ES2765726T3

ES2765726T3 - Polipéptido inmunogénico, compuesto por péptidos crípticos optimizados, derivados del antígeno tumoral restringido HLA-B7 y usos del mismo

Info

Publication number: ES2765726T3
Application number: ES15762719T
Authority: ES
Inventors: Catherine Gallou; Jeanne Menez-Jamet
Original assignee: Vaxon Biotech SA
Current assignee: Vaxon Biotech SA
Priority date: 2014-07-22
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2020-06-10
Anticipated expiration: 2035-07-17
Also published as: EP3193916B1; JP2017526650A; WO2016012921A3; EP3193916A2; WO2016012921A2; CA2954964C; US20170157228A1; JP6701164B2; CN106661127A; EP2977059A1; CA2954964A1

Abstract

Un polipéptido que comprende la secuencia SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA (SEQ ID NO: 23).

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido inmunogénico, compuesto por péptidos crípticos optimizados, derivados del antígeno tumoral restringido HLA-B7 y usos del mismo

La presente invención pertenece al campo de las vacunas anticancerosas. Más particularmente, la invención se refiere a un polipéptido quimérico optimizado para utilizar en pacientes de cáncer con HLA-B7, que comprende cuatro péptidos optimizados derivados de epítopos tumorales crípticos para mejorar su inmunogenicidad.

Las vacunas antitumorales actualmente en desarrollo adoptan muchas formas, incluyendo péptidos libres, proteínas recombinantes, células dendríticas cargadas con péptidos o lisados tumorales y ADN. Aunque las vacunas con base peptídica son muy atractivas en relación a otras formas en términos de viabilidad, se encontró que muchos estudios con vacunas dirigidas a péptidos tumorales dominantes provocaban solo respuestas débiles inmunológicas y clínicas, con gran variabilidad entre pacientes. Este fue el caso de varias vacunas peptídicas derivadas de gp100 probabas en varios estudios clínicos, el péptido BLP25 derivado de MUC1 probado en un ensayo en fase II aleatorizado y el péptido E75 derivado de HER-2/neu probado en un número muy elevado de estudios clínicos en fase I y en fase II (Butts et al, 2005; Peoples et al, 2008; Rosenberg et al., 2004).

Los péptidos crípticos optimizados inducen inmunidad antitumoral más eficazmente que los péptidos dominantes en modelos de ratones transgénicos (Gross et al., 2004) y en la actualidad, dos vacunas basadas en esta tecnología se encuentran en desarrollo clínico:

- Vx-001, un péptido monoepítopo derivado de TERT destinado a pacientes de cáncer de CPNM con HLA-A2, está en fase IIb y

- Vx-006, un polipéptido de tres epítopos que se dirige a los antígenos tumorales universales TERT, MAGE-A y HER-2/neu también destinado a pacientes con HLA-A2, está en fase I.

Los enfoques que provocan respuestas de CTL a múltiples antígenos utilizando vacunas con base polipeptídica tienen varias ventajas. En particular, la expresión de al menos un antígeno diana ha de ser suficiente para desencadenar la muerte de células tumorales mediante CTL inducidos por vacunas y es improbable que las células tumorales pierdan todos los antígenos diana simultáneamente, especialmente cuando estos antígenos son esenciales para la supervivencia celular y el crecimiento tumoral. Este enfoque puede provocar fuertes respuestas inmunitarias (Oukka et al., 1996) e incrementar la proporción de pacientes susceptibles de beneficiarse de la vacuna. Además, las vacunas contra el cáncer de amplio espectro deben dirigirse a antígenos tumorales universales, tales como TERT, HER-2/neu, MUC-1, CEA, EphA2 y MAGE-A, que están sobreexpresados por una amplia variedad de tumores (Minev et al., 2000; Ofuji et al., 1998; Ogata et al., 1992; Reese y Slamon, 1997; Slamon et al., 1987; Van den Eynde y van der Bruggen, 1997; Vonderheide et al., 1999). La mayoría de estos antígenos están implicados en la supervivencia de células tumorales y en carcinogénesis y su regulación a la baja para evitar la respuesta inmunitaria puede, por tanto, tener un efecto deletéreo en el crecimiento tumoral.

Para aumentar el número de pacientes que pueden beneficiarse de tales productos, los inventores han desarrollado una vacuna con base peptídica, denominada Vbx-016, diseñada para pacientes que expresan e1HLA-B7, que se dirige a cuatro antígenos tumorales expresados ampliamente: TERT, HER-2/neu, MAGE y CEA. Los cuatro péptidos crípticos optimizados (Tabla 1) que componen la Vbx-016, ya se han descrito (documentos WO2008/010098, WO2010/143010 y US 2012/142894 A1). Se observó que cada uno de los cuatro péptidos provoca una respuesta antitumoral in vivo e in vitro (documentos WO2008/010098, WO2010/143010 y US 2012/142894 A1), tanto contra el péptido optimizado y como contra el péptido afín nativo expresado de forma natural por las células tumorales (tabla 1). Cabe señalar que, los CTL provocados por MAGE-A²⁷³V⁶L⁹se dirigieron a seis antígenos MAGE (-A1, -A2, -A3, -A4, -A6 y -A12). De hecho, los CTL específicos inducidos utilizando el MAGE-A²⁷³V⁶L⁹son capaces de reconocer células cargadas con MAGE-A²⁷³A⁶(incluidas en MAGE-A1 y MAGE-A4), MAGE-A²⁷³I⁶(incluidas en MAGE-A2 y MAGE-A6) y MAGE-A²⁷³V⁶(incluidas en MAGE-A3 y MAGE-A12).

