ES2764273T3

ES2764273T3 - Nuevos genes de cetoacil ACP sintasa y uso de los mismos

Info

Publication number: ES2764273T3
Application number: ES15747630T
Authority: ES
Inventors: David Davis; George Rudenko; Aravind Somanchi; Jason Casolari; Scott Franklin; Aren Ewing
Original assignee: Corbion Biotech Inc
Current assignee: Corbion Biotech Inc
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: CN106574255A; WO2016007862A2; US20190345463A1; US9969990B2; US20180230442A1; WO2016007862A3; BR112017000414A2; EP3167053A2; EP3167053B1; EP3620517A3; US20160010066A1; EP3620517A2; US10316299B2

Abstract

Polinucleotido con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 39, o un polinucleotido que codifica una proteina de tipo KASI que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 2, o una proteina madura producida a partir de estos, donde dicho polinucleotido, cuando se coexpresa con un gen de acil-ACP tioesterasa FATA o FATB exogeno en una celula hospedadora de microalga oleaginosa, es capaz de enriquecer el contenido de C14:0 del aceite celular producido por la celula hospedadora, con respecto a un aceite producido por una celula del mismo tipo que no expresa dicho polinucleotido.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos genes de cetoacil ACP sintasa y uso de los mismos

CAMPO TÉCNICO

[0001] La presente invención se refiere a genes de p-cetoacil ACP sintasa nuevos y métodos para usar los genes que incluyen la expresión de los genes en células hospedadoras oleaginosas para producir triglicéridos con perfiles de ácidos grasos alterados.

ANTECEDENTES

[0002] Algunos organismos que incluyen plantas y algunas microalgas usan una vía biosintética de ácidos grasos de tipo II, caracterizada por el uso de enzimas discretas en un complejo multimérico para la síntesis de ácidos grasos. En cambio, los mamíferos y los hongos usan una única proteína grande multifuncional.

[0003] En los organismos que usan una vía biosintética de ácidos grasos de tipo II, la p-cetoacil-ACP sintasa I (KAS I, EC 2.3.1.41) es una de las enzimas responsables del alargamiento de acil-ACP graso de cadena media creciente de 4 a 16 átomos de carbono de longitud. La KAS I usa acil-ACP C2-C14 como sustratos para la condensación con una unidad C2 derivada de malonil-ACP. KASIV es una enzima relacionada que tiene una función de alargamiento similar. Así, KASI y KASIV pueden considerarse ambas enzimas tipo KASI.

[0004] Se ha introducido tales genes en plantas usando tecnología del ADN recombinante. Véanse por ejemplo las patentes US7301070, US6348642, US6660849, US6770465 y US2006/0094088. En las células plastídicas, tales como las procedentes de plantas, macroalgas y microalgas, se localizan enzimas tipo KAS I en los cloroplastos u otros plástidos junto con otra enzima de la vía de síntesis de ácidos grasos (FAS).

[0005] Las publicaciones PCT WO2010/063032, WO2011/150411, WO2012/106560 y WO2013/158938 revelan ingeniería genética de microalgas oleaginosas que incluye dirigir productos génicos de FAS exógenos al plástido de microalga.

[0006] Las patentes US 2013/004646 y WO 2010/063031 revelan células de microalga que contienen genes exógenos que codifican, por ejemplo, una lipasa, un transportador de sacarosa, una invertasa de sacarosa, una fructoquinasa, una enzima de degradación de polisacárido, una enzima de cetoacil-ACP sintasa, una acil-ACP tioesterasa grasa, una acil-CoA/aldehído reductasa grasa, una acil-CoA reductasa grasa, una aldehído reductasa grasa, una aldehído-descarbonilasa grasa y/o una proteína portadora de acilo.

[0007] La base de datos Geneseq [en línea] 14 de octubre de 2010 (2010-10-04), "Palmitic acid production-related gene, SEQ:20024.", recuperado del n.° de acceso a EBI GSN:AXE01814 Número de acceso a la base de datos AXE01814 divulga una secuencia de polinucleótidos que tiene un 93,6 % de identidad con la SEQ ID NO 21. La base de datos Geneseq [en línea] 15 junio 2007 (2007-06-15), "Oil-associated gene related protein #865.", recuperado del n.° de acceso a EBI GSP:ADJ49365 Número de acceso a la base de datos ADJ49365 divulga una secuencia polipeptídica que tiene un 90,2 % de identidad con la SEQ ID NO 2. La base de datos Geneseq [en línea] 29 octubre 2009 (2009-10-29), "Nucleotide sequence SEQ ID 134280, recuperado del n.° de acceso a Eb I GSN:AWK61076 Número de acceso a la base de datos AWK61076 divulga una secuencia de polinucleótidos que tiene un 93,55 % de identidad con la SEQ ID NO 21. La base de datos Geneseq [en línea] 20 junio 2013 (2013 06-20), "Plasmid pSZ1491 DNA construct, SEQ ID 232.", recuperado de n.° de acceso a EBI GSN:BAN54762 Número de acceso a la base de datos BAN54762 divulga una secuencia de polinucleótidos que tiene un 92,44 % de identidad con la SEQ ID NO 39.

RESUMEN

[0008] En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 39, o un polinucleótido que codifica una proteína de tipo KASI que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2, o una proteína madura producida a partir del mismo, donde dicho polinucleótido, cuando se coexpresa con un gen exógeno de acil ACP tioesterasa fAt A o FATB en una célula hospedadora de microalga oleaginosa, es capaz de enriquecer el contenido C14:0 del aceite celular producido por la célula hospedadora, con respecto a un aceite producido por una célula del mismo tipo que no expresa dicho polinucleótido.

[0009] En otro aspecto, formas de realización de la invención incluyen un vector de transformación que comprende un polinucleótido tal y como se ha mencionado anteriormente. En algunos casos, el vector comprende secuencias promotoras y 3'UTR en conexión funcional con el polinucleótido y, opcionalmente, una secuencia flanqueante para la recombinación homóloga. Las secuencias promotoras o 3'UTR son secuencias de nucleótidos heterólogas. Las secuencias promotoras heterólogas o 3'u Tr heterólogas pueden proceder de un organismo diferente del organismo a partir del cual se obtuvo en primer lugar la codificación de secuencias de nucleótidos KAS.

[0010] En un aspecto, el vector de transformación comprende una secuencia promotora heteróloga o 3'UTR heteróloga obtenida a partir del mismo organismo del que se aisló en primer lugar el gen KAS. Cuando la secuencia promotora, la secuencia 3'UTR y las secuencias de nucleótidos KAS son del mismo organismo, el promotor heterólogo no guía naturalmente la expresión de KAS y la 3'UTR no se produce naturalmente aguas abajo de las secuencias de nucleótidos de KAS en el organismo de origen.

[0011] En otro aspecto, el vector de transformación se utiliza para expresar el gen KAS en el organismo del que se aisló en primer lugar el gen KAS. Cuando el gen KAS se expresa recombinantemente en el organismo del que se aisló en primer lugar el gen KAS, el gen se expresa en un locus cromosómico diferente del locus cromosómico natural del gen KAS. De forma alternativa, el gen KAS se expresa en el citoplasma.

[0012] En otro aspecto, formas de realización de la invención incluyen una célula hospedadora que es una célula oleaginosa plastídica que tiene una vía de biosíntesis de ácidos grasos de tipo II que comprende el polinucleótido y/o el vector mencionado anteriormente, y que expresa una proteína de KAS funcional codificada por el polinucleótido. En algunos casos, la célula hospedadora comprende además un gen exógeno que codifica una acil-ACP tioesterasa FATA o acil-ACP tioesterasa FATB funcional. En un aspecto, la acil-ACP tioesterasa FATB tiene al menos un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 57. En algunos casos, la célula hospedadora produce un aceite celular caracterizado por un perfil de ácidos grasos con (i) al menos un 30, 40, 50 o 55 % de C14:0, (ii) al menos un 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 % de C8:0, (iii) al menos un 10, 15, 20, 25, 30 o 35 % en área para la suma de C8:0 y C10:0, o (iv) una relación C8/C10 en el rango de 2,2-2,5, 2,5-3,0 o 3,0-3,4. En algunos casos, la célula hospedadora es una microalga. En algunos casos, la célula hospedadora es de Trebouxiophyceae, y opcionalmente del género Chlorella o Prototheca. En algunos casos, la microalga es de la especie Prototheca moriformis.

