ES2769643T3 - Procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP) - Google Patents
Procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP) Download PDFInfo
- Publication number
- ES2769643T3 ES2769643T3 ES12753905T ES12753905T ES2769643T3 ES 2769643 T3 ES2769643 T3 ES 2769643T3 ES 12753905 T ES12753905 T ES 12753905T ES 12753905 T ES12753905 T ES 12753905T ES 2769643 T3 ES2769643 T3 ES 2769643T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vlp
- cells
- nacl
- vlps
- filtration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 59
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 57
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 48
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241000701460 JC polyomavirus Species 0.000 claims abstract description 10
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 claims description 45
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 7
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 101710106388 Structural protein VP1 Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 abstract description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 170
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 125
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 85
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 48
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 43
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 42
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 42
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 24
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 20
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 9
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical compound [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 8
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 7
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 5
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 229950007919 egtazic acid Drugs 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 4
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- -1 for example Chemical group 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 3
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 3
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 3
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 3
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000829192 Bos taurus polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001246431 Goose hemorrhagic polyomavirus Species 0.000 description 2
- 241000829106 Human polyomavirus 3 Species 0.000 description 2
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 description 2
- 241000829333 Mesocricetus auratus polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 2
- 241000829388 Mus musculus polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000829146 Mus musculus polyomavirus 2 Species 0.000 description 2
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241001631648 Polyomaviridae Species 0.000 description 2
- 241000205385 Simian virus 12 Species 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 2
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000340974 Alphapapillomavirus Species 0.000 description 1
- 241000829156 Aves polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000341809 Betapapillomavirus Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 241000282551 Cercopithecus Species 0.000 description 1
- 241000937945 Chimpanzee polyomavirus Species 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 241000768280 Crow polyomavirus Species 0.000 description 1
- 241000289427 Didelphidae Species 0.000 description 1
- 241001665956 Epsilonpapillomavirus Species 0.000 description 1
- 241000768279 Finch polyomavirus Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 1
- 241000829109 Human polyomavirus 2 Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710169675 Major capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000555300 Mamestra Species 0.000 description 1
- 241000256010 Manduca Species 0.000 description 1
- 241000721576 Melopsittacus undulatus Species 0.000 description 1
- 241000579048 Merkel cell polyomavirus Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 241000595629 Plodia interpunctella Species 0.000 description 1
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 241001096097 Rabbit kidney vacuolating virus Species 0.000 description 1
- 241001649628 Rabbit polyomavirus Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 241000289672 Trichosurus vulpecula Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 101150024766 VP1 gene Proteins 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011001 backwashing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012194 insect media Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Procedimiento para la purificación de partículas similares a virus (VLP), caracterizado porque se filtra una composición que contiene VLP por un medio filtrante con un límite de exclusión de más de 30 kDa a 1500 kDa, en cuyo caso como composición que contiene VLP se usa el sobrenadante del cultivo de las células que expresan VLP (sobrenadante de cultivo celular), en donde las VLP se componen de la proteína estructural VP1 del virus JC humano y con la filtración se efectúa al mismo tiempo una reamortiguación de pH) de la composición que contiene VLP.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP)
La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar composiciones que contienen VLP y composiciones que contienen VLP de alta pureza y a su uso en procedimientos de diagnóstico o terapéuticos.
En el desarrollo de procedimientos de diagnóstico o terapéuticos específicos, el uso de sistemas de transferencia (delivery systems) que permiten una transferencia, específica para células tanto como es posible, de sustancias tales como ácidos nucleicos, marcadores o sustancias activas es de gran importancia. para esta transferencia específica para células se ha desarrollado, entre otros, un sistema a base de “partículas similares” a virus (VLP por virus like particles) (publicaciones WO 97/19174; EP 1270586 B1). La base de este sistema es la propiedad de las VLPs, por ejemplo, de poder empacar sustancias activas o ácidos nucleicos y luego insertarlos específicamente en determinadas células.
Las VLPs se pueden preparar, por ejemplo, mediante la expresión recombinante de la proteína estructural principal VP1 del poliomavirus humano JCV (VP1-VLP). A diferencia de la expresión de VP1 de otros virus de polioma, Las VP1-VLP se secretan en el sobrenadante de los cultivos de células anfitrionas. Ya se han desarrollado varios procedimientos para purificar el VP1-VLP del sobrenadante del cultivo celular. Sin embargo, todos estos no son adecuados para preparar VLP a escala comercial (gran escala). Esto es válido principalmente si el procedimiento de preparación debe ser certificable por GMP, ya que la pureza dla VLP está sujeta a requisitos particularmente altos. Por ejemplo, Goldmann et al. (J. Virol., 1999, 73: 4465-4469) describen la purificación de VP1-VLP expresada en células de insecto mediante centrifugación por densidad con una solución de sacarosa al 40% seguida de una centrifugación por densidad con sacarosa al 40% y metrizamida (2-({3-(acetilamino)-5-[acetil(metil)amino]-2,4,6-triyodobenzoilo}amino)-2-desoxi-D-glucopiranosa al 50% . Este procedimiento no solo es inadecuado para la producción a gran escala. Las proteínas VP1 así proporcionadas también están contaminadas con fragmentos de VP1 de 38 y 40 kDa.
Para la purificación de VLP recombinante a partir de células de E. coli lisadas, Pushko et al. (Protein Engineering, 1993, 6(8): 883-891) usan una precipitación con sulfato de amonio seguida de cromatografía de permeación en gel usando una columna Sephadex G25 y una columna G100.
Por la publicación WO 92/13081 A1 se conoce un procedimiento de purificación para el aislamiento de VLP derivada de MS-2 por precipitación fraccionada con sulfato de amonio y posterior precipitación por puntos isoeléctricos, centrifugación por densidad de sacarosa y cromatografía de permeación en gel.
En la publicación WO 2006/136566 A9 se describe la purificación de VLP recombinante expresada de modo bacteriano mediante cromatografía de intercambio aniónico seguida de una columna de hidroxilapatita y una cromatografía de permeación en gel opcional.
Citkowicz et al. (Anal. Biochem., 2008, 376(2): 163-172) describen un procedimiento de purificación de VLP en el que las VLP se separan primero de los residuos celulares mediante centrifugación y luego se precipita el sobrenadante que contiene VP1-VLP usando PEG. Luego se filtra por medio de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 |jm. Las VLP se recogen en el filtrado y se purifican adicionalmente.
Los procedimientos conocidos del estado de la técnica no son lo suficientemente adecuados para preparar la VLP fuera de la escala del laboratorio, ya que son muy complejos, no permiten la ampliación a un procedimiento industrial y/o no cumplen con los altos requisitos de un procedimiento conforme con GMP. Esto último es válio sobre todo debido a las impurezas que se pueden incluir en las VLP.
Por lo tanto, la invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento de preparación de VLP que al menos reduzca o incluso evite en gran medida una desventaja de los procedimientos de preparación conocidos. Este objetivo se consigue según la invención mediante el procedimiento según la reivindicación principal. Las formas de realización ventajosas son objeto de las reivindicaciones dependientes correspondientes. También se reivindican composiciones de VLP de determinada pureza; así como proteínas ventajosas de VP1.
La presente invención proporciona un procedimiento para purificar eficazmente VLP. El procedimiento tiene la ventaja particular de que se permite la preparación a gran escala, que también cumple con los altos requisitos para un procedimiento de GMP (“buenas prácticas de fabricación”).
El procedimiento de acuerdo con la invención para la purificación de VLP se caracteriza porque una composición que contiene VLP se filtra a través de un medio filtrante, en particular una membrana; el medio filtrante tiene un límite de exclusión (corte de peso molecular (MWCO) de más de 30 kDa hasta 1500 kDa y como composición que contiene VLP se usa el sobrenadante de cultivo celular de células que expresan VLP. Los inventores han descubierto que, con una etapa así al comienzo de un procedimiento posterior que se lleva a cabo en todo caso
después de al menos una etapa de cromatografía del estado de la técnica, es posible una purificación simple y eficiente de las VLP.
Cuando la VLP se filtra a través del medio filtrante utilizado según la invención, los posibles contaminantes pasan a través del medio filtrante y se acumulan en el filtrado, mientras que las VLP de alto peso molecular permanecen en el retenido en forma purificada. Este procedimiento de una sola etapa permite, por lo tanto, una separación sencilla de las VLP de las impurezas presentes en la composición.
Dependiendo del procedimiento, se puede lograr una concentración de la composición que contiene VLP en esta etapa de purificación, ya que el volumen líquido del retenido disminuye naturalmente durante la filtración y aumenta la fracción relativa de VLP en el retenido. La concentración es una ventaja en muchos procedimientos de purificación, porque las etapas posteriores como, por ejemplo, una purificación por cromatografía en columna, se pueden llevar a cabo de manera más eficiente y rentable.
Además, esta etapa de purificación se usa para cambiar las condiciones de solución de la composición que contiene VLP, por ejemplo, intercambiando el regulador de pH (denominado, re-amortiguación). Este procedimiento también se conoce como diafiltración.
El procedimiento de purificación de acuerdo con la invención también tiene al menos una de las siguientes ventajas:
• es un procedimiento de purificación suave que deja las VLP en su forma nativa, tanto como es posible, lo cual es esencial para su actividad. Por lo contrario, en procedimientos del estado de la técnica se dan parcialmente cambios en la superficie de VLP (por ejemplo, con respecto a los cambios en la carga), que pueden afectar negativamente el uso posterior o el tratamiento de las VLP.
• Se puede evitar el uso de disolventes orgánicos, que de lo contrario pueden traer consigo el riesgo de desnaturalización de proteínas.