Tabla 1: Secuencias de epítopo nativas y optimizadas

Nombre del péptido optimizado

_nativoAntígenoPosición Modificación Secuencia tama

_ñoSEQ ID

7C1 CEA₁₈₈SPRLQLSNG ⁹1

7C1M CEA₁₈₈L9 SPRLQLSNL ⁹7

7HN3 HER-2/neu246 GPKHSDCLA ⁹2

7HN3M HER-2/neu246 A1 APKHSDCLA ⁹8

7T5 TERT⁴⁴⁴DPRRLVQLL ⁹3

7T5M TERT⁴⁴⁴A1 APRRLVQLL ⁹9

7M1A6 MAGE-A₂₇₃A6 GPRALAETS ⁹4

7M1V6 MAGE-A₂₇₃V6 GPRALIETS ⁹5

7M1I6 MAGE-A₂₇₃I6 GPRALVETS ⁹6

7M1M MAGE-A₂₇₃V6 L9 GPRALVETL ⁹10 Tradicionalmente, las vacunas con base polipeptídica se emulsionan con un adyuvante tal como el ISA51VG de Montanide (Seppic, Castres, Francia) antes de la inyección subcutánea. Después de la inyección, el polipéptido se asimila en Células Presentadoras de Antígenos (CPA) especialistas, en particular las células de Langerhans presentes localmente en la piel. Seguidamente, el polipéptido se procesa por el proteasoma en el aparato de Golgi y los epítopos se presentan en la superficie celular en asociación con moléculas de HLA. Para garantizar la presentación eficaz de cada epítopo del polipéptido, es preceptivo probar si cada unión se procesa correctamente por el proteasoma. Además, los inventores han descrito anteriormente, con el polipéptido Vx006 de tres epítopos, que el orden de los epítopos en la secuencia de una vacuna poliepitópica es crucial para el procesamiento de cada epítopo y finalmente para la obtención de una respuesta inmunitaria contra todos los epítopos correspondientes (documento WO2007/073768, Cornet et al., Vaccine 2016, p.2102-2109).

Para evitar probar las 24 supuestas disposiciones, la organización óptima de los cuatro péptidos optimizados en el polipéptido se determinó así en dos etapas: (i) prueba de cada secuencia de unión; y (ii) prueba del polipéptido completo correspondiente.

Por tanto, se probó cada unión potencial. Seguidamente, se probaron doce posibles dipéptidos presentados en la tabla 2 in vivo en ratones transgénicos HLA-B*0702 y en cultivo in vitro de PBMc de donante sano para:

- la capacidad del dipéptido para ser procesado eficazmente e inducir los CTL específicos capaces de reconocer células cargadas con cada uno de los epítopos optimizados,

- la capacidad de los CTL inducidos para reconocer los péptidos nativos afines correspondientes a la secuencia presente de forma natural en la superficie celular tumoral.

Tabla 2. Secuencias dipeptídicas probadas en ratones transgénicos

Nombre Secuencia Tamaño (AA) SEQ ID NO:

7C1HN3M SPRLQLSNLAPKHSDCLA 18 11

7HN3C1M APKHSDCLASPRLQLSNL 18 12

7C1T5M SPRLQLSNLAPRRLVQLL 18 13

7T5C1M APRRLVQLLSPRLQLSNL 18 14

7C1M1M SPRLQLSNLGPRALVETL 18 15

7M1C1M GPRALVETLSPRLQLSNL 18 16

7HN3T5M APKHSDCLAAPRRLVQLL 18 17

7T5HN3M APRRLVQLLAPKHSDCLA 18 18

7HN3M1M APKHSDCLAGPRALVETL 18 19

7M1HN3M GPRALVETLAPKHSDCLA 18 20

7T5M1M APRRLVQLLGPRALVETL 18 21

7M1T5M GPRALVETLAPRRLVQLL 18 22

En primer lugar, cada secuencia de dipéptido se sometió a dos programas principales de predicción de escisión con proteasoma in silico, MAPPP (desarrollado por Jorg Hakenberg y Hans-Joachim Mollenkopf en el Max-Planck-Institute for Infection Biology, disponible en Internet) y PAProC (Algoritmo de Predicción para Escisiones Proteasomales, también disponible en Internet) que predicen la probabilidad de procesamiento de cada epítopo.

Según PAProC, ninguno de los dipéptidos debería procesarse correctamente por el proteasoma (los sitios de escisión predichos se representan con barras, tabla 3), excepto el 7T5HN3M que podría producir ambos epítopos (sitio de escisión con una barra doble).

