ES2767294T3

ES2767294T3 - Lisinas de Acinetobacter

Info

Publication number: ES2767294T3
Application number: ES15812120T
Authority: ES
Inventors: Vincent Fischetti; Raymond Schuch; Rolf Lood; Benjamin Winer
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2020-06-17
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: NZ728429A; JP6818349B2; RU2017102306A; RU2725809C2; CA2953446A1; BR112016030580B1; CN106659748A; BR112016030580A2; WO2015200783A2; EP3164146A2; US20190345467A1; EP3164146B1; AU2015279705A1; WO2015200783A3; KR102441211B1; AU2015279705B2; KR20170026505A; GB201701187D0; RU2017102306A3; US10590403B2

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

Description

DESCRIPCIÓN

Lisinas de Acinetobacter

Campo

Composiciones que comprenden una enzima lítica bacteriófaga específica para Acinetobacter y un método para tratar infecciones por Acinetobacter.

Antecedentes

El complejo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus y otros miembros de esta especie frecuentemente colonizan la piel humana sin dañarla. Sin embargo, las lesiones en la piel causadas por raspaduras, heridas o cirugías, pueden dar como resultado una infección por Acinetobacter en la herida, sangre, tejidos blandos y sistema nervioso central. Dado que > 80 % de las especies de Acinetobacter también son resistentes a múltiples fármacos (MDR, por sus siglas en inglés) (al menos a tres clases de antibióticos), estas infecciones pueden dar lugar a resultados clínicos adversos, que incluyen altas tasas de morbilidad y mortalidad, hospitalización prolongada y gastos sustanciales de atención médica. El personal militar y los atletas tienen un mayor riesgo de lesiones (desde abrasiones de la piel hasta heridas graves) que serían susceptibles a la infección por especies de Acinetobacter, por lo tanto, los métodos para eliminarlos rápida y eficazmente reducirían o eliminarían las complicaciones posteriores. Se han informado brotes causados por Acinetobacter MDR en hospitales de todo el mundo; más recientemente, se han convertido en un problema grave en las instalaciones médicas militares. Debido a su MDR, las infecciones por Acinetobacter son difíciles de tratar, por lo que las infecciones por estos organismos generalmente dan como resultado un mal desenlace. Por lo tanto, se necesitan nuevas y mejores formas de controlar este patógeno.

Se han informado cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a todos los antibióticos conocidos. Actuando en sinergia con este perfil de resistencia emergente es la asombrosa capacidad de A. baumannii para sobrevivir durante períodos prolongados en todo el entorno hospitalario, lo que potencia su capacidad de propagación nosocomial. El organismo comúnmente se dirige a sujetos hospitalizados, que están gravemente enfermos con roturas en la integridad de la piel y en la protección de las vías respiratorias. Como tales, la neumonía adquirida en el hospital sigue siendo la infección más común causada por A. baumannii. Sin embargo, recientemente, las infecciones implican el sistema nervioso central, la piel y los tejidos blandos, y los huesos han surgido como altamente problemáticos para determinadas instituciones. Debido a este problema de resistencia, se deben desarrollar nuevos métodos para controlar estos patógenos.

Se han identificado agentes antimicrobianos conocidos como lisinas codificadas por bacteriófagos. Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y se estima que hay 106 especies distintas de bacteriófagos. Las lisinas de bacteriófagos son generalmente específicas de género o especie, es decir, una lisina del fago de Staphylococcus aureus puede tener actividad solo contra Staphylococcus aureus proporcionando un enfoque terapéutico dirigido. En algunos casos, las lisinas pueden tener actividad contra varios géneros o especies.

Los bacteriófagos infectan a sus bacterias hospedadoras para producir más partículas víricas. Al final del ciclo reproductivo se enfrentan a un problema, cómo liberar el fago de la progenie atrapado dentro de la bacteria. Resuelven este problema produciendo una enzima llamada "lisina" que degrada la pared celular de las bacterias infectadas para liberar el fago de la progenie. El sistema lítico consiste en una holina y al menos un peptidoglucano hidrolasa, o lisina, capaz de degradar la pared celular bacteriana. Por lo general, la holina se expresa en las últimas etapas de la infección del fago formando un poro en la membrana celular, permitiendo que la(s) lisina(s) acceda(n) al peptidoglucano de la pared celular, dando como resultado la liberación del fago de la progenie. De forma significativa, la lisina añadida exógenamente, en ausencia de una holina, puede lisar la pared celular de las células sanas y no infectadas, produciendo un fenómeno conocido como "lisis desde afuera".

Lood et al., (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 vol. 59, n.° 4, 1983-1991) describieron una nueva lisina de fagos capaz de destruir a la bacteria gramnegativa resistente a múltiples fármacos Acinetobacter baumannii en un modelo de bacteriemia en ratones.

Sumario

Recientemente se han identificado, purificado y caracterizado varias lisinas de fagos que atacan específicamente a la bacteria Acinetobacter. Este es un gran avance ya que la mayoría de las lisinas tienen actividad antibacteriana solo contra las bacterias grampositivas. Las lisinas de fagos purificadas de la presente invención son muy adecuadas para una variedad de aplicaciones tales como el tratamiento de infecciones bacterianas y desinfección.

La presente invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana. La presente invención también proporciona un polipéptido conjugado que comprende: un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un fragmento del polipéptido; y un péptido antimicrobiano conjugado con el polipéptido o el fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido conjugado tiene actividad antibacteriana.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones. La presente invención proporciona una composición de acuerdo con las reivindicaciones, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una infección bacteriana. La presente invención también proporciona una composición según las reivindicaciones que comprende un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una herida quirúrgica irrigando la herida quirúrgica con la composición.

La presente invención proporciona además una composición de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en la inhibición de la formación de o en la alteración de una biopelícula bacteriana en una cantidad eficaz para destruir bacterias en la biopelícula.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A. Micrografía electrónica de tinción negativa que muestra el fago inducido por la cepa 1790 de A. baumannii.

Figura 1B. Micrografía electrónica de tinción negativa que muestra el fago inducido por la cepa 1794 de A. baumannii

Figura 1C. Micrografía electrónica de tinción negativa que muestra el fago inducido por la cepa 1796 de A. baumannii

Figura 2. Una imagen representativa de la actividad del clon de lisina en el aclaramiento de A. baumannii vivo embebido en el agar.

Figura 3. Esquema de secuencias de aminoácidos de lisinas clonadas que muestran cuatro clases de actividad lítica: i) familia de glucosil hidrolasa, ii) lisozimas de la placa de base de fagos, iii) lisozima autolisinas y iv) lisinas. Figura 4. Alineación de secuencias de nucleótidos para lisinas clonadas.

Figura 5. Alineación de secuencias de aminoácidos para lisinas clonadas.

Figura 6. Es un gráfico que muestra la actividad lítica de 21 construcciones clonadas contra trece aislados clínicos de A. baumannii diferentes.

Figura 7A y 7B. Se observan ampollas en la membrana citoplasmática que contienen contenidos citosólicos de células de A. baumannii después del tratamiento con F307 (flechas).

Figura 8. Micrografía electrónica de barrido de biopelículas de 3 días de la cepa 1791 de A. baumannii antes y después del tratamiento con el polipéptido F307.

Figura 9. Es un gráfico que muestra la reducción en el recuento bacteriano en piezas de catéter completas con biopelícula Acinetobacter después del tratamiento con el polipéptido F307.

Figura 10. Es un gráfico que muestra la supervivencia de ratones infectados con A. baumannii tratados con el polipéptido F307 frente al control.

Figura 11. Secuencia de F307, polipéptido P307 sin y con extensión corta (P307Ex).

Figura 12. La Figura 12A es un gráfico que compara las actividades bactericidas in vitro de P307, P307SQ-8C y P307^AE_⁸contra las cepas número 1791, S5 y ATCC17978 de A. baumannii. La Figura 12B muestra la actividad bactericida comparativa in vivo de P307, P307SQ-8C y P307CS-8 contra las cepas número 1791 y S5 de A. baumannii. La Figura 12C muestra una comparación de la actividad bactericida comparativa in vivo de P307SQ-8C y P307CS-8 contra las cepas número 1791, S5 y ATCC17978 de A. baumannii.

Figura 13. Las actividades bactericidas in vitro de p 307 y P307SQ-8C contra la cepa número 1791 de A. baumannii para investigar el pH óptimo (13A) y NaCl óptimo (13B). Se usaron las mismas condiciones, excepto las variables, con Tris-HCI 50 mM, pH 7,5 para determinar la concentración óptima (13C) y la cinética de destrucción (13D). Las barras de error muestran la desviación estándar y la línea horizontal negra marca el límite de detección.

Figura 14. Es un gráfico que muestra la sensibilidad de diferentes especies bacterianas a P307 y P307SQ-8C. Las barras de error muestran la desviación estándar y la línea horizontal negra marca el límite de detección.

Figura 15. Las Figuras 15A y 15B son gráficos que muestran las actividades bactericidas de P307 y P307SQ-8C contra la fase logarítmica y la fase estacionaria de la cepa número 1791 de A. baumannii (15A) y la fase de biopelícula (15B).

Figura 16. La Figura 16 muestra los efectos citotóxicos de P307 y P307SQ-8C medidos por la supervivencia de los linfocitos B (16A) y la hemólisis (16B).

Figura 17. La Figura 17A muestra el efecto de DTT a 0, 0,1 y 1 mM sobre la actividad de P307 y P307SQ-8C. La Figura 17B muestra el efecto de la sustitución del resto de cisteína terminal de P307SQ-8C con alanina (P307SQ-8A).

Figura 18. Es un gel de desplazamiento de ADN que muestra el desplazamiento para el péptido control y P307. Figura 19. Las Figuras 7A-C muestran imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión de la cepa número 1791 de A. baumannii: control no tratada (19A), tratada con 300 |jg / ml de P307SQ-8C durante 5 minutos (19B) y durante 2 horas (19C). Aumento, X2600 (izquierda, barra de escala = 2 jm ) y X5000 (derecha arriba y abajo, barra de escala = 0,5 jm ). La Figura 7D muestra la actividad bactericida de P307SQ-8C sobre bacterias gramnegativas K. pneumoniae y E. coli a pH 7,5 y 8,8.

Figura 20. Muestra la permeabilidad de la membrana de las cepas número 1791 y S5 de A. baumannii tratadas con P307 y P307SQ-8C.

Figura 21. Muestra la inhibición de la actividad bactericida de P307 o P307SQ-8C por el eliminador de radicales hidroxilo, La tiourea y la condición anaeróbica.

Figura 22. Muestra el efecto del tratamiento de una infección de la piel con polimixina B y P307SQ-8C.

Descripción detallada

La presente invención proporciona polipéptidos que tienen actividad antibacteriana y para métodos para usar los polipéptidos divulgados. Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un/a", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa.

Los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende", "contiene", "que contiene" y similares tienen el significado atribuido en la ley de Patentes de los Estados Unidos; son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos o etapas del método adicionales no enumerados. Las expresiones tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado atribuido en la ley de Patentes de los Estados Unidos; permiten la inclusión de ingredientes o etapas adicionales que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. Las expresiones "consiste en" y "que consiste en" tienen el significado asignado en la ley de Patentes de los Estados Unidos; concretamente, que estos términos son cerrados

En el presente documento se describen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, o al menos un 91 %, o al menos un 92 %, o al menos un 93 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

En el presente documento se describen polipéptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, o al menos un 91 %, o al menos un 92 %, o al menos un 93 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

En el presente documento se describen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, o al menos un 85 %, o al menos un 90 %, o al menos un 91 %, o al menos un 92 %, o al menos un 93 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %, o un 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento está conjugado con un péptido antimicrobiano para producir un polipéptido conjugado y el polipéptido conjugado tiene actividad antibacteriana.

El polipéptido descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %o un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento está conjugado con un péptido antimicrobiano para producir un polipéptido conjugado y el polipéptido conjugado tiene actividad antibacteriana.

En el presente documento se describen polipéptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, o al menos un 85 %, o al menos un 90 %, o al menos un 91 %, o al menos un 92 %, o al menos un 93 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %, o un 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento está conjugado con un péptido antimicrobiano para producir un polipéptido conjugado y el polipéptido conjugado tiene actividad antibacteriana.

El polipéptido descrito en el presente documento puede consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 94 %, o al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 %o un 100 %, de identidad con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:21, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento está conjugado con un péptido antimicrobiano para producir un polipéptido conjugado y el polipéptido conjugado tiene actividad antibacteriana.

En algunas realizaciones, el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) en la que al menos un amino es cisteína y 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos del péptido antimicrobiano están sustituidos de forma conservativa. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos del péptido antimicrobiano están sustituidos de forma conservativa. En otras realizaciones, el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44). En aún otras realizaciones, el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) en la que 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos del péptido antimicrobiano están sustituidos de forma conservativa y el péptido antimicrobiano consiste en 8 aminoácidos. En otras realizaciones más, el péptido antimicrobiano consiste en la secuencia de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO:44).

En algunas realizaciones, el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO:50) en la que al menos un amino es cisteína y 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos del péptido antimicrobiano están sustituidos de forma conservativa. En otras realizaciones, el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO:50). En aún otras realizaciones, el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO:50) en la que 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos del péptido antimicrobiano están sustituidos de forma conservativa y el péptido antimicrobiano consiste en 8 aminoácidos. En otras realizaciones más, el péptido antimicrobiano consiste en la secuencia de aminoácidos CSQRQSES (SEQ ID NO:50).

En algunas realizaciones, el extremo C del polipéptido o del fragmento está conjugado con el péptido antimicrobiano. En otras realizaciones, el extremo C del polipéptido o del fragmento está conjugado con el extremo N del péptido antimicrobiano. En aún otras realizaciones, el extremo N del polipéptido o fragmento está conjugado con el péptido antimicrobiano. En otras realizaciones más, el extremo N del polipéptido o fragmento está conjugado con el extremo C del péptido antimicrobiano. Para cualquiera de las realizaciones, el péptido antimicrobiano puede conjugarse con el polipéptido o fragmento a través de un enlace peptídico.

