ES2756330T3

ES2756330T3 - Polipéptidos de factor de crecimiento insulínico estabilizados

Info

Publication number: ES2756330T3
Application number: ES13828987T
Authority: ES
Inventors: Mara Fornaro; Thomas Huber; Mauro Zurini
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2020-04-27
Anticipated expiration: 2033-12-16
Also published as: AP2015008440A0; MA38153B1; CU20150064A7; US20150329614A1; NZ708091A; KR102182523B1; GT201500168A; CU24308B1; PT2935320T; CR20150324A; HUE047386T2; EA201591165A1; SG11201503782PA; EP2935320B1; JP2016501025A; AU2013365796B2; JP6499080B2; ECSP15031046A; MY174820A; AU2013365796A1

Abstract

Un polipéptido que comrpende una proteína de IGF-1 humano, donde el aminoácido glicina en la posición 42 de dicha proteína de IGF-1 se muta a serina, y donde la numeración de los aminoácidos de dicha proteína de IGF-1 humano corresponde a la SEQ ID NO.: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de factor de crecimiento insulínico estabilizados

Campo técnico

Esta invención se encuentra en el campo de las modificaciones de factores de crecimiento insulínico 1 (IGF-1).

Antecedentes

Los factores de crecimiento insulínicos (IGF) son parte de un sistema complejo que utilizan las células para comunicarse con su entorno fisiológico. Este sistema complejo (a menudo denominado eje del factor de crecimiento insulínico) consta de dos receptores de la superficie celular (IGF-1R e IGF-2R), dos ligandos (IGF-1 e IGF-2), una familia de seis proteínas de unión a IGF con afinidad elevada (IGFBP 1 -6) y enzimas que degradan IGFBP asociadas (proteasas). Este sistema es importante no solamente para la regulación de la fisiología normal, sino también para una serie de estados patológicos (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003).

Se ha mostrado que el eje de IGF desempeña funciones en la promoción de la proliferación celular y la inhibición de la muerte celular (apoptosis). El IGF-1 es secretado principalmente por el hígado como resultado de la estimulación por parte de la hormona del crecimiento humana (hGH). Casi cada célula en el cuerpo humano está afectada por IGF-1, especialmente las células en los músculos, cartílago, huesos, hígado, riñón, nervios, piel y pulmones. Además de los efectos de tipo insulínico, el IGF-1 también puede regular el crecimiento celular. IGF-1 e IGF-2 son regulados por una familia de productos génicos conocidos como las proteínas de unión a IGF. Estas proteínas ayudan a modular la acción de IGF en formas complejas que conllevan tanto la inhibición de la acción de IGF evitando la unión a los receptores de IGF como la promoción de la acción de IGF a través de la contribución al suministro a los receptores y el aumento de la semivida de IGF en el torrente sanguíneo. Existen al menos seis proteínas de unión caracterizadas (IGFBP1-6).

En su forma madura, el IGF-1 humano, también denominado somatomedina, es una proteína de bajo peso molecular de 70 aminoácidos que se ha mostrado que estimula el crecimiento de una amplia variedad de células en cultivo. La proteína IGF-1 es codificada inicialmente por tres ARNm variantes de corte y empalme conocidos. El marco de lectura abierto de cada ARNm codifica una proteína precursora que contiene el IGF-1 de 70 aminoácidos (SEQ ID NO.: 1) y un péptido E particular en el extremo C terminal, dependiendo del ARNm de IGF-1 particular. Estos péptidos E se han denominado péptidos Ea (rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO.:2), Eb (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk; SEQ ID NO.:3) y Ec (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; SEQ ID NO.: 4) y oscilan entre 35 y 87 aminoácidos de longitud y engloban una región de secuencia común en el extremo N terminal y una región de secuencia variable en el extremo C terminal. Por ejemplo, el marco de lectura abierto de origen natural para IGF-1-Ea codifica un polipéptido de 135 aminoácidos que incluye la secuencia líder y un polipéptido de 105 aminoácidos sin la secuencia líder (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO.:5). En la expresión fisiológica, los péptidos E son escindidos del precursor por proteasas endógenas para proporcionar el IGF-1 de 70 aminoácidos maduro. La disponibilidad y la semivida de IGF-1 en suero humano está influenciada y modulada principalmente por proteasas y proteínas de unión a IGF-1 (IGFBP). IGFBP puede inhibir o potenciar actividades IGF-1 (Oh Y, et al., Characterization of the affinities of insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins 1-4 for IGF-I, IGF-II, IGF-I/insulin hybrid, and IGF-I analogs. Endocrinology. Marzo de 1993;132(3):1337-44). Se han descrito estrategias para aumentar la semivida de IGF-1 en la técnica anterior. Las estrategias que se han contemplado son

(i) la producción de variantes de IGF-1 que comprenden mutaciones específicas encaminadas a prevenir la escisión de IGF-1 en suero humano por serinproteasas, o a aliviar el impacto negativo de las proteínas de unión a IGF-1 en la disponibilidad o semivida en suero de IGF-1 (WO200040613, WO05033134, WO2006074390, WO2007/146689,); (ii) la producción de proteínas de fusión de IGF-1, donde la proteína IGF-1 madura se fusiona con una región Fc de inmunoglobulina humana (WO2005033134, WO200040613);

(iii) el uso de proteínas precursoras de IGF-1, donde la escisión del péptido E de IGF-1 por una proteasa se reduce mediante modificación de la proteína precursora (WO2007146689);

(iv) combinaciones de las estrategias descritas anteriormente ((i)/(ii) WO05033134, (i)/(ii) WO200040613, (i)/(iii) WO2007146689).

A pesar de las estrategias descritas anteriormente, las variantes de precursores de IGF-1 fusionadas a una región Fc de inmunoglobulina humana continúan siendo candidatos farmacológicos deficientes por dos razones principales: (i) bajo rendimiento de producción en un sistema de producción de mamífero, y (ii) mayor afinidad de unión al receptor de insulina (InsR) en comparación con el IGF-1 de origen natural humano sin modificar, que puede dar lugar a hipoglucemia, un evento adverso de interés terapéutico.

Por consiguiente, existe una necesidad de una tecnología que supere los problemas de la técnica anterior descritos anteriormente. La presente invención aborda esta necesidad en varios aspectos.

Compendio de la divulgación

Un primer objeto de la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende una proteína de IGF-1 humano (hIGF-1), donde el aminoácido de glicina en la posición 42 de dicha proteína hIGF-1 se elimina o sustituye, y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 1.

Una realización adicional de la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende una proteína de IGF-1 humano fusionada a una región Fc de inmunoglobulina de una IgG humana, donde el aminoácido de glicina en la posición 42 de la proteína de IGF-1 humano se elimina o sustituye, y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 1.

Otro objeto de la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende una proteína precursora de IGF-1 humano, donde el aminoácido de glicina en la posición 42 de dicha proteína precursora de IGF-1 humano se elimina o sustituye, y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5.

Una realización adicional de la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende una proteína precursora de IGF-1 humano fusionada con una región Fc de inmunoglobulina de una IgG humana, donde el aminoácido de glicina en la posición 42 de la proteína precursora de IGF-1 humano se elimina o sustituye, y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5.

En una realización determinada, la divulgación se refiere a los polipéptidos descritos anteriormente, donde el aminoácido de glicina en la posición 42 se elimina o se sustituye con serina.

En una realización adicional, la proteína de IGF-1 humano mencionada anteriormente comprende deleciones o mutaciones adicionales en los aminoácidos G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69 y/o A70.

Se divulga además una proteína precursora de IGF-1 humano que comprende un péptido Ea y deleciones o mutaciones adicionales de los aminoácidos G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77 G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 y/o M105.

En otra divulgación más, que se puede combinar con las realizaciones anteriores de la divulgación, la proteína precursora de IGF-1 humano y la región Fc están separadas por una región de bisagra peptídica.

Por consiguiente, la divulgación también se refiere a la proteína precursora de IGF-1 humano descrita anteriormente, donde la región de bisagra peptídica se selecciona del grupo constituido por los péptidos bisagra 1 (SEQ ID NO.: 22), bisagra 2 (SEQ ID NO.: 23) y bisagra 3 (SEQ ID NO.: 24).

En una realización particular de la divulgación, las proteínas precursoras de IGF-1 humano descritas anteriormente cuando se mutan en el péptido Ea en los aminoácidos R74, R77 y/o R104, dichos aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

Se divulga un polipéptido que comprende o está constituido por una proteína de IGF-1 humano o una proteína precursora de IGF-1 humano tal como se ha descrito anteriormente, donde

a. los aminoácidos E3, R71 y S72 se eliminan,

b. el aminoácido G42 se elimina o sustituye por serina, y

c. el aminoácido R37 se muta a alanina, y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5.

Otra divulgación particular se refiere a la proteína precursora de IGF-1 humano descrita anteriormente, donde el péptido E es el péptido Ea y donde

a. los aminoácidos G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan,

b. el aminoácido G42 se elimina o se muta a serina, y

c. los aminoácidos R36, R74, R77 y R104 se mutan a glutamina

d. el aminoácido R37 se muta a alanina, y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5.

a. los aminoácidos G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71, S72, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 y/o M105 se eliminan,

b. el aminoácido G42 se elimina o se muta a serina, y

c. los aminoácidos R36, R74 y R77 se mutan a glutamina, y

Asimismo, la divulgación se refiere a la proteína precursora de IGF-1 humano descrita anteriormente, donde el péptido E es el péptido Ea y donde

a. los aminoácidos G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan,

b. el aminoácido G42 se elimina o se muta a serina,

c. los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina, y

d. el aminoácido R37 se muta a ácido glutámico y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5.

b. el aminoácido G42 se elimina o se muta a serina,

c. los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina, y

Una divulgación particular adicional se refiere a la proteína de fusión de Fc precursora de IGF-1 humano descrita anteriormente, donde el péptido E es el péptido Ea y donde

a. los aminoácidos G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan,

b. el aminoácido G42 se elimina o se muta a serina, y

c. los aminoácidos R36, R74, R77 y R104 se mutan a glutamina,

d. el aminoácido R37 se muta a alanina, donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5, y

e. donde la proteína precursora de IGF-1 y la región Fc están separadas por la bisagra peptídica de bisagra 1 (SEQ ID NO.:22).

Además, la divulgación se refiere a la proteína de fusión de Fc precursora de IGF-1 humano descrita anteriormente, donde el péptido E es el péptido Ea y donde

a. los aminoácidos G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan,

b. el aminoácido G42 se elimina o se muta a serina,

c. los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina,

d. el aminoácido R37 se muta a ácido glutámico, donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5, y

e. donde la proteína precursora de IGF-1 y la región Fc están separadas por la bisagra peptídica de bisagra 3 (SEQ ID NO.: 24).

Una divulgación determinada se refiere a los polipéptidos descritos anteriormente, donde la región Fc se modifica para modular su unión al receptor de Fc.

Por consiguiente, la divulgación se refiere a la proteína de fusión de Fc precursora de IGF-1 humano descrita anteriormente, donde la región Fc se modifica para

I. reducir su afinidad por el receptor de Fc;

II. reducir la actividad ADCC; o

III. evitar la actividad ADCC.

Otra divulgación particular se refiere a las proteínas de fusión de Fc precursoras de IGF-1 humano descritas anteriormente que comprenden la SEQ ID NO.: 8, o SEQ ID NO.: 9, o SEQ ID NO.: 10, o SEQ ID NO.: 11, o SEQ ID NO.: 12, o SEQ ID NO.: 13, o SEQ ID NO.: 14, o SEQ ID NO.: 27.

En una determinada realización de la divulgación, que se puede combinar con las realizaciones precedentes de la divulgación, la proteína de fusión de Fc precursora de IGF-1 humano está glicosilada.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión de Fc precursoras de IGF-1 humano descritas anteriormente. Por consiguiente, la divulgación se refiere a un polinucleótido que comprende la molécula de ácido nucleico tal como se ha representado en la SEQ ID NO.:15 o SEQ ID NO.: 16 o SEQ ID NO.: 17 o SEQ ID NO.: 18 o SEQ ID NO.: 19 o SEQ ID NO.: 20 o SEQ ID NO.: 21.

La divulgación contempla además una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende cualquiera de las proteínas precursoras de IGF-1 humano divulgadas anteriormente para su uso en terapia.

En otra realización de la divulgación, el uso terapéutico mencionado anteriormente es el tratamiento de un trastorno muscular en un paciente que lo necesite. En una realización particular de la divulgación, el uso terapéutico es el tratamiento de pacientes de quemaduras que sufren pérdida de masa corporal magra y/o desgaste muscular o el tratamiento de pacientes de EPOC, o el tratamiento de pacientes de la enfermedad de Kennedy, o el tratamiento de pacientes de enfermedad renal crónica.

En una realización adicional de la divulgación, el trastorno muscular descrito anteriormente es atrofia muscular. Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, el uso terapéutico es el tratamiento de la sarcopenia asociada con la obesidad, sarcopenia y atrofia muscular asociada con la diabetes.

La divulgación contempla además un método para tratar un trastorno muscular en un paciente que lo necesite, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína precursora de IGF-1 humano descrita anteriormente de la invención.

Por consiguiente, en una realización particular, la divulgación se refiere a un método para tratar pacientes de quemaduras que padecen pérdida de masa muscular magra y/o desgaste muscular, o un método para tratar pacientes de EPOC, o un método para tratar pacientes de la enfermedad de Kennedy, o un método para tratar pacientes de enfermedad renal crónica.

Además, la divulgación proporciona un método para tratar un trastorno muscular en un paciente que lo necesite, donde el trastorno muscular es una atrofia muscular seleccionada del grupo constituido por sarcopenia asociada con la obesidad, sarcopenia y atrofia muscular asociada con la diabetes.

Además, la divulgación se refiere a un polipéptido de IGF-1 o un polipéptido precursor de IGF-1 tal como se ha descrito anteriormente, donde el aminoácido glicina en la posición 42 se elimina. Otra realización de la divulgación se refiere a un polipéptido de IGF-1 o un polipéptido precursor de IGF-1 tal como se ha descrito anteriormente, donde dicha proteína está pegilada.

Descripción breve de los dibujos

Figura 1: Afinidad de unión por IGF-1 R

La unión con afinidad elevada de variantes de hIGF-1 e IGF-1 a rhIGF1 R se midió utilizando resonancia de plasmón superficial (Biacore).

Figura 2 (A-D): Fosforilación de IGF-1 R en transfectantes de células NIH3T3-IGF-1R

Se cultivaron células NIH3T3 que sobreexpresaban el receptor de IGF-1 humano (NIH3T3-IGF-1R) durante 24 horas en medio de cultivo, se privaron de suero durante 18 horas en medio exento de suero y se estimularon durante 10 min a 37 °C con concentraciones equimolares de los péptidos indicados. Los niveles de fosforilación de IGF-1R se analizaron mediante ELISA. La fosforilación del receptor se expresa como % de control ± desviaciones estándar (DE) (células fibroblásticas embrionarias de ratón NIH 3T3 proceden de una línea celular aislada e iniciada en 1962 en el Departamento de Patología en la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York; Todaro GJ, Green H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J. Cell Biol. 17: 299-313, 1963)

Figura 3 (A-D): Fosforilación de InsR en transfectantes de células de NIH3T3-InsR

Se cultivaron células NIH3T3 que sobreexpresaban el receptor de insulina humano (NIH3T3-InsR) durante 24 horas en medio de cultivo, se privaron de suero durante 18 horas en medio exento de suero y se estimularon durante 10 min a 37 °C con concentraciones equimolares de los péptidos indicados. Los niveles de fosforilación de InsR se analizaron mediante ELISA. La fosforilación del receptor se expresa en forma de unidades arbitrarias ± desviaciones estándar (DE).

Figura 4 (A-C): Fosforilación de IGF-1 R en mioblastos primarios de cinomolgo y humanos

Las células se cultivaron en medio de crecimiento, se privaron de suero durante 4 horas y a continuación se estimularon con hIGF-1 o variantes de hIGF-1 durante 15 min a 37 °C. Los niveles de fosforilación de IGF-1R se analizaron mediante ELISA utilizando fósforo-IGF-1 R humano DuoSet IC. La fosforilación del receptor se expresa en forma de % de control ± desviaciones estándar (DE).

Figura 5 (A-D): Captación de glucosa en miotubos y adipocitos de ratón

Se sembraron adipocitos 3T3-L1 (B y D) y miotubos de ratón C2C12 (A y C) en placas de 24 pocillos y se cultivaron en DMEM exento de suero durante 4 horas. A continuación, el DMEM exento de suero se reemplazó por tampón KRP o HBS para los adipocitos 3T3-L1 y los C2C12, respectivamente. Las células se trataron durante 1 hora con los péptidos especificados a 37 °C. La captación de glucosa se midió añadiendo 0,4 (adipocitos) o 0,8 (C2C12) pCi de [3H] 2-desoxi-D-glucosa y 2-desoxi-D-glucosa 0,1 (adipocitos) o 0,01 (C2C12) mM durante 10 (adipocitos) o 5 (C2C12) minutos a temperatura ambiente. La radiactividad se analizó mediante recuento de centelleo.

Figura 6: Captación de glucosa: cronología en adipocitos

Los adipocitos 3T3-L1 se sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron en DMEM exento de suero (Medio de Eagle modificado de Dulbecco) durante 4 horas. A continuación, el DMEM exento de suero se reemplazó con tampón KRP y las células se trataron durante 15, 60, 90 y 120 minutos con los péptidos especificados a 37 °C. La captación de glucosa se midió añadiendo 0,4 pCi de [3H] 2-desoxi-D-glucosa y 2-desoxi-D-glucosa 0,1 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente. La radiactividad se analizó mediante recuento de centelleo. 3T3-L1 es una línea celular derivada de células 3T3 que se utiliza en investigación biológica sobre tejido adiposo, Green H, Kehinde O (1975). «An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion». Cell 5 (1): 19-27.

Figura 7 (A-B):

Las ratas macho adultas (n=3/grupo) recibieron una inyección subcutánea (s. c.) o de bolo intravenosa (i. v.) de hlGF-1-Ea-Fc_mut 13/2_A o hIGF-1-Ea-Fc_mut 04/2_E con una concentración de 10 mg/kg. Se recogieron muestras de sangre seriadas a las 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 168 y 336 horas después de la administración del material de prueba. Las concentraciones en suero de las proteínas recombinantes se determinaron mediante ELISA.

Figura 8 (A-C): Efectos de hIGF-1-Ea-Fc_mutantes contra la atrofia muscular inducida por dexametasona.

Los cambios en el peso corporal (A) y muscular (B y C) de los valores de los grupos (A) vehículo, (B) Dex, (C) Dex con hIGF-1 en forma de infusión con minibomba s. c. con una concentración de 3,8 mg/kg/día, (D) Dex con hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A s. c. cada dos días con una concentración de 3 mg/kg/día, (E) Dex con hIGF-1 -Ea-Fc_mut_13/2_A s. c. cada dos días con una concentración de 10 mg/kg/día y (F) Dex con hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A s. c. cada dos días con una concentración de 3 mg/kg/día se expresan en forma de promedios ± EEM (n=4-6). *: P < 0,05, **: P < 0,01, **: P < 0,001 frente al grupo B, ### P < 0,001 frente al grupo A (prueba de comparación múltiple de Dunnet después de ANOVA).

