ES2761689T3

ES2761689T3 - Métodos para producir abienol

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Publication number: ES2761689T3
Application number: ES15867372T
Authority: ES
Inventors: John Royer
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2020-05-20
Anticipated expiration: 2035-12-03
Also published as: US20170362583A1; CN107109393A; EP3242937A1; EP3242937B1; WO2016094178A1; CN107109393B; US10563190B2; EP3242937A4

Abstract

Un método para producir abienol, que comprende convertir difosfato de geranilgeranilo (GGPP) en abienol en presencia de una combinación de (1) diterpeno sintasa (diTPS) de clase II con al menos 50% de identidad en un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y (2) abienol sintasa de clase I/II (CAS) bifuncional con al menos 50% de identidad con un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para producir abienol

Realizaciones de la presente divulgación se refieren a nuevos métodos para la producción de abienol y de vectores de expresión y células huésped útiles en dichos métodos.

Con una economía mundial cada vez mayor y la petición de un mayor nivel de vida, la demanda de fragancia está en aumento. Sin embargo, los suministros de fragancias de origen animal o vegetal son limitados, debido a restricciones en los recursos naturales y la protección animal. Se han realizado intentos para producir fragancias o sus precursores a partir de fuentes renovables tales como microorganismos.

El ámbar gris es un ingrediente de fragancia preciado y tradicional, que es un subproducto del intestino de la ballena. Ambrox, un sustituto del ámbar gris, se produce mediante una conversión química del diterpeno esclareol, que actualmente se obtiene de la salvia. Ambrox también se puede generar a partir del diterpeno abienol relacionado, que se ha encontrado en el abeto y el tabaco (Barrero et al. 1993, Tetrahedron 49: 10405-10412). Véase también la Figura 1.

Se propone que las vías tanto a abienol como a esclareol en plantas implican dos etapas. La primera etapa consiste en la conversión de la molécula de la vía isoprenoide difosfato de geranilgeranilo (GGPP) en un compuesto intermedio común denominado difosfato de labda-13-en-8-ol (LDPP) a través de la actividad de una diterpeno sintasa de clase II (diTPS). La segunda etapa es catalizada por una diTPS de clase I. Hay varios tipos de diTPS de clase I, cada uno responsable de producir un producto final específico. Por ejemplo, la abienol sintasa (ABS) es para la producción de abienol, y la esclareol sintasa (Scs) es responsable de la producción de esclareol. Véase la Figura 2.

Las enzimas implicadas en la conversión de dos etapas de GGPP en esclareol o GGPP en abienol son específicas para las plantas y pueden ser en forma de dos enzimas independientes o una sola enzima con dos sitios activos. Por ejemplo, en la producción de abienol por parte del tabaco (Sallaud et al. 2012, Plant J., 72(1 ):1-17), la diTPS de clase II del tabaco (a la que se alude como NtCPS2 por Sallaud et al., y a la que se alude como Nt-diTPS de clase II por la presente divulgación) y la diTPS sintasa del tabaco de clase I (a la que se alude como abienol sintasa del tabaco o Nt-ABS por la presente divulgación), están en forma de dos moléculas de proteínas diferentes. De manera similar, en la producción de esclareol por la salvia (Schalk et al. 2012, Journal of Am. Chem Soc. 134:18900-18903); (Caniard et al. 2012, BMC Plant Biology 12:119), la diTPS de clase II de salvia (a la que se alude como Ss LPS por Schalk et al, y a la que se alude como Ss-diTPS de clase II por la presente divulgación) y la diTPS sintasa de clase I de salvia (a la que se alude como esclareol sintasa de salvia o Ss-Scs por la presente divulgación), también están en forma de dos moléculas de proteínas independientes. En contraposición, en la producción de abienol por parte del abeto (Zerbe et al. 2012, J. Biol. Chem. 287:12121-12131; documento US20130224809), ambas subunidades diTPS de clase I y clase II residen en una abienol sintasa de clase I/II bifuncional (a la que se alude como AbCAS por Zerbe et al. y por la presente divulgación). Por lo tanto, en el abeto, GGPP se convierte en abienol en presencia de la abienol sintasa de clase I/II bifuncional. Véase la Figura 2.

Se considera que fuentes vegetales para esclareol y abienol son poco fiables; por lo tanto, un procedimiento para la producción microbiana de cualquiera de los productos podría tener un valor comercial. Las diTPS de clase II y los genes esclareol sintasa de salvia se han aislado y expresado simultáneamente en E. coli, lo que da como resultado títulos de aproximadamente 1,5 gramos por litro de esclareol en fermentadores a escala de laboratorio. La producción mensurable en E. coli de abienol se ha logrado mediante la expresión simultánea de los genes diTPS de clase II y abienol sintasa del tabaco, o la expresión de abienol sintasa de abeto de clase I/II individual. Sin embargo, la producción de abienol basada en los métodos existentes es muy baja. Por lo tanto, podría ser deseable producir abienol a un título mucho más alto.

Los autores de la invención han encontrado ahora, sorprendentemente, un nuevo método para aumentar significativamente la velocidad de producción de abienol a partir de difosfato de geranilgeranilo (GGPP) en presencia de una combinación de una diterpeno sintasa de clase II y una abienol sintasa de clase I/II bifuncional. En una realización, la diTPS de clase II puede ser de tabaco o salvia, y la abienol sintasa de clase I/II bifuncional puede ser de abeto. De acuerdo con la presente invención, la diTPS de clase II anterior es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 1, o la diTPS de clase II anterior es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 2, combinados con la abienol sintasa de clase I/II bifuncional anterior que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 3.

En otra realización, la combinación de las diTPS de clase II y la abienol sintasa de clase I/II bifuncional es expresada por una célula huésped recombinante. En una realización, la célula recombinante es un microorganismo modificado genéticamente, modificado genéticamente para expresar al menos un polipéptido exógeno seleccionado del grupo que consiste en la diTPS de clase II anterior y la abienol sintasa de clase I/II bifuncional. En una realización, la célula huésped comprende al menos un ácido nucleico que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en dicha diTPS de clase II y dicha abienol sintasa de clase I/II bifuncional.

En una realización, la célula huésped recombinante es un hongo. En otra realización, la célula huésped recombinante es un hongo Yarrowia. En una realización específica, la célula huésped recombinante es Yarrowia lipolytica.

En otro aspecto de la divulgación, la presente invención se dirige a una célula huésped recombinante que comprende un diterpeno sintasa de clase II y una abienol sintasa de clase I/II bifuncional. En una realización, la diTPS de clase II puede ser de tabaco o salvia, y la abienol sintasa de clase I/II bifuncional puede ser de abeto. En otra realización, la diTPS de clase II anterior puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 1. En otra realización, la diTPS de clase II anterior puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 2. En otra realización, la abienol sintasa de clase I/II bifuncional anterior puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95 %, al menos 97% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto de la divulgación, la presente invención está dirigida a un vector de expresión que comprende una molécula de polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1 y una molécula de polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto de la divulgación, la presente invención está dirigida a un vector de expresión que comprende una molécula de polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2 y una molécula de polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3.

