, solvato o isómero de este) en una dosis unitaria de composición es una cantidad eficaz y se varía de acuerdo con el tratamiento particular involucrado. Un experto en la técnica apreciará que a veces es necesario hacer variaciones de rutina a la dosificación en dependencia de la edad y el estado del paciente. La dosificación dependerá además de la ruta de administración. Una variedad de vías se contemplan, que incluyen oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, inhalatoria, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal, y similares. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una modalidad, el compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propulsor que se requiera.
Como se usa en la presente descripción, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, aniones, cationes, materiales, composiciones, portadores, y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico, son adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que generalmente es seguro, no tóxico ni biológicamente ni de otra manera indeseable, e incluye un excipiente que es aceptable tanto para uso veterinario como también para uso farmacéutico humano. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa en la descripción y en las reivindicaciones incluye tanto uno como más de uno de tales excipientes.
Una composición farmacéutica descrita en la presente descripción se formula para que sea compatible con su ruta de administración prevista. Los ejemplos de rutas de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), y transmucosal. Las soluciones o suspensiones que se usan para la aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
Un compuesto o composición farmacéutica descrita en la presente descripción puede administrarse a un sujeto en muchos de los métodos bien conocidos actualmente usados para el tratamiento quimioterapéutico. Por ejemplo, para el tratamiento de cánceres, un compuesto de la invención puede inyectarse directamente en tumores, inyectarse en el torrente sanguíneo o cavidades corporales o tomarse oralmente o aplicarse a través de la piel con parches. La dosis elegida debe ser suficiente para constituir un tratamiento efectivo pero no tan alta como para causar efectos secundarios inaceptables. El estado de la condición de la enfermedad (por ejemplo, cáncer, precáncer y similares) y la salud del paciente se deben preferentemente controlar de cerca durante y por un período razonable después del tratamiento.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico para tratar, mejorar, o prevenir una enfermedad o afección identificada, o para exhibir un efecto terapéutico o inhibidor detectable. El efecto puede detectarse mediante cualquier método de ensayo conocido en la técnica. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá de la salud, talla y peso corporal del sujeto; la naturaleza y extensión de la afección; y el método terapéutico o la combinación de métodos terapéuticos seleccionados para la administración. Las cantidades terapéuticamente efectivas para una situación dada pueden determinarse por experimentación de rutina que está dentro de la experiencia y criterio del médico. En un aspecto preferido, la enfermedad o afección que se trata es el cáncer. En otro aspecto, la enfermedad o afección que se trata es un trastorno proliferativo celular.
Para cualquier compuesto, la cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente ya sea en los ensayos de cultivos celulares, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, generalmente ratas, ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal se puede también usar para determinar el intervalo de concentración adecuado y la ruta de administración. Tal información se puede usar después para determinar dosis útiles y rutas de administración en humanos. La eficacia terapéutica/profiláctica y la toxicidad pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50 % de la población) y LD50 (la dosis letal para 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación de LD50/ED50. Las composiciones farmacéuticas que exhiben índices terapéuticos grandes son preferidas. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente, y la ruta de administración.
La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del(los) agente(s) activo(s) para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tomar en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, salud general del sujeto, edad, peso, y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es) de fármaco(s), sensibilidad a reacciones, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de vida media y tasa de eliminación de la formulación particular.
Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos activos de la presente invención pueden fabricarse de manera que generalmente se conoce, por ejemplo, por medio de los procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento, o liofilización. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de una manera convencional con el uso de uno o más portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Por supuesto, la formulación apropiada depende de la vía de administración escogida.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir dispersiones o soluciones acuosas estériles (solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida hasta el punto que sea fácilmente inyectable. Debería ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debería preservarse contra la acción de contaminación de los microorganismos tales como bacteria y hongos. El portador puede ser un medio de dispersión o solvente que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por medio del uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse por varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato alumínico y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por la esterilización con filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un portador estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución estéril de este previamente filtrada.
Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible farmacéuticamente aceptable. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas, trociscos, o cápsulas. Las composiciones orales pueden prepararse además usando un portador fluido para su uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tales como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tales como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tales como estearato de magnesio o esterotes; un agente de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tales como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tales como yerbabuena, salicilato de metilo, o sabor de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en la forma de una atomización de aerosol a partir de un dispersador o contenedor presurizado, que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica puede ser además por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se usan penetrantes adecuados en la formulación para la barrera que se penetra. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse a través del uso de atomizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles, o cremas que se conocen generalmente en la técnica.
Los compuestos activos pueden prepararse con portadores farmacéuticamente aceptables que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas microencapsulados de suministro. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tal como acetato de acetato de etilenvinilo, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales pueden obtenerse, además, comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) pueden usarse, además, como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm.
4,522,811.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en la presente descripción se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención se dicta por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se desea alcanzar.
En aplicaciones terapéuticas, las dosificaciones de las composiciones farmacéuticas usadas de acuerdo con la invención varían según el agente, la edad, el peso y el estado clínico del paciente receptor, y la experiencia y el criterio del médico 0 profesional que administra la terapia, entre otros factores que afectan la dosis seleccionada. Generalmente, la dosis debería ser suficiente para resultar en reducir, y preferentemente regresar, el crecimiento de los tumores, y también preferentemente causar la regresión completa del cáncer. Las dosificación pueden variar de aproximadamente 0,01 mg/kg por día a aproximadamente 5000 mg/kg por día. En aspectos preferidos, la dosificación puede variar de aproximadamente 1 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día. En un aspecto, la dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 50 g/día; aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 25 g/día; aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 10 g/día; aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 3 g/día; o aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 g/día, en dosis únicas, divididas o continuas (dosis que puede ajustarse para el peso del paciente en kg, área de superficie corporal en m2, y edad en años). Una cantidad eficaz de un agente farmacéutico es aquella que proporciona una mejoría objetivamente identificable notada por el clínico u otro observador calificado. Por ejemplo, la regresión de un tumor en un paciente puede medirse con referencia al diámetro de un tumor. La disminución en el diámetro de un tumor indica regresión. La regresión además se indica por la incapacidad de los tumores de reaparecer después de que el tratamiento se ha detenido. Como se usa en la presente descripción, el término "forma efectiva de dosificación" se refiere a la cantidad de un compuesto activo para producir el efecto biológico deseado en un sujeto o célula.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un contenedor, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.
Los compuestos descritos en la presente descripción son capaces además de formar sales adicionales. Todas estas formas se contemplan, además, dentro del alcance de la invención reivindicada.
Como se usa en la presente descripción, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos descritos en la presente descripción en donde el compuesto original se modifica por producción de sales ácidas o básicas de este. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas, sales de álcali u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y lo similar. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales convencionales no tóxicas incluyen, pero no se limitan a, las derivadas de ácidos inorgánicos y orgánicos seleccionados de 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietanosulfónico, acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etano disulfónico, 1,2-etanosulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, glicolilarsanílico, hexilresorcínico, hidrabámico, hidrobrómico, hidroclórico, hidroyódico, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiónico, láctico, lactobiónico, laurilsulfónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicíclico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, toluenosulfónico, y los aminoácidos de uso común, por ejemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc.
Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácido hexanoico, ácido propiónico ciclopentano, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido 3-(4-hidroxibenzoilo)benzoico, ácido cinámico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido camforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido timetilacético, ácido butilacético terciario, ácido mucónico y similares. La presente invención abarca además sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto original o bien se reemplaza por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinotérreo, o un ion de aluminio; o se coordina con una base orgánica tales como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, y similares. En la forma de sal, se entiende que la relación del compuesto con respecto al catión o anión de la sal puede ser 1:1, o cualquier relación que no sea 1:1, por ejemplo, 3:1, 2:1, 1:2, o 1:3.
Debe entenderse que todas las referencias a las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formas de adición de solvente (solvatos) o formas cristalinas (polimorfos) como se define en la presente descripción, de la misma sal.
Los compuestos descritos en la presente descripción además pueden prepararse como ésteres, por ejemplo, ésteres farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, un grupo de función de ácido carboxílico en un compuesto puede convertirse en su éster correspondiente, por ejemplo, un metilo, etilo u otro éster. Además, un grupo alcohol en un compuesto puede convertirse en su éster correspondiente, por ejemplo, acetato, propionato u otro éster.
Los compuestos, o sales farmacéuticamente aceptables o sus solvatos, se administran oralmente, nasalmente, transdérmicamente, pulmonarmente, por inhalación, bucalmente, sublingualmente, intraperitonealmente, subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, rectalmente, intrapleuralmente, intratecalmente y parenteralmente. En una modalidad, el compuesto se administra oralmente. Un experto en la técnica reconocerá las ventajas de ciertas vías de administración.
El régimen de dosificación mediante el uso de los compuestos se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente, la severidad de la patología a tratar, la vía de administración, la función renal y hepática del paciente, y el compuesto en particular o la sal de este empleada. Un médico o un veterinario calificado normalmente pueden determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz necesaria del fármaco para prevenir, contrarrestar, o detener el progreso de la enfermedad.
Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos descritos de la invención pueden encontrarse en Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19na edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). En una modalidad, los compuestos descritos en la presente descripción, y las sales farmacéuticamente aceptables de estos, se usan en preparaciones farmacéuticas en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cargas o diluyentes sólidos inertes y soluciones acuosas u orgánicas estériles. Los compuestos estarán presentes en tales composiciones farmacéuticas en cantidades suficientes para proporcionar la cantidad de dosificación deseada en el intervalo descrito en la presente descripción.
Todos los porcentajes y relaciones que se usan en la presente descripción, a menos que se indique de cualquier otra forma, son en peso. Otras características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodologías útiles en la práctica de la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada. En base a la presente descripción, el técnico con experiencia puede identificar y emplear otros componentes y metodología útiles para practicar la presente invención.
En los esquemas sintéticos descritos en la presente descripción, los compuestos pueden dibujarse con una configuración particular por simplicidad. Tales configuraciones particulares no deben interpretarse como limitantes de la invención a uno u otro isómero, tautómero, regioisómero o estereoisómero, ni excluye mezclas de isómeros, tautómeros, regioisómeros o estereoisómeros; sin embargo, se entenderá que un isómero, tautómero, regioisómero o estereoisómero dado puede tener un mayor nivel de actividad que otro isómero, tautómero, regioisómero o estereoisómero.
Los compuestos diseñados, seleccionados y/u optimizados por los métodos descritos anteriormente, una vez producidos, pueden caracterizarse con el uso de una variedad de ensayos conocidos por los expertos en la técnica para determinar si los compuestos tienen actividad biológica. Por ejemplo, las moléculas pueden caracterizarse por ensayos convencionales, que incluyen pero no se limitan a los ensayos descritos más abajo, para determinar si tienen una actividad predicha, actividad de unión y/o especificidad de unión.
Además, el tamizaje de alto rendimiento puede usarse para acelerar el análisis con el uso de tales ensayos. Como resultado, puede ser posible tamizar rápidamente las moléculas descritas en la presente descripción para la actividad, con el uso de técnicas conocidas en la técnica. Las metodologías generales para realizar el tamizaje de alto rendimiento se describen, por ejemplo, en Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; y la Patente de Estados Unidos núm. 5,763,263. Los ensayos de alto rendimiento pueden usar una o más técnicas de ensayo diferentes que incluyen, pero no se limitan a, las que se describen más abajo.
Un inhibidor de EZH2 descrito en la presente descripción puede, si se desea, presentarse en un kit (por ejemplo, un paquete o dispositivo dispensador) que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el inhibidor EZH2. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina de metal o plástico, tal como un blíster. El envase o dispositivo dispensador puede acompañarse con las instrucciones para la administración. Las composiciones que comprenden un inhibidor EZH2 descrito en la presente descripción formulado en un portador farmacéutico compatible además pueden prepararse, colocarse en un contenedor apropiado, y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada. También pueden proporcionarse instrucciones para el uso.
También se proporcionan en la presente descripción kits que comprenden una pluralidad de reactivos de detección de metilación que detectan el H3-K27 metilado. Por ejemplo, el kit incluye reactivos de detección H3-K27 monometilados, H3-K27 dimetilados y H3-K27 trimetilados. El reactivo de detección es, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de estos, polipéptidos o aptámeros.
Un kit además puede incluir reactivos para detectar la pérdida de función de al menos un componente del complejo SWI/SNF, por ejemplo, ácidos nucleicos que identifican específicamente una secuencia de ácido nucleico de componente mutante al tener secuencias de ácido nucleico homólogas, tales como secuencias de oligonucleótidos, complementarias a una porción de la secuencia de ácido nucleico del componente mutante o anticuerpos contra proteínas codificadas por el silvestre y/o ácidos nucleicos de componente mutante empaquetados juntos en forma de kit. Los oligonucleótidos pueden ser fragmentos del gen componente. Por ejemplo los oligonucleótidos pueden tener 200, 150, 100, 50, 25, 10 o menos nucleótidos de longitud. El kit puede contener en contenedores separados un aptámero o un anticuerpo, formulaciones de control (positivas y/o negativas), y/o una etiqueta detectable tal como fluoresceína, proteína verde fluorescente, rodamina, tintes de cianina, tintes de Alexa, luciferasa, radiomarcadores, entre otros. Además, los reactivos para detectar la actividad biológica del complejo SWI/SNF (tal como su actividad de remodelación de la cromatina) pueden incluirse en el kit.
Las instrucciones (porejemplo, escritas, cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevara cabo el ensayo puede incluirse en el kit. El ensayo puede estar, por ejemplo, en forma de análisis de membrana de Western, Inmunohistoquímica (IHC), inmunofluorescencia (IF), secuenciación y espectrometría de masas (MS) como se conoce en la técnica.