• El medio iónico y el pH de la composición que contiene VLP se pueden mantener si es necesario.
• La etapa de filtración de acuerdo con la invención es rápida y económica. También es eficiente y puede usarse para purificación, concentración y/o amortiguación del pH al mismo tiempo.
• Se puede llevar a cabo a bajas temperaturas como, por ejemplo, en una habitación fría.
Sin embargo, la ventaja particular del procedimiento de acuerdo con la invención es que se puede lograr una mejora significativa en la pureza de las VLP en una composición altamente compleja y altamente contaminada en una sola etapa. Esto también se aplica a composiciones tan complejas como un sobrenadante de cultivo celular. Por lo tanto, la pureza de la composición que contiene VLP después de la filtración de acuerdo con la invención puede ser de al menos 70 %, ventajosamente de al menos 75% o de al menos 80%. La pureza se puede aumentar mediante procedimientos de purificación adicionales.
Definiciones
A menos que se especifique lo contrario, los términos utilizados en la descripción y las reivindicaciones tienen los significados que se definen a continuación:
el término “partículas similares a virus (VLP)” en el sentido de la invención se refiere a una estructura en forma de partículas en la que varias proteínas están presentes en forma agregada, en cuyo caso preferiblemente encierran un espacio vacío. Al menos una parte de las proteínas formadoras de estructura es idéntica a o derivada de proteínas estructurales virales (proteínas de la cápside), en particular de virus de la familia Papoviridae. Esto incluye la familia Papillomaviridae y la familia Polyomaviridae. Las VLP también pueden provenir de otras familias de virus, como, por ejemplo, la familia de Parvoviridae, Flavoviridae y Retroviridae. Las VLP según la invención se componen a partir de la proteína estructural VP1 del virus JC humano.
Se forma preferiblemente una VLP de 60, 72, 120, 180, 240, 300, 360 y más de 360 proteínas estructurales virales y puede tener una estructura tubular o esférica. Una VLP que consta de 360 proteínas estructurales generalmente está compuesta por 72 pentámeros, cada uno de los cuales está formado por cinco proteínas estructurales monoméricas. Las proteínas estructurales y los pentámeros pueden agregarse por unión no covalente o covalente de las proteínas. En el caso de un enlace covalente, se prefiere la formación de puentes disulfuro.
Una VLP puede construirse a partir de una multiplicidad de una sola proteína estructural, o puede comprender diferentes proteínas estructurales. Se prefiere la presencia de una sola proteína estructural, concretamente VP1. Se divulgan proteínas estructurales de las VLP, en particular la VP1 (pero también la VP2 y/o la VP3) que son idénticas a o derivadas de las proteínas estructurales, por ejemplo, de los siguientes virus de la familia de los Polyomaviridae: poliomavirus de cercopithecus (mono verde) (AGMPyV), poliomavirus de babuino 2 (BPyV-2), poliomavirus Humano 1 (BK Virus, BKV o BKPyV), poliomavirus Humano 2 (JC Virus, JCV o JCPyV), poliomavirus bovino (BPyV), poliomavirus de periquito (poliomavirus de enfermedad de polluelo, BFPyV), poliomavirus de hámster
(HaPyV), virus neumotrópico de murino (MPtV), poliomavirus de murino (MPyV), poliomavirus de conejo (virus vacuolado de riñon de conejo Rabbit kidney vacuolating virus, RKV), virus de simio 12 (SV-12), virus de simio 40 (SV-40), poliomavirus de cuervo, poliomavirus hemorrágico de ganso (GHPV), poliomavirus de células de Merkel, poliomavirus de chimpancé, poliomavirus de pinzón y poliomavirus KI (KIV).
Sin embargo, las VLP también pueden corresponder a o derivarse de las proteínas estructurales de los virus, preferiblemente el L1 (pero también el L2) de la familia Papillomaviridae, por ejemplo de los siguientes géneros de virus: alfa-papilomavirus, beta-papilomavirus, gamma-papilomavirus, delta-papilomavirus, épsilon-papilomavirus, zeta-papilomavirus, etapapilomavirus, thetapapilomavirus, iotapapilomavirus, kappapapilomavirus, lambdapapilomavirus, mupapilomavirus, nupapilomavirus, xipapilomavirus, omikronpapilomavirus, pipapilomavirus, papilomavirus de trichosurus vulpécula (zarigüeya australiana) y papilomavirus de didélfido.
La VLP de la invención también puede tener una o más proteínas heterólogas adicionales en la cápside: es decir, proteínas que no son idénticas o similares a una proteína de un virus de la familia Papoviridae. En principio, todas las proteínas que pueden incorporarse a la cápside o que se unen a la cápside y que no perjudican significativamente el ensamblaje de la VLP son adecuadas como proteínas heterólogas.
Una “composición que contiene VLP” es cualquier composición que contiene VLP, preferiblemente un líquido. El término “líquido”, a diferencia de un sólido, incluye todas las composiciones fluidas, incluyendo líquidos altamente viscosos, aceitosos o bituminosos. La composición puede ser monofásica o multifásica. Las VLP pueden estar disuletas, pero opcionalmente también pueden presentarse en forma de partículas dispersas o suspendidas con la formación de agregados.
Según la invención, el término "medio filtrante" se refiere a cualquier medio que permita la separación de sólido/líquido. Preferiblemente tiene la forma de una matriz porosa que separa al menos dos compartimentos y permite la etapa de sustancias individuales de un compartimento a al menos un segundo compartimento. Cualquier procedimiento que se lleve a cabo utilizando un medio filtrante debe entenderse como "filtración" dentro del alcance de la presente invención.
Una "membrana" en el sentido de la invención es una estructura que generalmente es extendida superficialmente y tiene poros. La membrana es preferiblemente flexible y consiste en un polímero o una mezcla de polímeros. Según la invención, el polímero utilizado es, en particular, polietersulfona o celulosa (en particular celulosa regenerada). Según la invención, el "límite de exclusión" (también "límite de separación") indica la tasa de retención de filtración. Por lo general, se relaciona con la masa molar y se indica en daltons (NMWC, inglés: corte de peso molecular nominal, también MWCO, corte de peso molecular). Se define como la masa molecular mínima de una molécula retenida por el medio filtrante.
Un "pentámero" en el contexto de la invención es una estructura que está formada por cinco subunidades de polipéptidos. La unión entre las subunidades de polipéptidos individuales puede tener lugar por unión no covalente o covalente. Las cinco subunidades a menudo forman una estructura anular con simetría pentagonal. Como regla general, cada subunidad interactúa con dos subunidades vecinas.
En el contexto de la invención, "disociación" significa el procedimiento en el cual la integridad de la VLP se ve afectada de tal manera que el espacio preferiblemente encerrado por la VLP entra en contacto con el medio externo que rodea la VLP y/o las proteínas de la cápside se separan de la VLP. Por lo general, esto se logra mediante la escisión de algunos polipéptidos o proteínas que forman la VLP. Aquí, la VLP también puede descomponerse enteramente en sus subunidades como, por ejemplo, los pentámeros VP1 o L1.
Según la invención, una "reasociación" es una restauración parcial o completa de una VLP a partir de una disociación de VLP previa.
La abreviatura "GMP" es el nombre corto de "Reglamento de buenas prácticas de fabricación". Estas reglas básicas de la Organización Mundial de la Salud compilan las reglas y medidas reconocidas para la fabricación de productos medicinales y alimenticios, que garantizan una producción segura para el consumidor (paciente o consumidor) con base en el estado actual de la técnica. Además del equipo adecuado para el personal, las habitaciones y las máquinas, las reglas de GMP requieren un sistema de medidas de seguridad que se extienda desde la inspección entrante hasta la inspección saliente durante todo el procedimiento de fabricación.
Las "impurezas" deben entenderse como aquellos componentes de la composición que contiene VLP que no son deseables en la composición y, por lo tanto, deben agotarse tanto como sea posible. Estas pueden ser, por ejemplo, sales, compuestos de bajo peso molecular o también macromoleculares. La extracción de las impurezas conduce a un aumento en la pureza de la sustancia deseada, es decir a un aumento en el contenido material de la sustancia deseada (aquí VLP) con respecto a toda la mezcla de sustancias. Los términos "intercambiador de aniones" o "matriz de intercambiador de aniones" son sinónimos y ambos se refieren a sustancias naturales o artificiales que pueden unir aniones y pueden intercambiarlos por aniones de un medio circundante. Un intercambiador de aniones transporta iones positivos e intercambia contraiones cargados negativamente.
Los "intercambiadores de aniones fuertes" en el sentido de la invención llevan grupos de amonio cuaternario de tipo I:
© ©
■N(CH3)3 x
o del tipo II:
que se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, cloruro, sulfato, bromuro, yoduro, fluoruro, sulfuro, hidrosulfato, sulfuro de hidrógeno, fosfato, difosfato, monofosfato, carbonato, bicarbonato (hidrocarbonato), citrato, tartrato y ftalato. Una columna disponible comercialmente con una fuerte matriz de intercambio aniónico es, por ejemplo, la columna Mono Q de GE Healthcare (Munich, RFA).
Los "intercambiadores de aniones débiles" en el sentido de la invención portan grupos de amina terciaria o secundaria como grupos funcionales, tales como, por ejemplo, grupos dietilaminoetilo (DEAE). Una matriz de intercambio aniónico DEAE débil disponible comercialmente es, por ejemplo, el "adsorbente de membrana Sartobind Q" de Sartorius (Gottingen, RFA).
