ES2756331T3

ES2756331T3 - Anticuerpos Ang2

Info

Publication number: ES2756331T3
Application number: ES15796232T
Authority: ES
Inventors: Donmienne Doen Mun Leung; Jianghuai Xu
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2020-04-27
Anticipated expiration: 2035-05-12
Also published as: TW201605893A; CL2016002892A1; EP3145544A4; CA2945152A1; KR101943724B1; EA201691889A1; AP2016009553A0; KR20160145158A; US9695241B2; US20150329627A1; JP6231632B2; EP3145544B1; JP2017031166A; SG11201608418PA; CN106456755A; CN106456755B; AR100270A1; TWI551610B; EP3145544A1; JP2016532633A

Abstract

Un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la cadena pesada comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos KASQDVYIAVA (SEQ ID NO: 8), YWASTRDT (SEQ ID NO: 9), y HQYSSYPPT (SEQ ID NO: 10), respectivamente, y en el que la cadena pesada comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GYSFTDYNMV (SEQ ID NO: 11), YIDPYNGGTGYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARTRDRYDVWYFDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos Ang2

La presente invención se refiere al campo de la medicina. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a la angiopoyetina-2 humana (Ang2), y puede ser útil para el tratamiento del cáncer, especialmente las metástasis tumorales, y en combinación con los inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGFR2) para tumores sólidos dirigidos por el VEGFR2 y Ang2, que incluyen cánceres gástricos, carcinoma hepatocelular, ováricos, colorrectales, y de mama.

Un distintivo del cáncer es la formación persistente de nuevos vasos sanguíneos, llamada angiogénesis. La angiopoyetina-1 (Ang1) y Ang2 son miembros de una ruta clave que regula la angiogénesis; la Ang1 y Ang2 son factores secretados que se unen al receptor de la tirosina cinasa Tie2 específico de células. La Ang1 se secreta constitutivamente por los pericitos y estabiliza la integridad de los vasos sanguíneos mediante el receptor del Tie2. La Ang2 se libera de las células endoteliales solamente en respuesta a un estímulo (por ejemplo, cicatrización de heridas, crecimiento tumoral) y facilita el brote de vasos sanguíneos e inhibe la interacción pericito-célula endotelial mediante la señalización del Tie2. Los estudios han sugerido que la inhibición de la Ang2 es más importante que la de la Ang1 para la inhibición de la angiogénesis, pero en ciertos estudios distintos, la inhibición de la Ang2 y la Ang1 ha sido beneficiosa (Cascone y col., J Clin One (2012) 30(4):441).

Un anticuerpo contra la Ang2 humana, cuando se dosifica en combinación con el bloqueante de VEGF aflibercept, ha demostrado que inhibe el crecimiento tumoral y disminuye el sistema vascular tumoral en modelos de xenoinjerto tumoral en ratones (REGN910 en Daly y col., Cancer Res (2013) 73(1):108 y H1H685P en el documento WO2011014469). En Brown y col. (Mol Cancer Ther (2010) 9(1):145) se expone que el mAb 3.19.3, un anticuerpo Ang2 humano, se une a Ang1 con al menos 500x menos afinidad que a la Ang2, aunque en los Ejemplos 4 y 9 del documento WO2006068953, los solicitantes desvelan que el 3.19.3 tiene una fuerte reactividad cruzada con Ang1 con una Kd para Ang2 de aproximadamente 5 pM y una Kd para Ang1 de aproximadamente 30 pM. En un estudio de xenoinjerto SW620, el 3.19.3 se dosificó en combinación con el DC101, un anticuerpo monoclonal que se une al VEGFR2 murino.

Sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos alternativos que inhiban la ruta de angiogénesis Ang/Tie2 que se unan a la Ang2 humana con alta afinidad y que neutralicen la Ang2 humana. En particular, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos que se unan a la Ang2 humana con alta afinidad y que neutralicen la Ang2 humana pero no se unan con alta afinidad o neutralicen la Ang1 humana.

En consecuencia, una realización de la presente invención proporciona un anticuerpo, que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en las que la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 3, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 1.

Ciertos anticuerpos de la presente invención se unen a la Ang-2 humana con alta afinidad que es mayor que los anticuerpos Ang2 humanos conocidos en la técnica. Además, ciertos anticuerpos de la presente invención presentan una respuesta positiva en modelos de xenoinjerto de tumores, tales como EL 1997 para el cáncer de mama triple negativo, SKOV3x.1 para el cáncer ovárico, y PC3 para el cáncer de próstata, indicando un potencial como terapéutico del cáncer. De manera adicional, ciertos anticuerpos de la invención se unen selectivamente a la Ang-2 humana sobre la Ang-1 humana y evitan el potencial funciones colaterales de la Ang1 humana.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en el que la LC tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 2.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 4, y cada cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 2.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en el que una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro intercatenario con una de las cadenas ligeras, y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro intercatenario con la otra cadena ligera, y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro intercatenarios con la otra cadena pesada.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en el que el anticuerpo está glicosilado.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la cadena pesada comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos KASQDVYIAVA (SEQ ID NO: 8), YWASTRDT (SEQ ID NO: 9), y HQYSSYPPT (SEQ ID NO: 10), respectivamente, y en las que la cadena pesada comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada HCDR1, Hc DR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos Gy SfTDYNMV (SEQ ID NO: 11), YIDPYNGGTGYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARTRDRYDVWYFDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en las que la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 3, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 1.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), en el que la LC tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 4, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 2.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 4, y cada cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 2.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), en el que una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro intercatenario con una de las cadenas ligeras, y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro intercatenario con la otra cadena ligera, y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro intercatenarios con la otra cadena pesada.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), en la que el anticuerpo está glicosilado.

Se desvela en el presente documento un anticuerpo como se ha descrito anteriormente que tiene una constante de disociación en equilibrio K^d, menor de aproximadamente 150 pM para la Ang2 humana. El anticuerpo que se ha descrito anteriormente está caracterizado adicionalmente por una tasa de kon para la Ang2 humana de aproximadamente 1 x 106 M-1 seg-1. El anticuerpo que se ha descrito anteriormente está caracterizado adicionalmente por una tasa de ko f para la Ang2 humana de aproximadamente 0,7 x 10-4 seg-1. Los valores de K^d, kon, y ko f se establecen por cinéticas de unión a 37 °C como se describe en "Cinéticas de unión, afinidad y selectividad" en la sección de Ensayos.

El anticuerpo de la presente invención se une a la Ang2 humana con alta afinidad. Para los fines de la presente invención, la expresión "alta afinidad" se refiere a una K^dmenor de aproximadamente 150 pM para la Ang2 humana. Los valores de K^dse establecen por cinéticas de unión a 37 °C como se describe en "Cinéticas de unión, afinidad y selectividad" en la sección de Ensayos.

En una realización, la presente invención proporciona una célula de mamífero, que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la célula es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de un anticuerpo, que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que comprende el cultivo de la célula de mamífero de la presente invención en condiciones tales que se exprese el anticuerpo, y la recuperación del anticuerpo expresado.

