ES2779149T3 - Vector retroviral que tiene actividad inmunoestimuladora - Google Patents

Vector retroviral que tiene actividad inmunoestimuladora Download PDF

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Douglas Jolly
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Joan Robbins
Derek Ostertag
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Abstract

Un vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante que comprende: una proteína retroviral GAG; una proteína retroviral POL; una cubierta retroviral; un polinucleótido retroviral basado en pAC3 que comprende: secuencias de repetición terminal larga (LTR) en el extremo 3' de la secuencia de polinucleótido retroviral, una secuencia promotora en el extremo 5' del polinucleótido retroviral, siendo dicho promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero, un dominio de ácido nucleico gag, un dominio de ácido nucleico pol; y un dominio de ácido nucleico env; al menos un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo, en donde el casete se posiciona en 5' de la LTR en 3' y en 3' del dominio de ácido nucleico env que codifica la cubierta retroviral, y en donde el ácido nucleico heterólogo codifica una secuencia de ácido nucleico inhibidora incorporada en miR30ARNsh; y secuencias que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, empaquetamiento e integración en una célula diana, en donde la secuencia de ácido nucleico inhibidora regula a la baja un agente inhibidor inmune seleccionado de PD-L1, IDO-1, y TGFβ2 y en donde las secuencias de LTR, la secuencia promotora, el dominio de ácido nucleico gag, el dominio de ácido nucleico pol, el dominio de ácido nucleico env, y las secuencias que actúan en cis son secuencias retrovirales de secuencias de ADN de pAC3 correspondientes presentadas en las SEQ ID NO: 1 y 7-16.

Description

DESCRIPCIÓN
Vector retroviral que tiene actividad inmunoestimuladora
Campo técnico
Esta descripción se refiere a la terapia del cáncer y, más específicamente, a la inhibición del crecimiento de un tumor utilizando distintas construcciones de vectores.
Antecedentes
El cáncer es el responsable de una gran parte de la morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos y es la segunda causa principal de muerte. El cáncer se caracteriza típicamente por la división incontrolada de una población de células. Esta división incontrolada da lugar típicamente a la formación de un tumor, que puede metastatizar posteriormente a otros sitios. Existe una necesidad de terapéuticos y estrategias adicionales para el cáncer no solo para tratar los tumores sólidos, sino las micrometástasis que se producen durante la progresión del cáncer.
La técnica anterior incluye WO 2010/036986. Este documento describe vectores MLV competentes para la replicación con insertos que codifican moléculas de ARN inhibidoras capaces de dar lugar a una expresión disminuida de Bma-1.
Resumen
La invención a la que pertenece la presente memoria descriptiva se muestra en las reivindicaciones adjuntas a esta descripción.
La descripción proporciona un vector retroviral recombinante que comprende al menos un casete de expresión que comprende al menos un agente que regula a la baja un agente inmunoinhibidor. En una realización, el vector comprende al menos dos casetes. En la presente memoria se describe que el vector retroviral recombinante comprende dos agentes que regulan a la baja un agente inmunoinhibidor. En cualquiera de las realizaciones anteriores, el al menos un agente comprende una secuencia de ácido nucleico inhibidora. En otras realizaciones más de lo anterior, el al menos un agente comprende una secuencia de ácido nucleico inhibidora y un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa. En la presente memoria se describe que el al menos un agente comprende una secuencia de ácido nucleico inhibidora y en donde el vector comprende además un segundo agente seleccionado del grupo que consiste en (i) una segunda secuencia de ácido nucleico inhibidora, (ii) un polinucleótido que codifica un anticuerpo de cadena única, (iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido que convierte un profármaco en un fármaco citotóxico, y (iv) un polinucleótido que codifica una citoquina o quimioquina. En otra realización, un primer casete comprende un promotor polIII unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora; y un segundo casete comprende un mini-promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene citosina desaminasa o un anticuerpo de cadena única. En otra realización más, un primer casete comprende un promotor polIII unido operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico inhibidora; y un segundo casete comprende un mini-promotor unido operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico inhibidora. En otra realización más de cualquiera de lo anterior, el vector retroviral es competente para la replicación. En una realización, el vector retroviral competente para la replicación comprende la estructura general de 5' a 3' que comprende una repetición terminal larga (LTR)-secuencia gag-secuencia pol-secuencia env-(al menos un casete de expresión)-LTR. En la presente memoria se describe que el vector comprende una secuencia de polinucleótido retroviral derivada del virus de la leucemia murina (MLV), virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus de la leucemia felina (FeLV) o virus de la leucemia de monos gibón (GALV). En la presente memoria se describe que el MLV es un MLV anfotrópico. En otra realización más del vector retroviral competente para la replicación, el vector comprende: una proteína retroviral GAG; una proteína retroviral POL; una cubierta retroviral; un polinucleótido retroviral que comprende: secuencias de repetición terminal larga (LTR) en el extremo 3' de la secuencia de polinucleótido retroviral, una secuencia promotora en el extremo 5' del polinucleótido retroviral, siendo dicho promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero, un dominio de ácido nucleico gag, un dominio de ácido nucleico pol; y un dominio de ácido nucleico env; al menos un casete que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo, en donde el casete está posicionado en 5' respecto a la 3' LTR y en 3' respecto al dominio de ácido nucleico env que codifica la cubierta retroviral; y secuencias que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, empaquetamiento e integración en una célula diana. En la presente memoria se describe que el promotor comprende un promotor de CMV que tiene una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1,7-15 o 16 desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 582 y puede incluir la modificación de una o más bases del ácido nucleico y que es capaz de dirigir e iniciar la transcripción. En la presente memoria se describe que el promotor comprende una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1, 7-15 o 16 desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 582. En la presente memoria se describe que el promotor comprende un polinucleótido del dominio CMV-R-U5. En la presente memoria se describe que el dominio CMV-R-U5 comprende el promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano unido a una región R-U5 de MLV. En la presente memoria se describe que el polinucleótido del dominio CMV-R-U5 comprende una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1,7-15 o 16 desde aproximadamente el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 1202 o secuencias que son al menos 95 % idénticas a una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1, 7-15 o 16 desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 1202, en donde el polinucleótido promueve la transcripción de una molécula de ácido nucleico unida operativamente al mismo. En otra realización, el dominio de ácido nucleico gag comprende una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 1203 hasta aproximadamente el nucleótido 2819 de SEQ ID NO: 1,7-15 o 16. En otra realización más, el dominio pol puede comprender una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 2820 hasta aproximadamente el nucleótido 6358 de SEQ ID NO: 1, 7-15 o 16. En una realización adicional, el dominio env codifica una proteína env anfotrópica. En una realización adicional más, el dominio env puede comprender una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 6359 hasta aproximadamente el nucleótido 8323 de SEQ ID NO: 1, 7-15 o 16. En otra realización, el al menos un casete comprende un promotor pollII unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora, de manera que se expresa la secuencia de ácido nucleico inhibidora. En una realización adicional, el promotor polIII comprende un promotor H1 o un promotor U6. En una realización adicional, el promotor H1 comprende una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 7 o 12 desde aproximadamente 8330 a 8553 y comprende secuencias de terminación polIII desde aproximadamente 8885 a 8889 y 8925 a 8930. En otra realización, el promotor U6 comprende una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 8 o 13 desde aproximadamente 8330-8595 y comprende secuencia de terminación polIII desde aproximadamente 8922-8926 y 8962 a 8967. En otra realización, el al menos un casete comprende un mini-promotor. En una realización adicional, el mini-promotor es un promotor de RSV. En una realización adicional más, el promotor de RSV comprende una secuencia desde aproximadamente 8330 a aproximadamente 8591 de SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, o 16. En otra realización más, el promotor de RSV está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora. En otra realización, el promotor de RSV está unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa. En otra realización más, el promotor de RSV está unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene citosina desaminasa seguido de y unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora. En otra realización más de lo anterior, el al menos un casete comprende dos casetes. En una realización adicional, un primer casete comprende un promotor H1 o U6 unido a una secuencia de ácido nucleico inhibidora y el segundo casete comprende un promotor de RSV unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido. En una realización de especificación, el vector comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7-15 y 16. En otra realización más, en donde el vector comprende un casete que codifica un polipéptido, el polinucleótido que codifica el polipéptido está optimizado para codones humanos. En la presente memoria se describe que el polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa está estabilizado con calor. En otra realización más, la secuencia de ácido nucleico inhibidora inhibe PDL1 o IDO1. En una realización adicional, el vector comprende al menos dos casetes. En otra realización más, al menos uno de los al menos dos casetes comprende un gen de interferón-Y (IFNy). En una realización adicional, al menos uno de los casetes comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa. En la presente memoria se describe que al menos un casete comprende una secuencia de ácido nucleico inhibidora y la secuencia heteróloga está precedida de un promotor polIII o un promotor RSV.
La descripción también proporciona un vector retroviral recombinante como se describe en la presente memoria para uso en el tratamiento de un cáncer o de un trastorno de la proliferación celular.
Los detalles de una o más realizaciones de la descripción se muestran en los dibujos adjuntos y la descripción siguiente. Otras características, objetos, y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1A-C muestra construcciones esquemáticas de la descripción. (A) Muestra un núcleo de RRV con un sitio de clonación Mlul/Notl para la inserción de un casete que contiene un pri-miARN o un pri-miARN dirigido por un promotor H1. (B) Muestra un núcleo de pAC3-yCD2 con un casete IRES o de promotor RSV con un sitio de clonación Notl para la inserción de un casete que comprende un promotor H1 que dirige un pre-ARNmi. (C) Muestra un núcleo pAC3 con un casete IRES o de promotor RSV unido a un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de cadena única (scAB) y un sitio de clonación Notl para el casete opcional que comprende un promotor H1 que dirige un pre-ARNmi.
La Figura 2 muestra la expresión de la proteína IDO1 en distintas líneas celulares de glioma.
La Figura 3 muestra la expresión en la superficie celular de PD-L1 en distintas líneas celulares de cáncer.
La Figura 4 muestra la expresión génica de las isoformas TGFp1,2 y 3 en distintas líneas celulares de cáncer.
La Figura 5 muestra esquemas de vectores RRV-ARNsh de la descripción.
La Figura 6 muestra la inactivación de la expresión de IDO1 por RRV-U6-IDO1ARNsh y RRV-U6-IDO1miR30ARNsh.
La Figura 7 muestra la inactivación de la expresión en la superficie celular de PDL1 por RRV-U6-PDL1ARNsh y RRV-U6-PDL1 miRARNsh.
La Figura 8 muestra la inactivación de la expresión de TGFp2 por RRV-U6-TGFb2ARNsh y RRV-U6-TGFb2miRARNsh.
La Figura 9 muestra la estabilidad del vector de vectores RRV-U6-miR30ARNsh dirigidos a IDO1, PDL1 y TGFp2. La Figura 10 muestra la inactivación de la expresión de IDO1 por RRV-H1-IDO1miR30ARNsh, RRV-RSV-IDO1 miR30ARNsh, RRV-RSV-yCD2-IDO1miR30ARNsh y RRV-RSV-yCD2-U6-IDO1miR30ARNsh.
La Figura 11 muestra la inactivación de la expresión en la superficie celular de PDL1 por RRV-H1-PDL1 miR30ARNsh. La Figura 12 muestra la estabilidad del vector de RRV-U6-miR30ARNsh, RRV-H1-miR30ARNsh, RRV-RSV-miR30ARNsh, RRV-RSV-yCD2-miR30ARNsh y RRV-RSV-yCD2-U6-miR30ARNsh dirigidos a IDO1 y PDL1.
La Figura 13 muestra la inactivación de la expresión en la superficie celular de PDL1 por RRV-RSV-PDL1 miR30ARNsh.
La Figura 14 muestra la inactivación de la expresión en la superficie celular de PDL1 por RRV-RSV-yCD2-PDL1 miR30ARNsh.
La Figura 15 muestra la inactivación de la expresión en la superficie celular de PDL1 por RRV-RSV-yCD2-U6-PDL1 miR30ARNsh.
La Figura 16A-C muestra la separación por FACS de células TIL (IFNy en el eje de las y; CD8 en el eje de las x). La Figura 17 muestra un diagrama esquemático de vectores retrovirales no replicativos pBA9b-IFNY.
