ES2763624T3 - Producción de ácidos grasos y derivados de los mismos - Google Patents

Abstract

Una célula de E. coli recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos una enzima de una ruta biosintética de alcohol graso para su uso en la producción de un alcohol graso, en donde el alcohol graso se libera de la célula al medio de cultivo a una relación 5 1: 1 de producto intracelular a producto extracelular, y en donde la una o más secuencias de ácido nucleico exógeno están sobreexpresadas.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de ácidos grasos y derivados de los mismos

Referencias con respecto a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos N.° 60/802016 presentada el 19 de mayo de 2006, de la solicitud provisional de los Estados Unidos N.° 60/801 995 presentada el 19 de mayo de 2006, de la solicitud provisional de los Estados Unidos N.° 60/908547 presentada el 28 de marzo de 2007 y de la solicitud PCT con el número PCT/US2007/003736 presentada el 13 de febrero de 2007.

Campo

Se proporcionan microorganismos genomodificados que producen productos a partir de la ruta biosintética de los ácidos grasos (derivados de ácidos grasos), así como métodos de su uso.

Antecedentes

Los desarrollos tecnológicos han estado acompañados por una mayor dependencia de las fuentes de combustible y dichas fuentes de combustible son cada vez más limitadas y difíciles de adquirir. Con la quema de combustibles fósiles a un ritmo sin precedente, es probable que la demanda mundial de combustible supere pronto los suministros actuales de combustible.

Como resultado, se han dirigido esfuerzos hacia el aprovechamiento de fuentes de energía renovable, tales como la luz solar, agua, viento y biomasa. El uso de biomasa para producir nuevas fuentes de combustible que no procedan de fuentes de petróleo, (es decir, biocombustible) ha surgido como una opción alternativa. El biocombustible (biodiésel) es un combustible inflamable biodegradable, de combustión limpia, compuesto por alcanos y ésteres de cadena larga. El biodiésel puede usarse en forma pura en la mayoría de los motores diésel de combustión interna, lo que se denomina biodiésel "puro", o como una mezcla en cualquier concentración con diésel de petróleo normal. Los métodos actuales de producción de biodiésel implican la transesterificación de triacilglicéridos (principalmente aceite vegetal) que conduce a una mezcla de ésteres de ácidos grasos y al producto secundario no deseado, la glicerina, proporcionando por tanto un producto que es heterogéneo y un producto de desecho que provoca ineficiencias económicas.

Sumario

En el presente documento se desvelan microorganismos recombinantes que son capaces de sintetizar productos derivados de la ruta biosintética de los ácidos grasos (derivados de ácidos grasos), y opcionalmente liberar dichos productos en el caldo de fermentación. Dichos derivados de ácidos grasos son útiles, entre otras cosas, como biocombustibles y productos químicos especializados. Estos biocombustibles y productos químicos especializados pueden utilizarse para fabricar productos adicionales, tales como complementos nutricionales, polímeros, sustitutos de parafina y productos para el cuidado personal.

Los microorganismos recombinantes desvelados en este documento pueden genomodificarse para producir diversos derivados de ácidos grasos que incluyen, pero sin limitación, alcoholes de cadena corta tales como etanol, propanol, isopropanol y butanol, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, hidrocarburos y ésteres de ceras.

En un ejemplo, la divulgación proporciona un método para modificar un microorganismo para que produzca y, opcionalmente libere, derivados de ácidos grasos generados a partir de una fuente de carbono renovable. Dichos microorganismos se genomodifican, por ejemplo, introduciendo una secuencia de ADN exógeno que codifique una o más proteínas capaces de metabolizar una fuente de carbono renovable para producir y, en algunos ejemplos, secretar, un derivado de ácido graso. Después, los microorganismos modificados pueden usarse en un procedimiento de fermentación para producir derivados de ácidos grasos útiles utilizando, como material de partida, la fuente de carbono renovable (biomasa). En algunos ejemplos, se utiliza un microorganismo existente, que puede tratarse genéticamente debido a la facilidad de genomodificar sus rutas para controlar el crecimiento, la producción y reducir o eliminar reacciones secundarias que reducen la eficacias de la ruta biosintética. Además, dichos microorganismos modificados pueden usarse para consumir fuentes de carbono renovables para generar combustibles que puedan usarse directamente como biocombustibles, sin la necesidad de métodos especiales para su almacenamiento o transporte. En otros ejemplos, microorganismos que producen de manera natural hidrocarburos, se genomodifican para que sobreproduzcan hidrocarburos expresando secuencias de ácido nucleico exógeno que aumentan la producción de ácidos grasos.

En el presente documento se proporcionan microorganismos que producen derivados de ácidos grasos que tienen niveles de saturación, ramificación y longitud de la cadena de carbono definidos. En ejemplos particulares, la producción de productos homogéneos disminuye el coste global asociado a la fermentación y separación. En algunos ejemplos, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos una tioesterasa (CE 3.1.2.14), y al menos una cera sintasa (CE 2.3.1.75). En otros ejemplos, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos una tioesterasa (CE 3.1.2.14) y al menos una alcohol acetiltransferasa (2.3.1.84). En otros ejemplos más, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos una tioesterasa (CE 3.1.2.14), al menos una acil-CoA reductasa (CE 1.2.1.50) y al menos una alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1). También se proporcionan microorganismos que expresan una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos una tioesterasa (CE 3.1.2.14) y al menos una acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso (CE 1.1.1.*). Para proporcionar productos homogéneos pueden elegirse péptidos de tioesterasa codificados por las secuencias de ácido nucleico exógeno.

En algunos ejemplos, el microorganismo que se genomodifica para producir el derivado de ácido graso es E. coli, Z. mobilis, Rhodococcus opacus, Ralstonia eutropha, Vibrio furnissii, Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus lactis, Streptomycetes, Stenotrophomonas maltophila, Pseudomonas o Micrococus leuteus y sus microorganismos relacionados.

En otros ejemplos, los microorganismos que producen hidrocarburos de forma endógena pueden genomodificarse para sobreproducir hidrocarburos optimizando la ruta biosintética de los ácidos grasos tal como se describe en el presente documento. Como ejemplos de microorganismos que se sabe que producen hidrocarburos y que pueden genomodificarse para sobreproducir hidrocarburos usando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento se incluyen Arthrobacter sp., Bacillus sp., Botryococcus braunii, Chromatium sp., Cladosporium resina (ATCC22711), Clostridium pasteurianum VKM, Clostridium tenanomorphum, Clostridium acidiurici, especies de Corynebacterium, especies de cianobacterias (Nostoc muscorum, Anacystis (Synechococcus) nidulans, Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii, Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii, Microcoleus chthonoplaseis, Coccochloris elabens, Agmenellum quadruplicatum, Plectonema terebrans, M vaginatus y C. scopulorum), Desulfovibrio desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAA-149), Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381,382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 401,533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516), Micrococcus lysodeikticus, especies de Mycobacterium, Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma virida, Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456), Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp., Rhodospirillium rubrum (ATCC11170), Rhodomicrobium vannielii, Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), Saccharomycodes ludwigii (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus, ludwiggi, tropicalis), Vibrio furnissii M1, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus, Serratia marinorubra, Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri, Sphacelotheca reiliana y Tilletia sp. (foetida, caries, controversa).

Además de genomodificarse para que exprese secuencias de ácido nucleico exógeno que permitan la producción de derivados de ácidos grasos, el microorganismo puede tener adicionalmente uno o más genes endógenos delecionados o atenuados funcionalmente. Por ejemplo, ackA (CE 2.7.2.1), ackB (CE 2.7.2.1), adhE. (CE 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (CE 2.3.1.179), fabR (registro NP_418398), fadE (CE 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (CE 6.3.2.3), gpsA (CE 1.1.1.94), ldhA (CE 1.1.1.28), pflB (CE 2.3.1.54), plsB (CE 2.3.1.15), poxB (CE 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutatión sintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de los mismos, pueden atenuarse.

Además de genomodificarse para que exprese secuencias de ácido nucleico exógeno que permitan la producción de derivados de ácidos grasos, el microorganismo puede tener adicionalmente uno o más genes adicionales sobreexpresados. Por ejemplo, pdh, panK, aceEF (que codifica el componente de deshidrogenasa E1p y el componente de dihidrolipoamida aciltransferasa E2p de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato deshidrogenasa, Registros: NP_414656, NP_414657, CE: 1.2.4.1.2.3.1.61,2.3.1.12), accABCD / fabH / fabD/fabG/acpP/fabF (que codifican FAS, Registros: CAD85557, CAD85558, NP_842277, NP_841683, NP_415613, CE: 2.3.1.180, 2.3.1.39, 1.1.1.100, 1.6.5.3, 2.3.1.179), genes que codifican acil-coA reductasas grasas (Registros: AAC45217, CE 1.2.1.-), UdhA o genes similares (que codifican la piridina nucleótido transhidrogenasa, Registro: CAA46822, CE: 1.6.1.1) y genes que codifican acil-CoA reductasas grasas (Registros: AAC45217, CE 1.2.1.-).

En algunos ejemplos, los microorganismos descritos en el presente documento producen al menos 1 mg de derivado de ácido graso por litro de caldo de fermentación. En otros ejemplos, los microorganismos producen al menos 100 mg/l, 500 mg/l, 1 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 25 g/l, 30 g/l, 35 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 100 g/l o 120 g/l de derivado de ácido graso por litro de caldo de fermentación. En algunos ejemplos, el derivado de ácido graso se produce y se libera del microorganismo y en otros ejemplos más, el microorganismo se somete a lisis antes de la separación del producto.

En algunos ejemplos, el derivado de ácido graso incluye una cadena de carbono que tiene una longitud de al menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34 carbonos. En algunos ejemplos al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % del producto derivado de ácido graso producido contiene una cadena de carbono que tiene una longitud de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34 carbonos. En otros ejemplos más, al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % del producto derivado de ácido graso contiene 1, 2, 3, 4 o 5, puntos de insaturación.

También se proporcionan métodos de producción de derivados de ácidos grasos. Estos métodos incluyen el cultivo de los microorganismos descritos en este documento y la separación del producto del caldo de fermentación.

Estos y otros ejemplos se describen adicionalmente en la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

En la figura 1 se muestra la ruta biosintética de FAS (por sus siglas en inglés Fatty Acid Synthase, ácido graso sintasa).

En la figura 2 se muestran rutas biosintéticas que producen ceras. Las ceras pueden producirse en una célula hospedadora utilizando alcoholes producidos dentro de la célula hospedadora o pueden producirse añadiendo alcoholes exógenos en el medio. Un microorganismo diseñado para producir ceras producirá enzimas cera sintasa (CE 2.3.1.75) utilizando secuencias de ácido nucleico exógeno, así como secuencias de tioesterasa (CE 3.1.2.14). Otras enzimas que también pueden modularse para aumentar la producción de ceras incluyen enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos (enzimas de FAS CE 2.3.1.85), acil-CoA sintasa (CE 2.3.1.86), acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso (CE 1.1.1.*), acil-CoA reductasa (1.2.1.50) y alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1). En la figura 3 se muestran rutas biosintéticas que producen alcoholes grasos. Los alcoholes grasos que tienen longitudes de cadena de carbono definidas pueden producirse expresando secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican tioesterasas (CE 3.1.2.14), y combinaciones de acil-CoA reductasas (CE 1.2.1.50), alcohol deshidrogenasas (CE 1.1.1.1) y acil-CoA reductasas formadoras de alcohol graso (FAR, CE 1.1.1 *). Otras enzimas que también pueden modularse para aumentar la producción de alcoholes grasos son las enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos (enzimas de FAS CE 2.3.1.85) y acil-CoA sintasa (CE 2.3.1.86).

En la figura 4 se muestran rutas biosintéticas que producen ésteres de ácidos grasos. Los ésteres de ácidos grasos que tienen longitudes de cadena de carbono definidas, pueden producirse expresando de manera exógena varias tioesterasas (CE 3.1.2.14), combinaciones de acil-CoA reductasa (1.2.1.50), alcohol deshidrogenasas (CE 1.1.1.1) y acil-CoA reductasa formadoras de alcohol graso (FAR, CE 1.1.1*), así como, acetil transferasa (CE 2.3.1.84). Otras enzimas que pueden modularse para aumentar la producción de ésteres de ácidos grasos incluyen enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos (enzimas de FAS CE 2.3.1.85) y la acil-CoA sintasa (CE 2.3.1.86).

En la figura 5 se muestra la producción de alcohol graso por la cepa descrita en el ejemplo 4, cotransformada con pCDFDuet-1-fadD-acr1 y plásmidos que contienen varios genes de tioesterasa. Las cepas se cultivaron en condiciones aerobias a 25° C en medio mineral M9 con glucosa al 0,4 % en frascos de agitación. Se identificaron alcoholes grasos C10, C12, C14, C16 y C18 saturados. En algunas muestras también se detectaron pequeñas cantidades de alcoholes grasos C16:1 y C18:1. Los alcoholes grasos se extrajeron de los sedimentos celulares usando acetato de etilo y se derivatizaron con N-trimetilsililo (TMS) imidazol para aumentar la detección.

En la figura 6 se muestra la liberación de alcoholes grasos de la cepa de producción. Aproximadamente, el 50 % del alcohol graso producido se liberó de las células cuando estas se cultivaron a 37° C.

En las figuras 7A-7D se muestra el espectro de CG-EM (Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas) de octanoato de octilo (C8C8) producido por hospedadores de producción que expresan alcohol acetil transferasa (AAT, CE 2.3.1.84) y hospedadores de producción que expresan cera sintasa (CE 2.3.1.75). En la figura 7A se muestra el extracto de acetato de acetilo de la cepa C41(DE3, AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 expresa ADP1 (cera sintasa). En la figura 7b se muestra el extracto de acetato de acetilo de la cepa C41(DE3, AfadE/pHZl43)/pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 expresa SAAT. En la figura 7C se muestra el extracto de acetato de acetilo de la cepa C41(DE3, AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 no contenía ADP1 (cera sintasa) o SAAT. En la figura 7D se muestra el espectro de masas y el patrón de fragmentación de C8C8 producidos por C41(DE3, AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 expresaba SAAT).

En la figura 8 se muestra la distribución de ésteres etílicos producidos cuando la cera sintasa de A. baylyi ADP1 (WSadp1) se coexpresaba con el gen de tioesterasa de Cuphea hookeriana en un hospedador de producción. En las figuras 9A y 9B se muestran cromatogramas de análisis de GC/MS. En la figura 9A se muestra un cromatograma del extracto de etilo del cultivo de la cepa LS9001 de E. coli transformada con los plásmidos pCDFDuet-1-fadD-WSadp1, pETDuet-1-'tesA. Las fermentaciones se sustentaron con etanol. En la figura 9B se muestra un cromatograma de hexadecanoato de etilo y oleato de etilo utilizados como referencia.

En la figura 10 se muestra una tabla que identifica varios genes que pueden sobreexpresarse o atenuarse para aumentar la producción de derivados de ácidos grasos. La tabla también identifica varios genes que pueden modularse para alterar la estructura del producto derivado de ácido graso. Un experto habitual en la técnica apreciará que algunos de los genes que se utilizan para alterar la estructura del derivado de ácido graso también aumentarán la producción de derivados de ácido graso.

Abreviaturas y términos

Para describir mejor la presente divulgación y para orientar a los expertos habituales en la materia a la hora de llevar a la práctica esta divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos y métodos. Como se usa en el presente documento, "que comprende" significa "que incluye" y las formas en singular "uno(a)", "un" o "el/la" incluyen referencias en plural, a menos que en el contexto se estipule claramente otra cosa. Por ejemplo, la referencia a "que comprende una célula" incluye una o una pluralidad de dichas células, y la referencia a "que comprende la tioesterasa" incluye la referencia a uno o más péptidos de tioesterasa y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos habituales en la materia, y así sucesivamente. El término "o" se refiere a un elemento individual de elementos alternativos indicados o una combinación de dos o más elementos, a menos que en el contexto se indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la frase "actividad tioesterasa o actividad acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso" se refiere a actividad tioesterasa, a actividad acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso, o a una combinación de actividad tanto acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso como tioesterasa.

A menos que se explique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende normalmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayos de la presente divulgación, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características de la divulgación son obvias a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Números de registro: Los números de registro a lo largo de esta descripción proceden de la base de datos del NCBI (siglas del inglés National Center for Biotechnology Information, Centro Nacional de Información Biotecnológica) gestionada por el Instituto Nacional de Salud (National Institute of Health), EE.UU. Los números de registro son tal como se proporcionan en la base de datos del 27 de marzo de 2007.

Números de la clasificación de enzimas (CE): Los números de la CE proporcionados a lo largo de esta descripción proceden de la base de datos KEGG Ligand, gestionada por la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, financiada en parte por la Universidad de Tokio. Los números de la CE son tal como se proporcionan en la base de datos el 27 de marzo de 2007.

Atenuar: Reducir el impacto, la actividad o la fuerza de algo. En un ejemplo, la sensibilidad de una enzima particular frente a la inhibición por retroalimentación o inhibición causada por una composición que no es un producto o un reactante (retroalimentación no específica de la ruta), se reduce de manera que la actividad enzimática no se ve afectada por la presencia de un compuesto. Por ejemplo, el gen fabH y su secuencia de aminoácidos correspondiente, son sensibles a la temperatura y pueden alterarse para disminuir la sensibilidad frente a fluctuaciones de temperatura. La atenuación del gen fabH puede utilizarse cuando se desean aminoácidos ramificados. En otro ejemplo, puede decirse que una enzima que se ha alterado para que sea menos activa es una enzima atenuada.

Para atenuar una enzima puede usarse una deleción funcional de una enzima. Una deleción funcional es una mutación, deleción parcial o completa, inserción u otra variación realizada en una secuencia génica o en una secuencia que controla la transcripción de una secuencia génica, que reduce o inhibe la producción del producto génico, o que hace que el producto génico no sea funcional (es decir la mutación descrita en el presente documento para el gen pIsB). Por ejemplo, la deleción funcional de fabR en E. coli reduce la represión de la ruta biosintética de ácidos grasos y permite que E. coli produzca más ácidos grasos insaturados (AGI). En algunos casos, una deleción funcional se describe como una mutación de desactivación.

Un experto habitual en la técnica apreciará que hay muchos métodos para atenuar una actividad enzimática. Por ejemplo, la atenuación puede realizarse introduciendo cambios en la secuencia de aminoácidos alterando la secuencia de ácido nucleico, colocando el gen bajo el control de un promotor menos activo, expresando ARN de interferencia, ribozimas o secuencias antisentido que se dirigen al gen de interés, o a través de cualquier otra técnica conocida en la materia.