[0013] En otro aspecto, formas de realización de la invención incluyen un método para hacer un aceite celular, donde el método comprende cultivar una célula hospedadora tal y como se ha mencionado anteriormente para producir el aceite celular, donde el aceite comprende triglicéridos y esteroles de microalga. En algunos casos, el aceite celular comprende esteroles caracterizados por un perfil de esterol y el perfil de esterol tiene un exceso de ergosterol con respecto al p-sitosterol y/o la presencia de 22,23-dihidrobrasicasterol, poriferasterol o clionasterol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0014] La fig. 1 muestra un árbol filogenético para genes de tipo KASI en relación con el ejemplo 3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

[0015] Tal y como se usa con respecto a los ácidos nucleicos, el término "aislado" se refiere a un ácido nucleico que está libre de al menos otro componente que está típicamente presente con el ácido nucleico de origen natural. De este modo, un ácido nucleico de origen natural está aislado si se ha purificado apartado de al menos otro componente de origen natural con el ácido nucleico.

[0016] Un "aceite celular" o "grasa celular" significará un aceite predominantemente de triglicérido obtenido a partir de un organismo, donde el aceite no se ha sometido a mezcla con otro aceite natural o sintético, o a fraccionamiento para alterar sustancialmente el perfil de ácidos grasos del triglicérido. En relación con un aceite que comprende triglicéridos de una regioespecificidad particular, el aceite celular o grasa celular no ha sido sometido a interesterificación u otro proceso sintético para obtener tal perfil triglicérido regioespecífico, más bien la regioespecificidad se produce naturalmente, por una célula o una población de células. Para un aceite celular o grasa celular producido por una célula, el perfil de esterol del aceite se determina generalmente por los esteroles producidos por la célula, no por reconstitución artificial del aceite por adición esteroles para imitar el aceite celular. En relación con un aceite celular o grasa celular, y tal y como se utiliza generalmente a lo largo de la presente descripción, lo términos aceite y grasa se usan de forma intercambiable, excepto donde se indique lo contrario. De este modo, un "aceite" o una "grasa" puede ser líquido, sólido o parcialmente sólido a temperatura ambiente, dependiendo de la composición de la sustancia y otras condiciones. Aquí, el término "fraccionamiento" significa eliminar material del aceite de manera que cambie su perfil de ácidos grasos con respecto al perfil producido por el organismo, independientemente de cómo se lleve a cabo. Los términos "aceite celular" y "grasa celular" engloban tales aceites obtenidos a partir de un organismo, donde el aceite ha sido sometido a un procesamiento mínimo, que incluye refinación, blanqueo y/o desgomado, que no cambia sustancialmente su perfil de triglicéridos. Un aceite celular también puede ser un "aceite celular no interesterificado", lo que significa que el aceite celular no ha sido sometido a un proceso en el que los ácidos grasos se han redistribuido en sus enlaces de acilo con el glicerol y permanece esencialmente con la misma configuración que cuando se extrajo del organismo.

[0017] "Gen exógeno" designará un ácido nucleico que codifica para la expresión de un ARN y/o proteína que se ha introducido en una célula (por ejemplo mediante transformación/transfección) y también se denomina "transgén". Una célula que comprende un gen exógeno se puede denominar célula recombinante, en la que se pueden introducir uno o más genes exógenos adicionales. El gen exógeno puede proceder de una especie diferente (y por tanto heteróloga), o de la misma especie (y por lo tanto homóloga), con respecto a la célula que se está transformando. De este modo, un gen exógeno puede incluir un gen homólogo que ocupa una ubicación diferente en el genoma de la célula o está bajo control diferente, con respecto a la copia endógena del gen. Un gen exógeno puede estar presente en más de una copia en la célula. Un gen exógeno se puede mantener en una célula, por ejemplo, como una inserción en el genoma (nuclear o plástido) o como una molécula episómica.

[0018] "Ácidos grasos" designará ácidos grasos libres, sales de ácidos grasos o fracciones de acilo graso en un glicerolípido. Se entenderá que los grupos acilo grasos de glicerolípidos se pueden describir en términos del ácido carboxílico o anión de un ácido carboxílico que se produce cuando el triglicérido se hidroliza o saponifica.

[0019] "Microalgas" son organismos microbianos que contienen un cloroplasto u otro plástido, y opcionalmente que son capaces de realizar fotosíntesis, o un organismo microbiano procariótico capaz de realizar fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente de carbono fijo como energía, así como heterótrofos, que pueden vivir exclusivamente de una fuente de carbono fija. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de las células hermanas poco después de la división celular, tales como las Chlamydomonas, al igual que los microbios tales como, por ejemplo, Volvox, que es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos de célula diferentes. Las microalgas incluyen células tales como Chlorella, Dunaliella y Prototheca. Las microalgas incluyen también otros organismos fotosintéticos microbianos que presentan una adhesión célula-célula, tales como Agmenellum, Anabaena y Pyrobotrys. Las microalgas incluyen también microorganismos heterótrofos obligados que han perdido la capacidad de realizar fotosíntesis, tales como algunas especies de algas dinoflageladas y especies del género Prototheca.

[0020] Una célula "oleaginosa" es una célula capaz de producir al menos un 20 % de lípido por peso de célula en seco, naturalmente o a través de la mejora de cepa recombinante o tradicional. Un "microbio oleaginoso" o "microorganismo oleaginoso" es un microbio, que incluye una microalga, que es oleaginoso.

[0021] El término "porcentaje de identidad de secuencia", en el contexto de dos o más secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos idéntico, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, medida usando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Para la comparación de secuencias para determinar el porcentaje de nucleótidos o de identidad de aminoácido, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la o las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designado. Se puede llevar a cabo un alineamiento óptimo de secuencias para la comparación usando el software NCBI BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) configurado en los parámetros por defecto. Por ejemplo, para comparar dos secuencias de ácidos nucleicos, se puede usar blastn con la herramienta "BLAST 2 Sequences" versión 2.0.12 (21 de abril de 2000) configurada en los parámetros por defecto siguientes: Matriz: BLOSUM62; Recompensa por coincidencia: 1; Penalización por incompatibilidad: -2; Hueco abierto: 5 y Hueco de extensión: 2 penalizaciones; Hueco x reducción: 50; Probabilidad: 10; Tamaño de palabra: 11; Filtro: activado. Para una comparación de parejas de dos secuencias de aminoácidos, se puede usar la herramienta "BLAST 2 Sequences" versión 2.0.12 (21 de abril de 2000) con blastp configurado, por ejemplo, en los siguientes parámetros por defecto: Matriz: BLOSUM62; Hueco abierto: 11 y Hueco de extensión: 1 penalizaciones; Hueco x reducción 50; Probabilidad: 10; Tamaño de palabra: 3; filtro: activado.

[0022] Donde se proporcionan múltiples identidades de secuencia para una cepa con un par de genes exógenos, esto engloba todas las combinaciones de identidades de secuencia. Por ejemplo, la coexpresión de un primer gen que codifica una primera proteína que tiene al menos un 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con el gen A y un segundo gen que codifica una segunda proteína que tiene al menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con el gen A debe entenderse englobando (i) al menos un 85 % de identidad con el gen A y al menos un 85 % de identidad con el gen B, (ii)) al menos un 85 % de identidad con el gen A y al menos un 99 % de identidad con el gen B, (iii) al menos un 92 % de identidad con el gen A y al menos un 95 % de identidad con el gen B y todas las demás combinaciones.

[0023] En relación con un aceite celular, un "perfil" es la distribución de especies particulares de triglicéridos o grupos acilo grasos en el aceite. Un "perfil de ácidos grasos" es la distribución de grupos acilo grasos en los triglicéridos del aceite sin referencia a la fijación a una estructura de glicerol. Los perfiles de ácidos grasos se determinan típicamente por conversión a un éster metílico de ácidos grasos (FAME), seguida de un análisis de cromatografía de gases (GC) con detección de ionización de llama (FID). El perfil de ácidos grasos se puede expresar como uno o más porciento de un ácido graso en la señal de ácidos grasos totales determinada a partir del área bajo la curva para dicho ácido graso. La medición FAME-GC-FID se aproxima a los porcentajes en peso de los ácidos grasos.

