ES2753364T3

ES2753364T3 - Formulaciones líquidas estables de virus vaccinia

Info

Publication number: ES2753364T3
Application number: ES15804407T
Authority: ES
Inventors: Mélina Chasle
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2020-04-08
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: RU2704485C2; RU2017121019A; IL252512A0; AU2015357225A1; CN107206063A; MX2017007178A; CA2969034A1; ZA201703534B; RU2017121019A3; IL252512B; MX378901B; EP3226894A1; JP2017537910A; US10517943B2; AU2015357225B2; WO2016087457A1; JP6655618B2; US20170326230A1; DK3226894T3; CN107206063B

Abstract

Formulación líquida que comprende: a) un poxvirus, en particular un virus vaccinia, b) un amortiguador farmacéuticamente aceptable, c) una sal monovalente, d) un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, y e) un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en la que el pH de la formulación está comprendido entre 6.5 y 8.5.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones líquidas estables de virus vaccinia.

Campo técnico de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de formulaciones líquidas estables destinadas al almacenamiento de líquidos de poxvirus, en particular virus vaccinia. Se refiere a formulaciones líquidas que comprenden a) un poxvirus, en particular un virus vaccinia, b) un amortiguador farmacéuticamente aceptable, c) una sal monovalente, d) un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, y e) un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en la que el pH de la formulación está comprendido entre 6.5 y 8.5.

Antecedentes de la invención

Los poxvirus son virus complejos envueltos que presentan un diámetro comprendido entre 200 y 300 nm que se distinguen principalmente por su morfología inusual, su gran genoma de ADN y su sitio de replicación citoplasmático. El genoma de muchos miembros de Ortopoxvirus, incluyendo dos cepas de virus vaccinia (VV): la cepa del virus vaccinia de Copenhagen (GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266 y 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401), la cepa de Wyeth (OSBORNE JD et al. Vacuna. 2007 Dec 17; 25(52):8807-32) y la cepa del virus modificado vaccinia Ankara (Mv A) (ANTOINE et al., 1998, Virol. 244:365-396), han sido mapeados y secuenciados. El VV presenta un genoma de ADN de doble cadena de aproximadamente 192 kb que codifica a aproximadamente 200 proteínas de las cuales aproximadamente 100 están implicadas en el ensamblaje del virus. MVA es una cepa de virus vaccinia altamente atenuado generado por más de 500 pasadas en serie de la cepa del virus vaccinia Ankara en fibroblastos de embriones de pollo (MAYR et al., 1975, Infection 3:6-16). El virus de MVA se depositó en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) con el n° de depósito I-721. La determinación de la secuencia completa del genoma de MVA y la comparación con el genoma de Copenhagen VV permite la identificación precisa de las alteraciones que ocurrieron en el genoma viral y la definición de muchas deleciones (I a VII) y muchas mutaciones portadoras de ORFs fragmentados (marco de lectura abierto) (ANTOINE et al., 1998, Virology 244:365-396).

Se usa el MVA como una vacuna profiláctica contra la viruela y el MVA recombinante actualmente es el objeto de muchos estudios preclínicos y clínicos para la vacunación profiláctica y terapéutica contra muchos tipos de dianas, incluyendo cáncer (especialmente melanoma, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer colorrectal), virales (especialmente hepatitis B o C, VIH), bacterianas (especialmente tuberculosis) y enfermedades parasitarias (especialmente malaria) (ver GOMEZ et al. Current Gene Therapy, 2008, 8:97-120). Los virus oncolíticos de vacunas asimismo están bajo desarrollo preclínico y clínico (ver KIRN et al. Nat Rev Cancer, 2009 Jan, 9(1):64-71).

En ambos casos, se usa un virus vivo de vacunas.

Una vacuna profiláctica o terapéutica de virus vivo vaccinia generalmente no se administra al paciente justo después de la producción y purificación, y por lo tanto requiere almacenarse por días, semanas o incluso meses, sin perder su potencia.

Como todos los virus vivos, el virus vivo vaccinia presenta inestabilidad natural, la que aumenta más por el hecho de que el virus vaccinia es un virus envuelto (es conocido que los virus envueltos son menos estables que los virus no envueltos, ver BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1 -83; y REXROa D et al. Cell Preservation Technology. June 2002, 1(2):91-104), presenta un tamaño grande (tamaño de ladrillo de 200 a 300 nm), un genoma largo y es conocido que es particularmente sensible a daño por UV, ver LYTLE et al. J. Virol.

2005, 79(22):14244). Más aún, la envoltura del virus vaccinia es incluso más compleja que esa de otros virus envueltos. Por lo tanto, la estabilización del virus vaccinia es particularmente desafiante.

Se han realizado intentos de estabilizar el virus vaccinia. En la mayoría de los casos, se ha propuesto una formulación liofilizada (BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1 -83). En efecto, mientras el desempeño de la liofilización puede inducir alguna pérdida del valor viral, una vez liofilizados, la baja temperatura y ausencia de movimiento y la interacción entre los compuestos en el estado liofilizado hacen a los virus liofilizados generalmente más estables que los virus en estado líquido. Por ejemplo, el documento EP 1418942 divulga formulaciones de virus vaccinia para liofilización que comprenden un virus vaccinia sustancialmente puro, un disacárido, un polímero farmacéuticamente aceptable y un amortiguador que no es un amortiguador de fosfato. El documento WO2014/053571 divulga otras formulaciones liofilizadas de MVA que comprenden polivinilpirrolidona (PVP) o derivados de la misma, por lo menos un azúcar (en particular sacarosa), por lo menos dos diferente aminoácidos (en particular glutamato de sodio y L-arginina), por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables (en particular NaCl, Na2HPO4 y KH2PO4), en donde por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato y, opcionalmente un amortiguador farmacéuticamente aceptable (en particular Tris).

Sin embargo, la liofiliación es costosa, requiere de equipo específico y las formulaciones liofilizadas requieren ser reconstituidas antes de la administración. Más aún, la liofilización implica una etapa de congelamiento que puede conducir a un poco de agregación del virus, en particular a valores altos del virus, lo que no es adecuado para administración inyectable. Por lo tanto podría ser muy útil tener disponibles formulaciones de virus vaccinia líquidas estables.

Los intentos previos para estabilizar el virus vaccinia en el estado líquido no han sido muy exitosos, ya que se observaron pérdidas log superiores a 1 log-10 después de menos de 1 hora a 50°C en la mayoría de los casos (ver BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1 -83). El documento WO2005/066333 divulga una formulación líquida de ALVAC que comprende un amortiguador Tris, glutamato sódico, sacarosa, sorbitol, polivinilpirrolidona (PVP), aminoácidos esenciales y no esenciales y urea, que está destinada a la liofilización. No se presenta ningún análisis de estabilidad a largo plazo de la formulación líquida.

Evans et al divulgan formulaciones líquidas estables de adenovirus (virus de ADN no envuelto) reguladas entre pH 6 y pH 8, que comprenden una sal (generalmente NaCl), un azúcar (sacarosa en la mayoría de los casos), un inhibidor de oxidación de radicales libres (especialmente EDTA, etanol o una combinación de EDTA/etanol), un tensioactivo no iónico y sales bivalentes (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75; y patente US n° 7.456.009). Las formulaciones preferidas generalmente asimismo comprenden histidina. Los parámetros identificados como esenciales para la estabilidad incluyen la presencia de un inhibitor de oxidación de radicales libres (en particular EDTA, etanol, una combinación de EDTA/etanol, y/o histidina), y la presencia de un tensioactivo no iónico. La presencia de sales bivalentes asimismo se identifica como importante para aumentar la estabilidad del adenovirus.

La utilidad de los tensioactivos no iónicos para los fines de estabilización asimismo ha sido documentada para el virus del papiloma (ver SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51). El documento US2007/0161085 probó varias formulaciones líquidas para la estabilización del virus de la gripe (virus de ARN envuelto). Las formulaciones más estables incluyeron arginina y gelatina. En este estudio, el EDTA mostró no tener un efecto en la estabilidad del virus de la gripe. Se encontró que una baja cantidad de tensioactivo, además de arginina y gelatina, es beneficiosa. La patente US n° 7.914.979 se refiere a una formulación para la estabilización del virus envuelto de la enfermedad de Newcastle, que comprende un sacárido no reductor tal como sacarosa. Las composiciones preferidas asimismo contienen un aminoácido seleccionado de lisina y arginina. En contraste, se indica que el EDTA presenta un efecto negativo en la estabilidad y está preferentemente ausente en la formulación. En el documento WO2014/029702, se probaron varios tipos de formulaciones para la estabilización de cuatro virus caninos: dos virus no envueltos pequeños y medianos (parvovirus canino y adenovirus canino tipo 2) y dos virus envueltos de la familia de paramixovirus (virus de moquillo canino y virus paragripal canino). Los resultados muestran que los virus envueltos son más difíciles de estabilizar que los virus no envueltos, y que la formulación óptima varía significativamente entre virus, incluso para dos virus envueltos de la misma familia de paramixovirus (virus de moquillo canino y virus paragripal canino). Además, se indica en el ejemplo 1 que mientras la sacarosa -en particular a una concentración de 17-25% -y aminoácidos (tales como arginina y metionina), son estabilizadores eficaces, los captadores de radicales libres (tales como EDTA) no cambian significativamente el perfil de estabilidad, aunque de algún modo puedan contribuir a la estabilidad.

La descripción anterior de la técnica anterior ilustra claramente que el diseño de una formulación líquida estable para un virus particular es una tarea difícil, ya que en la técnica se conocen muchos candidatos estabilizadores y porque su efecto de estabilización varía en gran medida dependiendo del virus específico que debe ser estabilizado. Además, como se explicó anteriormente, debido a su naturaleza envuelta, su gran tamaño y su genoma de ADN, el virus vaccinia es particularmente difícil de estabilizar, especialmente en el estado líquido.

Sumario de la invención

La invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto. Las formas de realización y/o los ejemplos de la descripción siguiente que no están comprendidos en las reivindicaciones adjuntas no se considera que formen parte de la presente invención. En el contexto de la presente invención, se identificaron formulaciones líquidas adecuadas para mantener la estabilidad de virus vaccinia en el estado líquido, a aproximadamente 5°C (es decir 5°C ± 3°C) o más. Los elementos esenciales de esas formulaciones son la presencia de un amortiguador farmacéuticamente aceptable, una sal monovalente, un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, un agente quelante farmacéuticamente aceptable; y un pH entre 6.5 y 8.5. La presencia adicional de un alcohol de C2-C3 mejora además la estabilidad de las formulaciones líquidas.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere así a una formulación líquida que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en:

a) un poxvirus, en particular un virus vaccinia,

b) un amortiguador farmacéuticamente aceptable,

c) una sal monovalente,

d) un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, y

e) un agente quelante farmacéuticamente aceptable,

en la que el pH de la formulación está comprendido entre 6.5 y 8.5.

En el contexto de la presente memoria se descubre asimismo sorprendentemente que la presencia de un agente quelante tal como EDTA protege al virus vaccinia contra daño por UV. La presente invención asimismo se refiere así a la utilización de un agente quelante para estabilizar un poxvirus, en particular un virus vaccinia contra daño por UV.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Efecto beneficioso de la presencia de una sal monovalente. Pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 después de 7, 14 o 28 días a 37°C en una formulación que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, pH 8.0, con NaCl 0 mM o 50 mM. El virus infeccioso se midió en unidades formadoras de partículas (PFU)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(PFU /ml).

Figura 2. Efecto beneficioso de la presencia de EDTA o EDTA/EtOH. Las pérdidas infecciosas de MVA-HCV en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; en una formulación de control de DS2 que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, pH 7.5; o en formulaciones que contienen Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, pH 7.5, y varias concentraciones de EDTA (50, 250, 500 y 1000 |jM) y opcionalmente EtOH 1% v/v después de 7, 14 o 28 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 3. Efecto beneficioso de la presencia de EtOH o EDTA/EtOH. Pérdidas infecciosas de MVA-HCV en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; en una formulación de DS2 de control que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, pH 7.5; o en formulaciones que contienen Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, pH 7.5, y varias concentraciones de EtOH (0.5; 1; 2 o 4% v/v) y opcionalmente EDTA (50 o 1000 j M) después de 7, 14 o 28 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 4. Efecto beneficioso de la presencia de EDTA/EtOH. Pérdidas infecciosas de MVA-HCV en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; en una formulación de DS2 de control que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 2.5 mM, NaCl 75 mM, pH 7.5; o en formulaciones que contienen Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 2.5 mM, NaCl 75 mM, pH 7.5, y varias concentraciones de EDTA (50, 150, o 250 j M) y EtOH (0.5; 1.5; o 2.5 % v/v) (A) después de 7, 14 o 28 días a 37°C; (B) después de 28 días, o 2, 3 o 6 meses a 25°C; o (C) después de 35 días, o 3, 6, 12, 18, o 24 meses a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (lG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml). (D) Curvas de lo deseado para las concentraciones de EDTA (j M) y EtOH (%) sobre la base del análisis combinado de pérdidas infecciosas después de 7 días a 37°C, pérdidas infecciosas después de 28 días a 37°C, y pérdidas infecciosas después de 24 meses a 5°C. Se presentan las curvas que representan los valores de las concentraciones de EDTA y EtOH para los que se obtiene un valor particular de lo deseado. Se prefieren el EDTA y EtOH que dan como resultado mayores valores de lo deseado.

Figura 5. Efecto beneficioso de bajas concentraciones de glutamato de Na. Pérdidas infecciosas de MVA-HCV en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; en una formulación de DS2 de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 0 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; o en formulaciones que contienen Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 0 a 10 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 j M, y EtOH 0.5 % v/v, pH 7.5 (A) después de 7, 14, o 28 días a 37°C; (B) después de 28 días, o 3, 6 o 12 meses a 25°C; (C) después de 2, 3, 6, 12, 18, 24 o 30 meses a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 6. Efecto beneficioso de sacarosa. Pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 en formulaciones que contienen Tris-HCl 10 mM, glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0, y cantidades variables de sacarosa (1.25; 2.5; 5, 7.5 y 10% (p/v)) después de 7 o 14 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en unidades formadoras de partículas (PFU)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(PFU/ml).

Figura 7. Sin efecto beneficioso e incluso efecto dañino del polisorbato. Pérdidas Infecciosas (A) y (B) de MVA-HPV en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; o en formulaciones que contienen Tris-HCl 5, 10 o 20 mM, sacarosa 5% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 50 o 75 mM, pH 7.5, y varias concentraciones de polisorbato 80 (0.005; 0.02, o 1% v/v) o polisorbato 40 (1% v/v) (A) después de 3, 7, 28 o 60 días a 25°C; o (B) después de 1, 2, 3, 6, 12, 18, o 24 meses a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log (IG/ml). (Figura 7C) Pérdidas infecciosas de la cepa Wyeth de virus vaccinia (VV) producida en una estirpe celular humana continua y purificada por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C, en una formulación de control que contiene Tris-HCl 30 mM, sacarosa al 10% (p/v), o en una formulación que contiene además polisorbato 80 a 150 pg/ml.

Figura 8. Sin efecto beneficioso de MgCl2 y un efecto más bien dañino a alta concentración. (A) Pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 en formulaciones que contienen Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5%(p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0, y cantidades variables de MgCh (0M; 0.5M; o 1M) después de 14 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en unidades formadoras de partículas (PFU)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log (PFU/ml). (B) Pérdidas infecciosas de la cepa de Wyeth de virus vaccinia (VV) producida en una estirpe celular humana continua y purificada por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa después de 7 o 14 días a 37°C, en una formulación de control que contiene Tris-HCl 30 mM, sacarosa al 10% (p/v), o en una formulación que contiene además MgCh 1000 mM.

Figura 9. Sin efecto beneficioso y un efecto más bien dañino de arginina. (A) Pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 en formulaciones que contienen Tris-HCl 10 mM, sacarosa de 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0, y cantidades variables de arginina (0, 30, 50, 100 o 200 mM) después de 3, 7, 14, o 28 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en unidades formadoras de partículas (PFU)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(PFU/ml). (B) Pérdidas infecciosas de la cepa Wyeth de virus vaccinia (VV) producida en una estirpe celular humana continua y purificada por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C, en una formulación de control que contiene Tris-HCl 30 mM, sacarosa al 10% (p/v), o en una formulación que contiene además arginina 50 mM.

Figura 10. Sin efecto beneficioso de una mezcla de aminoácidos. Pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 en formulaciones que contienen Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0, y cantidades variables de una mezcla de aminoácidos (0 o 1% (p/v)) después de 3, 7, 14, o 28 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en unidades formadoras de partículas (PFU)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(PFU/ml).

Figura 11. Sin efecto beneficioso de histidina. Pérdidas infecciosas de MVA-HPV en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; o en una formulación que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, e histidina 10 mM, pH 7.5 (A) después de 3, 7, 14, 28 o 60 días a 25°C; o (B) después de 1, 2, 3, 6, 12, 18, o 24 meses a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 12. Efecto de pH. Pérdidas infecciosas de MVA-HCV en formulaciones que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 pM y EtOH al 0.5% (v/v), con valores de pH variable (6.0; 7.0; 7.5; 8.0 y 9.0) (A) después de 7, 14 o 28 días a 37°C, o (B) después de 28 días, o 3, 6 o 12 meses a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log (IG/ml).

Figura 13. Efecto de la concentración del virus. Pérdidas infecciosas de MVA-HCV a varias concentraciones iniciales (1.0 108 PFU/ml; 5.0 107 PFU/ml; 1.0 107 PFU/ml; o 5.0 106 PFU/ml) en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5; o en una formulación (Inv) que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 2.5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 pM, EtOH al 0.5 % v/v, pH 7.5 (A) después de 7, 14, o 28 días a 37°C; (B) después de 28 días, o 3 o 7 meses a 25°C; o (C) después de 2, 6, 12 o 18 meses a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log (IG/ml).

Figura 14. Validación de la formulación optimizada según la invención en 3 virus de MVA distintos que expresan distintos genes heterólogos. Pérdidas infecciosas de MVA-HCV, MVA-MUC1 y MVA-HPV en una formulación de DS de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5 para MVA-HpV y pH 8.0 para MVA-HCV y MVA-MUC1; o en una formulación que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 pM, EtOH al 0.5 % v/v, pH 7.5 (A) después de 7, 14, o 28 días a 37°C; (B) después de 28 días, o 2, 3 o 6 meses a 25°C; o (C) después de 2, 3, 6, 12, 18, 24 o 30 meses a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 15. Validación de una formulación optimizada según la invención en varias cepas de virus vaccinia, producidas/purificadas por varios métodos. (A) Pérdidas infecciosas de MVA-HCV producidas en células embrionarias de pollo (MVA-HCV/CEC), o en células de una estirpe celular aviar inmortalizada (MVA-HCV/estirpe celular aviar); de MVA-FCU1 producida en células embrionarias de pollo (MVA-FCU1/CEC) y Copenhagen-FCU1 producido en células embrionarias de pollo (Copenhagen-FCU1/CEC); en sustancia de fármaco de control (Tris-HCl 10 mM, glutamato de Na 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), NaCI 50 mM, pH 7.5) o formulado en una formulación optimizada según la invención (Tris-HCl 20 mM, glutamato de Na 5 mM, sacarosa al 10% (p/v), NaCl 75 mM, EDTA 150 pM, EtOH al 0.5%, pH 7.5) después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C. (B) Pérdidas infecciosas de la cepa Wyeth de virus vaccinia (VV) producida en una estirpe celular continua humana y purificada por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa en sustancia de fármaco de control (Tris-HCl 30 mM, sacarosa al 10% (p/v), pH 7.5) o formulada en dos formulaciones optimizadas según la invención (Tris-HCl 30 mM, sacarosa al 10% (p/v), NaCl 200 o 500 mM, EDTA 150 pM, EtOH al 0.5%, pH 7.5) después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C.

