ES2755934T3 - Método para detectar ácido nucleico diana - Google Patents
Método para detectar ácido nucleico diana Download PDFInfo
- Publication number
- ES2755934T3 ES2755934T3 ES12845733T ES12845733T ES2755934T3 ES 2755934 T3 ES2755934 T3 ES 2755934T3 ES 12845733 T ES12845733 T ES 12845733T ES 12845733 T ES12845733 T ES 12845733T ES 2755934 T3 ES2755934 T3 ES 2755934T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- labeled
- probe
- fluorophore
- quencher
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 242
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 230
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 230
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 430
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 194
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 189
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 40
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 56
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 29
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 248
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 161
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 161
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 130
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 109
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 108
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 36
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 18
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 101100129629 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) mrtA gene Proteins 0.000 description 4
- 101100292591 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) mtrA1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 101150075316 folE gene Proteins 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150069500 mtrA gene Proteins 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- -1 saliva Substances 0.000 description 3
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 241001424309 Arita Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101100131749 Neisseria gonorrhoeae mtrA gene Proteins 0.000 description 2
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- XUQUNBOKLNVMMK-UHFFFAOYSA-N [5-[6-[2-cyanoethoxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxyhexylcarbamoyl]-6'-(2,2-dimethylpropanoyloxy)-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound C12=CC=C(OC(=O)C(C)(C)C)C=C2OC2=CC(OC(=O)C(C)(C)C)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)NCCCCCCOP(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N)=CC=C21 XUQUNBOKLNVMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037801 influenza A (H1N1) Diseases 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 239000000891 luminescent agent Substances 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUDSCJBUWTYENI-VPCXQMTMSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methyloxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1=CC(N)=NC(=O)N1[C@]1(C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O YUDSCJBUWTYENI-VPCXQMTMSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 108010017898 Shiga Toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005621 tetraalkylammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N trimethylamine N-oxide Chemical compound C[N+](C)(C)[O-] UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
Un método para detectar uno o más ácidos nucleicos diana presentes en una muestra, que comprende las siguientes etapas: (1) agregar un cebador o sonda marcada con fluoróforo y una sonda marcada con un desactivador a la muestra, o agregar la muestra a un cebador o sonda marcada con fluoróforo y una sonda marcada con un desactivador, en donde el cebador o sonda marcada con fluoróforo es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con un ácido nucleico diana, y la sonda marcada con desactivador es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador o sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador o sonda marcada con fluoróforo; (2) incubar la muestra a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (TF) del cebador o sonda marcada con fluoróforo y superior a la temperatura de fusión (TF) de la sonda marcada con desactivador en la que se amplifica el ácido nucleico diana en condiciones isotérmicas por amplificación isotérmica de ácidos nucleicos iniciada por cebadores quiméricos (ICAN), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por círculo rodante (RCA), proceso de amplificación inteligente versión 2 (SMAP2) o amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP); (3) hibridar el cebador o sonda marcado con fluoróforo que no está con el ácido nucleico diana, con la sonda marcada con desactivador incubando la muestra a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, desactivando de este modo con el desactivador la fluorescencia emitida por el cebador o sonda marcada con fluoróforo que no ha hibridado con el ácido nucleico diana; y (4) medir la fluorescencia del cebador o sonda marcado con fluoróforo unido al ácido nucleico diana, mientras que la muestra se mantiene a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, en donde solo se pueden detectar los marcadores fluorescentes en el cebador o sonda marcado con fluoróforo unido con éxito al ácido nucleico diana.
Description
DESCRIPCIÓN
Método para detectar ácido nucleico diana
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para detectar un ácido nucleico diana y un kit para su uso en la detección.
Antecedentes de la técnica
Los métodos para detectar un ácido nucleico diana utilizando la complementariedad de las secuencias de ácido nucleico se han mejorado o modificado de forma diversa desde la hibridación Southern tradicional hasta la fecha actual. En particular, el establecimiento de métodos de amplificación in vitro ha permitido detectar cantidades mucho más pequeñas del ácido nucleico diana.
Como métodos para detectar ácidos nucleicos diana se han desarrollado métodos de detección que usan sondas unidas a marcadores (por ejemplo, radioisótopos (RI), agentes luminiscentes o fluoróforos) que comprenden ácidos nucleicos que tienen complementariedad con ácidos nucleicos diana. La detección de elementos múltiples se puede lograr marcando con una pluralidad de RI que difieren en la energía liberada o marcando con una pluralidad de agentes luminiscentes (o fluoróforos) que difieren en la longitud de onda de la luz emitida. Además, los métodos para determinar los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) también se han establecido como métodos de sonda de desactivación (sonda Q, del inglés quenching) (referencia de patentes 1).
Por otro lado, los métodos para detectar ácidos nucleicos diana utilizando la complementariedad de secuencias de ácido nucleico, como los llamados microplacas o micromatrices de ADN, que han permitido detectar las cantidades de una pluralidad de ácidos nucleicos diana, también se han puesto en práctica marcando ácidos nucleicos diana con radioisótopos o similares e hibridando los ácidos nucleicos diana marcados con sondas de oligonucleótidos (que tienen complementariedad con el ácido nucleico diana) inmovilizadas en una superficie en fase sólida (referencia de patente 2).
Los ejemplos de los métodos de amplificación de ácido nucleico incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (referencias de patente 3 y 4), la amplificación de desplazamiento de cadena (SDA) (referencia de patente 5), la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) (referencia de patente 6), la amplificación de círculo rodante (RCA) (referencia no de patente 1) y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) (referencia de patente 7). Estos métodos de amplificación de ácido nucleico también proporcionan la detección de ácidos nucleicos diana.
Existe otro método de amplificación de ácido nucleico usando ligasa, tal como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (referencia de patente 8).
En el momento, la PCR se usa con frecuencia como método de amplificación de ácido nucleico. El método de PCR amplifica los ácidos nucleicos diana de manera exponencial mediante el uso de polimerasa termoestable y dos cebadores que tienen complementariedad con cada ácido nucleico diana y que realiza tres etapas repetitivamente con temperaturas controladas: (1) desnaturalización de ácidos nucleicos diana bicatenarios, (2) hibridación de los cebadores con los ácidos nucleicos diana desnaturalizados, y (3) reacción de extensión de los cebadores. Después de la reacción, los productos de amplificación se someten a electroforesis, y la presencia o ausencia del producto de amplificación de interés se puede detectar mediante el uso de un intercalador como el bromuro de etidio (EtBr) o verde SYBR(R). En otro método, el producto de amplificación se detecta mediante el uso de bases de nucleótidos unidas a fluoróforo en la reacción de extensión.
Los métodos alternativos establecidos implican detectar cuantitativamente la amplificación de los ácidos nucleicos diana mediante el uso de un fluoróforo y un desactivador (referencia de Patente 9). De manera específica, una sonda de oligonucleótidos tipificada por la sonda TaqMan(R), a la que se unen adyacentes un fluoróforo y un desactivador, se añade para la reacción de amplificación por PCR para realizar la reacción de PCR. En la etapa (2) de la PCR, la sonda también se hibrida con el ácido nucleico diana. Junto con la reacción de extensión de la etapa (3), la sonda se degrada por la actividad exonucleasa 5 '^ 3 ' de la polimerasa. La luz emitida por el fluoróforo liberado del desactivador puede detectarse para detectar de ese modo el ácido nucleico diana. El documento WO 97/29210 describe un ensayo de detección por fluorescencia para sistemas de hibridación de PCR homogéneos. De Baar et al., (Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39(5):1895-1902) describen un ensayo de amplificación isotérmica en tiempo real de un tubo para identificar y distinguir los subtipos A, B y C del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1, y las formas recombinantes en circulación AE y AG. Kennedy et al., (Analytical Biochemistry, 2006, 348:294-299) describen ácidos nucleicos bloqueados para optimizar las sondas de desplazamiento para PCR cuantitativa en tiempo real.
Se han formulado diversos métodos de detección de ácido nucleico que usan dicha combinación de un fluoróforo y un desactivador sobre la premisa de la amplificación por PCR (referencias de Patente 10 y 11). En ambos métodos, un fluoróforo está unido a una de las sondas de oligonucleótidos complementarios, y un desactivador está unido a la otra
sonda. Estos métodos se han formulado con el propósito de detectar ácidos nucleicos diana durante la amplificación en la etapa de hibridación (la etapa (2)) de la PCR.
La característica del método LAMP es que 4 cebadores (FIP, BIP, F3 y B3) están diseñados para 6 regiones en cada ácido nucleico diana, que a su vez se amplifica a una temperatura constante mediante el uso de reacción de desplazamiento de cadena. Una muestra que contiene ácidos nucleicos diana, los cebadores, ADN sintetasa de tipo desplazamiento de cadena, un sustrato y similares se mezclan y se incuban a una temperatura constante (alrededor de 65 ° C) para promover la reacción. En este método, el proceso de detección se puede realizar en una etapa. El uso adicional de un cebador de bucle B (LB) y/o de un cebador de bucle F (LF) puede acortar el tiempo requerido para la amplificación en 1/2 a 1/3 (referencia de patente 12). Debido a la alta eficacia de amplificación, los ácidos nucleicos diana pueden amplificarse de 109 a 1010 veces en 15 minutos a 1 hora. Además, debido a su muy alta especificidad, la presencia o ausencia de la secuencia del gen diana de interés puede determinarse basándose en la presencia o ausencia de productos de amplificación. Uno de estos métodos detecta la presencia de productos de amplificación convirtiendo un ion pirofosfato obtenido como subproducto de la reacción de amplificación de ácido nucleico en una sal insoluble (sal de magnesio) y midiendo la turbidez de la solución de reacción o haciendo reaccionar el ion pirofosfato con un complejo de calceína-manganeso y detectando la fluorescencia de calceína liberada (material fluorescente) (referencia de patente 13). Los métodos de detección que utilizan sondas fluorescentes se han establecido aún más (referencias de patente 14 y 15).
También se ha documentado un método para detectar ácidos nucleicos diana amplificados mediante el método LAMP utilizando cebadores marcados con fluoróforo y sondas marcadas con desactivador (referencia no de patente 2). De manera específica, los ácidos nucleicos diana se amplifican mediante el método LAMP utilizando cebadores marcados con fluoróforo. Después de la amplificación, las sondas marcadas con desactivador se añaden a las mismas para hibridar las sondas marcadas con desactivador con cebadores libres marcados con fluoróforo que no han contribuido a la amplificación del ácido nucleico diana. En este método, solo se detecta la luz emitida de fluoróforos en los cebadores marcados con fluoróforo que han contribuido a la amplificación del ácido nucleico diana, es decir, se han convertido en parte de los productos de amplificación.
Cualquiera de los métodos de detección de ácido nucleico anteriores tiene sus respectivas ventajas y desventajas. Estos métodos requieren costosos equipos sensibles, en particular, para la reacción o la detección, y además implican diversas etapas. Por lo tanto, se requieren habilidades para llevar a cabo los métodos. Estas técnicas de detección de ácido nucleico se han puesto en práctica principalmente en laboratorios específicos dedicados a la amplificación de ácido nucleico. Por ejemplo, el método de detección descrito en la referencia no de patente 2 tiene el riesgo de causar la contaminación entre muestras o de entornos experimentales debido a la liberación de productos de amplificación al momento de abrir y cerrar la tapa de un recipiente de reacción, porque los desactivadores deben agregarse después de la reacción de amplificación.
En los últimos años, ha habido una creciente demanda de pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAT) en diversos campos, incluida la industria, medicina e investigación, mientras que los tipos de elementos de prueba se han ampliado. En consecuencia, los ensayos de amplificación de ácido nucleico han estado más extendidos que nunca. Los ensayos de amplificación de ácido nucleico también se utilizan en, por ejemplo, ensayos realizados con el objetivo de garantizar la seguridad de los productos sanguíneos contra diversos virus en el campo farmacéutico. Debido a la oleada de tal proliferación o universalización, ha habido demandas de técnicas de detección de ácido nucleico convenientemente utilizables sin contaminar los entornos de ensayo y, por extensión, de técnicas capaces de la detección simultánea de múltiples elementos, tales como los ensayos de amplificación de ácido nucleico, que anteriormente solo se ponían en práctica en laboratorios específicos dedicados a la amplificación de ácidos nucleicos, que puedan llevarse a cabo en cada sitio o situación, como laboratorios generales, trabajos de campo, o junto al paciente.
Listado de referencias
Referencias de patentes
Referencia de patente 1: JP 2001-286300 A
Referencia de patente 2: JP 2001-521622 A
Referencia de patente 3: JP 61-274697 A
Referencia de patente 4: JP 62-000281 A
Referencia de patente 5: JP 5-192195 A
Referencia de patente 6: JP 2-005864 A
Referencia de patente 7: Patente japonesa N.° 3313358
Referencia de patente 8: JP 2-002934 A
Referencia de patente 9: JP 1994-500021 A
Referencia de patente 10: JP 10-262700 A
Referencia de patente 11: JP 2004-511227 A
Referencia de patente 12: Publicación internacional N.° WO 2002/024902
Referencia de patente 13: JP 2004-283161 A
Referencia de patente 14: JP 2001-272475 A
Referencia de patente 15: Publicación internacional N.° WO 2009/051214
Referencias no de patentes
Referencia no de patente 1: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 4641-4645 (1995)
Referencia no de patente 2: Journal of Medical Virology 81: 966-972 (2009)
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método novedoso para detectar ácidos nucleicos diana. Más específicamente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para detectar ácidos nucleicos diana de manera más conveniente y económica que las técnicas convencionales, y un kit o similar para su uso en la detección.
Solución al problema
Para alcanzar el objeto, los presentes inventores han desarrollado recientemente un método capaz de amplificar y detectar fácilmente los ácidos nucleicos en un sistema cerrado. De manera específica, los presentes inventores tienen la intención de permitir que se agreguen cebadores marcados con fluoróforo y sondas marcadas con desactivador antes de la reacción de amplificación en métodos para detectar ácidos nucleicos diana amplificados por el método LAMP usando los cebadores marcados con fluoróforo y la sonda marcada con desactivador. Para este fin, los cebadores marcados con fluoróforo y las sondas marcadas con desactivador están diseñados para diferir en la temperatura de fusión (en lo sucesivo, en el presente documento, denominada Tf) entre ellos. Esto facilita la hibridación de los cebadores marcados con fluoróforo con el ácido nucleico diana en condiciones a una temperatura de reacción incluso en presencia de las sondas marcadas con desactivador. A medida que la temperatura disminuye, los cebadores marcados con fluoróforo que no se han unido al ácido nucleico diana pueden hibridar con las sondas marcadas con el desactivador. Como resultado, se ha descubierto que estos marcadores fluorescentes son desactivados por los desactivadores, mientras que solo se pueden detectar los marcadores fluorescentes en los cebadores marcados con fluoróforo unidos con éxito al ácido nucleico diana.
Los presentes inventores han descubierto además que este método puede combinarse no solo con la amplificación de LAMP sino también con cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico y puede llevarse a cabo sin involucrar una etapa de amplificación de ácido nucleico diana, es decir, incluso usando cebadores marcados con fluoróforo como simples sondas. Por consiguiente, se pueden alcanzar los objetos de la presente invención, y la presente invención se ha completado basándose en estos hallazgos.
