ES2971126T3 - Anticuerpos contra LIF y usos de los mismos - Google Patents

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Johan Fransson
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Abstract

En el presente documento se describen anticuerpos que se dirigen al factor inhibidor de la leucemia (LIF). También se describen en el presente documento usos de estos anticuerpos para el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra LIF y usos de los mismos
Campo técnico
En el presente documento se describen nuevos anticuerpos anti-LIF que antagonizan o bloquean la actividad de LIF. Estos anticuerpos son útiles para el tratamiento del cáncer. Estos anticuerpos se pueden humanizar con el fin de desarrollar una terapia clínica para cánceres que expresan altos niveles de LIF, receptor de LIF o que presentan crecimiento dependiente de LIF. Uno de estos anticuerpos descritos en el presente documento presenta una mejora inesperada en la afinidad de unión y el efecto biológico después del procedimiento de humanización.
Antecedentes
El factor inhibidor de la leucemia (LIF) es una citoquina de tipo interleuquina 6 (IL-6) que está implicada en una variedad de actividades biológicas, incluida la inhibición de la diferenciación celular. El LIF humano es un polipéptido de 202 aminoácidos que ejerce efectos biológicos mediante la unión al receptor de LIF de la superficie celular(LIFro CD118) que se heterodimeriza con gp130. Esto conduce a la activación de rutas de señalización procrecimiento, tales como la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la ruta de la quinasa activada por Janus (JAK/STAT). Se ha demostrado que los niveles elevados de expresión y los niveles séricos elevados de LIF están asociados con un mal pronóstico para muchos tipos de cáncer.
La publicación internacional WO2011/124566 describe anticuerpos dirigidos contra el factor inhibidor de la leucemia (LI F) humano y una línea celular de hibridoma que produce dichos anticuerpos.
La publicación internacional WO1993/23556 describe anticuerpos monoclonales contra el factor inhibidor de la leucemia humana.
Resumen
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
En un aspecto, se describe en el presente documento, un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 (GFTFSHAW); b) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 (IKAKSDDYAT); c) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF); d) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (QSLLDSDGHTY); e) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26 (SVS); y f) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQIdNO: 29 (MQATHAPPYT), en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante se une a LIF glicosilado. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante está humanizado. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante está desinmunizado. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante comprende un Fab, F(ab)<2>, anticuerpo de dominio único, un fragmento variable de cadena única (scFv) o un nanocuerpo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF con una constante de disociación(K<d>)de menos de aproximadamente 200 picomolar. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF con una constante de disociación(K<d>)de menos de aproximadamente 100 picomolar. En determinadas realizaciones, la VH-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), en donde la VH-CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), en donde la VH-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), en donde la VL-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), en donde la VL-CDR2 comprende un secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), y en donde la VL-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). En determinadas realizaciones, la secuencia de VH es al menos aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y la secuencia de VL es al menos aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76. En determinadas realizaciones, la secuencia de VH es una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y la secuencia de VL es una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante es para usar en el tratamiento del cáncer. En determinadas realizaciones, el cáncer comprende glioblastoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario o cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante es un constituyente de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo recombinante y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración intracerebral. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica es para usar en el tratamiento del cáncer. En determinadas realizaciones, el cáncer comprende glioblastoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata o cáncer de pulmón.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 72 o 74; y b) una secuencia de región variable de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78.
También se describe un método para tratar a un individuo con cáncer que comprende administrar al individuo un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7 o 33; b) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 9-13 o 35; c) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15-19 o 37; d) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 21-23 o 39; e) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-27 o 41; y f) una región determinante de complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 30 o 43, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
También se describe un método para tratar a un individuo con cáncer que comprende administrar al individuo un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 72 o 74; y b) una secuencia de región variable de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78.
También se describe un método para preparar un tratamiento contra el cáncer para tratar a un sujeto con cáncer que comprende mezclar un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende: a) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7 o 33; b) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 9-13 o 35; c) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15-19 o 37; d) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 21-23 o 39; e) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-27 o 41; y f) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 30 o 43, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
También se describe un método para preparar un tratamiento contra el cáncer para tratar a un sujeto con cáncer que comprende mezclar un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una secuencia de región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 72 o 74; b) y una secuencia de región variable (VL) de cadena ligera de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de origen de rata y al menos una región armazón (FR) de inmunoglobulina de origen humano, en donde la al menos una CDR de origen de rata se une específicamente a LIF.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquier de las SEQ ID NO: 71, 72 o 74; y una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78.
También se describe un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar a un individuo un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF), en donde el anticuerpo recombinante que se une específicamente (LIF) comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de origen de rata y al menos una región armazón (FR) de inmunoglobulina de origen humano, en donde la al menos una CDR de origen de rata se une específicamente a LIF.
También se describe un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar a un individuo un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF), en donde el anticuerpo recombinante que se une específicamente (LIF) comprende una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 72 o 74; y una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78.
También se describe un método para preparar un tratamiento contra el cáncer para tratar a un sujeto con cáncer que comprende mezclar un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF), en donde el anticuerpo recombinante que se une específicamente (LIF) comprende al menos un región determinante de la complementariedad (CDR) de origen de rata y al menos una región armazón (FR) de inmunoglobulina de origen humano, en donde la al menos una CDR de origen de rata se une específicamente a LIF.
También se describe un método para preparar un tratamiento contra el cáncer para tratar a un sujeto con cáncer que comprende mezclar un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF), en donde el anticuerpo recombinante que se une específicamente (LIF) comprende una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 72 o 74; y una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une a LIF, en donde el anticuerpo comprende: una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada expuesta en la s Eq ID NO: 9, una secuencia de aminoácidos de CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 15, una secuencia de aminoácidos de FR1 de cadena pesada al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de FR2 de cadena pesada al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de FR3 de cadena pesada al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50,
una secuencia de aminoácidos de FR4 de cadena pesada al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 21, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 25, una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 29, una secuencia de aminoácidos de FR1 de cadena ligera al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de FR2 de cadena ligera al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de FR3 de cadena ligera al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65, y una secuencia de aminoácidos de FR4 de cadena ligera al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente a LIF, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada humanizada, al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a los aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 72, y una región variable de cadena ligera humanizada, al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a los aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 76.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente a LIF que comprende: a) una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7 o 33; b) una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 9-13 o 35; y c) una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15-19 o 37, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente a LIF que comprende: a) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 21-23 o 39; b) una región determinante de complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-27 o 41; y c) una región determinante de complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 30 o 43, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une a LIF, en donde el anticuerpo comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 9, y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 15, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 21, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 25, y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 29.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente a LIF que comprende: a) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 91-94; y b) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 87-90, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une a LIF, en donde el anticuerpo comprende: una CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 9, una CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 15, una CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21, una CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 29.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une a LIF, en donde el anticuerpo comprende: una CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene no más de 3, 2 o 1 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1 con, una CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene no más de 3, 2 o 1 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 9, una CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene no más de 3, 2 o 1 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 15, una CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene no más de 3, 2 o 1 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 21, una CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene no más de 3, 2 o 1 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 25, y una CDR3 de cadena ligera que tiene un secuencia de aminoácidos que contiene no más de 3, 2 o 1 sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 29.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une a LIF y compite con un anticuerpo definido por: una CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en las EqID NO: 9, una CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15, una CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21, una CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en laSe QID NO: 29
También se describe un anticuerpo monoclonal aislado, en donde, cuando se une al LIF humano, el anticuerpo monoclonal se une a al menos uno de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29,q 32,D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 de la SEQ ID NO: 98.
También se describe un anticuerpo monoclonal aislado, en donde, cuando se une al LIF humano, el anticuerpo monoclonal se une a al menos uno de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29,q 32,D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 de la SEQ ID NO: 98.
También se describe un anticuerpo monoclonal aislado en donde la VH-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VH-CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VH-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF) en 0, 1,2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VL-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde laVL-c Dr 2comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VL-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, y en donde el anticuerpo monoclonal se une a al menos uno de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 de la SEQ ID NO: 98.
También se describe un anticuerpo monoclonal aislado en donde la VH-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VH-CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VH-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 95 (TSWEWDLDF) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VL-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VL-CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, en donde la VL-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT) en 0, 1, 2, 3 o 4 restos de aminoácidos, y en donde el anticuerpo monoclonal se une a al menos uno de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 de la SEQ ID NO: 98.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10; una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15; una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22; y una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26; y una región determinante de complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3; una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9; una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16; una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21; y una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25; y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3; una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10; una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16; una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22; y una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26; y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3; b) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQIdNO: 10; c) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16; d) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22; e) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26; y f) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-7 o 33; b) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 11-13 o 35; c) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 17-19 o 37; d) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 21-23 o 39; e) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 25-27 o 41; y f) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 30 o 43; en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
También se describe un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: a) una VH-CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH); b) una la VH-CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG); c) una VH-CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), d) una VL-CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), e) una VL-CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES); y f) una VL-CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT); en donde el resto de cisteína de la SEQ ID NO: 15 es cualquier aminoácido excepto tirosina, triptófano, histidina, lisina o arginina. En determinadas realizaciones, el anticuerpo recombinante se une a LIF glicosilado.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 representa una transferencia Western que muestra la inhibición de la fosforilación de STAT3 inducida por LIF de diferentes anticuerpos anti-LIF humanizados.
La Fig. 2A y 2B representa una transferencia Western que muestra la inhibición de la fosforilación de STAT3 inducida por LIF del anticuerpo 5D8 parental y humanizado.
La Fig. 3A muestra una IC<50>para la inhibición de LIF en células U-251 utilizando el anticuerpo h5D8.
La Fig. 3B muestra la IC<50>representativa de curvas de dosis-respuesta de la inhibición por r5D8 y h5D8-1 de pSTAT3 en condiciones de estimulación de LIF endógeno. Se muestran las curvas representativas (n=1 h5D8, n=2 r5D8). Consulte las Figuras 2, 3 y 4 del Apéndice para todas las curvas de dosis de IC50 y controles.
La Fig. 4 representa una transferencia Western que muestra la inhibición de la fosforilación de STAT3 inducida por LIF de diferentes anticuerpos monoclonales descritos en esta descripción.
La Fig. 5 representa la tinción inmunohistoquímica y la cuantificación de la expresión de LIF en glioblastoma multiforme (GBM), NSCLC (carcinoma de pulmón no microcítico), cáncer de ovario y tumores de cáncer colorrectal de pacientes humanos. Las barras representan la media /- SEM.
La Fig. 6 Es un gráfico que muestra un experimento realizado en un modelo de ratón de cáncer de pulmón no microcítico utilizando el anticuerpo 5D8 humanizado.
La Fig. 7A muestra el efecto de r5D8 en la inhibición de las células U251 en un modelo de ratón ortotópico de cuantificación de GBM mostrado el día 26.
La Fig. 7B muestra datos de ratones a los que se inoculó células de GBM U251 humanas que expresan luciferasa y luego se trataron con 100, 200 o 300 μg de h5D8 o vehículo dos veces por semana. El tamaño del tumor se determinó por bioluminiscencia (Xenogen IVIS Spectrum) el día 7. El gráfico muestra mediciones de tumores individuales con barras horizontales que indican la media ± SEM. La significación estadística se calculó utilizando la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de datos no pareados.
La Fig. 8A muestra el efecto de r5D8 en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de ovario en un modelo de ratón singénico.
La Fig. 8B muestra las mediciones individuales de los tumores en el día 25.
La Fig. 8C ilustra que h5D8 muestra una reducción significativa en el crecimiento tumoral cuando se administran 200 jg/ratón dos veces por semana (p<0.05). Los símbolos son media SEM, significación estadística en comparación con el vehículo (con prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de datos no pareados).
La Fig. 9A muestra el efecto de r5D8 en la inhibición del crecimiento de células de cáncer colorrectal en un modelo de ratón singénico.
La Fig. 9B muestra las mediciones individuales de los tumores en el día 17.
La Fig. 10A muestra la reducción de la infiltración de macrófagos en los sitios tumorales en un modelo de ratón ortotópico de GBM con una imagen representativa y cuantificación de células CCL22+.
La Fig. 10B muestra la reducción de la infiltración de macrófagos en un modelo de cultivo de cortes de tejido organotípico humano.
La Fig. 10C muestra la reducción de la infiltración de macrófagos en los sitios tumorales en un modelo de ratón singénico de cáncer de ovario con una imagen representativa y cuantificación de células CCL22+.
La Fig. 10D muestra la reducción de la infiltración de macrófagos en los sitios tumorales en un modelo de ratón singénico de cáncer colorrectal con una imagen representativa y cuantificación de células CCL22+.
La Fig. 11A muestra aumentos en las células efectoras no mieloides en un modelo de ratón singénico de cáncer de ovario después del tratamiento con r5D8.
La Fig. 11B muestra aumentos en las células efectoras no mieloides en un modelo de ratón singénico de cáncer colorrectal después del tratamiento con r5D8.