Figura 16. Sustitución de estabilizadores inicialmente probados por otros compuestos de la misma familia o de otra familia. (A) Pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 en varias formulaciones definidas en la tabla 19 después de 7, 14, 21 o 28 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml). (B) y (C) El análisis estadístico del impacto de reemplazar un equivalente de candidato recién probado por el estabilizador probado inicialmente u otro equivalente de candidato recién probado después de 14 (B) o 28 (C) días a 37°C, usando software NemrodW®. Cada línea representa un cambio de una formulación que contiene el equivalente del candidato Y a una formulación que contiene el estabilizador probado inicialmente X u otro equivalente de candidato recién probado (Y => X), y barra y valor asociados. Cuando el valor es positivo, significa que el estabilizador probado inicialmente o el otro candidato recién probado X estabiliza mejor el MVA-MUC1 que el equivalente de candidato Y. En contraste, un valor negativo significa que el equivalente de candidato Y estabiliza mejor el MVA-MUC1 que el estabilizador probado inicialmente u otro equivalente de candidato X. A mayor valor absoluto, mayor es el efecto de reemplazar Y por X. En particular, se considera que el reemplazo presenta un impacto significativo en la estabilidad de m VA-MUC1 cuando la barra excede la línea punteada. (D) Pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 en varias formulaciones definidas en la tabla 19 después de 28, 90 y 180 días a 5°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 17. Protección de virus de MVA por la formulación optimizada contra daño por UV. (A). Pérdidas infecciosas de MVA-HCV en una formulación de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.5, o en un formulación optimizada que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, EDtA 150 pM y EtOH al 0.5% (v/v), pH 7.5 después de 1, 2, 3, 7, 14, 21 o 28 días a 25°C en la ausencia de luz, bajo luz PSM (simulación de 320-400 nm luz UV según ISO 10977) o bajo luz ICH (ICH Q1B prueba de fotoestabilidad de nuevas sustancias y productos farmacológicos). (B) Pérdidas infecciosas de MVA-HCV en una formulación de control que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, pH 7.5, o en formulaciones que contienen Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, y EDTA 150 pM y/o EtOH al 0.5% (v/v), pH 7.5 después de 2, 3, 7, 9, 14, o 21 días a 25°C en la ausencia de luz o bajo luz iCh (ICH Q1B prueba de fotoestabilidad de nuevas sustancias y productos farmacológicos). Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 18. Efecto de la estabilización de varias formulaciones con concentraciones variables de ingredientes. Las pérdidas infecciosas de MVA-MUC1 en muchas formulaciones con concentraciones variables de ingredientes (ver la tabla 20) después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Figura 19. Efecto de estabilización en virus de pseudoviruela de ganado. Pérdidas infecciosas de pseudoviruela de ganado en la composición de control que contiene Tris-HCl 10 mM, sacarosa al 5% (p/v), glutamato de Na 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0,) o en una formulación según la invención que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), glutamato de Na 5 mM, NaCl 75 mM, EDTA 150 pM, EtOH al 0.5 % v/v, pH 7.5 después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C. Los virus infecciosos se midieron en genomas infecciosos (IG)/ml, y las pérdidas infecciosas se expresan en log(IG/ml).

Descripción detallada de la invención

Formulación líquida estable

Como se expone anteriormente, en el contexto de la presente memoria se identificaron formulaciones líquidas adecuadas para mantener la de un poxvirus, en particular un virus vaccinia en el estado líquido, a aproximadamente 5°C o más. Esas formulaciones deben comprender un amortiguador farmacéuticamente aceptable, una sal monovalente, un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, un agente quelante farmacéuticamente aceptable; y un pH entre 6.5 y 8.5.

La presente invención se refiere así a una formulación líquida que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en:

a) un poxvirus, en particular un virus vaccinia,

b) un amortiguador farmacéuticamente aceptable,

c) una sal monovalente,

d) un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, y

e) un agente quelante farmacéuticamente aceptable,

en la que el pH de la formulación está comprendido entre 6.5 y 8.5.

La formulación líquida según la invención es una formulación acuosa.

"Que comprende" y “comprende(n)” pretenden indicar que los materiales, productos, formulaciones, composiciones y métodos incluyen los componentes o etapas de referencia, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente en" o “consiste(n) esencialmente en”, cuando se usa para definir productos, formulaciones, composiciones y métodos, debe indicar que excluye otros componentes o etapas de cualquier significación esencial. Así, por ejemplo, una formulación que consiste esencialmente en los componentes mencionados podría no excluir contaminantes traza y portadores farmacéuticamente aceptables. "Que consiste en" o “consiste(n) en” indicará que excluye más de los elementos traza de otros componentes o etapas.

Estabilidad

Las formulaciones según la invención son líquidas, presentando la ventaja de que no existe necesidad de procedimientos de liofilización costosos y laboriosos, y que se pueden administrar directamente, sin la necesidad de una reconstitución previa.

La estabilización de los materiales biológicos tales como virus en particular en el estado líquido, no es directa debido a la capacidad de los virus de interactuar con todos los componentes de la formulación, así como con el recipiente, lo que aumenta los riesgos de pérdida de valor viral.

Sin embargo, la presente invención proporciona formulaciones de virus que son estables en el estado líquido y permiten superar estas dificultades. En particular:

• la pérdida de poxvirus infeccioso, en particular virus vaccinia, el valor en formulaciones líquidas según la invención es preferentemente inferior a 1 logio de virus infecciosos durante el almacenamiento durante por lo menos 1 semana, preferentemente por lo menos 2 semanas, por lo menos 3 semanas, o incluso por lo menos 4 semanas a 37°C,

• la pérdida de poxvirus infeccioso, en particular virus vaccinia, el valor en formulaciones líquidas según la invención es preferentemente inferior a 1 logio de virus infecciosos durante el almacenamiento durante por lo menos 4 semanas, preferentemente por lo menos 3 meses, o por lo menos 6 meses a 25°C, y/o

• la pérdida de poxvirus infecciosos, en particular virus vaccinia, el valor en formulaciones líquidas según la invención es preferentemente inferior a 0.3 logio de virus infecciosos (que corresponde a una pérdida de infectividad de 50%) durante el almacenamiento durante por lo menos 12 meses, preferentemente por lo menos 18 meses, por lo menos 24 meses, por lo menos 30 meses, o incluso por lo menos 36 meses a aproximadamente 5°C (es decir 5°C ± 3 °C).

Los valores de los virus infecciosos de vacunas en el día 0 y en cualquier fecha posterior pueden determinarse ya sea midiendo el número de genomas infecciosos (IG) por ml (IG/ml) o usando una valoración de placa en células BHK-21 (poxvirus infeccioso, en particular virus vaccinia, el valor es una continuación expresada en las unidades formadoras de placa (PFU) por ml (PFU/ml). Puede preferirse la medición del número de genomas infecciosos por ml (IG/ml), ya que este método es más rápido y más preciso. Los protocolos detallados para medir el número de genomas infecciosos (IG) por ml (IG/ml) o por valoración de placa en células BKH-21 se divulga en los ejemplos.

Poxvirus

Las formulaciones según la invención comprenden un poxvirus.

Dicho poxvirus puede seleccionarse de entre las siguientes familias: Ortopoxvirus (por ejemplo virus vaccinia, virus de viruela de ganado), Parapoxvirus (por ejemplo virus de estomatitis papular Bovina, virus de ectima contagioso, virus de pseudoviruela de ganado), Suipoxvirus (por ejemplo virus de viruela de cerdos), Yatapoxvirus (por ejemplo virus de la enfermedad de tipo Yaba), Avipoxvirus (por ejemplo virus de viruela aviar y virus de viruela del canario) y Leporipoxvirux (virus de Mixoma). Dichos poxvirus pueden seleccionarse particularmente de entre Orthopoxviruses (por ejemplo virus vaccinia, virus de viruela del ganado) y Parapoxviruses (por ejemplo virus de estomatitis papular bovina, virus de ectima contagioso, virus de pseudoviruela del ganado). Los poxviruses especialmente preferidos son los virus vaccinia y virus de pseudoviruela del ganado.

En una forma de realización preferida, dicho poxvirus es un Ortopoxvirus, y más preferentemente un virus vaccinia (VV).

En el contexto de la presente invención se observa que la estabilidad del virus vaccinia en el estado líquido aumenta con la concentración de partículas de virus vaccinia en la formulación (ver el ejemplo 4). Como resultado, el poxvirus (en particular el virus vaccinia y especialmente el virus vaccinia de MVA, Wyeth o Copenhagen) está presente preferentemente en formulaciones líquidas según la invención a un valor de por lo menos 107 PFU/ml, preferentemente por lo menos 2.107 PFU/ml, por lo menos 3.107 PFU/ml, por lo menos 4.107 PFU/ml, más preferentemente por lo menos 5.107 PFU/ml, o incluso por lo menos 108 PFU/ml. Ya que la estabilidad del poxvirus (en particular virus vaccinia) aumenta con la concentración de las partículas del poxvirus (en particular el virus vaccinia) en la formulación, no existe una restricción particular relacionada con la concentración máxima de las partículas del poxvirus (en particular el virus vaccinia) en la formulación. Sin embargo, por razones prácticas, el poxvirus (en particular el virus vaccinia) generalmente estará comprendido en las formulaciones líquidas según la invención a un valor de a lo sumo 1012 PFU/ml, a lo sumo 1011 PFU/ml, o incluso a lo sumo 1010 PFU/ml. En particular, el poxvirus (en particular el virus vaccinia) puede estar comprendido en las formulaciones líquidas según la invención a un valor de 107 PFU/ml a 1012 PFU/ml, 107 PFU/ml a 1011 PFU/ml, 107 PFU/ml a 1010 PFU/ml, 107 PFU/ml a 5.109 PFU/ml, 107 PFU/ml a 109 PFU/ml, 107 PFU/ml a 5.108 PFU/ml, 107 PFU/ml a 108 PFU/ml, 2.107 PFU/ml a 1012 PFU/ml, 2.107 PFU/ml a 1011 PFU/ml, 2.107 PFU/ml a 1010 PFU/ml, 2.107 PFU/ml a 5.109 PFU/ml, 2.107 PFU/ml a 109 PFU/ml, 2.107 PFU/ml a 5.108 PFU/ml, 2.107 PFU/ml a 108 PFU/ml, 3.107 PFU/ml a 1012 PFU/ml, 3.107 PFU/ml a 1011 PFU/ml, 3.107 PFU/ml a 1010 PFU/ml, 3.107 PFU/ml a 5.109 PFU/ml, 3.107 PFU/ml a 109 PFU/ml, 3.107 PFU/ml a 5.108 PFU/ml, 3.107 PFU/ml a 108 PFU/ml, 4.107 PFU/ml a 1012 PFU/ml, 4.107 PFU/ml a 1011 PFU/ml, 4.107 PFU/ml a 1010 PFU/ml, 4.107 PFU/ml a 5.109 PFU/ml, 4.107 PFU/ml a 109 PFU/ml, 4.107 PFU/ml a 5.108 PFU/ml, 4.107 PFU/ml a 108 PFU/ml, 5.107 PFU/ml a 1012 PFU/ml, 5.107 PFU/ml a 1011 PFU/ml, 5.107 PFU/ml a 1010 PFU/ml, en particular 5.107 PFU/ml a 5.109 PFU/ml, 5.107 PFU/ml a 109 PFU/ml, 5.107 PFU/ml a 5.108 PFU/ml, 5.107 PFU/ml a 108 PFU/ml, 108 PFU/ml a 1012 PFU/ml, 108 PFU/ml a 1011 PFU/ml, 108 PFU/ml a 1010 PFU/ml, 108 PFU/ml a 5.109 PFU/ml, 108 PFU/ml a 109 PFU/ml, 108 PFU/ml a 5.108 PFU/ml.

Los poxvirus preferentemente se purifican o semipurifican para reducir las proteínas de las células hospedadoras y el ADN de las células hospedadoras para que sean bien tolerados después de administración a humanos. Más aún, un número de impurezas puede estar en el origen de la reacción de alergia humana después de la inyección. Esos procedimientos de semipurificación o purificación son convencionales en la técnica y pueden variar como una función de varios parámetros tales como el propio virus, la célula productora, el medio de cultivo usado, las enzimas y otros componentes introducidos durante las etapas de producción y purificación (por ejemplo nucleasas, proteasas, sales, etc). Por ejemplo, las impurezas tales como ovalbúmina de huevo y antibióticos están presentes típicamente cuando el virus se produce en células primarias como fibroblasto embrionario de pollo (CEF) mientras que los ácidos nucleicos y las proteínas de la célula hospedadora son contaminantes normales de la preparación del virus producido en estirpes celulares inmortalizadas tales como estirpes celulares de pato y estirpes celulares humanas. Para una guía general, se recomienda que el ADN de la célula hospedadora se reduzca a menos que 10 ng/dosis (ver la especificación normativa) y que la proteína de la célula hospedadora sea inferior a 150|jg/dosis. Los ejemplos representativos de técnicas adecuadas para lograr la preparación semipurificada o purificada del virus incluye sin limitación filtración de flujo tangencial, digestión enzimática, cromatografía, filtración frontal y similares. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, el poxvirus (en particular el virus vaccinia) está por lo menos semipurificado, comprendiendo 5 a 500|jg/dosis de proteínas de célula hospedadora y menos que 10ng/dosis de ADN de célula hospedadora.

En el contexto de la presente invención se descubre que las formulaciones líquidas según la invención son capaces de estabilizar tres cepas distintas del virus vaccinia: MVA, Wyeth, y Copenhagen (ver el ejemplo 4). Varias cepas de virus vaccinia pueden entonces estabilizarse usando las formulaciones líquidas según la invención. En particular, dichos virus vaccinia pueden seleccionarse de entre cepas modificadas de virus vaccinia de Elstree, Western Reserve, Wyeth, NYVAC, NYCBOH, Paris, Copenhagen, y Ankara (MVA). Dichos virus vaccinia pueden preferentemente seleccionarse de entre las cepas modificadas de los virus vaccinia de Ankara (MVA), Wyeth, y Copenhagen. En una forma de realización preferida, los virus vaccinia presentes en la formulación es un virus de MVA, y en particular MVA 575 (ECACC V00120707) o MVA-BN (ECACC V00083008). En otra forma de realización preferida, el virus vaccinia presente en la formulación es un virus vaccinia Wyeth. En otra forma de realización preferida, el virus vaccinia presente en la formulación es un virus vaccinia Copenhagen.

El poxvirus, en particular el virus vaccinia, comprendido en las formulaciones según la invención puede ser un poxvirus de tipo salvaje, uno atenuado, o un poxvirus recombinante, en particular virus vaccinia. El término "poxvirus recombinante" se refiere a un poxvirus que comprende por lo menos una secuencia exógena insertada en su genoma. Como se usa en la presente memoria, una “secuencia exógena” se refiere a un ácido nucleico que no está presente naturalmente en el poxvirus parental.

Cuando el poxvirus (en particular el virus vaccinia) comprendido en las formulaciones según la invención es recombinante, la secuencia(s) exógena puede ser cualquier secuencia exógena de interés.

En una primera forma de realización preferida, el poxvirus recombinante (en particular el virus vaccinia) comprende una secuencia exógena que codifica una molécula presenta una función citotóxica directa o indirectamente. Por "directa o indirecamente" citotóxica, se entiende que la molécula codificada por la secuencia exógena puede ser tóxica por sí misma (por ejemplo toxinas; citocinas o enzimas tales como ribonucleasa, desoxirribonucleasa) o puede metabolizarse para formar un producto tóxico, o puede actuar en otra cosa para formar un producto tóxico. En una forma de realización preferida, la molécula codificada por la secuencia exógena puede ser una toxina tal como ricina o exotoxina A de Pseudomonas. La secuencia de ADNc de ricina se divulga en LAMB et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148:265-270). En otra forma de realización preferida, la molécula codificada por la secuencia exógena puede ser una citocina. Esa citocina puede seleccionarse especialmente de entre factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina-2 (IL-2), interferón-gama (IFNy), o factor estimulante de colonia de granulocitosmacrófagos (GMCSF). En otra forma de realización preferida, la secuencia exógena que codifica una molécula presenta directa o indirectamente una función citotóxica puede ser un gen suicida. Un gen suicida codifica una proteína capaz de convertir un profármaco relativamente no tóxico en un fármaco tóxico. Por ejemplo, la enzima citosina desaminasa convierte 5-fluorocitosina (5-FC) a 5-fluorouracilo (5-FU) (MULLEN et al., 1922, PNAS 89:33); la enzima de herpes simplex timidina cinasa sensibiliza las células al tratamiento con el agente antiviral ganciclovir (GCV) o aciclovir (MOOLTEN, 1986, Cancer Res. 46:5276; EZZEDINE et al., 1991, New Biol 3:608). Puede usarse la citosina desaminasa de cualquier organismo, por ejemplo E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Así, en la forma de realización preferida de la invención, el gen suicida codifica una proteína presenta una actividad de citosina desaminasa, y más preferentemente la proteína FCU 1 o la proteína f Cu 1-8 revelada en las solicitudes de patente WO99/54481, WO2005/007857, WO2009/065546 y WO2009/065547, que se incorporan a la presente memoria como referencia. En este contexto, los virus recombinantes de vacunas preferidos comprendidos en las formulaciones líquidas según la invención son:

- MVA-FCU 1 (ver WO99/54481), asimismo denominado TG4023;

- MVA-FCU 1 -8 (ver WO2005/007857); y

- VV-FCU 1 en donde dicho virus vaccinia (VV) comprende más particularmente un gen defectuoso I4L y/o F4L, y un gen defectuoso J2R (ver los documentos WO2009/065546 y WO2009/065547).

En una segunda forma de realización preferida, el virus recombinante de vacunas comprende un gen exógeno que codifica una ribozima capaz de disociar el ARN o ADN diana. El ARN o ADN diana a ser disociado puede ser ARN o ADN que es esencial para la función de la célula y la disociación de la misma da como resultado tanto la muerte celular o que el ARN o ADN sea disociado puede ser ARN o ADN que codifica una proteína indeseable, por ejemplo un producto oncogénico, y la disociación de este ARN o ADN puede prevenir que la célula devenga cancerosa.

En una tercera forma de realización preferida, el poxvirus recombinante (en particular el virus vaccinia) comprende una secuencia exógena que codifica un ARN antisentido. Por "ARN antisentido" se entiende una molécula de ARN que se hibrida a, e interfiere con, la expresión de una molécula de ARNm que codifica una proteína o a otra molécula de ARN dentro de la célula tales como pre-ARNm o ARNt o ARNr, o se hibrida a, e interfiere con, la expresión de un gen.

En la cuarta forma de realización preferida, el poxvirus recombinante (en particular el virus vaccinia) comprende una secuencia exógena que reemplaza la función de un gen defectuoso en la célula diana. Existen varios miles de enfermedades genéticas hereditarias en los mamíferos, incluyendo humanos, que son provocadas por genes defectuosos. Los ejemplos de esas enfermedades genéticas incluyen fibrosis quística, en la que es conocido que existe una mutación en el gen CFTR; distrofia muscular de Duchenne, donde existe una mutación conocida en el gen de distrofina; enfermedad de anemia falciforme, donde es conocido que existe una mutación en el gen de HbA. Muchos tipos de cáncer son provocados por genes defectuosos, especialmente protooncogenes, y genes supresores de tumor que han sufrido una mutación. Los ejemplos de protooncogenes son ras, src, bcl y así sucesivamente; ejemplos de genes supresores de tumor son p53 y Rb.

En una quinta forma de realización preferida, el poxvirus recombinante (en particular virus vaccinia) comprende una secuencia exógena que codifica un antígeno asociado a tumor (TAA). El TAA se refiere a una molécula que se detecta a una mayor frecuencia o densidad en las células tumorales que en las células no tumorales del mismo tipo de tejido. Los ejemplos de TAA incluyen pero no se limitan a CEA, MART1, MAGE1, MAGE3, G P -100, MUC1 (ver los documentos WO92/07000, WO95/09241 y ROCHLITZ et al. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9 incorporado en la presente memoria como referencia), MUC2, oncogen ras mutado en punta, p53 normal o mutado en punto, p53 sobreexpresado, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, tirosinasa, TRP1, TRP2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER- 2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, superviviente y LRP. Según una forma de realización más preferida el TAA es MUC1.

En una sexta forma de realización preferida, el poxvirus recombinante (en particular el virus vaccinia) comprende un gen exógeno que codifica un antígeno. Como se usa en la presente memoria, "antígeno" se refiere a un ligando que se puede unir por un anticuerpo; un antígeno no requiere ser inmunógeno. Preferentemente el antígeno se deriva de:

• un virus

por ejemplo, el antígeno puede derivarse de:

o VIH-1, (tal como gp 120 o gp 160),

o cualquier virus de Inmunodeficiencia felina,

o virus de herpes humano o animal, tal como gD o derivados del mismo o proteína inmediata temprana tal como ICP27 de HSV1 o HSV2,

o citomegalovirus (tal como gB o derivados de los mismos),

o Virus de varicella zoster (tal como gpl, Il o III),

o un virus de la hepatitis tal como virus de hepatitis B (HBV) por ejemplo antígeno de superficie de la hepatitis B o un derivado del mismo, virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis C (HCV; ver el documento WO2004/111082; preferentemente proteína de HCV no estructural del genotipo 1 b cepa ja), y virus de la hepatitis E (HEV),

o Virus sincital respiratorio,

o Virus del papiloma humano virus (HPV; ver los documentos WO90/10459, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885 y WO2007/121894; proteína E6 y E7 de la cepa HPV16, se prefieren; ver asimismo LIU et al., 2004 Oct 5, Proc Natl Acad Sci U S A, 101 Suppl 2:14567-71), o

o Virus de la gripe.

• patógenos bacterianos, tales como Salmonella, Neisseria, Borrelia (por ejemplo OspA o OspB o derivados de los mismos), Clamydia, Bordetella (por ejemplo P.69, PT y FHA), o micobacteria (en particular micobacterium tuberculosis y mycobacterium bovis, ver los documentos WO2014/009438 y WO2014/009433),

• parásitos, tales como plasmodium o toxoplasma.

Según una forma de realización preferida más el antígeno se selecciona de entre antígenos de HCV, HPV, o micobacteria (en particular mycobacterium tuberculosis y mycobacterium bovis), y en particular los mencionados anteriormente. En este contexto, un virus recombinante preferido de vacunas presente en las formulaciones líquidas según la invención es MVA-HCV (ver WO2004/111082) asimismo denominado TG4040 que codifica los antígenos NS3, NS4 y NS5B HCV.