Otra realización de los péptidos de la presente divulgación es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRKSQSRESQA (SEQ ID NO: 45). Otra realización es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos NAKDYKGAAAEFPKWNKAGGRVLAGLVKRRKCSQRQSES (SEQ ID NO:51).

En algunas realizaciones los polipéptidos, fragmentos de polipéptidos o polipéptidos conjugados tienen actividad antibacteriana contra una bacteria gramnegativa. En algunas realizaciones, La bacteria gramnegativa es del género Acinetobacter.

En algunas realizaciones los polipéptidos, fragmentos de polipéptidos o polipéptidos conjugados tienen actividad antibacteriana contra E. coli, P. aeruginosa o A. baumannii.

En algunas realizaciones los polipéptidos, fragmentos de polipéptidos o polipéptidos conjugados tienen actividad antibacteriana contra una bacteria grampositiva. En algunas realizaciones, la bacteria grampositiva es S. aureus o B. anthracis.

En algunas realizaciones, El polipéptido se liofiliza.

EN la Tabla 1 de proporcionan polipéptidos específicos.

Tabla 1

P307SQ-8C y P307Ex se usan indistintamente en el presente documento.

La invención también proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos, fragmentos de polipéptidos o polipéptidos conjugados de la invención. En algunas realizaciones, las composiciones son composiciones farmacéuticas, que comprenden un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración tópica. En otras realizaciones, la composición farmacéutica se formula para suministro subcutáneo. En aún otras realizaciones, la composición farmacéutica se formula para suministro intravenoso. En otras realizaciones más, la composición farmacéutica se formula para suministro oral.

En algunas realizaciones, la composición comprende además un antibiótico. Ejemplos de antibióticos adecuados incluyen, pero sin limitación, amoxicilina, augmentine, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, penicilina G, penicilina V, cefalexina, cefazedona, cefuroxima, loracarbef, cemetazol, cefotetán, cefoxitina, ciprofloxacino, levaquin y floxacino, tetraciclina, doxiciclina o minociclina, gentamicina, amikacina y tobramicina, claritromicina, azitromicina, eritromicina, daptomicina, neomicina, Kanamicina o estreptomicina.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un agente de coagulación.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se liofiliza.

En el presente documento se describen métodos para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, fragmento de polipéptido o polipéptido conjugado de la invención, y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se describe un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la invención, y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se describe un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un fragmento de polipéptido de la invención, y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable.

El método puede ser un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un polipéptido conjugado de la invención, y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable.

El método puede ser un método para tratar una infección bacteriana y el tratamiento es un tratamiento terapéutico que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un polipéptido conjugado de la invención, y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable. El sujeto puede tener una infección bacteriana que no responde a otras modalidades de tratamiento. Por ejemplo, la infección bacteriana puede ser resistente a uno o más antibióticos. La infección bacteriana puede ser una infección de una herida.

El método puede ser un método para tratar profilácticamente a un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un polipéptido conjugado de la invención, y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el sujeto se ha sometido o se está sometiendo a cirugía y la herida quirúrgica se pone en contacto con una composición farmacéutica de la invención. En determinadas realizaciones, la herida quirúrgica se irriga con la composición farmacéutica antes del cierre de la herida. En otras realizaciones, la composición farmacéutica se aplica a la herida después del cierre, por ejemplo, la composición farmacéutica se aplica al área suturada o grapada de la herida.

Un método puede comprender administrar una composición farmacéutica de la invención que se administra en combinación con un antibiótico. El método puede comprender administrar por vía tópica una composición farmacéutica de la invención. El método puede comprender administrar una composición farmacéutica de la invención por vía subcutánea. El método puede comprender administrar una composición farmacéutica de la invención por inyección intravenosa. El método puede comprender administrar una composición farmacéutica de la invención por vía oral.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en una forma de dosificación unitaria. En otras realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de una crema, pomada, bálsamo, gel, pastilla para chupar, pulverizador o aerosol.

En el presente documento se describen métodos para tratar una infección bacteriana que comprende inhibir la formación de o alterar una biopelícula bacteriana que comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una composición que comprende un polipéptido, fragmento de polipéptido o polipéptido conjugado de la invención en una cantidad eficaz para destruir bacterias en la biopelícula.

Se proporcionan, adicionalmente, métodos de desinfección de un artículo que comprende poner en contacto el artículo con una composición que comprende un polipéptido, fragmento de polipéptido o polipéptido conjugado de la invención con el artículo durante un tiempo suficiente para desinfectar el artículo. El artículo puede ser una superficie dura. En algunas realizaciones, el artículo es una encimera, teclado, instrumento quirúrgico o dispositivo médico.

Se proporcionan, adicionalmente, métodos para inhibir la formación de o alterar una biopelícula bacteriana en un artículo que comprende poner en contacto el artículo con un polipéptido, fragmento de polipéptido o polipéptido conjugado de la invención, en una cantidad eficaz para destruir las bacterias en la biopelícula.

En el presente documento de describen artículos de fabricación que contienen una composición que comprende un polipéptido, fragmento de polipéptido o polipéptido conjugado de la invención. El artículo de fabricación puede ser una botella de aerosol que contiene un polipéptido, fragmento de polipéptido o polipéptido conjugado de la invención.

El artículo de fabricación puede contener una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, fragmento de polipéptido o polipéptido conjugado de la invención y un transportador, agente tamponante o conservante. El artículo de fabricación puede ser un vial. El artículo de fabricación puede ser un dispositivo de suministro. La composición contenida en el artículo de fabricación puede estar liofilizada.

Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los polipéptidos de la divulgación y aún obtener una molécula que tenga características similares al polipéptido (p. ej., una sustitución de aminoácidos conservativa). Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida apreciable de actividad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica de ese polipéptido, se pueden realizar determinadas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos y, sin embargo, obtener un polipéptido con propiedades similares.

Tales sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Sustituciones ejemplares que toman en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen (resto original: sustitución ejemplar): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gin, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gin: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gin), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu). Las realizaciones de esta divulgación contemplan así equivalentes funcionales o biológicos de un polipéptido como se establece anteriormente. En particular, los polipéptidos pueden incluir variantes que tienen aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 95 % de identidad de secuencia con el polipéptido de interés.

"Identidad" como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas, determinada por comparación de las secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente mediante algoritmos conocidos bien conocidos en la técnica. Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles públicamente. El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando un software de análisis (es decir, Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, Madison Wis.) que incorpora el algoritmo de Needelman y Wunsch, (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) (p. ej., NBLAST y XBLAST).

La identidad se puede medir como "identidad local" o "identidad global". La identidad local se refiere al grado de relación de secuencia entre polipéptidos según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La identidad global se refiere al grado de relación de secuencia de un polipéptido en comparación con la longitud completa de un polipéptido de referencia. A menos que se especifique otra cosa, como se usa en el presente documento, identidad significa identidad global. Los porcentajes de identidad global en el presente documento, se calculan utilizando el algoritmo ClustalW utilizado a través del software Mac Vector, utilizando la configuración predeterminada; tanto para la identidad local como global.

Producción de polipéptidos

Los polipéptidos de la presente invención se pueden producir por cualquier método conocido. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden producir en bacterias que incluyen, sin limitación, E. coli, o en otro sistema existente para polipéptidos (p. ej., Bacillus subtilis, sistemas de expresión de baculovirus que usan células Sf9 de Drosophila, sistemas de expresión de hongos filamentosos o levaduras, sistemas de expresión de células de mamífero), o pueden sintetizarse químicamente.

Si el polipéptido se va a producir en bacterias, p. ej., E. coli, la molécula de ácido nucleico que codifica el péptido también puede codificar una secuencia líder que permite la secreción del péptido maduro de la célula. Por lo tanto, la secuencia que codifica el péptido puede incluir la secuencia pre y la secuencia pro de, por ejemplo, un péptido ST bacteriano de origen natural. El péptido secretado, maduro puede purificarse a partir del medio de cultivo.

La secuencia que codifica un péptido descrito en el presente documento se puede insertar en un vector capaz de suministrar y mantener la molécula de ácido nucleico en una célula bacteriana. La molécula de ADN puede insertarse en un vector de replicación autónoma (los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, pGEM3Z y pcDNA3, y derivados de los mismos). El vector puede ser un vector de ADN bacteriano o bacteriófago tal como bacteriófago lambda o M13 y derivados de los mismos. La construcción de un vector que contiene un ácido nucleico descrito en el presente documento puede ir seguida por la transformación de una célula hospedadora tal como una bacteria. Los hospedadores bacterianos adecuados incluyen, pero sin limitación, E. coli, B subtilis, Pseudomonas, Salmonella. La construcción genética también incluye, además de la molécula de ácido nucleico codificante, elementos que permiten la expresión, tal como un promotor y secuencias reguladoras. Los vectores de expresión pueden contener secuencias de control transcripcional que controlan la iniciación transcripcional, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Los expertos en la materia conocen una variedad de secuencias de control transcripcional. El vector de expresión también puede incluir una secuencia reguladora de la traducción (p. ej., una secuencia 5' no traducida, una secuencia 3' no traducida o un sitio interno de entrada al ribosoma). El vector puede ser capaz de replicarse de forma autónoma o puede integrarse en el ADN del hospedador para garantizar la estabilidad durante la producción de péptidos.

En el presente documento se describen los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:45, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

El ácido nucleico puede codificar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:45, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

El ácido nucleico puede codificar un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:45, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

El ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID N0:41, o SEQ ID NO:42.

El ácido nucleico puede consistir en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.

En el presente documento se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:45, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

El vector de expresión puede comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:45, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

El vector de expresión puede comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, Se Q ID NO:2, SEQ ID No :3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:45, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

El vector de expresión puede comprender un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.

El vector de expresión puede comprender un ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.

La Tabla 2 la SEQ ID NO: de nucleótidos y los polipéptidos que codifican.

Tabla 2

(continuación)

El ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en el presente documento también puede fusionarse con un ácido nucleico que codifica una etiqueta de afinidad peptídica, p. ej., glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, proteína A, etiqueta FLAG, hexa-histidina, etiqueta myc o la etiqueta de gripe HA, para facilitar la purificación. La etiqueta de afinidad o fusión indicadora se une al marco de lectura del péptido de interés para el marco de lectura del gen que codifica la etiqueta de afinidad de manera que se genera una fusión traduccional. La expresión del gen de fusión da como resultado la traducción de un péptido único que incluye tanto el péptido de interés como la etiqueta de afinidad. En algunos casos donde se utilizan etiquetas de afinidad, la secuencia de ADN que codifica un sitio de reconocimiento de proteasas se fusionará entre los marcos de lectura para la etiqueta de afinidad y el péptido de interés.

También pueden usarse las construcciones genéticas y los métodos adecuados para la producción de formas inmaduras y maduras de los polipéptidos y variantes descritos en el presente documento en sistemas de expresión de proteínas que no sean bacterias, y bien conocidos por los expertos en la materia, para producir polipéptidos en un sistema biológico.

Los polipéptidos y sus variantes pueden sintetizarse por el método de fase sólida usando un sintetizador de péptidos automatizado. Por ejemplo, el péptido se puede sintetizar en resina Cyc(4-CH2 Bxl)-OCH2-4-(oximetil)-fenilacetamidometilo usando un programa de doble acoplamiento. Los péptidos también se pueden sintetizar mediante muchos otros métodos, incluida la síntesis en fase sólida utilizando la protección tradicional FMOC (es decir, el acoplamiento con DCC-HOBt y la desprotección con piperdina en DMF).

Composiciones Terapéuticas y Profilácticas y Su Uso

En el presente documento se describen métodos de tratamiento que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención. El sujeto es un ser humano u otro animal, incluidos, sin limitación, primates tales como monos y chimpancés; animales de ganado tal como vacas, cerdos, caballos o gallinas; y animales de compañía tales como perros, gatos y roedores. En una realización específica, el sujeto es un ser humano. En otra realización específica, el sujeto es un mamífero no humano. En una realización, los polipéptidos se administran como el único agente antibacteriano. En otra realización, los polipéptidos se administran en combinación con uno o más agentes antibacterianos diferentes.

Los métodos de administración de las composiciones farmacéuticas divulgadas pueden ser orales o parenterales e incluyen sin limitación, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarticular, intrasinovial, subcutánea, intranasal, epidural, tópica y oral. Los compuestos pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central mediante cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. Se puede emplear también la administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de formación de aerosol. En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en la zona que necesite tratamiento, tal como uso tópico sobre la piel; se puede utilizar cualquier método adecuado conocido en la técnica.

En un aspecto de la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de la presente invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una infección bacteriana. Se puede formular una composición farmacéutica para tratamiento tópico. Se puede formular una composición farmacéutica para infecciones sistémicas.

Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de la invención y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitación, disolventes, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma farmacéutica particular deseada. Dichos transportadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como transportadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición también puede contener agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o agentes tamponantes de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de una solución, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, pastilla para chupar, cápsula, polvo, parches para administración tópica y similares. Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada, loción o crema adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más transportadores. Transportadores adecuados para la administración tópica incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, compuestos de polioxietilen-polioxipropileno, cera emulsionante, polisorbato 60, cera de ésteres de etilo, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. La composición puede formularse como un supositorio con aglutinantes y transportadores tradicionales como los triglicéridos. La formulación oral puede incluir transportadores convencionales, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico, etc. Un experto en la materia está bien versado en la formulación de agentes terapéuticos. Véase p. ej., Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Md. (2000); Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición (Mack Publishing Company, 1995).

En el presente documento, también se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado a dicho recipiente o recipientes hay un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de agentes farmacéuticos o productos biológicos, aviso que refleja (a) la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para la administración a seres humanos, (b) instrucciones de uso, o ambas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar información adicional a un experto en la materia sobre cómo fabricar y usar los polipéptidos descritos en el presente documento, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) sin embargo, deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, el peso molecular es el peso molecular promedio y la temperatura está en grados centígrados.