La Figura 18A muestra la regulación al alza de MHC Clase I inducida por mIFNg en células CT-26.
La Figura 18B muestra la regulación al alza de MHC Clase I inducida por hlFNg en células HT-1080.
La Figura 19 muestra un diagrama esquemático de vectores retrovirales no replicativos pBA9b-IFNg-yCD2 y pBA9b-IL2.
La Figura 20A muestra la bioactividad de ARNsh dirigidos a IDO-1 en células infectadas con RRV-ARNsh.
La Figura 20B muestra la bioactividad de ARNsh dirigidos a PDL-1 en células infectadas con RRV-ARNsh.
La Figura 20C muestra la bioactividad de ARNsh dirigidos a TGF-p2 en células infectadas con RRV-ARNsh.
La Figura 21 muestra un diagrama esquemático de vectores retrovirales no replicativos pBA9b-IFNg-ARNsh.
Los símbolos de referencia semejantes en los distintos dibujos indican elementos semejantes.
Descripción detallada
Tal y como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula " incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el agente" incluye la referencia a uno o más agentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
También, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se afirme otra cosa. De forma similar, "comprenden", "comprende", "que comprende", "incluyen", "incluye" y "que incluye" son intercambiables y no se pretende que sean limitantes. Debe entenderse además que cuando las descripciones de distintas realizaciones usan el término "que comprende", los expertos en la técnica entenderán que, en algunos casos específicos, una realización puede describirse alternativamente usando la expresión "que consiste esencialmente en" o "que consiste en".
A no ser que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica de los métodos y composiciones descritos, en la presente memoria se describen métodos, dispositivos y materiales ejemplares.
Las publicaciones discutidas anteriormente y a lo largo del texto se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe considerarse nada en la presente memoria como una admisión de que los inventores no tienen derecho a antedatar dicha descripción en virtud de la descripción anterior.
El término "trastorno de la proliferación celular" se refiere a una afección caracterizada por un número anormal de células. La afección puede incluir un crecimiento celular tanto hipertrófico (la multiplicación continua de células que da lugar a un crecimiento excesivo de una población celular en un tejido) como hipotrófico (una ausencia o deficiencia de células en un tejido) o un flujo o migración excesivo de células en un área de un cuerpo. Las poblaciones celulares no son necesariamente células transformadas, tumorogénicas o malignas, sino que también pueden incluir células normales. Los trastornos de la proliferación celular incluyen trastornos asociados con un crecimiento excesivo de los tejidos conectivos, tales como distintas afecciones fibróticas, incluyendo escleroderma, artritis y cirrosis hepática. Los trastornos de la proliferación celular incluyen trastornos neoplásicos tales como carcinomas de cabeza y cuello. Los carcinomas de cabeza y cuello incluirán, por ejemplo, carcinoma de la boca, esófago, garganta, laringe, glándula tiroidea, lengua, labios, glándulas salivares, nariz, senos paranasales, nasofaringe, bóveda nasal superior y tumores del seno, estesioneuroblastoma, cáncer de células escamosas, melanoma maligno, carcinoma sinonasal indiferenciado (SNUC), neoplasia del cerebro (incluyendo glioblastomas) o de la sangre. También están incluidos el carcinoma de los nódulos linfáticos regionales incluyendo nódulos linfáticos cervicales, nódulos linfáticos prelaríngeos, nódulos linfáticos pulmonares yuxtaesofágicos y nódulos linfáticos submandibulares (Harrison's Principles of Internal Medicine (eds., Isselbacher, etal., McGraw-Hill, Inc., 13a Edición, p1850-1853, 1994). Otros tipos de cáncer, incluyen, pero no están limitados a, cáncer de pulmón, cáncer de colon-recto, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, linfoma de cáncer uterino, cáncer oral, cáncer pancreático, leucemia, melanoma, cáncer de estómago, cáncer de la piel y cáncer de ovario.
El término "secuencias optimizadas en codones" generalmente se refiere a secuencias de nucleótidos que se han optimizado para una especie de huésped particular mediante el reemplazo de cualesquiera codones que tienen una frecuencia de uso de menos de aproximadamente el 20 %. Las secuencias de nucleótidos que se han optimizado para la expresión en una especie de huésped dada por la eliminación de secuencias de poliadenilación espurias, eliminación de señales de corte y empalme de exones/intrones, eliminación de repeticiones semejantes a transposones y/u optimización del contenido de GC además de la optimización de codones se refieren en la presente memoria como "secuencias con expresión aumentada".
Tal y como se usa en la presente memoria, un "núcleo de promotor" se refiere a un promotor mínimo que comprende aproximadamente 50-100 pb y que carece de elementos potenciadores. Dichos núcleos de promotores incluyen, pero no están limitados a, núcleos de promotores SCP1, AdML y CMV. Más particularmente, cuando un casete con un núcleo de promotor está presente, estará presente un segundo casete (p. ej., un segundo casete de mini-promotor, un casete de promotor pollII o casete IRES) En algunas realizaciones, un vector que comprende un casete con un núcleo de promotor excluye específicamente el uso de núcleos de promotores SCP1, AdML y CMV, pero en su lugar utilizan núcleos de promotores de diseño como se describe adicionalmente en la presente memoria y más adelante.
Los núcleos de promotores incluyen determinados promotores virales. Los promotores virales, tal y como se usa en la presente memoria, son promotores que tienen una secuencia central pero también habitualmente algunos elementos accesorios adicionales. Por ejemplo, el promotor temprano para SV40 contiene tres tipos de elementos: una caja TATA, un sitio de inicio y una repetición GC (Barrera-Saldana et al., EMBO J, 4:3839-3849, 1985; Yaniv, Virology, 384:369-374, 2009). La caja TATA está localizada aproximadamente 20 pares de bases en 5' del sitio de inicio de la transcripción. Las regiones de repetición GC es una repetición de 21 pares de bases que contiene seis cajas GC y es el sitio que determina la dirección de la transcripción. Esta secuencia de núcleo de promotor tiene alrededor de 100 pb. La adición de repeticiones adicionales de 72 pares de bases, convirtiéndolo así en un "mini-promotor", es útil como un potenciador de la transcripción que incrementa la funcionalidad del promotor por un factor de aproximadamente 10. Cuando la proteína SP1 interacciona con las repeticiones de 21 pb se une bien a la primera o a las últimas tres cajas GC. La unión de las primeras tres inicia la expresión temprana, y la unión de las últimas tres inicia la expresión tardía. La función de las repeticiones de 72 pb es aumentar la cantidad de ARN estable e incrementar la tasa de síntesis. Esto se hace por la unión (dimerización) con la AP1 (proteína activadora 1) para proporcionar un transcrito primario que está poliadenilado en 3' y protegido en 5'. Otros promotores virales, tales como el virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor del gen X de HBV, y el núcleo del promotor de timidina quinasa de herpes también pueden usarse como la base para la selección de la función deseada.
Un núcleo de promotor engloba típicamente -40 a 40 respecto al sitio de inicio de la transcripción 1 (Juven-Gershon y Kadonaga, Dev. Biol. 339:225-229, 2010), que define la localización en la que la maquinaria de la ARN polimerasa II inicia la transcripción. Típicamente, la ARN polimerasa II interacciona con varios factores de transcripción que se unen a restos de ADN en el promotor. Estos factores se conocen comúnmente como factores de transcripción "generales" o "basales" e incluyen, pero no están limitados a, TFIIA (factor de transcripción para la ARN polimerasa IIA), TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, y TFIIH. Estos factores actúan de una manera "general" con todos los núcleos de promotores; por lo tanto, se refieren frecuentemente como los factores de transcripción "basales". Véase, la Publicación PCT No. WO2014/066700, y que describe adicionalmente núcleos de promotores útiles en los métodos y composiciones de la descripción.
Por célula "que se divide" se quiere decir una célula que experimenta mitosis activa, o meiosis. Dichas células que se dividen incluyen células madre, células de la piel (p. ej., fibroblastos y queratinocitos), gametos, y otras células que se dividen conocidas en la técnica. Tienen un interés articular, y están englobadas por el término célula que se divide, las células que tienen trastornos de la proliferación celular, tales como las células neoplásicas.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término secuencia de ácido nucleico o transgén "heterólogo" se refiere a (i) una secuencia que no existe normalmente en un retrovirus de tipo salvaje, (ii) una secuencia que se origina de una especie extraña, o (iii) si es de la misma especie, puede estar modificada sustancialmente respecto a su forma original. Alternativamente, una secuencia de ácido nucleico inalterada que no se expresa normalmente en una célula o portada por un virus es una secuencia de ácido nucleico heteróloga. En una realización específica, el polinucleótido heterólogo es (i) un polipéptido de la descripción que tiene actividad citosina desaminasa.
El término "célula huésped", tal y como se usa en la presente memoria, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación con una construcción de ácido nucleico. El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN extraño (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula huésped, de manera que la célula huésped expresará el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducido. El gen o secuencia introducido puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como secuencias de inicio, parada, promotor, señal, secreción, u otras usadas por la maquinaria genética de la célula. Una célula huésped que recibe y expresa el ADN o ARN introducido se ha "transformado" y es un "transformante" o un "clon". El ADN o ARN introducido en una célula huésped puede provenir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula huésped, o células de un género o especie diferente.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "mini-promotor" o "promotor pequeño" se refiere a un dominio regulador que promueve la transcripción de un gen o secuencia de ácido nucleico codificadora unida operativamente. El mini­ promotor, como el nombre implica, incluye la cantidad mínima de elementos necesaria para la transcripción y/o traducción efectiva de una secuencia codificadora unida operativamente. Un mini-promotor puede comprender un "núcleo de promotor" en combinación con elementos reguladores adicionales o un "núcleo de promotor modificado". Típicamente, el mini-promotor o núcleo de promotor modificado tendrá una longitud de aproximadamente 100-600 pb mientras un núcleo de promotor tendrá típicamente menos de aproximadamente 100pb (p. ej., aproximadamente 70­ 80 pb). En otras realizaciones, cuando está presente un núcleo de promotor, el casete comprenderá típicamente un elemento potenciador u otro elemento bien en 5' o 3' de la secuencia del núcleo del promotor que facilita la expresión de una secuencia codificadora unida operativamente por encima de los niveles de expresión del núcleo de promotor solo. Los promotores pequeños expresados de forma ubicua también incluyen promotores virales tales como los promotores tempranos y tardíos de SV40 (aproximadamente 340 pb), el promotor RSV LTR (aproximadamente 270 pb) y el promotor del gen X de HBV (aproximadamente 180 pb). Véase, la Publicación PCT No. W02014/066700, y que describe adicionalmente mini-promotores útiles en los métodos y composiciones de la descripción.
La expresión célula "que no se divide" se refiere a una célula que no experimenta mitosis. Las células que no se dividen pueden estar bloqueadas en cualquier punto del ciclo celular, (p. ej., G0/G1, G1/S, G2/M), siempre que la célula no se esté dividiendo activamente. Para la infección ex vivo, una célula que se divide puede tratarse para bloquear la división celular por técnicas estándar usadas por los expertos en la técnica, incluyendo irradiación, tratamiento con afidocolina, deprivación de suero, e inhibición por contacto. Sin embargo, debe entenderse que la infección ex vivo se realiza frecuentemente sin bloquear las células ya que muchas células están ya paradas (p. ej., células madre). Por ejemplo, un vector lentivirus recombinante es capaz de infectar una célula que no se divide. Los ejemplos de células que no se dividen preexistentes en el cuerpo incluyen células neuronales, musculares, hepáticas, de la piel, corazón, pulmón, y médula ósea, y sus derivados. Para las células que se dividen, pueden usarse vectores onco-retrovirales.
El término "región promotora" se usa en la presente memoria en su sentido ordinario para hacer referencia a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en donde la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora en 3' (dirección 3'). La secuencia reguladora puede ser homóloga o heteróloga respecto a la secuencia génica deseada. Por ejemplo, puede utilizarse un amplio rango de promotores, incluyendo un promotor viral o de mamíferos, como se describe en la presente memoria.
El término "secuencia de ácido nucleico reguladora" se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en 5', orígenes de la replicación, potenciadores y semejantes, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificadora en una célula receptora. No es necesario que todas estas secuencias de control estén siempre presentes, siempre que la secuencia codificadora seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una célula huésped apropiada. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente la secuencia de ácido nucleico reguladora a partir de bases de datos públicas y materiales. Además, un experto en la técnica puede identificar una secuencia reguladora que sea aplicable para el uso pretendido, por ejemplo, in vivo, ex vivo, o in vitro.