Por supuesto, el poxvirus recombinante (en particular el virus vaccinia) presente en las formulaciones líquidas según la invención puede comprender más de una secuencia exógena y cada secuencia exógena puede codificar más de una molécula.

Por ejemplo, puede ser útil para asociar en un mismo poxvirus recombinante (en particular virus vaccinia):

• una secuencia exógena que codifica por ejemplo un TAA (como se describió anteriormente) o un antígeno (como se describió anteriormente), y

• una secuencia exógena que codifica una citocina (por ejemplo interleucina (IL como por ejemplo IL-2); factor de necrosis tumoral (TNF); interferón (IFN); factor estimulante de colonia (CSF), o factor estimulante de granulocito-macrófago (GMCSF)).

En este contexto, los virus recombinantes preferidos de vacunas presentes en las formulaciones líquidas según la invención son:

- MVA-[MUC1-IL2] (ver los documentos WO92/07000 y WO95/09241) asimismo denominado TG4010 que codifica un MUC1 TAA y la IL-2 humana; y

- MVA-[HPV-IL2] (ver los documentos WO90/10459, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2007/121894) asimismo denominado TG4001 que codifica HPV-16 E6 no oncogénico y polipéptidos E7 y la IL-2 humana.

Otro ejemplo de asociación útil de dos secuencias exógenas en el mismo poxvirus (en particular virus vaccinia) vector es un poxvirus (en particular virus vaccinia) vector que comprende:

• Una secuencia exógena de interés, incluyendo todas las descritas anteriormente (en particular un gen suicida, una citocina, un TAA, o un antígeno patógeno), y

• Una secuencia exógena que codifica un marcador de selección. Ese marcador de selección puede especialmente seleccionarse de enzimas que pueden valorarse fácilmente tales como beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde y luciferasa.

En este contexto, un virus recombinante preferido de vacunas presente en las formulaciones líquidas según la invención es un virus vaccinia (preferentemente de la cepa Wyeth) defectuoso para el gen J2R, y que comprende una secuencia exógena que codifica el factor estimulante de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) (ver KIM JH et al., 2006 Sep, Mol Ther., 14(3):361-70 y BREITBACH CJ et al., 2011, Curr Pharm Biotechnol. Vol 12. No 12).

Los métodos para preparar y purificar poxviruses y en particular virus vaccinia se conocen por los expertos en la materia. Por ejemplo, los procedimientos para producir y purificar poxviruses y en particular virus vaccinia se revelan en los documentos WO2007/147528 y WO2010/130753, que se incorporan a la presente memoria como referencia. El virus vaccinia puede especialmente ser amplificado primeramente por:

a) la preparación de un cultivo de células de empaquetamiento;

b) la infección del cultivo de células de empaquetamiento con un virus vaccinia;

c) el cultivo de las células de empaquetamiento infectadas hasta que se produzca la progenie del virus vaccinia, y

d) recolectar los virus vaccinia producidos del sobrenadante de cultivo y/o las células de empaquetamiento.

En la etapa a), las células de empaquetamiento adecuadas dependen del tipo de virus vaccinia a ser amplificados. El MVA se restringe estrictamente al anfitrión y puede amplificarse en células aviares, ya sea células aviares primarias (tales como fibroblastos embrionarios de pollo o CEF) o una estirpe celular aviar inmortalizada, y en particular:

• una estirpe celular aviar inmortalizada de Cairina moschata que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa (TERT) (ver las estirpes celulares T3-17490 según se depositaron en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) bajo el número de acceso 08060502 y la estirpe celular T6-17490 según se depositó en ECACC bajo el número de acceso 08060501 divulgada en el documento WO2007/077256),

• una estirpe celular aviar inmortalizada de Cairina moschata que comprende una secuencia de ácido nucleico E1A y una secuencia de ácido nucleico que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), como se divulga en el documento W02009/004016,

• la estirpe celular DF1 divulgada en la patente US n° 5.879.924, que es una estirpe celular de pollo inmortalizada espontáneamente derivada de huevos de la estirpe East Lansing de 10 días de puestos (ELL O),

• la estirpe celular de pollo Ebx divulgada en el documento W02005/007840, que se deriva de células madre embrionarias por recortes progresivos de los factores de crecimiento y la capa alimentadora; o

• la estirpe cellular DEC 99 (IVANOV et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences), que es una estirpe celular permanente embrionaria de pato.

Para otros virus vaccinia u otras cepas de poxvirus, además de las células primarias aviares (tales como CEF -“fibroblastos embrionarios de pollo” - asimismo denominados CEC o “células embrionarias de pollo”) y estirpes celulares aviares, están disponibles muchas otras estirpes celulares aviares para amplificación, incluyendo células Hela, BHK-21, MRC-5, h EK-293, y Vero. En una forma de realización preferida, se amplifican virus vaccinia distintos de MVA en células Hela.

Las células de empaquetamiento se cultivan preferentemente en un medio libre de productos derivados de animales o humanos, usando un medio definido químicamente sin un producto de origen animal o humano. En particular, mientras pueden estar presentes los factores de crecimiento, se producen preferentemente recombinantemente y no se purifican de material animal. Un medio adecuado libre de animales puede seleccionarse fácilmente por los expertos en la materia dependiendo de las células de empaquetamiento seleccionadas. Esos medios están disponibles comercialmente. En particular, cuando se usan CEF como células de empaquetamiento, pueden cultivarse en medio de cultivo celular VP-SFM (Invitrogen). Los CEF asimismo se cultivan preferentemente durante entre 1 y 5 días, más preferentemente entre 1 y 2 días y incluso más preferentemente 2 días antes de la infección. Los CEF se cultivan además preferentemente a una temperatura comprendida entre 30°C y 37°C. Cuando se usan células de estirpes celulares no aviares inmortalizadas, se cultivan preferentemente durante entre 2 y 7 días antes de la infección. Si se requiere un alto número de células no aviares inmortalizadas, pueden hacerse varios pases de 2 a 7 días para aumentar el número total de células. Las células no aviares inmortalizadas se cultivan preferentemente a una temperatura comprendida entre 36°C y 38°C, más preferentemente a aproximadamente 37°C.

En la etapa b), las células de empaquetamiento se infectan por poxvirus (en particular virus vaccinia) bajo condiciones adecuadas (en particular usando una multiplicidad apropiada de infección (MOI)) para permitir la infección productiva de células de empaquetamiento. En particular, cuando el virus vaccinia es MVA (en particular los divulgados en los documentos WO90/10459, WO92/07000, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2004/111082, WO2007/121894, WO2014/009438 y WO2014/009433) y se amplifica usando CEF, puede sembrarse en el recipiente de cultivo celular que contiene CEF a un MOI que está comprendido preferentemente entre 0.001 y 0.1, más preferentemente entre 0.03 y 0.07 e incluso más preferentemente aproximadamente 0.05. Para otras cepas de virus vaccinia, en particular virus vaccinia oncolíticos tales como cepas Wyeth y Copenhagen (especialmente las divulgadas en los documentos WO2007/030668, WO2008/113078, WO2009/065546, WO2009/065547), pueden sembrarse los virus vaccinia en el recipiente de cultivo de células que contiene las células de empaquetamiento a un MOI que está preferentemente comprendido entre 0.0001 y 0.1, y más preferentemente aproximadamente 0.0001. La etapa de infección asimismo se realiza preferentemente en un medio (que puede ser el mismo o diferente del medio usado para cultivar las células de empaquetamiento) libre de productos derivados de animales o humanos, usando un medio definido químicamente sin algún producto de origen animal o humano. Para el MVA en los CEF, el medio de cultivo usado en la etapa b) es preferentemente un medio basal, especialmente medio de cultivo celular de Eagle de medio basal (Invitrogen).

En la etapa c), las células de empaquetamiento infectadas se cultivan a continuación bajo condiciones apropiadas bien conocidas por los expertos en la materia hasta que se produzca la progenie del poxvirus (en particular virus vaccinia). El cultivo de las células de empaquetamiento infectadas asimismo se desarrolla preferentemente en un medio (que puede ser el mismo o diferente del medio usado para el cultivo de células de empaquetamiento y/o para la etapa de infección) libre de productos derivados de animales o humanos, usando un medio definido químicamente sin algún producto de origen animal o humano. Para el MVA amplificado en CEF, los CEF pueden cultivarse especialmente en medio basal, especialmente medio de cultivo celular de Eagle de medio basal (Invitrogen), a una temperatura entre 33°C y+37°C, durante 1 a 4 días. Para otras cepas de virus vaccinia producidas en una estirpe celular no aviar inmortalizada, la etapa c) puede realizarse especialmente entre 35°C y+38°C durante 1 a 4 días. En la etapa d), el poxvirus (en particular virus vaccinia) producido en la etapa c) se recoge del sobrenadante de cultivo y/o las células de empaquetamiento. Cuando el poxvirus (en particular el virus vaccinia) se recoge de células de empaquetamiento (y opcionalmente asimismo del sobrenadante de cultivo), la etapa d) puede ser precedido por una etapa que permite la interrupción de la membrana de la célula de empaquetamiento. Esta etapa lleva a la liberación de poxvirus (en particular virus vaccinia) de células de empaquetamiento. La interrupción de la membrana de las células de empaquetamiento puede inducirse por varias técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, incluyendo pero sin limitación: congelamiento/descongelamiento, lisis hipotónica, sonicación, microfluidización, u homogenización de alta velocidad.

El poxvirus (en particular el virus vaccinia) a continuación puede purificarse, utilizando etapas de purificación bien conocidos en la técnica, tales como:

• el tratamiento con por lo menos una nucleasa para extraer el ADN de las células de empaquetamiento,

• el tratamiento con por lo menos una proteasa para extraer proteínas de células de empaquetamiento,

• la separación de poxvirus (en particular el virus vaccinia) de contaminantes usando ultracentrifugación (en particular a través de un gradiente de cloruro de cesio), filtración (en particular filtración profunda) o cromatografía (en particular cromatografía de intercambio iónico).

En una forma de realización preferida de la presente invención, el virus vaccinia presente en la formulación es un virus de MVA (en particular los divulgados en los documentos WO90/10459, WO92/07000, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2004/111082, WO2007/121894, WO2014/009438 y WO2014/009433) amplificado en CEF, más preferentemente un virus de MVA (en particular los divulgados en los documentos WO90/10459, WO92/07000, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2004/111082, WO2007/121894, WO2014/009438 y WO2014/009433) amplificado en CEF y que no ha sido sometido a una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa.

En otra forma de realización preferida, el virus vaccinia presente en la formulación es un virus de MVA (en particular los divulgados en los documentos WO90/10459, WO92/07000, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2004/111082, WO2007/121894, WO2014/009438 y WO2014/009433) amplificado en una estirpe celular aviar inmortalizada (incluyendo una estirpe celular aviar inmortalizada de Cairina moschata que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), una estirpe celular aviar inmortalizada de Cairina moschata que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de E1A y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), una estirpe celular de DF1, una estirpe celular de Ebx, o una estirpe celular de DEC 99), más preferentemente un virus de MVA (en particular los divulgados en los documentos WO90/10459, WO92/07000, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2004/111082, WO2007/121894, WO2014/009438 y WO2014/009433) amplificado en una estirpe celular aviar inmortalizada (incluyendo los mencionados anteriormente) que no ha sido sometida a por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa.

En otra forma de realización preferida, el virus vaccinia presente en la formulación es un virus vaccinia de Wyeth o Copenhagen (en particular los divulgados en los documentos WO2007/030668, WO2008/113078, WO2009/065546, WO2009/065547) amplificado en células Hela, más preferentemente un virus vaccinia Wyeth o Copenhagen (en particular los divulgados en los documentos WO2007/030668, WO2008/113078, WO2009/065546, WO2009/065547) amplificado en células Hela que han sido sometidas a por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa.

pH y amortiguador

Las formulaciones líquidas según la invención presentan un pH comprendido entre 6.5 y 8.5. En particular, las formulaciones líquidas según la invención pueden presentar un pH comprendido entre 6.5 y 8.4, entre 6.5 y 8.3, entre 6.5 y 8.2, entre 6.5 y 8.1, entre 6.5 y 8.0, entre 6.5 y 7.9, entre 6.5 y 7.8, entre 6.5 y 7.7, entre 6.5 y 7.6, entre 6.5 y 7.5, entre 6.6 y 8.5, entre 6.6 y 8.4, entre 6.6 y 8.3, entre 6.6 y 8.2, entre 6.6 y 8.1, entre 6.6 y 8.0, entre 6.6 y 7.9, entre 6.6 y 7.8, entre 6.6 y 7.7, entre 6.6 y 7.6, entre 6.6 y 7.5, entre 6.7 y 8.5, entre 6.7 y 8.4, entre 6.7 y 8.3, entre 6.7 y 8.2, entre 6.7 y 8.1, entre 6.7 y 8.0, entre 6.7 y 7.9, entre 6.7 y 7.8, entre 6.7 y 7.7, entre 6.7 y 7.6, entre 6.7 y 7.5, entre 6.8 y 8.5, entre 6.8 y 8.4, entre 6.8 y 8.3, entre 6.8 y 8.2, entre 6.8 y 8.1, entre 6.8 y 8.0, entre 6.8 y 7.9, entre 6.8 y 7.8, entre 6.8 y 7.7, entre 6.8 y 7.6, entre 6.8 y 7.5, entre 6.9 y 8.5, entre 6.9 y 8.4, entre 6.9 y 8.3, entre 6.9 y 8.2, entre 6.9 y 8.1, entre 6.9 y 8.0, entre 6.9 y 7.9, entre 6.9 y 7.8, entre 6.9 y 7.7, entre 6.9 y 7.6, entre 6.9 y 7.5, entre 7 y 8.5, entre 7 y 8.4, entre 7 y 8.3, entre 7 y 8.2, entre 7 y 8.1, entre 7 y 8, entre 7 y 7.9, entre 7 y 7.8, entre 7 y 7.7, entre 7 y 7.6, entre 7 y 7.5, entre 7.1 y 8.5, entre 7.1 y 8.4, entre 7.1 y 8.3, entre 7.1 y 8.2, entre 7.1 y 8.1, entre 7.1 y 8, entre 7.1 y 7.9, entre 7.1 y 7.8, entre 7.1 y 7.7, entre 7.1 y 7.6, entre 7.1 y 7.5, entre 7.2 y 8.5, entre 7.2 y 8.4, entre 7.2 y 8.3, entre 7.2 y 8.2, entre 7.2 y 8.1, entre 7.2 y 8, entre 7.2 y 7.9, entre 7.2 y 7.8, entre 7.2 y 7.7, entre 7.2 y 7.6, entre 7.2 y 7.5, entre 7.3 y 8.5, entre 7.3 y 8.4, entre 7.3 y 8.3, entre 7.3 y 8.2, entre 7.3 y 8.1, entre 7.3 y 8, entre 7.3 y 7.9, entre 7.3 y 7.8, entre 7.3 y 7.7, entre 7.3 y 7.6, entre 7.3 y 7.5, entre 7.4 y 8.5, entre 7.4 y 8.4, entre 7.4 y 8.3, entre 7.4 y 8.2, entre 7.4 y 8.1, entre 7.4 y 8, entre 7.4 y 7.9, entre 7.4 y 7.8, entre 7.4 y 7.7, entre 7.4 y 7.6, entre 7.4 y 7.5, entre 7.5 y 8.5, entre 7.5 y 8.4, entre 7.5 y 8.3, entre 7.5 y 8.2, entre 7.5 y 8.1, entre 7.5 y 8, entre 7.5 y 7.9, entre 7.5 y 7.8, entre 7.5 y 7.7, o entre 7.5 y 7.6. Preferentemente, las formulaciones líquidas según la invención presentan un pH entre 7 y 8, y más particularmente cerca a 7.5, en particular comprendido entre 7.2 y 7.8, entre 7.3 y 7.7, entre 7.4 y 7.6, o aproximadamente 7.5.

Para mantener este pH, las formulaciones líquidas según la invención comprenden un amortiguador con capacidad amortiguadora al pH de la formulación. Esos amortiguadores son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen especialmente los siguientes amortiguadores:

• TRIS-HCl (tris(hidroximetil)metilamina-HCl),

• TRIS (tris(hidroximetil)metilamina),

• HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinaetanosulfónico),

• Amortiguador de fosfato que comprende una mezcla de Na2HPO4 y KH2PO4 o una mezcla de Na2HPO4 y NaH2PO4,

ACES (ácido N-(2-Acetamido)-aminoetanosulfónico),

PIPES (ácido piperazina-N,N'-bis(2-etanosulfónico)),

MOPSO (ácido 3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico),

BIS-Tris-propano (1,3-Bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano),

BES (ácido N,N-bis (2-hidroxietil) 2-aminoetano sulfónico)

MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico),

TES (ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico),

• DIPSO (ácido 3-[bis(2-hidroxietil)amino]-2-hidroxipropano-1-sulfónico),

• MOBS (ácido 4-(N-morfolino)butanosulfónico),

• TAPSO (ácido 3-[N-Tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico),

• HEPPSO (ácido 4-(2-hidroxietil)-piperazina-1-(2-hidroxi)-propanosulfónico),

• POPSO (ácido 2-hidroxi-3-[4-(2-hidroxi-3-sulfopropil)piperazin-1-N]propano-1- sulfónico),

• TEA (trietanolamina),

• EPPS (ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-3-propanosulfónico), y

• TRICINE (N-[tris(hidroximetil)-metil]-glicina).

Preferentemente, dicho amortiguador se selecciona de entre TRIS-HCl, TRIS, Tricina, HEPES y amortiguador de fosfato que comprende una mezcla de Na2HPO4 y KH2PO4 o una mezcla de Na2HPO4 y NaH2PO4. Más preferentemente dicho amortiguador se selecciona de entre amortiguador TRIS-HCl, TRIS, o Tricina, y más preferentemente dicho amortiguador es amortiguador TRIS-HCl o TRIS, incluso más preferentemente dicho amortiguador es amortiguador TRIS-HCl.

Dicho amortiguador (en particular los mencionados anteriormente y especialmente TRIS-HCl) está presente preferentemente a una concentración de 10 a 50 mM. Puede especialmente estar presente a una concentración de 10 a 45 mM, 10 a 40 mM, 10 a 35 mM, 10 a 30 mM, 10 a 25 mM, 10 a 20 mM, 10 a 15 mM, 15 a 50 mM, 15 a 45 mM, 15 a 40 mM, 15 a 35 mM, 15 a 30 mM, 15 a 25 mM, 15 a 20 mM, 20 a 50 mM, 20 a 45 mM, 20 a 40 mM, 20 a 35 mM, 20 a 30 mM, 20 a 25 mM, 25 a 50 mM, 25 a 45 mM, 25 a 40 mM, 25 a 35 mM, 25 a 30 mM, 30 a 50 mM, 30 a 45 mM, 30 a 40 mM, 30 a 35 mM, 35 a 50 mM, 35 a 45 mM, 35 a 40 mM, 40 a 50 mM, 40 a 45 mM, o 45 a 50 mM. Preferentemente, dicho amortiguador (en particular los mencionados anteriormente y especialmente TRIS-HCl) está preferentemente presente a una concentración de 10 a 40 mM, en particular de 10 a 30 mM.

Sal monovalente

Las formulaciones líquidas según la invención comprenden una sal monovalente. Se cree que esta sal monovalente asegura una presión osmótica apropiada. Además, asimismo se cree que dicha sal monovalente presenta propiedades de inhibición de proteasas que pueden estar presentes en la formulación, mejorando así la estabilidad. Esas proteasas incluyen proteasas celulares liberadas cuando se dañan las células de empaquetamiento y asimismo, cuando el virus vaccinia presente en la formulación ha sido purificado por un método que implica el uso de la proteasa, trazas restantes de dicha proteasa añadida. El efecto inhibidor de la concentración de las sales monovalentes significativas en las proteasas ha sido documentado en la técnica (ver TOUGU V et al. Eur J Biochem. 1994 Jun, 222(2):475-81). Por ejemplo, para la Tripsina Proteasa Pierce (Thermo Scientific), el fabricante indica en las instrucciones que altas concentraciones de sal monovalente, tal como >100 mM NaCl, pueden interferir con la actividad de la tripsina.

Dicha sal monovalente puede especialmente ser seleccionada de entre NaCl y KCl, preferentemente dicha sal monovalente es NaCl.