Ejemplo 1

Identificación de polipéptidos que tienen actividad antibacteriana.

Se obtuvieron quince aislados clínicos de A. baumannii de un hospital de Nueva York. Las cepas de A. baumannii se aislaron y se trataron con mitomicina C para inducir la inducción de profagos. Los sobrenadantes se recogieron y la fase se precipitó con polietilenglicol (PEG). Los sobrenadantes de tres de los aislados de A. baumannii se examinaron mediante ME con tinción negativa y se tomaron imágenes del fago (Figuras 1A, 1B, y 1C).

El ADN del fago se separó de los compuestos precipitados conjuntamente mediante electroforesis en gel de agarosa y extracción de ADN de alto peso molecular. A partir de este ADN, se construyó una biblioteca aleatoria de enlazadores expresables (E-LASL) como se describe anteriormente. (Schmitz JE. et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74:1649-1652.) En resumen, para todas las muestras, se fragmentaron 100 ng de ADN con la enzima de restricción TSP509I (secuencia consenso AATT) Después de la extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol, el ADN se unió a 40 ng de secuencia enlazadora, con un saliente 5 ' complementario (AATTc g Gc TCGAG, donde el saliente está subrayado (SEQ ID NO: 46). La mezcla de unión se usó como plantilla para la PCR basada en Taq usando el cebador dirigido al enlazador CCATGACTCGAGCCGAATT (SEQ ID NO: 47).

Los insertos amplificados se unieron en el plásmido pBAD inducible por arabinosa usando el kit de expresión pBAD TOPO® TA; Invitrogen, según las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se transformaron en E. Coli TOP10 competente (Invitrogen). Para determinar qué clones tenían actividad lítica, las E. coli se colocaron en placas sobre agar LB suplementado con 100 |jg / ml de ampicilina y sangre de oveja desfibrinada al 5 %. Después del cultivo durante la noche a 37 °C, las placas se colocaron en un recipiente sellado que se unió a la salida de un nebulizador comercial. La arabinosa nebulizada se bombeó continuamente al recipiente durante 1 hora. Las placas se devolvieron a 37 °C y se identificaron colonias que desarrollaron una zona de hemólisis en el agar de sangre circundante. Los clones seleccionados se sembraron en estrías en placas de LB-ampicilina (que carecen de arabinosa) por separado y se dejaron propagar sin expresión inducida. (Schmitz JE, et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol.76:7181-7187).

Para determinar la actividad destructora de A. baumannii, se realizó una exploración secundaria esencialmente como se describe en Schmitz JE, et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol.76:7181-7187. Los resultados se sembraron en estrías como parches de aproximadamente 1 cm por 2 cm sobre placas de LB-ampicilina suplementadas con arabinosa al 0,2 %. Después de la incubación durante la noche a 37 °C, las placas se expusieron al vapor de cloroformo para destruir y permeabilizar cualquier E. coliaún viable. Después, los parches se cubrieron con agar blando fundido que contenía A. baumannii y se observaron las zonas de aclaramiento. Se identificaron veintiún clones positivos que exhibían una zona clara alrededor del clon. La Figura 2 muestra una exploración representativa de la actividad del clon de lisina en el aclaramiento de A. baumannii vivo embebido en el agar.

Los insertos de los cierres positivos se secuenciaron y compararon con las secuencias en la base de datos de proteínas NCBI. Las alineaciones mostraron que entre los 21 clones hay cuatro clases de actividad lítica: i) nueve pertenecían a la familia de las glicosil hidrolasas, ii) siete eran lisozimas de la placa de base de fagos, iii) dos eran lisozima autolisinas y iv) tres eran lisinas. (Fig. 3). Para facilitar la referencia en el presente documento, independientemente de la clase, los polipéptidos codificados por estas secuencias se denominan "lisinas". La Figura 4 muestra una alineación de secuencias basada en la similitud de las secuencias de nucleótidos que codifican los 21 clones. La Figura 5 muestra una alineación de secuencias basada en la similitud de las secuencias polipeptídicas de los 21 clones.

Ejemplo 2

Actividad de clones positivos.

Se exploraron veintiuna construcciones diferentes para determinar la actividad contra trece aislados clínicos de A. baumannii diferentes. Las construcciones se expresaron de forma recombinante en E. coli. Las células se cultivaron a 30 °C a 200 rpm, y cuando alcanzaron la fase logarítmica media se indujeron mediante la adición de arabinosa al 0,2 %. La inducción continuó durante la noche. Por la mañana, las células se centrifugaron, se lavaron 3x con tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, antes de homogeneizarse en un homogeneizador Emulsiflex. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación (16000 g, 45 min) y el lisado se pasó a través de un filtro estéril de 0,22 urn para generar el lisado bruto.

A. baumannii cultivado durante la noche en TSB, se mezcló con TSB de agar suave a 50 °C y se vertió en una placa de agar TSB como una capa de agar superior. La placa se dejó solidificar a temperatura ambiente. Los lisados crudos (10 ul) se añadieron a una placa de agar suave con A. baumannii, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente cada día, mientras se mantenían a 4 °C durante el resto del tiempo. Las placas se incubaron hasta que las zonas de aclaramiento fueron visibles (4-5 días). Se puntuó una zona de aclaramiento más grande que la mancha original del lisado crudo. El número sobre cada lisina indica cuántas manchas para las cuales esa lisina fue la más eficaz.

Los resultados se muestran en la Figura 6. La construcción de lisina se muestra en el eje x y el porcentaje de cepas de Acinetobacter lisadas se muestra en el eje y. Los números sobre cada barra indica el número de cepas para las cuales esa lisina fue la más eficaz, ningún número indica una cepa. Tal como se puede observar, La lisina F307 lisaba aproximadamente el 90 % de las cepas ensayadas y era la más activa contra siete cepas.

Ejemplo 3

Lisis de A. baumannii por F307.

La Figura 7 muestra Micrografías Electrónicas de Transmisión representativas de células de la cepa 1791 de A. baumannii después del tratamiento con el polipéptido F307. Las micrografías muestran que F307 provocó lisis a través de la extrusión de la membrana citoplasmática hacia el exterior de la célula. (Véase la Figura 7, flechas). Se iniciaron dos cultivos de 100 ml de la cepa 1791 de A. baumannii en medio BHI y se cultivaron en un matraz de 500 ml durante 1,5 h a 37 °C, 200 rpm. Las células se centrifugaron después y se lavaron una vez con tampón PBS 1X. Después, se resuspendieron en 1,2 ml de PBS 1X. Se añadió EDTA a una concentración final de 250 pM a cada muestra. A la muestra experimental, 300 pl de lisina (~ 1,2 mg de concentración final) e incubaron el control (EDTA solo) y experimental (EDTA lisina F307) a 25 °C. Los puntos de tiempo se tomaron a los 0,5, 1, 5, 10, 15 y 30 minutos. Las reacciones se interrumpieron y las células se fijaron usando Gluteraldhído al 2,5 % en tampón c Ac (cacodilato de sodio 10 mm, CaCI20,1 m, pH 6,5).

Ejemplo 4

Efecto del polipéptido F307 sobre las biopelículas de A. baumannii en catéteres in vitro e in vivo.

Tratamiento in vitro de A. baumannii 1791 adherente a catéter con lisina F307

Se cortó el tubo de catéter (CareFusion Ref número 72023E) usando un bisturí estéril en secciones de 3 pulgadas de largo. Se usó un cultivo durante la noche de A. baumannii 1791 para inocular 1:1000 a 50 ml de Glucosa con TBS al 0,2 % (-1X105 UFC / ml). Cada tubo de catéter de 3 pulgadas se sembró con 300-350 pl del cultivo diluido 1:1000. Después se sujetaron los catéteres y se colocaron en recipientes de plástico en una incubadora a 37 °C durante 3 días para permitir la formación de biopelículas. Después de los 3 días, los catéteres se lavaron dos veces bien con PBS o con tampón de fosfato de sodio pH 7,5 y después se añadieron 300-350 pl de F307 al tubo (~ 1 mg de concentración final). Después se sujetaron los catéteres. Se tomaron catéteres en los puntos de tiempo 0, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora. Los catéteres se lavaron dos veces con fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 y se cortaron en trozos pequeños. Se colocaron en un tubo ependorff de 1,5 ml y se añadieron 500 pl de tampón NaP 50 mM pH 7,5. Los tubos se sonicaron durante 20 minutos y se agitaron con formación de vórtice durante 1 minuto. Las muestras se diluyeron en serie y se colocaron en placas 20 pl sobre un cuadrante de una placa de agar BHI y se incubaron a 37 °C durante la noche. Las UFC se calcularon a la mañana siguiente.

Se observó una disminución aproximada de 4 en escala logarítmica en el número de unidades formadoras de colonias (UFC de A. baumannii después de 30 minutos de tratamiento. La Tabla 3 muestra los recuentos de UFC. La Figura 8 muestra micrografías de Barrido Electrónico de biopelículas de 3 días de la cepa 1791 de A. baumannii antes y después del tratamiento con 250 pg de polipéptido F307.

Tabla 3. Tratamiento de bio elículas de A. baumannii en catéteres.

Ejemplo 5

Modelo de Catéter en Ratones: Se sembraron varias secciones de tubo de catéter de 3 pulgadas (1:1000) con la cepa 1791 de A. baumannii. Las biopelículas de A. baumannii se formaron como se describe anteriormente. Se afeitó la espalda de veinte ratones BALB / C, se esterilizó la espalda y luego se hizo una incisión para colocar una sección de 1 pulgada del catéter con una biopelícula ya formada debajo de la dermis de la espalda. Las incisiones se cerraron con grapas. Después de 24 horas, se inyectaron 250 pl de F307 (1 mg) (n = 10) o 250 pl de vehículo de control (n = 10) directamente en el catéter que estaba debajo de la dermis del ratón. El tratamiento se repitió después de 4 horas. Después de 3 horas, se retiraron los catéteres de los ratones y se analizaron como se describe en el Experimento 4. La Figura 9 muestra la reducción de los recuentos bacterianos en aproximadamente 2 en escala logarítmica en el tratamiento de ratones con el polipéptido F307 en comparación con el control.

Ejemplo 6

El polipéptido F307 rescata a los ratones de la muerte después de una inyección letal de A. baumannii.

Veintidós ratones C57BL / 6 recibieron 108 UFC de cepa de A. baumannii por vía intraperitoneal (IP). Dos horas más tarde, dos ratones fueron sacrificados y los órganos se examinaron como se describe a continuación, diez ratones se inyectaron IP con 1 mg de F307 y diez ratones se inyectaron IP con vehículo de control. Los animales tratados mostraron un 50 % de supervivencia con esta dosis de lisina, mientras que los ratones control mostraron solo un 10 % de supervivencia 14 días después de la infección (Figura 10).

Los órganos de los dos ratones que fueron sacrificados después de la infección se examinaron para confirmar que los órganos estaban infectados con A. baumannii en el momento del tratamiento con el polipéptido F307. Se diseccionaron el hígado, bazo, riñón y corazón de los ratones. Los órganos se homogeneizaron después en 500 pl de PBS 1X. Se hicieron diluciones y se colocaron en placas sobre placas con Brain Heart infusion (BHI). Las placas se incubaron a 37 °C durante una noche. Se contó el número de unidades formadoras de colonias. Los ratones de control se sacrificaron a las dos horas y mostraron Acinetobacter en todos los órganos examinados, lo que indica que los órganos estaban infectados con A. baumannii en el momento del tratamiento.

Ejemplo 7

El polipéptido P307 (SEQ ID NO: 43) se ensayó por duplicado contra 18 aislados clínicos de cepas de A. baumannii. Las cepas de A. baumannii se cultivaron en ON para alcanzar la fase estacionaria. Las células se lavaron 3X en Tris 20 mM, pH 7,5 y se resuspendieron en el mismo tampón a una DO (595 nm) de aproximadamente 0,7. A estas células, se añadió P307 (250 ug / ml) o un volumen correspondiente de tampón, y la mezcla se dejó incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se hicieron diluciones de las mezclas y se colocaron en placas sobre placas de Agar con TSB para el recuento posterior de unidades formadoras de colonias.

El tratamiento con el polipéptido P307 dio como resultado una disminución de 1 a 8 en escala logarítmica en la viabilidad bacteriana, frente al control, después de la incubación durante 60 minutos con 250 |jg de P307. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Cuando se comparó P307 con el polipéptido F307 de longitud completa (SEQ ID NO: 1), el polipéptido P307 tuvo mayor actividad.

Tabla 4. Actividad de P307 contra 18 ce as de A. baumannii.

Ejemplo 8

La adición de un péptido de extensión corta dio como resultado una mayor actividad antibacteriana de P307.

El péptido SQSRESQC (SEQ ID NO: 44) procede del virus de la hepatitis C y se ha demostrado que tiene actividad antimicrobiana contra bacterias grampositivas y gramnegativas. Se conjugó esta secuencia con P307 (P307Ex) para determinar su efecto sobre la actividad. La secuencia de F307, p307 y P307Ex (SEQ ID n O: 1,43 y 45 respectivamente) se proporcionan en la figura 11, donde una parte de la secuencia de F307 está subrayada para mostrar la ubicación de P307 y una parte de la secuencia de P307 está doblemente subrayada para mostrar la ubicación de la secuencia antimicrobiana.

P307 y P307Ex se analizaron por duplicado contra seis cepas bacterianas. La acidez antibacteriana se midió como se describe en el Ejemplo 5. El tratamiento con P307Ex dio como resultado una disminución de 3,2 en escala logarítmica en A. baumannii 1791, mientras que el tratamiento con P307 dio como resultado una disminución de 2,9 en escala logarítmica que demuestra que la adición del péptido antimicrobiano aumentó la actividad de P307. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

continuación

P307 y P307Ex se ensayaron para determinar la actividad contra la cepa 1791 de A. baumannii, E. coli, cepa PA01 de P. aeruginosa, cepa RN4220 de S. aureus, cepa 8325 de S. aureus y B. anthracis. Tal como se muestra en la Tabla 6, P307 y P307 fueron más activos contra A. baumannii y B. anthracis.