De manera específica, la presente invención se constituye tal como se describe a continuación en [1] a [15],
[1] Un método para detectar uno o más ácidos nucleicos diana presentes en una muestra, que comprende las siguientes etapas:
(1) agregar un cebador o sonda marcada con fluoróforo y una sonda marcada con un desactivador a la muestra, o agregar la muestra a un cebador o sonda marcada con fluoróforo y una sonda marcada con un desactivador, en donde
el cebador o sonda marcado con fluoróforo es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con un ácido nucleico diana, y
la sonda marcada con desactivador es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador o sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador o sonda marcada con fluoróforo;
(2) incubar la muestra a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) del cebador o sonda marcada con fluoróforo y superior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, en donde el ácido nucleico diana se amplifica en condiciones isotérmicas por amplificación isotérmica de ácidos nucleicos iniciada por cebadores quiméricos (ICAN), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por círculo rodante (RCA), proceso de amplificación inteligente versión 2 (SMAP2) o amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP);
(3) hibridar el cebador o sonda marcado con fluoróforo que no está con el ácido nucleico diana, con la sonda marcada con desactivador incubando la muestra a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, desactivando de este modo con el desactivador la fluorescencia emitida por el cebador o sonda marcada con fluoróforo que no ha hibridado con el ácido nucleico diana; y (4) medir la fluorescencia del cebador o sonda marcado con fluoróforo unido al ácido nucleico diana, mientras que la muestra se mantiene a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, en donde solo se pueden detectar los marcadores fluorescentes en el cebador o
sonda marcado con fluoróforo unido con éxito al ácido nucleico diana.
[2] El método de detección de acuerdo con [1], en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador tiene una longitud de bases más corta que la del oligonucleótido del cebador o sonda marcada con fluoróforo.
[3] El método de detección de acuerdo con [1] o [2], en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador comprende una base modificada.
[4] El método de detección de acuerdo con una cualquiera de [1] a [3], en donde el cebador o sonda marcada con fluoróforo se inmoviliza sobre una superficie en fase sólida para su uso.
[5] El método de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [4], en el que se usa una combinación de dos o más cebadores o sondas marcadas con fluoróforo que difieren en longitud de onda de emisión y sondas marcadas con inhibidor respectivamente compatibles con los mismos para detectar dos o más ácidos nucleicos diana.
[6] El método de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5], en donde la medición de la fluorescencia en la etapa (4) es la determinación visual.
[7] El método de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5], en donde la medición de la fluorescencia en la etapa (4) es la determinación usando un detector de fluorescencia.
[8] Un kit para su uso en un método de detección de acuerdo con cualquiera de [1] a [7], que comprende una o más combinaciones, cada una de las cuales comprende:
un cebador o sonda marcado con fluoróforo, en donde el cebador o sonda marcado con fluoróforo es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con cada ácido nucleico diana, y una sonda marcada con desactivador, en donde la sonda marcada con desactivador es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador o sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador o sonda marcada con fluoróforo, en donde el desactivador es compatible con el fluoróforo, y un cebador y una polimerasa para amplificación en condiciones isotérmicas por ICAN, SDA, RCA, SMAP2 o LAMP.
[9] El kit para la detección de ácido nucleico diana de acuerdo con [8], en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador tiene una longitud de bases más corta que la del oligonucleótido del cebador o sonda marcada con fluoróforo.
[10] El kit para la detección de ácido nucleico diana de acuerdo con [8], en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador comprende una base modificada.
[11] El kit de acuerdo con cualquiera de [8] a [10], en donde el kit comprende además un reactivo para la amplificación de ácido nucleico.
[12] El kit para la detección de ácido nucleico diana de acuerdo con cualquiera de [8] a [11], en donde el cebador o sonda marcado con fluoróforo se inmoviliza sobre una superficie en fase sólida.
[13] Uso de un kit en un método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el kit comprende una o más combinaciones, cada una de las cuales comprende:
un cebador o sonda marcado con fluoróforo, en donde el cebador o sonda marcada con fluoróforo es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con un ácido nucleico diana, y una sonda marcada con desactivador, en donde la sonda marcada con desactivador es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador o sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador o sonda marcada con fluoróforo, en donde el desactivador es compatible con el fluoróforo.
[14] Uso del kit de acuerdo con [13], en donde:
(a) el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador tiene una longitud de bases más corta que la del oligonucleótido del cebador o sonda marcada con fluoróforo; o
(b) el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador comprende una base modificada.
[15] Uso del kit de acuerdo con [13] o [14], en donde:
(a) el kit comprende además un reactivo para la amplificación de ácido nucleico; y/o
(b) el cebador o sonda marcada con fluoróforo se inmoviliza sobre una superficie en fase sólida.
Efectos ventajosos de la invención
De acuerdo con el método de la referencia no de patentes 2, la reacción de amplificación no tiene lugar normalmente, si se agregan cebadores marcados con fluoróforo y sondas marcadas con desactivador antes de la reacción de amplificación. En este caso, los ácidos nucleicos diana son difíciles de detectar. En la presente invención, sin embargo, los cebadores o sondas marcadas con fluoróforo (en lo sucesivo, en el presente documento, denominados cebadores/sondas marcadas con fluoróforo) y las sondas marcadas con desactivador pueden tener distintas temperaturas de fusión (Tf). Los cebadores marcados con fluoróforo resultantes pueden hibridar preferentemente con ácidos nucleicos diana incluso en presencia de las sondas marcadas con desactivador.
Dicha ventaja de la presente invención se ejerce eficazmente no solo en el método de la referencia no de patente 2 que implica una etapa de amplificación, sino también en otros aspectos libres de la etapa de amplificación.
El método de la presente invención elimina la necesidad de agregar sondas marcadas con desactivador después de la reacción de amplificación y, por lo tanto, no corre peligro de contaminación entre muestras o entornos experimentales debido a la liberación de productos de amplificación. Asimismo, el método de la presente invención no implica una etapa de lavado o similar y hace que el control de temperatura sea relativamente conveniente y libre de la precisión necesaria y, por lo tanto, puede detectar ácidos nucleicos diana de manera más conveniente y económica sin la necesidad de habilidades o equipos especiales, en comparación con los métodos de hibridación convencionales.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un diagrama esquemático que muestra un aspecto básico del método de la presente invención. La Fig. 2 es un diagrama esquemático que muestra el método de la presente invención que comprende además la etapa de amplificar ácidos nucleicos diana.
La Fig. 3A es un diagrama esquemático que muestra el método de la presente invención aplicado a una micromatriz (aspecto sin amplificar los ácidos nucleicos diana).
La figura 3B es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de inmovilización de cebadores/sondas marcadas con fluoróforo en el método de la presente invención aplicado a una micromatriz.
La Fig. 3C es un diagrama esquemático que muestra el método de la presente invención aplicado a una micromatriz (aspecto que implica la etapa de amplificar ácidos nucleicos diana).
La Fig. 4 muestra la curva de turbidez en tiempo real de un ácido nucleico diana usando cebadores/sondas marcadas con fluoróforo en el Ejemplo 2.
La Fig. 5 muestra la detección de fluorescencia antes y después de la adición de CT-LBc-Q1-0 (SEQ ID NO: 8) en el Ejemplo 2.
La Fig. 6 muestra los resultados de la reacción estándar discriminante, Chlamydia trachomatis, y Neisseria gonorrhoeae en el ejemplo 3.
La Fig. 7 muestra la curva de turbidez en tiempo real de cada ácido nucleico diana añadido en el Ejemplo 4. La Fig. 8 muestra los tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación y la posterior adición de sondas marcadas con desactivador seguido de calentamiento a 95 °C durante 5 minutos y luego enfriamiento a temperatura ambiente en el Ejemplo 4.
La Fig. 9 muestra tubos de reacción irradiados con UV en el Ejemplo 5.
La Fig. 10 muestra la curva de turbidez en tiempo real de un ácido nucleico diana usando cebadores/sondas marcadas con fluoróforo y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 6.
La Fig. 11 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación en el Ejemplo 6. La Fig. 12 muestra una curva de turbidez en tiempo real a partir de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de Chlamydia trachomatis usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 13 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de Chlamydia trachomatis usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 14 muestra una longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de Chlamydia trachomatis usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 15 muestra una curva de turbidez en tiempo real a partir de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de Neisseria gonorrhoeae usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 16 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de Neisseria gonorrhoeae usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 17 muestra una longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de Neisseria gonorrhoeae usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 18 muestra una curva de turbidez en tiempo real a partir de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 19 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de Neisseria gonorrhoeae usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig.20 muestra una longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de un solo elemento de un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 21 muestra una curva de turbidez en tiempo real a partir de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 22 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación de ácido nucleico
diana de dos elementos de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig.23 muestra una longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 24 muestra una curva de turbidez en tiempo real a partir de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Chlamydia trachomatis y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 25 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Chlamydia trachomatis y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig.26 muestra una longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Chlamydia trachomatis y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 27 muestra una curva de turbidez en tiempo real a partir de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Neisseria gonorrhoeae y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 28 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Neisseria gonorrhoeae y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig.29 muestra una longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de dos elementos de Neisseria gonorrhoeae y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
La Fig. 30 muestra una curva de turbidez en tiempo real a partir de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de tres elementos de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7. La Fig. 31 muestra tubos de reacción irradiados con UV después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de tres elementos de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7. La Fig. 32 muestra una longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana de tres elementos de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y un ácido nucleico artificial usando cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, y sondas marcadas con desactivador en el Ejemplo 7.
Descripción de las realizaciones
En lo sucesivo en el presente documento, se describirá con detalle la presente invención.
La "muestra" se refiere a una mezcla que puede contener un "ácido nucleico diana" a detectar. La muestra proviene de un ser (por ejemplo, sangre, saliva, fluido corporal y tejido corporal) incluyendo un ser humano, de un ambiente (por ejemplo, suelo, agua de mar y agua ambiental (aguas termales, aguas de baño, agua de torre de refrigeración, etc.)), o de un material artificial o natural (por ejemplo, alimentos procesados como el pan, alimentos fermentados como el yogur, plantas cultivadas como arroz y trigo, microbios y virus) y generalmente se usa mediante extracción de ácido nucleico. En caso necesario, la purificación de ácido nucleico puede realizarse adicionalmente.
El "ácido nucleico diana" se refiere a una molécula de ácido nucleico a detectar de acuerdo con la presente invención. El tipo de ácido nucleico puede ser desoxirribonucleótido (ADN), ribonucleótido (ARN), o una mezcla o un conjugado de los mismos. Las bases que constituyen el ácido nucleico pueden ser nucleótidos naturales, por ejemplo, guanina (G), adenina (A), timina (T), citosina (C) y uracilo (U) o pueden contener otras bases naturales y artificiales modificadas. En este contexto, la "base modificada" significa una base en la cual cualquiera de estos 5 nucleótidos ha sufrido modificación química. Los ejemplos de la base modificada incluyen, pero sin limitación, metilcitidina, pseudouridina, 4-tiouridina, dihidrouridina, queuosina e hipoxantina (inosina (l)). En la presente invención, el ácido nucleico diana debe ser monocatenario cuando se detecta. Incluso un ácido nucleico bicatenario o un ácido nucleico que tiene una conformación, sin embargo, puede usarse después de convertirse en hebras simples por desnaturalización térmica, tratamiento de desnaturalización alcalina, o similares. El ácido nucleico diana de la presente invención también incluye tales formas desnaturalizadas. Como alternativa, el "ácido nucleico diana" también incluye ADNc preparado mediante reacción de transcripción inversa a partir de un molde de ARN.
El "oligonucleótido" significa un oligómero lineal compuesto de un enlace a través de enlaces fosfodiéster de nucleósidos como la adenosina, timidina, citidina, guanosina y uridina o nucleósidos que tienen una base modificada y se refiere a ADN, ARN, o un conjugado de los mismos. En algunos casos, se puede usar un ácido nucleico peptídico (PNA).
La "complementariedad" no solo significa que una cadena polinucleotídica u oligonucleotídica hibrida con otra cadena para formar una estructura bicatenaria donde los respectivos nucleótidos de las cadenas forman pares de bases de Watson-Crick, sino que significa que los nucleótidos forman pares de bases que no son de Watson-Crick, tales como pares de nucleótidos modificados que tienen una base de desoxiinosina (dl) o 2-aminopurina.
El "fluoróforo" significa una molécula o grupo funcional que libera energía redundante como una onda electromagnética (luz emitida) cuando regresa al estado fundamental desde el estado excitado de los electrones resultante de la absorción de la energía de la luz de excitación irradiada con una longitud de onda dada. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen, pero sin limitación, fluoresceína y sus derivados (fosforamidita de fluoresceína (FAM), isotiocianato de fluoresceína, etc.), rodamina y sus derivados (Texas Red, etc.) y colorantes Cy (Cy3, Cy5, etc.).
El "desactivador" significa una molécula o un grupo funcional que tiene un nivel de energía apropiado para absorber la energía de la luz emitida del fluoróforo. Se puede usar un fluoróforo como desactivador y, por ejemplo, la tetrametilrodamina (TAMRA) se puede utilizar como desactivador de la fosforamidita de fluoresceína (FAM). Sin embargo, una molécula o un grupo funcional que absorbe y excita la luz emitida por el fluoróforo, pero no emite luz en sí mismo es más adecuado como desactivador. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero sin limitación, DABCYL, Black Hole Quencher (BHQ (TM) (Biosearch Technologies, Inc.)) y Eclipse (TM) Dark Quencher (Epoch Biosciences, Inc.).
La "incubación" significa que la muestra se deja a una temperatura particular. Los ejemplos de medios para la conductividad térmica incluyen, pero sin limitación, baños de agua, baños de aire y baños de metal.
La temperatura de fusión (Tf) significa la temperatura a la cual 1/2 de las moléculas de ADN se disocian en cadenas simples durante el calentamiento de una solución de ADN bicatenaria. En la presente invención, la temperatura de fusión se calcula de acuerdo con la siguiente expresión del método vecino más cercano utilizando una concentración de Na+ de 50 mM (Na+ = 50310a3) y una concentración de oligonucleótidos de 0,5 mM (Ct = 0,5310a6) (Nucl. Acids Res. (1990) 18 (21): 6409-6412).
Tf = {(1000AH)/(- 10,8 AS Rln(Ct/4))} - 273,15 16,6log[Na+]
En este contexto, AH representa un total [kcal/mol] de cambios en la entalpía del vecino más cercano en un híbrido; AS representa un total [cal/mol K] de cambios en la entropía del vecino más cercano en el híbrido; R representa una constante de gas (1,987 cal/grado mol); Ct representa la concentración molar total [mol/l] del oligo; y Na+ representa una concentración molar [mol/l].
La temperatura de fusión (Tf) varía según la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido y su longitud. Un oligonucleótido que tiene mayores contenidos de guanina y citosina o que tiene una mayor longitud tiene una temperatura de fusión (Tf) más alta. Por consiguiente, la temperatura de fusión se puede ajustar permitiendo que un ajustador de temperatura de fusión esté contenido en la solución de reacción, aunque la temperatura de hibridación se determina dependiendo de la secuencia de nucleótidos y de su longitud.
Los ejemplos del ajustador de temperatura de fusión utilizado en un método de amplificación de ácido nucleico incluyen formamida, betaína (N,N,N,-trimetilglicina), prolina, dimetilsulfóxido, N-óxido de trimetilamina y sal de tetraalquilamonio.
El "cebador o sonda marcada con fluoróforo (en lo sucesivo, en el presente documento denominado cebador/sonda marcada con fluoróforo)" se refiere a un "oligonucleótido" unido a un "fluoróforo" y tiene complementariedad con cada ácido nucleico diana. En un aspecto donde el ácido nucleico diana no está amplificado, el cebador/sonda marcada con fluoróforo se usa solo como una "sonda". En un aspecto donde se amplifica el ácido nucleico diana, el cebador/sonda marcada con fluoróforo puede usarse como un "cebador". El "cebador/sonda marcada con fluoróforo" puede sintetizarse usando un (mono)nucleótido unido a fluoróforo, por ejemplo, nucleótido Alexa Fluor (TM) (Invitrogen Corp.). Como alternativa, un oligonucleótido sintetizado puede unirse en 5'-terminal o en 3'-terminal con el fluoróforo. Sin embargo, el extremo 3' no debe unirse al fluoróforo en el caso de amplificar el ácido nucleico diana utilizando el "cebador/sonda marcada con fluoróforo", es decir, en el caso de utilizar el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" en forma de "cebador". Se prefiere más un "oligonucleótido" unido en 5'-terminal con el fluoróforo. La secuencia de nucleótidos del "cebador/sonda marcada con fluoróforo" no está particularmente limitada por su longitud y es preferentemente de 15 bases o más, más preferentemente de 20 bases o más, más preferentemente de 25 bases o más. De manera deseable, la longitud de la secuencia de nucleótidos del "cebador/sonda marcada con fluoróforo" está diseñada teniendo en cuenta la hibridación con el ácido nucleico diana y las condiciones de temperatura de la reacción de amplificación posterior de modo que el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" tenga una temperatura de fusión (Tf) de 30 a 70 °C, preferentemente de 50 a 65 °C.