En una realización, una o ambas de las moléculas de polinucleótido arriba descritas están operativamente enlazadas a una secuencia control de la transcripción.

Las secuencias de ácidos nucleicos enumeradas en el listado de secuencias que se acompaña se muestran utilizando abreviaturas de letras estándar para bases de nucleótidos. Solo se muestra una cadena de cada una de las secuencias de ácidos nucleicos, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada. En la lista de secuencias que se acompaña:

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos que codifica la diterpeno sintasa de clase II de Nicotiana tabacum MQVUTSSHRFFCHHLHQLKSPTSLSAQKAEFKKHGPRNWLFQTEGSLLYKPVRLNCATS DASYLGNVNEYLESDHSKNSEEKDIQVSRTIQMKGLTEEIKHMLNSMEDGRLNVLAYD TAWVSFIPNTTNNGNDQRPMFPSCLQWIIDNQLSDGSWGEEIVFCIYDRLLNTLVCVIAL TLWNTCLHKRNKGVMFIKENLSKLETGEVENMTSGFELVFPTLLEKAQQLDIDIPYDAP VLKDIYARREVKLTRIPKDVIHTIPTTVLFSLEGLRDDLDWQRLLKLQMPDGSFLISPAST AFAFMETNDEKCLAYLQNWEKSNGGARQYPFDLVTRLWAIDRLQRLGISYYFAEEFK ELLNHVFRYWDEENGIFSGRNSNVSDVDDTCMAIRLLRLHGYDVSPDALNNFKDGDQF VCFRGEYDGSPTHMFNLYRCSQYLFPGEKILEEAKNFTYNFLQQCLANNRCLDKWYIA KDIPGEIWYALEFPWYASLPRVEARYYIEQYGGADDIWIGKTLYRMPDVNNNVYLQAA KLDYNRCQSQHRFEWLIMQEWFEKCNFQQFGISKKYLLVSYFLAAASIFEVEKSRERLA WAKSRIICKMITSYYNDEATTWTTRNSLLMEFKVSHDPTRKNGNETKEILVLKNLRQFL RQLSEETFEDLGKD1HHQLQNAWETWLVFLREEKNACQEETELLVRTINLSGGYMTHDE

ILFD AD YENL SNLTNKV CGKLNELQNDKVT GG S KNTNIELDM Q AL VKL VF GNT S SNIN Q DIKQTFFAWKTFYYSAHVSEEIMNFHISKVLFQQV SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos que codifica la diterpeno sintasa de clase II de Salvia sclarea MTSVNLSRAPAAIIRRRLQLQPEFHAECSWLKSSSKHAPFTLSCQIRPKQLSQIAELRVTS LDASQASEKDISLVQTPHKVEVNEKIEESIEYVQNLLMTSGDGRISVSPYDTAVIALIKDL KGRDAPQFPSCLEWIAHHQLADGSWGDEFFCIYDRILNTLACWALKSWNLQSDIIEKG VTYIKENVHKLKGANVEHRTAGFELWPTFMQMATDLGIQGLPYDHPLIKEIADTKKQR LKEIPKDLVYQMPTNLLYSLEGLGDLEWERLLKLQSGNGSFLTSPSSTAAVLMHTKDEK CLKYIENALKNCDGGAPHTYPVDIFSRLWAIDRLQRLGISRFFQHEIKYFLDHIESVWEET GVFSGRYTKFSDIDDTSMGVRLLKMHGYDVDPNVLKHFKQQDGKFSCYIGQSVESASP MYNLYRAAQLRFPGEEVFEEATKFAFNFLQEMLVKDRLQERWVISDHLFDEIKLGLKM PWYATLPRVEAAYYLDHYAGSGDVWIGKSFYRMPEISNDTYKELAE.DFNRCQTQHQL EW1HMQEWYDRCSLSEFGISKRELLRSYFLAAATIFEPERTQERLLLAKTRILSKMITSFV NISGTTLSLDYNFNGLDEIISSANEDQGLAGTLLATFHQLLDGFDrfTLHQLKHVWSQWF MKVQQGEGSGGEDAVLLANTLNICAGLNEDVLSNNEYTALSTLTNKICNRLAQIQDNKI LQWDGSIKDKELEQDMQALVKLVLQENGGAVDRNIRHTFLSVFKTFYYDAYHDDETT DLHIFKVL

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos que codifica la abienol sintasa de clase I/II bifuncional de Abies balsamea

MALPVYSLKSHIPITTIASAKMNYTPNKGMITANGRSRRIRLSPNKIVACAGEADRTFPSQ SLEKTALFPDQFSEKNGTPSNFTPPNREFPPSFWNNDIINSITASHKVQTGDRKRIQTLISEI KNVFNSMGDGETSPSAYDTAWVARIPAVDGSEQPQFPQTFEWIFQNQFKDGSWGEEFY FL AYDRLL ATL ACIITLTIWRT GN V QLHKGIEFFRKQ W R M D D E ADNHRP S GFEIVFP AM LNEAKSLGLDLPYELPFIEQMVKKREAKLKMITTNVLYTIQTTLLYSLEGLHEIVDFDKII KFQSKDGSFFGSPASTAAVFMQTGNTKCFEFFEFVFRKFRNHVPSDYPFDFFERFWWD TVERFGIDRHFKKEIKDAFDYYYSCWDERGIGWAKDSPIADIDDTAMGFRIFRFHGYNY SPDVFKTFKDENGEFFCFMGQTQRGVTDMFNVYRCSQVAFPGETIMEEAKFCTERYFR NAFENADAFDKWAIKKNIRGEVEYALKYPWHRSMPRFEVRSYIGNYGPNDYWFGKSF YMMPYISNEKYLEFAKFDFNSVQSFHQEEIREFVRWCKSSGFTEFKFTRDRWETYFAV ASSMFEPEFSTCRAVYTKISVLLVILDDLYDGYGSPDEIKLFSEAVKRWDLSLLEQMPDH MKICFFGFYNTVNEVAEEGRKTQGHDVFGYIRNFWEIQFAAFTREAEWSQGKYVPSFD EYIENAQ VSIGVATIFFITIFFTEEDDE.SHIDY GSKFFRFASFTARFANDIKTY QEERAHGE WSAIQCYMKDRPEITEEEALKYVYGRMVNDLAELNSEYLKSNEMPQNCKRLVFDTAR VAQFFTMEGDGFTY SDTMEIKEHIKKCFFEP AT