Los tumores sólidos primarios se tratan generalmente por resección quirúrgica. Sin embargo, la mayoría de los pacientes que tienen tumores sólidos también poseen micrometástasis más allá del sitio del tumor primario. Si se tratan solo con cirugía, aproximadamente el 70 % de estos pacientes experimentará recurrencia del cáncer. Además de la cirugía, muchos cánceres se tratan ahora con una combinación de terapias que implican fármacos quimioterapéuticos citotóxicos p. ej., Vincristina, vinblastina, cisplatino, metotrexato, 5-FU, etc.) y/o terapia de radiación. Una dificultad de esta estrategia es, sin embargo, que los agentes radioterapéuticos y quimioterapéuticos son tóxicos para los tejidos normales, y crean frecuentemente efectos secundaros potencialmente mortales. Además, estas estrategias tienen frecuentemente tasas extremadamente altas de fallo/remisión (hasta el 90 % dependiendo del tipo de cáncer).
A pesar de muchos años de investigación y desarrollo de nuevas modalidades de tratamiento, el cáncer permanece como la segunda causa principal de muerte en los EE. UU., y una lacra importante en todo el mundo. La modulación de la respuesta inmune ha sido reconocida durante algún tiempo como una nueva diana terapéutica potencial para la terapia del cáncer (Franks, H.A., Q. Wang, y P.M. Patel, Newanticancerimmunotherapies. Anticancer Res, 2012. 32: 2439-53).
Varias inmunoterapias han utilizado componentes bacterianos o virales como adyuvantes, con el fin de estimular el sistema inmune para destruir las células tumorales. Los ejemplos de dichos componentes incluyen BCG, endotoxina, vacunas bacterianas mixtas, interferones (a, p y y), inductores de interferón (p. ej., Brucella abortus, y distintos virus), y factores tímicos (p. ej., fracción de timosina 5, y timosina alfa-1) (véase, generalmente, "Principles of Cancer Biotherapy", Oldham (ed.), Raven Press, Nueva York, 1987). Dichos agentes han sido generalmente útiles como adyuvantes y como estimuladores no específicos en modelos tumorales animales, pero no se ha demostrado todavía que sean generalmente efectivos en los seres humanos.
Las linfoquinas también se han utilizado en el tratamiento del cáncer. Brevemente, las linfoquinas son secretadas por una variedad de células, y generalmente tienen un efecto en células específicas en la generación de una respuesta inmune. Los ejemplos de linfoquinas incluyen interleuquinas (IL)-1, 2, 3, y 4, así como factores estimuladores de colonias tales como G-CSF, GM-CSF, y M-CSF. Un grupo utilizó IL-2 para estimular las células de la sangre periférica con el fin de expandir y producir grandes cantidades de células que son citotóxicas para las células tumorales (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 313:1485-1492, 1985).
Sin embargo, incluso a la vista de las metodologías citadas anteriormente, las terapias de modulación inmune actuales se han encontrado con un éxito limitado en estudios clínicos (Zhou, G. y H. Levitsky, Towards curative cancer immunotherapy: overcoming posttherapy tumor escape. Clin Dev Immunol, 2012. 2012: p. 12418). Una de las razones para los resultados clínicos inesperadamente malos de estas terapias se debe probablemente a la estrategia monoterapéutica en la que se basan la mayoría de las inmunoterapias para la eficacia cuando el escape inmune implica múltiples mecanismos que crean un entorno inmunosupresor tumoral (Rolle et al., Mechanisms of immune evasion by gliomas. Adv Exp Med Biol, 746:53- 76, 2012; Hong y Zeng, Awaiting a new era of cancer immunotherapy. Cancer Res, 72:3715-9, 2012; Ichim et al., Exosomes as a tumor immune escape mechanism: possible therapeutic implications. J Transl Med, 6:37, 2008).
Muchos tumores expresan o secretan varias moléculas inmunosupresoras (Gajewski et al., Nature Immunol, 14:1014-1022, 2013; Motz GT. y Coukos G., Immunity, 39:61-73, 2013) incluyendo PD-L1, PD-L2, IDO-1 y 2, CD31, Tim3, Prostaglandina E2 (PGE2), IL-6, IL-10, VEGF, HLA G, FasL, IL-10, adenosina y TGF-p 1,2 y 3, con el fin de escapar de las respuestas inmunes antitumorales (Avril et al., Journal of Neuroimmunology 225:22- 33, 2010). Estas moléculas suprimen la proliferación de las células T, inhiben la activación y la diferenciación de las células T en células efectoras citotóxicas, o desencadenan la apoptosis de las células T. El escape inmune es un proceso central para el éxito oncogénico y juega un papel en el desarrollo de muchos cánceres.
Se ha identificado que el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), en particular la isoforma TGF-p2, es un factor clave en la progresión de los gliomas malignos. TGF-p2, descrito originalmente como "factor supresor de células T derivado de glioblastoma", está asociado con el estado de inmunosupresión de pacientes con glioblastoma, y es, por lo tanto, responsable de la pérdida de la vigilancia inmune tumoral. TGF beta tiene efectos en la capacidad de invasión del tumor, angiogénesis, proliferación tumoral y supresión inmune. Los niveles elevados de TGF beta están asociados con malignidades GBM, pancreática, colorrectal, NSCLC, próstata, melanoma, HCC y hematológicas.
Un cuerpo creciente de evidencia implica la implicación de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO-1 o IDO-2), que cataboliza el triptófano, en la mediación de la inmunosupresión. En modelos de cáncer preclínicos, se ha demostrado que la inhibición de IDO mejora la eficacia quimioterapéutica. El mecanismo de acción es a través de la inhibición de la supresión inmune causada, lo más probablemente, por la secreción del metabolito de triptófano quinurenina que causa apoptosis, parada del ciclo celular y activación disminuida de las células T y las células NK. Se ha mostrado que los niveles elevados de IDO ocurren en cánceres colorrectales, carcinoma hepatocelular, glioma y otros tumores.
Se ha mostrado que el receptor de la muerte programada (PD1, también conocido como PDCD1) está implicado en la regulación del equilibrio entre la activación de las células T y la tolerancia de las células T en respuesta a antígenos crónicos. Durante la infección con VIH1, se ha encontrado que la expresión de PD1 está incrementada en las células T CD4+. Se piensa que la regulación al alza de PD1 está unida, de alguna manera, a la exhaustion de las células T (definida como una pérdida progresiva de funciones efectoras clave) cuando la disfunción de las células T se observa en presencia de exposición crónica a antígenos, como es el caso en la infección por VIH. La regulación al alza de PD1 también puede estar asociada con apoptosis incrementada en estos mismos conjuntos de células durante la infección viral crónica (véase, Petrovas et al., J Immunol. 183(2):1120-32, 2009). PD1 también puede jugar un papel en el escape específico de tumor de la vigilancia inmune. Se ha demostrado que PD1 está altamente expresado en linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de tumor tanto en leucemia mielógena crónica (CML) como en leucemia mielógena aguda (AML). PD1 también está regulado al alza en linfocitos T infiltrantes en melanoma (TILS) (véase, Dotti, Blood 114 (8): 1457-58, 2009). Se ha encontrado que los tumores expresan el ligando de PD1 (PDL-1 y PDL-2) que, cuando se combina con la regulación al alza de PD1 en los CTL, puede ser un factor contribuyente en la pérdida de funcionalidad de las células T y la incapacidad de los CTL de mediar una respuesta antitumoral efectiva. Los investigadores han mostrado que en ratones infectados crónicamente con el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), la administración de anticuerpos anti-PD1 bloqueaba la interacción PD1 -PDL y era capaz de restaurar alguna funcionalidad de las células T (proliferación y secreción de citoquinas), y daba lugar a una disminución de la carga viral (Barber et al., Nature 439(9): 682-687, 2006). La desrregulación de PD1 también puede jugar un papel en la enfermedad autoinmune. Los SNP de PD1 (en particular PD 1.3) también se han asociado con un riesgo incrementado de lupus eritematoso sistémico (LES). Se ha mostrado que los pacientes con LES tienen una mayor frecuencia del alelo PD 1.3 de PD1, y que estos pacientes muestran una expresión reducida de PD1 en sus células T CD4+ activadas (véase, Bertsias et al., Arthritis Rheum. 60 (1): 207-18, 2009).
Además, el bloqueo de la interacción entre PD-1 y su ligando (PD-L1) potencia las respuestas inmunes in vitro y media la actividad antitumoral preclínica. PD-L1 es el principal ligando de PD-1 que está regulado al alza en los tumores sólidos, donde puede inhibir la producción de citoquinas y la actividad citolítica de células T PD-1+, CD4+ y CD8+ infiltrantes en tumores. Estas propiedades hacen que PD-L1 sea una diana potencialmente prometedora para la inmunoterapia del cáncer. (Brahmer et al., N Engl J Med., 366:2455-2465, 2012). El anticuerpo anti-PD-1 produjo respuestas objetivas en aproximadamente uno de cuatro a uno de cinco pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma, o cáncer de células renales.
IDO-1 y PDL-1 están sobreexpresados en gliomas lo que dificulta la respuesta antitumoral adaptativa sostenida (presentación de antígenos de DC, activación/proliferación de las células T, actividad citolítica de los CTL) (Fogel-Petrovic et al., Int Immunopharmacol., 7:1924-3, 2007; Wainwright et al., Clin Can Res, doi: 10.1158/1078- 0432.CCR-14-0514, 2012).
Los ARN de interferencia pequeños (ARNsi) regulan a la baja la expresión génica en las células humanas. Esta tecnología tiene el potencial de tratar un amplio rango de enfermedades incluyendo los cánceres, pero la administración de estas moléculas ha supuesto una barrera significativa para la implementación y al menos varias empresas farmacéuticas importantes (Novartis, Pfizer, Abbott y Merck) han abandonado o reducido el esfuerzo respecto a esta estrategia debido a este problema.
La supresión de la producción por el tumor de moléculas inmunomoduladoras sigue siendo difícil debido a la necesidad de suprimir continuamente dicha producción, cuando se utiliza con modalidades tales como moléculas pequeñas o citoquina/anticitoquinas. La producción local continua centrada en el tumor de agentes antisupresores o proinflamatorios es deseable porque esto evita toxicidades debidas a la administración sistémica de dichos fármacos potenciadores de la inmunidad, y también proporciona la producción continua del agente antiinmunosupresor.
La descripción describe distintas realizaciones que consiguen lo anterior usando un vector viral para administrar el agente o agentes antiinmunosupresores a los tumores directamente. En una realización, el vector es un vector replicativo y el agente antiinmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en una proteína activadora de profármaco, una citoquina, un anticuerpo de cadena única, una molécula de unión, un ARN sh/si (p. ej., una molécula de ARNi), o un agente que causa la producción de cualquiera de los anteriores incluyendo aptámeros. En una realización adicional, el vector replicativo es un vector retroviral replicativo (RRV).
Pueden usarse diferentes vectores en los métodos y composiciones de la descripción. Los polinucleótidos que codifican, por ejemplo, IFNy, CD, PD1 y ottos componentes inmunoestimuladores proporcionados en la presente memoria pueden incorporarse en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión adecuados para expresar un polipéptido o molécula de ARNi. Los vectores adecuados incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, p. ej., derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorabia, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus y muchos otros. Cualquier vector que transduce material genético en una célula.
El vector viral puede ser un vector adenoviral, un vector de sarampión, un vector herpes, un vector retroviral (incluyendo un vector lentiviral), un vector rhabdoviraltal tal como un vector viral de estomatitis vesicular, un vector reovirus, un vector de virus del valle de Séneca, un vector de virus de viruela (incluyendo vectores derivados de viruela animal o vaccinia), un vector parvovirus (incluyendo un vector AAV), un vector alfavirus u otro vector viral conocido para un experto en la técnica (véase también, p. ej., Concepts in Genetic Medicine, ed. Boro Dropulic y Barrie Carter, Wiley, 2008, Hoboken, NJ.; The Developmentof Human Gene Therapy, ed. Theodore Friedmann, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold springs Harbor, Nueva York, 1999; Gene and Cell Therapy, ed. Nancy Smyth Templeton, Marcel Dekker Inc., Nueva York, Nueva York, 2000 y Gene Therapy: Therapeutic Mechanism and Strategies, ed. Nancy Smyth Templetone y Danilo D Lasic, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, 2000).