El término "ultrafiltración" se refiere a un procedimiento en el que un líquido (típicamente bajo presión) se pone en contacto con un medio filtrante, en particular una membrana semipermeable. La presión se puede aplicar ejerciendo una presión sobre el líquido ubicado sobre la membrana del filtro o centrifugando la unidad de filtro. Alternativamente, la etapa de la solución puede acelerarse aplicando una presión negativa debajo de la membrana del filtro. La membrana contiene poros de un tamaño definido para que las moléculas o complejos que son lo suficientemente pequeños como para ser porosos pasen a través de la membrana hacia el lado opuesto, mientras que permanecen las moléculas o complejos que son demasiado grandes para pasar a través de los poros en el lado de carga de la membrana. Las membranas de ultrafiltración generalmente consisten en polímeros o mezclas de polímeros y están diseñadas para un límite de separación de peso molecular específico (límite de exclusión).
El término "diafiltración" se refiere a una forma de ultrafiltración que combina las propiedades de la diálisis con las de la ultrafiltración. La adición de un disolvente al retenido de filtración permite cambiar o diluir el disolvente original (por ejempolo, "re-amortiguación").
Un "sobrenadante de cultivo celular" en el contexto de la invención es esa parte del cultivo celular que proviene de un cultivo celular y que está esencialmente libre de células que secretan VLP. En una forma de realización preferida de la invención, el sobrenadante de cultivo celular contiene menos del 5%, preferiblemente menos del 2%, en particular menos del 1% de células secretoras de VLP. El sobrenadante del cultivo celular generalmente contiene una alta proporción de contaminantes (por, ejemplo, restos celulares, proteínas o fragmentos de los mismos). El sobrenadante del cultivo celular puede tratarse, por ejemplo, química o físicamente. El sobrenadante también se puede centrifugar. Pero también puede dejarse sin tratar, es decir, por ejemplo, puede purificarse según la invención sin centrifugación. Preferentemente se centrifuga, pero no se trata química ni enzimáticamente. Según la invención, el término sobrenadante de cultivo celular presupone que el medio de partida cosechado no se ha cromatografiado. La "cromatografía" es un procedimiento que permite la separación de una mezcla de sustancias mediante una distribución diferente de sus componentes individuales entre una fase estacionaria y una móvil. En este sentido, la centrifugación no es cromatografía.
Una cromatografía de "fase inversa" es un procedimiento en el que la fase estacionaria es una fase no polar y la fase móvil es una fase polar. Cualquier sustancia inerte no polar que pueda empaquetarse como una columna puede usarse para cromatografía de "fase inversa". Ejemplos de fases estacionarias son un residuo octadecilo (C18) unido a sílice, un residuo octilo (C8), un material de sílice que lleva grupos ciano o grupos fenilo o material de sílice puro. Como una fase no polar. La elución en gradiente se usa a menudo en HPLC, por lo que la composición del disolvente se cambia lentamente (por ejemplo, de 80% a 20% de contenido de agua). Esto significa que los componentes no polares abandonan la columna muy tarde y los componentes polares muy temprano y, por lo tanto, es posible separarlos unos de otros.
Una "disrupción celular" en el contexto de la invención es una composición que resulta de la disrupción de las células. La disrupción como destrucción de la integridad celular puede lograrse mediante procedimientos químicos (por ejemplo, detergentes), procedimientos biológicos (por ejemplo, tratamiento enzimático) y/o procedimientos
físicos (por ejemplo, tratamiento de ultrasonido, fuerzas de cizalla). En este sentido, la disrupción celular puede representar un sobrenadante de cultivo celular.
El término "mezcla de traducción in vitro sin células" se refiere a un procedimiento experimental en biología molecular con la ayuda de la cual las moléculas de ARNm aisladas de las células o generadas por medio de la transcripción in vitro se usan en el recipiente de reacción para la biosíntesis de proteínas (traducción). Son útiles los llamados sistemas de traducción in vitro que contienen las enzimas necesarias y las moléculas de ARNt, así como los aminoácidos, de modo que la síntesis de proteínas se produce después de la adición del ARNm. La metionina marcada con el isótopo de azufre 35S se agrega frecuentemente a la mezcla de reacción para poder detectar los productos de traducción. Los sistemas libres de células comunes son el extracto de germen de trigo y el lisado de reticulocitos.
La invención en detalle
De acuerdo con la invención, una composición que contiene VLP se filtra a través de un medio filtrante con un límite de exclusión de más de 30 kDa a 1500 kDa. Puede preferirse usar un medio filtrante con un límite de exclusión de al menos 40 kDa. En una forma de realización particular, el límite de exclusión del medio filtrante es de 80 a 1500 kDa; Se prefiere particularmente un límite de exclusión de aproximadamente 100 kDa.
Un medio filtrante que tiene un límite de exclusión en el intervalo mencionado anteriormente permite la separación eficiente de contaminantes de peso molecular más alto de la composición que contiene VLP mientras minimiza la pérdida de rendimiento de VLP.
La composición que contiene VLP es el sobrenadante del cultivo celular de las células secretoras de VLP. Este sobrenadante de cultivo celular puede tomarse directamente del cultivo celular y luego filtrarse de acuerdo con la invención. Sin embargo, en una forma de realización de la invención, también es posible que el sobrenadante de cultivo celular sea tratado de antemano, por ejemplo, química, enzimática o térmicamente. Bajo ciertas circunstancias, este tratamiento puede facilitar la filtración de acuerdo con la invención sin salir de la propia invención.
El medio filtrante que se puede usar según la invención puede consistir en un polímero o una mezcla de polímeros. Un polímero o mezcla de polímeros se selecciona preferiblemente del grupo que comprende celulosa, polietersulfona (PES), triacetato de celulosa (CTA), acetato de celulosa, nitrato de celulosa, poliacrilonitrilo (PAN), poliamida, policarbonato y politetrafluoroetileno (PTFE). Estos polímeros forman membranas de filtro estables que son inertes, no tienden a la agregación de proteínas y pueden propveer de cavidades de diámetro controlado.
En una forma de realización de la invención, al filtrar se crea una diferencia de presión entre 0,5 bares y 10 bares, preferiblemente entre 0,5 y 5 bares y de modo particularmente preferible entre 0,5 bares y 3 bares, entre el lado del filtrado y el compartimento del lado del retenido.
Numerosos procedimientos están disponibles para el experto en la materia para crear y regular una presión correspondiente. Al centrifugar la unidad de filtro, se puede ejercer una presión resultante sobre el retenido de acuerdo con la aceleración centrífuga. Además, aplicando una sobrepresión del lado retenido, por ejemplo, se puede generar una presión por medio de una bomba o un punzón. Alternativamente, la diferencia de presión también se puede generar aplicando una presión negativa en el lado del filtrado, por ejemplo, mediante una bomba de vacío. La diferencia de presión se puede mantener constante durante el tiempo de la purificación, pero también se puede generar una diferencia de presión variable en el tiempo que, por ejemplo, como programa de filtración, incluye diferentes fases con una duración de tiempo respectiva y una presión diferente.
En una forma de realización preferida, la filtración se puede llevar a cabo como la denominada "filtración de flujo transversal" (también llamada "flujo tangencial" o "filtración de flujo cruzado"). Aquí puede generarse un flujo cruzado a una alta velocidad, por ejemplo, de aproximadamente 2,5 a 3 m/s, que fluye a lo largo de una membrana o un medio filtrante. La alta velocidad evita que en la membrana pueda crearse una torta de filtro (capa superior o suciedad) a partir de las partículas sólidas que han de separarse.
En una forma de realización alternativa de la invención, la filtración también se puede llevar a cabo utilizando el procedimiento de dead-end (callejón sin salida). En la filtración dead-end, se bombea una corriente de alimentación contra la membrana con la presión más baja posible para minimizar la compactación de las sustancias retenidas. Debido al flujo de salida permanente del permeado, en la membrana se acumula una torta de filtro (capa superior o suciedad) o un gradiente de concentración (polarización de concentración) de las partículas de proteína a separar. La torta del filtro aumenta la resistencia a la filtración y, por lo tanto, la pérdida de presión a través de la membrana. Dependiendo de la composición de la alimentación, se debe eliminar a intervalos regulares mediante lavado a contracorriente (bombeando de nuevo el medio ya separado) y purificación química y, por lo tanto, el elemento del filtro se debe regenerar.
Según la invención, el medio filtrante puede tener diferentes geometrías, tal como puede formarse, por ejemplo, en forma de una membrana enrollada en espiral, membrana tubular o membrana de fibra hueca. La diferente geometría
del filtro considera las condiciones del procedimiento con respecto al volumen de la solución, la concentración/cantidad de VLP o contaminantes o diferencia de presión aplicada.
Además del sobrenadante de cultivo celular ya mencionado, en el procedimiento de purificación divulgado también pueden usarse otras composiciones que contienen VLP. Por lo tanto, los posibles medios de acuerdo con la divulgación se seleccionan del grupo de los siguientes medios:
(a) sobrenadante de cultivo celular del cultivo de células que expresan VLP;
(b) sobrenadante de cultivo celular según (a) después de la purificación por centrifugación y/o diálisis;
(c) disrupción celular de (a);
(d) disrupción celular (posterior) después de la purificación por centrifugación y/o diálisis;
(e) mezcla de traducción in vitro sin células; o
(f) mezcla de traducción in vitro sin células después de la purificación por centrifugación y/o diálisis.
En otra forma de realización de la invención, además de la purificación, también se logra que se concentre la composición que contiene VLP. Esto sucede preferiblemente porque el volumen de material retenido que disminuye durante la filtración no se completa o se completa solo parcialmente.