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos que codifica el gen de la abienol sintasa de Nicotiana tabacum MVFGFRSKIIPFPDHKFGNIKFGSVTNAICHRPCRVRCSHSTASSMEEAKERIRETFGKIE FSPSSYDTAWVAMVPSRYSMNQPCFPQCFDWIFENQREDGSWGFNPSHPFFVKDSFSST FASFFAFRKWRIGDNQVQRGFGFIETHGWAVDNKDQISPFGFEIIFPCMINYAEKFNFDF PFDPNFVNMMFCERELTIERAFKNEFEGNMANVEYFAEGFGEFCHWKEMMLRQRHNG SFFD SP ATT AAAFIYHQYDEKCF GYLNSILKLFIDN WVPTICPTK1HSNLFLVD ALQNLGV DRYFKTEVKRVLDEIYRLWLEKNEEIFSDVAHCAMAFRLLRMNNYEVSSEELEGFVDQE HFFTTSSGKLMNHVAE.ELHRASQVA1HERKDHILDKISTWTRNFMEQKLLDKHIPDRSK KEMEFAMRKFYGTFDRVETRRYIESYKMDSFKILKAAYRSSGINNIDLLKFSEHDFNLCQ TRHKEELQQMKRWFTDCKLEQVGLSQQYLYTSYFIIAAILFEPEYADARLAYAKYAIIIT AVDDFFDCFICKEELQNIIELVERWEGYSTVGFRSERVRIFFLALYKMVEEIAAKAETKQ GRCVKDHLINLWIDMLKCMLVELDLWKIKSTTPSIEEYLSVACVTIGVPCFVLTSLYLLG PKLSKDVIESSEVSALCNCTAAVARLIND1HSYKREQAESSTNMVSILITQSQGTISEEEAI RQIKEMMESKRRELLGMVLQNKESQLPQVCKDLFWTTINAAYS1HTHGDGYRFPEEFK NHINDVIYKPLNQYSP

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de ADN que codifica la diterpeno sintasa de clase II de Nicotiana tabacum, optimizada para la expresión en Yarrowia lipolytica

atgcaggttattattacctcctctcaccgatttttctgccaccaccttcaccagctcaagtcccctacctccctttctgctcagaaggctgagttta agaagcacggcccccgaaactggcttttccagactgagggctctctcctttacaagcctgtccgactcaactgtgctacttctgatgcttcttac cttggtaacgtgaacgagtaccttgagtctgaccactctaagaactccgaggagaaggatattcaggtttcccgaactatccagatgaagggt cttaccgaggagatcaagcacatgcttaactctatggaggacggacgacttaacgtcctcgcctacgacactgcttgggtttcctttattcctaa cactaccaacaacggaaacgatcagcgacctatgtttccctcttgtcttcagtggattattgacaaccagctttctgatggttcttggggagagg agattgttttctgcatttacgaccgactccttaacactctcgtttgtgttattgctctcactctctggaacacttgccttcacaagcgaaacaagggt gtgatgtttatcaaggagaacctttctaagctggagactggtgaggttgagaacatgacttctggttttgagcttgtttttcccactctccttgaga aggcccagcagctcgatattgacattccctacgatgctcctgtcctgaaggatatttacgctcgacgagaggttaagctcacccgaatcccta aggacgttatccacactattcccactaccgttctcttttctcttgagggactccgagatgacctcgactggcagcgactcctgaagctccagat gcctgacggttctttcctgatttcccctgcttccactgcctttgctttcatggagactaacgatgagaagtgtcttgcctaccttcagaacgttgtt gagaagtctaacggaggtgcccgacagtaccccttcgaccttgttactcgactttgggccattgatcgactccagcgactcggaatctcttact actttgccgaggagttcaaggagcttctcaaccacgtgttccgatactgggacgaggagaacggaattttctctggacgaaactctaacgttt ctgatgttgatgacacttgcatggctatccgacttctccgacttcacggttacgatgtttcccctgacgcccttaacaacttcaaggacggcgac cagttcgtttgcttccgaggtgaggtggacggttctcctacccacatgtttaacctctaccgatgttcccaggttcttttccccggagagaagatt cttgaggaggctaagaacttcacttacaacttccttcagcagtgccttgctaacaaccgatgcctcgacaagtgggtcattgctaaggacatc cccggcgagatttggtacgctcttgagtttccctggtacgcctcccttccccgagtggaggctcgatactacattgagcagtacggcggagct gacgatatttggattggcaagactctctaccgaatgcccgatgtcaacaacaacgtttaccttcaggctgccaagctcgattacaaccgatgc cagtcccagcaccgatttgagtggctgattatgcaggagtggtttgagaagtgcaactttcagcagttcggaatttccaagaagtacctccttg tttcttacttccttgctgccgcttctatttttgaggtcgagaagtcccgagagcgacttgcttgggctaagtctcgaattatctgtaagatgattact tcttactacaacgatgaggccactacctggaccactcgaaactctctccttatggagtttaaggtttctcacgaccctacccgaaagaacggta acgagactaaggagatccttgttctcaagaaccttcgacagttccttcgacagctttctgaggagactttcgaggaccttggcaaggacatcc accaccagcttcagaacgcttgggagacttggcttgttttccttcgagaggagaagaacgcttgtcaggaggagactgagcttctcgtgcga actattaacctctctggcggctacatgacccacgatgagattcttttcgatgccgactacgagaacctgtccaaccttaccaacaaggtttgtg gcaagctcaacgagcttcagaacgacaaggtcactggcggctctaagaacaccaacattgagcttgacatgcaggctctcgttaagctggtt tttggtaacacctcctctaacatcaaccaggacattaagcagactttctttgctgttgtcaagaccttctactactctgcccacgtttctgaggaga ttatgaactttcacatttccaaggtgctctttcagcaggtctaa

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de ADN de la diterpeno sintasa de clase II de Salvia sclarea, optimizada para la expresión en Yarrowia lipolytica