La Fig. 11C muestra disminuciones en el porcentaje de células T<reg>CD4+ en un modelo de ratón de cáncer de NSCLC después del tratamiento con r5D8.
La Fig. 12 muestra datos de ratones portadores de tumores CT26 tratados dos veces por semana con PBS (control) o r5D8 administrado por vía intraperitoneal en presencia o ausencia de anticuerpos agotadores anti-CD4 y anti-CD8. El gráfico muestra mediciones de tumores individuales en el día 13 expresadas como volumen tumoral medio SEM. Las diferencias estadísticas entre grupos se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de datos no pareados. R5D8 inhibió el crecimiento de los tumores CT26 (*p<0.05). La inhibición del crecimiento tumoral por r5D8 se redujo significativamente en presencia de anticuerpos agotadores anti-CD4 y anti-CD8 (****p<0.0001).
La Fig. 13A ilustra una visión general de la estructura cocristalina de Fab h5D8 en complejo con LIF. El sitio de interacción de gp130 está mapeado en la superficie de LIF (sombreado oscuro)
La Fig. 13B ilustra interacciones detalladas entre LIF y h5D8, mostrando restos que forman puentes salinos y restos de h5D8 con áreas de superficie enterradas superiores a 100 A2.
La Fig. 14A ilustra la superposición de las cinco estructuras cristalinas de Fab h5D8 e indica un alto grado de similitud a pesar de ser cristalizadas en diferentes condiciones químicas.
La Fig. 14B ilustra una extensa red de interacciones de van der Waals mediadas por la Cys100 no apareada. Este resto está bien ordenado, participa en la configuración de las conformaciones de HCDR1 y HCDR3 y no está implicado en el mezclado no deseado de disulfuros. Las distancias entre restos se muestran como líneas discontinuas y están etiquetadas.
La Fig. 15A ilustra la unión de mutantes h5D8 C100 a LIF humano por ELISA.
La Fig. 15B ilustra la unión de mutantes h5D8 C100 a LIF de ratón por ELISA.
La Fig. 16A ilustra que h5D8 no bloquea la unión entre LIF y LIFR mediante Octet. Unión secuencial de h5D8 a LIF seguida de LIFR.
Las Figs. 16B y 16C ilustran el análisis ELISA de complejos LIF/mAb que se unen a LIFR o gp130 inmovilizados. Señales de anticuerpos anti-IgG conjugados con peroxidasa específicos de especie (antihumano para (-) y h5D8, anti rata para r5d8 y B09) que detectan la porción de anticuerpo de los complejos mAb/LIF que se unen a placas recubiertas con LIFR (Fig. 16B) o gp130 (Fig. 16C) inmovilizados.
La Fig. 17A y 17B ilustran la expresión de ARNm de LIF (Fig. 16A) o LIFR (Fig. 16B) en 72 tejidos humanos diferentes.
Descripción detallada
Determinadas definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", “ la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cualquier referencia a "o" en este documento pretende abarcar "y/o" a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "aproximadamente" se refiere a una cantidad que es cercana a la cantidad indicada, por ejemplo en un 10%, 5% o 1%.
Tal como se usan en el presente documento, los términos "individuo", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente e incluyen seres humanos a los que se les ha diagnosticado o se sospecha que padecen un tumor, un cáncer u otra neoplasia.
Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno, es decir, fragmentos de anticuerpos que retienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno al que se une el anticuerpo de longitud completa, p. ej. fragmentos que retienen una o más regiones CDR. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; anticuerpos de cadena pesada, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla, p. ej. fragmentos de región variable de cadena sencilla (scFv), nanocuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos con especificidades separadas, tales como un anticuerpo biespecífico. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se humanizan de tal manera que se reduce la respuesta inmunitaria de un individuo contra el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser quiméricos, p. ej. región variable no humana con región constante humana, o CDR injertada, p. ej. regiones CDR no humanas con secuencias armazón de región constante y región variable humanas. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se desinmunizan después de humanización. La desinmunización implica eliminar o mutar uno o más epítopos de células T en la región constante del anticuerpo. Como se usa en el presente documento un "anticuerpo recombinante" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de dos especies diferentes o, o dos fuentes diferentes, e incluye moléculas sintéticas, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una CDR no humana y una región armazón o constante humana.
Los términos "cáncer" y "tumor" se refieren a la afección fisiológica en mamíferos caracterizada por un crecimiento celular desregulado. El cáncer es una clase de enfermedades en las que un grupo de células presenta un crecimiento descontrolado o no deseado. Las células cancerosas también pueden propagarse a otros lugares, lo que puede producir la formación de metástasis. La propagación de células cancerosas en el cuerpo puede ocurrir, por ejemplo, a través de la linfa o la sangre. El crecimiento incontrolado, la intrusión y la formación de metástasis también se denominan propiedades malignas de los cánceres. Estas propiedades malignas diferencian los cánceres de los tumores benignos, que normalmente no invaden ni metastatizan.
El porcentaje (%) de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de polipéptido o anticuerpo de referencia es el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido o anticuerpo de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que son conocidas, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Se pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluidos los algoritmos necesarios para lograr el alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines del presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc., y el código fuente se ha archivado con la documentación del usuario en la Oficina del Derecho de autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el número de registro de Derecho de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para usar en un sistema operativo UNIX, incluido UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que, alternativamente, puede expresarse como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 por la fracción X/Y, donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B de ese programa, y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa informático ALIGN-2.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante al que es capaz de unirse una proteína de unión al antígeno, tal como un anticuerpo. Un epítopo es una región de un antígeno a la que se une una proteína de unión al antígeno que se dirige a ese antígeno y, cuando el antígeno es una proteína, incluye aminoácidos específicos que entran en contacto directamente con la proteína de unión al antígeno. La mayoría de las veces, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otros tipos de moléculas, tales como sacáridos o lípidos. Los determinantes de epítopos pueden incluir agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
Atributos estructurales de los anticuerpos descritos en el presente documento.
Una región determinante de la complementariedad ("CDR") es parte de una región variable de inmunoglobulina (anticuerpo) que es principalmente responsable de la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo. Las regiones CDR son muy variables de un anticuerpo a otro incluso cuando el anticuerpo se une específicamente a la misma diana o epítopo. Una región variable de cadena pesada comprende tres regiones CDR, abreviadas VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3; y una región variable de cadena ligera comprende tres regiones CDR, abreviadas VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3. Estas regiones CDR están ordenadas consecutivamente en la región variable, siendo la CDR1 la más N-terminal y siendo la CDR3 la más C-terminal. Intercaladas entre las CDR hay regiones armazón que contribuyen a la estructura y presentan mucha menos variabilidad que las regiones CDR. Una región variable de cadena pesada comprende cuatro regiones armazón, abreviadas VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 y VH-FR4; y una región variable de cadena ligera comprende cuatro regiones armazón, abreviadas VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3 y VL-FR4. Los anticuerpos bivalentes de tamaño entero completos que comprenden dos cadenas pesadas y ligeras comprenderán: 12 CDR, con tres CDR de cadena pesada únicas y tres CDR de cadena ligera únicas; 16 regiones FR, con cuatro regiones FR de cadena pesada únicas y cuatro regiones FR de cadena ligera únicas. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden como mínimo tres CDR de cadena pesada. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden como mínimo tres CDR de cadena ligera. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden como mínimo tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera. Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR o FR dada se pueden determinar fácilmente utilizando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD (esquema de numeración de "Kabat"); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración de "Chothia"); MacCallum et al., J.Mol. Biol.262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography", (esquema de numeración de "contactos"); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains", Dev CompImmunol,enero de 2003; 27(1): 55-77 (esquema de numeración "IMGT"); y Honegger A y Plückthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool", J MolBiol,8 de junio de 2001; 309(3):657-70, (esquema de numeración "Aho"). Las CDR se identifican en el presente documento a partir de secuencias variables proporcionadas utilizando diferentes sistemas de numeración, en el presente documento con el sistema de numeración de Kabat, el IMGT, el Chothia o cualquier combinación de los tres. Los límites de una CDR o FR dada pueden variar dependiendo del esquema utilizado para la identificación. Por ejemplo, el esquema de Kabat se basa en alineamientos estructurales, mientras que el esquema de Chothia se basa en información estructural. La numeración para los esquemas tanto de Kabat como de Chothia se basa en las longitudes de secuencia de las regiones de anticuerpos más comunes, con inserciones acomodadas por letras de inserción, por ejemplo, "30a", y deleciones que aparecen en algunos anticuerpos. Los dos esquemas colocan determinadas inserciones y deleciones ("indeles") en diferentes posiciones, dando como resultado una numeración diferencial. El esquema de contacto se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas y es similar en muchos aspectos al esquema de numeración de Chothia.
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones armazón (FR) conservadas y tres CDR (Véase p. ej., Kindt et al. KubyImmunology,6a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007)). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente (Véase p. ej., Portolano et al., J.Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al.,Nature352:624-628 (1991)). En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden regiones variables de origen de rata. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden CDR de origen de rata. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden regiones variables de origen de ratón. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden CDR de origen de ratón.
Se pueden hacer alteraciones (p. ej., sustituciones) en las CDR, p. ej., para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Tales alteraciones pueden realizarse en los codones que codifican las c Dr con una alta tasa de mutación durante la maduración somática (Véase p. ej., Chowdhury,Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), y se puede ensayar la afinidad de unión de la variante resultante. La maduración de la afinidad (p. ej., usando PCR propensa a errores, barajado de cadenas, aleatorización de CDR o mutagénesis dirigida a oligonucleótidos) se puede utilizar para mejorar la afinidad de los anticuerpos (Véase p. ej., Hoogenboom et al. enMethodsin MolecularBiology178:1-37 (2001)). Los restos de las CDR implicados en la unión al antígeno se pueden identificar específicamente, p. ej., usando mutagénesis de barrido de alanina o modelización (Véase p. ej., Cunningham y WellsScience,244:1081-1085 (1989)). A menudo las dianas son en particular CDR-H3 y CDR-L3. De forma alternativa, o adicional, se analiza una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos pueden seleccionarse o eliminarse como candidatos para la sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden una región constante además de una región variable. La región constante de la cadena pesada (C<h>) comprende cuatro dominios abreviados C<h>1, C<h>2, C<h>3 y C<h>4, situados en el extremo C-terminal del polipéptido completo de la cadena pesada, C-terminal respecto a la región variable. La región constante de la cadena ligera (C<l>) es mucho más pequeña que la C<h>y está situada en el extremo C-terminal del polipéptido completo de la cadena ligera, C-terminal respecto a la región variable. La región constante está muy conservada y comprende diferentes isotipos que están asociados con funciones y propiedades ligeramente diferentes. En determinadas realizaciones, la región constante es prescindible para la unión del anticuerpo a un antígeno diana. En determinadas realizaciones, las regiones constantes del anticuerpo, tanto las cadenas pesadas como las ligeras, son prescindibles para la unión del anticuerpo. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento carecen de una o más de una región constante de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o ambas. La mayoría de los anticuerpos monoclonales son de un isotipo IgG; que se divide a su vez en cuatro subclases IgG<1>, IgG<2>, IgG3 e IgG4. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden cualquier subclase de IgG. En determinadas realizaciones, la subclase de IgG comprende IgG<1>. En determinadas realizaciones, la subclase de IgG comprende IgG<2>. En determinadas realizaciones, la subclase de IgG comprende IgG3. En determinadas realizaciones, la subclase de IgG comprende IgG4.
Los anticuerpos comprenden un fragmento de región cristalizable (región Fc) que es responsable de la unión a los receptores Fc y del complemento. La región Fc comprende las regiones C<h>2, C<h>3 y C<h>4 de la molécula de anticuerpo. La región Fc de un anticuerpo es responsable de activar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y del complemento. La región Fc también contribuye a la semivida en el suero de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, la región Fc de los anticuerpos descritos en el presente documento comprende una o más sustituciones de aminoácidos que promueven la lisis celular mediada por el complemento. En determinadas realizaciones, la región Fc de los anticuerpos descritos en el presente documento comprende una o más sustituciones de aminoácidos que promueven la ADCC. En determinadas realizaciones, la región Fc de los anticuerpos descritos en el presente documento comprende una o más sustituciones de aminoácidos que reducen la lisis celular mediada por el complemento. En determinadas realizaciones, la región Fc de los anticuerpos descritos en el presente documento comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la unión del anticuerpo a un receptor Fc. En determinadas realizaciones, el receptor Fc comprende FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32), FcyRIIIA (CD16a), FcyRIIIB (CD16b), o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, la región Fc de los anticuerpos descritos en el presente documento comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la semivida en el suero del anticuerpo. En determinadas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la semivida en el suero del anticuerpo aumentan la afinidad del anticuerpo por el receptor Fc neonatal (FcRn).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de esta descripción son variantes que poseen algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que los convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante pero determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad invitroy/oin vivopara confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor Fc (FcR) para asegurarse que el anticuerpo carezca de unión a F<cy>R (por lo tanto, probablemente carezca de actividad ADCC), pero conserve la capacidad de unión a FcRn. Ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en las patentes de EE. UU. N.° 5,500,362 y 5,821,337. Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayo no radiactivos (p. ej., ensayos de citotoxicidad no radiactivos ACTI™ y CytoTox 96®). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (P<b>M<c>), monocitos, macrófagos y células citolíticas naturales (NK).