Según la invención, además de la purificación, también se consigue una reamortiguación de pH de la composición que contiene VLP. Este intercambio de amortiguador tiene lugar preferiblemente porque el volumen de material retenido que disminuye durante la filtración se reemplaza por un amortiguador que tiene una composición que difiere con respecto al amortiguador de partida.
En una forma de realización preferida, el pH se reduce, y es ventajoso un pH cercano al valor de pI de las proteínas de la cápside. Para las VLP que consisten en VP1, este es un pH entre 5,0 y 8,0. Este valor de pH reducido da como resultado una estabilidad reducida de las VLP, que se pueden disociar más fácilmente en una etapa de disociación posterior y, por ejemplo, se deben usar cantidades más pequeñas de agente reductor disociador de puente disulfuro y agente complejante que enlaza iones Ca2+.
En una forma de realización de la invención, la composición que contiene VLP purificada usando el procedimiento de la invención se purifica me manera adicional mediante cromatografía, preferiblemente usando una cromatografía de intercambio aniónico.
La purificación adicional se lleva a cabo de modo preferido por separación usando un intercambiador de aniones (en particular débil). Este contiene grupos de amina primaria, secundaria o terciaria como grupos funcionales, en cuyo caso se prefieren los grupos dietilaminoetilo (DEAE). En una forma de realización preferida de la invención, la matriz de este intercambiador aniónico consiste en DEAE-Sepharose.
La elución de las VLP o los pentámeros VP1 de este intercambiador aniónico pueden prepararse según la invención mediante una solución que contiene NaCl que preferiblemente contiene NaCl en una concentración de 150 mM a 750 mM, de modo particularmente preferible NaCl de 300 mM.
En otra forma de realización de la invención, la purificación adicional de la VLP por medio de un intercambiador de aniones comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar la composición que contiene VLP purificada por ultrafiltración;
(b) poner en contacto la composición que contiene VLP con un intercambiador de aniones en condiciones que permitan que la VLP se una al intercambiador de aniones;
(c) lavado opcional del intercambiador de aniones;
(d) elución de la VLP unida;
(e) diálisis opcional de la VLP contra una solución acuosa.
Un intercambiador de aniones débil se utiliza preferiblemente para esto.
En otra forma de realización de la invención, la composición que contiene VLP purificada según la invención se purifica usando un intercambiador de aniones fuerte que contiene grupos de amonio cuaternario de tipo I o tipo II:
© G ^N(CH3)2 X
c 2 h5oh
" " (Tipo II)
donde X es un anión seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, cloruro, sulfato, bromuro, yoduro, fluoruro, sulfuro, hidrosulfato, sulfuro de hidrógeno, fosfato, difosfato, monofosfato, carbonato, bicarbonato (hidrocarbonato), citrato, tartrato o ftalato.
En un aspecto preferido de la invención, se usa una matriz Q-Sepharose o una columna MonoQ como el intercambiador de aniones fuerte.
La VLP puede eluirse del intercambiador de aniones fuerte por una o más soluciones acuosas que contienen NaCl. La concentración de NaCl se puede variar mediante un gradiente que aumenta linealmente o un gradiente escalonado.
Se prefiere un gradiente como el gradiente lineal de NaCl en el que la concentración de NaCl del amortiguador de elución aumenta de un NaCl inicial de 100 mM a 1 M. Se prefiere un gradiente de tres o cuatro etapas como el gradiente escalonado de NaCl.
El gradiente escalonado de NaCl de tres etapas puede consistir preferiblemente en las siguientes etapas:
(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,
(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,
(iii) NaCl de 1 M a 2 M; o
El gradiente escalonado de NaCl de cuatro etapas puede consistir preferiblemente en las siguientes etapas:
(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,
(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,
(iii) NaCl de 500 mM a 800 mM
(iv) NaCl de 1 M a 2 M.
En otra forma de realización de la invención, la composición que contiene VLP purificada usando el procedimiento de la invención se purifica adicionalmente mediante filtración en gel o mediante cromatografía en columna de hidroxiapatita cerámica. Estos procedimientos permiten que la VLP se separe de los monómeros de la cápsida u oligómeros de la cápsida como, por ejemplo, pentámeros.
En una forma de realización de la invención, las VLP purificadas por el procedimiento de acuerdo con la invención se purifican por un procedimiento de acuerdo con las siguientes etapas:
(a) disociación de las VLP;
(b) purificación de las VLP disociadas;
(c) Reasociación de las VLP disociadas.
La VLP se disocia preferiblemente en presencia de un agente reductor que disocia puentes de disulfuro y un agente complejante que une iones Ca2+.
En un aspecto de la invención, los compuestos que contienen azufre se usan como agentes reductores que disocian los puentes de disulfuro, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol (2-ME), ditiotreitol (DTT), ditioeritrol (DTE), glutatión, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), monotioglicerina y de modo particularmente preferible DTT.
En los casos en que la toxicidad es particularmente crítica, se prefieren los agentes reductores que disocian puentes de disulfuro: 2-mercaptoetanol (2-ME) y monotioglicerina. 2-ME puede eliminarse fácilmente debido a su volatilidad, pero la monotioglicerina, por otro lado, también es adecuada para su posterior uso en cultivo celular.
Los agentes reductores que contienen azufre son agentes reductores débiles, pero su potencial redox es suficiente para reducir los puentes de disulfuro y formar los residuos de cisteína libres. El uso de tales agentes reductores débiles tiene la ventaja de que no se reducen otros grupos funcionales de la VLP y, de esta manera, se conservan
esencialmente la integridad y la naturaleza nativa de las VLP. Según la invención, también es posible usar otros agentes reductores cuyo potencial redox se encuentre dentro del intervalo de los agentes reductores que contienen azufre mencionados anteriormente.
En otro aspecto de la invención, el agente complejante que enlaza el ion Ca2+, utilizado en la disociación, es un agente quelante, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicoltetraacético (EGTA) o las sales correspondientes de estos ácidos y particularmente se prefiere EGTA.
En una forma de realización de la invención, las VLP disociadas, que están presentes preferiblemente como proteínas de la cápside, de modo particularmente preferible como proteínas VP1 o L1, se purifican adicionalmente mediante cromatografía, preferiblemente usando cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de "fase inversa".
En una forma de realización preferida, se usa un intercambiador de aniones fuerte que contiene grupos de amonio cuaternario de tipo I o tipo II:
© ©
— N{CH3)s x
(Tipo I)
© G ^N(CH3)2 X
c 2 h5oh
" " Tipo (II)
donde X es un anión seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, cloruro, sulfato, bromuro, yoduro, fluoruro, sulfuro, hidrosulfato, sulfuro de hidrógeno, fosfato, difosfato, monofosfato, carbonato, bicarbonato, citrato, tartrato o ftalato.
En un aspecto preferido de la invención, se usa una matriz Q-Sepharose o una columna MonoQ como el intercambiador de aniones fuerte.
Según la invención, la VLP disociada (o las proteínas estructurales de la misma) se puede eluir del intercambiador aniónico fuerte mediante una o más soluciones acuosas que contienen NaCl. La concentración de NaCl se puede variar mediante un gradiente que aumenta linealmente o un gradiente escalonado. Se prefiere un gradiente como el gradiente lineal de NaCl en el que la concentración de NaCl del amortiguador de elución aumenta de NaCl de 100 mM inicial a 1 M. Se prefiere un gradiente de tres o cuatro etapas como el gradiente escalonado de NaCl.
El gradiente escalonado de NaCl de tres etapas puede consistir preferiblemente en las siguientes etapas:
(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,
(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,
(iii) NaCl de 1 M a 2 M; o
El gradiente escalonado de NaCl de cuatro etapas puede consistir preferiblemente en las siguientes etapas:
(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,
(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,
(iii) NaCl de 500 mM a 800 mM
(iv) NaCl de 1 M a 2 M.
En otra forma de realización de la invención, la purificación de la VLP disociada por medio de un intercambiador de aniones comprende las siguientes etapas:
(c) poner en contacto la composición que contiene VLP disociada con un intercambiador de aniones en condiciones que permitan que la VLP disociada se una al intercambiador de aniones;
(d) lavado opcional del intercambiador de aniones;
(e) elución de la VLP disociada unida;
(f) diálisis opcional de la VLP disociada contra una solución acuosa.
Para ello se usa preferiblemente un intercambiador de aniones fuerte.
Según la invención, la VLP disociada también puede purificarse mediante un intercambiador aniónico débil. Este contiene grupos de amina primaria, secundaria o terciaria como grupos funcionales, en cuyo caso se prefieren los grupos dietilaminoetilo (DEAE). En una forma de realización preferida de la invención, la matriz del intercambiador aniónico débil consiste en DEAE-Sepharose.
De acuerdo con la invención, la VLP disociada se eluye del intercambiador aniónico débil mediante una solución que contiene NaCl que preferiblemente contiene NaCl en una concentración de 150 mM a 750 mM, de modo particularmente preferible NaCl de 300 mM.
En otra forma de realización de la invención, la purificación de la VLP disociada por medio de un intercambiador de aniones comprende las siguientes etapas:
(c) poner en contacto la composición que contiene VLP disociada con un intercambiador de aniones en condiciones que permitan que la VLP disociada se una al intercambiador de aniones;
(d) lavado opcional del intercambiador de aniones;
(e) elución de la VLP disociada unida;
(f) diálisis opcional de la VLP disociada contra una solución acuosa.
Un intercambiador de aniones débil se utiliza preferiblemente para esto.
