TW201718598A - Ｅｚｈ２抑制劑 - Google Patents

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德其 郭
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葉綺湄
游國龍
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Abstract

本發明係關於抑制組蛋白離胺酸甲基轉移酶(Zeste增強子同源物2；EZH2)之活性之化合物、包含該等化合物之醫藥組合物，及使用該等化合物治療癌症(諸如血液學及實體腫瘤)之方法。

Description

EZH2抑制劑
本發明係關於抑制組蛋白離胺酸甲基轉移酶(Zeste增強子同源物2；EZH2)之活性之化合物、包含該等化合物之醫藥組合物，及使用該等化合物治療癌症(諸如血液學及實體腫瘤)之方法。
EZH2係由EZH2基因所編碼，及為聚梳抑制複合物2(polycomb repressive complex 2；PRC2)中造成染色質上之組蛋白3之離胺酸27(H3K27)甲基化之催化組分。據認為，EZH2過度表現會促進癌症，此係由於使腫瘤抑制基因之表現沉默之組蛋白甲基化增加。EZH2之催化活性係由130胺基酸Su(var)3-9、Zeste增強子及三空腔結構蛋白質(trithorax)(SET)域介導，此為S-腺苷甲硫胺酸(SAM)輔因子及離胺酸底物殘基提供結合口袋。核心PRC2複合物係由EZH2及蛋白質EED(胚胎外胚層發育)、SUZ12(Zeste 12同源物之抑制劑)及RbAp46/48(亦稱作RBBP7/4)組成，及亦可包括其他蛋白質，諸如JARID2、AEBP2及聚梳樣(polycomblike)(PCL)1/2/3。
除了EZH2之過度表現外，增加之H3K27甲基化亦可因會提高EZH2催化效率之突變諸如Y641N、A677G及A678V所引起。此外，亦據報導，可在實體腫瘤中通過不同信號傳導路徑諸如彼等涉及VEGFR2及PI3K/AKT者來調節H3K27甲基化之水平。
SWI/SNF及PRC2複合物分別在轉錄之活化及阻遏中發揮拮抗作用。缺少或缺乏SWI/SNF蛋白質SNF5(亦稱作SMARCB1/INI1)之腫瘤 可證實異常性甲基化及由PRC2之阻遏作用及在經EZH2小分子抑制劑處理後生長受到抑制。此外，缺少或缺乏SWI/SNF蛋白質ARID1A(亦稱作BAF250)組合PI3K路徑之組分中之組成性活化突變諸如PIK3CA之腫瘤亦在經EZH2小分子抑制劑處理後生長受到抑制。此外，同時缺少或缺乏SMARCA2(亦稱作BRM)及SMARCA4(亦稱作BRG1)之腫瘤亦在經EZH2小分子抑制劑處理後生長受到抑制。
H3K4甲基轉移酶(亦稱作MLL或COMPASS)複合物與SWI/SNF複合物在拮抗PRC2之阻遏效應方面配合(於Van der Meulen,J.等人(2014)Epigenetics 9：658-68；Xu,B.等人(2015)Exp.Hematol.43：698-712中評審)。僅缺少或缺乏H3K4甲基轉移酶複合物組分，包括(但不限於)MLL2(本文顯示之資料針對患者衍生之胃癌異種移植模型中EZH2抑制劑加上標準醫護化學療法之組合治療)、MLL3(本文顯示之資料針對患者衍生之肺癌異種移植模型中EZH2抑制劑加上標準醫護化學療法之組合治療)、離胺酸特異性去甲基化酶6A(亦稱作泛轉錄三角形四肽重複)、X染色體(UTX，亦稱作KDM6A[Ezponda,T.等人(2014)Blood 124：611])之腫瘤或組合缺少或缺乏上述SWI/SNF複合物中之組分，包括(但不限於)ARID1A(本文顯示之資料針對患者衍生之胃癌異種移植模型中EZH2抑制劑加上標準醫護化學療法之組合治療)之腫瘤在經EZH2小分子抑制劑作為單一試劑或組合標準醫護(SOC)化療劑治療後生長受到抑制。具有生長中心B-細胞源之淋巴瘤經在EZH2方面之擾動生長受抑制(Beguelin等人(2013)Cancer Cell 23：677-92；Velichutina,I.等人(2010)Blood 116：5247-5255)及亦具有高頻率之MLL2、CREBBP、EP300、ARID1A及SMARCA4中之突變(Lunning,M.A.及Green,M.R.(2015)Blood Cancer Journal5,e361；Carbone,A.等人(2014)Ann.Hematol.93：1263-1277)。
文獻中已知一些EZH2抑制劑。參見，例如，WO2012/142504、 WO2012/142513、WO2013/120104、WO2013/173441、WO2013/075083、WO2014/177982、WO2014/097041及WO2016/066697。
仍需要提供用於治療癌症之替代性EZH2抑制劑。因此，本發明提供某些可用於治療癌症之EZH2抑制劑。
本發明提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y'為-NR4R5、CH(CH3)-環己-4-基-二甲基胺基、CH(CH3)-環己-4-基-N-甲基-N-甲氧基乙基胺基或-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、2-丙氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、N-三唑基、N-吡咯啶基、嗎啉基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R4為經二甲基胺基、N-甲基-N-甲氧基乙基胺基、N-甲基-N-環丙基胺基或氮雜環丁-1-基取代之哌啶-4-基或環己-4-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y'為-NR4R5、-CH(CH3)-環己-4-基-N-甲基-N-甲氧基乙基或-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、2-丙氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、吡唑基、甲基吡唑基、三唑基、吡咯啶基、四氫呋喃氧基或嗎啉基取代；R4為經N-甲基-N-甲氧基乙基胺基、N-甲基-N-環丙基胺基或氮雜環丁-1-基取代之環己-4-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或吡唑基取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-；Y’為-NR4R5、CH(CH3)-環己-4-基二甲基胺基、CH(CH3)-環己-4-基-N-甲基-N-甲氧基乙基胺基或-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、2-丙氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、N-三唑基、N-吡咯啶基、嗎啉基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取 代；R4為經二甲基胺基、N-甲基-N-甲氧基乙基胺基、N-甲基-N-環丙基胺基或氮雜環丁-1-基取代之環己-4-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-；Y’為-NR4R5、CH(CH3)-環己-4-基-N-甲基-N-甲氧基乙基胺基或-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、2-丙氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、N-三唑基、N-吡咯啶基、嗎啉基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R4為經N-甲基-N-甲氧基乙基胺基、N-甲基-N-環丙基胺基或氮雜環丁-1-基取代之環己-4-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y’為-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、N-吡咯啶基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；及R6為甲基；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-；Y’為-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、N-吡咯啶基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；及R6為甲基；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-CH2-；Y’為-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、N-吡咯啶基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；及R6為甲基；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y’為-NR4R5；R4為環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；及R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-； Y’為-NR4R5；R4為環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-CH2-；Y’為-NR4R5；R4為環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y’為-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係 視情況經甲氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、N-吡咯啶基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽；其中連接在該6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮的2位置之碳係呈(R)構型。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y’為-CH[CH3]-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、N-吡咯啶基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽；其中連接在該6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮之2位置的碳係呈(R)構型及環己環係呈反式構型。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y’為-NR4R5；R4為環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧 基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽；其中環己環係呈反式構型。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；及Y為CHCH3、N(CH3)或N(CH2CH3)；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；及Y為CHCH3、N(CH3)或N(CH2CH3)；及R7為氫、視情況經甲基取代之甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、N-吡咯啶基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基；或其醫藥上可接 受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y為CHCH3、N(CH3)或N(CH2CH3)；及R7為氫、視情況經甲基取代之甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、N-吡咯啶基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式之化合物：
其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；及Y為CHCH3、N(CH3)或N(CH2CH3)；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種化合物，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種治療患者之癌症之方法，其中該癌症係選自由淋巴瘤、橫紋肌樣瘤、缺少或缺乏SWI/SNF複合物(例如SNF5)、MLL複合物及組成性活性PI3K路徑之一或多種組分之腫瘤、肉瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌組成之群，該方法包括投與有效量之本發明化合物或其鹽至該患者。較佳地，該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤或濾泡淋巴瘤。較佳地，該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤。較佳地，該癌症為胃癌。較佳地，該癌症為卵巢癌。較佳地，該癌症為多發性骨髓瘤。較佳地，該癌症為肺癌。較佳地，該癌症為結腸直腸癌。較佳地，該癌症為具有野生型(WT)EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤以及具有突變體EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤。較佳地，該癌症為具有WT EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤。較佳地，該癌症為具有突變體EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤。
本發明亦提供一種治療患者之卵巢癌之方法，該方法包括組合卡鉑及太平洋紫杉醇投與本發明化合物或其鹽至該患者。
本發明亦提供一種治療患者之胃癌之方法，該方法包括組合奧沙利鉑(oxaliplatin)及太平洋紫杉醇投與本發明化合物或其鹽至該患者。
本發明亦提供一種治療患者之肺癌之方法，其包括組合吉西他濱(gemcitabine)及順鉑投與本發明化合物或其鹽至該患者。
本發明亦提供一種治療患者之結腸直腸癌之方法，其包括組合 伊立替康(irirnotecan)及奧沙利鉑投與本發明化合物或其鹽至該患者。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包括本發明化合物或其鹽及一或多種醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
根據本發明之另一個態樣，提出一種用於治療卵巢癌之包括本發明化合物或其鹽及卡鉑及太平洋紫杉醇之套組。
根據本發明之另一個態樣，提出一種用於治療卵巢癌之包括本發明化合物或其鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑、及卡鉑與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑、及太平洋紫杉醇與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之套組。
根據本發明之另一個態樣，提出一種用於治療胃癌之包括本發明化合物或其鹽及奧沙利鉑及太平洋紫杉醇之套組。
根據本發明之另一個態樣，提供一種用於治療胃癌之包括本發明化合物或其鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑、及奧沙利鉑與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及太平洋紫杉醇與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之套組。
根據本發明之另一個態樣，提供一種用於治療肺癌之包括本發明化合物或其鹽及吉西他濱及順鉑之套組。
根據本發明之另一個態樣，提供一種用於治療肺癌之包括本發明化合物或其鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑、及吉西他濱與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及順鉑與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之套組。
根據本發明之另一個態樣，提出一種用於結腸直腸癌之包括本發明化合物或其鹽及伊立替康及奧沙利鉑之套組。
根據本發明之另一個態樣，提供一種用於治療結腸直腸癌之包括本發明化合物或其鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦 形劑、及伊立替康與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及奧沙利鉑與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之套組。
本發明亦提供一種用於治療之本發明化合物或其鹽。另外，本發明提供一種用於治療癌症之本發明化合物或其鹽，其中該癌症係選自由淋巴瘤、橫紋肌樣瘤、缺少或缺乏SWI/SNF複合物(例如SNF5)、MLL複合物及組成性活性PI3K路徑之一或多種組分之腫瘤、肉瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、胃腸道癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌組成之群。較佳地，該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤或濾泡淋巴瘤。較佳地，該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤。較佳地，該癌症為胃癌。較佳地，該癌症為卵巢癌。較佳地，該癌症為多發性骨髓瘤。較佳地，該癌症為肺癌。較佳地，該癌症為結腸直腸癌。較佳地，該癌症為具有野生型(WT)EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤以及具有突變體EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤。較佳地，該癌症為具有WT EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤。較佳地，該癌症為具有突變體EZH2之受體腫瘤或血液學腫瘤。
另外，本發明提供一種本發明化合物或其鹽於製造用於治療癌症之藥物之用途，其中該癌症係選自由淋巴瘤、橫紋肌樣瘤、缺少或缺乏SWI/SNF複合物(例如SNF5)、MLL複合物及組成性活性PI3K路徑之一或多種組分之腫瘤、肉瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、胃腸道癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌組成之群。較佳地，該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤或濾泡淋巴瘤。較佳地，該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤。較佳地，該癌症為胃癌。較佳地，該癌症為卵巢癌。較佳地，該癌症為多發性骨髓瘤。較佳地，該癌症為肺癌。較佳地，該癌症為結腸直腸癌。較佳地，該癌症為具有野生型(WT)EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤以及具有突變體EZH2之實體腫 瘤或血液學腫瘤。較佳地，該癌症為具有WT EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤。較佳地，該癌症為具有突變體EZH2之實體腫瘤或血液學腫瘤。
根據本發明之另一個態樣，提出一種組合，其包含本發明化合物或其鹽及卡鉑及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療卵巢癌。
根據本發明之另一個態樣，提出本發明化合物或其鹽，其係組合卡鉑及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療卵巢癌。
根據本發明之另一個態樣，提出卡鉑，其係組合本發明化合物或其鹽及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療卵巢癌。
根據本發明之另一個態樣，提出太平洋紫杉醇，其係組合本發明化合物或其鹽及卡鉑以供同時、分開或連續用於治療卵巢癌。
本發明亦提供一種本發明化合物或其鹽於製造用於治療卵巢癌之藥物之用途，其中本發明化合物或其鹽係意欲組合卡鉑及太平洋紫杉醇同時、分開或連續投與。
本發明亦提供一種卡鉑於製造用於治療卵巢癌之藥物之用途，其中該卡鉑係意欲組合本發明化合物或其鹽及太平洋紫杉醇同時、分開或連續投與。
本發明亦提供一種太平洋紫杉醇於製造用於治療卵巢癌之藥物之用途，其中該太平洋紫杉醇係意欲組合本發明化合物或其鹽及卡鉑同時、分開或連續投與。
根據本發明之另一個態樣，提出一種組合，其包含本發明化合物或其鹽及奧沙利鉑及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療胃癌。
根據本發明之另一個態樣，提出本發明化合物或其鹽，其係組合奧沙利鉑及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療胃癌。
根據本發明之另一個態樣，提出奧沙利鉑，其係組合本發明化合物或其鹽及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療胃癌。
根據本發明之另一個態樣，提出太平洋紫杉醇，其係組合本發明化合物或其鹽及奧沙利鉑以供同時、分開或連續用於治療胃癌。
本發明亦提供一種本發明化合物或其鹽於製造用於治療胃癌之藥物之用途，其中該本發明化合物或其鹽係意欲組合奧沙利鉑及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療胃癌。
本發明亦提供一種奧沙利鉑於製造用於治療胃癌之藥物之用途，其中該奧沙利鉑係意欲組合本發明化合物或其鹽及太平洋紫杉醇同時、分開或連續投與。
本發明亦提供一種太平洋紫杉醇於製造用於治療胃癌之藥物之用途，其中該太平洋紫杉醇係意欲組合本發明化合物或其鹽及奧沙利鉑同時、分開或連續投與。
根據本發明之另一個態樣，提出一種組合，其包含本發明化合物或其鹽及吉西他濱及順鉑以供同時、分開或連續用於治療肺癌。
根據本發明之另一個態樣，提出本發明化合物或其鹽，其係組合吉西他濱及順鉑以供同時、分開或連續用於治療肺癌。
根據本發明之另一個態樣，提出吉西他濱，其係組合本發明化合物或其鹽及順鉑以供同時、分開或連續用於肺癌。
根據本發明之另一個態樣，提出順鉑，其係組合本發明化合物或其鹽及吉西他濱以供同時、分開或連續用於治療肺癌。
本發明亦提供一種本發明化合物或其鹽於製造用於治療肺癌之藥物之用途，其中本發明化合物或其鹽係意欲組合吉西他濱及順鉑以供同時、分開或連續投與。
本發明亦提供一種吉西他濱於製造用於治療肺癌之藥物之用途，其中該吉西他濱係意欲組合本發明化合物或其鹽及順鉑以供同 時、分開或連續投與。
本發明亦提供一種順鉑於製造用於治療肺癌之藥物之用途，其中該順鉑係意欲組合本發明化合物或其鹽及吉西他濱以供同時、分開或連續投與。
根據本發明之另一個態樣，提出一種組合，其包含本發明化合物或其鹽及伊立替康及奧沙利鉑以供同時、分開或連續用於治療結腸直腸癌。
根據本發明之另一個態樣，提出本發明化合物或其鹽，其係組合伊立替康及奧沙利鉑以供同時、分開或連續用於治療結腸直腸癌。
根據本發明之另一個態樣，提出伊立替康，其係組合本發明化合物或其鹽及奧沙利鉑以供同時、分開或連續用於治療結腸直腸癌。
根據本發明之另一個態樣，提出奧沙利鉑，其係組合本發明化合物或其鹽及伊立替康以供同時、分開或連續用於治療結腸直腸癌。
本發明亦提供一種本發明化合物或其鹽於製造用於治療結腸直腸癌之藥物之用途，其中本發明化合物或其鹽係意欲組合伊立替康及奧沙利鉑以供同時、分開或連續投與。
本發明亦提供一種伊立替康於製造用於治療結腸直腸癌之藥物之用途，其中該伊立替康係意欲組合本發明化合物或其鹽及奧沙利鉑以供同時、分開或連續投與。
本發明亦提供一種奧沙利鉑於製造用於治療結腸直腸癌之藥物之用途，其中該奧沙利鉑係意欲組合本發明化合物或其鹽及伊立替康以供同時、分開或連續投與。
以下段落描述本發明之較佳類別：a)X為-CH2-；b)X為-CH2-CH2-；c)Y’為-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基 係視情況經甲氧基、環丙基氧基或四氫呋喃-3-基氧基取代；d)Y’為NR4R5；e)R4為環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基或甲氧基乙氧基取代；f)R5為乙基；g)R6為甲基；h)X為-CH2-，Y’為-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基取代，且R6為甲基；i)X為-CH2-，Y’為-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經環丙基氧基取代，且R6為甲基；j)X為-CH2-，Y’為-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經四氫呋喃-3-基氧基取代，且R6為甲基；k)X為-CH2-，Y’為NR4R5，R4為環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基取代，R5為乙基，且R6為甲基；l)X為-CH2-CH2-，Y’為NR4R5，R4為環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基乙氧基取代，R5為乙基，且R6為甲基；及m)X為-CH2-CH2-，Y’為-CH(CH3)-環己-4-基氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基取代，及R6為甲基。
一般技術者應明瞭，術語「反-」係如下文所描繪，其中繞環己基部分在1,4位置處之取代基相對於彼此係反-的： 其中R係選自二甲基胺基、N-甲基-N-甲氧基乙基胺基、N-環丙 基-N-甲基胺基或氧雜環丁-1-基，其係視情況經甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲基甲氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、嗎啉基、N-三唑基、吡咯啶-4-基、四氫呋喃-3-基氧基或N-吡唑基(其等視情況經甲基取代)取代及X及Y係如先前所定義。
熟練之讀者應明瞭本發明化合物能夠形成鹽。本發明化合物為鹼，及因此與諸多無機及有機酸中之任一者反應形成醫藥上可接受之鹽。該等醫藥上可接受之酸加成鹽及其常見製法係此項技術中所熟知的。參見，例如，P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2008)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。
可藉由此項技術中已知的各種程序來製備本發明化合物或其鹽，其中有些說明於下文製法及實例中。可將所述的具體合成步驟以不同方式組合來製備本發明化合物或鹽。可藉由相關技術中熟知的習知方法，包括萃取、蒸發、沉澱、層析、過濾、研磨及結晶，來回收該等合成步驟之產物。一般技術者很容易獲得試劑及起始物質。
本發明之一些中間物或化合物可具有一或多個對掌性中心。本發明涵蓋該等化合物之所有個別對映異構體或非對映異構體以及對映異構體及非對映異構體之混合物(包括外消旋物)。較佳地，本發明之包含至少一個對掌性中心之化合物係作為單一對映異構體或非對映異構體存在。可以對掌性試劑開始或藉由立體選擇性或立體特異性合成技術來製備該單一對映異構體或非對映異構體。或者，可藉由標準對掌性層析或結晶技術自混合物單離該單一對映異構體或非對映異構體。熟習此項技術者將瞭解，在一些情況中，由於不同層析管柱及移動相，對映異構體或非對映異構體之溶離順序可不同。
某些立體化學中心尚未指定及出於清楚起見某些取代基已在下 文反應圖中省去而非意欲以任何方式限制反應圖之教示。另外，可由一般技術者在合成本發明化合物中的任意適宜點藉由方法諸如選擇性結晶技術或對掌性層析分離或解析個別異構體、對映異構體或非對映異構體(參見，例如，J.Jacques等人，「Enantiomers,Racemates,and Resolutions」,John Wiley and Sons,Inc.,1981及E.L.Eliel及S.H.Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds」,Wiley-Interscience,1994)。另外，以下反應圖中所述之中間物包含多個氮保護基。該可變保護基在各次出現時根據特定反應條件及待進行之特定轉化可相同或可不同。保護及去保護條件為熟習此項技術者所熟知且述於文獻(參見，例如，「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis」，第四版，Peter G.M.Wuts及Theodora. W.Greene,John Wiley and Sons,Inc.2007)中。
某些縮寫定義如下：「AcOH」係指乙酸或冰乙酸；「ACN」係指乙腈；「AdoMet」係指S-腺苷-L-甲硫胺酸；「AEBP」係指脂肪細胞增強子結合蛋白；「AUC」係指曲線下面積；「BOC」係指第三丁氧基羰基；「bid」係指一天兩次給藥；「bm」係指寬多重峰；「Bn」係指苄基；「BSA」係指牛血清白蛋白；「c」係指濃度，單位為公克/毫升；「CAT.#」係指目錄號；「CDI」係指羰基二咪唑；「CO2」係指二氧化碳；「CV」係指管柱體積；「Ci」係指居里；「CPM」係指計數/1百萬份；「cPr」係指環丙基；「DCE」係指1,2-二氯乙烷；「DCM」係指二氯甲烷(methylene chloride/dichoromethane)；「DIBAL-H」係指氫化二異丁基鋁；「DIPEA」係指二異丙基乙胺；「dm」係指分米或10厘米；「DMA」係指二甲基乙醯胺；「DMEA」係指N,N-二甲基乙胺；「DMF」係指二甲基甲醯胺或N,N-二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「DNase」係指脫氧核糖核酸酶；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EED」係指胚胎外胚層發育；「Et2O」係指乙醚；「EtOAc」係指乙 酸乙酯；「ES/MS」係指電噴霧質譜法；「EtOH」係指乙醇或乙基醇；「Ex」係指實例；「GAPDH」係指甘油醛3-磷酸脫氫酶；「hr」係指小時；「HEC」係指羥乙基纖維素；「HOAt」係指羥基氮雜苯并三唑；「HOBt」係指羥基苯并三唑；「HSQC」係指異核單量子相干；「IPAm」係指異丙胺、丙-2-胺或2-胺基丙烷；「iPr」係指異丙基或1-甲基乙基；「IrMeO(COD)2」係指(1,5-環辛二烯)(甲氧基)銥(I)二聚物或雙(1,5-環辛二烯)二-μ-甲氧基二銥(I)；「kPa」係指千帕斯卡；「KHMDS」係指雙(三甲基甲矽烷基)醯胺鉀；「KOtBu」係指第三丁醇鉀；「LAH」係指氫化鋰鋁；「LiBH4」係指硼氫化鋰；「LC」係指液相層析；「LiHMDS」係指雙(三甲基甲矽烷基)醯胺鋰；「LOF」係指功能喪失；「3H-SAM」係指腺苷-L-甲硫胺酸、S[甲基-3H]；「IC50」係指試劑之產生50%針對該試劑可能之最大抑制反應之濃度；「Me」係指甲基；「MgSO4」係指硫酸鎂；「mpk」係指毫克/千克；「min」係指分鐘；「NaH」係指氫化鈉；「NBS」係指N-溴代琥珀醯胺；「NH3」係指氨；「nm」係指奈米；「MeOH」係指甲醇或甲基醇；「MSOH」係指甲磺酸；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「mut」係指突變體；「OAc」係指乙酸鹽；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PCR」係指聚合酶鏈反應；「PDX」係指患者衍生之異種移植；「PRC2」係指聚梳抑制複合物2」；「Prep」係指製備；「psi」係指磅/平方英寸；「PTSA」係指對甲苯磺酸；「定量產率」係指基本上大於99%產率；「RBBP4」係指視網膜母細胞瘤結合蛋白4；「RNase」係指核糖核酸酶；「rpm」係指轉/分鐘；「RT」係指室溫；「Rt」係指滯留時間，單位為分鐘；「RuPhos-G3-環鈀」係指甲磺酸(2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯苯基)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯基)]鈀(II)；「SCX」係指選擇性陽離子交換；「SFC」係指超臨界流體層析；「SPA」係指鄰近閃爍分析；「NaHCO3」係指碳酸氫鈉；「Na2SO4」係指硫酸鈉；「SoC」 係指標準醫護；「THF」係指四氫呋喃，「TEA」係指三乙胺；「Tris」係指參(羥甲基)-胺基甲烷；「WT」係指野生型；「XPhos Pd Gen 2」係指氯(2-二環己基膦基-2',4',6'-三異丙基-1,1'-聯苯)-[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯)]-鈀（II)；「Å」係指埃；「λ」係指波長；及「[α]D 20」係指化合物在偏振儀中使用鈉燈之D線(波長589.3nm)旋轉平面偏振光之旋光度，其中偏振測量觀測值α係在適宜溶劑(諸如MeOH)中於20℃、在界定濃度c下、體積2mL及路徑長度1dm下測得。
在以下反應圖中，除非另有指示，否則所有取代基係如先前所定義。一般技術者很容易獲得試劑及起始物質。以下反應圖、製備、實例及分析進一步說明本發明，但不應解釋成以任何方式限制本發明之範疇。
製備及實例
以下製備及實例進一步說明本發明及代表本發明化合物之典型合成。試劑及起始物質容易地獲得或可由一般技術者容易地合成。應明瞭，製備及實例係以說明而非限制的方式進行陳述，及一般技術者可作出各種修改。
可藉由標準技術諸如X射線分析，判定本發明化合物之R-或S-構型。1H NMR、對掌性HPLC及與對掌性-HPLC滯留時間之相關性可用於進一步闡明已知一個中心情況下之立體異構現象。