Figura 9: Producción de variantes de IGF-1 con diferentes mutaciones de G42 en células HEK293.

Datos de producción de un cultivo de HEK293F a una escala de 100 mL transfectado con FuGene. Los títulos se midieron con HPCL de la proteína A analítica a partir de los sobrenadantes de cultivo celular limpiados. Las concentraciones se midieron después de la purificación de la proteína A. Los niveles de agregación de proteínas purificadas se midieron mediante SEC-MALS.

Figura 10: Proporción de material cortado de hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-fc (SEQ ID NO. 6) (gris oscuro) y hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A (SEQ ID NO.9) (gris claro) expresados a partir de dos líneas celulares CHO diferentes. La proporción de material cortado se determinó a partir de la proteína purificada (cromatografía de la proteína A) de células derivadas de CHOK1 transfectadas, así como células derivadas de CHO-DUX11. La proporción de corte se determinó mediante análisis LC-MS de fase inversa. La proporción de material cortado es significativamente inferior para hIGF1 -Ea-hFc_mut13/2_A en ambas líneas celulares.

Figura 11: Crecimiento celular de células derivadas de CHO-K1 que expresan un anticuerpo recombinante (línea gruesa) y células derivadas de CHO-K1 que expresan hIGF-1Ea 3mut (SEQ ID NO.: 27) (línea de puntos) en experimentos del biorreactor. B: Porcentaje de células viables en experimentos del biorreactor (línea gruesa clon de derivado de CHO-K1 que produce anticuerpos, línea de puntos clones que expresan hIGF-1 Ea 3mut).

Figura 12: Número de células viables: La línea continua muestra el crecimiento celular de células derivadas de CHO-K1. Durante el cocultivo con IGF-1 de origen natural o hIGF-1 Ea 3mut, el crecimiento celular se inhibe (línea de puntos y discontinua, respectivamente). Se muestra el promedio de 3 replicados biológicos. IGF-1/hIGF-1 Ea 3mut se añadió en el día 2 (experimento de adición). B: Viabilidad celular: La línea continua muestra la viabilidad celular de la célula derivada de CHO-K1, la línea de puntos respectivamente la discontinua la viabilidad celular reducida después de la adición de IGF-1/hIGF-1Ea 3mut. La viabilidad celular desciende dos días antes si las células se coincubaban con IGF-1/hIGF-1Ea 3mut. No se pudo detectar diferencia entre IGF-1 y hIGF-1Ea 3mut en el crecimiento celular o la viabilidad celular.

Figura 13: Se muestra el crecimiento celular de células derivadas de CHO-DUXB11 (línea gruesa) y el crecimiento celular reducido durante el cocultivo con IGF-1 Ea 3mut (líneas de puntos). Después de añadir el inhibidor de tirosinacinasa IGF-1 R, NVPAEW541 (línea gruesa con asterisco), el crecimiento celular se reduce ligeramente. El cocultivo con IGF-1 Ea 3mut y la adición del inhibidor tirosina cinasa de IGF-1 R no dio lugar a ninguna inhibición del crecimiento celular adicional (línea de puntos con asterisco).

Figura 14: En negrita se muestra el crecimiento celular de las células derivadas de CHO-K1 de origen natural (WT) y en negrita con círculos se muestra el crecimiento celular reducido durante el cocultivo con IGF-1. Con líneas de puntos se muestra el crecimiento celular de los tres clones con IGF-1 R KO. El crecimiento celular se mejora ligeramente en comparación con las células derivadas de CHO-K1 de origen natural. El cocultivo con IGF-1 dio lugar solamente a una inhibición de crecimiento celular minoritaria y el crecimiento celular es similar a la célula derivada de CHO-K1 de origen natural sin cocultivo de IGF-1.

Figura 15: Se muestran los títulos de las proteínas de fusión de IGF-1-Fc de cultivos en modo discontinuo de 14 días (nivel de grupo). Se resaltan las expresiones de 7 proteínas de fusión de IGF-1-Fc diferentes en 5 líneas celulares diferentes. La expresión de las proteínas de fusión de IGF-1-Fc aumentó en un factor 5-20 en líneas celulares IGF-1R-KO derivadas de CHO-K1, líneas celulares IGF-1 R-KO derivadas de CHO-DUXB11, así como en líneas celulares con ARNhc derivadas de CHO-DUXB11 (expresión reducida de IGF-1R e INSR) en comparación con las líneas celulares de origen natural derivadas de CHO-DUXB11 o CHO-K1.

Figura 16: Títulos de la fusión de IGF-1-Fc de cultivos discontinuos de 14 días en matraces de agitación de 50 mL. Los títulos de la proteína de fusión de IGF-1-Fc: hIGF-1-Ea-fc_mut 13/2_A en los 15 mejores clones de IGF-1R-KO derivados de CHO-DUXB11 es aproximadamente un factor 6-7 superior en comparación con el título de la proteína de fusión de IGF-1-Fc: hIGF-1-Ea-A1-3, R37A, A71-72, R77Q-dominio fc en clones de células de origen natural derivadas de CHO-DUXB11.

Figura 17: Producción y estimulación con proteínas de variantes de IGF-1 en células HEK293F.

Datos de producción de un cultivo de HEK293T a una escala de 100 mL transfectado con PEI. Rendimiento después de la purificación de la proteína A extrapolado a un volumen de cultivo de 1 L. Agregación medida por SEC-MALS después de la purificación de la proteína A. Las proteínas purificadas se incubaron con medio de CHO acondicionado a partir de células derivadas de CHOK1 durante 5 días y células derivadas de CHODUXB11 durante 20 días. Se muestra el porcentaje de proteína completa restante. Método descrito en el Ejemplo 2.

Figura 18: Fosforilación de InsR en transfectantes de células de NIH3T3-InsR

Se cultivaron células NIH3T3 que sobreexpresaban el receptor de insulina humano (NIH3T3-InsR) durante 24 horas en medio de crecimiento, se privaron de suero durante 18 horas en medio exento de suero y se estimularon durante 10 min a 37 °C con concentraciones equimolares de los péptidos indicados. Los niveles de fosforilación de InsR se analizaron mediante ELISA. La fosforilación del receptor se expresa en forma de unidades arbitrarias ± desviaciones estándar (DE).

Figura 19: Captación de glucosa en miotubos y adipocitos de ratón

Se sembraron adipocitos 3T3-L1 (A) y miotubos de ratón C2C12 (B) en placas de 24 pocillos y se cultivaron en DMEM exento de suero durante 4 horas. A continuación, el DMEM exento de suero se reemplazó por tampón KRP o HBS para los adipocitos 3T3-L1 y los C2C12, respectivamente. Las células se trataron durante 1 hora con los péptidos especificados a 37 °C. La captación de glucosa se midió añadiendo 0,4 (adipocitos) o 0,8 (C2C12) gCi de [3H] 2-desoxi-D-glucosa y 2-desoxi-D-glucosa 0,1 (adipocitos) o 0,01 (C2C12) mM durante 10 (adipocitos) o 5 (C2C12) minutos a temperatura ambiente. La radiactividad se analizó mediante recuento de centelleo.

Definiciones generales

Con el fin de que la presente invención se pueda entender más fácilmente, en primer lugar se definen determinados términos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

Que comprende: la expresión «que comprende» se refiere a «que incluye», por ejemplo, una composición «que comprende» X puede estar constituida exclusivamente por X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El símbolo «A» o las letras «d» o «D»: en el contexto de una descripción de proteína (por ejemplo, «hIGF-1-Ea- A1-3, R37A, A 71-72, R77Q-dominio fc» o «hIGF-1 -Ea-D1 -3, R37A, D71-72, R77Q-dominio fc») se refieren a una eliminación de aminoácidos. Como ejemplo, el término «D71-72, 77» (en el contexto de la proteína hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-fc) describe el hecho de que los aminoácidos 71,72 y 77 se han eliminado.

La proteína del factor de crecimiento insulínico 1 o una variante de esta: la frase «proteína del factor de crecimiento insulínico 1 o una variante de esta» se refiere a proteínas que son codificadas por genes del factor de crecimiento insulínico 1, se prefiere particularmente la proteína del factor de crecimiento insulínico 1 humano (hIGF1) y variantes de esta. Una variante de la proteína IGF-1 es una proteína que difiere en al menos un aminoácido de la secuencia de origen natural de IGF-1, donde la expresión «secuencia de origen natural» se refiere a una secuencia de un gen o un polipéptido disponible en al menos un organismo natural o una secuencia de un gen o un polipéptido que no ha sido modificada, mutada o manipulada de otro modo por el hombre. Las expresiones variantes de IGF-1 y mimético de IGF-1 se utilizan indistintamente a lo largo del documento. Una variante de IGF-1 es también la proteína precursora de IGF-1 o la proteína pro-IGF-1 que comprende una secuencia líder peptídica. Una variante de IGF-1 es también una proteína de fusión que comprende una proteína IGF-1, p. ej., una proteína que comprende una proteína IGF-1 fusionada a una región Fc de inmunoglobulina. Algunos ejemplos para variantes de IGF-1 se divulgan, entre otras, en las solicitudes de patente WO05033134 (proteína IGF-1 estabilizada fusionada a una región Fc de inmunoglobulina) y WO2007146689 (proteínas precursoras de IGF-1 estabilizadas). Una variante de IGF-1 tal como se ha descrito anteriormente retiene su actividad biológica en el sentido de que dicha proteína se puede considerar como un equivalente funcional de la IGF-1 de origen natural.

Los equivalentes funcionales con respecto a la proteína IGF-1 se han de entender como proteínas IGF-1 que comprenden una mutación natural o artificial. Las mutaciones pueden ser inserciones, deleciones o sustituciones de uno o más ácidos nucleicos que no disminuyan la actividad biológica de la proteína IGF-1. Los equivalentes funcionales que tienen una identidad de al menos un 80%, preferentemente un 85%, más preferentemente un 90%, de la forma más preferente más de un 95%, de forma muy especialmente preferente al menos un 98% de identidad, pero menos de un 100% de identidad respecto a la proteína IGF-1 de origen natural, p. ej., la proteína de IGF-1 humano con la SEQ ID NO.: 1. En el caso de las proteínas de fusión como las descritas anteriormente, el 100% de identidad se debería definir solamente basándose en la parte IGF-1 de una proteína de fusión de este tipo.

Los factores de crecimiento insulínicos (IGF) son parte de un sistema complejo que utilizan las células para comunicarse con su entorno fisiológico. Este sistema complejo (a menudo denominado eje del factor de crecimiento insulínico) consta de dos receptores de la superficie celular (IGF-1R e IGF-2R), dos ligandos (IGF-1 e IGF-2), una familia de seis proteínas de unión a IGF con afinidad elevada (IGFBP 1 -6) y enzimas que degradan IGFBP asociadas (proteasas). Este sistema es importante no solamente para la regulación de la fisiología normal, sino también para una serie de estados patológicos (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003). Se ha mostrado que el eje de IGF desempeña funciones en la promoción de la proliferación celular y la inhibición de la muerte celular (apoptosis). IGF-1 es secretado principalmente por el hígado como resultado de la estimulación por parte de la hormona del crecimiento humana (hGH). Casi cada célula en el cuerpo humano está afectada por IGF-1, especialmente las células en los músculos, cartílago, huesos, hígado, riñón, nervios, piel y pulmones. Además de los efectos similares a insulina, el IGF-1 también puede regular el crecimiento celular. IGF-1 e IGF-2 son regulados por una familia de productos génicos conocidos como las proteínas de unión a IGF. Estas proteínas ayudan a modular la acción de IGF en formas complejas que conllevan tanto la inhibición de la acción de IGF evitando la unión a los receptores de IGF como la promoción de la acción de IGF a través de la contribución al suministro hacia los receptores y el aumento de la semivida de IGF en el torrente sanguíneo. Existen al menos seis proteínas de unión caracterizadas (IGFBP1-6). IGF-1 se utiliza en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas. La mecasermina (nombre comercial Increlex™) es un análogo sintético de IGF-1 que está aprobado para el tratamiento del fallo del crecimiento. Varias compañías han evaluado IGF-1 en ensayos clínicos para una serie de indicaciones adicionales, que incluyen diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, esclerosis lateral amiotrófica, lesión por quemadura grave y distrofia muscular miotónica.

Por claridad y consistencia, la numeración de los residuos de aminoácido en proteínas precursoras o maduras de IGF-1 a lo largo de esta solicitud y en las reivindicaciones se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de origen natural del factor de crecimiento insulínico 1 humano (somatomedina C), isoforma CRA_c (n.° de acceso EAW97697) sin péptido señal (es decir, SEQ ID NO.: 5).

Célula de mamífero: la expresión «célula de mamífero» en el contexto del método divulgado se refiere a células de mamífero que son adecuadas para la producción proteica a escala de fabricación industrial.

Esas células son muy conocidas para el experto y se han originado, por ejemplo, a partir de las especies Cricetulus griseus, Cercopithecus aethiops, Homo sapiens, Mesocricetus auratus, Mus musculus y Chlorocebus. Las respectivas líneas celulares se conocen como células CHO (ovario de hámster chino), células COS (una línea celular procedente de riñón de mono (mono verde africano), células Vero (células epiteliales de riñón extraídas de mono verde africano), células Hela (la línea se obtuvo de células de cáncer de cérvix tomadas de Henrietta Lacks), células BHK (células renales de crías de hámster, células HEK (riñón embrionario humano), células NS0 (línea de células de mieloma murino), células C127 (línea celular de ratón no tumorogénica), células PerC6® (línea celular humana, Crucell), células CAP (producción de Amniocitos de CEVEC) y células Sp-2/0 (células de mieloma de ratón).

La expresión «especificidad por receptor de las proteínas de la técnica anterior de IGF-1 estabilizadas» en el contexto de esta solicitud se refiere también a la capacidad reducida para inducir la fosforilación del receptor de insulina (potencia y/o eficacia reducida) de las moléculas de IGF-1 de las invenciones en comparación con las variantes de IGF-1 de la técnica anterior, que reduce el riesgo de inducir hipoglucemia, un evento adverso de interés terapéutico.

Precursor: En lo sucesivo, el término «precursor» cuando se utiliza en el contexto de la presente divulgación se referirá al precursor de la proteína de IGF-1 humano maduro sin péptido señal, pero que incluye el péptido Ea, Eb y Ec, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

Se han producido y evaluado moléculas que comprenden un péptido Ea fusionado a una región Fc de inmunoglobulina, donde los residuos de proteína G1, P2, E3, R71 y S72 han sido eliminados, el aminoácido R77 se ha eliminado o sustituido por glutamina y el aminoácido R37 se ha sustituido por alanina (hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72, 77-dominio fc (SEQ ID NO.:6) y hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72, R77Q-dominio fc (SEQ ID NO.:7)). La expresión de un hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72del71-72, 77-dominio fc (SEQ ID NO.:6) en un sistema de células de mamífero no fue posible, debido a problemas de agregación y degradación (más de un 90% de la proteína producida se degradó; remítase a la figura 10)

Además, las proteínas del hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72del71-72, 77-dominio fc (SEQ ID NO.:6) mostraron una disminución en la especificidad por el receptor en comparación con el IGF-1 maduro sin modificar en un ensayo de fosforilación de InsR de NIH3T3 (remítase a la figura 3).

Por tanto, las variantes del precursor de IGF-1 fusionadas a una región Fc de inmunoglobulina humana son candidatos farmacológicos deficientes, debido a (i) un rendimiento de producción bajo en un sistema de producción de mamífero, y (ii) una mayor afinidad de unión al receptor de insulina (InsR) en comparación con el IGF-1 de origen natural humano sin modificar, que puede dar lugar a hipoglucemia, un evento adverso de interés terapéutico.

La invención se basa en la sorprendente observación de que (1) el rendimiento de producción en los sistemas de producción de células de mamíferos y (2) la especificidad por el receptor de las proteínas de IGF-1 nativas o las proteínas de la técnica anterior de IGF-1 estabilizadas se pueden mejorar introduciendo mutaciones de aminoácidos específicas adicionales, donde diferentes mutaciones resuelven problemas diferentes y dichas mutaciones se pueden combinar para abordar múltiples cuestiones relacionadas con el rendimiento de producción, la eficacia y/o la especificidad por el receptor.

Un resultado sorprendente particular fue la observación de que la proteína de IGF-1 humano (SEQ ID NO.: 1) que se muta en la posición G42 (sustituciones de G42S) induce una captación de glucosa inferior en sistemas miotubos de C2C12 y adipocitos (3T3-L1) in vitro en comparación con el IGF-1 de origen natural humano sin modificar, lo que podría reducir el riesgo de hipoglucemia del tratamiento con IGF-1 in vivo (figura 19).

Un resultado sorprendente particular adicional fue la observación de que las proteínas de la técnica anterior precursoras de IGF-1 humano que se mutan en la posición G42 (deleción o sustituciones específicas) muestran una capacidad similar para estimular la fosforilación del receptor de insulina (InsR) que el IGF-1 de origen natural humano sin modificar, lo cual disminuye el riesgo de hipoglucemia de las variantes de IGF-1 de la técnica anterior (figura 3). Incluso más sorprendente fue la observación de que la mutación de G42S tiene un impacto positivo adicional en el rendimiento de producción de las proteínas de la técnica anterior precursoras de IGF-1 humano que se fusionan a una región Fc de inmunoglobulina en una célula de mamífero (figura 10/17), es decir, la formación de agregados que tienen un impacto negativo en el rendimiento de producción se podría reducir drásticamente introduciendo una mutación G42S (figura 9/17). En consecuencia, la invención se basa hasta cierto punto en el hallazgo sorprendente de que manipulando el aminoácido glicina 42 en la proteína de IGF-1 humano o variantes precursoras de IGF-1 humano de esta, se podrían haber superado dos trabas técnicas principales en el desarrollo de las variantes de IGF-1 terapéuticas. En otro aspecto, la divulgación proporciona una solución para el problema de que no se puedan producir las proteínas precursoras de IGF-1 de la técnica anterior fusionadas a una región Fc de inmunoglobulina de una IgG humana a escala industrial en células de mamífero, debido a que dichas proteínas de fusión son degradadas fácilmente por las proteasas de las células de mamífero. En consecuencia, en otro aspecto la divulgación se refiere al hallazgo sorprendente de que manipulando aminoácidos específicos en variantes precursoras del péptido Ea de IGF-1 se podría haber superado una traba técnica principal adicional en el desarrollo de variantes precursoras de IGF-1 terapéuticas.