En el presente documento se desvela un anticuerpo producido por un proceso de la presente invención.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo de la presente invención y un vehículo, diluyente o excipiente. aceptable.

En el presente documento se desvela un procedimiento de tratamiento del cáncer, que comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. Adicionalmente se desvela un procedimiento de tratamiento del cáncer, que comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, en el que el cáncer es un cáncer de mama, un cáncer ovárico, un cáncer gástrico, un cáncer colorrectal, o un carcinoma hepatocelular. Estos procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo como se ha descrito anteriormente en una combinación simultánea, separada, o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, doxorrubicina liposómica, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas para la suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, ramucirumab, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo, y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo, e irinotecan) y cetuximab.

Estos procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz del compuesto que se ha descrito anteriormente en una combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más de los agentes inmunooncológicos seleccionados de entre el grupo que consiste en nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, y durvalumab.

En el presente documento se desvela más adicionalmente un procedimiento de tratamiento del cáncer de mama, que comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. Estos procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo como se ha descrito anteriormente en una combinación simultánea, separada, o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en ramucirumab, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas para la suspensión inyectable, ixabepilona, y capecitabina.

En el presente documento se desvela más adicionalmente un procedimiento de tratamiento del cáncer ovárico, que comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. Estos procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo de la presente invención en una combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más de los agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en ramucirumab, cisplatino, carboplatino, y doxorrubicina liposómica.

En el presente documento se desvela más adicionalmente un procedimiento de tratamiento del cáncer gástrico, que comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. Estos procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo que se ha descrito anteriormente en una combinación simultánea, separada o secuencial con ramucirumab.

En el presente documento se desvela más adicionalmente un procedimiento de tratamiento del carcinoma hepatocelular, que comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. Estos procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo que se ha descrito anteriormente en una combinación simultánea, separada o secuencial con ramucirumab.

En el presente documento se desvela más adicionalmente un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. Estos procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo como se ha descrito anteriormente en una combinación simultánea, separada, o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en ramucirumab, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo, y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo, e irinotecan).

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en terapia. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del cáncer. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer es un cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, o carcinoma hepatocelular. En una realización adicional, para su uso en el tratamiento del cáncer, el anticuerpo de la presente invención está en una combinación simultánea, separada, o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, doxorrubicina liposómica, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas para la suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, ramucirumab, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo, y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo, e irinotecan) y cetuximab.

En una realización adicional, para su uso en el tratamiento del cáncer, el compuesto de la presente invención está en una combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más de los agentes inmuno-oncológicos seleccionados de entre el grupo que consiste en nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, y durvalumab.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del cáncer de mama. En una realización adicional, para su uso en el tratamiento del cáncer de mama, el anticuerpo de la presente invención está en una combinación simultánea, separada, o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en ramucirumab, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas para la suspensión inyectable, ixabepilona, y capecitabina.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del cáncer ovárico. En una realización adicional, para su uso en el tratamiento de un cáncer ovárico, el anticuerpo de la presente invención está en una combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más de los agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en ramucirumab, cisplatino, carboplatino, y doxorrubicina liposómica.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del cáncer gástrico. En una realización adicional, para su uso en el tratamiento del cáncer gástrico, el anticuerpo de la presente invención está en una combinación simultánea, separada o secuencial con ramucirumab.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del carcinoma hepatocelular. En una realización adicional, para su uso en el tratamiento del carcinoma hepatocelular, el anticuerpo de la presente invención está en una combinación simultánea, separada o secuencial con ramucirumab.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal. En una realización adicional, para su uso en el tratamiento de un cáncer colorrectal, el anticuerpo de la presente invención está en una combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más de los agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en ramucirumab, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo, y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo, e irinotecan), y cetuximab.

Se desvela en el presente documento el uso de un anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Se desvela adicionalmente más en el presente documento el uso de un anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer es un cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, o carcinoma hepatocelular.

Se desvela adicionalmente más el uso de un anticuerpo de la presente invención en una combinación simultánea, separada, o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados de entre el grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, doxorrubicina liposómica, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteínas para la suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, ramucirumab, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo, y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo, e irinotecan) y cetuximab para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Un anticuerpo de la presente invención es un polipéptido complejo modificado de origen no natural. Una molécula que se desvela en el presente documento es una molécula de ADN de origen no natural que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos del anticuerpo de la presente invención.

Un anticuerpo de la presente invención se diseña para que tenga CDR modificadas y tenga partes del anticuerpo (todo o parte de las regiones marco conservadas, regiones bisagra, y regiones constantes) que son de origen humano que son idénticas o sustancialmente idénticas (sustancialmente humanas) a las regiones marco conservadas y regiones constantes derivadas de las secuencias genómicas humanas. Las regiones marco conservadas, regiones bisagra y regiones constantes completamente humanas son las secuencias de la línea germinal humana, así como las secuencias con mutaciones somáticas de origen natural y con mutaciones modificadas artificialmente. Un anticuerpo de la presente invención puede comprender regiones marco conservadas, de bisagra o constantes derivadas de una región marco conservada, bisagra, o constante humanas que contienen una o más sustituciones, eliminaciones, o adiciones de aminoácidos en ellas. Adicionalmente, un anticuerpo de la presente invención es preferentemente no inmunogénico en seres humanos.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de tipo IgG y tiene cuatro cadenas de aminoácidos (dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligeras") que están entrecruzadas mediante enlaces de disulfuro intercatenarios. Cada cadena pesada está comprendida por una HCVR en el extremo N y una región constante de cadena pesada ("HCCR"). Cada cadena ligera está comprendida por una LCVR en el extremo N y una región constante de cadena pesada ("LCCR"). Cuando se expresan en ciertos sistemas biológicos, los anticuerpos que tienen secuencias Fc humanas nativas están glicosadas en la región Fc. Normalmente, la glicosilación se produce en la región Fc del anticuerpo en un sitio de N-glicosilación altamente conservada. Los N-glicanos se unen normalmente a la asparagina. Los anticuerpos se pueden glicosilar también en otras posiciones.

Opcionalmente, el anticuerpo de la presente invención contiene una parte Fc que se deriva de una región Fc de IgG4 humana debido a la capacidad reducida de conectarse con los mecanismos inflamatorios mediados por el receptor de Fc o para activar el complemento dando como resultado una función efectora reducida.

Adicionalmente, ciertos anticuerpos de la presente invención contienen una parte Fc PAA de IgG4. La parte Fc PAA de IgG4 tiene una mutación de serina a prolina en la posición 229, una mutación de fenilalanina a alanina en la posición 235 y una mutación de leucina a alanina en la posición 236. La mutación S229P es una mutación de la bisagra que evita la formación de medio anticuerpos (fenómeno de intercambio dinámico de medio moléculas en anticuerpos IgG4). Las mutaciones F235A y L236A reducen adicionalmente la función efectora del isotipo ya bajo de IgG4 humana.