Tabla 3: predicción de escisión con proteasoma para dipéptidos (PaProc)

Nombre Predicción de sitios de escisión SEQ ID NO:

De acuerdo con el modelo de predicción de MAPPP, muchas combinaciones deberían permitir el procesamiento de los cuatro epítopos (datos no mostrados). La secuencia mejor predicha que debe asegurar el procesamiento eficaz de cada epítopo por el proteasoma es CEA¹⁸⁸L⁹/ MAGE²⁷³L⁹/TERT⁴⁴⁴A¹/ HER-²/neu²⁴⁶A¹.

Seguidamente, los dipéptidos se probaron in vivo en ratones transgénicos HLA-B*0702. Como se describió en el ejemplo 1, las combinaciones 7C1HN3M, 7C1T5M, 7T5HN3M, 7M1HN3M y 7T5M1M dieron mejores resultados que las correspondientes secuencias invertidas, en términos del número de ratones que respondieron. 7C1M1M y 7M1C1M dieron los mismos resultados.

Basándose en estos datos experimentales in vivo, seguidamente se diseñó el siguiente polipéptido óptimo teórico: CEA¹⁸⁸L⁹/TERT ⁴⁴⁴A¹/MAGE273L9/HER-2/neu246A1.

Con el fin de determinar si los epítopos se procesan eficazmente en el cuadripéptido, el polipéptido correspondiente SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA (SEQ ID NO: 23) se probó seguidamente en ratones transgénicos HLA-B*0702 respecto a su capacidad para inducir CTL específicos que reconocen los cuatro epítopos optimizados y los cuatro péptidos nativos afines que están presentes de forma natural en la superficie de las células tumorales. Como se describió en el ejemplo 2, después de dos vacunaciones con el polipéptido, todos los ratones respondieron a al menos un péptido nativo y una gran mayoría de los ratones vacunados respondieron a dos o más péptidos nativos afines confirmando que el polipéptido se procesa eficazmente por el proteasoma. Cabe destacar que, todos los péptidos nativos se reconocieron al menos una vez en un ratón vacunado.

Cabe señalar que, esta secuencia es diferente de la secuencia seleccionada por el modelo de predicción de escisión de MAPPP del proteasoma, dado que se predijo que el 7M1T5M no se procesaría correctamente, contrariamente a lo que sucede in vivo.

Para confirmar los resultados obtenidos en ratones transgénicos HLA-B*0702 in vitro en seres humanos, cada unión del polipéptido definido (CEA¹⁸⁸L⁹/TERT⁴⁴⁴A¹, TERT⁴⁴⁴A¹/MAGE²⁷³L⁹y MAGE273L9/HER-2/neu246A1) se probó independientemente in vitro en un cultivo de PBMC de un donante humano sano. Los resultados descritos en el ejemplo 3 muestran que cada dipéptido se procesó eficazmente in vitro en seres humanos y que los CTL específicos inducidos fueron capaces de reconocer células cargadas con el péptido optimizado o con el péptido nativo afín. Finalmente, el polipéptido SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA (SEQ ID NO: 23) se probó en un cultivo de PBMC de un donante sano con HLA-B*0702 (ejemplo 4), confirmando la capacidad del polipéptido para generar una respuesta inmunitaria de CTL poliespecífica. Cabe destacar que, se reconocieron varios péptidos nativos. Estos resultados confirman que el polipéptido se procesa eficazmente por el proteasoma y que la respuesta inmunitaria inducida es poliespecífica.

El presente texto describe un polipéptido que comprende la secuencia SPRLQLSNLXXXAPRRLVQLLXXXGPRALVETLXXXAPKHSDCLA (SEQ ID NO: 24). En esta secuencia, los epítopos CEA¹⁸⁸L⁹, TERT⁴⁴⁴A¹, MAGE²⁷³L⁹y HER-2/neu246A1 están separados por los espaciadores XXX, en los que cada X es (independientemente entre sí) cualquier aminoácido o ninguno. El polipéptido tiene, por lo tanto, al menos 36 aminoácidos de longitud; su longitud se puede incrementar mediante la adición de espaciadores entre los epítopos y/o por la adición de señales, en sus extremos N-terminal y/o C-terminal, que favorecen su procesamiento. En particular, el polipéptido descrito puede comprender adicionalmente una secuencia de señal de translocación al retículo endoplasmático en su extremo N-terminal. Se han descrito varias secuencias de señal de translocación al retículo endoplasmático en la literatura científica y se pueden utilizar en el contexto de la invención. Por ejemplo, la secuencia de señal de cadena Ig kappa (Ishioka et al., 1999) y la secuencia de señal de proteína E3/19-kD (Anderson et al., 1991) se pueden añadir al extremo N-terminal de los péptidos de acuerdo con la invención. Como alternativa o adicionalmente, el polipéptido puede comprender adicionalmente ubiquitina en su extremo C-terminal, dado que la ubiquitinación de proteínas provoca una proteólisis mayor.

En un polipéptido de acuerdo con la invención, los cuatro epítopos están directamente ligados entre sí sin el uso de ningún espaciador (X=ninguno para cada posición). Por lo tanto, el polipéptido de acuerdo con la invención comprende la secuencia SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA (SEQ ID NO: 23). En ausencia de ubiquitina y de la señal de translocación al RE, el polipéptido consiste, por lo tanto, en el polipéptido ilustrado en los ejemplos de más adelante (SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA, SeQ ID NO: 23).