Los ejemplos de dichas moléculas inventivas incluyen los siguientes polipéptidos:

Una proteína de IGF-1 humano (SEQ ID N.°: 1) donde el aminoácido G42 se sustituye por el aminoácido serina. Una proteína de IGF-1 humano (SEQ ID N.°: 1) donde el aminoácido G42 se sustituye por el aminoácido serina y donde el o los aminoácidos

(a) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R36 se sustituye o elimina; o

(b) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q); o

(c) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye o elimina; o

(d) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E); o

(e) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye por alanina; o

(f) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P); o

(g) G1, P2, E3 se eliminan y los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen o eliminan; o

(h) G1, P2, E3 se eliminan y los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q); o

(i) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y R37 se sustituye por alanina.

Una proteína de IGF-1 humano (SEQ ID N.°: 1) donde el aminoácido G42 se sustituye por el aminoácido serina y donde el aminoácido E3 se elimina y el aminoácido R37 se sustituye por alanina.

Una proteína de IGF-1 humano (SEQ ID N.°: 1) donde el aminoácido G42 se sustituye por el aminoácido serina y donde el aminoácido E3 se elimina y el aminoácido R37 se sustituye por alanina fusionada a una región Fc de inmunoglobulina, particularmente una región Fc modificada, particularmente una región Fc, que se modifica para modular su unión al receptor Fc, tal como se describe más adelante.

Otro polipéptido de la invención es la proteína de IGF-1 humano de SEQ ID NO.: 117.

Otro polipéptido divulgado es la proteína precursora de IGF-1 humano de SEQ ID NO.: 118.

Se ha descubierto que la mutación o deleción de los aminoácidos R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 y/o M105 de las proteínas precursoras del péptido Ea de IGF-1 de la técnica anterior mencionadas anteriormente da lugar a un rendimiento superior de proteína no degradada cuando es expresada por células de mamífero. Se ha descubierto además que la combinación de las mutaciones/deleciones mencionadas en las posiciones R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 y/o M105 da lugar a un efecto sinérgico. Por lo tanto, en una realización de la divulgación R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 y/o M105, siempre que la proteína IGF-1 modificada comprenda el péptido Ea (SEQ ID NO.: 2), se elimina o se muta en las proteínas precursoras de IGF-1 modificadas divulgadas en la presente. En una realización de la divulgación, R74, R77 y/o R104 se mutan a Q en las proteínas precursoras de IGF-1 divulgadas en la presente. En una realización adicional de la divulgación, K68, S69, A70, R71 y/o R72 se pueden eliminar o mutar adicionalmente en las proteínas precursoras de IGF-1 modificadas divulgadas en la presente.

Por consiguiente, se divulgan polipéptidos que contienen una proteína precursora de IGF-1 humano, es decir, que comprende el péptido Ea de IGF-1 humano, donde el aminoácido glicina en la posición 42 se elimina o sustituye por otro aminoácido y donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5. El péptido E puede ser el péptido Ea, Eb o Ec (SEQ ID NO.: 2-4). En una realización particular de la divulgación, el aminoácido glicina en la posición 42 se elimina o sustituye por el aminoácido o serina.

En una realización de la divulgación, la proteína precursora del péptido Ea de IGF-1 humano descrito anteriormente que se muta en la posición G42 tal como se ha descrito anteriormente (eliminada o mutada a serina) comprende deleciones y/o mutaciones adicionales en los aminoácidos G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 y/o M105, donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5.

Algunos ejemplos de dichas moléculas divulgadas son los siguientes polipéptidos:

Un polipéptido que comprende una proteína precursora del péptido Ea de IGF-1 humano, donde el aminoácido G42 se sustituye por el aminoácido serina y donde el o los aminoácidos

(1) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. (2) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. (3) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. (4) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

(5) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. (6) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. (7) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen o eliminan y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

(8) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

(9) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

(10) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R77 se muta a glutamina (Q).

(11) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(12) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y Q104 se mutan a glutamina (Q).

(13) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(14) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(15) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(16) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R77 se muta a glutamina (Q).

(17) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(18) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(19) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(20) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(21) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(22) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(23) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(24) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina.

(25) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(26) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(27) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(28) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(29) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(1a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(2a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(3a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(4a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(5a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(6a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(7a) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen o eliminan y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(8a) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(9a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(10a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(11a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(12a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y Q104 se mutan a glutamina (Q).

(13a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(14a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(15a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(16a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(17a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(18a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(19a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(20a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(21a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(22a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(23a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S7272 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(24a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina.

(25a) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(26a) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(27a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(28a) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(29a) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

En otra realización la divulgación se refiere a las proteínas descritas anteriormente que comprenden los polipéptidos (1 )-(29a), donde dichas moléculas en lugar de mutarse en las posiciones 1 -3, solamente se elimina el aminoácido E3 (p. Ej., la molécula (28a) también se podría referir a un polipéptido que comprende una proteína precursora del péptido Ea de IGF-1 humano donde el aminoácido G42 se sustituye por el aminoácido serina y donde el aminoácido E3 se elimina, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).)

Además, la divulgación se refiere a un polipéptido que contiene una proteína precursora de IGF-1 humano, es decir, que comprende el polipéptido Ea de IGF-1 humano, que se fusiona a una región Fc de inmunoglobulina y donde el aminoácido de glicina en la posición 42 se sustituye por otro aminoácido y donde la numeración de los aminoácidos de la parte IGF-1 de dicha proteína corresponde a la SEQ ID NO.: 5. El péptido E puede ser el péptido Ea, Eb o Ec y el aminoácido por el cual se sustituye la glicina en la posición 42 es serina.

Por tanto, la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende una proteína precursora de IGF-1 humano; (a) donde el aminoácido G42 se elimina o sustituye por el aminoácido serina; y (b) que se conecta a una región Fc de inmunoglobulina, particularmente una región Fc modificada, particularmente una región Fc, que se modifica para modular su unión al receptor de Fc. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden reemplazar por un residuo de aminoácido diferente de modo que la región Fc tenga una afinidad alterada por el receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Las denominadas regiones Fc de inmunoglobulina silenciadas se han descrito en la técnica: LALA y N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); y D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol.

181: 6664-69; Strohl, W., supra). Algunos ejemplos de anticuerpos IgG 1 con Fc silente comprenden el denominado mutante LALA que comprende la mutación L234A y L235A en la secuencia de aminoácidos de Fc de la IgG 1. Otro ejemplo de un anticuerpo IgG1 silente comprende la mutación D265A. Otro anticuerpo IgG1 silente comprende la mutación N297A, que da como resultado anticuerpos aglicosilados/no glicosilados.

La estrategia de LALA mencionada anteriormente se describe con más detalle en los documentos US5624821 y US5

648 260 ambos de Winter et al. Por tanto, en una realización, la proteína precursora de hIGF-1 divulgada se fusiona a una región Fc que comprende la mutación L234A y L235A o la mutación D265A o la mutación N297A. Dichos constructos de Fc LALA, D265A o N297A tienen una actividad ADCC reducida.

En una realización de la divulgación, el polipéptido que contiene una proteína precursora del péptido Ea de IGF-1 humano fusionada a una región Fc de inmunoglobulina, donde el aminoácido glicina en la posición 42 se sustituye por el aminoácido serina, comprende deleciones y/o mutaciones adicionales en los aminoácidos G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77 y/o R104.

Algunos ejemplos de dichas moléculas incluyen los siguientes polipéptidos:

Un polipéptido que contiene una proteína precursora del péptido Ea de IGF-1 humano fusionada a una región Fc de inmunoglobulina, donde el aminoácido glicina en la posición 42 se sustituye por el aminoácido serina, donde la numeración de los aminoácidos de la parte IGF-1 de dicha proteína corresponde a la SEQ ID NO.: 5, y donde el o los aminoácidos

(1b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

(2b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

aminoácido R37 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

aminoácido R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. (6b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan. (7b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen o eliminan y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

(8b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos

R71 y S72 se eliminan.

(9b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

(10b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(11b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(12b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y Q104 se mutan a glutamina (Q).

(13b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(14b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(15b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(16b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R77 se muta a glutamina (Q).

(18b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(19b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(20b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(21 b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(22b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(23b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(24b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(25b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(26b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(27b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(28b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(29b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(1c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(2c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(3c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(4c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(5c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(6c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(7c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen o eliminan y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(8c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(9c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

(10c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(11c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(12c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye o elimina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y Q104 se mutan a glutamina (Q).

(13c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(14c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(15c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(16c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(17c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(18c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q). (19c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(20c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(21c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(22c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(23c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S7272 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(24c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(25c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

(26c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

27c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

(28c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

(29c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

En otra realización, la divulgación se refiere a las proteínas descritas anteriormente que comprenden los polipéptidos descritos anteriormente (1b)-(29c), donde dichas moléculas, en lugar de mutarse en las posiciones 1-3, solamente se elimina el aminoácido E3 (p. ej., la molécula (28c) también se podría referir a un polipéptido que comprende una proteína precursora de IGF-1 humano fusionada a una región Fc de inmunoglobulina, donde el aminoácido G42 se sustituye por el aminoácido aminoácido serina y donde el o los aminoácidos E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).)

En otra realización, la divulgación se refiere a los polipéptidos descritos anteriormente (p. ej., los polipéptidos 1-29c), que comprenden un péptido E mutado constituido por los aminoácidos

a) VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASG (SEQ ID. NO.: 25) o

b) VQAQQHTDMPKTQKYQPPATNKNTKSQRRKGS (SEQ ID. NO.: 26).

c) VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYQM (SEQ NO: 115)

En una realización adicional, la divulgación proporciona la proteína precursora de IGF-1 descrita anteriormente que se fusiona a una región Fc, donde la región Fc se puede fusionar directamente al polipéptido precursor de IGF-1 modificado o se puede conectar a través de una región bisagra utilizando tecnologías de ADN recombinante muy conocidas en la técnica. Si se utiliza una región bisagra de ADN, la región Fc se puede conectar a cualquier parte del polipéptido precursor de IGF-1 modificado. En una realización de la divulgación, la región Fc se fusiona directamente al extremo C terminal del polipéptido precursor de IGF-1 modificado. En otra realización, la región Fc se conecta al extremo C terminal del polipéptido precursor de IGF-1 modificado con un conector de Gly-Ser (-GS-).

Se puede utilizar un conector de ADN para proporcionar un sitio de restricción entre componentes para facilitar su manipulación. También se puede proporcionar un conector para potenciar la expresión del polipéptido a partir de una célula hospedadora, con el fin de disminuir el impedimento estérico de modo que el componente pueda adoptar su estructura terciaria o cuaternaria óptima y/o interaccionar de forma apropiada con su molécula diana. Para encontrar conectores y métodos de identificación de espaciadores deseables, remítase, por ejemplo, a George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879.

Una secuencia conectora puede incluir uno o más aminoácidos conectados de forma natural a un componente receptor, o puede ser una secuencia añadida utilizada para aumentar la expresión de la proteína de fusión, proporcionar sitios de interés deseados de forma específica, lo que permite que los dominios de componentes formen estructuras terciarias óptimas y/o aumenten la interacción de un componente con su molécula diana. En una realización de la divulgación, el conector comprende una o más secuencias de péptidos que tienen entre 1-100 aminoácidos, preferentemente 1-25 aminoácidos de longitud. En una realización de la divulgación, el conector es de 1-5 aminoácidos de longitud. En una realización, el conector es una secuencia de tres aminoácidos, más específicamente, la secuencia de tres aminoácidos de Gly Pro Gly. En otra realización, el conector es Gly Ser.

Los ejemplos de dichas moléculas bisagra incluyen, sin carácter limitante, los siguientes polipéptidos:

bisagra 1: CPPCPA (SEQ ID NO.: 22)

bisagra 2: DKTHTCPPCPA (SEQ ID NO.: 23)

bisagra 3: EPKSCDKTHTCPPCPA (SEQ ID NO.: 24)

En consecuencia, la divulgación se refiere a un polipéptido que contiene una proteína precursora del péptido Ea de IGF-1 humano que se fusiona a una región Fc de inmunoglobulina, particularmente una región Fc modificada, particularmente una región Fc, que se modifica para modular su unión al receptor de Fc, preferentemente sustituyendo uno o ambos de los aminoácidos 234 y 235 por alanina tal como se ha descrito anteriormente, donde el aminoácido glicina en posición 42 se sustituye por serina, donde la numeración de los aminoácidos corresponde a la SEQ ID NO.: 5 y donde la región Fc de inmunoglobulina se fusiona a la proteína precursora de IGF-1 a través de una región bisagra.

Algunos ejemplos de dichas moléculas incluyen los siguientes polipéptidos:

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E (SEQ ID NO.:8)

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A (SEQ ID NO.:9)

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C (SEQ ID NO.:10)

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F (SEQ ID NO.:11)

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E (SEQ ID NO.:12)

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A (SEQ ID NO.:13)

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F (SEQ ID NO.:14)

En una realización particular de la divulgación, los aminoácidos R71 y S72 de las proteínas precursoras de IGF-1 descritas anteriormente se pueden mutar de la siguiente manera:

(1) Deleción de uno o ambos de R71 y S72, y/o

(2) Mutación de uno o ambos de R71 y S72 a un aminoácido no básico tal como alanina, y/o

(3) Inserción de uno o más aminoácidos no básicos entre R71 y S72, y/o

(4) Colocación de un sitio de glicosilación próximo a R71 y S72 suficiente para enmascarar el sitio de proteasa, y/o (5) Pegilación dirigida al sitio utilizando la sustitución de R71 o S72, o la inserción próxima a R71 y S72 o entre ellos, con un aminoácido artificial.

Los métodos para la modificación de proteínas como la mutagénesis dirigida al sitio, la introducción de sitios de glicosilación o la pegilación dirigida al sitio son muy conocidos para los expertos en la técnica.

En una realización de la divulgación, la región Fc se modifica para modular su unión al receptor de Fc. En una realización de la divulgación, la región Fc se modifica para reducir su afinidad por el receptor de Fc. En una realización de la divulgación, la región Fc se modifica para reducir la actividad ADCC. En una realización, la región Fc se modifica para evitar la actividad ADCC.

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.: 8 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E). En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.: 9 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A). En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.:10 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C). En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.: 11 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F).

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.:12 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E).

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.:13 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A).

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID NO.:14 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F).

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido constituido por las SEQ ID NO.:8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14.

En una realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido que es al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% idéntico a la SEQ ID NO.: 8.

En una realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido que es al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% idéntico a la SEQ ID NO.: 9.

En una realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido que es al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% idéntico a la SEQ ID NO.: 10.

En una realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido que es al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% idéntico a la SEQ ID NO.: 11.

En una realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido que es al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% idéntico a la SEQ ID NO.: 12.

En una realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido que es al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% idéntico a la SEQ ID NO.: 13.

En una realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido que es al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% idéntico a la SEQ ID NO.: 14.

En una realización, los polipéptidos de la presente divulgación están glicosilados.

Mutaciones de aminoácidos

Como se ha mencionado anteriormente, varios aminoácidos se pueden mutar a otro aminoácido. Habitualmente, el aminoácido se reemplaza por un residuo de alanina. Sin embargo, se pueden utilizar otros aminoácidos tales como aminoácidos artificiales o aminoácidos naturales de otro grupo (es decir, polares, ácidos, básicos o apolares). Los métodos para introducir una mutación en los aminoácidos de una proteína son muy conocidos para los expertos en la técnica. Remítase, p. ej., a Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Los métodos comprenden, sin carácter limitante, la amplificación del ADN que codifica la variante funcionalmente activa del polipéptido o fragmentos de este mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) llevada a cabo con cebadores mutagénicos y el ensamblaje de los fragmentos mediante PCR de ensamblaje si es necesario o la introducción de mutaciones utilizando kits comercializados tales como «QuikChange.TM. Site-Directed Mutagenesis Kit» (Stratagene). Remítase, p. ej., a Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Además, se pueden obtener secuencias mutadas mediante síntesis de genes sintéticos, un servicio proporcionado por compañías comerciales (p. ej., Geneart, Life Technology). Un experto en la técnica puede lograr la generación de una variante funcionalmente activa de un polipéptido o un derivado de un polipéptido reemplazando un aminoácido que no influya en la función de un polipéptido.

Regiones Fc de inmunoglobulina

En una realización de la divulgación, la región Fc es de IgG, IgM o IgA. En una realización de la divulgación, la región Fc procede de IgG. El dominio Fc de IgG se puede seleccionar entre los isotipos IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipos. En una realización de la divulgación, la región Fc es una región Fc humana.

La región Fc se puede alterar reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras de la región Fc. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden reemplazar con un residuo de aminoácido diferente de modo que la región Fc tenga una afinidad alterada por el receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe en más detalle en los documentos US5 624 821 y US5 648 260, ambos de Winter et al. En particular, se pueden mutar los residuos 234 y 235. En particular, estas mutaciones pueden ser a alanina. Por tanto, en una realización, el anticuerpo de la divulgación tiene una mutación en la región Fc en uno o ambos de los aminoácidos 234 y 235. En otra realización de la divulgación, uno o ambos de los aminoácidos 234 y 235 se pueden sustituir por alanina. Una variante Fc de este tipo donde los residuos 234 y 235 se han sustituido por alanina se denomina comúnmente «LALA». Dichos constructos de Fc LALA tienen actividad ADCC reducida. En una realización de la divulgación, la proteína precursora de IGF-1 está conectada con una Fc LALA de IgG1.

Conexión

Las expresiones «fusionado a» o «conectado a» tal como se utilizan en la presente en el contexto de las proteínas divulgadas fusionadas/conectadas a una región Fc de inmunoglobulina significará combinar dos polipéptidos que no se encuentran presentes de forma natural en el mismo polipéptido.

La región Fc de inmunoglobulina se puede fusionar directamente al polipéptido de IGF-1 modificado o se puede conectar con un conector utilizando tecnologías de ADN recombinante muy conocidas en la técnica. Si se utiliza un conector de ADN, la región Fc se puede conectar a cualquier parte del polipéptido de IGF-1 modificado. En una realización de la divulgación, la región Fc se fusiona directamente al extremo C terminal del polipéptido de IGF-1 modificado. En otra realización de la divulgación, la región Fc se conecta al extremo C terminal del polipéptido de IGF-1 modificado con un conector de Gly Ser (-GS-) y/o región bisagra (SEQ ID NO.: 22 a 24) tal como para hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E (SEQ ID NO.: 8), hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A (SEQ ID NO.: 9), hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C (SEQ ID NO.: 10), hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F (SEQ ID NO.: 11), hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E (SEQ ID NO.: 12), hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A (SEQ ID NO.: 13) o hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F (SEQ ID NO.:14).

Se puede utilizar un conector de ADN para proporcionar un sitio de restricción entre componentes para facilitar su manipulación. También se puede proporcionar un conector para potenciar la expresión del polipéptido a partir de una célula hospedadora, con el fin de disminuir el impedimento estérico de modo que el componente pueda asumir su estructura terciaria o cuaternaria óptima y/o interaccionar de forma apropiada con su molécula diana. Para encontrar conectores y métodos de identificación de espaciadores deseables, remítase, por ejemplo, a George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879.