El vector retroviral replicativo (RRV) tiene ventajas sobre los vectores replicativos líticos ya que no matan a las células diana inmediatamente dando lugar a inflamación local y una respuesta inmune centrada en el virus (en lugar de en el tumor). El uso de RRV como un vehículo de administración in vivo permite la diseminación viral y transgénica a lo largo de tumores sin la lisis directa del tumor, amplificando así la señal del transgén en el tumor sin inmunidad antiviral activa. Otros han intentado expresar ARNsi a partir de RRV (Schaser T. et al. Gene Ther 2011 doi: 10.1038/gt.2011.48), pero estos vectores tuvieron un uso limitado debido a limitaciones de titulación y seguridad y solo fueron capaces de incorporar un casete de expresión génica. La descripción proporciona RRV que expresan genes activadores de profármacos en titulaciones útiles para el uso farmacéutico o que incorporan múltiples casetes. Además, el núcleo del vector de la descripción está actualmente en ensayos clínicos con genes activadores de profármacos (Cloughsey et al., Neuro-Oncology 16:v110-v118, 2014. doi: 10.1093/neuonc/nou258) lo que demuestra la seguridad y potencia de estos vectores en la clínica.
La descripción proporciona RRV que inhiben la expresión o producción de moléculas inmunosupresoras en tumores. Estas moléculas pueden ser moléculas pequeñas (p. ej., adenosina, quinurenina), proteínas inmunosupresoras secretadas, citoquinas o quimioquinas (p. ej., TGF beta 1,2 o 3, IL-1, IL-6, IL-10), ligandos inmunosupresores (p. ej., PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, GAL9) u otras moléculas inmunosupresoras (Pardoll D., Nat Rev Cancer, 12:252-264, 2012). En la presente memoria se describe que la producción o expresión de la molécula inmunosupresora se inhibe por la expresión de un anticuerpo de cadena única o una molécula de ARN de interferencia (molécula de ARNi). En una realización, la inhibición de la expresión o producción se consigue mediante la expresión de dos genes o casetes en un RRV. En una realización adicional, uno de los polinucleótidos heterólogos presentes en el vector expresa una molécula de ARNi. En una realización adicional más, el ARNi se expresa con un promotor pol III que dirige un casete de microRNA (miARN). En la presente memoria se describe que un segundo casete codifica uno de: otra molécula de ARNi; una proteína tal como, pero no limitado a, un gen activador de profármacos; un anticuerpo de cadena única; una citoquina/quimioquina; u otro gen anticanceroso.
La descripción proporciona vectores retrovirales replicativos que contienen un polinucleótido heterólogo que codifica, por ejemplo, una citosina desaminasa o mutante de la misma, un miARN o ARNsi, una citoquina, un dominio de unión a anticuerpo etc., que puede administrarse a una célula o sujeto.
La descripción proporciona vectores retrovirales replicativos modificados. Los vectores retrovirales replicativos modificados pueden derivar de miembros de la familia retroviridae. La familia Retroviridae consiste en tres grupos: los espumavirus (o virus espumosos) tales como el virus espumoso humano (HFV); los lentivirus, así como virus visna de ovejas; y los oncovirus (aunque no todos los virus de este grupo son oncogénicos). El término "lentivirus" se usa en su sentido convencional para describir un género de virus que contiene transcriptasa inversa. Los lentivirus incluyen los "virus de inmunodeficiencia" que incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 y tipo 2 (VIH-1 y VIH-2) y el virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV). Históricamente, los oncovirus se han subdividido además en los grupos A, B, C y D sobre la base de la morfología de las partículas, como se observa en microscopía electrónica durante la maduración viral. Las partículas del tipo A representan las partículas inmaduras de los virus de tipo B y D observadas en el citoplasma de las células infectadas. Estas partículas no son infecciosas. Las partículas de tipo B geman como un virión maduro de la membrana plasmática mediante el cubrimiento de las partículas de tipo A intracitoplásmicas. En la membrana, poseen un núcleo toroidal de 75 nm, a partir del que se proyectan espículas largas de glicoproteína. Después de la gemación, las partículas de tipo B contienen un núcleo electrónico denso localizado excéntricamente. El prototipo del virus de tipo B es el virus de tumor mamario de ratón (MMTV). No se pueden observar partículas intracitoplásmicas en las células infectadas con los virus de tipo C. En su lugar, las partículas maduras geman directamente desde la superficie celular mediante una condensación con forma de media luna C que se encierra en sí misma y está cubierta por la membrana plasmática. Las espículas de glicoproteína de la cubierta pueden ser visibles, junto con un núcleo electrónico denso uniforme. La gemación puede ocurrir desde la superficie de la membrana plasmática o directamente en vacuolas intracelulares. Los virus de tipo C son los más comúnmente estudiados e incluyen muchos de los virus de leucemia aviar y murina (MLV). El virus de la leucemia bovina (BLV), y los virus de la leucemia de células T humana de tipos I y II (HTLV-I/II) se clasifican de forma similar como partículas de tipo C debido a la morfología de su gemación desde la superficie celular. Sin embargo, también tienen una morfología hexagonal regular y estructuras genómicas más complejas que los virus de tipo C prototípicos tales como los virus de la leucemia murina (MLV). Las partículas de tipo D se parecen a las partículas de tipo B en que se muestran como estructuras semejantes a anillos en el citoplasma de las células infectadas, que geman desde la superficie celular, pero el virión incorpora espículas cortas de glicoproteína en la superficie. Los núcleos electrónicos densos también están localizados excéntricamente en las partículas. El virus del mono Mason Pfizer (MPMV) es el prototipo del virus de tipo D.
Los retrovirus se han clasificado de varias maneras, pero la nomenclatura se ha estandarizado en la última década (véase, ICTVdB - The Universal Virus Database, v 4 en la en la Red Mundial (www) en ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/ y el libro de texto "Retrovirus" Eds Coffin, Hughs y Varmus, Cold Spring Harbor Press 1997). En una realización, el vector retroviral competente para la replicación puede comprender un Ortoretrovirus o, más típicamente, un vector de retrovirus gamma.
Los retrovirus se definen por la manera en la que replican su material genético. Durante la replicación, el ARN se convierte en ADN. Después de la infección de la célula, se genera una molécula de ADN bicatenario a partir de las dos moléculas de ARN que se encuentran en la partícula viral por el proceso molecular conocido como transcripción inversa. La forma del ADN se integra covalentemente en el genoma de la célula huésped como un provirus, a partir del que se expresan los ARN virales con la ayuda de factores celulares y/o virales. Los ARN virales expresados se empaquetan en partículas y se liberan como virión infeccioso.
La partícula de retrovirus está compuesta por dos moléculas de ARN idénticas. Cada genoma de tipo salvaje tiene una molécula de ARN monocatenaria de sentido positivo, que está protegida en el extremo 5' y poliadenilada en la cola 3'. La partícula de virus diploide contiene las dos cadenas de ARN formando un complejo con proteínas gag, enzimas virales (productos del gen pol) y moléculas de ARNt del huésped en una estructura de 'núcleo' de proteínas gag. Alrededor de y protegiendo esta cápside se encuentra una bicapa lipídica, derivada de las membranas de la célula huésped y que contiene las proteínas de la cubierta viral (env). Las proteínas env se unen a un receptor celular para el virus y la partícula entra típicamente en la célula huésped a través de endocitosis mediada por receptor y/o fusión de membranas.
Después de que la cubierta externa se libera, el ARN viral se copia en ADN por transcripción inversa. Esta está catalizada por la enzima transcriptasa inversa codificada por la región pol y usa el ARNt de la célula huésped empaquetado en el virión como un cebador para la síntesis de ADN. De esta manera, el genoma de ARN se convierte en el genoma más complejo de ADN.
El ADN lineal bicatenario producido por la transcripción inversa puede tener, o no, que ser circularizado en el núcleo. El provirus tiene ahora dos repeticiones idénticas en cada extremo, conocidas como repeticiones terminales largas (LTR). El extremo de las dos secuencias LTR produce el sitio reconocido por un producto de pol -- la proteína integrasa -- que cataliza la integración, de manera que el provirus se une siempre a dos pares de bases (pb) del ADN del huésped desde los extremos de las LTR. Se observa una duplicación de secuencias celulares en los extremos de ambas LTR, reminiscente del patrón de integración de los elementos genéticos transponibles. Los retrovirus pueden integrar sus ADN en muchos sitios en el ADN del huésped, pero diferentes retrovirus tienen diferentes preferencias respecto al sitio de integración. Los ADN del VIH-1 y del virus de la inmunodeficiencia de simios se integran preferentemente en los genes expresados, el ADN del virus de la leucemia murina (MLV) se integra preferentemente cerca de los sitios de inicio de la transcripción (TSS), y los ADN del virus de la leucosis de sarcoma aviar (ASLV) y virus de la leucemia de células T humana (HTLV) se integran casi aleatoriamente, mostrando una ligera preferencia por genes (Derse D. et al. (2007) Human T-cell leukemia virus type 1 integration target sites in the human genome: comparison with those of other retrovirus. J Virol 81:6731-6741; Lewinski MK, et al. (2006) Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog 2:e601).
La transcripción, corte y empalme del ARN y traducción del ADN viral integrado están mediados por las proteínas de la célula huésped. Se generan transcritos con corte y empalme variado. En el caso de los retrovirus humanos VIH-1/2 y HTLV-I/II, también se usan las proteínas virales para regular la expresión génica. La interacción entre los factores celulares y virales es un factor en el control de la latencia del virus y la secuencia temporal en la que se expresan los genes virales.
Los retrovirus pueden trasmitirse horizontalmente y verticalmente. La transmisión infecciosa eficiente de los retrovirus requiere la expresión en la célula diana de receptores que reconocen específicamente las proteínas de la cubierta viral, aunque los virus pueden usar rutas de entrada no específicas independientes de receptor con una baja eficiencia. Normalmente, una infección viral da lugar a una única o pocas copias del genoma viral por célula debido al enmascaramiento o regulación a la baja del receptor que a su vez da lugar a resistencia a la superinfección (Cáp. 3 p104 en "Retroviruses", JM Coffin, SH Hughes, y HE Varmus 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY; Fan et al. J.Virol 28:802, 1978). Mediante la manipulación de la situación en cultivo tisular, es posible obtener algún nivel de infección múltiple, pero esta es menor de 5 copias/genoma diploide. Además, el tipo de célula diana debe ser capaz de soportar todos los estadios del ciclo de replicación después de que el virus se haya unido y haya penetrado. La transmisión vertical ocurre cuando el genoma viral se integra en la línea germinal del huésped. El provirus pasará entonces de generación en generación como se fuera un gen celular. Por lo tanto, los provirus endógenos se establecen, frecuentemente se mantienen latentes, pero pueden activarse cuando el huésped se expone a los agentes apropiados.
Un vector adecuado de la descripción tiene una estructura general de 5' a 3' que comprende una repetición terminal larga (LTR)-secuencia gag-secuencia pol-secuencia env-(al menos un casete de expresión)-LTR. El o los casetes de expresión están justo en 3' (p. ej., 1 a 50 pb, 2-40 pb, 3-20 pb, 5-15 pb o cualquier valor entre estos) desde el extremo del gen env, pero en 5' de la LTR en 3'. Las estructuras ejemplares de un vector de la descripción se muestran en las Figuras 1A-C.
En la presente memoria se describe que la secuencia de polinucleótido retroviral deriva del virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), el virus de la leucemia felina (FeLV) o el virus de la leucemia de monos gibón (GALV). En la presente memoria se describe que el MLV es un MLV anfotrópico. En una realización, el retrovirus es un oncoretrovirus o retrovirus gamma.