Fuente de carbono: Generalmente se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para su uso como fuente de carbono para el crecimiento de células procariotas o eucariotas sencillas. Las fuentes de carbono pueden ser de varias formas, entre las que se incluyen, aunque sin limitación, polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos, etc. Éstas incluyen, por ejemplo, varios monosacáridos tales como glucosa, oligosacáridos, polisacáridos, material celulósico, xilosa y arabinosa, disacáridos, tales como sacarosa, ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato, acetato, etanol, etc., o mezclas de los mismos. Adicionalmente, la fuente de carbono puede ser un producto de la fotosíntesis, incluyendo, pero sin limitación, glucosa.

ADNc (ADN complementario): Un trozo de ADN que carece de segmentos internos, no codificantes (intrones) y secuencias reguladoras que determinan la transcripción. El ADNc puede sintetizarse mediante transcripción inversa de ARN mensajero extraído de células.

Deleción: La eliminación de uno o más nucleótidos de una molécula de ácido nucleico o uno o más aminoácidos de una proteína, uniéndose entre sí las regiones en ambos lados.

Detectable: Que puede determinarse su existencia o presencia. Por ejemplo, la producción de un producto a partir de un reactante, por ejemplo, la producción de ácidos grasos C18, es detectable usando el método proporcionado más adelante en el ejemplo 11.

ADN: Ácido desoxirribonucleico. El ADN es un polímero de cadena larga que incluye el material genético de la mayoría de los organismos vivos (algunos virus tienen genes que incluyen ácido ribonucleico, ARN). Las unidades de repetición en los polímeros de ADN son cuatro nucleótidos diferentes, cada uno de los cuales incluye una de las cuatro bases, adenina, guanina, citosina y timina unidas un azúcar de desoxirribosa al que se une un grupo fosfato. En las moléculas de ADN, los tripletes de nucleótidos, denominados codones, codifican aminoácidos en un péptido. El término codón también se usa para las secuencias correspondientes (y complementarias) de tres nucleótidos en el ARNm en el que se transcribe la secuencia de ADN.

Endógeno: Como se usa en el presente documento con referencia a una molécula de ácido nucleico y a una célula o microorganismo particular, se refiere a una secuencia de ácido nucleico o péptido que está en la célula y que no se introdujo en la célula usando técnicas de genomodificación recombinantes. Por ejemplo, un gen que estaba presente en la célula cuando la célula se aisló originalmente de la naturaleza. Un gen se sigue considerando endógeno si las secuencias de control, tales como secuencias promotoras o potenciadoras que activan la transcripción o traducción, se han alterado mediante técnicas recombinantes.

Exógeno: Como se usa en el presente documento con referencia a una molécula de ácido nucleico y a una célula particular, se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que no se origina a partir de esa célula particular tal como se encuentra en la naturaleza. Por tanto, una molécula de ácido nucleico que no se produce de manera natural se considera que es exógena con respecto a la célula una vez introducida en la célula. Una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural también puede ser exógena con respecto a una célula particular. Por ejemplo, una secuencia codificante completa aislada de una célula X es un ácido nucleico exógeno con respecto a la célula Y una vez que la secuencia codificante se introduce en la célula Y, incluso si X e Y son el mismo tipo de célula.

Expresión: El proceso por el cual la información codificada en un gen se convierte en las estructuras y funciones de una célula, tal como una proteína, ARN de transferencia o ARN ribosómico. Los genes expresados incluyen los que se transcriben en ARNm y después se traducen en proteína y los que se transcriben en a Rn pero no se traducen en proteína (por ejemplo, ARN de transferencia y ribosómico).

Éster graso: Incluye cualquier éster compuesto por un ácido graso. Las cadenas de carbono en los ácidos grasos pueden contener cualquier combinación de las modificaciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, la cadena de carbono puede contener uno o más puntos de insaturación, uno o más puntos de ramificación, incluyendo ramificación cíclica, y puede genomodificarse para que sea corta o larga. Para formar ésteres de ácidos grasos puede usarse cualquier alcohol, por ejemplo, alcoholes derivados de la ruta biosintética de ácidos grasos, alcoholes producidos por el hospedador de producción a través de rutas biosintéticas de ácidos no grasos, y alcoholes que se suministran en el caldo de fermentación.

Derivado de ácido grasos: Incluye productos producidos, en parte, a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos del organismo hospedador. La ruta biosintética de ácidos grasos incluye enzimas de ácido graso sintasa que pueden genomodificarse como se describe en el presente documento para producir derivados de ácidos grasos, y en algunos ejemplos, pueden expresarse con enzimas adicionales para producir derivados de ácidos grasos que tienen características de cadena de carbono deseadas. Como ejemplos de derivados de ácidos grasos se incluyen, por ejemplo, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos y ésteres de ácidos grasos, incluidas las ceras.

Caldo de fermentación: Incluye cualquier medio que soporte la vida de los microorganismos (es decir un microorganismo que metabolice activamente carbono). Normalmente, un medio de fermentación contiene una fuente de carbono. La fuente de carbono puede ser cualquier cosa que el microorganismo pueda utilizar, con o sin enzimas adicionales, para obtener energía.

Hidrocarburo: incluye compuestos químicos que contienen los elementos carbono (C) e hidrógeno (H). Todos los hidrocarburos constan de un esqueleto de carbono y de átomos de hidrógeno unidos a este esqueleto. Algunas veces, el término se usa como una forma abreviada de la expresión "hidrocarburo alifático". Existen esencialmente tres tipos de hidrocarburos: (1) hidrocarburos aromáticos, que tienen al menos un anillo aromático; (2) hidrocarburos saturados, también conocidos como alcanos, que no tienen enlaces dobles, triples o aromáticos; y (3) hidrocarburos insaturados, que tienen uno o más enlaces dobles o triples entre átomos de carbono, se dividen en: alquenos, alquinos y dienos. Los hidrocarburos líquidos extraídos de menara geológica se denominan petróleo (literalmente "aceite de roca") o aceite mineral, mientras que los hidrocarburos geológicos gaseosos se denominan gas natural. Todos son fuentes significativas de combustible y materiales de partida como materias primas para la producción de productos químicos orgánicos y se encuentran habitualmente bajo la superficie de la tierra utilizando herramientas de la geología del petróleo. Las reservas de petróleo en rocas sedimentarias son la principal fuente de hidrocarburos para la industria energética y de productos químicos. Los hidrocarburos son de gran importancia económica porque incluyen los constituyentes de los principales combustibles fósiles (carbón mineral, petróleo, gas natural, etc.) y biocombustibles, así como plásticos, ceras, disolventes y aceites.

Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína o célula) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en los que el componente se produce de manera natural, tales como otros ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, y proteínas. Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que se han "aislado" incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas purificadas por métodos de purificación estándar. El término también incluye moléculas de ácido nucleico y proteínas preparadas por expresión recombinante en una célula hospedadora, así como moléculas de ácido nucleico y proteínas sintetizadas químicamente.

En un ejemplo, aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural que no está inmediatamente contigua a ambas secuencias con las que está inmediatamente contigua (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que procede.

Microorganismo: Incluye especies microbianas procariotas y eucariotas de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo este último levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas o protistas superiores. Las expresiones "células microbianas" y "microbios" se usan indistintamente con el término microorganismo.

Molécula de ácido nucleico: Abarca moléculas tanto de ARN como de ADN, incluyendo, sin limitación, ADNc, ADN genómico y ARNm. Incluye moléculas de ácido nucleico sintéticas, como las que se sintetizan químicamente o se producen de forma recombinante. La molécula de ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria. Cuando es monocatenaria, la molécula de ácido nucleico puede ser la cadena en sentido o la cadena antisentido. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser circular o lineal.

Unido operativamente: Una primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente unido a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteína, están en el mismo marco de lectura. Las configuraciones de genes separados que se transcriben en tándem como ARN mensajero individual se denominan operones. Por tanto, la colocación de genes en estrecha proximidad, por ejemplo, en un vector plasmídico, bajo la regulación transcripcional de un promotor individual, constituye un operón sintético.

ORF (siglas del inglés open reading frame, marco abierto de lectura): Una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación. Normalmente, estas secuencias son traducibles en un péptido.

Sobreexpresado: Cuando se hace que un gen se transcriba a una tasa elevada en comparación con la tasa de transcripción endógena de ese gen. En algunos ejemplos, sobreexpresión incluye adicionalmente una tasa elevada de traducción del gen en comparación con la tasa de traducción endógena de ese gen. En la técnica se conocen bien métodos de ensayo para la sobreexpresión, por ejemplo, los niveles de ARN transcrito pueden evaluarse usando rtPCR y los niveles de proteína pueden evaluarse usando análisis en gel de SDS page.

Purificado: El término purificado no requiere pureza absoluta; más bien, pretende ser un término relativo. Por tanto, por ejemplo, una preparación de derivado de ácido graso purificado, tal como una cera, o una preparación de éster de ácido graso, es una en la que el producto está más concentrado de lo que está el producto en su entorno dentro de una célula. Por ejemplo, una cera purificada es una cera que está sustancialmente separada de los componentes celulares (ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono y otros péptidos) que pueden acompañarla. En otro ejemplo, una preparación de cera purificada es una en la que la cera carece sustancialmente de contaminantes, como los que podría haber después de la fermentación.

En un ejemplo, un éster de ácido graso está purificado cuando al menos aproximadamente el 50 % en peso de una muestra está compuesta por el éster de ácido graso, por ejemplo cuando al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 % o 99 % o más de una muestra está compuesta por el éster de ácido graso. Los ejemplos de métodos que pueden usarse para purificar ceras, alcoholes grasos y ésteres de ácidos grasos, incluyen los métodos descritos más adelante en el ejemplo 11.

Recombinante: Una molécula de ácido nucleico o proteína recombinante es una que tiene una secuencia que no es de origen natural, que tiene una secuencia compuesta por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, o ambas cosas. Esta combinación artificial puede realizarse, por ejemplo, por síntesis química o manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácido nucleico o proteínas, tales como técnicas de genomodificación. Recombinante también se usa para describir moléculas de ácido nucleico que se han manipulado artificialmente, pero que contienen las mismas secuencias reguladoras y regiones codificantes que las que se encuentran en el organismo del cual se aisló el ácido nucleico. Una célula o un microorganismo recombinante es una/o que contiene una molécula de ácido nucleico exógeno, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante.

Liberación: El movimiento de un compuesto desde el interior de una célula (intracelular) hacia el exterior de una célula (extracelular). El movimiento puede ser activo o pasivo. Cuando la liberación es activa, puede ser facilitada por uno o más péptidos transportadores y, en algunos ejemplos, puede consumir energía. Cuando la liberación es pasiva, puede ser por difusión a través de la membrana y puede facilitarse mediante la recogida continua del compuesto deseado del entorno extracelular, promoviendo así la difusión adicional. La liberación de un compuesto también puede realizarse sometiendo a lisis una célula.

Tensioactivos: Sustancias capaces de reducir la tensión superficial de un líquido en el que están disueltas. Normalmente, se componen de una cabeza soluble en agua y una cadena o cola de hidrocarburo. El grupo soluble en agua es hidrófilo y puede ser iónico o no iónico, y la cadena de hidrocarburo es hidrófoba. Los tensioactivos se utilizan en una variedad de productos, incluidos detergentes y productos de limpieza, y también se utilizan como agentes auxiliares para textiles, cuero y papel, en procedimientos químicos, en productos cosméticos y farmacéuticos, en la industria alimentaria y en agricultura. Además, se pueden utilizar para ayudar en la extracción y el aislamiento de los aceites crudos que se encuentran en entornos de difícil acceso o como emulsiones de agua.

Hay cuatro tipos de tensioactivos caracterizados por diferentes usos. Los tensioactivos aniónicos tienen actividad de tipo detergente y generalmente se usan para aplicaciones de limpieza. Los tensioactivos catiónicos contienen hidrocarburos de cadena larga y a menudo se usan para tratar proteínas y polímeros sintéticos o son componentes de suavizantes de tejidos y acondicionadores del cabello. Los tensioactivos anfóteros también contienen hidrocarburos de cadena larga y normalmente se usan en champús. Los tensioactivos no iónicos se usan generalmente en productos de limpieza.

Célula transformada o recombinante: Una célula en la que se ha introducido una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ácido nucleico que codifica la acil-CoA sintasa, por ejemplo, mediante técnicas de biología molecular. La transformación abarca todas las técnicas mediante las cuales se puede introducir una molécula de ácido nucleico en dicha célula, incluyendo, pero sin limitación, transfección con vectores víricos, conjugación, transformación con vectores plasmídicos e introducción de ADN desnudo por electroporación, lipofección y aceleración con pistola de partículas.

En condiciones que permiten la producción de producto: Cualquier condición de fermentación que permita a un microorganismo producir un producto deseado, tal como ácidos grasos, hidrocarburos, alcoholes grasos, ceras o ésteres de ácidos grasos. Las condiciones de fermentación normalmente incluyen intervalos de temperatura, niveles de aireación y selección de medios, que cuando se combinan permiten que el microorganismo crezca. Como ejemplos de medios se incluyen caldos o geles. En general, el medio incluye una fuente de carbono tal como glucosa, fructosa, celulosa, o similares, que el microorganismo puede metabolizar directamente, o pueden usarse enzimas en el medio para facilitar la metabolización de la fuente de carbono. Para determinar si las condiciones de cultivo permiten la producción del producto, el microorganismo se puede cultivar durante 24, 36 o 48 horas y se puede obtener y analizar una muestra. Por ejemplo, las células en la muestra o el medio en el que se cultivaron las células, pueden analizarse para determinar la presencia del producto deseado. Cuando se analiza la presencia de un producto pueden utilizarse ensayos tales como los proporcionados más adelante en los ejemplos.

Vector: Una molécula de ácido nucleico tal como se introduce en una célula, produciendo así una célula transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que permiten que se replique en la célula, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores de selección y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.

Cera: Una variedad de ésteres de ácidos grasos que forman sólidos o sustancias maleables en un conjunto de condiciones físicas identificadas. Los ésteres de ácidos grasos que se denominan ceras generalmente tienen cadenas de carbono más largas que los ésteres de ácidos grasos que no son ceras. Por ejemplo, una cera generalmente forma una sustancia maleable a temperatura ambiente.

Descripción detallada

I. Producción de derivados de ácidos grasos

El organismo hospedador en el que se transforman secuencias de ADN exógeno puede ser un organismo hospedador modificado, tal como un organismo que se ha modificado para aumentar la producción de acil-ACP o acil-CoA, reducir el catabolismo de derivados de ácidos grasos y productos intermedios, o reducir la inhibición por retroalimentación en puntos específicos en la ruta biosintética. Además de modificar los genes descritos en el presente documento, se pueden desviar recursos celulares adicionales para sobreproducir ácidos grasos, por ejemplo, las rutas de lactato, succinato y/o acetato pueden atenuarse, y puede sobreexpresarse acetil-CoA carboxilasa (ACC). Las modificaciones en el hospedador de producción descrito en el presente documento pueden ser a través de alteraciones genómicas, sistemas de expresión extracromosómicos, o combinaciones de los mismos. En las figuras 1 y 2 se proporciona una visión general de la ruta.

A. De acetil-CoA - malonil-CoA a acil-ACP

La ácido graso sintasa (FAS) es un grupo de péptidos que catalizan el inicio y el alargamiento de cadenas de acilo (Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). La proteína transportadora de acilo (ACP, siglas del inglés acyl carrier protein) junto con las enzimas en la ruta de FAS controlan la longitud, el grado de saturación y la ramificación de los ácidos grasos producidos. Las enzimas que pueden incluirse en FAS incluyen AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, FabI, FabK, FabL, FabM, FabB y FabF. Dependiendo del producto deseado, uno o más de estos genes pueden atenuarse o sobreexpresarse.

Por ejemplo, la ruta biosintética de ácidos grasos en el hospedador de producción usa los precursores de acetil-CoA y malonil-CoA (figura 2). Para sobreproducir estos componentes, E. coli u otros organismos hospedadores genomodificados, pueden servir como punto de partida para etapas posteriores de genomodificación para proporcionar el producto de salida específico (tal como, ésteres de ácidos grasos, hidrocarburos, alcoholes grasos). Se pueden realizar varias modificaciones diferentes, ya sea en combinación o individualmente, en la cepa hospedadora para obtener un aumento de la producción de acetil CoA/malonil CoA/ácido graso y derivado de ácido graso. Por ejemplo, para aumentar la producción de acetil CoA, puede construirse un plásmido con pdh, panK, aceEF, (que codifica el componente (que codifica el componente de deshidrogenasa E1p y el componente de dihidrolipoamida aciltransferasa E2p de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato deshidrogenasa), fabh/fabD/fabG/acpP/fabF, y en algunos ejemplos, ADN adicional que codifica acil-CoA reductasas grasas y aldehído descarboxilasas, todo bajo el control de un promotor constitutivo, o que puede controlarse de otra manera. Son ejemplos de números de registro del Genbank para estos genes: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (también conocido como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179).

Adicionalmente, fadE, gpsA, IdhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA y/o ackB pueden desactivarse, o pueden reducirse sus niveles de expresión, en el microorganismo genomodificado por transformación con plásmidos replicativos o no replicativos de manera condicional que contienen mutaciones nulas o de deleción de los genes correspondientes, o sustituyendo secuencias promotoras o potenciadoras. Son ejemplos de números de registro del Genbank para estos genes; fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), ldhA ( AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356) y ackB (BAB81430).

Los microorganismos genomodificados resultantes pueden cultivarse en un entorno deseado, por ejemplo uno con glicerol limitado (menos del 1 % p/v en el medio de cultivo). Como tales, estos microorganismos tendrán niveles de producción de acetil-CoA aumentados. La sobreproducción de malonil-CoA puede efectuarse genomodificando el microorganismo como se describió anteriormente, con ADN que codifica accABCD (acetil CoA carboxilasa, por ejemplo, número de registro AAC73296, CE 6.4.1.2) incluido en el plásmido sintetizado de novo. La sobreproducción de ácidos grasos puede realizarse incluyendo adicionalmente ADN que codifica lipasa (por ejemplo, números de registro CAA89087, CAA98876) en el plásmido sintetizado de novo.

En algunos ejemplos, la acetil-CoA carboxilasa (ACC) se sobreexpresa para aumentar su concentración intracelular al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces o al menos 10 veces, por ejemplo, en relación con niveles de expresión nativos.