Los anticuerpos pueden tener semividas aumentadas y una mejor unión al receptor Fc neonatal (FcRn) (Véase p. ej., el documento US 2005/0014934). Dichos anticuerpos pueden comprender una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc al FcRn, e incluyen aquellos con sustituciones en uno o más restos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 según el sistema de numeración EU (Véase p. ej., la patente de EE. UU. N.° 7,371,826). También se contemplan otros ejemplos de variantes de la región Fc (Véase p. ej., Duncan y Winter,Nature322:738-40 (1988); las patentes de EE. UU. N.° 5,648,260 y 5,624,821; y WO94/29351).
Los anticuerpos útiles en centros médicos a menudo están "humanizados" para reducir la inmunogenicidad en individuos humanos. Los anticuerpos humanizados mejoran la seguridad y eficacia de la terapia con anticuerpos monoclonales. Un método común de humanización es producir un anticuerpo monoclonal en cualquier animal adecuado (p. ej., ratón, rata, hámster) y reemplazar la región constante con una región constante humana; los anticuerpos diseñados de esta manera se denominan "quiméricos". Otro método común es el "injerto de CDR", que reemplaza las V-FR no humanas con V-FR humanas. En el método de injerto de CDR, todos los restos excepto la región CDR son de origen humano. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento están humanizados. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento son quiméricos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento son de CDR injertadas.
La humanización generalmente reduce o tiene poco efecto sobre la afinidad general del anticuerpo. En el presente documento se describen anticuerpos que inesperadamente poseen una mayor afinidad por su diana después de la humanización. En determinadas realizaciones, la humanización aumenta la afinidad por el anticuerpo en 10%. En determinadas realizaciones, la humanización aumenta la afinidad por el anticuerpo en 25%. En determinadas realizaciones, la humanización aumenta la afinidad por el anticuerpo en 35%. En determinadas realizaciones, la humanización aumenta la afinidad por el anticuerpo en 50%. En determinadas realizaciones, la humanización aumenta la afinidad por el anticuerpo en 60%. En determinadas realizaciones, la humanización aumenta la afinidad por el anticuerpo en 75%. En determinadas realizaciones, la humanización aumenta la afinidad por el anticuerpo en 100%. La afinidad se mide adecuadamente usando resonancia de plasmón superficial (SPR). En determinadas realizaciones, la afinidad se mide utilizando LIF humano glicosilado. En determinadas realizaciones, el LIF humano glicosilado se inmoviliza en la superficie del chip de SPR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une con unaK<d>de menos de aproximadamente 300 nanomolar, 200 nanomolar, 150 nanomolar, 125 nanomolar, 100 nanomolar, 90 nanomolar, 80 nanomolar, 70 nanomolar, 60 nanomolar, 50 nanomolar, 40 nanomolar o menos.
Anticuerpos nuevos de la presente descripción.
Los anticuerpos descritos en el presente documento se generaron a partir de ratas y ratones inmunizados con ADN que codifica LIF humano.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VH-CDR1 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7 o 33, una VH-CDR2 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 9-13 o 35 y una VH-CDR3 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15 19 o 37. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VL-CDR1 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 21-23 o 39, una VL-CDR2 expuesta en las SEQ ID NO: 25-27 o 41 y una VL-CDR3 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 30, 43. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VH-CDR1 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7 o 33, una VH-CDR2 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 9-13 o 35 y una VH-CDR3 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15-19 o 37, una VL-CDR1 expuesta en una cualquiera de las SEQ IDn O:21-23 o 39, una VL-CDR2 expuesta en las SEQ ID NO: 25-27 o 41 y una VL-CDR3 expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 30, 43. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente al LIF humano.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52, o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67, o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, 90% o
95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos 80%, 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos 80%, 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ
ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente
95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55.
En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67, o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ
ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos H-FR3 idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano.
5D8
Los anticuerpos descritos en el presente documento se generaron a partir de ratas y ratones inmunizados con ADN que codifica LIF humano. Uno de dichos anticuerpos (5D8) se clonó y secuenció y comprende las CDR (usando la combinación de los métodos de numeración de CDR de Kabat e IMGT) con las siguientes secuencias de aminoácidos:
una VH-CDR1 correspondiente a la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), una VH-CDR2 correspondiente a SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), una VH-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), una VL-CDR1 correspondiente a SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDS<d>G<h>TYLN), una VL-CDR2 correspondiente a la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y una VL-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT).
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a
LIF que comprende una VH-CDR1 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), una VH-CDR2 al menos 80%, 90% o 95% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG) y una VH-CDR3 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VL-CDR1 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), una VL-CDR2 al menos 80% idéntica a la expuesta en la s Eq ID NO: 25 (SVSNLES) y una VL-CDR3 al menos 80% o 90%
idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VH-CDR1 expuesta en la
SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), una VH-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), una VH
CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), una VL-CDR1 expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), una VL-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y una VL-CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). Están previstas determinadas sustituciones de aminoácidos conservadoras en las secuencias de aminoácidos de las CDR de esta descripción. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos y no afecta a la afinidad de unión en más de 10%, 20% o 30%. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67, o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden todas de una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52, o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones estructurales de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ
ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta D NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta D NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta D NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta D NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta D NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta D NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SE
secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a
LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la
SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 al menos 80%, 90% o 95% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG) y una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 al menos
80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 95 (TSWEWDLDF). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 al menos 80% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 expuesta en la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 95 (TSWEWDLDF), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 expuesta en la SEQ IDNo :29 (MQATHAPPYT). Están previstas determinadas sustituciones de aminoácidos conservadoras en las secuencias de aminoácidos de las CDR de esta descripción. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos y no afecta a la afinidad de unión en más de 10%, 20% o 30%. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55.
En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente
95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID
NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden todos de una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:
50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la
SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%
o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:
68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de
VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ
ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59 , una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ
ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a
LIF que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 72 y 74. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo
que se une específicamente a LIF que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 72 y 74. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 75-78. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la<s>E<q>ID NO: 76.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 96; y una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 96; y una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 76.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 79-82; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 83-86. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 79-82; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 83-86. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 87-90; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 91-94. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 87-90; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 91-94.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 80; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 80; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 88; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 92. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la<s>E<q>ID NO: 88; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 92. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 88; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 97. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 88; y una cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 97.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10; una región determinante la de complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15; una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22; y una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26; y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3; una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9; una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16; una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21; y una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25; y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende: una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3; una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10; una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16; una región determinante de complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22; y una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26; y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
10G7
Otro anticuerpo clonado y secuenciado a partir de una inmunización de rata (10G7) comprende las CDR (usando la combinación de los métodos de numeración de CDR de Kabat e IMGT) con las siguientes secuencias de aminoácidos: una VH-CDR1 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 (GFTFSNAWMH), una VH-CDR2 correspondiente a la SEQ ID NO: 11 (QIKDKSDNYATYYAESVKG), una VH-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 17 (TCWEWYLDF), una VL-CDR1 correspondiente a la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), una VL-CDR2 correspondiente a la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y una VL-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT).
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VH-CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 4 (GFTFSNAWMH), una VH-CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 90% o 95% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 11 (QIKDKSDNYATYYAESVKG) y una VH-CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% o 90% idéntica a lo expuesta en la SEQ ID NO: 17 (TCWEWYLDF). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VL-CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), una VL-CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y una VL-CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una VH-CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 (GFTFSNAWMH), una VH-CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 (QIKDKSDNYATYYAESVKG), una VH-CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 (TCWEWYLDF), una VL-CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), una VL-CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y una VL-CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). Están previstas determinadas sustituciones de aminoácidos conservadoras en las secuencias de aminoácidos de las CDR de esta descripción. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 11, 17, 21,25 y 29 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 11, 17, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos y no afecta a la afinidad de unión en más de 10%, 20% o 30%. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52, o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de la cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden todas de una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente al LIF humano.
6B5
Otro anticuerpo clonado y secuenciado a partir de una inmunización de rata (6B5) comprende las CDR (usando el método de numeración de Kabat) con las siguientes secuencias de aminoácidos: una VH-CDR1 correspondiente a la SEQ ID NO: 7 (SKFMY), una VH-CDR2 correspondiente a la SEQ ID NO: 13 (WIYPGDGDTEYNQKFSE), una VH-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 19 (RDYHSSHFAY), una VL-CDR1 correspondiente a la SEQ ID NO: 23 (RSSQSLLHNNGNTYLS), una VL-CDR2 correspondiente a la SEQ ID NO: 27 (QVSNRFS) y una VL-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 30 (GQGTQYPYT).
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 al menos 80% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 7 (SKFMY), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 13 (WIYPGDGDTEYNQKFSE) y una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 19 (RDYHSSHFAY). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 23 (RSSQSLLHNNGNTYLS), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 al menos 80% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 27 (QVSNRFS) y una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 al menos 80% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 30(Gq GTQYPYT).En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 expuesta en la SEQ ID NO: 7 (SKFMY), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 13 (WIYPGDGDTEYNQKFSE), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 expuesta en laSeQID NO: 19 (RDYHSSHFAY), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 expuesta en la SEQ IDn O:23 (RSSQSLLHNNGNTYLS), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 27 (QVSNRFS) y una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 30 (GQGTQYPYT). Están previstas determinadas sustituciones de aminoácidos conservadoras en las secuencias de aminoácidos de las CDR de esta descripción. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 13, 19, 23, 27 y 30 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 13, 19, 23, 27 y 30 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos y no afecta a la afinidad de unión en más de 10%, 20% o 30%. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de la cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden todas de una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de la cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano.
9G7
Otro anticuerpo clonado y secuenciado a partir de una inmunización de ratón (9G7) comprende las CDR (usando el método de numeración de Kabat) con las siguientes secuencias de aminoácidos: una VH-CDR1 correspondiente a la SEQ ID NO: 33 (TAGMQ), una VH-CDR2 correspondiente a la SEQ ID NO: 35 (WINTQSGEPQYVDDFRG), una VH-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 37 (WALYSEYDVMDY), una VL-CDR1 correspondiente a la SEQ ID NO: 39 (KASENVDSYVS), una VL-CDR2 correspondiente a la SEQ ID NO: 41 (GASNRYT) y una VL-CDR3 correspondiente a la SEQ ID NO: 43 (GQSYRYPPT).
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 al menos 80% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 33 (TAGMQ), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 35 (WI<n>T<q>SGEPQYVDDFRG) y una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 37 (WALYSEYDVMDY). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID N<o>: 39 (KASENVDSYVS), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 al menos 80% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 41 (GASNRYT) y una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 al menos 80% o 90% idéntica a la expuesta en la SEQ ID NO: 43 (GQSYRYPPT). En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 expuesta en la SEQ ID NO: 33 (TAGMQ), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 35 (WINTQSGEPQYVDDFRG), una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 37 (WALYSEYDVMDY), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 expuesta en la SEQ ID NO: 39 (KASENVDSYVS), una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 expuesta en la SEQ ID NO: 41 (GASNRYT) y una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 43 (GQSYRYPPT). Están previstas determinadas sustituciones de aminoácidos conservadoras en las secuencias de aminoácidos de las CDR de esta descripción. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 39, 41, 43, 33, 35 y 37 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 39, 41, 43, 33, 35 y 37 en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos y no afecta a la afinidad de unión en más de 10%, 20% o 30%. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a LIF comprenden una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden todas de una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena pesada humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44-47, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52 o una secuencia de aminoácidos de la región VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-55. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 y una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a LIF comprende una o más regiones armazón de cadena ligera humana que comprenden: una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 56-59, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 60-63, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-67 o una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 68-70. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, la una o más regiones armazón de cadena pesada humana y la una o más regiones de cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos de VH-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45, una secuencia de aminoácidos de VH-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49, una secuencia de aminoácidos de VH-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, una secuencia de aminoácidos de VH-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, una secuencia de aminoácidos de VL-FR1 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 57, una secuencia de aminoácidos de VL-FR2 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 61, una secuencia de aminoácidos de VL-FR3 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de VL-FR4 idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 68. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a LIF humano.
Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen directamente al LIF humano. La secuencia de aminoácidos canónica del LIF humano viene dada por la SEQ ID NO: 98. Los expertos en la técnica apreciarán que son posibles variantes naturales de la SEQ ID NO: 98 entre la población humana que pueden conducir a diferencias de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos entre la SEQ ID NO: 98 y el LIF expresado por cualquier individuo humano dado. No se espera que los pequeños cambios que surgen debido a la variación natural den lugar a diferentes cinéticas de unión o eficacia en el tratamiento de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento.
