RS59545B1

RS59545B1 - Stabilizovani polipeptidi insulinu sličnog faktora rasta

Info

Publication number: RS59545B1
Application number: RS20191416A
Authority: RS
Inventors: Mara Fornaro; Thomas Huber; Mauro Zurini
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2019-12-31
Also published as: AP2015008440A0; MA38153B1; CU20150064A7; US20150329614A1; NZ708091A; KR102182523B1; GT201500168A; CU24308B1; PT2935320T; CR20150324A; HUE047386T2; EA201591165A1; SG11201503782PA; ES2756330T3; EP2935320B1; JP2016501025A; AU2013365796B2; JP6499080B2; ECSP15031046A; MY174820A

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Ovo je pronalazak u oblasti modifikacija insulinu sličnih faktora rasta 1 (IGF-1).

POZADINA

[0002] Insulinu slični faktori rasta (IGF) su deo složenog sistema koji ćelije koriste za komunikaciju sa svojim fiziološkim okruženjem. Ovaj složeni sistem (koji se često naziva osovinom insulinu sličnog faktora rasta) sastoji se od dva membranska receptora (IGF-1R i IGF-2R), dva liganda (IGF-1 i IGF-2), porodice od šest IGF-vezujućih proteina velikog afiniteta (IGFBP 1-6), i povezanih enzima koji razlažu IGFBP (proteaza). Ovaj sistem je značajan ne samo za regulisanje normalne fiziologije, već i za neka patološka stanja (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003).

[0003] Utvrđeno je da IGF osovina ima ulogu u promociji ćelijske proliferacije i inhibiranju ćelijske smrti (apoptoze). IGF-1 pre svega luči jetra usled stimulisanja od strane humanog hormona rasta (hGH). IGF-1 utiče na skoro sve ćelije u ljudskom telu, posebno na ćelije u mišićima, hrskavici, kostima, jetri, bubrezima, nervima, koži i plućima. Pored dejstva sličnog insulinu, IGF-1 može takođe regulisati i ćelijski rast. IGF-1 i IGF-2 reguliše porodica genskih proizvoda poznatih kao IGF-vezujući proteini. Ovi proteini pomažu u modulaciji aktivnosti IGF na složene načine koji obuhvataju inhibiranje aktivnosti IGF sprečavanjem vezivanja za IGF receptore, kao i promociju aktivnosti IGF putem pomaganja u isporuci do receptora i produžavanjem poluživota IGF u krvotoku. Postoji barem šest okarakterisanih vezujućih proteina (IGFBP1-6).

[0004] U svom zrelom obliku, humani IGF-1, koji se takođe naziva somatomedin, je mali protein sačinjen od 70 aminokiselina za koji je utvrđeno da stimuliše rast širokog opsega ćelija u medijumu. IGF-1 protein je prvobitno kodiran sa tri poznate splajsovane varijante iRNK. Otvoreni okvir čitanja svake iRNK kodira proteinski prekursor koji sadrži IGF-1 od 70 aminokiselina (ID BR. SEKV: 1) i konkretni E-peptid na C-kraju, u zavisnosti od konkretne iRNK IGF-1. Ovi E-peptidi su nazvani Ea (rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; ID BR. SEKV: 2), Eb (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkk gk; ID BR. SEKV: 3) i Ec (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; ID BR. SEKV: 4) peptidi, i imaju dužinu od 35 do 87 aminokiselina i obuhvataju region zajedničke sekvence na N-kraju i region varijabilne sekvence na C-kraju. Na primer, otvoreni okvir čitanja divljeg tipa za IGF-1-Ea kodira polipeptid od 135 aminokiselina uključujući vodeću sekvencu i polipeptid od 105 aminokiselina bez vodeće sekvence (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrh tdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; ID BR. SEKV: 5). U fiziološkoj ekspresiji, E-peptidi su otcepljeni od prekursora pomoću endogenih proteaza, dajući zreli IGF-1 od 70 aminokiselina. Na dostupnost i poluživot IGF-1 u humanom serumu pre svega utiču i moduliraju ih proteaze i IGF-1 vezujući proteini (IGFBP). IGFBP mogu da inhibiraju ili da potenciraju aktivnosti IGF-1 (Oh Y, i sar. Characterization of the affinities of insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins 1-4 for IGF-I, IGF-II, IGF-I/insulin hybrid, and IGF-I analogs.

Endocrinology. 1993 Mar;132(3):1337-44). Strategije za produžavanje poluživota IGF-1 su prethodno opisane u struci. Strategije koje su razmatrane su

(i) proizvodnja varijanti IGF-1 koje sadrže specifične mutacije sa ciljem da se spreči cepanje IGF-1 u humanom serumu putem serinskih proteaza, ili da se ublaži negativno dejstvo IGF-1 vezujućih proteina na dostupnost ili poluživot u serumu IGF-1 (WO200040613, WO05033134, WO2006074390, WO2007/146689,);

(ii) proizvodnja IGF-1 fuzionih proteina, pri čemu je zreli IGF-1 protein fuzionisan sa Fc regionom humanog imunoglobulina (WO2005033134, WO200040613);

(iii) upotreba IGF-1 proteinskih prekursora, pri čemu je cepanje E-peptida od IGF-1 putem proteaze umanjeno modifikovanjem proteinskog prekursora (WO2007146689);

(iv) kombinacije goreopisanih strategija ((i)/(ii) WO05033134, (i)/(ii) WO200040613, (i)/(iii) WO2007146689).

[0005] I pored goreopisanih strategija, varijante prekursora IGF-1 fuzionisane sa Fc regionom humanog imunoglobulina ostaju loši kandidati za lek, pre svega iz dva razloga: (i) malog proizvodnog prinosa u proizvodnom sistemu sisara, i (ii) povećanog afiniteta vezivanja za insulinski receptor (InsR) u poređenju sa nemodifikovanim humanim IGF-1 divljeg tipa, što može dovesti do hipoglikemije, neželjenog dejstva od terapeutskog značaja.

[0006] Usled toga, postoji potreba za tehnologijom koja prevazilazi prethodne goreopisane probleme u struci. Predmetni pronalazak ispunjava ovu potrebu u više aspekata.

SAŽETAK PRONALASKA

[0007] Prvi predmet pronalaska se odnosi na polipeptid koji sadrži humani IGF-1 (hIGF-1) protein, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 pomenutog hIGF-1 proteina izbačena ili supstituisana, i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 1.

[0008] Dodatno otelotvorenje otkrića se odnosi na polipeptid koji sadrži humani IGF-1 protein fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina humanog IgG, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 humanog IGF-1 proteina izbačena ili susptituisana, i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 1.

Drugi predmet pronalaska se odnosi na polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 pomenutog proteinskog prekursora humanog IGF-1 izbačena ili supstituisana, i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5.

[0009] Dodatno otelotvorenje pronalaska se odnosi na polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1 fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina humanog IgG, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 proteinskog prekursora humanog IGF-1 izbačena ili supstituisana, i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5.

U određenom otelotvorenju pronalazak se odnosi na goreopisane polipeptide, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 izbačena ili supstituisana serinom.

U dodatnom otelotvorenju, gorepomenuti humani IGF-1 protein sadrži dodatne delecije ili mutacije kod aminokiselina G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69 i/ili A70.

[0010] Nadalje je otkriven proteinski prekursor humanog IGF-1 koji sadrži Ea-peptid i dodatne delecije ili mutacije aminokiselina G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77 G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 i/ili M105.

[0011] U još jednom otelotvorenju, koje se može kombinovati sa prethodnim otelotvorenjima pronalaska, proteinski prekursor humanog IGF-1 i Fc region su razdvojeni peptidnim regionom šarke.

[0012] U skladu sa tim, pronalazak se takođe odnosi na goreopisani humani IGF-1 proteinski prekursor, pri čemu je peptidni region šarke odabran iz grupe koja se sastoji od peptidne šarke 1 (ID BR. SEKV: 22), šarke 2 (ID BR. SEKV: 23) i šarke 3 (ID BR. SEKV: 24).

[0013] U konkretnom otelotvorenju pronalaska, kada goreopisani humani IGF-1 proteinski prekursori bivaju mutirani u Ea-peptidu na aminokiselinama R74, R77 i/ili R104, pomenute aminokiseline R74, R77 i R104 mutiraju u glutamin (Q).

[0014] Otkriven je polipeptid koji sadrži ili se sastoji od humanog IGF-1 proteina ili proteinskog prekursora humanog IGF-1 kao što je prethodno opisano, pri čemu

a. aminokiseline E3, R71 i S72 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je izbačena ili supstituisana serinom, i

c. aminokiselina R37 je mutirana u alanin i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5.

[0015] Drugo konkretno otelotvorenje se odnosi na goreopisani proteinski prekursor humanog IGF-1, pri čemu, E-peptid je Ea-peptid i pri čemu

a. aminokiseline G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je izbačena ili mutirana u serin, i

c. aminokiseline R36, R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin

d. aminokiselina R37 je mutirana u alanin i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5.

[0016] Drugo konkretno otelotvorenje se odnosi na goreopisani proteinski prekursor humanog IGF-1, pri čemu, E-peptid je Ea-peptid i pri čemu

a. aminokiseline G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71, S72, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 i/ili M105 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je izbačena ili mutirana u serin, i

c. aminokiseline R36, R74 i R77 su mutirane u glutamin, i

[0017] Slično tome, pronalazak se odnosi na goreopisani proteinski prekursor humanog IGF-1, pri čemu, E-peptid je Ea-peptid i pri čemu

a. aminokiseline G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je izbačena ili mutirana u serin,

c. aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin, i

d. aminokiselina R37 je mutirana u glutaminsku kiselinu i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5.

[0018] Slično tome, pronalazak se odnosi na goreopisani proteinski prekursor humanog IGF-1, pri čemu, E-peptid je Ea-peptid i pri čemu

b. aminokiselina G42 je izbačena ili mutirana u serin,

c. aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin, i

[0019] Nadalje, konkretno otkriće se odnosi na goreopisani Fc fuzioni protein prekursora humanog IGF-1, pri čemu, E-peptid je Ea-peptid i pri čemu

a. aminokiseline G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je izbačena ili mutirana u serin, i

c. aminokiseline R36, R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin,

d. aminokiselina R37 je mutirana u alanin, pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5, i

e. pri čemu su proteinski prekursor IGF-1 i Fc region razdvojeni peptidnom šarkom 1 (ID BR. SEKV: 22).

[0020] Dodatno, pronalazak se odnosi na goreopisani Fc fuzioni protein prekursora humanog IGF-1, pri čemu, E-peptid je Ea-peptid i pri čemu

a. aminokiseline G1, P2, E3, K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je izbačena ili mutirana u serin,

c. aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin,

d. aminokiselina R37 je mutirana u glutaminsku kiselinu, pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5, i

e. pri čemu su proteinski prekursor IGF-1 i Fc region razdvojeni peptidnom šarkom 3 (ID BR. SEKV: 24).

[0021] Određeno otkriće se odnosi na goreopisane polipeptide, pri čemu je Fc region izmenjen da moduliše svoje vezivanje za Fc receptor.

U skladu sa tim, otkriće se odnosi na goreopisani Fc fuzioni protein prekursora humanog IGF-1, pri čemu je Fc region izmenjen da

I. smanji svoj afinitet prema Fc receptoru;

II. smanji ADCC aktivnost; ili

III. spreči ADCC aktivnost.

Drugi konkretni pronalazak se odnosi na goreopisane Fc fuzione proteine prekursore humanog IGF-1 koji obuhvataju ID BR. SEKV: 8, ili ID BR. SEKV: 9, ili ID BR. SEKV: 10, ili ID BR. SEKV: 11, ili ID BR. SEKV: 12, ili ID BR. SEKV: 13, ili ID BR. SEKV: 14, ili ID BR. SEKV: 27.

[0022] U određenom otelotvorenju pronalaska, koje se može kombinovati sa prethodnim otelotvorenjima otkrića, Fc fuzioni protein prekursora humanog IGF-1 je glikozilovan.

U drugom aspektu, otkriće se odnosi na polinukleotid koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira goreopisane Fc fuzione proteine prekursora humanog IGF-1. U skladu sa tim, otkriće se odnosi na polinukleotid koji sadrži molekul nukleinske kiseline kako je prikazano u ID BR. SEKV: 15 ili ID BR. SEKV: 16 ili ID BR. SEKV: 17 ili ID BR. SEKV: 18 ili ID BR. SEKV: 19 ili ID BR. SEKV: 20 ili ID BR. SEKV: 21.

[0023] Otkriće nadalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata polipeptid koji sadrži bilo koji od gore prikazanih proteinskih prekursora humanog IGF-1 za upotrebu u terapiji.

U drugom otelotvorenju otkrića, gorepomenuta terapeutska primena je lečenje mišićnih poremećaja kod pacijenta kome je to potrebno. U konkretnom otelotvorenju otkrića, terapeutska primena je lečenje pacijenata sa opekotinama koji pate od gubitka telesne mase bez masnih naslaga i/ili od atrofije mišića ili lečenje pacijenata sa HOBP ili lečenje pacijenata koji imaju Kenedijevu bolest ili lečenje pacijenata sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom.

[0024] U dodatnom otelotvorenju otkrića, goreopisani mišićni poremećaj je atrofija mišića. U skladu sa tim, u nekim aspektima otkrića, terapeutska primena je lečenje sarkopenije usled gojaznosti, sarkopenije, i atrofije mišića povezane sa dijabetesom.

[0025] Otkriće nadalje pruža metodu lečenja mišićnog poremećaja kod pacijenta kome je to potrebno, i metoda obuhvata davanje terapeutski efikasne količine goreopisanog proteinskog prekursora humanog IGF-1 iz pronalaska.

[0026] U skladu sa tim, jedno konkretno otelotvorenje otkrića se odnosi na metodu lečenja pacijenata sa opekotinama koji pate od gubitka telesne mase bez masnih naslaga i/ili od atrofije mišića ili na metodu lečenja pacijenata sa HOBP ili na metodu lečenja pacijenata koji imaju Kenedijevu bolest ili na metodu lečenja pacijenata sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom

[0027] Nadalje, otkriće pruža metodu lečenja mišićnog poremećaja kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu je mišićni poremećaj atrofija mišića odabrana iz grupe koja se sastoji od sarkopenije usled gojaznosti, sarkopenije, i atrofije mišića povezane sa dijabetesom.

[0028] Nadalje, otkriće se odnosi na IGF-1 polipeptid ili na polipeptidni prekursor IGF-1 kao što je prethodno opisano, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 izbačena. Drugo otelotvorenje otkrića se odnosi na IGF-1 polipeptid ili na polipeptidni prekursor IGF-1 kao što je prethodno opisano, pri čemu je pomenuti protein pegilovan.

KRATAK OPIS SLIKA

[0029]

Slika 1: Afinitet vezivanja za IGF-1R

Veliki afinitet vezivanja varijanti hIGF-1 i IGF-1 za rhIGF1R meren je upotrebom površinske plazmonske rezonance (Biacore).

Slika 2 (A-D): Fosforilacija IGF-1R u NIH3T3-IGF-1R ćelijama transfektantima

NIH3T3 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani IGF-1 receptor (NIH3T3-IGF-1R) uzgajane su 24 sata u medijumu za rast, izgladnjivane 18 sati u medijumu bez seruma i stimulisane 10 minuta na 37°C ekvimolarnim koncentracijama naznačenih peptida. Nivoi fosforilacije IGF-1R su analizirani pomoću ELISA. Fosforilacija receptora je izražena kao % kontrole ± standardna devijacija (SD) (NIH 3T3 ćelije fibroblasta mišjeg embriona potiču iz ćelijske linije izolovane i započete 1962. na Njujorškom univerzitetu, Medicinski fakultet, Odeljenje patologije; Todaro GJ, Green H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J. Cell Biol.17: 299-313, 1963)

Slika 3 (A-D): Fosforilacija InsR u transfektantima NIH3T3-InsR ćelija

NIH3T3 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani insulinski receptor (NIH3T3-InsR) su uzgajane 24 sata u medijumu za rast, izgladnjivane 18 sati u medijumu bez seruma i stimulisane 10 minuta na 37°C ekvimolarnim koncentracijama naznačenih peptida. Nivoi fosforilacije InsR su analizirani pomoću ELISA. Fosforilacija receptora je izražena kao proizvoljne jedinice ± standardna devijacija (SD).

Slika 4 (A-C): Fosforilacija IGF-1R u primarnim mioblastima ljudi i majmuna cinomolgus Ćelije su uzgajane u medijumu za rast, izgladnjivane 4 sata, a zatim stimulisane pomoću hIGF-1 ili hIGF-1 varijanti 15 minuta na 37°C. Nivoi fosforilacije IGF-1R su analizirani pomoću ELISA korišćenjem DuoSet IC humanog fosfor-IGF1R. Fosforilacija receptora je izražena kao % kontrole ± standardna devijacija (SD).

Slika 5 (A-D): Preuzimanje glukoze u mišićnim cevčicama i adipocitima miša

Ćelije 3T3-L1 adipocita (B i D) i C2C12 mišićnih cevčica miša (A i C) zasejane su na ploče sa 24 bunarčića i uzgajane u DMEM-u bez seruma tokom 4 sata. DMEM je zatim zamenjen KRP puferom ili HBS-om za 3T3-L1 adipocite, odnosno C2C12. Ćelije su tretirane naznačenim peptidima tokom 1 sata na 37°C. Preuzimanje glukoze je izmereno dodavanjem 0,4 (adipociti) ili 0,8 (C2C12) µCi [<3>H] 2-dezoksi-D-glukoze i 0,1 (adipociti) ili 0,01 (C2C12) mM 2-dezoksi-D-glukoze tokom 10 (adipociti) ili 5 (C2C12) minuta na sobnoj temperaturi. Radioaktivnost je analizirana pomoću scintilacionog brojača.

Slika 6: Preuzimanje glukoze: vremenski tok kod adipocita

3T3-L1 adipociti su zasejani na ploče sa 24 bunarčića i uzgajani u DMEM-u bez seruma (Dulbekov modifikovani Iglov medijum) tokom 4 sata. DMEM bez seruma je zatim zamenjen KRP puferom i ćelije su tretirane 15, 60, 90 i 120 minuta naznačenim peptidima na 37°C. Preuzimanje glukoze je izmereno dodavanjem 0,4 µCi [3H] 2-dezoksi-D-glukoze i 0,1 mM 2-dezoksi-D-glukoze tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Radioaktivnost je analizirana pomoću scintilacionog brojača.3T3-L1 je ćelijska linija dobijena iz 3T3 ćelija koja se koristi u biološkom istraživanju adipoznog tkiva; Green H, Kehinde O (1975). "An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion". Cell 5 (1): 19-27.

Slika 7 (A-B):

Odrasli mužjaci pacova (n=3/grupi) primili su intravenski (i.v.) bolus ili subkutanu (s.c.) injekciju hIGF-1-Ea-Fc_mut 13/2_A ili hIGF-1-Ea-Fc_mut 04/2_E od 10 mg/kg. Serijski uzorci krvi su prikupljeni 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 168 i 336 sati nakon davanja ispitivanog materijala. Koncentracije rekombinantnih proteina u serumu su utvrđene pomoću ELISA.

Slika 8 (A-C): Dejstvo hIGF-1-Ea-Fc_mutanata na mišićnu atrofiju indukovanu deksametazonom.

Promena težine tela (A), i mišića (B i C) grupa (A) nosač, (B) Deks, (C) Deks. sa hIGF-1 od 3,8 mg/kg/dan s.c. infuzija minipumpom, (D) Deks. sa hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A od 3 mg/kg/dan s.c. svaki drugi dan, (E) Deks. sa hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A od 10 mg/kg/dan s.c. svaki drugi dan, i (F) Deks. sa hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A od 3 mg/kg/dan s.c. svaki drugi dan Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (n=4-6). *: P < 0,05, **: P < 0,01, **: P < 0,001 u odnosu na grupu B,<###>P < 0,001 u odnosu na grupu A (Danetov test višestrukog poređenja nakon ANOVA).

Slika 9: Proizvodnja varijanti IGF-1 sa različitim G42 mutacijama u HEK293 ćelijama

Proizvodni podaci iz HEK293F medijuma na skali od 100 ml transfektovanog pomoću FuGene. Titri su izmereni HPLC analizom sa proteinom A iz supernatanta bistre ćelijske kulture. Koncentracije su izmerene nakon prečišćavanja proteina A. Nivoi agregacije prečišćenih proteina su izmereni pomoću SEC-MALS.