Además, para eliminar limitaciones en la reserva de acil-CoA, puede utilizarse la mutación D311E (por ejemplo, número de registro AAC77011) de plsB.

Además, para aumentar la producción de ácidos grasos monoinsaturados, en el hospedador de producción puede incluirse la sobreexpresión de un gen sfa (supresor de FabA, por ejemplo, número de registro AAN79592) (Rock et al., J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996).

B. De acil-ACP a ácido graso

Para genomodificar un hospedador de producción para la producción de una población homogénea de derivados de ácidos grasos, uno o más genes endógenos pueden atenuarse o delecionarse funcionalmente y pueden expresarse una o más tioesterasas. Por ejemplo, pueden producirse derivados de ácidos grasos C10 atenuando la tioesterasa C18 (por ejemplo, números de registro AAC73596 y P0ADA1), que usa C18:1-ACP y que expresa tioesterasa C10 (por ejemplo, número de registro Q39513), que usa C10-ACP. Por tanto, da como resultado una población relativamente homogénea de derivados de ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de carbono de 10. En otro ejemplo, pueden producirse derivados de ácidos grasos C14 atenuando tioesterasas endógenas que producen ácidos grasos no C14 y expresando la tioesterasa con el número de registro Q39473 (que usa C14-ACP). En otro ejemplo más, pueden producirse derivados de ácidos grasos C12 expresando tioesterasas que usan C12-ACP (por ejemplo, número de registro Q41635) y atenuando tioesterasas que producen ácidos grasos no C12. La sobreproducción de acetil CoA, malonil CoA y ácido graso puede verificarse utilizando métodos conocidos en la materia, por ejemplo, usando precursores radiactivos, HPLC y GC-EM posteriores a la lisis celular.

Tabla 1

C. De ácido graso a acil-CoA

Los hospedadores de producción pueden genomodificarse utilizando péptidos conocidos para producir ácidos grasos de varias longitudes. Un método de preparación de ácidos grasos implica aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, uno o más péptidos de acil-CoA sintasa (CE 2.3.1.86).

Como se usa en el presente documento, la acil-CoA sintasa incluye péptidos en el número de clasificación de enzimas CE 2.3.1.86, así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de un ácido graso en acil-CoA. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de acil-CoA sintasa catalizarán también otras reacciones, por ejemplo, algunos péptidos de acil-CoA sintasa aceptarán otros sustratos además de ácidos grasos. Por lo tanto, también se incluyen dichos péptidos de acil-CoA sintasa no específicos. Las secuencias de péptidos de acil-CoA sintasa están a disposición del público. En la figura 10 se proporcionan ejemplos de números de registro del GenBank.

D. De acil-CoA a alcoholes grasos

Los hospedadores de producción pueden genomodificarse utilizando polipéptidos conocidos para producir alcoholes grasos a partir de acil-CoA. Un método de preparación de alcoholes grasos implica aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, acil-CoA reductasa (FAR, CE 1.1.1.*) o acil-CoA reductasas (CE 1.2.1.50) y alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1) formadoras de alcohol graso. En lo sucesivo en el presente documento, la acil-CoA reductasa (FAR, CE 1.1.1.*), las acil-CoA reductasas (CE 1.2.1.50) y la alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1) formadoras de alcohol graso, se denominan conjuntamente péptidos formadores de alcohol graso. En algunos ejemplos, los tres genes formadores de alcoholes grasos pueden sobreexpresarse en un hospedador de producción, y aún en otros ejemplos, uno o más de los genes formadores de alcoholes grasos pueden sobreexpresarse.

Como se usa en el presente documento, los péptidos formadores de alcoholes grasos incluyen péptidos en los números de la clasificación de enzimas CE 1.1.1.*, 1.2.1.50 y 1.1.1.1, así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de acil-CoA en alcohol graso. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos formadores de alcoholes grasos catalizarán también otras reacciones, por ejemplo, algunos péptidos de acil-CoA reductasa aceptarán otros sustratos además de ácidos grasos. Por lo tanto, también se incluyen dichos péptidos no específicos. Las secuencias de péptidos formadores de alcoholes grasos están a disposición del público. En la figura 10 se proporcionan ejemplos de números de registro del GenBank.

Los alcoholes grasos también pueden describirse como tensioactivos a base de hidrocarburo. Para la producción de tensioactivos, el microorganismo se modifica para que produzca un tensioactivo a partir de una fuente de carbono renovable. Dicho microorganismo incluye una primera secuencia de ADN exógeno que codifica una proteína capaz de convertir un ácido graso en un aldehído graso y una segunda secuencia de ADN exógeno que codifica una proteína capaz de convertir un aldehído graso en un alcohol. En algunos ejemplos, la primera secuencia de ADN exógeno codifica una ácido graso reductasa. En una realización, la segunda secuencia de ADN exógeno codifica la aldehído reductasa microsómica de mamífero o la aldehído deshidrogenasa de cadena larga. En un ejemplo adicional, la primera y segunda secuencias de ADN exógeno son de un complejo multienzimático de Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinobacter sp cepa M-1 o Candida lipolytica. En una realización, la primera y segunda secuencias de ADN heterólogo son de un complejo multienzimático de Acinobacter sp cepa M-1 o Candida lipolytica.

Como fuentes adicionales de secuencias de ADN heterólogo que codifican proteínas convertidoras de alcohol de cadena larga para dar ácidos grasos, que pueden usarse en la producción de tensioactivos se incluyen, aunque sin limitación, Mortierella alpina (ATCC 32222), Crytococcus curvatus, (también denominada Apiotricum curvatum), Alcanivorax jadensis (T9T =DSM 12718 =a Tc C 700854), Acinetobacter sp. HO1-N, (ATCC 14987) y Rhodococcus opacus (PD630 DSMZ 44193).

En un ejemplo, el derivado de ácido graso es un producto de tensioactivo saturado o insaturado que tiene un contenido en átomos de carbono limitado a entre 6 y 36 átomos de carbono. En otro ejemplo, el producto tensioactivo tiene un contenido en átomos de carbono limitado a entre 24 y 32 átomos de carbono.

Los hospedadores apropiados para producir tensioactivos pueden ser microorganismos eucariotas o procariotas. Como ejemplos de hospedadores se incluyen Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinobacter sp cepa M-1, Arabidopsis thaliana o Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae y E. coli genomodificados para expresar acetil CoA carboxilasa. También pueden utilizarse hospedadores que demuestran una capacidad innata para sintetizar altos niveles de precursores de tensioactivos en forma de lípidos y aceites, tales como Rhodococcus opacus, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins y E. coli genomodificados para expresar acetil CoA carboxilasa, y otras bacterias, levaduras y hongos oleaginosos.

E. De alcoholes grasos a ésteres grasos

Los hospedadores de producción pueden genomodificarse utilizando polipéptidos conocidos para producir ésteres grasos de varias longitudes. Un método de preparación de ésteres grasos incluye aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, uno o más péptidos de alcohol O-acetiltransferasa (CE 2.3.1.84). Estos péptidos catalizan la reacción de acetil-CoA y un alcohol para formar CoA y un éster acético. En algunos ejemplos, los péptidos de alcohol O-acetiltransferasa pueden expresarse junto con péptidos de tioesterasa, péptidos de FAS y péptidos formadores de alcoholes grasos seleccionados, permitiendo por tanto controlar la longitud de la cadena de carbono, la saturación y el grado de ramificación. En algunos casos, el operón bkd puede coexpresarse para permitir que se produzcan precursores de ácidos grasos ramificados.

Como se usa en el presente documento, los péptidos de alcohol O-acetiltransferasa incluyen péptidos en el número de clasificación de enzimas CE 2.3.1.84, así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de acetil-CoA y un alcohol para formar CoA y un éster acético. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que los péptidos de alcohol O-acetiltransferasa también catalizarán otras reacciones, por ejemplo, algunos péptidos de alcohol O-acetiltransferasa aceptarán otros sustratos además de alcoholes grasos o acetil-CoA tioéster, es decir, tales como otros alcoholes y otros acil-CoA tioésteres. Por lo tanto, también se incluyen dichos péptidos de alcohol O-acetiltransferasa no específicos o de especificidad divergente. Las secuencias de péptidos de alcohol O-acetiltransferasa están a disposición del público. En la figura 10 se proporcionan ejemplos de números de registro del GenBank. En la técnica se conocen bien ensayos para caracterizar la actividad de péptidos de alcohol O-acetiltransferasa particulares. También pueden crearse O-acetiltransferasas y O-aciltransferasas genomodificadas que tengan nuevas actividades y especificidades para el grupo acilo donador o el resto alcohol aceptor. A través de enfoques teóricos y evolutivos bien documentados en la técnica podrían generarse enzimas genomodificadas.

F. De acil-CoA a ésteres grasos (biodiéseles y ceras)

Los hospedadores de producción pueden genomodificarse utilizando péptidos conocidos para producir ésteres de ácidos grasos a partir de acil-CoA y alcoholes. En algunos ejemplos, los alcoholes se proporcionan en los medios de fermentación y en otros ejemplos, el hospedador de producción puede proporcionar el alcohol como se describe en el presente documento. Un experto habitual en la técnica apreciará que, estructuralmente, los ésteres de ácidos grasos tienen un lado A y un lado B. Como se describe en el presente documento, el lado A del éster se usa para describir la cadena de carbono que aporta el alcohol, y el lado B del éster se usa para describir la cadena de carbono que aporta la acil-CoA. Cualquiera de las cadenas puede estar saturada o insaturada, ramificada o no ramificada. El hospedador de producción puede genomodificarse para producir alcoholes grasos o alcoholes de cadena corta. El hospedador de producción también puede genomodificarse para producir moléculas de acil-CoA específicas. Como se usa en este documento, los ésteres de ácidos grasos son ésteres derivados de un acilo graso-tioéster y un alcohol, en donde el lado A y el lado B del éster pueden variar en longitud independientemente. En general, el lado A del éster tiene una longitud de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 carbonos, mientras que el lado B del éster tiene una longitud de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 carbonos. El lado A y el lado B pueden ser de cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada.

La producción de ésteres grasos, incluyendo ceras a partir de acil-CoA y alcoholes, puede genomodificarse utilizando polipéptidos conocidos. Como se usa en el presente documento, las ceras son ésteres de ácidos grasos de cadena larga, en donde el lado A y el lado B del éster pueden variar en longitud independientemente. En general, el lado A del éster tiene una longitud de al menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 carbonos. De manera similar, el lado B del éster tiene una longitud de al menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 carbonos. El lado A y el lado B pueden estar mono-, di- y triinsaturados. La producción de ésteres grasos, incluyendo ceras a partir de acil-CoA y alcoholes, puede genomodificarse utilizando polipéptidos conocidos. Un método de preparación de ésteres grasos incluye aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, una o más cera sintasas (CE 2.3.1.75).

Como se usa en el presente documento, las cera sintasas incluyen péptidos en el número de clasificación de enzimas CE 2.3.1.75, así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de un acil-tioéster en ésteres grasos. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de cera sintasa catalizarán también otras reacciones, por ejemplo, algunos péptidos de cera sintasa aceptarán acil-CoA de cadena corta y alcoholes de cadena corta para producir ésteres grasos. Por lo tanto, también se incluyen dichas cera sintasas no específicas. Las secuencias de péptidos de cera sintasa están a disposición del público. En la figura 10 se proporcionan ejemplos de números de registro del GenBank. En la patente de Estados Unidos número 7118896, que se incorpora en el presente documento por referencia, se proporcionan métodos para identificar la actividad cera sintasa.

En ejemplos particulares, si el producto deseado es un biocombustible a base de éster graso, el microorganismo se modifica para que produzca un éster graso generado a partir de una fuente de energía renovable. Dicho microorganismo incluye una secuencia de ADN exógeno que codifica una éster de cera sintasa que se expresa para conferir a dicho microorganismo la capacidad de sintetizar un éster graso saturado, insaturado o ramificado a partir de una fuente de energía renovable. En algunas realizaciones, las proteínas de síntesis de éster de cera incluyen, aunque sin limitación: ácido graso elongasas, acil-CoA reductasas, aciltransferasas o cera sintasas, acil graso transferasas, diacilglicerol aciltransferasas, acil-coA cera alcohol aciltransferasas, éster de cera sintasa/acil-CoA: diacilglicerol aciltransferasa bifuncional seleccionada de un complejo multienzimático de Simmondsia chinensis, Acinetobacter sp. cepa ADP1 (anteriormente Acinetobacter calcoaceticus ADP1), Pseudomonas aeruginosa, Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana o Alkaligenes eutrophus. En una realización, las ácido graso elongasas, acil-CoA reductasas o cera sintasas son de un complejo multienzimático de Alkaligenes eutrophus y otros organismos que se sabe en la bibliografía que producen cera y ésteres de ácidos grasos.

Las fuentes adicionales de ADN heterólogo que codifica proteínas de síntesis de cera útiles en la producción de éster graso incluyen, aunque sin limitación, Mortierella alpina (por ejemplo ATCC 32222), Crytococcus curvatus, (también denominada Apiotricum curvatum), Alcanivorax jadensis (por ejemplo, T9T =DSM 12718 =ATCC 700854), Acinetobacter sp. HO1-N, (por ejemplo ATCC 14987) y Rhodococcus opacus (por ejemplo PD630, DSMZ 44193).

Los métodos descritos en este documento permiten la producción de ésteres grasos de longitud variable. En un ejemplo, el producto de éster graso es un producto de éster graso saturado o insaturado que tiene un contenido en átomos de carbono de entre 24 y 46 átomos de carbono. En una realización, el producto de éster graso tiene un contenido en átomos de carbono de entre 24 y 32 átomos de carbono. En otra realización, el producto de éster graso tiene un contenido en carbono de 14 y 20 carbonos. En otra realización, el éster graso es el éster metílico de C18: 1. En otra realización, el éster de ácido graso es el éster etílico de C16:1. En otra realización, el éster graso es el éster metílico de C16: 1. En otra realización, el éster de ácido graso es éster octadecílico de octanol.

Los hospedadores útiles para producir ésteres grasos pueden ser microorganismos eucariotas o procariotas. En algunas realizaciones, dichos hospedadores incluyen, aunque sin limitación, Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica, E. coli Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinobacter sp cepa M-1, Candida lipolytica y otros microorganismos oleaginosos.

En un ejemplo, se usa la éster de cera sintasa de Acinetobacter sp. ADP1 en el locus AAO17391 (descrito en Kalscheuer y Steinbuchel, J. Biol. Chem. 278: 8075-8082, 2003). En otro ejemplo, se usa la éster de cera sintasa de Simmondsia chinensis, en el locus AAD38041.

Opcionalmente, se puede usar un exportador de éster de cera, tal como un miembro de la familia de PTAG, para facilitar la liberación de ceras o ésteres en el entorno extracelular. Un ejemplo de un exportador de éster de cera que puede usarse es la proteína transportadora de ácido graso (cadena larga) CG7400-PA, isoforma A de Drosophila melanogaster, en el locus NP_524723.

G. De acil-ACP, acil-CoA a hidrocarburo

Se sabe que una diversidad de microorganismos produce hidrocarburos, tales como alcanos, olefinas e isoprenoides. Muchos de estos hidrocarburos proceden de la biosíntesis de ácidos grasos. La producción de estos hidrocarburos puede controlarse controlando los genes asociados a la biosíntesis de ácidos grasos en los hospedadores originarios. Por ejemplo, la biosíntesis de hidrocarburos en las algas Botryococcus braunii se produce a través de la descarbonilación de aldehídos grasos. Los aldehídos grasos se producen mediante la reducción de acil grasotioésteres mediante la acil graso-CoA reductasa. Por tanto, la estructura de los alcanos finales puede controlarse genomodificando B. braunii para expresar genes específicos, tales como tioesterasas, que controlan la longitud de la cadena de los ácidos grasos que se canalizan hacia la biosíntesis de alcanos. La expresión de las enzimas que dan como resultado la biosíntesis de ácidos grasos de cadena ramificada en B. braunii dará como resultado la producción de alcanos de cadena ramificada. La introducción de genes que afectan a la producción de desaturación de ácidos grasos dará como resultado la producción de olefinas. Otras combinaciones de estos genes pueden proporcionar un control adicional sobre la estructura final de los hidrocarburos producidos. Para producir niveles más altos de los hidrocarburos nativos o genomodificados, los genes implicados en la biosíntesis de ácidos grasos y sus precursores o la degradación a otros productos pueden expresarse, sobreexpresarse o atenuarse. Cada uno de estos enfoques se puede aplicar a la producción de alcanos en Vibrio furnissii M1 y sus homólogos funcionales, que produce alcanos a través de una reducción de alcoholes grasos (véase anteriormente en la biosíntesis y genomodificación de la producción de alcoholes grasos). Cada uno de estos enfoques también se puede aplicar a la producción de olefinas producidas por muchas cepas de Micrococcus leuteus, Stenotrophomonas maltophilia, Jeogalicoccus sp. (ATCC8456) y microorganismos relacionados. Estos microorganismos producen olefinas internas de cadena larga que proceden de la condensación directa de precursores de ácidos grasos. Controlar la estructura y el nivel de precursores de ácidos grasos utilizando los métodos descritos en el presente documento dará como resultado la formación de olefinas de diferente longitud de cadena, ramificación y nivel de saturación.