Epítopos a los que se unen anticuerpos LIF terapéuticamente útiles
En el presente documento se describe un epítopo único de LIF humano que, cuando se une, inhibe la actividad biológica de LIF (p. ej., fosforilación de STAT3) e inhibe el crecimiento tumoralin vivo.El epítopo descrito en el presente documento consiste en dos tramos discontinuos de aminoácidos (del resto 13 al resto 32 y del resto 120 al 138 del LIF humano), que están presentes en dos dominios topológicos distintos (hélices alfa A y C) de la proteína LIF humana. Esta unión es una combinación de interacciones débiles (atracción de Van der Waals), medias (enlace de hidrógeno) y fuertes (puente salino). En determinadas realizaciones, un resto de contacto es un resto en LIF que forma un enlace de hidrógeno con un resto en un anticuerpo anti-LIF. En determinadas realizaciones, un resto de contacto es un resto en LIF que forma un puente salino con un resto en un anticuerpo anti-LIF. En determinadas realizaciones, un resto de contacto es un resto en LIF que da como resultado una atracción de Van der Waals con y está dentro de al menos 5, 4 o 3 angstroms de un resto en un anticuerpo anti-LIF.
En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 o H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a todos los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo aislado que se une a todos los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes o medias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes. En una determinada realización, el anticuerpo interacciona con la hélice A y C de LIF. En una determinada realización, el anticuerpo bloquea la interacción de LIF con gp130.
En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo que comprende las CDR con una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1,9, 15, 21,25 y 29 que se une a cualquiera, de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 o H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo que comprende las CDR con una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 y 29 que se une a todos los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes o medias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes.
En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo que comprende las CDR con una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1,9, 95, 21,25 y 29 que se une a cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 o H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que comprende las CDR con una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 y 29 que se une a todos los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes o medias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes.
En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo que comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos y se une a cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 o H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo que comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos y se une a todos los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20,<q>25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes o medias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes.
En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo que comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos y se une a cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte de los siguientes restos : A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 o H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, en el presente documento se describe un anticuerpo que comprende CDR que difieren de la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 y 29 en 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos y se unen a todos los siguientes restos: a 13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, q 25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes o medias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76 y se une a cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 o H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76 y se une a todos los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes o medias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes.
En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 96; y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76 y se une a cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte de los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 o H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a LIF que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 96; y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76 y se une a todos los siguientes restos: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 y H138 de la SEQ ID NO: 98. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes o medias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo solo se une a restos que participan con el anticuerpo en interacciones fuertes.
Indicaciones terapéuticas
En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento inhiben la señalización de LIF en las células. En determinadas realizaciones, la IC<50>para la inhibición biológica del anticuerpo en condiciones de falta de suero en células U-251 es menor o igual a aproximadamente 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 5 o 1 nanomolar. En determinadas realizaciones, la IC<50>para la inhibición biológica del anticuerpo en condiciones de falta de suero en células U-251 es menor o igual a aproximadamente 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 o 100 nanomolar.
Cualquier referencia a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico). En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles para tratar tumores y cánceres que expresan LIF. En determinadas realizaciones, un individuo tratado con los anticuerpos de esta descripción se ha seleccionado para el tratamiento por tener un tumor/cáncer positivo para LIF. En determinadas realizaciones, el tumor es LIF positivo o produce niveles elevados de LIF. En determinadas realizaciones, la positividad de LIF se determina en comparación con un valor de referencia o un criterio patológico establecido. En determinadas realizaciones, un tumor positivo para LIF expresa más de 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces o más LIF que una célula no transformada de la que deriva el tumor. En determinadas realizaciones, el tumor ha adquirido expresión ectópica de LIF. Un tumor positivo para LIF se puede determinar histológicamente usando, por ejemplo, inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-LIF; mediante métodos de biología molecular comúnmente utilizados tales como, por ejemplo, cuantificación de ARNm por PCR en tiempo real o RNA-seq; o cuantificación de proteínas, por ejemplo, por transferencia Western, citometría de flujo, ELISA o ensayos de cuantificación de proteínas homogéneas (p. ej., alfaLISA). En determinadas realizaciones, los anticuerpos se pueden usar para tratar pacientes diagnosticados de cáncer. En determinadas realizaciones, el cáncer comprende una o más células madre cancerosas o es una o más células madre cancerosas.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles para tratar tumores en cánceres que expresan el receptor LIF (CD118). Un tumor positivo para el receptor de LIF se puede determinar por histopatología o citometría de flujo y, en determinadas realizaciones, comprende una célula que se une a un anticuerpo para el receptor de LIF más de 2 veces, 3 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más que un control de isotipo. En determinadas realizaciones, el tumor ha adquirido expresión ectópica del receptor de LIF. En una determinada realización, el cáncer es una célula madre cancerosa. En una determinada realización, un tumor o cáncer positivo para LIF se puede determinar por inmunohistoquímica usando anti-LIF un anticuerpo anti-LIF. En una determinada realización, un tumor positivo para LIF se determina por análisis IHC con un nivel de LIF en el 10%, 20%, 30%, 40% o 50% superior de los tumores.
Los anticuerpos descritos en el presente documento influyen en numerosos resultados. En una determinada realización, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden reducir la presencia de macrófagos M2 en tumores en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en un modelo de tumor en comparación con un anticuerpo de control (p. ej., control de isotipo). Los macrófagos M2 se pueden identificar mediante tinción para CCL22 y CD206 en secciones de IHC o mediante citometría de flujo de células inmunitarias o mieloides que infiltran tumores. En una determinada realización, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden reducir la unión de LIF a tumores gp130 en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más cuando se compara con un anticuerpo de control (p. ej., control de isotipo). En una determinada realización, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden reducir la señalización de LIF en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en una línea celular sensible a LIF en comparación con un anticuerpo de control (p. ej., control de isotipo). La señalización de LIF se puede medir, por ejemplo, mediante transferencia Western para STAT3 fosforilado (una diana posterior de la señalización de LIF). Los anticuerpos aquí también son altamente específicos para LIF en comparación con otras citoquinas miembros de la familia de IL-6. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se unen a LIF humano con una afinidad de aproximadamente 10 veces, aproximadamente 50 veces o aproximadamente 100 veces mayor que la de cualquier otra citoquina miembro de la familia de IL-6. En determinadas realizaciones, los anticuerpos LIF no se unen a otras citoquinas miembros de la familia de IL-6 que se producen en un sistema de mamífero. En determinadas realizaciones, los anticuerpos no se unen a la oncostatina M que se ha producido en un sistema de mamífero.
En determinadas realizaciones, se describen en el presente documento anticuerpos útiles para el tratamiento de un cáncer o tumor. En determinadas realizaciones, el cáncer comprende tumores de mama, corazón, pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza, cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, médula ósea, sangre, timo, útero, testículo y hepático. En determinadas realizaciones, los tumores que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención comprenden adenoma, adenocarcinoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y/o teratoma. En determinadas realizaciones, el tumor/cáncer se selecciona del grupo de melanoma lentiginoso acral, queratosis actínica, adenocarcinoma, carcinoma adenoide quístico, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, tumores astrocíticos, carcinoma de glándula de Bartolino, carcinoma de células basales, carcinoma de glándula bronquial, carcinoma capilar carcinoide, carcinosarcoma, colangiocarcinoma, condrosarcoma, cistadenoma, tumor del seno endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma del estroma endometrial, adenocarcinoma endometrioide, sarcoma ependimario, sarcoma de Swing, hiperplasia nodular focal, gastronoma, tumores de la línea germinal, glioblastoma, glucagonoma, hemangioblastoma, hemangioendotelioma, hemangioma, adenoma hepático, adenomatosis hepática, carcinoma hepatocelular, insulinita, neoplasia intraepitelial, neoplasia intraepitelial de células escamosas, carcinoma de células escamosas invasivo, carcinoma de células grandes, liposarcoma, carcinoma de pulmón, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leiomiosarcoma, melanoma, melanoma maligno, tumor mesotelial maligno, tumor de la vaina nerviosa, meduloblastoma, meduloepitelioma, mesotelioma, carcinoma mucoepidermoide, leucemia mieloide, neuroblastoma, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, osteosarcoma, carcinoma de ovario, adenocarcinoma seroso papilar, tumores hipofisarios, plasmocitoma, pseudosarcoma, carcinoma de próstata, blastoma pulmonar, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de tejido blando, tumor secretor de somatostatina, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma indiferenciado, melanoma uveal, carcinoma verrugoso, carcinoma de vagina/vulva, vipoma y tumor de Wilms. En determinadas realizaciones, el tumor/cáncer a tratar con uno o más anticuerpos de la invención comprende cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma colorrectal, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda de células pre-B, cáncer de vejiga, astrocitoma, preferiblemente astrocitoma de grado II, III o IV, glioblastoma, glioblastoma multiforme, cáncer microcítico y cáncer no microcítico, preferiblemente cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico independiente de andrógenos, cáncer de próstata metastásico dependiente de andrógenos, adenocarcinoma de próstata y cáncer de mama, preferiblemente cáncer ductal de mama y/o carcinoma de mama. En determinadas realizaciones, el cáncer tratado con los anticuerpos de esta descripción comprende glioblastoma. En determinadas realizaciones, el cáncer tratado con uno o más anticuerpos de esta descripción comprende cáncer de páncreas. En determinadas realizaciones, el cáncer tratado con uno o más anticuerpos de esta descripción comprende cáncer de ovario. En determinadas realizaciones, el cáncer tratado con uno o más anticuerpos de esta descripción comprende cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, el cáncer tratado con uno o más anticuerpos de esta descripción comprende cáncer de próstata. En determinadas realizaciones, el cáncer tratado con uno o más anticuerpos de esta descripción comprende cáncer de colon. En determinadas realizaciones, el cáncer tratado comprende glioblastoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata o cáncer de pulmón. En una determinada realización, el cáncer es refractario a otro tratamiento. En una determinada realización, el cáncer tratado recae. En una determinada realización, el cáncer es un glioblastoma en recaída/refractario, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata o cáncer de pulmón.
Métodos terapéuticos
En determinadas realizaciones, los anticuerpos se pueden administrar por cualquier vía adecuada para la administración de composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos, tales como, por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intratumoral o intracerebral, etc. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se administran por vía intravenosa. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se administran según una pauta posológica adecuada, por ejemplo, semanal, dos veces por semana, mensual, dos veces al mes, etc. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se administran una vez cada tres semanas. Los anticuerpos se pueden administrar en cualquier cantidad terapéuticamente eficaz. En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente aceptable está entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg. En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente aceptable está entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg. En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente aceptable está entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg.
Agentes terapéuticos adicionales
En determinadas realizaciones, los anticuerpos se pueden administrar con o durante el tratamiento con un agente terapéutico adicional. En determinadas realizaciones, el agente terapéutico comprende una proteína recombinante o anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, la proteína recombinante o anticuerpo monoclonal comprende Etaracizumab (Abegrin), Tacatuzumab tetraxetano, Bevacizumab (Avastin), Labetuzumab, Cetuximab (Erbitux), Obinutuzumab (Gazyva), Trastuzumab (Herceptin), Clivatuzumab, Trastuzumab emtansina (Kadcyla), Ramucirumab, Rituximab (MabThera, Rituxan), Gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg), Pertuzumab (Omnitarg), Girentuximab (Rencarex) o Nimotuzumab (Theracim, Theraloc). En determinadas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende un inmunomodulador que se dirige a un inhibidor de punto de control, por ejemplo PD-1 o CTLA-4. En determinadas realizaciones, el inmunomodulador comprende Nivolumab, Ipilimumab, Atezolizumab o Pembrolizumab. En determinadas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico. En determinadas realizaciones, el agente quimioterapéutico es un agente alquilante (p. ej., ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfán, melfalán, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas o temozolomida), una antraciclina (p. ej., doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirrubicina o mitoxantrona), un disruptor del citoesqueleto (p. ej., paclitaxel o docetaxel), un inhibidor de la histona desacetilasa (p. ej., vorinostat o romidepsina), un inhibidor de la topoisomerasa (p. ej., irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido o tenipósido), un inhibidor de la quinasa (p. ej., bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib o vismodegib), un análogo de nucleósido o un análogo precursor (p. ej., azacitidina, azatioprina, capecitabina, citarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato o tioguanina), un antibiótico peptídico (p. ej., actinomicina o bleomicina), un agente a base de platino (p. ej., cisplatino, oxaloplatino o carboplatino) o un alcaloide vegetal (p. ej., vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel o docetaxel). En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es un análogo de nucleósido. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es gemcitabina. En determinadas realizaciones, el agente terapéutico adicional es radioterapia.