Una secuencia conectora puede incluir uno o más aminoácidos conectados de forma natural a un componente receptor, o puede ser una secuencia añadida utilizada para aumentar la expresión de la proteína de fusión, proporcionar sitios de interés deseados de forma específica, lo que permite que los dominios de componentes formen estructuras terciarias óptimas y/o aumenten la interacción de un componente con su molécula diana. En una realización de la divulgación, el conector comprende una o más secuencias peptídicas que tienen entre 1-100 aminoácidos, preferentemente 1-25 aminoácidos de longitud. En una realización de la divulgación, el conector es de 1-5 aminoácidos de longitud. En una realización, el conector es una secuencia de tres aminoácidos; más específicamente, la secuencia de tres aminoácidos de Gly Pro Gly. En otra realización, el conector es Gly Ser.

Ácidos nucleicos

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención. Se divulgan además secuencias de ácido nucleico que codifican hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E, hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A, hIgF1 -Ea-Fc_mut 13/2_C, hIgF1 -Ea-Fc_mut 13/2_F, hIgF1 -Ea-Fc_mut 04/2_E, hIgF1 -Ea-Fc_mut 04/2_A o hIgF1 -Ea-Fc_mut 04/2_F (SEQ ID NO.: 15-21).

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN tal como ARNm o en forma de ADN, incluido, por ejemplo, ADNc o ADN sintético. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser bicatenarias o monocatenarias. El ADN monocatenario puede ser la hebra codificadora, también conocida como hebra sentido, o puede ser la hebra no codificadora, también denominada hebra antisentido.

La degeneración del código genético se conoce bien. Por tanto, dos o más secuencias de ácido nucleico diferentes pueden codificar la misma secuencia polipeptídica. Dichas secuencias de ácido nucleico variantes están incluidas dentro del alcance de la solicitud. De hecho, puede ser preferible llevar a cabo modificaciones conservadoras en una secuencia de ácido nucleico para mejorar la expresión de un polipéptido de la invención.

La divulgación proporciona además un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. El vector puede ser un vector de clonación o de expresión. En una realización de la divulgación, el ácido nucleico puede estar comprendido dentro de un vector de expresión que porte los elementos necesarios para una expresión eficiente muy conocidos para el experto en la técnica. Los elementos incluyen, por ejemplo, un promotor tal como, por ejemplo, el promotor potenciador de citomegalovirus (CMV), una secuencia señal para la secreción tal como la secuencia natural o cualquier otra secuencia de la que se tenga constancia que facilita la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de la transcripción, por ejemplo, procedente del gen de la hormona del crecimiento bovina (BGH), un elemento que permite la replicación episomal y la replicación en procariotas (p. ej., de origen SV40 y ColE1 u otros conocidos en la técnica) y elementos para permitir la selección tales como el gen de resistencia a ampicilina y el marcador de zeocina o higromicina.

En una realización, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:

a) la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO.: 15 o un complemento de esta;

b) una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la totalidad de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO.: 15;

c) la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO.: 16 o un complemento de esta;

d) una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la totalidad de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO.: 16;

e) la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO.: 17 o un complemento de esta;

f) una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la totalidad de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO.: 17;

g) la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO.: 18 o un complemento de esta;

h) una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la totalidad de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO.: 18;

i) la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO.: 19 o un complemento de esta;

j) una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la totalidad de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO.: 19;

k) la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO.: 20 o un complemento de esta;

l) una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la totalidad de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO.: 20;

m) la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO.: 21 o un complemento de esta;

n) una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia respecto a la totalidad de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO.: 21.

En otra realización, la divulgación se refiere a los polipéptidos variantes de IGF-1 descritos anteriormente, donde dichas proteínas precursoras de IGF-1 humano están pegiladas. La pegilación es particularmente preferida para las proteínas precursoras de IGF-1 que no están fusionadas a una región de Fc de inmunoglobulina de una IgG humana. Se ha probado que la conjugación con poli(etilenglicol) (PEG, pegilación) es beneficiosa para prolongar la semivida de los fármacos de proteínas terapéuticas. Se espera que la pegilación de los polipéptidos precursores de IGF de la divulgación puedan dar lugar a ventajas farmacéuticas similares. Los métodos de pegilación de IGF-1 son muy conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a la Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. 2006/0154865, que describe las propiedades beneficiosas de IGF-1 monopegilado en lisina. Dicha monopegilación en lisina se puede adaptar para los polipéptidos de IGF precursores de la divulgación. Además, la pegilación se puede llevar a cabo en cualquier parte de un polipéptido de la divulgación mediante la introducción de un aminoácido artificial.

Ciertos aminoácidos artificiales se pueden introducir mediante la tecnología descrita en Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang y Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 o en la Patente de EE. UU. n.° 7083970. En resumen, algunos de estos sistemas de expresión conllevan una mutagénesis dirigida al sitio para introducir un codón sin sentido tal como un TAG ámbar, en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la divulgación. Dichos vectores de expresión se introducen entonces en un hospedador que puede utilizar un ARNt específico para el codón antisentido introducido y se cargan con el aminoácido artificial preferido. Los aminoácidos artificiales particulares que son beneficiosos a efectos de conjugar restos con los polipéptidos de la divulgación incluyen aquellos con cadenas laterales de acetileno y azida. Los polipéptidos precursores de IGF que contienen estos aminoácidos novedosos se pueden pegilar después en estos sitios elegidos en la proteína. Además, dichas moléculas de IGF pegiladas sin el péptido E también son útiles como productos terapéuticos.

Producción de las variantes de IGF-1 de la invención en células de mamífero

La producción de IGF-1 humano nativo en sistemas de expresión procariotas es muy conocida para el experto en la técnica. En ocasiones, se prefiere la expresión en células eucariotas, en particular, células hospedadoras de mamífero, debido a que las células eucariotas tienen más probabilidad que las células procariotas de ensamblar y secretar una proteína plegada correctamente e inmunológicamente activa.

Las células hospedadoras de mamífero para la expresión de anticuerpos recombinantes incluyen el Ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas células dhfr-CHO, descritas por Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 utilizadas con un marcador seleccionable DH FR, p. ej., tal como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601 -621), células HEK293 (células 293 de riñón embrionario humano), células de mieloma murino NSO, células COS y células SP2. Las células hospedadoras preferidas son células derivadas de CHO K1. Sin embargo, la expresión de IGF-1 recombinante en líneas celulares CHO da como resultado la inhibición del crecimiento celular y títulos bajos (remítase a las figuras 11/12). La atenuación/supresión estable de IGF-1-R en células CHO utilizando la tecnología de las «nucleasas de dedos de zinc» dio como resultado un crecimiento celular mejorado y títulos de proteína IGF-1 superiores (figuras 14, 15, 16). Las células CHO con expresión reducida de IGF-1 -R (atenuación de ARNh/pi) que se transfectaron de forma estable con plásmidos que codificaban IGF-1 produjeron un título de grupo aproximadamente 5 veces superior en comparación con las células CHO de origen natural transfectadas de forma estable. Se pudo medir un título de grupo incluso superior después de la transfección estable de líneas celulares con supresión de IGF-1 -R. Se pudo detectar un aumento en el título de IGF-1 recombinante en un factor 5-20 en comparación con la línea celular CHO de origen natural. En resumen, estos datos muestran que la atenuación o supresión de los genes del receptor de IGF-1 en líneas de células de mamífero puede mejorar significativamente la producción de IGF-1 y variantes de estos.

Por tanto, un método adecuado para la producción de IGF-1 recombinante o variantes de este en células de mamífero, por ejemplo, una célula CHO, donde dicha célula de mamífero tiene una expresión deficiente de un receptor del factor de crecimiento insulínico funcional 1 (IGF-1 R) comprende los siguientes pasos:

a. Producir una célula de mamífero que es deficiente en la expresión del receptor del factor de crecimiento insulínico 1;

b. Transformar la célula del paso a. con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un IGF-1 o una variante de este;

c. Seleccionar una célula del paso b. que se va a transformar;

d. Cultivar la célula seleccionada en el paso c. en condiciones que permitan la expresión del IGF-1 o una variante de este; y

e. Recolectar el IGF-1 o una variante de este a partir de las células de mamífero cultivadas en el paso d, donde como alternativa, el orden de los pasos a. y b. se puede invertir o ambos pasos se pueden llevar a cabo al mismo tiempo.

El experto sabe cómo transformar, seleccionar y cultivar células de mamífero modificadas genéticamente, p. ej., células CHO, como las células derivadas de CHO-K1, células derivadas de CHO-DUXB11 o células CHO-DG44. Se utilizan de forma rutinaria protocolos de selección para facilitar la selección de células que es probable que hayan integrado el ADN recombinante que codifica la proteína terapéutica deseada, como factores de crecimiento, p. ej., IGF-1. La resistencia a antibióticos o la capacidad para crecer en un medio selectivo desde un punto de vista nutricional conferida por un gen cointegrado en el vector de transformación se utiliza rutinariamente. (Remítase a Weber, W. y Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, in Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., Ed.), Elsevier: Ámsterdam, págs. 589-604.) (Efficientselection forhigh-expression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi). Los dos sistemas de expresión de CHO más comunes para la producción de proteínas recombinantes utilizan una selección con metotrexato (MTX) basada en dihidrofolato-reductasa (DHFR) o una selección con sulfoximina de metionina (MSX) basada en glutaminasintetasa (GS) (Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. Feb. de 2010; 74(2):127-38. Epub 22 de oct. de 2009. Directrices de la modificación celular para la producción de anticuerpos monoclonales).

En la solicitud de patente WO09080720A se han divulgado vectores particularmente adecuados para producir polipéptidos en células de mamífero, particularmente células de roedores tales como células CHO y CHO con el gen DHFR defectuoso. Existen varios métodos apropiados conocidos en la técnica anterior para introducir un vector de expresión en una célula hospedadora de mamífero. Los métodos respectivos incluyen, sin carácter limitante, transfección con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, transferencia de genes mediada por polímeros y biolística. Las células hospedadoras adecuadas se han descrito anteriormente. Después de introducir el ácido nucleico del vector de expresión en la célula o células hospedadoras, los transformantes obtenidos se cultivan en condiciones selectivas adecuadas para evaluar la expresión del gen marcador seleccionable de mamífero contenido en el casete de expresión (MSM). Esto significa que, por ejemplo, cuando el gen marcador seleccionable de mamífero es un gen de resistencia a antibióticos, se cultivan los transformantes en un medio que contiene el antibiótico activo correspondiente en células de mamífero y se seleccionan los transformantes que son viables en dichas condiciones, con lo cual se posibilita así la obtención de transformantes que expresan el gen marcador y, por tanto, incorporan el vector. Además, se puede llevar a cabo un segundo paso de selección cultivando los transformantes en un medio de selección adaptado para la selección del gen marcador seleccionable amplificable comprendido en el casete de expresión (MASM). Por ejemplo, en caso de que se utilice DHFR como gen marcador seleccionable amplificable, los transformantes se pueden cultivar en un medio exento de purina o nucleótidos en presencia de un inhibidor de DHFR. En caso de que se utilice un promotor inducible en al menos un casete de expresión, se debería proporcionar una señal de inducción correspondiente con el fin de iniciar la expresión del polipéptido. Para hacer uso del sistema de selección/amplificación de DHFR, dichas células hospedadoras se pueden cultivar en presencia de un inhibidor de DHFR. Los inhibidores de DHFR adecuados son antifolatos tales como, p. ej., MTX. La concentración de antifolato/MTX utilizada depende de la célula hospedadora y la variante de DHFR incorporada en el vector. El intervalo de concentración se puede seleccionar para los procedimientos de amplificación en múltiples pasos, en células hospedadoras DHFR’’, por ejemplo, en valores alrededor de 5 nM - 20 nM que oscilan hasta valores de 500 nM a 1000 nM o incluso superiores para los pasos de amplificación secundarios o adicionales. Para las células DHFR+ las concentraciones iniciales son habitualmente superiores en el intervalo de 100 nM a 750 nM, preferentemente 500 nM en los primeros pasos y de 500 nM a 1000 nM y superiores para los pasos de amplificación adicionales. Las variantes de DHFR adecuadas se han descrito anteriormente.

Para hacer uso del sistema de selección/amplificación de GS, dichas células hospedadoras se pueden cultivar en presencia de, p. ej., MSX. La concentración de MSX utilizada depende de la célula hospedadora. El intervalo de concentraciones se puede seleccionar entre de aproximadamente 15 a 150 micromolar, de 20 a 100 micromolar y de 25 a 50 micromolar. Estos intervalos son particularmente adecuados para las células NSO y CHO.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene una o una combinación de las variantes de IGF-1 de la invención descritas anteriormente, formuladas junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en terapia combinada, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, las variantes de IGF-1 de la presente invención se pueden combinar con al menos un agente que aumente la masa/fuerza muscular, por ejemplo, anticuerpo anti-ActRIIB, IGF-2 o IGF-2 variantes, un anticuerpo antimiostatina, un propéptido de miostatina, una proteína señuelo de miostatina que se une a ActRIIB, pero no la activa, un agonista beta 2, un agonista de Ghrelina, un SARM, agonistas/miméticos de GH o folistatina. Algunos ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden utilizar en terapia de combinación se describen en mayor detalle más adelante en la sección sobre los usos de las variantes de IGF-1 de la invención.

La expresión «farmacéuticamente aceptable» se refiere a aprobada por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerada en la farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas generalmente reconocidas para utilizar en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término «portador» se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el producto terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos, pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, incluidos los derivados del petróleo o de origen animal, vegetal o sintético tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada desecada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Algunos ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en «Remington's Pharmaceutical Sciences» de E. W. Martin.

En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Cuando la composición se ha de administrar mediante infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contenga agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El portador debería ser adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, puede estar recubierto por un material para proteger el compuesto frente a la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan desactivar el compuesto.

Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes hidrosolubles tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes liposolubles tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de estos, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar tanto con procedimientos de esterilización, supra, como con la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir en las composiciones agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de una dispersión o soluciones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Salvo en la medida en la que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios a las composiciones.

Las composiciones terapéuticas habitualmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración de fármaco elevada. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de estos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, se pueden incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones estériles inyectables se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un agente o una combinación de agentes enumerados anteriormente, según se requiera y, a continuación, llevando a cabo una microfiltración de esterilización. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los demás agentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del agente activo más cualquier agente deseado adicional de una solución de estos previamente esterilizada por filtración.

La cantidad de agente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo concreto de administración. La cantidad de agente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma farmacéutica individual será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Por lo general, de un cien por cien, esta cantidad oscilará de aproximadamente un 0,01 por ciento a aproximadamente un noventa y nueve por ciento de agente activo, de aproximadamente un 0,1 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, o de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento de agente activo combinado con un portador farmacéuticamente aceptable.

Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o incrementar de forma proporcional la dosis según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente favorable formular composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, tal como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se han de tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociada con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención viene dictada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la técnica de combinar un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido en el contexto de administrar las variantes de IGF-1 de la divulgación o composición que comprende dichas variantes de IGF-1, oscila de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg, o de 0,01 a 30 mg/kg, y más normalmente de 0,1 a 10 mg/kg del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosis pueden ser de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal, pueden ser de aproximadamente 0,2 mg/kg de peso corporal, pueden ser de aproximadamente 0,3 mg/kg de peso corporal, pueden ser de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, pueden ser de aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, pueden ser de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. El experto sabe identificar una dosis eficaz adecuada, que variará dependiendo de la vía de administración (p. ej., por vía intravenosa o subcutánea). Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas o una vez al mes. Dicha administración se puede llevar a cabo por vía intravenosa o subcutánea. Los regímenes de dosificación para las variantes de IGF-1 de la invención incluyen 0,1 mg/kg de peso corporal o 0,2 mg/kg de peso corporal o 0,3 mg/kg de peso corporal o 0,5 mg/kg de peso corporal o 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal por administración intravenosa. Como alternativa, la composición puede ser una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. La dosis y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja con intervalos relativamente poco frecuentes durante un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes siguen recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere una dosis relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, o hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Los niveles de dosis reales de los agentes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden modificar con el fin de obtener una cantidad del agente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de diversos factores farmacocinéticos, que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, la sal o amida de estas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el género, el peso, la afección, el estado general de salud y el historial médico previo del paciente que se esté tratando, y factores similares muy conocidos en las técnicas médicas.

La administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una variante de IGF-1 inventiva comprendida en las composiciones de la invención puede dar como resultado una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la afección de la enfermedad, es decir, un aumento de la masa muscular y/o función o disminución/reducción del área de la herida en pacientes con quemaduras.

Los pacientes recibirán una cantidad eficaz del principio activo polipeptídico, es decir, una cantidad que es suficiente para detectar, tratar, mejorar o prevenir la enfermedad o trastorno en cuestión. Los efectos terapéuticos también pueden incluir la reducción de los síntomas físicos. La cantidad y la concentración eficaces óptimas de una proteína terapéutica para cualquier sujeto particular dependerán de varios factores, que incluyen la edad, tamaño, estado de salud y/o género del paciente, la naturaleza y el grado de la afección, la actividad de la proteína terapéutica particular, la tasa de su eliminación por parte del cuerpo y también cual(es)quier(a) agente(s) terapéutico(s) adicional(es) posible(s) administrado(s) en combinación con la proteína terapéutica. La cantidad eficaz suministrada para una situación determinada se puede determinar con experimentación rutinaria y está dentro del criterio de un médico. La dosificación se puede llevar a cabo mediante un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis.

Una composición de la presente invención se puede administrar por una o más vías de administración utilizando uno o más de una serie de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración para las proteínas terapéuticas de la invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La frase «administración parenteral», tal como se utiliza en la presente, se refiere a modos de administración diferentes de la administración enteral y la administración tópica, normalmente por inyección e incluye, sin carácter limitante, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. En una realización, la composición que comprende anticuerpos se administra por vía intravenosa. En otra realización, el anticuerpo se administra por vía subcutánea.

Como alternativa, se puede administrar una variante inventiva de IGF-1 que comprenda la composición de la invención mediante una vía no parenteral tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protejan el compuesto frente a una liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de viniletileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja tal como los dispositivos mostrados en las Patentes de EE. UU. n.os 5399 163; 5383 851; 5 312 335; 5064413; 4941 880; 4790824 o 4596556. Algunos ejemplos de implantes y módulos conocidos útiles en la presente invención incluyen: La Patente de EE. UU. n.° 4 487 603, que muestra una bomba de microinfusión implantable para dispensar la medicación a una tasa controlada; la Patente de EE. UU. n.° 4486 194, que muestra un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente de EE. UU. N.° 4447 233, que muestra una bomba de infusión de medicación para suministrar medicación a una tasa de infusión precisa; la Patente de EE. UU. N.° 4447224, que muestra un aparato de infusión implantable de flujo variable para el suministro continuo de fármacos; la Patente de EE. UU. N.° 4439 196, que muestra un sistema de suministro de fármacos osmótico que tiene múltiples compartimentos de cámara; y la Patente de EE. UU. N.° 4 475 196, que muestra un sistema de suministro de fármacos osmótico. Muchos implantes, sistemas de suministro y módulos de este tipo diferentes son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen los producidos por MicroCHIPSTM (Bedford, MA).