atgacttctgttaacctttcccgagcccccgctgccattatccgacgacgacttcagcttcagcctgagtttcacgccgagtgttcttggctgaa gtcttcttccaagcacgcccccttcaccctttcctgccagattcgacctaagcagctctcccagattgccgagcttcgagttacttccctcgatg cttcccaggcttccgagaaggacatttcccttgttcagactccccacaaggttgaggttaacgagaagatcgaggagtctatcgagtacgtcc agaaccttctcatgacttccggcgacggacgaatttctgtgtccccctacgacaccgctgtgatcgccctgattaaggacctcaagggtcga gatgcccctcagtttccctcttgtcttgagtggattgcccaccaccagcttgctgatggctcttggggcgacgagttcttctgtatttacgaccga atcctgaacactctcgcttgtgtcgtcgccctgaagtcttggaaccttcagtctgatattattgagaagggtgtgacctacatcaaggagaacgt ccacaagctcaagggtgccaacgttgagcaccgaactgccggattcgagcttgtggttcctacctttatgcagatggccactgaccttggcat tcagggtcttccctacgatcaccccctcatcaaggagattgctgacactaagaagcagcgactcaaggagattcccaaggatctcgtttacc agatgcctaccaaccttctctactcccttgagggactcggcgaccttgagtgggagcgactcctgaagctccagtccggcaacggctccttc ctcacttccccctcctccaccgccgccgtccttatgcacaccaaggacgagaagtgtctgaagtacatcgagaacgccctcaagaactgcg acggaggtgctccccacacttaccctgtcgatattttctctcgactttgggctattgatcgacttcagcgacttggtatttctcgattcttccagca cgagatcaagtacttcctcgatcacatcgagtccgtttgggaggagaccggagttttctctggacgatacactaagttttctgatattgatgaca cctctatgggcgttcgacttctcaagatgcacggatacgacgtcgatcccaacgttctcaagcacttcaagcagcaggatggtaagttttcctg ctacattggtcagtctgtcgagtctgcctctcctatgtacaacctttaccgagccgcccagcttcgattccctggtgaggaggtttttgaggagg ccactaagtttgcctttaacttccttcaggagatgcttgtcaaggatcgacttcaggagcgatgggtgatttccgaccaccttttcgatgagatta agctgggcctcaagatgccttggtacgccacccttccccgagtcgaggccgcttactacctcgatcactacgctggttctggtgatgtttggat tggcaagtctttctaccgaatgcctgagatttccaacgatacctacaaggagcttgccattctcgatttcaaccgatgccagactcagcaccag cttgagtggattcacatgcaggagtggtacgaccgatgctctctttccgagttcggcatttccaagcgagagcttctccgatcttactttctcgc cgccgctaccattttcgagcctgagcgaactcaggagcgacttctccttgccaagacccgaatcctgtctaagatgattacttcttttgtcaaca tttccggtactaccctttctctcgactacaacttcaacggcctcgatgagattatctcctctgccaacgaggatcagggtctggctggtactctc ctggctaccttccaccagcttctcgacggattcgatatttacactctccaccagctcaagcacgtttggtcccagtggttcatgaaggtgcagc agggagagggttctggcggcgaggacgccgtgctccttgccaacaccctcaacatctgcgccggcctcaacgaggacgtgctctccaac aacgagtacactgctctgtccaccctcaccaacaagatttgcaaccgactcgcccagatccaggacaacaagattctccaggttgtggacg gctccatcaaggataaggagcttgagcaggatatgcaggcccttgtcaagctcgtccttcaggagaacggcggagccgttgaccgaaaca tccgacacaccttcctttccgttttcaagactttctactacgatgcctaccacgacgatgagactaccgaccttcacatcttcaaggttctctttcg acccgttgtgtaa

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de ADN que codifica la abienol sintasa de clase I/II bifuncional de Abies balsamea, optimizada para la expresión en Yarrowia lipolytica

atggccctgcccgtttactctctcaagtcccacattcccatcactaccatcgcctctgctaagatgaactacacccccaacaagggtatgatta ccgccaacggacgatctcgacgaatccgactttctcccaacaagatcgttgcttgtgctggtgaggctgatcgaactttcccctctcagtccct tgagaagaccgctctctttcccgatcagttttctgagaagaacggtactccctctaacttcactccccccaaccgagagtttcccccctctttttg gaacaacgatattatcaactctattactgcttctcacaaggttcagactggcgaccgaaagcgaatccagactctcatttctgagattaagaac gtctttaactctatgggcgatggtgagacttctccctctgcttacgacaccgcttgggttgctcgaatccccgccgttgatggctctgagcagc cccagtttccccagactcttgagtggattcttcagaaccagctcaaggacggttcttggggtgaggagttctacttccttgcttacgaccgactt ctcgctacccttgcctgcattattaccctcaccatttggcgaactggcaacgttcagcttcacaagggcattgagttcttccgaaagcaggttgt tcgaatggacgatgaggctgataaccaccgaccctctggttttgagattgtctttcccgctatgcttaacgaggctaagtcccttggtcttgacc tgccctacgagcttcccttcattgagcagatggttaagaagcgagaggccaagctcaagatgattaccaccaacgtcctgtacaccattcag actaccctcctttactctctggagggccttcacgagattgttgacttcgataagattatcaagctccagtccaaggacggttctttcctcggctcc cccgcttctactgccgctgttttcatgcagactggtaacactaagtgccttgagttccttgagttcgttctccgaaagtttcgaaaccacgtgccc tctgactaccccctcgatctctttgagcgactttgggtcgttgacactgttgagcgacttggcattgatcgacacttcaagaaggagatcaagg acgctcttgactacgtgtactcttgttgggacgagcgaggcattggctgggccaaggactctcccatcgccgatattgatgacactgctatgg gccttcgaatccttcgactgcacggatacaacgtttcccccgatgttctcaagactttcaaggacgagaacggagagttcttttgcttcatgggt cagactcagcgaggagttaccgacatgcttaacgtttaccgatgttctcaggttgcttttcccggagagactatcatggaggaggccaagctc tgtactgagcgatacctgcgaaacgctctggagaacgccgacgcctttgacaagtgggctattaagaagaacattcgaggcgaggtggag tacgctctcaagtacccctggcaccgatctatgccccgactggaggtgcgatcttacattggtaactacggccccaacgatgtctggcttggt aagtccctttacatgatgccctacatttctaacgagaagtaccttgagcttgccaagctggacttcaactctgtgcagtcccttcaccaggagg agattcgagagcttgtccgatggtgtaagtcctctggtttcactgagctgaagttcacccgagatcgagttgttgagacttacttcgctgttgcct cctccatgtttgagcccgagttctctacctgtcgagccgtttacactaagatttccgttctcctcgtcattcttgacgacctttacgatggctacgg ttctcccgacgagatcaagctgttctccgaggctgtcaagcgatgggatctctcccttcttgagcagatgcccgaccacatgaagatttgcttc ctgggtctttacaacactgttaacgaggttgctgaggagggacgaaagactcagggccacgatgttcttggctacattcgaaacctttggga gattcagctcgccgctttcacccgagaggctgagtggtcccagggcaagtacgtgccctctttcgatgagtacattgagaacgcccaggttt ctattggagttgctactatcctccttattactattcttttcactgaggaggacgatattctctcccacattgattacggttccaagtttctccgactcg cttctcttaccgctcgacttgccaacgacatcaagacttaccaggaggagcgagcccacggcgaggtggtttccgctattcagtgttacatga aggaccgacccgagattactgaggaggaggctctcaagtacgtttacggtcgaatggttaacgatctcgccgagcttaactctgagtacctc aagtctaacgagatgccccagaactgcaagcgactggtttttgacactgcccgagttgcccagcttttcactatggagggtgacggcctcac ctactctgacactatggagattaaggagcacatcaagaagtgcctctttgagcccgctacctaa

La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de ADN que codifica el gen de la abienol sintasa de Nicotiana tabacum, optimizado para la expresión en Yarrowia lipolytica

atggttcttggcctgcgatctaagatcattccccttcccgatcacaagctcggaaacatcaagctcggttctgttaccaacgctatttgccaccg

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Figuras:

Se mostrarán ahora realizaciones de la invención, solo a modo de ejemplo, con referencia a las Figuras 1-3, en las que:

La FIG. 1 muestra que la conversión de esclareol y abienol en Ambrox puede realizarse mediante un procedimiento químico.