Tabla 6. P307 P307Ex contra otras es ecies bacterianas.

Ejemplo 9

P307 no es tóxico para los linfocitos B o los glóbulos rojos.

P307 se mezcló con glóbulos rojos para determinar si causaría lisis. No se observó lisis con 200 |jg de P307. Cuando se ensayó P307 para la lisis de una línea de linfocitos B, se encontró que tenía un ligero efecto sobre el número de células después de 24 horas. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Table 7 % viable

Los péptidos usados en los Ejemplos 10-20 se sintetizaron químicamente.

Los péptidos se crearon usando un sintetizador de péptidos Symphony™ de Protein Technologies (PTI Tucson, Arizona, EE. UU.) en resina Wang (alcohol p-alcoxi-bencílico) acoplada previamente (Bachem, Torrance, CA, EE. UU.). Los vasos de reacción se cargaron a 25 jM y los péptidos se alargaron usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Anaspec, San Jose, CA, EE.UU.) (1997. Standard Fmoc protocols. 289:44-67). La desprotección de la amina se realizó con piperidina al 20 % (Sigma-Aldrich) en NMP (N-metilpirrolidinona). Se realizaron reacciones de acoplamiento repetitivas usando HATU / CI-HOBT 0,6 M (hexafluorofosfato de azabenzotriazol tetrametiluronio / 6-cloro-1-hidroxibenzotriazol) (P3 Biosystems, Shelbyville, KY, EE. UU.) y NMM 0,4 M (N-metilmorfolina) usando NMP (EMD) como solvente primario (1989. New Coupling Reagents in Peptide Chemistry 30:1927-1930.). La escisión de la resina y la desprotección de la cadena lateral se lograron transfiriendo a un matraz de fondo redondo de 100 ml y se hicieron reaccionar con 4,0 ml de ácido trifluoroacético concentrado, grado de secuenciación (Fisher) con triisopropilsilano (Fluka), agua desgasificada y 3,6-dioxa-1,8-octaneditiol (DODT, Sigma-Aldrich) en una proporción de 95:2:2:1 durante un período de tiempo de 6 horas. Esto se siguió por filtración en columna a un matraz de fondo redondo de 50 ml y el volumen de TFA se redujo a 2 ml usando un evaporador rotatorio. Se realizó una precipitación de éter convencional en los péptidos individuales mediante la transferencia a un tubo de falcon de 50 ml que contenía 40 ml de terc-butil metil éter frío (TBME, Sigma-Aldrich). Las muestras se colocaron en un baño de hielo durante 2 horas para ayudar a la precipitación, seguido de la formación de sedimento mediante centrifugación (3300 rpm, 5 min). El exceso de éter se eliminó por aspiración al vacío y los sedimentos peptídicos se dejaron secar durante una noche en una campana extractora. Los sedimentos peptídicos secos se redisolvieron en acetonitrilo al 20 % y 10 ml de agua de grado HPLC se submuestrearon para LC / MS y se liofilizaron. Todos los productos brutos se analizaron posteriormente mediante AquLC ™ UPLC de fase inversa (Waters Chromatography, Milford, MA, EE. UU.) utilizando una columna Waters BEH C18. La integridad del péptido individual se verificó mediante espectrometría de masas por electroaspersión en tándem utilizando un sistema de espectrómetro ThermoFinnigan LTQ™ (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). La cromatografía preparativa se realizó en una columna preparativa Vydac C18 RP en una HPLC Waters 600 Prep. Se recogieron fracciones individuales en intervalos de 30 segundos, caracterizadas usando LC / MS y se liofilizaron las fracciones que contenían el producto deseado. Estas se almacenaron a -20 °C hasta que se resuspendieron en agua Milli-Q esterilizada en autoclave para varios ensayos. Las soluciones madre se almacenaron a 4 °C. Los péptidos se resumen con sus secuencias de aminoácidos, puntos isoeléctricos (pi) y pesos moleculares (PM) en la tabla 8.

Tabla 8

Ejemplo 10

Comparación de las actividades bactericidas in vitro de péptidos de la presente divulgación.

Para determinar las actividades bactericidas in vitro de los péptidos, P307, P307AE-8, P307SQ-8C y P307CS-8, las bacterias se trataron con los péptidos durante 2 horas a temperatura ambiente. Las células sobrevivientes se diluyeron en serie y se colocaron en placas sobre placas de agar con TSB para determinar la actividad.

Las actividades bactericidas de 50 |jg / ml de los péptidos, P307, P307AE-8 y P307SQ-8C se compararon tratando cepas número 1791, S5 y ATCC17978 de A. baumannii. P307SQ-8C fue el más activo, reduciendo aproximadamente 106 ufc / ml de bacterias por debajo del límite de detección (<10 ufc / ml). P307 fue ligeramente más activo que P307AE-8, pero ambos péptidos indujeron una disminución de aproximadamente 3,8 unidades logarítmicas en bacterias viables (Fig. 2A). Para investigar cómo los ocho aminoácidos, SQSRESQC, contribuyeron a la mayor actividad de P307SQ-8C, se añadió la misma concentración molar de péptido SQSRESQC que 50 jg / ml de P307 por sí mismo o en combinación con P307 a las cepas número 1791 y S5 de A. baumannii. Las actividades se compararon con 50 jg / ml de P307 y P307SQ-8C. La combinación fue solamente tan activa como P307 mientras que el péptido SQSRESQC solo no tiene actividad (Fig. 2B). Por lo tanto, el enlace es esencial para la alta actividad bactericida de P307SQ-8C. A continuación, se investigó la importancia de la secuencia y la composición. Al codificar los últimos ocho aminoácidos en P307SQ-8C, se sintetizó P307CS-8 con una adición C-terminal de CSQRQSES a P307. Las actividades de P307SQ-8C y P307CS-8 fueron comparables (Fig. 2C). Las barras de error muestran la desviación estándar y la línea horizontal negra marca el límite de detección. Por lo tanto, se llegó a la conclusión de que la actividad superior de P307SQ-8C deriva de la composición de los últimos ocho aminoácidos, independientemente del orden de los últimos ocho aminoácidos. Para una investigación adicional, SE UTILIZÓ P307SQ-8C porque es el más activo y comparamos su actividad con P307.

Ejemplo 11

Actividades bactericidas de P307 y P307SQ-8C

Se investigaron los efectos del pH y el NaCI sobre las actividades in vitro de P307 y P307SQ-8C. La cepa NÚMERO 1791 de A. baumannii se trató con 50 |jg / ml de péptidos para analizar cada condición. Se utilizaron dos sistemas de tampón (fosfato de sodio y Tris-HCI) para PROBAR pH 6,8, 7,5, 8,0 y 8,8. Los péptidos fueron más activos en Tris-HCI y un pH más alto provocó una mejor destrucción (Fig. 13A). Por lo tanto, se decidió continuar con los experimentos in vitro de los presentes inventores con Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, que se aproxima al pH fisiológico. Las actividades de ambos péptidos fueron inversamente proporcionales a la concentración de NaCl (Fig. 13B). A continuación, la titulación de P307 y la cinética de destrucción de P307 y P307SQ-8C se investigaron tratando la cepa número 1791 de A. baumannii. La actividad de P307 fue dependiente de la concentración, comenzando desde 4 jg / ml (Fig. 13C). P307SQ-8C actuó más rápido que P307, dando como resultado una disminución de aproximadamente 3,2 unidades logarítmicas ya en el punto de tiempo de 5 minutos (Fig. 13D). No hubo diferencias en las actividades de ninguno de los péptidos a temperatura ambiente o 37 °C (datos no mostrados). A partir de estos experimentos de caracterización in vitro, se decidió que las condiciones experimentales óptimas de los presentes inventores eran Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, 50 jg / ml de péptidos y 2 horas a temperatura ambiente (22-25 °C), a menos que se indique otra cosa.

Ejemplo 12

A continuación, se investigaron los espectros bactericidas in vitro de P307 y P307SQ-8C contra diferentes especies bacterianas, A. baumannii (cepas números 1775, 1776, 1777, 1788, 1789, 1790, 1791, 1792, 1793, 1794, 1796, 1797, 1798, 1799, ATCC 17978 y S1, S3, D5), Bacillus anthracis (ASterne), Escherichia coli (DH5a), Pseudomonas aeruginosa (PA01), Staphylococcus aureus (RN4220) y dos cepas de Klebsiella pneumonia (ATCC 700603 y ATCC10031). Estas especies bacterianas se trataron con 50 jg / ml de P307 o P307SQ-8C en Tris-HCI 50 mM, pH 7,5 durante 2 horas a temperatura ambiente para investigar la especificidad de los péptidos. Entre las bacterias ensayadas, las cepas de A. baumannii fueron consistentemente más sensibles a los péptidos, mostrando una disminución promedio de 2,7 y 6,2 unidades logarítmicas con P307 y P307SQ-8C, respectivamente. Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus son moderadamente sensibles. P307 y P307SQ-8C produjeron una disminución promedio de aproximadamente 1,3 y 2,9 unidades logarítmicas, respectivamente, para estas bacterias. Sin embargo, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae son resistentes a ambos péptidos (Fig. 14).

Ejemplo 13.

Además, para investigar las actividades de los péptidos contra A. baumannii en diferentes fases de crecimiento, se compararon las sensibilidades de la cepa número 1791 en la fase logarítmica, fase estacionaria y estado de biopelícula. Las bacterias en la fase logarítmica (3 horas después de la inoculación del cultivo durante la noche 1:100 en medios nuevos) y la fase estacionaria (cultivo durante la noche) se trataron con 50 jg / ml de P307 o P307SQ-8C durante 2 horas a temperatura ambiente. Las células sobrevivientes se diluyeron en serie y se colocaron en placas sobre placas de agar con TSB para determinar ufc/ml. (figura 15A). Las biopelículas de A. baumannii se establecieron incubando aproximadamente 10⁵ufc / ml de la cepa número 1791 en TSB con glucosa al 0,2 % dentro de catéteres de aproximadamente 2,5 cm de largo durante 72 horas a 37 °C. Después se lavaron los catéteres para eliminar las células planctónicas y se trataron con 250 jg / ml de P307 o P307SQ-8C. Después de 2 horas y 24 horas a temperatura ambiente, la biopelícula se alteró por completo y las células sobrevivientes se resuspendieron para sembrarse en placas y contarse para determinar la eficacia de destrucción de los péptidos contra la biopelícula in vitro, (figura 15B). Los organismos en fase logarítmica fueron ligeramente más sensibles a P307 que en fase estacionaria (aproximadamente una disminución de 3,7- frente a 2,4 unidades logarítmicas). Parece que no hay tal diferencia con P307SQ-8C (Figura 15A). Las biopelículas fueron las más resistentes de todas las fases de crecimiento. Las biopelículas se trataron con 250 jg / ml de P307 o P307SQ-8C durante 2 o 24 h. Después de 2 horas, se observó una disminución de aproximadamente 3 y 4 unidades logarítmicas en ufc / ml con P307 y P307SQ-8C, respectivamente. Después de 24 horas, P307 produjo una disminución adicional de aproximadamente 1,3 unidades logarítmicas, mientras que P307SQ-8C no lo hizo (figura 15B).

Ejemplo 14

Para comparar la eficacia de los péptidos P307 y P307SQ-8C con algunos antibióticos clínicamente utilizados, se realizó un ensayo de concentración inhibitoria mínima para dos cepas de A. baumannii, número 1791 y ATCC17978. Se usó el método de dilución por microtitulación para determinar las CIM de levofloxacino, ceftazidima, polimixina B, P307 y P307SQ-8C para las cepas número 1791, número 1798, S5 y ATCC17978 de A. baumannii. Para los antibióticos, se incluyeron diluciones en serie de 1,5-2 veces (tres inferiores y tres superiores) de las CIM determinadas por Etest Lood R, et al., 2015, Antimicrob. Agents Chemother. 59:1983-1991.). Para los péptidos, se analizaron diluciones en serie de dos veces (500-31,25 jg / ml). Los cultivos durante la noche se resuspendieron a DO⁶⁰⁰de 0,001 (aproximadamente 10⁵ufc / ml) en caldo Mueller-Hinton (pH 7,9). Los antibióticos o péptidos se agregaron hasta alcanzar 100 j l finales para cada dilución. Se permitió que las bacterias crecieran a 37 °C durante 24 horas a 220 rpm. La absorbancia a 595 nm se leyó después en un lector SpectraMax Plus (Molecular Devices). Las CIM se determinaron como las concentraciones más bajas de agentes antimicrobianos que inhiben completamente el crecimiento bacteriano. Se utilizó Alamar®Blue para confirmar los datos obtenidos a partir de DO⁵⁹⁵. Los experimentos se realizaron al menos dos veces por duplicado.

Las cepas presentaron un grado variable de sensibilidad a todos los agentes antimicrobianos (Tabla 9).

Tabla 9

P307SQ-8C tiene una CIM menor que P307, que está de acuerdo con la actividad de destrucción in vitro (Fig. 2 y 3).

Ejemplo 15

Efectos citotóxicos de P307 y P307SQ-8C medidos por la supervivencia de los linfocitos B y la hemólisis.

Los linfocitos B humanos obtenidos de un paciente con fiebre reumática en e1Hospital Universitario Rockefeller se cultivaron en medio RPMI suplementado con suero bovino al 10 %, penicilina y estreptomicina. Las células se cosecharon por centrifugación a baja velocidad, se lavaron una vez en medio y se volvieron a suspender en medio calentado previamente a una concentración de 10⁷células / ml, según se determinó mediante pruebas de exclusión con azul de tripano. Los péptidos (P307, P307SQ-8C y melitina) se diluyeron en serie (80-0,3125 j M) en medios de cultivo y se añadieron a 5x10⁴células vivas. Las células se incubaron durante 1 hora a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5 % de CO², después de lo cual se tiñeron (ensayo de proliferación celular no radiactivo CellTiter 96; Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se incubaron durante 4 horas adicionales, antes de agregar una solución de Solubilización / Parada, y se incubaron durante la noche. La absorbancia a 570 nm se midió en un lector SpectraMax Plus (Molecular Devices). Las reacciones se llevaron a cabo dos veces por triplicado y los datos representativos se muestran como media ± desviación estándar.