En determinadas realizaciones, la variante de IGF-1 humano que comprende la composición de la invención se puede formular para asegurar la distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos muy hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la b He (si se desea); se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para consultar métodos de fabricación de liposomas, remítase, por ejemplo, a las Patentes de Ee . UU.4522811; 5374548 y 5399331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que son transportados selectivamente a las células u órganos específicos, por lo que mejoran el suministro de fármacos dirigido (remítase, p. ej., V. V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685). Algunos restos de direccionamiento ilustrativos incluyen folato o biotina (remítase, p. ej., a la Patente de EE. UU. 5416016); manósidos (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); receptor de la proteína A superficial (Briscoe etal., 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier etal., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); remítase también a K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273.

Enfermedades y trastornos diana

La invención proporciona un polipéptido, un ácido nucleico o una composición farmacéutica de la invención para su uso en terapia. La invención proporciona además un polipéptido, un ácido nucleico o una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno patológico. La divulgación proporciona además el uso de un polipéptido, un ácido nucleico o una composición farmacéutica de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno patológico. La divulgación proporciona además un método para tratar a un paciente que padece un trastorno patológico que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, un ácido nucleico o una composición farmacéutica de la invención a dicho paciente.

El trastorno patológico puede ser una enfermedad o trastorno musculoesquelético tal como atrofia muscular. Existen muchas causas de atrofia muscular, incluso como resultado del tratamiento con un glucocorticoide tal como cortisol, dexametasona, betametasona, prednisona, metilprednisolona o prednisolona. La atrofia muscular también puede ser un resultado de la denervación debida a un traumatismo neural o un resultado de una neuropatía degenerativa, metabólica o inflamatoria (p. ej., síndrome de Guillian-Barré, neuropatía periférica o exposición a toxinas ambientales o fármacos).

Además, la atrofia muscular puede ser el resultado de una miopatía tal como miotonía; una miopatía congénita, que incluye la miopatía nemalínica, la miopatía multi/minicore y la miopatía miotubular (centronuclear); miopatía mitocondrial; parálisis periódica familiar; miopatía inflamatoria; miopatía metabólica tal como la causada por una enfermedad de almacenamiento de glucógeno o lípidos; dermatomiositisis; polimiositis; cuerpo de inclusión miositis; miositis osificante; rabdomiólisis y mioglobinurias.

En otra realización de la divulgación, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar para el tratamiento de la enfermedad de Kennedy o la enfermedad renal crónica.

La miopatía puede ser causada por un síndrome de distrofia muscular tal como de Duchenne, de Becker, miotónico, fascioescapulohumeral, de Emery-Dreifuss, oculofaríngeo, escapulohumeral, de cintura y extremidades, de Fukuyama, una distrofia muscular congénita o miopatía distal hereditaria. La enfermedad musculoesquelética también puede ser osteoporosis, una fractura ósea, baja estatura o enanismo.

Además, la atrofia muscular puede ser el resultado de una enfermedad de las neuronas motoras adultas tal como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil, atrofia muscular espinal juvenil, neuropatía motora autoinmunitaria con bloque conductor multifocal, parálisis debido a accidente cerebrovascular o lesión de la médula espinal, inmovilización esquelética debida a un trauma, reposo en cama prolongado, inactividad voluntaria, inactividad involuntaria, estrés metabólico o insuficiencia nutricional, cáncer, SIDA, ayuno, un trastorno de la glándula tiroidea o la glándula adrenal o la glándula pituitaria, diabetes, hipotonía congénita benigna, enfermedad del tronco, enfermedades hepáticas (ejemplos tales como fibrosis, cirrosis), sepsis, fallo renal, fallo cardiaco congestivo, envejecimiento, viajes al espacio o tiempo pasado en un ambiente de gravedad cero.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar para el tratamiento de pacientes de quemaduras que incluyen lesión por quemaduras pediátrica y en adultos, los que padecen de pérdida de masa corporal magra y/o desgaste muscular.

Algunos ejemplos de afecciones relacionadas con la edad que se pueden tratar incluyen sarcopenia, atrofia cutánea, desgaste muscular, atrofia cerebral, ateroesclerosis, arteriesclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión sanguínea elevada, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular asociada a la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, esperanza de vida reducida, fragilidad, pérdida de memoria, arrugas, función renal alterada y pérdida auditiva relacionada con la edad; trastornos metabólicos que incluyen diabetes tipo II, síndrome metabólico, hiperglucemia y obesidad.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar para el tratamiento de los pacientes de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).

En otra realización de la divulgación, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar para el tratamiento de la atrofia muscular. En una realización particular, la divulgación se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para el tratamiento de la atrofia muscular, donde el grupo de atrofias se selecciona del grupo constituido por sarcopenia asociada a la obesidad, sarcopenia y atrofia muscular asociada a diabetes.

Otras afecciones que se pueden tratar incluyen enfermedad o fallo renal agudo y/o crónico, fibrosis o cirrosis hepática, cáncer tal como pancreático, gastrointestinal (que incluye esofágico, gástrico y de colon), pulmonar, de próstata, linfoma o cáncer de mama; enfermedad de Parkinson; afecciones asociadas con la muerte neuronal tales como ELA (esclerosis lateral amiotrófica), atrofia cerebral o demencia y anemia; infecciones crónicas tales como tuberculosis, ya sea causada por tuberculosis micobacteriana o por micobacterias atípicas; infecciones fúngicas crónicas e infecciones oportunistas en el contexto de la supresión inmunitaria, ya sea iatrogénica o debida al SIDA.

Algunas condiciones adicionales incluyen caquexia, caquexia asociada con una artritis reumatoide y caquexia asociada con cáncer.

En otra realización, la divulgación se refiere a un método para tratar un trastorno muscular, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz, tal como se ha descrito anteriormente, de los polipéptidos de la invención. La necesidad de tratamiento con los polipéptidos divulgados o composiciones que los comprendan para aumentar la masa muscular puede ser el resultado de una de las condiciones mencionadas anteriormente, particularmente como consecuencia de una enfermedad o trastorno musculoesquelético tal como atrofia muscular, donde el trastorno muscular es una atrofia muscular seleccionada del grupo constituido por sarcopenia asociada con la obesidad, sarcopenia y atrofia muscular asociada a diabetes.

Además, la divulgación se refiere a un método para tratar una lesión por quemaduras, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), una afección relacionada con la edad como la sarcopenia, la enfermedad de Kennedy, o una enfermedad renal crónica, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz a un paciente, tal como se ha descrito anteriormente, de los polipéptidos de la invención.

En otra realización, la divulgación se refiere a un método para aumentar la masa muscular. En una realización particular, la divulgación se refiere a un método para aumentar la masa muscular en un paciente que lo necesite. La necesidad de aumentar la masa muscular puede ser el resultado de una de las condiciones mencionadas anteriormente, particularmente como consecuencia de una enfermedad o trastorno musculoesquelético tal como atrofia muscular. La necesidad de aumentar la masa muscular puede también ser el resultado de una lesión por quemaduras, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), una afección relacionada con la edad como sarcopenia, la enfermedad de Kennedy o una enfermedad renal crónica.

Administración al paciente

Una composición farmacéutica de la invención se puede administrar a un paciente. La administración será habitualmente a través de una jeringa. Por tanto, la divulgación proporciona un dispositivo de suministro (p. ej., una jeringa) que incluye una composición farmacéutica de la invención.

Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar el polipéptido de la invención, por ejemplo, la encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar la proteína, endocitosis mediada por receptor (remítase, p. ej., a Wu y Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral, viral adenoasociado, adenoviral, de un virus de la viruela (p. ej., de un virus avipox, particularmente del virus de la viruela aviar) u otro vector, etc. Los métodos para la introducción pueden ser enterales o parenterales e incluyen, sin carácter limitante, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, pulmonar, intranasal, intraocular, epidural y oral. Los polipéptidos se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluida la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular se puede facilitar con un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un reservorio tal como un reservorio de Ommaya. En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área que necesita tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, p. ej., por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas tales como membranas silásticas, fibras o sustitutos de la piel comerciales.

En otra realización, la composición farmacéutica se puede suministrar en una vesícula, en particular, un liposoma (remítase a Langer, Science 249:1527-1533, 1990). En otra realización más, el agente activo se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede utilizar una bomba.

Grupos de pacientes

Los pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento propuesto incluyen pacientes que se recuperan de una enfermedad aguda o crítica que requiere cuidado intensivo u hospitalización prolongada (más de 1 semana); pacientes mayores frágiles con sarcopenia; adultos jóvenes que se recuperan de un traumatismo grave tal como accidentes en vehículos de motor, quemaduras graves, lesiones de combate y otras lesiones traumáticas; pacientes con enfermedades crónicas de las que se tiene constancia que provocan caquexia, tal como se han enumerado anteriormente; y pacientes con enfermedades musculares, como se han enumerado anteriormente. Como la pérdida de músculo es una complicación común de la mayoría de enfermedades que son graves o prolongadas, se prevé que la reversión del desgaste muscular acelerará la recuperación y el retorno de la función de los pacientes que experimentan pérdida muscular independientemente de la causa subyacente de esta pérdida.

Terapia combinada

Este tratamiento se puede combinar con cualquier tratamiento orientado a la causa principal del proceso de desgaste muscular. Dichas combinaciones pueden incluir corticosteroides, agentes inmunosupresores, agentes anticitocínicos, fármacos anticancerosos; factores de crecimiento tales como eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF u otros; fármacos utilizados para el tratamiento de la diabetes (que incluyen insulina y agentes hipoglucémicos orales), fármacos antituberculosis y antibióticos. Las combinaciones pueden incluir tanto agentes de bajo peso molecular como biomoléculas.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar como el único agente activo o junto con, por ejemplo, como adyuvante o combinado con, otros fármacos, por ejemplo, un anticuerpo ActRIIB, un anticuerpo ActRIIA, un mimético de señuelo de ActRIIB soluble, un anticuerpo antimiostatina, un propéptido de miostatina, una proteína de señuelo de miostatina que se une a ActRIIB, pero no la activa, un agonista beta 2, un agonista de ghrelina, agonistas/miméticos de GH, SARM o folistatina. Por ejemplo, el fármaco de la invención se puede utilizar combinado con un anticuerpo ActRIIB tal como se divulga en el documento WO2010125003.

Secuencias

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Modos para llevar a cabo la invención

Se entenderá que la invención se ha descrito a modo de ejemplo únicamente y se pueden realizar modificaciones a la vez que se permanece dentro del alcance de la invención.

Ejemplos

Las variantes de IGF-1 recombinantes divulgadas en la presente tienen afinidad por un receptor de tipo proteico de origen natural (figuras 1), pero muestran un mejor perfil farmacocinético in vivo que el IGF-1 de origen natural (figura 7) y se pueden utilizar para prevenir la atrofia muscular con una dosificación menos frecuente (figura 8). Al contrario que algunas de las variantes de IGF-1 de la técnica anterior, que estimulan la fosforilación del receptor insulínico (InsR) que da lugar al riesgo de hipoglucemia, las proteínas del precursor de IGF-1 humano divulgadas que se mutan en la posición G42 (deleción o sustituciones específicas) muestran una capacidad como la de origen natural para estimular la fosforilación del receptor insulínico (InsR), que disminuye dicho riesgo de hipoglucemia (figura 5/6/19). Además, al contrario que el hIGF-1 de origen natural o algunas variantes de este de la técnica anterior, las variantes de IGF-1 divulgadas en la presente se pueden producir en títulos elevados y sin degradación en sistemas celulares de mamíferos, lo que permite una producción a escala industrial.

PARTE A: Metodología general

A1 Reactivos

El IGF-1 humano recombinante era de Novartis AG y la insulina humana recombinante se adquirió de Promocell (#C-60212).

A2 Construcción de vectores

Son factibles varios conjuntos vectoriales de acuerdo con las doctrinas de la presente divulgación. Como los elementos individuales del vector son conocidos en la técnica anterior, se pueden ensamblar vectores adecuados, p. ej., mediante secuenciación o amplificación y clonación apropiada de los elementos genéticos básicos y casetes de expresión en la orientación deseada. Los respectivos métodos de clonación forman parte del estado de la técnica y también la secuencia de los elementos genéticos descritos anteriormente están descritos en la técnica anterior. Posteriormente, la generación de constructos vectoriales se describe a modo de ejemplo. Sin embargo, los expertos en la técnica entienden que son adecuadas y se encuentran fácilmente disponibles varias realizaciones y formas diferentes de obtener los respectivos vectores. Todos los vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, pBW679) descritos en esta sección se basan en los vectores de expresión de mamíferos descritos en el documento WO2009080720, particularmente la figura 1, tabla 1 y la sección de ejemplos II: constructos vectoriales (página 21-31).

La síntesis de novo de hIGF1-Ea-delGPE-R37A) (SEQ ID NO.: 87) se encargó de The Blue Heron Biotech flanqueado por un 5'Kozak (CCCGCCCGCCCACC) (SEQ IDs NO.:112) y los sitios de restricción 5'HindIII/BamHI y 3'EcoRI se suministró en un vector pUC de Blue Heron. La reclonación en el vector pcDNA3,1 (Invitrogen, Life Technologies) se completó con una reacción de ligamiento con sitios de clonación 5' BamHI y 3'EcoRI compatibles. Se controló completamente la secuencia del constructo utilizando los cebadores específicos T7 y BGHA. A continuación, se llevó a cabo una mutagénesis dirigida al sitio (kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change II, Stratagene) para eliminar los dos residuos R71 y S72 utilizando el constructo anterior hIGF1-Ea-delGPE-R37A/pCDNA3,1. El constructo resultante hIGF1-Ea-delGPE-R37A-delRS se utilizó para reclonar hIGF1-Ea (delGPE, R37A, delRS) en el vector de expresión de mamíferos pRS5a (vector propiedad de Novartis, NPL000961). El PRS5a es un vector de expresión de mamíferos bajo el promotor CMV, un sitio de poliadenilación del gen BGH (hormona del crecimiento bovino) y resistencia a ampicilina. El hIGF1-Ea (delGPE, R37A, delRS)/pRS5a se archivó como NPL009759 (vector propiedad de Novartis).

hIGF1-Ea (del GPE, R37A, del RS) se amplificó a partir de NPL009759. El producto de PCR se digirió con 5'HindIII/3'BamHI y se clonó en el vector pRS5a-hIgG1 La LA (NPL012935, vector propiedad de Novartis). Se llevaron a cabo varias rondas de mutagénesis dirigida al sitio tal como se ha descrito anteriormente para suministrar el plásmido para hIGF1-Ea (delGPE, R37A, delRS)-[R74Q-R78Q -R104Q] (NPL017580, vector propiedad de Novartis). Este plásmido se utilizó como base para las clonaciones adicionales descritas a continuación.

Plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut2: Se amplificó un fragmento de PCR que contiene las mutaciones G42S a partir de NPL017580 utilizando los oligos mutagénicos (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (SEQ ID n O.: 88) y (5' TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGATGCTTGTCTGAGGCGCCGCCC 3') (SEQ ID NO.: 89). Se utilizaron los sitios de restricción de endonucleasas BIpI y BspEI para la clonación del fragmento de PCR generado de nuevo en NPL017580.

Plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut3: Se amplificó un fragmento de PCR que contiene las mutaciones G42P a partir de NPL017580 utilizando los oligos mutagénicos (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (SEQ ID n O.: 90) y (5' TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGATGGGTGTCTGAGGCGCCGCCC 3') (SEQ ID NO.: 91). Se utilizaron los sitios de restricción de endonucleasas BIpI y BspEI para la clonación del fragmento de PCR generado de nuevo en NPL017580.

Plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut4: Se amplificó un fragmento de PCR que contiene la mutación A37E a partir de NPL017580 utilizando los oligos mutagénicos (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (SEQ ID NO.: 92) y (5'

TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGATGCCTGTCTGAGGCGCMNNCCGACTGCTGGAGCCATACCCTG TGG) (SEQ ID NO.: 93). El codón titubeante se proporciona en nomenclatura IUPAC, donde M se refiere a las bases A o C y N se refiere a las bases A, C, G o T. Este último oligo portaría un codón titubeante para la posición 37. Se utilizaron los sitios de restricción de endonucleasas BIpI y BspEI para la clonación del fragmento de PCR generado de nuevo en NPL017580. La sustitución A37E se seleccionó mediante secuenciación.

Plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut12: Se amplificó un fragmento de PCR que contiene la mutación R36A-A37R a partir de NPL017580 utilizando los oligos mutagénicos (5' TGACACTATAGAATAAC AT CCACTTTGCC 3') (SEQ ID NO.: 94) y (5' TGTCTGAGGCGCCCGCGCACTGCTGGAGCCATACCCTGTGGGC 3') (SEQ ID NO.: 95). Se utilizaron los sitios de restricción de endonucleasas BlpI y SfoI para la clonación del fragmento de PCR generado de nuevo en NPL017580.

Plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut13: Un fragmento de PCR que contiene la mutación R36Q se amplificó a partir de NPL017580 (vector propiedad de Novartis) utilizando los oligos mutagénicos (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (SEQ ID NO.: 96) y (5' TGTCTGAGGCGCCGCCTGACTGCTG GAGCCATACCCTGTGG 3') (SEQ ID NO.: 97); se utilizaron los sitios de restricción de endonucleasas BlpI y SfoI para la clonación del fragmento de PCR generado de nuevo en NPL017580.

Las variantes hIGF1-Ea-hFc mut4 y mut13 se modificaron adicionalmente para introducir un conector diferente (es decir, SEQ ID 22 y 23): secuencias conectoras que se extendían desde el sitio de restricción de endonucleasas BspEI (correspondiente al residuo IGF1 F49-R50) hasta AleI (en la porción Fc) se encargaron de Geneart. Los conectores se clonaron mediante corte y pegado estándar con el fin de obtener plásmidos para hIGF1-Ea-hFc_mut4_E, hIGF1-Ea-hFc_mut13_E y hIGF1-Ea-hFc_mut13_A. En un paso sucesivo, se introdujo la mutación G42S.

Plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut4/2_E y hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_E: Un fragmento de PCR que contiene la mutación G42S se amplificó a partir del plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut2 utilizando los oligos (5' T GACACT AT AGAAT AACATCCACTTTGCC 3') (SEQ ID N.2: 88) y (5' CGGTACGTGCTGGCGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTG 3') (SEQ ID N.2: 98). Se utilizaron los sitios de restricción de endonucleasas BspEI y SfoI para clonar el fragmento de PCR generado en los plásmidos de hIGF1-EahFc_mut4_E y hIGF1-Ea-hFc_mut13_E.

Plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A: Un fragmento de PCR que contiene la mutación G42S-R36Q se amplificó a partir del plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_E utilizando los oligos (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (SEQ ID N.2: 88) y (5' CGGTACGTGC TGGCGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTG 3') (SEQ ID N.2: 98). Se utilizaron los sitios de restricción de endonucleasas BspEI y SfoI para clonar el fragmento de PCR generado en el plásmido de hIGF1-Ea-hFc_mut13_A.

A3 Producción de proteína recombinante

Producción a pequeña escala:

Se utilizaron dos métodos de transfección diferentes, basados en FuGene y polietilenimina (PEI), para producir las variantes de IGF1-Fc.