La "sonda marcada con desactivador" se refiere a un "oligonucleótido" unido con un "desactivador". La "sonda marcada con desactivador" puede sintetizarse usando un nucleótido unido al desactivador. Como alternativa, un oligonucleótido sintetizado puede unirse en 5'-terminal o en 3'-terminal con el desactivador. Preferentemente, el desactivador está unido a la posición en la que el desactivador desactiva eficazmente la luz emitida (fluorescencia) del fluoróforo en el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" cuando la "sonda marcada con el desactivador" y el "cebador/sonda marcada fluorescentemente" hibridan entre sí. En un aspecto que implica la amplificación de ácido nucleico diana, el extremo 3 'del oligonucleótido de la "sonda marcada con desactivador" está preferentemente bloqueado para no provocar una reacción de extensión. Más preferentemente, cuando el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" es un
"oligonudeótido" unido en 5'-terminal con el fluoróforo, una "sonda marcada con desactivador" deseable tiene el desactivador unido al extremo 3' y es compatible con el "oligonudeótido".
De manera deseable, la secuencia de nucleótidos del oligonudeótido de la "sonda marcada con desactivador" tiene complementariedad con la secuencia de nucleótidos del "cebador/sonda marcada con fluoróforo" y tiene una longitud de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bases más cortas que el cebador/sonda marcada con fluoróforo. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos es más corta porque las bases en 5'-terminal de la "sonda marcada con desactivador" son menores que las bases en 3'-terminal del "cebador/sonda marcada con fluoróforo". Como alternativa, se puede permitir que la "sonda marcada con desactivador" tenga una temperatura de fusión (Tf) sustancialmente más baja que la del "cebador/sonda marcada con fluoróforo" mediante el uso de un nucleótido que tiene una base modificada eficaz para disminuir la Tf, incluso si la "sonda marcada con desactivador" tiene la misma longitud de secuencia de nucleótidos que el "cebador/sonda marcada con fluoróforo". El nucleótido que tiene una base modificada eficaz para disminuir la Tf es, por ejemplo, un nucleótido que tiene inosina. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del oligonudeótido de la "sonda marcada con desactivador" está diseñada de modo que su temperatura de fusión sea igual o superior a la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C o 30 °C). La longitud del oligonudeótido preferentemente es de 7 bases o más, más preferentemente de 9 bases o más, para satisfacer estas condiciones.
En la presente invención, se requiere que el cebador/sonda marcada con fluoróforo y la sonda marcada con un desactivador difieran en la temperatura de fusión (Tf). La sonda marcada con desactivador tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador/sonda marcada con fluoróforo. Más específicamente, la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador es preferentemente 5 °C más baja, más preferentemente 10 °C más bajo, incluso más preferentemente 15 °C más bajo, más preferentemente 20 °C más bajo, aún más preferentemente 30 °C más bajo, aún más preferentemente 35 °C más bajo, particularmente preferentemente 40 °C o al menos 45 °C más bajo que la del cebador/sonda marcada con 1 fluoróforo.
La "adición" a la muestra incluye un aspecto en el que se agregan reactivos tales como el cebador/sonda marcada con fluoróforo y la sonda marcada con desactivador a la muestra, así como un aspecto en el que la muestra se agrega a los reactivos.
La proporción molar del "cebador/sonda marcada con fluoróforo" frente a la "sonda marcada con desactivador" utilizada para la adición puede ser 1:1, 1:2 o 1:10 o más y es más preferentemente de 1:2 o más.
La "inmovilización en una superficie en fase sólida" significa que los "cebadores/sondas marcadas con fluoróforo" se distribuyen de manera desigual durante la reacción. De manera específica, la inmovilización en una superficie en fase sólida significa que, pero sin limitación, los "cebadores/sondas marcadas con fluoróforo" están inmovilizadas en la superficie del vidrio, una membrana de nailon, una oblea semiconductora, microperlas, o similares. El método de inmovilización puede llevarse a cabo utilizando una técnica conocida en la materia. Los sitios de oligonucleótidos de los "cebadores/sondas marcadas con fluoróforo" pueden inmovilizarse directamente sobre la superficie de vidrio o similares o pueden inmovilizarse indirectamente sobre las mismas mediante la unión de biotina-avidina o similares o mediante una molécula de enlace.
La "amplificación de un ácido nucleico diana usando el cebador/sonda marcada con fluoróforo" significa que el ácido nucleico diana se amplifica a través de la extensión mediada por polimerasa usando el cebador/sonda marcada con fluoróforo como cebador. Es obvio para los expertos en la técnica que en un aspecto que comprende la etapa de amplificar ácidos nucleicos diana de la presente invención, naturalmente, el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" y la "sonda marcada con desactivador", y la muestra se complementan con otros reactivos necesarios para la amplificación del ácido nucleico diana, por ejemplo, cebadores, polimerasa y dNTP, según el método de amplificación a realizar.
La frase "la amplificación se realiza en condiciones isotérmicas" significa que cada ácido nucleico diana se amplifica con la temperatura mantenida constante. Los ejemplos del método de amplificación isotérmica incluyen la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos iniciada por cebadores quiméricos (ICAN), SDA, NASBA, r Ca , el proceso de amplificación inteligente versión 2 (SMAP2) (Nature Methods 4: 257-262 (2007)) y LAMP.
La "irradiación UV" se refiere a la irradiación con una onda electromagnética que tiene una longitud de onda del orden de 10 nm a 400 nm. La longitud de onda de la onda electromagnética puede no controlarse estrictamente y solo debe corresponder a la luz de excitación del fluoróforo.
La "determinación visual" significa que la presencia o ausencia de la luz emitida por el fluoróforo se determina a simple vista a corto plazo, por ejemplo, dentro de 5 segundos, 15 segundos, 30 segundos, o 1 minuto de la irradiación Uv . En algunos casos, la determinación visual se puede realizar en comparación con muestras de color.
Para la "determinación visual", la excitación por "irradiación UV" es la más adecuada, y se logra la detección simultánea de elementos múltiples (hasta aproximadamente 3 a 4 elementos). La medición usando un "detector de fluorescencia" puede lograr una detección simultánea de más elementos múltiples usando un detector de matriz de fotodiodos o
similar.
El "kit" significa reactivos para su uso en el método de detección según la presente invención. El kit comprende el "cebador/sonda marcada con fluoróforo", la "sonda marcada con desactivador" y un cebador y una polimerasa para la amplificación en condiciones isotérmicas por ICAN, SDA, RCA, SMAP2 o LAMP, y opcionalmente puede comprender reactivos, herramientas e instrumentos necesarios para la detección. El kit puede comprender además un manual de instrucciones del "kit" y muestras de color.
En el método de detección de la presente invención, cada ácido nucleico diana hibrida con el cebador/sonda marcada con fluoróforo preferentemente mediante incubación a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) del cebador/sonda marcada con fluoróforo y mayor que la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador. Posteriormente, un cebador/sonda marcado con fluoróforo que no hibrida con el ácido nucleico diana hibrida con la sonda marcada con desactivador por incubación a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador. Como resultado, el fluoróforo en el cebador/sonda marcada con fluoróforo que no hibrida con el ácido nucleico diana se encuentra adyacente al desactivador en la sonda marcada con desactivador. Mientras que la muestra se mantiene a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, la fluorescencia del cebador/sonda marcada con fluoróforo unido con el ácido nucleico diana se mide para detectar el ácido nucleico diana.
Una característica del método de detección de la presente invención es que: el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" y la "sonda marcada con desactivador" tienen distintas temperaturas de fusión (Tf); y para la detección del "ácido nucleico diana", la hibridación entre el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" y el "ácido nucleico diana" prevalece sobre la hibridación entre el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" y la "sonda marcada con desactivador" como resultado del control de la relación de estos temperaturas de fusión con temperaturas de reacción. Además, el método de la presente invención elimina la necesidad de añadir, después de la reacción de amplificación, el cebador/sonda marcada con fluoróforo y la sonda marcada con desactivador necesarias para la detección y, por lo tanto, pueden realizarse mediante una operación más conveniente y prevenir la contaminación atribuida a la liberación de productos de amplificación, en comparación con las técnicas convencionales.
En lo sucesivo en el presente documento, cada aspecto de la presente invención se desvelará en detalle. Sin embargo, la presente invención no pretende estar limitada a los mismos.
El aspecto más básico de la presente invención es como se muestra en la Fig. 1. Siempre que se agreguen primero el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" y la "sonda marcada con extintor", cada ácido nucleico diana puede detectarse en un sistema cerrado sin agregar posteriormente ningún reactivo. Por ejemplo, el cebador/sonda marcada con fluoróforo puede tener un valor de Tf de 65 °C, mientras que la sonda marcada con desactivador puede tener un valor de Tf de 35 °C. En ese caso, el cebador/sonda marcada con fluoróforo se une al ácido nucleico diana, pero no se une a la sonda marcada con desactivador a una temperatura de reacción establecida en 60 °C (Etapa 1). Cuando la temperatura de reacción se reduce a una temperatura (30 °C) igual o inferior al valor de Tf de la sonda marcada con desactivador (etapa 2), el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" que no se une al ácido nucleico diana hibrida con la "sonda marcada con el desactivador". Solo el fluoróforo en el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" unida al "ácido nucleico diana" emite luz (fluorescencia) tras la radiación UV, mientras que la fluorescencia del fluoróforo en el "cebador/sonda marcada con fluoróforo" unida a la "sonda marcada con desactivador" no se puede detectar. Por consiguiente, la intensidad de fluorescencia de la muestra depende de la cantidad de "ácido nucleico diana" en la muestra.
La Fig. 2 muestra un aspecto de la presente invención que comprende la etapa de amplificar ácidos nucleicos diana. En los métodos de amplificación y detección de ácido nucleico como se describe en las técnicas convencionales de las patentes japonesas N.° 3016759 y 3999653, una sonda marcada con fluoróforo que hibrida con un ácido nucleico diana coexiste con una sonda marcada con fluoróforo que hibrida con una sonda marcada con desactivador en la etapa de hibridación en PCR. En consecuencia, la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ácido nucleico diana amplificado, pero no indica directamente la cantidad de ácido nucleico diana amplificado. Además, la sonda marcada con fluoróforo y la sonda marcada con desactivador pueden inhibir la reacción de extensión posterior. Las técnicas convencionales son, por lo tanto, poco precisas. Por otro lado, de acuerdo con el aspecto de la presente invención que se muestra en la Fig. 2, el cebador/sonda marcada con fluoróforo se incorpora al producto bicatenario amplificado. Por lo tanto, solo la cantidad del ácido nucleico diana amplificado puede detectarse con mayor precisión.
La Fig. 3 muestra un aspecto en el que el método de la presente invención se aplica a una denominada microplaca o micromatriz de ADN.
La Fig. 3A es un diagrama esquemático que muestra el método de la presente invención que usa el cebador/sonda marcada con fluoróforo en forma de sonda (aspecto sin la etapa de amplificar ácidos nucleicos diana). En este caso, el cebador/sonda marcada con fluoróforo puede inmovilizarse en el extremo 3' de su oligonucleótido en la superficie de la fase sólida.
Los ejemplos de formas inmovilizadas se muestran en la Fig. 3B.
(1) El cebador/sonda marcada con fluoróforo se inmoviliza en el extremo 3' de su oligonucleótido en la superficie. En este caso, la sonda marcada con desactivador compatible deseablemente tiene el desactivador unido con el extremo 5'.
(2) El cebador/sonda marcada con fluoróforo se inmoviliza sobre él a través del fluoróforo unido al extremo 3' del oligonucleótido. En este caso, la sonda marcada con desactivador compatible deseablemente tiene el desactivador unido con el extremo 5'.
(3) El cebador/sonda marcada con fluoróforo tiene el fluoróforo unido al extremo 5' del oligonucleótido y se inmoviliza sobre él en el extremo 3' del oligonucleótido. En este caso, la sonda marcada con desactivador compatible deseablemente tiene el desactivador unido con el extremo 3'.
La Fig. 3C muestra un aspecto que comprende la etapa de amplificar ácidos nucleicos diana. En este caso, se prefiere que el cebador/sonda marcada con fluoróforo no se inmovilice en la región 3' de su oligonucleótido en la superficie. En el aspecto que comprende la etapa de amplificación de ácido nucleico, el ácido nucleico diana se une de manera más estable con el cebador/sonda marcada con fluoróforo.
Los ácidos nucleicos que se van a unir con una micromatriz están marcados con un radioisótopo, un fluoróforo, o similar e hibridan con, por ejemplo, oligonucleótidos inmovilizados sin marcar. Después, los ácidos nucleicos marcados no unidos se eliminan por lavado. Después, los marcadores de los ácidos nucleicos unidos con la micromatriz a través de la hibridación pueden detectarse para detectar de ese modo los ácidos nucleicos. Como es evidente por el aspecto de la Fig. 3, sin embargo, el uso del cebador/sonda marcada con fluorescencia unido a la superficie en fase sólida elimina la necesidad de marcar con fluorescencia toda la muestra y también elimina la necesidad de la etapa de lavado. Por consiguiente, los ácidos nucleicos diana se pueden detectar más convenientemente.
De acuerdo con la presente invención, varios ácidos nucleicos diana pueden detectarse simultáneamente usando varios cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, es decir, varios cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, respectivamente, que tienen marcadores de fluoróforo que emiten luces distintas, y sondas marcadas con desactivador, respectivamente, compatibles con ellos. Los fluoróforos en los cebadores/sondas marcados con fluoróforo liberan energía redundante como una onda electromagnética (luz emitida) cuando regresan al estado fundamental desde el estado excitado de los electrones resultante de la absorción de energía externa. La diferencia en el nivel de energía entre el estado excitado y el estado fundamental es específica para cada fluoróforo. Los diferentes fluoróforos emiten luces (ondas electromagnéticas) con sus respectivas longitudes de onda específicas de fluoróforo, es decir, emiten "luces con diferentes colores", incluso si absorbe energía externa al mismo tiempo. Estas luces emitidas son absorbidas y desactivadas solo por los desactivadores en las sondas compatibles marcadas con desactivador y no son influenciadas por otras sondas marcadas con desactivador. Por consiguiente, se pueden detectar varios ácidos nucleicos diana simultáneamente observando las "longitudes de onda", es decir, los "colores", de las luces emitidas de los fluoróforos. Estas luces emitidas se pueden detectar utilizando un espectrofotómetro o similar y se pueden detectar como color mixto o color entre los colores de fluorescencia a simple vista.
El método de detección de la presente invención puede aplicarse a la detección de diversos patógenos, incluidas bacterias, hongos y virus. Los ejemplos de las bacterias incluyen Mycoplasma pneumoniae, bacterias del género Legionella, bacterias del género Salmonella, E. coli enterohemorragica, Mycobacterium tuberculosis, Campylobacter jejuni y Campylobacter coli, y Bordetella pertussis. Ejemplos de hongos incluyen hongos del género Candida, hongos del género Aspergillus, y hongos del género Cryptococcus. Los ejemplos de los virus incluyen el virus pdm de la gripe A (H1N1), el virus de la gripe A (H1N1), el virus de la gripe del subtipo H5, el coronavirus del SARS, virus del herpes simple tipo 1/2 (HSV-1/2), y el norovirus de genogrupo I (Gl) y genogrupo II (GIl). Los ejemplos de parásitos incluyen parásitos de la malaria, Cryptosporidium spp., y Giardia spp. El método de detección de la presente invención no solo puede detectar el patógeno en sí mismo sino que también puede detectar un gen implicado en la patogenicidad, por ejemplo, un gen de toxina (por ejemplo, verotoxina (en adelante denominado VT) gen 1 (VT1) y 2 (VT2)), un gen de resistencia a los medicamentos o un gen asociado con la infección del hospedador (invasión, colonización o proliferación). El método de detección de la presente invención se puede aplicar adicionalmente a, por ejemplo, la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en genes de citocromo o similares, o la detección de una secuencia de genes específica de machos para la discriminación sexual de embriones bovinos. Para tal detección, primero se diseña un cebador/sonda marcada con fluoróforo que tiene una secuencia de oligonucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico específica para un sujeto de detección, y después se diseña una sonda marcada con un desactivador compatible con el mismo. El método de detección de la presente invención puede llevarse a cabo usando el cebador/sonda marcada con fluoróforo diseñado y la sonda marcada con desactivador.