Las regiones HCVR y LCVR pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones marco conservadas ("FR"). Cada HCVR y LCVR está compuesta normalmente por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En el presente documento, se hace referencia a las tres CDR de la cadena pesada como "HCDR1, HCDR2, y HCDR3" y se hace referencia a las tres CDR de la cadena ligera como "LCDR1, LCDR2 y LCDR3". Las CDR contienen la mayoría de los restos que forman interacciones específicas con el antígeno. Existen actualmente tres sistemas de designaciones de CDR para los anticuerpos que se utilizan para el diseño de secuencias. La definición de CDR de Kabat (Kabat y col., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) se basa en la variabilidad de secuencias del anticuerpo. La definición de Chothia (Chothia y col., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); AlLazikani y col., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) se basa en las estructuras tridimensionales de los anticuerpos y la topología de los bucles de CDR. Las definiciones de CDR de Chothia son idénticas a las definiciones de CDR de Kabat con la excepción de la HCDR1 y la HCDR2. La definición de CDR de North (North y col., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) se basa en el agolpamiento por afinidad de propagación con un gran número de estructuras cristalinas.

Para los fines de la presente invención, se utiliza una combinación de los tres procedimientos para definir las CDR. En el caso de las CDR de cadena liera, se utiliza la definición de North. En el caso de la HCDR1, se utiliza un hibrido de las definiciones de Kabat y Chothia. La definición de Kabat de la HCDR1 comienza en el noveno resto después de la primera cisteína de la cadena pesada y tiene normalmente de cinco a siete restos de longitud, mientras que la definición de Chothia HCDR1 comienza en el cuarto resto después de esta cisteína y normalmente tiene siete a nueve restos de longitud. La HCDR1 del anticuerpo de la presente invención se define por la posición de partida de Chothia y la posición final de Kabat. En el caso de la HCDR2, se utiliza la definición de CDR de Kabat. En el caso de la HCDR3, se utiliza un hibrido de las definiciones de North, Kabat y Chothia. La definición de North de la HCDR3 comprende los restos 99-110 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 2 para el anticuerpo de la presente invención) y normalmente comienza tres restos después de una cisteína. La definición de Chothia de la HCDR3 es la misma que en la definición de Kabat. La definición de North de la HCDR3 comprende los restos 97-110 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 2 para el anticuerpo de la presente invención) y normalmente comienza inmediatamente después del resto de cisteína. La HCDR3 del anticuerpo de la presente invención se define por la posición de partida de North y la posición final de Kabat/Chothia/North.

Un ADN aislado que codifica una región HCVR se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica la HCVR a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada. Las secuencias de los genes de región constante de cadena pesada humanas, así como de otros mamíferos se conocen en la técnica. Los fragmentos de ADN que engloban estas regiones se pueden obtener, por ejemplo, por amplificación mediante una PCR convencional.

Un ADN aislado que codifica una región LCVR se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica la LCVR a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena ligera. Las secuencias de los genes de región constante de cadena pesada humanas, así como de otros mamíferos se conocen en la técnica. Los fragmentos de ADN que engloban estas regiones se pueden obtener por amplificación mediante una PCR convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Los polinucleótidos desvelados en el presente documento se expresarán en una célula huésped después de unir operativamente las secuencias a una secuencia de control de la expresión. Los vectores de expresión normalmente son replicables en los organismos huésped sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina, neomicina, y dihidrofolato reductasa, para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

El anticuerpo de la presente invención se puede producir fácilmente en células de mamífero, tal como células CHO, NS0, HEK293 o COS. Las células huésped se cultivan utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótido de interés (por ejemplo, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos del anticuerpo y secuencias de control de la expresión) se pueden transferir en la célula huésped por procedimientos bien conocidos, que variarán dependiendo del tipo de huésped celular.

Se pueden emplear distintos procedimientos de purificación proteica y dichos procedimientos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3a Edición, Springer, NY (1994).

En otras realizaciones de la presente invención, el anticuerpo, o los ácidos nucleicos que codifican el mismo, se proporcionan en forma aislada. Como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" se refiere a una proteína, péptido o ácido nucleico que está libre o sustancialmente libre de cualquier otra especie macromolecular que se encuentra en un entorno celular. "Sustancialmente libre" como se utiliza en el presente documento significa la proteína, péptido, o ácido nucleico de interés que comprende más del 80 % (sobre una base molar) de las especies macromoleculares presentes, preferentemente más del 90 % y más preferentemente más del 95 %.

El anticuerpo de la presente invención, o las composiciones farmacéuticas que comprenden el mismo, se pueden administrar por vía parenteral (por ejemplo, subcutánea o intravenosa). Un anticuerpo de la presente invención se puede administrar a un paciente solo con vehículos, diluyentes, o excipientes farmacéuticamente aceptables en dosis únicas o múltiples. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar por procedimientos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (1995), A. Gennaro y col., Mack Publishing Co.) y comprende un anticuerpo desvelado en el presente documento, y uno o más vehículos, diluyentes, o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "tratamiento" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere al enlentecimiento, interrupción, detención, alivio, parada, reducción o inversión de la progresión de la gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente.

"Se une" como se utiliza en el presente documento en referencia a la afinidad de un anticuerpo por la Ang2 humana tiene la intención de significar, a menos de que se indique otra cosa, una K^dmenor de aproximadamente 1 x 10-8 M, preferentemente, menor de aproximadamente 1 x 10-9 M según se determina por procedimientos conocidos en la técnica. Que incluyen el uso de un biosensor de resonancia de plasmones superficiales (SPR) a 25 °C o 37 °C esencialmente como se describe en el presente documento. El término "selectivo" o "selectividad" que se utiliza en el presente documento en referencia a un compuesto de la presente invención se refiere a un compuesto que se une a una diana, tal como la Ang2 humana con una Kd aproximadamente 1000, 500, 200, 100, 50, o aproximadamente 10 veces menor que con la que el compuesto se une a otras proteínas, incluyendo un miembro de la familia de la diana tal como la Ang1 humana, según se mide por resonancia de plasmones superficiales a 25 °C o 37 °C. Adicional o alternativamente, un anticuerpo selectivo Ang2 de la presente invención se une a la Ang2 humana pero no se une o solo se une mínimamente a la Ang1 humana cuando se ensaya por los procedimientos descritos en el Ejemplo posteriormente.

"Cantidad eficaz" significa la cantidad de un anticuerpo de la presente invención o composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médico de o el efecto terapéutico deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero o ser humano que se sea deseado por el investigador, doctor médico, u otro clínico. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que se ha sopesado cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo respecto a los efectos terapéuticamente beneficiosos.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo no limitante.