Se transfectaron 100 mL de cultivo HEK 293F con (PEI) de la siguiente manera: Se diluyeron 100 gg de ADN plasmídico en agua en 7 mL de medio de expresión FreeStyle (GIBCO, Cat. 12338026) durante 10 min a temperatura ambiente. Se diluyeron 300 gg de PEI (de una solución madre de PEI con una concentración de 1 mg/mL) en 7 mL de medio de expresión FreeStyle a temperatura ambiente. A continuación, las soluciones de ADN y PEI se mezclaron y se incubaron durante 15 min antes de añadirlas a 36 mL de cultivo celular de HEK 293F con una densidad de aproximadamente 1,4x106 células/mL en un matraz de agitación de 500 mL. El cultivo se incubó en un aparato Kuehner-Shaker ISF1-X (Kuehner) configurado a 100 rpm, un 6% de CO²y 37 °C durante 6 días. A continuación, se purificaron las variantes de IGF1-Fc a partir de los sobrenadantes de cultivos celulares limpiados mediante cromatografía de Proteína A utilizando una columna HiTrap MabSelect Sure de 1mL (GE Healthcare) en un AKTA Avant (GE Healthcare). Después de un lavado inicial con PBS, el material unido se eluyó con citrato 50 mM, a pH 3,0, NaCl 150 mM y se neutralizó inmediatamente.

Se transfectaron 100 mL de cultivo de HEK 293F con reactivo de transfección FuGENE HD (Roche) de la siguiente manera: Se diluyeron 100 gg de ADN plasmídico en agua en 1 mL de medio de expresión FreeStyle (GIBCO, Cat.

12338026) mantenido a temperatura ambiente. Se añadieron 400 gL de FuGENE al ADN diluido y la mezcla se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, los 1,4 mL de mezcla ADN-FuGENE se añadieron a 98,6 mL de cultivo celular de HEK 293F (Invitrogen) en un matraz de 500 mL que tenía una densidad celular de aproximadamente 0,5x106 células/mL. El cultivo se incubó en un aparato Kuehner-Shaker ISF1-X (Kuehner) configurado a 100 rpm, un 6% de CO²y 37 °C durante 7 días. A continuación, se purificaron las variantes de IGF1-Fc a partir de los sobrenadantes de cultivos celulares limpiados mediante cromatografía de Proteína A utilizando una columna HiTrap MabSelect Sure de 1 mL (GE Healthcare) en un AKTA Avant (GE Healthcare). Después de un lavado inicial con PBS, el material unido se eluyó con citrato 50 mM, a pH 3,0, NaCl 150 mM y se neutralizó inmediatamente.

Producción a media escala:

Se transfectaron 9,5 L de cultivo de HEK 293 con polietilenimina (PEI) de la siguiente manera: Se incubaron 10 mg de ADN plasmídico en tampón TE en 250 mL de medio OptiMEM1 a temperatura ambiente [N.° de cat. Gibco 11058-021] durante 5 minutos. Se añadieron 20 mg de polietilenimina PEI (de una solución madre de PEI con una concentración de 1 mg/mL) a 250 mL de medio OptiMEM1 a temperatura ambiente (n.° de cat. Gibco 11058-021). Las soluciones de ADN y PEI se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos. A continuación, la mezcla de 500 mL de ADN-PEI se añadió a 9,5 L de cultivo de HEK con una densidad de entre 0,75x106 células/mL y 1,25x106 células/mL. Las células transfectadas se inocularon a 37 °C en un Wave Cellbag de 20 L (GE Healthcare, N.° CB0020L10-03). La Cellbag se colocó en un Wave System 20/50 EHT configurado a 25 rpm, con un ángulo de oscilación de 7°, un 7% de CO², 0,50 lpm de aire y 37 °C. Los constructos de fusión de Fc se capturaron a partir de los sobrenadantes de cultivo concentrados mediante cromatografía de Proteína A. Después de un lavado inicial con PBS, el material unido se eluyó con citrato 50 mM, a pH 2,7, NaCl 140 mM y se neutralizó inmediatamente. A continuación, la fracción neutralizada se concentró por ultrafiltración y se clasificó por tamaños sobre Superdex 200 en PBS con el fin de eliminar algunos agregados contaminantes. La pureza del material fue >95% a juzgar tanto por el análisis LC-MS y el SDS-PAGE.

A4 Evaluación del nivel de agregación por SEC-MALS

Las variantes de IGF-1-Fc con purificación de Proteína A se analizaron para determinar el nivel de agregación mediante cromatografía de exclusión de tamaños acoplada con mediciones con un detector de la dispersión de la luz multiángulo (SEC-MALS) se llevaron a cabo en un sistema de HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies) conectado con un detector de dispersión de la luz de tres ángulos (miniDAWN Treos, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, EE. UU.). La concentración de la muestra se siguió en línea con un refractómetro diferencial (Optilab rEX, Wyatt Technology) utilizando un valor de incremento del índice de refracción específico (dn/dc) de 0,186 mL/g. Se inyectaron volúmenes de muestra de 50 uL en una columna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Los datos se registraron y se procesaron utilizando el software ASTRA V (Wyatt Technology). Con el fin de determinar los volúmenes de retraso del detector y los coeficientes de normalización para el detector MALS, se utilizó una muestra de BSA (Sigma, A8531) como referencia. No se aplicó ni corrección de eliminación de artefactos ni de ensanchamiento de picos.

A5 Cultivo celular

Las células de músculo esquelético humanas (skMC) se obtuvieron de Cambrex (N.° CC-2561). Se cultivaron mioblastos primarios humanos en medio de cultivo [SkGM que contenía un 20% de suero fetal bovino (FBS, N.° 2-01F40-1, Amimed) y un 0,1% de gentamicina]. Después de 4-5 días (a 37 °C, 5% de CO²y un 95% de humedad) las células se sembraron en medio de cultivo con una densidad de 150000 células/pocillo y se cultivaron (a 37 °C, un 5% de CO²y un 95% de humedad). En el día 3 después de la siembra se utilizaron mioblastos skMC para experimentos de señalización. Los NIH3T3-IGF-1R y NIH3T3-InsR se mantuvieron en D-MEM que contenía un 10% de FBS, penicilina con una concentración de 100 U/mL, y estreptomicina con una concentración de 100 pg/mL. Los mioblastos de cinomolgo primarios se aislaron a partir del gastrocnemio de un mono cinomolgo, Macaca fascicularis. Las células se cultivaron en SkBM que contenía un 20% de suero fetal bovino (FBS, N.° 2-01F40-1, Amimed) y un 0,1% de gentamicina (Life Technologies, N.° 15750-037). Los adipocitos 3T3-L1 y las células C2C12 se obtuvieron de la colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC-CL-173 y ATCC; N.° 91031101, respectivamente). Los adipocitos 3T3-L1 se mantuvieron en DMEM, contenido elevado de glucosa, 1,5 g/Litro de NaHCO3 (At Tc N.° 30-2002) y la diferenciación se inició con la adición de DMEM, que contenía un 10% de FCS, un 1% de penicilina/estreptomicina, IBMX 0,5 mM, dexametasona 1 pM. Los mioblastos C2C12 se diferenciaron en el día 3 después de la siembra. Para hacer esto, las células se lavaron una vez con medio de diferenciación (DM) constituido por DMEM suplementado con un 2% de suero de caballo inactivado térmicamente (HS; N.° US 14-403F, Cambrex), 1% de penicilina/estreptomicina y un 1% de glutamina y posteriormente se incubó en DM durante 72 horas a 37 °C, un 5% de CO²y un 95% de humedad.

A6 Biacore

Las propiedades de unión se caracterizaron por SPR utilizando un instrumento Biacore T200 a 25 °C. Se prepararon tres chips CM5 (GE, BR-1005-30) aplicando el procedimiento de acoplamiento de aminas estándar. La celda de flujo 1 se inmovilizó con blanco para servir como referencia, mientras que en las celdas de flujo de medición 2 y 3 se inmovilizaron IGF-1 y hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A. Los niveles de inmovilización se adaptaron a la interacción individual y oscilaron entre 20 - 143 RU (IGF-1) y entre 32 - 113 RU (hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A). Se prepararon diluciones en serie de IGF-1R humano rec. (R&D Systems, 391-GR) en tampón de análisis, 1x HBS-EP+ (Teknova, H8022) que contiene citrato 30 mM y un 0,05% de BSA, y se inyectaron en el chip con una tasa de flujo de 50 pL/min. Los intervalos de concentración de analito se adaptaron a la interacción individual y oscilaron entre 1000 - 3,9 nM (IGF-1 R). Los ligandos se regeneraron inyectando tampón de elución Ag/Ab suave (Thermo Scientific, 21027) durante 90 segundos a 50 pL/min. Se calcularon las constantes de velocidad cinéticas y KD ajustando sensorgramas con doble referenciación respecto a un modelo de unión 1:1.

A7 ELISA

Para el análisis de la fosforilación de IGF-1R, se cultivaron células colocadas en placas de 6 pocillos en medio de cultivo durante 24 (NIH3T3-IGF-1R) o 72 horas (mioblastos primarios humanos y de cinomolgo). Las células se privaron de suero durante 24 (NIH3T3-IGF-1R) o 4 (mioblastos primarios humanos y de cinomolgo) horas y después se estimularon con los péptidos indicados durante 15 min a 37 °C. Las células se lisaron con tampón PhosphoSafe (Cell Signaling) que contenía varios inhibidores de proteasas y se limpiaron mediante centrifugación a 14 000 x g durante 15 minutos a 4°C y los niveles de fosforilación de IGF-1 R se analizaron mediante ELISA utilizando un kit de fósforo-IGF-1 R humano DuoSet IC (R&D Systems).

Para el análisis de la fosforilación del receptor de insulina, se colocaron en placas células NIH3T3-InsR con una densidad de 0,2 x 106 células por pocillo de una placa de 6 pocillos y se cultivaron en medio de cultivo durante 24 horas. Las células se privaron de suero durante 18 horas en medio exento de suero y después se estimularon con diferentes ligandos a 37 °C durante 10 minutos. Las células se lisaron tal como se ha descrito anteriormente y los niveles de fosforilación de InsR se analizaron mediante ELISA utilizando un kit ELISA de fósforo-InsR humano DuoSet IC (R&D Systems).

A8 Captación de glucosa

Para medir la captación de glucosa se sembraron miotubos de ratón C2C12 y adipocitos 3T3-L1 en placas de 24 pocillos y se cultivaron en DMEM exento de suero durante 4 horas. A continuación, el DMEM exento de suero se reemplazó con tampón KRP (NaCl 130 mM, MgSO41,3 mM, CaCl 1,3 mM, KCl 5 mM y Na2HPO410 mM) o HBS (NaCl 140 mM, MgSO4 2,5 mM, CaCl 1,0 mM, KCl 5 mM y Hepes 10 mM) para los adipocitos 3T3-L1 y los c 2c 12, respectivamente. Las células se trataron durante 1 hora con los péptidos especificados a 37 °C. La captación de glucosa se midió añadiendo 0,4 (adipocitos) o 0,8 (C2C12) pCi de [3H] 2-desoxi-D-glucosa y 2-deoxi-D-glucosa 0,1 (adipocitos) o 0,01 (C2C12) mM durante 10 (adipocitos) o 5 (C2C12) minutos a temperatura ambiente. El medio se aspiró y el ensayo se finalizó añadiendo tampón HBS o KRP que contenía citocalasina B 1 pM. A continuación, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se lisaron utilizando NaOH 0,2 M y la radiactividad se analizó mediante recuento del centelleo (remítase a las figuras 5/6).

A9 Perfiles farmacocinéticos

Las ratas macho adultas (n=3/grupo) recibieron una inyección de bolo intravenosa (i. v.) o subcutánea de hIGF-1-Ea-Fc_mut 13/2_A o hIGF-1-Ea-Fc_mut 04/2_E con una concentración de 10 mg/kg o hlGF-1 (1 mg/kg). Se recogieron varias muestras de sangre en serie a las 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 168 y 336 horas después de la administración de variantes de IGF-1 o 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8 y 24 horas después de la administración de hIGF-1. Las concentraciones en suero de las proteínas recombinantes se determinaron mediante ELISA.

A10 Efectos de hIGF-1 -Ea-Fc_mut_13/2_A frente a la atrofia muscular inducida por dexametasona.

Se disolvió dexametasona (Dex) en PBS para lograr una dosis de 0,075 mg/kg/día con el modelo de Alzet 2ML2 durante 28 días. La Dex se combinó en las minibombas con hIGF-1 con una dosis de 3,8 mg/kg/día en el grupo C. El tratamiento con Dex se combinó con un tratamiento subcutáneo cada dos días de hIGF1 -Ea-Fc_13/2_A en los grupos D, E y F con dosis de 3, 10 y 30 mg/kg, respectivamente. Las bombas se llenaron con la solución y se mantuvieron durante varias horas a 37 °C en PBS hasta el implante quirúrgico. Las ratas se trataron por vía subcutánea con Temgesic con una dosis de 0,02 mg/kg con un volumen de 1 mL/kg al menos 30 minutos antes de la cirugía, y posteriormente las bombas llenadas con la solución indicada anteriormente se implantaron por vía subcutánea en el lomo de las ratas anestesiadas con isoflurano con una concentración de un 3%. El Temgesic se administró por vía subcutánea a las ratas 24 h y 48 h después de la cirugía. Las ratas en los grupos A, B y C se trataron con inyección subcutánea diaria de PBS. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana. Cuatro semanas después del tratamiento las ratas se sacrificaron con CO², y los músculos se diseccionaron y se pesaron.

PARTE B: Ejemplos de trabajo

Una molécula de la técnica anterior que comprende un péptido Ea, donde los residuos de proteína E3, R71 y S72 se han eliminado y el aminoácido R37 ha sido sustituido por alanina (hIGF1-Ea-Fc-mut 3) (SEQ ID NO.: 27) ha sido producida y evaluada.

Ejemplo 1: Preparación de vectores de expresión de ADN

1.1 Se construyó un vector de expresión de ADN que codificaba el polipéptido precursor de hIGF-1-Ea que contenía las siguientes modificaciones tal como se ha descrito anteriormente: hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A (incluida la porción Fc de hIgG1 que portaba la mutación de silenciamiento de la función efectora L234A L235A ("LALA") (SEQ ID N.°: 9); donde G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q); y que se conecta a una región Fc de IgG1 LALA.

Esto da lugar a la siguiente secuencia proteica secretada:

(SEQ ID NO.: 9)

T L C G A E L V D A L Q F V C G D R G F Y F N K P T G Y G S S S Q A A P Q T S I V D E C C F R S C D L R R L E M Y C A P L K P A V Q A Q Q H T D M P K T Q K E V H L K N A S R G S A G N K N Y Q M C P P C P A P E A A G G P S V F L F P P K P K D T L M IS R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K

1.2 Se construyó un vector de expresión de ADN que codificaba el polipéptido precursor de hIGF-1-Ea que comprendía las siguientes modificaciones tal como se ha descrito en la sección A2 anterior:

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E (incluida la región Fc de hIgG1 LALA): una proteína precursora de IGF-1 humano, donde G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E) y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77y R104 se mutan a glutamina (Q); y que está conectado a una región Fc de IgG1 LALA.

Esto da lugar a la siguiente secuencia proteica secretada:

(SEQ ID NO.: 12)

T L C G A E L V D A L Q F V C G D R G F Y F N K P T G Y G S S S R E A P Q T S I V D E C C F R S C D L R R L E M Y C A P L K P A V Q A Q Q H T D M P K T Q K E V H L K N A S R G S A G N K N Y Q M D K T H T C P P C P A P E A A G G P S V F L F P P K P K D T L M IS R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K

Basándose en los principios expuestos anteriormente, se han producido las siguientes proteínas adicionales:

Ejemplo 54 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E; SEQ ID NO.:8)

Ejemplo 56 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C; SEQ ID NO.: 10)

Ejemplo 50 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F; SEQ ID NO.: 11)

Ejemplo 58 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A; SEQ ID NO.: 13)

Ejemplo 59 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F; SEQ ID NO.: 14)

1.3 Se construyó un vector de expresión de ADN que codificaba el polipéptido hIGF-1 que contenía las siguientes modificaciones utilizando métodos de construcción de vectores de ADN/manipulaciones de ADN conocidos en la técnica: hIgF1 G42S (SEQ ID N.°: 117);

Esto da lugar a la siguiente secuencia proteica:

(SEQ ID NO.: 117)

G P E T L C G A E L V D A L Q F V C G D R G F Y F N K P T G Y G S S S R R A P Q T S I V D E C C F R S C D L R R L E M Y C A P

L K P A K S A

1.4 Se construyó un vector de expresión de ADN que codificaba el polipéptido hIGF-1 que contenía las siguientes modificaciones utilizando métodos de construcción de vectores de ADN/manipulaciones de ADN conocidos en la técnica: hIGF1-Ea-mut 03-G42S (SEQ ID N.°: 118);

Esto da lugar a la siguiente secuencia proteica:

(SEQ ID NO.: 118)

G P T L C G A E L V D A L Q F V C G D R G F Y F N K P T G Y G S S S R A A P Q T S I V D E C C F R S C D L R R L E M Y C A P L

K P A K S A V R A Q R H T D M P K T Q K E V H L K N A S R G S A G N K N Y R M

Ejemplo 2: Estimulación con proteasas de variantes de IGF-1 -Fc

Las proteínas producidas en sistemas de expresión de células de mamíferos tales como, por ejemplo, CHO, pueden experimentar degradación proteolítica durante la expresión. Con el fin de evaluar eficientemente la potencial susceptibilidad a proteasas durante la producción de una forma estandarizada, se ha desarrollado un ensayo de estimulación con proteasas utilizando proteína purificada y medio acondicionado procedente de cultivos celulares de CHO. La comparación de ese ensayo con el patrón de escisión observado para una variante de IGF-1-Fc producida en células CHO proporcionó una validación del ensayo. En resumen, las células CHO se cultivaron (37 °C, 6% de CO², 85% de humedad rel., 90 -150 rpm) en medio CHODM122 procedente de 2E5 células/mL hasta una densidad de hasta 1E7 células/mL. El sobrenadante limpiado proporciona el medio acondicionado utilizado para el ensayo. Las variantes de IGF-1 -Fc se purificaron tal como se ha descrito anteriormente (A3) y se añadieron con una concentración de 100 ug/mL en medio acondicionado o PBS como control. Después de la filtración estéril, las muestras se incubaron a 37 °C hasta 20 días y se tomaron muestras para analizar en varios puntos temporales. Los diferentes productos de degradación se podrían aislar bien mediante técnicas SDS-PAGE estándar (NuPAGE Bis-Tris, Invitrogen) y la intensidad de las bandas de degradación se cuantificó por densitometría. Los resultados se muestran en la Figura 17.