En los polipéptidos de acuerdo con la invención, los aminoácidos pueden ser L-aminoácidos o D-aminoácidos. Un polipéptido según la invención induce una respuesta específica de linfocitos T CD8+ contra al menos uno y preferentemente al menos dos péptidos seleccionados entre los péptidos nativos afines CEA¹⁸⁸, TERT444, MAGE²⁷³y HER-2/neu246, en una mayoría de ratones transgénicos HLA-B*0702 vacunados con dicho polipéptido.

Un polipéptido según la invención también induce una respuesta específica de linfocitos T CD8+ contra al menos uno y preferentemente al menos dos péptidos seleccionados entre los péptidos nativos afines CEA¹⁸⁸, TERT⁴⁴⁴, MAGE²⁷³y HER-2/neu246 en un ensayo in vitro con PBMC humanas de donantes sanos de HLA-B*0702.

Con el fin de controlar que el polipéptido de SEQ ID NO: 23 está correctamente procesado y que tiene una buena inmunogenicidad, los inventores han demostrado también que:

- se reconoce a cada péptido nativo al menos una vez en un ratón transgénico HLA-B*0702;

- el polipéptido de SEQ ID NO: 23 induce una respuesta específica de linfocitos T CD8+ contra al menos uno y normalmente dos o más péptidos seleccionados entre los péptidos nativos afines CEA¹⁸⁸, TERT⁴⁴⁴, MAGE²⁷³y HER-2/neu246 en un ensayo in vitro con PBMC humanas de donantes sanos de HLA-B*0702; y

- estas respuestas específicas se obtienen con PBMC de dos o más donantes sanos de HLA-B*0702 y se reconoce cada péptido optimizado al menos una vez en un ensayo in vitro con PBMC humanas de un donante sano con HLA-B*0702.

En una realización más preferida, el polipéptido según la invención exhibe todas las propiedades anteriores, que pueden probarse fácilmente por el experto en la materia, utilizando los protocolos y ensayos descritos en la parte experimental más adelante.

Otro aspecto de la invención es una célula dendrítica aislada cargada con un polipéptido según la invención. En el presente contexto, "aislada" significa que dicha célula dendrítica está fuera del cuerpo del paciente. La célula se carga preferiblemente ex vivo. Por ejemplo, la célula dendrítica se puede cargar con el polipéptido mediante la técnica descrita por Vonderheide et al. (Vonderheide et al., 2004).

La invención también pertenece a un complejo que comprende un vector de liberación peptídico y un polipéptido según la invención. Son ejemplos de vectores de liberación peptídicos que se pueden emplear según la invención péptidos que penetran en la célula tales como los descritos, por ejemplo, en las solicitudes de patente publicadas como los documentos WO2013/150338, EP1795539 y WO2014/053629, toxinas bacterianas tales como la adenilato ciclasa de B. pertussis (Fayolle et al., 1999), la toxina de la difteria (Fayolle et al., 1999), la toxina del ántrax (Doling et al, 1999), la subunidad B de la toxina shiga (Haicheur et al, 2000) y otros vectores tales como el PLA2 del veneno de abeja (Babon et al, 2005), liposomas, virosomas (Bungener et al, 2002) y similares.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según la invención y/o una célula dendrítica modificada por ingeniería genética y/o un complejo como se describió anteriormente, así como un vehículo aceptable farmacéuticamente. En particular, se pueden utilizar polipéptidos, células dendríticas y complejos según la invención para la preparación de una composición inmunogénica de inmunoterapia anticancerosa. Estas composiciones son particularmente útiles para la inmunoterapia de tumores que expresan al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en la familia MAGE-A, la familia HER, CEA y TERT, especialmente para el tratamiento de individuos con HLA-B*0702.

La presente invención se puede utilizar para tratar (o prevenir la recaída de) virtualmente cualquier tipo de cánceres, tales como el cáncer adrenocortical, cáncer colorrectal, carcinoma del tracto biliar, cáncer de vejiga, cánceres óseos, cánceres de cerebro y del sistema nervioso central, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cánceres de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, tumores carcinoides gastrointestinales, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de hígado, mesotelioma de cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, cáncer de la hipófisis, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, cáncer de piel no melanoma), cánceres de testículos, cáncer de timo, cánceres de tiroides, cáncer de vagina, cáncer de la vulva y cáncer de útero.

También se describen en el presente documento métodos de vacunación o tratamiento contra el cáncer que comprenden una etapa de emulsión del polipéptido con un adyuvante y la administración de un polipéptido según la invención in vivo a un paciente que lo necesita, así como métodos de vacunación o tratamiento que comprenden una etapa de administración de complejos o células dendríticas modificadas por ingeniería genética como se describió anteriormente a un individuo.