Los hidrocarburos también pueden producir se utilizando óxido/reductasas evolucionadas para la reducción de alcoholes primarios. Se sabe que los alcoholes grasos primarios se usan para producir alcanos en microorganismos tales como Vibrio furnissii M1 (Myong-Ok, J. Bacteriol., 187:1426-1429, 2005). Una óxido/reductasa dependiente de NAD(P)H es el catalizador responsable. Las oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H sintéticas pueden producirse usando ingeniería genética evolutiva y pueden expresarse en hospedadores de producción para producir derivados de ácidos grasos. Un experto habitual en la técnica apreciará que el procedimiento de "evolucionar" una alcohol reductasa grasa para que tenga la actividad deseada de conoce bien (Kolkman y Stemmer Nat Biotechnol. 19:423-8, 2001, Ness et al., Adv Protein Chem. 55:261-92, 2000, Minshull y Stemmer Curr Opin Chem Biol. 3:284-90, 1999, Huisman y Gray Curr Opin Biotechnol. Ago; 13: 352-8, 2002, y véase la solicitud de patente de Estados Unidos 2006/0195947). Una biblioteca de oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H se genera mediante métodos estándar, tales como PCR propensa a error, mutagénesis aleatoria específica de sitio, mutagénesis por saturación específica de sitio o mutagénesis específica dirigida al sitio. Adicionalmente, se puede crear una biblioteca a través del "intercambio" se secuencias que codifican oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H que se producen de manera natural. La biblioteca se expresa en un hospedador adecuado, tal como E. coli. Después, las colonias individuales que expresan un miembro diferente de la biblioteca de óxido/reductasa, se analizan para determinar su expresión de una óxido/reductasa que puede catalizar la reducción de un alcohol graso. Por ejemplo, cada célula puede analizarse como una bioconversión de célula completa, un extracto celular, una célula permeabilizada o una enzima purificada. Las alcohol graso reductasas se identifican monitorizando la oxidación dependiente de alcohol graso de NAD(P)H por espectrofotometría o fluorometría. La producción de alcanos se monitoriza mediante CG/EM, CCF u otros métodos. Para producir alcanos, alquenos e hidrocarburos ramificados relacionados, se usa óxido/reductasa identificada de esta manera. Esto se realiza o bien in vitro o bien in vivo. Esto último se realiza expresando el gen de alcohol graso reductasa evolucionada en un organismo que produce alcoholes grasos, tales como los descritos en el presente documento. Los alcoholes grasos actúan como sustratos para la alcohol reductasa que produciría alcanos. También pueden genomodificarse otras oxidorreductasas para catalizar esta reacción, tal como las que usan hidrógeno molecular, glutatión, FADH u otras coenzimas reductoras.

II. Genomodificación de la cepa de producción para aumentar la producción de derivados de ácidos grasos

Para la producción de derivados de ácidos grasos en una célula hospedadora pueden introducirse de manera estable o transitoria secuencias de ADN heterólogas implicadas en una ruta biosintética usando técnicas bien conocidas en la materia, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, conjugación, transducción y similares. Para la transformación estable, una secuencia de ADN puede incluir además un marcador de selección, tal como, resistencia a antibióticos, por ejemplo resistencia a neomicina, tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina, genes que complementan deficiencias auxotróficas, y similares.

Diversas realizaciones de esta divulgación utilizan un vector de expresión que incluye una secuencia de ADN heterólogo que codifica una proteína implicada en una ruta metabólica o biosintética. Los vectores de expresión adecuados incluyen, aunque sin limitación, vectores víricos, tales como vectores de baculovirus, vectores de fagos, tales como vectores de bacteriófagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, vectores víricos (por ejemplo, vectores víricos basados en virus variolovacunal, poliovirus, adenovirus, virus adenoasociado, SV40, virus del herpes simple, y similares), cromosomas artificiales basados en P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura y cualquier otro vector específico para hospedadores específicos de interés (tales como E. coli, Pseudomonas pisum y Saccharomyces cerevisiae).

Los vectores de expresión útiles pueden incluir uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas. El gen marcador de selección codifica una proteína que es necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen marcador de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de bacilos. En realizaciones alternativas, el gen marcador de selección es uno que codifica la dihidrofolato reductasa o confiere resistencia a neomicina (para su uso en cultivo de células eucariotas), o uno que confiere resistencia a tetraciclina o ampicilina (para su uso en una célula hospedadora procariota, tal como E. coli).

La secuencia de ADN que codifica el producto génico de la ruta biosintética en el vector de expresión está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión apropiada, promotores, potenciadores y similares) para dirigir la síntesis del producto génico codificado. Dichos promotores pueden proceder de fuentes microbianas o víricas, incluyendo CMV y SV40. Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, en el vector de expresión pueden usarse cualquiera de varios elementos de control de la transcripción y traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987).

Los promotores adecuados para su uso en células hospedadoras procariotas incluyen, aunque sin limitación, promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores Pr y Pl del bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, de choque térmico y lacZ de E. coli, los promotores de alfa-amilasa y específicos de sigma de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla del gen de beta-lactamasa de pBR322 y el promotor CAT del gen de cloranfenicol acetil transferasa. En Glick, J. Ind. Microbiol. 1, 277, 1987; Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE 4a ed., Benjamin Cummins (1987); y Sambrook et al., citados anteriormente, se revisan promotores de procariotas.

Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados para su uso dentro de un hospedador eucariota son de origen vírico e incluyen el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273, 1982); el promotor TK del virus del herpes (McKnight, Cell 31: 355, 1982); el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature (Londres) 290: 304, 1981); el promotor del virus del sarcoma de Rous; el promotor de citomegalovirus (Foecking et al., Gene 45: 101, 1980); el promotor del gen gal4 de levadura (Johnston, et al., PNAS (EE. UU.) 79: 6971, 1982; Silver, et al., PNAS (USA) 81:5951, 1984); y el promotor de IgG (Orlandi et al., PNAS (USA) 86:3833, 1989).

La célula hospedadora microbiana puede modificarse genéticamente con una secuencia de ADN heterólogo que codifica un producto génico de la ruta biosintética que está unida operativamente a un promotor inducible. En la técnica se conocen bien promotores inducibles. Los promotores inducibles adecuados incluyen, aunque sin limitación, promotores que se ven afectados por proteínas, metabolitos o productos químicos. Estos incluyen: un promotor del virus de la leucemia bovina, un promotor de metalotioneína, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor SV40, un promotor de MRP pollII, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV temprano inmediato humano) así como los de los operones trp y lac.

En algunos ejemplos, una célula hospedadora modificada genéticamente se modifica genéticamente con una secuencia de ADN heterólogo que codifica un producto génico de la ruta biosintética que está unida operativamente a un promotor constitutivo. En la técnica se conocen promotores constitutivos adecuados e incluyen, un promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MPSV constitutivo y un promotor de CMV constitutivo.

En algunos ejemplos, una célula hospedadora modificada es una que está modificada genéticamente con una secuencia de ADN exógeno que codifica una proteína individual implicada en una ruta de biosíntesis. En otras realizaciones, una célula hospedadora modificada es una que está modificada genéticamente con secuencias de ADN exógeno que codifican dos o más proteínas implicadas en una ruta de biosíntesis, por ejemplo, la primera y segunda enzimas en una ruta biosintética.

Cuando la célula hospedadora se modifica genéticamente para expresar dos o más proteínas implicadas en una ruta biosintética, cada una de esas secuencias de ADN puede estar contenida en un vector de expresión individual o en vectores de expresión separados. Cuando esas secuencias de ADN están contenidas en un vector de expresión individual, en algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos estarán unidas operativamente a un elemento de control común (por ejemplo, un promotor), por ejemplo, el elemento de control común controla la expresión de todas las secuencias de a Dn que codifican proteínas de la ruta biosintética en el vector de expresión individual.

Cuando una célula hospedadora modificada se modifica genéticamente con secuencias de ADN heterólogo que codifican dos o más proteínas implicadas en una ruta de biosíntesis, una de las secuencias de ADN puede estar unida operativamente a un promotor inducible, y una o más de las secuencias de ADN pueden estar unidas operativamente a un promotor constitutivo.

En algunas realizaciones, la concentración intracelular (por ejemplo, la concentración del producto intermedio en la célula hospedadora modificada genéticamente) del producto intermedio de la ruta biosintética puede aumentarse para intensificar adicionalmente el rendimiento del producto final. La concentración intracelular del producto intermedio puede aumentarse de varias maneras, incluyendo, pero sin limitación, aumentar la concentración en el medio de cultivo de un sustrato para una ruta biosintética; aumentar la actividad catalítica de una enzima que es activa en la ruta biosintética; aumentar la cantidad intracelular de un sustrato (por ejemplo, un sustrato primario) para una enzima que es activa en la ruta biosintética; y similares.

En algunos ejemplos, el derivado o producto intermedio de ácido graso se produce en el citoplasma de la célula. La concentración citoplasmática puede aumentarse de varias maneras, incluyendo, pero sin limitación, unión del ácido graso a la coenzima A para formar un acil-CoA tioéster. Adicionalmente, la concentración de acil-CoA puede aumentarse aumentando la biosíntesis de CoA en la célula, tal como sobreexpresando genes asociados a la biosíntesis de pantotenato (panD) o desactivando los genes asociados a la biosíntesis de glutatión (glutatión sintasa).

III. Características de la cadena de carbono

Usando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, puede producirse una gama de productos. Estos productos incluyen hidrocarburos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos y ceras. Algunos de estos productos son útiles como biocombustibles y productos químicos especializados. Estos productos pueden diseñarse y producirse en microorganismos. Los productos pueden producirse de manera que contengan puntos de ramificación, niveles de saturación y longitud de cadena de carbono, por tanto, haciendo que estos productos sean materiales de partida deseables para su uso en muchas aplicaciones (en la figura 10 se proporciona una descripción de las diversas enzimas que pueden usarse solas o en combinación para preparar diversos derivados de ácidos grasos).

En otros ejemplos, la expresión de genes de FAS exógenos que se originan de diferentes especies o variantes genomodificadas, puede introducirse en la célula hospedadora para dar como resultado la biosíntesis de metabolitos de ácidos grasos estructuralmente diferentes (en longitud, ramificación, grado de insaturación, etc.) a los del hospedador nativo. Estos productos génicos heterólogos también pueden elegirse o genomodificarse para que no se vean afectados por los mecanismos reguladores complejos naturales en la célula hospedadora y, por lo tanto, funcionen de una manera más controlable para la producción del producto comercial deseado. Por ejemplo, las enzimas FAS de Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria, Brevibacteria, Mycobacteria, levaduras oleaginosas, y similares, pueden expresarse en el hospedador de producción.

Un experto habitual en la técnica apreciará que cuando un hospedador de producción se genomodifica para que produzca un ácido graso a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos que contiene un nivel específico de insaturación, ramificación, o longitud de cadena de carbono, el ácido graso genomodificado resultante puede usarse en la producción de derivados de ácidos grasos. Consecuentemente, los derivados de ácidos grasos generados a partir del hospedador de producción pueden presentar características del ácido graso genomodificado. Por ejemplo, un hospedador de producción puede genomodificarse para preparar ácidos grasos de cadena corta, ramificados y después, usando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento que se refieren a la producción de alcohol graso (es decir, que incluyen enzimas formadoras de alcohol tales como FAR), el hospedador de producción produce alcoholes grasos de cadena corta, ramificados. De manera similar, puede producirse un hidrocarburo genomodificando un hospedador de producción para producir un ácido graso que tenga un nivel definido de ramificación, insaturación y/o longitud de cadena de carbono, produciendo así una población homogénea de hidrocarburos. Por otra parte, cuando se desea un alcohol, éster de ácido graso o hidrocarburo insaturado, la ruta biosintética de ácidos grasos puede genomodificarse para producir niveles bajos de ácidos grasos saturados y para reducir la producción de producto saturado puede expresarse una desaturasa adicional.

A. Saturación

Los hospedadores de producción pueden genomodificarse para que produzcan ácidos grasos insaturados genomodificando el hospedador de producción para sobreexpresar fabB, o cultivando el hospedador de producción a bajas temperaturas (por ejemplo, inferiores a 37 °C). FabB tiene preferencia a cis-53decenoil-AcP y da como resultado la producción de ácidos grasos insaturados en E. coli. La sobreexpresión de FabB dio como resultado la producción de un porcentaje significativo de ácidos grasos insaturados (de Mendoza et al., J. Biol. Chem., 258:2098-101, 1983). Estos ácidos grasos insaturados pueden usarse como productos intermedios en hospedadores de producción que están genomodificados para producir derivados de ácidos grasos, tales como alcoholes grasos, ésteres, ceras, olefinas, alcanos y similares. Un experto habitual en la técnica apreciará que atenuando fabA, o sobreexpresando FabB y expresando tioesterasas específicas (descritas a continuación), pueden producirse derivados de ácidos grasos insaturados que tienen una longitud de cadena de carbono deseada. De manera alternativa, el represor de la biosíntesis de ácidos grasos, FabR (registro de Genbank NP_418398), puede delecionarse, lo que también dará como resultado una mayor producción de ácidos grasos insaturados en E. co li(Zhang et al., J. Biol. Chem. 277: págs. 15558, 2002.). Se puede realizar un aumento adicional de ácidos grasos insaturados mediante la sobreexpresión de FabM (trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa, registro de Genbank (DAA05501) y la expresión controlada de FabK (trans-2-enoil-ACP reductasa II, registro de Genbank (NP_357969) de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al., J. Biol. Chem. 277: 44809, 2002), mientras que se deleciona Fab I de E. coli ((trans-2-enoil-ACP reductasa, registro de Genbank (NP_415804). Adicionalmente, para aumentar el porcentaje de ésteres de ácidos grasos insaturados, el microorganismo también puede tener sobreexpresado fabB (que codifica p-cetoacil-ACP sintasa I, Registros: BAA16180, CE: 2.3.1.41), Sfa (que codifica un supresor de fabA, Registro: AAC44390) y gnsA y gnsB (ambos codifican supresores mutantes nulos de secG, también conocidos como proteínas de choque frío, Registro: ABD18647.1, AAC74076.1).

En algunos ejemplos, el gen de fabF endógeno puede estar atenuado, aumentando así el porcentaje de palmitoleato (C16: 1) producido.

B. Ramificación que incluye restos cíclicos

Utilizando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento pueden producirse derivados de ácidos grasos que contienen puntos de ramificación, restos cíclicos, y combinaciones de los mismos.

Microorganismos que producen de manera natural ácidos grasos lineales (AGl) pueden genomodificarse para producir ácidos grasos de cadena ramificada (AGr) expresando una o más secuencias de ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, E. coli produce de manera natural ácidos grasos lineales (AGl). Para genomodificar E. coli para producir AGr, pueden introducirse y expresarse varios genes que proporcionan precursores ramificados (operón bkd) y permiten el inicio de la biosíntesis de ácidos grasos a partir de precursores ramificados (fabH). Adicionalmente, el organismo puede expresar genes para el alargamiento de los AGr (por ejemplo, ACP, FabF) y/o delecionar los genes de E. coli correspondientes que normalmente conducen a AGl y que competirían con los genes introducidos (por ejemplo, FabH, FabF).

Los acil-CoA, 2-metil-buturil-CoA, isovaleril-CoA e isobuturil-CoA ramificados, son los precursores de AGr. En la mayoría de los microorganismos que contienen AGr, estos se sintetizan en dos etapas (descritas en detalle a continuación) a partir de aminoácidos ramificados (isoleucina, leucina y valina) (Kadena, Microbiol. Rev. 55: págs. 288, 1991). Para genomodificar un microorganismo para producir AGr, o para sobreproducir AGr, la expresión o sobreexpresión de una o más de las enzimas en estas dos etapas puede genomodificarse. Por ejemplo, en algunos casos, el hospedador de producción puede tener una enzima endógena que puede llevar a cabo una etapa y, por lo tanto, solo es necesario expresar de manera recombinante las enzimas implicadas en la segundo etapa.

La primera etapa en la formación de ácidos grasos ramificados, es la producción de los a-cetoácidos correspondientes mediante un aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada. E. coli tiene dicha enzima, IlvE (EC 2.6.1.42; registro de Genbank (YP_026247). En algunos ejemplos, puede no expresarse un aminoácido aminotransferasa heteróloga de cadena ramificada. Sin embargo, IlvE de E. coli o cualquier otro aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada, por ejemplo, ilvE de Lactococcus lactis (registro de Genbank AAF34406), ilvE de Pseudomonas putida (registro de Genbank NP_745648) o ilvE de Streptomyces coelicolor (Registro de Genbank NP_629657) pueden sobreexpresarse en un microorganismo hospedador, si la reacción de la aminotransferasa resulta ser limitante de la velocidad en la biosíntesis de AGr en el organismo hospedador elegido para la producción de derivados de ácidos grasos.

La segunda etapa, la descarboxilación oxidativa de los a-cetoácidos para dar la correspondiente acil-CoA de cadena ramificada, está catalizada por complejos de a-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (bkd; CE I.2.4.4.) (Denoya et al. J. Bacteriol. 177: págs. 3504, 1995), que constan de las subunidades E1a/p (descarboxilasa), E2 (dihidrolipoil transacilasa) y E3 (dihidrolipoil deshidrogenasa) y que son similares a los complejos de piruvato y acetoglutarato deshidrogenasa. En la Tabla 2 se muestran posibles genes bkd de varios microorganismos, que pueden expresarse en un hospedador de producción para proporcionar precursores de acil-CoA de cadena ramificada. Básicamente, todo microorganismo que posea AGr y/o que se cultive en aminoácidos de cadena ramificada, puede usarse como fuente para aislar genes bkd para la expresión en hospedadores de producción tales como, por ejemplo, E. coli. Asimismo, E. coli tiene el componente E3 (como parte de su complejo de piruvato deshidrogenasa; lpd, CE 1.8.1.4, registro de Genbank (NP_414658), por lo tanto, puede ser suficiente expresar solo los genes bkd de E1 a/p y E2.

Tabla 2

En otro ejemplo, puede producirse isobutiril-CoA en un hospedador de producción, por ejemplo en E. coli, a través de la coexpresión de una crotonil-CoA reductasa (Ccr, EC 1.1.1.9) y una isobuturil-CoA mutasa (subunidad grande IcmA, CE 5.4.99.2; subunidad pequeña IcmB, CE 5.4.99.13) (Han y Reynolds J. Bacteriol. 179: págs. 5157, 1997). La crotonil-CoA es un producto intermedio de la biosíntesis de ácidos grasos en E. coli y otros microorganismos. En la tabla 3 se proporcionan ejemplos de genes ccr e icm de microorganismos seleccionados.

Tabla 3

Además de la expresión de los genes bkd (véase anteriormente), el inicio de la biosíntesis de AGr utiliza p-cetoacilproteína transportadora de acilo sintasa III (FabH, EC 2.3.1.41) con especificidad por las acil CoA de cadena ramificada (Li et al. J. Bacteriol. 187: págs. 3795, 2005). En la tabla 4 se enumeran ejemplos de dichas FabH. En un hospedador de producción pueden expresarse genes de FabH que están implicados en la biosíntesis de ácidos grasos de cualquier microorganismo que contenga AGr. Las enzimas Bkd y FabH de hospedadores de producción que no producen AGr de forma natural, no pueden sustentar la producción de AGr y, por lo tanto, Bkd y FabH pueden expresarse de manera recombinante. De manera similar, el nivel endógeno de producción de Bkd y FabH puede no ser suficiente para producir AGr, por lo tanto, pueden sobreexpresarse. Adicionalmente, pueden expresarse otros componentes de la maquinaria de biosíntesis de ácidos grasos, tales como proteínas transportadoras de acilo (ACP) y candidatos a pcetoacil-proteína transportadora de acilo sintasa II son proteínas transportadoras de acilo (ACP) y p-cetoacil-proteína transportadora de acilo sintasa II (fabF, CE 2.3.1.41) (en Tabla 4 se enumeran los candidatos). Además de expresar estos genes, algunos genes en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos endógenos pueden atenuarse en el hospedador de producción. Por ejemplo, en E. coli los candidatos que es más probable que interfieran con la biosíntesis de AGr, son los genes fabH (n. ° de registro de Genbank NP_415609) y/o fabF (n. ° de registro de Genbank NP_415613).