En una forma de realización de la invención, las VLP disociadas se purifican por medio de cromatografía de fase inversa. Aquí se prefiere la purificación por "cromatografía líquida de alto desempeño" (HPLC) usando una columna de fase inversa. Esto permite que incluso grandes cantidades de VLP disociadas se purifiquen en poco tiempo. En otra forma de realización de la invención, las VLP disociadas se purifican usando cromatografía de permeación en gel. Este procedimiento se usa preferiblemente en casos en los que se usan proteínas de cápsida modificadas, a las que se les da un peso molecular diferente por la modificación (en particular inserciones o deleciones) y, por lo tanto, se pueden separar de las proteínas de cápsida no modificadas.
Las VLP disociadas pueden purificarse opcionalmente mediante una diálisis adicional para, por ejemplo, realizar un intercambio de los componentes del amortiguador. Para diálisis se usa preferiblemente un amortiguador de pH que es osmomolar con respecto a la sangre. Se prefiere particularmente el uso de solución salina fisiológica como amortiguador de pH de diálisis.
La diálisis se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, en cuyo caso se prefiere una temperatura de 5 ± 3°C. La duración de la diálisis es convenientemente de al menos 12 horas y preferiblemente es mayor de 16 horas. La diálisis puede durar hasta 48 horas.
Para almacenar las VLP disociadas, es ventajoso tomar las VLP disociadas en un amortiguador con un pH bajo (5,0 a 7,5) y con una mayor concentración de NaCl (250 mM a 500 mM). Esto evita la agregación. El almacenamiento se lleva a cabo a una temperatura de -80°C. Alternativamente, las VLP disociadas también pueden convertirse en una forma de almacenamiento estable mediante liofilización.
En una forma de realización particular, la VLP puede contener una o más sustancias en el interior de la estructura de la cápside. Dichas sustancias incluyen, por ejemplo, macromoléculas como, por ejemplo, ácidos nucleicos, es decir, ARN, ADN o ácidos nucleicos artificiales modificados, así como proteínas y otras sustancias fisiológicamente activas, que pueden ser naturales, sintéticas o recombinantes. Ejemplos de tales sustancias fisiológicamente activas son, por ejemplo, lípidos, fosfolípidos, péptidos, fármacos, toxinas, etc.
La VLP purificada y opcionalmente cargada con sustancia activa puede reasociarse mediante diálisis con un amortiguador de reasociación que contiene cationes divalentes o, si no, el catión monovalente Rb+. Este amortiguador contiene preferiblemente un catión seleccionado del grupo que consiste en Mg2+, Rb+ o Zn2+ y de modo particularmente preferido Ca2+. El amortiguador de reasociación contiene 0,1 mM a 10 mM de iones Ca2+, preferiblemente 0,5 mM a 5 mM de iones Ca2+ y en especial 1 mM de CaCl2.
En otra forma de realización de la invención, las VLP cargadas con la sustancia activa se purifican por medio de cromatografía de permeación en gel. Esto permite que las moléculas de sustancia activa se separen de las VLP cargadas con moléculas objetivo.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de purificación que, a partir de un sobrenadante de cultivo celular, da como resultado una composición que contiene VLP con una pureza de VLP de al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, en particular al menos 95% o lo más preferiblemente al menos 99% y, por lo tanto, es superior a los procedimientos de purificación VLP anteriores. La pureza de la VLP significa la proporción relativa de la VLP en la mezcla total de sustancias como resultado del procedimiento de purificación. Esta composición de VLP está libre de PEG y/o sales y preferiblemente libre de PEG.
Las VLP consisten esencialmente o exclusivamente en la proteína de la cápside VP1 que se deriva de la proteína de la cápsida VP1 del poliomavirus humano JC (JCV) o es idéntica a ella. La secuencia de la VP1 del poliomavirus humano JC se reproduce en la SEQ. ID. NO. 1.
Para la preparación de VP1 recombinante en células de insecto, de acuerdo con la invención puede usarse un ácido nucleico que se ha optimizado para la expresión en estas células puede usarse. Por ejemplo, se puede usar la secuencia mostrada en SEQ. ID. NO. 2 o una secuencia complementaria a la misma, una secuencia correspondiente a esta secuencia en el contexto de la degeneración del código genético o una secuencia hibridizante con estas en condiciones rigurosas. Para este propósito, la secuencia de ácido nucleico o un vector recombinante que contiene esta secuencia se introduce en una célula anfitriona adecuada, la célula anfitriona se cultiva en condiciones en las que se expresa la secuencia de ácido nucleico y la proteína se aísla de la célula o del sobrenadante celular. Las condiciones de hibridación estrictas se definen preferiblemente de acuerdo con Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e incluyen una etapa de lavado de 30 minutos en 0,1 x SSC, 0,5% SDS a 60°C, y preferiblemente 68°C.
En el contexto de la presente invención, por lo tanto, se usa preferiblemente un polipéptido VP1, que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ. ID. NO. 3, que tiene al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, de manera particularmente preferible al menos 90% y lo más preferiblemente al menos 95% de la secuencia de aminoácidos idéntica, en cuyo caso se determina la identidad en todo el intervalo de SEQ ID No. 3.
En otra forma de realización, se usa una proteína VP1 en la que la secuencia de aminoácidos en la región N-terminal, por ejemplo, fue cambiada en el intervalo de 25 aminoácidos N-terminales. Una señal de localización nuclear heteróloga se introduce preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de la VP1. Las señales de localización nuclear preferidas contienen la secuencia de aminoácidos CPGAAPX1X2P, donde X1 y X2 denotan cualquier aminoácido y de preferencia respectivamente K y, por ejemplo, se basan en las señales de localización del núcleo de SV40 o bKv . Las secuencias de aminoácidos de las señales de localización nuclear particularmente preferidas se describen en el documento EP 2036 980 A1, que con esto se incorpora por completo a la presente solicitud.
La VP1 preparada por expresión recombinante se expresa preferiblemente en células eucariotas y de manera particularmente preferible en células de insecto.
En otra forma de realización, se utiliza una proteína VP2 (SEQ ID N° 6), una proteína VP3 (SEQ ID N° 10), una proteína L1 (SEQ ID N° 13) o una proteína L2 (SEQ ID N° 15).
Las secuencias de ácido nucleico de tipo silvestre se pueden usar para la expresión recombinante, por ejemplo, la SEQ ID No. 4 para VP2, la SEQ ID No. 8 para VP3, la SEQ ID No. 12 para L1 y la SEQ ID No. 14 para L2.
En otra forma de realización, las secuencias de ácido nucleico están optimizadas con codones para el sistema de expresión correspondiente. En una forma de realización particular, las siguientes secuencias de ácido nucleico se usan para la expresión en células de insecto: SEQ ID No. 2 para una proteína VP1, SEQ ID No. 5 para una proteína VP2, SEQ ID No. 7 para una proteína VP2-HA, SEQ ID N° 9 para una proteína VP3-HA.
En una forma de realización particular, la proteína N-terminal o C-terminal respectiva se cambia para mejorar el uso como vacuna. En una forma de realización particular, este es un péptido localizado en el extremo C que comprende el epítopo de hemagluttinina (abreviado como "HA"). Ejemplos de una proteína modificada de este tipo son la proteína VP2-HA (SEQ ID No. 7) y la proteína VP3- HA (SEQ ID No. 11).
En una forma de realización preferida, para la expresión recombinante de las proteínas de la cápside VP1, VP2, VP2-HA, VP3-HA, L1 o L2 y, por lo tanto, para proporcionar VLP se usan células de Spodoptera frugiperda como, por ejemplo, la línea celular SF9, la línea celular SF21 o la línea celular SF158. También se pueden usar otras líneas celulares de insectos, por ejemplo, Trichoplusia ni TN-368, IAL-TND1, Lymantria dispar IPLB-LdFB, Mamestra brassica IZD-MB0503, L. dispar IPLB-LdElta, Anticarsa gemmatalis UFL Ag286, Plodia interpunctella IAL-PID2, Plutella xylostella BCIRL-PxHNU3, T. ni BTI-TN5B1-4 (HiFive®), Manduca sexta MRRL-CH1, líneas de Heliothis virescens: IPLB-HvT1, IPLB-HvE1A, IPLB-HvE6A y la línea celular Diabrotica undecimpunctata IPLB-DU182A.
Las VLP de acuerdo con la invención pueden usarse para fines de diagnóstico y terapéuticos, por ejemplo, para el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades y afecciones. Para este propósito, pueden contener sustancias terapéuticamente activas o también pueden usarse sin sustancias incluidas.
En una forma de realización preferida, la enfermedad es una infección causada por el virus JC, como PML.
EJEMPLO 1: Preparación de una "cepa de semilla" de baculovirus
1. Preparación del bácmido recombinante.
La secuencia optimizada con codón según la SEQ. ID. NO. 2 del gen VP1 se clonó en plásmidos pFastBac1 de GENEART. El plásmido pFastBac1 se transformó en células de DH5alfa E. coli, las células bacterianas se incrementaron y las bacterias se almacenaron como reservas de glicerina a -80°C. El plásmido pFasBac-VP1 se transformó en células de E. coli DH10Bac para aumentar el ADN de Baculo.
1.1. Transformación de la bacteria DH10Bac E. coli.
Para revitalizar la bacteria DH10Bac E. coli, las células Max Efficiency DH10Bac E. coli se retiran del congelador ultrabajo (-80°C), se descongelan en hielo y se extraen respectivamente 100 pl de la bacteria y se transfieren a un tubo de ensayo de 10 ml.
1.2. Las células DH10Bac E. coli se mezclan con 1 ng (=1 pL) de plásmido pFasBac-VP1 y se incuban en hielo durante 30±3 min. Las bacterias se transformaron con el plásmido de ADN pFastBac1-VP1.