Otro aspecto de la presente invención es un kit de partes que comprende al menos una dosis de polipéptido (o complejos) como se describió anteriormente y al menos una dosis de adyuvante. Los adyuvantes inmunológicos son sustancias que se añaden a formulaciones de vacunas para aumentar su eficacia. Los adyuvantes pueden aumentar la magnitud y la duración de la respuesta inmunitaria inducida mediante vacunación. Son ejemplos preferidos de adyuvantes que se pueden utilizar en los kits según la invención aquellos derivados del adyuvante incompleto de Freund (IFA). Las formulaciones de vacunas con estos adyuvantes son emulsiones de agua en aceite (W/O). Entre los ejemplos no limitantes de adyuvantes destoxificados de tipo IFA que se pueden utilizar para emulsiones con el péptido según la presente invención, se incluyen el ISA 51 con base de aceite mineral de Montanide® y el ISA 720 con base escualeno de Montanide® (SEPPIC, Francia).

Otro kit de partes según la presente invención comprende al menos dos dosis de polipéptidos o complejos como se describió anteriormente. El péptido ya puede estar formulado con el adyuvante o no.

Dado que la vacunación contra el cáncer necesita varios estímulos para ser totalmente eficaz, un kit de partes según la presente invención puede comprender de 3 a 50, preferentemente de 6 a 20 dosis de polipéptido como se describió anteriormente.

Según una realización preferida de los kits descritos anteriormente, cada dosis de polipéptido comprende entre 0,5 y 10 mg de polipéptido.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Los ejemplos se han realizado empleando los siguientes materiales y métodos:

Ratones transgénicos. Los ratones knockout clase I de H-2 con HLA-B7 se describieron anteriormente (Rohrlich et al., 2003) y se proporcionaron amablemente por F. Lemonnier (Institut Pasteur, París, Francia).

Células . Las células T2-B7 humanas transfectadas con HLA-B*0702 se describieron anteriormente (Rohrlich et al, 2003). Las células se cultivaron en medio de cultivo RPMI1640 suplementado con 20 % de SFB y penicilinaestreptomicina.

Péptidos y Plásmidos . Los péptidos se sintetizaron por Millegen (Labége, Francia) o por Eurogentec (Seraing, Bélgica).

Inducción de CTL in vivo en ratones transgénicos HLA-B*0702. Los ratones transgénicos HLA-B*0702 se vacunaron por vía subcutánea en la base de la cola con 200 |jg de dipéptidos optimizados o con 400 |jg de Vbx-016 junto con el péptido auxiliar HV core T13L auxiliar (150 jg ) y emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) o ISA51VG de Montanide (Seppic, Castres, Francia) dos veces con un intervalo de dos semanas.

Siete días después de la última vacunación, se extrajeron los bazos y se aislaron los linfocitos T mediante centrifugación Ficoll y se comprobó ex vivo el reconocimiento de 10 jM de los péptidos nativos u optimizados. El control positivo fue Concanavalina A y el control negativo fue el medio solo. Todas las condiciones se ensayaron por cuadriplicado. La producción de IFNy por los linfocitos T se cuantificó mediante ELISpot utilizando el Kit Murine IFNy ELISpot de Diaclone.

Una respuesta inmunitaria se consideró positiva cuando hubo 1) más de 10 puntos de diferencia/ 106 células entre el control negativo y el péptido sometido a prueba y 2) una diferencia estadísticamente significativa entre estos dos grupos con la prueba t (p<0,05).

Generación de CTL a partir de PBMC humanas. Las PBMC se obtuvieron mediante leucoféresis de voluntarios sanos con HLA-B*0702. Las células dendríticas (DC) se produjeron a partir de células adherentes cultivadas durante siete días con 500 Ul/ml de GM-CSF y 500 Ul/ml de IL-4, en un medio sintético completo (AIMV). El día 6, las DC se sometieron a pulsos con 10 jM de polipéptidos toda la noche. El día 7, se purificaron las células CD8+ mediante selección negativa con células CD8 Dynabeads Untouched Human CD8. Las células CD8+ (2x105) células CD8-(6x104) se estimularon con 3x104 DC pulsadas con péptido en medio AIMV suplementado con 1000 Ul/ml de IL-6 y 5 Ul/ml de IL-12, 1 jg/ml de anti-CD40 y 500 UI/ml de IFNy en placas de fondo redondo de 96 pocillos.

A partir del día 7, los cultivos se reestimularon semanalmente con DC cargados con péptidos en presencia de 20 UI/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-7, 1 jg/ml de anti-CD40 y 500 UI/ml de IFN^y.

Después de la tercera reestimulación, las células CD8 se mantuvieron en AIMV suplementado con 20 UI/ml de IL-2 durante 7 días. Los cultivos no se alimentaron durante una noche con AIMV y seguidamente se examinaron en un ensayo ELISpot de IFNy.

Ensayo ELISpot de IFN^y. Para un cultivo de 96 pocillos, se obtuvieron cuatro grupos de 24 pocillos, las células CD8 se contaron y 50 000 CD8 se repartieron sobre la placa ELISpot con 25 000 T2B7 cargados con 10 jM de cada monopéptido nativo o con 10 jM de monopéptidos modificados que componen el polipéptido. Se realizaron ocho réplicas de cada condición. El control positivo fue Fitohemaglutinina A y el control negativo fue T2B7 cargado con un péptido irrelevante incapaz de unirse a moléculas de HLA-B7.