Ejemplo 1: Expresión y purificación de anticuerpos

Los polipéptidos de las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y cadena ligera completa del anticuerpo A, y las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas, se enumeran posteriormente en la sección titulada "Secuencias de aminoácidos y nucleótidos". Además, las SEQ ID NO de la cadena ligera, cadena pesada, región variable de la cadena ligera, y región variable de la cadena pesada del anticuerpo A se muestran en la Tabla 1.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo A que puede producirse y purificarse esencialmente de la siguiente manera. Una célula huésped apropiada, tal como HEK 293 y CHO, pueden transfectarse transitoria o establemente con un sistema de expresión para que secreten anticuerpos utilizando una relación de vector HC:LC óptima predeterminada (tal como de 1:3 o 1:2) o un único sistema de vector que codifiquen tanto HC como LC. El medio clarificado, en el que se ha secretado el anticuerpo, se puede purificar utilizando cualquiera de las muchas técnicas que se utilizan comúnmente. Por ejemplo, el medio se puede aplicar convenientemente en una columna MabSelect (GE Healthcare) o una columna KappaSelect (GE Healthcare) para un fragmento Fab, que se ha equilibrado con un tampón compatible, tal como una solución salina tampón de fosfato (pH 7,4). La columna puede lavarse para retirar los componentes de unión no específica. El anticuerpo unido se puede eluir, por ejemplo, mediante un gradiente de pH (tal como 20 mM de tampón Tris a pH 7 para 10 mM de tampón de citrato sódico pH 3,0 o solución salina tampón de fosfato pH 7,4 para 100 mM de tampón de glicina pH 3,0). Las fracciones de anticuerpo se pueden detectar, tal como por SDS-PAGE, y luego se pueden agrupar. Una purificación adicional es opcional, dependiendo del uso que se pretenda. El anticuerpo se puede concentrar y/o esterilizar por filtración utilizando técnicas comunes. Los agregados solubles y multímeros se pueden retirar eficazmente por técnicas comunes, que incluyen la exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, multimodal, o cromatografía de hidroxiapatita. La pureza del anticuerpo después de estas etapas de cromatografía se mayor del 95 %. El producto se puede congelar inmediatamente a -70 °C o se puede liofilizar.

Tabla 1: Las SEQ ID NO

Ensayos

Cinéticas de unión, afinidad y selectividad

Las cinéticas de unión, afinidad y selectividad por múltiples especies de Ang2 soluble tal como humana, de cynomolgus, ratón, conejo y perro, puede determinarse por los anticuerpos de la presente invención a 25 °C o 37 °C mediante el uso de un biosensor de resonancia de plasmones superficiales (SPR) tal como un BIAcore® 2000, BIAcore® 3000, o un BIAcore® T100 (GE HealthCare) de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.

La Ang2 humana se puede adquirir en R&D Systems. Se puede preparar Proteína A de superficie para la captura de anticuerpos utilizando los siguientes procedimientos. La inmovilización de Proteína A soluble (Calbiochem, Cat: 539202) en un CM4 (Biacore n° BR-1005-34) o CMS (Biacore n° BR-1000-99) se puede preparar utilizando un procedimiento de acoplamiento de amina EDC/NHS (Biacore n° BR-1000-50). En resumen, se pueden activar las superficies de las cuatro células de flujo inyectando una mezcla 1:1 de EDC/NHS durante siete minutos a 5 pl/min o 10 pl/min. Tras lo cual, la proteína A soluble se puede diluir en 10 mM de tampón de acetato, pH 4,5, y se inmoviliza durante siete minutos en la célula de flujo (Fc) 2, 3 o 4 con una tasa de flujo de 5 pl/min o 10 pl/min. Los sitios que no reaccionan que siguen manteniéndose sobre la superficie del chip se pueden bloquear con una inyección de siete minutos de etanolamina a 5 pl/min o 10 pl/min. El tampón de ejecución puede ser HBS-EP+ (Biacore n° BR-1006-69). Las muestras de anticuerpo se pueden preparar a 1 pg/ml o 2 pg/ml mediante dilución en el tampón de ejecución. Las concentraciones separadas de ligandos Ang2 varía desde 200 nM a 3,1 nM se pueden preparar utilizando diluciones en serie de dos veces el tampón de ejecución. Cada ciclo de análisis puede consistir en una serie de cinco etapas distintas: (1) captura de anticuerpo en células de flujo separadas (Fc2, Fc3, y Fc4), (2) inyección (utilizando kinject) de 250 pl (tiempo de contacto con la superficie de 300 segundos) o concentraciones diferentes de Ang2 sobre todas las Fc a 50 pl/min, (3) vuelta al flujo de tampón durante 20 minutos para monitorizar la fase de disociación, (4) regeneración de las superficies del chip con una inyección de 10 pl (tiempo de contacto de 30 segundos) de 10 mM de glicina, pH 1,5 (5) equilibrado de la superficie del chip con una inyección de 15 pl (tiempo de contacto de 45 segundos) de HBS-EP+ tampón de ejecución. Los datos resultantes se pueden procesar utilizando una doble referencia convencional y se ajusta a un modelo de unión 1:1 utilizando el software de Evaluación Biacore 2000, versión 4,1, para determinar la tasa de asociación (kon, unidades M-1s-1), tasa de disociación (koff, unidades s-1). El cálculo de la constante de disociación en equilibrio (K^d) puede calcularse a partir de la siguiente relación, K^d= koff/kon, y se presenta en unidades molares.

H1H685P-293HEK es un anticuerpo IgG1 humano contra Ang2 que se expresa en células 293 HEK que utiliza una secuencia HCVR (SEQ ID NO: 18 del documento WO2011014469) y una secuencia de LCVR (SEQ ID NO: 20 del documento WO2011014469). 3.19.3-293HEK es un anticuerpo IgG1 humano que se expresa en células 293 HEK que se une a Ang2 y utiliza la secuencia de HCVR de 3.19.3 (SEQ ID NO: 2 del documento WO2009097325) y la secuencia de LCVR MEDI1 (SEQ ID NO: 3 del documento WO2009097325).

En los experimentos llevados a cabo esencialmente con se describe en este ensayo, el anticuerpo A se unen a la Ang2 humana con una K^daproximadamente 4x y 8x menor que la de H1H685P-293HEK y 3.19.3-293HEK, respectivamente (Tabla 2).

En los experimentos que se llevan a cabo esencialmente como se describe en este ensayo, el anticuerpo A se une a la Ang2 humana, de cynomolgus, ratón, conejo y perro con afinidades de 80, 107, 109, 210 y 140 pM, respectivamente (Tabla 3).

Tabla 2

Tabla 3

Medición de afinidad con Kinexa

Se puede utilizar un instrumento KinExa 3200 (Sapidyne Inst. Inc.) para medir las cinéticas de unión. En resumen, la Ang2 humana se puede acoplar covalentemente a perlas de sepharose y se puede detectar la unión de Mab libres a las perlas son el KinExa 3200. Para medir la Kd, se pueden incubar tubos individuales que contengan el Mab (1 pM, 2 pM, o 5 pM) con Ang2 humana diluida en serie decreciente durante unos pocos días a 25 °C en PBS que contenga 1 mg/ml de BSA. Después de la incubación, puede determinarse el mAb libre en cada muestra equilibrada. Los valores de Kd se puede determinar utilizando un análisis de la curva N con el software KinExa.

En los experimentos llevados a cabo esencialmente con se describe en este ensayo, el anticuerpo A se une a la Ang2 humana con una K^daproximadamente 4x y 8x menor que la de H1H685P-293HEK (Tabla 4).

Tabla 4

El Anticuerpo A inhibe la interacción de Ang2 humana con Tie2 humana mediante un ensayo ELISA de fase sólida

El bloqueo de la unión de la Ang2 humana a su receptor Tie2 humano con un anticuerpo de la presente invención se puede medir en un ensayo ELISA in vitro en fase sólida.