Slika 10: Udeo isečenog materijala hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-fc (ID BR. SEKV.6) (tamno sivo) i hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A (ID BR. SEKV.9) (svetlo sivo) eksprimiranog iz dve različite ćelijske linije CHO. Udeo isečenog materijala je određen iz prečišćenog proteina (protein A hromatografija) transficiranih CHOK1 izvedenih ćelija, kao i CHO-DUX11 izvedenih ćelija. Udeo isecanja je određen putem reversno fazne LC-MS analize. Udeo isečenog materijala je značajno manji za hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A kod obe ćelijske linije.

Slika 11: Ćelijski rast CHO-K1 izvedenih ćelija koje eksprimiraju rekombinantno antitelo (podebljana linija) i CHO-K1 izvedenih ćelija koje eksprimiraju hIGF-1Ea 3mut (ID BR. SEKV: 27) (tačkasta linija) u pokretanjima bioreaktora. B: Procenat održivih ćelija u pokretanjima bioreaktora (podebljana linija antitelo koje proizvodi CHO-K1 izvedeni klon, tačkasta linija hIGF-1Ea 3mut eksprimirajući klonovi).

Slika 12: Broj vijabilnih ćelija: Neprekidna linija prikazuje ćelijski rast CHO-K1 izvedenih ćelija. Tokom zajedničkog uzgajanja sa IGF-1 divljeg tipa ili sa hIGF-1Ea 3mut ćelijski rast je inhibiran (tačkasta, odnosno isprekidana linija). Prikazan je prosek od 3 biološka replikata. IGF-1/hIGF-1Ea 3mut je spajkovan 2. dana (eksperiment sa spajkovanjem). B: Ćelijska vijabilnost: Neprekidna linija pokazuje ćelijsku vijabilnost CHO-K1 izvedenih ćelija, tačkasta, odnosno isprekidana linija umanjenu ćelijsku vijabilnost nakon IGF-1/hIGF-1Ea 3mut spajkovanja. Ćelijska vijabilnost opada dva dana ranije ako su ćelije inkubirane zajedno sa IGF-1/hIGF-1Ea 3mut. Nije primećena nikakva razlika u ćelijskom rastu niti ćelijskoj vijabilnosti između IGF-1 i hIGF-1Ea 3mut.

Slika 13: Prikazan je ćelijski rast CHO-DUXB11 izvedenih ćelija (podebljana linija) i redukovani ćelijski rast tokom zajedničkog uzgajanja sa IGF-1Ea 3mut (tačkaste linije). Nakon dodavanja IGF-1R inhibitora tirozin kinaze NVPAEW541 (podebljana linija sa zvezdicom) ćelijski rast je neznatno smanjen. Zajedničko uzgajanje sa IGF-1Ea 3mut i dodavanje IGF-1R inhibitora tirozin kinaze nije dovelo do dalje inhibicije ćelijskog rasta (tačkasta linija sa zvezdicom).

Slika 14: Podebljano je prikazan ćelijski rast CHO-K1 izvedenih ćelija divljeg tipa (WT), a podebljano sa krugovima je prikazan redukovan ćelijski rast tokom zajedničkog uzgajanja sa IGF-1. Tačkastim linijama je prikazan ćelijski rast tri IGF-1R KO klona. Ćelijski rast je neznatno poboljšan u poređenju sa CHO-K1 izvedenim ćelijama divljeg tipa. Zajedničko uzgajanje sa IGF-1 je dovelo samo do manje inhibicije ćelijskog rasta i ćelijski rast je sličan CHO-K1 izvedenim ćelijama divljeg tipa bez zajedničkog uzgajanja sa IGF-1.

Slika 15: Prikazan je titar IGF-1-Fc fuzionog proteina 14-dnevne šarže kulture (spojeno). Istaknuta je ekspresija 7 različitih IGF-1-Fc fuzionih proteina kod 5 različitih ćelijskih linija. Ekspresija IGF-1-Fc fuzionog proteina bila je 5-20 puta povećana kod CHO-K1 derivata IGF-1R-KO ćelijskih linija, CHO-DUXB11 derivata IGF-1R-KO ćelijskih linija, kao i kod CHO-DUXB11 derivata shRNA (smanjena ekspresija IGF-1R i INSR) ćelijskih linija u poređenju sa CHO-K1 ili CHO-DUXB11 derivatima ćelijskih linija divljeg tipa.

Slika 16: Fuzioni titar IGF-1-Fc za 14-dnevne šarže kulture u bocama za mućkanje od 50 ml. Titri IGF-1-Fc fuzionog proteina: hIGF-1-Ea-fc_mut 13/2_A kod 15 najboljih CHO-DUXB11 derivata IGF-1R-KO klonova je oko 6-7 puta veći u poređenju sa titrom IGF-1-Fc fuzionog proteina: hIGF-1-Ea-Δ1-3, R37A, Δ71-72, R77Q-fc domen kod CHO-DUXB11 derivata ćelijskih klonova divljeg tipa.

Slika 17: Proizvodnja i proteinski izazov IGF-1 varijanti kod HEK293F ćelija.

Podaci o proizvodnji na skali od 100 ml HEK293T kulture transficirane pomoću PEI. Prinos nakon prečišćavanja sa proteinom A ekstrapoliran je na zapreminu ćelijske kulture od 1 l. Agregacija je merena pomoću SEC-MALS nakon prečišćavanja sa proteinom A. Prečišćeni proteini su inkubiran sa kondicioniranim CHO medijumima iz CHOK1 izvedenih ćelija tokom 5 dana i CHODUXB11 izvedenih ćelija tokom 20 dana. Prikazan je procenat preostalih kompletnih proteina. Metoda je opisana u primeru 2.

Slika 18: Fosforilacija InsR u transfektantima NIH3T3-InsR ćelija

NIH3T3 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani insulinski receptor (NIH3T3-InsR) uzgajane su 24 sata u medijumu za rast, izgladnjivane 18 sati u medijumu bez seruma i stimulisane 10 minuta na 37°C ekvimolarnim koncentracijama naznačenih peptida. Nivoi fosforilacije InsR su analizirani pomoću ELISA. Fosforilacija receptora je izražena kao proizvoljne jedinice ± standardna devijacija (SD).

Slika 19: Preuzimanje glukoze u mišićnim cevčicama i adipocitima miša

Ćelije 3T3-L1 adipocita (A) i C2C12 mišićnih cevčica miša (B) su zasejane na ploče sa 24 bunarčića i uzgajane u DMEM-u bez seruma tokom 4 sata. DMEM je zatim zamenjen KRP puferom ili HBS-om za 3T3-L1 adipocite, odnosno C2C12. Ćelije su tretirane naznačenim peptidima tokom 1 sata na 37°C. Preuzimanje glukoze je izmereno dodavanjem 0,4 (adipociti) ili 0,8 (C2C12) µCi [<3>H] 2-dezoksi-D-glukoze i 0,1 (adipociti) ili 0,01 (C2C12) mM 2-dezoksi-D-glukoze tokom 10 (adipociti) ili 5 (C2C12) minuta na sobnoj temperaturi. Radioaktivnost je analizirana pomoću scintilacionog brojača.

OPŠTE DEFINICIJE

[0030] Kako bi se predmetni pronalazak lakše razumeo, određeni termini su prethodno definisani. Dodatne definicije su postavljene kroz detaljan opis.

[0031] Sadrži: termin "sadrži" znači "uključujući", npr. kompozicija koja "sadrži" X može se sastojati samo od X ili može uključivati još nešto, npr. X Y.

[0032] Simbol "Δ" ili slova "d" ili "D": u kontekstu opisa proteina (npr. "hIGF-1-Ea- Δ1-3, R37A, Δ 71-72, R77Q-fc domen" ili "hIGF-1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, R77Q-fc domen") odnosi se na deleciju aminokiseline. Kao primer, termin "D71-72, 77" (u kontekstu proteina hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-fc) opisuje činjenicu da su aminokiseline 71, 72 i 77 izbačene.

[0033] Protein insulinu sličnog faktora rasta 1 ili njegova varijanta: fraza "Protein insulinu sličnog faktora rasta 1 ili njegova varijanta" odnosi se na proteine koji su kodirani genima insulinu sličnog faktora rasta 1, posebno je poželjan humani protein insulinu sličnog faktora rasta 1 (hIGF-1) i njegove varijante. Varijanta IGF-1 proteina je protein koji se razlikuje u najmanje jednoj aminokiselini od IGF-1 sekvence divljeg tipa, pri čemu se termin "sekvenca divljeg tipa" odnosi na sekvencu polipeptida ili gena dostupnu u najmanje jednom organizmu koji se javlja u prirodi ili na sekvencu polipeptida ili gena koja nije izmenjena, mutirana ili na drugi način manipulisana od strane čoveka. Termin varijanta IGF-1 i mimetički IGF-1 se koriste naizmenično u ovom dokumentu. Varijanta IGF-1 je takođe i proteinski prekursor IGF-1 ili pro-IGF-1 protein koji sadrži vodeću sekvencu peptida. Varijanta IGF-1 je takođe i fuzioni protein koji sadrži IGF-1 protein, npr. protein koji sadrži IGF-1 protein fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina. Primeri varijanti IGF-1 su između ostalog prikazani u patentnim prijavama WO05033134 (stabilizovani IGF-1 protein fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina) i WO2007146689 (stabilizovani IGF-1 proteinski prekursor). Varijanta IGF-1, kako je gore opisana, zadržava svoju biološku aktivnost u smislu da se takav protein može smatrati funkcionalnim ekvivalentom IGF-1 divljeg tipa.

Funkcionalni ekvivalenti u pogledu IGF-1 proteina moraju se posmatrati kao IGF-1 proteini koji sadrže prirodne ili veštačke mutacije. Mutacije mogu biti insercije, delecije ili supstitucije jedne ili više nukleinskih kiselina koje ne umanjuju biološku aktivnost IGF-1 proteina. Funkcionalni ekvivalenti imaju identičnost od najmanje 80%, poželjno 85%, poželjnije 90%, najpoželjnije više od 95%, veoma posebno poželjno najmanje 98% identičnosti – ali manje od 100% identičnosti sa IGF-1 proteinom divljeg tipa, npr. humani IGF-1 protein ID BR. SEKV: 1. U slučaju fuzionih proteina kako je gore opisano, identičnost od 100% će se definisati samo na osnovu IGF-1 dela takvog fuzionog proteina.

Insulinu slični faktori rasta (IGF) deo su složenog sistema koji ćelije koriste za komunikaciju sa svojim fiziološkim okruženjem. Ovaj složeni sistem (koji se često naziva osovinom insulinu sličnog faktora rasta) sastoji se od dva membranska receptora (IGF-1R i IGF-2R), dva liganda (IGF-1 i IGF-2), porodice od šest IGF-vezujućih proteina velikog afiniteta (IGFBP 1-6), i povezanih enzima koji razlažu IGFBP (proteaza). Ovaj sistem je značajan ne samo za regulisanje normalne fiziologije, već i za neka patološka stanja (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003). Utvrđeno je da IGF osovina ima ulogu u promociji ćelijske proliferacije i inhibiranju ćelijske smrti (apoptoze). IGF-1 pre svega luči jetra usled stimulisanja od strane humanog hormona rasta (hGH). IGF-1 utiče na skoro sve ćelije u ljudskom telu, posebno na ćelije u mišićima, hrskavici, kostima, jetri, bubrezima, nervima, koži i plućima. Pored dejstva sličnog insulinu, IGF-1 može takođe regulisati i ćelijski rast. IGF-1 i IGF-2 reguliše porodica genskih proizvoda poznatih kao IGF-vezujući proteini. Ovi proteini pomažu u modulaciji aktivnosti IGF na složene načine koji obuhvataju inhibiranje aktivnosti IGF sprečavanjem vezivanja za IGF receptore, kao i promociju aktivnosti IGF putem pomaganja u isporuci do receptora i produžavanjem poluživota IGF u krvotoku. Postoji barem šest okarakterisanih vezujućih proteina (IGFBP1-6). IGF-1 se koristi u širokom opsegu terapeutskih primena. Mekasermin (zaštićeno ime Increlex™) je sintetički analog IGF-1 koji je odobren za lečenje izostanka rasta. Nekoliko kompanija je u kliničkim ispitivanjima ocenilo IGF-1 za različite indikacije, uključujući dijabetes tip 1, dijabetes tip 2, amiotrofnu lateralnu sklerozu, ozbiljne opekotine i miotoničnu mišićnu distrofiju.

U cilju razumljivosti i konzistentnosti, numeracija aminokiselinskih ostataka u prekursoru IGF-1 ili zrelim proteinima u ovoj prijavi i u zahtevima zasniva se na numeraciji sekvenci proteinskog prekursora divljeg tipa humanog insulinu sličnog faktora rasta 1 (somatomedin C), izooblik CRA_c (pristupni br. EAW97697) bez signalnog peptida (tj. ID BR. SEKV: 5).

[0034] Ćelija sisara: termin "ćelija sisara" u kontekstu otkrivene metode odnosi se na ćelije sisara koje su pogodne za proizvodnju proteina u industrijskom proizvodnom obimu.

[0035] Te ćelije su dobro poznate stručnjaku i potiču, na primer, od vrsta Cricetulus griseus, Cercopithecus aethiops, Homo sapiens, Mesocricetus auratus, Mus musculus i vrste Chlorocebus. Odgovarajuće ćelijske linije su poznate kao CHO ćelije (ćelije jajnika kineskog hrčka), COS ćelije (ćelijska linija dobijena iz bubrega majmuna (afrički zeleni majmun), Vero ćelije (epitelne ćelije bubrega ekstrahovane od afričkog zelenog majmuna), Hela ćelije (linija je dobijena od ćelija raka grlića materice uzetih od Henrijete Laks), BHK ćelije (ćelije bubrega bebe hrčka), HEK ćelije (ćelije bubrega ljudskog embriona), NS0 ćelije (ćelijska linija mišjeg mijeloma), C127 ćelije (ćelijska linija miša koja ne formira tumore), PerC6® ćelije (humana ćelijska linija, Crucell), CAP ćelije (CEVEC's Amniocyte Production) i Sp-2/0 ćelije (ćelije mijeloma miša).

[0036] Termin "receptorska specifičnost stabilizovanih IGF-1 proteina iz prethodnog stanja tehnike" u kontekstu ove prijave takođe se odnosi na smanjenu sposobnost indukovanja fosforilacije insulinskog receptora (umanjena potentnost i/ili efikasnost) IGF-1 molekula iz pronalazaka u poređenju sa varijantama IGF-1 iz prethodnog stanja tehnike, što umanjuje rizik od izazivanja hipoglikemije, neželjenog dejstva od terapeutskog značaja.

[0037] Prekursor: U nastavku, termin "prekursor" kada se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosiće se na prekursor zrelog humanog IGF-1 proteina bez signalnog peptida, ali uključujući Ea, Eb, odnosno Ec peptid.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0038] Molekuli koji sadrže Ea-peptid fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina, pri čemu su proteinski ostaci G1, P2, E3, R71 i S72 izbačeni, aminokiselina R77 je izbačena ili supstituisana glutaminom, a aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72, 77-fc domen (ID BR. SEKV: 6) i hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72, R77Q-fc domen (ID BR. SEKV: 7)) su proizvedeni i testirani. Ekspresija hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72del71-72, 77-fc domena (ID BR. SEKV: 6) u ćelijskom sistemu sisara nije bila moguća, zbog problema sa agregacijom i degradacijom (više od 90% proizvedenog proteina je razloženo, vidi sliku 10)

[0039] Nadalje, hIGF1-Ea-del1-3, R37A, del71-72del71-72, 77-fc domen (ID BR. SEKV: 6) proteini su pokazali smanjenu receptorsku specifičnost u poređenju sa nemodifikovanim zrelim IGF-1 u NIH3T3 InsR testu fosforilacije (vidi sliku 3).

[0040] Stoga, varijante IGF-1 prekursora fuzionisane sa Fc regionom humanog imunoglobulina su loši kandidati za lek, zbog (i) lošeg proizvodnog prinosa u proizvodnom sistemu sisara i (ii) povećanog afiniteta vezivanja za insulinski receptor (InsR) u poređenju sa nemodifikovanim humanim IGF-1 divljeg tipa, što može dovesti do hipoglikemije, neželjenog dejstva od terapeutskog značaja.

[0041] Pronalazak je zasnovan na iznenađujućem opažanju da se (1) proizvodni prinos u proizvodnim sistemima ćelija sisara i (2) specifičnost receptora nativnih IGF-1 proteina ili stabilizovanih IGF-1 proteina iz prethodnog stanja tehnike mogu poboljšati uvođenjem dodatnih specifičnih aminokiselinskih mutacija, pri čemu različite mutacije rešavaju različite probleme i pomenute mutacije mogu da se kombinuju kako bi se otklonilo više problema vezanih za proizvodni prinos, efikasnost i/ili specifičnost receptora.

[0042] Posebno iznenađujući rezultat je opažanje da humani IGF-1 protein (ID BR. SEKV: 1) koji mutira na položaju G42 (G42S supstitucije) indukuje manje preuzimanje glukoze u in vitro sistemima C2C12 mišićnih cevčica i adipocita (3T3-L1) u poređenju sa nemodifikovanim humanim IGF-1 divljeg tipa, što može smanjiti rizik od hipoglikemije in vivo lečenja sa IGF-1 (slika 19).

[0043] Dalji posebno iznenađujući rezultat je opažanje da proteinski prekursor humanog IGF-1 iz prethodnog stanja tehnike koji mutira na položaju G42 (delecija ili specifične supstitucije) pokazuje sličnu sposobnost da stimuliše fosforilaciju insulinskog receptora (InsR) kao nemodifikovani humani IGF-1 divljeg tipa, što smanjuje rizik od hipoglikemije varijanti IGF-1 iz prethodnog stanja tehnike (slika 3). Čak i više iznenađujuće bilo je opažanje da mutacija G42S ima dodatno pozitivno dejstvo na proizvodni prinos proteinskog prekursora humanog IGF-1 iz prethodnog stanja tehnike koji se fuzioniše sa Fc regionom imunoglobulina u ćeliji sisara (slika 10/17), tj. nastanak agregata koji negativno utiču na proizvodni prinos može se značajno smanjiti uvođenjem mutacije G42S (slika 9/17).

Posledično, pronalazak je u određenoj meri zasnovan na iznenađujućem otkriću da manipulisanjem aminokiselinom glicinom 42 u humanom IGF-1 proteinu ili njegovim varijantama prekursora humanog IGF-1, dve značajne tehničke prepreke u razvoju terapeutskih varijanti IGF-1 mogu biti prevaziđene. U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje rešenje problema da se prema prethodnom stanju tehnike proteinski prekursori IGF-1 koji su fuzionisani sa Fc regionom imunoglobulina humanog IgG ne mogu proizvesti u industrijskom obimu u ćelijama sisara, jer se pomenuti fuzioni proteini lako razgrađuju proteazama ćelija sisara. Posledično, u drugom aspektu otkriće se odnosi na iznenađujuće otkriće da se manipulisanjem specifičnim aminokiselinama u varijantama IGF-1 Eapeptidnog prekursora može prevazići dodatna značajna tehnička prepreka u razvoju terapeutskih varijanti prekursora IGF-1.

[0044] Primeri za takve inventivne molekule uključuju sledeće polipeptide:

Humani IGF-1 protein (ID BR. SEKV: 1) pri čemu je aminokiselina G42 supstituisana aminokiselinom serinom.

Humani IGF-1 protein (ID BR. SEKV: 1) pri čemu je aminokiselina G42 supstituisana aminokiselinom serinom i pri čemu su aminokiseline

(a) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena; ili

(b) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q); ili

(c) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R37 je supstituisana ili izbačena; ili

(d) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E); ili

(e) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R37 je supstituisana alaninom; ili

(f) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P); ili

(g) G1, P2, E3 izbačene i aminokiseline R36 i R37 su supstituisane ili izbačene; ili

(h) G1, P2, E3 izbačene i obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q); ili

(i) G1, P2, E3 izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i R37 je supstituisana alaninom.

[0045] Humani IGF-1 protein (ID BR. SEKV: 1) pri čemu je aminokiselina G42 supstituisana aminokiselinom serinom i pri čemu je aminokiselina E3 izbačena, a aminokiselina R37 je supstituisana alaninom.

[0046] Humani IGF-1 protein (ID BR. SEKV: 1) pri čemu je aminokiselina G42 supstituisana aminokiselinom serinom i pri čemu je aminokiselina E3 izbačena, a aminokiselina R37 je supstituisana alaninom fuzionisanim sa Fc regionom imunoglobulina, posebno sa modifikovanim Fc regionom, posebno Fc regionom koji je modifikovan da moduliše svoje vezivanje za Fc receptor, kako je u nastavku opisano.