La descripción proporciona así un retrovirus competente para la replicación (RCR) recombinante que comprende: una proteína retroviral GAG; una proteína retroviral POL; una cubierta retroviral; un polinucleótido retroviral que comprende secuencias de repetición terminal larga (LTR) en el extremo 3' de la secuencia de polinucleótido retroviral, una secuencia promotora en el extremo 5' del polinucleótido retroviral, siendo dicho promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero, un dominio de ácido nucleico gag, un dominio de ácido nucleico pol y un dominio de ácido nucleico env; al menos un casete que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo, en donde el casete está posicionado en 5' respecto a la LTR en 3' y en 3' respecto al dominio de ácido nucleico env que codifica la cubierta retroviral; y secuencias que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, empaquetamiento e integración en una célula diana. En la presente memoria se describe que la secuencia de polinucleótido retroviral deriva del virus de la leucemia murina (MLV), virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus de la leucemia felina (FeLV) o virus de la leucemia de monos gibón (GALV). En la presente memoria se describe que el MLV es un MLV anfotrópico. En otra realización más, el retrovirus es un oncoretrovirus o retrovirus gamma.
En una realización, el promotor comprende un promotor de CMV que tiene una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1, 7-15 o 16 desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 582 y puede incluir modificación en una o más bases del ácido nucleico y que es capaz de dirigir e iniciar la transcripción. En una realización adicional más, el promotor comprende una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1, 7-15 o 16 desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 582. En una realización adicional, el promotor comprende un polinucleótido del dominio CMV-R-U5. En una realización, el dominio CMV-R-U5 comprende el promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano unido a una región R-U5 de MLV. En otra realización más, el polinucleótido del dominio CMV-R-U5 comprende una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1,7-15 o 16 desde aproximadamente el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 1202 o secuencias que son al menos un 95 % idénticas a una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1,7-15 o 16 desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 1202, en donde el polinucleótido promueve la transcripción de una molécula de ácido nucleico unida operativamente a la misma. En la presente memoria se describe que el promotor puede ser un promotor específico de tejido tal como los descritos más adelante. En una realización adicional, el gag y pol del polinucleótido derivan de un oncoretrovirus o retrovirus gamma. El dominio de ácido nucleico gag puede comprender una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 1203 hasta aproximadamente el nucleótido 2819 de SEQ ID NO: 1 y 7-16. El dominio pol puede comprender una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 2820 hasta aproximadamente el nucleótido 6358 de SEQ ID NO: 1 y 7-16. En una realización, el dominio env codifica una proteína env anfotrópica. El dominio env puede comprender una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 6359 hasta aproximadamente el nucleótido 8323 de SEQ ID NO: 1 y 7-16. Al menos un casete está en 3' respecto a la secuencia del gen env.
En una realización, el al menos un casete comprende un promotor polIII unido operativamente a una secuencia de ARNi que se va a expresar (véase, p. ej., la Figura 1A). En una realización, el promotor polIII comprende un promotor H1 (p. ej., SEQ ID NO: 7 o 12 desde aproximadamente 8330 a 8553, y una secuencia de terminación H1 desde aproximadamente 8885 a 8889 y 8925 a 8930). En otra realización, el promotor polIII comprende un promotor U6 (p. ej., SEQ ID NO: 8 o 13 desde aproximadamente 8330-8595 y una secuencia de terminación U6 desde aproximadamente 8922-8926 y 8962 a 8967). En cualquiera de las realizaciones anteriores, el promotor polIII (p. ej., H1 o U6) está unido operativamente a una secuencia codificadora de ARNi.
En algunas realizaciones, el al menos un casete comprende un núcleo de promotor o mini-promotor tal como el promotor de RSV. Por ejemplo, el promotor de RSV puede comprender una secuencia desde aproximadamente 8330 hasta aproximadamente 8591 de SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, o 16. En cualquiera de las realizaciones anteriores, el promotor de RSV está unido operativamente a una secuencia codificadora de ARNi. En otra realización, el promotor de RSV está unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa (p. ej., "yCD2" que tiene una secuencia desde aproximadamente 8592 hasta aproximadamente 9068 o 9071 de SEQ ID NO: 11 y 10, respectivamente). En una realización adicional más, el promotor de RSV puede estar unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene citosina desaminasa seguido de una secuencia que codifica una molécula de ARNi.
En algunas realizaciones, el al menos un casete comprende dos casetes en donde un primer casete comprende un promotor H1 o U6 unido a una secuencia codificadora de ARNi y el segundo casete comprende un promotor de RSV unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido (p. ej., una citosina desaminasa o dominio de anticuerpo).
En la presente memoria se describe que el casete comprende un promotor unido a una secuencia codificadora de ARNi y que comprende además un IRES unido operativamente a un gen activador de profármacos (p. ej., citosina desaminasa) (véase, p. ej., la Figura 1B). En la presente memoria se describe que el casete comprende un minipromotor o IRES unido operativamente a un anticuerpo (p. ej., una secuencia de anticuerpo de cadena única). En una realización adicional más, el casete que comprende la secuencia de anticuerpo puede comprender además un promotor polNI unido operativamente a una secuencia de ARNi (véase, p. ej., la Figura 1C).
Un sitio de entrada interno de ribosoma ("IRES") se refiere a un segmento de ácido nucleico que promueve la entrada o retención de un ribosoma durante la traducción de una secuencia codificadora, habitualmente en 3' respecto al IRES. En la presente memoria se describe que el IRES puede comprender un sitio de aceptor/donante de corte y empalme, sin embargo, los IRES preferidos carecen de un sitio de aceptor/donante de corte y empalme. Normalmente, la entrada de los ribosomas en el ARN mensajero tiene lugar a través de la caperuza localizada en el extremo 5' de todos los ARNm eucariotas. Sin embargo, hay excepciones a esta regla universal. La ausencia de una caperuza en algunos ARNm virales sugiere la existencia de estructuras alternativas que permiten la entrada de los ribosomas en un sitio interno de estos ARN. Hasta la fecha, varias de estas estructuras, designadas IRES por su función, se han identificado en la región no codificadora en 5' de los ARNm virales sin caperuza, tales como, en particular, de picornavirus tales como el virus de la poliomielitis (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1103-1112) y el virus de EMCV (virus de la encefalomiocarditis (Jang et al., J. Virol., 1988, 62, 2636-2643). La descripción proporciona el uso de un IRES en el contexto de un vector retroviral competente para la replicación.
El dominio de IRES del vector puede ser cualquier IRES, sin embargo, en la presente memoria se describe que el IRES deriva de un virus de encefalomiocarditis. En la presente memoria se describe que el IRES comprende una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 8327 hasta aproximadamente el nucleótido 8876 de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, o 99 % de identidad con la misma.
En otra realización, los promotores de ARN polimerasa III pueden ser un promotor U6 o un promotor H1. En la presente memoria se describe que el promotor polIII comprende un promotor H1 (p. ej., SEQ ID NO: 7 o 12 desde aproximadamente 8330 a 8553, y una secuencia de terminación H1 desde aproximadamente 8885 a 8889 y 8925 a 8930). En la presente memoria se describe que el promotor polIII comprende un promotor U6 promotor (p. ej., SEQ ID NO: 8 o 13 desde aproximadamente 8330-8595 y una secuencia de terminación U6 desde aproximadamente 8922­ 8926 y 8962 a 8967).
La siguiente tabla muestra dominios ejemplares para varios vectores descritos en la presente memoria.
Tabla 1:
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Como entenderá un experto en la técnica, la secuencia en 3' respecto al casete comprende secuencias no traducidas y LTR en 3' para cada uno de los vectores descritos en la presente memoria.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término " interferencia de ARN" (ARNi) se refiere al proceso de silenciamiento génico posterior a la transcripción específico de secuencia mediado por ácidos nucleicos cortos de interferencia (ARNsi o microARN (miARN)). ARNi se refiere generalmente al proceso por el que el ARNsi, miARN y semejantes se expresan a partir de un transcrito de ARN polimerasa e inhiben la expresión de un gen diana. Una "secuencia de ácido nucleico inhibidora" es un oligonucleótido o polinucleótido que cuando se expresa causa el silenciamiento génico posterior a la transcripción. Una secuencia de ácido nucleico inhibidora comprende así moléculas que cuando se procesan incluyen ARNsi, miARN y semejantes. El término "agente capaz de mediar la interferencia de ARN" se refiere a ARNsi, así como a vectores de ADN y ARN que codifican ARNsi cuando se transcriben en una célula. El término ARNsi o miARN se pretende que englobe cualquier molécula de ácido nucleico que sea capaz de mediar la interferencia por ARN específica de secuencia, por ejemplo, ARN de interferencia corto (ARNsi), ARN bicatenario (ARNds), micro-ARN (miARN), ARN de horquilla corto (ARNsh), oligonucleótido de interferencia corto, ácido nucleico de interferencia corto, oligonucleótido de interferencia corto modificado, ARNsi modificado químicamente, ARN de silenciamiento génico posterior a la transcripción (ARNptgs), y otros ARN no codificadores.
El rango adecuado para diseñar longitudes de tallo de un dúplex en horquilla, incluye longitudes de tallo de 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 nucleótidos, y 600-700 nucleótidos. El rango adecuado para diseñar longitudes de bucle de un dúplex en horquilla, incluye longitudes de bucle de 4-25 nucleótidos, 25-50 nucleótidos, o mayor si la longitud del tallo del dúplex en horquilla es sustancial. En un determinado contexto, las estructuras en horquilla con regiones en dúplex que son mayores de 21 nucleótidos pueden promover el silenciamiento efectivo dirigido por ARNsi, independientemente de la secuencia y longitud del bucle.
Los MicroARNA (miARN) son ARN pequeños no codificadores. Están localizados en los intrones de un gen codificador o no codificador, exones de genes no codificadores o en regiones intergénicas. Los genes de miARN se transcriben por la ARN polimerasa II que genera polinucleótidos precursores denominados miARN precursor primario (pri-miARN). El pri-miARN en el núcleo se procesa por la ribonucleasa Drosha para producir el precursor del miARN (pre-miARN) que forma una estructura en horquilla corta. Posteriormente, el pre-miARN se transporta al citoplasma mediante la Exportina 5 y se procesa adicionalmente por otra ribonucleasa denominada Dicer para generar un miARN maduro activo.
Un miARN maduro tiene una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos. Ejerce su función uniéndose a la región no traducida en 3' del ARNm de los genes diana y suprimiendo la expresión de proteínas bien por represión de la traducción de proteínas o la degradación del ARNm. Los miARN están implicados en procesos biológicos incluyendo el desarrollo, proliferación celular, diferenciación y progresión del cáncer. Los estudios del perfilado del miARN indican que algunas expresiones de miARN son específicas d tejido o están enriquecidas en determinados tejidos. Por ejemplo, se ha demostrado que las expresiones de miR-142-3p, miR-181 y miR-223 están enriquecidas en los tejidos hematopoyéticos en los seres humanos y ratones (Baskerville et al., 2005 RNA 11,241-247; Chen etal., 2004 Science 303, 83- 86).
Se ha observado que algunos miARN están regulados al alza (miARN oncogénicos) o regulados a la baja (represor) en varios tumores (Spizzo et al., 2009 Cell 137, 586e1). Por ejemplo, miR-21 está sobreexpresado en glioblastoma, cáncer de mama, pulmón, próstata, colon, estómago, esófago, y cuello uterino, leiomiosarcoma uterino, DLBCL, cáncer de cabeza y cuello. Por el contrario, se ha reportado que los miembros de let-7 están regulados a la baja en glioblastoma, cáncer de pulmón, mama, gástrico, de ovario, próstata y colon. El restablecimiento de la homeostasis de la expresión de los miARN en el cáncer es un mecanismo imperativo para inhibir o revertir la progresión del cáncer.
Como consecuencia de las funciones vitales moduladas por los miARN en los cánceres, el foco en el desarrollo de estrategias terapéuticas potenciales se ha dirigido hacia la inhibición mediada por antisentido (antigómeros) de miARN oncogénicos. Sin embargo, el reemplazo de miARN podría representar una estrategia igualmente eficaz. En esta estrategia, los miARN más útiles terapéuticamente son los expresados a bajos niveles en los tumores, pero a un nivel alto, y por lo tanto tolerado, en los tejidos normales.