Ejemplo 1: Regresión tumoral duradera en tumores rabdoides malignos y linfomas genéticamente alterados por inhibición de EZH2
El Compuesto A es un inhibidor potente y selectivo de EZH2: los ensayos bioquímicos sin células que incluyeron SAM radiomarcado y oligonucleosomas de eritrocitos de pollo o péptidos correspondientes a H3K27 como sustratos mostraron que el Compuesto A inhibió selectivamente la actividad de EZH2 silvestre que contiene PRC2 humano con un valor constante de inhibición (Ki) de 2,5 ± 0,5 nmol/L y valores de IC50 de 11 ± 5 nM (ensayo de nucleosomas) o 16 ± 12 nM (ensayo de péptidos). Los valores de IC50 fueron similares para las enzimas EZH2 humanas y de rata, así como para las proteínas EZH2 que llevan todas las mutaciones conocidas de cambio de función del linfoma. El valor de IC50 del Compuesto A aumentó al aumentar la concentración de SAM, pero se afectó mínimamente al aumentar la cantidad de oligonucleosoma que es consistente con una modalidad de inhibición competitiva de SAM y no competitiva de nucleosomas. Para demostrar la selectividad de HMT, se evaluó la inhibición por el Compuesto A contra un panel de los HMT distintos de EZH2 que abarca tanto HMT de lisina como de arginina. El compuesto A mostró una selectividad de 35 veces frente a EZH1 y una selectividad 4500 veces mayor que con respecto a otros 14 HMT probados.
El Compuesto A inhibe específicamente la metilación celular de H3K27 en las células: cuando las células de linfoma mutante WSU-DLCL2 EZH2 Y641F se incubaron con el Compuesto A durante 4 días, se observó una reducción dependiente de la concentración en los niveles globales de H3K27Me3 con un valor IC50 promedio de 0,26 pM (niveles de H3K27Me3 determinados por ELISA). Al estudiar la cinética de la inhibición de la metilación, la vida media de H3K27Me3 fue de aproximadamente 1 día ya que la inhibición del 90 % solo se logró después de 3 a 4 días de incubación. Cuando las células de linfoma silvestre OCI-LY19 EZH2 se incubaron con el Compuesto A 2,7 pM durante 4 días, las únicas marcas de metilo afectadas fueron H3K27Me1, H3K27Me2 y H3K27Me3, los tres productos conocidos de la catálisis PRC2. La incubación con el Compuesto A además resultó en un aumento en la acetilación de H3K27. La capacidad del Compuesto A para reducir los niveles globales de trimetilación de H3K27 se probó adicionalmente en varias otras líneas celulares de linfoma humano que incluyen líneas que expresan EZH2 silvestre o mutante. El Compuesto A redujo H3K27Me3 con una potencia similar en todas las líneas celulares independientemente del estado de EZH2 (Tabla 1).
El compuesto A conduce a la destrucción selectiva de líneas celulares de linfoma que tienen mutaciones puntuales EZH2: La incubación de células mutantes WSU-DLCL2 EZH2 Y641F con el Compuesto A conduce a efectos antiproliferativos con un valor IC50 promedio de 0,28 ± 0,14 pM en un ensayo de proliferación de 6 días. La cinética del efecto del Compuesto A sobre el número de células viables se probó adicionalmente durante un período prolongado de 11 días. El efecto antiproliferativo del Compuesto A fue evidente después de que las células WSU-DLCL2 habían estado expuestas al compuesto durante más de 4 días, consistente con la cinética de la inhibición de la metilación celular H3K27 mediada por el Compuesto A. El valor de IC50 para la inhibición del Compuesto A de la proliferación de células WSU-DLCL2 en el ensayo de 11 días (0,0086 pM, Tabla 1) fue menor en comparación con los resultados obtenidos con un ensayo de proliferación de 6 días, lo que sugiere una mayor sensibilidad con períodos de incubación más largos. A diferencia de las células WSU-DLCL2, el crecimiento de las células de linfoma humano OCI-LY19 (EZH2 silvestre para el residuo Y641) durante 11 días no se afectó significativamente, a pesar de los valores de IC50 comparables para la inhibición de H3K27Me3 para ambas líneas celulares (Tabla 1). Para identificar una concentración a la cual las células dejan de proliferar considerando el período de incubación completo de 11 días, se calculó la concentración citotóxica más baja (LCC) para una línea celular en particular. El valor de LCC para las células de linfoma humano mutantes WSU-DLCL2 EZH2 Y641Ffue significativamente menor en comparación con las células OCI-LY19 que son silvestres para EZH2 (Tabla 1). Esta muerte celular específica de contexto además se respaldó por los resultados de ensayos de proliferación de 11 días con un panel de línea celular de linfoma extendido. Todas las líneas celulares que albergan una mutación EZH2, con la excepción de la línea celular RL (EZH2 Y641N), fueron más sensibles a los efectos antiproliferativos del Compuesto A en comparación con las líneas celulares con EZH2 silvestre (Tabla 1). La línea celular Pfeiffer (EZH2 A677G) mostró un aumento de 20 a 300 veces en la sensibilidad al Compuesto A, medido por el valor de IC50 y la LCC, respectivamente, sobre las líneas celulares mutantes Y641. Luego el tiempo mínimo de exposición al compuesto necesario para la muerte celular sostenida se investigó mediante experimentos de lavado. Los valores de LCC en el día 11 o 14 para las células WSU-DLCL2 que se incubaron con el Compuesto A durante 7 días (seguido de 7 días de lavado del compuesto) o continuamente durante 14 días fueron similares (Tabla 2). Sin embargo, la exposición al fármaco durante solo 4 días no fue suficiente para inducir valores de la LCC similares a la incubación continua.
El compuesto A induce detención G1 y apoptosis en células de linfoma mutante EZH2: Luego, se evaluaron los efectos de la incubación con el Compuesto A (1 pM) durante 7 días sobre la progresión del ciclo celular y la apoptosis en células WSU-DLCL2. Un aumento en el porcentaje de células en la fase G1, y una disminución en el porcentaje de células en fase S y fase G2/M fase fue evidente después de 2 días de incubación del Compuesto A. El efecto máximo se logró después de 4 días. No hubo un aumento evidente en la fracción sub-G1 que sugiere que la apoptosis no fue inducida por la incubación del Compuesto A durante 7 días. Esto está de acuerdo con las curvas de crecimiento de las células WSU-DLCL2 en presencia del Compuesto A, lo que indica que los efectos citotóxicos se observaron solo después de 7 días de incubación. Después de la incubación de las células WSU-DLCL2 con el Compuesto A durante hasta 14 días, la fracción de células apoptóticas determinada por el ensayo TUNEL se aumentó significativamente el día 14 en comparación con el vehículo, lo que indica que la muerte celular mediada por el Compuesto A se produjo por la inducción de apoptosis.
La administración oral del Compuesto A conduce a la inhibición del objetivo EZH2 en modelos de xenoinjerto mutante EZH2 en ratones: El efecto de la dosificación oral del Compuesto A sobre la exposición a compuestos sistémicos y se investigó la inhibición del objetivo in vivo en ratones que portan xenoinjertos de linfoma mutante EZH2. Primero, los ratones SCID implantados por vía subcutánea con xenoinjertos WSU-DLCL2 se dosificaron oralmente con el Compuesto A durante 4 o 7 días. La medición de los niveles plasmáticos del Compuesto A ya sea 5 minutos antes o 3 horas después de la última dosis reveló un claro aumento dependiente de la dosis en la exposición. Solo los animales dosificados a 160 mg/kg TID o 213 mg/kg BID mantuvieron niveles medios de compuesto en plasma por encima de la LCC para las células WSU-DLCL2 a lo largo de un ciclo de dosificación (1652 ng/ml, considerando la unión a proteínas plasmáticas de ratones). La determinación del compuesto en homogeneizados de tumores recogidos 3 horas después de la última dosis reveló que solo para los grupos de dosis más altas los niveles de compuestos en los 2 compartimentos fueron similares. Cuando se analizaron los niveles de H3K27Me3 en tumores, se observó inhibición del objetivo de EZH2 dependiente de la dosis. La inhibición de H3K27Me3 fue menor en tumores de ratones a los que se les administró una dosis de 213 mg/kg QD, lo que sugiere que se requiere mantener una concentración plasmática por encima de la LCC durante un ciclo de dosificación para una inhibición óptima del objetivo. La dosificación durante 4 días a 160 mg/kg TID resultó en una inhibición objetivo ligeramente inferior a la dosificación durante 7 días a la misma dosis y horario, lo que indica que la dosificación prolongada aumentó el grado de inhibición objetivo en tumores WSU-DLCL2. Se realizó un estudio similar de 7 días en ratones desnudos implantados por vía subcutánea con xenoinjertos KARAPS-422 evaluando tanto los programas BID como QD. El compuesto A indujo una reducción dependiente de la dosis de los niveles de tumor H3K27Me3 en ambos regímenes.
El compuesto A induce efectos antitumorales significativos en varios xenoinjertos de linfoma mutante EZH2: Cuando los ratones SCID que portan tumor de xenoinjerto WSU-DLCL2 EZH2 Y641F mutantes se trataron con el compuesto A durante 28 días, se observó inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis, 58 % a la dosis más alta de 150 mg/kg TID. Solo los animales a los que se les administró la dosis más alta mantuvieron niveles plasmáticos promedios del Compuesto A por encima de la LCC para células WSU-DLCL2 durante todo el ciclo de dosificación. La dosificación del Compuesto A durante 28 días condujo a una acumulación relativa de compuesto en el tejido tumoral en comparación con el plasma, en contraste con lo que se observó con la dosificación de 7 días. El análisis ELISA de histonas de tumores recogidos en el día 28 indicó inhibición del objetivo dependiente de la dosis. Los niveles de H3K27Me3 en los xenoinjertos de WSU-DLCL2 fueron más bajos en ratones dosificados durante 28 días en comparación con 7 días, lo que indica que la administración prolongada del Compuesto A aumentó el grado de inhibición del objetivo. En los xenoinjertos mutantes KARPAS-422 EZH2 Y461N, la dosificación de 28 días del Compuesto A en un programa BID tuvo efectos mucho más dramáticos. La inhibición del crecimiento tumoral se observó a dosis tan bajas como 80,5 mg/kg BID, pero las dosis más altas erradicaron los xenoinjertos, y no se observó un nuevo crecimiento hasta 90 días después del cese de la dosificación. Cuando se investigaron los programas de dosificación intermitente en ratones con xenoinjerto KARPAS-422, el Compuesto A mostró nuevamente efectos antitumorales dependientes de la dosis con dos ciclos de programas de 7 días de trabajo/7 días de descanso y 21 días de trabajo/7 días de descanso. Para todos los programas de dosificación, se observó inhibición del crecimiento tumoral y regresiones completas a 90 y 361 mg/kg BID, respectivamente. El modelo de xenoinjerto mutante Pfeiffer EZH2 A677G fue el modelo de tumor más sensible, como lo sugieren los potentes efectos antiproliferativos in vitro del Compuesto A sobre esta línea celular. Todos los grupos de dosis del Compuesto A (programa QD) excepto el más bajo (30 mg/kg QD) mostraron regresiones tumorales completas en todos los animales. Nuevamente, no se observó el recrecimiento tumoral hasta el final del estudio (36 días después de suspender la administración del Compuesto A). Aunque se observó recrecimiento tumoral a 30 mg/kg QD, esta dosis muy baja indujo estasis tumoral durante el período de administración. Debido a problemas detolerabilidad, la dosificación se detuvo el día 12 para ratones a los que se les administró 1140 mg/kg QD; aun así, se observaron regresiones completas duraderas en este grupo que solo estuvieron expuestos al Compuesto A durante 12 días.
El compuesto A destruye selectivamente células MRT mutantes SMARCB1 in vitro e in vivo: Se analizó si la inhibición de EZH2 tuvo algún efecto sobre el crecimiento y la supervivencia de las células MRT con SMARCB 1 suprimido. La incubación de las líneas celulares MRT G401 y A204 con SMARCB1 suprimido con el Compuesto A en un ensayo de proliferación de 14 días in vitro indujo fuertes efectos antiproliferativos con valores IC50 en el intervalo mientras que las líneas celulares de control RD y SJCRH30 que expresaron SMARCB 1 se vieron mínimamente afectadas (Tabla 3). La dosificación de ratones SCID que portan xenoinjertos subcutáneos G401 con 266 o 532 mg/kg BID del Compuesto A durante 28 días eliminó esos tumores de crecimiento extremadamente rápido. Al igual que en los modelos de xenoinjerto NHL mutante KARPAS-422 y Pfeiffer EZH2, no se observó recrecimiento al final del estudio, 32 días después de la suspensión de la dosificación. El compuesto A dosificado a 133 mg/kg indujo estasis durante el período de administración, y produjo un retraso significativo en el crecimiento del tumor en comparación con el vehículo después de la suspensión de la dosificación. Los tumores que se recolectaron de los subconjuntos de ratones de cada grupo el día 21 mostraron una fuerte inhibición del objetivo EZH2 en todas las dosis.
El Compuesto A inhibe la metilación de H3K27 en tejidos no tumorales de una manera dependiente de la dosis: los datos descritos anteriormente demuestran que el Compuesto A representa una nueva modalidad de tratamiento para cánceres y los MRT impulsados por SWI/SNF. La medición de la modulación de biomarcadores farmacodinámicos después de la dosis frecuentemente se realiza en los primeros ensayos clínicos para evaluar el grado de inhibición del objetivo que se predice que producirá una respuesta basada en datos de modelos preclínicos. Dado que la recogida de biopsias tumorales posteriores a la dosis frecuentemente no es posible, se recogen frecuentemente en su lugar tejidos sustitutos más fáciles de acceder tales como las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), la piel o la médula ósea. Para evaluar la inhibición del objetivo EZH2 en tejidos sustitutos, se administraron oralmente a ratas Sprague Dawley macho y hembra 100, 300, o 1000 mg/kg de Compuesto A durante 28 días, y se recogieron PBMC, médula ósea y muestras de piel al final del estudio. Los niveles plasmáticos del Compuesto A aumentaron dependiente de la dosis tanto en ratas machos como hembras, y los niveles plasmáticos fueron generalmente más altos en las hembras que en los machos. Debido a problemas de tolerabilidad, las hembras en el grupo de 1000 mg/kg tuvieron que ser sacrificadas el día 23. Se observó inhibición del objetivo dependiente de la dosis en las PBMC y médula ósea de ratas a las que se les administró el Compuesto A, medido por ELISA. El grado de inhibición del objetivo fue menos pronunciado para las PBMC de hembras que se administraron durante 2 2 días en comparación con los machos que se administraron durante 28 días (la misma dosis de 1000 mg/kg). Se observó una reducción dependiente de la dosis en células positivas H3K27Me3 en la epidermis de la piel de ratas dosificadas con Compuesto A, según se evaluó mediante un ensayo de IHC. El efecto máximo se observó a la dosis más alta, y ya fue evidente después de 22 días de administración del Compuesto A.