[0047] Drugi polipeptid iz pronalaska je humani IGF-1 protein ID BR. SEKV: 117.

Drugi prikazani polipeptid je proteinski prekursor humanog IGF-1 ID BR. SEKV: 118.

Otkriveno je da mutacija ili delecija aminokiselina R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 i/ili M105 gore pomenutog proteinskog prekursora humanog IGF-1 Ea peptida iz prethodnog stanja tehnike dovodi do većeg prinosa nedegradiranog proteina kada ga eksprimiraju ćelije sisara. Nadalje je otkriveno da kombinacija pomenutih mutacija/delecija na položajima R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 i/ili M105 daje sinergijski efekat. Stoga, u jednom otelotvorenju otkrića R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 i/ili M105, pod uslovom da modifikovani protein IGF-1 sadrži Ea-peptid (ID BR. SEKV: 2), izbačena je ili mutirana u ovde prikazanim modifikovanim proteinskim prekursorima IGF-1. U jednom otelotvorenju otkrića, R74, R77 i/ili R104 su mutirane u Q u ovde prikazanim proteinskim prekursorima IGF-1. U daljem otelotvorenju otkrića, K68, S69, A70, R71 i/ili R72 mogu dodatno biti izbačene ili mutirane u ovde prikazanim modifikovanim proteinskim prekursorima IGF-1.

U skladu sa tim, prikazani su polipeptidi koji sadrže proteinski prekursor humanog IGF-1, tj. sadrže Ea-peptid iz humanog IGF-1, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 izbačena ili supstituisana drugom aminokiselinom i pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5. E-peptid može biti Ea, Eb, ili Ec peptid (ID BR. SEKV: 2-4). U konkretnom otelotvorenju otkrića, aminokiselina glicin na položaju 42 je izbačena ili supstituisana aminokiselinom ili serinom.

[0048] U jednom otelotvorenju otkrića, goreopisani proteinski prekursor humanog IGF-1 Eapeptida koji mutira na položaju G42 kao što je prethodno opisano (delecija ili mutacija u serin) sadrži dodatne delecije i/ili mutacije aminokiselina G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77, G96, S97, A98, G99, N100, K101, N102, Y103, Q104 i/ili M105, pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5.

[0049] Primeri takvih prikazanih molekula su sledeći polipeptidi:

[0050] Polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1 Ea-peptida, pri čemu je aminokiselina G42 supstituisana aminokiselinom serinom i pri čemu su aminokiseline

(1) G1, P2, E3 izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(2) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(3) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(4) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(5) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(6) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(7) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiseline R36 i R37 su supstituisane ili izbačene i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(8) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(9) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(10) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R77 je mutirana u glutamin (Q).

(11) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(12) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i Q104 su mutirane u glutamin (Q).

(13) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(14) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(15) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(16) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R77 je mutirana u glutamin (Q).

(17) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(18) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(19) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(20) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(21) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin

(22) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(23) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(24) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin

(25) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(26) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(27) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(28) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(29) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(1a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(2a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(3a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(4a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(5a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(6a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(7a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiseline R36 i R37 su supstituisane ili izbačene i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(8a) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(9a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(10a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(11a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(12a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i Q104 su mutirane u glutamin (Q).

(13a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(14a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(15a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(16a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(17a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(18a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(19a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(20a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(21a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin

(22a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(23a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S7272 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(24a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin

(25a) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(26a) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(27a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(28a) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(29a) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

[0051] U drugom otelotvorenju, otkriće se odnosi na goreopisane proteine koji sadrže polipeptide (1)-(29a), pri čemu je umesto mutacije pomenutih molekula na položajima 1-3, izbačena samo aminokiselina E3 (npr. molekul (28a) može takođe da se odnosi na polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1 Ea-peptida, pri čemu je aminokiselina G42 supstituisana aminokiselinom serinom i pri čemu je E3 izbačena, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).)

[0052] Dodatno, otkriće se odnosi na polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1, tj. sadrži Ea-peptid iz humanog IGF-1, koji je fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina, i pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 supstituisana drugom aminokiselinom i pri čemu numeracija aminokiselina iz IGF-1 dela pomenutog proteina odgovara ID BR. SEKV: 5. E-peptid može biti Ea, Eb, ili Ec peptid, a aminokiselina kojom je glicin na položaju 42 supstituisan je serin.

[0053] Tako, otkriće se odnosi na polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1; (a) pri čemu je aminokiselina G42 izbačena ili supstituisana aminokiselinom serinom; i (b) koji je povezan sa Fc regionom imunoglobulina, posebno sa modifikovanim Fc regionom, posebno sa Fc regionom, koji je modifikovan da modulira svoje vezivanje za Fc receptor. Na primer, jedna ili više aminokiselina može biti zamenjena različitim aminokiselinskim ostacima, tako da Fc region ima izmenjen afinitet prema Fc receptoru ili C1 komponenti komplementa. Takozvani utišani Fc regioni imunoglobulina su opisani u struci: LALA i N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. tom 20(6):685-691); i D265A (Baudino i sar. 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W., supra). Primeri za tiha Fc IgG1 antitela obuhvataju takozvani LALA mutant koji sadrži L234A i L235A mutacije aminokiselinske sekvence Fc IgG1. Drugi primer za tiho IgG1 antitelo sadrži D265A mutaciju. Drugo tiho IgG1 antitelo sadrži N297A mutaciju, koja dovodi do aglikozilovanih/neglikozilovanih antitela.

[0054] Gorepomenuti LALA pristup su u US5,624,821 i US5,648,260 detaljnije opisali Winter i sar. Tako, u jednom otelotvorenju prikazani proteinski prekursor hIGF-1 je fuzionisan sa Fc regionom koji sadrži L234A i L235A mutaciju ili D265A mutaciju ili N297A mutaciju. Takvi Fc LALA, D265A ili N297A konstrukti imaju smanjenu ADCC aktivnost

[0055] U jednom otelotvorenju otkrića polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1 Ea-peptida fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 supstituisana aminokiselinom serinom, sadrži dodatne delecije i/ili mutacije aminokiselina G1, P2, E3, R36, R37, K68, S69, A70, R71, S72, R74, R77 i/ili R104.

[0056] Primeri za takve molekule uključuju sledeće polipeptide:

[0057] Polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1 Ea-peptida fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 supstituisana aminokiselinom serinom, pri čemu numeracija aminokiselina IGF-1 dela pomenutog proteina odgovara ID BR. SEKV: 5 i pri čemu su aminokiseline

(1b) G1, P2, E3 izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(2b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(3b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(4b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(5b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(6b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(7b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiseline R36 i R37 su supstituisane ili izbačene i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(8b) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(9b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

(10b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(11b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(12b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i Q104 su mutirane u glutamin (Q).

(13b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(14b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(15b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(16b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R77 je mutirana glutaminom (Q).

(17b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(18b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(19b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(20b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(21b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(22b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(23b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(24b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(25b) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(26b) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(27b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(28b) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(29b) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(1c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(2c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(3c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(4c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(5c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(6c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(7c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiseline R36 i R37 su supstituisane ili izbačene i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(8c) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(9c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

(10c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(11c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(12c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana ili izbačena i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i Q104 su mutirane u glutamin (Q).

(13c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(14c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(15c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(16c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(17c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(18c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q). (19c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(20c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(21c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin

(22c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(23c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S7272 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(24c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(25c) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

(26c) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(27c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

(28c) G1, P2, E3 su izbačene, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q) i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

(29c) G1, P2, E3 su izbačene, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisana alaninom i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

[0058] U drugom otelotvorenju otkriće se odnosi na goreopisane proteine koji sadrže goreopisane polipeptide (1b)-(29c), pri čemu je umesto mutacije pomenutih molekula na položajima 1-3 samo izbačena aminokiselina E3 (npr. molekul (28c) može takođe da se odnosi na polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1 fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina, pri čemu je aminokiselina G42 supstituisana aminokiselinom serinom i pri čemu je aminokiselina (ili aminokiseline) E3 izbačena, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).)

[0059] U drugom otelotvorenju, otkriće se odnosi na goreopisane polipeptide (npr. polipeptide 1-29c), koji sadrže mutirani E-peptid koji sadrži aminokiseline

a) VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASG (ID BR. SEKV: 25), ili

b) VQAQQHTDMPKTQKYQPPATNKNTKSQRRKGS (ID BR. SEKV: 26).

c) VQAQQHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYQM (ID BR. SEKV: 115)

[0060] U daljem otelotvorenju, otkriće pruža goreopisani proteinski prekursor IGF-1 fuzionisan sa Fc regionom, pri čemu Fc region može biti neposredno fuzionisan sa modifikovanim polipeptidnim prekursorom IGF-1 ili može biti povezan preko regiona šarke pomoću rekombinantnih DNK tehnologija poznatih u struci. Ako se koristi region šarke DNK, Fc region može biti povezan sa bilo kojim delom modifikovanog polipeptidnog prekursora IGF-1. U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je fuzionisan neposredno sa C-krajem modifikovanog polipeptidnog prekursora IGF-1. U drugom otelotvorenju, Fc region je povezan sa C-krajem modifikovanog polipeptidnog prekursora IGF-1 preko Gly Ser (-GS-) linkera.

[0061] DNK linker se može koristiti da bi se obezbedilo restrikciono mesto između komponenata radi lakšeg rukovanja. Takođe, može biti obezbeđen linker radi pojačavanja ekspresije polipeptida iz ćelije domaćina, da bi se umanjile sterne smetnje kako bi komponenta mogla da poprimi svoju optimalnu tercijarnu ili kvaternernu strukturu i/ili na odgovarajući način interaguje sa svojim ciljnim molekulom. Za linkere i metode identifikovanja poželjnih spejsera, vidite, na primer, George i sar. (2003) Protein Engineering 15:871-879.

[0062] Sekvenca linkera može da uključuje jednu ili više aminokiselina prirodno povezanih sa komponentom receptora, ili joj se može dodati sekvenca radi pojačavanja ekspresije fuzionog proteina, obezbeđivanja specifično poželjnih interesnih mesta, dozvoljavanja domenima komponenti da formiraju optimalne tercijarne strukture i/ili pojačavanja interakcije komponente sa svojim ciljnim molekulom. U jednom otelotvorenju otkrića, linker sadrži jednu ili više peptidnih sekvenci koje imaju dužinu između 1-100 aminokiselina, poželjno 1-25 aminokiselina. U jednom otelotvorenju otkrića, linker ima dužinu od 1-5 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, linker je sekvenca tri aminokiseline, specifičnije, sekvenca tri aminokiseline Gly Pro Gly. U drugom otelotvorenju, linker je Gly Ser.

[0063] Primeri za takve molekule šarke uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće polipeptide:

šarka 1: CPPCPA (ID BR. SEKV: 22)

šarka 2: DKTHTCPPCPA (ID BR. SEKV: 23)

šarka 3: EPKSCDKTHTCPPCPA (ID BR. SEKV: 24)

[0064] Posledično, otkriće se odnosi na polipeptid koji sadrži proteinski prekursor humanog IGF-1 Ea-peptida koji je fuzionisan sa Fc regionom imunoglobulina, posebno sa modifikovanim Fc regionom, posebno sa Fc regionom koji je modifikovan da modulira svoje vezivanje za Fc receptor, poželjno supstituisanjem jedne ili obe aminokiseline 234 i 235 alaninom kao što je prethodno opisano, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 supstituisana serinom, pri čemu numeracija aminokiselina odgovara ID BR. SEKV: 5 i pri čemu je Fc region imunoglobulina fuzionisan sa proteinskim prekursorom IGF-1 preko regiona šarke.

[0065] Primeri za takve molekule uključuju sledeće polipeptide:

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E (ID BR. SEKV:8)

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A (ID BR. SEKV:9)

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C (ID BR. SEKV:10)

hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F (ID BR. SEKV:11)

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E (ID BR. SEKV:12)

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A (ID BR. SEKV:13)

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F (ID BR. SEKV:14)

[0066] U jednom konkretnom otelotvorenju otkrića, aminokiseline R71 i S72 goreopisanih proteinskih prekursora IGF-1 mogu mutirati na sledeći način:

(1) Delecija jednog ili oba R71 i S72, i/ili

(2) Mutacija jednog ili oba R71 i S72 u nebaznu aminokiselinu, kao što je alanin, i/ili

(3) Insercija jedne ili više nebaznih aminokiselina između R71 i S72, i/ili

(4) Postavljanje mesta glikozilacije blizu R71 i S72 dovoljno da zamaskira mesto proteaze, i/ili

(5) Pegilovanje usmereno mestom pomoću zamene R71 ili S72, ili insercija u blizini ili između R71 i S72, sa neprirodnom aminokiselinom.

[0067] Metode za modifikaciju proteina, poput mutageneze usmerene mestom, uvođenja mesta glikozilacije ili pegilovanja usmerenog mestom, dobro su poznate stručnjacima za ovu oblast.

[0068] U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je modifikovan da modulira svoje vezivanje za Fc receptor. U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je modifikovan da redukuje svoj afinitet prema Fc receptoru. U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je modifikovan da redukuje svoju ADCC aktivnost. U jednom otelotvorenju, Fc region je modifikovan da spreči ADCC aktivnost.

[0069] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV: 8 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E). U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV: 9 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A). U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV:10 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C). U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV: 11 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F).

[0070] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV:12 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E).

[0071] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV:13 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A).

[0072] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV:14 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F).

[0073] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje polipeptid koji sadrži ID BR. SEKV:8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14.

[0074] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid koji je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa ID BR. SEKV: 8.

[0075] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid koji je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa ID BR. SEKV: 9.

[0076] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid koji je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa ID BR. SEKV: 10.

[0077] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid koji je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa ID BR. SEKV: 11.

[0078] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid koji je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa ID BR. SEKV: 12.

[0079] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid koji je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa ID BR. SEKV: 13.

[0080] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid koji je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa ID BR. SEKV: 14.

[0081] U jednom otelotvorenju, polipeptidi predmetnog otkrića su glikozilovani.

Mutacije aminokiselina

[0082] Kao što je gore navedeno, različite aminokiseline mogu biti mutirane u druge aminokiseline. Tipično, aminokiselina je zamenjena alaninskim ostatkom. Međutim, mogu se koristiti druge aminokiseline, kao što su neprirodne aminokiseline ili prirodne aminokiseline iz druge grupe (tj. polarne, kisele, bazne ili nepolarne). Metode uvođenja mutacije u aminokiseline proteina su dobro poznate stručnjacima za ovu oblast. Vidi, npr. Ausubel (izd.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T.

Maniatis, E. F. Fritsch i J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Metode obuhvataju, ali nisu ograničene na, amplifikaciju DNK koja kodira funkcionalno aktivnu varijantu polipeptida ili njene fragmente putem lančane reakcije polimerizacije (PCR) izvedene pomoću mutagenih prajmera i sastavljanje fragmenata putem PCR za sastavljanje ukoliko je to potrebno ili uvođenje mutacija pomoću komercijalno dostupnih kompleta poput "QuikChange.TM. Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene). Vidi, npr. Ausubel (izd.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch i J.

Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nadalje, mutirane sekvence se mogu dobiti sintezom sintetičkih gena, uslugom koju pružaju komercijalne kompanije (npr. Geneart, Life Technology).

Generisanje funkcionalno aktivne varijante polipeptida ili derivata polipeptida zamenom aminokiseline koja ne utiče na funkciju polipeptida može obaviti osoba stručna za ovu oblast.

Fc regioni imunoglobulina

[0083] U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je iz IgG, IgM ili IgA. U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je izveden iz IgG. Fc domen IgG može biti odabran od izotipova IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, kao i od svakog alotipa u okviru svake grupe izotipa. U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je humani Fc region.

[0084] Fc region može biti izmenjen zamenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka različitim aminokiselinskim ostatkom kako bi se izmenila efektorska funkcija Fc regiona. Na primer, jedna ili više aminokiselina može biti zamenjena različitim aminokiselinskim ostacima, tako da Fc region ima izmenjen afinitet prema Fc receptoru ili C1 komponenti komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u US5,624,821 i US5,648,260, čiji su autori Winter i sar. Konkretno, ostaci 234 i 235 mogu biti mutirani. Konkretno, te mutacije mogu biti u alanin. Tako, u jednom otelotvorenju antitelo iz otkrića ima mutaciju u Fc regionu u jednoj ili obe aminokiseline 234 i 235. U drugom otelotvorenju otkrića, jedna ili obe aminokiseline 234 i 235 mogu biti supstituisane alaninom. Takva varijanta Fc u kojoj su ostaci 234 i 235 supstituisani alaninom uobičajeno se naziva "LALA". Takvi LALA Fc konstrukti imaju umanjenu ADCC aktivnost. U jednom otelotvorenju otkrića, proteinski prekursor IGF-1 je povezan sa Fc IgG1 LALA.

Vezivanje

[0085] "Fuzionisan sa" ili "povezan sa" kako se ovde koristi u kontekstu prikazanih proteina fuzionisanih sa/povezanih sa Fc regionom imunoglobulina, značiće kombinovanje dva polipeptida koji nisu prirodno prisutni u istom polipeptidu.

[0086] Fc region imunoglobulina može biti neposredno fuzionisan sa modifikovanim IGF-1 polipeptidom ili može biti povezan putem linkera pomoću tehnologija rekombinantne DNK koje su dobro poznate u struci. Ako se koristi DNK linker, Fc region može biti povezan sa bilo kojim delom modifikovanog IGF-1 polipeptida. U jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je fuzionisan direktno sa C-krajem modifikovanog IGF-1 polipeptida. U drugom otelotvorenju otkrića, Fc region je povezan sa C-krajem modifikovanog IGF-1 polipeptida pomoću Gly Ser (-GS-) linkera i/ili regiona šarke (ID BR. SEKV: 22 do 24) kao za hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E (ID BR. SEKV: 8), hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A (ID BR. SEKV: 9), hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C (ID BR. SEKV: 10), hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F (ID BR. SEKV: 11), hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E (ID BR. SEKV: 12), hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A (ID BR. SEKV: 13) ili hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F (ID BR. SEKV:14).

[0087] DNK linker se može koristiti da bi se obezbedilo restrikciono mesto između komponenata radi lakšeg rukovanja. Takođe, može biti obezbeđen linker radi pojačavanja ekspresije polipeptida iz ćelije domaćina, da bi se umanjile sterne smetnje kako bi komponenta mogla da poprimi svoju optimalnu tercijarnu ili kvaternernu strukturu i/ili na odgovarajući način interaguje sa svojim ciljnim molekulom. Za linkere i metode identifikovanja poželjnih spejsera, vidite, na primer, George i sar. (2003) Protein Engineering 15:871-879.

[0088] Sekvenca linkera može da uključuje jednu ili više aminokiselina prirodno povezanih sa komponentom receptora, ili joj se može dodati sekvenca radi pojačavanja ekspresije fuzionog proteina, obezbeđivanja specifično poželjnih interesnih mesta, dozvoljavanja domenima komponenti da formiraju optimalne tercijarne strukture i/ili pojačavanja interakcije komponente sa svojim ciljnim molekulom. U jednom otelotvorenju otkrića, linker sadrži jednu ili više peptidnih sekvenci dužine između 1-100 aminokiselina, poželjno 1-25 aminokiselina. U jednom otelotvorenju otkrića, linker je dužine 1-5 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, linker je sekvenca tri aminokiseline, specifičnije, sekvenca tri aminokiseline Gly Pro Gly. U drugom otelotvorenju, linker je Gly Ser.

Nukleinske kiseline

[0089] Pronalazak takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju polipeptide pronalaska. Nadalje su prikazane sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E, hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A, hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C, hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F, hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E, hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A ili hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F (ID BR. SEKV: 15-21).

[0090] Molekuli nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti u obliku RNK; kao što je iRNK, ili u obliku DNK, uključujući, na primer, kDNK ili sintetičku DNK. Molekuli nukleinske kiseline mogu biti dvolančani ili jednolančani. Jednolančana DNK može biti kodirajući lanac, poznat i kao smisleni ("sense") lanac, ili može biti nekodirajući lanac, koji se takođe naziva antismisleni lanac ("antisense").

[0091] Degeneracija genetskog koda je dobro poznata. Tako, dve ili više različitih sekvenci nukleinske kiseline mogu da kodiraju istu polipeptidnu sekvencu. Takve varijante sekvenci nukleinske kiseline su obuhvaćene u okviru ove prijave. Zaista, može biti poželjnije praviti konzervativne modifikacije sekvenci nukleinske kiseline kako bi se poboljšala ekspresija polipeptida pronalaska.