Dicha sal monovalente (en particular NaCl) está preferentemente presente a una concentración de 10 a 1000 mM. Puede especialmente estar presente en una concentración de 10 a 950 mM, 10 a 900 mM, 10 a 850 mM, 10 a 800 mM, 10 a 750 mM, 10 a 700 mM, 10 a 650 mM, 10 a 600 mM, 10 a 550 mM, 10 a 500 mM, 10 a 450 mM, 10 a 400 mM, 10 a 350 mM, 10 a 300 mM, 10 a 250 mM, 10 a 200 mM, 10 a 150 mM, 10 a 100 mM, 10 a 90 mM, 10 a 80 mM, 10 a 75 mM, 10 a 70 mM, 10 a 60 mM, 10 a 50 mM, 10 a 40 mM, 10 a 30 mM, 10 a 25 mM, 10 a 20 mM, 20 a 1000 mM, 20 a 950 mM, 20 a 900 mM, 20 a 850 mM, 20 a 800 mM, 20 a 750 mM, 20 a 700 mM, 20 a 650 mM, 20 a 600 mM, 20 a 550 mM, 20 a 500 mM, 20 a 450 mM, 20 a 400 mM, 20 a 350 mM, 20 a 300 mM, 20 a 250 mM, 20 a 200 mM, 20 a 150 mM, 20 a 100 mM, 20 a 90 mM, 20 a 80 mM, 20 a 75 mM, 20 a 70 mM, 20 a 60 mM, 20 a 50 mM, 20 a 40 mM, 20 a 30 mM, 20 a 25 mM, 25 a 1000 mM, 25 a 950 mM, 25 a 900 mM, 25 a 850 mM, 25 a 800 mM, 25 a 750 mM, 25 a 700 mM, 25 a 650 mM, 25 a 600 mM, 25 a 550 mM, 25 a 500 mM, 25 a 450 mM, 25 a 400 mM, 25 a 350 mM, 25 a 300 mM, 25 a 250 mM, 25 a 200 mM, 25 a 150 mM, 25 a 100 mM, 25 a 90 mM, 25 a 80 mM, 25 a 75 mM, 25 a 70 mM, 25 a 60 mM, 25 a 50 mM, 25 a 40 mM, 25 a 30 mM, 30 a 1000 mM, 30 a 950 mM, 30 a 900 mM, 30 a 850 mM, 30 a 800 mM, 30 a 750 mM, 30 a 700 mM, 30 a 650 mM, 30 a 600 mM, 30 a 550 mM, 30 a 500 mM, 30 a 450 mM, 30 a 400 mM, 30 a 350 mM, 30 a 300 mM, 30 a 250 mM, 30 a 200 mM, 30 a 150 mM, 30 a 100 mM, 30 a 90 mM, 30 a 80 mM, 30 a 75 mM, 30 a 70 mM, 30 a 60 mM, 30 a 50 mM, 30 a 40 mM, 40 a 1000 mM, 40 a 950 mM, 40 a 900 mM, 40 a 850 mM, 40 a 800 mM, 40 a 750 mM, 40 a 700 mM, 40 a 650 mM, 40 a 600 mM, 40 a 550 mM, 40 a 500 mM, 40 a 450 mM, 40 a 400 mM, 40 a 350 mM, 40 a 300 mM, 40 a 250 mM, 40 a 200 mM, 40 a 150 mM, 40 a 100 mM, 40 a 90 mM, 40 a 80 mM, 40 a 75 mM, 40 a 70 mM, 40 a 60 mM, 40 a 50 mM, 50 a 1000 mM, 50 a 950 mM, 50 a 900 mM, 50 a 850 mM, 50 a 800 mM, 50 a 750 mM, 50 a 700 mM, 50 a 650 mM, 50 a 600 mM, 50 a 550 mM, 50 a 500 mM, 50 a 450 mM, 50 a 400 mM, 50 a 350 mM, 50 a 300 mM, 50 a 250 mM, 50 a 200 mM, 50 a 150 mM, 50 a 100 mM, 50 a 90 mM, 50 a 80 mM, 50 a 75 mM, 50 a 70 mM, 50 a 60 mM, 60 a 1000 mM, 60 a 950 mM, 60 a 900 mM, 60 a 850 mM, 60 a 800 mM, 60 a 750 mM, 60 a 700 mM, 60 a

650 mM, 60 a 600 mM, 60 a 550 mM, 60 a 500 mM, 60 a 450 mM, 60 a 400 mM, 60 a 350 mM, 60 a 300 mM, 60

a 250 mM, 60 a 200 mM, 60 a 150 mM, 60 a 100 mM, 60 a 90 mM, 60 a 80 mM, 60 a 75 mM, 60 a 70 mM, 70 a

1000 mM, 70 a 950 mM, 70 a 900 mM, 70 a 850 mM, 70 a 800 mM, 70 a 750 mM, 70 a 700 mM, 70 a 650 mM, 70

a 600 mM, 70 a 550 mM, 70 a 500 mM, 70 a 450 mM, 70 a 400 mM, 70 a 350 mM, 70 a 300 mM, 70 a 250 mM, 70

a 200 mM, 70 a 150 mM, 70 a 100 mM, 70 a 90 mM, 70 a 80 mM, 70 a 75 mM, 75 a 1000 mM, 75 a 950 mM, 75 a

900 mM, 75 a 850 mM, 75 a 800 mM, 75 a 750 mM, 75 a 700 mM, 75 a 650 mM, 75 a 600 mM, 75 a 550 mM, 75 a 500 mM, 75 a 450 mM, 75 a 400 mM, 75 a 350 mM, 75 a 300 mM, 75 a 250 mM, 75 a 200 mM, 75 a 150 mM, 75 a 100 mM, 75 a 90 mM, 75 a 80 mM, 80 a 1000 mM, 80 a 950 mM, 80 a 900 mM, 80 a 850 mM, 80 a 800 mM, 80

a 750 mM, 80 a 700 mM, 80 a 650 mM, 80 a 600 mM, 80 a 550 mM, 80 a 500 mM, 80 a 450 mM, 80 a 400 mM, 80

a 350 mM, 80 a 300 mM, 80 a 250 mM, 80 a 200 mM, 80 a 150 mM, 80 a 100 mM, 80 a 90 mM, 90 a 1000 mM, 90

a 950 mM, 90 a 900 mM, 90 a 850 mM, 90 a 800 mM, 90 a 750 mM, 90 a 700 mM, 90 a 650 mM, 90 a 600 mM, 90

a 550 mM, 90 a 500 mM, 90 a 450 mM, 90 a 400 mM, 90 a 350 mM, 90 a 300 mM, 90 a 250 mM, 90 a 200 mM, 90

a 150 mM, 90 a 100 mM, 100 a 1000 mM, 100 a 950 mM, 100 a 900 mM, 100 a 850 mM, 100 a 800 mM, 100 a

750 mM, 100 a 700 mM, 100 a 650 mM, 100 a 600 mM, 100 a 550 mM, 100 a 500 mM, 100 a 450 mM, 100 a 400

mM, 100 a 350 mM, 100 a 300 mM, 100 a 250 mM, 100 a 200 mM, 100 a 150 mM, 150 a 1000 mM, 150 a 950 mM,

150 a 900 mM, 150 a 850 mM, 150 a 800 mM, 150 a 750 mM, 150 a 700 mM, 150 a 650 mM, 150 a 600 mM, 150

a 550 mM, 150 a 500 mM, 150 a 450 mM, 150 a 400 mM, 150 a 350 mM, 150 a 300 mM, 150 a 250 mM, 150 a

200, 200 a 1000 mM, 200 a 950 mM, 200 a 900 mM, 200 a 850 mM, 200 a 800 mM, 200 a 750 mM, 200 a 700 mM,

200 a 650 mM, 200 a 600 mM, 200 a 550 mM, 200 a 500 mM, 200 a 450 mM, 200 a 400 mM, 200 a 350 mM, 200

a 300 mM, 200 a 250 mM, 250 a 1000 mM, 250 a 950 mM, 250 a 900 mM, 250 a 850 mM, 250 a 800 mM, 250 a

750 mM, 250 a 700 mM, 250 a 650 mM, 250 a 600 mM, 250 a 550 mM, 250 a 500 mM, 250 a 450 mM, 250 a 400

mM, 250 a 350 mM, 250 a 300 mM, 300 a 1000 mM, 300 a 950 mM, 300 a 900 mM, 300 a 850 mM, 300 a 800 mM,

300 a 750 mM, 300 a 700 mM, 300 a 650 mM, 300 a 600 mM, 300 a 550 mM, 300 a 500 mM, 300 a 450 mM, 300

a 400 mM, 300 a 350 mM, 350 a 1000 mM, 350 a 950 mM, 350 a 900 mM, 350 a 850 mM, 350 a 800 mM, 350 a

750 mM, 350 a 700 mM, 350 a 650 mM, 350 a 600 mM, 350 a 550 mM, 350 a 500 mM, 350 a 450 mM, 350 a 400

mM, 400 a 1000 mM, 400 a 950 mM, 400 a 900 mM, 400 a 850 mM, 400 a 800 mM, 400 a 750 mM, 400 a 700 mM,

400 a 650 mM, 400 a 600 mM, 400 a 550 mM, 400 a 500 mM, 400 a 450 mM, 450 a 1000 mM, 450 a 950 mM, 450

a 900 mM, 450 a 850 mM, 450 a 800 mM, 450 a 750 mM, 450 a 700 mM, 450 a 650 mM, 450 a 600 mM, 450 a

550 mM, o 450 a 500 mM.

El MVA (en particular los divulgados en los documentos WO90/10459, WO92/07000, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2004/111082, WO2007/121894, WO2014/009438 y WO2014/009433) generalmente se amplificada en células aviares primarias, en cuyo caso no es necesario un tratamiento de proteasa para la eliminación de proteínas de células aviares primarias, ya que las células primarias no se consideran peligrosas.

Por lo tanto, para el MVA, y más generalmente cuando el poxvirus (preferentemente virus vaccinia) presente en la formulación ha sido purificado por un método que no implica tratamiento mediante por lo menos una proteasa,

dicha sal monovalente (en particular NaCl) puede estar presente a relativamente baja concentración, especialmente a una concentración de 10 a 200 mM, 10 a 150 mM, 10 a 100 mM, 10 a 90 mM, 10 a 80 mM, 10 a

75 mM, 20 a 200 mM, 20 a 150 mM, 20 a 100 mM, 20 a 90 mM, 20 a 80 mM, 20 a 75 mM, 25 a 200 mM, 25 a 150

mM, 25 a 100 mM, 25 a 90 mM, 25 a 80 mM, 25 a 75 mM, 30 a 200 mM, 30 a 150 mM, 30 a 100 mM, 30 a 90 mM,

30 a 80 mM, 30 a 75 mM, 40 a 200 mM, 40 a 150 mM, 40 a 100 mM, 40 a 90 mM, 40 a 80 mM, 40 a 75 mM, 50 a

200 mM, 50 a 150 mM, 50 a 100 mM, 50 a 90 mM, 50 a 80 mM, 50 a 75 mM, 60 a 200 mM, 60 a 150 mM, 60 a

100 mM, 60 a 90 mM, 60 a 80 mM, 60 a 75 mM, 70 a 200 mM, 70 a 150 mM, 70 a 100 mM, 70 a 90 mM, 70 a 80

mM, o 70 a 75 mM, más preferentemente a una concentración próxima a 75 mM, tal como 50 a 100 mM, 60 a 90

mM, 70 a 80 mM o aproximadamente 75 mM.

Otras cepas de poxviruses, y en particular virus vaccinia oncolíticos, tales como virus vaccinia Wyeth o Copenhagen (especialmente los divulgados en los documentos WO2007/030668, WO2008/113078, WO2009/065546, WO2009/065547), generalmente se amplifican en varias estirpes celulares inmortalizadas.

Algunas de estas estirpes celulares pueden contener oncogenes y la eliminación o por lo menos una reducción

drástica de ADN y proteínas de las células productoras en este caso es requerido por las autoridades sanitarias.

Para este fin, el procedimiento de purificación generalmente incluye por lo menos una etapa de tratamiento con

por lo menos una proteasa. Las trazas restantes de la proteasa(s) pueden, particularmente en una formulación

líquida, tener efectos dañinos en la estabilidad del virus vaccinia. En este sentido, en el contexto de la presente

invención se descubre que aumentando la concentración de dicha sal monovalente (en particular NaCl) da como

resultado una mejor estabilidad de los virus vaccinia. Sin limitarse por la teoría, se cree que un aumento en la concentración de dicha sal monovalente (en particular NaCl) presenta un efecto inhibidor en las trazas remanentes

de la proteasa(s).

Por lo tanto, cuando el poxvirus (en particular un virus vaccinia) presente en la formulación ha sido purificado por

un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa, dicha sal monovalente (en particular NaCI) está presente preferentemente a una concentración de 100 a 1000 mM, 100 a 950 mM, 100 a 900 mM, 100 a 850 mM, 100 a 800 mM, 100 a 750 mM, 100 a 700 mM, 100 a 650 mM, 100 a 600 mM, 100 a 550 mM, 100 a 500 mM, 100 a 450 mM, 100 a 400 mM, 100 a 350 mM, 100 a 300 mM, 100 a 250 mM, 100 a 200 mM, 150 a 1000 mM, 150 a 950 mM, 150 a 900 mM, 150 a 850 mM, 150 a 800 mM, 150 a 750 mM, 150 a 700 mM, 150 a 650 mM, 150 a 600 mM, 150 a 550 mM, 150 a 500 mM, 150 a 450 mM, 150 a 400 mM, 150 a 350 mM, 150 a 300 mM, 150 a 250 mM, 150 a 200, 200 a 1000 mM, 200 a 950 mM, 200 a 900 mM, 200 a 850 mM, 200 a 800 mM, 200 a 750 mM, 200 a 700 mM, 200 a 650 mM, 200 a 600 mM, 200 a 550 mM, 200 a 500 mM, 200 a 450 mM, 200 a 400 mM, 200 a 350 mM, 200 a 300 mM, 200 a 250 mM, 250 a 1000 mM, 250 a 950 mM, 250 a 900 mM, 250 a 850 mM, 250 a 800 mM, 250 a 750 mM, 250 a 700 mM, 250 a 650 mM, 250 a 600 mM, 250 a 550 mM, 250 a 500 mM, 250 a 450 mM, 250 a 400 mM, 250 a 350 mM, 250 a 300 mM, 300 a 1000 mM, 300 a 950 mM, 300 a 900 mM, 300 a 850 mM, 300 a 800 mM, 300 a 750 mM, 300 a 700 mM, 300 a 650 mM, 300 a 600 mM, 300 a 550 mM, 300 a 500 mM, 300 a 450 mM, 300 a 400 mM, 300 a 350 mM, 350 a 1000 mM, 350 a 950 mM, 350 a 900 mM, 350 a 850 mM, 350 a 800 mM, 350 a 750 mM, 350 a 700 mM, 350 a 650 mM, 350 a 600 mM, 350 a 550 mM, 350 a 500 mM, 350 a 450 mM, 350 a 400 mM, 400 a 1000 mM, 400 a 950 mM, 400 a 900 mM, 400 a 850 mM, 400 a 800 mM, 400 a 750 mM, 400 a 700 mM, 400 a 650 mM, 400 a 600 mM, 400 a 550 mM, 400 a 500 mM, 400 a 450 mM, 450 a 1000 mM, 450 a 950 mM, 450 a 900 mM, 450 a 850 mM, 450 a 800 mM, 450 a 750 mM, 450 a 700 mM, 450 a 650 mM, 450 a 600 mM, 450 a 550 mM, o 450 a 500 mM. Por ejemplo, dicha sal monovalente puede estar presente a una concentración próxima a 200 mM, tal como 100 a 300 mM, 150 a 250 mM, o aproximadamente 200 mM. Alternativamente, dicha sal monovalente puede estar presente en una concentración próxima a 500 mM, tales como 250 a 750 mM, 400 a 600 mM, o aproximadamente 500 mM. En incluso otra forma de realización, dicha sal monovalente puede estar presente a una concentración próxima a 750 mM, tales como 500 a 1000 mM, 700 a 800 mM, o aproximadamente 750 mM.

Disacárido o alcohol de azúcar

Las formulaciones líquidas según la invención comprenden un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable.

Este disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable es un crioprotector y se cree que protege el poxvirus (en particular el virus vaccinia) a baja temperatura de almacenamiento, tal como a aproximadamente 5°C. Además, ese disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable aumenta la viscosidad de la formulación líquida, que pudiera limitar las interacciones entre el poxvirus (en particular el virus vaccinia) y los compuestos potencialmente dañinos.

El disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable puede seleccionarse especialmente de entre sacarosa, trehalosa, maltosa, lactosa, manitol, y sorbitol, preferentemente dicho disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable es sacarosa.

El disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable (en particular los mencionados anteriormente y especialmente sacarosa) está preferentemente presente a una concentración de 5 a 20% (peso en g/volumen en L, denominado como p/v). En particular, puede estar presente a una concentración de 5 a 19% (p/v), 5 a 18% (p/v), 5 a 17% (p/v), 5 a 16% (p/v), 5 a 15% (p/v), 5 a 14% (p/v), 5 a 13% (p/v), 5 a 12% (p/v), 5 a 11% (p/v), 5 a 10% (p/v), 6 a 20% (p/v), 6 a 19% (p/v), 6 a 18% (p/v), 6 a 17% (p/v), 6 a 16% (p/v), 6 a 15% (p/v), 6 a 14% (p/v), 6 a 13% (p/v), 6 a 12% (p/v), 6 a 11% (p/v), 6 a 10% (p/v), 7 a 20% (p/v), 7 a 19% (p/v), 7 a 18% (p/v), 7 a 17% (p/v), 7 a 16% (p/v), 7 a 15% (p/v), 7 a 14% (p/v), 7 a 13% (p/v), 7 a 12% (p/v), 7 a 11% (p/v), 7 a 10% (p/v), 8 a 20% (p/v), 8 a 19% (p/v), 8 a 18% (p/v), 8 a 17% (p/v), 8 a 16% (p/v), 8 a 15% (p/v), 8 a 14% (p/v), 8 a 13% (p/v), 8 a 12% (p/v), 8 a 11% (p/v), 8 a 10% (p/v), 9 a 20% (p/v), 9 a 19% (p/v), 9 a 18% (p/v), 9 a 17% (p/v), 9 a 16% (p/v), 9 a 15% (p/v), 9 a 14% (p/v), 9 a 13% (p/v), 9 a 12% (p/v), 9 a 11% (p/v), o 9 a 10% (p/v). Preferentemente, dicho disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable (en particular los mencionados anteriormente y especialmente sacarosa) está presente preferentemente a una concentración próxima a 10% (p/v), tal como 5 a 15% (p/v), 6 a 14% (p/v), 7 a 13% (p/v), 8 a 12% (p/v), 9 a 11% (p/v), o aproximadamente 10%.

Agente quelante

Las formulaciones líquidas según la invención comprenden un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y en particular bicationes de agente quelante.

Las razones por las que dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable mejora la estabilidad de poxvirus (en particular el virus vaccinia) en el estado líquido en realidad no se comprenden. En efecto, como se explica en la sección de la técnica anterior, el efecto de EDTA en la estabilidad del virus difiere significativamente entre los diferentes virus, y no se puede elaborar fácilmente una clasificación obvia de los virus para los que el EDTA presenta un efecto beneficioso contra los virus para los que el EDTA no presenta un efecto beneficioso o presenta un efecto incluso dañino. En particular, aunque se ha encontrado un efecto beneficioso significativo para el adenovirus (virus de ADN no envuelto, ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75 ; y patente US n° 7.456.009), no se ha encontrado un efecto beneficioso significativo para el virus de la gripe (virus de ARN envuelto, ver el documento US2007/0161085), parvovirus canino (virus de ADN no envuelto), adenovirus canino tipo 2 (virus de ADN no envuelto), virus de moquillo canino (paramixovirus de ARN envuelto) y virus paragripal canina (paramixovirus de ARN envuelto) (ver el documento WO2014/029702). Finalmente, se ha encontrado un efecto dañino para el virus de Newcastle (paramixovirus de ARN envuelto, ver patente US n° 7.914.979). Sin embargo, como se demuestra en la sección experimental, dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable presenta un papel esencial en la estabilización de poxvirus (en particular el virus vaccinia) en formulaciones líquidas según la presente invención.

El agente quelante farmacéuticamente aceptable puede seleccionarse especialmente de entre ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA), y ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico (DMPS), preferentemente dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable es EDTA.

El agente quelante farmacéuticamente aceptable (en particular los mencionados anteriormente y especialmente EDTA) está presente preferentemente a una concentración de por lo menos 50 pM. En particular, puede estar presente a una concentración de 50 a 1000 pM, 50 a 750 pM, 50 a 500 pM, 50 a 400 pM, 50 a 300 pM, 50 a 250 pM, 50 a 200 pM, 50 a 150 pM; 50 a 100 pM, 50 a 75 pM, 75 a 1000 pM, 75 a 750 pM, 75 a 500 pM, 75 a 400 pM, 75 a 300 pM, 75 a 250 pM, 75 a 200 pM, 75 a 150 pM; 75 a 100 pM, 100 a 1000 pM, 100 a 750 pM, 100 a 500 pM, 100 a 400 pM, 100 a 300 pM, 100 a 250 pM, 100 a 200 pM, 100 a 150 pM; 150 a 1000 pM, 150 a 750 pM, 150 a 500 pM, 150 a 400 pM, 150 a 300 pM, 150 a 250 pM, 150 a 200 pM. Dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable (en particular los mencionados anteriormente y especialmente EDTA) puede estar presente especialmente a una concentración próxima a 150 pM, tal como 50 a 250 pM, 100 a 200 pM, o aproximadamente 150 pM. Sin embargo, pueden estar presentes mayores concentraciones, ya que no se ha observado un efecto dañino en la estabilidad, incluso a bajas concentraciones.

Componentes adicionales opcionales

Las formulaciones líquidas según la invención pueden comprender además compuestos adicionales con efecto de estabilización en virus vaccinia.