於Agilent HP1100液相層析系統上進行LC-ES/MS。於接口至HP1100 HPLC之質量選擇性偵測器四極質譜儀上進行電噴霧質譜測量(以正及/或負模式獲得)。LC-MS條件(低pH)：管柱：Phenomenex GEMINI® NX C-18 2.1×50mm，3.0μm；梯度：在3分鐘內從5% B變為100% B，接著，100% B持續0.75分鐘；管柱溫度：50℃+/-10℃；流速：1.2mL/min；溶劑A：具有0.1% HCOOH之去離子水；溶劑B：具有0.1%甲酸之ACN；波長214nm。替代LC-MS條件(高pH)：管柱： WATERSTM XTERRA® MS C-18管柱2.1×50mm，3.5μm；梯度：5%溶劑A持續0.25分鐘，在3分鐘內從5%溶劑B變為100%溶劑B之梯度及100%溶劑B持續0.5分鐘或在3分鐘內從10%溶劑B變為100%溶劑B及100%溶劑B持續0.75分鐘；管柱溫度：50℃+/-10℃；流速：1.2mL/min；溶劑A：10mM NH4HCO3 pH 9；溶劑B：ACN；波長：214nm。
於配備質量選擇性偵測器質譜儀及Leap自動進樣器/溶離份收集器之Agilent 1200 LC-ES/MS上進行製備型逆相層析。高pH方法係在75×30mm Phenomenex GEMINI®-NX(5μm粒度管柱，具有10×20mm保護)上運行。流速為85mL/min。溶離劑為含於ACN中之10mM碳酸氫銨(pH 10)。
使用殘餘溶劑[CDCl3，7.26ppm；(CD3)2SO，2.50ppm]作為參考標準，於Bruker AVIII HD 400MHz NMR光譜儀上進行NMR光譜，呈CDCl3或（CD3)2SO溶液獲得，以ppm報告。當報告峰值多重性時，可使用以下縮寫：s(單峰)、d(雙峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)、br-s(寬單峰)、dd(雙重雙峰)、dt(雙重三峰)。當報告時，偶聯常數(J)係以赫茲(Hz)報告。
反應圖1說明自受保護之4-側氧基環己烷羧酸酯(化合物1)開始形成經取代之1,4-二氧雜螺[4,5]癸烷(化合物5)。該受保護之4-側氧基環己烷羧酸酯可於溶劑諸如EtOH中經對甲苯磺酸、原甲酸三乙酯及乙二醇處理以提供受保護之1,4-二氧雜螺[4,5]癸烷-8-羧酸酯，其可接著藉由相關技術中熟知的程序，諸如藉由使用鹼水溶液脫去保護基，經2個步驟，可提供1,4-二氧雜螺[4,5]癸烷-8-羧酸(化合物2，反應圖1,步驟A)。可自步驟A之酸產物，藉由小份添加偶聯試劑諸如CDI或HOBt接著小份添加鹽酸N-甲氧基甲胺來製備Weinreb醯胺(化合物3)(反應圖1，步驟B)。可使用有機金屬試劑諸如格林納試劑或有機鋰試劑使Weinreb醯胺(化合物3)轉化成酮(化合物4)(反應圖1，步驟C)。更具體言之，可將溴化甲基鎂添加至適宜之溶劑諸如Et2O及/或THF中以提供甲基酮(化合物4)。甲基酮(化合物4)可藉由逐滴添加非親核性鹼諸如LiHMDS於溶劑諸如THF中，添加氯磷酸二苯酯而轉化成膦酸乙烯酯(化合物5)(反應圖1，步驟D)。
R2=OCH3、OCH2CH3、O-cPr、O-iPr、OCH2-cPr、CH2OCH3、O(CH2)2OCH3、N-吡唑基、N-(經取代之吡唑基)、N-三唑基、四氫呋喃-3-基、嗎啉基、N-吡咯啶基
反應圖2及3說明經取代之氮雜環丁烷之合成。可藉由以烷基鹵及非親核性鹼諸如DIPEA使經適當取代之3-羥基氮雜環丁烷(化合物6)烷基化，或另一種方式是，藉由於存在二元配位體諸如1,10-啡啉下、存在非親核性鹼諸如DIPEA或TEA下使用不對稱乙烯醚作為溶劑以鈀(II)源進行金屬介導之醚化來製備N保護的乙烯氧基氮雜環丁烷(化合物7a，R1=烯丙基)。熟習此項技術者當知曉可藉由大量保護基諸如烷基、經取代之烷基、芳烷基、醯胺或胺甲酸烷酯來保護氮雜環丁烷。更具體言之，可於存在TEA及4,7-二苯基-1,10-啡啉下，於正丁基乙烯醚中，經乙酸鈀(II)處理N-BOC-3-羥基氮雜環丁烷之溶液，以提供N保護的乙烯氧基氮雜環丁烷(化合物7a，R1=烯丙基，反應圖2，步驟A)。如反應圖2步驟B中所顯示，乙烯基可藉由Simmons-Smith反 應或相似的碳烯生成條件，例如，使用氯碘甲烷及烷基鋅試劑於DCE中轉化成受保護之3-環丙氧基氮雜環丁烷(化合物8)。於如相關技術中充分描述之彼等標準條件下，使受保護之3-環丙氧基氮雜環丁烷(化合物8)脫去保護基，接著藉由含於有機溶劑中之無機酸溶液，諸如含於乙醚或1,4-二噁烷中之HCl處理游離鹼，可提供穩定的氮雜環丁烷鹽(化合物9a)。更具體言之，當保護基為BOC時，熟習此項技術者當知曉，藉由酸諸如含於1,4-二噁烷中之HCl處理受保護的3-環丙氧基氮雜環丁烷(化合物8)，接著進行溶劑蒸發，可提供粗鹽酸3-環丙氧基氮雜環丁烷(化合物9a，反應圖2，步驟C)。另外，可藉由在強鹼性脫去保護基條件(例如，在極性溶劑諸如DMF或DMSO中之NaH)下以溴甲基環丙烷使經適當取代之3-羥基氮雜環丁烷(化合物6)烷基化來製備環丙基甲氧基氮雜環丁烷(化合物7b，R1=環丙基甲基，反應圖2，步驟A)，隨後使受保護之環丙基甲氧基氮雜環丁烷(化合物7b，R1=環丙基甲基)脫去保護基，以獲得粗鹽酸環丙基甲氧基氮雜環丁烷(化合物9b，反應圖2，步驟D)。
可自市售甲磺酸二苯甲基氮雜環丁烷(化合物10)，藉由在親核取代條件下使用適宜鹼諸如NaHCO3、K2CO3、DIPEA或TEA，經多種包含N、O、C及S之親核試劑處理及微波加熱，或藉由強鹼諸如NaH、KOtBu或LHMDS處理及在極性有機溶劑諸如DMF或DMSO中加熱，以提供經取代之二苯甲基氮雜環丁烷，來製備其他經取代之氮雜環丁烷(化合物11，反應圖3，步驟A)。隨後於催化氫化下脫去保護基(反應圖3，步驟B)可產生期望的經取代之氮雜環丁烷(化合物12)。
反應圖4描繪製備2-烷氧基-3-氯甲基-4,6-二甲基吡啶(化合物17，其中Ra為CH3、CH2CH3或Bn)，其可自市售3-氰基-4,6-二甲基吡啶酮(化合物13)開始進行製備。在熟習此項技術者已知的標準文獻條件下，藉由適宜鹵基烷使3-氰基-4,6-二甲基吡啶酮(化合物13)烷基化可提供期望的2-烷氧基-3-氰基-4,6-二甲基吡啶(化合物14)。具體而言，藉由在非質子溶劑諸如1,4-二噁烷、DMF、甲苯或CHCl3中，以碘甲烷或苄基氯與AgCO3或Ag2O處理3-氰基-4,6-二甲基吡啶酮(化合物13)，隨後加熱，可提供必要的2-甲氧基-或2-苄氧基-3-氰基-4,6-二甲基吡啶(化合物14，反應圖4，步驟A)。隨後，於文獻中為熟習此項技術者所熟知的標準條件下還原2-烷氧基-3-氰基-4,6-二甲基吡啶(化合物14)中之氰基，諸如於0℃或RT下於非質子溶劑諸如DCM中以還原劑諸如DIBAL-H慢慢處理，可提供對應之吡啶甲醛(化合物15，反應圖4，步驟B)。進一步還原成甲醇(化合物16，反應圖4，步驟C)可藉由為熟習此項技術者所熟知的標準條件來實現；具體而言，逐份地藉由常見還原劑諸如NaBH4於0℃或更低溫度下處理吡啶甲醛(化合物15)，可獲得甲醇(化合物16)。隨後於非質子溶劑諸如DCM中以典型 氯化劑諸如SOCl2或POCl3於低溫諸如-40℃至-60℃下氯化甲醇(化合物16)，可提供必要的氯甲基吡啶(化合物17，反應圖4，步驟D)。
反應圖5說明4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜戊硼烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯(化合物20)之合成。如此項技術中所熟知，可使用一系列鈀(II)觸媒及多種適宜膦配位體，具體而言乙酸鈀(II)及1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵，於存在醇諸如MeOH下，於極性溶劑諸如DMF或DMA中，含有或不含非親核性有機鹼諸如DIPEA或TEA下，在一氧化碳之加壓氛圍下使芳基溴(化合物18)羰基化，以獲得酯(化合物19，反應圖5，步驟A)。隨後，可藉由用烷基金屬化試劑諸如正丁基-、第二丁基-或第三丁基鋰脫質子化，用硼酸酯淬滅芳基陰離子，或藉由使用鈀(II)、銥(I)或鐵(III)之過渡金屬配位錯合物實現戊硼烷酯化，以獲得期望的硼酸酯。具體而言，可在非極性溶劑諸如環己烷中以雙(1,5-環辛二烯)二-μ-甲氧基二銥(I)及4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜戊硼烷逐份地處理該酯(化合物19)，同時加熱，以獲得4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜戊硼烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯(化合物20，反應圖5，步驟B)。
可根據反應圖6中所描繪之途徑，以丙二腈與乙醯基烯酮於鹼性條件下在適宜極性有機溶劑諸如氫化鈉及THF中縮合開始，以獲得2-胺基-3-氰基吡喃酮(化合物21，反應圖6，步驟A)，來製備2-乙氧基吡啶(化合物27)。隨後，用無機酸諸如HCl熱重排，可提供3-氰基-4-羥基-6-甲基吡啶酮(化合物22，反應圖6，步驟B)。可使用相關技術中熟知的多種氯化劑，更具體言之POCl3與PCl5之混合物，來實現4-氯吡啶酮(化合物23)之氯化(反應圖6，步驟C)；可經由在適宜非極性有機溶劑中以烷基鹵進行金屬介導之醚化，更具體言之使用含於甲苯中之氧化銀(I)及碘乙烷來實現所得吡啶酮(化合物23)之烷基化，以提供2-乙氧基-3-氰基-4-氯吡啶(化合物24，反應圖6，步驟D)。使用還原劑諸如DIBAL-H接著使用NaBH4或NaCNBH3之兩步驟還原，可提供醇(化合物26，反應圖6，步驟E-F)，及隨後以氯化劑諸如POCl3或PCl5在適宜有機溶劑中氯化，可生成乙氧基吡啶(化合物27)。更具體言之，可通過藉由自0℃至RT在DCM中以甲磺醯氯處理原位製備甲磺酸鹽來實現醇(化合物26)之氯化，以提供乙氧基吡啶(化合物27，反應圖6，步驟G)。
反應圖7描繪式I化合物之合成。所製得之磷酸乙烯酯(化合物5，反應圖1，步驟D)與硼酸芳酯(化合物20，反應圖5，步驟B)於標準鈴木類偶聯條件下，利用鈀(II)觸媒及膦配位體與輕度無機鹼諸如K3PO4在極性有機溶劑諸如1,4-二噁烷中偶聯，可提供乙烯基噻吩酯(化合物28，反應圖7，步驟A)。藉由相關技術中明確記錄之程序進行乙烯基部分之還原，以獲得α-甲基噻吩酯(化合物29，反應圖7，步驟B)。使用相關技術中明確記錄之一系列觸媒及配位體，具體言之利用銥(I)觸媒/配位體錯合物(諸如，肆(3,5-雙(三氟甲基)苯基硼酸[(4R,5R)-(+)-O-[1-苄基-(5-甲基-2-苯基-4,5-二氫噁唑-4-基)-2-苯乙基](二環己基次亞膦酸)(1,5-COD)銥(I))來實現乙烯基之立體選擇性還原，以產生期望 的立體特異性酯(化合物29)。在適宜有機溶劑(諸如CHCl3、DCM、EtOAc、1,4-二噁烷或CCl4)中使用溴化劑(諸如元素溴或NBS)來實現隨後反應圖7，步驟C的溴化作用，以產生5-溴噻吩酯(化合物30)。實現以下：於標準鈀介導之偶聯條件下，具體言之使用RuPhos-G3-環鈀進行烷基化為2-[2-(苄氧基羰基胺基)乙基]-5-[1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(化合物31)(反應圖7，步驟D)，接著使碳化苄氧基胺(化合物31)在相關技術中熟知的典型氫解條件下脫去保護基，具體而言，在極性有機醇溶劑(諸如MeOH)中進行原位環化(反應圖7，步驟E)及在標準酸性條件下，例如，使用在適宜極性溶劑(諸如THF或EtOH)中之HCl解除遮蔽為酮，以提供3-甲基-2-[1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫-5H-噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(化合物33，反應圖7，步驟F)。於存在路易士酸(Lewis acid)諸如異丙醇鈦及還原劑諸如NaBH4、Na(OAc3)BH或NaCNBH3下，在適宜溶劑(諸如DCM或MeOH)中實現還原胺化，以獲得反-及順-環己烷之混合物(化合物34，反應圖7，步驟G)，該混合物可藉由相關技術中熟知的結晶或層析方法進行分離。另外，熟習此項技術者當知曉，使用LiBH4作為還原劑可主要得到反式立體異構體。於熟知條件下藉由經適當取代之芳烷基鹵，諸如苄基鹵進行烷基化，接著，於酸性條件下，例如使用LiCl在存在PTSA下同時加熱來脫去甲基或脫去苄基，可提供式I之化合物(反應圖7，步驟H及M)。
或者，可使用相關技術中熟知的條件，例如利用碳載Pd(OH)2在適宜有機溶劑諸如MeOH中使碳化苄氧基胺(化合物31，反應圖7，步驟D)經歷氫解，且可於存在吡啶甲醛(例如，化合物15，反應圖4，步驟B)下實現氫解，以提供5-[1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基-2-[2-[(6-甲基-3-吡啶基)甲基胺基]乙基]噻吩-3-甲酸甲酯(化合物35，反應圖7，步驟I)。隨後如上述解除遮蔽為酮，還原胺化，於熱酸性 條件下環化，及O-脫去保護基，可得到式I之化合物(反應圖7，步驟J至M)。
或者，可使用相關技術中熟知的條件使胺諸如化合物38(其中R3=H，R4=苄基)經歷氫解以提供胺，其中R3=R4=H。使該胺經歷如上述之還原胺化條件及O-脫去保護基，可得到式I化合物。具體而言，使用酸、甲醛及三乙醯氧基硼氫化物可得到還原胺化產物，其中R3=R4=Me。
反應圖8描繪式II化合物之合成。使該酯(化合物19，反應圖5，步驟A)硝化，隨後於標準條件下進行硝基還原，可得到5-胺基-4-甲基-噻吩-3-甲酸甲酯(化合物40，反應圖8，步驟A至B)。藉由適宜胺保護基諸如BOC進行胺基保護，及隨後於典型條件下烷基化，例如藉由碘甲烷於存在存在溫和鹼諸如K2CO3或Cs2CO3下在極性溶劑諸如DMF中烷基化，可得到經適當N-烷基化之受保護之胺基噻吩，可接著進行原 位胺甲酸酯裂解及隨後進行還原胺化，例如藉由環己酮，諸如1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-酮、及Na(OAc3)BH或NaCHBH3在適宜有機溶劑諸如DCE中進行，以獲得必要的三級胺(化合物41，反應圖8，步驟C，其中R5=CH3)。或者，5-胺基-4-甲基噻吩-3-甲酸酯(化合物40)可先經歷以環己酮，諸如1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-酮於存在Na(OAc)3BH或NaCNBH3下在適宜有機溶劑諸如DCE中之還原胺化條件，接著以乙醛第二次原位還原胺化，以獲得必要的三級胺(化合物41，反應圖8，步驟C，其中R5=CH2CH3)。隨後，溴化、金屬介導之烷基化，環化為二環內醯胺(化合物44)，內醯胺N-烷基化，解除遮蔽為酮，還原胺化及最終脫去甲基或脫去苄基，其等均可類似於反應圖7之方法進行，以獲得最終的式II化合物(反應圖8，步驟D至J)。
或者，可首先在反應圖7中所述之類似條件下使縮酮(化合物45，反應圖8，步驟G)脫去烷基以獲得吡啶酮酮(化合物48，反應圖8，步驟K)。隨後可進行烷基化，接著進行還原胺化或雙重還原胺化(於類似於反應圖8，步驟C之條件下)，以獲得式II化合物(反應圖8，步驟L)。
反應圖9描繪式III化合物之合成。可經由相關技術中熟知的過渡金屬介導之偶聯程序，將N-烷基化之2-溴-5-[R5-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(化合物42，反應圖8，步驟D)炔基化。更具體言之，可於存在CuI、適宜之鈀(II)-配位體錯合物諸如二氯化雙(三苯基膦)鈀(II)及非親核性有機鹼諸如TEA下，以丙-2-炔-1-基胺甲酸苄酯處理溴噻吩(化合物42)，以獲得炔烴(化合物49，反應圖9，步驟A)。隨後還原該炔烴及使胺部分脫去保護基係此項技術中所熟知的。具體而言，於標準催化氫化條件下處理該炔烴(化合物49)及於存在碳載Pd或碳載Pd(OH)2下，在適宜有機溶劑諸如MeOH、EtOH或EtOAc中，於壓力下以H2原位氫解，可提供胺(化合物50，反應圖9，步驟B)，其可於隨後在鹼性條件諸如KOtBu及加熱下環化，以獲得內醯胺(化合物51，反應圖9，步驟C)。使內醯胺氮烷基化，解除遮蔽為酮，還原胺化及最終脫去烷基，其等均可類似於反應圖8中所述進行，以獲得式III化合物(反應圖9，步驟D至F)。
反應圖10描繪式IV化合物之合成，其從經適當取代之5-溴噻吩酯(化合物30)開始，利用類似於反應圖9中所述之彼等之方法(反應圖10，步驟A至F)。
式V化合物之製備係描繪於反應圖11中。於相關技術中熟知的還 原胺化條件下，以經適當保護之胺基烷基酮處理胺基噻吩(化合物40，反應圖8，步驟B)，隨後使用烷基化劑諸如CH3I或CH3CH3I於利用適宜鹼諸如NaH或K2CO3之鹼性條件下烷基化，或通過利用例如乙醛之第二還原胺化烷基化(反應圖11，步驟A)，可提供N-烷基化之N-哌啶基噻吩酯(化合物59)。更具體言之，可在適宜有機溶劑諸如DCE中，以4-側氧基哌啶1-甲酸第三丁酯處理3,4-二甲基噻吩-2-胺(化合物40)且逐份地添加適宜之還原劑諸如Na(OAc)3BH，於隨後添加甲醛或乙醛，以獲得N-烷基化之N-哌啶基噻吩(化合物59)。隨後溴化，於Pd催化之偶聯條件下將芳基溴(化合物60)烷基化以獲得烷基噻吩(化合物61)，環化為內醯胺，使內醯胺-N烷基化，及最終以類似於反應圖8中所述之方式之方式脫去保護基，可提供式V化合物(反應圖11，步驟B至F)。
反應圖12顯示式VI化合物之合成。於還原胺化條件下將胺基噻吩(化合物40)雙重烷基化，具體言之，首先使用經適當保護之4-胺基環己酮且接著於存在Na(OAc)3BH下使用乙醛，可提供N-烷基化之噻吩基環己胺(化合物64，反應圖12，步驟A)。另外，可藉由首先以適 宜胺保護基諸如BOC保護胺基噻吩，接著以強鹼諸如NaH或KOtBu處理後續之胺甲酸酯，以烷基鹵諸如CH3I處理所得陰離子，移去胺保護基，及最終以經適當保護之4-胺基環己酮還原胺化，實現N-甲基化為該N-烷基化之噻吩基環己胺(化合物64)。可通過一系列為熟習此項技術者所知曉的條件，輕易達成使環己基胺基脫去保護基，得到4-胺基環己烷(化合物65)(反應圖12，步驟B)。可使用2-甲氧基丙-1,3-二醇(化合物66)之原位生成的三氟甲磺酸鹽，實現該4-胺基環己烷(化合物65，反應圖12，步驟C)之烷基化(反應圖12，步驟C)，及隨後使用元素溴或NBS溴化，可提供溴噻吩(化合物69，反應圖12，步驟E)。於鈀催化之條件下，例如使用經取代之三氟硼酸鉀鹽與催化性RuPhos-G3-環鈀，在甲苯及水之混合物中，於存在無機鹼諸如K2CO3下及加熱，將芳基溴(化合物69)烷基化，可得到N-烷基化之2-[2-(苄氧基羰基胺基)乙基]-5-[[4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基]-4-甲基-噻吩-3-甲酸甲酯(化合物70，反應圖12，步驟F)。於相關技術中明確描述的條件下脫去保護基，同時使用經適當取代之雜芳基醛，例如，於存在碳載Pd(OH)2下在醇溶劑諸如EtOH中，於壓力下及加熱來原位還原胺化，可提供經取代之胺基甲基吡啶(化合物71，Ra=CH3或Bn，反應圖12，步驟G)。隨後環化及於類似於反應圖8中所述之彼等之條件下脫去保護基，可得到式VI化合物(反應圖12，步驟H至I)。
反應圖13描繪式II化合物之替代合成。於類似於反應圖7，步驟J或反應圖8，步驟K中所述之彼等之酸性條件下，將縮酮(化合物42，反應圖8，步驟D)解除遮蔽，可提供對應之酮(化合物73，反應圖13，步驟A)。於類似於反應圖8，步驟L之條件下雙重還原胺化，可得到環己胺(化合物74，反應圖13，步驟B)，及隨後於反應圖7，步驟D中所述之條件下進行過渡金屬介導之偶聯，接著進行文獻中明確描述之胺脫去保護基，可提供胺基環己烷(化合物75，反應圖13，步驟C)。於類似於反應圖11，步驟D中描述之條件下，環化為6,7-二氫-5H-噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(化合物76)，接著於類似於反應圖7，步驟H中描述之烷基化條件下，可提供經取代之吡啶(化合物77，反應圖13，步驟E)，及最終於類似於反應圖7，步驟M中描述之條件下脫去烷基，可得到式II化合物(反應圖13，步驟F)。
反應圖14說明式IV化合物之替代合成途徑。可使用一系列相關技術中熟知的技術諸如以氫氧化鈀(II)催化氫化，來同時還原炔烴化合物54及脫去保護基(反應圖10，步驟A)，及可於類似於反應圖9，步驟B中所述之彼等之條件下實現以經適當取代之2-烷氧基吡啶諸如4,6-二甲基-2-烷氧基吡啶原位還原胺化，以提供縮酮化合物78。隨後解除遮蔽為酮化合物79，環化為內醯胺化合物80，以經適當取代之胺來還原胺化以獲得化合物81，及最終脫去烷基，其等均在類似於反應圖7(步驟J至M)中描述之所述條件下進行，可得到式IV化合物。
熟習此項技術者當知曉，可使用相關技術中熟知的標準技術，例如，藉由使用標準矽膠急驟層析及適宜有機溶劑混合物(例如，EtOAc/己烷)或藉由於C-18矽石上之逆相層析，使用適宜之水/有機溶劑混合物(例如，經NH4OAc或NH4HCO3緩衝之H2O及ACN)實現述於反應圖7至12中之所有相關反式-及順式異構體之分離。
製備1
3-乙烯氧基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
將3-羥基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(12.0g，69.3mmol)、正丁基乙烯基醚(125.0mL，961mmol)及TEA(4.1mL，29mmol)添加至密封燒瓶。用N2強力地鼓泡該混合物10分鐘。添加4,7-二苯基-1,10-啡啉(1.0g，2.92mmol)及Pd(OAc)2(0.66g，2.91mmol)。密封該燒瓶及於N2下在80℃下攪拌該混合物7天。經由矽藻土過濾該混合物及用EtOAc沖洗濾餅。濃縮濾液及使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至20% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之標題化合物(9.95g，72%產率)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)δ 1.44(s,9H),3.90(dd,J=4.2,10.1Hz,2H),3.97(dd,J=2.5,14.5Hz,1H),4.08(dd,J=2.5,6.8Hz,1H),4.17(dd,J=6.5,10.1Hz,2H),4.55-4.61(m,1H),6.37(dd,J=6.8,14.5Hz,1H)。
製備2
3-(環丙氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
使3-乙烯氧基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(9.9g，50mmol)及氯碘甲烷(12mL，159.8mmol)含於DCE(50mL)中之溶液冷卻至-5℃，且接著歷時60分鐘時間逐滴添加1M二乙基鋅之庚烷溶液(80mL，80mmol)，同時維持內部溫度在0與-5℃之間。升溫至RT及攪拌該混合物30分鐘。在冰浴中再冷卻該混合物及藉由飽和NH4Cl水溶液淬滅反應。添加濃NH4OH溶液，且接著用MTBE萃取所得混合物三次。用飽和NH4Cl水溶液洗滌已合併之萃取物，經無水K2CO3乾燥，過濾，並於真空中濃縮。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至20% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈無色油之標題化合物(4.90g，46%產率)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)δ 0.45-0.50(m,2H), 0.57-0.62(m,2H),1.43(s,9H),3.21-3.26(m,1H),3.85(dd,J=4.2,9.8Hz,2H),4.08(dd,J=6.6,9.8Hz,2H),4.32(m,1H)。
製備3
鹽酸3-(環丙氧基)氮雜環丁烷
使3-(環丙氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(4.45g，20.9mmol)含於THF(10mL，123mmol)中之溶液於冰浴中冷卻及逐滴添加4N HCl之1,4-二噁烷溶液(20mL，80mmol)。於RT下攪拌該溶液3小時並於真空中濃縮。將殘餘物溶解於2-丙醇中，濃縮並於真空中乾燥以提供標題化合物(3.0g，96%產率)，其無需額外純化即可使用。1H NMR(400.1MHz,CD3OD)δ 0.48-0.54(m,2H),0.56-0.61(m,2H),3.35-3.40(m,1H),3.98(dd,J=4.8,11.8Hz,2H),4.29(dd,J=6.8,11.8Hz,2H),4.51-4.58(m,1H)。
製備4
1-二苯甲基-3-[(3S)-四氫呋喃-3-基]氧基-氮雜環丁烷
在微波中於100℃下加熱(3S)-四氫呋喃-3-醇(10mL，122.0mmol)與甲磺酸1-二苯甲基氮雜環丁-3-基酯(3.0g，9.3mmol)之混合物20分鐘。使該混合物冷卻至RT並用EtOAc及飽和Na2CO3水溶液稀釋。分離層，用水及飽和NaCl水溶液依序洗滌有機層，並經Mg2SO4乾燥。過濾並於真空中濃縮。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以10至30% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈無色油之 標題化合物(0.9g，30%產率)。ES/MS(m/z)：310(M+H)。
基本上藉由製備4之方法，使用(3R)-四氫呋喃-3-醇來製備製備5。
製備6
3-[(3S)-四氫呋喃-3-基]氧基氮雜環丁烷
使N2沖刷通過1-二苯甲基-3-[(3S)-四氫呋喃-3-基]氧基-氮雜環丁烷(0.85g，2.7mmol)、MeOH(20mL)、EtOAc(5mL)及AcOH(1mL)之混合物10分鐘。添加碳載10% Pd(0.50g)並於H2下在60psi下攪拌所得漿液18小時。藉由過濾移去觸媒及用MeOH沖洗濾餅。濃縮並於真空中乾燥殘餘物以提供標題化合物(0.39g，95%產率)，其無需進一步純化即適合使用。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)：δ 1.85-2.05(m,2H),2.05(bs,IH),3.58-3.72(m,5H),3.74(d,IH),3.80(m,1H),3.89(mIH),4.07(m,1H),4.34(m,1H)。
基本上藉由製備6之方法，使用1-二苯甲基-3-[(3R)-四氫呋喃-3-基]氧基-氮雜環丁烷來製備製備7。
製備8
1-[1-(二苯基甲基)氮雜環丁-3-基]-3-甲基-1H-吡唑及1-(1-二苯甲基氮雜環丁-3-基)-5-甲基吡唑(區域異構體之混合物)
將甲磺酸(1-二苯甲基氮雜環丁-3-基)酯(7g，22.05mmol)含於DMF(15mL)、3-甲基-1H-吡唑(2.17g，26.47mmol)及Cs2CO3(8.6g，26.47mmol)中之溶液添加至密封管及於120℃下攪拌該混合物24小時。冷卻至RT，將該混合物倒入冰水中，並用5% MeOH之DCM溶液萃取。分離層，經Na2SO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽膠上之層析，以7至30% EtOH/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之呈區域異構體之混合物形式之標題化合物(3.5g，49%產率)。ES/MS(m/z)：304(M+H)。
基本上藉由製備8之方法製備以下化合物。
製備11
1-(氮雜環丁-3-基)-3-甲基-1H-吡唑及1-(氮雜環丁-3-基)-5-甲基吡唑(區域異構體之混合物)
在300mL Parr高壓釜中，將1-[1-(二苯基甲基)氮雜環丁-3-基]-3-甲基-1H-吡唑(3.5g，11.5mmol)與1-(1-二苯甲基氮雜環丁-3-基)-5-甲基-吡唑之混合物(區域異構體之混合物)與碳載10% Pd(3.5g，1g/g)添加至MeOH(75mL)及EtOAc(25mL)之溶液。用H2淨化該容器三次，加入50psi H2，並在RT下強力攪拌24小時。經由矽藻土床過濾並於真空中濃縮濾液以提供呈無色油之呈區域異構體之混合物形式之標題化合物(1.58g，93%產率)。ES/MS(m/z)：138(M+H)。
基本上藉由製備11之方法，使用對應之1-(二苯基甲基)氮雜環丁烷製備以下化合物。
製備14
3-(環丙基甲氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
將NaH(60%含於油中，900mg，22.5mmol)添加至0℃的3-羥基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(3g，17.32mmol)含於DMF(10mL)中之溶液。於RT下攪拌該混合物1.5小時，接著慢慢地添加溴甲基環丙烷(2.80g，20.7mmol)並攪拌72小時。用EtOAc及Et2O稀釋該混合物，用水洗滌兩次，用飽和NaCl水溶液洗滌一次，分離層，經MgSO4乾燥有機萃取物，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至20% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈無色油之標題化合物(1.91g，48%產率)。H1 NMR(400.1MHz,CDCl3)δ 0.18-0.22(m,2H),0.54-0.58(m,2H),1.00-1.04(m,1H),1.43(s,9H),3.23(d,J=7.0Hz,2H),3.85(dd,J=4.3,10.1Hz,2H),4.06(dd,J=6.5,10.1Hz,2H),4.20-4.26(m,1H)。
製備15
鹽酸3-(環丙基甲氧基)氮雜環丁烷
將4N HCl的1,4-二噁烷溶液(15mL，60mmol)添加至圓底燒瓶內的3-(環丙基甲氧基)-氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(1.91g，8.40mmol)並於RT下攪拌過夜。於真空中濃縮反應混合物並於真空中乾燥所得殘餘物以提供標題化合物(1.68g，定量產率)，其無需進一步純化即適合使用。1H NMR(400.1MHz,DMSO-d6)δ 0.14-0.18(m,2H),0.44-0.48(m,2H),0.91-0.99(m,1H),3.21(d,J=7.0Hz,2H),3.72-3.82(m,2H),4.02-4.12(m,2H),4.30-4.37(m,1H),9.17(bs,2H)。
製備16
2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-甲腈
於水浴中，將NaOCH3之MeOH溶液(30質量%，175mL，940mmol)逐滴添加至2-氯-4,6-二甲基吡啶-3-甲腈(75g，441.1mmol)含於MeOH(450mL)中之溶液，接著又逐滴添加NaOCH3之MeOH溶液(25質量%，250mL，1090mmol)。攪拌所得混合物1小時，倒入冰冷的水中，攪拌30分鐘，並過濾所得固體。用己烷洗滌濾餅並於真空烘箱中乾燥過夜。用DCM萃取水性濾液，經MgSO4乾燥有機相，過濾並於真空中濃縮。將過濾之固體及蒸發之殘餘物合併以提供呈固體之標題化合物(71.8g，定量產率)。ES/MS(m/z)：163(M+H)。
製備17
2-甲氧基-4,6-二甲基-吡啶-3-甲醛
歷時2小時時間將1M DIBAL-H之甲苯溶液(240mL，240mmol)添加至0℃的2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-甲腈(48g，295.95mmol)含於DCM(480mL)中之溶液。1小時後移去冰浴並於RT下攪拌過夜。在水浴中於RT下冷卻並藉由慢慢地添加1M HCl水溶液(192mL)與AcOH(192mL)之混合物淬滅。添加DCM，分離層，用飽和NaCl水溶液洗滌有機相，經Na2SO4乾燥，過濾並於真空中濃縮。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至20% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，提供呈固體之標題化合物(22.6g，46%產率)。ES/MS(m/z)：166(M+H)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)δ 2.43(s,3H),2.54(s,3H),4.01(s,3H),6.61(s,1H),10.48(s,1H)。
製備18
(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲醇
將NaBH4(6.4g，170mmol)逐份地添加至0℃的2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(22.6g，137mmol)含於MeOH(500mL)中之溶液。使該溶液升溫至RT並攪拌過夜。添加另一份NaBH4(1.0g)並攪拌該混合物1小時。使燒瓶冷卻至0℃，添加冰冷的水(50mL)，並於真空中濃縮所得混合物至~½體積。將飽和NaHCO3水溶液添加至所得殘餘物，用DCM萃取，分離層，用飽和NaCl水溶液洗滌有機相，並經Na2SO4乾燥有機相。過濾並於真空中濃縮濾液，以提供呈油之標題化合物(23g，定量產率)。ES/MS(m/z)：168(M+H)。
製備19
3-(氯甲基)-2-甲氧基-4,6-二甲基-吡啶
將溶於DCM(100mL)中之甲磺醯氯(22mL，281mmol)溶液添加至0℃的(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲醇(39g，233.25mmol)含於包含DIPEA(54mL)之DCM(500mL)中之溶液。慢慢地升溫至RT並攪拌超過約48小時。於真空中濃縮反應混合物及使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以2至5% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈固體之標題化合物(30.85g，71%產率)。H1 NMR(399.8MHz,DMSO-d6)：2.28(s,3H),2.30(s,3H),3.84(s,3H),4.69(s,2H),6.70(s,1H)。
製備20
2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲腈
在配備機械攪拌器之2-L三頸燒瓶中，將苄基氯(100mL，859.5mmol)逐滴添加至2-羥基-4,6-二甲基吡啶-3-甲腈(100g，675mmol)及氧化銀(174g，747mmol)含於甲苯(1L)中之混合物。於110℃下攪拌該混合物6小時。使該混合物冷卻至~60℃，經過矽藻土過濾，用DCM沖洗並於真空中濃縮濾液。將粗產物溶解於DCM中並逐滴添加MeOH直到出現固體。過濾並收集所得固體以提供呈棕色固體之標題產物(144.9g，90%產率)。ES/MS(m/z)：239(M+H)。