En particular, el aspecto de la presente invención para detectar varios ácidos nucleicos diana es eficaz para detectar y discriminar simultáneamente virus de especies relacionadas tales como los virus de la gripe humana (tipos A (incluyendo H1N1, H3N2, H1N2, H2N2, H9N1 y H5N1), B y C) o virus de la hepatitis (virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B y virus de la hepatitis C). También, este aspecto es eficaz para detectar y discriminar simultáneamente (la presencia o ausencia de) agentes patógenos que lleva a diversos tipos de enfermedades de transmisión sexual, como Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, y Chlamydia trachomatis. Este aspecto es aún más eficaz para detectar y discriminar simultáneamente (la presencia o ausencia de) norovirus, rotavirus, y similares responsables de la gastroenteritis infecciosa. Como alternativa, el aspecto es eficaz para detectar y discriminar simultáneamente (la
presencia o ausencia de) el virus del SIDA (VIH), el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) como prueba de detección para el suministro de sangre.
El kit de la presente invención es un kit para la detección de ácido nucleico diana que se usa para detectar uno o más ácidos nucleicos diana presentes en una muestra con el uso de amplificación. El kit para la detección de ácido nucleico diana comprende una o más combinaciones, cada una de las cuales comprende: un cebador/sonda marcada con fluoróforo que es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con un ácido nucleico diana; una sonda marcada con desactivador que es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador/sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador/sonda marcada con fluoróforo; y un cebador y una polimerasa para la amplificación en condiciones isotérmicas por ICAN, SDA, RCA, SMAP2 o LAMP.
El oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador tiene una longitud de bases más corta que la del oligonucleótido del cebador/sonda marcada con fluoróforo. Como alternativa, el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador comprende una base modificada.
El cebador/sonda marcada con fluoróforo puede inmovilizarse en una superficie en fase sólida. El kit de la presente invención puede comprender otros reactivos para la amplificación de ácido nucleico diana y puede comprender opcionalmente otros reactivos necesarios para su uso en la detección habitual de ácido nucleico.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a estos Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Confirmación de influencia del valor de Tf
(1) Molde de ensayo
Una porción (SEQ ID NO: 21) de una región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis se subclonó como molde para el ensayo para preparar ADN de plásmido (en lo sucesivo, denominados plásmidos CT).
(2) Síntesis de cebador, cebador/sonda marcada con fluorescencia y sonda marcada con desactivador
Los cebadores para la reacción LAMP se diseñaron para dirigirse a la región del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis y no tienen reactividad cruzada con bacterias relacionadas. De los cebadores diseñados, se usó LB marcado con fluorescencia en 5'-terminal con FAM como un cebador/sonda marcada con fluorescencia, mientras que su cadena complementaria marcada en 3'-terminal con BHQ1 se usó como una sonda marcada con desactivador. También, se diseñaron sondas marcadas con desactivador que tienen un valor de Tf más bajo, en las que se delecionaron de 3 a 10 bases en 5'-terminal de cada sonda marcada con desactivador. La síntesis del cebador se encargó a Operon Biotechnologies Inc. La síntesis del cebador/sonda marcada con fluoróforo y las sondas marcadas con desactivador se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd. Los valores de Tf de las sondas marcadas con desactivador se indican en valores calculados por el método del vecino más cercano.
<cebador de Chlamydia trachomatis>
CT-FIP: 5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP: 5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2)
CT-F3: 5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 3)
CT-B3: 5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-LF: 5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (SEQ ID NO: 5)
CT-LB: 5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 6)
<cebador/sonda marcada con fluoróforo de Chlamydia trachomatis>
FAM-CT-LB: 5'-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 7)
<sonda marcada con desactivador de Chlamydia trachomatis>
CT-LBc-QI-0: 5'-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 8) Tf=60,6 °C
CT-LBc-QI-3: 5'-CTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 9) Tf=53,9 °C
CT-LBc-QI-5: 5'-TCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 10) Tf=49,7 °C
CT-LBc-QI-6: 5'-CGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 11) Tf=46,5 °C
CT-LBc-QI-7: 5'-GTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 12) Tf=37,5 °C
CT-LBc-QI-9: 5'-AACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 13) Tf=32,6 °C
CT-LBc-QI-10: 5'-ACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 14) Tf=26,7 °C
(3) Composición y concentración del reactivo de reacción LAMP
Las soluciones de reacción final de LAMP se prepararon de manera que cada reactivo tuviera una concentración que se muestra a continuación en 30 ml de cada una de las soluciones de reacción. Estas soluciones de reacción no se complementaron con ninguna sonda marcada con desactivador (control) ni con ninguno de CT-LBc-Q1-0 (SEQ ID NO: 8), CT-LBc-Q1-3 (SEQ ID NO: 9), CT-LBc-Q1-5 (SEQ ID NO: 10), CT-LBc-QI-6 (SEQ ID NO: 11), CT-LBc-Q1-7 (SEQ ID NO: 12), CT-LBc-Q1-9 (SEQ ID NO: 13), y CT-LBc-QI-10 (SEQ ID NO: 14).
Tris-HCI 30 mM (pH 8,8)
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
Tween 20 al 0,15 %
dATP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dCTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dGTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dTTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
ADN polimerasa de Bst 38,4 U (New England Biolabs Inc.)
Cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con desactivador:
CT-FIP 0,8 mM (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP 0,8 mM (SEQ ID NO: 2)
CT-F30,1 mM (SEQ ID NO: 3)
CT-B30,1 mM (SEQ ID NO: 4)
CT-LF 0,4 mM (SEQ ID NO: 5)
FAM-CT-LB 0,4 mM (SEQ ID NO: 7)
CT-LBc-QI-00,8 mM (SEQ ID NO: 8), CT-LBc-Q1-3 (SEQ ID NO: 9), CT-LBc-Q1-5 (SEQ ID NO: 10), CT-LBc-Q1-6 (SEQ ID NO: 11), CT-LBc-Q1-7 (SEQ ID NO: 12), CT-LBc-Q1-9 (SEQ ID NO: 13) o CT-LBc-Q1-10 (SEQ ID NO: 14)
(4) Amplificación
Se añadió agua destilada (AD) o 104 copias de plásmidos CT por reacción. La reacción de amplificación se realizó a 65 °C durante 120 minutos usando un aparato turbidimétrico en tiempo real LA-320C (Teramecs Co., Ltd.).
(5) Determinación
La reacción de amplificación se confirmó usando LA-320C (LA-320C controla la reacción de amplificación de ácido nucleico basándose en el cambio en la absorbancia causada por la formación de su subproducto pirofosfato de magnesio, es decir, cambio en la turbidez; valor de Tt: tiempo requerido para que el valor aritmético de los datos turbidmétricos alcance un valor de determinación desde el inicio de la reacción; curva de turbidez: gráfico de los datos de ensayo de turbidez en tiempo real), mientras que los tubos de reacción después de la amplificación se irradiaron con UV y se encontraron positivos cuando emitían fluorescencia verde (fAm ) o negativos cuando no emitían fluorescencia detectable.
Cuando no se utilizó una sonda marcada con desactivador, la amplificación de 104 copias de plásmidos CT se confirmó a los 20,7 minutos. Por el contrario, los tiempos de amplificación de los plásmidos CT complementados con las sondas marcadas con desactivador diferían dependiendo de las sondas marcadas con desactivador y fueron 92,4 minutos (+71,7 minutos) para CT-LBc-Q1-0 (Se Q ID NO: 8), 41,5 minutos (+20,8 minutos) para CT-LBc-Q1-3 (SEQ ID NO: 9), 27,8 minutos (+7,1 minutos) para CT-LBc-Q1-5 (SEQ ID NO: 10), 25,5 minutos (+4,8 minutos) para CT-LBc-Q1-6 (Se Q ID NO: 11), 22,8 minutos (+2,1 minutos) para Ct -LBc-QI-7 (s Eq ID NO: 12), 20,7 minutos (+0,0 minutos) para CT-LBc-Q1-9 (SEQ ID NO: 13) y 20,6 minutos (-0,1 minutos) para CT-LBc-Q1-10 (SEQ ID NO: 14). En cualquiera de los casos en los que se usaron sondas marcadas con un desactivador, la fluorescencia verde derivada de FAM se confirmó en los tubos suplementados con los plásmidos CT, pero no se confirmó en los tubos suplementados con AD (Tabla 1).
[Tabla 1]
Valor de Tf de la sonda marcada^ con desactivador (Q) y el tiempo de amplificación
CT-LBc- - Q1-0 Q1-3 0 1-5 Q1-6 Q1-7 Q1-9 0 1-10
60,6 53,9 49,7 46,5 37,5 32,6 26,7
Tt (AD) N.D.* N.D.* N.D.* N.D.* N.D.* N.D.* N.D.* N.D.*
Tt (CT) 20,7 92,4 41,5 27,8 25,5 22,8 20,7 20,6
A< 71,7 20,8 7,1 4,8 2,1 0,0 -0,1
N.D no detectado (no detectable)______________________________________________ "Tt (AD)" representa un valor de Tt derivado de la adición de AD. "Tt (CT)" representa un valor de Tt derivado de la reacción de 104 copias de plásmidos CT añadidos por reacción.
En ausencia de CT-LBc-Q1, se confirmó la fluorescencia incluso en los tubos suplementados con AD, porque el marcador fluorescente no se desactivó. En presencia de CT-LBc-Q1 (Q1-0), la fluorescencia se desactivó en cualquiera de los tubos suplementados con AD y se confirmó en los tubos suplementados con los plásmidos CT sin verse influenciado por el valor Tf de CT-LBc-Q1.
Tal como se muestra en la [Tabla 1], valores de Tf mayores de las sondas marcadas con desactivador retrasan más los tiempos de amplificación, mientras que esta influencia no se encuentra en valores de Tf de 32,6 °C o menos. Esto sugirió que la Tf de la sonda marcada con desactivador es deseablemente 32,6 °C o inferior.
Ejemplo 2. El caso de la sonda marcada con desactivador se agrega después de la amplificación de LAMP
(1) Molde de ensayo
Una porción (SEQ ID NO: 21) de una región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis se subclonó como molde para el ensayo para preparar ADN de plásmido (en lo sucesivo, denominados plásmidos CT).
(2) Síntesis de cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con desactivador
Los cebadores se diseñaron para dirigirse a la región del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis y no tienen reactividad cruzada con bacterias relacionadas. De los cebadores diseñados, se usó LB marcado con fluorescencia en 5'-terminal con FAM como cebador/sonda marcada con fluoróforo, mientras que su cadena complementaria marcada en 3'-terminal con BHQ1 se usó como una sonda marcada con desactivador. La síntesis del cebador se encargó a Operon Biotechnologies Inc. La síntesis del cebador marcado con fluoróforo y las sondas marcadas con extintor se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd.
<cebador de Chlamydia trachomatis>
CT-FIP: 5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP: 5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2)
CT-F3: 5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 3)
CT-B3: 5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-LF: 5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (SEQ ID NO: 5)
CT-LB: 5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 6)
<cebador marcado con fluoróforo de Chlamydia trachomatis>
FAM-CT-LB: 5'-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 7)
<sonda marcada con desactivador de Chlamydia trachomatis>
CT-LBc-QI-0: 5'-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 8)
(3) Composición y concentración del reactivo de reacción LAMP
Las soluciones de reacción final de LAMP se prepararon de manera que cada reactivo tuviera una concentración que se muestra a continuación en 30 ml de cada una de las soluciones de reacción.
Tris-HCI 30 mM (pH 8,8)
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
Tween 20 al 0,15 %
dATP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dCTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dGTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dTTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
ADN polimerasa de Bst 38,4 U (New England Biolabs Inc.)
Cebador y cebador/sonda marcada con fluoróforo:
CT-FIP 0,8 mM (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP 0,8 mM (SEQ ID NO: 2)
CT-F30,1 mM (SEQ ID NO: 3)
CT-B30,1 mM (SEQ ID NO: 4)
CT-LF 0,4 mM (SEQ ID NO: 5)
FAM-CT-LB 0,4 mM (SEQ ID NO: 7)
El siguiente reactivo también se añadió después de la reacción de amplificación.
Sonda marcada con desactivador:
CT-LBc-QI-0 0,8 mM (SEQ ID NO: 8)
(4) Amplificación
Se añadió AD o 104 copias de plásmidos CT por reacción. La reacción de amplificación se realizó a 65 °C durante 120 minutos usando LA-320C.
(5) Determinación
La reacción de amplificación se confirmó usando LA-320C de la misma manera que en el Ejemplo 1 (Tabla 2 y Fig. 4).
No se detectó ningún valor de Tt y no se observó aumento de la turbidez en el tubo de reacción suplementado con AD. Por el contrario, se confirmó un valor de Tt de 18,7 minutos y un aumento de la turbidez en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT. Estos resultados demostraron que la reacción de amplificación se produjo solo en los tubos de reacción que contienen los plásmidos CT, es decir, el ácido nucleico diana.
En cuanto a la fluorescencia de cada tubo de reacción, la fluorescencia se detectó tanto en el tubo de reacción suplementado con AD (T ubo N.° 1) como en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT (Tubo N.° 2) (Fig. 5). A continuación, se añadió CT-LBc-QI-0 (SEQ ID NO: 8) a cada tubo de reacción a temperatura ambiente. Como resultado, la fluorescencia se desactivó en el tubo de reacción suplementado con AD (Tubo N.° 3). Por el contrario, la fluorescencia se conservó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT (Tubo N.° 4).
[Tabla 21
Tiempo de amplificación
Muestra AD CT
Tt N.D.* 18,7
N. D. *: No detectado
Ejemplo 3. Método de amplificación y detección simultánea de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae usando LAMP
(1) Molde de ensayo
Una porción (SEQ ID NO: 21) de una región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis se subclonó como un molde estándar interno para preparar ADN de plásmido (en adelante, citados como los plásmidos CT). También, una porción (SEQ ID NO: 32) de una región mtrA de Neisseria gonorrhoeae se subclonó como un molde de ácido nucleico diana para preparar ADN plasmídico (en lo sucesivo, citados como los plásmidos NG).
(2) Síntesis del cebador de Chlamydia trachomatis, Cebador de bucle marcado con TAMRA (cebador/sonda marcada con fluoróforo) y sonda de desactivación marcada con BHQ2 (sonda marcada con desactivador)
Los cebadores se diseñaron para dirigirse a la región del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis y no tienen reactividad cruzada con bacterias relacionadas. La síntesis del cebador se encargó a Operon Biotechnologies Inc. La síntesis del cebador de bucle marcado con TAMRA y la sonda de desactivación marcada con BHQ2 se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd.
<cebador de Chlamydia trachomatis>
CT-FIP: 5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP: 5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2)
CT-F3: 5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 3)
CT-B3: 5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-LB: 5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 6)
<cebador de bucle marcado con TAMRA de Chlamydia trachomatis>
TAM-CT-LF: 5'-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3' (SEQ ID NO: 15)
<sonda de desactivación marcada con BHQ2 de Chlamydia trachomatis>
CT-LFC-Q2: 5'-GGGGTTATCTT-(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 16)
(3) Síntesis de cebador de Neisseria gonorrhoeae. cebador de bucle marcado con FAM (cebador/sonda marcada con fluoróforo) y sonda de desactivación marcada con BHQ1 (sonda marcada con desactivador)
Los cebadores se diseñaron para dirigirse a la región mtrA de Neisseria gonorrhoeae y no tienen reactividad cruzada con bacterias relacionadas. La síntesis del cebador se encargó a Operon Biotechnologies Inc. La síntesis del cebador de bucle marcado con FAM y la sonda de desactivación marcada con BHQ1 se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd.