[0092] Otkriće dalje obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz pronalaska. Vektor može biti klonirajući ili ekspresioni vektor. U jednom otelotvorenju otkrića, nukleinska kiselina može biti sadržana u ekspresionom vektoru koji nosi elemente potrebne za efikasnu ekspresiju dobro poznate stručnjacima za ovu oblast. Elementi uključuju, na primer, promoter, kao što je, na primer, pojačavač-promoter citomegalovirusa (CMV), signalna sekvenca za sekreciju, kao što je prirodna ili bilo koja druga sekvenca za koju se zna da olakšava sekreciju, signal za poliadenilaciju i terminator transkripcije, na primer, dobijen od gena goveđeg hormona rasta (BGH), element koji omogućava replikaciju epizoma i replikaciju kod prokariota (npr. SV40 porekla i ColE1 ili drugi poznati u struci) i elementi za omogućavanje selekcije, kao što je gen otpornosti na ampicilin i zeocin ili higromicin marker.

[0093] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleotida izabranu iz grupe koja se sastoji od:

a) sekvence polinukleotida date u ID BR. SEKV: 15 ili njenog komplementa;

b) sekvence polinukleotida koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa ukupnom sekvencom datom u ID BR. SEKV: 15;

c) sekvence polinukleotida date u ID BR. SEKV: 16 ili njenog komplementa;

d) sekvence polinukleotida koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa ukupnom sekvencom datom u ID BR. SEKV: 16;

e) sekvence polinukleotida date u ID BR. SEKV: 17 ili njenog komplementa;

f) sekvence polinukleotida koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa ukupnom sekvencom datom u ID BR. SEKV: 17;

g) sekvence polinukleotida date u ID BR. SEKV: 18 ili njenog komplementa;

h) sekvence polinukleotida koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa ukupnom sekvencom datom u ID BR. SEKV: 18;

i) sekvence polinukleotida date u ID BR. SEKV: 19 ili njenog komplementa;

j) sekvence polinukleotida koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa ukupnom sekvencom datom u ID BR. SEKV: 19;

k) sekvence polinukleotida date u ID BR. SEKV: 20 ili njenog komplementa;

l) sekvence polinukleotida koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa ukupnom sekvencom datom u ID BR. SEKV: 20;

m) sekvence polinukleotida date u ID BR. SEKV: 21 ili njenog komplementa;

n) sekvence polinukleotida koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa ukupnom sekvencom datom u ID BR. SEKV: 21.

[0094] U drugom otelotvorenju, otkriće se odnosi na goreopisane varijante polipeptida IGF-1, pri čemu su pomenuti proteinski prekursori humanog IGF-1 pegilovani. Pegilovanje je posebno poželjno za proteinske prekursore IGF-1 koji nisu fuzionisani sa Fc regionom imunoglobulina humanog IgG. Konjugacija sa poli(etilen glikolom) (PEG; pegilovanje) se pokazala kao korisna u produžavanju poluživota terapeutskih proteinskih lekova. Očekuje se da pegilovanje polipeptidnih prekursora IGF iz otkrića može dovesti do sličnih farmaceutskih koristi. Metode pegilovanja IGF-1 su dobro poznate u struci. Vidi, na primer, publikaciju US patentne prijave 2006/0154865, koja opisuje korisna svojstva lizinom monopegilovanog IGF-1. Takvo monopegilovanje lizinom može se prilagoditi za polipeptidne prekursore IGF iz otkrića. Dodatno, pegilovanje se može postići u bilo kom delu polipeptida iz otkrića uvođenjem neprirodne aminokiseline.

[0095] Određene neprirodne aminokiseline mogu biti uvedene pomoću tehnologije opisane u Deiters i sar. J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang i Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang i sar. Science 292:498-500, 2001; Zhang i sar. Science 303:371-373, 2004 ili u US patentu br.7,083,970. Ukratko, neki od tih ekspresionih sistema uključuju mutagenezu usmerenu na mesto radi uvođenja besmislenog kodona, kao što je ćilibarni TAG, u otvoreni okvir za čitanje koji kodira polipeptid iz otkrića. Takvi ekspresioni vektori su zatim uvedeni u domaćina koji može da koristi tRNK specifičnu za uvedeni besmisleni kodon i naelektrisanu neprirodnom aminokiselinom po izboru. Konkretne neprirodne aminokiseline koje su korisne u svrhu konjugovanja ostataka sa polipeptidima iz otkrića uključuju one sa acetilenskim i azido bočnim lancima. Polipeptidni prekursori IGF koji sadrže ove nove aminokiseline zatim mogu biti pegilovani na tim odabranim mestima u proteinu. Dodatno, takvi pegilovani molekuli IGF bez E-peptida su takođe korisni kao lekovi.

Proizvodnja varijanti IGF-1 iz pronalaska u ćelijama sisara

[0096] Proizvodnja nativnog humanog IGF-1 u prokariotskim ekspresionim sistemima je dobro poznata stručnjacima. Ekspresija u eukariotskim ćelijama, konkretno u ćelijama domaćinima sisara, ponekad je poželjnija jer je verovatnije da će se takve eukariotske ćelije, pre nego prokariotske ćelije, sakupiti i lučiti ispravno savijen i imunološki aktivan protein.

Ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 korišćene sa DH FR selektabilnim markerom, npr. kao što je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol.159:601-621), HEK293 ćelije (ćelije bubrega ljudskog embriona 293), NSO mišje ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Poželjne ćelije domaćini su CHO K1 izvedene ćelije. Međutim, ekspresija rekombinantnog IGF-1 u CHO ćelijskim linijama dovodi do inhibicije ćelijskog rasta i malih titara (vidi slike 11/12). Stabilno izbacivanje/deaktivacija (nokdaun/nokaut) IGF-1-R u CHO ćelijama pomoću tehnologije "cinkov prst nukleaza" dovelo je do poboljšanog rasta ćelija i većih titara IGF-1 proteina (slike 14, 15, 16). CHO ćelije sa smanjenom ekspresijom IGF-1-R (izbacivanje si/shRNK) koje su stabilno transficirane plazmidima koji kodiraju IGF-1 proizvele su oko 5 puta veći zbirni titar u poređenju sa stabilno transficiranim CHO ćelijama divljeg tipa. Čak veći zbirni titar se može izmeriti posle stabilne transfekcije IGF-1-R nokaut ćelijskim linijama. Petostruko do dvadesetostruko povećanje rekombinantnog IGF-1 je detektovano u poređenju sa ćelijskom linijom CHO divljeg tipa. Ovi podaci ukupno pokazuju da nokdaun ili nokaut gena IGF-1 receptora u ćelijskim linijama sisara može znatno da poboljša proizvodnju IGF-1 i njegovih varijanti.

[0097] Dakle, pogodna metoda za proizvodnju rekombinantnog IGF-1 ili njegovih varijanti u ćelijama sisara, na primer CHO ćelijama, pri čemu pomenute ćelije sisara imaju nedostatak ekspresije funkcionalnog receptora insulinu sličnog faktora rasta 1 (IGF-1R), sadrži sledeće korake:

a. Proizvodnja ćelije sisara sa nedostatkom ekspresije receptora insulinu sličnog faktora rasta 1;

b. Transformisanje ćelije iz koraka a. ekspresionim vektorom koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira IGF-1 ili njegovu varijantu;

c. Odabir ćelije iz koraka b. koja se transformiše;

d. Uzgajanje ćelije odabrane u koraku c. u uslovima koji omogućavaju ekspresiju IGF-1 ili njegove varijante; i

e. Prikupljanje IGF-1 ili njegove varijante iz ćelija sisara uzgajenih u koraku d,

pri čemu redosled koraka a. i b. može biti alternativno obrnut, ili se oba koraka mogu obaviti istovremeno.

[0098] Stručnjak zna kako da transformiše, odabere i uzgaji genetski modifikovane ćelije sisara, npr. CHO ćelije, poput CHO-K1 izvedenih ćelija, CHO-DUXB11 izvedenih ćelija ili CHO-DG44 ćelija. Protokoli za izbor se rutinski koriste da olakšaju izbor ćelija za koje se očekuje da su integrisale rekombinantnu DNK koja kodira željeni terapeutski protein, poput faktora rasta, npr. IGF-1. Otpornost na antibiotike ili sposobnost rasta u hranljivom selektivnom medijumu dodeljena genom zajednički integrisanim na transformacionom vektoru se rutinski koristi. (vidi Weber, W. i Fussenegger, M. (2003) Inducible gene expression in mammalian cells, u Gene transfer and expression in mammalian cells, (Makrides, S.C., izd.), Elsevier: Amsterdam, str.589-604.) (Efficient selection for highexpression transfectants with a novel eukaryotic vector: Niwa Hitoshi, Yamamura Ken-ichi, Miyazaki Jun-ichi). Dva najčešća CHO ekspresiona sistema za proizvodnju rekombinantnog proteina koriste izbor metotreksata (MTX) zasnovan na dihidrofolat reduktazi (DHFR) ili izbor metionin sulfoksimina (MSX) zasnovan na glutamin sintetazi (GS) (Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Eur J Pharm Biopharm. feb.2010;

74(2):127-38. Epub 22. oktobar 2009. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production).

[0099] Vektori posebno pogodni za proizvodnju polipeptida u ćelijama sisara, posebno ćelijama glodara, poput CHO ćelija i CHO ćelija sa defektnim DHFR genom, prikazani su u patentnoj prijavi WO09080720A. Postoji nekoliko odgovarajućih metoda prethodno poznatih u struci za uvođenje ekspresionog vektora u ćeliju domaćina sisara. Te metode uključuju, ali nisu ograničene na transfekciju kalcijum fosfatom, elektroporaciju, lipofekciju, biolistički i polimerom posredovane transfere gena. Pogodne ćelije domaćini su prethodno opisane. Nakon uvođenja nukleinske kiseline ekspresionog vektora u ćeliju/ćelije domaćina, dobijeni transformanti su uzgajani u selektivnim uslovima pogodnim za testiranje ekspresije selektabilnog marker gena sisara obuhvaćenog u ekspresionoj kaseti (MSM). To znači da, na primer, kada je selektabilni marker gen sisara gen otpornosti na antibiotike, transformanti se uzgajaju u medijumu koji sadrži odgovarajući antibiotik aktivan u ćelijama sisara i odabrani su transformanti koji su vijabilni u takvim uslovima, tako omogućavajući dobijanje transformanata koji eksprimiraju marker gen i tako inkorporiraju vektor. Dodatno, drugi selekcioni korak može biti obavljen uzgajanjem transformanata u selekcionom medijumu prilagođenom za izbor selektabilnih marker gena koji se mogu amplifikovati sadržanih u ekspresionoj kaseti (MASM). Npr. u slučaju da se DHFR koristi kao selektabilni marker gen koji se može amplifikovati, transformanti se mogu uzgajati u nukleotidu ili medijumu bez purina u prisustvu inhibitora DHFR. U slučaju da se induktabilni promoter koristi u najmanje jednoj ekspresionoj kaseti, treba obezbediti odgovarajući indukcioni signal kako bi započela ekspresija polipeptida. Da bi mogao da se iskoristi sistem za selekciju/amplifikaciju DHFR, pomenute ćelije domaćini mogu biti uzgajane u prisustvu inhibitora DHFR. Pogodni inhibitori DHFR su antifolati poput npr. MTX. Koncentracija antifolata/MTX koja se koristi zavisi od ćelije domaćina i varijante DHFR inkorporirane u vektoru. Raspon koncentracije može biti odabran za postupke amplifikacije sa više koraka u DHFR" ćelijama domaćina, na primer, u vrednosti oko 5 nM - 20 nM do raspona vrednosti od 500 nM do 1000 nM ili čak i većim za sekundarne ili dalje korake amplfikacije. Za DHFR+ ćelije, početne koncentracije su obično više, u rasponu od 100 nM do 750 nM, poželjno 500 nM u prvim koracima i 500 nM do 1000 nM i više za dalje korake amplifikacije. Pogodne varijante DHFR su prethodno opisane.

Da bi mogao da se iskoristi sistem za selekciju/amplifikaciju GS, pomenute ćelije domaćini mogu biti uzgajane u prisustvu npr. MSX. Koncentracija MSX koja se koristi zavisi od ćelije domaćina. Raspon koncentracije može biti izabran od oko 15 do 150 mikromola, 20 do 100 mikromola i 25 do 50 mikromola. Ovi rasponi su posebno pogodni za NSO i CHO ćelije.

Farmaceutske kompozicije

[0100] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jednu ili kombinaciju goreopisanih inventivnih varijanti IGF-1, formulisanih zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu biti davane u kombinovanoj terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim agensima. Na primer, varijante IGF-1 iz predmetnog pronalaska mogu biti kombinovane sa najmanje jednim agensom za povećanje mišićne mase/snage, na primer, anti-ActRIIB antitelom, IGF-2 ili varijantama IGF-2, anti-miostatinskim antitelom, miostatinskim propeptidom, miostatinskim proteinom mamcem koji vezuje ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonistom, grelinskim agonistom, SARM, GH agonistima/mimeticima ili folistatinom. Primeri za terapeutske agense koji se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji su detaljnije opisani u nastavku, u odeljku o upotrebi varijanti IGF-1 iz pronalaska.

[0101] Termin "farmaceutski prihvatljiv" znači odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili naveden u Farmakopeji SAD ili drugim opšte priznatim farmakopejama za primenu kod životinja, a konkretnije kod ljudi. Termin "nosač" se odnosi na razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili nosač sa kojim se terapeutik daje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, poput vode i ulja, uključujući one dobijene iz nafte, kao i životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Pogodni farmaceutski ekscipijensi uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, ukoliko je to poželjno, takođe može da sadrži male količine kvašljivaca ili emulgatora, ili pH puferujućih agenasa. Ove kompozicije mogu imati oblik rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Kompozicija može biti formulisana kao supozitorija, sa tradicionalnim vezivačima i nosačima kao što su trigliceridi. Oralne formulacije mogu da uključe standardne nosače, kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd. farmaceutske čistoće. Primeri za pogodne farmaceutske nosače su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" E. W. Martina.

[0102] U poželjnom otelotvorenju, kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim postupcima kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravensko davanje ljudskim bićima. Kada je to potrebno, kompozicija može takođe uključivati agens za solubilizaciju i lokalni anestetik, poput lidokaina, radi ublažavanja bola na mestu injektovanja. Kada se kompozicija primenjuje infuzijom, može se davati infuzionom bocom koja sadrži sterilnu vodu farmaceutske čistoće ili fiziološki rastvor. Kada se kompozicija primenjuje injekcijom, mogu biti obezbeđeni ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološki rastvor, kako bi se sastojci izmešali pre primene.

[0103] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Nosač treba da bude pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. putem injekcije ili infuzije). U zavisnosti od načina primene, aktivno jedinjenje, tj. antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, mogu biti obloženi materijalom za zaštitu jedinjenja od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.

[0104] Farmaceutska kompozicija iz pronalaska može takođe uključivati farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Primeri za farmaceutski prihvatljive antioksidanse uključuju: antioksidanse rastvorljive u vodi, poput askorbinske kiseline, cistein hidrohlorida, natrijum bisulfata, natrijum metabisulfita, natrijum sulfita i slično; antioksidanse rastvorljive u ulju, poput askorbil palmitata, butilovanog hidroksianizola (BHA), butilovanog hidroksitoluena (BHT), lecitina, propil galata, alfa-tokoferola, i slično; i helirajuće agense metala, poput limunske kiseline, etilendiamin tetrasirćetne kiseline (EDTA), sorbitola, vinske kiseline, fosforne kiseline, i slično.

Primeri za pogodne vodene i nevodene nosače koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (poput glicerola, propilen glikola, polietilen glikola, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, poput maslinovog ulja, i injektabilne organske estre, poput etil oleata. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije, i upotrebom surfaktanata.

[0105] Ove kompozicije mogu takođe sadržati adjuvanse, poput konzervanasa, kvašljivaca, emulgatora i agenasa za disperziju. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se osigurati i prethodno navedenim postupcima sterilizacije, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola sorbinske kiseline, i slično. Takođe, može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonični agensi, poput šećera, natrijum hlorida, i slično. Dodatno, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju, poput aluminijum monostearata i želatina.

[0106] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za preparat za neposrednu upotrebu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Osim u meri u kojoj su bilo koji klasični medijumi ili agensi inkompatibilni sa aktivnim jedinjenjem, njihova primena u farmaceutskim jedinjenjima iz pronalaska je razmatrana. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe biti obuhvaćena kompozicijama.

[0107] Terapeutske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom obloga, poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, u kompoziciju se mogu uključiti izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilne farmaceutske kompozicije može se postići uključivanjem u kompoziciju agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.

Sterilni injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jedinim ili kombinacijom prethodno nabrojanih agenasa, po potrebi, a zatim sterilizacijom putem mikrofiltracije. Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporacijom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži bazni disperzioni medijum i druge potrebne agense od prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, metode pripreme su sušenje pod vakuumom i liofilizacija, koje daju prašak aktivnog agensa plus bilo koji dodatni poželjan agens iz njegovog prethodno sterilno filtiranog rastvora.

[0108] Količina aktivnog agensa koja se može kombinovati sa nosećim materijalom radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika će varirati u zavisnosti od lečenog subjekta i konkretnog načina primene. Količina aktivnog agensa koja se može kombinovati sa nosećim materijalom radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika će uopšteno biti ona količina jedinjenja koja proizvodi terapeutsko dejstvo. Uopšteno, od sto procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0,01 procenat do oko devedeset devet procenata aktivnog agensa, od oko 0,1 procenat do oko 70 procenata, ili od oko 1 procenat do oko 30 procenata aktivnog agensa u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0109] Dozni režimi su prilagođeni da obezbede optimalni poželjan odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može biti primenjen pojedinačni bolus, nekoliko podeljenih doza može biti primenjeno u određenom vremenskom periodu ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u pojedinačnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doze. Pojedinačni dozni oblik, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice prilagođene kao jedinične doze za subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za pojedinačne dozne oblike iz pronalaska je uslovljena i direktno zavisna od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i konkretnog terapeutskog dejstva koje treba da se postigne, i rizika svojstvenih za stručno mešanje takvog aktivnog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.

[0110] Terapeutski efikasna količina polipeptida u kontekstu primene varijanti IGF-1 iz pronalaska ili kompozicija koje sadrže pomenute varijante IGF-1, u opsegu je od oko 0,001 do 100 mg/kg, ili 0,01 do 30 mg/kg, a uobičajenije 0,1 do 10 mg/kg telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti oko 0,1 mg/kg telesne težine, mogu biti oko 0,2 mg/kg telesne težine, mogu biti oko 0,3 mg/kg telesne težine, mogu biti oko 1 mg/kg telesne težine, mogu biti oko 3 mg/kg telesne težine, mogu biti oko 5 mg/kg telesne težine ili oko 10 mg/kg telesne težine. Stručnjak ume da identifikuje pogodnu efikasnu dozu, koja će varirati u zavisnosti od načina primene (npr. intravenski ili subkutano). Primer režima lečenja podrazumeva primenu jednom dnevno, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje ili jednom mesečno. Takva primena može se obaviti intravenski ili subkutano. Dozni režimi za varijante IGF-1 iz pronalaska uključuju 0,1 mg/kg telesne težine ili 0,2 mg/kg telesne težine ili 0,3 mg/kg telesne težine ili 0,5 mg/kg telesne težine ili 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine intravenskom primenom.

Alternativno, kompozicija može biti formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna ređa primena. Doza i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela u pacijentu. Doza i učestalost primene mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Kod profilaktičkih primena, relativno mala doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastave sa primanjem lečenja do kraja života. Kod terapeutskih primena, relativno velika doza u relativno kratkim intervalima je ponekad potrebna dok se progresija bolesti ne umanji ili završi ili dok pacijent ne ispolji parcijalno ili kompletno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu može biti davan profilaktički režim.

[0111] Stvarni dozni nivoi aktivnih agenasa u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu varirati kako bi se dobila količina aktivnog agensa koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za konkretnog pacijenta, kompoziciju i način primene, koja neće biti toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo će zavisiti od niza farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost konkretnih kompozicija iz predmetnog pronalaska koje se koriste ili njihovih estara, soli ili amida, načina primene, vremena primene, brzine izlučivanja konkretnog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne zdravstvene istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora poznatih u medicinskoj struci.

[0112] Primena terapeutski efikasne doze inventivne varijante IGF-1 sadržane u kompozicijama iz pronalaska može dovesti do smanjenja ozbiljnosti simptoma bolesti, povećane učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevencije pogoršanja ili invaliditeta usled bolesti, tj. do porasta mišićne mase i/ili funkcije ili smanjenja/redukcije područja rane kod pacijenata sa opekotinama.