El compuesto A mostró propiedades similares a otros inhibidores de EZH2 in vitro, tal como la muy alta especificidad para EZH2 en ensayos bioquímicos en comparación con otros HMT y la inhibición específica de la metilación de H3K27 celular que conduce a la destrucción específica de contexto de líneas celulares NHL mutadas con EZH2. Sin embargo, este compuesto logró un aumento de potencia de aproximadamente 1 0 veces, reflejado por la disminución de los valores de Ki y de IC50 determinados en ensayos bioquímicos y funcionales celulares. Además, el Compuesto A mostró una excelente biodisponibilidad oral cuando se administró a roedores, lo que condujo a una inhibición de objetivo de EZH2 dependiente de la dosis en tejidos tumorales y no tumorales de xenoinjerto. Es importante destacar que la dosificación del Compuesto A indujo efectos antitumorales significativos en ratones que portan xenoinjertos de linfoma mutante EZH2. Las respuestas variaron desde la erradicación del tumor (sin recrecimiento después del cese de la dosis) hasta la inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis. El inicio retardado de la actividad antitumoral (después de 4 a 7 días) fue consistente con la cinética de la inhibición de la metilación y la actividad antiproliferativa inducida por la incubación de las células con el Compuesto A in vitro. Mantener los niveles plasmáticos del Compuesto A por encima de LCC durante un ciclo de dosificación fue necesario para que el modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2 indujera la inhibición máxima del objetivo y la respuesta antitumoral. Sin embargo, los otros dos modelos de xenoinjerto de linfoma (KARPAS-422 y Pfeiffer) fueron extremadamente sensibles a la administración del Compuesto A, y no fue necesario mantener los niveles plasmáticos por encima de la LCC. Los tumores de xenoinjerto mutante Pfeiffer EZH2 A677G desaparecieron permanentemente con dosis muy bajas o períodos de dosificación cortos, lo que sugiere que los pacientes con este tipo de NHL genéticamente definido tendrían un efecto de tratamiento significativo con el Compuesto A.
Los MRT son cánceres pediátricos extremadamente agresivos del cerebro, los riñones y los tejidos blandos que son altamente malignos, localmente invasivos, frecuentemente metastásicos y particularmente letales, pero generalmente son diploides y carecen de aberraciones genómicas. Sin embargo, se caracterizan por una penetración casi completa de la pérdida de expresión de SMARCB 1, un componente central del complejo de remodelación de cromatina sW i/SNF. La inactivación bialélica de SMARCB 1, por ejemplo inducida por mutaciones, es en esencia el único evento genético en las MRT que sugiere un papel impulsor de esta aberración genética. A través de estudios genéticos, se ha sugerido que PRC2 y SWI/SNF regulan antagónicamente la expresión génica alrededor de las vías RB, Cyclin D1 y MYC. Aquí, se ha demostrado que la inhibición farmacológica de EZH2 indujo efectos antiproliferativos en las líneas celulares MRT SMARCB1-suprimido y en los xenoinjertos MRT erradicados permanentemente en ratones. Esto confirma la dependencia de tales cánceres, en los que EZH2 en sí no se altera genéticamente, en la actividad de PRC2.
El compuesto A representa una nueva modalidad de tratamiento para los subconjuntos genéticamente definidos de NHL y para los MRT. La capacidad de medir los cambios dependientes de la dosis en los niveles de H3K27Me3 en la piel, las PBMC y médula ósea presagia el uso de la señal de estos tejidos sustitutos como un biomarcador farmacodinámico no invasivo en ensayos clínicos en humanos.
Tabla 1: Valores de IC50 de metilación y proliferación, así como valores de LCC para el Compuesto A en líneas celulares de linfoma humano
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Tabla 2: Valores de LCC para el Compuesto A para células de linfoma humano WSU-DLCL2 dosificadas ya sea de forma continua o después del lavado del compuesto
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Tabla 3: Valores de IC50 para el compuesto A para líneas celulares MRT negativas SMARCB1 y líneas celulares de control positivo SMARCB1
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Ejemplo 2: Regresión tumoral duradera en tumores rabdoides malignos genéticamente alterados por inhibición de EZH2
El compuesto A es un inhibidor potente y selectivo de EZH2: El Compuesto A se desarrolló a través de la química medicinal iterativa (Figura 10A). El compuesto A inhibió la actividad del PRC2 humano que contiene EZH2 silvestre con un valor de inhibición constante (Ki) de 2,5 ± 0,5 nM, y se observó una potencia similar para las proteínas EZH2 que portan todas las mutaciones conocidas de cambio de función del linfoma (Tabla 5). Se descubrió que el compuesto era competitivo en SAM y no competitivo en nucleosomas mediante los estudios cinéticos de estado estacionario (Figura 11). Además se evaluó la inhibición por el Compuesto A contra un panel de los HMT que no sea EZH2 que abarca tanto los HMT de lisina como de arginina. El compuesto A mostró una selectividad de 35 veces frente a EZH1 y una selectividad >4500 veces con respecto a otros 14 HMT probados (Tabla 5).
Tabla 4: Inhibición de la histona metiltransferasa por el compuesto A
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El compuesto A inhibe específicamente la metilación celular H3K27 que conduce a la muerte apoptótica selectiva de células MRT SMARCB1-mutante: un panel de células MRT SMARCB1 deficientes y las células de controlSMARCBIde tipo silvestre (confirmadas por inmunotransferencia, Figura 12A) se trataron con el Compuesto A durante 4 días, dando como resultado reducciones dependientes de la concentración en los niveles globales de H3K27Me3 (Figura 10B y tabla 6 ). El tratamiento de las células mutantes o silvestres resultó en una disminución solo de las marcas de metilo en H3K27, sin que se vean afectadas otras marcas de metil histona (Figura 12B). El tratamiento in vitro de líneas celulares MRT SMARCB1 -suprimidas con el Compuesto A indujeron fuertes efectos antiproliferativos con valores de IC50 en el intervalo de nM; mientras que las líneas celulares de control (silvestres) se afectaron mínimamente (Figura 10C y tabla 6 ). Los efectos antiproliferativos fueron evidentes en células MRT SMARCB1 -suprimidas después de 7 días de exposición del compuesto, pero requirieron 14 días de exposición para la actividad máxima. Además se evaluaron los efectos de la incubación con el Compuesto A (1 j M) durante 14 días sobre la progresión del ciclo celular y la apoptosis en células G401 y RD. La incubación del Compuesto A de las células RDSMARCB1 tipo silvestre no mostraron cambios en el ciclo celular o apoptosis en comparación con el control DMSO (Figura 13A). En contraste, las células G401SMARCB1-suprimidas mostraron un aumento en el porcentaje de células en la fase G1, y una disminución concomitante en la fase S y fase G2/M después de 7 días (Figura 13b ). No hubo un aumento evidente en la fracción sub-G1 hasta el día 7, lo que sugiere que la apoptosis aún no fue inducida por ese momento. Esto coincide con las curvas de crecimiento de las células G401 en presencia del Compuesto A que muestran citotoxicidad solo después de 7 días de incubación (Figura 10C). Después del tratamiento del Compuesto A de células G401 durante hasta 14 días, la fracción de células en sub-G1 así como las células apoptóticas determinadas por el ensayo TUNEL aumentaron de manera dependiente del tiempo durante los días 11 y 14, lo que indica que la muerte celular mediada por el Compuesto A se produjo a través de la inducción de apoptosis (Figura 13B).
Tabla 6
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El compuesto A induce genes de diferenciación neuronal e inhibición del ciclo celular mientras suprime la expresión de los genes de la vía hedgehog, MYC y EZH2: Se ha sugerido que la pérdida de SMARCB 1 impulsa la formación de cáncer a través de la perturbación epigenética simultánea de las vías clave del cáncer. Los datos actuales confirmaron la expresión reducida de los genes previamente descritos, importante para la diferenciación neuronal (CD133, DOCK4, PTPRK), inhibición del ciclo celular (CDKN2A) y supresión tumoral (BIN1), así como una expresión aumentada del gen de la vía hedgehog GLI1 en células G401 SMARCB1 -suprimidas en comparación con las células de control (Figura 14A). El tratamiento con el compuesto A de células G401 durante hasta 7 días indujo fuertemente la expresión de CD133, DOCK4 y PTPRKe inhibidores del ciclo celular regulados corriente arriba CDKN1A y CDKN2A y supresor tumoral BIN1, todo de una manera dependiente del tiempo (Figura 14B). Simultáneamente, la expresión de los genes de la vía hedgehog, MYCyEZH2 se redujeron. Debe notar que, las células G402SMARCB1-suprimidas expuestas al Compuesto A durante 14 días asumieron una morfología de tipo neuronal (Figura 14C). Por el contrario, la incubación del Compuesto A de las células de control RD tuvo un efecto mínimo sobre la expresión de los genes mencionados anteriormente.
El Compuesto A erradica los xenoinjertos MRT mutantes SMARCB1: La dosificación oral del Compuesto A condujo a la exposición a compuestos sistémicos, la inhibición del objetivo in vivo y actividad antitumoral en ratones portadores de xenoinjertos MRT SMARCBI-suprimido. Se realizó un estudio en ratones SCID que portan xenoinjertos subcutáneos de G401 en los que los animales se dosificaron durante 21 días con el Compuesto A. La mitad de los ratones por grupo se sacrificaron el día 21 para recoger sangre y tejidos, mientras que los animales restantes se trataron durante 7 días adicionales y después se dejaron sin dosificación por otros 32 días. El compuesto A fue bien tolerado en todas las dosis con un efecto mínimo sobre el peso corporal (Figura 15A). La dosificación a 250 o 500 mg/kg dos veces al día (BID) durante 21 a 28 días prácticamente eliminó los tumores de crecimiento rápido G401 (Figuras 15B, 14C y 16A). El recrecimiento no se observó durante 32 días después del cese de la dosis. El compuesto A dosificado a 125 mg/kg indujo estasis tumoral durante el periodo de administración, y produjo un retraso significativo en el crecimiento del tumor en comparación con el vehículo después del período de dosificación. La medición de los niveles plasmáticos del Compuesto A ya sea 5 minutos antes o 3 horas después de la dosificación del día 21 reveló un claro aumento dependiente de la dosis en la exposición sistémica (Figura 15D). Los tumores que se recogieron de subconjuntos de ratones de cada grupo el día 21 mostraron una fuerte inhibición de H3K27me3, que se correlaciona con la actividad antitumoral (efecto máximo alcanzado a 250 mg/kg, Figura 16B). Además, los cambios dependientes de la dosis en la expresión de CD133, PTPRK, DOCK4 y GLI1 se detectaron en los tumores de xenoinjerto g 401 (Figura 16C).
Los datos actuales demuestran que la inhibición farmacológica de EZH2 indujo efectos antiproliferativos específicamente en líneas celulares MRT SMARCBI-suprimido y xenoinjertos MRT permanentemente erradicados en ratones. Esto confirma la dependencia de tales cánceres de la actividad de PRC2, a pesar del hecho de que EZH2 en sí no se altera genéticamente en este contexto. Los datos presentados en la presente descripción muestran que en el contexto de MRTSM^RCBI-suprimido, la inhibición de EZH2 funciona como un sustituto de SMARCB 1 y elimina la represión de los genes de diferenciación neuronal, inhibidores del ciclo celular y supresores de tumores mientras reduce GLI1, PTCH1, MYC y EZH2. La suma de los efectos de la inhibición de EZH2 mediada por el Compuesto A en varias rutas de cáncer es la causa de la actividad antitumoral dramática y permanente observada en los modelos MRT. Así, el Compuesto A representa una nueva modalidad de tratamiento para estos tumores letales infantiles.
Además, dado que varios miembros del complejo SWI/SNF están genéticamente alterados en otros tipos de cáncer además de MRT, es concebible que EZH2 desempeñe además un papel en el mantenimiento y la supervivencia del tumor en un espectro de tipos de cáncer. Combinado con los informes recientes que demuestran la efectividad de los inhibidores de EZH2 en la muerte selectiva de mutantes de EZH2 que portan linfomas non-Hodgkin, los presentes datos demuestran que la inhibición de EZH2 basada en moléculas pequeñas es un mecanismo efectivo de intervención terapéutica en una variedad de tumores hematológicos y sólidos para los cuales las alteraciones genéticas - ya sean dirigidas o indirectas -confieren una dependencia proliferativa sobre la actividad enzimática EZH2.
Ejemplo 3: Materiales y Métodos
Cultivo celular: Líneas celulares 293T, RD, SJCRH30, A204, G401, G402 y KYM-1. 293T (CRL-11268), RD (CRL-136), SJCRH30 (CRL-2061), A204 (HTB-82), G401 (CRL-1441), y G402 (CRL-1440) se obtuvieron de ATCC. KYM-1 (JCRB0627) se obtuvo de JCRB. Las células 293T y RD se cultivaron en DMEM+FBS al 10 %. Las células SJCRH30 se cultivaron en RPMI+FBS al 10 %. Las células A204, G401, y G402 se cultivaron en McCoys 5a+FBS al 10 %. Las células KYM-1 se cultivaron en DMEM/Ham's F12+FBS al 10 %.