Ejemplo 3: Unión con afinidad elevada de hIGF-1 y análogos a IGF-1 R humano recombinante

La unión con afinidad elevada de variantes de hIGF-1 e IGF-1 a rhIGF1 R se midió utilizando resonancia de plasmón superficial (Biacore). Se llevó a cabo un ensayo de unión directa. Se inmovilizaron IGF-1 -Ea_Fc_Mut_13/2_A y hIGF-1 humanos en un chip y el receptor de IGF-1 sirvió como analito en solución. Los sensorgramas resultantes se ajustaron a un modelo de interacción 1:1 para calcular las constantes de disociación de equilibrio (KD). Los resultados muestran que la unión de hIGF-1 -Ea_Fc_Mut_13/2_A a IGF-1R es comparable con hIGF-1 (Figura 1).

Ejemplo 4: Inducción de fosforilación de IGF-1 R

La capacidad del hIGF-1 y las variantes de hIGF-1 para estimular la fosforilación del IGF-1 R se evaluó en primer lugar en células NIH3T3 que sobreexpresaban IGF-1R humano (NIH3T3-IGF-1R) mediante ELISA. En estas células, la fosforilación de IGF-1 R fue inducida de una manera dependiente de la concentración por todos los péptidos evaluados. El ajuste de la curva logístico de los datos de ELISA promediados mostró que la potencia (CE⁵⁰) de hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, R77Q-Fc y hIGF1-Ea -Fc_mut_04/2_E era reducida en comparación con hIGF-1 (Figura 2A-B). Sin embargo, el ajuste de la curva logístico de los datos de ELISA promediados proporcionó un valor de respuesta máxima comparable para todos los péptidos evaluados (Figura 2C-D). La capacidad de las variantes de hIGF-1 y el hIGF-1 para estimular la fosforilación del IGF-1 R endógeno se evaluó en mioblastos humanos primarios y en mioblastos de cinomolgo. En estas células, la fosforilación de IGF-1 R fue inducida de una manera dependiente de la concentración por todos los péptidos evaluados (Figura 4B-C). El ajuste de curva logístico de los datos de ELISA promediados mostró que la potencia (CE⁵⁰) de las variantes de hIGF-1 era E era reducida en comparación con hIGF-1 (Figura 4A). Sin embargo, el ajuste de curva logístico de los datos de ELISA promediados proporcionó un valor de respuesta máxima comparable para todos los péptidos evaluados (Figura 4).

Ejemplo 5: Especificidad frente a receptor de insulina

Para evaluar si las modificaciones de aminoácidos de las variantes de IGF-1 afectaban a la especificidad de los receptores, se analizaron los efectos de los péptidos de variantes de IGF-1 en la fosforilación de InsR en NIH3T3 que sobreexpresan el InsR humano mediante ELISA. Los inventores trataron transfectantes de células NIH3T3-InsR con concentraciones diferentes de variantes de IGF-1, hIGF-1 e insulina. Se utilizaron concentraciones equimolares de los péptidos indicados. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3/18. Las modificaciones afectaron a la especificidad por receptores de la mayoría de las variantes de IGF-1 a excepción de las variantes que portan la mutación G42S (hIGF1-Ea -Fc_mut_02, hIGF1-Ea -Fc_mut_03, hIGF1-Ea -Fc_mut_04/2_E y hIGF1-Ea -Fc_mut_13/2_A) que se mostró que mantenían la especificidad por receptores y que eran inductores débiles de la fosforilación de InsR incluso con concentraciones a las cuales la insulina proporcionaría respuestas máximas. Sorprendentemente, se mostró que hIGF1-Ea Fc_mut_13/2_A y hIGF1-Ea Fc_mut_04/2_E eran significativamente menos potentes que el IGF-1 en las funciones efectoras impulsadas por la unión rápida al receptor de insulina (por ejemplo, captación de glucosa en adipocitos diferenciados) tal como se muestra en la Figura 5B y D y en la Figura 6. Por el contrario, hIGF1-Ea Fc_mut_13/2_A y hIGF1-Ea Fc_mut_04/2_E y hIGF-1 fueron equipotentes para las funciones mediadas por IGF-1R tales como la captación de glucosa en los miotubos C2C12 (Figura 5A y C). La introducción de la mutación G42S en la proteína IGF-1 (que dio lugar a la variante IGF-1 G42S de SEQ ID No .:117) así como en la proteína hIGF1-Ea-mut 03 (que dio lugar a la variante hIGF1-Ea-mut 03- G42S de SEQ ID NO.:118) redujo la fosforilación de InsR (Figura 18) en las células NIH3T3-InsR. Además, dichas mutaciones tienen un impacto sobre la captación de glucosa en adipocitos y en miotubos C2C12, respectivamente (Figura 19).

Ejemplo 6: Determinación de la concentración en suero

Las concentraciones en suero de hIGF1-Ea-Fc-mut_13/2_A y hIGF1-Ea.Fc_mut_04/2_E después de una administración de una única dosis i.v. y s.c. en ratas Fischer macho (n=3) se determinó mediante ELISA específico para hIGF-1Ea 3mut (para consultar los detalles remítase a la sección A5 anterior). Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 7-A y 7-B. La semivida terminal es de aproximadamente 753 y 50,1 horas, respectivamente. La concentración máxima se alcanzó después de 8 y 24 horas (Tmáx) de la administración de una dosis s.c., respectivamente. Por el contrario, después de la administración intravenosa de hIGF-1 (1,0 mg/kg), los niveles de hIGF-1 fueron cuantificables durante un intervalo temporal de 0-8 horas. Después de que se alcanzase la Tmáx (0,083 h), se observó un descenso rápido de la concentración en suero del péptido que dio lugar a una semivida terminal aparente de 1,81 h. Después de la administración subcutánea de hIGF-1 (1,0 mg/kg), los niveles en suero fueron cuantificables hasta 8 h después de la dosificación y la concentración máxima se observó a las 0,5 h después de la dosis. Por tanto, los análogos de IGF-1 exhiben un perfil farmacocinético muy mejorado en comparación con el IGF-1 humano.

Ejemplo 7: Efectos de hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A frente a la atrofia muscular inducida por dexametasona.

Como se ha mostrado que la IGF-1 estimula la síntesis proteica e inhibe la degradación proteica en el músculo esquelético, se evaluó si la administración de hIGF-1 -Ea_Fc_mut_13/2_A en ratas tratadas con dexametasona podría prevenir la atrofia muscular. Se infundieron de forma continua ratas Wistar macho a través de una bomba Alzet con 75 pg de dexametasona/kg/día solo o junto con vehículo (PBS) o hIGF-1. Un grupo adicional de animales infundidos con dexametasona tal como se ha descrito anteriormente recibió cada dos días una inyección s.c. de hIGF-1 -Ea_Fc_mut_13/2_A. Todos los animales se trataron durante veintiocho días y después se sacrificaron. El peso corporal se monitorizó al inicio del experimento y después en el día 28 después de la inyección.

Como se esperaba, se observaron reducciones significativas en el peso corporal y muscular en las ratas tratadas con dexametasona en comparación con el control de vehículo (Figura 8). La inyección de hIGF-1-Ea_Fc_mut_13/2_A redujo significativamente la pérdida de peso corporal y muscular (Figura 8).

Además de las variantes de polipéptidos precursores de hIGF-1-Ea descritas anteriormente, las siguientes variantes de proteínas adicionales se pueden producir y utilizar de acuerdo con la invención:

Ejemplo 8

(2b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkna

srgsagnknyrm (SEQ ID NO.:32).

Ejemplo 9

(4b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkna

srgsagnknyrm (SEQ ID NO.:33).

Ejemplo 10

(5b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkna

srgsagnknyrm (SEQ ID NO.:34).

Ejemplo 11

(6b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkna

srgsagnknyrm (SEQ ID NO.:35).

Ejemplo 12

(8b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:36).

Ejemplo 13

(9b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina y los aminoácidos R71 y S72 se eliminan.

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:37).

Ejemplo 14

(13b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:38).

Ejemplo 15

(14b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:39).

Ejemplo 16

(15b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

asrgsagnknyqm (SEQ ID NO.:40).

Ejemplo 17

(16b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R77 se muta a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqqhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:41).

Ejemplo 18

(17b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:42).

Ejemplo 19

(18b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

asrgsagnknyqm (SEQ ID NO.:43).

Ejemplo 20

(19b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:44).

Ejemplo 21

(20b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn

asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:45).

Ejemplo 22

(21b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

asrgsagnknyqm (SEQ ID NO.:46).

Ejemplo 23

(22b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavqaqrhtdm pktqkevhlkn asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:47).

Ejemplo 24

(23b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:48).

Ejemplo 25

(24b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn asrgsagnknyqm (SEQ ID NO.:49).

Ejemplo 26

(25b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqrhtdmpktqkevhlkn asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:50).

Ejemplo 27

(26b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:51).

Ejemplo 28

(27b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn asrgsagnknyrm (SEQ ID NO.:52).

Ejemplo 29

(28b) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn asrgsagnknyqm (SEQ ID NO.:53).

Ejemplo 30

(29b) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina, los aminoácidos R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q)-tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavqaqqhtdmpktqkevhlkn asrgsagnknyqm (SEQ ID NO.:54).

Ejemplo 31

(2c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan.

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrg sagnknyrm (SEQ ID NO.:55).

Ejemplo 32

(4c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan. tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:56).

Ejemplo 33

(5c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan. tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:57).

Ejemplo 34

(6c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan. tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:58).

Ejemplo 35

(8c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan. tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpaqvraqrhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyrm (SEQ ID NO.:59).

Ejemplo 36

(9c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan. tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavraqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:60).

Ejemplo 37

(13c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:61).

Ejemplo 38

(14c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina y los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyrm (SEQ ID NO.:62).

Ejemplo 39

(15c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqrapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyqm (SEQ ID NO.:63).

Ejemplo 40

(16c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:64).

Ejemplo 41

(17c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyrm (SEQ ID NO.:65).

Ejemplo 42

(18c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssreapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyqm (SEQ ID NO.:66).

Ejemplo 43

(19c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:67).

Ejemplo 44

(20c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, y R77 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyrm (SEQ ID NO.:68).

Ejemplo 45

(21c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por alanina (A), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyqm (SEQ ID NO.:69).

Ejemplo 46

(22c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasrg

sagnknyrm (SEQ ID NO.:70).

Ejemplo 47

(23c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S7272 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q).

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyrm (SEQ ID NO.:71).

Ejemplo 48

(24c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrpapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyqm (SEQ ID NO.:72).

Ejemplo 49

(25c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y el aminoácido R74 se muta a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqrhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyrm (SEQ ID NO.:73).

Ejemplo 50

(26c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q)-tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyrm (SEQ ID NO.:74).

Ejemplo 51

(27c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74 y R77 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr

gsagnknyrm (SEQ ID NO.:75).

Ejemplo 52

(28c) G1, P2, E3 se eliminan, los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por glutamina (Q), G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqqapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyqm (SEQ ID NO.:76).

Ejemplo 53

(29c) G1, P2, E3 se eliminan, el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q), R37 se sustituye por alanina, G42 se sustituye por serina, los aminoácidos K68, S69, A70, R71 y S72 se eliminan y los aminoácidos R74, R77 y R104 se mutan a glutamina (Q). tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssqaapqtsivdeccfrscdlrrlemycaplkpavqaqqhtdmpktqkevhlknasr gsagnknyqm (SEQ ID NO.:77).

Ejemplo 54: Expresión de IGF-1 recombinante en líneas de células CHO con deficiencia de receptor IGF-1.

La expresión de IGF-1 recombinante en líneas de células CHO dio como resultado la inhibición del crecimiento celular y títulos bajos. En la figura 11 se muestran las mediciones de los títulos de hIGF-1 Ea 3mut (SEQ ID NO.: 27) durante un proceso en un biorreactor. La medición del título máximo de hIGF-1Ea 3mut fue de 8 ug/mL que corresponde a 100 mg/L de un título de anticuerpo (basado en la masa molar). Las mediciones de título promedio de un anticuerpo recombinante en un proceso en biorreactor son de aproximadamente 3 g/L. Una causa del título bajo de IGF-1 es el crecimiento celular reducido y una viabilidad celular baja de las células que expresan IGF-1. Durante un proceso de expresión de anticuerpos de la célula derivada de CHO-K1, las células crecen hasta 2-25 x 107 células/mL y la viabilidad celular es superior a un 97% durante las primeras 230-260 h de tiempo de cultivo. Por el contrario, las células derivadas de CHO-K1 que expresan IGF-1 crecen solamente hasta 0,5-0,9 x 107 células/mL y la viabilidad celular cae ya después de 80 h por debajo de un 97% (remítase a la figura 11).

El crecimiento celular reducido también se pudo detectar durante el cocultivo de las células derivadas de CHO-K1 no transfectadas con IGF-1. La Figura 12 muestra que las células derivadas de CHO-K1 precursoras crecen hasta 2,5 x 107 células/mL. Durante el cocultivo de células derivadas de CHO-K1 con IGF-1 de origen natural o hIGF-1Ea 3mut (50 mg/L), el crecimiento celular también se inhibe de forma significativa (0,9 x 107 células/mL).

En el siguiente paso, un inhibidor de tirosina-cinasa IGF-1R específico (NVPAEW541) (In vivo antitumor activity of NVPAEW541- A novel, potent, and selective inhibitor of the IGF-IR kinase; Carlos García-Echeverría et al.; Cáncer Cell; publicado en internet el 26 de febrero de 2004 DOI: 10.1016/S1535610804000510) se añadió durante los experimentos de cocultivo de IGF-1 en células derivadas de CHO-DUXB11. La inhibición del crecimiento celular se pudo evitar (remítase a la figura 13). Este verifica que el IGF-1-R desencadena una señal en la célula que da como resultado una inhibición del crecimiento celular.

En el siguiente paso, se llevó a cabo una supresión de IGF-1 R utilizando la técnica de nucleasas de dedos de zinc (ZFN) en líneas de células derivadas de CHO-DUXB11 y célula derivada de CHO-K1. Se diseñaron ZFN que son específicas que se unen en la región del exón 3 de IGF-1R. Dos plásmidos, cada uno de los cuales codifica una subunidad de la ZFN con especificidad por IGF-1 R, se cotransfectaron en células derivadas de CHO-DUXB11 o célula derivada de CHO-K1. Cada subunidad de ZFN se une a secuencias de una longitud de 18 pares de bases específicas; por lo tanto, en total, se reconoce específicamente una secuencia de 36 pb (lo que evita el corte aleatorio en otras ubicaciones del genoma). El dominio endonucleasa de FokI se rediseña para que funcione solamente como heterodímero con el fin de escindir ADN. El dímero de ZFN crea roturas bicatenarias dirigidas en el exón 3 de IGF-1 R. A través del proceso celular proclive a errores de la unión de extremos no homólogos, esta rotura bicatenaria puede dar como resultado una modificación de la secuencia de ADN y, por tanto, crea una supresión funcional del gen diana. Para la célula derivada de CHO-K1, se generaron tres clones con supresión (supresión en ambos alelos y mutaciones de desplazamiento del marco): Clon 1: A2 (SEQ ID NO.: 99), clon 2: A5 (SeQ iD NO.: 100) y clon 3: A2 (SEQ ID NO.: 101), Clon 1: 18 (y sustitución de 14 pb) (SEQ ID NO.: 103), clon 2: A22 (SEQ ID NO.: 102) y clon 3: A114 (SEQ ID NO.: 104).

La línea de células derivadas de CHO-DUXB11 es, al contrario que la célula derivada de CHO-K1, policlonal y poliploide, lo que hizo complicada la supresión del IGF-1R (se tuvieron que suprimir más de 2 copias de IGF-1R/genoma). Los inventores han generado varios clones de supresión únicos con mutación de desplazamiento del marco y se validaron dos de ellas con clonación TOPO y secuenciación. Clon 12: A7 (50%) (SEQ ID NO.: 106)/ A22 (50%) (SEQ ID NO.: 105), clon 19: A7 (14,5%) / A16 (44%) / A22 (18%) / A22mut (15%). Los porcentajes entre paréntesis se basan en la frecuencia con la que esta mutación tiene lugar a partir de 32 colonias bacterianas secuenciadas. Para el clon 19, se puede asumir que existen 6 alelos de IGF-1 R (3 x A16, 1 x A7, 1 x A22, 1 x A22mut). Los tres clones con IGF-1 R KO en células derivadas de CHO-K1 generados se cocultivaron con IGF-1 y no se pudo detectar inhibición del crecimiento celular (remítase a la figura 14).

Los dos clones derivados de CHO-DUXB11 con IGF-1 R KO generados también se cultivaron en presencia/ausencia de IGF-1. De formar similar a los clones con IGF-1 R KO en CHO-K1, se pudo detectar un crecimiento celular mejorado para los clones KO en comparación con las células derivadas de CHO-DUXB11 de origen natural (remítase a la figura 15). Uno de los clones KO no mostró inhibición del crecimiento celular en presencia de IGF-1 y el otro clon KO tuvo en presencia de IGF-1 un recuento de células viables máx. similar a la célula derivada de CHO-DUXB11 sin cocultivo de IGF-1.

Estrategia de clonación del vector pBW806 (hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A).

El vector pBW806, que codifica el hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A, se preparó siguiendo dos pasos de clonación consecutivos. En un primer paso, el plásmido 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E _pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con Xbal y AscI con el fin de extraer la región Fc sintetizada de novo. En paralelo, pBW679 (vector propiedad de Novartis) se digirió con AscI y Xbal, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector intermedio pBW805. En un segundo paso, el plásmido 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y Sse232I con el fin de extraer la región n-terminal de la proteína de fusión hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A. En paralelo, el vector intermedio pBW805 se digirió posteriormente con Sse232l y Xbal, lo que suministró la fracción estructural deseada que finalmente se ligó con el fragmento 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A_pMA-T, lo que dio lugar al vector de expresión final pBW806.

Estrategia de clonación del vector pBW807 (hlGF1-Ea-fc_mut 13/2_C).

El vector pBW807, que codifica el hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C, se preparó siguiendo dos pasos de clonación consecutivos. En un primer paso, el plásmido 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E _pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con Xbal y AscI con el fin de extraer la región Fc sintetizada de novo. En paralelo, pBW679 (vector propiedad de Novartis) se digirió con AscI y Xbal, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector intermedio pBW805. En un segundo paso, el plásmido 11AARNWC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y Sse232I con el fin de extraer la región n-terminal de la proteína de fusión hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C. En paralelo, el vector intermedio pBW805 se digirió posteriormente con Sse232I y XbaI, lo que suministró la fracción estructural deseada que finalmente se ligó con el fragmento 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C_pMA-T (vector propiedad de Novartis), lo que dio lugar al vector de expresión final pBW807.

Estrategia de clonación del vector pBW808 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F).

El vector pBW808, que codifica el hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F (vector propiedad de Novartis), se preparó siguiendo dos pasos de clonación consecutivos. En un primer paso, el plásmido 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y AscI con el fin de extraer la región Fc sintetizada de novo. En paralelo, pBW679 (vector propiedad de Novartis) se digirió con AscI y XbaI, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector intermedio pBW805. En un segundo paso, el plásmido 11AARNYC_hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y Sse232I con el fin de extraer la región n-terminal de la proteína de fusión hIgF1 -Ea-Fc_mut 13/2_Fc. En paralelo, el vector intermedio pBW805 se digirió posteriormente con Sse232I y XbaI, lo que suministró la fracción estructural deseada que finalmente se ligó con el fragmento 11AARNUC_hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F_pMA-T (vector propiedad de Novartis), lo que dio lugar al vector de expresión final pBW808.