Como se ha mencionado anteriormente, a través de la combinación de genes de expresión que dan soporte a la síntesis de AGr y a la síntesis de alcohol, se pueden producir alcoholes de cadena ramificada. Por ejemplo, cuando una alcohol reductasa tal como Acr1 de Acinetobacter baylyi ADP1 se coexpresa con un operón bkd, E. coli puede sintetizar isopentanol, isobutanol o 2-metil butanol. De manera similar, cuando Acr1 se coexpresa con genes ccr/icm, E. coli puede sintetizar isobutanol.

Para convertir un hospedador de producción, tal como E. coli,en un organismo capaz de sintetizar ácidos grasos cíclicos u (AG cíclicos), es necesario introducir y expresar varios genes que proporcionen el precursor cíclico ciclohexilcarbonil-CoA (Cropp et al. Nature Biotech. 18: págs. 980, 2000). Los genes enumerados en Tabla 4 (fabH, ACP y fabF) entonces pueden expresarse entonces para permitir el inicio y el alargamiento de ácidos grasos cíclicos u. De manera alternativa, los genes homólogos pueden aislarse de microorganismos que producen AG cíclicos y expresarse en E. coli.

Tabla 4

La expresión de los siguientes genes es suficiente para proporcionar ciclohexilcarbonil-CoA en E. coli: ansJ, ansK, ansL, chcA y ansM del grupo de genes de ansatrienina de Streptomyces collinus (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261: págs. 1999, 1999) o plmJ, plmK, plmL, chcA y plmM del grupo de genes de foslactomicina B de Streptomyces sp. HK803 (Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278: págs. 35552, 2003) junto con el gen chcB (Patton et al. Biochem., 39: págs. 7595, 2000) de S. collinus, S. avermitilis o S. coelicolor (véase la tabla 5 para los números de registro de Genbank).

Tabla 5

Los genes enumerados en la Tabla 4 (fabH, ACP y fabF) son suficientes para permitir el inicio y el alargamiento de ácidos grasos cíclicos u>, porque pueden tener una amplia especificidad de sustrato. En el caso de que la coexpresión de cualquiera de estos genes con los genes ansJKLM/chcAB o pmlJKLM/chcAB de la Tabla 5 no produzca AG cíclicos, pueden aislarse homólogos de fabH, ACP y/o fabF de microorganismos que producen AG cíclicos (por ejemplo, utilizando cebadores de PCR degenerados o sondas de ADN heterólogo) y coexpresarse. La Tabla 6 enumera microorganismos seleccionados que contienen ácidos grasos cíclicos u>.

Tabla 6

C. Características de ésteres

Un experto habitual en la técnica apreciará que un éster incluye un lado A y un lado B. Como se describe en el presente documento, al lado B contribuye un ácido graso producido a partir de la síntesis de novo en el organismo hospedador. En algunos casos en los que el hospedador se genomodifica adicionalmente para producir alcoholes, incluyendo alcoholes grasos, el lado A también es producido por el organismo hospedador. En otros ejemplos más, el lado A puede proporcionarse en el medio. Como se describe en el presente documento, seleccionando los genes de tioesterasa deseados puede diseñarse el lado B, y cuando están produciéndose alcoholes grasos el lado A, para que tengan determinadas características de la cadena de carbono. Estas características incluyen puntos de insaturación, ramificación y longitudes de la cadena de carbono deseadas. Más adelante, en el Ejemplo 6, se proporcionan ejemplos de métodos de fabricación de ésteres de ácidos grasos de cadena larga, en los que el hospedador de producción produce los lados A y B. De manera similar, en el ejemplo 5 se proporcionan métodos de preparación de ésteres de ácidos grasos de cadena media. Cuando el hospedador de producción contribuye tanto al lado A como al lado B y se producen usando productos intermedios de la ruta biosintética de ácidos grasos, tendrán características de la cadena de carbono similares. Por ejemplo, al menos el 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de los ésteres de ácidos grasos producidos tendrán lados A y lados B que varían en 6, 4 o 2 carbonos de longitud. El lado A y el lado B también presentarán niveles de ramificación y saturación similares.

Además de producir alcoholes grasos para contribuir al lado A, el hospedador puede producir otros alcoholes de cadena corta tales como etanol, propanol, isopropanol, isobutanol y butanol para su incorporación en el lado A usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el organismo hospedador puede producir butanol. Para crear células productoras de butanol, la cepa LS9001 (descrita en el Ejemplo 1, a continuación) puede genomodificarse adicionalmente para que exprese atoB (acetil-CoA acetiltransferasa) de Escherichia coli K12, p-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Butyrivibrio fibrisolvens, crotonasa de Clostridium beijerinckii, butiril CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii, aldehído deshidrogenasa (ALDH) CoA acilante de Cladosporium fulvum y adhE que codifica una aldehído-alcohol deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum en el vector de expresión pBAD24 bajo el sistema promotor de prpBCDE. De manera similar, utilizando los métodos enseñados por Kalscheuer et al., Microbiology 152:2529-2536, 2006, puede producirse etanol en un hospedador.

IV. Fermentación

La producción y el aislamiento de derivados de ácidos grasos puede potenciarse empleando técnicas de fermentación específicas. Un método para maximizar la producción al mismo tiempo que se reducen los costes es aumentar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte en productos de hidrocarburos. Durante los ciclos de vida celulares normales, el carbono se usa en funciones celulares, incluida la producción de lípidos, sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos. La reducción de la cantidad de carbono necesaria para las actividades relacionadas con el crecimiento puede aumentar la eficacia de la conversión de la fuente de carbono en producción. Esto se puede lograr haciendo que los microorganismos crezcan primero a una densidad deseada, tal como una densidad alcanzada en el pico de la fase logarítmica de crecimiento. En dicho punto, los genes de punto de control de la replicación pueden aprovecharse para detener el crecimiento de las células. De manera específica, pueden usarse mecanismos de percepción de cuórum (revisado en Camilli y Bassler Science 311:1113,2006; Venturi FEMS Microbio Rev 30: 274­ 291, 2006 y Reading y Sperandio FEMS Microbiol Lett 254: 1-11, 2006) para activar genes tales como p53, p21, u otros genes de punto de control. Como genes que pueden activarse para detener la replicación y el crecimiento celular en E. coli se incluyen genes de umuDC, cuya sobreexpresión detiene la progresión desde la fase estacionaria hasta el crecimiento exponencial (Murli et al., J. of Bact. 182:1127, 2000). UmuC es una ADN polimerasa que puede llevar a cabo la síntesis translesión sobre lesiones no codificantes, la base mecanística de la mayor parte de la mutagénesis química y por UV. Los productor génicos de umuDC se utilizan para el procedimiento de síntesis translesión y también sirven como punto de control del daño en el ADN. Los productos génicos de UmuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD', UmuD'2C, UmuD'2 y UmuD2. Simultáneamente, los genes que producen producto se activarían, minimizando así la necesidad de utilizar rutas de replicación y mantenimiento mientras que está preparándose el derivado de ácido graso.

El porcentaje de carbonos de entrada convertidos en productos de hidrocarburos es un factor determinante de costes. Cuanto más eficaz (es decir, cuanto mayor sea el porcentaje), menos costoso es el procedimiento. Para fuentes de carbono que contienen oxígeno (es decir, glucosa y otras fuentes basadas en hidratos de carbono), el oxígeno debe liberarse en forma de dióxido de carbono. Por cada 2 átomos de oxígeno liberados, se libera también un átomo de carbono lo que conduce a una eficacia metabólica teórica máxima de -34 % (p/p) (para productos derivados de ácidos grasos). Sin embargo, esta cifra cambia para otros productos de hidrocarburos y fuentes de carbono. Las eficacias típicas en la bibliografía son de ~<5 %. Los microorganismos genomodificados que producen productos de hidrocarburos pueden tener una eficacia superior al 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 %. En un ejemplo, los microorganismos presentarán una eficacia de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 25 %. En otros ejemplos, dichos microorganismos presentarán una eficacia de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 30 %, y en otros ejemplos, dichos microorganismos presentarán una eficacia >30 %.

En algunos ejemplos en los que el producto final se libera de la célula, puede emplearse un procedimiento continuo. En este enfoque, puede ensamblarse un reactor con organismos que producen derivados de ácidos grasos de múltiples modos. En un ejemplo, se retira una parte de los medios y se deja reposar. Los derivados de ácidos grasos se separan de la capa acuosa, que a su vez, se devolverá a la cámara de fermentación.

En un ejemplo, la cámara de fermentación contendrá una fermentación que está sometiéndose a una reducción continua. En este caso, se crearía un entorno reductor estable. El equilibrio de electrones se mantendría mediante la liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa). Los esfuerzos para aumentar el equilibrio de NAD/H y NADP/H también pueden facilitar la estabilización del equilibrio de electrones.

La disponibilidad de NADPH intracelular también puede potenciarse genomodificando el hospedador de producción para que exprese una NADH:NADPH transhidrogenasa. La expresión de una o más NADH:NADPH transhidrogenasas convierte el NADH producido en la glicólisis en NADPH, lo que potencia la producción de derivados de ácidos grasos.

En este documento se desvela un sistema para producir y exportar de manera continua derivados de ácidos grasos fuera de microorganismos hospedadores recombinantes por medio de una proteína transportadora. Muchas proteínas transportadoras y de flujo de salida sirven para excretar una gran variedad de compuestos y estar evolucionadas para ser selectivas para un tipo particular de derivados de ácidos grasos. Por tanto, en algunas realizaciones, el microorganismo hospedador recombinante expresará funcionalmente una secuencia de ADN exógeno que codifica un transportador ABC (por las siglas del inglés ATP-binding cassette), de manera que el microorganismo exporta el derivado de ácido graso al medio de cultivo. En un ejemplo, el transportador ABC es un transportador ABC de Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, Alkaligenes eutrophus o Rhodococcus erythropolis (locus AAN73268). En otro ejemplo, el transportador ABC es un transportador ABC seleccionado de CER5 (locus At1g51500 o AY734542), AtMRP5, AmiS2 y AtPGP1. En algunos ejemplos, el transportador ABC es CER5. En otro ejemplo más, el gen CER5 es de Arabidopsis (locus At1g51500, AY734542, At3g21090 y At1g51460).

Por ejemplo, la proteína transportadora, también puede ser una proteína de flujo de salida seleccionada de: AcrAB, TolC y AcrEF de E. coli, o tll1618, tll1619 y tll0139 de Thermosynechococcus elongatus BP-1.

Además, la proteína transportadora puede ser, por ejemplo, una proteína transportadora de ácidos grasos (PTAG) seleccionada de Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mycobacterium tuberculosis o Saccharomyces cerevisiae o cualquiera de las PTAG de mamíferos. Adicionalmente, las PTAG pueden volver a sintetizarse con las regiones membranosas invertidas para invertir la dirección del flujo del sustrato. De manera específica, las secuencias de aminoácidos que componen los dominios hidrófilos (o dominios de membrana) de la proteína, podrían invertirse manteniendo al mismo tiempo los mismos codones para cada aminoácido particular. La identificación de estas regiones se conoce bien en la técnica.

También pueden seleccionarse hospedadores de producción por su capacidad endógena para liberar derivados de ácidos grasos. La eficacia de producción de productos y liberación al caldo de fermentación puede expresarse como una relación de producto intracelular con respecto a producto extracelular. En algunos ejemplos, la relación puede ser de 5:1,4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5.

El hospedador de producción puede genomodificarse adicionalmente para expresar celulosomas recombinantes, tales como los descritos en la solicitud PCT número PCT/US2007/003736, lo que permitirá que el hospedador de producción use material celulósico como fuente de carbono. Por ejemplo, el hospedador de producción puede genomodificarse adicionalmente para expresar invertasas (CE 3.2.1.26) de modo que pueda usarse sacarosa como fuente de carbono.

De manera similar, el hospedador de producción puede genomodificarse utilizando las enseñanzas descritas en las patentes de Estados Unidos números 5000000, 5028539, 5424202, 5482846 y 5602030 de Ingram et al. de modo que el hospedador de producción pueda asimilar carbono de manera eficaz y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono.

IV. Procesamiento posproducción

Los derivados de ácidos grasos producidos durante la fermentación pueden separarse de los medios de fermentación. Se puede usar cualquier técnica conocida para separar derivados de ácidos grasos de medios acuosos. Un ejemplo de procedimiento de separación proporcionado en el presente documento es un procedimiento de separación de dos fases (bifásico). Este procedimiento implica fermentar los hospedadores de producción genomodificados en condiciones suficientes para producir un derivado de ácido graso, permitir que el derivado se recoja en una fase orgánica y separar la fase orgánica del caldo de fermentación acuoso. Este método se puede poner en practicar en un entorno de fermentación tanto discontinua como continua.

La separación bifásica utiliza la inmiscibilidad relativa de los derivados de ácidos grasos para facilitar la separación. Inmiscible se refiere a la relativa incapacidad de un compuesto para disolverse en agua y se define por el coeficiente de reparto de los compuestos. El coeficiente de reparto, P, se define como la concentración en equilibrio de compuesto en una fase orgánica (en un sistema bifásico, la fase orgánica suele ser la fase formada por el derivado de ácido graso durante el procedimiento de producción, sin embargo, en algunos ejemplos, se puede proporcionar una fase orgánica (tal como una capa de octano para facilitar la separación del producto) dividida entre la concentración en equilibrio en una fase acuosa (es decir, caldo de fermentación). Cuando se describe un sistema de dos fases, el P generalmente se indica en términos de logP. Un compuesto con un logP de 10 tendría un reparto de 10:1 en la fase orgánica, mientras que un compuesto de logP de 0,1 tendría un reparto de 10:1 en la fase acuosa. Un experto habitual en la técnica apreciará que eligiendo un caldo de fermentación y la fase orgánica de manera que el derivado de ácido graso que se está produciendo tenga un valor de logP alto, el derivado de ácido graso se separará en la fase orgánica, incluso a concentraciones muy bajas en el recipiente de fermentación.

Los derivados de ácidos grasos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento serán relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por lo tanto, el derivado de ácido graso se recogerá en una fase orgánica intracelular o extracelularmente. La recogida de los productos en una fase orgánica reducirá el impacto del derivado de ácido graso sobre la función celular y permitirá que el hospedador de producción produzca más producto. Dicho de otra manera, la concentración del derivado de ácido graso no tendrá un impacto tan significativo sobre la célula hospedadora.

Los alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ceras e hidrocarburos, producidos como se describe en este documento, permiten la producción de compuestos homogéneos en los que al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos y ceras producidos tendrán longitudes de la cadena de carbono que varían en menos de 4 carbonos, o menos de 2 carbonos. Estos compuestos también se pueden producir de modo que tengan un grado de saturación relativamente uniforme, por ejemplo al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, hidrocarburos y ceras serán mono-, di o triinsaturados. Estos compuestos pueden usarse directamente como combustibles, aditivos para el cuidado personal, complementos nutricionales. Estos compuestos también pueden usarse como materia prima para reacciones posteriores, por ejemplo, transesterificación, hidrogenación, craqueo catalítico por hidrogenación, pirólisis, o ambas o bien reacciones de epoxidación para preparar otros productos.

V. Composiciones de combustible

Los derivados de ácidos grasos descritos en el presente documento pueden usarse como combustible. Un experto habitual en la técnica apreciará que, dependiendo del fin previsto del combustible, se pueden producir y usar diferentes derivados de ácidos grasos. Por ejemplo, para combustible de automóviles destinado a su uso en climas fríos, puede ser deseable un derivado de ácido graso ramificado y, utilizando las enseñanzas proporcionadas en este documento, pueden prepararse hidrocarburos, ésteres de ácidos grasos y alcoholes ramificados. Usando los métodos descritos en el presente documento, pueden producirse combustibles que comprenden derivados de ácidos grasos relativamente homogéneos que tienen calidades de combustible deseadas. Dichos combustibles pueden caracterizarse por la huella de carbono, por su falta de impurezas en comparación con los combustibles derivados del petróleo o biodiésel derivado de triglicéridos y, por otra parte, los combustibles a base de derivados de ácidos grasos pueden combinarse con otros combustibles o aditivos de combustibles para producir combustibles que tengan propiedades deseadas.

A. Huella de carbono

Los derivados de ácidos grasos producidos de manera biológica representan una nueva materia prima para combustibles, tales como alcoholes, diésel y gasolina. Algunos biocombustibles preparados usando derivados de ácidos grasos no se han producido a partir de fuentes renovables y, como tales, son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos combustibles se pueden distinguir de los combustibles derivados de carbono petroquímico basándose en la huella isotópica del carbono doble. Adicionalmente, la fuente específica de carbono de origen biológico (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante la huella isotópica del carbono doble (véase, la patente de Estados Unidos número 7169588, incorporada en el presente documento por referencia).