Análisis de las membranas de tipo Western: Las histonas se extrajeron con ácido como se describió previamente (Daigle y otros, Blood. 8 de agosto de 2013; 122(6): 1017-25). Las membranas de Western para histonas extraídas con ácido se realizaron como se describió previamente (Knutson y otros, Proc Natl Acad Sci USA. 7 de mayo de 2013;110(19):7922-7). Los lisados de células enteras (WCL) se prepararon con el uso de un tampón RIPA modificado (Tampón de Lisis RIPA 10x (Millipore # 20-188), SDS al 0,1 % (Invitrogen AM9823), minitableta de proteasa (Roche # 1836153)). Las células se sedimentaron, se lavaron con PBS helado, se resuspendieron en tampón RIPA helado, y se incubaron en hielo durante 5 minutos. Los lisados se sonicaron 3 veces durante 10 segundos al 50 % de potencia, después se incubaron en hielo durante 10 minutos. Los lisados se centrifugaron después a la velocidad máxima durante 15 minutos a 4 grados en una centrífuga de mesa. Los lisados clarificados se dividieron en alícuotas en un tubo nuevo, y las concentraciones de proteínas para WCL se determinaron por ensayo de BCA (Pierce). Se fraccionaron diez microgramos de cada lisado en gel Tris-Glicina (Biorad) al 10-20 %, se transfirieron con el uso de iBlot (7 minutos en el programa 3, con el uso de pilas de transferencia de nitrocelulosa), y se probaron con los siguientes anticuerpos en tampón de bloqueo Odyssey: SNF5 (CST #8745), EZH2 (CST #5246), y Beta-actina (CST #3700).
Ensayos celulares
in vitro: Para los ensayos de proliferación de líneas celulares adherentes (todas las líneas celulares excepto KYM-1, que se analizó como se describió previamente para las líneas celulares en suspensión (Daigle y otros, Blood. 8 de agosto de 2013; 122(6):1017-25), las densidades de recubrimiento para cada línea celular se determinaron en base a las curvas de crecimiento (medidas por la viabilidad de ATP) y la densidad durante un curso de tiempo de 7 días. El día anterior al tratamiento del compuesto, las células se sembraron en placas ya sea en placas de 96 pocillos por triplicado (para el día 0-7 curso de tiempo) o en placas de 6 pocillos (para resiembra el día 7 durante el resto del curso de tiempo). El día 0, las células o no se trataron, se trataron con DMSO, o se trataron con el compuesto A comenzando a 10 pM y disminuyendo ya sea en diluciones de 3 o 4 veces. Las placas se leyeron el día 0, el día 4, y el día 7 con el uso de CellTiter-Glo® (Promega), y el compuesto/medio que se repuso el día 4. El día 7, las placas de 6 pocillos se tripsinizaron, se centrifugaron, y se resuspendieron en medios nuevos para contar con Vi-Cell. Las células de cada tratamiento se resembraron a la densidad original en placas de 96 pocillos por triplicado. Se permitió que las células se adhirieran a la placa durante toda la noche, y las células se trataron como en el día 0. Los días 7, 11 y 14, las placas se leyeron con el uso de CellTiter-Glo®, con el compuesto/medio que se repuso el día 11. Se usaron promedios de triplicados para trazar la proliferación en el curso del tiempo, y calcular los valores de IC50. Para el ciclo celular y la apoptosis, las células G401 y r D se sembraron en placas de 15 cm por duplicado a una densidad de 1x106 células por placa. Las células se incubaron con el Compuesto A 1 pM, en un total de 25 ml, durante un curso de 14 días, con las células que se dividieron de nuevo a la densidad de placas original en los días 4, 7, y 11. El análisis del ciclo celular y el ensayo TUNEL se realizaron con el uso de un citómetro de flujo Guava®, siguiendo el protocolo del fabricante.
Análisis de Expresión Génica: Las células G401 y RD se sembraron en frascos T-75 a 175,000 células/frasco y 117,000 células/frasco respectivamente y se dejaron adherir durante toda la noche. El día 0, las células se trataron por duplicado con DMSO o con el compuesto A 1 uM. Las células se cosecharon y sedimentaron en los días 2, 4, y 7 con medio y el compuesto se repuso el día 4. Se usaron para el análisis de expresión génica tejidos tumorales de los animales con xenoinjerto G401 dosificados durante 21 días (vehículo, 125 mg/kg y 250 mg/kg ( 6 animales cada uno) y 500 mg/kg (4 animales) grupos de dosis de Compuesto A). El ARNm total se extrajo de los sedimentos celulares y el tejido tumoral con el uso del Mini Kit RNeasy (Qiagen # 74106) y se transcribió de forma inversa mediante el Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems (AB) #4368813). La RT-PCR se realizó mediante Sistemas de PCR en tiempo real ViiA™ 7 (AB) con el uso de Mezcla maestra TaqMan Fast Avanzada (AB #4444964) y conjuntos de cebadores/sondas TaqMan en la tabla más abajo. La expresión génica se normalizó a 18S (AB #Hs99999901_s1) y el cambio en la proporción se calculó con el uso del método AACt. Para las muestras in vivo, se determinó el valor de Ct promedio /- Sd para cada grupo de dosis y se calculó el cambio en la proporción en comparación con el grupo de dosis del vehículo con el uso del método AACt.
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ELISA: Las histonas se aislaron de tumores como se describió previamente (Daigle y otros) y se prepararon en concentraciones equivalentes (0,5 ng/ul para H3 y 4 ng/ul para H3K27Me3) en tampón de recubrimiento (PBS con BSA al 0,05 %). Se añadió muestra o estándar (100 j l) por duplicado a dos placas ELISA de 96 pocillos (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Las histonas aisladas de células G401 que se trataron con DMSO o Compuesto A 10 jmol/L durante 4 días se añadieron a los pocillos de control a la misma concentración de histona que las muestras de histona del tumor. Las placas se sellaron y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Al día siguiente, las placas se lavaron 3 veces con 300 jl/pocillo de PBST (PBS con Tween 20 al 0,05 %; 10x PBST, KPL #51-14-02) en un lavador de placas Bio Tek. Las placas se bloquearon con 300 jl/pocillo de diluyente (PBS BSA al 2 % Tween 20 al 0,05 %), se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, y se lavaron 3 veces con PBST. Todos los anticuerpos se diluyeron en diluyente. Se añadieron a cada placa 100 jl/pocillo de anti-H3K27Me3 (CST #9733, glicerol al 50 % de concentrado 1:1000) o anti-H3 total (Abcam #ab1791, glicerol al 50 % de concentrado 1:10,000). Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron 100 jl/pocillo de anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) 1:2000 a la placa H3K27Me3 y 1:6000 a la placa H3 y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4 veces con PBST. Para la detección, se añadió 100 jl/pocillo de sustrato TMB (BioFx Laboratories, #TMBS) y las placas se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 minutos. La reacción se detuvo con 100 jl/pocillo H2SO4 IN. Se leyó la absorbancia a 450 nm en el lector de microplacas SpectraMax M5.
Estudio de xenoinjerto: Todos los procedimientos relacionados con la manipulación, el cuidado y el tratamiento de los animales en este estudio se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Shanghai Chemparner siguiendo la guía de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio. (AAALAC). Para el estudio in vivo, los ratones se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho con células tumorales G-401 (5x106 /ratón) en una mezcla de 0,2 ml de medio base y Matrigel (McCoy 5A : Matrigel=1:1) para el desarrollo del tumor. Los tratamientos se iniciaron cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 157 mm3 para el estudio de eficacia tumoral (n=16 ratones por grupo). El compuesto A o vehículo (NaCMC al 0,5 %+Tween-80 al 0,1 % en agua) se administró oralmente BID a un volumen de dosis de 10 jl/g durante 21 o 28 días. El peso corporal de los animales se midió todos los días durante la primera semana, después dos veces por semana durante el resto del estudio. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana en dos dimensiones con el uso de un calibrador, y el volumen se expresó en mm3. Para el análisis PK/PD, 8 ratones con la mayor carga tumoral se sacrificaron para la extracción de tumores y sangre después de 21 días de dosificación. Los ratones restantes se continuaron dosificando durante una semana más, y desde el día 29, se suspendió el tratamiento y los ratones se inscribieron en un estudio de retraso del crecimiento tumoral. Los ratones se observaron individualmente hasta que alcanzaron el punto final del peso del tumor ( 2 0 0 0 mm3) o hasta el día 60 (lo que ocurra primero).
Análisis farmacocinético: La dexametasona se usó como patrón interno. Se añadió una alícuota de 30 j l de muestra de plasma con 30 j l de IS (Dexametasona, 1000 ng/ml) y 150 j l de ACN. La mezcla se sometió a vórtice durante 5 minutos y se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos. Se inyectó una alícuota de 2 j l de sobrenadante para análisis LC-MS/MS (Q-trap 3200). Para muestras de plasma diluido 10 veces, se añadió una alícuota de 3 j l de muestra de plasma con 27 j l de plasma en blanco, el factor de dilución fue 1 0 , después se añadió con 30 j l de IS (Dexametasona, 1 0 0 0 ng/ml) y 150 j l de ACN. La mezcla se sometió a vórtice durante 5 minutos y se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos. Se inyectó una alícuota de 2 j l de sobrenadante para análisis LC-MS/MS. Las muestras de tumor se homogeneizaron en Beadbeater® durante 30 segundos con 3 x PBS (p/v) para obtener un homogeneizado de tumor. Se añadió una alícuota de 30 j l de muestra de homogeneizado de tumor con 30 j l de IS (Dexametasona, 1000 ng/ml) y 150 j l de ACN. La mezcla se sometió a vórtice durante 5 minutos y se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos. Se inyectó una alícuota de 2 j l de sobrenadante para análisis LC-MS/MS.
Ejemplo 4: Procedimientos experimentales generales
NMR
Los espectros de H-NMR1 se tomaron con el uso de CDCI3 a menos que se indique de cualquier otra forma y se grabaron a 400 o 500 MHz con el uso de un imán de instrumentos Varían o Oxford (500 MHz). Las multiplicidades indicadas son s=singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuarteto, quint = quinteto, sxt = sexteto, m = multiplete, dd =doblete de dobletes, dt = doblete de tripletes; br indica una señal amplia.
LCMSy HPLC
Shimadzu LC-Q, Shimadzu LCMS-2010EV o Waters Acquity Ultra Performance LC. HPLC: Los productos se analizaron por Shimadzu SPD-20A con una columna de 150 x 4,5 mm YMC ODS-M80 o una columna de 150 x 4,6mm YMC-Pack Pro C18 a 1,0 ml/min.
La fase móvil fue MeCN:H2O=3:2 (que contiene SDS al 0,3 % y H3 PO4 al 0,05 %), TFA al 0,05 % en agua, TFA al 0,05 % en acetonitrilo (gradiente inicial 20 %, después TFA/MeCN al 0,05 % a conc. a 95 % en 3 minutos. Retenciones durante 0,5 min. a 3,51 hasta 4,50 min y después TFA/MeCN al 0,05 % conc. 20 %).
Alternativamente el LCMS, se usaron 2 métodos diferentes; el que más usamos es el pH alto (METCR1600) y el otro para compuestos más estándar (METCR1416).
Ácido fórmico al 0,1 % en agua - Fase móvil "A" Ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo - Fase móvil "B" utilizando Waters Atlantis dC18, 2,1 mm x 100 mm, columna de 3 pm, con una velocidad de flujo = 0,6 ml/min Temperatura de la columna = 40°C; Tiempo (minutos) %B 0,00 min B al 5 %, 5,0 minutos B al 100 %, 5,4 minutos B al 100 % y 42 minutos B al 5 % método de 3,5 minutos se refiere a Atlantis dC18, 2,1 mm x 50 mm, columna de 3 pm, velocidad de flujo de 1ml/min a 40°C. Fase móvil A Ácido fórmico (aq.) al 0,1 % fase móvil B ácido fórmico (MeCN) al 0,1 %, inyección 3 pl, gradiente 0 minutos (orgánico al 5), 2,5 minutos (orgánico al 100 %), 2,7 minutos (orgánico al 100 %), 2,71 min (orgánico al 5 %), 3,5 min (orgánico al 5 %)
el método de 7,0 minutos se refiere a Atlantis dC18, 2,1 mm x 100 mm, columna de 3 pm, velocidad de flujo de 0,6 ml/min a 40°C. Fase móvil AÁcido fórmico (aq.) al 0,1 % fase móvil B ácido fórmico (MeCN) al 0,1 %, inyección 3 pl, gradiente 0 minutos (orgánico al 5 %), 5 minutos (orgánico al 100 %), 5.4 minutos (orgánico al 100 %), 5,42 min (orgánico al 5 %), 7 min (orgánico al 5 %)
Ambos métodos de 3,5 y 7 minutos se realizaron en un sistema MS18 Shimadzu LCMS-2010EV o en un sistema MS19 Shimadzu LCMS-2010EV que utiliza bombas LC-20AB y detectores PDA SPD-M20A.
Los productos se purificaron por HPLC/MS con el uso del sistema de autopurificación Waters con 3100 Mass Detector.
Los análisis de HPLC además pueden realizarse en un Shimdazu LC-2010CHT con el uso de una columna YMC ODS-A, C18, (150x4,6x5 pm) a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 1,4 ml/min. Se utiliza un volumen de inyección de 10 pl y la detección se produce a través de UV/PDA. La fase móvil A es TFA al 0,05 % en agua y la fase móvil B es TFA al 0,05 % en acetonitrilo con un programa de gradiente de inicial B al 5 % hasta B al 95 % en 8 minutos, mantener durante 1,5 minutos, en 9,51 a 12 min B. conc. 0,5 %. El diluyente es la fase móvil.
Otro
La cromatografía en columna rápida automatizada se realizó en un Biotage Isolera versión 4. Cartucho SNAP de 10 g funcionando a 12 ml/min o un cartucho SNAP de 25 g funcionando a 25 ml/min y detectando a 254 nm y 280 nm.
Pueden realizarse reducciones de nitrilo seleccionadas en un ThalesNano H-Cube® de acuerdo con las condiciones descritas en el procedimiento experimental.
Otros procedimientos generales relacionados además pueden encontrarse en la publicación de patente PCT núm.WO12/118812, solicitud de patente PCT núm.PCT/US2012/033648y la solicitud de patente PCT núm.PCT/US2012/033662, cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.