[0113] Pacijenti će dobijati efikasnu količinu aktivnog sastojka polipeptida, tj. količinu koja je dovoljna da otkrije, leči, ublaži ili spreči bolest ili poremećaj u pitanju. Terapeutska dejstva takođe mogu da uključe smanjenje fizičkih simptoma. Optimalna efikasna količina i koncentracija terapeutskog proteina za bilo kog konkretnog ispitanika zavisiće od raznih faktora, uključujući pacijentovu starost, veličinu, zdravlje i/ili pol, prirodu i stepen stanja, aktivnost konkretnog terapeutskog proteina, brzinu njegovog klirensa od strane organizma, a takođe i sva moguća dalja terapeutska sredstva koja se daju u kombinaciji sa terapeutskim proteinom. Efikasna količina isporučena u datoj situaciji može se odrediti rutinskim eksperimentma, i podložna je proceni lekara. Doziranje može biti po rasporedu pojedinačne doze ili po rasporedu višestruke doze.

[0114] Kompozicija iz predmetnog pronalaska može se primenjivati putem jednog ili više načina primene upotrebom raznovrsnih metoda poznatih u struci. Kao što će stručnjaci razumeti, način i/ili metoda primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Načini primene terapeutskih proteina iz pronalaska uključuju intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili druge parenteralne načine primene, na primer, putem injekcije ili infuzije. Izraz "parenteralna primena", kako se ovde koristi, podrazumeva načine primene koji nisu enteralna i topikalna primena, obično putem injekcije, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrastemalnu injekciju i infuziju. U jednom otelotvorenju, antitelo koje sadrži kompoziciju se daje intravenski. U drugom otelotvorenju, antitelo se daje subkutano.

[0115] Alternativno, inventivna varijanta IGF-1 koja sadrži kompoziciju iz pronalaska može se davati neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni način primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.

[0116] Aktivna jedinjenja mogu biti pripremljena sa nosačima koji će štititi jedinjenje od ubrzanog oslobađanja, poput formulacije sa produženim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikroenkapsulirane sisteme isporuke. Mogu da se koriste biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, poput etilen vinil acetata, polianhidrida, poliglikolne kiseline, kolagena, poliortoestara i polimlečne kiseline. Mnoge metode za pripremu takvih formulacija su patentirane ili uopšteno poznate stručnjacima. Vidi, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, izd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0117] Terapeutske kompozicije se mogu davati medicinskim uređajima poznatim u struci. Na primer, u jednom otelotvorenju, terapeutska kompozicija iz pronalaska može se primenjivati pomoću hipodermalnog injekcionog uređaja bez igle, kao što su uređaji prikazani u U.S. patentima br.5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880;

4,790,824 ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula korisnih za predmetni pronalazak uključuju: US Patent br.4,487,603, koji prikazuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za izdavanje leka kontrolisanom brzinom; US Patent br.4,486,194, koji prikazuje terapeutski uređaj za primenu leka kroz kožu; US Patent br.4,447,233, koji prikazuje infuzionu pumpu za lek, za isporuku leka sa preciznom brzinom infuzije; US Patent br.

4,447,224, koji prikazuje implantabilni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za neprekidnu isporuku leka; US Patent br.4,439,196, koji prikazuje osmotski sistem za isporuku leka koji ima pregrade sa više odeljaka; i US Patent br.4,475,196, koji prikazuje osmotski sistem za isporuku leka. Mnogi takvi implantati,sistemi za isporuku i moduli su poznati stručnjacima, i uključuju one koje proizvodi MicroCHIPSTM (Bedford, MA).

[0118] U određenim otelotvorenjima, varijanta humanog IGF-1 koja sadrži kompoziciju iz pronalaska može se formulisati da obezbedi ispravnu distribuciju in vivo. Na primer, krvnomoždana barijera (KMB) isključuje mnoga veoma hidrofilna jedinjenja. Da bi se obezbedilo da terapeutska jedinjenja iz pronalaska prođu KMB (ukoliko je to poželjno), ona mogu biti formulisana, na primer, u lipozomima. Za metode proizvodnje lipozoma, vidi, npr. US Patente 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više ostataka koji se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, tako povećavajući ciljanu isporuku leka (vidi, npr. V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol.29:685). Primeri ciljnih ostataka uključuju folat ili biotin (vidi, npr. US Patent 5,416,016); manozide (Umezawa i sar.

1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antitela (P.G. Bloeman i sar. 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais i sar.1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); surfaktantski receptor proteina A (Briscoe i sar. 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier i sar.1994 J. Biol. Chem.269:9090); vidi takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett.

346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273.

Ciljne bolesti i poremećaji

[0119] Pronalazak obezbeđuje polipeptid, nukleinsku kiselinu ili farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska za korišćenje u terapiji. Pronalazak dalje obezbeđuje polipeptid, nukleinsku kiselinu ili farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska za primenu u lečenju patološkog poremećaja. Otkriće dalje obezbeđuje primenu polipeptida, nukleinske kiseline ili farmaceutske kompozicije iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za lečenje patološkog poremećaja. Otkriće dalje obezbeđuje metodu lečenja pacijenta koji pati od patološkog poremećaja, koja obuhvata davanje terapeutski efikasne količine polipeptida, nukleinske kiseline ili farmaceutske kompozicije iz pronalaska pomenutom pacijentu.

[0120] Patološki poremećaj može biti oboljenje ili poremećaj mišićno-skeletnog sistema, poput mišićne atrofije. Postoji mnogo uzroka mišićne atrofije, koja može biti i posledica lečenja glukokortikoidima kao što je kortizol, deksametazon, betametazon, prednizon, metilprednizolon, ili prednizolon. Mišićna atrofija takođe može biti posledica denervacije usled povrede nerava ili posledica degenerativne, metaboličke ili inflamatorne neuropatije (npr. Giljеn Bаrеоv sindrоm, periferna neuropatija, ili izloženost toksinima ili lekovima iz okruženja).

[0121] Dodatno, mišićna atrofija može biti posledica miopatije, kao što je miotonija; kongenitalna miopatija, uključujući nemalinsku miopatiju, više/malojezgrenu miopatiju i miotubularnu (centronuklearnu) miopatiju; mitohondrijalnu miopatiju; porodičnu periodičnu paralizu; inflamatornu miopatiju; metaboličku miopatiju, kao što je ona izazvana glikogenom ili bolest skladištenja lipida; dermatomiozitisis; polimiozitis; uključeni telesni miozitis; miozitis osifikans; rabdomiolizu i mioglobinurije.

[0122] U drugom otelotvorenju otkrića, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može da se koristi za lečenje Kenedijeve bolesti ili hronične bubrežne insuficijencije

[0123] Miopatija može biti izazvana sindromom mišićne distrofije, kao što je Dišenova, Bekerova, miotonična, facioskapulohumeralna, Emeri-Drajfusova, okulofaringalna, skapulohumeralna, mišićna distrofija u pojasu udova, Fukujamina, kongenitalna mišićna distrofija, ili nasledna distalna miopatija. Oboljenje mišićno-skeletnog sistema takođe može biti osteoporoza, prelom kostiju, nizak ili patuljast rast.

[0124] Pored toga, mišićna atrofija može biti posledica bolesti motornih neurona kod odraslih, kao što je amiotrofična lateralna skleroza; infantilna spinalna mišićna atrofija, juvenilna spinalna mišićna atrofija, autoimuna motorna neuropatija sa multifokalnim konduktorskim blokom, paraliza usled moždanog udara ili oštećenja kičmene moždine, imobilizacija skeleta usled traume, produženo ležanje, dobrovoljna neaktivnost, metabolički stres ili nedovoljna ishrana, kancer, AIDS, post, poremećaj tiroidne žlezde ili nadbubrežne žlezde ili poremećaj hipofize, dijabetes, benigna kongenitalna hipotonija, bolest centralnog jezgra, bolesti jetre (na primer, fibroza, ciroza), sepsa, bubrežna insuficijencija, kongestivna srčana insuficijencija, starenje, putovanje u svemiru ili vreme provedeno u okolini sa nultom gravitacijom.

[0125] U konkretnom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može da se koristi za lečenje pacijenata sa opekotinama, uključujući opekotine kod dece i odraslih, gubitka telesne mase bez masnih naslaga i/ili atrofije mišića kod pacijenata.

[0126] Primeri stanja povezanih sa starenjem koja se mogu lečiti uključuju sarkopeniju, atrofiju kože, atrofiju mišića, atrofiju mozga, aterosklerozu, arteriosklerozu, emfizem pluća, osteoporozu, osteoartritis, imunološku nesposobnost, visok krvni pritisak, demenciju, Hantingtonovu bolest, Alchajmerovu bolest, katarakte, starosnu degeneraciju makule, rak prostate, moždani udar, skraćeno očekivano trajanje života, krhkost, gubitak pamćenja, bore, oslabljen rad bubrega i gubitak sluha povezan sa starenjem; metaboličke poremećaje, uključujući dijabetes tip II, metabolički sindrom, hiperglikemiju i gojaznost.

[0127] U konkretnom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može da se koristi za lečenje pacijenata koji imaju hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP).

[0128] U drugom otelotvorenju otkrića, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može da se koristi za lečenje mišićne atrofije. U konkretnom otelotvorenju, otkriće se odnosi na korišćenje farmaceutske kompozicije iz pronalaska za lečenje mišićne atrofije, pri čemu je grupa atrofije izabrana iz grupe koja obuhvata sarkopeničnu gojaznost, sarkopeniju i mišićnu atrofiju povezanu sa dijabetesom.

[0129] Druga stanja koja se mogu lečiti uključuju akutnu i/ili hroničnu bolest ili insuficijenciju bubrega, fibrozu ili cirozu jetre, rak poput raka pankreasa, gastrointestinalnog kancera (uključujući rak jednjaka, želuca i debelog creva), kancera pluća, prostate, limfoma, ili raka dojke; Parkinsonovu bolest, stanja povezana sa smrću neurona, kao što je ALS (amiotrofična lateralna skleroza), atrofija mozga, ili demencija i anemija; hronične infekcije, kao što je tuberkuloza, bez obzira na to da li je izazivač Mycobacterium tuberculosis ili atipična mikobakterija; hronične gljivične infekcije; i oportunističke infekcije u okolnostima imunosupresije, bilo jatrogene ili usled AIDS-a.

[0130] Dalja stanja uključuju kaheksiju, kaheksiju povezanu sa reumatoidnim artritisom i kaheksiju povezanu sa kancerom.

[0131] U drugom otelotvorenju, otkriće se odnosi na metodu lečenja mišićnog poremećaja, pri čemu metoda obuhvata davanje terapeutski efikasne količine, kako je gore opisano, polipeptida iz pronalaska. Do potrebe za lečenjem polipeptidima iz otkrića ili kompozicijama koje ih sadrže, da bi se povećala mišićna masa, može doći usled nekog od gorenavedenih stanja, posebno kao posledica oboljenja ili poremećaja mišićno-skeletnog sistema, kao što je mišićna atrofija, pri čemu je poremećaj mišića mišićna atrofija odabrana iz grupe koja obuhvata sarkopeničnu gojaznost, sarkopeniju i mišićnu atrofiju povezanu sa dijabetesom.

[0132] Dodatno, otkriće se odnosi na metodu za lečenje opekotina, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), stanja povezanih sa starenjem, kao što je sarkopenija, Kenedijeve bolesti ili hronične bolesti bubrega, koja obuhvata davanje terapeutski efikasne količine polipeptida iz pronalaska pacijentu, kako je gore opisano.

[0133] U drugom otelotvorenju, otkriće se odnosi na metodu za povećanje mišićne mase. U konkretnom otelotvorenju, otkriće se odnosi na metodu za povećanje mišićne mase kod pacijenta kome je to potrebno. Potreba za povećanjem mišićne mase može biti posledica nekog od gorenavedenih stanja, posebno kao posledica oboljenja ili poremećaja mišićnoskeletnog sistema, poput mišićne atrofije. Do potrebe za povećanjem mišićne mase može takođe doći usled opekotine, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), stanja povezanih sa starenjem, kao što je sarkopenija, Kenedijeve bolesti ili hronične bolesti bubrega.

Primena na pacijentu

[0134] Farmaceutska kompozicija iz pronalaska može se primeniti na pacijentu. Primena će uobičajeno biti pomoću šprica. Tako, otkriće obezbeđuje uređaj za isporuku (npr. špric) koji sadrži farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska.

[0135] Poznati su različiti sistemi za isporuku i mogu se upotrebiti za primenu polipeptida iz pronalaska, npr., enkapsulacija u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne za ekspresiju proteina, endocitoza posredovana receptorom (vidi, npr, Wu i Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987), konstruisanje nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog, adeno-asociranog virusnog, adenovirusnog, virusa boginja (npr, virus ptičjih boginja, konkretno virus boginja pernate živine) ili drugog vektora, itd. Metode uvođenja mogu biti enteralna ili parenteralna, i uključujući, bez ograničenja, intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, pulmonalni, intranazalni, intraokularni, epiduralni i oralni način primene. Ovi polipeptidi se mogu davati bilo kojim uobičajenim putem, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorbovanjem kroz epitelnu ili mukokutanu površinu (npr. oralna sluzokoža, rektalna i crevna sluzokoža, itd.) i mogu se davati zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Primena može biti sistemska ili lokalna. Pored toga, može biti poželjno uvođenje farmaceutskih kompozicija iz izuma u centralni nervni sistem pogodnim putem, uključujući intraventrikularnu i intratekalnu injekciju; intraventrikularna injekcija može biti olakšana intraventrikularnim kateterom, na primer, povezanim za rezervoar, kao što je Omajin rezervoar. U specifičnom otelotvorenju, može biti poželjno primeniti farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska lokalno u oblast kojoj je potrebno lečenje; to se može postići, na primer, i ne ograničavajući se na, lokalnom infuzijom tokom operacije, topikalnom primenom, npr. putem injekcije, putem katetera, ili putem implantata, pri čemu implantat može biti od poroznog, neporoznog, ili želatinskog materijala, uključujući membrane, kao što su silastične membrane, vlakna, ili komercijalne zamene za kožu.

[0136] U drugom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija se može isporučiti u vezikuli, posebno lipozomu (vidi, Langer, Science 249:1527-1533, 1990). U još jednom otelotvorenju, aktivni agens se može isporučiti u sistemu sa kontrolisanim otpuštanje. U jednom otelotvorenju, može se koristiti pumpa.

Grupe pacijenata

[0137] Pacijenti koji mogu da imaju korist od predloženog lečenja uključuju pacijente koji se oporavljaju od akutne ili kritične bolesti koja zahteva intenzivnu negu ili dugoročnu hospitalizaciju (duže od 1 nedelje); krhke starije pacijente sa sarkopenijom; mlade odrasle osobe koje se oporavljaju od ozbiljne traume, kao što su saobraćajne nesreće, teške opekotine, povrede u borbi i druge traumatske povrede; pacijente sa hroničnim bolestima za koje je poznato da izazivaju kaheksiju, kao što je gore navedeno; i pacijente sa mišićnim oboljenjima, kao što je gore navedeno. Pošto je gubitak mišića uobičajena komplikacija kod većine bolesti koje su ozbiljne ili dugoročne, predviđa se da će preokret propadanja mišića ubrzati oporavak i funkcionalnost pacijenata koji su doživeli gubitak mišića bez obzira na uzrok tog gubitka.

Kombinovana terapija

[0138] Ovo lečenje može da se kombinuje sa bilo kojim lečenjem usmerenim na primarni uzrok procesa propadanja mišića. Takve kombinacije mogu da uključuju kortikosteroide, imunosupresivne agense, anticitokine, antikancerogene lekove; faktore rasta kao što je eritropoeitin, G-CSF, GM-CSF, ili drugi; lekove koji se koriste u lečenju dijabetesa (uključujući insulin i oralne hipoglikemijske agense), lekove protiv tuberkuloze i antibiotike. Kombinacije mogu da uključuju i male molekule i biomolekulske agense.

[0139] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu se primenjivati kao jedini aktivni agens ili kombinovano, npr. kao adjuvans ili u kombinaciji sa drugim lekovima, npr. ActRIIB antitelom, ActRIIA antitelom, rastvorljivim ActRIIB mimetskim mamcem, antimiostatinskim antitelom, miostatinskim propeptidom, miostatinskim proteinom mamcem koji vezuje ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonistom, grelinskim agonistom, SARM, GH agonistom/mimetikom ili folistatinom. Na primer, lek iz pronalaska može da se koristi u kombinaciji sa ActRIIB antitelom, kako je opisano u WO2010125003.

Sekvence

NA INI ZA SPROVOĐENJE PRONALASKA

[0140] Podrazumeva se da je pronalazak opisan samo putem primera i da mogu biti načinjene modifikacije, a da se pri tom ostane u opsegu pronalaska.

PRIMERI

[0141] Ovde prikazane rekombinantne varijante IGF-1 imaju afinitet proteinu sličnog receptora divljeg tipa (slike 1), ali pokazuju bolji in vivo farmakokinetički profil od IGF-1 divljeg tipa (slika 7) i mogu se koristiti za sprečavanje mišićne atrofije uz ređe doze (slika 8). Za razliku od nekih varijanti IGF-1 iz prethodnog stanja tehnike, koje stimulišu fosforilaciju insulinskog receptora (InsR) dovodeći do rizika od hipoglikemije, prikazani proteinski prekursori IGF-1 koji mutiraju na položaju G42 (delecija ili specifična supstitucija) ispoljavaju sposobnost za stimulisanje fosforilacije insulinskog receptora (InsR) kao divlji tip, što umanjuje pomenuti rizik od hipoglikemije (slika 5/6/19). Nadalje, za razliku od hIGF-1 divljeg tipa ili nekih od njegovih varijanti iz prethodnog stanja tehnike, ovde prikazane varijante IGF-1 mogu da se proizvedu sa velikim titrima i bez degradacije u ćelijskim sistemima sisara, što omogućava proizvodnju u industrijskom obimu.

DEO A: Opšta metodologija

A1 Reagensi

[0142] Rekombinantni humani IGF-1 je nabavljen od kompanije Novartis AG, a rekombinantni humani insulin je kupljen od kompanije Promocell (br. C-60212).

A2 Konstrukcija vektora

[0143] Izvodljivo je nekoliko sklopova vektora u skladu sa metodologijom predmetnog pronalaska. Pošto su individualni elementi vektora poznati iz prethodnog stanja tehnike, pogodni vektori mogu biti sastavljeni npr. sekvenciranjem ili amplifikacijom i odgovarajućim kloniranjem osnovnih genetskih elemenata i ekspresionih kaseta sa poželjnom orijentacijom. Odgovarajuće metode kloniranja su poslednja reč tehnike, a sekvenca goreopisanih genetskih elemenata je takođe opisana u prethodnom stanju tehnike. Zato je nastanak vektorskih konstrukcija opisan putem primera. Međutim, stručnjaci za ovu oblast znaju da je pogodno i dostupno nekoliko drugih otelotvorenja i načina za dobijanje odgovarajućih vektora. Svi ekspresioni vektori sisara (npr. pBW679) opisani u ovom odeljku su zasnovani na ekspresionim vektorima sisara opisanim u WO2009080720, posebno na slici 1, u tabeli 1 i odeljku sa primerima II: vektorske konstrukcije (strane 21-31).

[0144] De novo sinteza hIGF1-Ea-delGPE-R37A) (ID BR. SEKV: 87) je poručena od kompanije The Blue Heron Biotech, uz sekvencu 5'Kozak bočno (CCCGCCCGCCCACC) (ID BR. SEKV:112) i 5'HindIII/BamHI i 3'EcoRI restrikciona mesta su isporučena u vektoru Blue Heron pUC. Ponovno kloniranje u vektor pcDNA3.1 (Invitrogen, Life Technologies) je dovršeno reakcijom ligacije sa kompatibilnim 5' BamHI i 3'EcoRI mestima kloniranja.

Konstrukt je u potpunosti sekvenciono kontrolisan pomoću specifičnih prajmera T7 i BGHA. Zatim je izvršena mutageneza usmerena mestom (Quick Change II site directed Mutagenesis Kit, Stratagene) kako bi se uklonila dva ostatka R71 i S72 koristeći prethodni konstrukt hIGF1-Ea-delGPE-R37A/pCDNA3.1. Dobijeni konstrukt hIGF1-Ea-delGPE-R37A-delRS je upotrebljen za ponovno kloniranje hIGF1-Ea (delGPE, R37A, delRS) u ekspresioni vektor sisara pRS5a (vektor vlasništvo kompanije Novartis, NPL000961). PRS5a je ekspresioni vektor sisara pod CMV promoterom, mestom poliadenilacije iz BGH gena (goveđi hormon rasta) i otpornošću na ampicilin. hIGF1-Ea (delGPE, R37A, delRS)/pRS5a je arhiviran kao NPL009759 (vektor vlasništvo kompanije Novartis).