[0024] Tal y como se utiliza en este caso, se dice que un aceite está "enriquecido" en uno o más ácidos grasos particulares si hay al menos un 10 % de aumento en la masa de dicho ácido graso en el aceite con respecto al aceite no enriquecido. Por ejemplo, en el caso de una célula que expresa un gen FatB heterólogo descrito aquí, se dice que el aceite producido por la célula está enriquecido con, por ejemplo, ácidos grasos C8 y C16 si la masa de estos ácidos grasos en el aceite es al menos un 10 % superior a la del aceite producido por una célula del mismo tipo que no expresa el gen FatB heterólogo (por ejemplo aceite de tipo salvaje).

[0025] "Recombinante" es una célula, ácido nucleico, proteína o vector que ha sido modificado debido a la introducción de un ácido nucleico exógeno o a la alteración de un ácido nucleico nativo. Así, por ejemplo, las células (hospedadoras) recombinantes pueden expresar genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresar genes nativos de forma diferente a como se expresan tales genes por una célula no recombinante. Las células recombinantes pueden, sin limitación, incluir ácidos nucleicos recombinantes que codifican un producto génico o elementos de supresión tales como mutaciones, inactivaciones, antisentido, ARN (ARNi) o ARNbc interferente que reducen los niveles de producto génico activo en una célula. Un "ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico formado originalmente in vitro, en general por la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo usando polimerasas, ligasas, exonucleasas y endonucleasas, usando síntesis química o, de otro modo, está en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Se pueden producir ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, para colocar dos o más ácidos nucleicos en el enlace funcional. Así, tanto un ácido nucleico aislado como un vector de expresión formados in vitro por nucleico mediante ligamiento de moléculas de ADN que no se unen normalmente en la naturaleza, se consideran recombinantes para los fines de esta invención. También se pueden producir ácidos nucleicos recombinantes de otras formas; por ejemplo usando síntesis de ADN química. Una vez que se hace un ácido nucleico recombinante y se introduce en una célula u organismo hospedador, se puede replicar usando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedadora; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez que se han producido de forma recombinante, aunque posteriormente se repliquen intracelularmente, todavía se consideran recombinantes para fines de la presente invención. De forma similar, una "proteína recombinante" es una proteína hecha usando técnicas recombinantes, es decir a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante.

[0026] Un gen o enzima "de tipo KAS I" designará un gen o enzima KAS I o KAS IV.

[0027] Las formas de realización de la presente invención se refieren al uso de genes de tipo KASI tal y como se describe en las reivindicaciones, aislados de plantas, que se pueden expresar en una célula hospedadora transgénica para alterar el perfil de ácidos grasos de un aceite celular producido por la célula hospedadora. Aunque la Prototheca moriformis de microalga se ha usado para cribar los genes por capacidad para alterar el perfil de ácidos grasos, los genes descubiertos son útiles en una amplia variedad de células hospedadoras para las que son conocidas técnicas de transformación genética. Por ejemplo, los genes se pueden expresar en bacterias, cianobacterias, otras microalgas eucarióticas o plantas superiores. Los genes se pueden expresar en plantas superiores según los métodos descritos en las patentes de EE. UU. de números: US7301070, US6348642, US6660849 y US6770465. Se ha descubierto que los transgenes de tipo KASI se pueden usar solos o en combinación con un transgén FatB (que codifica una acil-ACP tioesterasa activa) para estimular los niveles de ácidos grasos de cadena media (por ejemplo, ácidos cápricos, caprílicos, láuricos, mirísticos o palmíticos) en el perfil de ácidos grasos del aceite celular. La combinación de un gen de tipo KASI exógeno con un gen FATA o FATB exógeno en una célula hospedadora puede proporcionar niveles de ácidos grasos de cadena media y/o ácidos grasos de cadena larga (por ejemplo esteárico u oleico) superiores a un gen exógeno solo. Los ácidos grasos del aceite celular se pueden convertir además en triglicéridos, aldehídos grasos, alcoholes grasos y otros oleoquímicos ya sea sintética o biosintéticamente.

[0028] En formas de realización específicas, los triglicéridos se producen por una célula hospedadora que expresa un gen de tipo KASI nuevo tal y como se describe en las reivindicaciones (a partir de un ADNc nuevo y/o bajo control de un promotor heterólogo). Se puede extraer un aceite celular de la célula hospedadora. Generalmente, el aceite celular comprende principalmente triglicéridos y esteroles. El aceite celular se puede refinar, desgomar, blanquear y/o desodorizar. El aceite, en su forma sin procesar o procesada, se puede usar para alimentos, productos químicos, combustibles, cosméticos, plásticos y otros usos.

[0029] Los genes KAS se pueden usar en una variedad de construcciones genéticas que incluyen plásmidos u otros vectores para una expresión o recombinación en una célula hospedadora. Los genes pueden presentar una optimización de codones para la expresión en una célula hospedadora diana. Los genes se pueden incluir en un casete de expresión que incluye un promotor (por ejemplo un promotor heterólogo) y elemento regulador aguas abajo. El vector puede incluir secuencias flanqueantes para la recombinación homóloga. Por ejemplo, el vector puede causar la inserción en un cromosoma de la célula hospedadora, dónde se puede expresar de forma estable. Las proteínas producidas por los genes se pueden usar in vivo o en forma purificada. En una forma de realización, un casete de expresión comprende un promotor homólogo, una CDS (secuencia codificante, por sus siglas en inglés) operable para expresar una enzima de tipo KASI de la tabla 1 y una 3'UTR. La 3'UTR puede comprender un sitio de poliadenilación.

[0030] Tal y como se describe en los ejemplos más adelante, los genes KAS nuevo se han descubierto a partir de ADNc producido a partir de transcritos de ARNm de semillas vegetales. Por consiguiente, las secuencias de gen no son naturales porque carecen de intrones que están presentes en los genes vegetales y transcritos de ARNm de los genes antes del empalme de ARNm. Por consiguiente, la invención comprende un gen de tipo KASI no natural aislado en la tabla 1. Otra desviación del gen natural está en el uso de elementos reguladores heterólogos y expresión en células hospedadoras para las que tales genes no se producen de forma natural.

[0031] Por ejemplo, el gen se puede preparar en un vector de expresión que incluye un promotor y 5'UTR enlazados operativamente. Donde una célula plastídica se usa como el hospedador, un péptido dirigido a plástido adecuadamente activo (designado también más adelante como un "péptido de tránsito") se puede fusionar al gen de tipo KASI, como en los ejemplos más adelante. Los genes descritos comprenden una secuencia de identificación de plástido N-terminal hidrofóbica, que se puede sustituir por una secuencia de identificación alternativa y variar en longitud. Variar el péptido dirigido a plástido puede mejorar la localización celular y la actividad enzimática para un tipo de célula hospedadora determinada. De este modo, la invención contempla deleciones y proteínas de fusión para optimizar la actividad enzimática en una célula hospedadora determinada. Por ejemplo, se puede usar un péptido de tránsito del hospedador o especies relacionadas en vez del de los genes vegetales recién descubiertos descritos aquí. Las deleciones adicionales terminales o internas pueden hacerse siempre que se retenga la actividad enzimática. El péptido dirigido se puede escindir por la célula hospedadora para producir una proteína de tipo KASI madura que carece del péptido dirigido.

[0032] Un gen marcador seleccionable puede estar incluido en el vector para ayudar en el aislamiento de una célula transformada. Ejemplos de marcadores seleccionables útiles en microalgas incluyen invertasa de sacarosa, alfa galactosidasa (para la selección en melibiosa) y genes de resistencia antibiótica.

[0033] Las secuencias de gen descritas también se pueden usar para preparar ARN antisentido o inhibitorio (por ejemplo, ARNi o ARN en horquilla) para inhibir genes complementarios en una planta u otro organismo. Por ejemplo, con la ayuda del conocimiento de una secuencia de genes de la tabla 1, se puede obtener por ingeniería una planta con el mismo gen de tipo KASI o similar para expresar un constructo de ARNi, un gen inactivado, una mutación puntual o similar y así reducir la actividad de KASI o KASIV de la semilla de la planta. Como resultado de ello, la planta puede producir un aceite con un perfil de ácidos grasos alterado donde se disminuye o aumenta la longitud de cadena media, dependiendo de la presencia de otros genes de síntesis de ácidos grasos.