La FIG. 2 muestra las rutas bioquímicas para convertir difosfato de geranilgeranilo en abienol en tabaco y en esclareol en salvia. A. vías hacia abienol en tabaco y esclareol en la salvia implican la actividad de dos enzimas separadas: un diTPS de tipo II que convierte el difosfato de geranilgeranilo (GGPP) en difosfato de labda-13-en-8-ol (LDPP) y una diTPS de tipo I que convierte LDPP en el producto final. En el tabaco, una abienol sintasa (Nt-ABS) que es un tipo de diTPS I convierte LDPP en abienol. En salvia, una esclareol sintasa, que es otro tipo de diTPS I convierte LDPP en esclareol. B. en primer lugar, la conversión en 2 etapas de GGPP en LDPP y de LDPP en abienol se realiza mediante una sola cis abienol sintasa de clase I/II bifuncional (Ab-CAS).

La FIG. 3 muestra un cromatograma HPLC de una capa de dodecano de una cepa productora de abienol. Se utilizó una columna C18. La fase móvil fue metanol etanol 4:1, TFA al 0,1% con una adición de agua al 11% durante los primeros tres minutos y luego metanol etanol directo durante 14 minutos. Las muestras se diluyeron 1:10 en fase móvil antes de la inyección. La FIG. 3a muestra el pico de abienol de la muestra de referencia comercial de abienol. La Fig. 3b muestra el pico de abienol del abienol generado a partir de los transformantes.

A menos que se defina lo contrario en esta memoria, las expresiones y los términos científicos y técnicos utilizados en esta memoria tendrán los significados que se entienden comúnmente por los expertos ordinarios en la técnica. La expresión "diterpeno sintasa de clase II" o "diTPS de clase II" indica una enzima capaz de catalizar la conversión de difosfato de geranilgeranilo en difosfato de labda-13-en-8-ol. La diterpeno sintasa de clase II puede provenir de diversos organismos, tales como el tabaco (Nicotiana) o la salvia (Salvia). A una diterpeno sintasa de clase II específica utilizada en las realizaciones en esta memoria, derivada de Nicotiana tabacum y Salvia sclarea se la alude mediante una notación adicional, p. ej., "Nt-diTPS-Clase II" y "Ss-diTPS-Clase II", respectivamente. Un ejemplo de una Nt-diTPS-Clase II es el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. Un ejemplo de una Ss-diTPS-Clase II es el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

La expresión "diterpeno sintasa de clase I" o "diTPS de clase I" indica una enzima capaz de catalizar la conversión de difosfato de labda-13-en-8-ol en abienol o esclareol. A una diterpeno sintasa de clase I específica utilizada en las realizaciones en esta memoria, derivada de Nicotiana tabacum se la alude mediante una notación adicional, p. ej., "Nt-ABS". Un ejemplo de una Nt-ABS es el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

La expresión "abienol sintasa de clase I/II bifuncional" o "CAS de clase I/II bifuncional" indica una enzima capaz de catalizar la conversión de difosfato de geranilgeranilo en abienol. La abienol sintasa de clase I/II bifuncional tiene dos sitios activos, que tienen la función de una diterpeno sintasa de clase I y una diterpeno sintasa de clase II, respectivamente. La abienol sintasa de clase I/II bifuncional específica utilizada en realizaciones particulares en esta memoria, derivada de Abies balsamea, se la alude mediante una notación adicional, p. ej., "CAS de clase I/II Abbifuncional", o simplemente CAS-Ab. Un ejemplo de abienol sintasa de clase I/II Ab-bifuncional es el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

Identidad de la Secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad de la secuencia".

Para los fines de la presente divulgación, el grado de identidad de la secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol Biol.

48:. 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son la penalización de apertura de hueco de 10, la penalización de extensión de hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue:

(Desoxirribonucleótidos Idénticos x 100)/(Longitud del Alineamiento - Número Total de Huecos en el Alineamiento)

Construcción de ácido nucleico: La expresión "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena sencilla o doble, que se aísla de un gen que se produce de forma natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de una manera que no existiría en la naturaleza o que es sintético. La expresión construcción de ácido nucleico es sinónima a la expresión "casete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente divulgación.

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" significa todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente divulgación. Cada una de las secuencias de control puede ser nativa o extraña al polinucleótido que codifica el polipéptido o nativa o extraña entre sí. Secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a un conductor, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.

Enlazada operativamente: La expresión "enlazada operativamente" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación post-transcripción, traducción, modificación post-traducción, y secreción.

Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está operativamente enlazada a nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión.

Célula huésped: La expresión "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción, y similares con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente divulgación. La expresión "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no sea idéntica a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Variante: La expresión "variante" significa un polipéptido que tiene actividad enzimática que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción de uno o más (varios) residuos de aminoácidos en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la separación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir uno o más aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición. En alguna realización, el uno o más aminoácidos anteriores son 1-3 aminoácidos.

En una realización del método de acuerdo con el primer aspecto de la invención, abienol se convierte en difosfato de geranilgeranilo (GGPP) en presencia de una combinación de diterpeno sintasa de clase II y abienol sintasa de clase I/II bifuncional. La diterpeno sintasa de clase II de acuerdo con las realizaciones de esta memoria puede ser de cualquier organismo que exprese de forma nativa una enzima independiente de la diterpeno sintasa de clase II. En una realización, la diterpeno sintasa de clase II es de tabaco o, específicamente, de Nicotiana tabacum. En otra realización, la diterpeno sintasa de clase II es de salvia o, específicamente, de Salvia sclarea. La diterpeno sintasa de clase II de acuerdo con las realizaciones de esta memoria es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

La abienol sintasa de clase I/II bifuncional de acuerdo con realizaciones en esta memoria puede ser de cualquier organismo que exprese de forma nativa una única enzima con dos sitios activos, que tiene actividad de diterpeno sintasa de clase I y actividades de diterpeno sintasa de clase II, respectivamente. En una realización, la abienol sintasa de clase I/II bifuncional es de abeto o, específicamente, de Abies balsamea. La abienol sintasa de clase I/II bifuncional de acuerdo con las realizaciones de esta memoria es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80% , al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% , al menos 99% de identidad con la SEQ ID NO: 3.