<cebador de Neisseria gonorrhoeae>
NG-FIP: 5'-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3' (SEQ ID NO: 17)
NG-BIP: 5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3' (SEQ ID NO: 18)
NG-F3: 5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3' (SEQ ID NO: 19)
NG-B3: 5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3' (SEQ ID NO: 20)
NG-LF: 5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3' (SEQ ID NO: 22)
<cebador de bucle marcado con FAM de Neisseria gonorrhoeae>
FAM-NG-LB: 5'-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3' (SEQ ID NO: 23)
<sonda de desactivación marcada con BHQ1 de Neisseria gonorrhoeae>
NG-LBc-QI: 5'-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 24)
(4) Composición y concentración del reactivo de reacción LAMP
Las soluciones de reacción final de LAMP se prepararon de manera que cada reactivo tuviera una concentración que se muestra a continuación en 30 ml de cada una de las soluciones de reacción.
Tris-HCI 30 mM (pH 8.8)
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
Tween 20 al 0.15 %
ATP 2.1 mM
CTP 2.1 mM
GTP 2.1 mM
TTP 2.1 mM
ADN polimerasa de Bst 38.4 U (New England Biolabs Inc.)
Cebador de Chlamydia trachomatis. cebador de bucle marcado con TAMRA y sonda de desactivación marcada con BHQ2:
CT-FIP 0.8 mM (SEQ ID NO: 1) y CT-BIP (SEQ ID NO: 2)
CT-F30.1 mM (SEQ ID NO: 3) y CT-B3 (SEQ ID NO: 4)
CT-LB 0.4 mM (SEQ ID NO: 6) y TAM-CT-LF (SEQ ID NO: 15)
CT-LFC-Q20.8 mM (SEQ ID NO: 16)
Cebador de Neisseria gonorrhoeae. cebador de bucle marcado con FAM y sonda de desactivación marcada con BHQ1:
NG-FIP 0.8 mM (SEQ ID NO: 17) y NG-BIP (SEQ ID NO: 18)
NG-F30.1 mM (SEQ ID NO: 19) y NG-B3 (SEQ ID NO: 20)
NG-LF 0.4 mM (SEQ ID NO: 22) y FAM-NG-LB (SEQ ID NO: 23)
NG-LBc-QI 0.8 mM (SEQ ID NO: 24)
(5) Amplificación
Se añadió AD. 104 copias de plásmidos CT. o 104 copias de plásmidos NG. o 104 copias de plásmidos CT y 104 copias de plásmidos NG por reacción. La reacción de amplificación se realizó a 65 °C durante 60 minutos usando LA-320C.
(6) Determinación
La amplificación del ácido nucleico derivado de Chlamydia trachomatis (CT) produce un color rojo visualmente detectable (TAMRA) bajo radiación UV, mientras que la amplificación del ácido nucleico derivado de Neisseria gonorrhoeae (NG) produce un color verde visualmente detectable (FAM) bajo irradiación UV. Después de la reacción de amplificación, la fluorescencia se confirmó por irradiación UV. Como resultado (Fig. 6), el AD (muestras negativas) era incolora (Tubos N.° 1 a 4); el color verde se detectó visualmente en las muestras positivas de Neisseria gonorrhoeae (Tubos N.° 5 a 8); el color rojo se detectó visualmente en las muestras positivas de Chlamydia trachomatis (Tubos N.° 9 a 12); y se detectó visualmente el color amarillo (rojo verde) en las muestras positivas para ambas bacterias (Tubos N.° 13 a 16).
Ejemplo 4. Amplificación simultánea de múltiples elementos y detección de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae. y ácido nucleico artificial
(1) Molde de ensayo
Una porción (SEQ ID NO: 21) de una región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis se subclonó como molde para el ensayo para preparar ADN de plásmido (en lo sucesivo, denominados plásmidos CT). También, se subclonó una porción (SEQ ID NO: 32) de la región mtrA de Neisseria gonorrhoeae como molde para el ensayo para preparar ADN plasmídico (en lo sucesivo, denominados plásmidos NG). Además, se subclonó una secuencia de ácido nucleico artificial (SEQ ID NO: 33) como molde para el ensayo para preparar ADN plasmídico (en lo sucesivo, denominados plásmidos ARITA2).
(2) Síntesis de cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con desactivador
Los cebadores para la reacción LAMP se diseñaron para dirigirse a la región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis, a la región mtrA de Neisseria gonorrhoeae, o a la secuencia de ácido nucleico artificial y no tienen reactividad cruzada con bacterias relacionadas. De los cebadores diseñados, LF de Chlamydia trachomatis marcado en 5'-terminal con fluorescente con TAMRA, LB de Neisseria gonorrhoeae marcado en 5'-terminal con fluorescente con FAM, y la secuencia de ácido nucleico artificial LB marcada en 5'-terminal con fluorescente con Alexa Fluor (TM) 350 (en lo sucesivo, en el presente documento denominado Alexa350) se usaron como cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, mientras que una cadena complementaria de LF de Chlamydia trachomatis marcada en 3'-terminal con BHQ2, una cadena complementaria de LB de Neisseria gonorrhoeae marcada en 3'-terminal con BHQ1, y una cadena complementaria de LB de secuencia de ácido nucleico artificial marcada en 3'-terminal con BHQ0 se usaron como sondas marcadas con desactivador. La síntesis del cebador se encargó a Operon Biotechnologies Inc. La síntesis de los cebadores/sondas marcados con fluoróforo y las sondas marcadas con el desactivador se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd.
<cebador de Chlamydia trachomatis>
CT-FIP: 5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP: 5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2)
CT-F3: 5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 3)
CT-B3: 5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-LB: 5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 6)
<cebador/sonda marcada con fluoróforo de Chlamydia trachomatis>
TAM-CT-LF: 5'-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3' (SEQ ID NO: 15)
<sonda marcada con desactivador de Chlamydia trachomatis>
CT-LFC-Q2: 5'-ACGTGCGGGGTTATCTT-(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 16)
<cebador de Neisseria gonorrhoeae>
NG-FIP: 5'-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3' (SEQ ID NO: 17)
NG-BIP: 5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3' (SEQ ID NO: 18)
NG-F3: 5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3' (SEQ ID NO: 19)
NG-B3: 5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3' (SEQ ID NO: 20)
NG-LF: 5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3' (SEQ ID NO: 22)
<cebador/sonda marcada con fluoróforo de Neisseria gonorrhoeae>
FAM-NG-LB: 5'-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3' (SEQ ID NO: 23)
<sonda marcada con desactivador de Neisseria gonorrhoeae>
NG-LBc-QI: 5'-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 24)
Cebador de ácido nucleico artificiad
ARITA2-FIP: 5'-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3' (SEQ ID NO: 25)
ARITA2-BIP: 5'-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3' (SEQ ID NO: 26)
ARITA2-F3: 5'-GGACAATCGAAGCCAGAA-3' (SEQ ID NO: 27)
ARITA2-B3: 5'-ATCACGGATCGTATGTGG-3' (SEQ ID NO: 28)
ARITA2-LF: 5'-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3' (SEQ ID NO: 29)
<Cebador/sonda marcada con fluoróforo de ácido nucleico artificiad
Ale-ARITA2-LB: 5'-(Alexa350)-AACGATCGCACTAAGCAT-3' (SEQ ID NO: 30)
<sonda marcada con desactivador de ácido nucleico artificiad
ARITA2-LBC-Q0: 5'-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ0)-3' (SEQ ID NO: 31)
(3) Composición y concentración del reactivo de reacción LAMP
Las soluciones de reacción final de LAMP se prepararon de manera que cada reactivo tuviera una concentración que se muestra a continuación en 30 ml de cada una de las soluciones de reacción.
Tris-HCI 30 mM (pH 8,8)
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
Tween 20 al 0,15 %
dATP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dCTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dGTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dTTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
ADN polimerasa de Bst 38,4 U (New England Biolabs Inc.)
Cebador y cebador/sonda marcada con fluoróforo:
CT-FIP 0,6 mM (SEQ ID NO: 1), NG-FIP (SEQ ID NO: 17)
CT-BIP 0,6 mM (SEQ ID NO: 2), NG-BIP (SEQ ID NO: 18)
CT-F30,1 mM (SEQ ID NO: 3), NG-F3 (SEQ ID NO: 19)
CT-B30,1 mM (SEQ ID NO: 4), NG-B3 (SEQ ID NO: 20)
CT-LB 0,3 mM (SEQ ID NO: 6), NG-LF (SEQ ID NO: 22)
ARITA2-FIP 0,1 mM (SEQ ID NO: 25), ARITA2-BIP (SEQ ID NO: 26)
ARITA2-F3 0,02 mM (SEQ ID NO: 27), ARITA2-B3 (SEQ ID NO: 28)
ARITA2-LF 0,1 mM (SEQ ID NO: 29)
TAM-CT-LF 0,4 mM (SEQ ID NO: 15), FAM-NG-LB (SEQ ID NO: 23), Ale-ARITA2-LB (SEQ ID NO: 30) El siguiente reactivo también se añadió después de la reacción de amplificación.
Sonda marcada con desactivador:
CT-LFC-Q20,8 mM (SEQ ID NO: 16), NG-LBc-Q1 (SEQ ID NO: 24) y ARITA2-LBc-Q0 (SEQ ID NO: 31)
(4) Amplificación
Se añadió AD o uno o más de 104 copias de plásmidos CT, 104 copias de plásmidos NG y 102 copias de los plásmidos ARITA2 por reacción. La reacción de amplificación se realizó a 65 °C durante 120 minutos usando LA-320C.
T l 1
(5) Determinación
La reacción de amplificación se confirmó usando LA-320C de la misma manera que en el Ejemplo 1 (Tabla 3 y Fig. 7).
No se detectó ningún valor de Tt y no se observó aumento de la turbidez en el tubo de reacción suplementado con AD (negativo (-) para todos los plásmidos TC, NG y ARITA2). Por otro lado, se obtuvo cada valor de Tt y se confirmó un aumento de la turbidez en los tubos de reacción suplementados con uno, dos en combinación, o tres de los plásmidos CT, los plásmidos NG y los plásmidos ARITA2. Estos resultados demostraron que la reacción de amplificación se produjo solo en los tubos de reacción que contienen uno o más de los plásmidos CT, los plásmidos NG y los plásmidos ARITA2. 0,8 mM cada uno de CT-LFc-Q2 (SEQ ID NO: 16), NG-LBc-Q1 (SEQ ID NO: 24) y ARITA2-LBc-Q0 (SEQ ID NO: 31) se añadieron a cada tubo de reacción después de completar la amplificación. Los tubos de reacción se calentaron a 95 °C durante 5 minutos, luego se enfriaron a temperatura ambiente y luego se irradiaron con UV para confirmar la fluorescencia (Fig. 8).
No se confirmó fluorescencia en los tubos de reacción suplementados con AD, debido a la ausencia de productos de amplificación (Tubo N.° 1). La fluorescencia roja se confirmó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT (Tubo N.° 2). Asimismo, la fluorescencia verde se confirmó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos NG (Tubo N.° 3), mientras que la fluorescencia azul se confirmó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos ARITA2 (Tubo N.° 4). Los tubos de reacción suplementados con dos de los plásmidos presentaron color entre sus respectivos colores de fluorescencia. La fluorescencia amarilla se confirmó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT y los plásmidos NG (Tubo N.° 5). La fluorescencia violeta se confirmó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT y los plásmidos ARITA2 (Tubo N.° 6). La fluorescencia azul claro se confirmó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos NG y los plásmidos ARITA2 (Tubo N.° 7). La fluorescencia blanca se confirmó en el tubo de reacción suplementado con tres de los plásmidos (Tubo N.° 8).
Ejemplo 5. Detección de ácido nucleico diana (Chlamydia trachomatis) usando la sonda
(1) Preparación de muestra
Las soluciones de reacción LAMP después de la reacción de amplificación se usaron como muestras. En cuanto a las condiciones de reacción de LAMP, la composición y la concentración final de cada reactivo fueron como se muestra a continuación, y se agregaron 104 copias de plásmidos CT como molde por reacción o se añadió AD en lugar del molde para preparar 30 ml de cada una de las soluciones de reacción final de LAMP. La reacción de amplificación se realizó a 65 °C durante 40 minutos usando LA-320C. Las soluciones de reacción obtenidas se trataron térmicamente a 80 °C durante 5 minutos para la inactivación de la ADN polimerasa de Bst para evitar que se produzca una reacción de amplificación durante la detección posterior usando un cebador/sonda marcada con fluoróforo. Las soluciones de reacción de LAMP, es decir, las muestras, obtenidas de este modo se definieron como una muestra positiva cuando se preparó con los plásmidos CT como molde o como muestra negativa cuando se preparó mediante la adición de AD.
<Composición y concentración final de reactivo de reacción de LAMP>
Las soluciones de reacción final de LAMP se prepararon de manera que cada reactivo tuviera una concentración que se muestra a continuación en 30 ml de cada una de las soluciones de reacción.
Tris-HCI 30 mM (pH 8,8)
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
Tween 20 al 0,15 %
dATP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dCTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dGTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dTTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
ADN polimerasa de Bst 38,4 U (New England Biolabs Inc.)
<cebador de Chlamydia trachomatis>
CT-FIP 0,8 mM: 5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP 0,8 mM: 5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2)
CT-F30,1 mM: 5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 3)
CT-B30,1 mM: 5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-FL 0,4 mM: 5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (SEQ ID NO: 5)
CT-BL 0,4 mM: 5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 6)
(2) Síntesis de cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con desactivador
De los cebadores diseñados, se usó BL marcado en 5'-terminal con fluorescencia con FAM como un cebador/sonda marcada con fluoróforo, mientras que su cadena complementaria marcada en 3'-terminal con BHQ1 se usó como una sonda marcada con desactivador. La síntesis del cebador/sonda marcada con fluoróforo y la sonda marcada con desactivador se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd.
<cebador/sonda marcada con fluoróforo de Chlamydia trachomatis>
FAM-CT-BL: 5'-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 7)
<sonda marcada con desactivador de Chlamydia trachomatis>
CT-BLc-QI-0: 5'-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 8)
(3) Adición de cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con desactivador a la muestra
Se añadió cebador/sonda marcada con fluoróforo 0,4 mM (SEQ ID NO: 7) a cada muestra positiva y la muestra negativa preparada en el párrafo (1). Las muestras se trataron térmicamente a 95 °C durante 5 minutos para la desnaturalización del molde. Posteriormente, las muestras se enfriaron a temperatura ambiente para que hibridase el cebador marcado con fluoróforo con el molde.
Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió a la misma una sonda marcada con un desactivador 0,8 mM (SEQ ID NO: 8) y se agitó. Después, la fluorescencia de las muestras se confirmó bajo irradiación UV (Fig. 9).
(4) Determinación
No se detectó fluorescencia ni en la muestra positiva ni en la muestra negativa antes de la adición del cebador/sonda marcada con fluoróforo (Tubos N.° 1 y 2), y se detectó después de la adición del cebador/sonda marcada con fluoróforo FAM-CT-BL (SEQ ID n O: 7) (Tubos N.° 3 y 4). Estos tubos de reacción se calentaron a 95 °C durante 5 minutos, luego se enfriaron a temperatura ambiente y se suplementaron con la sonda CT-BLc-Q1-0 marcada con desactivador (SEQ ID NO: 8). La fluorescencia se desactivó en la muestra negativa, porque FAM-CT-BL (SEQ ID NO: 7) se une a CT-BLc-Q1-0 (SEQ ID NO: 8) en ausencia de productos de LAMP (Tubo N.° 5). Por el contrario, la fluorescencia se mantuvo en la muestra positiva, porque FAM-CT-BL (SEQ ID NO: 7) se une a los productos amplificados por LAMP con los plásmidos CT como molde, sin unión a CT-BLc-Q1-0 (SEQ iD NO: 8) (Tubo N.° 6).