Ejemplo 1: Evaluación de la respuesta inmunitaria de linfocitos T producida en ratones transgénicos HLA-B*0702 después de dos vacunaciones con todas las diferentes combinaciones de dipéptidos

Se utilizó cada dipéptido para vacunar ratones transgénicos HLA-B*0702 dos veces en un intervalo de 2 semanas y se probó su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria tanto contra péptidos optimizados como contra sus homólogos nativos afines. Se describen los dipéptidos en la tabla 2. En cada experimento, la mejor combinación se resalta en gris. 7C1HN3M, 7C1T5M, 7T5HN3M, 7M1HN3M y 7T5M1M dieron mejores resultados que la secuencia invertida, en términos del número de ratones que respondieron. 7C1M1M y 7M1C1M dieron los mismos resultados.

Comparación de 7C1HN3M frente a 7HN3M

dipéptido CEA188 CEA188L9 HER-2Neu HER-2Neu

246 246A1

7C1HN3M 2/4 4/4 3/4 1/4

7HN3C1M 1/3 1/3 1/3 0/3

Comparación de 7C1T5M frente a 7T5C1M

dipéptido CEA188 CEA188L9 TerT444 Tert444A1

7C1T5M 8/8 5/8 6/8 6/8

7T5C1M 3/7 4/7 6/7 7/7

Comparación de 7C1M1M frente a 7M1C1M

dipéptido CEA188 CEA188L9 MageA273V6 MageA273L9

7C1M1M 4/7 5/7 2/7 4/7

7M1C1M 4/5 4/5 1/5 4/5

Comparación de 7HN3T5M frente a 715M HN3

dipéptido HER-2/Neu246 HER-2/Neu246A1 TerT444 Tert444Al

7HN3T5M 2/7 0/7 5/7 5/7

7T5HN3M 3/8 2/8 4/8 5/8

Comparación de 7HN3M1M frente a 7M1HN3M

dipéptido HER-2/Neu246 HER-2Neu246A1 MageA273V6 MageA273L9

7HN3M1M 0/7 1/7 1/7 5/7

7M1HN3M 1/7 4/7 5/7 5/7

Comparación de 7T5M1M frente a 7M1T5M

dipéptido TerT444 Tert444A1 MageA273V6 MageA273L9

7T5M1M 4/4 4/4 2/4 4/4

7M1T5M 4/4 4/4 0/4 4/4

Tabla 4: prueba de cada dipéptido en ratones transgénicos HLA-B*0702.

Ejemplo 2: Evaluación de la respuesta inmunitaria de linfocitos T producida en ratones HLA-B*0702 después de dos vacunaciones con Vbx-016

Para evaluar si la Vbx-016 (SEQ ID NO: 23) determinada en los experimentos dipeptídicos es óptima, los ratones transgénicos HLA-B*0702 se vacunaron por vía subcutánea en la base de la cola con 400 |jg de Vbx-016 y 150 jg del péptido auxiliar HBV core T13L emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) o ISA51VG de Montanide (Seppic, Castres, Francia) dos veces con un intervalo de dos semanas.

Después de dos vacunaciones, todos los ratones responden a al menos un péptido nativo y 13/14 de los ratones vacunados respondieron a dos o más péptidos nativos afines. Cabe destacar que, cada péptido nativo se reconoció al menos una vez en un ratón vacunado.

Número de ratones que responden/número total de ratones

Prueba t significativa (<0,05)

VbxQ16+ Vbx016+ Auxiliar adyuvante

auxiliar+IFA auxiliar+Montanide (IFA o Montanide)

CEA188 8/9 5/5 13/14

CEA188L9 8/9 5/5 13/14

HER-2Neu246 1/9 0/5 1/14

HER-_2Neu246A12/9 0/5 2/14

Tert444 8/9 4/5 12/14

Tert444A1 9/9 5/5 14/14

MageA273A6 2/9 0/5 2/14

MageA273l6 1/9 2/5 3/14

MageA273V6 1/9 1/5 2/14

MageA273L9 7/9 5/5 12/14

Vbx-016 9/9 4/4 14/14

Dos o más

epítopos 8/9 5/5 13/14

nativos

Tabla 5: Prueba del cuadripéptido de SEQ ID NO: 23 en ratones transgénicos HLA-B*0702 Ejemplo 3: Evaluación de respuesta inmunitaria de linfocitos T mediante la inducción de linfocitos T citotóxicos específicos a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas in vitro con los dipéptidos seleccionados en ratones transgénicos HLA-B*0702.