Los miARN que están regulados a la baja en los cánceres podrían ser útiles como agentes anticancerosos. Los ejemplos incluyen mir-128-1, let-7, miR-26, miR-124, y miR-137 (Esquela-Kerscher et al., 2008 Cell Cycle 7, 759-764; Kumar et al., 2008 Proc Nati Acad Sci USA 105, 3903-3908; Kota et al., 2009 Cell 137, 1005-1017; Silber et al., 2008 BMC Medicine 6:14 1-17). Se ha reportado que la expresión de miR-128 está enriquecida en el sistema nervioso central y se ha observado que está regulada a la baja en los glioblastomas (Sempere et al., 2004 Genome Biology 5:R13.5-11; Godlewski et al., 2008 Cancer Res 68: (22) 9125-9130). miR-128 está codificado por dos genes distintos, miR-128-1 y miR-128-2. Ambos se procesan en una secuencia madura idéntica. Se ha reportado que Bmi-1 y E2F3a son dianas directas de miR-128 (Godlewski et al., 2008 Cancer Res 68: (22) 9125-9130; Zhang et al., 2009 J. Mol Med 87:43-51). Además, se ha observado que la expresión de Bmi-1 está regulada al alza en una variedad de cánceres humanos, incluyendo gliomas, linfomas de células del manto, y cáncer de pulmón de células no pequeñas linfoma no de Hodgkin de células B, y cáncer de mama, colorrectal y de próstata. Además, se ha demostrado que se requiere Bmi-1 para la autorrenovación de las células madre de diversos tejidos, incluyendo células madre neuronales, así como la población de células "semejantes a madre" en los gliomas.
Las secuencias de ARNi ejemplares se muestran en la Tabla 1 (anteriormente) y se definen por sus secuencias identificadas en la tabla. Dichos ARNi incluyen, pero no están limitados a: las secuencias de IDO1miR30ARNsh2 y PDL1miR30ARNsh4 mostradas en la presente memoria.
Los vectores retrovirales replicativos de la descripción pueden usarse para tratar enfermedades mediante la expresión de ARNsi o miARN modificado por ingeniería (Dennis, Nature, 418: 1222002) que inactiva o disminuye la expresión de genes clave que gobiernan la proliferación o supervivencia de células enfermas incluyendo las células tumorales. Dichas dianas incluyen genes como Rad 51 una enzima central en la reparación del ADN, y sin la cual el crecimiento celular se restringe drásticamente. Otras dianas incluyen muchas de las moléculas de la ruta de señalización que controla el crecimiento celular (Marquez y McCaffrey Hum Gene Ther. 19:27 2008). El ARNsi o miARN puede combinarse con la expresión de un gen citotóxico del mismo vector retroviral o uno diferente de la descripción. Un ejemplo de un gen citotóxico adecuado comprende una citosina desaminasa o citosina desaminasa modificada de la descripción. Los ejemplos de ARNsi o miARN que pueden expresarse a partir del mismo vector o un vector diferente con citosina desaminasa son ARNsi o miARN dirigidos a la timidilato sintasa, dihidropirimidina deshidrogenasa u otras enzimas de ácidos nucleicos anabólicas o sintéticas, que pueden aumentar o complementar la acción del 5-FU producido localmente en un tumor o tejido a partir de la activación de 5-FC por la citosina desaminasa.
En el uso, el o los vectores retrovirales se replicarán a través del tumor u otro tejido diana y antes de que ocurra la inhibición del crecimiento, el virus se integra en primer lugar en el genoma del huésped y continúa produciendo virus después de que se inhiba el crecimiento de esa célula. Los métodos para seleccionar secuencias de miARN o ARNsi funcionales son conocidos en la técnica. La característica clave, en general, para diseñar secuencias de ARNsi o miARN efectivas, es habitualmente evitar efectos "fuera de la diana". Sin embargo, para el uso de vectores replicativos que son altamente específicos de las células tumorales tales como los de la descripción, estos efectos secundarios no son muy importantes, ya que se espera que las células mueran eventualmente. Un vector retroviral de esta descripción puede prepararse usando células de otras especies para las que la proteína correspondiente no es una diana significativamente. Dichas células incluyen líneas celulares de perro o línea celular de pollo. Alternativamente, el virus se prepara por transfección transitoria en células derivadas de 293 humanas u otra línea celular que permita una transfección transitoria eficiente. Para este uso, no es necesario que el virus utilice un IRES, y la secuencia de ARNsi o miARN puede insertarse simplemente en un sitio conveniente en el genoma viral. Este sitio incluye la región en 3' de la cubierta y en 5' de la LTR en 3' del retrovirus replicativo.
Como se ha descrito anteriormente, las unidades de transcripción polI 11 pueden insertarse en el genoma viral con los ARNsi o miARN apropiados, típicamente en 3' del gen de la cubierta en 3'. Pueden insertarse varias secuencias de ARNsi o miARN diferentes para asegurar una regulación a la baja eficiente del gen diana o la regulación a la baja de más de un gen. Las secuencias y dianas adecuadas pueden obtenerse de fuentes conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo:
• la base de datos de ARNsi MIT/ICBP http: (//) web.mit.edu/sirna/ - "The MIT [Massachusetts Institute of Technology] /ICBP [Integrative Cancer Biology Program] La base de datos de ARNsi es un gran esfuerzo universitario para catalogar estos reactivos validados experimentalmente y hacer que la información esté disponible para otros investigadores, tanto dentro como fuera de la comunidad del MIT. (Massachusetts Institute of Technology).
• ARNi Central - http: (//) katahdin.cshl.org:9331/ARNi_web/scripts/main2. pi Recursos de ARNi, incluyendo herramientas de diseño de ARNsi y ARNsh. (Hannon Lab, Cold Spring Harbor Laboratory)
• La red de ARNi - http: (//) www.rnaiweb.com/ General resource.
• siDIRECT - http: (//) genomics.jp/sidirect/ Programa de diseño de ARNsi específicos de diana en línea para AN de interferencia de mamíferos. (Universidad de Tokio, Japón).
• Base de datos de ARNsi - Una base de datos exhaustiva de ARNsi que contiene dianas de ARNsi frente a todas las secuencias conocidas de ARNm en una variedad de organismos. (Parte del sitio de internet de la biología de sistemas Protein Lounge)
• Base de datos de ARNsi y recursos para los estudios de la interferencia de ARN http: (//) www rnainterference.org/
• Selector de ARNsi - http: (//) bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm. Se usó un conjunto de reglas para evaluar la funcionalidad de ARNsi sobre la base de parámetros termodinámicos (Khvorova et al., 2003, Schwarz et al., 2003) y determinantes relacionados con la secuencia desarrollados por Dharmacon (Reynolds et al., 2004). La especificidad se determina usando BLAST frente a las bases de datos UniGene. (Wistar Institute)
• Buscador de diana de ARNsi http: (//) www (.) ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html (Ambion).
En la presente memoria se describe un vector retroviral no replicativo (RNV, también conocido como retrovirus defectivo para la replicación). Los vectores retrovirales no replicativos (RNV) se preparan por ingeniería para que carezcan de genes y elementos clave para la transmisión. Por ejemplo, un RNV carece de uno o más de los genes pol o env o las secuencias que actúan en cis (^ ) necesarias para la transcripción y empaquetamiento en una célula huésped.
El RNV de la descripción incluye al menos un promotor/potenciador transcripcional o elemento o elementos de definición del locus, u otros elementos que controlan la expresión génica por otros medios, tales como corte y empalme alternativo, exportación de ARN nuclear, modificación posterior a la traducción del mensajero, o modificación posterior a la transcripción de la proteína. Dichas construcciones de vectores incluyen una señal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTR) o parte de las mismas, y sitios de unión de cebador de cadena positiva y negativa apropiados para el retrovirus usado (si estos no están ya presentes en el vector retroviral). Opcionalmente, el vector retroviral recombinante también puede incluir una señal que dirige la poliadenilación, un marcador seleccionable tal como un marcador seleccionable no de antibióticos (p. ej., citosina desaminasa, timidina quinasa y semejantes), así como uno o más sitios de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. Como ejemplo, dichos vectores incluyen típicamente una LTR en 5', un sitio de unión de ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN, y una LTR en 3' o una parte de la misma. También pueden usarse distintas modificaciones o adiciones a estas especificaciones de la estructura de RNV que pueden incrementar la seguridad o rendimiento (véase, p. ej., Corrigan-Curay et al., Mol Ther op.cit; Stein et al. Hum Gene Ther-Clin Develop 24:86-98 2013, DOI: 10.1089/humc .2013.019)
Como se ha indicado anteriormente, la descripción proporciona retrovirus recombinantes que se construyen para portar al menos un casete o expresar una o más moléculas de ácido nucleico de interés. Los RNV de la descripción pueden construirse fácilmente a partir de una amplia variedad de retrovirus, incluyendo, por ejemplo, retrovirus de tipo B, C, y D, así como espumavirus y lentivirus. Típicamente, los retrovirus para la preparación o construcción de vehículos de administración RNV de la descripción incluyen retrovirus seleccionados del grupo que consiste en virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia bovina, virus de la leucemia murina, virus inductores de focos en las células del visón, virus del sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus del sarcoma de Rous. En una realización específica, puede usarse un virus de la leucemia murina tal como MLV 4070A y 1504A (Hartley y Rowe, 1976, J. Virol.
19:19-25), de Abelson (ATCC No. VR- 999), de Friend ATCC No. VR-245), de Graffi, de Gross (ATCC No. VR-590), de Kirsten, virus del sarcoma de Harvey y de Rauscher (ATCC No. VR-998), y virus de la leucemia murina de Moloney (ATCC No. VR-190). Dichos retrovirus pueden obtenerse fácilmente de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC"; Manasassas, Va.), o aislarse a partir de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.
Cualquiera de los retrovirus anteriores puede utilizarse fácilmente con el fin de ensamblar o construir un vehículo de administración génica RNV dada la descripción proporcionada en la presente memoria, y las técnicas recombinantes estándar (p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, 1985, PNAS 82:488). Además, partes de los vehículos retrovirales de administración génica pueden derivar de diferentes retrovirus. Por ejemplo, en la presente memoria se describe que las LTR de los vectores retrovirales pueden derivar de un virus de sarcoma murino, un sitio de unión de ARNt de un virus de sarcoma de Rous, una señal de empaquetamiento de un virus de leucemia murina, y un origen de síntesis de segunda cadena de un virus de leucosis aviar.
En la presente memoria se describe que un RNV puede prepararse introduciendo una construcción de vector como se ha discutido anteriormente, en una célula (denominada una "célula de empaquetamiento") que contiene los elementos necesarios para la producción de retrovirus recombinantes infecciosos que no están presentes en la construcción de vector. Puede utilizarse una amplia variedad de construcciones de vector retroviral en la descripción con el fin de preparar un RNV. Por ejemplo, se proporcionan construcciones de vector retroviral que comprenden una LTR en 5', un sitio de unión de ARNt, una señal de empaquetamiento, uno o más casetes (p. ej., secuencias heterólogas), un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN y una LTR en 3', en donde la construcción de vector carece de todas o una parte de las secuencias codificadoras gag/pol o env. Brevemente, las repeticiones terminales largas ("LTR") se subdividen en tres elementos, designados U5, R y U3. Estos elementos contienen una variedad de señales que son responsables de la actividad biológica de un retrovirus, incluyendo, por ejemplo, elementos promotores y potenciadores que están localizados en U3. Las LTR pueden identificarse fácilmente en el provirus debido a la duplicación precisa en cualquier extremo del genoma. Tal y como se utiliza en la presente memoria, debería entenderse que una LTR en 5' incluye un elemento promotor en 5', y una secuencia de LTR suficiente como para permitir la transcripción inversa y la integración de la forma de ADN del vector. Debería entenderse que la LTR en 3' incluye una señal de poliadenilación, y una secuencia de LTR suficiente como para permitir la transcripción inversa y la integración de la forma de ADN del vector.
El sitio de unión de ARNt y el origen de la síntesis de la segunda cadena de ADN también son importantes para que un retrovirus sea biológicamente activo, y pueden identificarse fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, el ARNt retroviral se une al sitio de unión de ARNt por emparejamiento de bases de Watson-Crick, y es portado con el genoma del retrovirus en una partícula viral. El ARNt se utiliza entonces como un cebador para la síntesis del ADN por la transcriptasa inversa. El sitio de unión de ARNt puede identificarse fácilmente sobre la base de su localización justo en 3' de la LTR en 5'. De forma similar, el origen de la síntesis de la segunda cadena de ADN es, como su nombre indica, importante para la síntesis de la segunda cadena de ADN de un retrovirus. Esta región, que también se refiere como el tracto poli-purina, está localizada justo en 5' de la LTR en 3'.