[0145] hIGF1-Ea (del GPE, R37A, del RS) je amplifikovan iz NPL009759. PCR proizvod je digestovan pomoću 5'HindIII/3'BamHI i kloniran u pRS5a-hIgG1 LALA vektor (NPL012935, vektor vlasništvo kompanije Novartis). Izvedeno je nekoliko ciklusa mutageneze usmerene mestom, kao što je gore opisano, dajući plazmid za hIGF1-Ea (delGPE, R37A, delRS)-[R74Q-R78Q -R104Q] (NPL017580, vektor vlasništvo kompanije Novartis). Plazmid je korišćen kao osnova za dalja kloniranja opisana u nastavku.

[0146] Plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut2: PCR fragment koji sadrži G42S mutacije je amplifikovan iz NPL017580 pomoću mutagenih oligonukleotida (5' TGACACTATAGAATAACATC CACTTTGCC 3') (ID BR. SEKV: 88) i (5' TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACG ATGCTTGTCTGAGGCGCCGCCC 3') (ID BR. SEKV: 89). BlpI i BspEI restrikciona mesta endonukleaze su korišćena za kloniranje generisanog PCR fragmenta nazad u NPL017580.

[0147] Plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut3: PCR fragment koji sadrži G42P mutacije je amplifikovan iz NPL017580 pomoću mutagenih oligonukleotida (5' TGACACTATAGAATAACATCCA CTTTGCC 3') (ID BR. SEKV: 90) i (5' TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGAT GGGTGTCTGAGGCGCCGCCC 3') (ID BR. SEKV: 91). BlpI i BspEI restrikciona mesta endonukleaze su korišćena za kloniranje generisanog PCR fragmenta nazad u NPL017580.

[0148] Plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut4: PCR fragment koji sadrži A37E mutaciju je amplifikovan iz NPL017580 pomoću mutagenih oligonukleotida (5' TGACACTATAGAATAACATCCA CTTTGCC 3') (ID BR. SEKV: 92) i (5'

TCACAGCTCCGGAAGCAGCACTCATCCACGAT

GCCTGTCTGAGGCGCMNNCCGACTGCTGGAGCCATACCCTGTGG) (ID BR. SEKV: 93). Klimavi kodon je dat u IUPAC nomenklaturi, gde M označava baze A ili C, i N označava baze A, C, G ili T. Drugi oligonukleotid bi imao klimavi kodon na položaju 37. BlpI i BspEI restrikciona mesta endonukleaze su korišćena za kloniranje generisanog PCR fragmenta nazad u NPL017580. A37E supstitucija je izabrana pomoću sekvenciranja.

[0149] Plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut12: PCR fragment koji sadrži R36A-A37R mutaciju je amplifikovan iz NPL017580 pomoću mutagenih oligonukleotida (5' TGACACTATAGAATAAC AT CCACTTTGCC 3') (ID BR. SEKV: 94) i (5' TGTCTGAGGCGCCCGCGCACTGCTGGA GCCATACCCTGTGGGC 3') (ID BR. SEKV: 95). BlpI i SfoI restrikciona mesta endonukleaze su korišćena za kloniranje generisanog PCR fragmenta nazad u NPL017580.

[0150] Plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut13: PCR fragment koji sadrži R36Q mutaciju je amplifikovan iz NPL017580 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) pomoću mutagenih oligonukleotida (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (ID BR. SEKV: 96) i (5' TGTCTGAGGCGCCGCCTGACTGCTG GAGCCATACCCTGTGG 3') (ID BR. SEKV: 97); BlpI i SfoI restrikciona mesta endonukleaze su korišćena za kloniranje generisanog PCR fragmenta nazad u NPL017580.

[0151] Varijante hIGF1-Ea-hFc mut4 i mut13 su dalje modifikovane da bi se uveo različiti linker (tj. ID BR. SEKV: 22 i 23): sekvence linkera koje se protežu od BspEI restrikcionog mesta endonukleaze (koje odgovara ostatku IGF1 F49-R50) do AleI (u Fc delu) poručene su od kompanije Geneart. Linkeri su klonirani standardnim isecanjem i lepljenjem, dajući plazmide za hIGF1-Ea-hFc_mut4_E, hIGF1-Ea-hFc_mut13_E i hIGF1-Ea-hFc_mut13_A. U sledećem koraku, uvedena je mutacija G42S.

[0152] Plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut4/2_E i hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_E: PCR fragment koji sadrži G42S mutacije je amplifikovan iz plazmida hIGF1-Ea-hFc_mut2 pomoću oligonukleotida (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (ID BR. SEKV: 88) i (5' CGGTACGTGC TGGCGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTG 3') (ID BR. SEKV: 98). BspEI i SfoI restrikciona mesta endonukleaze su korišćena za kloniranje generisanog PCR fragmenta u plazmide hIGF1-Ea-hFc_mut4_E i hIGF1-Ea-hFc_mut13_E.

[0153] Plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_A: PCR fragmenti koji sadrže G42S-R36Q mutacije su amplifikovani iz plazmida hIGF1-Ea-hFc_mut13/2_E pomoću oligonukleotida (5' TGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCC 3') (ID BR. SEKV: 88) i (5' CGGTACGTGC TGGCGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTG 3') (ID BR. SEKV: 98). BspEI i SfoI restrikciona mesta endonukleaze su korišćena za kloniranje generisanog PCR fragmenta u plazmid hIGF1-Ea-hFc_mut13_A.

A3 Proizvodnja rekombinantnog proteina

Proizvodnja malog obima:

[0154] Dve različite metode transfekcije, FuGene i metoda zasnovana na polietileniminu (PEI), korišćene su za proizvodnju varijanti IGF1-Fc.

[0155] 100 ml ćelijske kulture HEK 293F je transficirano sa (PEI) na sledeći način: 100 µg plazmidske DNK u vodi razblaženo je u 7 ml FreeStyle ekspresionog medijuma (GIBCO, kat. 12338026) tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi.300 µg PEI (iz 1 mg/ml osnovnog rastvora PEI) razblaženo je u 7 ml FreeStyle ekspresionog medijuma na sobnoj temperaturi. Rastvori DNK i PEI su zatim pomešani i inkubirani 15 minuta, pre nego što su dodati u 36 ml HEK 293F ćelijskog medijuma pri gustini od oko 1,4x10<6>ćelija/ml u boci za mućkanje od 500 ml. Medijum je inkubiran u Kinerovom šejkeru ISF1-X (Kuehner) podešenom na 100 o/min, 6% CO2 i 37°C tokom 6 dana. Varijante IGF1-Fc su zatim prečišćene iz supernatanata čiste ćelijske kulture pomoću Protein A hromatografije korišćenjem kolone HiTrap MabSelect Sure od 1ml (GE Healthcare) na sistemu AKTA Avant (GE Healthcare). Nakon početnog ispiranja PBS-om, vezani materijal je eluiran 50 mM citratom, pH 3,0, sa 150 mM NaCl i odmah neutralisan.

[0156] 100 ml ćelijske kulture HEK 293F je transficirano transfekcionim reagensom FuGENE HD (Roche) na sledeći način: 100 µg plazmidske DNK u vodi je razblaženo u 1 ml FreeStyle ekspresionog medijuma (GIBCO, kat.12338026) koji se čuva na sobnoj temperaturi. 400 µl FuGENE je dodato u razblaženu DNK i smeša je inkubirana 15 minuta na sobnoj temperaturi. 1,4 ml smeše DNK-FuGENE je zatim dodato u 98,6 ml ćelijske kulture HEK 293F (Invitrogen) u bocu od 500 ml sa gustinom ćelija od 0,5x10<6>ćelija/ml. Medijum je inkubiran u Kinerovom šejkeru ISF1-X (Kuehner) podešenom na 100 o/min, 6% CO2 i 37°C tokom 7 dana. Varijante IGF1-Fc su zatim prečišćene iz supernatanata čiste ćelijske kulture pomoću Protein A hromatografije korišćenjem kolone HiTrap MabSelect Sure od 1ml (GE Healthcare) na sistemu AKTA Avant (GE Healthcare). Nakon početnog ispiranja PBS-om, vezani materijal je eluiran 50 mM citratom, pH 3,0, sa 150 mM NaCl i odmah neutralisan.

Proizvodnja srednjeg obima:

[0157] 9,5 l ćelijske kulture HEK 293 je transficirano polietileniminom (PEI) na sledeći način: 10 mg plazmidske DNK u TE puferu je na sobnoj temperaturi inkubirano u 250 ml medijuma OptiMEM1 [Gibco kat. br.11058-021] tokom 5 minuta.20 mg polietilenimina PEI (iz osnovnog rastvora PEI, 1 mg/ml) je na sobnoj temperaturi dodato u 250 ml medijuma OptiMEM1 (Gibco kat. br.11058-021). Rastvori DNK i PEI su zatim pomešani i inkubirani tokom 15 minuta. 500 ml smeše DNK-PEI je zatim dodato u 9,5 l ćelijske kulture HEK pri gustini između 0,75x106 ćelija/ml i 1,25x106 ćelija/ml. Transficirane ćelije su inokulisane na 37<o>C u kesi od 20 l Wave Cellbag (GE Healthcare, br. CB0020L10-03). Kesa Cellbag je postavljena na sistem Wave 20/50 EHT podešen na 25 o/min, ugao ljuljanja 7<o>, 7% CO2, 0,50 l/min vazduha, i 37<o>C. Fuzioni konstrukti Fc su prikupljeni iz supernatanata koncentrisane kulture pomoću Protein A hromatografije. Nakon početnog ispiranja PBS-om, vezani materijal je eluiran 50 mM citratom, pH 2,7, sa 140 mM NaCl i odmah neutralisan. Neutralisana frakcija je onda koncentrovana ultrafiltracijom i odvojene su frakcije na koloni Superdex 200 u PBS-u da bi se uklonili neki kontaminirajući agregati. Čistoća materijala je bila >95% kako je procenjeno SDS-PAGE i LC-MS analizom.

A4 Određivanje stepena agregacije pomoću SEC-MALS

[0158] Varijante IGF-1-Fc prečišćene pomoću proteina A ispitane su na stepen agregacije pomoću gel filtracije povezane sa detektorom višeugaonog rasipanja svetlosti (SEC-MALS); merenja su izvršena na sistemu Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies) povezanim sa detektorom trougaonog rasipanja svetlosti (miniDAWN Treos, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, SAD). Koncentracija uzorka je praćena onlajn pomoću diferencijalnog refraktometra (Optilab rEX, Wyatt Technology) koristeći vrednost inkrementa specifičnog indeksa prelamanja (dn/dc) od 0,186 ml/g. Zapremine uzoraka od 50 ul su injektovane na kolonu Superdex 20010/300 GL (GE Healthcare). Podaci su snimani i obrađivani pomoću softvera ASTRA V (Wyatt Technology). Da bi se odredila zapremina kašnjenja detektora i koeficijenti normalizacije za MALS detektor, kao referenca je korišćen uzorak BSA (Sigma, A8531). Nije primenjen ni despajking ni korekcija širenja trake.

A5 Ćelijska kultura

[0159] Ćelije humanog skeletnog mišića (skMC) su nabavljene od kompanije Cambrex (br. CC-2561). Primarni humani mioblasti su uzgajani u medijumu za rast [SkGM koji sadrži 20% fetalnog goveđeg seruma (FBS, br.2-01F40-1, Amimed) i 0,1% gentamicina]. Nakon 4-5 dana (na 37°C, 5% CO2 i 95% vlažnosti), ćelije su zasejane u medijumu za rast pri gustini od 150.000 ćelija/bunarčiću i uzgajane (na 37°C, 5% CO2 i 95% vlažnosti). Trećeg dana nakon zasejavanja, skMC mioblasti su upotrebljeni za eksperimente signalizacije. NIH3T3-IGF-1R i NIH3T3-InsR su držani u D-MEM-u koji sadrži 10% FBS, 100 U/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Primarni mioblasti majmuna cinomolgus su izolovani iz trbušastog mišića lista makaki rakojeda, majmuna cinomolgus. Ćelije su uzgajane u SkBM-u koji sadrži 20% fetalnog goveđeg seruma (FBS, br.2-01F40-1, Amimed) i 0,1% gentamicina (Life Technologies, br. 15750-037). 3T3-L1 adipociti i C2C12 ćelije su nabavljene od kompanije American Type Culture collection (ATCC-CL-173, odnosno ATCC; br.91031101). 3T3-L1 adipociti su držani u DMEM-u sa velikim sadržajem glukoze, 1,5 g/litru NaHCO3 (ATTC br.

30-2002), i diferencijacija je aktivirana dodavanjem DMEM-a koji sadrži 10% FCS, 1% penicilina/streptomicina, 0,5 mM IBMX, 1 µM deksametazona. C2C12 mioblasti su diferencirani trećeg dana posle zasejavanja. Da bi se to postiglo, ćelije su jednom isprane diferencijacionim medijumom (DM) koji sadrži DMEM sa dodatkom 2% toplotno inaktiviranog konjskog seruma (HS; br. US 14-403F, Cambrex), 1% penicilina/streptomicina i 1% glutamina i zatim inkubirane u DM-u tokom 72 sata na 37°C, 5% CO2 i 95% vlažnosti.

A6 Biacore

[0160] Osobine vezivanja su okarakterisane pomoću SPR koristeći instrument Biacore T200 na 25 °C. Tri CM5 čipa (GE, BR-1005-30) pripremljena su primenom standardnog postupka kuplovanja amina. Protočna ćelija 1 je slepo imobilisana da bi se koristila kao referenca, dok su IGF-1 i hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A imobilisani na merne protočne ćelije 2 i 3. Stepen imobilizacije je prilagođen individualnoj interakciji, i iznosio je od 20 - 143 RU (IGF-1) i od 32 - 113 RU (hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A). Serije razblaženja rek. humanog IGF-1R (R&D Systems, 391-GR) pripremljene su u radnom puferu, 1x HBS-EP+ (Teknova, H8022) koji je sadržao 30 mM citrat i 0,05 % BSA, i injektovane na čip pri protoku od 50 µl/min. Opseg koncentracije analita je prilagođen individualnoj interakciji, i iznosio je od 1000 - 3,9 nM (IGF-1R). Ligandi su regenerisani injektovanjem blagog Ag/Ab elucionog pufera (Thermo Scientific, 21027) tokom 90 s na 50 µl/min. Kinetičke konstante brzine i KD izračunate su podešavanjem senzorgrama sa dvostrukim referencama na 1:1 model vezivanja.

A7 ELISA

[0161] Radi analize fosforilacije IGF-1R, ćelije nanete na ploče sa 6-bunarčića uzgajane su u medijumu tokom 24 (NIH3T3-IGF-1R) ili 72 sata (primarni mioblasti čoveka i cinomolgusa). Ćelije su izgladnjivane tokom 24 (NIH3T3-IGF-1R) ili 4 (primarni mioblasti čoveka i cinomolgusa) sata i zatim stimulisane navedenim peptidima tokom 15 min na 37°C. Ćelije su lizirane PhosphoSafe puferom (Cell Signaling) koji je sadržao različite inhibitore proteaza, i izbistrene centrifugiranjem na 14.000 x g tokom 15 minuta na 4°C, i nivoi fosforilacije IGF-1R su analizirani putem ELISA, pomoću kompleta DuoSet IC human phosphor-IGF-1R (R&D Systems).

[0162] Radi analize fosforilacije insulinskog receptora, NIH3T3-InsR ćelije su nanete na ploču pri gustini od 0,2 x 10<6>ćelija po bunarčiću ploče sa 6-bunarčića i uzgajane u medijumu tokom 24 sata. Ćelije su izgladnjivane tokom 18 sati u medijumu bez seruma i zatim stimulisane različitim ligandima na 37°C tokom 10 minuta. Ćelije su lizirane kao što je gore opisano, i nivoi fosforilacije InsR su analizirani putem ELISA, pomoću kompleta DuoSet IC human phosphor-InsR ELISA (R&D Systems).

A8 Preuzimanje glukoze

[0163] Da bi se izmerilo preuzimanje glukoze, 3T3-L1 adipociti i C2C12 ćelije mišićnih cevčica miša su zasejane na ploče sa 24 bunarčića i uzgajane u DMEM-u bez seruma tokom 4 sata. DMEM bez seruma je zatim zamenjen KRP puferom (130 mM NaCl, 1,3 mM MgSO4, 1,3 mM CaCl, 5 mM KCl i 10 mM Na2HPO4) ili HBS-om (140 mM NaCl, 2,5 mM MgSO4, 1,0 mM CaCl, 5 mM KCl i 10 mM Hepes) za 3T3-L1 adipocite, odnosno C2C12. Ćelije su tretirane naznačenim peptidima tokom 1 sata na 37°C. Preuzimanje glukoze je izmereno dodavanjem 0,4 (adipociti) ili 0,8 (C2C12) µCi [3H] 2-dezoksi-D-glukoze i 0,1 (adipociti) ili 0,01 (C2C12) mM 2-dezoksi-D-glukoze tokom 10 (adipociti) ili 5 (C2C12) minuta na sobnoj temperaturi. Medijum je usisan, i test je prekinut dodavanjem KRP ili HBS pufera koji sadrži 1 µM citohalazin B. Ćelije su zatim isprane ledenim PBS-om i lizirane pomoću 0,2 M NaOH, a radioaktivnost je analizirana pomoću scintilacionog brojača (vidi slike 5/6).

A9 Farmakokinetički profili

[0164] Odrasli mužjaci pacova (n=3/grupi) primili su intravenski (i.v.) bolus ili subkutanu injekciju hIGF-1-Ea-Fc_mut 13/2_A ili hIGF-1-Ea-Fc_mut 04/2_E od 10 mg/kg ili hIGF-1 (1 mg/kg). Serijski uzorci krvi su prikupljeni 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 168 i 336 sati nakon primene varijanti IGF-1 ili 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8 i 24 sata nakon primene hIGF-1.

Koncentracije rekombinantnih proteina u serumu su utvrđene pomoću ELISA.

A10 Dejstvo hIGF-1-Ea-Fc mut 13/2 A na mišićnu atrofiju indukovanu deksametazonom.

[0165] Deksametazon (deks.) je rastvoren u PBS-u da bi se dobila doza od 0,075 mg/kg/dan sa Alzet modelom 2ML2 tokom 28 dana. Deks. je kombinovan u minipumpama sa hIGF-1 u dozi od 3,8 mg/kg/dan u grupi C. Lečenje deksametazonom je kombinovano sa subkutanim lečenjem svakog drugog dana sa hIGF1-Ea-Fc_13/2_A u grupama D, E i F u dozi od 3, 10, odnosno 30 mg/kg. Pumpe su napunjene rastvorom i ostavljene nekoliko sati na 37°C u PBS-u do hirurške implantacije. Pacovi su subkutano lečeni buprenorfinom u dozi od 0,02 mg/kg sa zapreminom od 1 ml/kg najmanje 30 minuta pre operacije, a zatim su pumpe napunjene gorenavedenim rastvorom subkutano implantirane u leđa pacova pod anestezijom izofluranom u koncentraciji od 3%. Buprenorfin je subkutano davan pacovima 24 i 48 h nakon operacije. Pacovi iz grupe A, B i C su svakodnevno lečeni subkutanom injekcijom PBS-a. Telesne težine su merene dvaput nedeljno. Četiri nedelje nakon lečenja, pacovi su eutanazirani sa CO2 i mišići su disecirani i izmereni.

DEO B: Radni primeri

[0166] Molekul iz prethodnog stanja tehnike koji sadrži Ea-peptid, pri čemu su proteinski ostaci E3, R71 i S72 izbačeni i aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (hIGF1-Ea-Fcmut 3) (ID BR. SEKV: 27) je proizveden i testiran.

Primer 1: Priprema ekspresionih vektora DNK

[0167]

1.1 Ekspresioni vektor DNK koji kodira polipeptidni prekursor hIGF-1-Ea koji sadrži sledeće modifikacije je konstruisan kako je prethodno opisano: hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_A (uključujući Fc deo hIgG1 sa utišavajućom mutacijom efektorske funkcije L234A L235A ("LALA") (ID BR. SEKV: 9); pri čemu su G1, P2, E3 izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom, i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q); i koji je povezan sa Fc regionom IgG1 LALA.