Estrategia de clonación del vector pBW809 (hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E).

El vector pBW809, que codifica la secuencia de fusión HIGF1 -EA-FC_MUT 04/2_E Fc, se preparó siguiendo dos pasos de clonación consecutivos. En un primer paso, el plásmido 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y AscI con el fin de extraer la región Fc sintetizada de novo. En paralelo, pBW679 (vector propiedad de Novartis) se digirió con AscI y XbaI, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector intermedio pBW805. En un segundo paso, el plásmido 11AARN2C_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y Sse232I con el fin de extraer la región n-terminal de la proteína de fusión hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E. En paralelo, el vector intermedio pBW805 se digirió posteriormente con Sse232I y XbaI, lo que suministró la fracción estructural deseada que finalmente se ligó con el fragmento 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E_pMA-T (vector propiedad de Novartis), lo que dio lugar al vector de expresión final pBW809.

Estrategia de clonación del vector pBW810 (hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A).

El vector pBW810, que codifica el hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A, se preparó siguiendo dos pasos de clonación consecutivos. En un primer paso, el plásmido 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y AscI con el fin de extraer la región Fc sintetizada de novo. En paralelo, pBW679 (vector propiedad de Novartis) se digirió con AscI y XbaI, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector intermedio pBW805. En un segundo paso, el plásmido 11AARN2C_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A_pMA-T (vector propiedad de Novartis) se digirió con XbaI y Sse232I con el fin de extraer la región n-terminal de la proteína de fusión hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A. En paralelo, el vector intermedio pBW805 se digirió posteriormente con Sse232I y XbaI, lo que suministró la fracción estructural deseada que finalmente se ligó con el fragmento 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A_pMA-T (vector propiedad de Novartis), lo que dio lugar al vector de expresión final pBW810.

Estrategia de clonación del vector pBW410 (hIGF-1 Ea 3mut).

El vector 0610900pGA4 (vector propiedad de Novartis), que codifica la secuencia de hIGF-1Ea 3mut se digirió con XbaI y MluI con el fin de extraer la secuencia codificante de IGF sintetizada de novo. En paralelo, pBW165 (vector propiedad de Novartis) se digirió con MIuI y XbaI, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector de expresión final pBW410.

Estrategia de clonación del vector pBW664 (hIGF1 -Ea-D1 -3, R37A, D71-72, 77-dominio fc).

El vector 0905915 (vector propiedad de Novartis), que codifica la secuencia de hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-dominio fc se digirió con XbaI y AscI con el fin de extraer la secuencia codificante de IGF sintetizada de novo. En paralelo, pBW596 (vector propiedad de Novartis) se digirió con AscI y XbaI, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector de expresión final pBW664.

Estrategia de clonación del vector pBW666 (hIGF1 -Ea- A1 -3, R37A, A71-72, R77Q-dominio fc).

El vector 0950919 (vector propiedad de Novartis), que codifica la secuencia de hIGF1 -Ea- A1 -3, R37A, A 71-72, R77Q-dominio fc se digirió con XbaI y AscI con el fin de extraer la secuencia codificante de IGF sintetizada de novo. En paralelo, pBW596 (vector propiedad de Novartis) se digirió con AscI y XbaI, lo que generó el fragmento estructural correspondiente que portaba elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, así como un marcador de selección/amplificación G418/DHFR. Ambos elementos digeridos se ligaron por sus extremos compatibles, lo que dio como resultado el vector de expresión final pBW666.

El clon con IGF-1R KO en una célula derivada de CHO-K1 A5/A22, así como el clon con IGF-1R KO derivado de células CHO-DUXB11 A7/A22 se transfectaron con 5 candidatos de fusión de IGF-1-FC diferentes (remítase a la figura 15). Se pudo detectar un aumento en un factor 5-17 del título de proteína IGF-1 -FC recombinante a nivel de grupo, en comparación con la línea de células derivada de células CHO-DUXB11/célula derivada de CHO-K1 de origen natural transfectada con un candidato de fusión de IGF-1-FC diferente.

Dos de los candidatos de fusión de IGF-1-FC (hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A y hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E) expresados en líneas de células con IGF1R-KO de células derivadas de CHO-K1 o con IGF1R-KO derivadas de CHO-DUXB11 se cultivaron en un biorreactor wave de 100 L (proceso semicontinuo y cambio de temperatura). Los grupos de IGF1RKO de células derivadas de CHO-K1 que expresan hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A/4 crecen hasta una densidad de células viables máx. de 3 x 107 células/mL, que es superior a un proceso AB promedio (la densidad de células promedio es de 2,2 x 107 células/mL. En comparación con las células de origen natural derivadas de CHO-K1 que expresan IGF-1, este es un aumento en un factor 3-6 en los valores de células viables (remítase a la figura 11). Las células IGF1 RKO derivadas de CHO-DUXB11 que expresan hIGF1 -Ea-fc_mut 13/2_A/4 crecían hasta una densidad de células máx. de 1,5-2 x 107 células/mL, que es una densidad de células máx. superior en comparación con la línea de células derivadas de CHO-DUXB11 de origen natural.

Las células IGF1R KO derivadas de CHO-DUXB11 que expresan hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A se sometieron a clasificación celular individual y se determinaron los títulos por lote en el pocillo 24 así como en cultivos discontinuos de 50 mL. En la figura 15, se muestra el título de 24 pocillos de los 30 mejores clones hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A en clones con IGF-1 R KO derivados de CHO-DUXB11, así como de los 30 mejores clones derivados de CHO-DUXB11 de origen natural que expresan hIGF-1 -Ea-D1 -3, R37A, D71-72, 77-dominio fc; en la figura 16 se muestra el título del matraz de agitación de los 15 mejores clones de cada grupo. En total, los clones con IGF-1 R KO derivados de células CHO-DUXB11 tienen un título en el pocillo 24 superior en un factor 8 y un título en un matraz agitado superior en un factor 7.

Ejemplo 55: Cultivo de células CHO transformadas que expresan IGF-1 en un biorreactor.

Para el cultivo de células transformadas que expresan IGF-1 en un biorreactor se aplicó un proceso semicontinuo. Los eventos del proceso tales como el inicio de la alimentación y el cambio de temperatura se programaron para respaldar el crecimiento celular y para extender la fase de producción manteniendo la viabilidad (Niraj Kumar, Patrick Gammell, Martin Clynes (2007) Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO basedproduction culture; Cytotechnology (2007) 53:33-46).

Ejemplo 56: Recolección de IGF-1 a partir de células CHO.

Como procedimiento de recolección se aplicó una técnica de separación de células estándar con filtración en profundidad seguida de filtración esterilizante. Las células CHO se cultivaron y recolectaron de acuerdo con métodos estándar conocidos para el experto en la técnica (p. ej., Curr. Protoc. Protein Sci. Mayo de 2001 ;Capítulo 5: Unidad 5,10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S; (Mahesh Prashada, Klaus Tarrach (2006) Depth filtration: Cellclarification of bioreactor offloads, Filtration & Separation Volumen 43, Número 7, septiembre de 2006, páginas 28-30).

Ejemplo 57: Diseño/producción y uso de ZFN que son específicas para el exón 3 de IGF-1 R:

el Exón 3 de IGF-1 R y los intrones flanqueantes se secuenciaron en las líneas de células CHO de los inventores (SEQ ID NO.: 110/111). En primer lugar, el exón 3 se secuenció utilizando un cóntigo de ADN de hámster que cubre una parte de ADNc de IGF-1 R que comprende el exón 3, así como la secuencia de ratón del gen IGF-1 R.

Los cebadores de PCR se diseñaron sobre partes conservadas y los productos de PCR resultantes se secuenciaron. La secuencia del exón 3 obtenida se proporcionó a Sigma para secuenciar los intrones flanqueantes del exón 3, así como para diseñar dos ZNF modificadas dirigidas al exón 3 de IGF-1 R. Cada ZFN se dirige y se une a 18 nucleótidos en la hebra de ADN inversa (en el 5’) respectivamente la directa (en el 3’). Los dos sitios de unión están separados por los cinco nucleótidos del sitio de corte (SEQ ID NO.: 107). Existe una descripción de producto y métodos disponibles en Sigma en un documento denominado ‘74188 CompoZr Custom ZFN Tech Bulletin'. Sigma también diseñó los cebadores de PCR directo e inverso en las secuencias intrónicas circundantes (SEQ ID NO.: 108 y 109) para amplificar el exón 3 de IGF-1 R en el ADNg, lo que dio lugar a un producto de PCR de 501 pb. Sigma proporcionó el kit CompoZr™ (nucleasas con dedos de zinc a medida, número de producto CSTZFN-1KT, número de lote 08021019MN) que comprende 20-25 gg de dos vectores de ADN, que codifican la hebra inversa (pZFN1) respectivamente la directa (pZFN2) que reconocen la ZFN diseñada.

Se transformaron E.Coli, de acuerdo con protocolos de transformación muy conocidos, con cada vector y se extendieron en placas de agarosa que contenían una concentración de 25 pg/mL de kanamicina. Para cada vector, se seleccionaron y expandieron 4 colonias bacterianas. Las secuencias de ZFN de las cuatro muestras de plásmidos de ADN purificadas de cada pZFN se validaron utilizando los cebadores directo T7 e inverso BHG y se agruparon. Se transfectaron 6 pg o 10 pg de una mezcla homogénea de vectores pZFNI y pZFN2 circulares en células derivadas de CHO-K1 y células precursoras derivadas de CHO-DUXB11, tres veces para cada cantidad, de modo que se generasen seis grupos (más control negativo de la transfección) con cada línea de células. Para medir la eficiencia de escisión de las ZFN en los grupos, se utilizó el ensayo de detección de mutaciones Surveyor (Transgenomics, catálogo 706025) en los días 3 y 10 después de la transfección (contabilizada como día cero) tal como se describe en un protocolo confidencial proporcionado por Sigma. El ADN genómico de los grupos se aisló utilizando el kit Miniprep de ADN genómico de mamífero GenElute (Sigma, catálogo G1N70-1KT), el exón 3 amplificado en una reacción de PCR utilizando los cebadores de secuenciación directo e inverso de IGF-1R situados en las secuencias intrónicas flanqueantes. A continuación, el producto de PCR se desnaturalizó a temperaturas elevadas. Cuando la temperatura se redujo gradualmente, algo de producto de origen natural y mutado se hibrida para formar ADN bicatenario con apareamientos incorrectos alrededor del sitio de escisión, que fue escindido por una enzima denominada Surveyor®. Los productos finales se analizaron utilizando un sistema de electroforesis en gel denominado lab901. Para los 6 grupos transfectados, además del producto de PCR totalmente coincidente de 501 pb, se detectaron dos bandas de menor tamaño de aproximadamente 277 pb y 224 pb, correspondientes a los fragmentos a cada lado del sitio de corte, lo que confirma la actividad ZFN en las células de los inventores. Siete días después de la transfección, los grupos se sometieron a clonación unicelular en placas de 10 x 96 pocillos.

En la línea de células derivadas de CHO-K1 transfectadas con pZFN, se cultivaron 507 clones en placas de 96 pocillos y se evaluaron para detectar mutaciones utilizando el ensayo de detección de mutaciones Surveyor descrito anteriormente (el ADN genómico de los clones se extrae en placas de 96 pocillos utilizando un kit de PCR Extract-N-Amp Blood de Sigma, catálogo XNAB2). 42 clones fueron positivos (se detectaron dos bandas de menor tamaño), lo que significa que su genoma contiene al menos una copia mutada del exón 3, y su exón 3 de IGF-1R amplificado por PCR se secuencia. Como se esperaba para los clones generados a partir de una línea de células derivadas de CHO-K1 pseudodiploides, los cromatogramas de secuenciación de ADN mostraron como máximo dos señales superpuestas de la misma intensidad, lo que indica dos copias de la secuencia diana. 6 clones tenían mutaciones en ambas copias, entre las cuales 3 clones tenían mutaciones que generaban codones de parada cercanos en ambas copias (SEQ ID NO.: 99 y 100) o un codón de parada cercano en una copia y una gran deleción en la otra (SEQ ID NO.: 101). Las secuencias de las dos copias en esos 3 clones se confirmaron mediante clonación TOPO (kit de clonación de TA, Invitrogen, cat. K4575-40; se recogieron 6 colonias bacterianas). Los 3 clones K. O. crecían con densidades celulares significativamente superiores a las células precursoras, y cuando se añadió IGF-1 ('hIGF-1 Ea 3mut' (SEQ ID NO.: 27) con una concentración de 50mg/L en medio estándar, crecían con densidades similares a las células precursoras en medio estándar (figura 8). El clon con el genotipo A5/A22 (SEQ ID NO.: 100/102) se seleccionó para la transfección con la proteína del factor de crecimiento insulínico 1, p. ej., el IGF-1 humano (SEQ ID NO.: 1 o 5) o una variante de esta (p. ej., SEQ ID NO.: 8-14).

En la línea de células derivadas de CHO-DUXB11 transfectadas con pZFN, solamente se cultivaron 117 clones en placas de 96 pocillos y se evaluaron para detectar mutaciones con el ensayo Surveyor. 28 clones tenían al menos una copia mutada de exón 3 (se detectaron dos bandas de menor tamaño), pero la secuenciación indicó que todos esos clones aún tenían copias de origen natural; la secuencia de origen natural tenía una intensidad superior en los cromatogramas de secuenciación que la secuencia mutada. La línea de células derivadas de CHO-DUXB11 es mutagenizada y policlonal; los cariotipos muestran hasta ocho copias de un cromosoma en algunas células, lo que hace difícil la estimación del número de copia esperado de un gen. Dos clones, en los que la secuencia mutada detectada (A22 o A16) generó codones de parada cercanos, se seleccionaron para una segunda ronda de transfección con pZFN; se generaron 3 grupos por clones originales utilizando 10pg de pZFN mezcladas. Siete días después de la transfección, los grupos se sometieron a clonación por FACS en placas de 6 x 96 pocillos. Se cultivaron 379 clones, de los cuales 211 se secuenciaron para detectar el exón 3 de IGF-1 R (ya no es posible realizar el ensayo Surveyor debido a que es una secuencia ya mutada) y se analizaron visualmente las secuencias superpuestas en los cromatogramas. La mayoría de los clones secuenciados eran heterocigotos con la secuencia de origen natural y la secuencia mutada esperada (A22 or A16); ~20% de los clones tenían una secuencia de origen natural y 2 secuencias mutadas (principalmente con deleciones alrededor del sitio de corte; en dos clones se detectaron 4 secuencias diferentes (confirmadas con clonación TOPO, pero una de las secuencias era de origen natural o solamente una inserción de un nucleótido); 2 clones eran clones K.O., ambos con 2 secuencias detectadas (A16/A22 y A16/A5), pero su crecimiento en presencia de IGF-1 era muy poco mejor que en la línea de células derivadas de CHO-DUXB11. Por tanto, se seleccionaron tres clones, con el genotipo A22/A7/origen natural, A16/A7/origen natural y A16/A22/origen natural, se seleccionaron para una tercera ronda de transfección con pZFN (sus secuencias se confirman mediante clonación TOPO, con 32 colonias bacterianas seleccionadas y secuenciadas por clon). Cada uno de los tres clones se transfectó 2 veces con 8 pg de pZFN. Una vez que los dos grupos de cada clon se recuperaron (viabilidad >91%, después de 7-9 días), se agruparon y cocultivaron aproximadamente 6-8 semanas en presencia de IGF-1 con una concentración de 50 mg/L (para seleccionar las células más resistentes). Dos días antes de la clonación por FACS, se dividieron sin IGF-1 (para permitir la unión de IGF-1 -Cy5 y seleccionar el 5% de células menos fluorescentes). Los tres grupos se clonaron por FACS en un total de 9 x placas de 96 pocillos.

Se diseñó un cebador de PCR que se unía a la secuencia de sitio de corte de origen natural en el exón 3 de IGF-1R, lo que permitió un cribado eficiente de clones mutados. La PCR se llevó a cabo junto con el cebador de secuenciación directo para IGF-1 R; asumiendo que la PCR funciona siempre, si un clon era negativo en PCR, o no había secuencia de origen natural, o el clon no se cultivaba bien (demasiado poco ADN extraído, por lo que se cultivaron pocas células). De los 389 clones cultivados cribados de esta forma, 58 eran negativos y se secuenciaron. En 30 de esos clones, no se detectó secuencia de origen natural, y para 22 clones las mutaciones son eran desplazamientos del marco (13 clones con las dos secuencias A22/A7, del clon A22/A7/origen natural). Se evaluó su crecimiento con y sin IGF-1 con una concentración de 50 mg/L, y se seleccionó el clon que se cultivaba mejor con IGF-1 (también entre el clon que se cultivaba mejor sin IGF-1), con las secuencias A22/A7 (verificadas mediante clonación TOPO), para la transfección con constructos de ADN que codificaban las proteínas de las SEQ ID N.°: 8-14.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comrpende una proteína de IGF-1 humano, donde el aminoácido glicina en la posición 42 de dicha proteína de IGF-1 se muta a serina, y donde la numeración de los aminoácidos de dicha proteína de IGF-1 humano corresponde a la SEQ ID NO.: 1.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde la proteína de IGF-1 humano comprende las siguientes modificaciones:

a) el aminoácido E3 se elimina,

b) el aminoácido G42 se muta a serina, y

c) el aminoácido R37 se muta a alanina.

3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde la proteína de IGF-1 humano comprende las siguientes modificaciones:

a) los aminoácidos G1, P2 y E3 se eliminan,

b) el aminoácido G42 se muta a serina, y

c) el aminoácido R37 se muta a alanina.

4. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde la proteína de IGF-1 humano comprende las siguientes modificaciones:

a) los aminoácidos G1, P2 y E3 se eliminan,

b) el aminoácido G42 se muta a serina,

c) el aminoácido R36 se muta a glutamina, y

d) el aminoácido R37 se muta a alanina.

5. Una proteína de IGF-1 humano, donde el aminoácido glicina en la posición 42 sustituido por el aminoácido serina y donde el o los aminoácidos:

a) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R36 se sustituye o elimina; o

b) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q); o

c) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye o elimina; o

d) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye por ácido glutámico (E);

o

e) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye por alanina; o

f) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R37 se sustituye por prolina (P); o

g) G1, P2, E3 se eliminan y los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen o eliminan;

o

h) G1, P2, E3 se eliminan y los aminoácidos R36 y R37 se sustituyen ambos por

glutamina (Q); o

i) G1, P2, E3 se eliminan y el aminoácido R36 se sustituye por glutamina (Q) y R37 se sustituye por alanina.

6. Un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, para su uso en terapia.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de un trastorno muscular en un paciente que lo necesite.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, donde el trastorno muscular es atrofia muscular.