Este método distingue útilmente materiales químicamente idénticos y distribuye el carbono en los productos por la fuente (y posiblemente el año) de crecimiento del componente biosférico (vegetal). Los isótopos, 14C y 13C, aportan información complementaria a este problema. El isótopo de datación de radiocarbono (14C), con su semivida nuclear de 5730 años, permite claramente distribuir un carbono de muestra entre materias primas fósiles ("muertas") y biosféricas ("vivas") [Currie, L. A. "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle y H. P. van Leeuwen, Eds., 1 del vol. I de la IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc) (1992) 374]. La suposición básica en la datación de radiocarbono es que la constancia de la concentración de 14C en la atmósfera conduce a la constancia de 14C en los organismos vivos. Cuando se trata con una muestra aislada, la edad de una muestra puede deducirse aproximadamente por la relación t=(-5730/0.693)ln(A/A.sub.O) (ecuación 5) donde t=edad, 5730 años es la semivida del radiocarbono, y A y A.sub.O son la actividad de 14C específica de la muestra y del patrón moderno, respectivamente [Hsieh, Y., Soil Sci. Soc. Am J., 56, 460, (1992)]. Sin embargo, debido a las pruebas nucleares atmosféricas desde 1950 y a la quema de combustible fósil desde 1850, el 14C ha adquirido una segunda característica temporal geoquímica. Su concentración en CO2 atmosférico, y consecuentemente, en la biosfera viva, se duplicó aproximadamente en el pico de las pruebas nucleares, a mediados de la década de 1960. Desde entonces, ha vuelto gradualmente a la tasa de isótopos inicial cosmogénica (atmosférica) en estado estacionario (14C/12C) de aprox. 1,2x1012, con una "semivida" de relajación aproximada de 7-10 años. (esta última semivida no debe tomarse literalmente; sino más bien debe usarse la función de entrada nuclear atmosférica/desintegración detallada para trazar la variación del 14C atmosférico y biosférico desde el inicio de la era nuclear.) Es esta última característica temporal del 14C biosférico la que mantiene la promesa de la datación anual del carbono biosférico reciente. El 14C puede medirse mediante espectrometría de masas con acelerador (EMA), con resultados proporcionados en unidades de "fracción de carbono moderno" (fM). La fM se define por los Materiales de Referencia Patrón (MRP) 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, National Institute of Standards and Technology), conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la relación de isótopos de 14C/12C de HOxI (denominada AD 1950). Esto es más o menos equivalente a la madera de antes de la revolución industrial corregida para la desintegración. Para la biosfera viva actual (material vegetal), la fM es de aproximadamente 1,1.

La relación de isótopos de carbono estables (13C/12C) proporciona una vía complementaria para obtener la discriminación y distribución. La relación de 13C/12C en un material de origen biológico dado es una consecuencia de la relación de 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento en el que se fija el dióxido de carbono y también refleja la ruta metabólica exacta. También se producen variaciones regionales. El petróleo, las plantas C3 (de hoja ancha), las plantas C.sub.4 (hierbas) y los carbonatos marinos, muestran diferencias significativas en 13C/12C y en los correspondientes valores de delta 13C. Asimismo, la materia lipídica de plantas C3 y C4 se analiza de manera diferente a la de los materiales derivados de los componentes de hidratos de carbono de las mismas plantas como consecuencia de la ruta metabólica. Dentro de la precisión de la medición, el 13C muestra grandes variaciones debido a los efectos de fraccionamiento isotópico, siendo el más significativo para la presente invención el mecanismo fotosintético. La principal causa de las diferencias en la relación de isótopos de carbono en las plantas está estrechamente asociada a las diferencias en la ruta del metabolismo de carbono fotosintético en las plantas, particularmente la reacción que se produce durante la carboxilación primaria, es decir, la fijación inicial de CO2.atmosférico. Dos grandes clases de vegetación son las que incorporan el ciclo fotosintético "C3" (o de Calvin-Benson) y las que incorporan el ciclo fotosintético "C4" (o de Hatch-Slack). Las plantas C3, tales como de madera dura y las coníferas, son dominantes en las zonas de clima templado. En las plantas C3, la fijación de CO2 primaria o reacción de carboxilación implica la enzima ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa y el primer producto estable es un compuesto de 3 carbonos. Por otro lado, las plantas C4, incluyen plantas tales como hierbas tropicales, maíz y caña de azúcar. En las plantas C4, una reacción de carboxilación adicional que implica otra enzima, fosfoenol-piruvato carboxilasa, es la reacción de carboxilación primaria. El primer compuesto de carbono estable es un ácido de 4 carbonos que posteriormente se descarboxila. El CO2 así liberado vuelve a fijarse mediante el ciclo C3.

Las plantas tanto C4 como C3 presentan un intervalo de relaciones isotópicas 13C/12C, pero los valores típicos son de aprox. -10 a -14 por mil (C4) y de -21 a -26 por mil (C3) [Weber et al., J. Agric. Food Chem., 45, 2942 (1997)]. El carbón y el petróleo se encuentran generalmente en este último intervalo. La escala de medición de 13C se definió originalmente por un ajuste a cero con piedra caliza belemnita Pee Dee (PDB, siglas del inglés Pee Dee Belemnite), en donde los valores se dan en partes por mil desviaciones con respecto a este material. Los valores de "A13C" están en partes por mil (por mil), abreviado %, y se calculan de la siguiente manera:

513C = (13C/12C^ Tre%a: (13C/12C)patrón x 100% (Ecuación 6)

Dado que el material de referencia (MR) PDB se ha agotado, se ha desarrollado una serie de MR alternativos en cooperación con el IAEA (International Atomic Energy Agency, organismo internacional de energía atómica), el SGEU (United States Geological Survey, servicio geológico de los Estados Unidos), el NIST (National Institute of Standards and Technology, instituto nacional de estándares y tecnología) y con otros laboratorios de isótopos internacionales seleccionados. La anotación para las desviaciones por mil con respecto a PDB es A13C. Las mediciones se realizan en CO2 mediante espectrometría de masas de relaciones isotópicas (IRMS, Isotope-ratio mass spectrometry) de alta resolución, en iones moleculares de masas 44, 45 y 46.

Los derivados de ácidos grasos y los biocombustibles, productos químicos y mezclas asociados, pueden distinguirse completamente de sus homólogos derivados de productos petroquímicos basándose en 14C (fM) y en la huella isotópica del carbono, indicando nuevas composiciones de materia.

Los derivados de ácidos grasos descritos en el presente documento tienen utilidad en la producción de biocombustibles y productos químicos. Las nuevas composiciones de productos basados en derivados de ácidos grasos proporcionadas por la presente invención se pueden distinguir además basándose en la huella isotópica del carbono doble de los materiales obtenidos únicamente de fuentes petroquímicas. La capacidad para distinguir estos productos es beneficiosa en el rastreo de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, los combustibles o productos químicos que comprenden perfiles de isótopos de carbono tanto "nuevos" como "antiguos" pueden distinguirse de los combustibles y productos químicos preparados únicamente con materiales "antiguos". Consecuentemente, los presentes materiales pueden rastrearse en el comercio basándose en su perfil único y con el propósito de definir la competencia y para determinar la fecha de caducidad.

En algunos ejemplos, se prepara una composición de biocombustible que incluye un derivado de ácido graso que tiene un 813C de aproximadamente -10,9 a aproximadamente -15,4, en donde el derivado de ácido graso representa al menos aproximadamente el 85 % del material de origen biológico (derivado de un recurso renovable tal como materiales celulósicos y azúcares) en la composición. En otros ejemplos, la composición de biocombustible incluye un derivado de ácido graso que tiene la fórmula

X-(CH(R))nCH3

en donde X representa CH3, -CH2OR1; -C(O)OR2; o -C(O)NR3R4;

R está, para cada n, independientemente ausente, es H o un compuesto alifático inferior;

n es un número entero de 8 a 34, tal como de 10 a 24; y

R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H y alquilo inferior. Normalmente, cuando R es un compuesto alifático inferior, R representa un resto alquilo inferior o alquenilo inferior, ramificado, no ramificado o cíclico. Como ejemplos de grupos R se incluyen, sin limitación, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, ciclopentenilo y similares. El derivado de ácido graso se caracteriza adicionalmente por tener un 813C de aproximadamente -10,9 a aproximadamente -15,4; y el derivado de ácido graso representa al menos aproximadamente el 85 % del material de origen biológico en la composición. En algunos ejemplos, el derivado de ácido graso en la composición de biocombustible se caracteriza por tener una fracción de carbono moderno (fM 14C) de al menos aproximadamente 1,003, 1,010 o 1,5.

B. Derivados de ácidos grasos

El número de cetano (NC), la viscosidad, el punto de fusión y el calor de combustión para varios ésteres de ácidos grasos se han caracterizado, por ejemplo, en Knothe Fuel Processing Technology 86:1059-1070, 2005, que se incorpora en el presente documento por referencia. Usando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, se puede genomodificar un hospedador de producción para producir uno cualquiera de los ésteres de ácidos grasos descritos en Knothe, Fuel Processing Technology 86:1059-1070, 2005.

Los hospedadores de producción descritos en el presente documento pueden producir alcoholes (de cadena corta, de cadena larga, ramificados o insaturados). Dichos alcoholes pueden usarse como combustibles directamente o pueden usarse para crear un éster, es decir, el lado A de un éster como se describió anteriormente. Dicho éster, solo o en combinación con los otros derivados de ácidos grasos descritos en el presente documento, son útiles como combustibles.

De manera similar, los hidrocarburos producidos a partir de los microorganismos descritos en el presente documento pueden usarse como biocombustibles. Dichos combustibles a base de hidrocarburos pueden diseñarse para que contengan puntos de ramificación, grados de saturación definidos y longitudes de carbono específicas. Cuando se usan como biocombustibles, solos o en combinación con otros derivados de ácidos grasos, los hidrocarburos pueden combinarse adicionalmente con aditivos u otros combustibles tradicionales (alcoholes, diésel derivado de triglicéridos y combustibles a base de petróleo).

C. Impurezas

Los derivados de ácidos grasos descritos en el presente documento son útiles para preparar biocombustibles. Estos derivados de ácidos grasos se preparan directamente a partir de ácidos grasos y no del procesamiento químico de triglicéridos. Por consiguiente, los combustibles que comprenden los derivados de ácidos grasos desvelados, contendrán menos impurezas que las que normalmente están asociadas a biocombustibles derivados de triglicéridos, tales como combustibles derivados de aceites y grasas vegetales.

Los biocombustibles de derivados de ácidos grasos en bruto descritos en el presente documento (antes de mezclar el derivado de ácido graso con otros combustibles tales como combustibles tradicionales) contendrán menos catalizador de transesterificación que diésel petroquímico o biodiésel. Por ejemplo, el derivado de ácido graso puede contener menos de aproximadamente el 2 %, 1,5 %, 1,0 %, 0,5 %, 0,3 %, 0,1 %. 0,05% o 0 % de un catalizador de transesterificación o una impureza resultante de un catalizador de transesterificación. Los catalizadores de transesterificación incluyen, por ejemplo, catalizadores de hidróxido, tales como NaOH, KOH, LiOH y catalizadores ácidos, tales como catalizadores de ácido mineral y catalizadores de ácido de Lewis. Los catalizadores e impurezas resultantes de los catalizadores de transesterificación incluyen, sin limitación, estaño, plomo, mercurio, cadmio, cinc, titanio, circonio, hafnio, boro, aluminio, fósforo, arsénico, antimonio, bismuto, calcio, magnesio, estroncio, uranio, potasio, sodio, litio y combinaciones de los mismos.

De manera similar, los biocombustibles de derivados de ácidos grasos en bruto descritos en el presente documento (antes de mezclar el derivado de ácido graso con otros combustibles tales como diésel petroquímico o biodiésel) contendrán menos glicerol (o glicerina) que los biocombustibles preparados a partir de triglicéridos. Por ejemplo, el derivado de ácido graso puede contener menos de aproximadamente el 2 %, 1,5 %, 1,0 %, 0,5 %, 0,3 %, 0,1 %, 0,05 % o 0 % de glicerol.

El biocombustible en bruto derivado de los derivados de ácidos grasos también contendrá menos alcohol libre (es decir, alcohol que se usa para crear el éster) que biodiésel preparado a partir de triglicéridos. Esto se debe en parte a la eficacia de la utilización del alcohol por parte del hospedador de producción. Por ejemplo, el derivado de ácido graso contendrá menos de aproximadamente el 2 %, 1,5 %, 1,0 %, 0,5 %, 0,3 %, 0,1 %, 0,05% o 0% de alcohol libre.

El biocombustible derivado de los derivados de ácidos grasos desvelados, puede caracterizarse adicionalmente por su baja concentración de azufre en comparación con el diésel derivado de petróleo. Por ejemplo, el biocombustible derivado de derivados de ácidos grasos puede tener menos de aproximadamente el 2 %, 1,5 %, 1,0 %, 0,5 %, 0,3 %, 0,1 %, 0,05% o 0% de azufre.

D. aditivos

Para potenciar el rendimiento de un combustible o motor, se utilizan aditivos de combustible. Por ejemplo, pueden utilizarse aditivos de combustible para alterar el punto de congelación/gelificación, el punto de turbidez, la lubricidad, la viscosidad, la estabilidad oxidativa, la calidad de ignición, el nivel de octano y el punto de inflamación. En los Estados Unidos, todos los aditivos de combustible deben estar registrados en la Environmental Protection Agency (Agencia de Protección Medioambiental) y las compañías que comercializan el aditivo de combustible y el nombre del aditivo de combustible están a disposición del público en el sitio web de la agencia y también contactando con la agencia. Un experto habitual en la técnica apreciará que los derivados de ácidos grasos descritos en el presente documento pueden mezclarse con uno o más de estos aditivos para conferir una calidad deseada.

Un experto habitual en la técnica también apreciará que los derivados de ácidos grasos descritos en el presente documento pueden mezclarse con otros combustibles tales como biodiésel derivado de triglicéridos, diversos alcoholes tales como etanol y butanol, y productos derivados de petróleo tales como gasolina. En algunos ejemplos, se produce un derivado de ácido graso, tal como éster etílico C16:1 o éster etílico C18:1, que tiene un punto de gelificación bajo. Este derivado de ácido graso con punto de gelificación bajo se mezcla con biodiésel preparado a partir de triglicéridos para reducir el punto de gelificación global del combustible. De manera similar, un derivado de ácido graso, tal como éster etílico C16:1 o éster etílico C18:1, puede mezclarse con diésel derivado del petróleo para proporcionar una mezcla que tenga al menos, y a menudo más, del 5 % de biodiésel. En algunos ejemplos, la mezcla incluye al menos el 20 % o más del derivado de ácido graso.

Por ejemplo, se puede preparar una composición de biocombustible que incluya al menos aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de un derivado de ácido graso que incluya una cadena de carbono que sea de 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0,18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1,20:2, 20:3, 22:0, 22:1 o 22:3. Dichas composiciones de biocombustible pueden incluir adicionalmente al menos un aditivo seleccionado de un aditivo que disminuya el punto de turbidez que pueda disminuir el punto de turbidez a na temperatura de hasta menos de aproximadamente 5 °C o 0 °C, un tensioactivo o una microemulsión, al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, 85 %, 90% o 95% de combustible diésel de triglicéridos, gasolina derivada del petróleo o combustible diésel del petróleo.

Ejemplos

La figura 1 es un diagrama de la ruta de FAS que muestra las enzimas directamente implicadas en la síntesis de acil-ACP. Para aumentar la producción de ceras/ésteres de ácidos grasos y alcoholes grasos, una o más de las enzimas pueden sobreexpresarse o mutarse para reducir la inhibición por retroalimentación. Adicionalmente, las enzimas que metabolizan los productos intermedios para preparar productos no a base de ácidos grasos (reacciones secundarias) pueden delecionarse o atenuarse funcionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta biosintética de ácidos grasos. Los ejemplos 1, 2 y 8 a continuación proporcionan hospedadores de producción ejemplares que se han modificado para aumentar la producción de ácidos grasos.

Las figuras 2, 3 y 4 muestran vías biosintéticas que pueden genomodificarse para preparar alcoholes grasos y ésteres ácidos grasos/ceras, respectivamente. Como se ilustra en la figura 2, la conversión de cada sustrato (acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graso y acil-CoA) en cada producto (acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graso y acil-CoA) puede realizarse utilizando varios polipéptidos diferentes que son miembros de las clases de enzimas indicadas. Los siguientes ejemplos describen microorganismos que se han genomodificado o que pueden genomodificarse para que produzcan alcoholes grasos y ceras/ésteres de ácidos grasos e hidrocarburos específicos.

Ejemplo 1, Construcción del hospedador de producción

Un ejemplo de hospedador de producción es LS9001. LS9001 se produjo modificando C41 (DE3) de Overexpress.com (Saint Beausine, Francia) para delecionar funcionalmente el gen fadE (acil-CoA deshidrogenasa).

Resumiendo, utilizando los cebadores YafV_NotI e Ivry_Ol para amplificar aproximadamente 830 pb aguas arriba (sentido 5') de fadE y los cebadores Lpcaf_ol y LpcaR_Bam para amplificar aproximadamente 960 pb aguas abajo (sentido 3') de fadE, se preparó la cepa de E. coli con el gen fadE desactivado. Para crear una construcción para la deleción en marco del gen fadE completo, se usó PCR de solapamiento. La construcción para la deleción de fadE se clonó en el plásmido pKOV3 sensible a la temperatura, que contenía un gen SacB para la contraselección y se realizó una deleción cromosómica de fadE según el método de Link et al., J. Bact. 179:6228-6237, 1997). La cepa resultante no podía degradar ácidos grasos y acil graso-CoA (en el presente documento, a esta deleción funcional se la denomina AfadE)

Modificaciones adicionales que pueden incluirse en un hospedador de producción incluyen la introducción de un plásmido que lleva los cuatro genes que son responsables de la actividad acetil-CoA carboxilasa en E. coli (accA, B, C y D, Registros: NP_414727, NP_417721, NP_417722, NP_416819, EC 6.4.1.2). Los genes accABCD se clonaron en dos etapas como operones bicistrónicos en los sitios NcoI/HindIII y NdeI/Avrde pACYCDuet-1 (Novagen, Madison, WI), el plásmido resultante se denominó pAS004.126.

Modificaciones adicionales que pueden incluirse en un hospedador de producción incluyen las siguientes: sobreexpresión de aceEF (que codifica el componente de deshidrogenasa E1p y el componente de dihidrolipoamida aciltransferasa E2p de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato deshidrogenasa); y fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (que codifican FAS) de cualquier organismo conocido en la técnica que codifica dichas proteínas, incluyendo, por ejemplo, E. coli, Nitrosomonas europaea (ATCC 19718), Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria, Brevibacteria, Mycobacteria, levaduras oleaginosas, y similares, pueden expresarse en el hospedador de producción. De manera similar, pueden genomodificarse hospedadores de producción para que expresen accABCD (que codifica la acetil co-A carboxilasa) a partir de Pisum savitum en lugar de, o además de, los homólogos de E. coli. Sin embargo, cuando el hospedador de producción también está produciendo butanol, es menos deseable expresar el homólogo de Pisum savitum.