To je dalo sledeću izlučenu proteinsku sekvencu:

1.2 Ekspresioni vektor DNK koji kodira polipeptidni prekursor hIGF-1-Ea koji sadrži sledeće modifikacije je konstruisan kako je prethodno opisano u odeljku A2:

hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_E (uključujući Fc region hIgG1 LALA): proteinski prekursor humanog IGF-1, pri čemu su G1, P2, E3 izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q); i koji je povezan sa Fc regionom IgG1 LALA.

To je dalo sledeću izlučenu proteinsku sekvencu:

Na osnovu prethodno navedenih principa, proizvedeni su sledeći dodatni proteini:

Primer 54 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_E; ID BR. SEKV: 8)

Primer 56 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_C; ID BR. SEKV: 10)

Primer 50 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F; ID BR. SEKV: 11)

Primer 58 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_A; ID BR. SEKV: 13)

Primer 59 (hIgF1-Ea-Fc_mut 04/2_F; ID BR. SEKV: 14)

1.3 Ekspresioni vektor DNK koji kodira polipeptid hIGF-1 koji sadrži sledeće modifikacije je konstruisan pomoću metoda vektorske konstrukcije DNK / DNK manipulacije poznatih u struci: hIgF1 G42S (ID BR. SEKV: 117);

To je dalo sledeću proteinsku sekvencu:

1.4 Ekspresioni vektor DNK koji kodira polipeptid hIGF-1 koji sadrži sledeće modifikacije je konstruisan pomoću metoda vektorske konstrukcije DNK / DNK manipulacije poznatih u struci: hIGF1-Ea-mut 03-G42S (ID BR. SEKV: 118);

To je dalo sledeću proteinsku sekvencu:

Primer 2: Izazov proteaze varijanti IGF-1-Fc

[0168] Proteini proizvedeni u ekspresionim sistemima ćelija sisara, kao što su, na primer, CHO, mogu da trpe proteolitičku degradaciju tokom ekspresije. Da bi se efikasno procenila potencijalna podložnost proteaze tokom proizvodnje na standardizovan način, razvili smo test izazova proteaze pomoću prečišćenog proteina i kondicioniranih medijuma iz ćelijskih kultura CHO. Poređenje tog testa sa obrascem cepanja primećenim za varijante IGF-1-Fc proizvedene u CHO ćeliji obezbedilo je validaciju testa. Ukratko, CHO ćelije su uzgajane (37°C, 6% CO2, 85% rel. vlažnosti, 90 -150 o/min) u CHODM122 medijumu od 2E5 ćelija/ml do gustine od 1E7 ćelija/ml. Izbistreni supernatant obezbeđuje kondicionirani medijum korišćen za test. Varijante IGF-1-Fc su prečišćene kako je prethodno opisano (A3) i spajkovane pri koncentraciji od 100 ug/ml u kondicioniranom medijumu ili PBS-u kao kontrola. Nakon sterilne filtracije, uzorci su inkubirani na 37°C do 20 dana i uzeti su uzorci za analizu u različitim vremenskim trenucima. Različiti degradacioni proizvodi se mogu dobro izolovati standardnim SDS-PAGE tehnikama (NuPAGE Bis-Tris, Invitrogen) i intenzitet degradacionih traka je kvantifikovan denzitometrijski. Rezultati su prikazani na Slici 17.

Primer 3: Veliki afinitet vezivanja hIGF-1 i analoga za rekombinantni humani IGF-1R

[0169] Veliki afinitet vezivanja varijanti hIGF-1 i IGF-1 za rhIGF1R meren je upotrebom površinske plazmonske rezonance (Biacore). Izveden je test direktnog vezivanja. Humani IGF-1-Ea_Fc_Mut_13/2_A i hIGF-1 su imobilisani na čipu, i IGF-1 receptor je poslužio kao analit u rastvoru. Dobijeni senzorgrami su ubačeni u interakcioni model 1:1 kako bi se izračunale ravnotežne konstante disocijacije (KD). Rezultati pokazuju da je vezivanje hIGF-1-Ea_Fc_Mut_13/2_A za IGF-1R uporedivo sa hIGF-1 (Slika 1).

Primer 4: Indukcija fosforilacije IGF-1R

[0170] Sposobnost varijanti hIGF-1 i hIGF-1 da stimulišu fosforilaciju IGF-1R je prvi put procenjena u NIH3T3 ćelijama koje prekomerno eksprimiraju humani IGF-1R (NIH3T3-IGF-1R) pomoću ELISA. U ovim ćelijama, fosforilacija IGF-1R je svim testiranim peptidima indukovana na način zavistan od koncentracije. Logistička kriva postavljena za prosek svih podataka ELISA testa pokazala je da je potentnost (EC50) hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, R77Q-Fc i hIGF1-Ea -Fc_mut_04/2_E umanjena u poređenju sa hIGF-1 (Slika 2A-B).

Međutim, logistička kriva postavljena za prosek svih podataka ELISA testa dala je veoma uporedivu vrednost maksimalnog odgovora za sve testirane peptide (Slika 2C-D). Sposobnost varijanti hIGF-1 i hIGF-1 da stimulišu fosforilaciju IGF-1R je procenjena u primarnim humanim mioblastima i u mioblastima majmuna cinomolgus. U ovim ćelijama, fosforilacija IGF-1R je svim testiranim peptidima indukovana na način zavistan od koncentracije (Slika 4B-C). Logistička kriva postavljena za prosek svih podataka ELISA testa pokazala je da je potentnost (EC50) varijanti hIGF-1 bila E i bila je umanjena u poređenju sa hIGF-1 (Slika 4A). Međutim, logistička kriva postavljena za prosek svih podataka ELISA testa dala je veoma uporedivu vrednost maksimalnog odgovora za sve testirane peptide (Slika 4).

Primer 5: Specifičnost u odnosu na insulinski receptor

[0171] Da bi se ispitalo da li aminokiselinske modifikacije varijanti IGF-1 utiču na specifičnost receptora, dejstvo varijanti peptida IGF-1 na fosforilaciju InsR je analizirano u NIH3T3 koje preterano eksprimiraju InsR putem ELISA. Tretirali smo transfektante ćelija NIH3T3-InsR različitim koncentracijama varijanti IGF-1, hIGF-1 i insulinom. Korišćene su ekvimolarne koncentracije naznačenih peptida. Rezultati tih eksperimenata su prikazani na Slici 3/18. Modifikacije su uticale na specifičnost receptora većine varijanti IGF-1, sa izuzetkom varijanti sa G42S mutacijom (hIGF1-Ea -Fc_mut_02, hIGF1-Ea -Fc_mut_03, hIGF1-Ea -Fc_mut_04/2_E i hIGF1-Ea -Fc_mut_13/2_A), za koje je otkriveno da zadržavaju specifičnost receptora i da su slabi induktori fosforilacije InsR čak i u koncentracijama pri kojima bi insulin dao maksimalne odgovore. Iznenađujuće, pokazalo se da su hIGF1-Ea Fc_mut_13/2_A i hIGF1-Ea Fc_mut_04/2_E značajno manje potentne od IGF-1 na efektorske funkcije koje pokreće ubrzano vezivanje insulinskog receptora (npr. preuzimanje glukoze u diferenciranim adipocitima), kako je prikazano na Slici 5B i D i na Slici 6.

Nasuprot tome, hIGF1-Ea Fc_mut_13/2_A i hIGF1-Ea Fc_mut_04/2_E i hIGF-1 su bili ekvipotentni za IGF-1R-posredovane funkcije, poput preuzimanja glukoze u C2C12 mišićnim cevčicama (Slika 5A i C). Uvođenje G42S mutacije u protein IGF-1 (što dovodi do IGF-1 G42S varijante ID BR. SEKV: 117) kao i u protein hIGF1-Ea-mut 03 (što dovodi do hIGF1-Ea-mut 03- G42S varijante ID BR. SEKV: 118) umanjilo je fosforilaciju InsR (Slika 18) u NIH3T3-InsR ćelijama. Nadalje, pomenute mutacije su uticale na preuzimanje glukoze u adipocitima, odnosno C2C12 mišićnim cevčicama (Slika 19)

Primer 6: Određivanje koncentracije u serumu

[0172] Koncentracije u serumu hIGF1-Ea-Fc-mut_13/2_A i hIGF1-Ea.Fc_mut_04/2_E nakon pojedinačne i.v. ili s.c. primene doze kod mužjaka Fišerovih pacova (n=3) određena je pomoću ELISA testa specifičnog za hIGF-1Ea 3mut (za više detalja videti A5 iznad).

Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slikama 7-A i 7-B. Terminalni poluživot je oko 75,3 sata, odnosno 50,1 sat. Maksimalna koncentracija je dostignuta nakon 8, odnosno 24 sata (Tmax) od primene s.c. doze. Nasuprot tome, nakon intravenske primene hIGF-1 (1,0 mg/kg), nivoi hIGF-1 mogli su da se kvantifikuju u rasponu od 0-8 sati. Nakon što je dostignuto Tmax (0,083 h), primećeno je ubrzano opadanje koncentracije peptida u serumu, što je dovelo do prividnog terminalnog poluživota od 1,81 h. Nakon subkutane primene hIGF-1 (1,0 mg/kg), nivoi u serumu su mogli da se kvantifikuju do 8 h posle doziranja, i maksimalna koncentracija je uočena 0,5 h nakon doze. Tako, analozi IGF-1 pokazuju znatno poboljšan farmakokinetički profil u poređenju sa humanim IGF-1.

Primer 7: Dejstvo hIGF-1-Ea-Fc_mut_13/2_A na mišićnu atrofiju indukovanu deksametazonom

[0173] Pošto se pokazalo da IGF-1 stimuliše sintezu proteina i inhibira degradaciju proteina kod skeletnih mišića, ispitali smo da li primena hIGF-1-Ea_Fc_mut_13/2_A na pacovima tretiranim deksametazonom može da spreči atrofiju mišića. Mužjaci Vistar pacova su putem Alzet pumpe dobijali neprekidnu infuziju 75 µg deksametazona/kg/dan, samostalno ili zajedno sa nosačem (PBS), ili hIGF-1. Dodatna grupa životinja koja je dobijala infuziju deksametazona, kao što je gore opisano, svaki drugi dan je dobijala s.c. injekciju hIGF-1-Ea_Fc_mut_13/2_A. Sve životinje su tretirane 28 dana, a zatim žrtvovane. Telesna težina je posmatrana na početku eksperimenta, a zatim 28 dana nakon injekcije.

[0174] Kao što je očekivano, uočeno je značajno smanjenje telesne i mišićne mase kod pacova tretiranih deksametazonom u poređenju sa kontrolnim uzorkom sa nosačem (Slika 8). Injekcija hIGF-1-Ea_Fc_mut_13/2_A je značajno smanjila gubitak telesne i mišićne mase (Slika 8).

[0175] Pored prethodno opisanih varijanti polipeptidnih prekursora hIGF-1-Ea, sledeće dodatne varijante proteina se mogu proizvesti i koristiti prema pronalasku:

Primer 8

[0176] (2b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

Primer 9

[0177] (4b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

Primer 10

[0178] (5b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom, G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

Primer 11

[0179] (6b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

Primer 12

[0180] (8b) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

Primer 13

[0181] (9b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom, G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline R71 i S72 su izbačene.

Primer 14

[0182] (13b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 15

[0183] (14b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 16

[0184] (15b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 17

[0185] (16b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R77 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 18

[0186] (17b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 19

[0187] (18b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 20

[0188] (19b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 21

[0189] (20b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 22

[0190] (21b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 23

[0191] (22b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 24

[0192] (23b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 25

[0193] (24b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 26

[0194] (25b) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 27

[0195] (26b) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 28

[0196] (27b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom, G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 29

[0197] (28b) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 30

[0198] (29b) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom, G42 je supstituisan serinom, aminokiseline R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 31

[0199] (2c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

Primer 32

[0200] (4c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

Primer 33

[0201] (5c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom, G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

Primer 34

[0202] (6c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

Primer 35

[0203] (8c) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

Primer 36

[0204] (9c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom, G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene.

Primer 37

[0205] (13c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 38

[0206] (14c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 39

[0207] (15c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 40

[0208] (16c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 41

[0209] (17c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 42

[0210] (18c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 43

[0211] (19c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina

R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 44

[0212] (20c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline

R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 45

[0213] (21c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana alaninom (A), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline

R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin

Primer 46

[0214] (22c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina

R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 47

[0215] (23c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je serinom, i aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S7272 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 48

[0216] (24c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 49

[0217] (25c) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiselina R74 je mutirana u glutamin (Q).

Primer 50

[0218] (26c) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 51

[0219] (27c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom, G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74 i R77 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 52

[0220] (28c) G1, P2, E3 su izbačeni, obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane glutaminom (Q), G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 53

[0221] (29c) G1, P2, E3 su izbačeni, aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q), R37 je supstituisan alaninom, G42 je supstituisan serinom, aminokiseline K68, S69, A70, R71 i S72 su izbačene i aminokiseline R74, R77 i R104 su mutirane u glutamin (Q).

Primer 54: Ekspresija rekombinantnog IGF-1 u ćelijskim linijama CHO deficitarnim IGF-1 receptorom.

[0222] Ekspresija rekombinantnog IGF-1 u ćelijskim linijama CHO dovela je do inhibicije ćelijskog rasta i malog titra. Na slici 11 prikazano je merenje titra hIGF-1Ea 3mut (ID BR. SEKV: 27) tokom bioreaktorskog procesa. Maksimalno merenje titra hIGF-1Ea 3mut je bilo 8 ug/ml što odgovara 100 mg/l titra antitela (na osnovu molarne mase). Prosečno merenje titra rekombinantnog antitela u bioreaktorskom procesu je oko 3 g/l. Jedan uzrok malog titra IGF-1 je smanjen ćelijski rast i mala ćelijska vijabilnost IGF-1 eksprimirajućih ćelija. Tokom procesa ekspresije antitela, CHO-K1 izvedene ćelije rastu do 2-2,5 x 10<7>ćelija/ml, i ćelijska vijabilnost je preko 97% tokom prvih 230-260 h uzgajanja. Nasuprot tome, CHO-K1 izvedene ćelije koje eksprimiraju IGF-1 rastu samo do 0,5-0,9 x 10<7>ćelija/ml, i ćelijska vijabilnost već nakon 80 h opada ispod 97% (vidi sliku 11).

Smanjen ćelijski rast se takođe mogao detektovati prilikom zajedničkog uzgajanja netransficiranih CHO-K1 izvedenih ćelija sa IGF-1. Slika 12 pokazuje da matične CHO-K1 izvedene ćelije rastu do 2,5 x 10<7>ćelija/ml. Tokom zajedničkog uzgajanja CHO-K1 izvedenih ćelija sa divljim tipom IGF-1 ili hIGF-1Ea 3mut (50 mg/l), ćelijski rast je takođe značajno inhibiran (0,9 x 10<7>ćelija/ml).

[0223] U sledećem koraku, specifični IGF-IR inhibitor tirozin kinaze (NVPAEW541 (In vivo antitumor activity of NVPAEW541- A novel, potent, and selective inhibitor of the IGF-IR kinase; Carlos García-Echeverría i sar. Cancer Cell; objavljeno onlajn 26. februara 2004. DOI: 10.1016/S1535610804000510) dodat je tokom eksperimenata zajedničkog uzgajanja IGF-1 u CHO-DUXB11 izvedenim ćelijama. Inhibicija ćelijskog rasta je mogla biti sprečena (vidi sliku 13). To potvrđuje da IGF-1-R aktivira signal u ćeliji, što dovodi do inhibicije ćelijskog rasta.

[0224] U sledećem koraku, izvršen je nokaut IGF-1R pomoću tehnike "cinkov prst nukleaza" (ZFN) u CHO-K1 izvedenim ćelijama i CHO-DUXB11 izvedenim ćelijskim linijama.

Dizajnirane su ZFN koje se specifično vezuju u regionu eksona 3 IGF-1R. Dva plazmida, od kojih svaki kodira jednu podjedinicu IGF-1R specifične ZFN, kotransficirani su u CHO-K1 izvedenim ćelijama ili CHO-DUXB11 izvedenim ćelijama. Svaka podjedinica ZFN vezuje specifične sekvence dužine 18 baznih parova; zato se specifično prepoznaje sekvenca od 36 bp (izbegava se nasumično sečenje na drugim lokacijama u genomu). FokI domen endonukleaze je preuređen da funkcioniše samo kao heterodimer da bi cepao DNK. ZFN dimer proizvodi ciljano cepanje dvostrukog lanca na eksonu 3 IGF-1R. Putem ćelijskog procesa spajanja nehomologih krajeva, koji je sklon greškama, ovo cepanje dvostrukog lanca može dovesti do modifikacije sekvence DNK i tako stvara funkcionalni nokaut ciljnog gena. Za CHO-K1 izvedene ćelije, stvorena su tri nokaut klona (nokaut na oba alela i mutacije pomaka okvira): Klon 1: Δ2 (ID BR. SEKV: 99), klon 2: Δ5 (ID BR. SEKV: 100) i klon 3: Δ2 (ID BR. SEKV: 101), klon 1: 18 (i supstitucija 14 bp) (ID BR. SEKV: 103), klon 2: Δ22 (ID BR. SEKV: 102) i klon 3: Δ114 (ID BR. SEKV: 104).

[0225] CHO-DUXB11 izvedena ćelijska linija je u suprotnosti sa CHO-K1 izvedenim ćelijama poliklonski i poliploidija, zbog čega nokaut IGF-1R predstavlja izazov (više od 2 IGF-1R kopije/genoma treba da budu nokautirani). Stvorili smo nekoliko jedinstvenih nokaut klonova sa mutacijom pomaka okvira i validirali smo dva pomoću TOPO kloniranja i sekvenciranja. Klon 12: Δ7 (50%) (ID BR. SEKV: 106)/ Δ22 (50%) (ID BR. SEKV: 105), klon 19: Δ7 (14,5%) / Δ16 (44%) / Δ22 (18%) / Δ22mut (15%). Procenti u zagradama su zasnovani na učestalosti javljanja ove mutacije kod 32 sekvencirane bakterijske kolonije. Za klon 19 se može pretpostaviti da postoji 6 IGF-1R alela (3 x Δ16, 1 x Δ7, 1 x Δ22, 1 x Δ22mut). Tri generisana KO klona CHO-K1 izvedenih ćelija IGF-1R su zajednički uzgajana sa IGF-1 i nije se mogla detektovati inhibicija ćelijskog rasta (vidi sliku 14).

[0226] Dva generisana IGF-1R KO CHO-DUXB11 izvedena klona su takođe uzgajana u prisustvu/odsustvu IGF-1. Slično kao i CHO-K1 IGF-1R KO klonovi, mogao se videti poboljšan ćelijski rast za KO klonove u poređenju sa divljim tipom CHO-DUXB11 izvedenih ćelija (vidi sliku 15). Jedan od KO klonova nije ispoljio inhibiciju ćelijskog rasta u prisustvu IGF-1, a drugi KO klon je u prisustvu IGF-1 imao sličan maks. broj vijabilnih ćelija kao CHO-DUXB11 izvedena ćelija bez zajedničkog uzgajanja sa IGF-1.

[0227] Strategija kloniranja vektora pBW806 (hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A).

Vektor pBW806, koji kodira hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A, pripremljen je praćenjem dva uzastopna koraka kloniranja. U prvom koraku, plazmid 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E _pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i AscI da bi se ekstrahovao de novo sintetisani Fc region. Istovremeno, pBW679 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa AscI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući intermedijarni vektor pBW805. U drugom koraku, plazmid 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i Sse232I da bi se ekstrahovao n-terminalni region fuzionog proteina hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A. Istovremeno, intermedijarni vektor pBW805 je zatim digestovan sa Sse232I i XbaI, dajući željeni deo skeleta, koji je na kraju ligiran sa fragmentom 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A_pMA-T, dajući finalni ekspresioni vektor pBW806.

Strategija kloniranja vektora pBW807 (hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C).

Vektor pBW807, koji kodira hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C, pripremljen je praćenjem dva uzastopna koraka kloniranja. U prvom koraku, plazmid 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E _pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i AscI da bi se ekstrahovao de novo sintetisani Fc region. Istovremeno, pBW679 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa AscI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući intermedijarni vektor pBW805. U drugom koraku, plazmid 11AARNWC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) digestovan je sa XbaI i Sse232I da bi se ekstrahovao n-terminalni region fuzionog proteina hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C. Istovremeno, intermedijarni vektor pBW805 je zatim digestovan sa Sse232I i XbaI, dajući željeni deo skeleta, koji je na kraju ligiran sa fragmentom 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_C_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis), dajući finalni ekspresioni vektor pBW807.

Strategija kloniranja vektora pBW808 (hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F).