Vehículos farmacéuticamente aceptables
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente descripción se administran suspendidos en una solución estéril. En determinadas realizaciones, la solución comprende una concentración de sal fisiológicamente apropiada (p. ej., NaCl). En determinadas realizaciones, la solución comprende NaCl entre aproximadamente al 0.6% y al 1.2%. En determinadas realizaciones, la solución comprende NaCl entre aproximadamente al 0.7% y al 1.1%. En determinadas realizaciones, la solución comprende NaCl entre aproximadamente al 0.8% y al 1.0%. En determinadas realizaciones, una solución madre de anticuerpo altamente concentrada se puede diluir en NaCl aproximadamente al 0.9%. En determinadas realizaciones, la solución comprende NaCl aproximadamente al 0.9%. En determinadas realizaciones, la solución comprende además uno o más de: tampones, por ejemplo, acetato, citrato, histidina, succinato, fosfato, bicarbonato e hidroximetilaminometano (Tris); tensioactivos, por ejemplo, polisorbato 80 (Tween 80), polisorbato 20 (Tween 20), polisorbato y poloxámero 188; poliol/disacárido/polisacáridos, por ejemplo, glucosa, dextrosa, manosa, manitol, sorbitol, sacarosa, trehalosa y dextrano 40; aminoácidos, por ejemplo, histidina, glicina o arginina; antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico, metionina; y agentes quelantes, por ejemplo, EGTA o EGTA. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente descripción se envían/almacenan liofilizados y se reconstituyen antes de la administración. En determinadas realizaciones, las formulaciones de anticuerpos liofilizados comprenden un agente de carga tal como manitol, sorbitol, sacarosa, trehalosa y dextrano 40. En una determinada realización, los anticuerpos anti-LIF de esta descripción se pueden enviar y almacenar como una solución madre concentrada para ser diluida en el lugar de uso del tratamiento. En determinadas realizaciones, la solución madre comprende histidina aproximadamente 25 mM, sacarosa aproximadamente al 6%, polisorbato aproximadamente al 0.01% y anticuerpo anti-LIF aproximadamente 20 mg/ml.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustrativos son representativos de realizaciones de las aplicaciones de software, sistemas y métodos descritos en el presente documento y no pretenden ser limitantes de ninguna manera.
Ejemplo 1 - Generación de anticuerpos de rata específicos para LIF
Se clonó un ADNc que codifica los aminoácidos 23-202 de LIF humano en plásmidos de expresión (Aldevron GmbH, Friburgo, Alemania). Se inmunizaron grupos de ratas de laboratorio (Wistar) mediante aplicación intradérmica de partículas de oro recubiertas con ADN utilizando un dispositivo portátil para bombardeo de partículas ("pistola de genes"). La expresión en la superficie celular en células HEK transfectadas transitoriamente se confirmó con anticuerpos anti-marcador que reconocen un marcador añadido al extremo N de la proteína LIF. Se recogieron muestras de suero después de una serie de inmunizaciones y se ensayaron por citometría de flujo en células HEK transfectadas transitoriamente con los plásmidos de expresión antes mencionados. Se aislaron células productoras de anticuerpos y se fusionaron con células de mieloma de ratón (Ag8) según procedimientos convencionales. Los hibridomas que producen anticuerpos específicos para LIF se identificaron mediante cribado en un ensayo de citometría de flujo como se describió anteriormente. Se prepararon sedimentos celulares de células de hibridoma positivas utilizando un agente de protección de ARN (RNAlater, n.° de cat. AM7020 de ThermoFisher Scientific) y se procesaron adicionalmente para la secuenciación de los dominios variables de los anticuerpos.
Ejemplo 2 - Generación de anticuerpos de ratón específicos para LIF
Se clonó un ADNc que codifica los aminoácidos 23-202 de LIF humano en plásmidos de expresión (Aldevron GmbH, Friburgo, Alemania). Se inmunizaron grupos de ratones de laboratorio (NMRI) mediante aplicación intradérmica de partículas de oro recubiertas con ADN utilizando un dispositivo portátil para bombardeo de partículas ("pistola de genes"). La expresión en la superficie celular en células HEK transfectadas transitoriamente se confirmó con anticuerpos anti-marcador que reconocen un marcador añadido al extremo N de la proteína LIF. Se recogieron muestras de suero después de una serie de inmunizaciones y se ensayaron por citometría de flujo en células HEK transfectadas transitoriamente con los plásmidos de expresión antes mencionados. Se aislaron células productoras de anticuerpos y se fusionaron con células de mieloma de ratón (Ag8) según procedimientos convencionales. Los hibridomas que producen anticuerpos específicos para LIF se identificaron mediante cribado en un ensayo de citometría de flujo como se describió anteriormente. Se prepararon sedimentos celulares de células de hibridoma positivas utilizando un agente de protección de ARN (RNAlater, n.° de cat. AM7020 de ThermoFisher Scientific) y se procesaron adicionalmente para la secuenciación de los dominios variables de los anticuerpos.
Ejemplo 3 - Humanización de anticuerpos de rata específicos para LIF
Se eligió un clon de la inmunización de ratas (5D8) para su posterior humanización. La humanización se realizó utilizando métodos de injerto de CDR convencionales. Las regiones de cadena pesada y cadena ligera se clonaron a partir del hibridoma 5D8 usando técnicas de clonación molecular convencionales y se secuenciaron mediante el método de Sanger. Luego se realizó una búsqueda BLAST frente a secuencias variables de cadena pesada y cadena ligera humanas y se eligieron 4 secuencias de cada una como regiones armazón aceptoras para la humanización. Estas regiones armazón aceptoras se desinmunizaron para eliminar los epítopos de respuesta de células T. Las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera de 5D8 se clonaron en 4 regiones armazón aceptoras de cadena pesada diferentes (H1 a H4) y 4 regiones armazón de cadena ligera diferentes (L1 a L4). Luego se analizaron los 16 anticuerpos diferentes para determinar: expresión en células CHO-S (Selexis); inhibición de la fosforilación de STAT3 inducida por LIF; y afinidad de unión por resonancia de plasmones superficiales (SPR). Estos experimentos se resumen en la Tabla 1.
El rendimiento de la expresión de las células transfectadas se comparó en matraces Erlenmeyer (siembra de 3x105 células/ml, volumen de cultivo de 200 ml) dentro del cultivo discontinuo alimentado después de 10 días de cultivo celular. En este punto se recogieron las células y el anticuerpo secretado se purificó usando una columna de Proteína A y luego se cuantificó. Todos los anticuerpos humanizados eran expresados excepto aquellos que usan la cadena pesada H3.
La inhibición de la fosforilación de STAT3 en la tirosina 705 inducida por LIF se determinó mediante transferencia Western. Se sembraron células de glioma U251 en placas de 6 pocillos a una densidad de 100000 células/pocillo. Las células se cultivaron en medio completo durante 24 horas antes de cualquier tratamiento y después de eso, las células se privaron de suero durante 8 horas. Después de eso, las células con los anticuerpos indicados se dejaron durante la noche a una concentración de 10 μg/ml. Después del tratamiento, las proteínas obtenidas en el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contenía inhibidores de fosfatasa y proteasa, se cuantificaron (ensayo de proteínas BCA, Thermo Fisher Scientific) y se usaron en la transferencia Western. Para la transferencia Western, las membranas se bloquearon durante 1 hora en leche en polvo desnatada al 5% - TBST y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche (p-STAT3, n.° de catálogo 9145, Cell Signaling o STAT3, n.° de catálogo 9132, Cell Signaling) o 30 minutos (p-actina-peroxidasa, n.° de catálogo A3854, Sigma-Aldrich). Luego se lavaron las membranas con TBST, se incubaron con secundario y se lavaron nuevamente. Las proteínas se detectaron por quimioluminiscencia (SuperSignal Substrate, n.° de catálogo 34076, Thermo Fisher Scientific). Estos resultados se muestran en la Fig. 1. Cuanto más oscura es la banda de pSTAT3, menos inhibición está presente. La inhibición era alta en los carriles designados 5D8 (de rata no humanizado), A(H0L0), C (H1L2), D (H1l3) y G (H2L2); la inhibición era moderada en H (H2L3), O (H4L2) y P (H4L3); la inhibición estuvo ausente en B (H1L1), E (H1L4), F (H2L1), I (H2L4), N (H4L1) y Q (H4L4).
Los anticuerpos que presentaban inhibición de la fosforilación de STAT3 inducida por LIF después se analizaron por SPR para determinar la afinidad de unión. Brevemente, se observó la unión de los anticuerpos humanizados A(H0L0), C (<h>1<l>2), D (H1L3) y G (H2L2), H (H2L3) y O (H4L2) a hLIF acoplado a amina utilizando un instrumento Biacore™ 2002. Las constantes cinéticas y las afinidades se determinaron mediante ajuste matemático de sensorgramas (modelo de interacción de Langmuir [A B = AB]) de todos los sensorgramas generados en todas las superficies de los chips sensores en seis concentraciones de ligando. Las curvas mejor ajustadas (Chi2 mínimo) de cada concentración se utilizaron para calcular las constantes cinéticas y las afinidades. Véase la Tabla 1.
Dado que la configuración experimental utilizó anticuerpos bivalentes como analitos, los sensorgramas mejor ajustados también se analizaron basándose en un modelo de ajuste de analitos bivalentes [A+B = AB; AB+B = a B2] con el fin de obtener una visión más detallada del mecanismo de unión a la diana de los anticuerpos humanizados. El análisis de sensorgrama cinético utilizando un modelo de ajuste bivalente [A+B = AB; AB+B = AB2] confirmó la clasificación de afinidad relativa de las muestras de mAb.
El 5D8 humanizado que comprendía H2 y L2 se seleccionó para un análisis más profundo debido a su alta afinidad de unión y alto rendimiento del cultivo discontinuo.
Ejemplo 4 - La humanización del clon 5D8 mejora la unión a LIF
Los autores de la invención seleccionaron el clon H2L2 (h5D8) para análisis adicionales y compararon la unión por SPR con el 5D8 de rata parental (r5D8) y un clon de ratón 1B2. El anticuerpo 1B2 es un anticuerpo anti-LIF de ratón previamente descrito, depositado previamente en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSM ACC3054) y se incluyó con fines de comparación. Los LIF humanos recombinantes, purificados deE. coliy células HEK-293, respectivamente, se utilizaron como ligandos. El LIF de origen humano o de E.colise acopló covalentemente a la superficie de chips sensores ópticos de Biacore utilizando química de acoplamiento de aminas, y las afinidades de unión se calcularon a partir de las constantes cinéticas.
Materiales y métodos
El LIF humano a partir de E. coli se obtuvo de Millipore, referencia LIF 1010; el LIF humano a partir de células HEK-293 se obtuvo de ACRO Biosystems, referencia LIF-H521 b. El LIF se acopló a los chips sensores utilizando el kit de acoplamiento de aminas de Biacore (BR-1000-50; GE-Healthcare, Uppsala). Las muestras se analizaron en un instrumento Biacore™ 2002 que utiliza chips de sensores ópticos CM5 (BR-1000-12; GE-Healthcare, Uppsala). Se utilizó tampón HBS-EP de Biacore durante los análisis de la máquina (BR-1001-88; GE-Healthcare, Uppsala). El análisis cinético de los sensorgramas de unión se realizó utilizando el software BIAevaluationn 4.1. Las constantes cinéticas y las afinidades se determinaron mediante ajuste matemático de sensorgramas (modelo de interacción de Langmuir [A B = AB]) de todos los sensorgramas generados en todas las superficies de chips sensores a concentraciones crecientes de analito. Los sensorgramas también se analizaron basándose en un modelo de ajuste de sensorgrama de analito bivalente [A+B = AB; AB+B = AB<2>], incluido el análisis de componentes, con el fin de generar una estimación en la contribución bivalente a las afinidades anticuerpo-diana de Langmuir determinadas (p. ej., contribución de avidez). Las curvas mejor ajustadas (Chi2 mínimo) de cada concentración se utilizaron para el cálculo de constantes cinéticas y afinidades. Los resúmenes de estos experimentos de afinidad se muestran en la Tabla 2 (LIF humano hecho en E.coli)y Tabla 3 (LIF humano hecho en células HEK 293).
El modelo de ajuste de sensorgramas de Langmuir 1:1 de este conjunto de experimentos indica que el anticuerpo 5D8 humanizado (h5D8) se unió con una afinidad ~10 - 25 veces mayor al LIF humano que 1B2 de ratón y r5D8.
A continuación, se ensayó el anticuerpo h5D8 contra LIF de múltiples especies por SPR. La cinética de unión de h5D8 por SPR se realizó para analitos de LIF recombinantes derivados de diferentes especies y sistemas de expresión: LIF humano (E. coli, células HEK293); LIF de ratón (E. coli, células CHO); LIF de rata (E. coli); LIF de macaco cangrejero (levadura, células HEK293).
Materiales y métodos
El anticuerpo h5D8 se inmovilizó en la superficie del chip sensor mediante captura específica de Fc no covalente. Se utilizó proteína A/G de S.aureusrecombinante, específica de Ig(Fc) como agente de captura, permitiendo una presentación estéricamente uniforme y flexible del anticuerpo anti-LIF a los analitos LIF. Las fuentes de los analitos LIF son las siguientes: LIF humano (a partir de E.coli;referencia Millipore LIF 1050); LIF humano (a partir de células HEK ACRO Biosystems LIF-H521); LIF de ratón (E.coli;Millipore n.° de cat. NF-LIF2010); LIF de ratón (a partir de células CHO; n.° de catálogo de Reprokine RCP09056); LIF de macaco (levadura Kingfisher Biotech n.° de cat. RP1074Y); LIF de macaco producido en célula HEK-293. En general, h5D8 presentaba unión a LIF de varias especies. Un resumen de este experimento de afinidad se muestra en la Tabla 4.