Alcohol de C2-C3

Aunque la presencia de un amortiguador farmacéuticamente aceptable que permite presentar un pH entre 6.5 y 8.5, una sal monovalente, un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, y un agente quelante farmacéuticamente aceptable se ha descubierto como esencial para la estabilización del virus vaccinia en el estado líquido, en el contexto de la presente invención se descubre asimismo que la presencia adicional de una baja concentración de un alcohol de C2-C3, aunque no es necesario para la estabilización del virus vaccinia, hace sinergia con la presencia de un agente quelante para mejorar más la estabilidad del virus vaccinia en estado líquido. En contraste, una concentración demasiado alta del mismo alcohol de C2-C3 presenta efectos dañinos en la estabilidad del virus vaccinia en el estado líquido. Por lo tanto, las formulaciones líquidas según la invención comprenden preferentemente además un alcohol de C2-C3 a una concentración de 0.05 a 5% (volumen/volumen o v/v). Este hallazgo fue muy inesperado, porque los poxviruses, y en particular los virus vaccinia, son virus envueltos, para los que podría esperarse que la adición de un sovente polar pudiera alterar la envolvente, contrario al caso de los virus no envueltos tales como adenovirus.

Dicho alcohol de C2-C3 puede seleccionarse especialmente de entre etanol e isopropanol, preferentemente dicho alcohol de C2-C3 es etanol.

Dicho alcohol de C2-C3 (en particular ese mencionado anteriormente y especialmente etanol) puede estar presente especialmente a un concentración de 0.05 a 5% (v/v), 0.05 a 4% (v/v), 0.05 a 3% (v/v), 0.05 a 2% (v/v), 0.05 a 1% (v/v), 0.05 a 0.9% (v/v), 0.05 a 0.8% (v/v), 0.05 a 0.7% (v/v), 0.05 a 0.6% (v/v), 0.05 a 0.5% (v/v), 0.1 a 5% (v/v), 0.1 a 4% (v/v), 0.1 a 3% (v/v), 0.1 a 2% (v/v), 0.1 a 1% (v/v), 0.1 a 0.9% (v/v), 0.1 a 0.8% (v/v), 0.1 a 0.7% (v/v), 0.1 a 0.6% (v/v), 0.1 a 0.5% (v/v), 0.2 a 5% (v/v), 0.2 a 4% (v/v), 0.2 a 3% (v/v), 0.2 a 2% (v/v), 0.2 a 1% (v/v), 0.2 a 0.9% (v/v), 0.2 a 0.8% (v/v), 0.2 a 0.7% (v/v), 0.2 a 0.6% (v/v), 0.2 a 0.5% (v/v), 0.3 a 5% (v/v), 0.3 a 4% (v/v), 0.3 a 3% (v/v), 0.3 a 2% (v/v), 0.3 a 1% (v/v), 0.3 a 0.9% (v/v), 0.3 a 0.8% (v/v), 0.3 a 0.7% (v/v), 0.3 a 0.6% (v/v), 0.3 a 0.5% (v/v), 0.4 a 5% (v/v), 0.4 a 4% (v/v), 0.4 a 3% (v/v), 0.4 a 2% (v/v), 0.4 a 1% (v/v), 0.4 a 0.9% (v/v), 0.4 a 0.8% (v/v), 0.4 a 0.7% (v/v), 0.4 a 0.6% (v/v), 0.4 a 0.5% (v/v), 0.5 a 5% (v/v), 0.5 a 4% (v/v), 0.5 a 3% (v/v), 0.5 a 2% (v/v), 0.5 a 1% (v/v), 0.5 a 0.9% (v/v), 0.5 a 0.8% (v/v), 0.5 a 0.7% (v/v), o 0.5 a 0.6% (v/v). Preferentemente, dicho alcohol de C2-C3 (en particular los mencionados anteriormente y especialmente etanol) está presente a una concentración que no excede 2% (v/v) (en particular cualquier intervalo divulgado anteriormente con un valor mayor de a lo sumo 2%) y más preferentemente próxima a 0.5% (v/v), tal como 0.1 a 1% (v/v), 0.1 a 0.9% (v/v), 0.2 a 0.8% (v/v), 0.3 a 0.7% (v/v), 0.4 a 0.6% (v/v), más preferentemente aproximadamente 0.5% (v/v).

Glutamato de sodio

Aunque su efecto de estabilización es menos pronunciado, las formulaciones líquidas según la invención asimismo pueden comprender glutamato de sodio a una concentración inferior a 10 mM, tal com 8 mM, 0 a 7.5 mM, 0 a 7 mM, 0 a 6.5 mM, 0 a 6 mM, 0 a 5.5 mM, 0 a 5 mM, 1 a 10 mM, 1 a 7.5 mM, 1 a 7 mM, 1 a 6.5 mM, 1 a 6 mM, 1 a 5.5 mM, 1 a 5 mM, 2 a 10 mM, 2 a 9 5 mM, 2 a 7 mM, 2 a 6.5 mM, 2 a 6 mM, 2 a 5.5 mM, 2 a 5 mM, 2.5 a 10 mM, 2.5 a 9 mM, 2.5 mM, 2.5 a 7 mM, 2.5 a 6.5 mM, 2.5 a 6 mM, 2.5 a 5.5 mM, 2.5 a 5 mM, 3 a 10 mM, 3 a 9 mM, M, 3 a 7 mM, 3 a 6.5 mM, 3 a 6 mM, 3 a 5.5 mM, 3 a 5 mM, 3.5 a 10 mM, 3.5 a 9 mM, 3.5 a 8 mM, 3.5 a 6.5 mM, 3.5 a 6 mM, 3.5 a 5.5 mM, 3.5 a 5 mM, 4 a 10 mM, 4 a 9 mM, 4 a 8 4 a 6.5 mM, 4 a 6 mM, 4 a 5.5 mM, 4 a 5 mM, 4.5 a 10 mM, 4.5 a 9 mM, 4.5 a 8 mM, 4.5 a 6.5 mM, 4.5 a 6 mM, 4.5 a 5.5 mM, 4.5 a 5 mM, 5 a 10 mM, 5 a 9 mM, 5 a 8 mM,

6.5 mM, 5 a 6 mM, o 5 a 5.5 mM.

En particular, en el contexto de la presente invención se ha descubierto que, especialmente para el MVA, la presencia de glutamato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM es óptima. Cuando el glutamato de sodio está presente en las formulaciones líquidas según la invención, está preferentemente presente a una concentración próxima a 5 mM, tal como 2.5 a 7.5 mM, 3 a 7 mM, 3.5 a 6.5 mM, 4 a 6 mM, 4.5 a 5.5 mM, más preferentemente a aproximadamente 5 mM.

Compuestos potencialmente excluidos

Tensioactivo

Los tensioactivos no iónicos han demostrado inducir la estabilización de varios virus en el estado líquido (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75, patente US n° 7.456.009, SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51, documento US2007/0161085).

Sin embargo, para el virus vaccinia, en el contexto de la presente invención se descubre que la presencia de un tensioactivo tal como un tensioactivo no iónico Tween 80 (asimismo conocido como polisorbato 80) a una baja concentración no presenta un efecto beneficioso y que las concentraciones superiores a 0.02% v/v o incluso superiores 0.005% v/v son dañinas para la estabilidad del virus vaccinia (ver el ejemplo 1).

Si el polisorbato, o más generalmente un tensioactivo no iónico o incluso algún tensioactivo está presente en una composición líquida según la invención, debe estar presente a una concentración inferior a 0.1%, preferentemente inferior a 0.05% (v/v), inferior a 0.04% (v/v), inferior a 0.03% (v/v), inferior a 0.02% (v/v), inferior a 0.01% (v/v), inferior a 0.009% (v/v), inferior a 0.008% (v/v), inferior a 0.007% (v/v), inferior a 0.006% (v/v), inferior a 0.005% (v/v), inferior a 0.004% (v/v), inferior a 0.003% (v/v), inferior a 0.002% (v/v), o incluso inferior a 0.001% (v/v).

En otra forma de realización preferida de una composición líquida según la invención, la composición líquida está libre de polisorbato, o más generalmente libre de tensioactivos no iónicos, o incluso más generalmente libre de cualquier tensioactivo.

En una forma de realización preferida, la formulación líquida según la invención está libre de un tensioactivo o comprende un tensioactivo a una concentración inferior a 0.1%, preferentemente inferior a 0.05% (v/v), inferior a 0.04% (v/v), inferior a 0.03% (v/v), inferior a 0.02% (v/v), inferior a 0.01% (v/v), inferior a 0.009% (v/v), inferior a 0.008% (v/v), inferior a 0.007% (v/v), inferior a 0.006% (v/v), inferior a 0.005% (v/v), inferior a 0.004% (v/v), inferior a 0.003% (v/v), inferior a 0.002% (v/v), o incluso inferior a 0.001% (v/v).

Sales bivalentes

Se ha descubierto que las sales bivalentes tales como MgCh o CaCh inducen la estabilización de varios virus en el estado líquido (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75 y patente US n° 7.456.009). En esos casos, los cationes bivalentes están presentes en la formulación líquida a una concentración de por lo menos 0.5 mM, y preferentemente por lo menos a 1 mM.

En el contexto de la presente invención, sin embargo, se descubre que la presencia de sales bivalentes no presenta un alto efecto beneficioso en la estabilidad del virus vaccinia (ver el ejemplo 1), y más bien presenta efectos dañinos a mayores concentraciones (por lo menos 75 mM). Las formulaciones líquidas según la invención pueden así ser libres de MgCh y/o CaCh, o más generalmente de sales bivalentes. Sin embargo, ya que los cationes bivalentes parecen no tener un efecto dañino en la estabilidad virus vaccinia a baja concentración, esos cationes bivalentes pueden estar presentes en las formulaciones líquidas según la invención, en particular a baja concentración.

Cuando esos cationes bivalentes (en particular MgCh o CaCh) están presentes en las formulaciones líquidas según la invención, sin embargo, están presentes preferentemente a una concentración inferior a 100 mM, preferentemente inferior a 90 mM, inferior a 80 mM, inferior a 75 mM, inferior a 70 mM, inferior a 60 mM, inferior a 50 mM, inferior a 45 mM, inferior a 40 mM, inferior a 35 mM, inferior a 30 mM, inferior a 25 mM, inferior a 20 mM, inferior a 15 mM, inferior a 10 mM, inferior a 9 mM, inferior a 8 mM, inferior a 7 mM, inferior a 6 mM, inferior a 5 mM, inferior a 4 mM, inferior a 3 mM, inferior a 2 mM, más preferentemente inferior a 1 mM, inferior a 0.9 mM, inferior a 0.8 mM, inferior a 0.7 mM, inferior a 0.6 mM, inferior a 0.5 mM.

En una forma de realización preferida, la formulación líquida según la invención está libre de sales bivalentes o comprende sales bivalentes a un concentración inferior a 100 mM, preferentemente inferior a 90 mM, inferior a 80 mM, inferior a 75 mM, inferior a 70 mM, inferior a 60 mM, inferior a 50 mM, inferior a 45 mM, inferior a 40 mM, inferior a 35 mM, inferior a 30 mM, inferior a 25 mM, inferior a 20 mM, inferior a 15 mM, inferior a 10 mM, inferior a 9 mM, inferior a 8 mM, inferior a 7 mM, inferior a 6 mM, inferior a 5 mM, inferior a 4 mM, inferior a 3 mM, inferior a 2 mM, más preferentemente inferior a 1 mM, inferior a 0.9 mM, inferior a 0.8 mM, inferior a 0.7 mM, inferior a 0.6 mM, inferior a 0.5 mM.

Aminoácidos distintos de ácido glutámico

Se ha descubierto que los aminoácidos, y en particular histidina, arginina o metionina, inducen la estabilización de varios virus en el estado líquido (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75, patente US n° 7.456.009, documento US2007/0161085, patente US n° 7.914.979, documentos WO2014/029702, WO2014/053571). Cuando está presente la histidina en una formulación líquida para mejorar la estabilidad, la histidina está presente generalmente a una concentración de por lo menos 5 mM, y preferentemente por lo menos 10 mM (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75, patente US n° 7.456.009, documento WO2014/029702). Cuando está presente la arginina en una formulación líquida para mejorar la estabilidad, la arginina está presente generalmente a una concentración de por lo menos 50 mM (ver el documento US2007/0161085, por lo menos 1% p/v de arginina correspondiente a por lo menos aproximadamente 57.4 mM), y algunas veces preferentemente por lo menos 150 mM, y en particular aproximadamente 300 mM (ver el documento WO2014/029702). Cuando está presente la metionina en una formulación líquida para una mejora en la estabilidad, la metionina está presente generalmente a una concentración de por lo menos 25 mM, y preferentemente aproximadamente 67 mM (ver el documento WO2014/029702).

Sin embargo, en el contexto de la presente invención se descubre que la presencia de aminoácidos distintos de ácido glutámico (arginina, histidina o aminoácidos en general) no presenta un efecto beneficioso en la estabilidad del virus vaccinia (ver ejemplo 1).

Las formulaciones líquidas según la invención así pueden estar libres de histidina. Alternativa o adicionalmente, las formulaciones líquidas según la invención pueden estar libres de arginina. Alternativa o adicionalmente, las formulaciones líquidas según la invención pueden estar libres de metionina. En particular, las formulaciones líquidas según la invención pueden estar libres de arginina y metionina, o incluso libres de histidina, arginina y metionina. Más generalmente, las formulaciones líquidas según la invención pueden estar libres de aminoácidos distintos de ácido glutámico.

Sin embargo, aunque no presenta un efecto beneficioso, se descubre que esos aminoácidos distintos de glutamato no presentan un efecto dañino, y así pueden estar presentes en las formulaciones líquidas según la invención, en particular a baja concentración.

Cuando está presente la histidina en las formulaciones líquidas según la invención, sin embargo, está presente preferentemente a una concentración inferior a 10 mM, preferentemente inferior a 9 mM, inferior a 8 mM, inferior a 7.5 mM, inferior a 7 mM, inferior a 6 mM, o incluso inferior a 5 mM.

De modo similar, cuando está presente la arginina en las formulaciones líquidas según la invención, no obstante está presente preferentemente a una concentración inferior a 300 mM, preferentemente inferior a 150 mM, inferior a 100 mM, inferior a 75 mM, o incluso inferior a 50 mM. Asimismo, cuando está presente la metionina en las formulaciones líquidas según la invención, no obstante está presente preferentemente a una concentración inferior a 60 mM, preferentemente inferior a 50 mM, inferior a 40 mM, inferior a 30 mM, o incluso inferior a 25 mM.

Más generalmente, cuando está/están presentes uno o más aminoácidos distintos de glutamato de sodio en las formulaciones líquidas según la invención, está/están presentes preferentemente a una concentración inferior a 300 mM, preferentemente inferior a 150 mM, inferior a 100 mM, inferior a 75 mM, inferior a 50 mM, inferior a 40 mM, inferior a 30 mM, inferior a 25 mM, inferior a 20 mM, inferior a 10 mM, inferior a 9 mM, inferior a 8 mM, inferior a 7.5 mM, inferior a 7 mM, inferior a 6 mM, o incluso inferior a 5 mM.

En una forma de realización preferida, la formulación líquida según la invención está libre de histidina o comprende histidina a una concentración inferior a 10 mM, preferentemente inferior a 9 mM, inferior a 8 mM, inferior a 7.5 mM, inferior a 7 mM, inferior a 6 mM, o incluso inferior a 5 mM.

En una forma de realización preferida, la formulación líquida según la invención está libre de arginina o comprende arginina a una concentración inferior a 300 mM, preferentemente inferior a 150 mM, inferior a 100 mM, inferior a 75 mM, o incluso inferior a 50 mM.

En una forma de realización preferida, la formulación líquida según la invención está libre de metionina o comprende metionina a una concentración inferior a 60 mM, preferentemente inferior a 50 mM, inferior a 40 mM, inferior a 30 mM, o incluso inferior a 25 mM.

En una forma de realización preferida, la formulación líquida según la invención está libre de aminoácidos distintos de glutamato de sodio o comprende aminoácidos distintos de glutamato de sodio a una concentración inferior a 300 mM, preferentemente inferior a 150 mM, inferior a 100 mM, inferior a 75 mM, inferior a 50 mM, inferior a 40 mM, inferior a 30 mM, inferior a 25 mM, inferior a 20 mM, inferior a 10 mM, inferior a 9 mM, inferior a 8 mM, inferior a 7.5 mM, inferior a 7 mM, inferior a 6 mM, o incluso inferior a 5 mM.

Urea

En el contexto de la presente invención se descubre asimismo que la urea no presenta un efecto beneficioso en la estabilidad del virus vaccinia (ver el ejemplo 1).

Las formulaciones líquidas según la invención así pueden preferentemente estar libres de urea.

Polímeros de alto peso molecular

Las formulaciones de virus liofilizado contienen generalmente polímeros de alto peso molecular tales como dextrano o polivinilpirrolidona (PVP), que ayudan a la formación de la torta durante la liofilización (ver los documentos EP 1418942 y WO2014/053571).

Sin embargo, esos polímeros de alto peso molecular no son útiles para la estabilización del virus vaccinia en el estado líquido y las formulaciones líquidas según la invención pueden así estar libres de esos polímeros de alto peso molecular. Si están presentes en las formulaciones líquidas según la invención, están presentes preferentemente a una concentración inferior a 10 g/L, preferentemente inferior a 7.5 g/L, inferior a 5 g/L, inferior a 2.5 g/L, o incluso inferior a 1 g/L.

En una forma de realización preferida, la formulación líquida según la invención está así libre de dextrano, PVP o más generalmente de polímeros de alto peso molecular o comprende dextrano, PVP o más generalmente polímeros de alto peso molecular a una concentración inferior a 10 g/L, preferentemente inferior a 7.5 g/L, inferior a 5 g/L, inferior a 2.5 g/L, o incluso inferior a 1 g/L.

Estabilizadores derivados de animales o humanos

Los estabilizadores derivados de animales o humanos tales como suero o gelatina han sido utilizados durante un largo tiempo para la estabilización de virus vivos (ver el documento US2007/0161085). Sin embargo, esos estabilizadores derivados de animales o humanos de origen animal o humano implican potencialmente un riesgo de salud, debido a un potencial de contaminación por agentes virales o no convencionales.

Esos estabilizadores derivados de animales o humanos no son necesarios para la estabilidad del virus vaccinia en las formulaciones líquidas según la invención, y las formulaciones líquidas según la invención están así preferentemente libres de estabilizadores derivados de animales o humanos, tales como suero o gelatina.

Formulaciones preferidas

Varios compuestos específicos que pertenecen a la familia de cada elemento esencial u opcional de las formulaciones según la invención han sido descritos anteriormente en la sección que se refiere específicamente a este elemento. En el contexto de la invención, cada listado de compuestos apropiados para un elemento particular y cada compuesto específico divulgado para un elemento particular puede combinarse con cualquier otro elemento genérico, listado de compuestos apropiados para dichos otros elementos o cualquier compuesto específico divulgado para dicho otro elemento.

En particular, las formas de realización preferidas de un elemento esencial u opcional de las formulaciones según la invención pueden combinarse con cualquier otro elemento genérico o con formas de realización preferidas de dicho otro elemento.

Las formulaciones particularmente preferidas según la invención incluyen formulaciones que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en elementos mencionados en la tabla 1 siguiente:

Tabla 1. Las formulaciones preferidas según la invención comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los elementos anteriores

Uso de un agente quelante farmacéuticamente aceptable para estabilizar un virus vaccinia contra daño por UV El virus vaccinia es particularmente sensible a daño por UV (ver LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244). Sorprendentemente, en el contexto de la presente invención se descubre que el EDTA presenta un efecto protector en los virus vaccinia contra daño por UV (ver el ejemplo 6). Así, la presente invención asimismo se refiere al uso de un agente quelante farmacéuticamente aceptable para estabilizar un poxvirus (en particular un virus vaccinia) contra daño por UV.

Para la estabilización de poxvirus (en particular virus vaccinia) contra daño por UV, el agente quelante se selecciona preferentemente de entre ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA), y ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico (DMPS), preferentemente dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable es EDTA.

Cuando se usa un agente quelante farmacéuticamente aceptable para estabilizar un poxvirus (en particular un virus vaccinia) contra daño por UV, dicho poxvirus (en particular el virus vaccinia) está preferentemente en una composición líquida y dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable (en particular los mencionados anteriormente y especialmente EDTA) está presente preferentemente a una concentración de por lo menos 50 j M, preferentemente 50 a 1000 j M, 50 a 750 j M, 50 a 5O0 j M, 50 a 400 j M, 50 a 300 j M, 50 a 25o j M, 50 a 200 j M, 50 a 150 j M; 50 a 100 j M, 50 a 75 j M, 75 a 1000 j M, 75 a 750 j M, 75 a 500 j M, 75 a 400 j M, 75 a 300 j M, 75 a 250 j M, 75 a 200 j M, 75 a 150 j M; 75 a 100 j M, 100 a 1000 j M, 100 a 750 j M, 100 a 500 j M, 100 a 400 j M, 100 a 300 j M, 100 a 250 j M, 100 a 200 j M, 100 a 150 j M; 150 a 1000 j M, 150 a 750 j M, 150 a 500 j M, 150 a 400 j M, 150 a 300 j M, 150 a 250 j M, o 150 a 200 j M.