Vektor pBW808, koji kodira hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F (vektor vlasništvo kompanije Novartis), pripremljen je praćenjem dva uzastopna koraka kloniranja. U prvom koraku, plazmid 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i AscI da bi se ekstrahovao de novo sintetisani Fc region. Istovremeno, pBW679 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa AscI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući intermedijarni vektor pBW805. U drugom koraku, plazmid 11AARNYC_hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i Sse232I da bi se ekstrahovao n-terminalni region fuzionog proteina hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_Fc. Istovremeno, intermedijarni vektor pBW805 je zatim digestovan sa Sse232I i XbaI dajući željeni deo skeleta, koji je na kraju ligiran sa fragmentom 11AARNUC_hIgF1-Ea-Fc_mut 13/2_F_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) dajući finalni ekspresioni vektor pBW808.

[0228] Strategija kloniranja vektora pBW809 (hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E).

Vektor pBW809, koji kodira HIGF1-EA-FC_MUT 04/2_E Fc fuzionu sekvencu, pripremljen je praćenjem dva uzastopna koraka kloniranja. U prvom koraku, plazmid 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i AscI da bi se ekstrahovao de novo sintetisani Fc region. Istovremeno, pBW679 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa AscI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući intermedijarni vektor pBW805. U drugom koraku, plazmid 11AARN2C_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i Sse232I da bi se ekstrahovao n-terminalni region fuzionog proteina hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E. Istovremeno, intermedijarni vektor pBW805 je zatim digestovan sa Sse232I i XbaI dajući željeni deo skeleta, koji je na kraju ligiran sa fragmentom 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) dajući finalni ekspresioni vektor pBW809.

Strategija kloniranja vektora pBW810 (hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A).

Vektor pBW810, koji kodira hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A, pripremljen je praćenjem dva uzastopna koraka kloniranja. U prvom koraku, plazmid 11AARNSC_hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_E_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i AscI da bi se ekstrahovao de novo sintetisani Fc region. Istovremeno, pBW679 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa AscI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući intermedijarni vektor pBW805. U drugom koraku, plazmid 11AARN2C_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa XbaI i Sse232I da bi se ekstrahovao n-terminalni region fuzionog proteina hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A. Istovremeno, intermedijarni vektor pBW805 je zatim digestovan sa Sse232I i XbaI dajući željeni deo skeleta, koji je na kraju ligiran sa fragmentom 11AARNUC_hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_A_pMA-T (vektor vlasništvo kompanije Novartis) dajući finalni ekspresioni vektor pBW810.

[0229] Strategija kloniranja vektora pBW410 (hIGF-1Ea 3mut).

Vektor 0610900pGA4 (vektor vlasništvo kompanije Novartis), koji kodira sekvencu hIGF-1Ea 3mut, digestovan je sa XbaI i MluI da bi se ekstrahovala de novo sintetisana kodirajuća sekvenca IGF. Istovremeno, pBW165 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa MluI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući finalni ekspresioni vektor pBW410.

[0230] Strategija kloniranja vektora pBW664 (hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-fc domen).

Vektor 0905915 (vektor vlasništvo kompanije Novartis), koji kodira sekvencu domena hIGF1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-fc, digestovan je sa XbaI i AscI da bi se ekstrahovala de novo sintetisana kodirajuća sekvenca IGF. Istovremeno, pBW596 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa AscI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući finalni ekspresioni vektor pBW664.

[0231] Strategija kloniranja vektora pBW666 (hIGF1-Ea- Δ1-3, R37A, Δ71-72, R77Q-fc domen).

Vektor 0950919 (vektor vlasništvo kompanije Novartis), koji kodira sekvencu domena hIGF1-Ea- Δ1-3, R37A, Δ 71-72, R77Q-fc je digestovan sa Ascl i Xbal da bi se ekstrahovala de novo sintetisana kodirajuća sekvenca IGF. Istovremeno, pBW596 (vektor vlasništvo kompanije Novartis) je digestovan sa AscI i XbaI, dajući odgovarajući fragment skeleta sa transkripcionim i translacionim regulatornim elementima, kao i markerom selekcije/amplifikacije G418/DHFR. Oba digestovana elementa su ligirana preko kompatibilnih krajeva, dajući finalni ekspresioni vektor pBW666.

[0232] IGF-1R KO klon izvedene ćelije Δ5/Δ22 CHO-K1, kao i IGF-1R KO klon izveden iz ćelije Δ7/Δ22 CHO-DUXB11, transficirani su sa 5 različitih fuzionih kandidata IGF-1-FC (vidi sliku 15). Detektovan je 5-17 puta veći titar rekombinantnog IGF-1-FC proteina na zbirnom nivou, u poređenju sa ćelijskom linijom CHO-K1 izvedene ćelije divljeg tipa/CHO-DUXB11 izvedene ćelije transficirane raličitim fuzionim kandidatima IGF-1-FC.

[0233] Dva fuziona kandidata IGF-1-FC (hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A i hIGF1-Ea-fc_mut 04/2_E) eksprimirana u ćelijskoj liniji CHO-K1 izvedene ćelije IGF1R-KO ili CHO-DUXB11 izvedenoj IGF1R-KO ćelijskoj liniji uzgajana su u wave bioreaktoru od 100 l (dolivni postupak i temperaturni pomak). Objedinjene IGF1RKO izvedene ćelije CHO-K1 koje eksprimiraju hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A/4 rastu do maks. gustine vijabilnih ćelija od 3 x 10<7>ćelija/ml, što je više od prosečne vrednosti za AB postupak (prosečna gustina ćelija je 2,2 x 10<7>ćelija/ml. U poređenju sa ćelijama divljeg tipa izvedenim iz CHO-K1 koje eksprimiraju IGF-1, ovo je povećanje broja vijabilnih ćelija od 3-6 puta (vidi sliku 11). IGF1RKO ćelije izvedene iz CHO-DUXB11 koje eksprimiraju hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A/4 rasle su do maks. gustine ćelija od 1,5-2 x 107 ćelija/ml, što je veća maks. gustina ćelija u poređenju sa ćelijskom linijom izvedenom iz CHO-DUXB11 divljeg tipa.

[0234] IGF1R KO ćelije izvedene iz CHO-DUXB11 koje eksprimiraju hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A bile su sortirane prema pojedinačnoj ćeliji, i određen je titar šarže u 24 bunarčića, kao i 50 ml kulture šarže. Na slici 15, prikazan je titar u 24 bunarčića 30 najboljih klonova hIGF1-Ea-fc_mut 13/2_A kod IGF-1R KO klonova izvedenih iz CHO-DUXB11, kao i 30 najboljih hIGF-1-Ea-D1-3, R37A, D71-72, 77-fc domena koji eksprimiraju klonove izvedene iz CHO-DUXB11 divljeg tipa; na slici 16 prikazan je titar boce za trešenje 15 najboljih klonova svake grupe. Ukupno su IGF-1R KO klonovi dobijeni od CHO-DUXB11 ćelija imali 8 puta veći titar za 24 bunarčića i 7 puta veći titar boce za trešenje.

Primer 55: Uzgajanje transformisanih CHO ćelija koje eksprimiraju IGF-1 u bioreaktoru.

[0235] Za uzgajanje transformisanih ćelija koje eksprimiraju IGF-1 u bioreaktoru, primenjen je dolivni postupak. Događaji u postupku, kao što je početak dolivanja i pomak temperature, bili su tempirani tako da podrže rast ćelija i da prošire proizvodnu fazu uz održavanje vijabilnosti (Niraj Kumar, Patrick Gammell, Martin Clynes (2007) Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture;

Cytotechnology (2007) 53:33-46).

Primer 56: Prikupljanje IGF-1 iz CHO ćelija.

[0236] Kao tehnika prikupljanja, primenjene su standardne tehnike separacije ćelija sa dubinskom filtracijom praćene sterilnom filtracijom. CHO su uzgajane i prikupljane u skladu sa uobičajenim metodama poznatim stručnjacima (npr. Curr. Protoc. Protein Sci.2001 May;Chapter 5: Unit 5.10. Production of recombinant proteins in mammalian cells. Chen S, Gray D, Ma J, Subramanian S; (Mahesh Prashada, Klaus Tarrach (2006) Depth filtration: Cell clarification of bioreactor offloads, Filtration & Separation tom 43, izdanje 7, septembar 2006, strane 28-30).

Primer 57: Projektovanje/proizvodnja i upotreba ZFN koje su specifične za ekson 3 IGF-1R:

[0237] Ekson 3 IGF-1R i bočni introni su sekvencirani u našim CHO ćelijskim linijama (ID BR. SEKV: 110/111). Prvo je ekson 3 sekvenciran koristeći kontig DNK hrčka koji pokriva deo kDNK IGF-1R koji obuhvata ekson 3, kao i mišju sekvencu gena IGF-1R.

[0238] PCR prajmeri su konstruisani na konzerviranim delovima, i dobijeni PCR proizvodi su sekvencirani. Dobijena sekvenca eksona 3 data je kompaniji Sigma da sekvencira bočne introne eksona 3, kao i da konstruiše dva projektovana ZFN koji ciljaju ekson 3 IGF-1R. Oba ZFN ciljaju i vezuju se za 18 nukleotida na reversnom (na 5'), odnosno direktnom (na 3') lancu DNK. Dva vezujuća mesta su razdvojena sa pet nukleotida mesta isecanja (ID BR. SEKV: 107). Opis proizvoda i metode dostupni su u kompaniji Sigma, u dokumentu pod nazivom ‘74188 CompoZr Custom ZFN Tech Bulletin'. Kompanija Sigma je takođe konstruisala direktni i reversni PCR prajmer u okolnim sekvencama introna (ID BR. SEKV: 108 i 109) radi amplifikacije eksona 3 IGF-1R u gDNK, dajući PCR proizvod od 501 bp. Kompanija Sigma je obezbedila komplet CompoZrTM (uobičajene cinkov prst nukleaze, broj proizvoda CSTZFN-1KT, broj serije 08021019MN) koji sadrži 20-25µg dva vektora DNK, koji kodiraju ZFN konstruisan da prepoznaje reversni (pZFN1), odnosno direktni (pZFN2) lanac.

[0239] E.Coli su, prema dobro poznatim protokolima transformacije, transformisane sa oba vektora i raširene po agaroznim pločama sa 25µg/ml kanamicina. Za svaki vektor su odabrane i proširene 4 bakterijske kolonije. ZFN sekvence četiri prečišćena uzorka DNK plazmida oba pZFN validirane su pomoću direktnog T7 i reversnog BHG prajmera i objedinjene. 6µg ili 10µg homogene smeše cirkularnih vektora pZFN1 i pZFN2 transficirano je u CHO-K1 izvedenim ćelijama i CHO-DUXB11 izvedenim matičnim ćelijama, tri puta za svaku količinu, tako da je dobijeno šest objedinjenih uzoraka (i negativna kontrola za transfekciju) za svaku ćelijsku liniju. Da bi se odredila efikasnost cepanja ZFN u objedinjenim uzorcima, upotrebljen je program za detekciju Surveyor Mutation (Transgenomics, katalog 706025) 3. i 10. dana nakon transfekcije (što se računa kao nulti dan), kao što je opisano u poverljivom protokolu dobijenom od kompanije Sigma. Genomska DNK iz objedinjenih uzoraka je izolovana pomoću kompleta GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep kit (Sigma, katalog G1N70-1KT), i ekson 3 amplifikovan u PCR reakciji koristeći direktni i reversni prajmer za sekvenciranje IGF-1R se nalazi u sekvencama bočnih introna. PCR proizvod je zatim denaturisan na visokoj temperaturi. Prilikom postepenog snižavanja temperature, neki proizvodi divljeg tipa i mutirani proizvodi hibridizuju, dajući DNK sa dvojnim lancem, sa neusklađenostima oko mesta cepanja, koji se cepaju pod dejstvom enzima nazvanog Surveyor®. Finalni proizvodi su analizirani pomoću sistema za gel elektroforezu pod nazivom lab901. Kod svih 6 transficiranih objedinjenih uzoraka, pored PCR proizvoda od 501 bp sa savršenim poklapanjem, detektovane su dve manje trake od oko 277 bp i 224 bp, koje odgovaraju fragmentima sa obe strane mesta isecanja, što potvrđuje ZFN aktivnost u našim ćelijama. Sedam dana nakon transfekcije, kod objedinjenih uzoraka je izvršeno kloniranje pojedinačne ćelije na pločama sa bunarčićima 10 x 96.

[0240] Kod pZFN-transficirane CHO-K1 izvedene ćelijske linije, 507 klonova je uzgajeno na pločama sa 96 bunarčića, i procenjeni su na mutacije pomoću goreopisanog testa Surveyor Mutation Detection (genomska DNK klonova je ekstrahovana na pločama sa 96 bunarčića, koristeći komplet Extract-N-Amp Blood PCR kompanije Sigma, katalog XNAB2).42 klona su bila pozitivna (detektovane su dve manje trake),što znači da njihov genom sadrži barem mutiranu kopiju eksona 3, i njihov PCR amplifikovani IGF-1R ekson 3 je sekvenciran. Kao što se očekuje od klonova dobijenih od pseudo-diploidne ćelijske linije dobijene od CHO-K1, hromatogrami sekvenciranja DNK pokazuju na maksimumu dva preklopljena signala istog intenziteta, koji ukazuju na dve kopije ciljne sekvence. 6 klonova je imalo mutacije u obe kopije, od toga su 3 klona imala mutacije koje aktiviraju obližnje stop kodone u obe kopije (ID BR. SEKV: 99 i 100) ili obližnje stop kodone u jednoj kopiji i veliku deleciju u drugoj (ID BR. SEKV: 101). Sekvence dve kopije kod ova 3 klona potvrđene su TOPO kloniranjem (TA komplet za kloniranje, Invitrogen, kat. K4575-40; odabrano 6 bakterijskih kolonija). Sva 3 K.O. klona su rasla sa znatno većom gustinom ćelija nego matične ćelije, i kada je IGF-1 ('hIGF-1Ea 3mut' (ID BR. SEKV: 27) spajkovan sa 50mg/l u standardnom medijumu, rasli su sa sličnom gustinom kao matične ćelije u standardnom medijumu (slika 8). Klon sa genotipom Δ5/Δ22 (ID BR. SEKV: 100/102) odabran je za transfekciju sa proteinom insulinu sličnog faktora rasta 1, npr. humanim IGF-1 (ID BR. SEKV:1 ili 5) ili njegove varijante (npr. ID BR. SEKV: 8-14).

[0241] U pZFN-transficiranim CHO-DUXB11 izvedenim ćelijskim linijama, samo 117 klonova je uzgajano na pločama sa 96 bunarčića i procenjeni su na mutacije testom Surveyor.

28 klonova je imalo najmanje jednu mutiranu kopiju eksona 3 (detektovane su dve manje trake), ali je sekvenciranje nagovestilo da svi ti klonovi i dalje imaju kopije divljeg tipa; sekvenca divljeg tipa je imala veći intenzitet na hromatogramima sekvenciranja od mutirane sekvence. CHO-DUXB11 izvedena ćelijska linija je mutagenizovana i poliklonska; kariotipovi pokazuju do osam kopija hromozoma u nekim ćelijama, što otežava procenu broja kopija gena. Dva klona, kod kojih je mutirana sekvenca detektovala (Δ22 ili Δ16) aktivirane obližnje stop kodone, odabrani su za drugi ciklus transfekcije sa pZFN; generisana su 3 objedinjena uzorka po originalnom klonu koristeći 10µg mešanih pZFN. Sedam dana nakon transfekcije, objedinjeni uzorci su klonirani pomoću FACS na pločama sa bunarčićima 6 x 96. Uzgajeno je 379 klonova, i od toga je 211 sekvencirano za ekson 3 IGF-1R (više nije bio moguć Surveyor test jer je sekvenca već mutirana) i preklopljene sekvence su vizuelno analizirane na hromatogramima. Najveći broj sekvenciranih klonova su bili heterozigoti sa divljim tipom i očekivanom mutiranom sekvencom (Δ22 ili Δ16); ~20% klonova je imalo divlji tip i 2 mutirane sekvence (uglavnom sa delecijama oko mesta isecanja); u dva klona detektovane su 4 različite sekvence (potvrđeno TOPO kloniranjem, ali je jedna od sekvenci bila divljeg tipa, ili samo jedna insercija nukleotida); 2 klona su K.O. klonovi, oba sa 2 detektovane sekvence (Δ16/Δ22 i Δ16/Δ5), ali je njihov rast u prisustvu IGF-1 bio samo malo bolji nego kod matične izvedene ćelijske linije CHO-DUXB11. Tako su tri klona, sa genotipom Δ22/Δ7/divlji tip, Δ16/Δ7/divlji tip i Δ16/Δ22/divlji tip, odabrana za treći ciklus transfekcije sa pZFN (njihove sekvence su potvrđene TOPO kloniranjem, sa 32 bakterijske kolonije odabrane i sekvencirane po klonu). Svaki od tri klona je transficiran 2 puta sa 8µg pZFN. Kada su dobijena dva objedinjena uzorka od svakog klona (vijabilnost >91%, nakon 7-9 dana), oni su objedinjeni i zajedno kultivisani oko 6-8 nedelja u prisustvu 50 mg/l IGF-1 (da bi se odabrale rezistentnije ćelije). Dva dana pre FACS kloniranja, oni su podeljeni bez IGF-1 (da se omogući vezivanje IGF-1-Cy5 i odaberu 5% manje fluorescentne ćelije). Tri objedinjena uzorka su FACS klonirani na ukupno 9 ploča sa 96 bunarčića.

[0242] Konstruisan je PCR prajmer koji vezuje sekvencu mesta isecanja divljeg tipa u eksonu 3 IGF-1R, koji omogućava efikasan skrining mutiranih klonova. PCR je izvršen sa direktnim sekvencirajućim prajmerom za IGF-1R; pod pretpostavkom da PCR uvek funkcioniše, ako je klon PCR negativan, ili nema sekvence divljeg tipa, ili klon nije dobro rastao (premalo DNK je ekstrahovano pa je premalo ćelija naraslo). Od 389 uzgajenih klonova prema skriningu, 58 su negativni i sekvencirani su. Kod 30 ovih klonova, sekvenca divljeg tipa nije detektovana, a kod 22 klona mutacije su bile pomak okvira (13 klonova sa dve sekvence Δ22/Δ7, iz klona Δ22/Δ7/divlji tip). Procenjen je njihov rast bez i sa 50mg/l IGF-1, i klon koji je najbolje rastao sa IGF-1 (takođe klon koji je najbolje rastao bez IGF-1), sa sekvencama Δ22/Δ7 (provereno TOPO kloniranjem), odabran je za transfekciju sa DNK konstruktima koji kodiraju proteine ID BR. SEKV: 8-14.

Claims

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji sadrži humani IGF-1 protein, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 pomenutog proteina IGF-1 mutirana u serin, i pri čemu numeracija aminokiselina pomenutog humanog proteina IGF-1 odgovara ID BR. SEKV: 1.

2. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu humani IGF-1 protein sadrži sledeće modifikacije:

a. aminokiselina E3 je izbačena,

b. aminokiselina G42 je mutirana u serin, i

c. aminokiselina R37 je mutirana u alanin.

3. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu humani IGF-1 protein sadrži sledeće modifikacije:

a. aminokiseline G1, P2 i E3 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je mutirana u serin, i

c. aminokiselina R37 je mutirana u alanin.

4. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu humani IGF-1 protein sadrži sledeće modifikacije:

a. aminokiseline G1, P2 i E3 su izbačene,

b. aminokiselina G42 je mutirana u serin,

c. aminokiselina R36 je mutirana u glutamin, i

d. aminokiselina R37 je mutirana u alanin.

5. Humani IGF-1 protein, pri čemu je aminokiselina glicin na položaju 42 supstituisana aminokiselinom serinom i pri čemu su aminokiseline:

(d) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R37 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E);

ili

(e) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R37 je supstituisana alaninom; ili

(f) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R37 je supstituisana prolinom (P); ili

(g) G1, P2, E3 izbačene i aminokiseline R36 i R37 su supstituisane ili izbačene;

ili

(h) G1, P2, E3 izbačene i obe aminokiseline R36 i R37 su supstituisane

glutaminom (Q); ili

(i) G1, P2, E3 izbačene i aminokiselina R36 je supstituisana glutaminom (Q) i R37 je supstituisana alaninom.

6. Polinukleotid koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-5.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid iz bilo kog od zahteva 1-5 za korišćenje u terapiji.

8. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 7 za primenu u lečenju mišićnog poremećaja kod pacijenta kome je to potrebno.

9. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 8, pri čemu je mišićni poremećaj mišićna atrofija.