製備21
2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛
歷時3小時時間將1M DIBAL-H之甲苯溶液(200mL，200mmol)逐滴添加至0℃的2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲腈(40.3g，169mmol)含於DCM(400mL)中之溶液。使反應混合物升溫至RT，並攪拌3小時。於RT下用1N HCl(160mL)與乙酸(160mL)之1：1混合物極慢地淬滅反應。添加飽和NaCl水溶液(100mL)並用DCM萃取。分離層並經Na2SO4乾燥有機萃取物過夜。過濾，於真空中濃縮濾液，及使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至5% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可獲得標題化合物(24.47g，60%產率)。ES/MS(m/z)：242(M+H)。
製備22
(2-苄氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲醇
於冰浴中配備機械攪拌器之2-L三頸燒瓶中，將2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(46.5g，193mmol)溶解於MeOH(1L)中及歷時1小時時間小份地添加NaBH4(8.7g，230mmol)。使該混合物升溫至RT並攪拌3小時。使該混合物再冷卻至0℃並用冰冷的水(50mL)淬滅。於真空中濃縮反應混合物並添加飽和NaHCO3水溶液。用DCM萃取三次，用飽和NaCl水溶液洗滌已合併的萃取物，並經Na2SO4乾燥。過 濾並於真空中濃縮濾液，以提供呈無色油之標題化合物(46.8g，99.8%產率)。ES/MS(m/z)：244(M+H)。
製備23
2-苄氧基-3-(氯甲基)-4,6-二甲基-吡啶
於N2下，將SOCl2(4.0g，33mmol)慢慢地添加至-60℃的(2-苄氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲醇(6.0g，25mmol)含於DCM(100mL)中之溶液且接著升溫至-40℃持續30分鐘。將該冷反應混合物倒入冰/水(100mL)中。用飽和NaHCO3水溶液調整混合物之pH直到略鹼性，接著依序用DCM萃取水性混合物兩次，將有機萃取物合併，並經MgSO4乾燥。過濾並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至30% EtOAc/己烷的梯度溶離，可提供呈白色固體之標題化合物(4.90g，76%產率)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)δ 2.35(s,3H),2.40(s,3H),4.71(s,2H),5.43(s,2H),6.61(s,1H),7.28-7.33(m,1H),7.35-7.40(m,2H),7.47-7.51(m,2H)。
製備24
2-胺基-6-甲基-4-側氧基-4H-吡喃-3-甲腈
使NaH(85.4g，2.10mol)含於無水THF(0.70L)中之懸浮液冷卻至0℃。將純丙二腈(238g，3.6mol)逐滴添加至經攪拌之懸浮液。於0℃下攪拌10分鐘，接著冷卻至-10℃並逐滴添加乙醯基烯酮(163g，1.91 mol)含於THF(0.6L)中之溶液。於-10至0℃下攪拌1小時，接著使用濃HCl中和並用水(1.0L)稀釋。於RT下攪拌16小時。藉由過濾收集固體並空氣乾燥以提供黃色固體。自EtOH再結晶以獲得呈黃色粉末之標題化合物(120g，42%產率)。1H NMR(400.1MHz,DMSO-d6)δ 2.15(3H,s)5.87(1H,s),8.50(2H,s)。
製備25
4-羥基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-甲腈
伴隨攪拌下於100℃加熱2-胺基-6-甲基-4-側氧基-4H-吡喃-3-甲腈(120g，0.80mol)含於10% HCl水溶液(1.0L)中之懸浮液12小時。冷卻至RT並於減壓下濃縮。將EtOH(0.40L)添加至所得殘餘物並藉由過濾收集固體以提供呈白色固體之標題化合物(103g，86%產率)。1H NMR(400.1MHz,DMSO-d6,)δ 2.15(3H,s),5.87(1H,s),11.68(1H,s),12.49(bs)。
製備26
4-氯-6-甲基1-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-甲腈
將4-羥基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-甲腈(103g，0.69mol)懸浮於CHCl3(1.0L)中並添加磷醯氯(210g，1.37mol)及五氯化膦(286g，1.37mol)。伴隨攪拌下於70℃加熱8小時。冷卻至RT，伴隨強力攪拌下慢慢地倒入冰水中，使用濃NH3水溶液中和該混合物，並藉由過濾收集所得沉澱，於真空烘箱中乾燥後，提供呈棕色固體之標題化合物(77g，65%產率)。1H NMR(DMSO-d6,400.1MHz,ppm)δ 2.27 (3H,s),6.50(1H,s)。
製備27
4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-甲腈
將碘乙烷(3.3mL，41mmol)添加至4-氯-6-甲基-2-側氧基-1H-吡啶-3-甲腈(4.6g，27mmol)及Ag2O(13g，55.8mmol)含於甲苯(250mL)中之混合物並於回流下攪拌所得混合物4小時。使該混合物冷卻至60℃，經由矽藻土過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至100% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之標題化合物(2.5g，47%產率)。ES/MS(m/z)：(35Cl/37Cl)197/199(M+H)。
製備28
4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-甲醛
將1M DIBAL-H之甲苯溶液(18mL，18mmol)逐滴添加至0℃的4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-甲腈(2.2g，11mmol)含於DCM(100mL)中之溶液。使該混合物逐漸地升溫至RT，攪拌過夜，將燒瓶置於RT的水浴中，並藉由逐滴添加1M HCl水溶液(9mL)與AcOH(9mL)之混合物淬滅反應。用DCM稀釋所得混合物，分離所得層，用飽和NaCl水溶液洗滌有機萃取物，並經無水Na2SO4乾燥有機萃取物。過濾並於真空中濃縮濾液，以提供呈橙色固體之標題化合物(1.7g，76%產率)。ES/MS(m/z)：(35Cl/37Cl)200/202(M+H)。
製備29
(4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-基)甲醇
將NaBH4(0.230g，6.08mmol)添加至0℃的4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-甲醛(1g，5mmol)含於MeOH(50mL)中之溶液。使該混合物逐漸地升溫至RT，攪拌約2小時，藉由飽和NaHCO3水溶液淬滅該混合物，於真空中濃縮該混合物，用飽和NaHCO3水溶液稀釋所得殘餘物，並用DCM萃取。分離層，經無水Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色油之標題化合物(1.03g，82%產率)。ES/MS(m/z)：(35Cl/37Cl)202/204(M+H)。
製備30
4-氯-3-(氯甲基)-2-乙氧基-6-甲基吡啶
將DIPEA(0.762mL，4.33mmol)添加至(4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-基)甲醇(1.03g，4.09mmol，80%純度)含於DCM(40mL)中之RT溶液。使該溶液冷卻至0℃，接著逐滴添加甲磺醯氯(0.335mL，4.28mmol)。使該溶液逐漸地升溫至RT，於RT下攪拌所得混合物約3小時，並於真空中濃縮該混合物。添加飽和NaHCO3水溶液並用EtOAc萃取。分離層，經無水Na2SO4乾燥有機萃取物，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以5至30% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之標題化合物(0.788g，88%產率)。1H NMR δ(400.1MHz,DMSO)：1.31(t,J=7.0Hz,3H), 2.37(s,3H),4.37(q,J=7.0Hz,2H),4.71(s,2H),7.05(s,1H)。
製備31
1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-甲酸
將原甲酸三乙酯(2.35kg，2.65L，15.9mol)、PTSA(2.8g，16mmol)及乙二醇(1.64kg，26.4mol)添加至4-側氧基環己烷甲酸乙酯(900g，5.29mol)含於EtOH(4L)中之溶液並於50℃下攪拌該混合物1小時。冷卻至RT並歷時20分鐘時間慢慢地添加5M NaOH水溶液(4.24L，21.18mol)；攪拌所得混合物2小時。於減壓下蒸發大多數EtOH，添加水(5L)及MTBE(4L)，攪拌，分離相，並丟棄有機相。使水相冷卻至15℃並藉由慢慢地添加5M HCl水溶液酸化直到pH~3.3(~3.7L)。添加DCM(8L)，分離層，經Na2SO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液，以提供呈黏性油之標題化合物，其在靜置時慢慢地固化為白色低熔點固體(887g，90%產率)，其無需進一步純化即適合用於下一步驟。(GC-MS)MS(m/z)：99(M-87)。
製備32
N-甲氧基-N-甲基-1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-甲醯胺
歷時20分鐘時間小份地將CDI(915g，5.64mol)慢慢地添加至1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-甲酸(988.6g，5.31mol)含於DCM(10L)中之溶液並攪拌1小時。歷時15分鐘時間小份地添加鹽酸N-甲氧基甲胺(577g，5.92mol)並攪拌12小時。添加更多的鹽酸N-甲氧基甲胺(53g，0.55mol)並再攪拌12小時。添加水(10L)，分離相，用水(5L)及飽和 NaCl水溶液(5L)依序洗滌有機相，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液，以獲得呈無色油之標題化合物(1.24kg，定量產率)，其無需額外純化即適合用於下一步驟。ES/MS(m/z)：230(M+H)。
製備33
1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙酮
於N2下，使N-甲氧基-N-甲基-1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-甲醯胺(400g，1.74mol)含於THF(3.5L)中之溶液冷卻至0℃並歷時30分鐘時間添加3M MeMgBr之Et2O溶液(697.87mL，2.1mol)。攪拌30分鐘同時升溫至RT。藉由慢慢地添加飽和NH4Cl水溶液(1L)淬滅反應並用MTBE(500mL×3)萃取。分離層並用飽和NaCl水溶液洗滌有機層。經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液以獲得呈黃色油之粗標題化合物(275g，86%產率)，其無需進一步純化即適合使用。(GC-MS)MS(m/z)：184(M+)。
製備34
磷酸1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙烯酯二苯酯
使1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙酮(150g，0.81mol)含於THF(1L)中之溶液冷卻至-70℃並歷時30分鐘時間逐滴添加1M LiHMDS之THF溶液(896mL，0.89mol)。於-60℃下攪拌該混合物15分鐘且接著逐滴添加-70℃的含於THF(450mL)中之氯磷酸二苯酯(240.6g，896 mmol)。攪拌反應混合物14小時同時升溫至RT。用飽和NaHCO3水溶液(1L)淬滅反應並攪拌1小時。用MTBE(8L×3)萃取，分離層，經Na2SO4乾燥已合併的有機萃取物，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以2至33% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之標題化合物(190g，56%產率)。ES/MS(m/z)：417(M+H)。
製備35
4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將3-溴-4-甲基噻吩(200g，1.13mol)、MeOH(800mL)、DMA(1200mL)、TEA(390mL，2.8mol)混合及用氮氣淨化10分鐘。添加1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵(50g，0.09mol)及乙酸鈀(II)(20g，0.09mol)並於80℃下在60psi下的CO氛圍下攪拌30小時。使該混合物冷卻至RT，用EtOAc稀釋，用水及飽和NaCl水溶液依序洗滌，並經Na2SO4乾燥有機相。過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色油之標題化合物(360g)，其無需額外純化即已足以使用。ES/MS(m/z)：157(M+H)。
4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯之替代製法
將3-溴-4-甲基噻吩(1.00kg，5.65mol)及TEA(1.43kg，14.12mol)溶解於DMA(2.5L)及MeOH(1.32L)中並添加1,1-雙-二苯基膦基二茂鐵(187.9g，0.34mol)，接著添加Pd(OAc)2(63.4g，0.28mol)。於80℃下在50psi下的CO氛圍下攪拌所得混合物16小時。於冷卻至RT後，添加EtOAc(5L)，用10%檸檬酸水溶液(1.6L×2)、飽和NaHCO3水溶液(1.6L×2)、水(1.2L×2)及飽和NaCl水溶液(1L×2)依序洗 滌。分離層，經MgSO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以5% EtOAc/己烷溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之標題化合物(653g，74%產率)。ES/MS(m/z)：157(M+H)。
製備36
4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜戊硼烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯
將4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(250g，1.60mol)、4-第三丁基-2-(4-第三丁基-2-吡啶基)吡啶(8.59g，32.01mmol)及[IrMeO(COD)]2(5.37g，8.00mmol)在環己烷(2.5L)中混合。於真空下使該混合物脫氣，用N2徹底淨化，且接著歷時1小時小份地添加4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜戊硼烷(409.67g，3.20mol)。於70℃下攪拌所得混合物3小時。使該混合物冷卻至RT，於真空中濃縮，並使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至1% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可獲得呈固體之標題化合物(300g，66%產率)。ES/MS(m/z)：283(M+H)。
製備37
5-[1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙烯基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
於RT下，攪拌磷酸1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙烯酯二苯酯(240g，576.37mmol)、4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜戊硼烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯(211.4g，749.28mmol)及2M K3PO4水溶液(367g，1.73mol)含於二噁烷(2.4L)中之混合物。添加氯(2-二環己基膦基- 2',4',6'-三異丙基-1,1'-聯苯基)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯基)]鈀(II)(9.07g，11.53mmol)並於80℃下攪拌3小時。於減壓下蒸發溶劑，用EtOAc(750mL×2)萃取，分離層，用水(150mL)及飽和NaCl水溶液依序洗滌已合併的有機相，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以5% EtOAc/己烷溶離，於移除溶劑後，可提供呈固體之標題化合物(375g，67%產率)。ES/MS(m/z)：323(M+H)。
製備38
5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙烯基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將肆(3,5-雙(三氟甲基)苯基硼酸[(4R,5R)-(+)-O-[1-苄基-1-(5-甲基-2-苯基-4,5-二氫噁唑-4-基)-2-苯基乙基](二環己基次亞膦酸)(1,5-COD)銥(I)(1.61g，0.93mmol)添加至5-[1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙烯基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(60g，186mmol)含於DCM(1.9L)中之溶液並於RT下藉由48mL不鏽鋼反應器以12mL/min在80part之氫氣氛圍下溶離溶液2小時。過濾該溶液並於真空中濃縮濾液以獲得呈棕色油之粗標題化合物(60g，定量產率)，其無需進一步純化即適合用於下一步驟。ES/MS(m/z)：325(M+H)。
製備39
4-甲基-5-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]噻吩-3-甲酸甲酯
將1N HCl溶液(450mL，5.53mol)添加至5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(64.7g，178mmol)含於THF(450mL)中之溶液並於RT下攪拌16小時接著於45℃下攪拌2小時。於真空中濃縮反應混合物，添加MTBE(500mL)並分離相。用水(200mL)、飽和NaHCO3水溶液(100mL)及飽和NaCl水溶液(100mL)依序洗滌有機相。經MgSO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈棕色油之粗標題產物(53.3g，96%產率)，其可無需額外純化即使用。ES/MS(m/z)：281(M+H)。
製備40a
5-[(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
於RT下攪拌鹽酸3-甲氧基氮雜環丁烷(43.4g，351mmol)及DIPEA(65mL，373mmol)含於MeOH(500mL)中之溶液45分鐘。將該混合物添加至4-甲基-5-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]噻吩-3-甲酸甲酯(50.0g，160mmol)含於THF(250mL)中之溶液並於RT下攪拌40分鐘。使該混合物於-70℃下冷卻並歷時25分鐘時間分五小份添加LiBH4(4.9g，220mmol)。允許攪拌4小時同時升溫至-20℃。將該混合物慢慢地倒入1M HCl水溶液(500mL)中並攪拌10分鐘。於真空中蒸發大多數有機溶劑，添加DCM(500mL)及5M K2CO3水溶液(~pH 9)，分離層，並再次用DCM(250mL)洗滌水相。將有機萃取物合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經MgSO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液。添加EtOAc(50mL)並於真空中再次濃縮。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以20% EtOAc/2%三乙胺/己烷溶離，於蒸發溶劑後，可提供油。將所得油溶解於MTBE(200mL)中，用1M HCl水溶液(200mL)洗滌並再次添加2M K3PO4至水相(~pH 7.5)。用EtOAc(2×300mL)萃取該水溶液，經MgSO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液以獲得呈淺黃色油之標題化合物(15.5g，57%產率)。ES/MS(m/z)：352(M+H)。
製備40b
鹽酸5-[(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
可基本上如製備40a中所述來製備鹽酸5-[(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基]-4-甲基-噻吩-3-甲酸甲酯，其中於HCl淬滅後對粗反應混合物溶劑蒸發，並於矽石上層析，以0至100% 2M NH3/MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供油，其於真空中乾燥後部分地結晶。隨後自EtOAc及痕量MeOH再結晶，可提供對於X射線結晶學而言足夠的結晶材料。ES/MS(m/z)：352(M+H)。
藉由在EtOAc及MeOH中再結晶製備鹽酸5-[(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯之單一晶體。於-173℃下安裝在薄纖維上。使用Iμ CuKα輻射源(λ=1.54178Å)及配備SMART® 6000CCD面積偵測器之基於Bruker D8之3圈測角器繞射儀收集數據(晶體尺寸=0.150×0.080×0.020mm)。使用SAINT程式 V8.32b進行晶胞精修及數據簡化。將單位晶胞指數化，其具有12.2214(3)Å、b=7.0314(2)Å、c=12.8284(3)Å及β=108.8099(15)°之單斜晶系參數(於-173℃下，晶體結構之晶胞體積=1043.52(5)Å3，結構密度計算值=1.235g/cm3)。藉由直接方法利用SHELXS程式判定結構。獨立地定義除了氫原子外之各向異性上的所有原子參數。置於理想化的計算位置。藉由使用SHELXL程式成功地收斂F2之全矩陣最小平方精修，最終擬合優度為1.110，證實空間群之選擇，即，P2I。最終R指數(I>2 σ(I))為R1=0.0603、R2=0.1242。精修絕對結構參數為0.081(12)。判定結構。判定該結構為鹽酸鹽及判定絕對結構在立體中心處為R-構型及在環己烷環周圍為反式構型。
製備41
2-溴-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將N-溴代琥珀醯亞胺(6.18g，34.7mmol)添加至5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(15.56g，47.97mmol)含於EtOAc(60mL)中之溶液並於55℃下攪拌該混合物30分鐘，接著於40℃下攪拌過夜。用飽和NaHSO3水溶液洗滌反應混合物兩次，分離層，並經MgSO4乾燥已合併的有機層。過濾並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至20% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(15.67g，81%產率)。ES/MS(m/z)(79Br/81Br)：403/405(M+H)。
製備42
2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將2-溴-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基-噻吩-3-甲酸甲酯(15.44g，38.28mmol)、甲苯(350mL)及水(40mL)加入配備機械攪拌器之1-L三頸燒瓶中。於室內真空下使該混合物脫氣15分鐘。添加N-[2-(三氟甲硼烷尿甙)乙基]胺甲酸苄酯鉀(17.3g，57.6mmol)、Cs2CO3(37.4g，115mmol)及RuPhos-G3-環鈀(2.30g，2.69mmol)。再使該混合物脫氣15分鐘且接著於N2下在80至85℃下攪拌過夜。添加飽和NaHCO3水溶液並用EtOAc萃取三次；用水及飽和NaCl水溶液依序洗滌已合併的萃取物，經MgSO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至50% EtOAc/己烷的梯度溶離，可提供呈油之標題化合物(14.72g，76%產率)。ES/MS(m/z)：502(M+H)。
製備43
2-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於H2下，在60psi下攪拌2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(14.72g，29.35mmol)及乾燥之碳載10% Pd(3.0g)含於MeOH(80mL)中之混合物 過夜。經過矽藻土過濾反應混合物，於RT下攪拌濾液24小時並於真空中濃縮。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以20至100% EtOAc/己烷的梯度且接著以10% MeOH/EtOAc的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(8.20g，83%產率)。ES/MS(m/z)：336(M+H)。
製備44
3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於RT下攪拌2-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(6.18g，18.4mmol)在THF(30mL)與1N HCl(30mL)之混合物中之溶液過夜，接著於55℃下攪拌2小時。用固態Na2CO3淬滅反應並用EtOAc萃取。用飽和NaCl水溶液洗滌已合併的萃取物並經MgSO4乾燥。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至100% EtOAc/己烷的梯度溶離，於移除溶劑後，可提供呈發泡體之標題化合物(4.69g，87%產率)。ES/MS(m/z)：292(M+H)。
製備45
4-甲基-5-硝基噻吩-3-甲酸甲酯
將乙酸酐(2.5L)添加至低於25℃的4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(150g，0.96mol)含於AcOH(4.5L)中之溶液。使該混合物冷卻至10℃，慢慢地添加發煙HNO3(220mL)，維持溫度低於15℃，升溫至RT，並攪拌1小時。將該反應慢慢地倒入冰水中並用EtOAc(2×3L)萃取。分離 所得層，用水(4×3L)及飽和NaHCO3水溶液依序洗滌有機相，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以5% EtOAc/己烷溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈橙色固體之標題化合物(91g，47%產率)。1H NMR(400.1MHz,DMSO-d6)δ 2.77(s,3H)；3.83(s,3H)；8.61(s,1H)。
製備46
5-胺基-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將鐵(166g，2.98mol)慢慢地添加至4-甲基-5-硝基噻吩-3-甲酸甲酯(120g，0.55mol)含於AcOH(1200mL)及EtOH(1200mL)中之溶液。於80℃下攪拌該混合物15分鐘。使該反應冷卻，慢慢地倒入冰水中，並添加飽和NaHCO3水溶液直到pH 7至7.5。用EtOAc(2×3L)萃取，分離層，用飽和NaCl水溶液洗滌已合併的有機層，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中蒸發濾液以提供呈黃色油之標題化合物(98g，98%產率)，其無需額外純化既已足夠使用。ES/MS(m/z)：172(M+H)。
製備47
5-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將碳酸第三丁氧基羰基第三丁酯(16.3g，74.6mmol)添加至5-胺基-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(7.79g，37.3mmol)含於1,4-二噁烷(40mL) 中之溶液，於回流下加熱2小時，接著冷卻至RT並於真空中濃縮反應混合物。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色稠油之標題化合物(8.88g，88%產率)。ES/MS(m/z)：272(M+H)。
製備48
5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將Cs2CO3(6.03g，18.5mmol)及CH3I(1.05g，7.41mmol)添加至5-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(2.01g，7.41mmol)含於DMF(20mL)中之溶液。於80℃下加熱該混合物10分鐘並使反應混合物冷卻至RT。用DCM(50mL)及水(10mL)稀釋，分離有機層，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。將MeOH(40mL)及5M HCl水溶液(20mL)添加至所得殘餘物，並於50℃下加熱約1小時。於真空中濃縮該混合物，用DCM稀釋並添加固態NaHCO3直到將該混合物中和至約pH 7。分離有機層，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供粗4-甲基-5-(甲基胺基)-噻吩-3-甲酸甲酯。ES/MS(m/z)：186(M+H)。
將粗4-甲基-5-(甲基胺基)-噻吩-3-甲酸甲酯溶解於DCM(20mL)中，在攪拌30分鐘同時添加1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-酮(1.16g，7.40mmol)，接著添加三乙醯氧基硼氫化鈉(3.13g，14.8mmol)並於RT下再攪拌30分鐘。添加額外的1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-酮(0.289g，1.85mmol)，攪拌15分鐘，添加更多的三乙醯氧基硼氫化鈉(0.784g，3.70mmol)，並於RT下攪拌所得混合物過夜。用飽和NaHCO3水溶液(10mL)及DCM(40mL)稀釋反應，攪拌1小時，分離有機層，經Na2SO4乾 燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈無色油之標題化合物(1.21g，50%產率)。ES/MS(m/z)：326(M+H)。
製備49
2-溴-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
在RT下，將N-溴代琥珀醯亞胺(0.701g，3.82mmol)添加至含於DCM(11mL)中之5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(1.13g，3.47mmol)。於5分鐘後，用DCM(40mL)稀釋反應並用0.1M NaOH(2×10mL)洗滌。分離有機層，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈棕色油之粗標題化合物(1.47g，定量產率)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)404/406(M+H)。
製備50
2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將甲苯(15mL)及水(2.5mL)添加至燒瓶內的粗2-溴-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(1.36g，3.20mmol)、N-[2-(三氟甲硼烷尿甙)乙基]胺甲酸苄酯鉀(1.25g，4.15mmol)及Cs2CO3(3.64g，11.2mmol)。用N2淨化該混合物，接著添加RuPhos(0.0761g，0.160mmol)及第2代Ruphos預觸媒(0.124g，0.160 mmol)。強力地攪拌該混合物並於100℃下加熱18小時。冷卻至RT並用EtOAc(40mL)及水(10mL)稀釋反應。分離有機層，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至30% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈橙色油之標題化合物(0.93g，58%產率)。ES/MS(m/z)：503(M+H)。
製備51