Por consiguiente, el Ejemplo 5 muestra que se puede llevar a cabo el aspecto más básico de la presente invención que se muestra en la Fig. 1.
Ejemplo 6. Amplificación y detección de Chlamydia trachomatis utilizando el proceso de amplificación inteligente versión 2 (en adelante, denominado SMAP2) (amplificación de ácido nucleico y detección del producto de amplificación en presencia de sonda marcada con desactivador en el método de amplificación isotérmica SMAP2 que no sea LAMP) (1) Molde de ensayo
Una porción (SEQ ID NO: 21) de una región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis se subclonó como molde para el ensayo para preparar ADN de plásmido (en lo sucesivo, denominados plásmidos CT).
(2) Síntesis de cebador, cebador marcado con fluoróforo y sonda marcada con desactivador
Los cebadores para la reacción SMAP2 (un total de cinco cebadores: FP, TP, OP1, OP2 y BP) fueron diseñados para dirigirse a una parte de la región del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis y no tienen reactividad cruzada con bacterias relacionadas. De los cebadores diseñados, un cebador BP capaz de hibridar con un resto de bucle formado en productos de amplificación por un cebador TP se marcó fluorescentemente en 5'-terminal con Alexa350 y se usó como cebador/sonda marcada con fluoróforo. Se usó una cadena complementaria de cebador BP marcada en 3' con BHQ0 como una sonda marcada con desactivador. La síntesis del cebador se encargó a Operon Biotechnologies Inc. La síntesis del cebador/sonda marcada con fluoróforo y la sonda marcada con desactivador se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd.
<Cebador SMAP2 de Chlamydia trachomatis>
CT-FP: 5'-TTTATATATATATAAAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 34)
CT-TP: 5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 35)
CT-OP1: 5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (SEQ ID NO: 36)
CT-OP2: 5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 37)
<cebador/sonda marcada con fluoróforo de Chlamydia trachomatis>
Ale-CT-BP: 5'-(Alexa350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 38)
<sonda marcada con desactivador de Chlamydia trachomatis>
CT-BPc-QO: 5'-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3' (SEQ ID NO: 39)
(3) Composición y concentración del reactivo de reacción SMAP2
Las soluciones de reacción final SMAP2 se prepararon de manera que cada reactivo tuviera una concentración que se muestra a continuación en 30 ml de cada una de las soluciones de reacción.
Tris-HCI 30 mM (pH 8,8)
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
Tween 20 al 0,15 %
dATP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dCTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dGTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
dTTP 2,1 mM (GeneACT, Inc.)
ADN polimerasa de Bst 38,4 U (New England Biolabs Inc.)
Cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con un desactivador:
CT-FP 1,33 mM (SEQ ID NO: 34)
CT-TP 1,33 mM (SEQ ID NO: 35)
CT-OP1 0,17 mM (SEQ ID NO: 36)
CT-OP20,17 mM (SEQ ID NO: 37)
Ale-CT-BP 0,67 mM (SEQ ID NO: 38)
CT-BPc-QO 1,33 mM (SEQ ID NO: 39)
(4) Amplificación
Se añadió AD o 106 copias de plásmidos CT por reacción. La reacción de amplificación se realizó a 65 °C durante 45 minutos usando un aparato turbidimétrico en tiempo real Loopamp EXIA (TM) (Teramecs Co., Ltd.).
(5) Determinación
La reacción de amplificación se confirmó usando Loopamp EXIA(TM) (Loopamp EXIA (TM), que controla la reacción de amplificación de ácido nucleico basándose en el cambio en la absorbancia causado por la formación de su subproducto pirofosfato de magnesio, es decir, cambio en la turbidez; valor de Tt: tiempo requerido para que el valor aritmético de los datos de turbidimetría alcance un valor de determinación desde el inicio de la reacción; curva de turbidez: gráfico de los datos de turbidez del ensayo en tiempo real) (Tabla 4 y Fig. 10).
No se detectó ningún valor de Tt y no se observó aumento de la turbidez en el tubo de reacción suplementado con AD. Por otro lado, se confirmó un valor de Tt de 23,2 minutos y un aumento de la turbidez en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT. Estos resultados demostraron que la reacción de amplificación se produjo solo en los tubos de reacción que contienen los plásmidos CT, es decir, el ácido nucleico diana.
Cada tubo de reacción se irradió con UV después de la finalización de la reacción de amplificación para observar fluorescencia. Como resultado (Fig. 11), no se observó fluorescencia en el tubo de reacción suplementado con AD (Tubo N.° 1), y se observó en el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT (Tubo N.° 2).
El ejemplo 6 muestra que la presente invención puede llevarse a cabo no solo para el método LAMP sino también para diversas reacciones de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos.
_______ [Tabla 41_______
Tiempo de amplificación
Muestra Tt
AD 
N.D. *
CT 23,2
*N.D. : No detectado
Ejemplo 7. Detección de la longitud de onda de fluorescencia en un sistema de reacción de amplificación simultánea de dos o tres elementos
(1) Molde de ensayo
Una porción (SEQ ID NO: 21) de una región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis se subclonó como molde para el ensayo para preparar ADN de plásmido (en lo sucesivo, denominados plásmidos CT). También, se subclonó una porción (SEQ ID NO: 32) de la región mtrA de Neisseria gonorrhoeae como molde para el ensayo para preparar ADN plasmídico (en lo sucesivo, denominados plásmidos NG). Además, se subclonó una secuencia de ácido nucleico artificial (SEQ ID NO: 33) como molde para el ensayo para preparar ADN plasmídico (en lo sucesivo, denominados plásmidos ARITA2).
(2) Síntesis de cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con desactivador
Los cebadores para la reacción LAMP se diseñaron para dirigirse a la región de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis, a la región mtrA de Neisseria gonorrhoeae, o a la secuencia de ácido nucleico artificial y no tienen reactividad cruzada con bacterias relacionadas. De los cebadores diseñados, BL marcado en 5'-terminal con fluorescente con Alexa350 de Chlamydia trachomatis, BL marcado en 5'-terminal con fluorescente con TAMRA de Neisseria gonorrhoeae, y la secuencia de ácido nucleico artificial de BL marcado en 5'-terminal con fluorescente con FAM se usaron como cebadores/sondas marcadas con fluoróforo, mientras que una cadena complementaria de BL de Chlamydia trachomatis marcada en 3 'terminal con BHQO, una cadena complementaria de BL de Neisseria gonorrhoeae marcada en 3'-terminal con BHQ2, y una cadena complementaria de BL de la secuencia de ácido nucleico artificial marcada en 3'-terminal con BHQ1 se usaron como sondas marcadas con desactivador. La síntesis del cebador se encargó a Operon Biotechnologies Inc. La síntesis de los cebadores/sondas marcados con fluoróforo y las sondas marcadas con el desactivador se encargó a Japan Bio Services Co., Ltd.
<cebador de Chlamydia trachomatis>
CT-FIP: 5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP: 5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2)
CT-F3: 5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 3)
CT-B3: 5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-LF: 5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (SEQ ID NO: 5)
<cebador/sonda marcada con fluoróforo de Chlamydia trachomatis>
Ale-CT-LB: 5'-(Alexa350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (SEQ ID NO: 40)
<sonda marcada con desactivador de Chlamydia trachomatis>
CT-LBc-QO: 5'-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3' (SEQ ID NO: 41)
<cebador de Neisseria gonorrhoeae>
NG-FIP: 5'-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3' (SEQ ID NO: 17)
NG-BIP: 5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3' (SEQ ID NO: 18)
NG-F3: 5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3' (SEQ ID NO: 19)
NG-B3: 5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3' (SEQ ID NO: 20)
NG-LF: 5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3' (SEQ ID NO: 22)
<cebador/sonda marcada con fluoróforo de Neisseria gonorrhoeae>
TAM-NG-LB: 5'-(TAMRA)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3' (SEQ ID NO: 42)
<sonda marcada con desactivador de Neisseria gonorrhoeae>
NG-LBC-Q2: 5'-CGTTTTGTCG-(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 43)
<Cebador de ácido nucleico artificial>
ARITA2-FIP: 5'-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3' (SEQ ID NO: 25)
ARITA2-BIP: 5'-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3' (SEQ ID NO: 26)
ARITA2-F3: 5'-GGACAATCGAAGCCAGAA-3' (SEQ ID NO: 27)
ARITA2-B3: 5'-ATCACGGATCGTATGTGG-3' (SEQ ID NO: 28)
ARITA2-LF: 5'-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3' (SEQ ID NO: 29)
<Cebador/sonda marcada con fluoróforo de ácido nucleico artificial>
FAM-ARITA2-LB: 5'-(FAM)-AACGATCGCACTAAGCAT-3' (SEQ ID NO: 44)
Sonda marcada con desactivador de ácido nucleico artificiad
ARITA2-LBC-Q1: 5'-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 45)
(3) Composición y concentración del reactivo de reacción LAMP
Las soluciones de reacción final de LAMP se prepararon de manera que cada reactivo tuviera una concentración que se muestra a continuación en 30 ml de cada una de las soluciones de reacción.
Tris-HCI 30 mM (pH 8,8)
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
Tween 20 al 0,15 %
ATP 2,1 mM
CTP 2,1 mM
GTP 2,1 mM
TTP 2,1 mM
ADN polimerasa de Bst 38,4 U (New England Biolabs Inc.)
En cuanto a los cebadores, se añadieron uno o más conjuntos de 3 formas que contienen cebadores, cebadores/sondas marcadas con fluoróforo y sondas marcadas con desactivador descritas a continuación.
Estos conjuntos que contienen cada uno el cebador, el cebador/sonda marcada con fluoróforo y la sonda marcada con desactivador fueron: 3 tipos para la amplificación de un solo elemento de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y el ácido nucleico artificial, respectivamente; 3 tipos para la amplificación simultánea de dos elementos de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y ácido nucleico artificial, y Neisseria gonorrhoeae y ácido nucleico artificial, respectivamente; y un tipo para la amplificación simultánea de 3 elementos de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y el ácido nucleico artificial.
<cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo, y sonda marcada con desactivador de Chlamydia trachomatis>
CT-FIP 0,67 mM (SEQ ID NO: 1)
CT-BIP 0,67 mM (SEQ ID NO: 2)
CT-F30,17 mM (SEQ ID NO: 3)
CT-B30,17 mM (SEQ ID NO: 4)
CT-LF 0,33 mM (SEQ ID NO: 5)
Ale-CT-LB 0,67 mM (SEQ ID NO: 40)
CT-LBc-Q0 1,33 mM (SEQ ID NO: 41)
<cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo, y sonda marcada con desactivador de Neisseria gonorrhoeae>
NG-FIP 1,20 mM (SEQ ID NO: 17)
NG-BIP 1,20 mM (SEQ ID NO: 18)
NG-F30,17 mM (SEQ ID NO: 19)
NG-B30,17 mM (SEQ ID NO: 20)
NG-LF 0,67 mM (SEQ ID NO: 22)
TAM-NG-LB 0,67 mM (SEQ ID NO: 42)
NG-LBc-Q2 1,33 mM (SEQ ID NO: 43)
<Cebador, cebador/sonda marcada con fluoróforo y sonda marcada con desactivador de ácido nucleico artificiad
ARITA2-FIP 0,20 mM (SEQ ID NO: 25)
ARITA2-BIP 0,20 mM (SEQ ID NO: 26)
ARITA2-F30,03 mM (SEQ ID NO: 27)
ARITA2-B30,03 mM (SEQ ID NO: 28)
ARITA2-LF 0,13 mM (SEQ ID NO: 29)
FAM-ARITA2-LB 0,67 mM (SEQ ID NO: 44)
ARITA2-LBC-Q1 1,33 mM (SEQ ID NO: 45)
(4) Amplificación
Se añadió AD o uno o más de 103 copias de plásmidos CT, 103 copias de plásmidos NG y 103 copias de los plásmidos ARITA2 por reacción. La reacción de amplificación se realizó a 65 °C durante 45 minutos usando LoopampEXIA (TM).
(5) Determinación
La reacción de amplificación se confirmó usando Loopamp EXIA(TM).
Cada tubo de reacción se irradió con UV después de la finalización de la reacción de amplificación para observar fluorescencia.
También, cada solución de reacción después de la reacción de amplificación se diluyó 100 veces con un diluyente y se irradió con luz de excitación correspondiente a cada marcador fluorescente usando un espectrofluorofotómetro RF-5300PC (fabricado por Shimadzu Corp.) para escanear una longitud de onda de fluorescencia.
Composición del diluyente>
Tris-HCI 30 mM, pH 8,8
KCI 15 mM
(NH4)2SO415 mM
MgSO412 mM
La siguiente longitud de onda se usó como la luz de excitación correspondiente a cada marcador fluorescente.
Alexa350: 350 nm
TAMRA: 555 nm
FAM: 495 nm
1) Resultados de medir la longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de un solo elemento en el sistema de reacción de amplificación de Chlamydia trachomatis
En el tubo de reacción suplementado con AD, no se observó amplificación de ácido nucleico (el molde CT en la Tabla 5 muestra que no se detectó ningún valor de Tt; y la curva de amplificación de AD en la Fig. 12 no muestra aumento en la turbidez), y no se confirmó fluorescencia bajo radiación UV (Tubo N.° 1 en la Fig. 13). En el tubo de reacción suplementado con los plásmidos CT, se observó amplificación de ácido nucleico (el molde CT "+" en la Tabla 5 muestra un valor de Tt de 13,3 minutos; y la curva de amplificación de CT en la Fig. 12 muestra un aumento en la turbidez), y la fluorescencia azul presumiblemente derivada de Ale-CT-LB (SEQ ID NO: 40) se confirmó bajo irradiación UV (Tubo N.° 2 en la Fig. 13). En cuanto a la longitud de onda de fluorescencia, asimismo, solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm en la solución de reacción de molde(-) (suplementada con AD) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350 (Fig. 14A). Por otro lado, se confirmó un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde(+) (suplementado con plásmido CT) (Fig. 14B).
______________ [Tabla 51______________
Molde añadido y tiempo de amplificación
Molde CT -
Tt N.D.* 
13,3
* N.D. : No detectado
2) Resultados de medir la longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación de un solo elemento en el sistema de reacción de amplificación de Neisseria gonorrhoeae
En el tubo de reacción suplementado con AD, no se observó amplificación de ácido nucleico (el molde NG en la Tabla 6 muestra que no se detectó ningún valor de Tt; y la curva de amplificación de AD en la Fig. 15 no muestra aumento en la turbidez), y no se confirmó fluorescencia bajo radiación UV (Tubo N.° 1 en la Fig. 16). En el tubo de reacción suplementado con los plásmidos NG, se observó amplificación de ácido nucleico (el molde NG "+" en la Tabla 6 muestra un valor de Tt de 11,6 minutos; y la curva de amplificación de NG en la Fig. 15 muestra un aumento en la turbidez), y la fluorescencia roja presumiblemente derivada de TAM-NG-LB (SEQ ID NO: 42) se confirmó bajo radiación UV (Tubo N.° 2 en la Fig. 16). En cuanto a la longitud de onda de fluorescencia, asimismo, solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en la solución de reacción del molde (-) (suplementado con AD) irradiada con luz de excitación correspondiente con TAMRA (Fig. 17A). Por otro lado, la luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en la solución de reacción de molde(+) (suplementado con plásmido NG) (Fig. 17B).