Incluso más preferentemente, para estabilizar un poxvirus (en particular un virus vaccinia) contra daño por UV, se usa una formulación líquida según la invención (como se divulga anteriormente).

Los siguientes ejemplos pretenden únicamente ilustrar la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Cribado de los compuestos estabilizadores candidatos

Se probó el efecto de varios compuestos candidatos para estabilizar el virus de MVA en una formulación líquida a 5°C sobre la base de los compuestos conocidos de la técnica previa por presentar un efecto de estabilización de otros tipos de virus.

Materiales y métodos

Virus

Se usaron los siguientes virus de MVA:

• MVA-MUC1 (TG4010), un virus recombinante de MVA que expresa en antígeno asociado a tumor MUC1 e interleucina 2 (ver los documentos WO92/07000 y WO95/09241), que se diluyó a una concentración de 1 4 108 PFU/ml.

• MVA-HCV (TG4040), un virus recombinante MVA que expresa las proteínas HCV no estructurales (NS3, NS4 y NS5B) de la cepa de HCV de genotipo 1 b ja (ver el documento WO2004/111082), que se diluyó a una concentración diana inicial de 1-4 107 PFU/ml.

• MVA-HPV (TG4001), un virus recombinante de MVA que expresa los antígenos del papilomavirus E6 y E7 humanos e interleucina 2 (ver los documentos WO90/10459, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2007/121894), que se diluyó a una concentración diana inicial de 0.5-2 108 PFU/ml.

Los tres virus de MVA se produjeron en fibroblastos embrionarios de pollo, y se recuperaron y purificaron por un método que comprende la recuperación del cultivo de CEF infectado, la rotura de las células por medios mecánicos, y varias etapas de purificación que no implican ninguna etapa de tratamiento con una proteasa.

Asimismo se usó un virus recombinante de vacunas de la cepa Wyeth, producido en una estirpe celular continua humana y purificado por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa (VV Wyeth), a un valor diana inicial de 2108 a 2109 PFU/ml.

Formulaciones probadas

Las formulaciones probadas se representan en las tablas 2 a 11 siguientes:

• Efecto beneficioso de la presencia de una sal monovalente:

Tabla 2. Formulaciones con y sin NaCl probadas para MVA-MUC1

_____________ _____________

• Efecto beneficioso de la presencia de EDTA, EtOH o EDTA/EtOH:

_____ _____

_____ _____

Tabla 3. Primeras formulaciones con EDTA, EtOH o EDTA/EtOH probadas para MVA-HCV

_____ _____

______ ______

Tabla 4. Formulaciones adicionales con EDTA, EtOH o EDTA/EtOH probadas para MVA-HCV • Efecto beneficioso de bajas concentraciones de glutamato de Na:

Tabla 5. Formulaciones con glutamato de Na probadas para MVA-HCV

_________ _________

• Efecto beneficioso de una baja concentración de sacarosa:

Tabla 6. Formulaciones con sacarosa probadas para MVA-MUC1

__________ __________

• Sin efecto beneficioso e incluso efecto dañino del polisorbato:

o virus de MVA:

Tabla 7A. Formulaciones con o sin polisorbato probadas para MVA-HPV

_________ _________

o VV Wyeth:

Tabla 7B. Formulaciones con o sin polisorbato probadas para VV Wyeth

• Sin efecto beneficioso de MgCh:

o virus de MVA:

Tabla 8A. Formulaciones con o sin MgCh probadas para MVA-MUC1

_________ _________

o VV Wyeth:

Tabla 8B. Formulaciones con o sin MgCh probadas para VV Wyeth

• Sin efecto beneficioso de arginina.

o virus de MVA:

Tabla 9A. Formulaciones con o sin arginina probadas para MVA-MUC1

__________ __________

o VV Wyeth:

Tabla 9B. Formulaciones con o sin arginina probadas para VV Wyeth

• Sin efecto beneficioso de una mezcla de aminoácidos.

Tabla 10. Formulaciones con o sin una mezcla de aminoácidos probadas para MVA-MUC1

___________________ ___________________

• Sin efecto beneficioso de histidina:

Tabla 11. Formulaciones con o sin histidina probadas para MVA-HPV

___________________ ___________________

Análisis de estabilidad

La estabilidad se analizó a 37°C (±2°C), 25°C (±2°C), y/o 5°C (±3°C) (ver la sección de resultados).

A 37°C (±2°C) (prueba de estabilidad acelerada), las muestras se mantuvieron a humedad relativa de 75% y se analizó la estabilidad al medir las pérdidas infecciosas durante por lo menos 28 días (con mediciones intermedias a los días 7 y 14).

A 25°C (±2°C) (prueba de estabilidad acelerada), las muestras se mantuvieron a una humedad relativa de 60% y se analizó la estabilidad al medir las pérdidas infecciosas durante por lo menos 6 meses (con mediciones intermedias a aproximadamente 1 mes, y a 2 y 3 meses).

A 5°C (±3°C) (prueba de temperatura de almacenamiento diana), las muestras se mantuvieron sin ningún control de humedad relativa y se analizó la estabilidad al medir las pérdidas infecciosas durante por lo menos 24 meses (con mediciones intermedias a aproximadamente 1 mes, y a 3, 6, 12, 18 y 24 meses).

Se calcularon las pérdidas infecciosas al sustraer el número de genomas infecciosos o unidades formadoras de partículas por ml (IG/ml o PFU/ml) al tiempo de medir al número inicial de IG/ml o PFU/ml a día 0, y expresado como logaritmo decimal (log™ (IG/ml o PFU/ml)), abreviado en la presente descripción como log (IG/ml o PFU/ml). Medición de los valores infecciosos

Los valores infecciosos en un momento dado pueden medirse ya sea al medir el número de genomas infecciosos (IG) por ml (IG/ml) o usando una valoración de placa en células BHK-21 (el valor del virus infeccioso de vacunas a continuación se expresa en las unidades formadoras de placa (PFU) por ml (PFU/ml)). En la presente memoria se ha preferido el número de genomas infecciosos por ml (IG/ml), ya que este método es más rápido y más preciso. Sin embargo, aunque no se muestran datos específicos usando la valoración de placa en células BHK-21, debe apreciarse que los valores infecciosos se midieron en algunos puntos asimismo usando valoración de placa en células BHK-21 y esos resultados siempre fueron coherentes con los resultados obtenidos usando el método de genomas infecciosos.

La medición del número de genomas infecciosos por ml (IG/ml) se realiza como se expone a continuación:

• Día D: Siembra de células e infección

La muestra del virus se diluye en serie en medio de cultivo DMEM suplementado con suero fetal de ternero (FSC) al 5% en una placa de cultivo de 96 pocillos (100 pL por pocillo).

Las células BHK-21 se cosecharon en medio de cultivo (DMEM FCS al 5%) y se sembraron a una relación de 1:100 (100pL por pocillo) en la placa de 96 pocillos que contiene las diluciones virales.

A continuación se incuba la placa de cultivo a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas /- 4 horas.

• D+1 día: Lisis de células infectadas

Tras 20-28h de la infección, se desecharon los sobrenadantes y las monocapas celulares se lavaron 2 veces con PBS. Se agregaron 100 pL de amortiguador de lisis que contiene proteinasa K a cada pocillo. La placa se incubó a 56° durante por lo menos 30 minutos (hasta 420 minutos), y a continuación se calentó a 95°C por 5 minutos para inactivar la proteinasa K.

• Del día D+1 al D+30 (a -20°C): análisis de qPCR

Los lisados celulares se diluyeron 49 veces en agua y se sometieron a qPCR con cebadores específicos y sonda ajustada para dirigirse a la región de la proteína de unión a quimiocina secretada (SCBP) del genoma del virus vaccinia.

El número de genomas infecciosos de la muestra de prueba (IG/ml) se cuantificó por el método de valoración de línea paralela (PLA) usando un estándar viral calibrado en el valor infeccioso (PFU/ml) (establecido usando la valoración de unidad formadora de plaqueta estándar).

Este método puede medir genomas infecciosos (IG/ml) para cualquier valor de por lo menos 1.105 IG/ml.

La medición de los valores infecciosos usando la valoración de placa en células BHK-21 se realiza como se expone a continuación:

1. Diseminación de células

Unas células hospedadoras BHK-21 se cultivaron en monocapas en DMEM. En la confluencia, las células se lavaron con 10mL de PBS y a continuación se tripsinaron. Después de extraer la tripsina, a continuación se resuspendieron las células en 10mL de DMEM con SfV al 10% a 37°C.

A continuación, la suspensión celular se homogenizó y distribuyó en las placas de multipocillos (2mL en cada uno de los 6 pocillos de la placa). A continuación, dichas placas se incubaron a 37°C, CO2 al 5%.

2. Infección de las células

Aproximadamente 1 día después de la diseminación de las células, se agregaron alícuotas de suspensiones virales en cada pocillo que comprende las células BHK-21 de la etapa 1. Si fue necesario, primero dichas suspensiones se diluyeron en serie en PBS, cationes 100X y suero fetal de ternero (FCS) al 1%, según un método bien conocido por el experto en la materia. Dependiendo del caso, las suspensiones virales que se agregaron a las células BHK-21 de la etapa 1 fueron ya sea composiciones que contienen el virus líquido antes de la liofilización o una composición reconstituida que contiene el virus (es decir, después de la liofilización, a diferentes periodos de tiempo y temperaturas).

A continuación se extrajo el medio de cultivo y después de agitar durante 60 minutos a temperatura ambiente, se distribuyeron 2mL del medio de infección (DMEM FCS 5%) en cada pocillo. A continuación se incubaron las placas a 37°C, CO2 al 5%.

3. Fijación de células

Después de haber extraído el medio, se lavaron las células con PBS (aproximadamente 1mL por pocillo). A continuación, se agregó 1mL de una solución metanol/acetona (50/50) y la mezcla resultante se agitó ligeramente a temperatura ambiente.

A continuación las placas se dejaron secar a temperatura ambiente.

4. Determinación de detección y valor

Se realizó la determinación de valor del virus según la reacción bien conocida de peroxidasa usando anticuerpos antivacuna y anticuerpos anticonejo combinados con peroxidasa. Más precisamente, antes de la reacción se diluyeron los anticuerpos antivacuna 100 veces en PBS FCS al 2%. A continuación, se agregaron 500 ^|jL de dichos anticuerpos a cada pocillo y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 30 minutos y a continuación se lavaron 3 veces con 1mL de PBS Triton X-100 al 1%.

La reacción con anticuerpos anticonejo combinados con peroxidasa se realizó de la misma manera, con la excepción de que antes de la reacción, dichos anticuerpos se diluyeron 200 veces en PBS FCS al 2%.

Se preparó la solución de DAB al disolver un comprimido DAB comercial en 15mL de TRIS-HCL 0.05M. A continuación, se filtró la solución obtenida en una unidad de filtración NALGENE de 2 jm y la solución filtrada resultante se agregó a 15 jL de solución acuosa de H2O2 al 30%. Una vez preparado, se agregó 1 ml de la solución de DAB a cada pocillo y se dejó hasta que apareció una coloración marrón. La solución de coloración se extrajo subsecuentemente y los resultados se interpretaron visualmente.

A continuación, se calculó el valor infeccioso en PFU/ml, usando la fórmula siguiente:

[media de números de placas virales * 4] * factor de dilución = número de PFU/ml

Cada uno de estos métodos presenta una variabilidad similar, de aproximadamente ± 0.30 log-10 para una única determinación. Sin embargo, la variabilidad de ambos métodos disminuye cuando aumenta el número de determinaciones (es decir, el número de réplicas probadas). Para una determinación doble (uso de muestras por duplicado), se espera una variabilidad de ± 0.25 logm Para una determinación triple (uso de muestras por triplicado), se espera una variabilidad de ± 0.20 log-10. En todos los ejemplos, una única determinación se hizo cuando se midió el número de genomas infecciosos (IG) por ml (IG/ml), mientras la determinación de unidades formadoras de placa (PFU) por ml (PFU/ml) se realizó por triplicado.

Resultados

Necesidad de una sal monovalente

La estabilidad de MVA-MUC1 se probó en formulaciones que contienen Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, pH 8.0, y que contienen ya sea 0 mM o 50 mM de NaCl (ver la tabla 2 anteriormente).

Las pérdidas infecciosas después de 7, 14, o 28 días a 37°C se presentan en la figura 1. Aunque ninguna de las dos formulaciones probadas es muy estable, los resultados muestran claramente que la adición de NaCl 50 mM mejora significativamente la estabilidad al día 14 (pérdida de aproximadamente 1 log versus casi pérdida 2 log) y al día 28 (pérdida de aproximadamente 3 log versus más de pérdida 6 log).

Por lo tanto, la adición de NaCl a la formulación mejora significativamente la estabilidad.

Efecto beneficioso de EDTA, una baja concentración de EtOH o EDTA/EtOH

La influencia de EDTA en la estabilidad de MVA-HCV a 37°C y 5°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 7.5 ha sido probada usando varias concentraciones de EDTA (ver la tabla 3). Los resultados se presentan en la figura 2.

A 37°C (prueba de estabilidad acelerada), todas las formulaciones que contienen EDTA muestran menos de 1 log de pérdida infecciosa a 7 y 14 días, y menos que 1.5 log de pérdida infecciosa a 28 días. En contraste notable, las formulaciones sin EDTA (DS de control y DS2 de control) mostraron un perfil de estabilidad muy débil (aproximadamente 1, 2.5 y 4 log de pérdida infecciosa a 7, 14 y 28 días, respectivamente). La concentración de EDTA usada (de 50 j M a 1000 j M) no parece influir sobre el efecto de estabilización. Al día 28, las formulaciones que contienen EtOH además de EDTA parecen estar estabilizadas (ver la figura 2).

La influencia del etanol (EtOH) en la estabilidad de MVA-HCV a 37°C y 5°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 7.5 ha sido probada usando varias concentraciones de EtOH (ver la tabla 3). Los resultados se presentan en la figura 3. A 37°C (prueba de estabilidad acelerada), todas las formulaciones que contienen EtOH muestran significativamente menores pérdidas infecciosas que los controles sin EtOH a los días 7 y 14. Además, se puede observar alguna tendencia a una mayor estabilización de las menores concentraciones de EtOH. En contraste notable, las formulaciones sin EDTA (Ds de control y DS2 de control) mostraron un perfil de estabilidad muy débil (aproximadamente 1, 2.5 y 4 log de pérdida infecciosa a 7, 14 y 28 días, respectivamente). Más aún, las formulaciones que contienen EDTA además de EtOH muestran significativamente menores pérdidas infecciosas que las que contienen únicamente EtOH (ver la figura 3).

Por lo tanto, las pruebas primarias usando EDTA y EtOH muestran que ambos compuestos aumentan independientemente la estabilidad de MVA-HCV en formulaciones líquidas, el efecto de estabilización de EDTA es mayor que el efecto de estabilización de EtOH. Más aún, la combinación de ambos compuestos aumentó más la estabilidad.

Se realizaron experimentos adicionales para confirmar la estabilidad de MVA-HCV en formulaciones que contienen concentraciones variables de EDTA (50 a 250 j M) y EtOH (0.5 a 2.5%) (ver la tabla 4) a 37°C, 25°C y 5°C. Los resultados se presentan en las figuras 4A, 4B y 4C. A todas las temperaturas probadas, se observó buena estabilidad para todas las formulaciones. En particular, para todas las formulaciones que contienen EDTA y EtOH, las pérdidas infecciosas estuvieron próximas a 1 log después de 28 días a 37°C (ver la figura 4A), y las pérdidas infecciosas fueron inferiores a 0.3 después de 12 meses a 5°C. A 5°C, la mayoría de las formulaciones que contienen EDTA y EtOH muestran además pérdidas infecciosas inferiores a 0.3 log-iü después de 18 y 24 meses. En contraste, la estabilidad de las formulaciones de control DS y DS2 sin EDTA y EtOH disminuyó muy rápidamente, especialmente a 37°C y 25°C (por ejemplo aproximadamente 1 log de pérdida infecciosa a 7 días a 37°C y 28 días a 25°C).

Otra representación de los resultados obtenidos a 37°C y 5°C se presenta en la figura 4D, usando la matriz del experimento para definir el espacio del diseño de la formulación según las cantidades de EDTA y etanol, para definir las concentraciones óptimas de EDTA y EtOH, sobre la base de los resultados obtenidos tanto a 37°C (a días 7 y 28) como a 5°C (a 24 meses). En esta figura, la concentración de EDTA (j M) se representa como eje x y la concentración de EtOH (%) como eje y. Las curvas correspondientes a lo deseado de la formulación a continuación se representan en esta área de 2 dimensiones, a mayor el valor de lo deseado, mejor es la formulación.

La figura 4D muestra que las mejores formulaciones se obtienen para EDTA 50-150 j M y 0.5-1% v/v de EtOH.

Sobre la base de este análisis, se definió una formulación óptima usando EDTA 150 j M y 0.5% v/v de EtOH.

Efecto beneficioso de una baja concentración de glutamato de sodio

La influencia del glutamato de Na en la estabilidad de MVA-HCV a 37°C y 25°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 7.5 ha sido probada con o sin varias concentraciones de glutamato de Na de 0 a 10 mM (ver la tabla 5). Los resultados se presentan en las figuras 5A, 5B y 5C respectivamente.

A 37°C, las tres formulaciones que contienen por lo menos 5 mM de glutamato de Na muestran pérdidas infecciosas inferiores a 1 al día 28, mientras las dos formulaciones que contienen 0 mM o 2.5 mM de glutamato de Na presentan pérdidas infecciosas superiores a pero próximas a 1. Esto muestra que el glutamato de Na no presenta un alto efecto de estabilización, pero que una baja concentración de glutamato de Na, entre 5 y 10 mM, puede tener un efecto de estabilización menor. Además, la figura 5A sugiere que la concentración óptima sea de aproximadamente 5 mM, ya que las formulaciones con glutamato de Na a 7.5 y 10 mM presentan ligeramente menor estabilidad que la formulación con glutamato de Na a 5 mM (Figura 5A).

A 25°C, las pérdidas infecciosas a 12 meses confirman que el glutamato de Na presenta un pequeño efecto de estabilización, y que es óptima una concentración de aproximadamente 5 mM (Figura 5B).

A 5°C, las pérdidas infecciosas de 12 meses a 30 meses confirman que el glutamato de Na presenta un efecto pequeño de estabilización, y que es óptima una concentración de aproximadamente 5 mM (Figura 5C). Los resultados obtenidos a 5°C muestran pérdidas infecciosas tan pequeñas a 12 meses que es difícil de demostrar un efecto beneficioso de glutamato de Na. De hecho, la presencia en las formulaciones de otros compuestos, en particular EDTA y EtOH, pueden explicar el efecto de estabilización, y un pequeño efecto de glutamato de Na es difícil de evidenciar a esta baja temperatura. Sin embargo, esto no contradice el pequeño efecto y la concentración óptima de aproximadamente 5 mM observada a mayores temperaturas de 25 y 37 °C.

Efecto beneficioso de una baja concentración de sacarosa

La influencia de la sacarosa en la estabilidad de MVA-MUC1 a 37°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 8.0 ha sido probada con varias concentraciones de sacarosa (ver la tabla 6). Los resultados se presentan en la figura 6, y muestran que la concentración de sacarosa no impacta significativamente el nivel de estabilidad.

Sin efecto beneficioso e incluso efecto dañino del polisorbato 80 o polisorbato 40

La influencia del polisorbato 80 o polisorbato 40 en la estabilidad de MVA-HPV a 25°C y 5°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 7.5 (ver la tabla 7) ha sido probada usando varias concentraciones de polisorbato 80 o polisorbato 40 mostrado con un efecto de estabilización en otros virus (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75, patente US n° 7.456.009, SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51, documento US2007/0161085). Los resultados se presentan en las figuras 7A y 7B.

A 25°C y 5°C, ninguna concentración de polisorbato permite un aumento de estabilidad en comparación a la formulación de control sin polisorbato, de modo que no se observa un efecto de estabilización.

En contraste, a ambas temperaturas, para concentraciones de polisorbato de por lo menos 0.02% v/v, puede apreciarse un efecto desestabilizador, que aumenta con la concentración usada de polisorbato. A 5°C, incluso la concentración muy baja de 0.005 % v/v resulta en algún efecto desestabilizador.

Por lo tanto debe concluirse que el polisorbato no presenta un efecto de estabilización, y que las concentraciones de por lo menos 0.02% v/v presentan más bien un efecto de desestabilización. El polisorbato así debe preferentemente excluirse o presentarse a muy bajas concentraciones en las formulaciones líquidas de virus vaccinia.

De modo similar, la estabilidad de una cepa de virus vaccinia Wyeth producida en una estirpe celular continua humana y purificada por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa, en una formulación de control que contiene Tris-HCl 30 mM, sacarosa 10%(p/v), o en una formulación que contiene además 150 pg/ml de polisorbato 80 fue probada después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C. Los resultados se presentan en la figura 7C y asimismo muestran claramente que, para esta cepa del virus vaccinia, el polisorbato no presenta un efecto positivo en la estabilidad.

Sin efecto beneficioso e incluso efecto dañino a altas concentraciones de MgCl?