Ejemplo 5 - El clon 5D8 humanizado inhibe la fosforilación de STAT3 inducida por LIFin vitro
Para determinar la actividad biológica de h5D8, las versiones humanizada y parental se ensayaron en un modelo de cultivo celular de activación de LIF. La Fig. 2A muestra que el clon humanizado presentaba una mayor inhibición de la fosforilación de STAT3 (Tyr 705) cuando se incubó una línea celular de glioma con LIF humano. La Fig. 2B muestra un experimento con la misma configuración de la Fig. 2A repetido con diferentes diluciones del anticuerpo h5D8.
Métodos
Se sembraron células de glioma U251 en placas de 6 pocillos a una densidad de 150000 células/pocillo. Las células se cultivaron en medio completo durante 24 horas antes de cualquier tratamiento. Después de eso, las células se trataron durante la noche o no (células de control) con el anticuerpo anti-LIF r5D8 o el anticuerpo anti-LIF h5D8 a una concentración de 10 pg/ml.
Después del tratamiento, se obtuvieron las proteínas en el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contenía inhibidores de fosfatasa y proteasa, se cuantificaron (ensayo de proteínas BCA, Thermo Fisher Scientific) y se usaron en transferencia Western. Para la transferencia Western, las membranas se bloquearon durante 1 hora en leche desnatada al 5% - TBST y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche (p-STAT3, n.° de catálogo 9145, Cell Signaling o STAT3, n.° de catálogo 9132, Cell Signaling) o 30 minutos (p-actina-peroxidasa, n.° de catálogo A3854, Sigma-Aldrich). Luego las membranas se lavaron con TBST, se incubaron con anticuerpo secundario si era necesario y se lavaron nuevamente. Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia (SuperSignal Substrate, n.° de catálogo 34076, Thermo Fisher Scientific).
Ejemplo 6 - Valor de IC<50>del tratamiento con anticuerpos h5D8 en niveles endógenos de LIF en células U-251.
También se determinó una IC<50>tan baja como 490 picomolar (Fig. 3A) para la inhibición biológica de h5D8 en condiciones de privación de suero en células U-251. Véanse los resultados representativos en las Figs. 3A y 3B y Tabla 5.
Métodos
Las células U-251 se sembraron a razón de 600000 células por placa de 6 cm (por condición). Las células se trataron con h5D8 en la concentración correspondiente (titulación) durante la noche a 37°C, con privación de suero (FBS al 0.1 %). Como control positivo para pSTAT3, se usó LIF recombinante (R&D n.° 7734-LF/CF) para estimular las células a 1.79 nM durante l0 min a 37°C. Como control negativo de pSTAT3, se usó el inhibidor de JAK I (Calbiochem n.° 420099) a 1 uM durante 30 minutos a 37°C. Luego, las células se recogieron en hielo para obtener lisados siguiendo el protocolo de los kits Multi-Spot Assay System Total STAT3 de Meso Scale Discovery (n.° de cat. K150SND-2) y Phospho-STAT3 (Tyr705) (n.° de cat. K150SVD-2), para medir los niveles de proteína detectables mediante el MSD Meso Sector S600.
Ejemplo 7 - Anticuerpos adicionales que se unen específicamente al LIF humano
Se identificaron otros clones de anticuerpos de rata (10G7 y 6B5) que se unen específicamente al LIF humano y a continuación se muestra un resumen de sus características de unión en la Tabla 6, el clon 1B2 sirvió como comparación.
Métodos
Se realizó un análisis de cinética de unión en tiempo real para los mAb anti-LIF 1B2, 10G7 y 6B5, inmovilizados en la superficie de chips sensores ópticos CM5, aplicando proteínas diana LIF recombinantes [LIF humano(E. coli);n.° de cat. de Millipore LIF 1010 y LIF humano (células HEK293); ACRO Biosystems n.° de cat. LIF-H521b] como analitos.
Las constantes cinéticas y las afinidades se obtuvieron mediante ajuste matemático de sensorgramas utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1 que aplica algoritmos globales (ajuste simultáneo de conjuntos de sensorgramas), así como de ajuste de curva única. La verosimilitud de los ajustes globales fue evaluada por análisis de kobs.
Ejemplo 8 - Anticuerpos anti-LIF adicionales inhiben la fosforilación de STAT3 inducida por LIFin vitro
Se ensayó la capacidad de clones adicionales para inhibir la fosforilación de STAT3 inducida por LIF en cultivos celulares. Como se muestra en la Fig. 4 los clones 10G7 y el r5D8 previamente detallado presentaban una alta inhibición de la fosforilación de STAT3 inducida por LIF, en comparación con el clon 1B2. Se incluyeron antisueros policlonales anti-LIF (pos.) como control positivo. Si bien 6B5 no presentó inhibición, esto puede explicarse por una posible falta de unión de 6B5 al LIF no glicosilado que se usó en este experimento.
Métodos
Se sembraron células de glioma derivadas de pacientes en placas de 6 pocilios a una densidad de 150000 células/pocillo. Las células se cultivaron en medio GBM que consistía en medio Neurobasal (Life Technologies) suplementado con B27 (Life Technologies), penicilina/estreptomicina y factores de crecimiento (EGF 20 ng/ml y FGF-2 20 ng/ml [PeproTech]) durante 24 horas antes de cualquier tratamiento. Al día siguiente, las células se trataron o no con LIF recombinante producido en E. coli o una mezcla de LIF recombinante más los anticuerpos indicados durante 15 minutos (concentración final de 10 pg/ml para los anticuerpos y 20 ng/ml de LIF recombinante). Después del tratamiento, se obtuvieron las proteínas en el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contenía inhibidores de fosfatasa y proteasa, se cuantificaron (ensayo de proteínas BCA, Thermo Fisher Scientific) y se usaron en transferencia Western. Para la transferencia Western, las membranas se bloquearon durante 1 hora en leche desnatada al 5% - TBST y se incubaron con anticuerpo primario durante la noche (p-STAT3, n.° de catálogo 9145, Cell Signaling) o 30 minutos (p-actina-peroxidasa, n.° de catálogo A3854, Sigma-Aldrich). Luego se lavaron las membranas con TBST, se incubaron con anticuerpo secundario si era necesario y se lavaron nuevamente. Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia (SuperSignal Substrate, n.° de catálogo 34076, Thermo Fisher Scientific).
Ejemplo 9 - LIF está altamente sobreexpresado en múltiples tipos de tumores
Se realizó el análisis inmunohistoquímico en múltiples tipos de tumores humanos para determinar el grado de expresión de LIF. Como se muestra en la Fig. 5 LIF se expresa altamente en glioblastoma multiforme (GBM), cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de ovario y cáncer colorrectal (CRC).
Ejemplo 10 - El clon h5D8 humanizado inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de ratón de carcinoma de pulmón no microcítico
Para determinar la capacidad del clon 5D8 humanizado para inhibir un cáncer positivo para LIFin vivo,este anticuerpo se ensayó en un modelo de ratón de carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC). La Fig. 6 muestra crecimiento tumoral reducido en ratones tratados con este anticuerpo en comparación con un control negativo de vehículo.
Métodos
La línea celular KLN205 de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) murino con altos niveles de LIF se infectó de manera estable con lentivirus que expresaban el gen de la luciferasa de luciérnaga para el seguimiento de la bioluminiscenciain vivo.Para desarrollar el modelo del ratón, se implantaron de forma ortotópica 5x105 células KLN205 de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) en el pulmón izquierdo de ratones DBA/2 singénicos inmunocompetentes de 8 semanas de edad mediante punción intercostal. Los ratones se trataron con un vehículo de control o con 15 mg/kg o 30 mg/kg del anticuerpo h5D8 por vía intraperitoneal dos veces por semana y se siguió el crecimiento del tumor por bioluminiscencia. Para las imágenes de bioluminiscencia, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 0.2 ml de D-luciferina 15 mg/ml bajo anestesia con isoflurano inhalado al 1-2%. Las señales de bioluminiscencia se siguieron utilizando el sistema IVIS serie 2000 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE. UU.) que consiste en una cámara CCD enfriada de alta sensibilidad. Se utilizó el software Living Image (Xenogen Corp.) para cuadricular los datos de imágenes e integrar las señales de bioluminiscencia total en cada región encuadrada. Los datos se analizaron utilizando la emisión total del flujo de fotones (fotones/segundo) en las regiones de interés (ROI). Los resultados demuestran que el tratamiento con el anticuerpo h5D8 promueve la regresión tumoral. Los datos se presentan como media ± SEM.
Ejemplo 11 - h5D8 inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de ratón de glioblastoma multiforme
En un modelo de tumor GBM ortotópico que utiliza una línea celular humana que expresa la luciferasa U251, r5D8 redujo significativamente los volúmenes tumorales en ratones a los que se les administraron 300 pg de r5D8 y h5D8 por inyección intraperitoneal (IP) dos veces por semana. Los resultados de este estudio se muestran en la Fig. 7A (cuantificación el día 26 después del tratamiento). Este experimento también se realizó utilizando ratones tratados con 200 pg o 300 pg de h5D8 humanizado que mostraron una reducción estadísticamente significativa del tumor después de 7 días de tratamiento.
Métodos
Se recogieron células U251 que expresaban luciferasa de manera estable, se lavaron en PBS, se centrifugaron a 400 g durante 5 min, se resuspendieron en PBS y se contaron con un contador de células automatizado (Countess, Invitrogen). Las células se mantuvieron en hielo para mantener una viabilidad óptima. Los ratones se anestesiaron con administración intraperitoneal de ketamina (Ketolar50®) / Xilacina (Rompún®) (75 mg/kg y 10 mg/kg respectivamente). Cada ratón se colocó cuidadosamente en el dispositivo estereotáctico y se inmovilizó. Se quitó el pelo de la cabeza con crema depilatoria y se cortó la piel de la cabeza con un bisturí para exponer el cráneo. Se realizó cuidadosamente una pequeña incisión con un taladro en las coordenadas 1.8 mm lateral y 1 mm anterior a la Lambda. Se inocularon 5 pl de células utilizando una jeringa Hamilton 30G en el cuerpo estriado derecho, a 2.5 mm de profundidad. La incisión en la cabeza se cerró con adhesivo tisular Hystoacryl (Braun) y a los ratones se les inyectó el analgésico subcutáneo Meloxicam (Metacam®) (1 mg/kg). El número final de células implantadas en cada ratón era 3x105.
Los ratones se trataron dos veces por semana con h5D8 administrado por vía intraperitoneal. El tratamiento se inició el día 0, inmediatamente después de la inoculación de las células tumorales. Los ratones recibieron un total de 2 dosis de h5D8 o control de vehículo.
Peso corporal y volumen del tumor: el peso corporal se midió 2 veces por semana y el crecimiento del tumor se cuantificó por bioluminiscencia el día 7 (Xenogen IVIS Spectrum). Para cuantificar la actividad de bioluminiscencia¡n vivo,los ratones se anestesiaron con isofluorano y se les inyectó por vía intraperitoneal sustrato de luciferina (PerkinElmer) (167 pg/kg).
El tamaño del tumor determinado por bioluminiscencia (Xenogen IVIS Spectrum) se evaluó el día 7. Se calcularon las mediciones individuales del tumor y la media ± SEM para cada grupo de tratamiento. La significación estadística se determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica para datos no pareados.
Ejemplo 12 - h5D8 inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de ratón de cáncer de ovario
La eficacia de r5D8 se evaluó en otros dos modelos de tumores singénicos. En el modelo ID8 de tumor ortotópico de ovario, la administración IP de 300 pg de r5D8 dos veces por semana inhibió significativamente el crecimiento del tumor medido por el volumen abdominal (Fig. 8A y 8B). Los resultados en la Fig. 8C muestran que h5D8 también redujo el volumen del tumor con una dosis de 200 pg y superior.
Métodos
Las células ID8 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Invitrogen), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Gibco, Invitrogen), penicilina 40 U/ml y estreptomicina 40 pg/ml (PenStrep) (Gibco, Invitrogen) y plasmocina 0.25 pg/ml (Invivogen).
Las células ID8 se recogieron, se lavaron en PBS, se centrifugaron a 400 g durante 5 min y se resuspendieron en PBS. Las células se mantuvieron en hielo para mantener la viabilidad óptima y se inyectaron por vía intraperitoneal 200 pl de la suspensión celular con una aguja de 27G. El número final de células implantadas en ratones fue 5x106.
Los ratones se trataron dos veces por semana con h5D8 administrado vía ip en diferentes dosis según lo indicado. Se midieron los pesos corporales 2 veces por semana y se siguió la progresión del tumor midiendo la circunferencia abdominal con un calibre (Fisher Scientific).