Se recogió sangre humana de un individuo sano en un tubo de EDTA y se recogieron glóbulos rojos (RBC) a través de centrifugación a baja velocidad. Las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en una solución de RBC al 10 %. P307 y P307SQ-8C se diluyeron en serie en PBS (80-0,3125 j M). se utilizaron PBS y Triton X-100 al 1 % como controles negativos y positivos, respectivamente. Las muestras se mezclaron y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Se recogió el sobrenadante y se registró la absorbancia a 405 nm a través del lector SpectraMax Plus (Molecular Devices). Las reacciones se llevaron a cabo dos veces por triplicado y los datos representativos se muestran como media ± desviación estándar.

Se incubaron diluciones en serie de péptidos con aproximadamente 5x10⁴linfocitos B vivos durante 1 hora a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO², y se usó melitina como control positivo. El ensayo de Proliferación Celular No Radiactivo CellTiter 96® (Promega) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para cuantificar la supervivencia de los linfocitos B. Los glóbulos rojos (RBC) se incubaron con diluciones en serie de los péptidos y la liberación de hemoglobina en el sobrenadante se midió por DO⁴⁰⁵para determinar la hemólisis. Se usó Triton X-100 como control positivo. Las barras de error muestran la desviación estándar.

Los péptidos se probaron para determinar su citotoxicidad utilizando linfocitos B y glóbulos rojos (RBC) humanos. A diferencia del control positivo de melitina, las membranas de los linfocitos B no se ven afectadas por P307 o P307SQ-8C. Incluso a la concentración más alta probada (80 j M), la viabilidad de las células permanece igual que el control del tampón (figura 16A). Análogamente, la integridad de los glóbulos rojos tampoco se ve afectada por ninguno de los péptidos en comparación con el control positivo Triton X-100 (figura 16B).

Ejemplo 16

Una porción de P307SQ-8C (aproximadamente el 25 %) se desplaza al doble del peso molecular teórico en comparación con P307SQ-8A, que se desplaza a 4,3 kD (datos no mostrados). Para determinar la importancia de la formación de enlaces disulfuro para la alta actividad de P307SQ-8C, se compararon las actividades bactericidas de P307 y P307SQ-8C en presencia de ditiotreitol (DTT) 0, 0,1 y 1 mM. La cepa número 1791 de A. baumannii se trató con 50 jg / ml de P307 o 10 jg / ml de P307SQ-8C en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 durante 2 horas a temperatura ambiente. Las células sobrevivientes se diluyeron en serie y se colocaron en placas sobre placas de agar con TSB. P307SQ-8C se vuelve menos activo con una mayor concentración de DTT, mientras que la actividad de P307 aumenta ligeramente (figura 17A). Para confirmar aún más la importancia de la formación de disulfuro para la actividad de P307SQ-8C, se sintetizó P307SQ-8A con la última cisteína cambiada a alanina. Las cepas número 1791 y ATCC17978 de A. baumannii se trataron con 10 jg / ml de cada péptido. Los ensayos bactericidas de P307SQ-8C y P307SQ-8A mostraron que el primero es ligeramente más activo que el último (figura 17B). Estos resultados en conjunto señalaron que parte de la actividad superior de P307SQ-8C deriva de la formación de enlaces disulfuro entre dos moléculas.

Ejemplo 17

A continuación, se investigó si P307 se une al ADN, dadas las cargas positivas en los péptidos (carga neta de 7). El péptido P307 se mezcló con ADN a diferentes relaciones péptido: ADN (0:1-15:1) y se incubó durante 1 hora antes de analizarlo en un gel de agarosa. En comparación con el péptido de control positivo, no se observó ningún cambio en el peso molecular para P307 en ninguna de las proporciones de péptido a ADN ensayadas (Fig. 18).

Ejemplo 18

Debido a que los péptidos no parecían destruir las bacterias al interactuar con el ADN, se investigó si afectan la membrana bacteriana mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, por sus siglas ne inglés). La cepa número 1791 de A. baumannii se trató con tampón (control) o 300 |jg / ml de P307SQ-8C durante 5 minutos o 2 horas. La comparación de las imágenes por TEM de las muestras revela una alteración de la membrana interna y cambios en la densidad intracelular (Figuras 19A, B y C). Además, se descubrió que las bacterias resistentes a pH 7,5 (figura 3) eran sensibles a P307 a pH 8,8, incluidas E. coli y K. pneumoniae (figura 19D). Debido a que las cargas en el péptido no varían a medida que el pH cambia de 7,5 a 8,8, se razonó que los cambios se producen en la membrana bacteriana. A un pH más alto, la membrana bacteriana se carga más negativamente, permitiendo que los péptidos cargados positivamente establezcan interacciones iónicas más fuertes.

Ejemplo 19

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se planteó la hipótesis del siguiente mecanismo de acción: P307SQ-8C interactúa con la membrana bacteriana para ingresar a la célula y, en el proceso, altera la membrana citoplasmática. La permeabilización de la membrana es más eficaz cuando el péptido se dimeriza. La alteración induce la producción de especies reactivas de oxígeno, tal como los radicales hidroxilo, que alteran el contenido intracelular. Para investigar esta hipótesis, se determinó la alteración de la membrana utilizando el ensayo de absorción SYTOX® Green.

^{Los cultivos de bacterias durante la noche se lavaron en Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, y se resuspendieron a una DO}600 ^de0,3 (aproximadamente 107 ufc / ml). Se añadió Benzonase® nucleasa (25 U / ml) (Novagen) y SYTOX® Green (1 jM ) (nitrógeno) a las células bacterianas, y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se añadieron péptidos (50 jg / ml; P307 14,7 jM y P307SQ-8C 11,6 jM , y se usó melitina (14,7 jM ) (Sigma) como control. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR) se midieron en un lector SpectraMax Plus (Molecular Devices) a temperatura ambiente (ex: 485 nm, em: 520 nm) durante 2 horas. Las reacciones se llevaron a cabo dos veces por duplicado y los datos representativos se muestran como media ± desviación estándar.

Ambos péptidos permeabilizan las membranas de las bacterias sensibles, dando lugar a un aumento de las señales fluorescentes del tinte SYTOX® Green a medida que se une al ADN intracelular (figura 20). La formación de radicales hidroxilo se investigó tratando las bacterias con P307 y P307SQ-8C en presencia de un eliminador de radicales hidroxilo, tiourea. La polimixina B se incluyó como control, ya que se ha indicado que su actividad bactericida depende parcialmente de la vía de destrucción por radicales hidroxilo. La tiourea (300 mM) inhibe completamente la actividad de P307 y P307SQ-8C (Fig. 21A). Sin embargo, no se puede ignorar que la tiourea afecta las actividades por otras vías. Por tanto, las actividades bactericidas también se compararon en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Debido a que A. baumannii es una bacteria estrictamente aeróbica, E. coli se usó para el ensayo bactericida con Tris-HCl 50 mM, pH 8,8. Las actividades de ambos péptidos se inhibieron completamente por la condición anaeróbica (Fig. 21B). Aunque no se pueden descartar otras posibilidades, tal como el efecto sobre el mecanismo de transporte dependiente del oxígeno, los resultados actuales respaldan la hipótesis de los presentes inventores de formación de radicales hidroxilo.

Ejemplo 20

Se investigó la actividad in vivo de P307SQ-8C usando el modelo de piel en ratones porque la infección de la piel es una ruta común de enfermedad por A. baumannii. Las espaldas de 40 ratones hembra CD-1 (de 6 a 8 semanas de edad; Charles River Laboratories) se afeitaron con una rasuradora eléctrica. Se aplicó Nair™ (loción depilatoria para cuerpo y piernas, aloe y lanolina) en las áreas afeitadas para eliminar el vello restante. Después, las áreas se desinfectaron con toallitas con alcohol, y se indujo la abrasión de la piel por un esparadrapo. Después se marcó un área de - 1 cm2 de la piel abrasado con esparadrapo y se infectó con 10 j l de aproximadamente 108 ufc / ml de cepa número 1791 de A. baumannii. Se permitió que las bacterias colonizaran durante 16-18 horas, después de lo cual el área infectada se dejó sin tratar o se trató con 200 jg de P307SQ-8C o 2 jg de polimixina B durante 2 horas. Para recoger las bacterias restantes en la piel, se sacrificaron los ratones y la piel infectada se procesó en 500 j l de PBS durante 1 minuto en un Stomacher® 80 Biomaster usando una microbolsa (Seward Ltd., Reino Unido). La solución se diluyó en serie y se colocó en placas sobre agar LB que contenía 4 jg / ml de levofloxacina y 12 jg / ml de ampicilina para la selección. Las ufc / ml resultantes de cada animal se muestra como un punto y las barras horizontales representan los medios. Ambos tratamientos reducen significativamente la carga bacteriana

(valor p = 0,0023, ANOVA unidireccional ordinaria) (figura 22).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> The Rockeffer University Office of Techonology Transfer

<120> LISINAS DE ACINETOBACTER

<130> 235932-373399

<150> 62/017.618

<151> 26/06/2014

<160> 53

<170> Patentln versión 3.5

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 1

Val Lys Thr Ser Asn Pro Gly Val Asp Leu lie Lys Gly Phe Glu Gly

1 5 10 15

Leu Arg Leu Lys Ala Tyr Asp Asp Gly Val Gly Val Trp Thr lie Gly

20 25 30

Phe Gly Thr lie Lys Tyr Pro Asn Gly Val Arg Val Lys Lys Gly Asp

35 40 45

Thr Cys Thr Glu Ser Gln Ala Glu Glu Tyr Leu Arg Asn Asp Leu Val 50 55 60

Val Phe Glu Ser Ala lie Asn Arg Leu Val Lys Val Pro Leu Asn Gln

65 70 75 80

Asn Gln Phe Asp Ala Leu Ala Ser Phe Thr Tyr Asn Leu Gly Glu Gly 85 90 95

Asn Leu Ser lie Ser Thr Leu Leu Lys Lys Leu Asn Ala Lys Asp Tyr

100 105 110

Lys Gly Ala Ala Ala Glu Phe Pro Lys Trp Asn Lys Ala Gly Gly Arg

115 120 125

Val Leu Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Lys Ala Glu Met Glu Leu Phe 130 135 140

Leu Lys

145

<210>2

<211> 189

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<220>

<221> MOD_RES

<222> (105)..(105)

<223> METILACIÓN, Abu

<400>2

<210>3

<211> 185

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 3

Leu Lys Glu Thr Glu Met Asn lie Glu Lys Tyr Leu Asp Glu Leu lie

1 5 10 15

Lys Arg Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asn Pro Ala Asp Arg Gly Gly Ala

20 25 30

Thr Lys Tyr Gly lie Thr Gln Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Trp Asn

35 40 45

Gly Asn Met Lys Asp Leu Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Lys 50 55 60

Lys Gln Tyr Trp Thr Ala Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Ala Val Ser

65 70 75 80

Ser Ala Val Ala Glu Glu Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly Thr 85 90 95

Gly Phe Ala Lys Pro Leu Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn

100 105 110

Gln Gly Lys Ala Gly Tyr Ala Asp Leu Glu Val Asp Gly Val Tyr Gly

115 120 125

Ser Ala Thr Leu Gly Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Ser Lys Arg Gly Lys 130 135 140

Glu Gly Glu Lys Val Leu Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln

145 150 155 160

Arg Tyr lie Glu lie Cys Glu Arg Asn Pro Lys Gln Glu Gln Phe Phe 165 170 175

Tyr Gly Trp lie Ala Asn Arg lie Gly

180 185

<210>4

<211> 86

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 4

Leu Pro Ser Thr Thr Arg Ala Glu Leu Ser Gln Thr Glu Tyr Asp Leu

1 5 10 15 Tyr Leu Asp Phe Thr Tyr Gln Tyr Gly Val Pro Thr Phe Ala Lys Ser

20 25 30

Ser Met Leu Lys His Leu Lys Ala Gly Gln Tyr Lys Ala Ala Cys Asp

35 40 45

Ser Leu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Ala Lys Arg Asp Cys Ser Val Arg 50 55 60

Lys Asn Gly Cys Tyr Gly Val Trp Thr Arg Gln Val Glu Arg His Ala

65 70 75 80

Lys Cys lie Gly Ala Gln

85

<210>5

<211> 195

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400>5

Met Pro Pro Ser Gly Gly Phe Leu His Leu Lys Glu Thr Glu Met Asn

1 5 10 15

lie Glu Gln Tyr Leu Asp Glu Leu lie Lys Arg Glu Gly Gly Tyr Val

20 25 30

Asn Asn Pro Ala Asp Arg Gly Gly Glu Thr Lys Tyr Gly lie Thr Glu

35 40 45

Ala Val Ala Arg Thr Asn Gly Phe Lys Gly Asn Met Lys Asp Leu Pro 50 55 60

Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Lys Lys Gln Tyr Trp Thr Asp Pro

65 70 75 80

Arg Phe Asp Gln Val Asn Val lie Ser Ser Leu Val Ala Glu Glu Leu 85 90 95

Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly Thr Gly Phe Ala Lys Pro Leu Leu