La influencia de MgCh en la estabilidad de MVA-MUC1 a 37°C durante 14 días en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 8.0 (ver la tabla 8) ha sido probada con o sin varias concentraciones de MgCl2 que muestran tener un efecto de estabilización en otros virus (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75 y la patente US n° 7.456.009). Los resultados se presentan en la figura 8 y muestran claramente que el MgCh no presenta un efecto beneficioso en la estabilidad de MVA incluso presenta efectos dañinos en la estabilidad de MVA a concentraciones de por lo menos 0.5M. MgCh debe así preferentemente excluirse o presentarse a bajas concentraciones en las formulaciones líquidas de virus vaccinia.

Esta es toda la verdad porque las formulaciones optimizadas según la invención contienen un agente quelante (en particular un agente quelante de cationes bivalentes y más preferentemente EDTA), que por lo tanto puede interferir con algún efecto beneficioso de MgCh en poxvirus, y más particularmente la estabilidad del virus vaccinia.

Evidencia adicional del efecto dañino de MgCh en formulaciones según la invención se presenta en el ejemplo 5 a continuación (ver asimismo la figura 16).

De modo similar, la estabilidad de una cepa de virus vaccinia Wyeth producida en una estirpe celular continua humana y purificada por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa, en una formulación de control que contiene Tris-HCl 30 mM, sacarosa al 10% (p/v), o en una formulación que contiene además 1000 mM (1M) MgCh se probó después de 7 o 14 días a 37°C. Los resultados se presentan en la figura 8B y muestran claramente que asimismo para esta cepa de virus vaccinia, el MgCh no presenta un efecto positivo en la estabilidad.

Sin efecto beneficioso y más bien efecto dañino de arginina

La influencia de arginina en la estabilidad de MVA-MUC1 a 37°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 8.0 (ver la tabla 9) ha sido probada con o sin varias concentraciones de arginina que muestran tener un efecto de estabilización en otros virus (ver el documento US2007/0161085). Los resultados se presentan en la figura 9 y muestran claramente que la arginina no presenta un efecto beneficioso en la estabilidad del MVA. En contraste, después de 28 días a 37°C, la presencia de arginina es más bien dañina, en particular a alta concentración.

La arginina debe así preferentemente excluirse o presentarse a muy bajas concentraciones en las formulaciones líquidas del virus vaccinia.

De modo similar, la estabilidad de una cepa de virus vaccinia Wyeth producida en una estirpe celular continua humana y purificada por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa, en una formulación de control que contiene Tris-HCl 30 mM, sacarosa al 10%(p/v), o en una formulación que contiene además arginina 50 mM fue probada después de 7, 14, 21, o 28 días a 37°C. Los resultados se presentan en la figura 9B y muestran claramente que, para esta cepa de virus vaccinia, la arginina no presenta un efecto positivo en la estabilidad.

Sin efecto beneficioso de una mezcla de aminoácidos

La influencia de una mezcla de aminoácidos en la estabilidad de MVA-MUC1 a 37°C y 25°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 8.0 (ver la tabla 10) ha sido probada con o sin dicha mezcla de aminoácidos. Los resultados se presentan en la figura 10 y muestran claramente que la presencia de una mezcla de aminoácidos no presenta un efecto significativo en la estabilidad del MVA.

Aunque una mezcla de aminoácidos puede estar presente en las formulaciones líquidas del virus vaccinia, claramente no es esencial y no requiere estar presente.

Sin efecto beneficioso y más bien efecto dañino de histidina

La influencia de histidina en la estabilidad de MVA-HPV a 25°C y 5°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, pH 7.5 ha sido probada con o sin histidina 10 mM (ver la tabla 11), una concentración que muestra tener un efecto de estabilización en otros virus (ver EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75, patente US n° 7.456.009, documento US2007/0161085, patente US n° 7.914.979, documentos WO2014/029702, WO2014/053571). Los resultados se presentan en las figuras 11A y 11B.

No se observó efecto de estabilización de histidina a 25°C o a 5°C. En contraste, puede observarse una tendencia hacia un efecto de desestabilización a ambas temperaturas.

La histidina debe así preferentemente excluirse o presentarse a muy bajas concentraciones en las formulaciones líquidas del virus vaccinia.

Conclusiones

Los resultados anteriores muestran claramente que:

• Los siguientes compuestos presentan un efecto beneficioso significativo en la estabilidad de los virus vaccinia en una formulación líquida:

o Sales monovalentes tales como NaCl.

o Disacáridos tales como sacarosa a bajos porcentajes. Esos componentes son crioprotectores y así se cree que protegen al virus vaccinia a baja temperatura de almacenamiento, tal como a aproximadamente 5°C. Además, esos compuestos aumentan la viscosidad de la formulación líquida, que pudiera limitar las interacciones entre el virus vaccinia y los compuestos potencialmente dañinos.

o El EDTA, presenta un fuerte efecto de estabilización.

o El etanol, presenta un efecto de estabilización significativo, aunque menos que el EDTA.

o Una combinación de EDTA y etanol, esta combinación proporciona un efecto de estabilización adicional en comparación a cada compuesto solo.

Uno o más de estos compuestos puede así estar presente en las formulaciones líquidas del virus vaccinia.

En particular, los resultados anteriores muestran que una formulación líquida regulada que contiene sacarosa, una sal monovalente y EDTA, y preferentemente asimismo que contiene etanol, muestra una estabilidad particularmente buena.

• Los siguientes compuestos no presentan un efecto beneficioso significativo y tampoco un efecto dañino en la estabilidad del virus vaccinia en una formulación líquida:

o Glutamato de Na. Aunque este compuesto no es esencial para la estabilidad, una baja concentración puede tener un pequeño efecto de estabilización en el MVA.

o Una mezcla de aminoácidos. Aunque este compuesto no es esencial para la estabilidad, una baja concentración puede tener un pequeño efecto de estabilización en el MVA.

Esos compuestos pueden o no estar presentes en las formulaciones según la invención.

• Los siguientes compuestos no presentan un efecto beneficioso a baja concentración y un efecto dañino a mayor concentración en la estabilidad del virus vaccinia en una formulación líquida, y así debe preferentemente estar ausente o presente a muy bajas concentraciones en formulaciones líquidas estables de virus vaccinia:

o Tensioactivos tales como polisorbato. A bajas concentraciones, no se observa un efecto. Sin embargo, a concentraciones de por lo menos 0.02% v/v, se observa un efecto de desestabilización que aumenta con la concentración de polisorbato.

o Histidina: a 10 mM, puede observarse un efecto de desestabilización débil.

o MgCh: a 0.5 o 1 M, o incluso a 75 mM (ver el ejemplo 5 siguiente), se observa un efecto de desestabilización,

o Arginina: se observa un efecto débil de desestabilización a concentraciones de por lo menos 30 mM y la desestabilización aumenta con la concentración de arginina.

Ejemplo 2: Influencia del pH en la estabilidad del virus de MVA

Se probó la influencia del pH de la formulación líquida en la estabilidad del virus vaccinia, para determinar un intervalo de pH adecuado para las formulaciones líquidas estables.

Materiales y métodos

Virus de MVA

El virus de MVA usado fue MVA-HCV (TG4040), un virus recombinante de MVA que expresa proteínas HCV no estructurales (NS3, NS4 y NS5B) de la cepa de HCV de genotipo 1 b ja (ver el documento WO2004/111082), que se diluyó a una concentración diana inicial de 4-8 107 IG/ml. El MVA-HCV se produjo en fibroblastos embrionarios de pollo (CEF), y se recuperó y purificó por un método que comprende la recuperación de cultivo de CEF infectado, la rotura de las células por medios mecánicos, y varias etapas de purificación que no implican ninguna etapa de tratamiento con una proteasa.

Formulaciones probadas

Las formulaciones probadas se representan en la tabla 12 siguiente:

Tabla 12. Formulaciones probadas con pH variable

____________________

Análisis de estabilidad

El análisis de estabilidad se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Medición de los valores infecciosos

La medición de los valores infecciosos se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Resultados

La influencia del pH en la estabilidad de MVA-HCV a 37°C y 5°C en una formulación que contiene Tris-HCl, glutamato de Na, sacarosa, NaCl, EDTA y etanol ha sido probada a varios valores de pH. Los resultados se presentan en las figuras 12A y 12B.

A 37°C (Figura 12A), ya es claro que después de 7 días es importante que el pH esté comprendido entre más de 6 y menos de 9. En particular, se obtienen buenos resultados cuando el pH está comprendido entre 7 y 8.

A 5°C asimismo (Figura 12B), los resultados a 12 meses sugieren que es mejor que el pH esté comprendido entre más de 6 y menos de 9. En particular, se obtienen buenos resultados cuando el pH está comprendido entre 7 y 8. Conclusiones

Los resultados anteriores muestran que el pH de una formulación líquida de virus vaccinia preferentemente debe estar comprendido entre más de 6 y menos de 9. En particular, se obtienen buenos resultados cuando el pH está comprendido entre 7 y 8. Un pH comprendido entre 6.5 y 8.5 puede así ser aceptable.

Ejemplo 3. Influencia del valor inicial del virus de MVA en la estabilidad

A continuación se probó asimismo la influencia del valor inicial del virus vaccinia en la estabilidad subsecuente en una formulación líquida.

Materiales y métodos

Virus de MVA

El virus de MVA usado fue MVA-HCV (TG4040), un virus de MVA recombinante que expresa proteínas HCV no estructurales (NS3, NS4 y NS5B) de la cepa HCV genotipo 1 b ja (ver el documento WO2004/111082), que se diluyó a concentraciones diana iniciales variables: 1.0- 108 PFU/ml, 5.0 107 PFU/ml, 1.0 107 PFU/ml, y 5.0 106 PFU/ml.

El MVA-HCV se produjo en fibroblastos embrionarios de pollo, y se recuperó y purificó por un método que comprende la recuperación del cultivo de CEF infectado, la rotura de las células por medios mecánicos, y varias etapas de purificación que no implican ninguna etapa de tratamiento con una proteasa.

Formulaciones probadas

Las formulaciones probadas se representan en la tabla 13 siguiente:

Tabla 13. Formulaciones probadas con valores iniciales variables de MVA

___________ ___________

Análisis de estabilidad

El análisis de estabilidad se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Medición de los valores infecciosos

Resultados

La evolución de las pérdidas infecciosas de MVA-HCV a valores iniciales variables a 37°C, 25°C y 5°C se presentan en las figuras 13A, 13B y 13C respectivamente.

A 37°C, los valores infecciosos de todas las formulaciones según la invención fueron inferiores a 1 log después de 7 días. Sin embargo, puede observarse una tendencia hacia mayor estabilidad de las formulaciones con mayor valor inicial de MVA-HCV. En el día 14, los valores infecciosos de todas las formulaciones según la invención excepto la formulación que contiene un valor inicial de MVA-HCV de 5.0106 PFU/ml fueron inferiores a 1 log, pero se observa una clara tendencia de mayor estabilidad de las formulaciones con mayor valor inicial de MVA-HCV. Esta observación se confirmó en el día 28, únicamente las formulaciones según la invención que contienen un valor inicial de MVA-HCV de 5.0 107 PFU/ml o 1.0 108 PFU/ml mostraron una pérdida infecciosa inferior a 1 log (Figura 13A).

El mismo tipo de observaciones puede hacerse a 25°C (Figura 13B). Sin embargo, la diferencia de estabilidad de las formulaciones según la invención depende del valor inicial de MVA-HCV más que distinguir dos subfamilias: las tres formulaciones con por lo menos 1.0 107 PFU/ml (que muestran menos que 1 log de pérdida de valor infeccioso a los 7 meses) y la única formulación con menos de 1.0107 PFU/ml (5.0 106 PFU/ml, que muestra más de 1 log de pérdida de valor infeccioso a los 7 meses, y ya muestra casi 1 log de pérdida de valor infeccioso a los 3 meses).

A 5°C, la diferencia de estabilidad de las formulaciones según la invención que depende del valor inicial de MVA-HCV distingue las mismas dos subfamilias como a 25°C (Figura 13C): las tres formulaciones con por lo menos 1.0 107 PFU/ml (que muestran menos que 0.2 log de pérdida de valor infeccioso a los 18 meses) y la única formulación con menos de 1.0 107 PFU/ml (5.0 106 PFU/ml, que muestra más de 0.5 log de pérdida de valor infeccioso ya a los 12 meses, y más que el límite definido de 0.3 log ya a los 2 meses).

Conclusiones

A partir de los resultados anteriores, parece que un valor inicial de por lo menos 1.0 107 PFU/ml es muy preferido para garantizar la estabilidad de una formulación líquida de MVA.

Ejemplo 4. Estabilidad de varias cepas de virus vaccinia

Para confirmar la estabilidad de las formulaciones optimizadas definidas en los ejemplos previos, esas formulaciones optimizadas se probaron en varias cepas de virus vaccinia, en dos experimentos distintos.

Materiales y métodos

Virus

Se usaron los siguientes virus vaccinia:

• Experimento 1:

o MVA-MUC1 (TG4010), virus recombinante de MVA que expresa antígeno asociado a tumor MUC1 e interleucina 2 (ver los documentos WO92/07000 y WO95/09241), que se diluyó a una concentración diana inicial de 5 a 8108 IG/ml.

o MVA-HCV (TG4040), un virus recombinante de MVA que expresa proteínas HCV no estructurales (NS3, NS4 y NS5B) de cepa HCV de genotipo 1 b ja (ver el documento WO2004/111082), que se diluyó a una concentración diana inicial de 4 a 6107 IG/ml.

o MVA-HPV (TG4001), un virus recombinante de MVA que expresa los antígenos del virus de papiloma humano e6 y E7 e interleucina 2 (ver los documentos WO90/10459, WO95/09241, WO98/04705, WO99/03885, WO2007/121894), que se diluyó a una concentración diana inicial de 2 a 3108 IG/ml. Los tres virus de MVA se produjeron en fibroblastos embrionarios de pollo, y se recuperaron y purificaron por un método que comprende la recuperación del cultivo de CEF infectado, la rotura de las células por medios mecánicos, y varias etapas de purificación que no implican ninguna etapa de tratamiento con una proteasa. •

• Experimento 2:

o MVA-HCV (TG4040), un virus recombinante de MVA que expresa proteínas HCV no estructurales (NS3, NS4 y NS5B) de cepa de HCV de genotipo 1 b ja (ver el documento WO2004/111082), producido en:

• células embrionarias de pollo (MVA-HCV/CEC) (valor diana inicial de 2.5 a 3107 IG/ml), o

• una estirpe celular embrionaria inmortalizada de pato (MVA-HCV/ estirpe celular de pato) (valor diana inicial de 3 a 4107 IG/ml),

o MVA-FCU1 (TG4023), un virus recombinante de MVA que expresa una proteína de fusión con actividad 1 de citosina desaminasa (ver el documento WO99/54481), producido en células embrionarias de pollo (MVA-FCU1/CEC) (valor diana inicial de 1 a 1.5108 IG/ml),

o Copenhagen-FCU1 (TG6002), una cepa recombinante de virus vaccinia Copenhagen, que expresa una proteína de fusión FCU1 con actividad de citosina desaminasa y que comprende un gen defectuoso I4L y un gen defectuoso J2R (ver los documentos WO2009/065546 y WO2009/065547) producido en células embrionarias de pollo (Copenhagen-FCU1/CEC) (valor diana inicial de 2 a 3.0 108 IG/ml). Los métodos usados para la producción/purificación de los virus MVA-HCV/CEC, MVA-HCV/ estirpe celular de pato, MVA-FCU1/CEC, y Copenhagen-FCU1/CEC no comprendió ninguna etapa con adición de una enzima de proteasa.

• Experimento 3:

o Asimismo se usó un virus recombinante de vacunas de la cepa Wyeth, producido en una estirpe celular continua humana y purificado por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa (VV Wyeth), a un valor diana inicial de 5 a 8108 PFU/ml.

Formulaciones probadas

Experimento 1:

Las formulaciones probadas para los virus de MVA se representan en la tabla 14 siguiente:

Tabla 14. Formulaciones probadas para 3 virus MVA.* pH 7.5 para MVA-HPV y pH 8.0 para MVA-HCV y MVA-

MUC1

___________ ___________

Experimento 2:

Las formulaciones probadas para los virus MVA-HCV/CEC, MVA-HCV/estirpe celular de pato, MVA-FCU1/CEC, y Copenhagen-FCU1/CEC se representan en la tabla 15A siguiente:

Tabla 15A. Formulaciones probadas para los virus MVA-HCV/CEC, MVA-HCV/estirpe celular, MVA-FCU1/CEC, y Copenhagen-FCU1/CEC

___________ ___________

Experimento 3:

Las formulaciones probadas para el virus VV Wyeth se representan en la tabla 15B siguiente:

Tabla 15B. Formulaciones probadas para el virus de VV Wyeth

___________ ___________

Análisis de estabilidad

El análisis de estabilidad se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Medición de los valores infecciosos

Resultados

Experimento 1:

La estabilidad de los tres virus de MVA en la formulación optimizada de la invención a 37°C, 25°C y 5°C se presenta en las figuras 14A, 14B y 14C respectivamente.

A 37°C, los tres vectores de MVA mostraron menos que 1 log de pérdida de valor infeccioso al día 28, mostrando así muy buena estabilidad a esta temperatura elevada.

A 25°C, los tres vectores de MVA asimismo mostraron menos de 1 log de pérdida de valor infeccioso a los 6 meses, mostrando así asimismo muy buena estabilidad a esta temperatura.

Finalmente, los tres vectores de MVA asimismo mostraron menos de 0.3 log de pérdida de valor infeccioso después de 30 meses a 5°C, mostrando así muy alta estabilidad a esta temperatura de almacenamiento dirigida. Aunque pueden observarse variaciones menores dependiendo del vector de MVA usado, los resultados anteriores muestran claramente que la formulación optimizada diseñada en los ejemplos anteriores aplica a cualquier vector de MVA, sin importar que son las secuencias heterogéneas insertadas en él.

Experimento 2:

En este segundo experimento, la misma formulación optimizada anteriormente para MVA se probó en muchos virus de MVA obtenidos por varios métodos, y en otra cepa de virus vaccinia: Copenhagen (vector TG6002). Los resultados se presentan en la figura 15A, y muestran que la formulación probada según la invención, que se optimizó en virus de MVA, asimismo permite la estabilización de otras cepas de virus vaccinia, tales como Copenhagen. En particular, se observa menos de 1 log de pérdida al día 14 para todos los virus probados.

El virus menos estabilizado es MVA-HCV/CEC. Esto puede explicarse por el hecho de que este virus es el virus usado al valor inicial más bajo.

Experimento 3:

En este tercer experimento, la misma formulación anteriormente optimizada para MVA se probó en otra cepa de virus vaccinia (cepa Wyeth), que se produjo en una estirpe celular continua humana y se purificó por un método que implica por lo menos una etapa de tratamiento con por lo menos una proteasa.

Los resultados se presentan en la figura 15B, y muestran que la formulación probada según la invención, que fue optimizada en los virus de MVA, asimismo permitir la estabilización de la cepa del virus de vacuna Wyeth, a pesar de la presencia residual de alguna proteasa en el entorno del virus. En particular, se observa menos de 1 log de pérdida al día 28.

Asimismo debe apreciarse que, en el contexto de un entorno de virus que puede contener alguna proteasa residual, aumentar la sal monovalente (NaCl) de 200 a 500 mM aumenta más la estabilidad del virus.

Conclusiones

Los resultados anteriores demuestran claramente que las formulaciones optimizadas diseñadas en el contexto de la presente invención se aplican a varias cepas de virus vaccinia, y que las construcciones heterogéneas que pueden insertarse en esos virus no influyen significativamente en la estabilización proporcionada por las formulaciones optimizadas según la invención.

Los resultados anteriores asimismo muestran que las formulaciones optimizadas diseñadas por los inventores son aplicables incluso cuando el procedimiento de purificación implica el tratamiento con por lo menos una proteasa y por lo tanto cuando el entorno del virus puede contener proteasa residual. En este caso particular, el aumento de la concentración de la sal monovalente de la formulación sobre 200 mM mejora más la estabilidad.

Ejemplo 5. Sustitución de los compuestos preferidos por los compuestos de la misma fam ilia o de otras familias

Para confirmar si los compuestos individuales probados anteriormente pueden reemplazarse por otros compuestos de la misma familia de o otras familias, se realizó un experimento, en el que cada uno de los compuestos individuales probados anteriormente de una formulación optimizada se reemplazó por un compuesto de la misma familia o de otras familias:

• Amortiguador: el amortiguador Tris-HCl probado anteriormente se reemplazó por amortiguador de Tricina o HEPES a la misma concentración de 2o mM. Ambos amortiguadores de repuesto asimismo presentan capacidad amortiguadora entre pH 7 y pH 8.

• Sal: la sal monovalente de NaCl probada anteriormente se reemplazó ya sea por otra sal monovalente (KCl) o por una sal bivalente (MgCh) a la misma concentración de 75 mM.

• Disacárido o alcohol de azúcar: el disacárido sacarosa probado anteriormente se reemplazó ya sea por otro disacárido (trehalosa) o por un alcohol de azúcar (manitol) a la misma concentración de 10% p/v.

• Agente quelante: el agente quelante EDTA probado anteriormente se reemplazó por EGTA o DTPA, dos distintos agentes quelantes, a la misma concentración de 150 pM.