Ejemplo 5: Síntesis de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
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Etapa 1: Síntesis de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico
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A una solución agitada de ácido 2-metil-3-nitrobenzoico (100 g, 552 mmol) en H2SO4 conc.(400 ml), se añadió 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindiona (88 g, 308 mmol) en porciones de forma gradual a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agitó después a temperatura ambiente durante 5 h. La mezcla de reacción se vertió en agua helada, el sólido precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío para proporcionar un compuesto deseado como un sólido (140 g, 98 %). El compuesto aislado se llevó directamente a la siguiente etapa. 1H NMR (d MSO-cÍ6, 400 MHz) 58,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H).
Etapa 2: Síntesis de 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo
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A una solución agitada de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (285 g, 1105 mmol) en DMF (2,8L) a temperatura ambiente se añadió carbonato de sodio (468 g, 4415 mmol) seguido de la adición de yoduro de metilo (626,6 g, 4415 mmol). La mezcla de reacción resultante se calentó a 60 °C durante 8 h. Una vez completada (controlada por TLC), la mezcla de reacción se filtró (para eliminar el carbonato de sodio) y se lavó con acetato de etilo (1L x 3). El filtrado combinado se lavó con agua (3l x 5) y la fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (1L X 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido (290g, rendimiento de 97 %). El compuesto aislado se llevó directamente a la siguiente etapa. 1H NMR (CDCls, 400 MHz) 58,17 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H).
Etapa 3: Síntesis de 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo
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A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (290 g, 1058 mmol) en etanol (1,5L) se añadió cloruro de amonio acuoso (283 g, 5290 mmol disuelto en 1,5L de agua). La mezcla resultante se agitó a 80°C a la que se añadió polvo de hierro (472 g, 8451 mmol) en una porción de forma gradual. La mezcla de reacción resultante se calentó a 80 °C durante 12 h. Una vez completado como se determinó por TLC, la mezcla de reacción se filtró en caliente sobre celite®y el lecho de celite se lavó con metanol (5L) seguido de lavado con MeOH al 30 % en DCM (5L). El filtrado combinado se concentró al vacío, el residuo obtenido se diluyó con solución acuosa de bicarbonato de sodio (2L) y se extrajo con acetato de etilo (5L x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido (220 mg, 85 %). El compuesto fue llevado directamente a la siguiente etapa. 1H NMR (CDCls, 400 MHz) 57,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (bs, 2H), 2,31 (s, 3H).
Etapa 4: Síntesis de 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il) amino) benzoato de metilo
Figure imgf000060_0001
A una solución agitada de 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (15 g, 61,5 mmol) y dihidro-2H-piran-4(3)-ona (9,2 g, 92 mmol) en dicloroetano (300 ml) se añadió ácido acético (22 g, 369 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después la mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (39 g, 184 mmol). La mezcla de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción como se determinó por TLC, se añadió solución acuosa de bicarbonato de sodio a la mezcla de reacción hasta que se obtuvo un pH de 7-8. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El compuesto bruto se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) eluyendo con acetato de etilo: hexano para proporcionar el compuesto deseado como un sólido (14 g, 69 %). 1H NMR (DMSO-CÍ6, 400 MHz) 57,01 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 5,00 (d, 1H, J=7,6 Hz), 3,84-3,87 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 3,54-3,56 (m, 1H), 3,43 (t, 2H, J=12 Hz), 2,14 (s, 3H), 1,81-1,84 (m, 2H), 1,47-1,55 (m, 2H).
Etapa 5: Síntesis de 5-bromo-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2-metilbenzoato de metilo
Figure imgf000060_0002
A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il) amino) benzoato de metilo (14 g, 42,7 mmol) en dicloroetano (150 ml) se le añadió acetaldehído (3,75 g, 85,2 mmol) y ácido acético (15,3 g, 256 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (27 g, 128 mmol). La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 3 horas. Una vez completada la reacción como se determinó por TLC, se añadió solución acuosa de bicarbonato de sodio a la mezcla de reacción hasta que se obtuvo un pH de 7-8, la fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El compuesto bruto se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) eluyendo con acetato de etilo: hexano para proporcionar el compuesto deseado como un líquido viscoso (14 g, 93 %). 1H NMR (DMSO-da, 400 MHz) 57,62 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 3,80 (bs, 5H), 3,31 (t, 2H), 2,97-3,05 (m, 2H), 2,87-2,96 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 1,52-1,61 (m, 2H), 1,37-1,50 (m, 2H), 0,87 (t, 3H, J = 6,8 Hz).
Etapa 6: Síntesis de 5-bromo-N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1, 2-dihidropiridin-3-il) metil)-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2-metilbenzamida
Figure imgf000060_0003
A una solución agitada de 5-bromo-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2-metilbenzoato (14 g, 39,4 mmol) en etanol (100 ml) se añadió NaOH acuoso (2,36 g, 59,2 mmol en 25 ml de agua) y la mezcla resultante se agitó a 60 °C durante 1 h. Una vez completada la reacción como se determinó por TLC, el disolvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo obtenido se acidificó con HCl IN hasta que se obtuvo un pH 7 y después se añadió solución acuosa de ácido cítrico hasta que se obtuvo un pH 5-6. La capa orgánica se extrajo con MeOH en DCM al 10 % (200mL X 3), las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para dar el ácido respectivo (14 g, 100 %).
El ácido anterior (14 g, 40,9 mmol) se disolvió después en DMSO (70 ml) y se le añadió 3-(amino metil)-4, 6-dimetilpiridin-2(1H)-ona (12,4 g, 81,9 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se añadió PYBOP (31,9 g, 61,4 mmol) y se continuó agitando durante toda la noche a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción como se determinó por TLC, la mezcla de reacción se vertió en agua helada (700 ml), se agitó durante 30 minutos y el sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua (500 ml) y se secó al aire. El sólido obtenido se agitó con acetonitrilo (75 ml x 2), se filtró y se secó al aire. El sólido obtenido se agitó nuevamente con MeOH al 5 % en DCM (100 ml), se filtró y se secó completamente al vacío para proporcionar el compuesto del título como un sólido (14 g, 74 %). 1H NMR (DMSO-de, 400 MHz) 5 11,47 (s, 1H), 8,23 (t, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,08 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,23 (d, 2H, J=4,4 Hz), 3,81 (d, 2H, J=10,4 Hz), 3,20-3,26 (m, 2H), 3,00-3,07 (m, 1H), 2,91-2,96 (m, 2H), 2,18 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,58-1,60 (m, 2H), 1,45-1,50 (m, 2H), 0,78 (t, 3H, J=6,8 Hz).
Etapa 7: Síntesis de N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1, 2-dihidropiridin-3-il) metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
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A una solución agitada de 5-bromo-N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1, 2-dihidropiridin-3-il) metil)-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2-metilbenzamida (14 g, 29,5 mmol) en una mezcla de dioxano/agua (70 ml/14 ml) se añadió 4-(4-(4, 4, 5, 5-tetrametil-1, 3, 2-dioxaborolan-2-il) bencil) morfolina (13,4 g, 44,2 mmol) seguido de la adición de Na2CO3(11,2 g, 106,1 mmol). La solución se purgó con argón durante 15 minutos y después Pd (PPh3 )4 (3,40 g, 2,94 mmol) se añadió y la solución se purgó nuevamente con argón durante 10 minutos más. La mezcla de reacción se calentó a 100°C durante 4 h. Después de la terminación (monitoreado por TLC); la mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con MeOH/DCM al 10 %. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El compuesto bruto se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) eluyendo con metanol: DCM al compuesto del título como un sólido (12 g, 71 %). Datos analíticos: LCMS: 573,35 (M 1)+; HPLC: 99,5 % (@ 254 nm) (Rr; 3,999; Método: Columna: YMC ODS-A 150 mm x 4,6 mm x 5 p; Fase móvil: A; TFA al 0,05 % en agua/ B; TFA al 0,05 % en acetonitrilo; Vol de Inj.: 10 pl, Temperatura de Col.: 30 °C; Velocidad de flujo: 1,4 ml/min.; Gradiente: B al 5 % a B al 95 % en 8 min, Mantener durante 1,5 min, 9,51-12 min B al 5 %); 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 5 11,46 (s, 1H), 8,19 (t, 1H), 7,57 (d, 2H, J=7,2 Hz), 7,36-7,39 (m, 3H), 7,21 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,28 (d, 2H, J=2,8 Hz), 3,82 (d, 2H, J=9,6 Hz), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,24 (t, 2H, J=10,8Hz), 3,07-3,09 (m, 2H), 3,01 (m, 1H), 2,36 (m, 4H), 2,24 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,64-1,67 (m, 2H), 1,51-1,53 (m, 2H), 0,83 (t, 3H, J = 6,4 Hz). Etapa 8: Síntesis de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida trihidrocloruro
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N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1, 2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida (12 g, 21,0 mmol) se disolvió en HCl metanólico (200 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de tres horas de agitación, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El sólido obtenido se agitó con éter (100 ml x 2) para proporcionar la sal deseada como un sólido (11 g, 77 %). Datos analíticos de la sal tri-HCl: LCMS: 573,40 (M 1)+; HPLC: 99,1 % (@ 254 nm) (Rr; 3,961; Método: Columna: YMC ODS-A 150 mm x 4,6 mm x 5 p; Fase móvil: A; TFA al 0,05 % en agua/ B; TFA al 0,05 % en acetonitrilo; Vol. de Inj.: 10 pl, Temperatura de la col.: 30 °C; Velocidad de flujo: 1,4 ml/min.; Gradiente: B al 5 % a B al 95 % en 8 min, Mantener durante 1,5 min, 9,51-12 min B al 5 %); 1H RMN (D2O 400 MHz) 57,92 (bs, 1H,) 7,80 (s, 1H), 7,77 (d, 2H, J=8 Hz), 7,63 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 6,30 (s, 1H), 4,48 (s, 2H), 4,42 (s, 2H), 4,09-4,11 (m, 4H), 3,95-3,97 (m, 2H), 3,77 (t, 3H, J=10,4 Hz), 3,44-3,47 (m, 3H), 3,24-3,32 (m, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,01 (m, 2H), 1,76 (m, 2H), 1,04 (t, 3H, J=6,8 Hz).
Ejemplo de referencia 6: N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(((1r,4r)-4-(dimetilamino)ciclohexil)(etil)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
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Etapa 1: Ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico
A una solución agitada de ácido 2-metil-3-nitrobenzoico (100 g, 552,48 mmol) en H2SO4 conc.(400 ml), se añadió 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindiona (87,98 g, 307,70 mmol) en una porción de forma gradual a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó después a temperatura ambiente durante 5 h. La mezcla de reacción se vertió en agua helada, el sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó bajo vacío para proporcionar el ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico sólido blanquecino deseado (140 g, rendimiento 97,90 %). 1H NMR (DMSO-cfó, 400 MHz) 8 8,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H).
Etapa 2: 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo
A una solución agitada de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (285 g, 1104,65 mmol) en DMF (2,8L) se le añadió carbonato de sodio (468 g, 4415,09 mmol) seguido de la adición de yoduro de metilo (626,63 g, 4415 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se agitó a 60 °C durante 8 h. La mezcla de reacción se filtró después para eliminar los sólidos en suspensión que se lavaron bien con acetato de etilo (3 x 1 L). Los filtrados combinados se lavaron bien con agua (5 x 3 L) y la fase acuosa se extrajo nuevamente con acetato de etilo (3 x 1 L). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo como un sólido blanquecino (290 g, rendimiento 97 %). 1H NMR (CDCla, 400 MHz) 8 8,17 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H).
Etapa 3: 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo
A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (290 g, 1058,39 mmol) en etanol (1,5 L) se añadió cloruro de amonio acuoso (283 g, 5290 mmol disuelto en 1,5 L de agua). La mezcla resultante se agitó y calentó a 80 °C seguido de la adición de polvo de hierro (472 g, 8451 mmol) en porciones a 80 °C. La mezcla de reacción resultante se calentó a 80 °C durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró después en caliente a través de Celite® y el lecho de Celite® se lavó bien con metanol (5 L) y después con MeOH al 30 % en DCM (5 L). Los filtrados combinados se concentraron al vacío y el residuo obtenido se diluyó con bicarbonato acuoso (2 L) y se extrajo con acetato de etilo ( 3 x 5 L). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo como un sólido marrón (220 g, rendimiento 89,41 %).
Una porción del producto (5 g) se disolvió en etanol caliente (20 ml), el residuo insoluble se filtró y las aguas madres se concentraron para obtener 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (3,5 g, rendimiento 70 %) con pureza por HPLC 93,81 % como sólido marrón claro. 1H NMR (CDCla, 400 MHz) 8 7,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (bs, 2H), 2,31 (s, 3H).
Etapa 4: 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexil)amino)-2-metilbenzoato de metilo
A una solución agitada de 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (5 g, 20,5 mmol) y carbamato de terc-butilo (4-oxociclohexil) (5,69 g, 26,7 mmol) en dicloroetano (50 ml), ácido acético (7,4 g, 123 mmol) se añadió y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (13,1 g, 61,7 mmol) a 0°C y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se desactivó con bicarbonato de sodio acuoso, la fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (tamaño de malla 1 0 0 -2 0 0 ) eluyendo con acetato de etilo al 10 % en hexano para proporcionar 3,5 g del isómero (trans) más polar, metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexil)amino)-2-metilbenzoato, como un sólido (38,46 %). 1H NMR (CDCh, 400 MHz) 8 7,21 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 4,41 (bs, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,60 (m, 1H), 3,45 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,15 (bs, 2H), 2,05 (bs, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,30 (m, 4H).
Etapa 5: 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexil)-(etil)amino)-2-metilbenzoato de metilo
A una solución agitada de 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato de metilo (55 g, 0,124 mol) y acetaldehído (11 g, 0,25 mol) en dicloroetano (550 ml), se añadió ácido acético (44,64 g, 0,744 mol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (79 g, 0,372 mol) a 0°C y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se desactivó con bicarbonato de sodio acuoso, la fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con diclorometano. Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron al vacío. El compuesto bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (tamaño de malla 100-200) eluyendo con acetato de etilo al 10 % en hexano para proporcionar 44 g de metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexil)-(etil)amino)-2-metilbenzoato (75,2 %) como un sólido. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 87,55 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 6,65 (d, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,15 (bs, 1H), 3,05 (q, 2H), 2,60 (m, 1H), 2,30 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,40 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,80 (t, 3H).