1.3. El ADN recombinante de baculo VP1 se aísla de acuerdo con procedimientos estándar.
2. Revitalización de las células SF9 criopreservadas
Para revitalizar las células SF9, se retira un criotubo de las células SF9 del tanque de almacenamiento de nitrógeno y se descongela. Después del final del procedimiento de descongelación, las células en el tubo de ensayo de 15 ml se distribuyen uniformemente invirtiendo cuidadosamente tres veces y se toma una alícuota para determinar el número de células y la vitalidad (número de células vivas).
Una vez que se completa el procedimiento de descongelación, las células se transfieren a una botella de cultivo celular de un tamaño adecuado (T75 o T175), de modo que se logra una densidad celular de 3 x 105 células vitales por mililitro. En el caso de un T75, la suspensión celular se ajusta a un volumen de <30 ml, en el caso de una botella de cultivo celular T175, la suspensión celular se ajusta a un volumen de >30 ml y <50 ml de medio completo y se transfiere a la botella de cultivo celular. Para la expansión, las células SF9 se incuban en una incubadora a una temperatura de 26°C y una humedad de >80%.
3. Expansión de las células
Las células se incuban en la incubadora hasta que la capa celular tenga una densidad superior al 70%. Luego, se separan las células del fondo del recipiente de cultivo celular y se distribuyen a una botella más grande de cultivo celular o a varias botellas de cultivo celular. Para este propósito, las células en la botella de cultivo celular se enjuagan con amortiguador PBS y se separan de su superficie de crecimiento con el raspador celular. Para distribuir las células de manera uniforme en el medio completo, el recipiente de cultivo se gira cuidadosamente y luego se toma una alícuota para el recuento de células. Al volver a sembrar, se siembran 1x106 células/pocillo en 3 ml de medio completo.
4. Transfección de las células de insecto con complejos recombinantes VP1-Baculo-ADNCellfectina
De 16 hasta 24 horas después de sembrar las células en placas de 6 pocillos, se retira el recipiente de cultivo celular de la incubadora, se disminuye el medio completo y se agrega 1 ml de medio precalentado, sin suero por pocillo. Ahora se preparan los complejos ADN-Cellfectina. Para este fin, se mezclan 8 pl de reactivo Cellfectina con 100 pl de medio sin suero. Se diluyen 2 pg (=2 pL) de VP1-Baculo-ADN con medio sin suero. El lote de Cellfectina se purifica con el lotge de VP1-Baculo-ADN y se incuba durante 30±2 min a temperatura ambiente (20 ± 4°C). Se pipetean 210 pl de los lotes de transfección Cellfectina-ADN en cada pocillo de la placa de 6 pocillos y las células se incuban en la incubadora durante 5 horas ± 15 minutos a 26 ± 1°C. Luego, el medio se retira de los pocillos individuales de la placa de 6 pocillos utilizando el lote de transfección Cellfectina-ADN y se añaden 2 ml/pocillo de medio completo. Las células transfectadas se incuban adicionalmente durante 72 ± 1 hora a 26 ± 1°C. Los baculovirus recombinantes se liberan en el medio de cultivo celular durante este tiempo. Para recolectar los baculovirus recombinantes, el medio de cultivo celular que contiene el virus de las células transfectadas se retira y se transfiere a un tubo de muestra de 15 ml y se centrifuga durante 10 minutos a 2000 * g a 4°C para separar los restos celulares contenidos en las células lisadas del medio de cultivo celular que contiene el virus. A continuación, el medio de cultivo celular que contiene virus (el sobrenadante) se transfiere a un tubo de muestra de 2 ml y se almacena a 5 ± 3°C hasta su uso posterior. Los baculovirus se llaman P1. 1 ml de estos se almacena a -80 ± 5°C. El volumen restante se almacena para la preparación de la cepa de semillas.
5. Preparación de la cepa de semillas de baculovirus
5.1. Preparación de células de insecto Sf9 para la preparación de baculovirus.
Las células se incuban en la incubadora hasta que la capa de células tenga una densidad superior al 70%. Luego, las células se desprenden del fondo del recipiente de cultivo celular y se distribuyen sobre una superficie de crecimiento más grande o varias botellas de cultivo celular. Para este propósito, las células en la botella de cultivo celular se enjuagan con amortiguador PBS y se desprenden de su superficie de crecimiento con el raspador celular. Para distribuir las células de manera uniforme en el medio completo, el recipiente de cultivo se gira cuidadosamente y luego se toma una muestra para determinar el número de células. Por medio del número determinado de células, se siembran 5 x 106 células por botella de cultivo de células T25 en 5 ml de medio completo.
5.2. Infección de las células SF9 con los baculovirus recombinantes
De 16 hasta 24 horas después de sembrar las células, se retira la botella de cultivo celular de la incubadora y se comprueba el medio completo visualmente y microscópicamente en busca de turbidez y, por lo tanto, de posible contaminación. Luego se retira el medio completo y se agregan 4 ml de nuevo medio completo precalentado. Se agrega 1 ml de baculovirus P1 en medio completo. Durante la siguiente infección, las células SF9 se incuban con los baculovirus recombinantes a 26 ± 2°C durante 3 (± 1) días en la incubadora.
5.3. Cosecha del baculovirus recombinante
Para recolectar los baculovirus producidos, el medio de cultivo celular de las células infectadas se retira y se transfiere a un tubo de ensayo de 15 o 50 ml y se centrifuga durante 10 minutos a 2000 * g a 4°C para separar los restos celulares contenidos de las células lisadas del medio que contiene el virus. El medio de cultivo celular que contiene el virus (sobrenadante) se almacena a 5 (± 3) °C.
Para cuantificar el título de los virus, el ADN del baculovirus se aísla de 150 pl de medio que contiene virus y se amplifica y cuantifica por medio de PCR cuantitativa. Los baculovirus se denominan P2 y se almacenan a -80 ± 5°C.
6. Almacenamiento de baculovirus recombinantes.
Cada ml de P1 y P2 se toman dos veces y se transfieren a criotubos de 2 ml etiquetados y se almacenan como muestras de reserva a - 80 (± 5) °C.
EJEMPLO 2: Preparación de VP1-VLP por expresión mediada por baculovirus en células SF9
1. Revitalización de las células SF9 criopreservadas.
Para revitalizar las células SF9, se retira un criotubo de las células SF9 del tanque de almacenamiento de nitrógeno en la habitación B.OG 2.4.06 y se descongela. Después del final del procedimiento de descongelación, las células se distribuyen uniformemente en el tubo de ensayo de 15 ml mediante una cuidadosa inversión y se toma una muestra para determinar el número de células y la vitalidad (número de células vivas).
Una vez que se completa el procedimiento de descongelación, las células se transfieren a una botella de cultivo celular de un tamaño adecuado (T75 o T175, botellas de suspensión de 500 ml), de modo que se logra una densidad celular de 3 * 105 células por mililitro. El tamaño de la botella de cultivo celular depende del número de células congeladas y su vitalidad después de la descongelación. En el caso de un T75, la suspensión celular se ajusta a un volumen >10 y <30 ml, en el caso de una botella de cultivo celular T175, la suspensión celular se ajusta a un volumen de >30 ml y <50 ml de medio completo y se transfiere a la botella de cultivo celular. Para la expansión, las células SF9 se incuban en una incubadora a una temperatura de 26°C y una humedad de >80%.
2. Expansión de las células.
Las células se incuban en la incubadora hasta que la capa de células tenga una densidad superior al 70%. Luego, las células se enjuagan con amortiguador PBS, se desprenden del fondo del recipiente de cultivo celular con un raspador celular estéril y se distribuyen en una botella de cultivo celular más grande o en varias. Para distribuir las células de manera uniforme en el medio completo, el recipiente de cultivo se gira cuidadosamente y luego se extrae una para determinar la cantidad de células. El número de células determinado determina el volumen del medio completo en el que las células se resuspenden posteriormente y el tamaño o número de botellas de cultivo celular en las que se transfieren las células SF9. Se aplica lo siguiente: se siembran 3x105 células/ml de medio completo. La suspensión celular se transfiere a una botella T75 de 12 a 30 mililitros y a una botella T175 de 30 a 50 mililitros, y de 300 a 500 ml en la botella de suspensión. Un día después de transferir las células SF9 a nuevas botellas de cultivo celular, se inicia la preparación de las células SF9 para la infección con baculovirus.
3. Infección de las células SF9 con baculovirus
3.1. Preparación de las células SF9 para la infección con baculovirus.
Antes del propio procedimiento de infección, las células SF9 se desprenden de su superficie de crecimiento, se determina el número de células vitales y las células se transfieren a una o más botellas de cultivo celular T175 o a una botella de suspensión de 500 ml. Para este propósito, se siembran 3 x 107 células en 50 ml de medio completo por botella de cultivo celular T175 y 30 a 50 x 108 por botella de suspensión de 500 ml en medio sin suero.
3.2. Infección de las células SF9 con baculovirus
De 16 hasta 24 horas después de sembrar las células, se retira la botella de cultivo celular de la incubadora, se retira el medio completo y se añaden 10 ml de medio precalentado, sin suero. Ahora la botella de cultivo celular se gira cuidadosamente y el medio sin suero se retira nuevamente. Para que la capa de células no se seque, se añaden inmediatamente 10 ml de medio sin suero y la cantidad de baculovirus recombinantes se pipetea en medio completo, de modo que se logra una multiplicidad de la infección (MOI) de 1. Las células en suspensión SF9 se infectan con MOI 5 directamente en volumen completo. Durante la siguiente infección, las células SF9 se incuban con los baculovirus durante 20 ± 5 min a temperatura ambiente (20 ± 4°C). Luego se añaden 30 ml de medio de cultivo celular sin suero a cada botella de cultivo celular T175 y las células adherentes o en suspensión se incuban en la incubadora durante otros 5 (± 1) días.