Para el ensayo, las placas de ELISA de 96 pocillos de alta unión (Costar n° 2592) pueden revestirse con 4 jg/m l (100 |jl) de Tie2-Fc humano recombinante (R&D Systems n° 313-TI), durante una noche a temperatura ambiente. Las placas se pueden lavar 3x con TBST (solución salina tampón Tris que contiene un 0,05 % de Tween 20) y luego se pueden bloquear con 300 jl/pocillo de tampón de bloqueo (0,5 % de BSA/D-PBS) (BSA: Jackson ImmunoResearch n° 001 000-162; IgG libre, libre de proteasa) durante 1-2 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital. Durante la etapa de bloqueo, en las placas multipocillo de polipropileno, se pueden añadir 75 j l de 2x de anticuerpos de ensayo (diluidos en serie 1:3 en tampón de bloqueo) con 75 j l de 2x de Ang2 humana biotinilada (R&D Systems n° BT623) (también en tampón de bloqueo diluido). Las mezclas de anticuerpo/Ang2 biotinilada se pueden incubar entonces durante 1 hora a 37 °C (la concentración de Ang2 biotinilada final era de 100 ng/ml). La solución de bloqueo se puede retirar de las placas revestidas con Tie2-Fc, tras lo cual se pueden añadir 50 j l por pocillo de las mezclas de anticuerpo/Ang2 biotinilada (en pocillos duplicados). Las placas se pueden incubar durante 2 horas a temperatura ambiente, se cubren con selladores de placas, en un agitador orbital. Las placas entonces se lavaron 3x tras lo cual se pueden añadir 100 j l por pocillo de estreptavidina-HRP (R&D Systems n° DY998, que pueden diluirse 1:200 en tampón de bloqueo). Las placas se pueden incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente, se cubren con selladores de placas, en un agitador orbital. Las placas entonces se pueden lavar 3x de nuevo.

Las placas se pueden entonces desarrollar añadiendo 100 j l por pocillo de sustrato TMB de un componente (puede calentarse a temperatura ambiente) (Surmodics/BioFX Labs n° TMBW-1000-01). Puede permitirse que progrese el desarrollo durante 10 minutos a temperatura ambiente (las placas pueden cubrirse con una hoja de aluminio). El desarrollo se puede parar con 100 j l por pocillo de solución de parada ácida (solución de parada de TMB, Surmodics/BioFX Labs n° LSTP-1000-01). Las placas se pueden mezclar en un agitador orbital tras lo cual se pueden leer a 450 nm en un lector de ELISA (Molecular Devices SpectraMax 190), utilizando el software SOFTmax PRO 5.4.1 (Molecular Devices Corp.). Los valores de A450 reflejan la cantidad de Ang2 biotinilada que se mantenga unida al Tie-2-Fc. La reducción de los valores de A450 reflejaba el bloqueo de la unión de Ang2 biotinilada a Tie-2-Fc.

Los valores de la CI50 para la inhibición de la unión de Ang2 a Tie-2 se puede calcular con GraphPad Prism 6 , utilizando los valores de X Log transformados. El análisis de regresión no lineal (ajuste de la curva) (respuesta a la dosis sigmoidal, pendiente variable) se puede llevar a cabo sobre los datos de log transformados para obtener los valores de la CI50. Si se lleva a cabo un experimento más de una vez, se puede calcular la media geométrica del valor de la CI50 (y el intervalo de confianza del 95 %) entre los experimentos.

En los experimentos que se llevan a cabo esencialmente como se ha descrito en este ensayo, el anticuerpo A bloquea específicamente la unión de la Ang2 a Tie-2 de una manera dependiente de la dosis, dando como resultado un valor de la CI50 media (n=2) de 0,027 nM (con un intervalo de confianza del 95 % de 0,00089 - 0,8029 nM). El anticuerpo A y H1H685P-293HEK tenía valores de neutralización de la CI50 comparables.

Neutralización de fosforilación de Tie-2 inducida por Ang2, pero no de la fosforilación mediada por Ang1.

La inhibición basada en células in vitro del Tie-2 humano con el anticuerpo de la presente invención puede medirse en un ensayo basado en células en el que Ang1 y Ang2 se unen e inducen la fosforilación del Tie-2 humano de una manera dependiente de la dosis. El ensayo basado en células in vitro se puede utilizar para evaluar la capacidad del anticuerpo A para neutralizar selectivamente la fosforilación mediada por Ang2 y no por Ang1 del receptor de la Tie-2 de una manera dependiente de la dosis. Un anticuerpo Ang2, un anticuerpo de reacción cruzada Ang1/2, y un anticuerpo PAA de isotipo IgG4 humano de control se pueden incluir como controles positivo y negativo , respectivamente.

Se puede generar la línea celular CHO-Tie-2 mediante transfección estable de un receptor Tie-2 humano de longitud completa (con un marcador 3x FLAG en el extremo C). Las células. CHO-Tie-2 se pueden mantener en medio completo de Ham F-12 (CellGro/Mediatech n° 10-080-CV), con un 10% de FBS inactivado por calor (Life Technologies/Invitrogen n° 10082-147), 1X de antibiótico antimicótico (Life Technologies/Invitrogen n° 15240-062), 1,25 mg/ml de G418 (Corning Cellgro n° 30-234-CI), 10 pg/ml de puromicina (Calbiochem n° 540411), y un 0,078 % de bicarbonato sódico (Thermo Hyclone n° SH30033.01).

Para el ensayo, las células CHO-Tie-2 se resuspendieron hasta 10.000 células por pocillo (en 100 pl de medio de cultivo), en los 60 pocillos internos de placas de 96 pocillos revestidos de polilisina (BD Biocoat n° 356640). Se pueden colocar 200 pl de D-PBS en los pocillos de los extremos para reducir la evaporación. Las células se pueden incubar durante una noche a 37 °C, un 95 % de RH, un 5 % de CO2. Al día siguiente, las células se pueden lavar una vez y se puede remplazar el medio con 100 pl de medio de cultivo libre de suero que contenga un 0,1 % de BSA (Sigma n° A7979, bajo en endotoxinas). Las células se pueden entonces privar de alimento durante 7,5 a 24 horas en medio libre de suero a 37 °C, un 95 % de RH, un 5 % de CO2. Durante el periodo de privación, los anticuerpos (a 6X las concentraciones finales) se pueden diluir en serie 1:2 en placas de propileno con medio de cultivo libre de suero que contenga un 0,1 % de BSA. También se puede diluir la Ang2 humana (R&D Systems n° 623-AN, reconstituida en D-PBS/0,1 % de BSA) y la Ang1 humana (R&D Systems n° 923-AN, reconstituida D-PBS/0,1 % de BSA) hasta 6X la concentración final en medio de cultivo libre de suero que contenga un 0,1 % de BSA. Los anticuerpos y el ligando de Ang2 o Ang1 se pueden mezclar entonces con una relación 1:1 en placas de polipropileno y se pueden incubar durante 1 hora a 37 °C. Las mezclas de anticuerpo/ligando se pueden añadir entonces a 50 pl por pocillo a las células (en pocillos triplicados por tratamiento) y se pueden incubar durante 13 minutos hasta 21 horas a 37 °C, un 95 % de RH, un 5 % de CO2. El intervalo de concentraciones final de anticuerpo puede ser de 0,0625 a 283 nM, y la concentración final de Ang2 y Ang1 humanas puede ser de 0,3 pg/ml (aproximadamente 6 nM) y 0,5 pg/ml (aproximadamente 8,9 nM), respectivamente. Después del tiempo de incubación, el medio se retiró rápida y completamente de las células, y las células se pueden lisar en 60 pl por pocillo de 1x tampón de lisis Tris frío (Meso Scale Discovery n° R60TX; 150 mM de NaCl, 20 mM de Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, un 1 % Triton X-100) que puede contener inhibidores recién añadidos de proteasa y de fosfatasa (1X de coctel inhibidor de proteasa, Sigma n° P8340; 1X de coctel 2 inhibidor de fosfatasa, Sigma n° P5726; 1X de coctel 3 inhibidor de fosfatasa, n° P0044; 1 mM final de ortovanadato sódico activado (EMD Chemicals n° 567540)). Las placas se pueden colocar entonces en hielo durante 10 minutos tras lo cual se pueden colocar en un agitador orbital a baja velocidad durante 25 minutos a 4 °C. Las placas se pueden entonces sellar y congelar a -80 °C.