Etapa 6: ((1r,4r)-4-((5-bromo-3-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-2-metilfenil)(etil)amino)ciclohexil)carbamato de terc-butilo
NaOH acuoso (3,5 g, 0,08 mol en 10 ml de H2O) se añadió a una solución de 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((tercbutoxicarbonil)amino)ciclohexil)-(etil)amino)-2-metilbenzoato de metilo (25 g, 0,053 mol) en EtOH (100 ml) y se agitó a 60 °C durante 1 h. Después se eliminó el etanol bajo presión reducida y se acidificó a pH 8 con HCl diluido y a pH 6 con ácido cítrico. La mezcla se extrajo con metanol al 10 % en DCM (3 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron y se concentraron dando el ácido respectivo (24,2 g, 99,0%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 813,13 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,68 (d, 1H), 3,14 (bs, 1H), 3,03 (q, 2H), 2,56 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,80-1,65 (m, 4H), 1,40 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,77 (t, 3H).
El ácido (24 g, 0,053 mol) se disolvió en DMSO (100 ml) y se añadió 3-(aminometil)-4,6-dimetilpiridin-2(1H)-ona (16 g, 0,106 mol) y trietilamina (5,3 g, 0,053 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de que se añadiera PyBop (41 g, 0,079 mmol) y después se continuó la agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se vertió en agua helada (1L). El precipitado resultante se recogió mediante filtración, se lavó bien con agua (2 x 1L) y se secó. El producto obtenido se purificó adicionalmente mediante lavados con acetonitrilo (3 x 200 ml) y DCM (100 ml) para proporcionar terc-butil((1r,4r)-4-((5-bromo-3-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-2-metilfenií)(etil)amino)ciclohexil)-carbamato (24 g, 77 %). 1H Nm R (DMSO-d6, 400 MHz) 8 11,47 (s, 1H), 8,24 (t, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,04 (s, 1H), 6,67 (d, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,24 (d, 2H), 3,13 (bs, 1H), 3,01 (q, 2H), 2,53 (m, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,10 (s, 6H), 1,80-1,65 (m, 4H), 1,40 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,77 (t, 3H).
Etapa 7: terc-butil ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-il)(etil)amino)ciclohexil)carbamato
A una solución agitada de terc-butil ((1r,4r)-4-((5-bromo-3-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-2-metilfenil)(etil)amino)ciclohexil)-carbamato (24 g, 0,041 mol) y 4-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencil)morfolina (18 g, 0,061 mol) en una mezcla de dioxano/ agua (160 ml 40 ml, Na2CO3 (15 g, 0,15 mol) se añadió y la solución se purgó con argón durante 15 minutos. Pd(PPh3 )4 (4,7 g, 0,041 mol) se añadió después y la mezcla de reacción se purgó nuevamente con argón durante 10 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 100 °C durante 4 h. La mezcla de reacción se diluyó después con MeOH/ DCM 10 % (500 ml) y se filtró. El filtrado se concentró, se diluyó con agua (500 ml) y se extrajo con MeOH al 10 % en DCM (3 x 500 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y los solventes se eliminaron bajo presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (malla 100-200) eluyendo con MeOH al 7 % en DCM para proporcionar ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-il)(etil)amino)ciclohexil)carbamato de tercbutilo (20 g, 71,43%). 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 811,46 (s, 1H), 8,20 (t, 1H), 7,56 (d, 2H), 7,36 (m, 3H), 7,17 (s, 1H), 6,66 (d, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,28 (d, 2H), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,20-3,05 (m, 3H), 2,62 (m, 1H), 2,36 (bs, 4H), 2,20 (s, 6H), 2,10 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,42 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,82 (t, 3H).
Etapa 8: 5-(((1r,4r)-4-aminociclohexil)(etil)amino)-N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
A una solución agitada de ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-il)(etil)amino)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (20 g, 0,03 mol) en DCM (200 ml) a 0 °C, TFA (75 ml) se añadió y la reacción se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró después hasta sequedad y el residuo se basificó con solución acuosa saturada de bicarbonato (300 ml) a pH 8. La mezcla se extrajo con metanol al 20 % en DCM (4 x 200 m). Los extractos combinados se secaron sobre Na2SO4y el solvente se eliminó bajo presión reducida para proporcionar 5-(((1r,4r)-4-aminociclohexil)(etil)amino)-N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida (15,5 g, 91 %) que se usó como está en la siguiente reacción. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 88,18 (bs, 1H), 7,57 (d, 2H), 7,38 (m, 3H), 7,20 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,29 (d, 2H), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,31 (bs, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,91 (m, 1H), 2,67 (m, 1H), 2,36 (bs, 4H)), 2,21 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,23 (m, 2H), 0,83 (t, 3H).
Etapa 9: N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(((1r,4r)-4-(dimetilamino)ciclohexil)(etil)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
A una solución agitada de 5-(((1r,4r)-4-aminociclohexil)(etil)amino)-N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida (14 g, 0,023 mol) en diclorometano (150 ml) se añadió solución acuosa de formaldehído al 35 % (2,4 g, 0,080 mol) a 0° C. Después de agitar durante 20 min, Na(OAc)3 se añadió BH (12,2 g, 0,057 mol) y la agitación continuó durante 2 horas a 0° C. Después se añadió agua (100 ml) a la mezcla de reacción y la mezcla se extrajo con metanol al 20 % en DCM (3 x 200 ml). Los extractos combinados se secaron sobre Na2SO4y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de alúmina básica eluyendo con MeOH al 6-7 % en DCM para proporcionar el compuesto del título (10 g, 63,6 %). LCMS: 614,65 (M 1)+; HPLC: 98,88 % (@ 210-370 nm) (Rí; 3,724; Método: Columna: YMC ODS-A 150 mm x 4,6 mm x 5 p; Fase móvil: A; TFA al 0,05 % en agua/ B; TFA al 0,05 % en acetonitrilo; Vol. de Inj.: 10 pl, Temperatura de la Col.: 30 °C; Velocidad de flujo: 1,4 ml/min.; Gradiente: B al 5 % a B al 95 % en 8 min, Mantener durante 1,5 min, 9,51-12 min B al 5 %); 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 811,45 (s, 1H), 8,17 (t, 1H), 7,56 (d, 2H, J=8 Hz), 7,36 (m, 3H), 7,17 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,29 (d, 2H, J=4,4 Hz), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,09 (q, 2H), 2,66 (m, 1H), 2,36 (bs, 4H), 2,21 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,11 (s, 9H), 1,79 (m, 4H), 1,36 (m, 2H), 1,11 (m, 2H), 0,82 (t, 3H, J=6,4 y 6,8 Hz).
Ejemplo 7: Protocolo de bioensayo y métodos generales
Protocolo para ensayos de enzimas PRC2 de tipo silvestre y mutantes
Materiales generales. S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteína (SAH), bicina, KCl, Tween20, dimetilsulfóxido (DMSO) y gelatina de piel bovina (BSG) se compraron de Sigma-Aldrich con el mayor nivel de pureza posible. El ditiotreitol (DTT) se compró de EMD. 3H-SAM se compró de American Radiolabeled Chemicals con una actividad específica de 80 Ci/mmol. Se compraron placas de destello de estreptavidina de 384 pocillos de PerkinElmer.
Sustratos. Los péptidos representativos de los residuos de histona humana H3 21-44 que contienen una lisina no modificada 27 (H3K27me0) o lisina dimetilada 27 (H3K27me2) se sintetizaron con un motivo de etiqueta de afinidad de enlace C-terminal G (K-biotina) y una caperusa amida C-terminal por 21st Century Biochemicals. Los péptidos se purificaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con una pureza superior al 95 % y se confirmaron por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). Las secuencias se enumeran más abajo.
H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK (biotina)-amida (SEQ ID NO: 13)
H3K27me2: ATKAARK (me2) SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEQ ID NO: 14)
Los oligonucleosomas de eritrocitos de pollo se purificaron de la sangre de pollo de acuerdo con los procedimientos establecidos.
Complejos recombinantes de PRC2. Los complejos PRC2 humanos se purificaron como complejos enzimáticos de 4 componentes coexpresados en células Spodopíera frugiperda (sf9) que usan un sistema de expresión de baculovirus. Las subunidades expresadas fueron EZH2 de tipo silvestre (NM_004456) o EZH2 Y641F, N, H, S o C mutantes generados a partir de la construcción EZH2 de tipo silvestre, EED (NM_003797), Suz12 (NM_015355) y RbAp48 (NM_005610). La subunidad EED contenía una etiqueta FLAG N-terminal que se usó para purificar todo el complejo de 4 componentes de los lisados de células sf9. La pureza de los complejos alcanzó o excedió el 95 % como se determinó por SDS-PAGE y el análisis Agilent Bioanalyzer. Se determinaron las concentraciones de las concentraciones de reserva enzimática (generalmente 0,3 - 1,0 mg/ml) con el uso de un ensayo de Bradford contra un estándar de albúmina de suero bovino (BSA).
Procedimiento general para ensayos de enzimas PRC2 en sustratos peptídicos. Todos los ensayos se realizaron en un tampón que consiste en bicina 20 mM (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, BSG al 0,005 % y Tween20 al 0,002 %, preparado el día de uso. Los compuestos en DMSO al 100 % (1 pl) se colocaron en placas de fondo en V de polipropileno de 384 pocillos (Greiner) con el uso de un Platemate 2 X 3 equipado con una cabeza de pipeta de 384 canales (Thermo). Se añadió DMSO (1 pl) a las columnas 11, 12, 23, 24, filas A - H para el control de la señal máxima, y SAH, un producto conocido e inhibidor de PRC2 (1 pl) a las columnas 11,12, 23, 24, filas I - P para el control de la señal mínima. Multidrop Combi (Thermo) añadió un cóctel (40 pl) que contenía la enzima PRC2 de tipo silvestre y el péptido H3K27me0 o cualquiera de las enzimas mutantes Y641 y el péptido H3K27me2. Los compuestos se dejaron incubar con PRC2 durante 30 min a 25°C, después se añadió un cóctel (10 pl) que contenía una mezcla de no radiactiva y H-SAM para iniciar la reacción (volumen final = 51 pl). En todos los casos, las concentraciones finales fueron las siguientes: la enzima PRC2 de tipo silvestre o mutante fue de 4 nM, la SAH en los pocillos de control de señal mínima fue de 1 mM y la concentración de DMSO fue del 1 %. Las concentraciones finales del resto de los componentes se indican en la Tabla 7, más abajo. Los ensayos se detuvieron mediante la adición de SAM no radioactivo (10 pl) a una concentración final de 600 pM, que diluye el 3H-SAM a un nivel donde su incorporación en el sustrato peptídico ya no es detectable. Después se transfirieron 50 pl de la reacción en la placa de polipropileno de 384 pocillos a una placa de destello de 384 pocillos y se dejó que los péptidos biotinilados se unieran a la superficie de estreptavidina durante al menos 1 h antes de lavarlos tres veces con Tween20 al 0,1 % en un lavador de placas Biotek ELx405. Las placas se leyeron en un lector de placas PerkinElmer TopCount para medir la cantidad de péptido marcado con 3H unido a la superficie de la placa de destello, medido como desintegraciones por minuto (dpm) o, alternativamente, denominado recuentos por minuto (cpm).
Tabla 7: Concentraciones finales de componentes para cada variación de ensayo basada en la identidad EZH2 (EZH2 mutante de tipo silvestre o Y641)
Figure imgf000065_0002
Procedimiento general para el ensayo enzimático PRC2 de tipo silvestre en sustrato de oligonucleosomas. Los ensayos se realizaron en un tampón compuesto por bicina 20 mM (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, BSG al 0,005 %, KCl 100 mM y Tween20 al 0,002 %, preparado el día de uso. Los compuestos en DMSO al 100 % (1 ^l) se colocaron en placas de fondo en V de polipropileno de 384 pocillos (Greiner) con el uso de un Platemate 2 X 3 equipado con una cabeza de pipeta de 384 canales (Thermo). Se añadió DMSO (1 |jl) a las columnas 11, 12, 23, 24, filas A - H para el control de la señal máxima, y SAH, un producto conocido e inhibidor de PRC2 (1 ^l) a las columnas 11,12, 23, 24, filas I - P para el control de la señal mínima. Multidrop Combi (Thermo) añadió un cóctel (40 ^l) que contenía la enzima PRC2 de tipo silvestre y el oligonucleosoma de eritrocitos de pollo. Los compuestos se dejaron incubar con PRC2 durante 30 min a 25 °C, después un cóctel (10 |jl) que contenía una mezcla de sustancias no radiactivas y 3se añadió H-SAM para iniciar la reacción (volumen final = 51 ^l). Las concentraciones finales fueron las siguientes: la enzima PRC2 de tipo silvestre fue de 4 nM, la SAM no radioactiva fue de 430 nM, la H-SAM fue de 120 nM, el olignonucleosoma de eritrocitos de pollo fue de 120 nM, la SAH en los pocillos de control de señal mínima fue de 1 mM y la concentración de DMSO fue al 1 %. El ensayo se detuvo mediante la adición de SAM no radioactivo (10 ^l) a una concentración final de 600 ^M, lo que diluye e1H-SAM a un nivel donde su incorporación al sustrato de olignonucleosoma de eritrocitos de pollo ya no es detectable. Después, se transfirieron 50 ^l de la reacción en la placa de polipropileno de 384 pocillos a una placa de destello de 384 pocillos y los nucleosomas de eritrocitos de pollo se inmovilizaron en la superficie de la placa, que después se lavó tres veces con Tween 20 al 0,1 % en una lavadora de placa Biotek ELx405. Las placas se leyeron en un lector de placas PerkinElmer TopCount para medir la cantidad de oligonucleosoma de eritrocitos de pollo marcado con 3H unido a la superficie de la placa de destello, medido como desintegraciones por minuto (dpm) o, alternativamente, referido como recuentos por minuto (cpm).