[0034] Los genes/proteínas de tipo KASI que se han revelado como útiles para producir perfiles de ácidos grasos deseados en una célula se resumen más adelante en la tabla 1 y las proteínas relativas descubiertas mediante secuenciación de transcripción (como en los ejemplos 1 y 2) se muestran en la tabla 1a. Se pueden usar ácidos nucleicos o proteínas que tienen la secuencia de SEQ ID NOS: 2 y 39 para alterar el perfil de ácidos grasos de una célula recombinante. También se pueden usar variantes de ácidos nucleicos; por ejemplo variantes que tengan al menos un 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS: 21 o 39. Se contempla la optimización de codones de los genes para una variedad de organismos hospedadores, como lo es el uso de fragmentos génicos. Los codones preferidos para las cepas de Prototheca y para Chlorella protothecoides se muestran a continuación en las tablas 2 y 3, respectivamente. El uso de codones para Cuphea wrightii se muestra en la tabla 4. El uso de codones para Arabidopsis se muestra en la tabla 5; por ejemplo, se puede seleccionar el codón más preferido para cada aminoácido. En la técnica se conocen tablas de codones para otros organismos que incluyen microalgas y plantas superiores. En algunas formas de realización, los primeros y/o segundos codones de Prototheca más preferidos se emplean para la optimización de codones. En formas realización específicas, las secuencias de aminoácidos nuevas contenidas en los listados de secuencias más adelante se convierten en secuencias de ácidos nucleicos según el uso de codón más preferido en Prototheca, Chlorella, Cuphea wrightii o Arabidopsis tal y como se expone en las tablas 2 a 3b o secuencias de ácidos nucleicos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con estas secuencias de ácidos nucleicos derivadas. Por ejemplo, el gen de tipo KASI puede presentar optimización de codones para Prototheca moriformis sustituyendo los codones más preferidos según la tabla 2 por al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % de todos los codones. Asimismo, el gen de tipo KASI puede presentar optimización de codones para Chlorella protothecoides sustituyendo los codones más preferidos según la tabla 3 por al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % de todos los codones. De forma alternativa, el gen de tipo KASI puede presentar optimización de codones para Chlorella protothecoides o Prototheca moriformis sustituyendo primeros o segundos codones más preferidos según la tabla 2 o 3 por al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % de todos los codones. Los genes de codones optimizados son de origen no natural porque se optimizan para la expresión en un organismo hospedador.

[0035] En algunas formas de realización, el porcentaje de identidad de secuencia para las variantes de los ácidos nucleicos o proteínas mencionados anteriormente se puede calcular usando la secuencia de ácidos nucleicos en toda su longitud (por ejemplo una de la SEQ ID NOS: 21 y 39 o la secuencia de aminoácidos en toda su longitud (por ejemplo la s Eq iD n O: 2) como la secuencia de referencia y comparando la secuencia de prueba en toda su longitud con esta secuencia de referencia. Para los fragmentos, el porcentaje de identidad de secuencia para las variantes de ácido nucleico o fragmentos de proteína se puede calcular a lo largo de toda la longitud del fragmento. En algunas formas de realización, hay un ácido nucleico o fragmento de proteína con al menos un 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NOS: 21, 39 o 2.

[0036] Opcionalmente, el péptido dirigido a plástido se puede intercambiar por otro péptido que funciona para guiar la enzima tipo KASI a un plástido sintetizador de ácidos grasos de una célula hospedadora plastídica. Por consiguiente, en varios ejemplos de la divulgación, una célula de transgén o transgénica hospedadora comprende un nucleótido o fusión peptídica correspondiente de una secuencia dirigida a plástico y una secuencia de dominio de enzima (la secuencia restante después de la eliminación del péptido de tránsito), donde la proteína madura tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de proteína madura enumerada en la tabla 1 o la tabla 1a. Los péptidos de tránsito/dirigidos a plástido están subrayados en el listado de secuencias informal anexo. Ejemplos de péptidos dirigidos incluyen aquellos de la tabla 1 y otros conocidos en la técnica, especialmente en relación con la dirección de los productos génicos de KAS I, KAS II, KAS III, FATA, FATB y Sa D (estearoil-ACP desaturasa) a cloroplastos u otros plástidos de plantas y microalgas. Véanse los ejemplos de Chorophyta proporcionados en las publicaciones PCT WO2010/063032, WO2011/150411, WO2012/106560 y WO2013/158938. Opcionalmente, los genes tipo KASI codifican 450, 475 o 500 aminoácidos o más (con o sin el péptido de tránsito), o aproximadamente 555 residuos (con el péptido de tránsito), a diferencia de las secuencias truncadas conocidas.

Tabla 1. Genes tipo KASI: el casete de expresión usado para evaluar los genes en combinación con un transgén FATB se proporciona en la SEQ ID NO: 38 (es decir, sustituyendo la secuencia codificante de KASIV de Cpal de la SEQ ID NO: 38 con varias otras secuencias codificantes de la tabla 1), excepto por el hecho de que el KASIV h h k ri n v l n l x r i n l E ID N : 1. V n l m l 1-4.

Tabla 1a. Proteínas adicionales codificadas por ADNc descubiertas mediante análisis por perfil de transcripción de las semillas. Las secuencias codificantes se pueden derivar de tablas de codones para varias células hos edadoras.

Tabla 2. Uso de codones en cepas de Prototheca.

Ala GCG 345 (0,36) Asn AAT 8 (0,04)

GCA 66 (0,07) AAC 201 (0,96)

GCT 101 (0,11)

GCC 442 (0,46) Pro CCG 161 (0,29)

CCA 49 (0,09) Cys TGT 12 (0,10) CCT 71 (0,13)

TGC 105 (0,90) CCC 267 (0,49)

Asp GAT 43 (0,12) Gln CAG 226 (0,82)

GAC 316 (0,88) CAA 48 (0,18)

Glu GAG 377 (0,96) Arg AGG 33 (0,06)

GAA 14 (0,04) AGA 14 (0,02)

CGG 102 (0,18) Phe TTT 89 (0,29) CGA 49 (0,08)

TTC 216 (0,71) CGT 51 (0,09)

CGC 331 (0,57) Gly GGG 92 (0,12)

GGA 56 (0,07) Ser AGT 16 (0,03)

GGT 76 (0,10) AGC 123 (0,22)

GGC 559 (0,71) TCG 152 (0,28)

TCA 31 (0,06) His CAT 42 (0,21) TCT 55 (0,10)

CAC 154 (0,79) TCC 173 (0,31)

Ile ATA 4(0,01) Thr ACG 184 (0,38)

ATT 30 (0,08) ACA 24 (0,05)

ATC 338 (0,91) ACT 21 (0,05)

ACC 249 (0,52) Lys AAG 284 (0,98)

AAA 7 (0,02) Val GTG 308 (0,50)

GTA 9 (0,01) Leu TTG 26 (0,04) GTT 35 (0,06)

TTA 3 (0,00) GTC 262 (0,43)

CTG 447 (0,61)

CTA 20 (0,03) Trp TGG 107 (1,00) CTT 45 (0,06)

CTC 190 (0,26) Tyr TAT 10 (0,05)

TAC 180 (0,95) Met ATG 191 (1,00)

Parada TGA/TAG/TAA

Tabla 3. Uso preferido de codones en Chlorella protothecoides. TTC (Phe) TAC (Tyr) TGC (Cys) TGA (parada) TGG (Trp) CCC (pro) CAC (His) CGC (Arg) CTG (Leu) CAG (Gln) ATC (Ile) ACC (Thr) GAC (Asp) TCC (Ser) ATG (Met) AAG (Lys) GCC (Ala) AAC (Asn) GGC (Gly) GTG (Val) GAG (Glu)

Tabla 4: uso de codones para Cuphea wrightii (codón, aminoácido, frecuencia, por mil, número)

UUU F 0,48 19,5 (52) UCU S 0,21 19,5 (52) UAU Y 0,456,4 (17) UGU C 0,41 10,5 (28)

UUC F 0,5221,3 (57) UCC S 0,2623,6 (63) UAC Y 0,557,9 (21) UGC C 0,59 15,0 (40)

UUA L 0,075,2 (14) UCA S 0,18 16,8 (45) UAA * 0,330,7 (2) UGA * 0,330,7 (2)