100 105 110

Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly Trp Pro

115 120 125

Asp Leu Thr Val Asp Gly lie Tyr Gly Pro Ala Thr Leu Asn Ala Leu 130 135 140

Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Asp Gly Glu Lys Val Leu Val

145 150 155 160

Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie Cys Glu 165 170 175

Arg Asn Pro Ser Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala Asn Arg

180 185 190

Val Val lie

195

<210>6

<211> 189

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400>6

Met Ser Ala Asn Pro Glu Leu Pro Trp lie Ala Glu Ala Arg Arg His

1 5 10 15

lie Gly Leu Ala Glu lie Ala Gly Pro Lys His Asn Gln Thr lie lie

20 25 30

Lys Trp Leu Lys Asp Leu Lys Ser Ser Trp Leu Asp Asp Glu Thr Ala

35 40 45

Trp Cys Gly Thr Phe Val Ala His Cys Leu Gln Thr Ala Gly Phe Gln 50 55 60

Arg Gly Ser Val Asn Ser Arg Ser Lys Thr Tyr Lys Ser Gly Thr Lys

65 70 75 80

Ala Pro Pro Gly Phe Tyr Pro Phe Asn Trp Tyr Ala Ala Leu Glu Tyr 85 90 95

lie Lys Glu Gly Gly Val Lys Leu Asp Lys Pro Cys Tyr Gly Cys Val

100 105 110

Ala Val Lys Ser Arg Glu Gly Gly Gly His Val Thr Phe Val Val Gly

115 120 125

Lys Thr Pro Thr Gly Lys Leu lie Cys Leu Gly Gly Asn Gln Ser Asn 130 135 140

Lys Val Cys Phe Ala Val Tyr Asp Val Ser Ala Phe Glu Ala Phe Met

145 150 155 160 Trp Tyr Gly Lys Thr Ser Lys Pro Ala Ala His Arg Tyr Asp Leu Pro 165 170 175

Val Leu Lys lie Val Ser Val Thr Ser Val Ser Glu Ala

180 185

<210>7

<211> 256

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400>7

Val Gly Arg Asp Lys Lys Ser Gly Lys Leu Val Cys Leu Gly Gly Asn

195 200 205

Gln Ser Asn Lys Val Cys Tyr Ala Leu Tyr Asn Asp Ser Asp Phe Gln 210 215 220

Glu Phe Arg Trp Tyr Gly Arg Thr Thr Gln Pro Ala Ser Lys Arg Tyr

225 230 235 240

Thr Leu Pro Gln Leu Lys Gly Val Thr Ala Thr Arg Val Leu Glu Ala 245 250 255

<210>8

<211> 256

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400>8

Leu Asp Tyr Val Asn Tyr Gly Thr Lys Leu Ala Lys Pro Ala Tyr Gly 165 170 175

Cys Val Ala lie Lys Thr Arg Lys Gly Gly Gly His Val Cys Phe Val

180 185 190

Val Gly Arg Asp Lys Lys Ser Gly Lys Leu Val Cys Leu Gly Gly Asn

195 200 205

Gln Ser Asn Lys Val Cys Tyr Ala Leu Tyr Asn Asp Ser Asp Phe Gln 210 215 220

Glu Phe Arg Trp Tyr Gly Arg Thr Thr Gln Pro Ala Ser Lys Arg Tyr

225 230 235 240

Thr Leu Pro Gln Leu Lys Gly Val Thr Ala Thr Arg Val Leu Glu Ala 245 250 255

<210>9

<211> 256

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400>9

Met Lys Leu lie Glu Asn Asn Ala Trp Gln Tyr Leu Ser Val Lys Leu

1 5 10 15

Pro Ala Val Gly Ala Phe lie Met Leu lie Leu Leu Pro Ala Leu Gln

20 25 30

Trp Gly Val Asp Tyr Glu Val lie Pro Glu Lys His His Ala Phe Val

35 40 45

Thr Gly Thr Leu Met Leu Val Leu Ser Trp lie Gly Lys Lys lie Ser 50 55 60

Gln Pro Arg Leu Asn Gly Pro Gln Leu Thr Gly Gln Leu Val Gly lie

65 70 75 80

Asn Ser Leu Leu Asn lie Pro Thr Pro Thr Lys Pro Asp Glu Leu Ala 85 90 95

Trp lie Ala Glu Ala Lys Lys His Leu Gly Leu Gln Glu lie Pro Gly

100 105 110

Lys Gln His Asn Pro Thr lie Leu Lys Trp Leu Ser Glu Leu Lys Ala

115 120 125

Trp Trp Ala Asp Asp Glu Thr Ala Trp Cys Gly Thr Phe Val Ala His 130 135 140

Cys Leu Lys Ser Ala Gly lie Ala Tyr Pro Lys His Trp Tyr Arg Ala

145 150 155 160

Leu Asp Tyr Val Asn Tyr Gly Thr Lys Leu Ala Lys Pro Ala Tyr Gly 165 170 175

Cys Val Ala lie Lys Thr Arg Lys Gly Gly Gly His Val Cys Phe Val

180 185 190

Val Gly Arg Asp Lys Lys Ser Gly Lys Leu Val Cys Leu Gly Gly Asn

195 200 205

Gln Ser Asn Lys Val Cys Tyr Ala Leu Tyr Asn Asp Ser Asp Phe Gln 210 215 220

Glu Phe Arg Trp Tyr Gly Arg Thr Thr Gln Pro Ala Gly Lys Arg Tyr

225 230 235 240

Thr Leu Pro Gln Leu Lys Gly Val Thr Ala Thr Arg Val Leu Glu Ala 245 250 255

<210> 10

<211> 256

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 10

Met Lys Leu lie Glu Asn Asn Ala Trp Gln Tyr Leu Ser Val Lys Leu

1 5 10 15

Pro Ala Val Gly Ala Phe lie Met Leu lie Leu Leu Pro Ala Leu Gln

20 25 30

Trp Gly Val Asp Tyr Glu Val lie Pro Glu Lys Tyr His Ala Phe Val

35 40 45

Thr Gly Thr Leu Met Leu Val Leu Ser Trp lie Gly Lys Lys lie Ser 50 55 60

Gln Pro Arg Leu Asn Gly Pro Gln Leu Thr Gly Gln Leu Val Gly lie

65 70 75 80

Asn Ser Leu Leu Asn lie Pro Thr Pro Thr Lys Pro Asp Glu Leu Ala 85 90 95 Trp lie Ala Glu Ala Lys Lys His Leu Gly Leu Gln Glu lie Pro Gly

100 105 110

Lys Gln His Asn Pro Thr lie Leu Lys Trp Leu Ser Glu Leu Lys Ala

115 120 125

Trp Trp Ala Asp Asp Glu Thr Ala Trp Cys Gly Thr Phe Val Ala His 130 135 140

Cys Leu Lys Ser Ala Gly lie Ala Tyr Pro Lys His Trp Tyr Arg Ala

145 150 155 160

Leu Asp Tyr Val Asn Tyr Gly Thr Lys Leu Ala Lys Pro Ala Tyr Gly 165 170 175

Cys Val Ala lie Lys Thr Arg Lys Gly Gly Gly His Val Cys Phe Val

180 185 190

Val Gly Arg Asp Lys Lys Ser Gly Lys Leu Val Cys Leu Gly Gly Asn

195 200 205

Gln Ser Asn Lys Val Cys Tyr Ala Leu Tyr Asn Asp Ser Asp Phe Gln 210 215 220

Glu Phe Arg Trp Tyr Gly Arg Thr Thr Gln Pro Ala Ser Lys Arg Tyr

225 230 235 240

Thr Leu Pro Gln Leu Lys Gly Val Thr Ala Thr Arg Val Leu Glu Ala 245 250 255

<210> 11

<211> 248

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 11

Leu Thr Gly Gln Leu Val Gly lie Asn Ser Leu Leu Asn lie Pro Thr

65 70 75 80

Pro Thr Lys Pro Asp Glu Leu Ala Trp lie Ala Glu Ala Lys Lys His 85 90 95

Leu Gly Leu Gln Glu lie Pro Gly Lys Gln His Asn Pro Thr lie Leu

100 105 110

Lys Trp Leu Ser Glu Leu Lys Ala Trp Trp Ala Asp Asp Glu Thr Ala

115 120 125

Trp Cys Gly Thr Phe Val Ala His Cys Leu Lys Ser Ala Gly lie Ala 130 135 140

Tyr Ser Lys His Trp Tyr Arg Ala Leu Asp Tyr Val Asn Tyr Gly Thr

145 150 155 160

Lys Leu Ala Lys Pro Ala Tyr Gly Cys Val Ala lie Lys Thr Arg Lys 165 170 175

Gly Gly Gly Arg Val Cys Phe Val Val Gly Arg Asp Lys Lys Ser Gly

180 185 190

Lys Leu Val Cys Leu Gly Gly Asn Gln Ser Asn Lys Val Cys Tyr Ala

195 200 205

Leu Tyr Asn Asp Ser Asp Phe Gln Glu Phe Arg Trp Tyr Gly Arg Thr 210 215 220

Thr Gln Pro Ala Ser Lys Arg Tyr Thr Leu Pro Gln Leu Lys Gly Val

225 230 235 240

Thr Ala Thr Arg Val Leu Glu Ala

245

<210> 12

<211> 180

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 12

Met Lys lie Glu Gln Tyr Leu Asp Asp Leu lie Lys Arg Val Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Val Asn Asn Pro Val Asp Arg Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Gly lie Thr Glu Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Gly Asn Met Lys Asp

35 40 45

Leu Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Arg Lys Gln Tyr Trp lie 50 55 60

Glu Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Thr Leu Ser Ser Ala Val Ala Glu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly lie Asn Phe Ala Lys Pro 85 90 95

Leu Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly

100 105 110

Tyr Ala Asp Leu Lys Val Asp Gly Val Tyr Gly Ser Asn Thr Leu Gly

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Glu Gly Glu Lys Val 130 135 140

Leu Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie

145 150 155 160

Cys Glu Arg Asn Lys Ser Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala 165 170 175

Asn Arg lie Gly

180

<210> 13

^<211^{> 180}

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 13

Met Lys lie Glu Gln Tyr Leu Asp Asp Leu lie Lys Arg Glu Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Val Asn Asn Pro Val Asp Arg Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Gly lie

20 25 30

Thr Glu Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Gly Asn Met Lys Asp

35 40 45

Leu Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Arg Lys Gln Tyr Trp lie 50 55 60

Glu Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Thr Leu Ser Ser Ala Val Ala Glu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly lie Asn Phe Ala Lys Pro 85 90 95

Leu Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly

100 105 110

Tyr Ala Asp Leu Lys Val Asp Gly Val Tyr Gly Ser Asn Thr Leu Gly

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Glu Gly Glu Lys Val 130 135 140

Leu Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie

145 150 155 160

Cys Glu Arg Asn Lys Ser Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala 165 170 175

Asn Arg lie Gly

180

<210> 14

<211> 180

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 14

Met Lys lie Glu Gln Tyr Leu Asp Asp Leu lie Lys Arg Glu Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Val Asn Asn Pro Val Asp Arg Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Gly lie

20 25 30

Thr Glu Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Gly Asn Met Lys Asp

35 40 45

Leu Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Arg Lys Gln Tyr Trp lie 50 55 60

Glu Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Thr Leu Ser Ser Ala Val Ala Glu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly lie Asn Phe Ala Lys Pro 85 90 95 Leu Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly

100 105 110

Tyr Ala Asp Leu Lys Val Asp Gly Val Tyr Gly Ser Asn Thr Leu Gly

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Glu Gly Glu Lys Val 130 135 140

Leu Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie

145 150 155 160

Cys Glu Arg Asn Lys Ser Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala 165 170 175

Asn Arg lie Gly

180

<210> 15

^<211^{> 180}

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 15

Met Lys lie Glu Gln Tyr Leu Asp Asp Leu lie Lys Arg Glu Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Val Asn Asn Pro Val Asp Arg Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Gly lie

20 25 30

Thr Glu Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Gly Asn Met Lys Asp

35 40 45

Leu Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Arg Lys Gln Tyr Trp lie 50 55 60

Glu Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Thr Leu Ser Ser Ala Val Ala Glu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly lie Asn Phe Ala Lys Pro 85 90 95

Leu Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly

100 105 110

Tyr Ala Asp Leu Lys Val Asp Gly Val Tyr Gly Ser Ser Thr Leu Gly

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Glu Gly Glu Lys Val 130 135 140

Leu Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie

145 150 155 160

Cys Glu Arg Asn Pro Lys Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala 165 170 175

Asn Arg lie Gly

180

^<210^{> 16}

^<211^{> 168}

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 16

Met Ser Asn Lys Thr Lys lie lie Val Thr Thr Leu Ser Ala Ser Ala

1 5 10 15

Leu Phe Phe Ala Ser Leu lie Gly Tyr Glu Gly Tyr Lys Ser Lys Pro

20 25 30

Tyr Leu Asp Ser Ala Lys Val Ala Thr lie Gly lie Gly Ser Thr Ser

35 40 45

Tyr Glu Asn Gly Thr Lys Val Lys Met Thr Asp Lys Pro lie Thr Lys 50 55 60

Glu Arg Ala Val Gln lie Ala Lys Ala His lie Ala Lys Asp Glu Val

65 70 75 80

Ala Phe Arg Lys Ser Leu Gln Gly Val Arg Leu Thr Gln Thr Glu Tyr 85 90 95

Asp Val Tyr Leu Asp Phe Val Tyr Asn Tyr Gly Gln Ala Asn Trp Asn

100 105 110

Gly Ser Ser Met Leu Arg Asn Leu Lys Ala Gly Gln Tyr Lys Gln Ala

115 120 125

Cys Ala Ser Leu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Ala Lys Arg Asp Cys Ser 130 135 140

lie Arg Ser Asn Gly Cys Tyr Gly Val Trp Thr Arg Gln Gln Asp Cys

145 150 155 160

<210> 17

<211>168

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 17

^<210^{> 18}

^<211^{> 180}

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 18

Met Lys lie Glu Gln Tyr Leu Asp Asp Leu lie Lys Arg Glu Gly Gly

Tyr Val Asn Asn Pro Val Asp Arg Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Gly lie

20 25 30

Thr Glu Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Gly Asn Met Lys Asp

35 40 45

Leu Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Arg Lys Gln Tyr Trp lie 50 55 60

Glu Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Thr Leu Ser Ser Ala Val Ala Glu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly lie Asn Phe Ala Lys Pro 85 90 95

Leu Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly

100 105 110

Tyr Ala Asp Leu Lys Val Asp Gly Val Tyr Gly Ser Ser Thr Leu Gly

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Glu Gly Glu Lys Val 130 135 140