En algunos hospedadores de producción ejemplares, pueden desactivarse o atenuarse genes utilizando el método de Link, et al., J. Bacteriol. 179:6228-6237, 1997). Por ejemplo, los genes que pueden desactivarse o atenuarse incluyen gpsA (que codifica la sn-glicerol 3-fosfato deshidrogenasa biosintética, registro NP_418065, CE: 1.1.1.94); ldhA (que codifica la lactato deshidrogenasa, registro NP_415898, CE: 1.1.1.28); pflb (que codifica la formiato acetiltransferasa 1, registros: P09373, CE: 2.3.1.54); adhE (que codifica la alcohol deshidrogenasa, registros: CAA47743, CE: 1.1.1.1, 1.2.1.10); pta (que codifica la fosfotransacetilasa, registros: NP_416800, CE: 2.3.1.8); poxB (que codifica la piruvato oxidasa, registros: NP_415392, CE: 1.2.2.2); ackA (que codifica la acetato cinasa, registros: NP_416799, CE: 2.7.2.1) y combinaciones de los mismos.

De manera similar, para la deleción de fadE, puede introducirse la mutación PlsB[D311E] en LS9001 para atenuar PIsB utilizando el método descrito anteriormente. Una vez introducida, esta mutación disminuirá la cantidad de carbono que se desvía a la producción de fosfolípidos (véase la figura 1). Resumiendo, reemplazando el codón GAC para aspartato 311 por un codón GAA para glutamato, se prepara un alelo que codifica PlsB[D311E]. El alelo alterado se prepara por síntesis génica y el alelo de tipo silvestre plsB cromosómico se intercambia por el alelo plsB[D311E] mutante usando el método de Link et al. (véase anteriormente).

Ejemplo 2, Modificaciones del hospedador de producción

Para la expresión de diversas proteínas que se usaron en la síntesis de derivados de ácidos grasos se construyeron los siguientes plásmidos. Las construcciones se prepararon utilizando métodos de biología molecular convencionales y todos los genes clonados se pusieron bajo el control de promotores inducibles por IPTG (promotores de T7, tac o lac).

El gen 'tesA (gen de tioesterasa A, registro NP_415027 sin secuencia líder (Cho y Cronan, The J. of Biol Chem., 270:4216-9, 1995, CE: 3.1.1.5, 3.1.2.-) de E. coli, se clonó en pETDuet-1 digerido con Ndel/AvrlI (pETDuet-1 descrito en el presente documento está disponible en Novagen, Madison, WI). Genes que codificaban tioesterasas (TE) vegetales de tipo FatB de Umbellularia californica, Cuphea hookeriana y Cinnamonum camphorum (registros: UcFatB 1=AAA34215, ChFatB2=AAC49269, ChFatB3=AAC72881, CcFatB=AAC49151 se clonaron individualmente en tres vectores diferentes: (i) pETDuet-1 digerido con NdeI/AvrII, (ii) pBluescript KS+ digerido con Xhol/HindIII (Stratagene, La Jolla, CA) (utilizado para crear proteínas de fusión lacZ::TE N terminales) y (iii) pMAL-c2X digerido con XbaI/HindIII (New England Lab, Ipswich, MA) (usado para crear fusiones MalE::TE N-terminales). El gen fadD (que codifica la acil-CoA sintetasa) de E. coli se clonó en un derivado de pCDFDuet-1 digerido con NcoI/HindIII, que contenía el gen acr1 (acil-CoA reductasa) de Acinetobacter baylyi ADP1 dentro de sus sitios NdeI/AvrII. En la tabla 7 se proporciona un resumen de los plásmidos generados para preparar varias cepas de producción ejemplares, un experto habitual en la técnica apreciará que para obtener cepas similares pueden utilizarse diferentes plásmidos y modificaciones genómicas.

Tabla 7

Los plásmidos de expresión elegidos contenían replicones compatibles y marcadores de resistencia a antibióticos, de modo que pudo establecerse un sistema de expresión de cuatro plásmidos. Por lo tanto, LS9001 puede cotransformarse con (i) cualquiera de los plásmidos de expresión de TE, (ii) el plásmido de expresión de FadD, que también expresa acr1 y (iii) el plásmido de expresión de cera sintasa. Cuando se induce con IPTG, la cepa resultante producirá mayores concentraciones de alcoholes grasos a partir de fuentes de carbono tales como glucosa. La longitud de la cadena de carbono y el grado de saturación del alcohol graso producido depende del gen de tioesterasa que se expresa.

Ejemplo 3, Producción de alcohol graso en las cepas de E. co li recombinantes

Los alcoholes grasos se produjeron expresando un gen de tioesterasa y un gen de acil-CoA reductasa (FAR) de manera exógena en un hospedador de producción. De manera más específica, los plásmidos pCDFDuet-1-fadD-acr1 (acil-CoA reductasa) y pET-Duet-1-'tesA (tioesterasa) se transformaron en la cepa LS9001 de E. coli (descrita en el ejemplo 1) y los transformantes correspondientes se seleccionaron en placa de LB complementado con 100 mg/l de espectinomicina y 50 mg/l de carbenicilina. Cuatro transformantes de LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1 se inocularon independientemente en 3 ml de medio M9 complementado con 50 mg/l de carbenicilina y 100 mg/l de espectinomicina). Las muestras que contenían los transformantes se cultivaron a 25 °C en un agitador (250 rpm) hasta que alcanzaron una DO600.de 0,5. A un frasco de 250 ml que contenía 30 ml del medio descrito anteriormente, se transfirieron 1,5 ml de cada muestra. El cultivo resultante se cultivó a 25 °C en un agitador hasta que el cultivo alcanzó una DO600 de entre 0,5-1,0. Después, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y el crecimiento continuó durante 40 horas.

Después, las células se centrifugaron a 4000 rpm y los sedimentos celulares se suspendieron en 1,0 ml de metanol. A continuación, 3 ml de acetato de etilo se mezclaron con las células suspendidas. Después, se añadieron 3 ml de H2O a la mezcla y se sometió a ultrasonido durante 20 minutos. La muestra resultante se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos y la fase orgánica (la fase superior) que contenía alcohol graso se sometió a análisis de CG/EM. El rendimiento de alcohol total (incluyendo tetradecanol, hexadecanol, hexadecenol y octadecenol) fue de aproximadamente 1-10 mg/l. Cuando una cepa de E. coli, que llevaba solo vectores vacíos, se cultivó de la misma manera, en el extracto de acetato de etilo solo se encontraron 0,2-0,5 mg/l de alcoholes grasos.

Ejemplo 4, Producción y liberación de alcohol graso del hospedador de producción

Acr1 (acil-CoA reductasa) se expresó en E. coli que se cultivó en glucosa como única fuente de carbono y energía. La E. coli produjo pequeñas cantidades de alcoholes grasos tales como dodecanol (C12:0-OH), tetradecanol (C14:0-OH) y hexadecanol (C16:0-OH). En otras muestras, se expresó fadD (acil-CoA sintetasa) junto con acrl en E. coli y se observó un aumento de cinco veces en la producción de alcohol graso.

En otras muestras, acrl, fadD, accABCD (acetil-CoA carboxilasa) (plásmido que llevaba accABCD construido como se describe en el ejemplo 1), se expresaron junto con varias tioesterasas (TE) individuales en E. coli C41(DE3) de tipo silvestre y una E. coli C41(DE3 ñfadE, una cepaque carece de acil-CoA deshidrogenasa). Esto dio como resultado aumentos adicionales en la producción de alcohol graso y la modulación de los perfiles de alcoholes grasos (véase la figura. 5). Por ejemplo, la sobreexpresión de ’tesA de E. coli (pETDuet-1-'tesA) en este sistema logró un aumento de aproximadamente 60 veces en c 12:0-OH, C14:0-OH y C16:0-OH siendo C14:0-OH el alcohol graso principal. Se obtuvo un resultado muy similar cuando se expresó la enzima ChFatB3 (FatB3 de Cuphea hookeriana en pMAL-c2X-TEcu). Cuando se expresó la enzima UcFatB1 (FatB1 de Umbellularia californica en pMAL-c2X-TEuc), la producción de alcohol graso aumentó aproximadamente 20 veces y C12:0-OH fue el alcohol graso predominante.

La expresión de ChFatB3 y UcFatB1 también condujo a la producción de cantidades significativas de los alcoholes grasos insaturados C16:1-Oh y C14:1-OH, respectivamente. La presencia de alcoholes grasos también se encontró en el sobrenadante de las muestras generadas a partir de la expresión de tesA (figura 6). A 37 °C se encontraron cantidades aproximadamente iguales de alcoholes grasos en el sobrenadante y en el sedimento celular, mientras que a 25 °C se encontró aproximadamente el 25 % de los alcoholes grasos en el sobrenadante.

Ejemplo 5, Ésteres de ácidos grasos de cadena media

Las alcohol acetil transferasas (AAT, CE 2.3.1.84), que son responsables de la producción de acetato de acilo en varias plantas, pueden usarse para producir ceras de longitud de cadena media, tales como octanoato de octilo, octanoato de decilo, decanoato de decilo y similares. Los ésteres grasos, sintetizados a partir de alcohol de cadena media (tal como C6, C8) y acil-CoA de cadena media (o ácidos grasos tales como C6 o C8), tienen un punto de fusión bajo relativo. Por ejemplo, el hexanoato de hexilo tiene un punto de fusión de -55 °C y el octanoato de octilo tiene un punto de fusión de -18 a -17 °C. Los puntos de fusión bajos de estos compuestos hacen que sean buenos candidatos para su uso como biocombustibles.

En este ejemplo, un gen de SAAT se coexpresó en un hospedador de producción C41(DE3, AfadE) con fadD de E. coli y acr1 (alcohol reductasa de A. baylyi ADP1) y se proporcionó ácido octanoico en el caldo de fermentación. Esto dio como resultado la producción de octanoato de octilo. De manera similar, cuando el gen de cera sintasa de A. baylyi ADP1 se expresó en el hospedador de producción en lugar del gen de SAAT, se produjo octanoato de octilo.

Usando DNA 2.0 (Menlo Park, CA 94025), se sintetizó un gen de SAAT recombinante. El ADN sintetizado se basaba en la secuencia génica publicada (número de registro AF193789) y se modificó para eliminar el sitio Ncol. El gen de SAAT sintetizado (como un fragmento de BamHI-HindlII) se clonó en pRSET B (Invitrogen, Calsbad, California), linealizado con BamHI y HindlIl. El plásmido resultante, pHZ1.63A, se cotransformó en un hospedador de producción de E. coli con pAS004.114B, que llevaba un gen fadD de E. coli y un gen acr1 de A. baylyi ADP1. Los transformantes se cultivaron en 3 ml de medio M9 con 2 % de glucosa. Después de la inducción con iPTg y la adición de 0,02 % de ácido octanoico, el cultivo continuó a 25 °C a partir de 40 horas. Después de esto, se añadieron 3 ml de acetato de acetilo a todo el cultivo y se mezcló varias veces con una mezcladora. La fase de acetato de acetilo se analizó mediante CG/EM.

De manera sorprendente, en el extracto de acetato de acetilo, no se encontró acetato de acilo. Sin embargo, se encontró un nuevo compuesto y el compuesto era octanoato de octilo. Mientras que la cepa de control sin el gen de SAAT [C41(DE3, AfadE)/pRSET B+pAS004.114B] no produjo octanoato de octilo. Además, la cepa [C41(DE3, AfadE)/pHz1.43 B+pAS004.114B], en la que pHZ1.43 portaba el gen de cera sintasa de A. baylyi Ad P1, produjo octanoato de octilo (véase la figura 7B).

El hallazgo de que la actividad de SAAT produce octanoato de octilo no se ha notificado antes y hace posible producir ceras de cadena media tales como octanoato de octilo, decanoato de octilo, que tienen un punto de fusión bajo y son buenos candidatos para su uso como biocombustible para reemplazar el biodiésel a base de triglicéridos.

Ejemplo 6, Producción de éster de cera en la cepa LS9001 de E. co li

Se produjeron ésteres de cera genomodificando un hospedador de producción de E. coli para expresar una acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso, tioesterasa y una cera sintasa. Por tanto, el hospedador de producción produjo tanto el lado A como el B del éster y la estructura de ambos lados estaba influenciada por la expresión del gen de tioesterasa.

De manera más específica, la cera sintasa de A. baylyi ADP1 (denominada WSadp1, registros AA017391, CE: 2.3.175) se amplificó con los siguientes cebadores utilizando, como molde, ADN genómico de A. baylyi ADP1. Los cebadores fueron (1) WSadp1_Ndel, 5'-TCATATGCGCCCATTACATCCG-3' y (2) WSadp1_Avr, 5'-TCCTAGg AGg GCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3'. El producto de PCR se digirió con Ndel y AvrII y se clonó en pCOALDeut-1 para dar pHZ 1,43. Después, el plásmido que llevaba WSadp1, se cotransformó en la cepa LS9001 de E. coli tanto con pETDuet-1'tesA como con pCDFDuet-1-fadD-acr1 y los transformantes se seleccionaron en placas de LB complementado con 50 mg/l de kanamicina, 50 mg/l de carbenicilina y 100 mg/l de espectinomicina. Se inocularon tres transformantes en 3 ml de LBKCS (caldo de LB complementado con 50 mg/l de kanamicina, 50 mg/l de carbenicilina, 100 mg/l de espectinomicina y 10 g/l de glucosa) y se cultivaron a 37 °C en un agitador (250 rpm). Cuando los cultivos alcanzaron una DO600 de 0,5, se transfirieron 1,5 ml de cada cultivo a frascos de 250 ml que contenían 50 ml de LBKCS y los frascos se cultivaron en un agitador (250 rpm) a 37 °C hasta que el cultivo alcanzó una DO600.de 0,5-1,0. Después, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM. Los cultivos inducidos se cultivaron en un agitador a 37 °C durante otras 40-48 horas.

Después, el cultivo se colocó en tubos cónicos de 50 ml y las células se centrifugaron a 3500 X g durante 10 minutos. El sedimento celular se mezcló después con 5 ml de acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo se analizó con CG/EM. El rendimiento intracelular de ceras (incluyendo C16C16, C14:1C16, C18:1C18:1, C2C14, C2C16, C2C16:1, C16C16:1 y C2C18:1) fue de aproximadamente 10 mg/l. Cuando una cepa de E. coli, que solo llevaba vectores vacíos, se cultivó de la misma manera, solo se encontraron 0,2 mg/l de cera en el extracto de acetato de etilo.

Ejemplo 7, Producción y liberación de éster etílico graso del hospedador de producción

La cepa LS9001 se modificó transformándola con los plásmidos que llevaban un gen de cera sintasa de A. baylyi (plásmido pHZ1.43), un gen de tioesterasa de Cuphea hookeriana (plásmido pMAL-c2X-TEcu) y un gen fadD de E. coli (plásmido pCDFDuet-1-fadD). Esta cepa recombinante se cultivó a 25 °C en 3 ml de medio M9 con 50 mg/l de kanamicina, 100 mg/l de carbenicilina y 100 mg/l de espectinomicina. Después de la inducción con IPTG, los medios se ajustaron a una concentración final de etanol al 1 % y glucosa al 2 %. El cultivo se dejó en cultivo durante 40 horas después de la inducción con IPTG. Las células se separaron del medio gastado por centrifugación a 3500 X g durante 10 minutos). El sedimento celular se resuspendió con 3 ml de medio M9. La suspensión celular y el medio gastado se extrajeron después con 1 volumen de acetato de etilo. Las fases de acetato de etilo resultantes de la suspensión celular y el sobrenadante se sometieron a análisis de CG-EM. Los resultados mostraron que el éster etílico C16 era la especie de éster más relevante (tal como se esperaba para esta tioesterasa, véase la tabla 1), y que el 20 % del éster de ácido graso producido se liberaba de la célula (véase la figura 8). Un cepa C41(DE3, AfadE) de E. coli de control, que contenía pCOLADuet-1 (vector vacío para el gen de cera sintasa), pMAL-c2X-TEuc (que contenía fatB de U. california) y pCDFDuet-1-fadD (gen fadD de E. coli), no pudo producir cantidades detectables de ésteres etílicos grasos. Los ésteres de ácidos grasos se cuantificaron, usando como referencia, éster etílico de ácido palmítico comercial. También se prepararon ésteres de ácidos grasos usando los métodos descritos en el presente documento con la salvedad de que se añadió metanol o isopropanol al caldo de fermentación y se produjeron los ésteres de ácidos grasos esperados.

Ejemplo 8, La influencia de varias tioesterasas sobre la composición de ésteres etílicos grasos producidos en cepas de E. co li recombinantes.

Las tioesterasas FatB3 (C. hookeriana), TesA (E. coli) y FatB (U. california) se expresaron simultáneamente con cera sintasa (A. baylyi). Se construyó un plásmido denominado pHZ1.61 reemplazando el fragmento de NotI-AvrII (que llevaba el gen acr1) por el fragmento NotI-AvrII de pHZ1.43 de modo que fadD y la cera sintasa ADP1 estaban en un plásmido y ambas secuencias codificantes estaban bajo el control de un promotor de T7 distinto. La construcción de pHZ1.61 hizo posible utilizar un sistema de dos plásmidos en lugar del sistema de tres plásmidos como se describe en el ejemplo 6. Después, pHZ1.61 se cotransformó en E. coli C41 (DE3, AfadE) con uno de los diversos plásmidos que llevaban los diferentes genes de tioesterasa indicados anteriormente.

Los ésteres etílicos de ácidos grasos totales (sobrenadantes y ésteres etílicos de ácidos grasos intracelulares) producidos por estos transformantes se evaluaron usando la técnica descrita en el presente documento. Los rendimientos y la composición de los ésteres etílicos de ácidos grasos se resumen en tabla 8.

Tabla 8

Ejemplo 9, Construcción del hospedador de producción

Los genes que controlan la producción de ácidos grasos están conservados entre microorganismos. Por ejemplo, en la tabla 9 se identifican los homólogos de muchos de los genes descritos en el presente documento que se sabe que se expresan en microorganismos que producen hidrocarburos. Para aumentar la producción de ácidos grasos y, por lo tanto, la producción de hidrocarburos en microorganismos tales como los identificados en la tabla 9 , pueden expresarse genes heterólogos, tales como los de E. coli. Un experto habitual en la técnica también apreciará que, utilizando los métodos descritos en el presente documento, también pueden sobreexpresarse o atenuarse genes que son endógenos a los microorganismos proporcionados en la tabla 9. Por otra parte, para permitir la producción de hidrocarburos específicos con longitud de cadena de carbono, puntos de saturación y puntos de ramificación definidos, los genes que se describen en la figura 10, pueden expresarse o atenuarse en microorganismos que producen hidrocarburos de forma endógena.