4. Cosecha de VP1 -VLP.
Para cosechar la VP1-VLP, se extrae el medio de cultivo celular de las células infectadas y se transfiere a un tubo de muestra de 50 ml y se centrifuga durante 60 minutos a 5000xg y 5°C para separar los restos celulares contenidos de las células lisadas del medio que contiene proteínas. El medio de cultivo celular que contiene proteínas (sobrenadante) se transfiere a un vaso de precipitados adecuado y se almacena a 5 (± 3)°C.
EJEMPLO 3: Purificación del VP1-VLP utilizando un intercambiador de aniones débil
1. Purificación de VP1-VLP utilizando DEAE-FPLC
Las VP1-VLP en el medio de cultivo celular se purifican mediante filtración de flujo cruzado (sistema Vivoflow Easy Load de Sartorius) y también se concentran en la misma etapa del procedimiento. El sistema de flujo cruzado está preparado para su uso. Se colocan 500 ml de ddH20 en un depósito adecuado y se lava el sistema con este. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares. Se colocan 500 ml de Tris-HCl 10 ml en el depósito, se lava el sistema con este. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares.
El sobrenadante del cultivo celular se libera de posibles restos celulares en una etapa de centrifugación. El sobrenadante de cultivo celular clarificado se transfiere al depósito y se bombea a través del sistema. El volumen original se reduce a la mitad y luego se conecta un depósito más grande (generalmente con un volumen de 1 a 2 l) con el sistema amortiguador estándar (Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM). El medio se intercambia luego con un sistema amortiguador Tris-HCl (Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM). El volumen se reduce a 150 ml. Esta filtración de flujo cruzado elimina todas las impurezas de bajo peso molecular, incluidas las proteínas y los fragmentos de proteínas con un tamaño de 100 kDa.
Las VLP están inicialmente presentes en la muestra como partículas intactas. La siguiente cromatografía de intercambio aniónico separa las contaminaciones de proteínas y los ácidos nucleicos libres contenidos en la muestra. Se utiliza una columna DEAE-Sepharose como un intercambiador de iones débil. Las VLP se miden en el amortiguador estándar usando un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M) o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. 1 M a NaCl 2 M).
2. Post-purificación opcional por diálisis
Opcionalmente, la muestra que contiene VLP se dializa contra Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 50 a 150 mM, pH 7,5 durante 24 ± 2 horas para establecer la concentración de sal correctamente.
3. Almacenamiento del VP1-VLP,
Las VP1-VLP se diluyen con Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 150 mM, pH 7,5 a la concentración de 0,5 mg/ml, se distribuyen en alícuotas en tubos de ensayo de 1,5 ml y se almacenan a -80 ± 5°C.
EJEMPLO 4: Purificación del VP1-VLP utilizando un intercambiador de aniones fuerte
1. Purificación de VP1-VLP usando Q-Sepharose FPLC
Las VP1-VLP en el medio de cultivo celular se purifican mediante filtración de flujo cruzado (sistema Vivoflow Easy Load de Sartorius) y también se concentran en la misma etapa del procedimiento. El sistema de flujo cruzado está preparado para su uso. Se colocan 500 ml de ddH20 en un depósito adecuado y se lava el sistema con el mismo. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares. Se colocan 500 ml de Tris-HCl de 10 mM en el depósito, se lava el sistema con el mismo. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares.
El sobrenadante del cultivo celular se libera de posibles restos celulares en una etapa de centrifugación. El sobrenadante de cultivo celular clarificado se transfiere al depósito y se bombea a través del sistema. El volumen original se reduce a la mitad y luego se conecta un depósito más grande (generalmente con un volumen de 1 a 2 l) con el sistema amortiguador estándar (Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM). El medio se intercambia luego con un sistema amortiguador Tris-HCl (Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM). El volumen se reduce a 150 ml. Esta filtración
de flujo cruzado elimina todas las impurezas de bajo peso molecular, incluidas las proteínas y los fragmentos de proteínas con un tamaño de 100 kDa.
Las VLP están inicialmente presentes en la muestra como partículas intactas. La siguiente cromatografía de intercambio aniónico separa las contaminaciones de proteínas y los ácidos nucleicos libres contenidos en la muestra. Aquí se usa una columna Q-Sepharose como un intercambiador iónico fuerte. Las VLP se miden en el amortiguador estándar usando un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M) o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. NaCl de 1 M a 2 M).
2. Post-purificación opcional por diálisis.
Opcionalmente, la muestra que contiene VLP se dializa luego contra Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 50 a 150 mM, pH 7,5 durante 24 ± 2 horas para establecer la concentración de sal correctamente.
3. Almacenamiento del VP1-VLP.
Las VP1-VLP se diluyen con Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 150 mM, pH 7,5 a la concentración de 0,5 mg/ml, se distribuyen en alícuotas en tubos de ensayo de 1,5 ml y se almacenan a -80 ± 5°C.
EJEMPLO 5: Purificación de los pentámeros VP1 usando un intercambiador aniónico débil
1. Disociación de las VLP en pentámeros VP1
En la primera etapa, las VLP en la muestra se disocian agregando DTT de 5 a 20 mM y EGTA de 10-30 mM (concentración final) a temperatura ambiente durante 1 hora y se aplican a una columna con una matriz DEAE como un intercambiador aniónico débil con matriz DEAE. Esta etapa es esencial para obtener una pureza de casi el 100% de los pentámeros VP1, ya que en esta etapa se eliminan los ácidos nucleicos empaquetados y otros contaminantes. Los pentámeros se tratan con un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M), o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. NaCl de 1 M a 2 M).
2. Post-purificación opcional por diálisis
En el caso de que se requiera una reducción en la concentración de sal, la solución que contiene pentámeros VP1 se puede dializar opcionalmente contra solución salina fisiológica durante la noche a 5 ± 3°C. Al envasar ingredientes activos, los pentámeros VP1 se mezclan con el ingrediente activo sin esta etapa opcional de purificación posterior (véase la siguiente etapa 3).
3. Mezcla de los pentámeros VP1 con los ingredientes activos.
Se mezclan 1 |jg a 100 |jg de pentámeros VP1 purificados con 1 a 10 |jg de ADN plasmídico. La mezcla se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se coloca en una cámara de diálisis (por ejemplo, de Pierce) con tamaños de poro entre 5kDa y 20kDa. Las cámaras de diálisis se colocan en un amortiguador de reasociación.
4. Reasociación de los pentámeros VP1 en las VLP
Los pentámeros VP1 se reasocian en las VLP por diálisis contra un denominado amortiguador de reasociación que contiene CaCl2 de 1 a 5 mM, Tris-HCl de 10 mM y NaCl de 150 mM, pH 7,5) a 5 ± 3°C durante 24-48 h.
5. Almacenamiento de las VLP que contienen ingrediente activo
Luego, las VLP se almacenan a 5 ± 3°C hasta su posterior tratamiento o se congelan a -80°C para su almacenamiento permanente.
EJEMPLO 6: Purificación de los pentámeros VP1 usando un intercambiador de aniones fuerte
Las VP1-VLP en el medio de cultivo celular se purifican mediante filtración de flujo cruzado (sistema Vivoflow Easy Load de Sartorius) y también se concentran en la misma etapa del procedimiento. El sistema de flujo cruzado está preparado para su uso. Se colocan 500 ml de ddH20 en un depósito adecuado y se lava el sistema con el mismo. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares. Se colocan 500 ml de Tris-HCl de 10 mM en el depósito, se lava el sistema con el mismo. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares.
El sobrenadante del cultivo celular se libera de los restos celulares en una etapa de centrifugación. El sobrenadante de cultivo celular clarificado se transfiere al depósito y se bombea a través del sistema. El volumen original se reduce a la mitad y luego se conecta un depósito más grande (generalmente con un volumen de 1 a 2 litros) con el sistema de amortiguador estándar (generalmente se usa Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM como el amortiguador estándar). El medio se intercambia luego con un sistema de amortiguador Tris-HCl (generalmente se usa Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM como el amortiguador estándar). El volumen se reduce a 150 ml. Esta filtración de flujo
cruzado elimina todas las impurezas de bajo peso molecular, incluidas las proteínas y los fragmentos de proteínas con un tamaño de 100 kDa.
2. Disociación de las VLP en pentámeros VP1
En la primera etapa, las VLP en la muestra se disocian agregando DTT de 5 a 20 mM y EGTA de 10-30 mM (concentración final) a temperatura ambiente durante 1 hora y se aplican a una columna Mono Q o columna Q Sepharose. Esta etapa es esencial para obtener una pureza de casi el 100% de los pentámeros VP1, porque en esta etapa se eliminan los ácidos nucleicos empaquetados y otros contaminantes. Los pentámeros se tratan con un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M), o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. NaCl de 1M a 2 M).
3. Post-purificación opcional por diálisis
En el caso de que se requiera una reducción en la concentración de sal, la solución que contiene pentámeros VP1 se puede dializar opcionalmente durante la noche contra solución salina fisiológica a 5 ± 3°C. Al envasar ingredientes activos, los pentámeros VP1 se mezclan con el ingrediente activo sin esta etapa opcional de purificación posterior (véase la siguiente etapa 3).
4. Mezcla de los pentámeros VP1 con los ingredientes activos.
1|jg a 100 |jg de los pentámeros VP1 purificados se mezclan con 1 a 10 |jg de ADN plasmídico. La mezcla se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se coloca en una cámara de diálisis (por ejemplo, de Pierce) con tamaños de poro entre 5kDa y 20kDa. La diálisis se lleva a cabo contra un amortiguador de reasociación.