_______________ [Tabla 61_______________
Molde añadido y tiempo de amplificación
Molde NG \ - \ +
_______ Tt________| N.D.* | 11,6
* N.D. : No detectado
3) Resultados de medir la longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación en un sistema de reacción de amplificación de ácido nucleico artificial de un solo elemento
En el tubo de reacción suplementado con AD, no se observó amplificación de ácido nucleico (el molde ARITA2 en la Tabla 7 muestra que no se detectó ningún valor de Tt; y la curva de amplificación de AD en la Fig. 18 no muestra aumento en la turbidez), y no se confirmó fluorescencia bajo radiación UV (Tubo N.° 1 en la Fig. 19). En el tubo de reacción suplementado con los plásmidos ARITA2, se observó amplificación de ácido nucleico (el molde ARITA2 "+" en la Tabla 7 muestra que no se detectó un valor de Tt dentro del tiempo de reacción, pero la curva de amplificación de ARITA2 en la Fig. 18 muestra un aumento en la turbidez; por lo tanto, se concluyó que el ácido nucleico se amplificó) y se confirmó la fluorescencia verde presumiblemente derivada de FAM-ARITA2-LB (SEQ ID NO: 44) bajo irradiación UV (Tubo N.° 2 en la Fig. 19).
En cuanto a la longitud de onda de fluorescencia, se observó luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico de fluorescencia derivado presumiblemente de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm tanto en la solución de reacción de molde(-) (suplementada con AD) (Fig. 20A) como en la solución de reacción de molde(+) (suplementada con plásmido ARITA2) (Fig. 20B) irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM. Sin embargo, se confirmó un pico más pequeño (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) en la solución de reacción de molde(-), mientras que se confirmó un pico más grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) en la solución de reacción del(los) molde(s).
_______________ [Tabla 71_______________
Molde añadido y tiempo de amplificación
Molde ARITA2 -
* N.D. : No detectado
4) Resultados de medir la longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación en un sistema de reacción de amplificación simultánea de dos elementos de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae
En el tubo de reacción suplementado con AD, no se observó amplificación de ácido nucleico (el molde CT y NG en la Tabla 8 muestran que no se detectó ningún valor de Tt; y la curva de amplificación de AD en la Fig. 21 no muestra aumento en la turbidez), y no se confirmó fluorescencia bajo radiación UV (Tubo N.° 1 en la Fig. 22). En el tubo de reacción suplementado solo con los plásmidos CT, solo los plásmidos NG, o los plásmidos CT y los plásmidos NG, se observó amplificación de ácido nucleico (Molde CT "+" y Molde NG "+" y CT y Molde CT "+" y NG "+" en la Tabla 8 muestran valores de Tt de 12,8 minutos, 13,6 minutos y 12,2 minutos, respectivamente; y las curvas de amplificación de CT, NG, y CT NG en la Fig. 21 muestran un aumento en la turbidez), y fluorescencia azul (Tubo N. 2 en la Fig. 22) presumiblemente derivada de Ale-CT-LB (SEQ ID NO: 40), fluorescencia roja (Tubo N.° 3 en la Fig. 22) presumiblemente derivada de TAM-NG-LB (SEQ ID NO: 42), y fluorescencia violeta (Tubo N.° 4 en la Fig. 22) presumiblemente derivada de Ale-CT-LB y TAM-NG-LB se confirmaron respectivamente bajo irradiación UV.
En cuanto a la longitud de onda de fluorescencia, la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm se confirmaron en la solución de reacción de molde CT y NG(-) (suplementada con AD) (Fig. 23A) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA.
Se confirmó un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT (+) y molde NG (-) (suplementada con plásmido CT y sin plásmido NG) (Fig. 23B) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA.
Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm en la solución de reacción de molde NG (+) y molde CT (-) (suplementada con plásmido NG y sin plásmido CT) (Fig. 23C) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que la luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA.
Un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB se confirmó alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación para Alexa350 alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT y NG (+) (suplementada con plásmido CT y suplementada con plásmido NG) (Fig. 23D) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que la luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA.
[Tabla 81
Molde añadido y tiempo de amplificación
CT -
Molde NG
Tt N.D.* 12,8 13,
12,2
* N.D. : No detectado
5) Resultados de medir la longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación en un sistema de reacción de amplificación simultánea de dos elementos de Chlamydia trachomatis y ácido nucleico artificial
En el tubo de reacción suplementado con AD, no se observó amplificación de ácido nucleico (el molde CT y ARITA2 en la Tabla 9 muestran que no se detectó ningún valor de Tt; y la curva de turbidez de AD en la Fig. 24 no muestra aumento en la turbidez), y no se confirmó fluorescencia bajo radiación UV (Tubo N.° 1 en la Fig. 25). En el tubo de reacción suplementado solo con los plásmidos CT, solo los plásmidos ARITA2, o los plásmidos CT y los plásmidos ARITA2, se observó amplificación de ácido nucleico (Molde CT "+" y ARITA2, molde a R|TA2 "+" y CT y molde CT "+" y ARITA2 "+" en la Tabla 9 muestran valores de Tt de 12,0 minutos, 28,2 minutos y 13,6 minutos, respectivamente; y las curvas de turbidez de CT, ARITA2 y CT ARITA2 en la Fig. 24 muestran un aumento en la turbidez) y fluorescencia azul (Tubo N.° 2 en la Fig. 25) presumiblemente derivada de Ale-CT-LB (SEQ ID NO: 40), fluorescencia verde (Tubo N.° 3 en la Fig. 25) presumiblemente derivada de FAM-ARITA2-LB (SEQ ID NO: 44), y fluorescencia azul claro (Tubo N.° 4 en la Fig. 25) presumiblemente derivada de Ale-CT-LB y FAM-ARITA2 -LB se confirmaron respectivamente bajo irradiación UV.
En cuanto a la longitud de onda de fluorescencia, la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm se confirmaron en la solución de reacción de molde CT y ARITA2 (-) (suplementada con AD) (Fig. 26A) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 495 nm en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Se confirmó un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT (+) y molde ARITA2 (-) (suplementada con plásmido CT y sin plásmido ARITA2) (Fig. 26B) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pequeño pico (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm en la solución de reacción de molde ARITA2 (+) y molde Ct (-) (suplementada con plásmido ARITA2 y no suplementada con plásmido CT) (Fig. 26C) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Se confirmó un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT y ARITA (+) (suplementado con plásmido CT y suplementado con plásmido ARITA2) (Fig. 26D) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350, mientras que la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
[Tabla 91
Molde añadido y tiempo^ de amplificación
CT - 
Molde ARITA2 - -
Tt N.D.* 12,0 28,2 13,6
* N.D. : No detectado
6) Resultados de medir la longitud de onda de fluorescencia después de la reacción de amplificación en un sistema de reacción de amplificación simultánea de dos elementos de Neisseria gonorrhoeae y ácido nucleico artificial
En el tubo de reacción suplementado con AD, no se observó amplificación de ácido nucleico (el molde de NG y ARITA2 en la Tabla 10 muestra que no se detectó ningún valor de Tt; y la curva de turbidez de AD en la Fig. 27 no muestra aumento en la turbidez), y no se confirmó fluorescencia bajo radiación UV (Tubo N.° 1 en la Fig. 28). En el tubo de reacción suplementado solo con los plásmidos NG, solo los plásmidos ARITA2, o los plásmidos NG y los plásmidos
ARITA2, se observó amplificación de ácido nucleico (molde NG "+" y ARITA2, molde ARITA2 "+" y NG y molde NG "+" y ARITA2 "+", en la Tabla 10 se muestran valores de Tt de 12,0 minutos, 29,0 minutos y 11,9 minutos, respectivamente; y las curvas de turbidez de NG, ARITA2 y NG+ARITA2 en la Fig. 27 muestran un aumento en la turbidez), y la fluorescencia roja (Tubo N.° 2 en la Fig. 28) presumiblemente derivada de TAM-NG-LB (SEQ ID NO: 42), la fluorescencia verde (Tubo N.° 3 en la Fig. 28) presumiblemente derivada de FAM-ARITA2-LB (SEQ ID NO: 44) y la fluorescencia amarilla (Tubo N.° 4 en la Fig. 28) presumiblemente derivados de TAM-NG-LB y FAM-ARITA2-LB se confirmaron respectivamente bajo irradiación UV.
En cuanto a la longitud de onda de fluorescencia, se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en la solución de reacción del molde NG y ARITA2(-) (suplementada con AD) (Fig. 29A) irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA, mientras que la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pequeño pico (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
La luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en la solución de reacción de molde NG (+) y molde ARITA2 (-) (suplementada con plásmido NG y no suplementado con plásmido ARITA2) (Fig. 29B) irradiado con luz de excitación correspondiente a TAMRA, mientras que la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pequeño pico (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en la solución de reacción del molde ARITA2 (+) y del molde NG (-) (suplementada con plásmido ARITA2 y sin plásmido NG) (Fig. 29C) irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA, mientras que la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
La luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia supuestamente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en la solución de reacción de molde NG y ARITA (+) (suplementada con plásmido NG y suplementada con plásmido ARITA2) (Fig. 29D) irradiado con luz de excitación correspondiente a TAMRA, mientras que la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAMARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
7) Resultados de medir la longitud de onda de fluorescencia después del sistema de reacción de amplificación en un sistema de reacción de amplificación de tres elementos de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y ácido nucleico artificial
En el tubo de reacción suplementado con AD, no se observó amplificación de ácido nucleico (Molde CT NG y ARITA2 en la Tabla 11 muestran que no se detectó ningún valor de Tt; y la curva de turbidez de AD en la Fig. 30 no muestra aumento en la turbidez), y no se confirmó fluorescencia bajo radiación UV (Tubo N.° 1 en la Fig. 31). En el tubo de reacción suplementado con uno, dos en combinación, o tres de los plásmidos CT, los plásmidos NG y los plásmidos ARITA2, se observó amplificación de ácido nucleico (Molde CT "+" y el otro molde NG "+" y el otro molde ARITA2 "+" y el otro molde CT "+" y NG "+", molde CT "+" y ARITA2 "+", molde NG "+" y ARITA2 "+", y molde CT "+", NG "+" y ARITA2 "+" en la Tabla 11 muestran valores de Tt de 14,3 minutos, 13,5 minutos, 35,6 minutos, 12,3 minutos, 14,2 minutos, 13,5 minutos y 12,4 minutos, respectivamente; y las curvas de turbidez de CT, NG, ARITA2, CT+NG, CT+ARITA2, NG+ARITA2 y CT+NG+ARITA2 en la Fig. 30 muestran un aumento en la turbidez), y la fluorescencia azul (Tubo N.° 2 en la Fig. 31) probablemente derivada de Ale-CT-LB (SEQ ID NO: 40), la fluorescencia roja (Tubo N.° 3 en la Fig. 31) presumiblemente derivada de TAM-NG-LB (SEQ ID NO: 42), la fluorescencia verde (Tubo N.° 4 en la Fig. 31) presumiblemente derivada de FAM-ARITA2-LB (SEQ ID NO: 44), la fluorescencia violeta (Tubo N.° 5 en la Fig. 31) presumiblemente derivada de Ale-CT-LB y TAM-NG-LB, la fluorescencia azul claro (Tubo N.° 6 en la Fig. 31) presumiblemente derivada de Ale-CT-LB y FAM-ARITA2-LB, la fluorescencia amarilla (Tubo N.° 7 en la Fig. 31) presumiblemente derivada de TAM-NG-LB y FAM-ARITA2-LB, y la fluorescencia blanca (Tubo N.° 8 en la Fig. 31) presumiblemente derivada de Ale-CT-LB, TAM-NG-LB y FAM-ARITA2-LB se confirmaron respectivamente bajo irradiación UV.
En cuanto a la longitud de onda de fluorescencia, solo la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm se confirmaron en la solución de reacción de molde CT, NG y ARITA2 (-) (suplementada con AD) (Fig. 32A) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. Solo se confirmó la luz
de excitación alrededor de 555 nm en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. La luz de excitación alrededor de 495 nm y un pequeño pico (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB se confirmó alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT (+) (suplementado con plásmido CT) (Fig. 32B) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. La luz de excitación alrededor de 495 nm y un pequeño pico (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm en la solución de reacción de molde NG (+) (suplementada con plásmido NG) (Fig. 32C) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. Un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB se confirmó alrededor de 580 nm, además de la luz de excitación alrededor de 555 nm, en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. La luz de excitación alrededor de 495 nm y un pequeño pico (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm en la solución de reacción de molde ARITA2 (+) (suplementado con plásmido ARITA2) (Fig. 32D) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. La luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Se confirmó un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación para Alexa350 alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT y NG (+) (suplementada con plásmido CT y suplementada con plásmido NG) (Fig. 32E) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. La luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. Por el contrario, solo la luz de excitación alrededor de 495 nm y un pequeño pico (intensidad de fluorescencia: menos de 20) (fondo) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB se confirmó alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT y ARITA2 (+) (suplementada con plásmido CT y suplementada con plásmido ARITA2) (Fig. 32F) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 555 nm en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. La luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Solo se confirmó la luz de excitación alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm en la solución de reacción de molde NG y ARITA2 (+) (suplementada con plásmido NG y suplementada con plásmido ARITA2) (Fig. 32G) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. La luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. La luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de Ale-CT-LB se confirmó alrededor de 443 nm, además de la luz de excitación para Alexa350 alrededor de 350 nm y un pico espectral Raman de agua alrededor de 398 nm, en la solución de reacción de molde CT y ARITA2 (+) (suplementada con plásmido CT y suplementada con plásmido ARITA2) (Fig. 32H) irradiada con luz de excitación correspondiente a Alexa350. La luz de excitación alrededor de 555 nm y un pico de fluorescencia presumiblemente derivado de TAM-NG-LB alrededor de 580 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a TAMRA. La luz de excitación alrededor de 495 nm y un pico lo suficientemente grande (intensidad de fluorescencia: más de 80) de fluorescencia presumiblemente derivado de FAM-ARITA2-LB alrededor de 522 nm se confirmaron en esta solución de reacción irradiada con luz de excitación correspondiente a FAM.
Claims (15)
1. Un método para detectar uno o más ácidos nucleicos diana presentes en una muestra, que comprende las siguientes etapas:
(1) agregar un cebador o sonda marcada con fluoróforo y una sonda marcada con un desactivador a la muestra, o agregar la muestra a un cebador o sonda marcada con fluoróforo y una sonda marcada con un desactivador, en donde el cebador o sonda marcada con fluoróforo es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con un ácido nucleico diana, y
la sonda marcada con desactivador es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador o sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador o sonda marcada con fluoróforo;
(2) incubar la muestra a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (TF) del cebador o sonda marcada con fluoróforo y superior a la temperatura de fusión (TF) de la sonda marcada con desactivador en la que se amplifica el ácido nucleico diana en condiciones isotérmicas por amplificación isotérmica de ácidos nucleicos iniciada por cebadores quiméricos (ICAN), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por círculo rodante (RCA), proceso de amplificación inteligente versión 2 (SMAP2) o amplificación isotérmica mediada por bucle (LAm P);
(3) hibridar el cebador o sonda marcado con fluoróforo que no está con el ácido nucleico diana, con la sonda marcada con desactivador incubando la muestra a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, desactivando de este modo con el desactivador la fluorescencia emitida por el cebador o sonda marcada con fluoróforo que no ha hibridado con el ácido nucleico diana; y
(4) medir la fluorescencia del cebador o sonda marcado con fluoróforo unido al ácido nucleico diana, mientras que la muestra se mantiene a una temperatura igual o inferior a la temperatura de fusión (Tf) de la sonda marcada con desactivador, en donde solo se pueden detectar los marcadores fluorescentes en el cebador o sonda marcado con fluoróforo unido con éxito al ácido nucleico diana.
2. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador tiene una longitud de bases más corta que la del oligonucleótido del cebador o sonda marcada con fluoróforo.
3. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador comprende una base modificada.
4. El método de detección de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cebador o sonda marcada con fluoróforo se inmoviliza sobre una superficie en fase sólida para su uso.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se usa una combinación de dos o más cebadores o sondas marcadas con fluoróforo que difieren en longitud de onda de emisión y sondas marcadas con inhibidor respectivamente compatibles con los mismos para detectar dos o más ácidos nucleicos diana.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la medición de la fluorescencia en la etapa (4) es la determinación visual.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la medición de la fluorescencia en la etapa (4) es la determinación usando un detector de fluorescencia.