El día antes del análisis para fosfo-Tie-2 (con un kit de ELISA FuoSet para fosfo-Tie-2 humano de R&D Systems, n° DYC2720), se pueden revestir placas de ELISA de alta unión (Greiner BioOne, n° 655081) durante una noche a 4 °C con 4 pg/ml de anticuerpo de captura de Tie-2 anti-humano total de ratón en 1X de tampón de revestimiento ELISA (Surmodics/BioFX Labs n° COAT-1000-01).

El día de la medición de fosfo-Tie-2, las placas que contienen los lisados se descongelaron sobre hielo. Las placas de ELISA se pueden lavar con tampón de lavado (1X TBST que contiene un 0,05 % de Tween 20) y bloquear con 300 pl por pocillo de tampón de bloqueo (un 1 % de BSA (Jackson ImmunoResearch n° 001-000-162; libre de IgG, libre de proteasas), un 0,01 % de azida sódica) durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital (mientras está cubierto con selladores de placa). Durante el bloqueo, los lisados se pueden diluir 1:5 o 1:10 en placas de polipropileno en tampón de lisis frío que contenga inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las placas de ELISA se pueden bloquear y lavar 4X, y se pueden añadir 100 pl por pocillo de lisados diluidos (o referencias de fosfo-Tie-2 ELISA) e incubarse durante 2 horas a temperatura ambiente, se cubre con selladores, en un agitador orbital. Las placas se pueden lavar 4X y se pueden añadir 100 pl por pocillo de anti-fosfotirosina de ratón conjugado con HRP (diluido como se recomienda en el vial en TBST/0,1 % de BSA). Las placas se pueden cubrir con selladores, e incubarse durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital. Las placas se pueden lavar 6X entonces y puede asegurarse la retirada de todo el líquido de los pocillos. Las placas se pueden entonces desarrollar añadiendo 100 pl por pocillo de sustrato TMB de un componente (Surmodics/BioFX Labs n° TMBW-1000-01). Se permitió que las placas se desarrollaran durante 20 o 30 minutos a temperatura ambiente cubiertas con una hoja de aluminio. El desarrollo se puede parar con 100 pl por pocillo de solución de parada ácida (solución de parada de TMB, Surmodics/BioFX Labs n° LSTP-1000-01). Las placas se pueden entonces mezclar en un agitador orbital. Las placas se pueden leer entonces a 450 nm en un lector de ELISA (Molecular Devices SpectraMax 190), utilizando un software SOFTmax PRO 5.4.1 (Molecular Devices Corp.). Los valores de Fosfo-para las muestras se pueden obtener a partir de la curva de referencia (ajuste logístico de 4 parámetros), y se multiplican por el factor de dilución de 5 o 10. El porcentaje de inhibición se puede calcular por la siguiente fórmula: (valor de tratamiento de pTie2 - media del valor de pTie2 del tratamiento solo con Ang2) / (media del valor de pTie2 solo con medio - valor medio de pTie2 solo con tratamiento con Ang2) * 100.

Los valores de la CI50 para la inhibición de la fosfo-Tie-2 inducida por Ang2 se puede calcular con GraphPad Prism 4, utilizando los valores de X Log transformados. El análisis de regresión no lineal (ajuste de la curva) (respuesta a la dosis sigmoidal, pendiente variable) se puede llevar a cabo sobre los datos de log transformados para obtener los datos log transformados para obtener los valores de la CI50. Si se lleva a cabo un experimento más de una vez, se puede calcular la media geométrica del valor de la CI50 (y el intervalo de confianza del 95 %) entre los experimentos.

En los experimentos que se llevan a cabo esencialmente como se ha descrito en este ensayo, la fosfo-Tie-2 inducida por Ang2 humana neutralizado por el Anticuerpo A dependiendo de la dosis en células CHO-Tie-2 con una CI50 de 0,773 nM (un intervalo de confianza del 95 % de 0,412 -1,45 nM) (n = 3). Además, el anticuerpo A no neutralizaba la fosfo-Tie-2 inducida por la Ang1 humana en células CHO-Tie-2 cuando se comparaba con el anticuerpo anti-Ang1/2 de reacción cruzada 3.19.3-293HEK. El anticuerpo A y H1H685P-293HEK tenían valores CI50 de neutralización de la Ang2 comparables.

Represión del desarrollo de vasos sanguíneos inducido por Ang2

La represión in vivo de la angiogénesis fisiológica mediante un anticuerpo Ang2 se puede medir en un modelo de desarrollo de vasos sanguíneos en la reina de ratón. El ensayo mencionado anteriormente se puede utilizar para estudiar la capacidad de los anticuerpos de la presente invención para reprimir la angiogénesis fisiológica en la retina de ratón.

Para este ensayo, el día del suministro de crías de ratón por las hembras gestantes se puede marcar como P0 (días 0 posnatal). A continuación del suministro, en los días dos y cuatro (P2 y P4) se pueden inyectar las crías con el vehículo de control (PBS) o 10 mg/kg de Anticuerpo A. En P5 los ratones se pueden sacrificar y se pueden recolectar los ojos y se pueden fijar en formalina durante 5 horas y se pueden lavar con PBS.

Las retinas se pueden disecar entonces y se pueden teñir con anti-CD31 diluido 1:200 (BD Pharmingen; clon MEC 13.3; Catálogo 553370), y anti-SMA-FTIC diluido a 1:200 (Sigma; Clon1A4 Catálogo F3777). Para las retinas tratadas con anti-CD31 se utilizó un anticuerpo secundario anti-Alexa-647 de rata diluido 1:400 (Jackson Immuno Research; Catálogo 712-606-153). La adquisición de las retinas se puede hacer utilizando una Nikon Ti, y se puede llevar a cabo la cuantificación de la progresión vascular, número de células apicales de brote, y la densidad vascular de remodelación del plexo utilizando un software FIJI. Las imágenes de magnificación se pueden adquirir utilizando un Nikon A1 confocal.