Además de una LTR en 5 ' y 3', el sitio de unión de ARNt, y el origen de la síntesis de la segunda cadena de ADN, determinadas construcciones de RNV que se proporcionan en la presente memoria también comprenden una señal de empaquetamiento, así como una o más moléculas de ácido nucleico (p. ej., secuencias heterólogas), cada una de las cuales se discute con más detalle más adelante.
En la presente memoria se describe que se proporcionan construcciones de vector retroviral que carecen de secuencias codificadoras gag/pol y env. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión "carece de secuencias codificadoras gag/pol o env" debería entenderse que significa que el vector retroviral no contiene al menos 20, al menos 15, al menos 10, o al menos 8 nucleótidos consecutivos que se encuentran en los genes gag/pol o env, y en particular, en los casetes de expresión de gag/pol o env que se usan para construir líneas celulares de empaquetamiento para la construcción de vector retroviral. Alternativamente, se proporcionan construcciones de vector retroviral que carecen de secuencias pol o env pero que portan las secuencias gag que corresponden a la secuencia de empaquetamiento extendida, pero con mutaciones que impiden la traducción en esas secuencias gag.
La secuencia de ácido nucleico heteróloga de la descripción está presente típicamente en un casete bajo el control bien de las señales promotoras-potenciadoras de LTR viral o un promotor interno, y las señales retenidas en la LTR retroviral pueden todavía proporcionar una integración eficiente del vector en el genoma de la célula huésped. Por consiguiente, los vectores retrovirales recombinantes de la descripción, las secuencias, genes y/o fragmentos génicos deseados pueden insertarse en varios sitios y bajo diferentes secuencias reguladoras. Por ejemplo, un sitio para la inserción puede ser el sitio próximo al potenciador/promotor viral (es decir, locus génico dirigido por LTR en 5'). Alternativamente, las secuencias deseadas pueden insertarse en un sitio distal (p. ej., en 3' de la secuencia IRES en 3' respecto al gen env, la secuencia RSV en 3' respecto al gen env, y/o la secuencia promotora H1 o U6 en 3' respecto al gen env) o cuando dos o más secuencias heterólogas están presentes, una secuencia heteróloga puede estar bajo el control de una primera región reguladora y una segunda secuencia heteróloga bajo el control de una segunda región reguladora. Pueden usarse otros sitios distales que incluyen secuencias promotoras virales, donde la expresión de la secuencia o secuencias deseadas es a través de corte y empalme del cistrón proximal de promotor, un promotor heterólogo interno como SV40 o CMV, o un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES).
Además, esta lista de promotores no debería considerarse exhaustiva o limitante, los expertos en la técnica conocerán otros promotores que pueden usarse conjuntamente con los promotores y métodos descritos en la presente memoria.
Tabla 2 Promotores específicos de tejido
Tejido Promotor
Páncreas Insulina Elastina Amilasa pdr-1 pdx-1 glucoquinasa
Hígado Albúmina PEPCK potenciador de HBV a fetoproteína apolipoproteína C a-1 anitripsina vitelogenina, NF-AB Transtiretina
Músculo esquelético Cadena H de miosina Creatina quinasa muscular Distrofina Calpaína p94 alfa-actina esquelética troponina 1 rápida
Piel Queratina K6 Queratina K1
Pulmón CFTR Citoqueratina 18 humana (K18) Proteínas tensioactivas pulmonares A, B y C CC-10 P1
Músculo liso sm-22 a SM-alfa-actina
Endotelio Endotelina-1 E-selectina factor de von Willebrand TIE, KDR/flk-1 Tirosinasa de melanocitos
Tejido adiposo Lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1988) Adipsina (Spiegelman et al., 1989) acetil-CoA carboxilasa (Pape y Kim, 1989) glicerofosfato deshidrogenasa (Dani et al., 1989) P2 de adipocitos (Hunt et al., 1986)
Mama Proteína ácida del suero (w Ap ) (Andres et al. PNAS 84:1299-1303 1987
Sangre p-globina
Los "elementos reguladores específicos de tejido" son elementos reguladores (p. ej., promotores) que son capaces de dirigir la transcripción de un gen en un tejido mientras permanecen en gran medida "silenciosos" en otros tipos de tejidos. Se entenderá, sin embargo, que los promotores específicos de tejido pueden tener una cantidad detectable de actividad de "fondo" o "basal" en aquellos tejidos en los que son silenciosos. El grado en el que un promotor se activa selectivamente en un tejido diana puede expresarse como una relación de selectividad (actividad en un tejido diana/actividad en un tejido control). A este respecto, un promotor específico de tejido útil en la práctica de la descripción tiene típicamente una relación de selectividad mayor de aproximadamente 5. Preferiblemente, la relación de selectividad es mayor de aproximadamente 15.
Se entenderá además que determinados promotores, aunque no tienen la actividad restringida a un único tipo de tejido, pueden no obstante mostrar selectividad, ya que pueden ser activos en un grupo de tejidos, y menos activos o silenciosos en otro grupo. Dichos promotores también se denominan "específicos de tejido", y se contemplan para su uso con la descripción. Por consiguiente, los elementos reguladores específicos de tejido usados en la descripción, tienen aplicabilidad para la regulación de las proteínas heterólogas tales como los polipéptidos que tienen actividad citosina desaminasa de la descripción, así como una aplicabilidad como una secuencia de polinucleótido de direccionamiento en los vectores retrovirales.
Como se ha indicado anteriormente, la descripción está dirigida generalmente hacia métodos para inhibir el crecimiento de un tumor seleccionado utilizando construcciones de vectores que dirigen la expresión de un agente antitumoral. En particular, la descripción proporciona métodos para inhibir el crecimiento de un tumor seleccionado en un animal de sangre caliente, que comprende la etapa de administrar directamente al tumor una construcción de vector de la descripción (p. ej., un RRV o RNV), que dirige la expresión de al menos un agente antitumoral, de manera que se inhibe el crecimiento del tumor.
En el contexto de la descripción, "inhibir el crecimiento de un tumor seleccionado" se refiere bien a (1) la inhibición directa de la división de las células tumorales, o (2) la lisis de las células tumorales mediada por células inmunes, o ambas, lo que da lugar a una supresión en la expansión neta de las células tumorales. La inhibición del crecimiento tumoral por cualquiera de estos dos mecanismos puede determinarla fácilmente un experto en la técnica sobre la base de varios métodos muy conocidos. Por ejemplo, la inhibición tumoral puede determinarse midiendo el tamaño tumoral real durante un periodo de tiempo. Alternativamente, la inhibición tumoral puede determinarse estimando el tamaño de un tumor (durante un periodo de tiempo) utilizando métodos muy conocidos para los expertos en la técnica. Más específicamente, puede utilizarse una variedad de métodos de imagenología radiológica (p. ej., tomografía computarizada por emisión de fotón único y positrones; véase, generalmente, "Nuclear Medicine in Clinical Oncology", Winkler, C. (ed.) Springer-Verlag, Nueva York, 1986), para estimar el tamaño tumoral. Dichos métodos también pueden utilizar una variedad de agentes de imagenología, incluyendo, por ejemplo, agentes de imagenología convencionales (p. ej., citrato de Galio-67), así como reactivos especializados para la imagenología de metabolitos, imagenología de receptores, o imagenología de inmunológica (p. ej., marcadores tumorales específicos de anticuerpos monoclonales radiomarcados). Además, también pueden utilizarse métodos no radiactivos tales como ultrasonidos (véase, "Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff y Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, Nueva York, 1984), para estimar el tamaño de un tumor.
Además de los métodos in vivo para determinar la inhibición tumoral discutidos anteriormente, puede utilizarse una variedad de métodos in vitro con el fin de predecir la inhibición tumoral in vivo. Los ejemplos representativos incluyen actividad citolítica antitumoral mediada por linfocitos determinada, por ejemplo, por un ensayo de liberación de 51Cr, proliferación de linfocitos dependiente de tumor (Ioannides et al., J. Immunol. 146 (5): 1700-1707, 1991), generación in vitro de anticuerpos específicos de tumor (Herlyn et al., J. Immunol. Meth. 73:157-167, 1984), inhibición mediada por células (p. ej., CTL, célula T auxiliar) o humoral (p. ej., anticuerpo) del crecimiento celular in vitro (Gazit et al., Cancer Immunol. Immunother 35:135-144, 1992), y, para cualquiera de estos ensayos, la determinación de la frecuencia de precursores celulares (Vose, Int. J. Cancer 30:135-142 (1982), véase también F. Saade et al. Exp Rev Vaccines 11:1459-14702012 para una revisión de dichos métodos
Alternativamente, para otras formas de cáncer, la inhibición del crecimiento tumoral puede determinarse sobre la base de un cambio en la presencia de un marcador tumoral. Los ejemplos incluyen antígeno específico de la próstata ("PSA") para la detección de cáncer de próstata (véase la Pat. de EE. UU. No. Re. 33.405), y antígeno carcinoembrionario ("CEA") para la detección de cáncer colorrectal y determinados cánceres de mama. Para otros tipos más de cánceres tales como leucemia, la inhibición del crecimiento tumoral puede determinarse sobre la base de los números disminuidos de células leucémicas en un recuento representativo de células sanguíneas.
Puede seleccionarse una variedad de tumores para el tratamiento según los métodos descritos en la presente memoria. Pueden tratarse tumores sólidos, leucemias y linfomas. Los ejemplos representativos de tumores adecuados incluyen melanomas, carcinomas colorrectales, carcinomas de pulmón (incluyendo de células grandes, células pequeñas, escamosos y adenocarcinomas), carcinomas de células renales, glioblastomas y adenocarcinomas de mama.
Como se ha indicado anteriormente, puede utilizarse una variedad de agentes antitumorales según la descripción. En el contexto de la descripción, "agentes antitumorales" se entiende que se refiere a compuestos o moléculas que inhiben el crecimiento de un tumor seleccionado como se ha discutido anteriormente. Los ejemplos representativos de agentes antitumorales incluyen activadores inmunes e inhibidores de la proliferación tumoral. Brevemente, los activadores inmunes funcionan mejorando el reconocimiento inmune de antígenos específicos de tumor de manera que el sistema inmune se "ceba". El cebado puede consistir en la proliferación, diferenciación o evolución de los linfocitos a interacciones de mayor afinidad. El sistema inmune así cebado inhibirá o matará más efectivamente a las células tumorales. La activación inmune puede subcategorizarse en moduladores inmunes (moléculas que afectan la interacción entre el linfocito y la célula tumoral) y linfoquinas, que actúan para proliferar, activar, o diferenciar las células efectoras inmunes. Los ejemplos representativos de moduladores inmunes incluyen CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, p-2-microglobulina, chaperonas, interferón-a y y, B7/BB1 y complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los ejemplos representativos de linfoquinas incluyen interferón gamma, factor de necrosis tumoral, IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-23 GM-CSF, CSF-1, y G- CSF. Las secuencias codificadoras para todos estos factores son muy conocidas en la técnica.
Las secuencias que codifican los agentes antitumorales descritos anteriormente pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes de bases de datos públicas tales como Genbank o PubMed y pueden sintetizarse de novo por proveedores comerciales. Alternativamente, la secuencia puede amplificarse por PCR y clonarse a partir de bibliotecas de ADNc por métodos muy conocidos para los expertos en la técnica. Los plásmidos que contienen secuencias que codifican agentes antitumorales pueden obtenerse de las mismas maneras o a partir de depósitos tales como la American Type Culture Collection (ATCC, Manasassas, VA). Las secuencias de fuentes representativas que codifican los agentes antitumorales indicados anteriormente incluyen BBG 12 (que contiene el gen GM-CSF que codifica la proteína madura de 127 aminoácidos), BBG 6 (que contiene secuencias que codifican interferón gamma), ATCC No.
39656 (que contiene secuencias que codifican TNF), ATCC No. 20663 (que contiene secuencias que codifican interferón alfa), ATCC Nos. 31902, 31902 y 39517 (que contiene secuencias que codifican interferón beta), ATCC No 67024 (que contiene una secuencia que codifica Interleuquina-1 p), ATCC Nos. 39405, 39452, 39516, 39626 y 39673 (que contiene secuencias que codifican interleuquina-2), ATCC Nos. 59399, 59398, y 67326 (que contienen secuencias que codifican interleuquina-3), ATCC No. 57592 (que contiene secuencias que codifican interleuquina-4), ATCC Nos. 59394 y 59395 (que contienen secuencias que codifican interleuquina-5), y ATCC No. 67153 (que contiene secuencias que codifican interleuquina-6).