Cálculo de % de inhibición
Figure imgf000065_0001
Donde dpm = desintegraciones por minuto, cmpd = señal en el pocillo de ensayo, y min y max son los respectivos controles de la señal mínima y máxima.
Ajuste de cuatro parámetros IC50
(Superior-Inferior)
V 1 — Inferior
1 - Coeficiente de Hill
K x )
Donde las partes superior e inferior normalmente se les permite flotar, pero pueden fijarse a 100 o 0 respectivamente en un ajuste de 3 parámetros. El Coeficiente de Hill normalmente permite flotar, pero además puede fijarse en 1 en un ajuste de 3 parámetros. Y es el % de inhibición y X es la concentración del compuesto.
Los valores de IC50 para los ensayos de enzimas PRC2 en sustratos peptídicos (por ejemplo, EZH2 tipo silvestre e Y641F) se presentan en la Tabla 8 más abajo.
Ensayo de metilación de WSU-DLCL2
Las células de suspensión WSU-DLCL2 se compraron de DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania). El medio RPMI/Glutamax, la penicilina-estreptomicina, el suero bovino fetal inactivado por calor y el D-PBS se compraron de Life Technologies, Grand Island, NY, Estados Unidos. El tampón de extracción y el tampón de neutralización (5X) se compraron de Active Motif, Carlsbad, CA, Estados Unidos. El anticuerpo anti-histona H3 de conejo se compró de Abcam, Cambridge, MA, Estados Unidos. Se compraron anti-H3K27me3 de conejo y anti-IgG de conejo conjugada con HRP de Cell Signaling Technology, Danvers, MA, Estados Unidos. El sustrato "Super sensible" TMB se obtuvo de BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, Estados Unidos. La albúmina de suero bovino libre de IgG se compró de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Estados Unidos. PBS con Tween (PBST 10X) se compró de KPL, Gaithersburg, MD, Estados Unidos. El ácido sulfúrico se compró de Ricca Chemical, Arlington, TX, Estados Unidos. Las placas Immulon ELISA se compraron en Thermo, Rochester, NY, Estados Unidos. Las placas de cultivo celular con fondo en V se compraron en Corning Inc., Corning, NY, Estados Unidos. Las placas de polipropileno con fondo en V se compraron en Greiner Bio-One, Monroe, NC, Estados Unidos.
Las células en suspensión WSU-DLCL2 se mantuvieron en medio de crecimiento (RPMI 1640 suplementado con 10 % v/v de suero bovino fetal inactivado por calor y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) y se cultivaron a 37 °C bajo CO2al 5 %. En condiciones de ensayo, las células se incubaron en medio de ensayo (RPMI 1640 suplementado con 20 % v/v de suero bovino fetal inactivado por calor y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) a 37 °C bajo CO2 al 5 % en un agitador de placas.
Las células WSU-DLCL2 se sembraron en medio de ensayo a una concentración de 50,000 células por ml en una placa de cultivo celular de fondo en V de 96 pocillos con 200 ^l por pocillo. El compuesto (1^l) de placas fuente de 96 pocillos se añadió directamente a la placa de células con fondo en V. Las placas se incubaron en un agitador de placa de titulación a 37 °C, CO2 al 5 % durante 96 horas. Después de cuatro días de incubación, las placas se centrifugaron a 241 x g durante cinco minutos y el medio se aspiró suavemente de cada pocillo de la placa celular sin alterar el sedimento celular. El sedimento se resuspendió en 200 ^l de DPBS y las placas se centrifugaron nuevamente a 241 x g durante cinco minutos. El sobrenadante se aspiró y se añadió tampón de extracción frío (4 °C) (100 ^l) por pocillo. Las placas se incubaron a 4 °C en un agitador orbital durante dos horas. Las placas se centrifugaron a 3427 x g x 10 minutos. El sobrenadante (80 ^l por pocillo) se transfirió a su pocillo respectivo en una placa de polipropileno con fondo en V de 96 pocillos. Se añadió tampón de neutralización 5X (20 ^l por pocillo) a la placa de polipropileno con fondo en V que contenía el sobrenadante. Las placas de polipropileno con fondo en V que contenían preparación de histona cruda (CHP) se incubaron en agitador orbital x cinco minutos. Se añadieron preparaciones de histona bruta (2 ^l por pocillo) a cada pocillo respectivo en placas ELISA duplicadas de 96 pocillos que contenían 100 ^l de tampón de recubrimiento (PBS IX BSA 0,05 % p/v). Las placas se sellaron y se incubaron durante toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con 300 ^l por pocillo de PBST IX. Los pocillos se bloquearon durante dos horas con 300 ^l de diluyente ELISA por pocillo ((PBS (IX) BSA (2 % p/v) y Tween20 (0,05 % v/v)). Las placas se lavaron tres veces con PBST IX. Para la placa de detección de Histona H3, se añadieron 100 ^l por pocillo de anticuerpo anti-Histona-H3 (Abcam, ab1791) diluido 1:10,000 en diluyente de ELISA. Para la placa de detección de trimetilación H3K27, se añadieron 100 ^l por pocillo de anti-H3K27me3 diluido 1:2000 en diluyente de ELISA. Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 ^l de PBST IX por pocillo. Para la detección de Histona H3, se añadieron por pocillo 100 ^l de anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con HRP diluido a 1:6000 en diluyente de ELISA. Para la detección de H3K27me3, se añadieron por pocillo 100 ^l de anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con HRP diluido a 1:4000 en diluyente de ELISA. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces con 300 ^l por pocillo de PBST IX. Se añadió 100 ^l por pocillo de sustrato TMB. Las placas de histona H3 se incubaron durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las placas H3K27me3 se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico IN (100 ^l por pocillo). La absorbancia para cada placa se leyó a 450 nm.
Primero, la relación para cada pocillo se determinó mediante:
Valor DO 450 de H3K27m e3 '
1 Valor DO 450 de H istona H3 , )
Cada placa incluyó ocho pocillos de control de tratamiento solo con DMSO (inhibición mínima), así como ocho pocillos de control para la inhibición máxima (pocillos de fondo).
Se calculó el promedio de la relación de valores para cada tipo de control y se usó para determinar el porcentaje de inhibición para cada pocillo de prueba en la placa. El compuesto de prueba se diluyó en serie tres veces en DMSO para un total de diez concentraciones de prueba, comenzando a 25 ^M. Se determinó el porcentaje de inhibición y se generaron las curvas de IC5o con el uso de pocillos duplicados por concentración de compuesto. Los valores IC5o para este ensayo se presentan en la Tabla 8 más abajo.
Porcentaje de inhibición = 100-
.■ (Relación de muestra de prueba individual)-(Relación promedio de fondo)
Figure imgf000066_0001
' (Relación de inhibición mínima)-(Relación promedio de fondo) 100
Análisis de la proliferación celular
Las células de suspensión WSU-DLCL2 se compraron de DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania). Se compraron RPMI/medio Glutamax, penicilina-estreptomicina, suero bovino fetal inactivado por calor de Life Technologies, Grand Island, NY, Estados Unidos. Se compraron placas de polipropileno de 384 pocillos con fondo en V de Greiner Bio-One, Monroe, NC, Estados Unidos. Se compraron placas opacas blancas de 384 pocillos para el cultivo de células de Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos. Cell-Titer Glo® se compró de Promega Corporation, Madison, WI, Estados Unidos. El lector de placas SpectraMax M5 se compró de Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, Estados Unidos.
Las células en suspensión WSU-DLCL2 se mantuvieron en medio de crecimiento (RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % v/v y cultivado a 37 °C bajo CO2 al 5 %. En condiciones de ensayo, las células se incubaron en medio de ensayo (RPMI 1640 suplementado con 20 % v/v de suero bovino fetal inactivado por calor y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) a 37 °C bajo CO2 al 5 %.
Para la evaluación del efecto de los compuestos sobre la proliferación de la línea celular WSU-DLCL2, las células en crecimiento exponencial se colocaron en placas opacas blancas de 384 pocillos a una densidad de 1250 células/ml en un volumen final de 50 pl de medio de ensayo. Se preparó una placa fuente de compuesto realizando diluciones en serie triples de nueve puntos y 3 veces en DMSo , comenzando a 10 mM (la concentración máxima final de compuesto en el ensayo fue 20 pM y el DMSO fue 0.2 %). Se añadió una alícuota de 100 nl de la placa de reserva del compuesto a su pocillo respectivo en la placa de células. El control de inhibición al 100 % consistió en células tratadas con una concentración final de 200 nM de estaurosporina y el control de inhibición al 0 % consistió en células tratadas con DMSO. Después de la adición de los compuestos, las placas de ensayo se incubaron durante 6 días a 37 °C, CO2 al 5 %, humedad relativa > 90 % durante 6 días. La viabilidad celular se midió mediante la cuantificación del ATP presente en los cultivos celulares, añadiendo 35 pl de reactivo CellTiter-Glo®® a las placas celulares. La luminiscencia se leyó en el SpectraMax M5. La concentración que inhibe la viabilidad celular en un 50 % se determinó con el uso de un ajuste paramétrico de 4 de las curvas de respuesta a la dosis normalizadas.
No se pretende que la mención de publicaciones y de documentos de patentes sean una admisión de que cualquier técnica anterior es pertinente, ni constituye cualquier admisión referente a los contenidos o fecha de los mismos. Los expertos en la técnica reconocerán que la invención ahora descrita por medio de una descripción escrita, puede practicarse en una variedad de modalidades y que la descripción precedente y los ejemplos anteriores son para fines ilustrativos y no son limitativos de las reivindicaciones que siguen.
Equivalentes
La invención puede modelarse de otras formas específicas sin apartarse de las características esenciales de esta. Por lo tanto las modalidades anteriores deben considerarse ilustrativas en todos los aspectos en lugar de limitativas de la invención descrita en la presente descripción. El alcance de la invención se indica así por las reivindicaciones adjuntas más que por la descripción anterior.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de EZH2 para usar en el tratamiento del sarcoma epitelioide, en donde el inhibidor de EZH2 es:
Figure imgf000068_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos.
2. El inhibidor de EZH2 para usar de acuerdo con la reivindicación 1, para tratar o aliviar un síntoma de un cáncer asociado a un complejo SWI/SNF en un sujeto, caracterizado porque el sujeto tiene sarcoma epitelioide, en donde se identifica que el sujeto tiene una expresión alterada y/o pérdida de función del complejo SWI/SNF o uno o más componentes del complejo SWI/SNF.
3. El inhibidor de EZH2 para usar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el cáncer asociado a SWI/SNF se caracteriza por una expresión reducida o pérdida de función del complejo SWI/SNF o uno o más componentes del complejo s W i/SNF.
4. El inhibidor de EZH2 para usar de acuerdo con la reivindicación 3, en donde uno o más componentes se seleccionan del grupo que consiste en SNF5, ATRX y ARID1A.
5. El inhibidor de EZH2 para usar de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la pérdida de función es causada por una mutación de pérdida de función que resulta de una mutación puntual, una supresión y/o una inserción.
6. El inhibidor de EZH2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene una supresión de SNF5.
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US (7) US9688665B2 (es)
EP (2) EP2908823B1 (es)
JP (5) JP6351182B2 (es)
KR (3) KR102021642B1 (es)
CN (2) CN105142642B (es)
AU (4) AU2013331368A1 (es)
BR (1) BR112015008447A2 (es)
CA (2) CA2887243C (es)
CY (1) CY1122186T1 (es)
ES (1) ES2750199T3 (es)
HR (1) HRP20191814T1 (es)
HU (1) HUE046790T2 (es)
IL (4) IL288181B2 (es)
LT (1) LT2908823T (es)
MX (2) MX376008B (es)
NZ (2) NZ706836A (es)
PL (1) PL2908823T3 (es)
PT (1) PT2908823T (es)
RS (1) RS59541B1 (es)
RU (2) RU2677276C2 (es)
SI (1) SI2908823T1 (es)
SM (1) SMT201900593T1 (es)
WO (1) WO2014062720A2 (es)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130102477A1 (en) 2010-06-23 2013-04-25 Ryan D. Morin Biomarkers for non-hodgkin lymphomas and uses thereof
JO3363B1 (ar) 2011-04-13 2019-03-13 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
WO2013075084A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Constellation Pharmaceuticals Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
CA2862289C (en) 2012-02-10 2019-11-26 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
DK3628670T3 (da) 2012-04-13 2022-12-05 Epizyme Inc Saltform til ezh2-hæmning
CN105102432B (zh) 2012-10-15 2019-01-04 Epizyme股份有限公司 经取代的苯化合物
KR102021642B1 (ko) 2012-10-15 2019-09-16 에피자임, 인코포레이티드 암을 치료하는 방법
US8993555B2 (en) 2012-12-21 2015-03-31 Epizyme, Inc. PRMT5 inhibitors and uses thereof
WO2014151142A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
WO2015023915A1 (en) 2013-08-15 2015-02-19 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Indole derivatives as modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
EP3057962B1 (en) 2013-10-16 2023-10-18 Epizyme, Inc. Hydrochloride salt form for ezh2 inhibition
AU2014337121A1 (en) * 2013-10-18 2016-04-14 Epizyme, Inc. Method of treating cancer
EP3076977B1 (en) 2013-12-06 2021-03-03 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
BR112016029492A2 (pt) * 2014-06-17 2017-10-17 Eisai R&D Man Co Ltd método para tratamento de linfoma não hodgkin
CA2952285A1 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Biomarkers for response to ezh2 inhibitors
MX383635B (es) * 2014-10-16 2025-03-14 Epizyme Inc Método para tratar el cáncer.