2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將碳載20% Pd(OH)2(0.500g，3.56mmol)及TEA(0.78mL，5.57mmol)添加至含於MeOH(10mL)中之2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基)乙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.93g，1.86mmol)。將H2(345kPa)加入反應容器並於RT下攪拌。約1.5小時後，藉由過濾移出觸媒，接著於70℃下加熱該混合物5小時。使該混合物冷卻至RT並於真空中濃縮，以提供呈黃色發泡體之標題化合物(0.513g，82%產率)，其無需額外純化即已足夠使用。ES/MS(m/z)：337(M+H)。
製備52
5-[{反-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]環己基}(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將三乙醯氧基硼氫化鈉(441g，2.05mol)添加至RT的5-胺基-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(98g，0.57mol)含於包含(4-側氧基環己基)胺甲酸第三丁酯(156.7g，0.75mol)之DCE(1000mL)及AcOH(118mL)中之溶液。於RT下攪拌所得混合物30分鐘，添加乙醛(63.7mL，1.15mol)，再攪拌45分鐘，並添加水接著添加飽和NaHCO3水溶液(pH ~9-10)。用EtOAc(2×3L)萃取水性混合物，用飽和NaCl水溶液洗滌已合併的有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以5% EtOAc/己烷溶離，於移除溶劑後，可提供337g順式-/反式-混合物。藉由多次順序對掌性SFC運行(CHIRALPAK® AD，5μm，5×25cm；溶離劑：5% MeOH/CO2之等濃度混合物；管柱溫度：50℃；流速：400g/min)分離該等順式-及反式-異構體，於移除溶劑後，可提供呈棕色固體之純反式-標題化合物(183g，76%產率)。Rt=3.54分鐘。ES/MS(m/z)：397(M+H)。
製備53
5-[(反-4-胺基環己基)(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
使5-[[4-(第三丁氧基羰基胺基)環己基]-乙基胺基]-4-甲基-噻吩-3-甲酸甲酯(40g，100.9mmol)含於THF(200mL)中之溶液冷卻至0℃。逐滴添加4M HCl之二噁烷溶液(250mL，1000mmol)並於RT下攪拌所得混合物16小時。於真空中濃縮至~1/4體積，添加EtOAc(400mL)及飽和K2CO3水溶液(200mL)，並於RT下攪拌所得混合物1小時。分離所得相，用EtOAc(2×100mL)洗滌水相，將有機層合併，並用水(100mL)及飽和NaCl水溶液(100mL)依序洗滌。經Na2SO4乾燥有機層，過 濾，並於真空中濃縮濾液，於蒸發溶劑後，可提供呈暗棕色油之標題化合物(31.7g，定量產率)。ES/MS(m/z)：297(M+H)。
製備54
2-甲氧基丙烷-1,3-二醇
於-15℃下將2.3M LAH之2-甲基四氫呋喃溶液(170mL，150g，385.47mmol)逐滴添加至於-15℃下之冷的2-甲氧基丙二酸二甲酯(25g，154.19mmol)含於THF(300mL)中之溶液並於0℃下攪拌2小時，接著於RT下攪拌1小時。再冷卻至-15℃且用水(15mL)、2N KOH(15mL)及水(30mL)慢慢地淬滅，並於RT下攪拌所得混合物30分鐘。過濾所得白色固體，用EtOAc(250mL)接著用40%(v/v)MeOH/EtOAc(500mL)洗滌固體，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽膠層析，以0至20% MeOH/EtOAc的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈無色油之標題化合物(6.66g，40%產率)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)δ 2.50(bs,2H),3.47(s,3H),3.36(五重峰，J=4.5Hz,1H),3.69(dd,J=4.6,11.7Hz,2H),3.79(dd,J=4.2,11.7Hz,2H)。
製備55
5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
歷時45分鐘將三氟甲磺酸酐(36.47mL，61.16g，214.6mmol)逐滴添加至於-20℃下的2-甲氧基丙烷-1,3-二醇(14.81g，139.6mmol)含 於ACN(500mL)中之溶液。接著歷時35分鐘逐滴添加DIPEA(44.4mL，32.9g，255mmol)並於-15℃下攪拌所得混合物45分鐘。使該混合物冷卻至-25℃並歷時20分鐘逐滴添加DIPEA(44.4mL，32.9g，255mmol)。歷時30分鐘逐滴添加5-[(反-4-胺基環己基)(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(31.72g，107.0mmol)含於ACN(300mL)中之溶液。使該反應升溫至RT且接著於70℃下再攪拌1小時。使該混合物冷卻至RT，用EtOAc(500mL)及水(500mL)稀釋，分離相，並用EtOAc(2×250mL)萃取水相。將4M K2CO3水溶液(250mL)添加至已合併的有機萃取物並於RT下攪拌2小時。分離相，用飽和NaCl水溶液(250mL)洗滌有機層，經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% MeOH/EtOAc的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈棕色固體之標題化合物(29.2g，74%產率)。ES/MS(m/z)：367(M+H)。
製備56
2-溴-5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(29.17g，79.59mmol)及NBS(17.00g，95.51mmol)在DMF(400mL)中混合並於RT下攪拌所得混合物2小時。用EtOAc(400mL)及水(250mL)稀釋，分離相，並用4M K2CO3水溶液(2×200mL)、水(200mL)及飽和NaCl水溶液(200mL)依序洗滌有機層。經 Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈棕色油之標題化合物(32.4g，89%產率)，其無需進一步純化即適合用於下一步驟。ES/MS(m/z)(79Br/81Br)：445,447(M+H)。
製備57
2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將N-[2-(三氟甲硼烷尿甙)乙基]胺甲酸苄酯鉀(23.62g，82.85mmol)逐滴添加至K2CO3(657.8g，414.3mmol)含於水(123mL，6828mmol)中之溶液，接著添加2-溴-5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(32.37g，69.04mmol)含於甲苯(450mL)中之溶液。用N2輕柔地淨化該混合物同時歷時30分鐘升溫至90℃，接著添加2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯苯(2.46g，5.18mmol)及氯(2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯苯基)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯基)]鈀(II)(4.02g，5.18mmol)。於105℃下攪拌所得混合物4小時，冷卻至RT，用EtOAc(300mL)及水(100mL)稀釋，分離相，用EtOAc(3×100mL)萃取水相，並用4M K2CO3水溶液(2×100mL)、水(150mL)及飽和NaCl水溶液(150mL)依序洗滌已合併的有機層。經Na2SO4乾燥有機層，於真空中濃縮濾液，並使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至5% MeOH/EtOAc的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈棕色油之標題化合物(23.1g，51%產率)。ES/MS(m/z)：544(M+H)。
製備58
5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-2-(2-{[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]胺基}乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將碳載Pd(OH)2(20乾重%，水潤(water wet))(5.75g)添加至2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(23.00g，35.11mmol)及2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(7.03g，42.13mmol)含於EtOH(280mL)中之混合物並於H2(70psi)下在50℃下攪拌24小時。經由矽藻土過濾該混合物，用EtOH沖洗，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至25% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈棕色油之標題化合物(18.4g，89%產率)。ES/MS(m/z)：559(M+H)。
製備59
2-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於110℃下攪拌5-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-2-(2-{[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]胺基}乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(18.35g，30.21mmol)及AcOH(9.07g，151.1mmol)含 於甲苯(175mL)中之混合物3小時。冷卻該混合物，用EtOAc(250mL)及水(150mL)稀釋，分離相，用EtOAc(3×100mL)萃取水相，用4M K2CO3水溶液(2×100mL)、水(150mL)及飽和NaCl水溶液(150mL)依序洗滌已合併的有機萃取物。經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液，以提供呈棕色油之標題化合物(16.42g，95%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：527(M+H)。
製備60
5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將低於25℃的三乙醯氧基硼氫化鈉(159.6g，754mmol)慢慢地添加至5-胺基-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(43g，251mmol)、1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-酮(39.23g，251mmol)及AcOH(47mL)含於DCE(430mL)中之溶液。於RT下攪拌該混合物30分鐘且接著添加乙醛(28mL，503mmol)。於RT下攪拌該混合物30分鐘。將該混合物之內含物倒入冰水中並藉由添加飽和NaHCO3水溶液鹼化直到pH 7.0至7.5。用EtOAc(2×3L)萃取所得混合物，用飽和NaCl水溶液洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以5% EtOAc/己烷溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈固體之標題化合物(55g，67%產率)。ES/MS(m/z)：340(M+H)。
製備61
2-溴-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(91g，268.1mmol)含於DCM(1.2L)中之溶液添加至配備加料漏斗之三頸圓底燒瓶。使燒瓶冷卻至0℃，接著歷時1小時逐份地添加NBS(58.4g，322mmol)。移走冰浴並於RT下攪拌反應混合物2小時。添加水，分離有機層並於真空中濃縮有機相。使所得殘餘物分四個批次經歷矽石上之層析，各以10至50% EtOAc/己烷溶離。濃縮從前兩個批次合併的溶離份以提供油。於真空中乾燥該物質過夜以提供白色固體(40.9g)。濃縮批次三及四之溶離份以提供棕色油。用少量的己烷處理所得物質直到出現固體，過濾，並於真空中乾燥過夜以提供淺棕色固體(37.9g)。將這兩個所得的所收集批次合併以提供呈棕色油狀固體之標題化合物(78.8g，70%產率)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)418/420(M+H)。
製備62
2-溴-5-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將1M HCl水溶液(100mL)添加至含於THF(140mL)中之2-溴-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(7.81g，18.7mmol)。於RT下攪拌該反應約25小時。用EtOAc(200mL)稀釋反應混合物並分離層。用飽和NaHCO3水溶液(2×25mL)洗滌有機層。經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈紅棕 色稠油之粗標題化合物(6.71g，96%產率)，其無需額外純化即足夠用於下一步驟。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)374/376(M+H)。
製備63
2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
在兩個單獨批次中，將甲苯(428mL)及水(100mL)添加至2-溴-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(20g，48mmol)、N-[2-(三氟甲硼烷尿甙)乙基]胺甲酸苄酯鉀(17.5g，58.9mmol)、甲磺酸(2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯苯基)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯基)]鈀(II)(4.1g，4.8mmol)及Cs2CO3(47g，144mmol)之混合物。用N2淨化反應混合物，接著於80℃下加熱4小時。將反應混合物倒入冰冷的水中，添加EtOAc，分離層，經矽藻土過濾有機相，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以5至40% EtOAc/己烷的梯度溶離。濃縮所得的期望溶離份並於真空中乾燥72小時以提供呈棕色油之標題化合物(41.9g合併質量，85%合併產率，來自兩次運行)。ES/MS(m/z)：517(M+H)。
製備64
2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
用N2淨化Parr燒瓶，添加碳載20% Pd(OH)2(40g，284.9mmol)，用N2再次淨化該燒瓶，並添加TEA(150mL，1080mmol)、MeOH(500mL)、及2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(39.5g，76.5mmol)含於MeOH(500mL)中之溶液。密封該燒瓶，用N2淨化，用H2氣體淨化，並使系統充滿H2(414kPa)。於RT下攪拌約4小時並允許反應混合物靜置72小時。過濾所得懸浮液，於真空中濃縮濾液，將所得殘餘物溶解於EtOAc中，並添加少許Et2O直到固體形成。過濾並收集所得固體以提供呈白色固體之標題化合物(15.3g)。濃縮黃色濾液並使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以10至60% EtOAc/己烷的梯度溶離，可提供額外的標題化合物(8g)。將經過濾且經層析之物質合併以供進一步使用(23.3g，86%產率)。ES/MS(m/z)：351(M+H)。
製備65
4-{乙基[4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基]胺基}哌啶-1-甲酸第三丁酯
將含於DCE(408mL)及AcOH(17mL，297mmol)中之5-胺基-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(~50%純度，34g，99mmol)、4-側氧基哌啶-1-甲酸第三丁酯(25.7g，129mmol)添加至圓底燒瓶，於RT下攪拌10分鐘，接著冷卻至0℃並慢慢逐份地添加三乙醯氧基硼氫化鈉(54.2g，248mmol)。使反應混合物逐漸地升溫至RT並攪拌2小時。逐滴添加乙醛(11.1mL，199mmol)，接著攪拌72小時。使反應混合物冷卻至0℃，用飽和NaHCO3水溶液淬滅，並用DCM稀釋。分離層，用DCM萃 取水層，將有機相合併，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈橙色油之標題化合物(6.4g，17%產率)。ES/MS(m/z)：383(M+H)。
製備66
4-{[5-溴-4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基](乙基)胺基}哌啶-1-甲酸第三丁酯
將含於DCM(84mL)中之4-{乙基[4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基]胺基}哌啶-1-甲酸第三丁酯(6.4g，17mmol)添加至圓底燒瓶，冷卻至0℃，逐份地添加NBS(3.3g，18mmol)，並攪拌1小時。用水稀釋反應混合物，分離層，用額外的DCM萃取水層，將有機相合併，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至20% EtOAc/己烷的梯度溶離，於移除溶劑後，可提供呈橙色油之標題化合物(6.7g，87%產率)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)405/407(M+H-第三丁基)。
製備67
4-{[5-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基](乙基)胺基}哌啶-1-甲酸第三丁酯
在兩個單獨批次中，將4-{[5-溴-4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基](乙基)胺基}哌啶-1-甲酸第三丁酯(0.900g，1.95mmol)、N-[2-(三氟甲硼烷尿甙)乙基]胺甲酸苄酯鉀(0.695g，2.34mmol)、甲磺酸(2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯苯基)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯基)]鈀(II)(0.167g，0.195mmol)、Cs2CO3(1.91g，5.85mmol)、甲苯(9.75mL)及水(3.55mL)添加至圓底燒瓶。用N2使各混合物脫氣15分鐘，接著於90℃下加熱過夜。使各反應混合物冷卻至RT並合併。用冰水淬滅，用EtOAc稀釋，分離層，用額外的EtOAc萃取水層，將有機層合併，並經Na2SO4乾燥。過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至30% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之標題化合物(1.29g，59%產率)。ES/MS(m/z)：460(M+H-BOC)。
製備68
4-[乙基(3-甲基-4-側氧基-4,5,6,7-四氫噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)胺基]哌啶-1-甲酸第三丁酯
將含於MeOH(23mL)及THF(15mL)中之4-{[5-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基](乙基)胺基}哌啶-1-甲酸第三丁酯(1.29g，2.30mmol)添加至圓底燒瓶，用N2脫氣~10分鐘，添加碳載10% Pd(1.29g)及TEA(0.400mL，2.84mmol)，接著置於H2氛圍下並於RT下攪拌約72小時。經由矽藻土過濾反應混合物，用MeOH洗滌，並於真空中濃縮濾液。將殘餘物轉移至微波小瓶，添加TEA(0.300mL)，並於90℃下加熱2小時。伴隨攪拌下冷卻至RT過 夜，接著於真空中濃縮反應混合物。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至30% ACN/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色發泡體之標題化合物(0.466g，51%產率)。ES/MS(m/z)：394(M+H)。
製備69
2-(3-{[(苄氧基)羰基]-胺基}丙-1-炔-1-基)-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將TEA(52mL，369mmol)添加至粗2-溴-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基-噻吩-3-甲酸甲酯(10.1g，25.0mmol)、CuI(1.91g，10.0mmol)及丙-2-炔-1-基胺甲酸苄酯(11.4g，60.3mmol)含於1,4-二噁烷(130mL)中之混合物。用N2使該混合物脫氣並淨化，接著添加二氯化雙(三苯基膦)鈀(II)(3.6g，5.1mmol)。於40℃下攪拌1小時。經矽藻土過濾該混合物並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至20% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈淺棕色油之標題化合物(10.8g，80%產率)。ES/MS(m/z)：512(M+H)。
製備70
2-(3-胺基丙基)-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將TEA(0.500mL，3.55mmol)添加至2-(3-{[(苄氧基)羰基]-胺基}丙-1-炔-1-基)-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(10g，19.55mmol)含於MeOH(150mL)中之混合物。用N2使該混合物脫氣並淨化，添加碳載20% Pd(OH)2(4.10g，5.84mmol)，使反應容器充滿H2(414kPa)並攪拌過夜。添加另一份碳載20% Pd(OH)2(500mg，0.712mmol)及TEA(0.500mL，3.55mmol)，再次用N2脫氣並使反應容器充滿H2(414kPa)。再攪拌6小時，經矽藻土過濾反應，並於真空中濃縮濾液至黃色油。使所得油經歷矽石上之層析，以0至30% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之標題化合物(6.6g，89%產率)。ES/MS(m/z)：382(M+H)。
製備71
2-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將2-(3-胺基丙基)-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(1.5g，3.9mmol)含於甲苯(8mL)中之溶液添加至微波小瓶，接著添加KOtBu(940mg，7.87mmol)。於90℃下攪拌該混合物過夜。將該反應倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液中，用DCM萃取，分離層，並於真空中濃縮有機層。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至5% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈淺棕色固體之標題化合物(1.3g，85%產率)。ES/MS(m/z)：350 (M+H)。
製備72
2-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲腈]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將研磨KOH(700mg，12.4mmol)添加至2-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(1.1g，3.1mmol)含於THF(10mL)中之溶液。攪拌30分鐘，接著添加已溶於THF(1mL)中之3-(氯甲基)-2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶(700mg，3.77mmol)，並攪拌所得混合物2小時。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液中，用DCM萃取，分離層，並於真空中濃縮有機層。於真空中乾燥所得殘餘物以提供呈棕色油之粗標題化合物(2.2g，87%產率)，其無需額外純化即適合另外使用。ES/MS(m/z)：499(M+H)。
製備73
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將PTSA(1.3g，7.2mmol)添加至含於DMF(10mL)中之粗2-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(1.0g，1.2 mmol)，並於70℃下攪拌所得混合物2小時。將該混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液，用DCM萃取，分離層，並於真空中濃縮有機層。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至5% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈淺棕色油之標題化合物(680mg，定量產率)。ES/MS(m/z)：441(M+H)。
製備74
2-[(1R)-1-{反-4-[3-(環丙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將異丙醇鈦(IV)(1.40g，4.9mmol)及鹽酸3-(環丙基氧基)氮雜環丁烷(0.74g，4.9mmol)添加至3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.72g，2.5mmol)含於包含DIPEA(0.87mL，4.9mmol)之DCM(10mL)中之溶液，於RT下攪拌所得反應混合物18小時，並於真空中濃縮反應混合物。將THF(4mL)及MeOH(6mL)添加至剩餘的殘餘物並使所得溶液冷卻至-78℃。逐滴添加2M LiBH4之THF溶液(1.9mL，3.8mmol)並歷時3小時逐漸地升溫至RT。用DCM/CHCl3之1：1混合物(100mL)及50%飽和NaHCO3水溶液(50mL)稀釋反應混合物，分離所得層，經MgSO4乾燥已合併的有機萃取物，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以10至50%之10% MeOH之DCM溶液及DCM之混合物的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(0.40g，42%產率)。ES/MS(m/z)：389(M+H)。
基本上藉由製備74之方法使用對應經取代之氮雜環丁烷來製備以下化合物。
製備81
2-[(1R)-1-{反-4-[3-(甲氧基甲基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於N2下，在RT下，攪拌鹽酸3-(甲氧基甲基)氮雜環丁烷(368mg，2.67mmol)及DIPEA(400mg，3.06mmol)含於MeOH(5mL)中之混合物10分鐘，添加3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(400mg，1.37mmol)，並攪拌該混合物4小時。冷卻至-78℃，慢慢地添加2M LiBH4之THF溶液(0.90mL，1.8mmol)，並逐漸地升溫升至RT過夜。於真空中濃縮該混合物，用飽和NaHCO3水溶液稀釋所得殘餘物，用DCM萃取，並分離所得層。經MgSO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至80%之(10% 2N NH3 MeOH溶液)含於DCM及DCM中之混合物的梯度溶離。將包含期望的產物之溶離份合併並於真空中濃縮。使所得殘餘物於C-18-矽石(40g)上進行逆相層析，以10mM NH4HCO3，pH 10含於5% MeOH/水及ACN中使用100% 10mM NH4HCO3含於5% MeOH/水中溶離5分鐘，接著以25% ACN/10mM NH4HCO3含於5% MeOH/水中溶離5分鐘之分級梯度，接著以25%至90% ACN/10mM NH4HCO3含於5% MeOH/水中之線性梯度溶離。將純溶離份合併並於真空中濃縮以提供標題化合物(114mg，22%產率)。ES/MS(m/z)：377(M+H)。
製備82
5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(環丙基氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
歷時30分鐘將0.7M KHMDS之甲苯溶液(1.2mL，0.84mmol)慢慢添加至RT的2-[(1R)-1-{反-4-[3-(環丙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(230mg，0.59mmol)含於THF(10mL)中之溶液，並再攪拌30分鐘。逐滴添加2-苄氧基-3-(氯甲基)-4,6-二甲基-吡啶(200mg，0.76mmol)含於THF(5mL)中之溶液並於RT下攪拌18小時。將反應混合物加熱至55℃，攪拌1小時，冷卻至RT，倒入冰冷的NaHCO3水溶液中，並用EtOAc萃取。分離層，用飽和NaCl水溶液洗滌有機萃取物，經MgSO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以10至50% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(210mg，57%產率)。ES/MS(m/z)：614(M+H)。
基本上藉由製備82之方法及經適當取代之6,7-二氫-5H-噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮來製備以下化合物。
製備90
5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基1-2-(2-{[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]胺基}乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
於Parr反應器中，將2-(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(77g，153.5mmol)及2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(23.3g，140mmol)溶解於 EtOH(500mL)中並添加碳載Pd(OH)2，20乾重%，水潤(11.5g)。使容器充滿H2(100psi)並於50℃下攪拌3.5小時。冷卻至RT後，經由矽藻土過濾該混合物並用EtOH洗滌。於真空中濃縮濾液，將甲苯(800mL)添加至殘餘物，並繼續局部蒸餾揮發物至約400g之最終重量，以獲得呈在甲苯中之溶液之標題化合物，其無需額外純化即適合用於下一步驟。經蒸發樣本之ES/MS(m/z)：517(M+H)。
製備91
2-(2-{[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]胺基}乙基)-4-甲基-5-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]噻吩-3-甲酸甲酯
將1M HCl水溶液(800mL)添加至來自製備90之5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-2-(2-{[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]胺基}乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯之粗甲苯溶液(約76g)並於RT下攪拌1小時。分離層，用2M HCl水溶液(2×50mL)依序洗滌有機層，並用甲苯(100mL)洗滌已合併的酸性水層。將甲苯(0.4L)添加至水層並添加6M K2CO3水溶液至pH 9，攪拌5分鐘，分離相，用飽和NaCl水溶液洗滌有機層，接著使其通過Na2SO4短墊。用甲苯進一步沖洗Na2SO4墊以獲得標題化合物之粗甲苯溶液(近似體積1L)，其無需額外純化即適合用於下一個步驟。蒸發樣本之ES/MS(m/z)：473(M+H)。
製備92
5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將AcOH(9mL，157.1mmol)添加至2-(2-{[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]胺基}乙基)-4-甲基-5-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]噻吩-3-甲酸甲酯(1L，約79g，來自製備91)之粗溶液並於90℃下攪拌2小時。用2M HCl水溶液(總共0.15L)洗滌該混合物兩次，並每次用水、1M K3PO4水溶液及飽和NaCl水溶液(各0.1L)依序洗滌一次。經MgSO4乾燥有機層，過濾，並於真空中蒸發濾液以提供呈橙色黏性油之標題化合物(40.98g，48.5%產率)。ES/MS(m/z)：441(M+H)。
製備93