UUG L 0,19 14,6(39) UCG S 0,11 9,7 (26) UAG * 0,330,7 (2) UGG W 1,0015,4 (41)

CUU L 0,2721,0 (56) CCU P 0,4821,7 (58)

H 0,60 11,2 (30) CGU R 0,095,6 (15)

CUC L 0,22 17,2 (46) CCC P 0,167,1 (19) H 0,407,5 (20) CGC R 0,137,9 (21)

CUA L 0,13 10,1 (27) CCA P 0,21 9,7(26) CAA Q 0,31 8,6 (23) CGA R 0,11 6,7 (18)

CUG L 0,129,7 (26) CCG P 0,167,1 (19) CAG Q 0,69 19,5 (52) CGG R 0,169,4 (25)

AUU 10,4422,8 (61) ACU T 0,33 16,8 (45) AAU N 0,6631,4 (84) AGU S 0,18 16,1 (43)

AUC yo 0,29 15,4 (41) ACC T 0,27 13,9 (37) AAC N 0,34 16,5 (44) AGC S 0,076,0 (16)

AUA yo 0,27 13,9 (37) ACA T 0,26 13,5 (36) K AAA 0,4221,0 (56) AGA R 0,24 14,2 (38)

AUG M 1,0028,1 (75) ACG T 0,147,1 (19) AAG K 0,5829,2 (78) AGG R 0,27 16,1 (43)

GUU V 0,28 19,8 (53) GCU A 0,3531,4 (84) GAU D 0,63 35,9 (96) GGU G 0,2926,6 (71)

GUC V 0,21 15,0 (40) GCC A 0,20 18,0 (48) GAC D 0,3721,0 (56) GGC G 0,20 18,0 (48)

GUA V 0,14 10,1 (27) GCA A 0,3329,6 (79) GAA E 0,41 18,3 (49) GGA G 0,3531,4 (84)

GUG V 0,3625,1 (67) GCG A 0,11 9,7 (26) GAG E 0,5926,2 (70) GGG G 0,1614,2 (38)

Tabla 5: uso de codones para Arabidopsis (codón, aminoácido, frecuencia, por mil)

UUU F 0,51 21,8 UCU S 0,2825,2 UAU Y 0,52 14,6 UGU C 0,60 10,5

UUC F 0,4920,7 UCC S 0,13 11,2 UAC Y 0,48 13,7 UGC C 0,407,2

UUA L 0,14 12,7 UCA S 0,20 18,3 UAA * 0,360,9 UGA * 0,44 1,2

UUG L 0,2220,9 UCG S 0,109,3 UAG * 0,200,5 UGG W 1,0012,5

CUU L 0,2624,1 CCU P 0,38 18,7 CAU H 0,61 13,8 CGU R 0,179,0

CUC L 0,17 16,1 CCC P 0,11 5,3 CAC H 0,398,7 CGC R 0,073,8

CUA L 0,11 9,9 CCA P 0,33 16,1 CAA Q 0,56 19,4 CGA R 0,126,3

CUG L 0,11 9,8 CCG P 0,188,6 CAG Q 0,44 15,2 CGG R 0,094,9

AUU I 0,41 21,5 ACU T 0,34 17,5 AAU N 0,5222,3 AGU S 0,16 14,0

AUC I 0,35 18,5 ACC T 0,20 10,3 AAC N 0,4820,9 AGC S 0,13 11,3

AUA I 0,24 12,6 ACA T 0,31 15,7 K AAA 0,4930,8 AGA R 0,3519,0

AUG M 1,0024,5 ACG T 0,157,7 AAG K 0,51 32,7 AGG R 0,20 11,0

GUU V 0,4027,2 GCU A 0,4328,3 GAU D 0,6836,6 GGU G 0,3422,2

GUC V 0,19 12,8 GCC A 0,16 10,3 GAC D 0,32 17,2 GGC G 0,149,2

GUA V 0,159,9 GCA A 0,27 17,5 GAA E 0,5234,3 GGA G 0,3724,2

GUG V 0,26 17,4 GCG A 0,149,0 GAG E 0,4832,2 GGG G 0,16 10,2

Combinaciones de genes

[0037] En una forma de realización, un gen/producto génico tal y como se describe en las reivindicaciones se coexpresa en una célula hospedadora con un gen de acil-ACP tioesterasa FATA o FATB exógeno. En una forma de realización específica, el producto génico FATB tiene al menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,597, 97.5, 98, 98,5 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el FATB2 de Cuphea palustris ("Cpal FATB2", acceso AAC49180, SEQ ID NO: 1) o el FATB2 de C. hookeriana ("Ch FATB2", acceso U39834, SEQ ID NO: 57) o fragmento de los mismos. Opcionalmente, el producto génico FATB tiene al menos un 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 95.5, 96 ,96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el dominio de péptido de no tránsito de FATB2 de Cuphea palustris ("Cpal FATB2", acceso AAC49180, SEQ ID NO: 1) o FATB2 de C. Hookeriana ("Ch FATB2", acceso U39834 SEQ ID NO: 57).

[0038] Los genes FATA codifican enzimas que preferentemente, pero no exclusivamente, hidrolizan ácidos grasos de cadena larga con una actividad máxima hacia C18:1. Los genes FATB codifican un grupo de enzimas con especificidades de sustrato más heterogéneas pero muestran generalmente actividad más alta hacia los ácidos grasos saturados. Las especificidades de sustrato de las enzimas de FATB son bastante heterogéneas; hay un número de enzimas de FATB que muestran una alta actividad hacia C18:0 y C18:1. Las enzimas FATA y FATB terminan la síntesis de ácidos grasos hidrolizando el enlace de tioéster entre la fracción de acilo y la proteína portadora de acilo (ACP).

[0039] En una forma de realización, una célula hospedadora se transforma para expresar tanto un transgén FATA o FATB y tipo KASI. La célula hospedadora produce un aceite celular. Juntos, los genes FATA o FATB y tipo KASI se expresan para producir sus productos génicos respectivos y alteran así el perfil de ácidos grasos del aceite celular. Los dos genes funcionan por adición o sinérgicamente con respecto a las cepas de control que carecen de uno de los dos genes. Opcionalmente, la célula hospedadora es oleaginosa y pueden ser microalgas eucarióticas oleaginosas tales como las descritas previamente o más adelante. El perfil de ácidos grasos del aceite celular puede estar enriquecido (con respecto a un control apropiado) en C14:0 (mirístico), C8:0, C10:0 o una combinación de C8/C10.

[0040] En una forma de realización, el perfil de ácidos grasos de la célula está enriquecido con ácidos grasos C14:0. En esta forma de realización, el gen FATB expresa una enzima de acil-ACP tioesterasa que tiene al menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje de identidad de aminoácidos con la enzima de la SEQ ID NO: 1. El gen de tipo KASI coexpresado codifica una beta-cetoacil ACP sintasa que tiene al menos un 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje de identidad de aminoácidos con la enzima de la SEQ ID NO: 2. También se describe que el gen de tipo KASI coexpresado codifica una beta-cetoacil ACP sintasa que tiene al menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje de identidad de aminoácidos con la enzima de la SEQ ID NO: 7. Opcionalmente, el aceite celular tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o al menos el 55 % C14:0 (% en área por FAME-GC-FID).

[0041] En otra forma de realización, el perfil de ácidos grasos de la célula está enriquecido con ácidos grasos C8:0 y/o C10:0. En esta forma de realización, el gen FATB expresa una enzima de acil-ACP tioesterasa que tiene al menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje de identidad de aminoácidos con la enzima de la SEQ ID NO: 57. El gen de tipo KASI coexpresado codifica una beta-cetoacil ACP sintasa que tiene al menos un 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje de identidad de aminoácidos con una enzima de la SEQ ID NOS: 2. Opcionalmente, el aceite celular tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por al menos un 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 % en área C8:0 (por FAME-GC-FID).Opcionalmente, el aceite celular tiene un perfil de ácidos grasos caracterizado por al menos un 10, 15, 20, 25, 30 o 35 % en área para la suma de ácidos grasos C8:0 y C10:0 (por FAME-GC-FID). Opcionalmente, la proporción C8/C10 del aceite celular está en el rango de 2,2 2,5, 2,5-3,0 o 3,0-3,4.