En los experimentos que se llevan a cabo esencialmente como se ha descrito en este ensayo, el Anticuerpo A reprimía la progresión vascular, reducía tanto el número de células apicales endoteliales como la densidad vascular, así como aumentaba de manera similar el recubrimiento de pericitos a 3 mg/kg, 10 mg/kg y 30 mg/kg cuando se compara con el grupo de control con PBS. Estos datos eran estadísticamente significativos con una p < 0,0001 para todos los grupos de tratamiento cuando se comparan con el grupo de control de PBS (Tabla 5).

Tabla 5

Efectos anti-angiogénicos in vivo del anticuerpo A en un modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata PC3

El efecto anti-angiogénico de los anticuerpos Ang2 y anticuerpos Ang2 en combinación con anticuerpos VEGFR2 se pueden evaluar en un modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata PC3.

Los ratones que tienen tumores de xenoinjerto PC3 con un volumen de aproximadamente 250 mm3, distribuidos aleatoriamente a 10 ratones/grupo, se pueden tratar con la IgG1 de control, DC101 (un anticuerpo murino anti-VEGFR2), Anticuerpo A, DC101 anticuerpo A durante 6 días (2QW; 20 mg/kg). Después de los seis días, se recolectan los tumores, se fijan y seccionan. Los tumores seccionados se tiñeron con CD105 y se puede determinar el área total de los vasos.

En los experimentos que se llevan a cabo esencialmente como se ha descrito, cuando se compara con el grupo de control de IgG1, el área total de los vasos se reducía un 65 % en el grupo de tratamiento DC101, del 69 % en el grupo de tratamiento con Anticuerpo A, y del 84 % en el grupo de tratamiento de combinación. Cuando se comparan con el grupo de control de IgG1, estos resultados son estadísticamente significativos con un p<0,0001 para todos los grupos de tratamiento.

Al anticuerpo A y el anticuerpo anti-VEGFR2 inhibe el crecimiento tumoral in vivo

La eficacia de los anticuerpos de la presente invención se puede medir mediante modelos de xenoinjerto in vivo. La eficacia antitumoral de DC101 (un anticuerpo murino anti-VEGFR2), el Anticuerpo A y su combinación se puede evaluar en el modelo de cáncer de mama derivado de un paciente triple negativo subcutáneo (EL 1997) y el modelo de xenoinjerto ovárico subcutáneo (SKOV3x.1). Los ratones que tenían los tumores se pueden tratar con los anticuerpos diluidos en PBS, en una base de dos veces a la semana mediante inyección intraperitoneal. El crecimiento se puede determinar por mediciones tridimensionales con calibre de los volúmenes tumorales dos veces a la semana durante el curso del tratamiento.

Xenoinjertos derivados de un paciente triple negativo EL 1997: Los ratones inmunodeficientes que tienen xenoinjertos derivados de un paciente triple negativo EL 1997 (TNBC PDX) con un volumen de aproximadamente 350 mm3 distribuidos aleatoriamente a n = 7 ratones/grupo se pueden tratar con el vehículo de control, monoterapia de DC101 a 20 mg/kg, monoterapia de Anticuerpo A a 20 mg/kg, una combinación de Ciclofosfamida y Doxorrubicina a 100 mg/kg y 10 mg/kg respectivamente, una combinación de DC 101 y Anticuerpo A o una combinación de Ciclofosfamida, Doxorrubicina, DC101 y Anticuerpo A dosificadas a las respectivas concentraciones de monoterapia. Los tratamientos se pueden administrar dos veces a la semana durante 4 semanas consecutivas.

En los experimentos que se llevaron a cabo esencialmente como se ha descrito, los grupos de tratamiento con monoterapia de DC101 y Anticuerpo A presentaban un % T/C (cambio en el volumen tumoral) del 35,2 % y 56,7 %, respectivamente. La combinación de los dos anticuerpos, DC101 y Anticuerpo A daba como resultado un %T/C de un 19,9%. Además, la combinación de ciclofosfamida, Doxorrubicina, DC101 y Anticuerpo A daba como resultado un %T/C de un 0,4 % con una reducción estadísticamente significativa (p=0,0019) del volumen tumoral cuando se compara con la combinación de DC101 y Anticuerpo A. El tratamiento de combinación de los agentes quimioterapéuticos solos, Ciclofosfamida y Doxorrubicina daba como resultado un %T/C del 32 %. Estos resultados indican que el tratamiento con monoterapia de DC101 o Anticuerpo A es eficaz y tiene un potencial para mayor eficacia en combinación; que está aumentada adicionalmente con la adición de agentes quimioterápicos.

Xenoinjertos ováricos SKOV3x.1: Los ratones inmunodeficientes que tienen xenoinjertos ováricos SKOV3x.1 con un volumen de aproximadamente 350 mm3, distribuidos aleatoriamente a n=10 ratones/grupo, se pueden tratar con el vehículo de control, monoterapia de Anticuerpo A a 3,10 o 30 mg/kg, monoterapia de Paclitaxel a 25 mg/kg o la combinación de Paclitaxel y Anticuerpo A a 25 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente. Los tratamientos se pueden administrar dos veces a la semana durante 4 semanas.

En los experimentos que se llevaron a cabo esencialmente como se han descrito, los resultados presentaban unos valores de %T/C de 39,1, 32,5 y 27,3 para las dosis de 3, 10 y 30 mg/kg de Anticuerpo A respectivamente y un %T/C de 20,3 para la monoterapia de paclitaxel a 25 mg/kg con valores de p de <0,001 en comparación con el control. La combinación de 25 mg/kg de Paclitaxel y 10 mg/kg de Anticuerpo A aumentaba la eficacia de las dos monoterapias, presentando un %T/C del 7,1 % cuando se compara con el grupo con vehículo de control.

Xenoinjertos ováricos SKOV3x.1: Los ratones inmunodeficientes que tenían los xenoinjertos ováricos SKOV3x.1 con un volumen de aproximadamente 250 mm3, distribuidos aleatoriamente a n=10 ratones/grupo, se pueden tratar con un vehículo de control, monoterapia de DC101 a 20 mg/kg, monoterapia de Paclitaxel a 25 mg/kg, una combinación de DC101 y Anticuerpo A a 25 mg/kg cada uno, o una combinación de Paclitaxel, DC101 y anticuerpo A dosificados a las concentraciones de monoterapia respectivas. Los tratamientos se pueden administrar dos veces a la semana durante 4 semanas.

En los experimentos que se llevaron a cabo esencialmente como se ha descrito, el tratamiento con monoterapia de DC101 daba como resultado un %T/C del 9,6%, mientras que la combinación de los dos anticuerpos, DC101 y Anticuerpo A, daba como resultado un aumento del %T/C del 0,1 % cuando se compara con el grupo de vehículo de control. La combinación de Paclitaxel, DC101 y Anticuerpo A daba como resultado regresiones tumorales de aproximadamente un -33% en comparación con un %T/C del 17,8% para la monoterapia con Paclitaxel. Estos resultados indican en el modelo de xenoinjerto que la inhibición de VEGFR2 con DC101 tiene el potencial de aumentar la eficacia en combinación con el Anticuerpo A. El beneficio de esta combinación aumenta adicionalmente con la adición de un agente quimioterápico dando lugar a regresiones estadísticamente significativas en los volúmenes tumorales.