5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-2-{(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將DIPEA(29mL，21.5g，166mmol)添加至鹽酸3-甲氧基氮雜環丁烷(18.7g，151mmol)含於MeOH(280mL)中之溶液並於RT下攪拌30分鐘。將該混合物添加至5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(27.55g，56.28mmol)，於N2下在RT下攪拌1.5小時且接著添加THF(50mL)。使反應冷卻至-70℃並歷時30分鐘添加2M LiBH4之THF溶液(40mL，80mmol)。於相同溫度下攪拌該反應2小時。藉由歷時10分鐘將該反應慢慢地倒入1M HCl水溶液(約1L)中淬滅該反 應。用MTBE(2×0.25L)洗滌，接著用2M K3PO4水溶液處理水相至pH 9並用EtOAc(約0.5L)萃取。用3M K2CO3水溶液及飽和NaCl水溶液(各約100mL)依序洗滌有機相，經Na2SO4乾燥，過濾並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以10至25%之7N NH3/MeOH含於EtOAc中之20%溶液的梯度溶離以提供呈白色固體之標題化合物(19.5g，68%產率)。ES/MS(m/z)：512(M+H)。
製備94
5-[2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(3-甲基-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮及5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-[反-4-[3-(5-甲基吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基]乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(區域異構體之混合物)
於RT下攪拌1-(氮雜環丁-3-基)-3-甲基-1H-吡唑及1-(氮雜環丁-3-基)-5-甲基吡唑(0.53g，3.59mmol，區域異構體之混合物)、DIPEA(1.37mL，7.79mmol)及4N HCl之二噁烷溶液(1.8mL，7.190mmol)之混合物含於MeOH(5mL)中之溶液30分鐘。將該溶液添加至5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(600mg，1.2mmol)含於MeOH(19mL)中之溶液並於RT下攪拌2小時。使該混合物冷卻至-78 ℃並添加2M LiBH4之THF溶液(0.78mL，1.56mmol)；逐漸地升溫至RT並攪拌反應混合物過夜。於真空中濃縮反應混合物。使所得殘餘物於SCX(25g濾筒)上進行層析，以MeOH(2×100mL)接著2N NH3之MeOH溶液溶離。於真空中濃縮含於NH3中之MeOH溶離份以提供呈淺黃色油之呈區域異構體之混合物形式之標題化合物(0.51g，65%產率)。ES/MS(m/z)：562(M+H)。
基本上藉由製備94之方法，使用5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮及經適當取代之氮雜環丁烷來製備以下化合物。
製備99
5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-2-[(1R)-1-{4-[3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(非對映異構體之混合物)
將DIPEA(0.45mL，2.49mmol)添加至鹽酸3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁烷(0.42g，2.38mmol)含於MeOH(5.6mL)中之溶液並於RT下攪拌30分鐘。添加5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.62g，1.12mmol)並於RT下攪拌過夜。使該混合物冷卻至-78℃，添加2M LiBH4之THF溶液(0.74mL，1.47mmol)，升溫至RT，並攪拌過夜。添加飽和NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取，並分離層。經Na2SO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈油之標題化合物(0.5g，98%產率)。ES/MS(m/z)：556(M+H)。
製備100
2-{(1R)-1-[反-4-(苄基胺基)環己基]乙基}-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於RT下攪拌苄基胺(0.257g，2.397mmol)、DIPEA(0.95mL，5.39mmol)及4N HCl之二噁烷溶液(600μL，2.397mmol)含於MeOH(5mL)中之溶液30分鐘。將該混合物添加至5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.6g，1.2mmol)含於MeOH(19mL)中之溶 液並於RT下攪拌所得混合物18小時。使該混合物冷卻至-70℃並添加2M LiBH4之THF溶液(0.78mL，1.558mmol)。允許逐漸地升溫至室溫。添加冰冷的飽和NaHCO3溶液，用EtOAc(100mL)萃取，分離層，用飽和NaCl水溶液洗滌有機萃取物，並經Na2SO4乾燥有機萃取物。過濾並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色油之標題化合物(0.75g，99%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：532(M+H)。
製備101
2-[(1R)-1-(反-4-胺基環己基)乙基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
攪拌2-{(1R)-1-[反-4-(苄基胺基)環己基]乙基}-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(750mg，1.19mmol)含於MeOH(20mL)中之溶液。添加10% Pd-C(500mg，0.474mmol)並於30psi的H2下在RT下攪拌過夜。經由矽藻土過濾並用MeOH洗滌。蒸發濾液以提供呈黃色油之標題化合物(0.5g，80%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：442(M+H)。
製備102
2-{(1R)-1-[反-4-(二甲基胺基)環己基]乙基}-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
攪拌2-[(1R)-1-(反-4-胺基環己基)乙基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡 啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.5g，0.95mmol)含於MeOH(10mL)中之溶液。添加AcOH(172mg，2.85mmol)、37%甲醛水溶液(232mg，2.853mmol)。用冰浴冷卻該溶液並添加三乙醯氧基硼氫化物(605mg，2.853mmol)。允許逐漸地升溫至RT並攪拌過夜。添加冰冷的飽和NaHCO3溶液，並用DCM(2×100mL)萃取。分離層，將有機相合併，並用飽和NaCl水溶液洗滌已合併的有機萃取物。經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色油之標題化合物(390mg，70%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：470(M+H)。
製備103
5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將1M KHMDS之THF溶液(2.14mL，2.14mmol)添加至0℃的含於THF(5mL)中之2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.51g，1.53mmol)。升溫至RT並於15分鐘後添加2-苄氧基-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(0.60g，2.29mmol)。於RT下攪拌約17小時，接著用飽和NH4Cl水溶液(1mL)淬滅。用EtOAc(40mL)及水(5mL)稀釋混合物，分離有機層，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色油之標題化合物(0.94g，92%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：562(M+H)。
製備104
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[甲基 (4-側氧基環己基)胺基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將1M HCl水溶液(14mL，14mmol)添加至含於THF(14mL)中之粗5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.94g，1.4mmol)，將該混合物加熱至50℃持續8小時並於RT下攪拌2天。添加固態NaHCO3(1.8g，21mmol)及EtOAc(125mL)，分離有機層，並經Na2SO4乾燥。過濾並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% 7N甲醇NH3/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色發泡體之標題化合物(0.408g，62%產率)。ES/MS(m/z)：428(M+H)。
製備105
2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
在兩個單獨批次中，歷時30分鐘將0.91M雙(三甲基矽烷基)醯胺鉀之THF溶液(22mL，20mmol)慢慢地添加至RT的2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(6g，17.12mmol)含於THF(70mL)中之溶液。於RT下再攪拌所得混合物30分鐘，接著逐滴添加含於THF(10mL)中之3-(氯甲基)-2-甲氧基-4,6-二甲基-吡啶(3.4g，18mmol)。於RT下攪拌所得混合物過夜。將兩個混合物合併，倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液，並用EtOAc萃 取。分離相，經MgSO4乾燥有機萃取物，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色膠之標題化合物(總共18.55g，定量產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：500(M+H)。
製備106
2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將6M HCl水溶液(20mL，120mmol)添加至粗2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(18.05g，36.12mmol)含於THF(20mL)中之溶液。於50℃下加熱所得混合物2小時，並於RT下攪拌過夜。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液，用DCM萃取，分離層，並於真空中濃縮有機層。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以10至50% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色油之標題化合物(4.01g，24%產率)。ES/MS(m/z)：456(M+H)。
製備107
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
在密封管中，添加2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(6.3g，14mmol)含於DMF(50mL)中之溶液，使該管冷卻至0℃， 並添加LiCl(3g，70mmol)，接著添加PTSA(13g，72mmol)。於70℃下加熱所得混合物2小時。冷卻至RT，並慢慢地倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液(400mL)中。過濾所沉澱的固體並用水洗滌。將固體轉移至圓底燒瓶，用MeOH稀釋，並於真空中濃縮。於真空中使該固體與MeOH及THF再次共沸，接著於真空烘箱中乾燥殘餘物過夜以提供呈棕色固體之標題化合物(6.1g，100%產率)。ES/MS(m/z)：442(M+H)。
製備108
2-{[反-4-(苄基胺基)環己基](乙基)胺基}-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向圓底燒瓶，將苯基甲胺(0.445mL，4.076mmol)、5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.600g，1.359mmol)添加至THF(25mL)及MeOH(5mL)，並於RT下攪拌過夜。使反應混合物冷卻至-78℃並逐滴添加至2M LiBH4之THF溶液(1.698mL，3.397mmol)。將反應置於冰浴中並允許伴隨攪拌下升溫至RT持續3小時。用飽和NaHCO3水溶液淬滅反應混合物並用DCM稀釋。分離有機層並另外用DCM萃取水層。將有機相合併，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% MeOH/DCM的梯度溶離，並於真空中濃縮所得反式-及順式-異構體之混合物。使所得混合物經歷逆相層析，以10至75% ACN含於10mM NH4CO3水溶液/水的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之 標題化合物(0.132g，18%產率)。ES/MS(m/z)：533(M+H)。
製備109
2-[(反-4-胺基環己基)(乙基)胺基]-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
向圓底燒瓶添加含於於濕90% EtOH(0.89mL)中之2-{[反-4-(苄基胺基)環己基](乙基)胺基}-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.095g，0.178mmol)、碳載10% Pd(0.095g)及NH4HCO2(0.057g，0.892mmol)。用N2脫氣10分鐘，密封反應容器，並於90℃下加熱過夜。使反應混合物冷卻至RT，經由矽藻土過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以7至100% DCM：MeOH：NH4OH之87.5：11：1.5溶液/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈白色粉末之標題化合物(0.045g，57%產率)。ES/MS(m/z)：443(M+H)。
製備110
4-(乙基{5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-4-側氧基-4,5,6,7-四氫噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基}胺基)哌啶-1-甲酸第三丁酯
將含於包含KHMDS之THF溶液(0.91M，2.6mL，2.348mmol)之THF(20mL)中之4-[乙基(3-甲基-4-側氧基-4,5,6,7-四氫噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基)胺基]哌啶-1-甲酸第三丁酯(0.770g，1.957mmol)及3-(氯甲 基)-2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶(0.436g，2.348mmol)添加至圓底燒瓶。於RT下攪拌反應混合物4小時，用冰冷的飽和NaHCO3水溶液淬滅，用EtOAc稀釋，分離層，並用額外的EtOAc萃取水層。將有機相合併，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色油之標題化合物(1.17g，99%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：543(M+H)。
製備111
2-(乙基{4-[(2-甲氧基乙基)(甲基)胺基]環己基}胺基)-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(順式-及反式-非對映異構體之混合物)
將2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.57g，1.25mmol)添加至2-甲氧基乙胺(0.19g，2.64mmol)含於MeOH(10mL)中之溶液並攪拌該混合物4小時。冷卻至-78℃並添加2M LiBH4之THF溶液(0.82mL，1.63mmol)。慢慢地提高溫度至RT並攪拌1小時。於真空中濃縮該混合物，添加飽和NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取，分離所得層，經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液。將所得殘餘物溶解於DCM(6.2mL)中並添加37%甲醛之H2O溶液(0.27mL，3.7mmol)，於RT下攪拌所得混合物15分鐘，接著添加三乙醯氧基硼氫化鈉(1.06g，5.03mmol)並於RT下攪拌所得混合物過夜。將反應混合物之內含物加載至SCX濾筒上，首先以MeOH接著以2M NH3之MeOH溶液溶離，並於真空中濃縮甲醇氨溶離份，於蒸發溶劑後，可 提供呈油之標題化合物(0.57g，86%產率)。ES/MS(m/z)：529(M+H)。
製備112
2-[{4-反-[環丙基(甲基)胺基]環己基}(乙基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.57g，1.26mmol)添加至環丙胺(0.15g，2.641mmol)含於MeOH(10mL)中之溶液並攪拌該混合物4小時。冷卻至-78℃，並添加2M LiBH4之THF溶液(0.82mL，1.64mmol)中。使反應混合物慢慢地升溫至RT並攪拌1小時。於真空中移除溶劑，添加飽和NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取，分離所得層，並經Na2SO4乾燥有機相。過濾並於真空中濃縮濾液。將所得殘餘物溶解於DCM(6.2mL)中，添加37%甲醛之H2O溶液(0.27mL，3.77mmol)，並攪拌15分鐘。接著，添加三乙醯氧基硼氫化鈉(0.8g，5.03mmol)並於RT下攪拌過夜。將反應混合物直接加載至SCX濾筒上，首先以MeOH溶離接著以2M NH3之MeOH溶液之溶離。於真空中濃縮甲醇氨溶離份，於蒸發溶劑後，可提供油(0.56g，87%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：511(M+H)。
製備113
2-溴-5-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將異丙醇鈦(IV)(6.79g，23.2mmol)及鹽酸3-乙氧基氮雜環丁烷(1.60g，11.6mmol)添加至含於DCM(20mL)中之2-溴-5-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(2.17g，5.80mmol)之粗樣本。於RT下攪拌反應約18小時。添加THF(20mL)，接著於真空中濃縮該混合物至約20mL。使所得混合物冷卻至-78℃，接著添加MeOH(25mL)，接著逐滴添加2M LiBH4之THF溶液(4.34mL，8.70mmol)。攪拌所得混合物約3小時，接著移走冷浴並允許該混合物慢慢地升溫至RT。用EtOAc(200mL)及飽和NaHCO3水溶液(50mL)稀釋反應混合物，濾去固體，於真空中濃縮濾液，用EtOAc(50mL)稀釋殘餘物，並再次過濾固體。於真空中濃縮有機層以提供呈黃色膠之標題化合物(2.25g，78%產率)，其無需分離異構體或進一步層析即適合使用。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)459/461(M+H)。
製備114
2-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]乙基}-5-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將含於水(0.6mL)中之N-[2-(三氟甲硼烷尿甙)乙基]胺甲酸第三丁酯鉀(0.47g，1.8mmol)及碳酸銫(0.89g，2.7mmol，0.89g)添加至含 於甲苯(6mL)中之粗2-溴-5-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.68g，1.4mmol)，接著添加乙酸鈀(II)(0.031g，0.14mmol)及2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯苯(0.13g，0.27mmol)。用流動N2使所得混合物脫氣。於100℃下加熱所得混合物約2小時，用EtOAc(60mL)稀釋該混合物，並分離層。經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% 7N NH3含於MeOH/DCM中的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色膠之標題化合物(0.401g，44%產率)。ES/MS(m/z)：524(M+H)。
製備115
2-(2-胺基乙基)-5-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將4M HCl之二噁烷溶液(5mL，20mmol)中添加至RT下之含於DCM(5mL)中之2-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]乙基}-5-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.401g，0.605mmol)。於RT下攪拌反應約2小時並於真空中濃縮該混合物。添加MeOH(5mL)，並於真空中再次濃縮該混合物。用DCM(25mL)稀釋所得殘餘物，用飽和NaHCO3水溶液(3mL)洗滌，分離層，並經Na2SO4乾燥有機層。過濾並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色膠之粗標題化合物(0.380g，95%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：424(M+H)。
製備116
2-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將含於MeOH(4mL)中之2-(2-胺基乙基)-5-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.380g，0.574mmol)加熱至回流持續3小時，於真空中濃縮反應混合物，並使殘餘物於C-18矽石(WATERSTM XBRIDGE® OBD，30×75mm，5μm)上進行逆相層析，以20至90% ACN含於包含5% MeOH之10mM NH4CO3水溶液中的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈灰白色膠之標題化合物(0.113g，50%產率)。ES/MS(m/z)：392(M+H)。
製備117
5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
在冰浴中冷卻含於THF(2mL)中之2-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.113g，0.289mmol)，添加1M KHMDS之THF溶液(0.404mL，0.404 mmol)，移走冰浴，升溫至RT，並攪拌該混合物30分鐘。逐滴添加含於THF(2mL)中之2-苄氧基-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(0.113g，0.433mmol)。於RT下攪拌反應混合物22小時。用飽和NH4Cl水溶液(2mL)淬滅該反應混合物，用EtOAc(40mL)萃取，分離有機層，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽膠上之層析，以0至10% 7N NH3/MeOH含於DCM中的梯度溶離，可提供呈黃色膠之標題化合物(0.084g，45%產率)。ES/MS(m/z)：617(M+H)。
製備118
5-[(4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-基)甲基]-2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
以一份式添加粉狀KOH(0.427g，7.53mmol)至2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.660g，1.88mmol)含於THF(10mL)中之溶液。攪拌所得混合物30分鐘，添加含於THF(1mL)中之4-氯-3-(氯甲基)-2-乙氧基-6-甲基吡啶(0.500g，2.27mmol)，並於RT下攪拌所得混合物過夜。用飽和NaHCO3水溶液淬滅該混合物，用DCM萃取，分離層，經無水Na2SO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至100% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈淺黃色油之標題化合物(0.988g，98%產率)。ES/MS(m/z)：(35Cl/37Cl)534/536(M+H)。
製備119
5-[(4-氯-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側 氧基環己基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將LiCl(0.395g，9.22mmol)及PTSA(1.67g，9.21mmol)添加至5-[(4-氯-2-乙氧基-6-甲基吡啶-3-基)甲基]-2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.985g，1.84mmol)含於DMF(20mL)中之溶液並於70℃下加熱所得混合物1小時。提高溫度至90℃，攪拌5小時，使混合物冷卻至RT，添加水，並於RT下攪拌過夜。用飽和NaHCO3水溶液淬滅該混合物，用DCM萃取，分離所得層，並用5% LiCl水溶液洗滌有機相。分離層，經無水Na2SO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至50% EtOAc/己烷的梯度接著以0至20% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈橙色油之標題化合物(0.450g，26%產率)。ES/MS(m/z)：(35Cl/37Cl)462/464(M+H)。
製備120
2-(3-{[(苄氧基)羰基]胺基}丙-1-炔-1-基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將TEA(55.6g，550.0mol)添加至2-溴-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(7.9g，19.0mmol)、CuI(1.5g，7.90mmol)及N-丙-2-炔基胺甲酸苄酯(8.9g，47mmol)含於 THF(200mL)中之混合物。用流動N2使該混合物脫氣並添加二氯化雙(三苯基膦)鈀(II)(2.8g，3.9mmol)。於RT下攪拌該混合物過夜。經矽藻土過濾反應混合物，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至60% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(8.2g，82%產率)。ES/MS(m/z)：513(M+H)。
製備121
2-(3-胺基丙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將2-(3-{[(苄氧基)羰基]胺基}丙-1-炔-1-基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(7.6g，14mmol)含於包含TEA(1.0mL，7.1mmol)及碳載10% Pd(3g，2.82mmol)之MeOH(200mL)中之溶液添加至壓力容器。使反應容器充滿H2(414kPa)並攪拌4小時。經矽藻土過濾反應混合物，於真空中濃縮濾液至約150mL，添加碳載20% Pd(OH)2(2.0g)，用N2接著用H2脫氣，並於H2氛圍下攪拌過夜。經矽藻土床過濾反應混合物，於真空中濃縮至約100mL，添加碳載20% Pd(OH)2(1.2g)並於H2(414kPa)下攪拌過夜。經矽藻土過濾反應並於真空中濃縮濾液以提供呈棕色油之標題化合物(6.5g，定量產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：397(M+H)。
製備122
2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將KOtBu(3g，25mmol)添加至2-(3-胺基丙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(7.6g，19mmol)含於THF(200mL)及TEA(1.0mL，7.1mmol)中之溶液。於80℃下加熱該混合物4小時，冷卻至RT，並添加水(100mL)。於真空中濃縮全部混合物並用少量的MeOH處理所得殘餘物直到出現固體。過濾出所得固體並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物於C-18矽石(Thermo scientific Hypersil GOLDTM)上經歷逆相層析，以包含0.1%甲酸之0至50% ACN及包含0.1%甲酸之水的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈淺棕色固體之標題化合物(1.7g，24%產率)。ES/MS(m/z)：365(M+H)。
製備123
2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將粉狀KOH(1.1g，19mmol)添加至2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(1.7g，4.7mmol)含於二甲亞碸(20mL)及THF(20mL)中之溶液。攪拌該混合物30分鐘，接著添加3-(氯甲基)-2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶(1.0g，5.4mmol)。攪拌所得混合物1小時，將該混合物倒入冰冷的NaHCO3水溶液，並用DCM萃取。分離所得層並於真空中濃縮有機相以提供呈棕色油之標題化合物(2.1g，61%產率)，其無需額外純化即適合使用。 ES/MS(m/z)：514(M+H)。
製備124
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將LiCl(0.830g，19.4mmol)及PTSA(3.5g，19mmol)添加至2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(乙基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(2.0g，2.7mmol，~70%純度)含於DMF(20mL)中之溶液並於70℃下加熱所得混合物1小時。使反應混合物冷卻至RT，倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液中，用DCM(2×100mL)萃取，並分離層。於真空中濃縮已合併的有機層。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈淺棕色油之標題化合物(1.8g，~85%純度，藉由分析型LCMS測得)。ES/MS(m/z)：456(M+H)。
製備125
2-(3-{[(苄氧基)羰基]胺基}丙-1-炔-1-基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將TEA(35.4g，350.0mmol)添加至2-溴-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(5.40g，13.0mmol)、CuI(0.987g，5.18mmol)及N-丙-2-炔基胺甲酸苄酯(3.17g 14.3mmol, 85%純度)含於1,4-二噁烷(54mL)中之懸浮液。用流動N2使該混合物脫氣，添加二氯化雙(三苯基膦)鈀(II)(1.84g，2.59mmol)，於40℃下攪拌該混合物1小時，添加額外的N-丙-2-炔基胺甲酸苄酯(3.17g，14.3mmol，85%純度)，並於40℃下加熱1小時。於真空中濃縮反應混合物，添加DCM/己烷(約1：1)，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得棕色油性殘餘物經歷矽石上之層析，以0至75% MTBE/己烷的梯度溶離，於真空中濃縮層析溶離份，將所得殘餘物溶解於MeOH中，並於真空中再次濃縮以提供呈黏性棕色殘餘物之標題化合物(5.23g，75%產率)。ES/MS(m/z)：513(M+H)。
製備126
2-(3-胺基丙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