5. Reasociación de los pentámeros VP1 en las VLP
Los pentámeros VP1 se reasocian en las VLP por diálisis contra un denominado amortiguador de reasociación que contiene CaC^de 1 a 5 mM, Tris-HCl de 10 mM y NaCl de 150 mM, pH 7,5) a 5 ± 3°C durante 24-48 h.
6. Almacenamiento de las VLP que contienen ingrediente activo
Luego, las VLP se almacenan a 5 ± 3°C hasta su posterior tratamiento o se congelan para un almacenamiento permanente a -80°C o se liofilizan alternativamente.
Abreviaturas
Bácmido = vector lanzadera (shuttle), propagable en E. coli y en células de insecto
FCS = suero fetal de ternera
LAF = flujo de aire laminar
min = minutos
rpm = revoluciones por minuto
RT = temperatura ambiente
T25, T75, T175 = botellas de cultivo celular con área de crecimiento 25, 75 o 175 cm2
medio completo = Medio de insecto TC-100 con 10% de suero de ternera fetal
VLP = partícula similar a virus
VP1 = proteína 1 viral del virus JC
Listado de figuras
Fig. 1: Diagrama de flujo para la preparación de baculovirus que codifican VP1 por transfección de células de insecto SF9.
Fig. 2: Diagrama de flujo para la recolección de los baculovirus para crear una "cepa de semillas".
Fig. 3: Diagrama de flujo para el procedimiento de preparación de VLP: Parte 1 infección de las células SF9 Fig. 4: Diagrama de flujo para el procedimiento de preparación de VLP: Parte IIa Purificación de las VLP por FPLC con un intercambiador de aniones fuerte
Claims (11)
1. Procedimiento para la purificación de partículas similares a virus (VLP), caracterizado porque se filtra una composición que contiene VLP por un medio filtrante con un límite de exclusión de más de 30 kDa a 1500 kDa, en cuyo caso como composición que contiene VLP se usa el sobrenadante del cultivo de las células que expresan VLP (sobrenadante de cultivo celular), en donde las VLP se componen de la proteína estructural VP1 del virus JC humano y con la filtración se efectúa al mismo tiempo una reamortiguación de pH) de la composición que contiene VLP.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el medio filtrante presenta un límite de exclusión de más de 30 kDa a 100 kDa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en donde al filtrar se desarrolla una diferencia de presión entre 0,5 bares y 10 bares, preferiblemente entre 0,5 y 5 bares y de modo particularmente preferido entre 0,5 bares y 3 bares.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde al reamortiguar el pH desciende a un valor entre 5,0 y 8,0.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde la filtración se realiza como filtración de flujo cruzado (crossflow).
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en donde la filtración de flujo cruzado genera una corriente transversal de 2,5 a 3 m/s que fluye a lo largo del medio de filtro.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde con la filtración al mismo tiempo se efectúa una concentración de la composición que contiene VLP.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde el sobrenadante de cultivo celular se centrifuga antes de la filtración, pero no se trata de modo enzimático o químico, o se somete a cromatografía.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde las VLP se someten adicionalmente a las siguientes etapas:
(a) Disociación de las VLP;
(b) purificación de las VLP disociadas;
(c) Reasociación de las VLP.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, después de la filtración, la composición que contiene VLP se purifica adicionalmente mediante cromatografía, de preferencia mediante cromatografía de intercambio aniónico.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la VLP presenta la proteína estructural VP1 con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos según SEQ. ID. NO:1 o SEQ. ID. NO:2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20110176295 EP2554664A1 (de) | 2011-08-02 | 2011-08-02 | Verfahren zur Aufreinigung von Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) |
| PCT/EP2012/003273 WO2013017272A1 (de) | 2011-08-02 | 2012-08-01 | Verfahren zur aufreinigung von virus-ähnlichen partikeln (vlp) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2769643T3 true ES2769643T3 (es) | 2020-06-26 |
Family
ID=46796518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES12753905T Active ES2769643T3 (es) | 2011-08-02 | 2012-08-01 | Procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP) |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9868762B2 (es) |
| EP (2) | EP2554664A1 (es) |
| DK (1) | DK2739725T3 (es) |
| ES (1) | ES2769643T3 (es) |
| SI (1) | SI2739725T1 (es) |
| WO (1) | WO2013017272A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3031820A1 (en) * | 2014-12-08 | 2016-06-15 | Life Science Inkubator | JC Polyomavirus VLP (virus-like particle) with a targeting peptide |
| CN110225790A (zh) * | 2016-12-09 | 2019-09-10 | 龙沙有限公司 | 减少药物中病毒滴度的方法 |
| US11279938B2 (en) | 2018-12-18 | 2022-03-22 | Neuway Pharma Gmbh | Drug delivery system and methods providing thereof |
| CN112125950A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-12-25 | 哈尔滨维科生物技术有限公司 | 一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法 |
| US11821000B2 (en) | 2020-11-10 | 2023-11-21 | Dionex Corporation | Method of separating viral vectors |
| WO2022261149A2 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | Scribe Therapeutics Inc. | Particle delivery systems |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9101550D0 (en) | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
| DE19543553B4 (de) | 1995-11-22 | 2009-04-09 | Deutsches Primatenzentrum Gmbh | VP-Antigene des JC-Virus |
| DE10131145B4 (de) * | 2001-06-28 | 2005-07-14 | Innovent E.V. | Zusammensetzung zum zellspezifischen Transfer von Wirkstoffen |
| KR20080047343A (ko) | 2005-06-17 | 2008-05-28 | 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 유기/무기 루이스산 복합 재료 |
| EP1736538A1 (en) | 2005-06-21 | 2006-12-27 | Cytos Biotechnology AG | Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs) |
| SG179488A1 (en) * | 2007-03-14 | 2012-04-27 | Ligocyte Pharmaceuticals Inc | Virus like particle purification |
| EP2036980A1 (de) | 2007-09-14 | 2009-03-18 | Gruber, Jens | Herabregulation der Genexpression mittels Nukleinsäure-beladener virusähnlicher Partikel |
| EP2133358A1 (en) * | 2008-06-10 | 2009-12-16 | Universitätsklinikum Freiburg | Rift valley fever virus-like particles and their use for immunization and as test system |
-
2011
- 2011-08-02 EP EP20110176295 patent/EP2554664A1/de not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-08-01 WO PCT/EP2012/003273 patent/WO2013017272A1/de not_active Ceased
- 2012-08-01 EP EP12753905.4A patent/EP2739725B1/de active Active
- 2012-08-01 DK DK12753905.4T patent/DK2739725T3/da active
- 2012-08-01 SI SI201231725T patent/SI2739725T1/sl unknown
- 2012-08-01 US US14/236,210 patent/US9868762B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-08-01 ES ES12753905T patent/ES2769643T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2739725B1 (de) | 2019-11-06 |
| WO2013017272A1 (de) | 2013-02-07 |
| EP2554664A1 (de) | 2013-02-06 |
| SI2739725T1 (sl) | 2020-04-30 |
| EP2739725A1 (de) | 2014-06-11 |
| US20140309408A1 (en) | 2014-10-16 |
| DK2739725T3 (da) | 2020-02-17 |
| US9868762B2 (en) | 2018-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2769643T3 (es) | Procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP) | |
| ES2813413T3 (es) | Métodos y composiciones para la producción de virus vaccina | |
| ES2278399T3 (es) | Metodo mejorado para la produccion y purificacion de vectores adenovirales. | |
| ES2218185T3 (es) | Metodo para la purificacion de adn plasmidico exento de rnasa y de solvente organico, usando filtracion de flujo tangencial. | |
| ES2345606T3 (es) | Multiplicacion de virus en un cultivo celular. | |
| ES2557997T3 (es) | Métodos para generar preparados de vectores AAV de título elevado sin virus auxiliar | |
| ES2578514T3 (es) | Método para la producción de vectores adenovíricos | |
| EP3151866B1 (en) | Chimeric capsids | |
| US11697825B2 (en) | Compositions and methods for the production of scAAV | |
| US10023846B2 (en) | Production method for non-enveloped virus particles | |
| ES2338288T3 (es) | Metodo mejorado para la produccion y purificacion de vectores adenovirales. | |
| ES2317517T5 (es) | Purificación de virus usando ultrafiltración | |
| EP3262162A1 (en) | Regulatable expression using adeno-associated virus (aav) | |
| ES2230820T3 (es) | Procedimiento de inactivacion de virus envueltos en una preparacion virica de adenovirus. | |
| ES2733489T3 (es) | Proceso de purificación de poliovirus a partir de cultivos celulares | |
| WO2021154923A2 (en) | Methods and systems for producing aav particles | |
| BR112012008516B1 (pt) | Método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula | |
| JP2005523722A (ja) | 改善されたウイルス精製方法 | |
| CN108085301B (zh) | 从宿主细胞提取和纯化腺相关病毒和腺病毒的方法及其组分和试剂盒 | |
| US10851350B1 (en) | Bioreactor production of virus from adherent cells | |
| WO2021041485A1 (en) | Controlled expression of viral proteins | |
| WO2024044892A1 (zh) | 一种用于基因靶向与表达的aav-8型血清型的改造型载体及其构建方法及应用 | |
| Zhu et al. | CRISPR engineering of bacteriophage T4 to design vaccines against SARS-CoV-2 and emerging pathogens | |
| CN116529382A (zh) | 由贴壁细胞在生物反应器中产生病毒 | |
| TW202216992A (zh) | 從細胞培養物中製備純化之桿狀病毒之方法 |