En una realización de la invención, la diTPS de clase II y la abienol sintasa de clase I/II bifuncional son expresadas por una célula huésped recombinante, tal como un microorganismo recombinante. Por lo tanto, las etapas de un aspecto de la invención pueden tener lugar dentro de una célula huésped, es decir, el método puede ser al menos parcialmente un método in vivo. La célula huésped puede ser recombinante y puede ser, por ejemplo, un microorganismo modificado genéticamente. Por lo tanto, un microorganismo puede ser modificado genéticamente, es decir, alterado artificialmente de su estado natural, para expresar tanto la diTPS de clase II como la abienol sintasa de clase I/II bifuncional. En una realización, expresa una combinación de una Nt-diTPS de clase II y una abienol sintasa de clase I/II Ab-bifuncional. En otra realización, expresa una combinación de una Ss-diTPS de clase II y una abienol sintasa de Ab-bifuncional de clase I/II. Preferiblemente, las enzimas son exógenas, es decir, no están presentes en la célula antes de la modificación, habiéndose introducido utilizando métodos microbiológicos tales como los descritos en esta memoria. Además, en el método de la invención, las enzimas pueden expresarse cada una por una célula huésped recombinante, ya sea dentro de la misma célula huésped o en células huésped separadas. El abienol puede secretarse de la célula huésped en la que se forma.

La célula huésped puede ser genéticamente modificada de cualquier manera conocida adecuada para este fin por la persona experta en la técnica. Esto incluye la introducción de los genes de interés, tales como uno o más genes que codifican las enzimas bifuncionales de abienol sintasa de clase I/II y diTPS de clase II, en un plásmido o cósmido u otro vector de expresión que se capaz de reproducirse dentro de la célula huésped. Alternativamente, el ADN de plásmido o cósmido o parte del ADN de plásmido o cósmido o una secuencia de ADN lineal puede integrarse en el genoma del huésped, por ejemplo mediante recombinación homóloga o integración aleatoria. Para llevar a cabo la modificación genética, el ADN puede ser introducido o transformado en células por absorción natural o mediado por procesos bien conocidos, tales como electroporación. La modificación genética puede implicar la expresión de un gen bajo el control de un promotor introducido. El ADN introducido puede codificar una proteína que podría actuar como una enzima o podría regular la expresión de genes adicionales.

Una célula huésped de este tipo puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una abienol sintasa de clase I/II bifuncional y una diTPS de clase II. Por ejemplo, la célula puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 3 y al menos una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, o un fragmento de un polinucleótido de este tipo que codifica una variante funcional (que puede ser un fragmento que proporciona una variante funcional) de cualquiera de las enzimas en abienol sintasa de clase I/II bifuncional y diTPS de clase II, por ejemplo enzimas tal como se describen en esta memoria. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas pueden ser exógenas, es decir, no se producen de forma natural en la célula huésped.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona una célula huésped recombinante, tal como un microorganismo, que comprende un primer polipéptido que es una diTPS de clase II, que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 65 %, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95 %, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a las SEQ ID NOs: 1 o 2 y que comprende un segundo polipéptido que es una abienol sintasa de clase I/II bifuncional, que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 3. La célula también puede comprender polipéptidos que son variantes funcionales o fragmentos de cualquiera de las secuencias anteriores.

Un polinucleótido adecuado pueden ser introducido en la célula por integración aleatoria, recombinación homóloga y/o puede formar parte de un vector de expresión que comprende una combinación de secuencias de polinucleótidos SEQ ID NOs: 1 y 3, una combinación de secuencias de polinucleótidos SEQ ID NOs: 1 y 2, o un complemento de los mismos. Un vector de expresión de este tipo forma otro aspecto de la invención. Vectores adecuados para la construcción de un vector de expresión de este tipo son bien conocidos en la técnica y pueden disponerse para que comprendan el polinucleótido enlazado operativamente a una o más secuencias de control de la expresión, de modo que sean útiles para expresar las enzimas requeridas en una célula huésped, por ejemplo un microorganismo tal como se describe arriba. Por ejemplo, promotores que incluyen, pero no se limitan a promotores TEF1, HSP e HYP pueden utilizarse junto con genes endógenos y/o genes heterólogos para la modificación de patrones de expresión de diTPS de clase II y una abienol sintasa de clase I/II bifuncional. De manera similar, secuencias terminadoras a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan al uso de secuencias terminadoras XPR2 de Yarrowia lipolytica.

En algunas realizaciones, la célula huésped recombinante o modificada genéticamente, como se ha mencionado a lo largo de esta memoria descriptiva, puede ser cualquier microorganismo seleccionado del grupo que consiste en levaduras, hongos (tales como miembros del género Yarrowia), protistas, algas, bacterias y arqueas. La bacteria puede comprender una bacteria gram-positiva o una bacteria gram-negativa que incluye, pero no se limita los géneros Escherichia, Corynebacterium, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Paracoccus y Rhodococcus. En determinadas realizaciones de la invención, se emplean levaduras u hongos de géneros que incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon Trichosporon y Yarrowia. En determinadas realizaciones particulares, se utilizan organismos de especies que incluyen, pero no se limitan a Blakeslea trispora, Candida pulcherrima, C. revkaufi, C. tropicalis, Cryptococcus curvatus, Cunninghamella echinulata, C. elegans, C. japonica, Escherichia coli, Fusarium sporotrichioides , F. graminearum, Fusarium venenatum, Gibberrella zea, G. fujikuroi, Lipomyces starkeyi, L. lipoferus, Mortierella alpina, M. isabellina, M. ramanniana, M. vinacea, Mucor circinelloides, Phycomyces blakesleanus, Pythium irregulare, Rhodosporidium turuloides, Rhodotorula glutinis, R. gracilis, R. graminis, R. mucilaginosa, R. pinicola, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon pullans, T. cutaneum y Yarrowia lipolytica.

Microorganismos particularmente adecuados, por ejemplo, incluyen Yarrowia lipolytica, Escherichia coli, Fusarium venenatum, Gibberrella fujikuroi y Saccharomyces cerevisiae.

La plataforma Yarrowia ha sido optimizada para el flujo a través de la ruta de isoprenoides y ha alcanzado niveles de producción de más de 10 gramos por litro de carotenoides totales. Dado que los diterpenos también se derivan de la vía isoprenoide, Yarrowia es muy adecuada para la producción a alto nivel de abienol.