將TEA(6.40mL，45.9mmol)及碳載10% Pd(2.6g，2.4mmol)添加至含於MeOH(45mL)及EtOAc(15mL)中之2-(3-{[(苄氧基)羰基]胺基}丙-1-炔-1-基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(5.23g，9.18mmol)。將反應容器抽真空並在RT於H2(345kPa)下攪拌5小時。添加碳載20% Pd(OH)2(2.78g，3.96mmol)，將反應容器抽真空，加入H2，並於RT下攪拌約17小時。添加額外的碳載20% Pd(OH)2(1.0g，1.4mmol)，加入H2，並於RT下攪拌4小時。經矽藻土床過濾反應混合物，並於真空中濃縮濾液，使殘餘物經歷矽石上之層析，以0至12% 7N甲醇NH3/DCM的梯度溶離。於減壓下濃縮層析溶離份，將所得殘餘物溶解於MeOH中，並於真空中再次濃縮以提供呈黃色油之標題化合物(2.60g，73%產率)。ES/MS(m/z)：383 (M+H)。
製備127
2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4h-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將KOtBu(20重量%，含於THF中，5.46g，9.72mmol)添加至2-(3-胺基丙基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(2.53g，6.48mmol)含於甲苯(25mL)中之混合物。於120℃下攪拌1小時，冷卻至RT，添加丙基膦酸酐(50重量%，含於乙酸乙酯中，0.386mL，0.648mmol)並攪拌30分鐘。用飽和NH4Cl溶液淬滅反應混合物，用EtOAc(約50mL)稀釋，並分離層。經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供呈黃色油之標題化合物(2.21g，97%產率)，其無需額外純化即適合使用。ES/MS(m/z)：351(M+H)。
製備128
5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
以一份式添加粉狀KOH(1.43g，25.2mmol)至2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4h-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(2.21g，6.31mmol)含於THF(10mL)及二甲亞碸(10mL)中之溶 液，攪拌30分鐘，接著添加已溶於THF(2mL)中之2-苄氧基-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(1.98g，6.81mmol，90%純度)。於RT下攪拌所得混合物4小時，接著倒入冰冷的NaHCO3水溶液中，並用DCM萃取。分離層並於真空中濃縮有機層。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至50% EtOAc/己烷的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(3.2g，86%產率)。ES/MS(m/z)：576(M+H)。
製備129
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[甲基(4-側氧基環己基)胺基]-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將LiCl(1.4g，33mmol)及PTSA(5.8g，32mmol)添加至5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(3.2g，5.4mmol)含於DMF(30mL)中之溶液。於70℃下加熱1小時，冷卻至RT，倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液中，並用DCM萃取。分離所得層並於真空中濃縮有機相。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至5% 7N甲醇NH3/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之標題化合物(1.7g，60%產率)。ES/MS(m/z)：442(M+H)。
製備130
5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-2-[(1R)-1-{反-4-[2-甲氧基乙基(甲基)胺基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮
將2-甲氧基乙胺(100mg，1.33mmol)溶解於MeOH(4mL)中並添加5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(160mg，0.36mmol)。攪拌該混合物4小時。冷卻至-78℃並逐滴添加2M LiBH4之THF溶液(235μL，0.47mmol)。攪拌所得混合物15分鐘並伴隨攪拌下升溫至RT持續1小時。於真空中濃縮反應混合物並用DCM及飽和NaHCO3水溶液稀釋。分離層，用額外的DCM萃取水相，將有機萃取物合併，並經MgSO4乾燥有機相。過濾並濃縮濾液以獲得呈油之粗5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-2-[(1R)-1-{反-4-[(2-甲氧基乙基胺基)環己基]乙基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(150mg，83%產率)，其無需額外純化即足夠用於下一個步驟。ES/MS(m/z)：500(M+H)。
將粗5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-2-[(1R)-1-{反-4-[(2-甲氧基乙基胺基)環己基]乙基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(100mg，0.20mmol)溶解於DCM(2mL)中並添加37%甲醛水溶液(0.4mL，5.0mmol)；於RT下攪拌該混合物15分鐘。添加Na(OAc)3BH(170mg，0.80mmol)並於RT下攪拌該混合物約3小時。添加額外的37%甲醛水溶液(1.5mL，18.75mmol)至該反應混合物並於RT下攪拌2小時。於真空中濃縮該反應混合物並添加DCM(25mL)。進一步將該混合物懸浮於具有TEA(1.5mL，11mmol)之MeOH(8mL)中。添加37%甲醛水溶液(6mL，80.0mmol)。於RT下攪拌該混合物1小時。添加Na(OAc)3BH(300mg，1.42mmol)並於RT下 攪拌所得混合物約4小時。用DCM(40mL)及飽和NaHCO3水溶液(1.0mL）稀釋反應。分離層，經MgSO4乾燥有機相並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(48mg，47%產率)。ES/MS(m/z)：514(M+H)。
製備131
5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-2-[3-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基胺基]丙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
在60℃下，使2-(3-{[(苄氧基)羰基]胺基}丙-1-炔-1-基)-5-[1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基(甲基)胺基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(803g，1.57mol)、2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(314.5g，1.90mol)及活性碳載鈀Pd(OH)2(298g)含於EtOH(7.5L)中之溶液於100psi下經歷氫化。於停止H2吸收(18h)後，冷卻反應並經由矽藻土過濾所得混合物，用EtOH(2L)沖洗。於減壓下移除溶劑以提供呈油之標題化合物(892g，>99%產率)。ES/MS(m/z)：531(M+H)。
製備132
5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-7,8-二氫-6H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將三甲基矽醇化鉀(256.7g，2.0mol)添加至5-[(1R)-1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-基)乙基]-2-[3-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基胺基]丙基]-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(531.4g，1.0mol)含於THF(6.4L)中之溶液。於65℃下加熱該混合物18h，冷卻至5℃，並依序添加TEA(382mL，2.7mol)及鹽酸三乙胺(471g，3.4mol)。攪拌10分鐘後，歷時30分鐘添加2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三磷雜環己烷-2,4,6-三氧化物之EtOAc溶液(887mL，1.5mol)同時維持溫度~5℃。於RT下攪拌反應混合物過夜，並於23℃添加2N HCl水溶液(5.0L，10.0mol)。攪拌該反應16h，用EtOAc(6.5L)稀釋，並用2M K3PO4(6.5L)中和。用飽和NaCl水溶液(3.2L)洗滌有機層，分離層，經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於減壓下濃縮所得濾液。藉由矽石(4kg)上之層析純化所得殘餘物，以10至50% EtOAc/庚烷的梯度溶離。用庚烷(2.3L)研磨經純化之溶離份並於真空下在40℃下乾燥，以獲得標題化合物(196.2g，43%產率)。ES/MS(m/z)：455(M+H)。
製備133
2-[(1R)-1-[4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-7,8-二氫-6H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-7,8-二氫-6H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(246.3g，0.5418mol)添加至鹽酸3-甲氧基氮雜環丁烷(186.9g，1.51mol)含於包含DIPEA(573mL，3.29mol)之MeOH(2.9L)中之溶液。於RT下攪拌所得反應混合物過夜。添加THF(991ml)並使該溶液冷卻至-72℃。歷時45分鐘逐滴添加2M LiBH4之THF溶液(379mL，0.758mol)，同時維持內部溫度低於-70℃。攪拌2.5h後，藉由歷時20分鐘添加該反應混合物至1M HCl水溶液(6.6L)來淬滅該反應。攪拌該混合物10分鐘並用6M K2CO3水溶液(1.25L)調整至pH~9。濃縮所得混合物以移除揮發物並用EtOAc(6L)稀釋剩餘的水性混合物。分離層並用3M K2CO3(1.65L)及飽和NaCl水溶液依序洗滌有機層。經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於減壓下濃縮濾液。於矽膠(3.2kg)上純化所得殘餘物，以0至5% 7N NH3/MeOH含於EtOAc中之混合物的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可獲得標題化合物(208.6g，73%產率)。ES/MS(m/z)：526(M+H)。
實例1
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將LiCl(9.83g，230mmol)及PTSA(41.6g，230mmol)添加至5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-2-{(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(23.5g，45.9mmol)含於DMF(188mL)中之溶液。於50℃下攪拌所得混合物8小時並於RT下攪拌16小時。添加水(400mL)及2M K2CO3水溶液(300mL)，用EtOAc(2×250mL)萃取，分離層，經MgSO4乾燥已合併的有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液。將所得固體懸浮於庚烷(400mL)中並於80℃下加熱3小時。冷卻該懸浮液，過濾，並於真空下在45℃下乾燥16小時。將所得固體懸浮於二異丙醚(195mL)中，在70℃下溫熱2小時，冷卻該懸浮液，過濾，並於真空下在45℃下乾燥16小時。將所收集固體懸浮於水(180mL)中並在70℃下溫熱5小時，接著在RT下溫熱5小時。過濾所得固體並於真空下在45℃下乾燥16小時，以提供呈灰白色固體之標題化合物(16.6g，70%產率)。ES/MS(m/z)：498(M+H)。[α]D 20=-68.93°(c=1.0,MeOH)。
實例2及3
實例2：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(3-甲基-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
實例3：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-[4-[3-(5-甲基吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基]乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮
將LiCl(198mg，4.63mmol)及PTSA(839mg，4.63mmol)添加至0℃的5-[2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(3-甲基-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮及5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-[反-4-[3-(5-甲基吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基]乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(800mg，0.925mmol，區域異構體之混合物)含於DMF(5mL)中之溶液。於50℃下加熱所得懸浮液過夜。添加冰冷的飽和NaHCO3水溶液，用DCM(2×100mL)萃取，分離層，將有機相合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物於C-18矽石(XBRIDGETM，5μm，19×100mm，流速：25mL/min)上經歷逆相層析，使用40至60% 20mM NH4HCO3水溶液(pH 9)/ACN的梯度，於蒸發溶劑後，可提供呈淺黃色固體粉末之呈區域異構體之混合物形式之標題化合物(130mg，26%)。藉由製備型SFC層析(CHIRALPAK® IA，35% EtOH(0.2% IPAm)/CO2，21×250mm)分離該等區域異構體並基於1H 及HSQC光譜術指定結構。區域異構體1(實例2)：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(3-甲基-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮，ES/MS(m/z)：548(M+H),tR=2.93分鐘(分析型SFC CHIRALPAK® IA，35%(0.2% IPAm)/CO2，5mL/min，225nm，5×25mm)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)：δ 0.87-1.04(m,4H),1.22(d,J=6.8Hz,3H),1.31-1.25(m,1H),1.60-1.69(m,1H),1.69-1.79(m,1H),1.86-1.91(m,1H),1.92-2.01(m,1H),2.08-2.17(m,1H),2.26(s,3H),2.27(s,3H),2.30(s,3H),2.39(s,3H),2.79-2.89(m,3H),3.33-3.43(m,2H),3.62-3.71(m,2H),3.77(q,J=6.8Hz,2H),4.71(s,2H),4.85(五重峰，J=7.2Hz,IH),5.92(s,IH),6.01(d,J=1.9Hz,IH),7.36(d,J=2.0Hz,IH),12.53-12.55(bs,IH)。吡唑之C5展現HSQC光譜術中之128.6ppm之碳位移。區域異構體2(實例3)：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-[4-[3-(5-甲基吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基]乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮，ES/MS(m/z)：548(M+H),tR=3.69分鐘(分析型SFC CHIRALPAK® IA，35%(0.2% IPAm)/CO2，5mL/min，225nm，5×25mm)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)：δ 0.90-1.04(m,4H),1.21(d,J=6.9Hz,3H),1.25-1.31(m,1H),1.62-1.67(m,1H),1.79(s,IH),1.84-1.91(m,1H),1.99-2.01(m,1H),2.09-2.19(m,1H),2.23(s,3H),2.26(s,3H),2.30(s,3H),2.39(s,3H),2.81-2.89(m,3H),3.50-3.56(m,2H),3.62-3.71(m,2H),3.79(q,J=6.7Hz,2H),4.71(s,2H),4.81-4.88(m,1H),5.92(s,IH),5.99(s,IH),7.43(d,J=1.5Hz,IH),12.32-12.34(bs,IH)。吡唑之C3展現HSQC譜中之138.4ppm之碳位移。
基本上藉由實例2之方法，使用適宜之5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-[4取代之環己基]乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮並藉由正相或逆相層析中任一種層析純化來製備以下化合物。
實例9
2-[(1R)-1-[4-[3-(環丙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基]乙基]-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮
於90℃下攪拌5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(環丙基氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(200mg，0.33mmol)含於THF(6mL)及1N HCl(10mL)中之混合物2小時。冷卻至RT並將該混合物倒入具有冰之飽和NaHCO3水溶液中，且接著用EtOAc萃取兩次。用飽和NaCl水溶液洗滌已合併的萃取物，經MgSO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以20至50%之(10% 7N NH3 MeOH)含於DCM及DCM中之混合物的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供66mg純產物。使較不純的已合併的溶離份(於蒸發溶劑後，54mg)於C-18矽石(Phenomenex LUNA®，5μm C-18 AXIA®，30×75mm，管柱溫度25℃，85mL/min)上，使用10至75% ACN/10mM NH4HCO3(pH 10)/水的梯度經歷逆相層析。將相似溶離份合併，於真空中濃縮，並使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以20至50%之(10% 7N NH3含於MeOH中)含於DCM及DCM中之混合物的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供額外的22mg標題化合物。將兩個經純化之物質合併為標題化合物(88mg，51%產率)。ES/MS(m/z)：524(M+H)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)：0.40-0.47(m,2H),0.49-0.55(m,2H),0.91-1.01(m,4H),1.20(d,J=6.9Hz,3H),1.24-1.29(m,1H),1.55-1.65(m,1H),1.67-1.76(m,1H),1.76-1.82(m,1H),1.86-1.97(m,2H),2.30(s,3H),2.26(s,3H),2.38(s,3H),2.77-2.89(m,5H),3.17-3.22(m,1H),3.57-3.69(m,4H),4.71(s,2H),4.20(五重峰，J=6.0Hz,1H),5.92(s,1H),12.81-12.83(bs,1H)。
基本上藉由實例9之方法，使用經適當取代之5-[(2-苄氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-2-[(1R)-1-[4-氮雜環丁-1-基]環己基]乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮來製備以下化合物。
實例12：1HNMR(399.8MHz,CDCl3)：1.05-1.07(m,2H),1.32-1.46(m,2H),1.83-1.85(m,2H),1.93-1.94(m,2H),2.14-2.16(m,1H),2.25(s,3H),2.29(s,3H),2.32(s,3H),2.62(s,3H),2.58-2.67(m,1H),2.76-2.80(m,2H),3.43-3.47(m,2H),3.62-3.66(m,2H),3.77-3.81(m,2H),4.69(s,2H),4.92-4.95(m,1H),5.90(s,IH),6.24(t,J=2.0Hz,IH),7.46(d,J=2.1Hz,IH),7.53(d,J=1.9Hz,IH)。(未觀察到可交換NH質子。)
實例15
2-{(1R)-1-[反-4-(氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於60psi下之H2下攪拌2-{(1R)-1-[反-4-(氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(190mg，0.34mmol)及碳載10% Pd(60mg)含於MeOH(15mL)中之混合物過夜。經矽藻土床過濾反應混合物並濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至60%之10% 7N NH3 MeOH/DCM之混合物含於DCM中的梯度溶離，於蒸發溶劑後，獲得標題化合物(117mg，73%產率)。ES/MS(m/z)：468(M+H)。
實例16
2-[(1R)-1-{反-4-[3-(環丙基甲氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於62℃下攪拌5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(環丙基甲氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(96mg，0.15mmol)、LiCl(34mg，0.79 mmol)及對甲苯磺酸單水合物(135mg，0.77mmol)含於DMF(3mL)中之混合物1.5小時並於真空中濃縮反應混合物。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至70%之含於MeOH/DCM中之10% 2N NH3之混合物含於DCM中的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供標題化合物(40mg，48%產率)。ES/MS(m/z)：538(M+H)。
實例17及18
實例17：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[(1R)-{反-4-[3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基)]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
實例18：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[(1R)-{順-4-[3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基)]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將LiCl(0.2g，5.57mmol)及PTSA(1.01g，5.578mmol)添加至5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-2-[(1R)-1-{4-[3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.62g，1.11mmol，順式-及反式-非對映異構體之混合物)含 於DMF(5.6mL)中之溶液並於90℃下攪拌2小時。添加飽和NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物於SCX(10g)上進行層析，首先用MeOH接著用2M NH3之MeOH溶液溶離。於真空中濃縮含於氨水中之MeOH溶離份，並使所得殘餘物於C-18矽石(Xterra XBRIDGE®管柱，5μm，19×100cm)上，以35至55% 20mM NH4CO3(pH 9)含於水/ACN中的梯度，以25mL/分鐘歷時3分鐘溶離經歷逆相層析，於蒸發溶劑後，可提供呈固體之首先溶離之反式-化合物實例17(0.148g，25%產率)，ES/MS(m/z)：541(M+H)、及呈固體之第二溶離之順式-化合物實例18(0.027g，4.5%產率)，ES/MS(m/z)：541(M+H)。
實例19
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基](甲基)胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於RT下攪拌含於具有DIPEA(0.308mL，1.77mmol)之MeOH(5mL)及THF(5mL)中之鹽酸3-甲氧基氮雜環丁烷(0.304g，2.460mmol)30分鐘。添加5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[甲基(4-側氧基環己基)胺基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.28g，0.49mmol)並於RT下攪拌1小時。使該混合物冷卻至-78℃並添加2M LiBH4之THF溶液(6.4mL，13mmol)，於-78℃下攪拌所得混合物1小時，並升溫至RT。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3溶液中，用DCM萃取，分離層，經Na2SO4乾燥有機萃取物，過濾， 並於真空中濃縮有機萃取物。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至50% 10% 7N甲醇性NH3溶液含於DCM中至DCM的梯度溶離。收集包含反式-及順式-異構體之層析溶離份並於真空中濃縮。藉由於C-18矽石(30g Thermo Scientific Hypersil GOLDTM)上，以10至100% ACN含於10mM NH4CO3水溶液的梯度溶離之逆相層析分離反式-及順式-異構體，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之標題化合物(0.064g，26%產率)。ES/MS(m/z)：499(M+H)。
實例20
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-(甲基{反-4-[3-(1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}胺基)-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
於RT下，將異丙醇鈦(IV)(0.373g，1.27mmol)添加至含於DCM(2.5mL)中之5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[甲基(4-側氧基環己劑)胺基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.148g，0.32mmol)，接著添加二鹽酸1-(氮雜環丁-3-基)吡唑(0.187g，0.955mmol)。3小時後，添加THF(2.5mL)，接著於真空中濃縮該混合物至約2.5mL。使反應混合物冷卻至-78℃，添加MeOH(2.5mL)，接著添加2M LiBH4之THF溶液(0.24mL，0.48mmol)，逐漸地升溫至RT，並攪拌過夜。用DCM(50mL)及水(10mL)稀釋該混合物，經矽藻土床過濾，並用DCM(100mL)洗滌濾餅。於真空中濃縮濾液並使所得殘餘物於C-18矽石(WATERSTM XBRIDGE®，30×75mm，5μm)上，以20至60% ACN含於包含5% MeOH之10mM NH4CO3水溶液中的梯度溶離經歷逆相層析，於蒸發溶劑後，可提供呈透明薄膜之標題化合物(0.025g，14%產率)。ES/MS(m/z)：535(M+H)。
實例21
5-[(4-氯-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將含於甲醇(5mL)中之鹽酸3-甲氧基氮雜環丁烷(0.300g，2.43mmol)添加至裝納THF(5mL)及DIPEA(0.306mL，1.75mmol)之圓底燒瓶，於RT下攪拌30分鐘，接著添加5-[(4-氯-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.450g，0.487mmol，50%純度)至該溶液，並於RT下攪拌1小時。使反應混合物冷卻至-78℃並添加2M LiBH4之THF溶液(0.63mL，1.3mmol)。攪拌1小時，接著使該混合物逐漸地升溫至RT，將該混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液，用DCM萃取，分離層，經無水Na2SO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至40% 10%之7N NH3/MeOH含於DCM中之混合物/DCM的梯度溶離。為分離順式-及反式-異構體，蒸發包含產物之溶離份並使所得殘餘物於C-18矽石(15.5g Thermo Scientific Hypersil GOLDTM)上，以10至100% ACN含於包含5% MeOH之10mM NH4CO3中的梯度溶離經歷逆相層析，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之標題化合物(0,120g，46%產率)。ES/MS (m/z)：(35Cl/37Cl)533/535(M+H)。
實例22
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將LiCl(6.13g，143.2mmol)添加至2-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(16.40g，28.65mmol)及PTSA(25.96g，143.2mmol)含於DMF(100mL)中之混合物並於50℃下攪拌9小時且接著於RT下攪拌18小時。用EtOAc(400mL)及4M K2CO3水溶液(200mL)稀釋。分離相，用EtOAc(3×100mL)萃取水相，並用4M K2CO3水溶液(2× 100mL)、水(100mL)及飽和NaCl水溶液(100mL)依序洗滌已合併的有機層。經Na2SO4乾燥有機相，過濾，並於真空中濃縮濾液以提供淺棕色固體。用EtOAc(100mL)漿化該固體並於RT下攪拌1小時。添加乙醚(100mL)，於RT下攪拌2小時，過濾固體，用冷乙醚(50mL)洗滌，並於真空下乾燥。將TEA(21.54g，212.8mmol)添加至所得固體含於ACN(500mL)中之混合物並於85℃下攪拌24小時。冷卻該混合物，於真空中濃縮，將所得殘餘物懸浮於水(165mL)中，並於RT下攪拌4小時。過濾所得固體，用水(50mL)洗滌，並於真空下在50℃下乾燥16小時以提供呈淺象牙色固體之標題化合物(10.83g，76%產率)。ES/MS(m/z)：513(M+H)。
實例23
2-[{反-4-[3-(環丙基氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}(乙基)胺基]-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將鹽酸3-(環丙氧基)氮雜環丁烷(0.6776g，4.529mmol)、MeOH(4mL)、DIPEA(0.5853g，4.529mmol)、5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.500g，1.13mmol)及THF(20mL)添加至圓底燒瓶。於RT下攪拌所得溶液過夜。使反應混合物冷卻至-78℃並逐滴添加2M LiBH4之THF溶液(1.13mL，2.26mmol)。將該反應置於0℃的冰浴中並允許歷時1.5小時慢慢地升溫至RT。用飽和NaHCO3水溶液淬滅反應混合物，用DCM稀釋，分離層，並用額外的DCM萃取水相。將有機相合併，經無水Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷於C-18矽石上之逆相層析。於真空中濃縮期望的溶離份以提供呈白色粉末之標題化合物(0.092g，15%)。ES/MS(m/z)：539(M+H)。
實例24及25