[0042] Opcionalmente, los aceites producidos por estos métodos pueden tener un perfil de esterol de acuerdo con aquellos descritos más adelante.

Células hospedadoras

[0043] La célula hospedadora puede ser una única célula (por ejemplo microalga, bacterias o levadura) o parte de un organismo multicelular tal como una planta o un hongo. Se proporcionan métodos para expresar genes tipo KASI en una planta en las patentes US7301070, US6348642, US6660849 y US6770465 o se pueden llevar a cabo usando otras técnicas conocidas generalmente en biotecnología vegetal. Se describe ingeniería de microbios oleaginosos eucarióticos que incluyen microalgas eucarióticas (por ejemplo de Chlorophyta) en las patentes WO2010/063032, WO2011/150411 y WO2012/106560 y en los ejemplos más adelante.

[0044] Las células hospedadoras oleaginosas plastídicas que tienen una vía biosintética de ácidos grasos de tipo II incluyen células oleaginosas plastídicas tales como las de algas oleaginosas. Ejemplos específicos de células de microalga incluyen microalgas eucarióticas heterótrofas o heterótrofas obligadas del filo Chlorophtya, la clase Trebouxiophytae, el orden Chlorellales o la familia Chlorellacae. Se proporcionan ejemplos de células hospedadoras de microalgas oleaginosas eucarióticas en las solicitudes de patente de PCT publicadas WO2008/151149, WO2010/06032, WO2011/150410 y WO2011/150411, que incluyen especies de Chlorella y Prototheca, un género que comprende heterótrofos obligados. Las células oleaginosas pueden ser, por ejemplo, capaces de producir un 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85 o aproximadamente un 90 % de aceite por peso celular, ±5 %. Opcionalmente, los aceites producidos pueden ser bajos en ácidos grasos DHA o EPA. Por ejemplo, los aceites pueden comprender menos del 5 %, 2 % o 1% de DHA y/o EPA. Las publicaciones anteriormente mencionadas revelan también métodos para cultivar tales células y extraer aceite, especialmente a partir de células de microalga; tales métodos son aplicables a las células descritas aquí. Cuando se usan células de microalga, se pueden cultivar de forma autótrofa (salvo un heterótrofo obligado) o a oscuras usando un azúcar (por ejemplo glucosa, fructosa y/o sacarosa). Cuando se cultivan heterótrofamente, las células y el aceite celular comprenden menos de 200 ppm, 20 ppm o 2 ppm de impurezas generadoras de color o de clorofila. En cualquiera de las formas de realización descritas aquí, las células pueden ser células heterótrofas que incluyen un gen de invertasa exógeno para permitir que las células produzcan aceite a partir de una materia prima de sacarosa. De forma alternativa, o adicional, las células pueden metabolizar xilosa a partir de materias primas celulósicas. Por ejemplo, las células pueden ser modificar por ingeniería genética para que expresen uno o más genes de metabolismo de xilosa tales como los que codifican un transportador de xilosa activa, un transportador de xilulosa-5-fosfato, una xilosa isomerasa, una xiluloquinasa, una xilitol dehidrogenasa y una reductasa de xilosa - véase la patente WO2012/154626. Las células se pueden cultivar en una materia prima celulósica despolimerizada tal como bagazo hidrolizado con ácido o enzima, pulpa de remolacha azucarera, hojas y troncos de maíz, astillas de madera, serrín o pasto varilla. Opcionalmente, las células se pueden cultivar en una materia prima celulósica despolimerizada que comprende glucosa y al menos un 5, 10, 20, 30 o 40 % de xilosa, mientras que produce al menos un 20 % de lípido por peso en seco. Opcionalmente, el lípido comprende triglicéridos que tienen un perfil de ácidos grasos caracterizado por al menos un 10, 15 o 20 % de C12:0.

[0045] Opcionalmente, la célula hospedadora comprende ARNr 23S con al menos un 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la SEQ ID NO: 58.

Aceites y productos relacionados

[0046] Las células oleaginosas expresan uno o más genes exógenos que codifican enzimas de biosíntesis de ácidos grasos. Como resultado de ello, algunas formas de realización incluyen aceites celulares que no se pueden obtener a partir de un aceite que no es vegetal o no es de semilla, o no se pueden obtener en absoluto.

[0047] Las células oleaginosas producen un aceite de almacenamiento, que es principalmente un triglicérido y se puede almacenar en cuerpos de almacenamiento de la célula. Un aceite crudo se puede obtener a partir de las células rompiendo las células y aislando el aceite. Las patentes WO2008/151149, WO2010/06032, WO2011/150410 y WO2011/1504 revelan un cultivo heterótrofo y técnicas de aislamiento del aceite. Por ejemplo, se puede obtener aceite cultivando, secando y prensando las células. Los aceites celulares producidos se pueden refinar, blanquear y desodorizar (RBD) tal y como se conoce en la técnica del aceite de semilla o como se describe en la patente WO2010/120939. La etapa de refinación puede comprender el desgomado. Los aceites crudos, refinados o RBD se pueden usar en una variedad de alimentos, sustancias químicas y productos o procesos industriales. Después de recuperar el aceite, permanece una biomasa residual valiosa. Usos para la biomasa residual incluyen la producción de papel, plásticos, absorbentes, adsorbentes, como pienso para animales, para nutrición humana o para fertilizante.

[0048] Donde se proporcione aquí un perfil de ácidos grasos de un aceite celular de triglicérido (también denominado un "triglicérido" o "TAG"), se entenderá que esto hace referencia a una muestra no fraccionada del aceite de almacenamiento extraído de la célula analizada bajo condiciones en las que se han eliminado fosfolípidos o con un método de análisis que es sustancialmente insensible a los ácidos grasos de los fosfolípidos (por ejemplo usando cromatografía y espectrometría de masa). El aceite se puede someter a un proceso RBD para eliminar fosfolípidos, ácidos grasos libres y olores y aún así tener solo cambios menores o insignificantes en el perfil de ácidos grasos de los triglicéridos del aceite. Dado que las células son oleaginosas, en algunos casos el aceite de almacenamiento constituirá el volumen de todos los TAG de la célula.

[0049] El valor de isótopo de carbono estable 513C es una expresión de la proporción de 13C/12C con respecto a un estándar (por ejemplo PDB, carbonita de esqueleto fósil de Belemnite americana de la Formación Peedee de Carolina del Sur). El valor de isótopo de carbono estable 513C (0/00) de los aceites se puede relacionar con el valor 513C de la materia prima usada. En algunas formas de realización, los aceites son derivados de organismos oleaginosos cultivados heterótrofamente en azúcar derivados a partir de una planta C4 tal como maíz o caña de azúcar. En algunas formas de realización, el 513C (0/00) del aceite es de -10 a -170/00 o de -13 a -16 0/00.

[0050] Los aceites producidos según los métodos anteriores en algunos casos se han elaborado usando una célula hospedadora de microalga. Tal y como se ha descrito anteriormente, la microalga puede ser, sin limitación, una microalga eucariótica que recae en la clasificación de la Chlorophyta, Trebouxiophyceae, Chlorellales, Chlorellaceae o Chlorophyceae. Se ha descubierto que las microalgas de Trebouxiophyceae se pueden distinguir de aceites vegetales en función de sus perfiles de esterol. Se descubrió que el aceite producido por la Chlorella protothecoides (un pariente cercano de la Prototheca moriformis) producía esteroles que parecían ser brasicasterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol y beta-sitosterol, cuando se detectan mediante GC-MS. Sin embargo, se cree que todos los esteroles producidos por la Chlorella tienen estereoquímica C24p. De este modo, se cree que las moléculas detectadas como campesterol, estigmasterol y beta-sitosterol son en realidad 22,23-dihidrobrasicasterol, proferasterol y clionasterol, respectivamente. De este modo, los aceites producidos por las microalgas anteriormente descritas se pueden distinguir de los aceites vegetales por la presencia de esteroles con estereoquímica C24a y la ausencia de estereoquímica C24a en los esteroles presentes. Por ejemplo, los aceites producidos pueden contener 22,23-dihidrobrasicasterol mientras que carecen de campesterol; contener clionasterol, mientras que carecen de beta-sitosterol, y/o contener poriferasterol mientras que carecen de estigmasterol. Alternativa o adicionalmente, los aceites pueden contener cantidades significativas de A7-poriferasterol.