• Alcohol de C2-C3: el alcohol de C2-C3 etanol probado anteriormente se reemplazó por isopropanol, a la misma concentración de 0.5%.

Materiales y métodos

Virus

El virus de MVA usado fue MVA-MUC1 (TG4010), un virus de MVA recombinante que expresa el antígeno asociado a tumor MUC1 e interleucina 2 (ver los documentos WO92/07000 y WO95/09241), diluido a un valor diana inicial entre 8.0 107y 2 108 IG/ml.

El MVA-MUC1 se produjo en fibroblastos embrionarios de pollo, y se recuperó y purificó por un método que comprende la recuperación de cultivo de CFE infectado, rotura de células por medios mecánicos, y varias etapas de purificación que no implican ninguna etapa de tratamiento con una proteasa.

Formulaciones probadas

Las formulaciones probadas se representan en la tabla 16 siguiente:

Tabla 16. Formulaciones probadas para MVA-MUC1

Análisis de estabilidad

El análisis de estabilidad se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Medición de los valores infecciosos

Resultados

Las pérdidas infecciosas de las varias formulaciones probadas a 37°C se representan en la figura 16A.

La significancia estadística de reemplazar los compuestos probados inicialmente por uno de los otros compuestos mencionados anteriormente se analizó usando el software NemrodW® después de 21 (Figura 16B) o 28 (Figura 16C) días a 37°C. Los resultados muestran que:

Amortiguador: al día 21, reemplazar el amortiguador Tris-HCl por Tricina o HEPES no influye significativamente en la estabilidad del virus de m Va , aunque parece que el Tris-HCl es ligeramente mejor para estabilizar el MVA-MUC1. Al día 28, el reemplazo del Tris-HCl por Tricina no influye significativamente en la estabilidad del virus de MVA, aunque parece que el Tris-HCl es ligeramente mejor, y el amortiguador de HEPES es menos eficaz que Tris-HCl y Tricina.

Sal: reemplazar el NaCl por KCl no influye significativamente en la estabilidad del virus de MVA, después de 21 o 28 días. En contraste, reemplazar NaCl o KCl by MgCh presenta un efecto dañino significativo en la estabilidad del MVA, tanto al día 21 como al día 28, confirmando además que el MgCh puede ser dañino a concentraciones tan bajas como 75 mM.

Disacárido o alcohol de azúcar: reemplazar la sacarosa por manitol no impacta significativamente la estabilidad del virus de MVA. Cuando se reemplaza sacarosa por trehalosa, se aprecia un pequeño efecto hacia la mejora de la estabilidad del MVA a los días 21 y 28.

Agente quelante: reemplazar el EDTA por DTPA o EGTA no influye significativamente en la estabilidad del virus de MVA a los días 21 y 28.

Alcohol de C2-C3: reemplazar etanol (EtOH) por isopropanol no influye significativamente en la estabilidad del virus de MVA a los días 21 y 28.

Las pérdidas infecciosas de las varias formulaciones probadas a 5°C se representan en la figura 16D. Los resultados muestran que, al día 180, todas las formulaciones probadas muestran muy bajas pérdidas infecciosas, todas siendo inferiores a 0.3 log-10.

Conclusiones

Los resultados anteriores demuestran claramente que, en una formulación optimizada según la invención, los compuestos probados inicialmente pueden reemplazarse por otros compuestos de la misma familia (Tris-HCl por otro amortiguador con capacidad amortiguadora entre pH 7 y 8, NaCl por otra sal monovalente, sacarosa por otro disacárido o un alcohol de azúcar, EDTA por otro agente quelante, EtOH por otro alcohol de C2-C3), sin alterar significativamente la estabilidad del virus vaccinia.

En contraste, el NaCl u otra sal monovalente no debe reemplazarse por una sal divalente, confirmando así los resultados previos que muestran efectos dañinos de las sales bivalentes cuando están presentes a una concentración significativa (75 mM).

Ejemplo 6. Propiedades inmunizantes in vivo de una formulación líquida estable de MVA según la invención Se verifica además si una formulación líquida estabilizada de MVA según la invención presenta inmunogenicidad similar in vivo después de 12 meses de almacenamiento que una formulación de MVA recién obtenida.

Materiales y métodos

Virus de MVA

El virus de MVA usado fue MVA-MUC1 (TG4010), un virus de MVA recombinante que expresa el antígeno asociado a tumor MUC1 e interleucina 2 (ver los documentos WO92/07000 y WO95/09241), diluido a un valor diana inicial de 1 a 3108 PFU/ml

Formulación probada y almacenamiento

El MVA-MUC1 se formuló en una formulación líquida que contiene Tris-HCl 20 mM, sacarosa al 10% p/v, NaCl 75 mM, EDTA 150 ^|jM, EtOH 0.5% v/v, y glutamato de Na 5 mM.

Para la prueba de inmunogenicidad, se usó cualquiera de un MVA recién formulado almacenado a -80°C (T=0), o un MVA formulado almacenado durante 12 meses a 5°C ± 3°C (T=12 meses).

Prueba de inmunogenicidad

El modelo usado es un modelo profiláctico, en el que el vector de MVA-MUC1 se inyecta a ratones antes de la administración posterior de células tumorales que expresan el antígeno MUC1. A continuación se proporcionan detalles adicionales:

1er Experimento:

• Ratones: Se usaron ratones C57BL/6. Cada grupo estuvo compuesto de 20 animales:

o Los grupos 1: sólo formulación,

o Grupo 2-4: MVA-MUC1 T=0 (104,105, o 106 PFU),

o Grupo 5-7: MVA-MUC1 T=12 meses (104,105, o 106 PFU).

• Administración de productos que van a ser probados: cada producto se inyectó subcutáneamente tres veces en un intervalo de una semana (D0/D7/D14) para cada condición (T=0/T=12 meses). Para cada producto, se probaron tres dosis (104,105, o 106 PFU). Además, como un control negativo, se administró la formulación sola (sin ningún virus de MVA-MUC1) con el mismo protocolo.

• Administración de células tumorales: una semana después de la última inyección de virus/formulación, es decir, al día 21 (D21), las células RMA-MUC1 se inyectaron subcutáneamente.

• Se vigiló la supervivencia de los ratones, la presencia y tamaño del tumor, hasta el día 107 (D107) o hasta que el volumen del tumor fue 2000 mm3, en cuyo momento se sacrificaron los ratones).

2° Experimento:

Se usó el mismo modelo para comparar la inmunogenicidad de la formulación sola o MVA-MUC1 en la formulación a T=0 y T=24 meses, para una dosis de 104 PFU.

Resultados

1er Experimento:

La tabla 17A a continuación presenta el porcentaje de los ratones que estuvieron libres de tumor al día 86, dependiendo del producto (formulación sola o MVA-MUC1 después de 0 o 12 meses de almacenamiento) y la dosis inyectada.

Tabla 17A. Porcentaje de ratones que estuvieron libres de tumor al día 86 dependiendo del producto (formulación o MVA-MUC1 después de 0 o 12 meses de almacenamiento) y dosis inyectada

Los resultados anteriores muestran que:

• La formulación líquida probada no, como tal, induce una respuesta inmunitaria que proteja a los ratones contra las células tumorales RMA-MUC1, y

• Almacenamiento por 12 meses a 5°C ± 3°C de MVA-MUC1 en la formulación probada no afecta significativamente la capacidad de MVA-MUC1 de inducir una respuesta inmunitaria protectora de ratones contra las células tumorales de RMA-MUC1.

2° experimento:

La tabla 17B a continuación presenta el porcentaje de ratones que estuvieron libres de tumor al día 65, dependiendo del producto (formulación sola o MVA-MUC1 después de 0 o 24 meses de almacenamiento).

Tabla 17B. Porcentaje de ratones que estuvieron libres de tumor al día 65, dependiendo del producto (formulación sola o MVA-MUC1 después de 0 o 24 meses de almacenamiento)

Los resultados anteriores muestran que:

• Las formulaciones probadas líquidas no, como tal, inducen una respuesta inmunitaria protectora de ratones contra el desafío de células tumorales RMA-MUC1, y

• Almacenamiento durante 24 meses a 5°C ± 3°C de MVA-MUC1 en las formulaciones probadas no afecta significativamente la capacidad de MVA-MUC1 de inducir una respuesta inmunitaria protectora de ratones contra el desafío de las células tumorales de RMA-MUC1.

Conclusión

Los datos anteriores confirman que las formulaciones optimizadas según la invención no mantienen únicamente los valores del virus infeccioso durante almacenamiento durante dos años, y asimismo mantienen la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria protectora in vivo.

Ejemplo 7. Efecto protector del EDTA contra daño por UV

El virus vaccinia es particularmente sensible a daño por UV (ver LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244). La capacidad de varias formulaciones para proteger al virus vaccinia contra daño por UV se probó en dos experimentos independientes.

Materiales y métodos

Virus de MVA

El virus de MVA usado fue MVA-HCV (TG4040), un virus recombinante de MVA que expresa proteínas HCV no estructurales (NS3, NS4 y NS5B) de cepa de HCV de genotipo 1 b ja (ver el documento WO2004/111082), que se diluyó a un valor diana inicial de entre 5107 y 7107 IG/ml para el experimento 1 y entre 3108 y 5108 IG/ml para el experimento 2.

Formulaciones probadas

Las formulaciones probadas para MVA-HCV en el experimento 1 se representan en la tabla 18 siguiente:

Tabla 18. Formulaciones probadas para MVA-HCV en condiciones de luz variable (experimento 1)

_____________ _____________

Las formulaciones probadas para MVA-HCV en el experimento 2 se representan en la tabla 19 siguiente:

Tabla 19. Formulaciones probadas para MVA-HCV en condiciones de luz ICH (experimento 2)

___________ ___________

Condiciones de luz

Las muestras se almacenaron en las siguientes condiciones de luz:

• Sin luz,

• Bajo PSM (cualquier fuente de luz que esté diseñada para producir una descarga similar a la emisión estándar de D65/ID65 tal como una lámpara fluorescente de luz del día artificial que combina descargas visible y ultravioleta (UV), xenón, o lámpara de haluro de metal. El D65 es el estándar reconocido internacionalmente para la luz del día al exterior según se define en ISO 10977 (1993). ID65 es la luz del día indirecta de interiores estándar. Para una fuente de luz que emite una radiación significativa debajo de 320 nm, puede ajustarse un(os) filtro(s) apropiado(s) para eliminar esa radiación) a temperatura ambiente, o

• Bajo luz ICH (una lámpara fluorescente próxima a UV presenta una distribución espectral de 320 nm a 400 nm con una emisión máxima de energía entre 350 nm y 370 nm; una proporción significativa de UV debe estar en ambas bandas de 320 a 360 nm y 360 a 400 nm. Ver la prueba de fotoestabilidad de ICH Q1B de nuevas sustancias y productos farmacológicos)

Análisis de estabilidad

La estabilidad se analizó a 25°C (±2°C) durante 28 días.

Las pérdidas infecciosas se calcularon al sustraer el número de genomas infecciosos por ml (IG/ml) al momento de la medición al número inicial de IG/ml a día 0, y se expresaron como logaritmo decimal (log™ (IG/ml)), abreviado en la presente descripción como log (IG/ml).

Medición de los valores infecciosos

Resultados

Los resultados se presentan en las figuras 17A y 17B para los experimentos 1 y 2, respectivamente. En la figura 17A, se probó el efecto de varias condiciones de luz (sin luz, PSM, o ICH) en la estabilidad de una formulación de control y una optimizada según la invención. Para todas las formulaciones, las condiciones de luz ICH resultaron en una desestabilización significativa, que no es sorprendente conociendo la sensibilidad de la luz del virus vaccinia y las condiciones de iluminación muy fuertes de ICH. Sin embargo, a pesar de la desestabilización de todas las formulaciones, resulta evidente a partir de la figura 17A que usar una formulación líquida según la invención da como resultado una disminución de la desestabilización de MVA-HCV (ver las pérdidas infecciosas a los días 2, 3 y 7 especialmente). Ha sido apreciado que bajo estas condiciones drásticas de luz, se amplificaron las pérdidas del valor infeccioso observadas con el control de la formulación, alcanzando 1 log al día 2.

Además, en el caso de las condiciones de luz más razonables (condiciones de PSM), usando una formulación líquida según la invención asimismo da como resultado una disminución significativamente disminuida de MVA-HCV, las pérdidas infecciosas después de 28 días a 25°C son menores en gran medida que 0.5 log mientras que exceden 1 log después de 21 días a 25°C con la formulación de control.

En la figura 17B, se probó el efecto de estabilización bajo condiciones de luz ICH de varias formulaciones. Como en la figura 17A, una formulación optimizada que contiene Tris-HCl, NaCl, glutamato de Na, sacarosa, EDTA y EtOH mejora la estabilidad bajo las condiciones de luz de ICH, mejor que una formulación de control sin EDTA y EtOH. Además, la figura 17B muestra que el efecto de estabilización es debido a EDTA, ya que una formulación con EDTA pero sin EtOH presenta un efecto de estabilización similar, mientras una formulación con EtOH pero sin EDTA no es mejor que la formulación de control.

Conclusiones

Los resultados anteriores muestran claramente que las formulaciones según la invención no únicamente estabilizan los virus vaccinia en la ausencia de luz, sino asimismo protegen además al virus vaccinia contra la degradación debido a daño por UV. Esto puede ser muy útil para limitar las restricciones en el almacenamiento del virus vaccinia en una formulación líquida.

Ejemplo 8. Efecto de estabilización robusta de las formulaciones reclamadas a concentraciones variables de ingredientes

Para una prueba de la robustez del efecto de estabilización de las formulaciones según la invención, varias formulaciones que contienen concentraciones variables de los distintos ingredientes han sido probadas por su capacidad de estabilizar un vector MVA.

Materiales y métodos

Virus

Se usó el virus MVA como el MVA-MUC1 (TG4010), un virus recombinante de MVA que expresa en antígeno asociado a tumor MUC1 e interleucina 2 (ver los documentos WO92/07000 y WO95/09241), que se diluyó a un valor diana inicial de 1 a 4108 PFU/ml.

Formulaciones probadas

Las formulaciones probadas se representan en la tabla 20 siguiente:

Tabla 20. Formulaciones probadas para MVA-MUC1

________________ ________________

Análisis de estabilidad

El análisis de estabilidad se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Medición de los valores infecciosos

Resultados

Las pérdidas infecciosas de las varias formulaciones probadas a 37°C se representan en la figura 18.

Al día 21 después de la formulación, todas las formulaciones probadas tuvieron pérdidas infecciosas inferiores a 1 log-10. En el día 28, la mayoría de las formulaciones probadas asimismo tuvo pérdidas infecciosas inferiores a 1 log-10.

Conclusión

Los datos anteriores confirman que las formulaciones optimizadas según la invención presentan un efecto de estabilización robusto sobre un intervalo de concentraciones de ingredientes contenidos en la formulación. Ejemplo 9. Efecto de estabilización de las formulaciones reivindicadas en otro tipo de poxvirus Materiales y métodos

Virus

Un virus no recombinante de pseudoviruela de ganado (familia de parapoxvirus) se usó a un valor diana inicial de 1 a 3108 PFU/ml.

Formulaciones probadas

Las formulaciones probadas se representan en la tabla 21 siguiente:

Tabla 21. Formulaciones probadas para virus de pseudoviruela de ganado

____________ ____________

Análisis de estabilidad

El análisis de estabilidad se realizó como se describió en el ejemplo 1 a 37°C.

Medición de los valores infecciosos

Resultados

Los resultados se presentan en la figura 19, y muestran que la formulación probada según la invención estabiliza en gran medida al virus de pseudoviruela de ganado. En particular, aunque las pérdidas infecciosas después de 28 días a 37°C están sobre 2.5 log-10 para el virus de pseudoviruela de ganado de control en Tris y sacarosa únicamente, las pérdidas infecciosas después de 28 días a 37°C son solo aproximadamente 0.5 log-io para el virus formulado de pseudoviruela de ganado.

Conclusión

Los resultados anteriores muestran claramente que las formulaciones según la invención asimismo son adecuadas para estabilizar el virus de pseudoviruela de ganado, un poxvirus de la familia parapoxvirus.

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WO2014/009433,

WO2014/009438,

WO2014/029702,

WO2014/053571

Claims

REIVINDICACIONES

1. Formulación líquida que comprende:

a) un poxvirus, en particular un virus vaccinia,

b) un amortiguador farmacéuticamente aceptable,

c) una sal monovalente,

d) un disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable, y

e) un agente quelante farmacéuticamente aceptable,

en la que el pH de la formulación está comprendido entre 6.5 y 8.5.

2. Formulación líquida según la reivindicación 1, en la que dicha formulación líquida:

a) está libre de un tensioactivo o comprende un tensioactivo a una concentración inferior a 0.005% (p/v); b) está libre de sales bivalentes o comprende sales bivalentes a una concentración inferior a 1 mM;

c) está libre de histidina o comprende histidina a una concentración inferior a 5 mM; y/o

d) está libre de arginina y metionina o comprende arginina a una concentración inferior a 300 mM y/o metionina a una concentración inferior a 60 mM.

3. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en la que dicho poxvirus:

a) está presente a un valor de por lo menos 107 PFU/ml, y/o

b) está por lo menos semipurificado, comprendiendo menos de 500 pg/dosis de proteínas de célula hospedadora y menos de 10 png/dosis de ADN de célula hospedadora.

4. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho amortiguador farmacéuticamente aceptable presenta una capacidad amortiguadora entre pH 7 y pH 8 y:

a) está presente en una concentración de 10 a 50 mM; y/o

b) se selecciona de entre TRIS-HCl, TRIS, HEPES, amortiguador de fosfato que comprende una mezcla de Na2HPO4 y KH2PO4 o una mezcla de Na2HPO4 y NaH2PO4, amortiguadores ACES, PIPES, MOPSO, BIS-Tris-propano, BES, MOPS, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, y tricina, preferentemente dicho amortiguador farmacéuticamente aceptable con capacidad amortiguador entre pH 7 y pH 8 es amortiguador de TRIS-HCl.

5. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha sal monovalente: a) está presente en una concentración de 10 a 1000 mM; y/o

b) se selecciona de entre NaCl y KCl, preferentemente dicha sal monovalente es NaCl.

6. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable:

a) está presente en una concentración de 5 a 20% (p/v), preferentemente de 5 a 15% (p/v) y más preferentemente aproximadamente 10% (p/v); y/o

b) se selecciona de entre sacarosa, trehalosa, maltosa, lactosa, manitol y sorbitol, preferentemente dicho disacárido o alcohol de azúcar farmacéuticamente aceptable es la sacarosa.

7. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable:

a) está presente en una concentración de por lo menos 50 pM, preferentemente entre 50 y 250 pM; y/o b) se selecciona de entre ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), ácido etilenglicoltetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico (DMPS), preferentemente dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable es EDTA.

8. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además un alcohol de C2 C3 en una concentración de 0.05 a 5% (v/v), preferentemente 0.1 a 2% (v/v), más preferentemente aproximadamente 0.5% (v/v).

9. Formulación líquida según la reivindicación 8, en la que dicho alcohol de C2-C3 se selecciona de entre etanol e isopropanol, preferentemente dicho alcohol de C2-C3 es etanol.

10. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además glutamato de sodio en una concentración inferior a 10 mM, preferentemente en una concentración de 2.5 a 7.5 mM, más preferentemente de aproximadamente 5 mM.

11. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que:

a) la pérdida de valor de poxvirus infeccioso en dicha formulación líquida es inferior a 1 log-10 de virus infeccioso durante el almacenamiento durante por lo menos 1 semana a 37°C; y/o

b) la pérdida de valor de poxvirus infeccioso en dicha formulación líquida es inferior a 0.3 log-10 de virus infeccioso durante el almacenamiento durante por lo menos 12 meses a 5°C.

12. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho poxvirus es un ortopoxvirus o un parapoxvirus, preferentemente dicho poxvirus es un virus vaccinia y se selecciona preferentemente de entre cepas modificadas de virus vaccinia Ankara (MVA), Wyeth y Copenhagen.

13. Formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho virus vaccinia es un virus vaccinia recombinante que comprende por lo menos una secuencia exógena seleccionada de entre:

• una secuencia exógena que codifica una molécula que presenta una función directa o indirectamente citotóxica, en particular un gen suicida tal como un gen de citosina desaminasa (CDasa),

• una secuencia exógena que codifica un antígeno asociado a tumor (TAA), en particular MUC1, y opcionalmente una citocina, en particular interleucina 2 (IL-2),

• una secuencia exógena que codifica un antígeno viral, en particular un antígeno de papilomavirus humano, un antígeno de hepatitis B, un antígeno de hepatitis C, y

• una secuencia exógena que codifica un antígeno bacteriano, en particular un antígeno de micobacteria.

14. Utilización de un agente quelante farmacéuticamente aceptable para estabilizar un poxvirus contra daño por UV.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable a) se selecciona de entre ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), ácido etilenglicoltetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico (DMPS), preferentemente dicho agente quelante farmacéuticamente aceptable es EDTA; y/o

b) está presente en una concentración de por lo menos 50 pM, preferentemente entre 50 y 250 pM.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15, en la que dicho poxvirus está en una composición líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.