實例24：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{反-4-[3-(1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}胺基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
實例25：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{順-4-[3-(1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}胺基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將二鹽酸1-(氮雜環丁-3-基)吡唑(0.266g，1.36mmol)、MeOH(6.8mL)及DIPEA(0.239mL，1.36mmol)添加至圓底燒瓶，並於RT下攪拌30分鐘。添加5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.150g，0.340mmol)至反應混合物並攪拌3小時。使反應混合物冷卻至-78℃，接著逐滴添加2M LiBH4之THF溶液(0.255mL，0.510mmol)並攪拌3小時。使反應混合物升溫至RT，倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液中，用DCM/水稀釋所得懸浮液，並用DCM萃取三次。分離層，將有機相合併，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷於C-18矽石上之逆相層析，以0至55% ACN含於10mM NH4CO3/水中之梯度溶離，可提供呈白色固體之反式-標題化合物實例24(0.088g，47%產率),ES/MS(m/z)：549(M+H)、及呈白色固體之順式-標題化合物實例25(0.048g，26%產率)，ES/MS(m/z)：549(M+H)。
實例26
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{反-4-[3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}胺基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將含於MeOH(20mL)中之鹽酸3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁烷(1.5g，8.9mmol)及DIPEA(2mL，11.5mmol)添加至圓底燒瓶。於RT下攪拌30分鐘，接著添加含於THF(5mL)中之5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(1.0g，2.3mmol)並於RT下攪拌所得混合物過夜。使反應混合物冷卻至-78℃並逐滴添加2M LiBH4之THF溶液(2.8mL，5.6mmol)。將該反應置於冰浴中並慢慢地升溫至RT持續2小時。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液中，用DCM萃取，分離層，並於真空中濃縮有機萃取物。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至3%之7N NH3/MeOH含於DCM中之混合物的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈非純淺棕色固體之反式異構體(0.450g，36%產率)及呈淺棕色油之順式異構體(0.220g，17%產率)。使反式異構體經歷於C-18矽石上之逆相層析，以0至60% ACN含於10mM NH4CO3/水中之梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈淺棕色固體之反式標題化合物(233mg，18%產率)。ES/MS(m/z)：557(M+H)。1H NMR(400.1MHz,CDCl3)：0.94(t,J=7.0Hz,3H),0.98-1.03(m,2H),1.20-1.28(m,2H),1.78-1.81(m,2H),1.86-1.92(m,3H),2.29(s,3H), 2.35(s,6H),2.67-2.77(m,1H),2.83(t,J=6.6Hz,2H),2.85-2.95(m,4H),3.39(s,3H),3.59(dd,J=6.1,7.5Hz,2H),3.52(s,4H),3.69(t,J=6.6Hz,2H),4.13(五重峰，J=5.9Hz,1H),4.73(s,2H),5.94(s,1H),12.24-12.25(bs,1H)。
實例27
2-{[反-4-(二甲基胺基)環己基](乙基)胺基}-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將含於MeOH(4mL)中之2-[(反-4-胺基環己基)(乙基)胺基]-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.050g，0.113mmol)、乙酸(0.019mL，0.339mmol)及37%甲醛水溶液(0.025mL，0.3389mmol)添加至5mL微波小瓶。使該小瓶冷卻至0℃並慢慢地添加NaCNBH4(0.0213g，0.3389mmol)至反應混合物。升溫至RT，攪拌4.5小時，接著於真空中濃縮反應混合物。用DCM及水稀釋所得殘餘物，分離層，並用額外的DCM萃取水層。將有機相合併，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷於C-18矽石(50g)上之逆相層析，以ACN含於10mM NH4CO3/水中溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈白色粉末之標題化合物(0.0135g，25%產率)。ES/MS(m/z)：471(M+H)。
實例28
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(哌啶-4-基)胺基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將含於DMF(6.45mL)中之4-(乙基{5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-4-側氧基-4,5,6,7-四氫噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基}胺基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(0.700g，1.290mmol)添加至微波小瓶。冷卻至0℃，接著添加LiCl(0.276,6.45mmol)及PTSA(1.17g，6.45mmol)。將所得混合物加熱至90℃過夜，使反應混合物冷卻至RT，用冰冷的飽和NaHCO3水溶液淬滅，並用DCM稀釋。分離層，用額外的DCM萃取水層，將有機相合併，經Na2SO4乾燥，過濾，並於真空中濃縮。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% 7N NH3之MeOH溶液/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈米色固體之標題化合物(0.284g，51%產率)。ES/MS(m/z)：429(M+H)。
實例29及30
實例29：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{反-4-[(2-甲氧基乙基)(甲基)胺基]環己基}胺基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
實例30：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{順-4-[(2-甲氧基乙基)(甲基)胺基]環己基}胺基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將LiCl(0.22g，5.20mmol)及PTSA(0.94g，5.20mmol)添加至2-(乙基{4-[(2-甲氧基乙基)(甲基)胺基]環己基}胺基)-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.55g，1.04mmol，順式及反式非對映異構體之混合物)含於DMF(5.2mL)中之溶液並在密封管中於90℃下加熱1小時。使反應冷卻至RT，添加飽和NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取，並於真空中濃縮有機萃取物。將所得殘餘物加載至SCX濾筒(25g)上，首先以MeOH且接著以2M NH3之MeOH溶液溶離。於真空中濃縮甲醇性氨溶離份並使所得殘餘物經歷超臨界流體層析(CHIRALCEL® OD，5um，2×25cm)，以在65mL/min下包含0.2% DMA之CO2/MeOH之移動相30%等濃度地溶離，可提供標題化合物：5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{反-4-[(2-甲氧基乙基)(甲基)胺基]環己基}胺基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮，實例29(0.07g，13%產率)，ES/MS(m/z)：515(M+H)。5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{順-4-[(2-甲氧基乙基)(甲基)胺基]環己基}-胺基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮，實例30(0.04g，8%產率)，ES/MS(m/z)：515(M+H)。
實例31
2-[{反-4-[環丙基(甲基)胺基]環己基}(乙基)胺基]-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將LiCl(0.23g，5.38mmol)及PTSA(0.97g，5.38mmol)添加至2-[{4-反-[環丙基(甲基)胺基]環己基}(乙基)胺基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.55g，1.07mmol)含於DMF(5.4mL)中之溶液並於90℃下加熱1小時。冷卻至RT並添加飽和NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取，並分離層。經無水Na2SO4乾燥有機相，過濾，於真空中濃縮，並將所得殘餘物加載至SCX濾筒上，首先以MeOH且接著以2M NH3之MeOH溶液溶離。於真空中濃縮甲醇性氨溶離份並藉由SFC(CHIRALCEL® OD，5μm，2×25cm)使所得殘餘物經歷層析，以在65mL/分鐘下包含0.2% DMA之CO2/MeOH之移動相30%等濃度地溶離，可提供呈固體之標題化合物(0.15g，29%產率)。ES/MS(m/z)：497(M+H)。
實例32
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
將碳載10% Pd(0.035g，0.033mmol)添加至5-{[2-(苄氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基]甲基}-2-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](乙基)胺基}-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(0.084g，0.13 mmol)含於EtOAc(2mL)及MeOH(2mL)中之溶液。使反應容器充滿H2(345kPa)，攪拌約3小時，過濾，並於真空中濃縮反應混合物。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以20% EtOAc/DCM接著以0至10% 7N NH3/MeOH含於DCM中之梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供呈黃色膠之標題化合物(0.041g，57%產率)。ES/MS(m/z)：527(M+H)。
實例33
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-(乙基{反-4-[3-(1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}胺基)-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4h-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將1-(氮雜環丁-3-基)吡唑(0.600g，4.87mmol)添加至包含DIPEA(1.5mL，8.6mmol)之MeOH(10mL)溶液，於RT下攪拌30分鐘，接著添加含於THF(10mL)中之5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(0.800g，1.76mmol)。於RT下攪拌1小時，使反應混合物冷卻至-78℃，並添加2M LiBH4之THF溶液(0.9mL，1.8mmol)。攪拌所得混合物3小時，逐漸地升溫至RT，並攪拌過夜。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3溶液中，用DCM萃取，分離層，並於真空中濃縮有機相。使殘餘物經歷於C-18矽石(100g，Thermo Scientific Hypersil GOLDTM)上，以包含0.1%甲酸之0至50% ACN及包含0.1%甲酸之水的梯度溶離之逆相層析，蒸發溶劑，並使所得殘餘物再一次經歷於C-18矽石(100g，Thermo Scientific Hypersil GOLDTM)上，以包含0.1%甲酸之0至40% ACN及包含0.1%甲酸之水的梯度溶離之逆相層析。用飽和NaHCO3水溶液處理已合併的層析溶離份，用DCM萃取，分離層，經MgSO4乾燥有機相，過濾，於真空中濃縮濾液，並於真空烘箱中乾燥過夜，以提供呈白色固體之呈單一異構體形式之標題化合物(0.047g，4.7%產率)。ES/MS(m/z)：563(M+H)。
實例34
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{乙基[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]胺基}-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將鹽酸3-甲氧基氮雜環丁烷(0.580g，4.69mmol)添加至MeOH(5mL)及DIPEA(1mL，5.7mmol)之溶液，於RT下攪拌30分鐘，接著添加含於THF(5mL)中之5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[乙基(4-側氧基環己基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(0.600g，1.12mmol，85%純度)。於RT下攪拌所得混合物1小時，冷卻至-78℃，並添加2M LiBH4之THF溶液(1.2mL，2.4mmol)。攪拌所得混合物1小時，伴隨攪拌下升溫至RT持續2小時，接著將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3溶液中。用DCM(3×100mL)萃取，分離層，並於真空中濃縮有機相。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% MeOH/DCM的梯度溶離，於蒸發溶劑後，可提供反式及順式異構體之混合物。藉由於C-18矽石(100g，Thermo Scientific Hypersil GOLDTM)上，以0至60% ACN含於10mM NH4CO3水溶液中的梯度溶離之逆相層析來分離反式及順式異構體，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之標題化合物(0.0779g，13%產率)。ES/MS(m/z)：527(M+H)。
實例35
2-[{反-4-[3-(環丙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}(甲基)胺基]-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
使鹽酸3-(環丙氧基)氮雜環丁烷(0.400g，2.67mmol)於MeOH(10mL)中漿化，添加THF(10mL)及DIPEA(0.600mL，3.44mmol)，於RT下攪拌30分鐘，添加5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[甲基(4-側氧基環己基)胺基]-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(0.300g，0.577mmol，85%純度)，並於RT下攪拌所得混合物過夜。使該混合物冷卻至-78℃並添加2M LiBH4之THF溶液(0.700mL，1.4mmol)。於-78℃下攪拌所得混合物1小時。使該混合物升溫至RT，攪拌1小時，將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3溶液中，用DCM萃取，分離層，並於真空中濃縮有機層。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至5% 7N甲醇NH3/DCM的梯度溶離。收集包含反式及順式異構體之層析溶離份並於真空中濃縮。藉由於C-18矽石(40g，Thermo Scientific Hypersil GOLDTM)上，以5至60% ACN含於10mM NH4CO3水溶液中的梯度溶離之逆相層析來分離反式及順式 異構體，於蒸發溶劑後，可提供呈淺棕色固體之標題化合物(0.0662g，21%產率)。ES/MS(m/z)：539(M+H)。
實例36
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{(反-4-[3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁-1-基]環己基}(甲基)胺基]-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
於RT下攪拌含於包含DIPEA(0.418mL，2.40mmol)之MeOH(5mL)及THF(5mL)中之3-(2-甲氧基乙氧基)氮雜環丁烷(0.437g，2.460mmol)30分鐘。添加5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[甲基(4-側氧基環己基)胺基]-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(0.35g，0.67mmol)並於RT下攪拌1小時。使該混合物冷卻至-78℃並添加2M LiBH4之THF溶液(0.87mL，1.7mmol)，於-78℃下攪拌所得混合物2小時並升溫至RT過夜。使該混合物冷卻至-78℃，添加2M LiBH4之THF溶液(0.5mL，1.0mmol)，並升溫至RT。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3溶液中，用DCM萃取，分離層，經Na2SO4乾燥有機萃取物，過濾，並於真空中濃縮有機萃取物。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至40%之10% 7N甲醇NH3/DCM溶液/DCM的梯度溶離。收集包含反式及順式異構體之層析溶離份並於真空中濃縮。藉由於C-18矽石(15.5g Thermo Scientific Hypersil GOLDTM)上，以10至100% ACN含於包含5% MeOH之10mM NH4CO3 水溶液中的梯度溶離之逆相層析來分離反式及順式異構體，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之標題化合物(0.036g，9%產率)。ES/MS(m/z)：557(M+H)。
實例37
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{[反-4-(3-乙氧基氮雜環丁-1-基)環己基](甲基)胺基}-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將含於MeOH(5mL)及DIPEA(0.55mL，3.15mmol)中之鹽酸3-乙氧基氮雜環丁烷(0.424g，3.08mmol)添加至含於THF(10mL)中之5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[甲基(4-側氧基環己基)胺基]-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(0.320g，0.616mmol)。於RT下攪拌30分鐘。使該混合物冷卻至-78℃並慢慢地添加2M LiBH4之THF溶液(0.650mL，1.3mmol)，於-78℃下攪拌所得混合物1小時，升溫至RT，並攪拌1小時。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3溶液中，用DCM萃取，分離層，經Na2SO4乾燥有機萃取物，過濾，並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至70%之10% 7N甲醇性NH3含於DCM中之溶液至DCM的梯度溶離。收集包含反式及順式異構體之層析溶離份並於真空中濃縮。藉由於C-18矽石(Phenomenex Luna)上，以40至75% ACN含於包含5% MeOH之10mM NH4CO3水溶液中的梯度溶離之逆相層析來分離順式及反式異構體，於蒸發溶劑後，可提供呈白色固體之標題化合物 (0.099g，37%產率)。ES/MS(m/z)：527(M+H)。
實例38
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將DIPEA(1.0mL，5.7mmol)添加至含於MeOH(10mL)及THF(10mL)中之鹽酸3-甲氧基氮雜環丁烷(480mg，3.88mmol)，並於RT下攪拌30分鐘。添加5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(0.25g，0.57mmol)至該溶液並於RT下攪拌1小時。使反應混合物冷卻至-78℃且接著添加2M硼氫化鋰之THF溶液(1.0mL，2.0mmol)。3小時後，移走冰浴並於RT下攪拌1小時。將反應混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液中並於真空中濃縮。使所得殘餘物以0至50% ACN(包含0.1%甲酸)含於水(包含0.1%甲酸)中的梯度溶離經歷逆相層析。收集純的溶離份並濃縮以提供呈甲酸鹽形式之產物。將該產物與來自遵循類似程序約2倍規模之前一運行反應之物質合併。將飽和NaHCO3水溶液添加至已合併的產物混合物，用DCM萃取，用鹽水洗滌，經MgSO4乾燥並過濾。於真空中濃縮濾液並於烘箱中乾燥過夜以提供呈白色固體之標題化合物(合併質量0.057g，合併產率6%)。ES/MS(m/z)：512(M+H)。[α]D 20=-42.80°(c=1.0，MeOH)。
實例38之替代程序
歷時10分鐘在25至34℃之溫度下將氯三甲基矽烷(233mL，1.83 mol)添加至2-[(1R)-1-[4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基]-5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-7,8-二氫-6H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(240g，0.456mol)及NaI(267g，1.78mol)含於乙腈中之混合物。在33至41℃加熱該反應2h。冷卻至RT，並用乙腈(4L)稀釋兩次，各次於減壓下濃縮該混合物至初始體積。用乙酸乙酯(2.4L)及水(2.4L)稀釋該混合物，並用NH4OH(380ml)調整至約pH 10。分離所得層，用飽和NaCl水溶液(1.9L)洗滌有機層。經Na2SO4乾燥有機層，過濾，並於減壓下移除溶劑。藉由經矽膠塞過濾，首先以10% EtOH/EtOAc接著以5% 7N NH3之MeOH溶液與10% EtOH之EtOAc溶液之混合物溶離來純化所得殘餘物。蒸發甲醇氨濾液並用0℃的丙酮(3體積)研磨所得殘餘物。於真空下在RT下乾燥以獲得呈白色固體之標題化合物(186.4g，80%產率)。ES/MS(m/z)：512(M+H)。
實例39
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-[4-(3-吡唑-1-基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基]-7,8-二氫-6H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮
將THF(5mL)及DIPEA(0.500mL，2.87mmol)添加至1-(氮雜環丁-3-基)吡唑(0.380g，3.09mmol)含於MeOH(5mL)中之溶液，於RT下攪拌所得混合物30分鐘，添加5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-(4-側氧基環己基)乙基]-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮(0.400g，0.763mmol，84%純度)，並於RT下攪 拌該混合物過夜。使反應混合物冷卻至-78℃，添加2M LiBH4之THF溶液(0.720mL，1.4mmol)，於-78℃下攪拌所得混合物2小時，升溫至RT，攪拌2小時，將該混合物倒入冰冷的飽和NaHCO3水溶液，用DCM(3×100mL)萃取，分離層，並於真空中濃縮已合併的有機相。使所得殘餘物經歷於C-18矽石上之逆相層析，以5至60% ACN含於10mM NH4CO3水溶液中的梯度溶離，於蒸發溶劑及真空乾燥後，可提供呈白色固體之標題化合物(0.110g，26%產率)。ES/MS(m/z)：548(M+H)。
實例40
2-{(1R)-1-[反-4-(二甲基胺基)環己基]乙基}-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮甲磺酸鹽
將MsOH(9.1mg，94.3mmol)添加至2-{(1R)-1-[反-4-(二甲基胺基)環己基]乙基}-5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(42.9mg，90.5mmol)含於MeOH(2mL)中之懸浮液並超音波處理以獲得無色溶液。於真空中濃縮該溶液以獲得呈白色固體之標題化合物(47.8mg，93.8%產率)。ES/MS(m/z)：454.3(M-H)。
實例41
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(5-甲基-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-6,7-二 氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮甲磺酸鹽
將MsOH(1.55μL，0.0238mmol)含於MeOH(1mL)中之溶液添加至5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-[4-[3-(5-甲基吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基]乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(12.7mg，0.023mmol)含於MeOH(2mL)中之溶液。超音波處理該混合物以獲得透明溶液。於真空中濃縮並於烘箱中在約40℃下乾燥所得殘餘物，接著在RT下乾燥數天，以提供呈白色固體之標題化合物(13.8mg，84%產率)。ES/MS(m/z)：548(M+H)。
實例42
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(3-甲基-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮甲磺酸鹽
將MsOH(1.73μL，0.0265mmol)添加至5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-2-[(1R)-1-{反-4-[3-(3-甲基-1H-吡唑-1-基)氮雜環丁-1-基]環己基}乙基]-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(14.5mg，0.027mmol)含於MeOH(2mL)中之懸浮液。於真空中濃縮 該溶液並於真空烘箱中在50℃下乾燥所得殘餘物2小時，以提供呈白色固體之標題化合物(15.1mg，89%產率)。ES/MS(m/z)：548(M+H)。
實例43
5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-[(1R)-1-{反-4-[(2-甲氧基乙基)(甲基)胺基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-C]吡啶-4(5H)-酮
將5-[(2-甲氧基-4,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]-2-[(1R)-1-{反-4-[2-甲氧基乙基(甲基)胺基]環己基}乙基]-3-甲基-6,7-二氫噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(48.0mg，0.093mmol)溶解於DMF(3.0mL)中。添加LiCl(30.0mg，0.71mmol)及PTSA(30mg，0.16mmol)。於60℃下加熱該混合物4小時。冷卻至RT並攪拌過夜。用EtOAc(30mL)及水(3mL)稀釋。用水萃取乙酸乙酯層並經MgSO4乾燥EtOAcc。過濾並於真空中濃縮濾液。使所得殘餘物經歷矽石上之層析，以0至10% MeOH/DCM的梯度溶離，於移除溶劑後，可提供呈白色粉末之標題化合物(47mg，定量產率)。ES/MS(m/z)：500(M+H)。
生物分析
在文獻中，EZH2表現與多種類型之癌症有關，例如，淋巴瘤(Velichutina,I.等人(2010)Blood 116：5247-55；Sneeringer,C.J.等人(2010)Proc Natl Acad Sci USA.107：20980-5；McCabe等人(2012)Nature 492：108-12；Béguelin,W.等人(2013)Cancer Cell 23：677-92；Knutson,S.K.等人，Mol Cancer Ther 13：842-S4)、橫紋肌樣瘤 (Knutson,S.K.等人(2013)Proc Natl Acad Sci USA.110：7922-7)、缺少或缺乏SNF5之腫瘤(Wilson,B.G.等人(2010)Cancer Cell 18：316-28)、肉瘤(Kadoch及Crabtree(2013)Cell 153：71-85；Shen等人(2016)Sci Rep 6：25239)、多發性骨髓瘤(Kalushkova,A.等人(2010)PLoS One 5：el1483；Popovic,R.等人(2014)PLoS Genet.10：el004566；Hernando,H.等人(2016)Mol Cancer Ther.15(2)：287-98；Agarwal,P等人(2016)Oncotarget 7：6809-23)、黑色素瘤(Zingg等人(2015)Nat Commun.6：6051；Barsotti,A.M.等人(2015)Oncotarget 6(5)：2928-38；Souroullas,G.P.等人(2016)Nat.Med.22：632-40)、結腸直腸癌(Nagarsheth,N.等人(2016)Cancer Res.76：275-82)、肺癌(Byers,L.A.等人(2012)Cancer Discov.2：798-811；Behrens,C.等人(2013)Clin Cancer Res.19：6556-65；Riquelme,E.等人(2014)Clin Cancer Res.20：3849-61；Fillmore,C.M.等人(2015)Nature 520：239-42)、腎癌(Adelaiye,R.等人(2015)Mol Cancer Ther.14(2)：513-22)、乳癌(Kleer,C.G.等人(2003),Proc Natl Acad Sci USA.100：11606-11；Ren等人(2012)Cancer Res 72：3091-104)、卵巢癌(Bitler等人(2015)Nat Med 21：231-8)及前列腺癌(Varambally,S.等人(2002)Nature 419：624-9；Yu,J.等人(2007)Cancer Res.67：10657-63；Varambally,S.等人(2008)Science 322：1695-9；Yu,J.等人(2010)Cancer Cell 17：443-54)。
以下分析之結果證實實例1至43之化合物為EZH2抑制劑及本發明化合物(例如，實例1、9、13、22及38)在本文中可用於治療癌症。如本文所使用，「IC50」係指藥劑產生針對該藥劑所可能之最大抑制反應之50%的濃度(相對IC50)、或藥劑相比於安慰劑對照產生靶酵素活性之50%抑制的濃度(絕對IC50)。
EZH2 WT/Y64IN mut 384孔生物化學分析
該分析之目的係測量在PRC2複合物之背景內容中化合物對於 EZH2 WT/Y641N之催化活性之效應。
在Sf9細胞中使用桿狀病毒表現系統表現FLAG標記之EZH2或EZH2 Y641N為由EZH2、EED、SUZ12、RBBP4及AEBP蛋白質組成之PRC2 5員(5-mer)複合物，及使用FLAG®親和純化(Sigma-Aldrich)純化。利用分析緩衝液(50mM Tris-HCl pH 8.5，10mM DTT，0.005% TRITON®-X 100)將該酵素複合物稀釋為3.33nM(就mut分析而言，6.67nM)之工作原液中。在WT分析中，將非生物素離胺酸27三甲基化組蛋白H3(21-44)共活化劑肽(CPC Scientific Cat # 869799)稀釋於上述酵素工作溶液中至13.33nM之最終濃度。利用3H-SAM(腺苷-L-甲硫胺酸，S-(甲基)-3H(Adomet)，批號169500/12，15Ci/mmol或0.55mCi/mL，36.7μM，Perkin Elmer NET155)共稀釋針對WT分析而言生物素組蛋白H3(21-44)肽底物(殘基21-44，CPC Scientific Cat# S11115)或針對mut分析而言生物素離胺酸27二甲基化組蛋白H3(21-44)肽底物(CPC Scientific，Cat# 830754)至於分析緩衝液中之4μM(WT分析)或2μM(mut分析)之最終濃度。