Por ejemplo, secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican acetil-CoA carboxilasa, se introducen en K. radiotolerans. Los siguientes genes comprenden el producto proteico de acetil-CoA carboxilasa en K. radiotolerans; acetil CoA carboxilasa, subunidad alfa (accA/ZP_00618306), acetil-CoA carboxilasa, proteína transportadora de biotina y carboxilo (accB/ZP_00618387), acetil-CoA carboxilasa, subunidad de biotina carboxilasa (accC/ZP_00618040) y acetil-CoA carboxilasa, subunidad beta (carboxiltranferasa) (accD/ZP_00618306). Estos genes se clonan en un plásmido de modo que constituyen un operón de acetil-CoA carboxilasa (accABCD) sintética bajo el control de un sistema de expresión de K. radiotolerans tal como el sistema de expresión desvelado en Ruyter et al., Appl Environ Microbiol. 62:3662-3667, 1996. La transformación del plásmido en K. radiotolerans potenciará la producción de ácidos grasos. Usando los métodos desvelados en el presente documento, la cepa productora de hidrocarburos de K. radiotolerans, también puede genomodificarse para preparar hidrocarburos ramificados, insaturados que tienen longitudes de cadena de carbono específicas.

Tabla 9

Hospedadores de producción de hidrocarburos

Organismo Nombre del gen Número de registro/Seq ID/locus N° de CE Desulfovibrio accA YP_388034 6.4.1.2 desulfuricans G20

Desulfovibrio accC YP_388573/YP_388033 6.3.4.14, 6.4.1.2 desulfuricans G22

Desulfovibrio accD YP_388034 6.4.1.2 desulfuricans G23

Desulfovibrio fabH YP_38S920 2.3.1.180 desulfuricans G28

Desulfovibrio fabD YP_388786 2.3.1.39 desulfuricans G29

Desulfovibrio fabG YP_388921 1.1.1.100 desulfuricans G30

Desulfovibrio acpP YP_388922/YP_389150 3.1.26.3, desulfuricans G31 1.6.5.3, 1.6.99.3 Desulfovibrio fabF YP_388923 2.3.1.179 desulfuricans G32

Desulfovibrio gpsA YP_389667 1.1.1.94 desulfuricans G33

Desulfovibrio ldhA YP_388173/YP_390177 1.1.1.27, desulfuricans G34 1.1.1.28 Erwinia accA 942060 - 943016 6.4.1.2 (micrococcus)

amylovora

(continuación)

Hospedadores de producción de hidrocarburos

Organismo Nombre del gen Número de registro/Seq ID/locus N° de CE Erwinia accB 3440869 - 3441336 6.4.1.2 (micrococcus)

amylovora

Erwinia accC 3441351 - 3442697 6.3.4.14,6.4.1.2 (micrococcus)

amylovora

Erwinia accD 2517571 - 2516696 6.4.1.2 (micrococcus)

amylovora

Erwinia fadE 1003232 - 1000791 1.3.99.-(micrococcus)

amylovora

Erwinia pIsB (D311E) 333843 - 331423 2.3.1.15 (micrococcus)

amylovora

Erwinia aceE 840558 - 843218 1.2.4.1 (micrococcus)

amylovora

Erwinia aceF 843248 - 844828 2.3.1.12 (micrococcus)

amylovora

Erwinia fabH 1579839 - 1580789 2.3.1.180 (micrococcus)

amylovora

Erwinia fabD 1580826 - 1581749 2.3.1.39 (micrococcus)

amylovora

Erwinia fabG CAA74944 1.1.1.100 (micrococcus)

amylovora

Erwinia acpP 1582658 - 1582891 3.1.26.3, (micrococcus) 1.6.5.3, 1.6.99.3 amylovora

Erwinia fabF 1582983 - 1584221 2.3.1.179 (micrococcus)

amylovora

Erwinia gpsA 124800 - 125810 1.1.1.94 (micrococcus)

amylovora

Erwinia IdhA 1956806 - 1957789 1.1.1.27, (micrococcus) 1.1.1.28 amylovora

Kineococcus accA ZP_00618306 6.4.1.2 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus accB ZP_00618387 6.4.1.2 radiotoferans

SRS30216

Kineococcus accC ZP_00618040/ZP_00618387 6.3.4.14, 6.4.1.2 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus accD ZP_00618306 6.4.1.2 radiotolerans

SRS30216

Kineacoccus fadE ZP_00617773 1.3.99.-radiotolerans

SRS30216

Kineococcus pIsB (D311E) ZP_00617279 2.3.1.15 radiotolerans

SRS30216

(continuación)

Hospedadores de producción de hidrocarburos

Organismo Nombre del gen Número de registro/Seq ID/locus N° de CE Kineococcus aceE ZP_00617600 1.2.4.1 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus aceF ZP_00619307 2.3.1.12 radiololerans

SRS30216

Kineococcus fabH ZP_00618003 2.3.1.180 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus fabD ZP_00617602 2.3.1.39 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus fabG ZP_00615651 1.1.1.100 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus acpP ZP_00617604 3.1.26.3, radiotolerans 1.6.5.3, 1.6.99.3 SRS30216

Kineococcus fabF ZP_00617605 2.3.1.179 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus gpsA ZP_00618825 1.1.1.94 radiotolerans

SRS30216

Kineococcus IdhA ZP_00618879 1.1.1.27, radiotolerans 1.1.1.28 SRS30216

Rhodospirillum accA YP_425310 6.4.1.2 rubrum

Rhodospirillum accB YP_427521 6.4.1.2 rubrum

Rhodospirillum accC 6.3.4.14, 6.4.1.2 rubrum Rhodospirillum accD

6.4.1.2 rubrum

Rhodospirillum fadE YP_427035 1.3.99.-rubrum

Rhodospirillum aceE YP_427492 1.2.4.1 rubrum

Rhodospirillum aceF YP_426966 2.3.1.12 rubrum

Rhodospirillum fabH YP_426754 2.3.1.180 rubrum

Rhodospirillum fabD YP_425507 2.3.1.39 rubrum

Rhodospirillum fabG

425365 1.1.1.100 rubrum

Rhodospirillum acpP YP_425509 1.6.5.3, 1.6.99.3 rubrum

Rhodospirillum fabF

2.3.1.179 rubrum

Rhodospirillum gpsA YP_428652 1.1.1.94 rubrum

Vibrio furnissii accA 1,16 6.4.1.2 Vibrio furnissii accB 2, 17 6.4.1.2 Vibrio furnissii accC 3, 18 6.3.4.14, 6.4.1.2 Vibrio furnissii accD 4, 19 6.4.1.2 Vibrio furnissii fadE 5, 1.3.99.-plsB

Vibrio furnissii (D311E) 6, 21 2.3.1.15 (continuación)

Hospedadores de producción de hidrocarburos

Organismo Nombre del gen Número de registro/Seq ID/locus N° de CE Vibrio furnissii aceE 7, 22 1.2.4.1 Vibrio furnissii aceF 8, 23 2.3.1.12 Vibrio furnissii fabH 9, 24 2.3.1.180 Vibrio furnissii fabD 10, 25 2.3.1.39 Vibrio furnissii fabG 11, 26 1.1.1.100

3.1.26.3 Vibrio furnissii acpP 12, 27 1.6.5.3, 1.6.99.3 Vibrio furnissii fabF 13, 28 2.3.1.179 Vibrio furnissii gpsA 14, 29 1.1.1.94 Vibrio furnissii IdhA 15, 30 1.1.1.27,

1.1.1.28 Stenotrophomonas accA ZP_01643799 6.4.1.2 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas accB ZP_01644036 6.4.1.2 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas accC ZP_01644037 6.3.4.14, 6.4.1.2 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas accD ZP_01644801 6.4.1.2 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas fadE ZP_01645823 1.3.99.-maltophilia R551-3

Stenotrophomonas plsB (D311E) ZP_01644152 2.3.1.15 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas aceE ZP_01644724 1.2.4.1 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas aceF ZP_01645795 2.3.1.12 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas fabH ZP_01643247 2.3.1.180 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas fabD ZP_01643535 2.3.1.39 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas fabG ZP_01643062 1.1.1.100 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas acpP ZP_01643063 3.1.26.3, maltophilia R551-3 1.6.5.3, 1.6.99.3 Stenotrophomonas fabF ZP_01643064 2.3.1.179 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas gpsA ZP_01643216 1.1.1.94 maltophilia R551-3

Stenotrophomonas IdhA ZP_01645395 1.1.1.27, maltophilia R551-3 1.1.1.28 Para la tabla 9, los números de registro son del GenBank, versión 159.0 del 15 de abril de 2007,

Los números de CE son de la KEGG, versión 42.0 de abril de 2007 (más actualizaciones diarias hasta el 05/09/07 inclusive), los resultados de la cepa Ea273 de Erwinia amylovora se extrajeron del centro de secuenciación Sanger, secuencia aleatoria completada el 5/9/07, las posiciones de Erwinia representan ubicaciones en el pseudocromosoma de Sanger, las secuencias de Vibrio furnissii M1 son del pseudocromosoma LS9 VFM1, v2 creada el 28/09/06 e incluye el gen completo, y también puede incluir la secuencia flanqueante__________________

Ejemplo 10, Cepas de producción ejemplares adicionales

En la tabla 10, a continuación, se proporcionan cepas de producción ejemplares adicionales. Se describen dos ejemplos de rutas biosintéticas para producir ácidos grasos, alcoholes grasos y ésteres de ceras. Clonando la expresión de los genes accABCD de E. coli, el gen 'tesA de E. coli y el gen fadD de E. coli en una célula hospedadora, puede producirse un hospedador genomodificado. Las células hospedadoras pueden seleccionarse de E. coli, levaduras, añadir a la lista. Estos genes también pueden transformarse en una célula hospedadora que se modifica para que contenga una o más de las manipulaciones genéticas descritas anteriormente en los ejemplos 1 y 2. anteriormente. Como se proporciona en la tabla 10, utilizando los genes exógenos indicados, pueden crearse hospedadores de producción adicionales.

J _n S

Ejemplo 11, Fermentación

También pueden genomodificarse microorganismos hospedadores para que expresen umuC y umuD de E. coli en pBAD24 bajo el sistema del promotor de prpBCDE a través de síntesis de novo de este gen con los genes de producción de productos finales apropiados. Para la producción de productos de hidrocarburos a pequeña escala, células de E. coli BL21(DE3), que contenían pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de productos finales) así como pUMVC1 (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil CoA/malonil CoA), se incubaron durante la noche a 37 °C en frascos de 2 l con agitación a >200 rpm en 500 ml de medio LB complementado con ampicilina 75 pg/ml y kanamicina 50 pg/ml hasta que los cultivos alcanzaron una DO600 de>0,8. Tras lograr una DO600 de> 0,8, las células se complementaron con propionato de sodio 25 mM (pH 8.0) para activar los sistemas génicos genomodificados para la producción, así como para detener la proliferación celular (a través de la activación de las proteínas umuC y umuD). La inducción se realizó durante 6 horas a 30 °C. Después de la incubación, los medios se examinaron para detectar el producto usando CG-EM (como se describe a continuación).

Para la producción de productos a gran escala, los microorganismos genomodificados se cultivaron en lotes de 10 l, 100 l o más grandes, se fermentaron y se indujeron para expresar los productos deseados en función de los genes específicos codificados en los plásmidos, según corresponda. Se incubaron células de E. coli BL21(DE3), que contenían pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de productos finales) así como pUMVC1 (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil CoA/malonil CoA), a partir de un cultivo de siembra de 500 ml para fermentaciones de 10 l (5 l para fermentaciones de 100 l) en medios LB (sin glicerol) a 37 °C con agitación a >200 rpm hasta que los cultivos alcanzaron una DO600 de>0,8 (normalmente 16 horas) incubados con kanamicina 50 pg/ml y ampicilina 75 pg/ml. Los medios se tratan con complementación continua para mantener propionato de sodio 25 mM (pH 8,0) para activar los sistemas génicos genomodificados para la producción, así como para detener la proliferación celular (a través de la activación de las proteínas umuC y umuD). Los medios se complementan de manera continua con glucosa para mantener una concentración de 90 g/100 ml. Después de la primera hora de inducción, cada hora, se retiran partes alícuotas de no más del 10 % del volumen celular total y se dejan reposar sin agitar para permitir que el producto de hidrocarburo suba a la superficie y experimente una separación de fases espontánea. Después, se recoge el componente de hidrocarburo y la fase acuosa se devuelve a la cámara de reacción. La cámara de reacción funciona de manera continua. Cuando la DO600 cae por debajo de 0,6, las células se reemplazan por un nuevo lote cultivado a partir de un cultivo de semillas.

Para la producción de ésteres de cera, después del aislamiento, los ésteres de cera se lavan sucintamente en HCl 1 M para escindir el enlace éster, y se devuelven a pH 7 con un lavado exhaustivo con agua destilada.

Ejemplo 12, Caracterización del producto

Para caracterizar y cuantificar los alcoholes grasos y los ésteres de ácidos grasos, se utilizó la cromatografía de gases (CG) acoplada con detección por espectros de masas (EM) de impacto electrónico. Las muestras de alcohol graso se derivatizaron primero con un exceso de N-trimetilsililo (TMS) imidazol para aumentar la sensibilidad de la detección. Los ésteres de ácidos grasos no requerían derivatización. Se disolvieron tanto los derivados de alcohol graso-TMS como los ésteres de ácidos grasos en un disolvente volátil apropiado, como acetato de etilo. Las muestras se analizaron en una columna capilar DP-5 de 30 m utilizando el siguiente método. Después de una inyección no dividida de 1 pl en la columna de CG/EM, el horno se mantiene a 100 °C durante 3 minutos. La temperatura se elevó hasta 320 °C a una velocidad de 20 °C/minuto. El horno se mantuvo a 320 °C durante 5 minutos más. La velocidad de flujo del gas portador helio era de 1,3 ml/minuto. La EM de cuadrupolo escanea de 50 a 550 m/z. Los tiempos de retención y los patrones de fragmentación de picos de producto se compararon con referencias auténticas para confirmar la identidad de los picos.

Por ejemplo, un éster etílico del ácido hexadecanoico se eluyó a los 10,18 minutos (figuras 9A y 9B). El ion original de 284 unidades de masa se observó fácilmente. Más abundantes fueron los iones hijos producidos durante la fragmentación de masas. Esto incluía el ion hijo más frecuente de 80 unidades de masa. El alcohol graso derivatizado hexadecanol-TMS eluyó a los 10,29 minutos y se pudo observar el ion original de 313. El ion más frecuente fue el ion M-14 de 299 unidades de masa.

La cuantificación se llevó a cabo inyectando varias concentraciones de las referencias auténticas apropiadas usando el método de CG/EM descrito anteriormente. Esta información se utilizó para generar una curva patrón con respuesta (recuento total de iones integrados) frente a la concentración.

EQUIVALENTES

Aunque en el presente documento se divulgan explícitamente ejemplos específicos de las invenciones en cuestión, la memoria descriptiva y los ejemplos anteriores del presente documento, son ilustrativos y no restrictivos. Muchas variaciones de las invenciones resultarán obvias para los expertos en la técnica después de la revisión de esta memoria descriptiva incluyendo los ejemplos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una célula de E. coli recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos una enzima de una ruta biosintética de alcohol graso para su uso en la producción de un alcohol graso, en donde el alcohol graso se libera de la célula al medio de cultivo a una relación 1: 1 de producto intracelular a producto extracelular, y en donde la una o más secuencias de ácido nucleico exógeno están sobreexpresadas.

2. La célula de E. coli recombinante la reivindicación 1, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en una acetil-CoA carboxilasa de C.E. 6.4.1.2, una tioesterasa de CE 3.1.2.14, una acil-CoA sintasa de CE 2.3.1.86, una acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso de CE 1.1.1.*, una acil-CoA reductasa de 1.2.1.50, una alcohol deshidrogenasa de CE 1.1.1.1 y una enzima FAS de CE 2.3.1.85.

3. Un medio de cultivo que comprende la célula de E. coli recombinante de la reivindicación 1.

4. El medio de cultivo de la reivindicación 3, que comprende además un alcohol graso que es producido por la célula de E. coli recombinante de la reivindicación 1.

5. El medio de cultivo de la reivindicación 4, en donde el derivado de ácido graso comprende de 1 a 5 enlaces dobles.

6. El medio de cultivo de la reivindicación 4, en donde el derivado de ácido graso comprende una longitud de cadena de carbono de 8 a 30.

7. El medio de cultivo de la reivindicación 4, en donde el derivado de ácido graso comprende de 1 a 5 puntos de ramificación.

8. Uso de una célula de E. coli recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos un polipéptido de una ruta biosintética de alcohol graso para la producción de un alcohol graso, en donde el alcohol graso se libera de la célula al medio de cultivo a una relación 1: 1 de producto intracelular a producto extracelular, y en donde la una o más secuencias de ácido nucleico exógeno están sobreexpresadas.

9. Un método para producir un alcohol graso que comprende cultivar una célula de E. coli recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican al menos un polipéptido de una ruta biosintética de alcohol graso, en donde el derivado de ácido graso se libera de la célula al medio de cultivo a una proporción 1: 1 de producto intracelular a producto extracelular, y en donde la una o más secuencias de ácido nucleico exógeno están sobreexpresadas.

10. El uso de la reivindicación 8, o el método de la reivindicación 9, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en una acetil-CoA carboxilasa de C.E. 6.4.1.2, una tioesterasa de CE 3.1.2.14, una acil-CoA sintasa de CE 2.3.1.86, una acil-CoA reductasa formadora de alcohol graso de CE 1.1.1.*, una acil-CoA reductasa de 1.2.1.50, una alcohol deshidrogenasa de CE 1.1.1.1 y una enzima FAS de CE 2.3.1.85.

11. El uso de la reivindicación 8, o el método de la reivindicación 9, en donde el derivado de ácido graso comprende de 1 a 5 enlaces dobles.

12. El uso de la reivindicación 8, o el método de la reivindicación 9, en donde el derivado de ácido graso comprende una longitud de cadena de carbono de 8 a 30.

13. El uso de la reivindicación 8, o el método de la reivindicación 9, en donde el derivado de ácido graso comprende de 1 a 5 puntos de ramificación.

14. Un recipiente que contiene la célula de E. coli recombinante de la reivindicación 1 o 2, o el medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

15. Un caldo de fermentación que comprende la célula de E. coli recombinante de la reivindicación 1 o 2, o el medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.