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos

SEQ ID NO: 1 (HCVR del Anticuerpo A)

QVQLVQSG AEVKXPGAS VKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQ APGQGLEWMGYID

PYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDV

WYFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 2 (HC del Anticuerpo A)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQGLEWMGYID

PYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDV

WYFDV WGQGTLVTV S S ASTKGPS VFPLAPC SRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTV

SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV

DKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED

PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 3 (LCVR del Anticuerpo A)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTR

DT GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYY CHQYSSYPPTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 4 (LC del Anticuerpo A)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTR

DTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGGGTKVEIKRTV

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 5 (ADN de la LC del Anticuerpo A)

G ACATCC AGAT G ACCC AGTCTCCATCTT CCGTGT CTGCAT CTGTAGG AG AC AG AGTC ACC ATC ACTTGT AAGGCCAGT C AGGAT GTGTAT ATTGCTGT AGCCTGGT ATC AGC AG AAACC AGGGAAAGCCCCT AAGCT CCT GATCTATT GGGC ATCCAC CCGGGAC ACTGGGGTCCC ATC AAGGTT CAGCGGC AGT GGATCTGGGAC AGAT TTC ACTCTC ACC ATC AGC AGCCTGC AGCCTG AAG ATTTT GC AACTT ACT ATT G TC ACC AAT AT AGCAGCTAT CCTCCTACGTTCGGCGG AGGG ACC AAGGTGG AG ATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA GCAGTTG AAATCTGG AACTGCCTCTGTTGT GTGCCTGCT G AAT AACTTCT ATC CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG AAGGTGG ATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CT CCC AGG AG AGTGT CAC AGAGC AGG AC AGC AAGG ACAGC ACCT ACAGCCTC AGCAGCACCCT G ACGCTGAGC AAAGC AG ACTACG AG AAAC ACAAAGT CT AC GCCTGCGAAGT CACCCAT CAGGGCCT GAGCTCGCCCGTC ACA AAG AGCTTC A ACAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO: 6 (ADN de la HC del Anticuerpo A)

C AGGTT CAGCT GGTGCAGT CT GG AGCT G AGGTG AAGAAGCCTGGGGCCTC AG T G AAGGTCTCCTGC AAGGCTT CTGGTT ACTC ATTC ACTGACT AC AAC ATGGTG TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATATATTGATC CTT AC AATGGTGGT ACTGGCT AC AACCAG AAGTTCG AGGGC AG AGTC ACC AT GACC ACAG ACAC ATCC ACGAGCAC AGCCT AC ATGG AGCT G AGG AGCCTG AGA T CT GACGAC ACGGCCGTGT ATT ACT GT GCGAGAACG AGGGAT AGGT ACGACG T CT GGTACTTCG ATGTCT GGGGCC AGGG AACCCT GGTC ACCGTCT CCTC AGCC T CC ACCAAGGGCCCAT CGGT CTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGC ACCT C CG AG AGC ACAGCCGCCCT GGGCT GCCTGGTC AAGG ACTACTTCCCCG AACCG GT G ACGGT GTCGTGG AACTC AGGCGCCCT G ACC AGCGGCGTGC ACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCT ACTCCCTC AGC AGCGTGGTGACCGT G CCCT CC AGC AGCTTGGGCACGAAG ACCT AC ACCTGC AACGTAGAT CAC AAGC CC AGC AAC ACC AAGGTGG AC AAG AG AGTTGAGT CC AAAT ATGGTCCCCCAT G CCCACCCTGCCC AGCACCT GAGGCCGCCGGGGGACC ATC AGTCTTCCTGTT CC CCCC AAAACCCAAGGAC ACT CT CAT G ATCTCCCGG ACCCCT GAGGT CACGT G CGT GGTGGTGG ACGTG AGCCAGG AAG ACCCCGAGGT CC AGTT CAACTGGT AC GTGG ATGGCGTGG AGGT GC AT AATGCC AAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGC AG TTC AACAGC ACGTACCGT GTGGTC AGCGTCCT CACCGTCCTGCACC AGG ACT G GCTG AACGGC AAGG AGT AC AAGTGC AAGGTCTCC AAC AA AGGCCTCCCGT CC TCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGG T GTAC ACCCTGCCCCCAT CCC AGG AGG AG ATGACC AAG AACCAGGT CAGCCT GACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCC AGCG ACAT CGCCGT GGAGTGGG AA AGC AAT GGGC AGCCGG AG AACA ACTACAAGACC ACGCCTCCCGT GCTGGACT CCG ACGGCTCCTTCTTCCTCTAC AGCAGGCTAACCGT GGAC AAGAGC AGGT G GCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC C ACT ACAC ACAG AAG AGC CTCTCCCTGT CT CTGGGT

SEQ ID NO: 7 (Ang2 humana) YNNFRKSMDSIGKKQYQVQHGSCSYTFLLPEMDNCRSSSSPYVSNAVQRDAPLE YDDSVQRLQVLENIMENNTQWLMKLENYIQDNMKKEMVEIQQNAVQNQTAVM IEIGTNLLNQTAEQTRKLTDVEAQVLNQTTRLELQLLEHSLSTNKLEKQILDQTSEI

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a la Ang2 humana (SEQ ID NO: 7), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la cadena pesada comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera LCDR1, LCDR2, y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos KASQDVYIAVA (SEQ ID NO: 8), YWASTRDT (SEQ ID NO: 9), y HQYSSYPPT (SEQ ID NO: 10), respectivamente, y en el que la cadena pesada comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos GYSFTDYNMV (SEQ ID NO: 11), YIDPYNGGTGYNQKFEG (SEQ ID NO: 12), y ARTRDRYDVWYFDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en el que la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 3, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 1.

3. El anticuerpo de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 2, en el que la LC tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 4, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 2.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que cada cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 4, y cada cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos que se da en la SEQ ID NO: 2.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en el que una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro intercatenario con una de las cadenas ligeras, y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro intercatenario con la otra cadena ligera, y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro intercatenarios con la otra cadena pesada.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo está glicosilado.

7. Una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 4 y una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la célula es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

8. Un procedimiento de producción de un anticuerpo, que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que comprende el cultivo de la célula de mamífero de la Reivindicación 7 en condiciones para que se exprese el anticuerpo, y la recuperación del anticuerpo expresado.

9. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, y un vehículo, diluyente, o excipiente aceptable.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, para su uso en terapia.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, para su uso en el tratamiento del cáncer.

12. El anticuerpo para el uso de la Reivindicación 11, en el que el cáncer es un cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, o carcinoma hepatocelular.

13. El anticuerpo de una cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el anticuerpo es para administrar en una combinación simultánea, separada, o secuencial con ramucirumab.