La célula huésped recombinante o el microorganismo se pueden utilizar para expresar las enzimas arriba mencionadas y un extracto exento de células obtenidos entonces por métodos estándar, para uso en el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Realizaciones de la presente divulgación también abarcan variantes de los polipéptidos tal como se definen en esta memoria. Tal como se usa en esta memoria, una "variante" significa un polipéptido en el que la secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia base de la que se deriva en que uno o más aminoácidos dentro de la secuencia son sustituidos por otros aminoácidos. Por ejemplo, una variante de SEQ ID NO: 1 puede tener una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 50% idéntica a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, al menos aproximadamente 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica. Las variantes y/o los fragmentos son variantes/fragmentos funcionales en que la secuencia variante tiene características de actividad enzimática funcional similares o idénticas a la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos no variante especificada en esta memoria.

Por ejemplo, una variante funcional de la SEQ ID NO: 1 tiene características de diTPS de clase II similares o idénticas a SEQ ID NO: 1. Un ejemplo puede ser que la tasa de conversión por una variante funcional de SEQ ID NO: 1, de GGPP a LDPP, puede ser la misma o similar, aunque dicha variante funcional también puede proporcionar otros beneficios. Por ejemplo, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o al menos aproximadamente 100%, la tasa se logrará cuando se usa la enzima que es una variante funcional de la SEQ ID NO : 1.

Una variante funcional o fragmento de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO anteriores, por lo tanto, es cualquier secuencia de aminoácidos que permanece dentro de la misma categoría de enzima (es decir, tiene el mismo número EC). Métodos para determinar si una enzima cae dentro de una categoría particular son bien conocidos por la persona experta, que puede determinar la categoría de enzima sin el uso de la habilidad inventiva. Métodos adecuados pueden obtenerse, por ejemplo, de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser consideradas como "conservadora", cuando un aminoácido es reemplazado por un aminoácido diferente con propiedades ampliamente similares. Sustituciones no conservativas son cuando los aminoácidos son reemplazados por aminoácidos de un tipo diferente.

Por "sustitución conservativa" se entiende la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido de la misma clase, en que las clases se definen como sigue:

Ejemplos de Clases de Aminoácidos:

No polares: A, V, L, I, P, M, F, W

Polares sin carga: G, S, T, C, Y, N, Q

De carácter ácido: D, E

De carácter básico: K, R, H.

La invención se extiende a una combinación nueva de diTPS de clase II y una abienol sintasa de clase I/II bifuncional para la conversión de GGPP en abienol. La mejora significativa de la tasa de conversión de GGPP en abienol es el resultado de una combinación nueva de este tipo. En una realización particular tal como se muestra en el Ejemplo 3, se observó una mejora de 10 veces en el título de abienol cuando se utilizó la diTPS de clase II de Nicotiana tabacum o Salvia sclarea en combinación con una abienol sintasa de clase I/II bifuncional de Abies balsamea , cuando se comparan con una abienol sintasa de clase I/II bifuncional utilizada sola.

El resultado arriba descrito es inesperado. Se reconoce convencionalmente en la técnica que una sola enzima bifuncional sería más eficiente para catalizar un sustrato que dos enzimas separadas que tienen las mismas dos funciones, debido a un efecto de armazón (Zerbe et al. 2012, J. Biol. Chem. 287:págs.12121-12131). El razonamiento es que la expresión de las dos actividades en la enzima bifuncional es más equilibrada, y las actividades se mantienen en estrecha proximidad entre sí. Esta visión se corrobora por la observación en esta divulgación de que una combinación de diTPS de clase I y clase II de Nicotiana tabacum produce poco abienol en comparación con las diTPS de clase I/II bifuncionales de A. balsamea. Véase el Ejemplo 3.

En contra de las enseñanzas anteriores, los autores de la presente divulgación crearon transformantes que contienen una enzima diTPS de función única de clase II y una abienol sintasa de clase I/II bifuncional. Los resultados demostraron que el título de producción de abienol es significativamente mayor que el producido por el sistema de dos enzimas de diTPS de clase I y clase II, o por una sola abienol sintasa de clase I/II bifuncional. Añadir una enzima diTPS de clase II además de una abienol sintasa de clase I/II bifuncional no produce simplemente un efecto aditivo. En cambio, se logra un efecto sinérgico, que es inesperado.

Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar la invención sin limitar su alcance de modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de Vectores que Contienen el gen diTPS de Clase II, la abienol sintasa de Clase I/II Bifuncional Los plásmidos que se construyeron y utilizaron en la presente divulgación se muestran en la Tabla 1.

El gen abienol sintasa de clase I/II bifuncional de Abies balsamea (Ab-CAS) fue optimizado en codones de acuerdo con el sesgo de codones de Yarrowia, y se sintetizó de novo. Durante la síntesis de novo, la secuencia 5'TGCTAGCCACAAAA, que contiene un sitio de restricción NheI y una secuencia típica de Kozak para permitir un inicio eficiente de la traducción, se añadió inmediatamente aguas arriba del presunto codón de iniciación ATG. La secuencia ACGCGT-3', que comprende un sitio de restricción Mlu\, se añadió inmediatamente aguas abajo del codón de parada. Esta secuencia se escindió utilizando Nhe\ y Mlu\ y se ligó a pMB6655 cortado con Nhe\ y Mlu\ para producir pMB6839. La proteína resultante codificada por el gen Ab-CAS de pMB6839 se especifica en SEQ \D No: 3. El gen diTPS de clase \\ de Nicotinia tabacum (Nt-diTPS-Clase \\) se clonó en el vector de expresión pMB6674 tal como se describió anteriormente para crear pMB6845. La secuencia de la proteína del gen Nt-diTPS-Clase \\ codificado por pMB6845 se especifica en la SEQ \D No: 2. El gen Ab-CAS y el promotor y terminador en pMB6839 se escindieron por digestión con Pvu\\ y Ssp\ y se clonaron en el sitio EcoRV de pMB6845 para crear pMB6847, que expresa tanto el gen Ab-CAS como el gen Nt-diTPS-Clase \\ junto con el gen de resistencia a la higromicina HPH.

El gen de la abienol sintasa de Nicotinia tabacum (Nt-ABS) se sintetizó y se clonó en pMB6655 tal como se describe para pMB6839, para crear pMB6840. La secuencia de proteínas para el gen Nt-ABS de pMB6840 se especifica en la SEQ \D No: 4. El gen Nt-ABS y el promotor y terminador en pMB6840 se separaron por digestión con Pvu\\ y Ssp\, y se clonaron en el sitio EcoRV de pMB6845 para crear pMB6849, que expresa tanto el gen Nt-ABS como el gen NtdiTPS-clase \\ junto con el gen de resistencia a la higromicina HPH.

El gen diTPS de clase \\ de Salvia sclarea (Ss-diTPS-clase \\) se sintetizó y se clonó en pMB6674 tal como se describe arriba para crear pMB6874. La secuencia de proteínas de Ss-diTPS-clase \\ se especifica en SEQ \D No. 2. El gen Ab-CAS y las señales de expresión de pMB6839 se escindieron por digestión con Pvu\\ y Ssp\ y se clonaron en el sitio EcoRV de pMB6874 para crear pMB6879, que expresa tanto el gen Ab-ABS como el gen Ss-diTPS-clase \\ con selección de higromicina.