[0051] En una forma de realización, los aceites proporcionados aquí no son aceites vegetales. Los aceites vegetales son aceites extraídos de plantas y semillas de plantas. Los aceites vegetales se pueden distinguir de los aceites no vegetales proporcionados provistos aquí basándose en su contenido de aceite. Una variedad de métodos para analizar el contenido de aceite se puede emplear para determinar la fuente del aceite o si se ha producido una adulteración de un aceite proporcionado aquí con un aceite de origen diferente (por ejemplo vegetal). La determinación se puede hacer basándose en uno o una combinación de los métodos analíticos. Estas pruebas incluyen, pero no se limitan a, el análisis de uno o más ácidos grasos libres, perfil de ácidos grasos, contenido de triacilglicerol total, contenido de diacilglicerol, valores de peróxido, propiedades espectroscópicas (por ejemplo absorción de UV), perfil de esterol, productos de degradación de esterol, antioxidantes (por ejemplo tocoferoles), pigmentos (por ejemplo clorofila), valores d13C y análisis sensorial (por ejemplo sabor, olor y textura en la boca). Muchas de estas pruebas se han estandarizado para aceites comerciales tales como las normas del código Codex Alimentarius para grasas y aceites comestibles.

[0052] El análisis del perfil del esterol es un método particularmente conocido para determinar la fuente biológica de materia orgánica. Campesterol, p-sitosterol y estigmasterol son esteroles vegetales comunes, donde el psitosterol es un esterol vegetal de principio. Por ejemplo, se descubrió que el p-sitosterol estaba en mayor cantidad en un análisis de determinados aceites de semilla, aproximadamente un 64 % en el maíz, 29 % en la colza, 64 % en el girasol, 74 % en la semilla de algodón, 26 % en la soja y 79 % en el aceite de oliva (Gul et al. J. Cell and Molecular Biology 5:71-79, 2006).

[0053] El aceite aislado de cepa UTEX1435 de Prototheca moriformis se clarificó (CL), refinó y blanqueó (RB), o refinó, blanqueó y desodorizó (RBD) por separado y se evaluó para el contenido de esterol según el procedimiento descrito en JAOCS vol. 60, n.° 8, agosto de 1983. Los resultados del análisis se muestran a continuación (unidades en mg/100g) en la tabla 6.

[0054] Estos resultados muestran tres características llamativas. En primer lugar, se descubrió que el ergosterol era el más abundante de todos los esteroles, contabilizando aproximadamente un 50 % o más de los esteroles totales. La cantidad de ergosterol es mayor que la de campesterol, beta-sitosterol y estigmasterol combinados. El ergosterol es un esteroide comúnmente hallado en hongos y que no se encuentra habitualmente en plantas y su presencia, particularmente en cantidades significativas, sirve como un marcador útil para los aceites no vegetales. En segundo lugar, se descubrió que el aceite contenía brasicasterol. A excepción del aceite de colza, el brasicasterol no se encuentra comúnmente en aceites vegetales. En tercer lugar, se descubrió que estaba presente menos del 2 % de beta-sitosterol. El beta-sitosterol es un prominente esterol vegetal que no se encuentra comúnmente en las microalgas y su presencia particularmente en cantidades significativas sirve como un marcador útil para los aceites de origen vegetal. En resumen, se ha descubierto que la cepa UTEX1435 de Prototheca moriformis contiene tanto cantidades significativas de ergosterol como solo pequeñas cantidades de beta-sitosterol como un porcentaje de contenido de esterol total. Por consiguiente, la relación de ergosterol: beta-sitosterol o en combinación con la presencia de brasicasterol se puede usar para distinguir este aceite de los aceites vegetales.

[0055] En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí contiene, como un porcentaje de esteroles totales, menos del 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de beta-sitosterol. En otras formas de realización el aceite carece de beta-sitosterol.

[0056] En algunas partes de la divulgación, el aceite carece de uno o más de beta-sitosterol, campesterol o estigmasterol. En algunas partes de la divulgación, el aceite carece de beta-sitosterol, campesterol y estigmasterol. En algunas partes de la divulgación, el aceite carece de campesterol. En algunas partes de la divulgación, el aceite carece de estigmasterol.

[0057] En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí comprende, como un porcentaje de esteroles totales, menos del 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de 24-etilcolest-5-en-3-ol. En algunas partes de la divulgación, el 24-etilcolest-5-en-3-ol es clionasterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí comprende, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % de clionasterol.

[0058] En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí contiene, como un porcentaje de esteroles totales, menos del 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de 24-metilcolest-5-en-3-ol. En algunas partes de la divulgación, el 24-metilcolest-5-en-3-ol es 22,23-dihidrobrasicasterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí comprende, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % de 22,23-dihidrobrasicasterol.

[0059] En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí contiene, como un porcentaje de esteroles totales, menos del 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de 5,22-colestadien-24-etil-3-ol. En algunas partes de la divulgación, el 5,22-colestadien-24-etil-3-ol es poriferasterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí comprende, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % de poriferasterol.

[0060] En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite de un aceite proporcionado aquí contiene ergosterol o brasicasterol o una combinación de los dos. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 % de ergosterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 25 % de ergosterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 40 % de ergosterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 % de una combinación de ergosterol y brasicasterol.

[0061] En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % de brasicasterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales menos del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 % o 5 % de brasicasterol.

[0062] En algunas partes de la divulgación la proporción de ergosterol a brasicasterol es de al menos 5:1, 10:1, 15:1 o 20:1.

[0063] En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 % de ergosterol y menos del 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de beta-sitosterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite contiene, como un porcentaje de esteroles totales, al menos el 25 % de ergosterol y menos del 5 % de beta-sitosterol. En algunas partes de la divulgación, el contenido de aceite comprende además brasicasterol. Para cualquiera de los aceites o aceites de célula descritos en esta aplicación, el aceite puede tener el perfil de esterol de cualquier columna de la tabla 6 anterior con una variación esterol por esterol del 30 %, 20 %, 10 % o menos.

[0064] Los esteroles contienen de 27 a 29 átomos de carbono (C27 a C29) y se encuentran en todas las eucariotas. Los animales hacen exclusivamente esteroles C27 ya que carecen de la capacidad de modificar adicionalmente los esteroles C27 para producir esteroles C28 y C29. Las plantas, sin embargo, son capaces de sintetizar esteroles C28 y C29, y los esteroles vegetales C28/C29 se denominan a menudo fitoesteroles. El perfil de esterol de una planta determinada es alto en esteroles C29 y los esteroles primarios en las plantas son generalmente los esteroles C29 beta-Sitosterol y estigmasterol. En cambio, el perfil de esterol de los organismos no vegetales contiene porcentajes superiores de esteroles C27 y C28. Por ejemplo, los esteroles en los hongos y en muchas microalgas son principalmente esteroles C28. El perfil de esterol y particularmente el notable predominio de los esteroles C29 sobre los esteroles C28 en las plantas ha sido aprovechado para determinar la proporción de material vegetal y marino en muestras de suelo (Huang, Wen-Yen, Meinschein W. G., "Sterols as ecological indicators"; Geochimica et Cosmochimia Acta. Vol 43. Pp. 739-745).

[0065] En algunas partes de la divulgación, los esteroles primarios en los aceites de microalga proporcionados aquí son esteroles diferentes del beta-sitosterol y estigmasterol. En algunas partes de la divulgación de los aceites de microalga, los esteróles C29 componen menos del 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % o 5 % en peso del contenido de esterol total.

[0066] En algunas partes de la divulgación, los aceites de microalga proporcionados aquí contienen esteroles C28 que exceden los esteroles C29. En algunas partes de la divulgación de los aceites de microalga, los esteroles C28 constituyen más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % en peso del contenido de esterol total. En algunas partes de la divulgación, el esterol C28 es ergosterol. En algunas partes de la divulgación el esterol C28 es brasicasterol.

[0067] En ejemplos de la presente descripción, las células oleaginosas que expresan uno o más de los genes de la tabla 1 pueden producir un aceite con al menos el 20, 40, 60 o 70 % de ácidos grasos C8, C10, C12, C14 o C16. En una forma de realización específica, el nivel de miristato (C14:0) en el aceite es superior al 30 %.