SG11201703806XA (en) * 2014-11-17 2017-06-29 Epizyme Inc Method for treating cancer
TW201636344A (zh) 2014-12-05 2016-10-16 美國禮來大藥廠 Ｅｚｈ２抑制劑
EP3236962A2 (en) 2014-12-23 2017-11-01 University of Copenhagen Treatment of cancer by inhibiting ezh2 activity
EA201792304A1 (ru) * 2015-04-20 2018-03-30 Эпизайм, Инк. Комбинированная терапия для лечения рака
AU2016275051A1 (en) 2015-06-10 2017-12-07 Epizyme, Inc. EZH2 inhibitors for treating lymphoma
CN108025191A (zh) 2015-08-24 2018-05-11 Epizyme股份有限公司 治疗癌症的方法
TW201718598A (zh) 2015-08-27 2017-06-01 美國禮來大藥廠 Ｅｚｈ２抑制劑
US10577350B2 (en) 2015-08-28 2020-03-03 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of (R)-N-((4-methoxy-6-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl)-2-methyl-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroethyl)piperidin-4-yl)ethyl)-1H-indole-3-carboxamide
MX2018003663A (es) * 2015-09-25 2018-08-14 Epizyme Inc Metodo de tratamiento de tumor rabdoide maligno del ovario (mrto) /cancer microcitico del ovario del tipo hipercalcemico (sccoht) con un inhibidor de ezh2.
WO2017062495A2 (en) * 2015-10-06 2017-04-13 Epizyme, Inc. Method of treating medulloblastoma with an ezh2 inhibitor
US20190070188A1 (en) * 2015-11-06 2019-03-07 Epizyme, Inc. Pediatric dosing for treatment of cancer with an ezh2 inhibitor
CN105440023A (zh) * 2015-12-10 2016-03-30 江苏理工学院 Epz-6438的合成方法
WO2017132518A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
WO2017139404A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Epizyme, Inc. Methods of treating cancer
US10933068B2 (en) * 2016-05-26 2021-03-02 Sonic Master Limited Modulators of DUX4 for regulation of muscle function
US11786533B2 (en) 2016-06-01 2023-10-17 Epizyme, Inc. Use of EZH2 inhibitors for treating cancer
WO2017214373A1 (en) * 2016-06-08 2017-12-14 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
US11147819B2 (en) 2016-06-17 2021-10-19 Epizyme, Inc. EZH2 inhibitors for treating cancer
WO2018034801A1 (en) * 2016-08-15 2018-02-22 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of treating arid1a-mutated cancers with hdac6 inhibitors and ezh2 inhibitors
US11433068B2 (en) * 2016-09-08 2022-09-06 The General Hospital Corporation Treatment of cancers having alterations within the SWI/SNF chromatin remodeling complex
EP3529242A1 (en) 2016-10-19 2019-08-28 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of inhibitors of ezh2
WO2018076060A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Genea Ip Holdings Pty Ltd Improved generation of muscle lineage cells and therapeutic uses thereof
CN108314677B (zh) 2017-01-17 2020-06-30 安徽中科拓苒药物科学研究有限公司 一种ezh2抑制剂及其用途
AU2018217139A1 (en) * 2017-02-02 2019-08-22 Epizyme, Inc. Cancer treatment modalities
US10266542B2 (en) 2017-03-15 2019-04-23 Mirati Therapeutics, Inc. EZH2 inhibitors
US11642346B2 (en) 2017-03-31 2023-05-09 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
WO2018223030A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Epizyme, Inc. Use of ezh2 inhibitors for treating cancer
WO2019018635A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 Children's Medical Center Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASES ASSOCIATED WITH IMPRESSIVE FAULT
EP3668876B1 (en) 2017-08-18 2024-01-24 Cothera Bioscience, Inc. Polymorphic form of tg02
CA3074720A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
BR112020008325A2 (pt) 2017-11-14 2020-10-20 Pfizer Inc. terapias de combinação com o inibidor de ezh2
NZ766447A (en) 2018-01-31 2021-12-24 Mirati Therapeutics Inc Prc2 inhibitors
JP2021531340A (ja) * 2018-07-09 2021-11-18 フォンダシヨン、アジール、デ、アブグルスFondation Asile Des Aveugles 眼障害を治療するためのｐｒｃ２サブユニットの阻害
TWI798532B (zh) * 2019-03-25 2023-04-11 大陸商深圳微芯生物科技股份有限公司 Ｋｄｍ５ａ基因和ａｔｒｘ基因的應用
US20220154295A1 (en) * 2019-03-27 2022-05-19 The Johns Hopkins University Methods and materials for assessing and treating cancer
WO2020219606A1 (en) 2019-04-22 2020-10-29 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of erk5 inhibitors for treating gliomas in pediatric subjects
JP7624404B2 (ja) 2019-04-22 2025-01-30 ミラティ セラピューティクス，インク． Ｐｒｃ２阻害剤としてのナフチリジン誘導体
WO2020247130A1 (en) * 2019-06-03 2020-12-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compounds and methods for inhibiting cancers via rest inhibition
AU2020288563A1 (en) 2019-06-05 2022-01-06 Mirati Therapeutics, Inc. Imidazo(1,2-c)pyrimidine derivatives as PRC2 inhibitors for treating cancer
AU2020303943B2 (en) 2019-06-28 2026-01-29 Als Therapy Development Institute Inhibition of dipeptide repeat proteins
WO2021173960A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Treatment of carm1-overexpressing and/or arid1a mutant cancers with ire-1/xbp-1 inhibitors
KR20230039657A (ko) * 2020-06-18 2023-03-21 에피자임, 인코포레이티드 암의 치료를 위한 smarca4 억제
CN111773387A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 北京大学 一种通过改变bin1剪切体比例改善心脏横管结构的方法
US20240350508A1 (en) 2021-08-25 2024-10-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of ezh2 inhibitors for the treatment of aortic valve stenosis
CN116019916A (zh) * 2021-10-27 2023-04-28 蚌埠医学院第一附属医院 非小细胞肺癌靶点arid1a及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5455044A (en) 1993-05-14 1995-10-03 Depotech Corporation Method for treating neurological disorders
US5763263A (en) 1995-11-27 1998-06-09 Dehlinger; Peter J. Method and apparatus for producing position addressable combinatorial libraries
US7229774B2 (en) 2001-08-02 2007-06-12 Regents Of The University Of Michigan Expression profile of prostate cancer
DK2238982T3 (da) 2003-06-27 2013-01-28 Astellas Pharma Inc Terapeutisk middel til blødt væv-sarcom
WO2009006577A2 (en) * 2007-07-03 2009-01-08 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inhibiting ezh2
US20120114670A1 (en) * 2007-10-02 2012-05-10 University Of Rochester Methods and compositions related to synergistic responses to oncogenic mutations
WO2009048958A2 (en) * 2007-10-08 2009-04-16 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions involving chitosan nanoparticles
US20110251216A1 (en) * 2010-02-19 2011-10-13 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inhibiting ezh2
US8536179B2 (en) 2010-05-07 2013-09-17 Glaxosmithkline Llc Indoles
ES2528269T3 (es) 2010-05-07 2015-02-06 Glaxosmithkline Llc Azaindazoles
WO2011140325A1 (en) 2010-05-07 2011-11-10 Glaxosmithkline Llc Indazoles
WO2012071096A2 (en) * 2010-09-03 2012-05-31 The Johns Hopkins University Arid1a and ppp2r1a mutations in cancer
AU2011298987B2 (en) 2010-09-10 2017-09-28 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
US9175331B2 (en) 2010-09-10 2015-11-03 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
WO2012068589A2 (en) * 2010-11-19 2012-05-24 Constellation Pharmaceuticals Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
US8765792B2 (en) * 2010-12-01 2014-07-01 Glaxosmithkline Llc Indoles
EP3323820B1 (en) 2011-02-28 2023-05-10 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
US20140296248A1 (en) 2011-04-04 2014-10-02 Stichting het Nederlands Kanker Instiuut-Antoni van Leeuwenhoek ziekenhuis Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
JO3363B1 (ar) 2011-04-13 2019-03-13 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
TW201733984A (zh) 2011-04-13 2017-10-01 雅酶股份有限公司 經取代之苯化合物
WO2012156463A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Ulrike Nuber Novel cancer therapies and methods
US9073924B2 (en) * 2011-09-13 2015-07-07 Glaxosmithkline Llc Azaindazoles
BR112014007603A2 (pt) 2011-09-30 2017-06-13 Glaxosmithkline Llc métodos de tratamento do câncer
WO2013059944A1 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 British Columbia Cancer Agency Branch Epigenetic regulators and uses thereof
CA2862289C (en) 2012-02-10 2019-11-26 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
HUE042271T2 (hu) * 2012-03-12 2019-06-28 Epizyme Inc Emberi EZH2 inhibitorai és azok alkalmazási eljárásai
EP2828250B1 (en) * 2012-03-19 2021-03-10 Imperial College Innovations Limited Quinazoline compounds and their use in therapy
KR102117982B1 (ko) * 2012-04-13 2020-06-03 에피자임, 인코포레이티드 암 치료용 병용 요법
DK3628670T3 (da) 2012-04-13 2022-12-05 Epizyme Inc Saltform til ezh2-hæmning
US9562041B2 (en) * 2012-05-16 2017-02-07 Glaxosmithkline Llc Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
KR102021642B1 (ko) 2012-10-15 2019-09-16 에피자임, 인코포레이티드 암을 치료하는 방법
CN105102432B (zh) 2012-10-15 2019-01-04 Epizyme股份有限公司 经取代的苯化合物
US20140120083A1 (en) 2012-11-01 2014-05-01 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancers using pi3 kinase isoform modulators
US9895390B2 (en) 2012-12-10 2018-02-20 Children's Medical Center Corporation Methods and assays for combination treatment of cancer
CA2894216A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. 1,4-pyridone compounds
AU2013361079B2 (en) 2012-12-21 2018-07-26 Epizyme, Inc. 1,4-pyridone bicyclic heteroaryl compounds
ME02730B (me) 2013-02-11 2017-10-20 Constellation Pharmaceuticals Inc Modulatori enzima koji modifikuju metil, njihove kompozicije i upotreba
US9045477B2 (en) 2013-03-15 2015-06-02 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
US9243001B2 (en) 2013-03-15 2016-01-26 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
US9776996B2 (en) 2013-03-15 2017-10-03 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
AU2014254392B2 (en) 2013-03-15 2018-05-24 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
US20160091485A1 (en) 2013-04-25 2016-03-31 The Broad Institute, Inc. Markers for ezh2 inhibitors
US9505745B2 (en) 2013-04-30 2016-11-29 Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
CN105452246A (zh) 2013-06-06 2016-03-30 葛兰素史密斯克莱知识产权（第2号）有限公司 Zeste增强子同源物2的抑制剂
EP3019494B1 (en) 2013-07-10 2017-06-21 Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
US10150764B2 (en) 2013-07-19 2018-12-11 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
US9624205B2 (en) 2013-07-19 2017-04-18 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
EP3057962B1 (en) 2013-10-16 2023-10-18 Epizyme, Inc. Hydrochloride salt form for ezh2 inhibition
AU2014337121A1 (en) 2013-10-18 2016-04-14 Epizyme, Inc. Method of treating cancer
EP3076977B1 (en) 2013-12-06 2021-03-03 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
WO2015103431A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for the diagnosis and treatment of ovarian cancers that are associated with reduced smarca4 gene expression or protein function
WO2015128837A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Methods of treating cancer patients responding to ezh2 inhibitor gsk126
CN106255693A (zh) 2014-03-07 2016-12-21 葛兰素史密斯克莱知识产权（第2 号）有限公司 Zeste增强子同源物2的抑制剂
SG10201808053XA (en) 2014-03-19 2018-10-30 Infinity Pharmaceuticals Inc Heterocyclic compounds for use in the treatment of pi3k-gamma mediated disorders
WO2015193768A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Pfizer Inc. Aryl fused lactams as ezh2 modulators
BR112016029492A2 (pt) 2014-06-17 2017-10-17 Eisai R&D Man Co Ltd método para tratamento de linfoma não hodgkin
CA2952285A1 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Biomarkers for response to ezh2 inhibitors
EP3160940A4 (en) 2014-06-25 2018-05-02 Epizyme, Inc. Substituted benzene and 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
MX382891B (es) 2014-09-05 2025-03-13 Arqule Inc Composiciones y métodos para tratar trastornos de proliferación.
MX383635B (es) * 2014-10-16 2025-03-14 Epizyme Inc Método para tratar el cáncer.
SG11201703806XA (en) 2014-11-17 2017-06-29 Epizyme Inc Method for treating cancer
EA201792304A1 (ru) 2015-04-20 2018-03-30 Эпизайм, Инк. Комбинированная терапия для лечения рака
AU2016275051A1 (en) 2015-06-10 2017-12-07 Epizyme, Inc. EZH2 inhibitors for treating lymphoma
CN108025191A (zh) 2015-08-24 2018-05-11 Epizyme股份有限公司 治疗癌症的方法
MX2018003663A (es) 2015-09-25 2018-08-14 Epizyme Inc Metodo de tratamiento de tumor rabdoide maligno del ovario (mrto) /cancer microcitico del ovario del tipo hipercalcemico (sccoht) con un inhibidor de ezh2.
WO2017062495A2 (en) 2015-10-06 2017-04-13 Epizyme, Inc. Method of treating medulloblastoma with an ezh2 inhibitor
US20190070188A1 (en) 2015-11-06 2019-03-07 Epizyme, Inc. Pediatric dosing for treatment of cancer with an ezh2 inhibitor
CN108697716A (zh) 2015-12-07 2018-10-23 Epizyme股份有限公司 Ezh2抑制剂及其使用方法
WO2017132518A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
WO2017139404A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Epizyme, Inc. Methods of treating cancer
US11786533B2 (en) 2016-06-01 2023-10-17 Epizyme, Inc. Use of EZH2 inhibitors for treating cancer
WO2017214373A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
US11147819B2 (en) 2016-06-17 2021-10-19 Epizyme, Inc. EZH2 inhibitors for treating cancer
AU2018217139A1 (en) 2017-02-02 2019-08-22 Epizyme, Inc. Cancer treatment modalities
US11642346B2 (en) 2017-03-31 2023-05-09 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
WO2018223030A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Epizyme, Inc. Use of ezh2 inhibitors for treating cancer
WO2018231973A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 Epizyme, Inc. Inhibitors of ezh2 and methods of use thereof
CA3074720A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
CA3162315A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Marinus Jacobus Verwijs Crystalline hydrobromide salt of a ezh2 inhibitor, its preparation and pharmaceutical composition useful for the treatment of cancer
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