Ejemplo 13 - r5D8 inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de ratón de cáncer colorrectal
En ratones con tumores CT26 de colon subcutáneos, r5D8 (administrados 300 pg IP dos veces por semana) inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Fig. 9A y 9B).
Métodos
Las células CT26 se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI [Gibco, Invitrogen]), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina 40 U/ml y estreptomicina 40 pg/ml (PenStrep) y plasmocina 0.25 pg/ml.
Células CT26 (8 * 105) se tripsinizaron, se enjuagaron con PBS, se centrifugaron a 400 g durante 5 minutos y se resuspendieron en 100 pl de PBS. Las células se mantuvieron en hielo para evitar la muerte celular. Las células CT26 se administraron a ratones mediante inyección subcutánea utilizando una aguja 27G.
Se administraron 300 pg de r5D8, o control de vehículo, a los ratones mediante inyección intraperitoneal (IP) dos veces por semana desde el día 3 después del implante de células CT26.
El peso corporal y los volúmenes tumorales se midieron tres veces por semana. El volumen del tumor se midió usando un calibre (Fisher Scientific).
Ejemplo 14 - r5D8 reduce la infiltración inflamatoria en modelos tumorales
En el modelo ortotópico de GBM U251, la expresión de CCL22, un marcador de macrófagos polarizados M2, disminuyó significativamente en los tumores tratados con r5D8 como se muestra en la Fig. 10A. Este hallazgo también se confirmó en un modelo de cultivo de cortes de tejido organotípico fisiológicamente relevante utilizando h5D8 en el que tres muestras de pacientes mostraron una disminución significativa en la expresión de CCL22 y CD206 (MRC1) (también un marcador de macrófagos M2) después del tratamiento como se muestra en la Fig. 10B (compare la parte superior izquierda, control, con la parte inferior derecha, tratada, tanto para MRC1 como para CCL22). Además, r5D8 también disminuyó los macrófagos M2 CCL22+ en tumores ID8 (Fig. 10C) y CT26 (Fig. 10D) singénicos en ratones inmunocompetentes.
Ejemplo 15 - r5D8 aumenta las células efectoras no mieloides
Para investigar mecanismos inmunitarios adicionales, se evaluó el efecto de r5D8 sobre células T y otras células efectoras inmunitarias no mieloides dentro del microambiente tumoral. En el modelo singénico de ID8 ortotópico ovárico, el tratamiento con r5D8 dio como resultado un aumento de células NK intratumorales y un aumento de células T CD4+ y CD8+ totales y activadas como se muestra en la Fig. 11A. De manera similar, en el modelo de tumor CT26 singénico de colon, r5D8 aumentó las células NK intratumorales, aumentó las células T CD4+ y CD8+ y tendió a disminuir las células T-reg CD4+CD25+FoxP3+ como se muestra en la Fig. 11B. También se observaron una tendencia a la disminución de células T-reg CD4+CD25+FoxP3+ en el modelo de tumor ortotópico singénico KLN205 después del tratamiento con r5D8 como se muestra en la Fig. 11C. De acuerdo con un requisito de que las células T medien la eficacia, el agotamiento de células T CD4+ y CD8+ en el modelo CT26 inhibió la eficacia antitumoral de r5D8 como se muestra en la Fig. 12.
Métodos para el agotamiento de las células T
Se cultivaron células CT26 en medio de cultivo RPMI (Gibco, Invitrogen), suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS [Gibco, Invitrogen]), penicilina 40 U/ml y estreptomicina 40 pg/ml (PenStrep [Gibco, Invitrogen]) y plasmocina 0.25 pg/ml (Invivogen). Las células CT26 (5x105) se recogieron, se enjuagaron con PBS, se centrifugaron a 400 g durante 5 minutos y se resuspendieron en 100 pl de PBS. Las células se mantuvieron en hielo para evitar la muerte celular. Las células CT26 se administraron a ratones en ambos flancos mediante inyección subcutánea utilizando una jeringa 27G. Los ratones se trataron dos veces por semana con r5D8 administrado por vía intraperitoneal como se indica en el diseño del estudio. Se administró a los ratones control de vehículo (PBS), r5D8 de rata y/o anti-CD4 y anti-CD8 mediante inyección intraperitoneal (IP) dos veces por semana como se indica en el diseño del estudio. Todos los tratamientos con anticuerpos se administraron concomitantemente.
Ejemplo 16 - Estructura cristalina de h5D8 en complejo con LIF humano
La estructura cristalina de h5D8 se resolvió con una resolución de 3.1 angstroms con el fin de determinar el epítopo en LIF al que se unía h5D8 y para determinar los restos de h5D8 que participan en la unión. La estructura cocristalina puso de manifiesto que el bucle N-terminal de LIF está situado centralmente entre las regiones variables de cadena ligera y pesada de h5D8 (Fig. 13A). Además, h5D8 interacciona con restos en la hélice A y C de LIF, formando así un epítopo discontinuo y conformacional. La unión está guiada por varios puentes salinos, enlaces H e interacciones de Van der Waals (Tabla 7, Figura 13B). El epítopo de LIF de h5D8 abarca la región de interacción con gp130. Véase Boulanger, MJ, Bankovich, AJ, Kortemme, T., Baker, D. y Garcia, KC. Convergent mechanisms for recognition of divergent cytokines by the shared signaling receptor gpl30.Molecular cell12, 577-589 (2003). Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 7 y se representan en la Fig. 13.
Métodos
LIF se expresó transitoriamente en células HEK 293S (Gnt I-/-) y se purificó usando cromatografía de afinidad de Ni-NTA, seguido de cromatografía de filtración en gel en Tris 20 mM, pH 8.0 y NaCl 150 mM. El Fab h5D8 recombinante se expresó transitoriamente en células HEK 293F y se purificó usando cromatografía de afinidad KappaSelect, seguido de cromatografía de intercambio catiónico. Se mezclaron Fab h5D8 y LIF purificados en una relación molar de 1:2.5 y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la desglicosilación usando EndoH. Posteriormente se utilizó cromatografía de filtración en gel para purificar el complejo. El complejo se concentró a 20 mg/ml y se preparó para ensayos de cristalización usando tamices de matriz dispersa. Los cristales se formaron a 4°C en unas condiciones que contenían isopropanol al 19% (v/v), PEG 4000 al 19% (p/v), glicerol al 5% (v/v), citrato de sodio 0.095 M, pH 5.6. El cristal se difractó a una resolución de 3.1 A en la línea de luz 08ID-1 de la Fuente de Luz Canadiense (CLS). Los datos se recogieron, procesaron y escalaron usando XDS según Kabsch et al. Xds.Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography66, 125-132 (2010). Las estructuras se determinaron por reemplazo molecular usando Phaser según McCoy et al. Phaser crystallographic software.J Appl Crystallogr40, 658-674 (2007). Se realizaron varias iteraciones de construcción y refinamiento del modelo utilizando Coot y phenix.refine hasta que las estructuras convergieron a un Rtrabajo y Rlibre aceptables. Véase Emsley et al. Features and development of Coot.Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography66, 486-501 (2010); y Adams, et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography66, 213-221 (2010) respectivamente. Las figuras se generaron en PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Versión 2.0 Schrodinger, LLC).
Ejemplo 17 - h5D8 tiene alta especificidad para LIF
Se quería ensayar la unión de h5D8 a otros miembros de la familia LIF para determinar la especificidad de unión. Utilizando el análisis Octet96, la unión de h5D8 al LIF humano es aproximadamente 100 veces mayor que la unión a la Oncostatina M (OSM), el miembro de la familia IL-6 de mayor homología con LIF, cuando ambas proteínas se producen enE. coli.Cuando ambas proteínas se producen en un sistema de mamíferos, h5D8 no presenta unión a OSM. Los datos se resumen en la Tabla 8.
Métodos
Experimentos de unión de Octet: los reactivos se utilizaron y prepararon según el manual proporcionado por el fabricante. Se realizó un experimento de cinética básica utilizando el software Octet Data Acquisition ver. 9.0.0.26 como sigue: Configuración de sensores/programa: i) Equilibrio (60 segundos); ii) Carga (15 segundos); iii) Línea base (60 segundos); iv) Asociación (180 segundos); y v) Disociación (600 segundos)
Afinidad de h5D8 por citoquinas mediante Octet: se realizó un experimento de cinética básica utilizando el software Octet Data Acquisition ver. 9.0.0.26 de la siguiente manera: Los biosensores de 2.a generación reactivos con aminas (AR2G) se hidrataron durante un mínimo de 15 minutos en agua. La conjugación de aminas de h5D8 con los biosensores se realizó de acuerdo con la Nota técnica 26 de ForteBio (por favor, consulte las referencias) utilizando el kit de segunda generación de acoplamiento de aminas. Las etapas de inmersión se realizaron a 30°C, 1000 rpm como sigue: i) 60 segundos Equilibrio en agua; ii) 300 segundos Activación en ECD 20 mM, sulfo-NHS 10 mM en agua; iii) 600 segundos Inmovilización de h5D8 10 pg/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 6,0; iv) 300 segundos Inactivación en etanolamina 1 M, pH 8.5; v) 120 segundos Línea base en agua. Luego se realizaron experimentos de cinética con las siguientes etapas de inmersión y lectura a 30°C, 1000 rpm: vi) 60 segundos Línea base en tampón cinético 1X; vii) 180 segundos Asociación de diluciones seriadas apropiadas de una citoquina en tampón cinético 1X; viii) 300 segundos Disociación en tampón cinético 1X; ix) Tres ciclos de regeneración/neutralización alternando entre glicina 10 mM pH 2.0 y tampón cinético 1X respectivamente (5 segundos en cada uno durante 3 ciclos). Después de la regeneración, los biosensores se reutilizaron para análisis de unión posteriores.
El LIF recombinante humano producido a partir de células de mamíferos era de ACROBiosystems (LIF-H521b); la OSM recombinante humana producida en células de mamíferos era de R&D (8475-OM/CF); y la OSM recombinante humana producido en célulasE. coliprocedían de R&D (295-OM-050/CF).
Ejemplo 18 - Estructura cristalina de fab h5D8
Se determinaron cinco estructuras cristalinas del Fab h5D8 bajo un amplio espectro de condiciones químicas. Las altas resoluciones de estas estructuras indican que las conformaciones de los restos de CDR están asociadas con una flexibilidad menor y son muy similares en diferentes entornos químicos. Una característica única de este anticuerpo es la presencia de una cisteína no canónica en la posición 100 de la región variable pesada. El análisis de la estructura muestra que la cisteína no está apareada y en gran medida es inaccesible al disolvente.
Fab H5D8 se obtuvo mediante digestión con papaína de su IgG, seguida de purificación utilizando técnicas convencionales de cromatografía por tamaño, intercambio iónico y afinidad. Los cristales se obtuvieron utilizando métodos de difusión de vapor y permitieron determinar cinco estructuras cristalinas con una resolución que variaba entre 1.65 A a<2 .0>A. Todas las estructuras se resolvieron en el mismo grupo espacial cristalográfico y con dimensiones de celda unitaria similares (P<2121 21>, a~53.8 A, b~66.5 A, c~143.3 A), a pesar de que las condiciones de cristalización variaban en cinco niveles de pH diferentes: 5.6, 6.0, 6.5, 7.5 y 8.5. Así pues, estas estructuras cristalinas permiten la comparación de la disposición tridimensional de Fab h5D8 sin impedimentos por artefactos del empaquetamiento cristalino y en un amplio espectro de condiciones químicas.
Se observó densidad electrónica para todos los restos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que posteriormente se modelizaron. Visiblemente, LCDR1 y HCDR2 adoptaban conformaciones alargadas que junto con regiones LCDR3 y HCDR3 poco profundas formaban un surco de unión en el centro del paratopo (Fig. 14A). Las cinco estructuras eran muy similares en todos los restos, con desviaciones cuadráticas medias de todos los átomos que variaban entre 0.197 A y 0.327 A (Fig. 14A). Estos resultados indicaban que las conformaciones de los restos de las CDR se mantenían en diversos entornos químicos, incluidos niveles de pH que variaban entre 5.6 y 8.5 y fuerzas iónicas que variaban entre 150 mM y 1 M. El análisis de la superficie electrostática del paratopo de h5D8 puso de manifiesto que las regiones con carga positiva y negativa contribuían por igual a las propiedades hidrofílicas, sin parches hidrofóbicos predominantes. h5D8 tiene la característica poco común de una cisteína no canónica en la base de HCDR3 (Cys100). En las cinco estructuras, esta cisteína libre está ordenada y no forma ninguna mezcla de disulfuros. Además, no se modifica por la adición de Cys (cisteinilación) o glutatión (glutationilación) y forma interacciones de Van der Waals (distancias de 3.5-4.3 A) con los átomos de la cadena principal y la cadena lateral de Leu4, Phe27, Trp33, Met34, Glu102 y Leu105 de la cadena pesada (Fig. 14B). Finalmente, la Cys100 es un resto estructural predominantemente enterrado que parece estar implicado en la mediación de las conformaciones de CDR1 y HCDR3. Por tanto, es poco probable que tenga reactividad con otras cisteínas, como se observa por una disposición homogénea de esta región en las cinco estructuras cristalinas.