[0068] De este modo, en ejemplos de la divulgación, hay un proceso para producir un aceite, triglicérido, ácidos grasos o derivado de cualquiera de estos, que comprende transformar una célula con cualquiera de los ácidos nucleicos tratados aquí. En otra forma de realización, la célula transformada se cultiva para producir un aceite y, opcionalmente, se extrae el aceite. El aceite extraído de esta manera se puede usar para producir alimentos, oleoquímicos u otros productos.

[0069] Los aceites mencionados anteriormente solos o en combinación son útiles en la producción de alimentos, combustibles y productos químicos (incluyendo plásticos, espumas, películas, detergentes, jabones, etc.). Los aceites, triglicéridos y ácidos grasos de los aceites se pueden someter a activación C-H, hidroaminometilación, metoxicarbonatación, ozonólisis, transformaciones enzimáticas, epoxidación, metilación, dimerización, tiolación, metátesis, hidroalquilación, lactonización u otros procesos químicos.

[0070] Después de la extracción del aceite, puede quedar una biomasa residual, que puede tener uso como un combustible, como un pienso para animales o como un ingrediente en papel, plástico u otro producto. Por ejemplo, la biomasa residual de algas heterótrofas se puede usar en dichos productos.

Ejemplos

Ejemplo 1: cribado de genes KAS en combinación con acil-ACP tioesterasa de FATB2 de Cuphea palustris.

[0071] Se elaboró una cepa de Prototheca moriformis que expresa FATB2 de Cuphea palustris (Cpal) con optimización de codones tal y como se describe en la patente WO2013/158938, ejemplo 53 (p. 231). La secuencia de aminoácidos del gen FATB2 de Cpal se proporciona en la SEQ ID NO: 1. Esta cepa (S6336) produjo un aceite celular caracterizado por un perfil de ácidos grasos que tiene aproximadamente un 38 % de ácido mirístico (C14:0).

[0072] Se clonaron seis genes tipo KASI a partir de genomas de aceite de semilla. El ARN total se extrajo de semillas maduras secas usando un mortero y mano de mortero de nitrógeno líquido refrigerado para romper las paredes de semilla. A continuación, se precipitó el ARN con una solución de 8M urea, 3M LiCl seguido de una extracción de fenol-cloroformo. Se generó un banco de ADNc con iniciadores oligo dT usando el ARN purificado y sometido a secuenciación de nueva generación. Los genes KAS nuevos se identificaron a partir del transcriptoma ensamblado usando BLAST con genes KAS conocidos como cebo. Las secuencias de gen KAS identificadas se optimizaron en codones para la expresión en Prototheca y se sintetizaron para la incorporación en un casete de expresión.

[0073] Para evaluar el impacto en la acumulación de miristato, se transformó S6336 con un plásmido linealizado diseñado para recombinación homóloga en el locus de bucle p y para expresar los genes tipo KASI con coexpresión de un marcador de selección (véase la patente WO2013/1589380). El vector se describe en la SEQ ID NO 38, los genes KAS con optimización de codones restantes se sustituyeron en el segmento de la CDS de KAS de este vector antes de la transformación. Tal y como se muestra en la tabla 7, se observaron aumentos en los niveles de C14:0 en el aceite celular extraído con la expresión de los genes KASIV de C. camphora (D3147), KASI de C. camphora (D3148), KASI de U. californica (D3150) o KASVI de U. californica (D3152) en S6336. Se produjeron aumentos todavía mayores en los niveles de C14:0 como resultado de la expresión del gen KASI de KASIV de C. palustris (D3145) o KASAI de C. wrightii (D3153), con algunas líneas individuales que producen >50 % o >55 % de C14:0. La producción de C14 superaba con mucho la pequeña cantidad hallada en el aceite de tipo salvaje (véase la tabla 7a).

Tabla 7. Genes KAS ue efectúan un aumento en los ácidos rasos C14 en el aceite de microal a eucariota.

T l 7 . P rfil i r i Pr h m rif rmi i lv n r .

Ejemplo 2: cribado de genes KAS en combinación con acil-ACP tioesterasa de FATB de Cuphea hookeriana.

[0074] Se construyeron cepas de P. moriformis que expresan acil-ACP tioesterasa de ChFATB2 junto con un gen KAS seleccionado entre diez KASI, un KASIII y un KAS mitocondrial fueron clonados a partir de genomas de aceite de semilla, optimizados en codones e introducidos en la Prototheca tal y como se ha descrito en el ejemplo 1. Los genes KAS se fusionaron a un epítopo HA TAG en el extremo C-terminal de cada KAS para permitir la confirmación de expresión de proteína.

Tabla 8. Perfiles de ácidos grasos C8:0-C10:0 medios derivados de la transformación de la cepa de microalga ue ex resa FATB2 con enes ti o KASI aislados de enomas de aceite de semilla.

[0075] La cepa parental es una cepa de microalga estable que expresa el FATB2 de C. hookeriana bajo el control del promotor PmUAPAI compatible con pH5. La cepa parental acumula el 27,8 % de C8:0-C10:0 con una relación C10/C8 de 2,6. Todos los transformantes se derivan de integraciones de los transgenes KASI en el locus de bucle p de la cepa parental. Las medias se calculan desde al menos 19 transformantes individuales para cada transgén KAS (NE = no enumerado).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polinucleótido con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 39, o un polinucleótido que codifica una proteína de tipo KASI que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2, o una proteína madura producida a partir de estos,

donde dicho polinucleótido, cuando se coexpresa con un gen de acil-ACP tioesterasa FATA o FATB exógeno en una célula hospedadora de microalga oleaginosa, es capaz de enriquecer el contenido de C14:0 del aceite celular producido por la célula hospedadora, con respecto a un aceite producido por una célula del mismo tipo que no expresa dicho polinucleótido.

2. Vector de transformación que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende opcionalmente secuencias promotoras y 3'UTR en conexión funcional con el polinucleótido y, opcionalmente, una secuencia flanqueante para una recombinación homóloga.

3. Célula hospedadora oleaginosa plastídica que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 o el vector según la reivindicación 2, donde la célula hospedadora tiene una vía de biosíntesis de ácidos grasos de tipo II.

4. Célula hospedadora oleaginosa plastídica que comprende:

a) un polinucleótido según la reivindicación 1; y

b) un polinucleótido que codifica una acil-ACP tioesterasa FATA o acil-ACP tioesterasa FATB,

donde la célula hospedadora tiene una vía de biosíntesis de ácidos grasos de tipo II.

5. Célula hospedadora según la reivindicación 4, donde la acil-ACP tioesterasa FATA o la acil-ACP tioesterasa FATB es una acil-ACP tioesterasa FATB que tiene al menos un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 57.

6. Célula hospedadora según la reivindicación 5, donde la célula hospedadora produce un aceite celular caracterizado por un perfil de ácidos grasos con (i) al menos un 30, 40, 50 o 55 % de C14:0, (ii) al menos un 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 % de C8:0, (iii) al menos un 10, 15, 20, 25, 30 o 35 % en área para la suma de C8:0 y C10:0, o (iv) una relación C8/C10 en el rango de 2,2-2,5; 2,5-3,0 o 3,0-3,4.

7. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde uno o más de los polinucleótidos presenta una optimización de codones para la expresión en la célula hospedadora de manera que la secuencia codificante del polinucleótido contenga el codón más preferido o el segundo codón más preferido para al menos el 60 % de los codones de la secuencia codificante de manera que la secuencia de codones optimizados se traduzca de forma más eficiente en la célula hospedadora con respecto a una secuencia no optimizada, opcionalmente donde la secuencia codificante contiene el codón más preferido para al menos el 80 % de los codones de la secuencia codificante.

8. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, donde la célula hospedadora es una microalga.

9. Célula hospedadora según la reivindicación 8, donde la célula hospedadora es de Trebouxiophyceae, y opcionalmente del género Chlorella o Prototheca, opcionalmente donde, además, la microalga es de la especie Prototheca moriformis.

10. Método para hacer un aceite celular, donde el método comprende cultivar una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, para producir el aceite celular, donde el aceite comprende triglicéridos y esteroles de microalga, donde opcionalmente el aceite celular comprende esteroles, caracterizado por un perfil de esterol y el perfil de esterol tiene un exceso de ergosterol con respecto al p-sitosterol y/o la presencia de 22,23-dihidrobrasicasterol, poriferasterol o clionasterol.