Para evaluar si la unión presente en el poMpéptido CEAi88L9/TERT444Ai/MAGE273L9/HER-2/neu246Ai validada en ratones transgénicos se procesa eficazmente en seres humanos, se estimularon PBMC humanas con cada dipéptido (CEA¹⁸⁸L⁹/TERT⁴⁴⁴A¹, t ErT⁴⁴⁴A¹/MAGE²⁷³L⁹y MAGE²⁷³L⁹/HER-²/neu²⁴⁶A¹) según el protocolo descrito en los métodos. El reconocimiento de los péptidos nativos afines se evaluó midiendo células productoras de IFNy específicas a partir de las CD8+ estimuladas por el dipéptido, divididas en 4 grupos para la prueba. Se realizó la prueba t cuando el número medio de puntos obtenidos para el péptido de interés fue superior al número medio de puntos obtenidos con el péptido irrelevante; cuando el valor de la prueba t fue inferior a 0,05, el resultado se consideró positivo significativamente y se destaca en gris en la siguiente tabla.

En cada donante, las CTL consiguieron reconocer tanto péptidos optimizados como nativos afines (y los cuatro nativos para el péptido compartido MAGE-A²⁷³L⁹), confirmando que cada unión está bien procesada por el proteasoma.

Donante 596 HER-7M1HN3M irr HER-2Neu246 2NeU246A1 MageA273A6 MageA2731i6 MageA273V6 MageA273L9 Grupo 1 275 310 264 318 300 311,4 283,3 prueba t 0,057 0,06 0,04998 0,04 0,31 Grupo 2 341 331 318 370 353 375,8 343,7 prueba t 0,12 0,33 0,12 0,46 Grupo 3 360 434 329 398 384 413 373 prueba t 0,00005 0,08 0,054 0,02 0,18 Grupo 4 306 351 316 357 337 365 329 prueba t 0,004 0,27 0,005 0,03 0,001 0,049 Donante 3628

7T5HN3M irr Tert444 Tprt444A1 MageA273i6 MageA273A6 MageA273V6 MageA273L9 Grupo 1 115 120 117 139 104 121 120 prueba t ^{0 , 3 7}0,46 0,06 0,35 0,37 Grupo 2 138 146 137 141 142 139 132 prueba t 0,22 0,41 0,39 0,47

Grupo 3 126 146 154 168 147 160 1,29 prueba t 0,03 0,03 0,01 0,01 0,01 0,40 Grupo 4 116 1,25 121 136 116 126 106 prueba t 0,15 0,32 0,03 0,49 0,13

Donante 8647

7C1T5M irr CEA¹⁸⁸CEA¹⁸⁸L⁹Tert444 Tert444A1

Grupo 1 100 81 91 93 81

prueba t

Grupo 2 108 126 108 123 121

prueba t 0,04 0,48 0,04 0,07

Grupo 3 109 136 119 131 117

prueba t 0,003 0,08 0,01 0,18

Grupo 4 93 101 91 102 101

prueba t 0,11 0,15 0,14

Tabla 6: Cultivo de PBMC de donantes sanos con HLA-B7 estimuladas con cada uno de los dipéptidos incluidos en el polipéptido SEQ ID NO: 23, irr: péptido irrelevante, las pruebas t positivas se resaltan en gris

Ejemplo 4: Inducción de linfocitos T citotóxicos específicos a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas in vitro con Vbx-016.

Finalmente, se utilizó Vbx-016 para estimular PBMC humanas de un donante sano.

Se realizó la prueba t cuando el número medio de puntos obtenidos para el péptido de interés fue superior al número medio de puntos obtenidos con el péptido irrelevante; cuando el valor de la prueba t fue inferior a 0,05, el resultado se consideró positivo significativamente y se destaca en gris en la siguiente tabla. Se indujo una respuesta poliespecífica y se reconocieron varios péptidos nativos por las CTL inducidas, confirmando que el polipéptido está bien procesado por el proteasoma y que la respuesta inducida es poliespecífica.

Donante irr C1 C1M T5 T5M M1A6 M1A6 M1V6 M1M HN3 HN3

802 M

Grupo 1 310 302 347 354 300 329 325 306 298 336 318 prueba t 0,03 0,002 0,16 0,17 0,02 10,33 Grupo 2 388 380,9 371,14 382 357 361 365 360,0 365,4 376 341 prueba t

Grupo 3 329 314 356 380 361 357 370 360 355 350 322 prueba t 0,01 0,0003 0,004 0,005 0,001 0,02 0,06 0,02

369 343 396 377 368 377 372 357 358 357 334 Grupo 4

prueba t 0,02 I 0,18 0,19 0,39

Tabla 7: Cultivo de PBMC de donantes sanos con HLA-B7 estimuladas con el polipéptido SEQ ID NO: 23, irr: péptido irrelevante, los resultados positivos de las pruebas t se resaltan en gris

REFERENCIAS

Anderson K, Cresswell P, Gammon M, Hermes J, Williamson A, Zweerink H (1991) Endogenously synthesized peptide with an endoplasmic reticulum signal sequence sensitizes antigen processing mutant cells to class I-restricted cell-mediated lysis. J Exp Med 174: 489-492

Babon A, Almunia C, Boccaccio C, Beaumelle B, Gelb MH, Menez A, Maillere B, Abastado JP, Salcedo M, Gillet D (2005) Cross-presentation of a CMV pp65 epitope by human dendritic cells using bee venom PLA2 as a membrane binding vector. FEBS Lett 579: 1658-1664