將含於100% DMSO中之測試化合物(針對WT分析而言50μL 4mM原液或針對mut分析而言50μL 0.2mM原液)添加至384孔NUNCTM板(Thermo Scientific，Cat# 264573)。將20μL 100% DMSO置於稀釋孔中。自一個孔轉移10μL至下一個孔進行3×連續稀釋。在WT分析中，使2μL經連續稀釋之化合物與38μL DMSO在Labcyte 384孔板(Cat# P-05525)中混合，而在mut分析中，將全部20μL經連續稀釋之化合物轉移至384孔Labcyte低容量板(Cat# LP-0200)。聲學轉移200nL(WT分析)或100nL(mut分析)化合物至接受384孔分析板(Corning 3706)。在WT分析中，將15μL酵素/三甲基H3共活化劑肽混合物分配至分析板中，接著分配5μL生物素H3肽底物/3H-SAM混合物。密封該等板並於RT下振盪2小時。最終分析條件為2.5nM酵素複合物、10 nM三甲基組蛋白/共活化劑H3肽、1μM生物素底物肽、1μM 3H-SAM及最高濃度為1μM之測試化合物(WT分析)；或5nM酵素複合物、0.5μM生物素底物肽、0.5μM 3H-SAM及最高濃度為1μM之測試化合物(mut分析)。使矽酸釔鏈黴親和素SPA珠粒(Perkin Elmer，Cat# RPNQ0012)在3M胍-HCL中以1mg/mL(WT分析)或0.5mg/mL(mut分析)復水。以20μL/孔將該珠粒混合物添加至分析板，振盪10分鐘，並允許於MICROBETA®上計數前在RT下沉降1小時。計算原始數據(CPM)並使用Genedata Assay分析儀標準化至抑制%為抑制%=100-[(測試化合物CPM-最小CPM中位數)/(最大CPM中位數-最小CPM中位數)×100]。將經標準化之數據作圖及使用GENEDATA® Condoseo使得曲線為抑制%(y軸)相對log化合物濃度(x軸)，並使用4參數非線性邏輯擬合演算法確定IC50值。可在該分析中實質上如上所述測試本發明範圍內的化合物。例如，實例1及20之化合物具有證實在PRC2複合物背景內容中重組體WT/mut EZH2之甲基轉移酶活性之抑制作用之生物化學IC50結果。例如，實例1之化合物顯示對抗WT 5-mer EZH2為2.06±1.90nM(n=5)及對抗mut 5-mer EZH2為2.11±0.58nM(n=2)之IC50。實例22之化合物顯示對抗WT 5-mer EZH2為3.29±1.24nM(n=3)及對抗mut 5-mer EZH2為7.21nM(n=1)之IC50。實例38之化合物顯示對抗WT 5-mer EZH2為0.923±0.091nM(n=2)及對抗mut 5-mer EZH2為2.65nM(n=1)之IC50。
基於H3K27me3細胞之ELISA
該分析之目的係經由測量細胞三甲基化H3K27濃度評估化合物抑制細胞中EZH2之功能性活性之能力。在黑色96孔BD BIOCOAT® Cellware聚離胺酸板(BD Biosciences，Cat# 354640)中以5,000個細胞/100μL/孔接種Karpas-422(EZH2 Y641N)細胞。在NUNCTM 96孔聚丙烯MICROWELLTM板(Thermo Scientific Cat# #249944)中藉由添加40 μL/孔之10mM化合物(代表起始最終濃度為20μM)或40μL DMSO製備化合物板，接著經由自一個孔轉移20μL至下一個孔製備連續稀釋液。在單獨的NUNCTM 96孔聚丙烯MICROWELLTM板中添加5μL測試化合物至245μL/孔之生長培養基，及標記11μL之化合物/培養基混合物至細胞板上。將細胞板置於37℃培養箱中48小時。從培養箱移走該等板，將該等板置於室溫下15至20分鐘，並以1000rpm旋轉減慢該等板5分鐘。於RT下用30μL 16%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定細胞15分鐘。移除多聚甲醛並於RT下用100μL/孔包含0.1% TRITON® X-100之PBS減去鈣或鎂(-/-)透化細胞20分鐘。用PBS(-/-)(2x)洗滌板，接著於RT下用50μL/孔初級抗體溶液(Diagenode抗-H3K27me3 MAb-181-050；於包含1% BSA之PBS加上鈣及鎂(+/+)中之1：3000稀釋)培養2小時。用PBS-/-(3x)洗滌板，接著於RT下在黑暗中用50μL/孔二級抗體溶液(Invitrogen山羊抗小鼠IgG Alexa 488，Cat# A11001；於PBS+/+中之1：1000稀釋)培養1小時。用PBS-/-(3x)洗滌板，接著添加50μL/孔之含於包含200μg/mL RNA酶(Invitrogen；Cat# 12091021)之PBS中之5μg/mL碘化鉀(Invitrogen；Cat# p3566)染色溶液。用黑色板密封件覆蓋板並於ACUMEN®雷射掃描細胞儀(TTP Lab Tech)上以Ex 488nm/Em 505nm至530nm(H3K27m3信號)及LP655nm(細胞核信號)掃描。在該分析中可實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。例如，實例1之化合物顯示在MDA MB-231及Karpas-422中分別為19.2±1.55nM(n=2)或23.6±20.5nM(n=6)之細胞H3K27me3 IC50。實例22之化合物顯示在MDA MB-231及Karpas-422中分別為<1nM(n=1)或0.0148±0.0147nM(n=6)之細胞H3K27me3 IC50。實例38之化合物顯示在Karpas-422中為0.00973±0.00956nM(n=4)之細胞H3K27me3 IC50。
Karpas-422增殖分析
該分析之目的係證實測試化合物抑制活體外腫瘤細胞生長之能 力。
在96孔、黑色96孔BD BIOCOAT® Cellware聚離胺酸板(BD Biosciences，Cat# 354640)中以5000個細胞/100μL/孔之密度接種Karpas-422細胞。添加40μL 10mM測試化合物(代表起始最終濃度為20μM)或添加100% DMSO至NUNCTM 96-孔聚丙烯MICROWELLTM板(Thermo Scientific Cat# #249944)。藉由從一個孔轉移20μL至下一個孔來進行連續稀釋。於單獨NUNCTM 96孔聚丙烯MICROWELLTM板中，添加5μL化合物至含245μL/孔生長培養基，及標記11μL化合物/培養基混合物至細胞板上。於37℃下培養細胞板7天。添加100μL/孔之Cell Titer GLO®試劑(Promega，Cat# G7671)至細胞板。振盪2分鐘並使用板讀取器測量發光。在該分析中可實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。例如，實例1之化合物顯示176±165nM(n=5)之IC50。實例22之化合物顯示84.5±42.7nM(n=5)之IC50。實例38之化合物顯示10.1±4.6nM(n=4)之IC50。
異種移植研究
該分析之目的係評估測試化合物抑制活體內腫瘤EZH2功能及EZH2介導之腫瘤生長之能力。
以實例1之化合物使用基本上如McCabe等人(2012)Nature 492：108-12中所述之Karpas-422異種移植模型，在以下改變/規格下實施活體內靶向抑制及效力研究：1)改用羥乙基纖維素(1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑)代替20% CAPTISOL®為調配媒劑；2)藉由口腔強飼代替藉由腹膜內注射投與化合物；3)當腫瘤體積就效力實驗而言達到150至200mm3範圍及就靶向抑制實驗而言達到300至350mm3時開始化合物治療及；4)改在第7天代替第10天測量腫瘤甲基化或腫瘤TNFRSF21表現之抑制。
腫瘤衍生之三甲基化H3K27之基於ELISA之測量
為自腫瘤酸萃取組蛋白，將約0.5cm×0.25cm或20至30mg重之腫瘤切片放入溶胞基質D 500×2mL中。於無RNA酶/DNA酶管中添加用於均質化之珠粒(MP Biomedicals，Cat# 6913-500)。添加650μL酸溶胞緩衝液(包含蛋白酶抑制劑混合物錠劑(Roche；Cat# 11836153001)之0.4N HCl)。在FASTPREP® FP120均質機中，以速度6m/秒均質化腫瘤樣本20秒2至3次。將樣本置於冰上1小時以進行分離。將上清液轉移至Eppendorf管並置於管旋轉器上以於4℃下溶胞過夜。以8000rpm在4℃下旋轉減慢樣本10分鐘。將上清液轉移至新管並測量蛋白質濃度。
將150μL/孔之MSD阻斷溶液A(Meso Scale Discovery(MSD)；最終濃度為3%)添加至MULTI-SPOT®三甲基組蛋白H3(K27)SINGLEPLEX®板(MSD；Cat#：N45CA-1)。於RT下振盪1小時。用IX MSD Tris洗滌緩衝液TM(MSD)(3×)洗滌板。將0.25μg腫瘤溶胞液/孔分配在25μL酸溶胞緩衝液中，一式三份。於4℃下振盪過夜。用IX MSD Tris洗滌緩衝液TM洗滌板三次。添加25μL/孔之偵測抗體SULFO-TAGTM-三甲基組蛋白H3(K27)，其已於抗體稀釋緩衝液(1% MSD阻斷劑A；0.1% MSD阻斷劑D-B及0.1% MSD®阻斷劑D-G之最終濃度)中稀釋至1.5μg/μL之最終濃度。於RT下振盪1至2小時。用IX MSD Tris洗滌緩衝液洗滌板三次。藉由添加100μL/孔之含於PBS中之4%甲醛固定板。於RT下振盪30分鐘。用1 x MSD Tris洗滌緩衝液洗滌板三次。添加150μL/孔IX MSD®讀取緩衝液並使用MSD SECTOR®成像儀6000儀器測量化學電致發光。在該分析中可實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。例如，小鼠中BID投與50mpk之實例1之化合物導致腫瘤甲基化抑制53%(n=8隻小鼠；p<0.0001)。小鼠中BID投與15mpk之實例38之化合物導致腫瘤甲基化抑制73%(n=8隻小鼠；p<0.0001)。
腫瘤衍生之TNFRSF21 mRNA表現之基於qPCR之測量
為自腫瘤組織單離RNA，將約0.5cm×0.25cm或20至30mg重之腫瘤切片放入溶胞基質D 500 x 2mL中。於無RNA酶/DNA酶管中添加用於均質化之珠粒(MP Biomedicals，REF：6913-500)。添加650μL來自RNEASY®套組(Qiagen；Cat#74104)之RLT緩衝液。在FASTPREP® FP120均質機中以速度6均質化樣本20秒2至3次。將樣本置於冰上以冷卻10分鐘。於4℃下以13000rpm離心10分鐘。將上清液放入QIA管中並使用RNEASY®套組(Qiagen；Cat#74104)單離RNA。
使用高容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems；Cat# 4368813)，自3μg腫瘤RNA製備cDNA並在PCR熱循環儀中使用以下循環條件培養樣本：於25℃下10分鐘；於37℃下2小時，維持在4℃。在Applied Biosystems ViiA 7TM即時PCR循環儀中，使用Thermo Scientific ABsolute Blue QPCR ROX混合物(Applied Biosystems；Cat# AB-4139)及針對TNFRSF21之Taqman探針(Applied Biosystems；Cat# Hs01560899_ml)及管家基因GAPDH(Applied Biosystems；Cat# Hs02758991-gl)來擴增cDNA產物。計算TNFRSF21循環臨限值並標準化至其各別樣本的GAPDH水平。在該分析中可實質上如上所述測試本發明範圍內之化合物。例如，BID投與50mpk之實例1之化合物導致腫瘤TNFRSF21基因表現增加25倍(n=8隻小鼠；p<0.0001)。BID投與15mpk之實例38之化合物導致腫瘤TNFRSF21基因表現增加60倍(n=8隻小鼠；p<0.0001)。
EZH2抑制劑及其他癌症化療劑之組合治療
以下段落提供支持以下之證據：EZH2抑制劑(包括但不限於實例1或實例38)，單獨地且/或組合標準醫護(SoC)化學療法用於治療具有SWI/SNF複合物及/或MLL複合物及/或PI3K路徑之組分中之突變組合的卵巢癌、胃癌、肺癌或結腸直腸癌。該等癌症包括但不限於缺乏ARID1A蛋白質表現組合PTEN或PIK3CA突變及/或於蘇胺酸 308(Thr308)上磷酸化之Akt之組成性蛋白質表現之卵巢癌。另外，該等癌症包括但不限於同時缺乏SMARCA2及SMARCA4蛋白質表現之卵巢癌。另外，該等癌症包括但不限於具有ARID1A中異型接合功能喪失(LOF)突變(包括(但不限於)無意義、框移及編碼接合突變)組合MLL2中異型接合LOF突變但不具有TP53中同型接合突變之胃癌。另外，該等癌症包括但不限於具有ARID1A中異型接合LOF突變(包括(但不限於)無意義、框移及編碼接合突變)組合PTEN或PIK3CA中突變及/或於Thr308上磷酸化之Akt之組成性蛋白質表現但不具有TP53中同型接合突變之胃癌。另外，該等癌症包括但不限於具有MLL3中異型接合LOF突變之肺癌。另外，該等癌症包括但不限於具有ARID1A中異型接合LOF突變組合具有PTEN或PIK3CA中突變之突變及/或於Thr308上磷酸化之Akt之組成性蛋白質表現之結腸直腸癌。
在7-或10-天增殖檢定中測試對實例1或實例38回應之卵巢癌細胞系。針對細胞數量及分裂時程將各細胞系最佳化，此將7或10天期間96孔格式中log階段生長最大化。第0天在96孔黑色、透明底、塗覆聚-D-離胺酸之96孔板(BD BioSciences；BD BIOCOATTM Cellware，聚離胺酸，Cat.#354640)中將細胞接種於總體積90μL之細胞培養基中並於37℃/5% CO2下培養18至24小時。第1天，藉由添加150μL包含2%二甲亞碸(DMSO；Sigma-Aldrich Cat.#D2438)之培養基至96孔透明平底板(CORNING® COSTAR®細胞培養板Cat #3596)之第3至12欄製備化合物稀釋板。製備實例1或實例38在100% DMSO中之10mM原液，並進一步在細胞培養基中稀釋至200μM之工作濃度。添加225μL之實例1或實例38至化合物稀釋板之第2欄，並以第3欄至第12欄製備測試化合物之1：3 10點連續稀釋。將10μL之經連續稀釋之化合物添加至細胞板，可提供1nM至20μM之最終測試化合物濃度範圍及0.2%之最終DMSO濃度。在該7-或10-天檢定期結束時，使細胞經歷如下之 CELLTITER-GLO®發光細胞存活率分析(Promega，Cat.#G7570)：1)解凍CELLTITER-GLO®緩衝液並使其與室溫平衡；2)使凍乾CELLTITER-GLO®底物與室溫平衡；3)將CELLTITER-GLO®緩衝液轉移至底物瓶以形成CELLTITER-GLO®試劑；4)使細胞板與室溫平衡；5)僅就黏附細胞而言，自細胞板移除培養基；6)添加25μL CELLTITER-GLO®試劑至各孔；7)讓板在室溫下再培養20至30分鐘；8)使用Perkin Elmer EnVision 2104多偵測微量滴定板讀取器讀取發光。
如Ye,X.S.等人(1997)Methods Enzymol.283：520-32中所述衍生得卵巢癌細胞系之全細胞溶胞產物並藉由西方墨點法，使用以下抗體：抗-ARID1A(Bethyl，Cat.#A301-040A)；抗-SMARCA2/BRM(Abcam，Cat.# ab15597)；抗-BRG1/SMARCA4(Bethyl，Cat.#A300-813A)及抗-磷酸化-Akt(Thr308)抗體D25E6(Cell Signaling，Cat.#13038)，來測量SWI/SNF複合物、MLL複合物及PI3K路徑組分，其包括ARID1A、SMARCA2、SMARCA4(使用3至8% SDS-PAGE)及於Thr308上磷酸化之Akt(使用4至20% SDS-PAGE)之蛋白質表現。使用抗-Akt(泛)抗體40D4(Cell Signaling，Cat.#2920)及抗-β-肌動蛋白AC-74(Sigma，Cat.#A2228)抗體以測量總Akt及肌動蛋白含量作為蛋白質負載之對照。
表1概述實例38對卵巢細胞系小組之效應及顯示ARID1A陰性而且於Akt上之Thr308上磷酸化、或同時缺乏SMARCA2及SMARCA4表現之卵巢癌細胞系中對EZH2抑制劑敏感。
使用A2780異種移植模型，活體內測試相較於卵巢癌SoC卡鉑加上太平洋紫杉醇之實例38之效應。皮下植入含於50% MATRIGEL®中之2百萬個A2780細胞至每個組各10隻無胸骨裸小鼠(Envigo RMS,Inc.,Indianapolis,IN)之右後脅腹中。當腫瘤體積達到100至150mm3時開始治療。用實例38預治療動物5天接著再共投與實例38及SoC至少23天或直到媒劑腫瘤體積達到2000mm3。在1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑中調配實例38並藉由口腔強飼(p.o.)以50mpk每天兩次(BID)投與。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中調配卡鉑(APP Pharmaceuticals NDC 63323-172-60)並藉由腹膜內(i.p.)注射以60mpk每2週(Q14D)投與。在PBS中調配太平洋紫杉醇(Hospira,Inc NDC 61703-342-50)並藉由靜脈內(IV)注射以10mpk Q14D投與。測量腫瘤生長抑制為AT/C(%)，經計算為個別動物之平均值[(實例38治療第28天時的腫瘤體積減去第0天時的腫瘤體積)除以(媒劑處理第28天時的腫瘤體積減去第0天時的腫瘤體積)]乘以100。表2概述治療第28天實例38及卵巢癌SoC對於A2780腫瘤生長之效應之結果。與單獨SoC對A2780腫瘤生長之弱效應對比，於單用50mpk BID p.o.實例38治療後，及於用50mpk QD p.o.實例38組合SoC治療後，觀察到A2780腫瘤生長受到顯著抑制。
START Discovery(http：//startdiscovery.net/)具有患者衍生腫瘤模型之平臺。基於存在或不存在SWI/SNF組分功能喪失及PI3K路徑突變選擇兩個START Discovery卵巢患者衍生模型，及在START Discovery測試實例1對腫瘤生長之效應。治療各2隻小鼠的2個組28天。用卵巢標準醫護(SoC)化合物卡鉑(在0.9% NaCl中調配並以60mpk Q14D i.p.投與)及太平洋紫杉醇(在0.9% NaCl中調配並以10mpk Q14D IV投與)治療組1。用實例1(在1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑中調配並以50mpk BID p.o.投與)預治療組2持續5天，接著共投與實例1及SoC持續23天或直到腫瘤體積達到2000mm3。監測模型，顯示藉由組合治療在第28天腫瘤停滯或消退，停止給藥後直到觀察到腫瘤再生長。將腫瘤體積之平均改變%與第0天的基線腫瘤體積進行比較，並計算為個別動物之平均值[(治療第x天時的腫瘤體積減去第0天時的腫瘤體積)除以第0天時的腫瘤體積]乘以100。表3概述實例1治療對兩種患者衍生之卵巢腫瘤模型之生長之效應。顯示利用實例1治療顯著抑制腫瘤生長之ST884(一種患者衍生之卵巢腫瘤模型)具有ARID1A中之異型接合突變及PIK3CA中之突變之組合。相比之下，為異型接合突變體ARID1A而無PIK3CA或PTEN中突變之ST416(一種患者衍生之卵巢腫瘤模型)未顯示實例1治療之腫瘤生長抑制。
Oncotest(http：//www.oncotest.com/)亦具有直接地自患者移植之患者腫瘤外植體之已確認的大量集合並呈PDX形式皮下繼代培養於裸小鼠中。基於功能喪失(LOF)SWI/SNF及/或MLL複合體突變之存在來選擇9個Oncotest胃PDX，並在Oncotest測試實例1或媒劑對於腫瘤生長之效應。就模型GXA-3011而言，測試每個組各5隻動物並用媒劑(1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑)或實例1中任一者以50mpk BID p.o.治療28天。監測模型，顯示第28天腫瘤停滯或消退，在停止給藥後直到觀察到腫瘤再生長。計算ΔT/C(%)為個別動物之平均值[(實例1治療28天時的腫瘤體積減去第0天時的腫瘤體積)除以(媒劑治療28天時的腫瘤體積減去第0天時的腫瘤體積)]乘以100。
就其他Oncotest胃PDX而言，治療各2隻小鼠的2個組28天。用胃標準醫護(SoC)化合物奧沙利鉑(在5%葡萄糖中調配並以8mpk Q14D i.p.投與)及太平洋紫杉醇(在0.9% NaCl中調配並以10mpk Q14D IV投與)治療組1。用實例1(在1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑中調配並以50mpk BID p.o.投與)預治療組2動物5天，接著共投與實例1及SoC持續23天或直到腫瘤體積達到2000mm3。計算腫瘤體積之平均變化%為個別動物之平均值[(治療28天時的腫瘤體積減去第0天時的腫瘤體積)除以第0天時的腫瘤體積]乘以100。
表4概述實例1治療對於患者衍生之胃癌模型(癌或腺癌)之生長之效應之結果，及顯示其生長受到實例1治療阻礙之模型具有兩種突變：1)ARID1A中至少一個異型接合LOF突變及2)MLL2中之任一異型 接合LOF(在PDX GXA-3052、GXA-3079、GXA-3083中發現)及/或影響PI3K路徑之組分之突變(包括(但不限於)PIK3CA及PTEN；在PDX GXA-3002及GXA-3005中發現)。在實例1治療後其生長不受抑制之模型具有p53中之同型接合突變，而不論ARID1A或MLL2中之LOF突變狀態(如在PDX GXA 3011中)及不論PI3K路徑之組分之突變狀態(如在PDX GXA-3069中)。
類似地，具有兩個異型接合MLL3功能喪失突變之患者衍生之肺腫瘤模型LXFE 937之生長在以實例1組合肺癌SoC吉西他濱(在0.9% NaCl中調配並每週一次以120mpk i.p投與)加上順鉑(在0.9% NaCl中調配並每週一次以3.2mpk經皮下投與)治療後受到顯著抑制。數據顯示於表5中。
類似地，患者衍生之結腸直腸腫瘤CXF 1034(其不表現ARID1A蛋白質及具有PIK3CA及PTEN中之突變)在用實例1與SoC組合鹽酸伊立替康三水合物(在0.9% NaCl中調配並以20mpk Q7D IV投與)加上奧沙利鉑(在5%葡萄糖中調配並以8mpk Q14D i.p.投與)測試時其生長受到顯著限制。數據顯示於表6中。
總言之，上述結果提供支持以下之證據：EZH2抑制劑，包括但不限於實例1或實例38，單獨及/或組合標準醫護(SoC)化學療法用於治療具有SWI/SNF複合物及/或MLL複合物及/或PI3K路徑之組分之突變組合的卵巢癌、胃癌、肺癌或結腸直腸癌。
本發明化合物較佳調配為藉由多種途徑投藥之醫藥組合物。最佳地，此等組合物係用於經口投與。此等醫藥組合物及其製備方法係相關技術中所熟知的。參見，例如，REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(D.Troy等人編，第21版，Lippincott Williams & Wilkins,2005)。
患者之SoC化合物之劑量可按照已核可之給藥進行投與或可根據醫師建議改變。SoC化合物給藥之實例可係例如如下：就卵巢癌而 言，卡鉑加上太平洋紫杉醇之劑量可為每3週175mg/m2 IV太平洋紫杉醇接著每3週175mg/m2 IV卡鉑。就胃癌而言，太平洋紫杉醇加上奧沙利鉑之劑量可為每週50mg/m2 IV太平洋紫杉醇及每週AUC 2mg/mL奧沙利鉑。就肺癌而言，吉西他濱加上順鉑之劑量可為每3週125mg/m2 IV吉西他濱加上每3週75mg/m2 IV順鉑。就結腸直腸癌而言，伊立替康加上奧沙利鉑之劑量可為每週125mg/m2 IV或每3週350mg/m2 IV伊立替康及每2週85mg/m2 IV奧沙利鉑。(SoC治療劑量之參考亦可在http：//www.cancertherapyadvisor.com/gastrointestinal-cancers/gastric-cancer-treatment-regimens/article/218159/中找到)。
本發明EZH2化合物在寬劑量範圍內普遍有效。例如，每日劑量可落在分一或多劑投與之至多5000mg/天，較佳約100至2000mg/天之日範圍內。然而，應了解：實際所投與之化合物的量將由醫師根據相關情況(包括待治療的病狀、所選投與途徑、投與的實際化合物、個別患者的年齡、體重及反應及患者症狀的嚴重度)來決定。

Claims (47)

  1. 一種下式之化合物： 其中：X為-CH2-或-CH2-CH2-；Y'為-NR4R5、-CH(CH3)-環己基-4-基-N-甲基-N-甲氧基乙基或-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、2-丙氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、吡唑基、甲基吡唑基、三唑基、吡咯啶基、四氫呋喃基氧基或嗎啉基取代；R4為經N-甲基-N-甲氧基乙基胺基、N-甲基-N-環丙基胺基或氮雜環丁-1-基取代之環己-4-基，其中該氮雜環丁-1-基係經甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基或吡唑基取代；R5為甲基或乙基；及R6為甲基或氯；或其醫藥上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物或其鹽，其中X為-CH2-。
  3. 如請求項1之化合物或其鹽，其中X為-CH2-CH2-。
  4. 如請求項1至3中任一項之化合物或其鹽，其中Y'為-CH(CH3)-環己基-4-基-N-甲基-N-甲氧基乙基或-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、2-丙氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、吡唑基、甲基吡唑基、三唑基、吡咯啶基、四氫呋喃基氧基或嗎啉基取代。
  5. 如請求項1至3中任一項之化合物或其鹽，其中Y'為-CH(CH3)-環己-4-基-氮雜環丁-1-基，其中該氮雜環丁-1-基係視情況經甲氧基、2-丙氧基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基、環丙基氧基、環丙基甲氧基、吡唑基、甲基吡唑基、三唑基、吡咯啶基、四氫呋喃基氧基或嗎啉基取代。
  6. 如請求項1至3中任一項之化合物或其鹽，其中R6為甲基。
  7. 如請求項1至3中任一項之化合物或其鹽，其中Y'為-NR4R5。
  8. 如請求項1之化合物或其鹽，其為 或其醫藥上可接受之鹽。
  9. 如請求項8之化合物或其鹽，其為5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{(1R)-1-[4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮或其醫藥上可接受之鹽。
  10. 如請求項9之化合物或其鹽，其為5-[(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基]-2-{(1R)-1-[反-4-(3-甲氧基氮雜環丁-1-基)環己基]乙基}-3-甲基-5,6,7,8-四氫-4H-噻吩并[3,2-c]氮呯-4-酮或其醫藥上可接受之鹽。
  11. 如請求項1至3及8至10中任一項之化合物或其鹽，其係用於治療中。
  12. 如請求項1至3及8至10中任一項之化合物或其鹽，其係用於治療癌症。
  13. 如請求項12之化合物或其鹽，其中該癌症係選自由淋巴瘤、橫紋肌樣瘤、缺少或缺乏SWI/SNF複合物、MLL複合物及組成性活性PI3K路徑之一或多種組分之腫瘤、肉瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、胃腸道癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌組成之群。
  14. 如請求項13之化合物或其鹽，其中該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤或濾泡淋巴瘤。
  15. 如請求項14之化合物或其鹽，其中該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
  16. 如請求項14之化合物或其鹽，其中該癌症為缺少SNF5之橫紋肌樣瘤。
  17. 如請求項14之化合物或其鹽，其中該癌症為胃癌。
  18. 如請求項14之化合物或其鹽，其中該癌症為卵巢癌。
  19. 如請求項14之化合物或其鹽，其中該癌症為多發性骨髓瘤。
  20. 如請求項1至3及8至10中任一項之化合物或其鹽，其係與卡鉑(carboplatin)及太平洋紫杉醇(paclitaxel)同時、分開或連續組合用於治療卵巢癌。
  21. 如請求項1至3及8至10中任一項之化合物或其鹽，其係與奧沙利鉑(oxaliplatin)及太平洋紫杉醇同時、分開或連續組合用於治療胃癌。
  22. 如請求項1至3及8至10中任一項之化合物或其鹽，其係與吉西他濱(gemcitabine)及順鉑(cisplatin)同時、分開或連續組合用於治療肺癌。
  23. 如請求項1至3及8至10中任一項之化合物或其鹽，其係與伊立替康(irinotecan)及奧沙利鉑(oxaliplatin)同時、分開或連續組合用於治療結腸直腸癌。
  24. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及一或多種醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  25. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽於製造用於治療患者之癌症之藥物之用途，其中該癌症係選自由淋巴瘤、橫紋肌樣瘤、缺少或缺乏SWI/SNF複合物、MLL複合物及組成性活性PI3K路徑之一或多種組分之腫瘤、肉瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、胃腸道癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌組成之群。
  26. 如請求項25之用途，其中該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤及濾泡淋巴瘤。
  27. 如請求項25或26之用途，其中該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
  28. 如請求項25之用途，其中該癌症為缺少SNF5之橫紋肌樣瘤。
  29. 如請求項25之用途，其中該癌症為胃癌。
  30. 如請求項25之用途，其中該癌症為卵巢癌。
  31. 如請求項25之用途，其中該癌症為多發性骨髓瘤。
  32. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽於製造用於治療患者之卵巢癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：卡鉑及太平洋紫杉醇。
  33. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽於製造用於治療患者之胃癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：奧沙利鉑及太平洋紫杉醇。
  34. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽於製造用於治療患者之肺癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：吉西他濱及順鉑。
  35. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽於製造用於治療患者之結腸直腸癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組 合下列同時、分開或連續使用：伊立替康及奧沙利鉑。
  36. 一種組合，其包含如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及卡鉑及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療卵巢癌。
  37. 一種卡鉑於製造用於治療卵巢癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及太平洋紫杉醇。
  38. 一種太平洋紫杉醇於製造用於治療卵巢癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物及卡鉑。
  39. 一種組合，其包含如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及奧沙利鉑及太平洋紫杉醇以供同時、分開或連續用於治療胃癌。
  40. 一種奧沙利鉑於製造用於治療胃癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及太平洋紫杉醇。
  41. 一種太平洋紫杉醇於製造用於治療胃癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及奧沙利鉑。
  42. 一種組合，其包含如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及吉西他濱及順鉑以供同時、分開或連續用於治療肺癌。
  43. 一種吉西他濱於製造用於治療肺癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及順鉑。
  44. 一種順鉑於製造用於治療肺癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及吉西他濱。
  45. 一種組合，其包含如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及伊 立替康及奧沙利鉑以供同時、分開或連續用於治療結腸直腸癌。
  46. 一種伊立替康於製造用於治療結腸直腸癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及奧沙利鉑。
  47. 一種奧沙利鉑於製造用於治療結腸直腸癌之藥物之用途，其中該藥物進一步包含或係組合下列同時、分開或連續使用：如請求項1至10中任一項之化合物或其鹽及伊立替康。
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