Las secuencias de genes que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ \D NOs 1-4 fueron optimizadas en codones de acuerdo con el sesgo de codones de Yarrowia y las secuencias de ácidos nucleicos resultantes son SEQ \D NOs 5-8, respectivamente.

Tabla 1. Plásmidos

Todos los procedimientos de biología molecular básica y de manipulación de ADN descritos en esta memoria se llevan a cabo generalmente de acuerdo con Sambrook et al. o Ausubel et al. (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nueva York; F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D, Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl (eds.). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nueva York).

Ejemplo 2

Construcción de Células Huésped Recombinantes que contienen genes de diTPS de Clase N y de abienol sintasa de Clase !/!! Bifuncionales

En este ejemplo, los vectores que contienen genes diTPS de clase \\ y abienol sintasa de clase \/\\ bifuncionales se introdujeron en una cepa huésped de Y. lipolytica.

Los vectores arriba descritos se transformaron en una cepa de Y. lipolytica (ML7206) que previamente había sido optimizada para el aumento de flujo a través de la ruta de isoprenoides. La cepa huésped ML7206 es una cepa prototrófica de Y. lipolytica con el siguiente genotipo (MATB erg9-4789::ura3 {HMG-tr GGS carB}). La cepa ML7206 se construyó mediante la introducción de genes heterólogos bajo el control de promotores constitutivos, junto con varias generaciones de cruzamiento, comenzando con MF350 y ATCC201249 tal como se describe en la Patente de EE.UU. N° 7.851.199. El gen ERG9 , que codifica la escualeno sintasa, fue reemplazado por una versión hipomórfica que alberga una mutación puntual (F317I) y una inserción del gen URA3 (posteriormente inactivado por mutación) directamente después del codón de parada.

El gen GGS y el gen HMG truncado ("HMG-ti“') se derivaron de secuencias de Yarrowia correspondientes a los genes geranilgeranil pirofosfato sintasa nativa e hidroximetilglutaril-CoA reductasa, respectivamente. El gen carB se derivó de Mucor circinelloides, y codifica una actividad de fitoeno deshidrogenasa, pero no tiene relación con el siguiente ejemplo.

Ejemplo 3

Estudio del Título de Abienol de las Células Huésped Recombinantes que contienen un gen diTPS de Clase II y un gen CAS de Clase I/II Bifuncional

En este ejemplo, se examinaron las producciones de abienol en células huésped recombinantes descritas en el Ejemplo 2.

Los transformantes descritos en el Ejemplo 2 se hicieron crecer en matraces de agitación en un medio rico (YPD) recubierto con un volumen de 10% de dodecano. Estudios previos con isoprenoides han demostrado que los productos isoprenoides son típicamente exportados por microorganismos y se acumulan en una capa de dodecano. Después del crecimiento a 28°C, 200 rpm, durante 6 días, la fracción de dodecano se retiró de los matraces de agitación y se analizó por HPLC en una columna C18, con un detector de matriz de fotodiodos. La configuración de HPLC consistió en una columna YMC PackPro C18 RS [parte n° RS08503-1456WT 150 x 4,6 mm S3 gm] a una temperatura de la columna de 16°C, la fase móvil consistió en una mezcla de (400 ml de Metanol, 100 ml de Etanol y Ácido Trifluoroacético al 0,1%) utilizando un caudal isocrático de 1 mL/min. Los transformantes que contienen el gen abienol sintasa generaron un pico a 2,90 minutos con una absorbancia óptima de 237 nm (Figura 3b). Este pico fue consistente con un patrón de referencia de abienol adquirido de Toronto Research Chemicals Cat. n° 107600 (Figura 3a).

Tabla 2. Producción de abienol en transformantes de la cepa MB7206 optimizada con isoprenoide

Como se muestra en la Tabla 2, la transformación que contiene tanto el gen diTPS de Clase II como el gen diTPS abienol sintasa (ABS) de Clase I de tabaco en Yarrowia resultó en una producción muy baja de abienol. La transformación del gen abienol sintasa de clase I/II bifuncional (Ab-CAS) de abeto solo dio como resultado una producción ligeramente elevada de abienol. Sorprendentemente, los transformantes que contienen el gen abienol sintasa de clase I/II bifuncional (Ab-CAS) junto con el gen di-TPS de clase II de tabaco o el gen di-TPS de clase II de salvia produjeron niveles significativamente más elevados de abienol. Este efecto se observó repetidamente en tres composiciones de medio diferentes en el transformante que contiene el gen di-TPS de clase II de tabaco y el gen Ab-CAS. Es inesperado observar que la adición de la enzima de clase II de tabaco o salvia podría superar significativamente la actividad de la abienol sintasa de clase I/II bifuncional de abeto sola, particularmente dado el hecho de que la transformación de los genes diTPS de Clase II y diTPS abienol sintasa de Clase I de tabaco dieron como resultado muy poco producto.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir abienol, que comprende convertir difosfato de geranilgeranilo (GGPP) en abienol en presencia de una combinación de (1) diterpeno sintasa (diTPS) de clase II con al menos 50% de identidad en un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y (2) abienol sintasa de clase I/II (CAS) bifuncional con al menos 50% de identidad con un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la diTPS de clase II es de tabaco o salvia.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la abienol sintasa de clase I/II bifuncional es de abeto.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que abienol es producido por una célula huésped que expresa de forma recombinante al menos una de dichas diTPS de clase II y dichas abienol sintasa de clase I/II bifuncional.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula huésped es un microorganismo recombinante que se modifica genéticamente para expresar al menos un polipéptido exógeno seleccionado del grupo que consiste en dicha diTPS de clase II y dicha abienol sintasa de clase I/II bifuncional.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el microorganismo recombinante comprende al menos un ácido nucleico que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en dicha diTPS de clase II y dicha abienol sintasa de clase I/II bifuncional.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la célula huésped es un hongo.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la célula huésped es Yarrowia lipolytica.

9. Una célula huésped que comprende una diterpeno sintasa heteróloga de clase II con al menos un 50% de identidad con un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y una abienol sintasa heteróloga de clase I/II (CAS) bifuncional con al menos 50% de identidad con un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3.

10. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que la diTPS de clase II es de tabaco o salvia.

11. La célula huésped recombinante de la reivindicación 9, en la que la abienol sintasa de clase I/II bifuncional es de abeto.

12. La célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que es un hongo.

13. La célula huésped de la reivindicación 12, que es Yarrowia lipolytica.

14. Un vector de expresión que comprende una molécula de polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID No : 3 o que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

15. El vector de expresión de la reivindicación 14, en el que una o ambas secuencias de polinucleótidos están operativamente enlazadas a una secuencia de control de la transcripción.