8. Un kit para su uso en un método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una o más combinaciones, cada una de las cuales comprende:
un cebador o sonda marcado con fluoróforo, en donde el cebador o sonda marcada con fluoróforo es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con un ácido nucleico diana, y una sonda marcada con desactivador, en donde la sonda marcada con desactivador es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador o sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador o sonda marcada con fluoróforo, en donde el desactivador es compatible con el fluoróforo, y un cebador y una polimerasa para la amplificación en condiciones isotérmicas por ICAN, SDA, RCA, SMAP2 o LAMP.
9. El kit para la detección de ácido nucleico diana de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador tiene una longitud de bases más corta que la del oligonucleótido del cebador o sonda marcada con fluoróforo.
10. El kit para la detección de ácido nucleico diana de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador comprende una base modificada.
11. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el kit comprende además un reactivo
para la amplificación de ácido nucleico.
12. El kit para la detección de ácido nucleico diana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el cebador o sonda marcado con fluoróforo se inmoviliza sobre una superficie en fase sólida.
13. Uso de un kit en un método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el kit comprende una o más combinaciones, cada una de las cuales comprende:
un cebador o sonda marcado con fluoróforo, en donde el cebador o sonda marcada con fluoróforo es un oligonucleótido marcado con fluoróforo que tiene complementariedad con un ácido nucleico diana, y
una sonda marcada con desactivador, en donde la sonda marcada con desactivador es un oligonucleótido marcado con desactivador que tiene complementariedad con el cebador o sonda marcada con fluoróforo y que tiene una temperatura de fusión (Tf) menor que la del cebador o sonda marcada con fluoróforo, en donde el desactivador es compatible con el fluoróforo.
14. Uso del kit de acuerdo con la reivindicación 13, en donde:
(a) el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador tiene una longitud de bases más corta que la del oligonucleótido del cebador o sonda marcada con fluoróforo; o
(b) el oligonucleótido de la sonda marcada con desactivador comprende una base modificada.
15. Uso del kit de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde:
(a) el kit comprende además un reactivo para la amplificación de ácido nucleico; y/o
(b) el cebador o sonda marcada con fluoróforo se inmoviliza sobre una superficie en fase sólida.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011238174 | 2011-10-31 | ||
| PCT/JP2012/077596 WO2013065574A1 (ja) | 2011-10-31 | 2012-10-25 | 標的核酸の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2755934T3 true ES2755934T3 (es) | 2020-04-24 |
Family
ID=48191923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES12845733T Active ES2755934T3 (es) | 2011-10-31 | 2012-10-25 | Método para detectar ácido nucleico diana |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10876160B2 (es) |
| EP (1) | EP2787077B1 (es) |
| JP (1) | JP6085564B2 (es) |
| KR (1) | KR101958048B1 (es) |
| CN (2) | CN103975061A (es) |
| AU (1) | AU2012333771B2 (es) |
| CA (1) | CA2857308C (es) |
| ES (1) | ES2755934T3 (es) |
| HK (2) | HK1199287A1 (es) |
| TW (1) | TWI608103B (es) |
| WO (1) | WO2013065574A1 (es) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201319180D0 (en) * | 2013-10-30 | 2013-12-11 | Mast Group Ltd | Nucleic acid probe |
| DK3237636T3 (da) * | 2014-12-22 | 2021-01-25 | Anapa Biotech As | Dobbelt-quenching analyse til multiplex detektion af målnukleinsyrer |
| US10724091B1 (en) * | 2015-02-10 | 2020-07-28 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | Endpoint detection of amplified nucleic acids |
| US20180155764A1 (en) * | 2015-06-04 | 2018-06-07 | Mizuho Medy Co., Ltd. | Kit for together detecting multiple target nucleic acids differing from each other and detection method using the same |
| US10337051B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-07-02 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting a target RNA |
| CN110177887B (zh) * | 2016-11-10 | 2024-10-29 | 达丽斯生物医学公司 | 用于扩增和检测沙眼衣原体的多核苷酸 |
| CN110225919A (zh) * | 2016-11-10 | 2019-09-10 | 达丽斯生物医学公司 | 用于扩增和检测淋病奈瑟氏菌的多核苷酸 |
| US20190093155A1 (en) * | 2017-05-25 | 2019-03-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplex Nucleic Acid Amplification Assay |
| US11753681B2 (en) * | 2017-11-03 | 2023-09-12 | University Of Washington | Digital nucleic acid amplification using encoded particles |
| CN108531649B (zh) * | 2018-04-11 | 2022-03-22 | 四川农业大学 | 一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用 |
| US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
| EP3830301B1 (en) | 2018-08-01 | 2024-05-22 | Mammoth Biosciences, Inc. | Programmable nuclease compositions and methods of use thereof |
| US12275964B2 (en) | 2018-08-22 | 2025-04-15 | The Regents Of The University Of California | Variant type V CRISPR/Cas effector polypeptides and methods of use thereof |
| US20210317527A1 (en) | 2018-08-27 | 2021-10-14 | The Regents Of The University Of California | Reporter nucleic acids for type v crispr-mediated detection |
| JP2020065488A (ja) * | 2018-10-24 | 2020-04-30 | 国立感染症研究所長 | 重症熱性血小板減少症候群（ｓｆｔｓ）ウイルス検出用プライマーセット |
| EP3931313A2 (en) | 2019-01-04 | 2022-01-05 | Mammoth Biosciences, Inc. | Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection |
| MX2021010559A (es) | 2019-03-07 | 2021-12-15 | Univ California | Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos. |
| CN109837333B (zh) * | 2019-04-15 | 2022-06-21 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 同时检测多种目标基因的荧光实时检测试剂及方法 |
| US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
| US11377683B2 (en) | 2020-03-13 | 2022-07-05 | Uh-Oh Labs Inc. | Looped primer and loop-de-loop method for detecting target nucleic acid |
| US11047007B1 (en) | 2020-03-23 | 2021-06-29 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of SARS-CoV-2 |
| CN111394432B (zh) * | 2020-03-27 | 2023-03-24 | 深圳闪量科技有限公司 | 基于通用探针芯片的多重定量pcr检测系统 |
| WO2021240443A1 (en) | 2020-05-27 | 2021-12-02 | King Abdullah University Of Science And Technology | Iscan: an rt-lamp-coupled crispr-cas module for rapid, sensitive detection of sars-cov-2 |
| US20230348900A1 (en) * | 2020-08-20 | 2023-11-02 | Zymergen Inc. | High-throughput methods for the detection of ectopic integration of transforming dna |
| EP4206332A4 (en) * | 2020-08-31 | 2024-10-09 | Yokogawa Electric Corporation | TARGET MEASURING METHOD, TARGET MEASURING DEVICE, TARGET MEASURING APPARATUS AND TARGET MEASURING KIT |
| WO2023023673A2 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Kasa Bio, L.L.C. | Compositions and methods for multiplex detection of mirna and other polynucelotides |
| WO2024005458A1 (ko) | 2022-06-27 | 2024-01-04 | 주식회사 씨젠 | 베타-하이드록시산을 이용한 타겟 핵산의 증폭 방법 |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA862334B (en) | 1985-03-28 | 1987-11-25 | Cetus Corp | Process for amplifying,detecting and/or cloning nucleic acid sequences |
| US4996143A (en) * | 1985-12-23 | 1991-02-26 | Syngene, Inc. | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization |
| CA1323293C (en) | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| JP2650159B2 (ja) | 1988-02-24 | 1997-09-03 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 核酸増幅方法 |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| JP3737516B2 (ja) | 1995-06-26 | 2006-01-18 | パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド | 高速自動化連続流、多次元分子選別および分析 |
| US5716784A (en) | 1996-02-05 | 1998-02-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems |
| JP3016759B2 (ja) | 1997-02-28 | 2000-03-06 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転移 |
| EP1959255A3 (en) | 1997-04-04 | 2008-09-24 | Caliper Life Sciences, Inc. | Closed-loop biochemical analyzers |
| US6504083B1 (en) * | 1998-10-06 | 2003-01-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize Gos-2 promoters |
| EP1020534B2 (en) | 1998-11-09 | 2011-01-05 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
| JP3437816B2 (ja) | 1999-04-20 | 2003-08-18 | 環境エンジニアリング株式会社 | 核酸の測定方法 |
| US20040081959A9 (en) * | 1999-12-08 | 2004-04-29 | Epoch Biosciences, Inc. | Fluorescent quenching detection reagents and methods |
| JP2001272475A (ja) | 2000-03-27 | 2001-10-05 | Nec Ocean Eng Ltd | 自己浮上式海底地震観測装置 |
| TWI221855B (en) | 2000-04-11 | 2004-10-11 | Eiken Chemical | Process for synthesizing nucleic acid |
| ES2327712T3 (es) | 2000-09-19 | 2009-11-03 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Procedimiento para sintetizar polinucleotidos. |
| CN1348096A (zh) | 2000-10-10 | 2002-05-08 | 栾国彦 | 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法 |
| US20040086879A1 (en) * | 2001-12-20 | 2004-05-06 | Yingufu Li | Tripartite molecular beacons |
| AU2003228425A1 (en) * | 2002-04-01 | 2003-10-20 | Phase-1 Molecular Toxicology, Inc. | Liver necrosis predictive genes |
| JP5165177B2 (ja) | 2003-03-04 | 2013-03-21 | 栄研化学株式会社 | 核酸増幅の有無を検出する方法および装置 |
| US20050260619A1 (en) * | 2004-02-11 | 2005-11-24 | Roland Brousseau | DNA microarray for fingerprinting and characterization of microorganisms in microbial communities |
| US20060115838A1 (en) * | 2004-10-19 | 2006-06-01 | Trevigen Inc. | Real-time detection of amplicons using nucleic acid repair enzymes |
| US20060240462A1 (en) * | 2005-04-21 | 2006-10-26 | Johnson & Johnson Research Pty Limited | Methods for amplification and detection of nucleic acids |
| JP2006333739A (ja) * | 2005-05-31 | 2006-12-14 | Hitachi High-Technologies Corp | 単分子計測による核酸分析方法 |
| WO2007018601A1 (en) * | 2005-08-02 | 2007-02-15 | Rubicon Genomics, Inc. | Compositions and methods for processing and amplification of dna, including using multiple enzymes in a single reaction |
| US8097414B2 (en) * | 2005-11-25 | 2012-01-17 | K. K. Dnaform | Method for detecting and amplifying nucleic acid |
| US7488581B2 (en) * | 2006-03-20 | 2009-02-10 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method for detecting a target nucleic acid sequence |
| US20080228406A1 (en) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Myconostica Ltd. | System and method for fungal identification |
| JP5313157B2 (ja) | 2007-10-19 | 2013-10-09 | 栄研化学株式会社 | 核酸増幅法、それに用いる試薬及び試薬キット |
| EP2496705B1 (en) * | 2009-11-05 | 2018-01-03 | Becton Dickinson and Company | Sequence-specific methods for homogenous, real-time detection of lamp products |
| MX2012014917A (es) | 2010-06-22 | 2013-03-18 | Univ Hawaii | Monitoreo en tiempo real, especifico de secuencia de la amplificacion isotermica mediada por asa (lamp). |
| WO2012014778A1 (ja) * | 2010-07-26 | 2012-02-02 | オリンパス株式会社 | 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法 |
| WO2013063454A1 (en) * | 2011-10-27 | 2013-05-02 | Nesher Technologies, Inc. | Methods and compositions for multiplexed and ultrasensitive microrna detection |
-
2012
- 2012-10-25 US US14/354,991 patent/US10876160B2/en active Active
- 2012-10-25 CA CA2857308A patent/CA2857308C/en active Active
- 2012-10-25 ES ES12845733T patent/ES2755934T3/es active Active
- 2012-10-25 WO PCT/JP2012/077596 patent/WO2013065574A1/ja not_active Ceased
- 2012-10-25 AU AU2012333771A patent/AU2012333771B2/en active Active
- 2012-10-25 EP EP12845733.0A patent/EP2787077B1/en active Active
- 2012-10-25 HK HK14112730.4A patent/HK1199287A1/xx unknown
- 2012-10-25 KR KR1020147013855A patent/KR101958048B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2012-10-25 JP JP2013541737A patent/JP6085564B2/ja active Active
- 2012-10-25 CN CN201280058995.6A patent/CN103975061A/zh active Pending
- 2012-10-25 CN CN201711466811.0A patent/CN108103145A/zh active Pending
- 2012-10-30 TW TW101140141A patent/TWI608103B/zh active
-
2018
- 2018-07-04 HK HK18108668.4A patent/HK1249143A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2013065574A1 (ja) | 2013-05-10 |
| US10876160B2 (en) | 2020-12-29 |
| CN103975061A (zh) | 2014-08-06 |
| AU2012333771B2 (en) | 2017-10-05 |
| HK1199287A1 (en) | 2015-06-26 |
| KR20140091562A (ko) | 2014-07-21 |
| US20140349295A1 (en) | 2014-11-27 |
| EP2787077A4 (en) | 2015-07-01 |
| EP2787077A1 (en) | 2014-10-08 |
| EP2787077B1 (en) | 2019-10-23 |
| CA2857308A1 (en) | 2013-05-10 |
| HK1249143A1 (zh) | 2018-10-26 |
| JP6085564B2 (ja) | 2017-02-22 |
| CN108103145A (zh) | 2018-06-01 |
| CA2857308C (en) | 2019-10-01 |
| KR101958048B1 (ko) | 2019-03-13 |
| AU2012333771A1 (en) | 2014-06-26 |
| JPWO2013065574A1 (ja) | 2015-04-02 |
| TW201333209A (zh) | 2013-08-16 |
| TWI608103B (zh) | 2017-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2755934T3 (es) | Método para detectar ácido nucleico diana | |
| CN108774639B (zh) | 一种定向聚合的荧光探针pcr | |
| ES2684525T3 (es) | Composiciones de sonda:antisonda para detección de ADN o ARN de alta especificidad | |
| US9194007B2 (en) | Double-stranded probes for the fluorescent detection of nucleic acids | |
| ES2854049T3 (es) | Composiciones y procedimientos para la detección de Mycoplasma genitalium | |
| US10689718B2 (en) | HEV Assay | |
| CN115867653A (zh) | 用于检测靶核酸的环状引物和loop-de-loop方法 | |
| ES3031673T3 (en) | Compositions and methods for detection of candida auris | |
| CN109983138B (zh) | 用于检测bk病毒的组合物和方法 | |
| ES2773873T3 (es) | Detección de polimorfismo mononucleotídico usando cebador y sonda de fusión superpuestos | |
| ES2874259T3 (es) | Composiciones y procedimientos para la detección de Trichomonas vaginalis | |
| US20230257804A1 (en) | Switch oligonucleotide | |
| WO2018183621A1 (en) | Quantification of ngs dna by adapter sequence | |
| WO2015028792A1 (en) | Oligonucleotides comprising a secondary structure and uses thereof | |
| US20240318240A1 (en) | Target nucleic acid amplification method using guide probe and clamping probe and composition for amplifying target nucleic acid comprising same | |
| ES3008759T3 (en) | Helper oligonucleotide for improving efficiency of amplification and detection/quantitation of nucleic acids | |
| EP4334472A1 (en) | Compositions and methods for detecting hepatitis delta virus by a dual-target assay | |
| ES2622908T3 (es) | Ensayo de Neisseria gonorrhoeae | |
| US10370731B2 (en) | Compositions and methods for detection of hepatitis C virus genotype 3 | |
| ES2923224T3 (es) | Oligonucleótidos y métodos para el control interno de las reacciones de amplificación de ADN eucariota | |
| Huang et al. | Enzyme-free signal amplification of analyte in a single closed tube by fluorescent hybridization chain reaction. | |
| CN103290139A (zh) | 反转录环介导等温扩增检测禽流感病毒的试剂盒及方法 |