Leu Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie

145 150 155 160

Cys Glu Arg Asn Pro Lys Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala 165 170 175

Asn Arg lie Gly

180

<210> 19

^<211^>211

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 19

Leu Thr Lys Asn Leu Ser Leu His Phe Trp lie Asn lie Asn lie Lys

1 5 10 15

Phe Thr Asp Gln Leu Val Ala Phe Leu Arg Leu Lys Glu Ser Glu Met

^’ 20 25 30

Lys lie Glu Gln Tyr Leu Asp Asp Leu lie Lys Arg Glu Gly Gly Tyr

35 40 45

Val Asn Asn Pro Val Asp Arg Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Gly lie Thr 50 55 60

Glu Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Gly Asn Met Lys Asp Leu

65 70 75 80

Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Arg Lys Gln Tyr Trp lie Glu 85 90 95

Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Thr Leu Ser Ser Ala Val Ala Glu Glu

100 105 110

Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly lie Asn Phe Ala Lys Pro Leu

115 120 125

Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly Tyr 130 135 140

Ala Asp Leu Lys Val Asp Gly Val Tyr Gly Ser Asn Thr Leu Gly Ala

145 150 155 160

Leu Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Glu Gly Glu Lys Val Leu 165 170 175

Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie Cys

180 185 190

Glu Arg Asn Lys Ser Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala Asn

195 200 205

Arg lie Gly

210

^<210^>20

^<211^{> 180}

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 20

Met Lys lie Glu Gln Tyr Leu Asp Asp Leu lie Lys Arg Glu Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Val Asn Asn Pro Val Asp Arg Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Gly lie

20 25 30

Thr Glu Ala Val Ala Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Gly Asn Met Lys Asp

35 40 45

Leu Pro Leu Asp Val Ala Lys Ala lie Tyr Arg Lys Gln Tyr Trp lie 50 55 60

Glu Pro Arg Phe Asp Gln Val Asn Thr Leu Ser Ser Ala Val Ala Glu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Asp Thr Gly Val Asn Cys Gly lie Asn Phe Ala Lys Pro 85 90 95

Leu Leu Gln Arg Ala Leu Asn Leu Leu Asn Asn Gln Gly Lys Ala Gly

100 105 110

Tyr Thr Asp Leu Lys Val Asp Gly Val Tyr Gly Ser Ser Thr Leu Gly

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Lys Glu Gly Glu Lys Val 130 135 140

Leu Val Arg Val Leu Asn lie Met Gln Gly Gln Arg Tyr lie Glu lie

145 150 155 160

Cys Glu Arg Asn Pro Lys Gln Glu Gln Phe Phe Tyr Gly Trp lie Ala 165 170 175

Asn Arg lie Gly

180

^<210^>21

<211> 146

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 21

Met Lys Thr Ser Asn Ser Gly lie Asn Leu lie Lys Gly Phe Glu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Leu Lys Ala Tyr Asp Asp Gly Val Gly Val Trp Thr lie Gly

20 25 30

Phe Gly Thr lie Lys Tyr Pro Asn Gly Val Arg Val Lys Lys Gly Asp

35 40 45

lie Cys Thr Glu Ser Gln Ala Glu Gly Tyr Leu Arg Asn Asp Leu Val 50 55 60

Ala Phe Glu Asn Ala lie Asn Arg Leu Val Lys Val Pro Leu Asn Gln

65 70 75 80

Asn Gln Phe Asp Ala Leu Ala Ser Phe Thr Tyr Asn Leu Gly Glu Gly 85 90 95

Asn Leu Ser Lys Ser Thr Leu Leu Lys Lys Leu Asn Ala Lys Asp Tyr

100 105 110

Lys Gly Ala Ala Ala Glu Phe Pro Lys Trp Asn Lys Ala Gly Gly Arg

115 120 125

Val Leu Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Lys Ala Glu Met Glu Leu Phe 130 135 140

Leu Lys

145

^<210^>22

<211> 441

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 22

gtga aaacaa gtaacccag g agtggattta atcaaaggct ttgaaggtc t acgattgaaa 60 gcct atgacg atggtgtgg g cgtttggacc attggctttg gcaccatca a atacccgaac 120 ggtg tgcgag tcaaaaaag g cgatacatgc actgaatctc aagcggaag a ataccttcgc 180 aat gacttag ttgtatttg a aagcgctatc aatcgtttgg tgaaagttc c gcttaatcaa 240 aac caattcg atgctttgg c ctcattcact tacaaccttg gtgagggca a tcttagtata 300 tcaa ctttgc taaaaaagct taatgc caaa gactataaag gtgctgcag c tgaatttcct 360 aaa tggaata aggcgggtg g tcgtgtcttg gctggattag ttaaacgtc g caaagctgaa 420 atgga gttat ttttaaaat g a 441 <210> 23

<211> 570

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 23

ttaag cctct gaaacactc g taacagaaac gatttttagg actggtaaat cgtat cggtg 60 agcag ctggt ttacttgttt tgccata cca cataaaggct tcaaaagcc g aaacgtcata 120 tactg caaaa caaactttat ttgactg att accacctaag caaattaatt tacca gtagg 180 tgttt tacca acaacgaaag ttacatg gcc accgccctct cttgatttt a ccgcaacaca 240 cccat aacaa ggcttgtyta atttgac tcc gccttctttg atgtattca a gtgcggcata 300 ccagt tgaaa ggataaaagc ctggtgg ggc ctttgttcct gatttata ag ttttggaacg 360

gatcc acggt aattctggat ttg cactcat 570 <210> 24

<211> 558

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 24

ctgaa ggaaa ccgaaatgaa tattgaa aaa tatcttgatg aattaatta a gcgtgaaggc 60 gggta tgtaa ataacccagc tgatcgg ggc ggtgcaacta aatatggcat cacaca agct 120 gttgc gcgtg aaaatggct g gaatggcaat atgaaagatt tgccgcttg a tgtggccaaa 180 gctat ttaca agaagcaata ctggaca gct ccgcgatttg accaagtaa a tgctgtttct 240 tctgc agtag ctgaagagct tctagac act ggtgtgaatt gcggtaccg g atttgcaaaa 300 cctct tttac aacgagcttt gaacttg ctt aataaccaag gtaaagctg g atatgcagat 360 ttaga ggttg atggtgttta tggctca gca acgctaggtg cccttaaaa c atacttgtca 420 aaacg tggga aagaaggtga gaaggtt ctg gtgcgagtgc tcaatattat gcaagg gcaa 480 cgcta cattg aaatctgtga gcgtaat cca aagcaggaac agtttttct a tggctggatt 540 gctaa ccgga tcggctag 558 <210> 25

^<211^{> 261}

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 25

tcac tgcgct cctatacatt ttgcgt gtcg ttctacttgt ctggtccag a cgccataaca 60 ccc gttttta cgaacagagc aatcgcgctt tgca acgtac ttatatttaa gtaaaga gtc 120 gcaa gctgct ttatattgac cagcct ttaa atgcttaagc attgatgatt ttgcgaa tgt 180 tggc acaccg tattgatac g tgaaatcaag gtataggtca tattcagtct gtgataa ttc 240 ggct cgagtt gtggaaggca g 261 ^<210^{> 26}

<211>588

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 26

tcata taaca actcgattgg cgatcca acc atagaaaaac tgttcct ggc taggattgc g 60 ttcac agatt tcaatgtaac gttgccc ttg catgatatta agaacac gca ccaggacttt 120 ttc gccgtct tttccacg ct tggccagata agttttgagt gcattaa gag ttgctggac c 180 at aaattccg tcaactgt ta aatctggcca acctgcttta ccttggt tat tcagcaaatt 240 taa agcacgc tgtaagag tg gttttgcaaa tccggtaccg caattta ccc cagtatctaa 300 aa gctcttca gcaactaa cg agctaattac attcacttga tcaaatc gcg gatctgtcc a 360 at actgcttt ttataaat gg ctttggccac atcaagcggt aaatctt tca tgttgccctt 420 aa agccgtta gtacgtgc ta ctgcttcagt aataccgtac tttgttt cac cgcctcgatc 480 tg ctgggttg tttacgta cc cgccctcacg cttaattaac tcgtcca gat attgttcaat 540 gt tcatttcg gtttcctt ca gatgtaaaaa accgcccgaa ggcggcat 588 <210> 27

<211> 570

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 27

ttaag cctct gaaacactc g taacagaaac gatttttagg actggtaaat cgtatc ggtg 60 agcag ctggt ttacttgttt tgccata cca cataaaggct tcaaaagcc g aaacgtcata 120 tactg caaaa caaactttat ttgactg att accacctaag caaattaatt taccag tggg 180 tgttt tacca acaacgaaa g ttacatggcc accgccctct cttgatttta ccgcaac aca 240 cccat aacaa ggcttgtcta atttgac tcc gccttctttg atgtattca a gtgcggcata 300 ccag ttgaaa ggataaaagc ctggtgg ggc ctttgttcct gatttataa g ttttggaacg 360 cgagt ttaca cttcctcttt gaaatcc cgc cgtttggaga cagtgcgca a cgaatgttcc 420 gcacc atgca gtttcatcgt caagcca aga ggactttaag tccttcagcc atttgat gat 480 tgtct ggttg tgtttggggc cggcgat ttc agccaaccct atgtgacgg c gagcctctgc 540 gatcc acggt aattctggat ttgcactc at 570 ^<210^{> 28}

<211> 771

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 28

atga agttaa ttgaaaaca a tgcttggcag tatctatctg ttaagttac c cgccgtaggt 60 gcat tcatca tgctaatttt attgcc agca ctacaatggg gtgttgat ta tgaagttatt 120 cctg aaaaat atcatgcatt tgttact ggt actttgatgc ttgttctgt c atggattgga 180 aaga aaattt ctcaaccac g ac ttaatggc ccgcaattaa caggccagtt agtagggatc 240 aatt ctttat tgaatatccc aa caccaaca aagcctgatg aattagcttg gattgcggaa 300 gcaaa aaagc atcttggcct tca agaaata cctggtaaac agcataaccc aactatttta 360

aaat ggctct cggagctaaa ggc ttggtgg gctgacgatg aaacggcttg gtgtgggacc 420 ttcgt tgcac attgcttgaa at cagctgga attgcttatc ctaagcattg gtaccgtgca 480 ttgga ttatg tgaattatg g tac aaaatta gctaaacccg cttacggttg tgtagctatt 540 aaaa ctcgaa agggtggtg g gc atgtttgt tttgtagttg gccgtgacaa aaagtctgga 600 aagt tagtat gccttggag g ca atcagtca aataaagttt gttatgcact ttataatgac 660

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 29

ttagg cttcc aaaaccctag tag ctgttacgc cttttaat tgtg gcaatg tataacgctt 60 acttg ctggt tgagttgtac gac cataccat ctgaattct tgaa agtcag agtcattata 120 aagtg cataa caaactttat ttg actgattgc ctccaagg cat actaact ttccagactt 180 tttgt cacgg ccaactacaa aac aaacatgcc caccaccc ttt cgagttt taatagctac 240 acaac cgtaa gcgggtttag ct aattttgtac cataattc acat aatcca atgcacggta 300 ccaat gctta ggataagcaa ttc cagctgatt tcaagcaa tgtg caacga aggtcccaca 360 ccaag ccgtt tcatcgtcag ccc accaagcct ttagctcc gag agccatt ttaaaatagt 420

ccaag ctaat tcatcaggct ttg ttggtgttg ggatattc aat aaagaat tgatccctac 540 taact ggcct gttaattgcg ggc cattaagtc gtggttga gaa attttct ttccaatcca 600 tgaca gaaca agcatcaaag tac cagtaacaa atgcatga tatt tttcag gaataacttc 660

gggta actta acagatagat act gccaagcat tgttttca atta acttca t 771 <210> 30

<211> 771

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 30

ttagg cttcc aaaaccctag tagctgtt ac gccttttaat tgtggcaatg tataacgc tt 60 acctg ctggt tgagttgtac gaccata cca tctgaattct tgaaagtcag agtcatt ata 120 aagtg cataa caaactttat ttgactga tt gcctccaagg catactaact ttccagac tt 180 tttgt cacgg ccaactacaa aacaaac atg cccaccaccc tttcgagttt taatagc tac 240 acaac cgtaa gcgggtttag ctaatttt gt accataattc acataatcca atgcacg gta 300

ccaat gctta ggataagcaa ttccagc tga tttcaagcaa tgtgcaacga aggtccc aca 360 ccaag ccgtt tcatcgtcag cccacca agc ctttagctcc gagagccatt ttaaaata gt 420 tgggt tatgc tgtttaccag gtatttc ttg aaggccaaga tgcttttttg cttctgca at 480 ccaag ctaat tcatcaggct ttgttggt gt tgggatattc aataaagaat tgatccc tac 540 taact ggcct gttaattgcg ggccatt aag tcgtggttga gaaattttct ttccaat cca 600 tgaca gaaca agcatcaaag taccagt aac aaatgcatga tgtttttcag gaataac ttc 660 ataat caaca ccccattgta gtgctggc aa taaaattagc atgatgaatg cacctac ggc 720 gggta actta acagatagat actgccaa gc attgttttca attaacttca t 771

<210> 31

<211>771

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 31

atga agttaa ttgaaaaca a tgcttggcag tatctatctg tcaagttac c cgccgtaggt 60 gcatt catca tgctaatttt attgcc agca ctacaatggg gtgttgatt a tgaagttatt 120 cctg aaaaat atcatgcatt tgttact ggt actttgatgc ttgttctgt c atggattgga 180 aaga aaattt ctcaaccac g acttaatggc ccgcaattaa caggccagt t agtagggatc 240 aatt ctttat tgaatatccc aacacc aaca aagcctgatg aattagctt g gattgcagaa 300 gcaaa aaagc atcttggcct tcaagaa ata cctggtaaac agcataacc c aactatttta 360 aaat ggctct cggagctaaa ggcttg gtgg gctgacgatg aaacggct tg gtgtgggacc 420 ttcgt tgcac attgcttgaa atcagct gga attgcttatc ctaagcat tg gtaccgtgca 480 ttgga ttatg tgaattatg g tacaaaatta gctaaacccg cttacggtt g tgtagctatt 540 aaaa ctcgaa agggtggtg g gcatgtttgt tttgtagttg gccgtgaca a aaagtctgga 600 aagt tagtat gccttggag g caatcagtca aataaagttt gttatgcac t ttataatgac 660 tctga ctttc aagaattca g atggtatggt cgtacaactc aaccagca ag taagcgttat 720 acatt gccac aattaaaag g cgtaacagct actagggttt tggaagcct a a 771