Bungener L, Idema J, ter Veer W, Huckriede A, Daemon T, Wilschut J (2002) Virosomes in vaccine development: induction of cytotoxic T lymphocyte activity with virosome-encapsulated protein antigens. J Liposome Res 12: 155-163

Butts C, Murray N, Maksymiuk A, Goss G, Marshall E, Soulieres D, Cormier Y, Ellis P, Price A, Sawhney R, Davis M, Mansi J, Smith C, Vergidis D, Ellis P, MacNeil M, Palmer M (2005) Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology: oficial journal of the American Society of Clinical Oncology 23: 6674-6681

Doling AM, Ballard JD, Shen H, Krishna KM, Ahmed R, Collier RJ, Starnbach MN (1999) Cytotoxic T-lymphocyte epitopes fused to anthrax toxin induce protective antiviral immunity. Infect Immun 67: 3290-3296

Fayolle C, Ladant D, Karimova G, Ullmann A, Leclerc C (1999) Therapy of murine tumors with recombinant Bordetella pertussis adenylate cyclase carrying a cytotoxic T cell epitope. J Immunol 162: 4157-4162

Gross DA, Graff-Dubois S, Opolon P, Cornet S, Alves P, Bennaceur-Griscelli A, Faure O, Guillaume P, Firat H, Chouaib S, Lemonnier FA, Davoust J, Miconnet I, Vonderheide RH, Kosmatopoulos K (2004) High vaccination efficiency of low-affinity epitopes in antitumor immunotherapy. J Clin Invest 113: 425-433

Haicheur N, Bismuth E, Bosset S, Adotevi O, Warnier G, Lacabanne V, Regnault A, Desaymard C, Amigorena S, Ricciardi-Castagnoli P, Goud B, Fridman WH, Johannes L, Tartour E (2000) The B subunit of Shiga toxin fused to a tumor antigen elicits CTL and targets dendritic cells to allow MHC class I-restricted presentation of peptides derived from exogenous antigens. J Immunol 165: 3301-3308

Ishioka GY, Fikes J, Hermanson G, Livingston B, Crimi C, Qin M, del Guercio MF, Oseroff C, Dahlberg C, Alexander J, Chesnut RW, Sette A (1999) Utilization of MHC class I transgenic mice for development of minigene DNA vaccines encoding multiple HLA-restricted CTL epitopes. J Immunol 162: 3915-3925

Minev B, Hipp J, Firat H, Schmidt JD, Langlade-Demoyen P, Zanetti M (2000) Cytotoxic T cell immunity against telomerase reverse transcriptase in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 4796-4801

Ofuji S, Ikeda M, Tsujitani S, Ikeguchi M, Kaibara N, Yuasa I, Mitsuya K, Katoh M, Ito H (1998) Expression of MAGE-1, MAGE-2 and MAGE-3 genes in human gastric carcinomas; lack of evidence for cytotoxic effects in cases with simultaneous expression of MAGE-3 and HLA-A2. Anticancer Res 18: 3639-3644

Ogata S, Uehara H, Chen A, Itzkowitz SH (1992) Mucin gene expression in colonic tissues and cell lines. Cancer Res 52: 5971-5978

Oukka M, Manuguerra JC, Livaditis N, Tourdot S, Riche N, Vergnon I, Cordopatis P, Kosmatopoulos K (1996) Protection against lethal viral infection by vaccination with nonimmunodominant peptides. J Immunol 157: 3039

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende la secuencia SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA (SEQ ID NO: 23).

2. El polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA (SEQ ID NO: 23).

3. El polipéptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una secuencia de señal de translocación al retículo endoplasmático en su extremo N-terminal.

4. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente ubiquitina en su extremo C-terminal.

5. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que induce una respuesta de linfocitos T CD8+ contra al menos dos epítopos seleccionados del grupo que consiste en CEA-ias, HER-2/neu246, TERT⁴⁴⁴, MAGE²⁷³A6, MAGE²⁷³V6 y MAGE²⁷³16, en una mayoría de ratones HHD vacunados con dicho polipéptido.

6. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que induce una respuesta de linfocitos T CD8+ contra al menos dos epítopos, seleccionados del grupo que consiste en CEA¹⁸⁸, HER-2/neu246, TERT⁴⁴⁴, MAGE²⁷³A6, MAGE²⁷³V6 and MAGE²⁷³16 en un ensayo in vitro con PBMC humanas de donantes sanos de HLA-B*0702.

7. Una célula dendrítica aislada, cargada con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un complejo que comprende un vector de liberación peptídico y un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y/o una célula dendrítica según la reivindicación 7 y/o un complejo según la reivindicación 8.

10. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y/o una célula dendrítica según la reivindicación 7 y/o un complejo según la reivindicación 8, para utilizarlo en inmunoterapia del cáncer en un paciente que tiene un fenotipo de HLA-B*0702.

11. Un kit de partes que comprende al menos una dosis de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y al menos una dosis de adyuvante.

12. Un kit de partes que comprende al menos dos dosis de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. El kit de partes según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, que comprende de 6 a 20 dosis de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. El kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que cada dosis de polipéptido comprende entre 0,5 y 10 mg de polipéptido.