Métodos
La IgG h5D8-1 se obtuvo de Catalent Biologics y se formuló en histidina 25 mM, sacarosa al<6>%, polisorbato 80 al 0.01%, a pH 6.0. La IgG formulada se sometió a intercambio extensamente con tampón en PBS usando un concentrador de MWCO de 10 K (Millipore) antes de la digestión con papaína 1:100 microgramos (Sigma) durante 1 hora a 37°C en PBS, EDTA 1.25 mM, cisteína 10 mM. La IgG digerida con papaína se hizo pasar a través de una columna de Proteína A (GE Healthcare) utilizando un sistema de cromatografía AKTA Start (GE Healthcare). El flujo a través de la proteína A, que contenía el Fab h5D8, se recuperó y se sometió a intercambio con tampón en acetato de sodio 20 mM, pH 5.6 usando un concentrador de MWCO de 10 K (Millipore). La muestra resultante se cargó en una columna de intercambio catiónico Mono S (GE Healthcare) utilizando un sistema de cromatografía AKTA Pure (GE Healthcare). La elución con un gradiente de cloruro de potasio 1 M dio como resultado un pico de Fab h5D8 predominante que se recuperó, concentró y purificó hasta lograr homogeneidad de tamaño usando una columna de filtración en gel Superdex 200 Increase (GE Healthcare) en Tris-HCl 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, a pH 8.0. La alta pureza del Fab h5D8 se confirmó por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras.
El Fab h5D8 purificado se concentró a 25 mg/ml usando un concentrador de MWCO de 10 K (Millipore). Se utilizó un dispensador Oryx 4 (Douglas Instruments) para configurar experimentos de cristalización por difusión de vapor con cribados comerciales de matriz dispersa de 96 condiciones JCSG TOP96 (Rigaku Reagents) y MCSG-1 (Anatrace) a 20°C. Los cristales se obtuvieron y se recogieron después de cuatro días en las cinco condiciones de cristalización siguientes: 1) citrato de sodio 0.085 M, PEG 4000 al 25.5% (p/v), acetato de amonio 0.17 M, glicerol al 15% (v/v), pH 5.6; 2) MES 0.1 M, PEG 6000 al 20% (p/v), cloruro de litio 1 M, pH 6.0; 3) MES 0.1 M, PEG 4000 al 20% (p/v), cloruro de sodio 0.6 M, pH 6.5; 4) HEPES de sodio 0.085 M, PEG 4000 al 17% (p/v), 2-propanol al 8.5% (v/v), glicerol al 15% (v/v), pH 7.5; y 5) Tris<0 .08>M, PEG 4000 al 24% (p/v), cloruro de magnesio 0.16 M, glicerol al 20% (v/v), pH 8.5. Antes de la congelación instantánea en nitrógeno líquido, las aguas madre que contenían los cristales se complementaron con glicerol al 5-15% (v/v) o etilenglicol al 10% (v/v), según fuera necesario. Los cristales se sometieron a radiación en sincrotrón de rayos X en Advanced Photon Source, línea de luz 23-ID-D (Chicago, IL) y se registraron patrones de difracción en un detector Pilatus3<6>M. Los datos se procesaron usando XDS y las estructuras se determinaron por reemplazo molecular usando Phaser. El refinamiento se llevó a cabo en PHENIX con la construcción de modelos iterativos en Coot. Las figuras se generaron en PyMOL. Se accedió a todo el software a través de SBGrid.
Ejemplo 19 - Las mutaciones en la cisteína 100 de h5D8 preservan la unión.
El análisis de h5D8 puso de manifiesto un resto de cisteína libre en la posición 100 (C100) en la región variable de la cadena pesada. Las variantes de H5D8 se generaron sustituyendo C100 por cada aminoácido natural con el fin de caracterizar la unión y la afinidad por el LIF humano y de ratón. La unión se caracterizó usando ELISA y ensayo Octet. Los resultados se resumen en la Tabla 9. Las curvas de EC50 de ELISA se muestran en la Fig. 15 (Fig. 15A LIF humano y Figura 15B LIF de ratón).
Métodos
ELISA: La unión de las variantes en C100 de h5D8 a LIF humano y de ratón se determinó por ELISA. Se recubrieron placas de 384 pocillos Maxisorp con proteína LIF recombinante humana o de ratón a 1 ug/ml durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con tampón de bloqueo 1x durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron valoraciones de cada variante en C100 de h5D8 y se dejó que se unieran durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS+Tween-20 al 0.05%. Se añadió anti-IgG humana conjugada con HRP y se dejó que se uniera durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS+Tween-20 al 0.05% y se revelaron utilizando sustrato 1x TMB. La reacción se detuvo con HCl 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm. La generación de figuras y el análisis de regresión no lineal se realizaron utilizando Graphpad Prism.
Octet RED96: La afinidad de las variantes en C100 de h5D8 por LIF humano y de ratón se determinó por BLI utilizando el sistema Octet RED96. Las variantes en C100 de h5D8 se cargaron en biosensores Anti-Fc humano a 7.5 ug/ml después de una línea base de 30 segundos en tampón cinético 1X. Las valoraciones de la proteína LIF humana o de ratón se asociaron a los biosensores cargados durante 90 segundos y se dejaron disociar en tampón cinético 1x durante 300 segundos. Las KD se calcularon mediante el software de análisis de datos utilizando un modelo de ajuste global 1:1.
Ejemplo 20 - h5D8 bloquea la unión de LIF a gp130in vitro
Para determinar si h5D8 impedía que LIF se uniera al LIFR, se realizó un ensayo de unión molecular utilizando la plataforma Octet RED 96. Se cargó h5D8 sobre biosensores AHC mediante captura de anti-Fc humano. Luego, los biosensores se sumergieron en LIF y, como se esperaba, se observó asociación (Fig. 16A, tercio central). Posteriormente, los biosensores se sumergieron en diferentes concentraciones de LIFR. Se observó una asociación dependiente de la dosis (Fig. 16A, tercio de la derecha). El experimento de control demostró que esta asociación era específica de LIF (no se muestra) y no se debía a una interacción no específica de LIFR con h5D8 o con los biosensores.
Para caracterizar mejor la unión de h5D8 y LIF, se realizó una serie de experimentos de unión por ELISA. h5D8 y LIF se preincubaron y luego se introdujeron en placas recubiertas con LIFR humano recombinante (hLIFR) o gp130. La falta de unión entre el complejo h5D8/LIF y el sustrato en el recubrimiento indicaría que h5D8 de alguna manera alteraba la unión de LIF al receptor. Además, también se utilizaron los anticuerpos de control que no se unían a LIF (control de isotipo, indicado por (-)) o que se unen a LIF en sitios de unión conocidos (B09 no compite ni con gp130 ni con LIFR por la unión de LIF; r5D8 es la versión parental de rata de h5D8). Los resultados de ELISA demostraron que el complejo h5D8/LIF era capaz de unirse a hLIFR (al igual que el complejo r5D8/LIF), lo que indica que estos anticuerpos no impedían la asociación LIF/LIFR (Figura 16A). Por el contrario, el complejo h5D8/LIF (y un complejo r5D8/LIF) no fue capaz de unirse a la gp130 humana recombinante (Fig. 16B). Esto indica que el sitio de unión de gp130 de LIF se vio afectado cuando LIF se unió a h5D8.
Ejemplo 21 - Expresión de LIF y LIFR en tejidos humanos
Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real en muchos tipos diferentes de tejido humano con el fin de determinar los niveles de expresión de LIF y LIFR. Los niveles medios de expresión mostrados en la Fig. 17A y 17B se dan como copias por 100 ng de ARN total. La mayoría de los tejidos expresaban al menos 100 copias por 100 ng de ARN total. La expresión de ARNm de LIF más alta era en el tejido adiposo humano (mesentérico-íleon [1]), tejido de los vasos sanguíneos (plexo coroideo [6] y mesentérico [8]) y tejido del cordón umbilical [68] y más baja en el tejido cerebral (corteza [20] y sustancia negra [28]). La expresión de ARNm de LIFR más alta era en el tejido adiposo humano (mesentérico-íleon [1]), tejido de vasos sanguíneos (pulmonar [9]), tejido cerebral [11-28] y tejido tiroideo [66] y la más baja era en PBMC [31]. Los niveles de expresión de ARNm de LIF y LIFR en tejidos de macaco cangrejero eran similares a los observados en tejidos humanos, en donde la expresión de LIF era alta en el tejido adiposo y la expresión de LIFR era alta en el tejido adiposo y baja en PBMC (datos no mostrados).
La numeración de tejidos para la Fig. 17A y Fig. 17B es: 1 - adiposo (mesentérico-íleon); 2 - glándula suprarrenal; 3 -vejiga; 4 - vejiga (trígono); 5 - vaso sanguíneo (cerebral: arteria cerebral media); 6 - vaso sanguíneo (plexo coroideo); 7 - vaso sanguíneo (arteria coronaria); 8 - vaso sanguíneo (mesentérico (colon)); 9 - vaso sanguíneo (pulmonar); 10 -vaso sanguíneo (renal); 11 - cerebro (amígdala); 12 - cerebro (caudado); 13 - cerebro (cerebelo); 14 cerebro - (corteza: cíngulo anterior); 15 - cerebro (corteza: cíngulo posterior); 16 - cerebro (corteza: frontal-lateral); 17 - cerebro (corteza: frontal-medial); 18 - cerebro (corteza: occipital); 19 - cerebro (corteza: parietal); 20 - cerebro (corteza: temporal); 21 -cerebro (núcleo-dorsal-rafe); 22 - cerebro (hipocampo); 23 - cerebro (hipotálamo: anterior); 24 - cerebro (hipotálamo: posterior); 25 - cerebro (locus coeruleus); 26 - cerebro (bulbo raquídeo); 27 - cerebro (núcleo accumbens); 28 - cerebro (sustancia negra); 29 - pecho; 30 - ciego; 31 células mononucleares de sangre periférica (PBMC); 32 - colon; 33 -ganglios de la raíz dorsal (DRG); 34 - duodeno; 35 - trompa de Falopio; 36 - vesícula biliar; 37 - corazón (aurícula izquierda); 38 - corazón (ventrículo izquierdo); 39 - íleon; 40 - yeyuno; 41 - riñón (corteza); 42 - riñón (médula); 43 -riñón (pelvis); 44 - hígado (parénquima); 45 - hígado (bronquio: primario); 46 - hígado (bronquio: terciario); 47 - pulmón (parénquima); 48 - glándula linfática (amígdala); 49 - músculo (esquelético); 50 - esófago; 51 - ovario; 52 - páncreas; 53 - glándula pineal; 54 - glándula pituitaria; 55 - placenta; 56 - próstata; 57 - recto; 58 - piel (prepucio); 69 - médula espinal; 60 - bazo (parénquima); 61 - estómago (antro); 62 - estómago (cuerpo); 63 - estómago (fondo gástrico); 64 -estómago (canal pilórico); 65 - testículo; 66 - glándula tiroides; 67 - tráquea; 68 - cordón umbilical; 69 - uréter; 70 -útero (cuello uterino); 71 - útero (miometrio); y 72 - conductos deferentes.
Si bien en el presente documento se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invención, será obvio para los expertos en la técnica que dichas realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo únicamente.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo recombinante que se une específicamente al factor inhibidor de la leucemia (LIF) que comprende:
a) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (VH-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 (GFTFSHAW);
b) una región determinante de complementariedad 2 de cadena pesada (VH-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 (IKAKSDd Ya T);
c) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (VH-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF);
d) una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (VL-CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 (QSLLDSDGHTY);
e) una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (VL-CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26 (SVS); y
f) una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (VL-CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT),
en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF.
2. El anticuerpo recombinante de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo recombinante se une a LIF glicosilado.
3. El anticuerpo recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el anticuerpo recombinante está humanizado.
4. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo recombinante está desinmunizado.
5. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo recombinante comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina.
6. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo recombinante comprende un Fab, F(ab)<2>, anticuerpo de dominio único o un fragmento variable de cadena única (scFv).
7. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF con una constante de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 200 picomolar.
8. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo recombinante se une específicamente a LIF con una constante de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 100 picomolar.
9. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la VH-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), en donde la VH-CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), en donde la VH-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), en donde la VL-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), en donde la VL-CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) y en donde la VL-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT).
10. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la secuencia de VH es al menos aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y la secuencia de VL es al menos aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76.
11. El anticuerpo recombinante de la reivindicación 10, en donde la secuencia de VH es una región variable de cadena pesada humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 72; y la secuencia de VL es una región variable de cadena ligera humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76.
12. El anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para usar en el tratamiento de un cáncer.
13. El anticuerpo recombinante para usar de la reivindicación 12, en donde el cáncer comprende glioblastoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata o cáncer de pulmón.
14. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, formulada para administración intravenosa.
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