<210> 32

<211> 747

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 32

aatg gcccgc aattaacag g ccagttagtaggg atcaatt cttta ttgaa tatcccaaca 240 ccaa caaagc ctgatgaatt agct tggattgc agaagcaa aaaa gcatct tggccttcaa 300 gaaa tacctg gtaaacagc a taacccaactatt ttaaaat ggct ctcgga gctaaaggct 360 tggt gggctg acgatgaaac ggct tggtgtgg gaccttcg ttgc acattg cttgaaatca 420 gctg gaattg cttattctaa gcat tggtaccg tgcattgg attat gtgaa ttatggtaca 480

aca gctacta gggttttgga agcc taa 747 <210> 33

<211> 543

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 33

ctagc cgatc cggttagcga tccagcc ata aaaaaactgc tcttggcttt tattacg ttc 60 acaga tttca atgtatcgtt ggccttg cat aatatttaac acgcgcacta agacctt ttc 120 gcctt ctttg ccacgtttgg ccaagtaa gt ttttagagct cctaaagtgt tagaacc ata 180 aacgc catca accttcaagt ctgcata acc agctttacct tgattgttaa gcaagtt caa 240 agcac gttgt aaaagtggtt ttgcaaag tt gataccacag ttcacaccag tgtctaa aag 300 ttctt cagct actgcagagc taagagt att aacctgatca aaacgtggct ctatcca gta 360 ctgtt tccga taaattgctt tggccac atc aagaggcaaa tctttcatat tgccctt ata 420 gccgt tttca cgtgctacag cttcagta at accgtatttg gtagcacctc ctcgatc tac 480 tggat tattt acataaccgc ctacgcg ttt aatcaaatca tcaagatatt gttcaat ttt 540 cat 543 <210> 34

<211> 543

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 34

atgaa aattg aacaatatct tgatgat ttg attaaacgcg aaggcggtt a tgtaaataat 60 ccagt ggatc gaggaggtgc taccaaa tac ggtattactg aagctgtag c acgtgaaaac 120 ggcta taagg gcaatatgaa agatttg cct cttgatgtgg ccaaagcaat ttatcgg aaa 180 cagta ctgga tagagccac g ttttgatcag gttaatactc ttagctctg c agtagctgaa 240 gaact tttag acactggtgt gaactgt ggt atcaactttg caaaaccact tttacaa cgt 300

tag 543 <210> 35

<211> 543

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 35

at gaaaattg aacaatatc t tgatgatttg attaaacgcg aaggtggt ta tgtaaataat 60 cc agtagatc gaggaggtg c taccaaatac ggtattactg aagctgta gc acgtgaaaac 120 gg ctataagg gcaatatg aa agatttgcct cttgatgtgg ccaaagcaat ttatc ggaaa 180 ca gtactgga tagagcca cg ttttgatcag gttaatactc ttagctct gc agtagctgaa 240 ga acttttag acactggtgt gaact gtggt atcaactttg caaaaccact tttac aacgt 300 gc tttgaact tgcttaaca a tcaaggtaaa gctggttatg cagacttg aa ggttgatggc 360 gt ttatggtt ctaacactt t aggagctcta aaaacttact tggccaaa cg tggcaaagaa 420 gg cgaaaagg tcttagtg cg cgtgttaaat attatgcaag gccaacga ta cattgaaatc 480 tg tgaacgta ataaaagc ca agagcagttt ttttatggct ggatcgct aa ccggatcggc 540 tag 543 <210> 36

<211> 543

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 36

cta gccgatc cggttagca a tccagccata gaagaattgc tcttgctt gg gattacgctc 60 aca aatttcg atatatcgc t ggccttgcat gatattaaga actcgcac ta ggactttctc 120 acc ttctttc ccacgttt gg ccaagtaagt tttgagagct cctaatgt gc tagaaccata 180 aac gccatca accttcaag t ctgcataacc agctttacct tgattgtt aa gcaagttcaa 240 agc acgttgt aaaagtggt t ttgcaaagtt gataccacag ttcacacc ag tgtctaaaag 300 ttc ttcagct actgcagag c taagagtatt aacctgatca aaacgtgg ct ctatccagta 360 ctg tttccga taaattgct t tggccacatc aagaggcaaa tctttcat at tgcccttata 420 gcc gttttca cgtgctac ag cttcagtaat accgtatttg gtagcacc tc ctcgatctac 480 tgg attattt acataaccg c cttcgcgttt aatcaaatca tcaagata tt gttcaatttt 540

cat 543 <210> 37

<211> 507

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 37

tcact gcacc gccatacact tgcta taaca atcttgttgg cgtgtccaga caccataaca 60 accat tggac cgaatcgagc aatca cgctt tgcaacatat ttgtatttca gtaatgaagc 120 acaag cttgc ttatattgcc ctgct ttgag attacgaagc attgatgagc cgttccaatt 180 tgctt ggcca tagttgtaaa caaag tctaa gtacacatca tattcagtct gagttagcct 240 cacgc cctgc aacgacttgc gaaat gccac ctcatcttta gcaatgtgag ctttggcaat 300 ttgaa cagca cgttcttttg taatc ggctt gt.cagt.catt ttgaccttgg taccgttttc 360 atagg aagtg gatccgatac caatc gttgc cactttagcg ctatctaaat atggctttga 420 tttgt acccc tcatagccaa ttaaa gatgc aaaaaaaagc gctgatgcgc ttaatgttgt 480 tacta tgatt ttagtcttgt ttgac at 507 <210> 38

<211>507

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 38

atgtc aaaca agactaaaat catagta aca acattaagcg catcagcgct tttttttg ca 60 tcttt aattg gctatgaggg gtacaaat ca aagccatatt tagatagcgc taaagtgg ca 120 acgat tggta tcggatccac ttcctatg aa aacggtacca aggtcaaaat gactgaca ag 180 ccgat tacaa aagaacgtgc tgttcaaa tt gccaaagctc acattgctaa agatgagg tg 240 gcat ttcgca agtcgttgc a gggcgtgagg ctaactcaga ctgaatatg a tgtgtactta 300 gactt tgttt acaactatg g ccaagcaaat tggaacggct catcaatgct tcgtaat ctc 360 aaag cagggc aatataagca agcttgtg ct tcattactga aatacaaata tgttgca aag 420 cgtg attgct cgattcggtc caatggtt gt tatggtgtct ggacacgcca acaagatcgt 480 tatag caagt gtatggcggt gcaatga 507 <210> 39

<211> 543

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 39

ctag ccgatc cggttagcaa tccagcc ata gaagaattgc tcttgctta g gattacgctc 60 acaa atttcg atatatcgct ggccttgc at gatattaaga actcgcact a ggactttctc 120 acctt ctttc ccacgtttgg ccaagtaa gt tttgagagct cctaatgtgc tagaacc ata 180 aacgc catca accttcaagt ctgcata acc agctttacct tgattgttaa gcaagtt caa 240 agcac gttgt aaaagtggtt ttgcaaag tt gataccacag ttcacacca g tgtctaaaag 300 ttctt cagct actgcagagc taagagta tt aacctgatca aaacgtggct ctatcca gta 360 ctgtt tccga taaattgctt tggccaca tc aagaggcaaa tctttcatat tgccctt ata 420 gccgt tttca cgtgctacag cttcagta at accgtatttg gtagcacctc ctcgatc tac 480 tggat tattt acataaccgc cttcgcgt tt aatcaaatca tcaagatatt gttcaat ttt 540 cat 543 <210> 40

<211> 636

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 40

ctagc cgatc cggttagcga tccagcc ata aaaaaactgc tcttggcttt tattacg ctc bu acaga tttca atgtatcgtt ggccttgc at aatatttaac acgcgcacta agacctt ttc 120 gcctt ctttg ccacgtttgg ccaagtaa gt ttttagagct cctaaagtgt tagaacc ata 180 aacgc catca accttcaagt ctgcata acc agctttacct tgattgttaa gcaagtt caa 240 agcac gttgt aaaagtggtt ttgcaaag tt gataccacag ttcacaccag tgtctaa aag 300 ttctt cagct actgcagagc taagagta tt aacctgatca aaacgtggct ctatcca gta 360 ctgtt tccga taaattgctt tggccac atc aagaggcaaa tctttcatat tgccctt ata 420 gccgt tttca cgtgctacag cttcagt aat accgtatttg gtagcacctc ctcgatc tac 480

<210> 41

<211> 543

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 41

atgaa aattg aacaatatct tgatgat ttg attaaacgcg aaggcggtta tgtaaata at 60 ccagt agatc gaggaggtgc taccaaat ac ggtattactg aagctgtagc acgtgaa aac 120 ggcta taagg gcaatatgaa agatttgc ct cttgatgtgg ccaaagcaat ttatcgg aaa 180 cagta ctgga tagagccacg ttttgat cag gttaatactc ttagctctgc agtagct gaa 240 gaact tttag acactggtgt gaactgtg gt atcaactttg caaaaccact tttacaac gt 300 gcttt gaact tgcttaacaa tcaaggta aa gctggttata cagacttgaa ggttgat ggc 360

gttta tggtt ctagcacatt aggagct ctc aaaacttact tggccaaac g tgggaaagaa 420 ggtga gaaag tcctagtgcg agttctta at atcatgcaag gccagcgata tatcgaa att 480 tgtga gcgta atcctaagca agagcaa ttc ttctatggct ggattgctaa ccggatc ggc 540 tag 543 <210> 42

<211> 441

<212> ADN

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 42

t cattttaaa aataac tcca tttca gctttgcga cgtttc accagtcctg ccaatacac g 60

t cctgagtt a cttgttttca t 441 <210> 43

<211> 31

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 43

<210> 44

^<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Ex

<400> 44

Ser Gl n Ser Ar g Gl u Ser Gln Cys

1 5

<210> 45

<211> 39

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> P307Ex

<400> 45

<210> 46

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Cebador

<400> 46

Al a Al a Thr Thr Cys Gl y Gl y Cys Thr Cys Gly Al a Gly 1 5 10

<210> 47

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Cebador

<400> 47

Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala

1 5 10 15

Ala Thr Thr

<210> 48

^<211^{> 7}

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Extensión Peptídica

<400> 48

Ala Glu Met Leu Phe Leu Lys

1 5

<210> 49

<211> 39

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> P307AE-8

<400> 49

Asn Ala Lys Asp Tyr Lys Gly Ala Ala Ala Glu Phe Pro Lys Trp Asn

1 5 10 15

Lys Ala Gly Gly Arg Val Leu Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Lys Ala

20 25 30

Glu Met Glu Leu Phe Leu Lys

35

<210> 50

^<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Extensión Peptídica

<400> 50

Cys Ser Gln Arg Gln Ser Glu Ser

1 5

<210> 51

<211> 39

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> P307CS-8

<400> 51

Asn Ala Lys Asp Tyr Lys Gly Ala Ala Ala Glu Phe Pro Lys Trp Asn

1 5 10 15

Lys Ala Gly Gly Arg Val Leu Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Lys Cys

20 25 30

Ser Gln Arg Gln Ser Glu Ser

35

<210> 52

^<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Extensión Peptídica

<400> 52

Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Ala

1 5

<210> 53

<211> 39

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> P307SQ-8A

<400> 53

Asn Ala Lys Asp Tyr Lys Gly Ala Ala Ala Glu Phe Pro Lys Trp Asn

1 5 10 15

Lys Ala Gly Gly Arg Val Leu Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Lys Ser

20 25 30

Gln Ser Arg Glu Ser Gln Ala

35

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido o fragmento tiene actividad antibacteriana.

3. Un polipéptido conjugado que comprende: el polipéptido o fragmento de la reivindicación 1; y un péptido antimicrobiano conjugado con el polipéptido o el fragmento del polipéptido, en el que el polipéptido conjugado tiene actividad antibacteriana.

4. El polipéptido conjugado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el péptido antimicrobiano comprende los ocho aminoácidos C, S, Q, R, S, E y S en cualquier orden.

5. El polipéptido conjugado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el péptido antimicrobiano tiene la secuencia de aminoácidos SQSRESQC (SEQ ID NO:44) o CSQRQSES (SEQ ID NO:50).

6^{. El polipéptido conjugado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el polipéptido conjugado comprende la}secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:51.

7. El polipéptido conjugado de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que el extremo C del polipéptido o fragmento está conjugado con el péptido antimicrobiano o en el que el extremo N del polipéptido o fragmento está conjugado con el péptido antimicrobiano.

8^{. El polipéptido conjugado de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el polipéptido conjugado}tiene actividad antibacteriana contra una bacteria gramnegativa o en el que el polipéptido conjugado tiene actividad antibacteriana contra una bacteria grampositiva.

9. Una composición que comprende uno o más polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 8.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una infección bacteriana.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 9 y un transportador, agente tamponante o conservante farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una herida quirúrgica irrigando la herida quirúrgica con la composición.

12. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la herida quirúrgica se irriga antes del cierre quirúrgico de la herida.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en la inhibición de la formación de o en la alteración de una biopelícula bacteriana en una cantidad eficaz para destruir bacterias en la biopelícula.

14. Método para inhibir la formación de o alterar una biopelícula bacteriana sobre un artículo que comprende poner en contacto el artículo con la composición de la reivindicación 9 en una cantidad eficaz para destruir bacterias en la biopelícula.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el artículo es una encimera, teclado, instrumento quirúrgico o dispositivo médico.