Además de los agentes antitumorales descritos anteriormente, la descripción también proporciona agentes antitumorales que comprenden una proteína de fusión de, por ejemplo, dos o más citoquinas, moduladores inmunes, toxinas o factores de diferenciación. Los agentes antitumorales preferidos a este respecto incluyen interferón alfa--interleuquina-2, GM-CSF-IL-4, GM-CSF-IL-2, GM-CSF-IL-3 (véanse las Pat. de EE. UU. Nos. 5.082.927 y 5.108.910), GM-CSF--interferón gamma, e interferón gamma--IL-4. En una realización particularmente preferida, el agente antitumoral es una proteína de fusión de interferón gamma-interleuquina-2. La construcción de este o estos agentes antitumorales puede conseguirse fácilmente dada la descripción proporcionada en la presente memoria. La construcción de un agente antitumoral particularmente preferido, interferón gamma--interleuquina-2, se describe con más detalle más adelante en el Ejemplo 1F.
Los inhibidores de la proliferación tumoral actúan inhibiendo directamente el crecimiento celular, o matando directamente a la célula tumoral. Los ejemplos representativos de inhibidores de la proliferación tumoral incluyen toxinas tales como ricina (Lamb et al., Eur. J. Biochem. 148:265-270, 1985), abrina (Wood et al., Eur. J. Biochem.
198:723-732, 1991; Evensen, et al., J. of Biol. Chem. 266:6848-6852, 1991: Collins et al., J. of Biol. Chem. 265:8665-8669, 1990; Chen et al, Fed. of Eur. Biochem Soc. 309:115-118, 1992), toxina de la difteria (Tweten et al., J. Biol. Chem. 260:10392-10394, 1985), toxina del cólera (Mekalanos et al., Nature 306:551-557, 1983; Sanchez y Holmgren, PNAS 86:481-485, 1989), gelonina (Stirpe et al., J. Biol. Chem. 255:6947-6953, 1980), fitolaca (Irvin, Pharmac. Ther.
21:371-387, 1983), proteína antiviral (Barbieri et al., Biochem. J. 203:55-59, 1982; Irvin et al., Arch. Biochem. & Biophys. 200:418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem & Biophys. 169:522-528, 1975), tritina, toxina de Shigella (Calderwood et al., PNAS 84:4364-4368, 1987; Jackson et al., Microb. Path. 2:147-153, 1987), y exotoxina A de Pseudomonas (Carroll y Collier, J. Biol. Chem. 262:8707-8711, 1987), timidina quinasa del virus del herpes simple (HSVTK) (Field et al., J. gen. Virol. 49:115-124, 1980), citosinas desaminasas, y guanina fosforibosil transferasa de E. coli. Los ejemplos adicionales de inhibidores de la proliferación tumoral incluyen secuencias antisentido, ARNsi y miARN que inhiben el crecimiento de las células tumorales previniendo la síntesis celular de proteínas críticas necesarias para el crecimiento celular o inhibiendo antagonistas de agentes potenciadores inmunes. Los ejemplos de secuencias antisentido incluyen timidina quinasa antisentido, dihidrofolato reductasa antisentido (Maher y Dolnick, Arch. Biochem. & Biophys. 253:214-220, 1987; Bzik et al., PNAS 84:8360-8364, 1987), HER2 antisentido (Coussens et al., Science 230:1132-1139, 1985), ABL antisentido (Fainstein, et al., Oncogene 4:1477-1481, 1989), Myc antisentido (Stanton et al., Nature 310:423-425, 1984) y ras antisentido, así como secuencias antisentido que bloquean cualquiera de las enzimas en la ruta biosintética de nucleótidos. Finalmente, los inhibidores de la proliferación tumoral también incluyen supresores tumorales tales como p53, retinoblastoma (Rb), y MCC y APC para carcinoma colorrectal.
Las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para uso con las construcciones de vector retroviral descritas anteriormente pueden prepararse fácilmente (véase, p. ej., la Publicación de Patente PCT No. WO 2010/148203, Publicación de Patente PCT No. WO 95/30763; y Publicación de Patente PCT No. WO 92/05266), y utilizarse para crear líneas celulares productoras (también denominadas líneas celulares productoras de vector o "VCLS") para la producción de partículas de vector recombinantes. En algunas realizaciones, las líneas celulares de empaquetamiento se preparan a partir de seres humanos (p. ej., células HT1080) permitiendo de esta manera la producción de retrovirus recombinantes que son capaces de sobrevivir a la inactivación en el suero humano. En la presente memoria se describe que las líneas celulares de empaquetamiento carecen de una ruta de función de interferón gamma para promover la producción viral óptima.
Rutinariamente, se usan modelos de ratón para ensayar los agentes biológicos. El vector de la descripción puede analizarse usando modelos de ratón. Por ejemplo, los sistemas de tumor de ratón pueden utilizarse para mostrar que las respuestas inmunes mediadas por células pueden potenciarse por la administración directa de una construcción de vector que expresa al menos un agente antitumoral. Por ejemplo, pueden inyectarse subcutáneamente a ratones Balb/C o C57B1/6 hembra de seis a ocho semanas de edad 1x105 a 2x105 células tumorales (CT26 o B16F10, respectivamente) que se dejan crecer en los ratones durante una a dos semanas. Los tumores resultantes pueden tener un tamaño variable (habitualmente 1-4 mm3 de volumen) siempre que el injerto no se vea comprometido por infección o ulceración. Se inyectan entonces intratumoralmente cinco a doscientos microlitros de una construcción de vector de la descripción, que expresa un agente antitumoral tal como, por ejemplo, IFNy, (titulación mínima 106 TU/ml). Se proporcionan múltiples inyecciones del vector en el tumor cada dos a tres días. Dependiendo de los parámetros del experimento particular, la naturaleza de las preparaciones de vector también puede ser variable. El vector puede ser de sobrenadante filtrado o no filtrado de líneas celulares productoras de vector (VCL), o puede procesarse además por filtración, concentración o diálisis y formulación. También pueden utilizarse otras técnicas estándar de purificación, tales como cromatografía de filtración en gel y de intercambio iónico para purificar el vector. Por ejemplo, puede usarse diálisis para eliminar el IFNy que ha sido producido por la VCL en sí misma (y que, si se administra, puede afectar el crecimiento tumoral). También puede usarse diálisis para eliminar posibles inhibidores de la transducción. Otra opción es realizar inyecciones intratumorales del IFNy de VCL en sí mismo, con el fin de introducir más extensamente el vector. Brevemente, las células pueden inyectarse después de haber sido centrifugadas de fluido de cultivo y resuspenderse en un medio farmacéuticamente aceptable (p. ej., PBS más 1 mg/ml de HSA). Pueden usarse tan pocas como 105 células en dicha realización. La eficacia de la construcción de vector puede determinarse midiendo la reducción en el crecimiento del tumor primario, la reducción en la carga tumoral (como se determina por un volumen tumoral disminuido), o por la inducción de una actividad incrementada de las células T frente a las células tumorales diana (como se mide en un sistema de ensayo in vitro usando linfocitos aislados de los bazos de estos animales que portan tumores). En un modelo de tumor metastásico murino, la eficacia también puede determinarse inyectando en primer lugar células tumorales que son metastásicas, y, cuando el tumor tiene un volumen de 1 -4 mm3, inyectando el vector varias veces en ese tumor. El injerto de tumor primario puede retirarse entonces quirúrgicamente después de 2-3 semanas, y contarse la reducción en las metástasis en el órgano diana establecido (pulmón, riñón, hígado, etc.). Para medir el cambio en las metástasis en el órgano diana, el órgano puede retirarse, pesarse, y compararse con un órgano sin tumor. Además, puede medirse la cantidad de metástasis en el órgano diana contando el número de nódulos metastásicos visibles usando un microscopio de disección con poco aumento.
Para los seres humanos, la localización para la administración directa de una construcción de vector depende de la localización del tumor o tumores. El gen de IFNy humano o de otras secuencias que codifican agentes antitumorales puede introducirse directamente en los tumores sólidos por la administración del vector (los vectores pueden purificarse como se ha descrito previamente). También pueden administrarse a leucemias, linfomas o tumores de ascitis. Para lesiones cutáneas tales como melanomas, el vector puede inyectarse directamente en o alrededor de la lesión. Deberían administrarse al menos 105 TU de partículas de vector, típicamente más de 106 TU en una formulación farmacéuticamente aceptable (p. ej., 10 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de HAS, Tris 25 mM pH 7,2 y NaCl 105 mM). Si se usa un curso de 5-FC complementario, los sujetos se dosifican durante 1 semana a 150mg/kg/día. Para las lesiones tumorales internas, el tumor afectado puede localizarse por rayos X, escaneo CT, imagenología de anticuerpos u otros métodos conocidos para los expertos en la técnica de la localización de tumores. La inyección del vector puede ser a través de la piel en lesiones internas, o por adaptaciones de broncoscopia (para pulmones), colonoscopia (para tumores colorrectales o esofágicos) o catéter de vaso intraarterial o intrasanguíneo (para muchos tipos de tumores sólidos vascularizados). La inyección puede ser en o alrededor de la lesión tumoral. La eficiencia de la inducción de una respuesta biológica puede medirse por CTL u otro ensayo de células T o por reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en el tumor. La eficacia y respuestas clínicas pueden determinarse midiendo la carga tumoral usando rayos X, escaneo CT o imagenología de anticuerpos u otros métodos conocidos para los expertos en la técnica de la localización de tumores.
Como entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso modificar una secuencia codificadora para aumentar su expresión en un huésped particular. El código genético es redundante con 64 posibles codones, pero la mayor parte de los organismos usan preferentemente un subconjunto de estos codones. Los codones que se utilizan lo más frecuentemente en una especie se denominan codones óptimos, y los que no se utilizan muy frecuentemente se clasifican como codones raros o de bajo uso (véase, p. ej., Zhang etal. (1991) Gene 105:61-72). Los codones pueden sustituirse para reflejar el uso de codones preferidos del huésped, un proceso denominado a veces "optimización de codones" o "control para el sesgo de codones de la especie".
Pueden prepararse secuencias codificadoras optimizadas que contienen codones preferidos por un huésped procariota o eucariota particular (véase también, Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508; E.Angov Biotechnol J. 6: 650-6592011, doi: 10.1002/biot.201000332), por ejemplo, para incrementar la tasa de traducción o para producir transcritos de ARN recombinantes que tienen propiedades deseables, tales como mayor semivida, en comparación con los transcritos producidos a partir de una secuencia no optimizada. Los codones de parada de la traducción también pueden modificarse para reflejar la preferencia del huésped. Por ejemplo, los codones de parada preferidos para S. cerevisiae y mamíferos son UAA y UGA, respectivamente. El codón de parada preferido para las plantas monocotiledóneas es UGA, mientras que los insectos y E. coli prefieren usar UAA como el codón de parada (Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218).
El sesgo en el uso de codones se refiere a las diferencias entre organismos en la frecuencia de aparición de codones en las secuencias de ADN codificadoras de proteínas (genes). Un codón es una serie de tres nucleótidos (tripletes) que codifica un residuo específico de aminoácido en una cadena de polipéptido. Como hay cuatro nucleótidos en el ADN, adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T), hay 64 tripletes posibles que codifican 20 aminoácidos, y tres codones de terminación de la traducción (sin sentido). Debido a esta redundancia, todos menos dos aminoácidos están codificados por más de un triplete. Los diferentes organismos muestran frecuentemente preferencias particulares para uno de los varios codones que codifican el mismo aminoácido. Cómo surgen estas preferencias es un área de gran debate de la evolución molecular.
Se sabe generalmente que las preferencias de codones reflejan un equilibrio entre sesgos mutaciones y selección natural para la optimización de la traducción. Los codones óptimos en microorganismos con un crecimiento rápido, como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), reflejan la composición de su conjunto de ARNt genómico respectivo. Se piensa que los codones óptimos ayudan a conseguir tasas de traducción más rápidas y una alta exactitud. Como resultado de estos factores, se espera que la selección de la traducción sea más fuerte en genes altamente expresados, como es de hecho el caso para los organismos mencionados anteriormente. En otros organismos que no muestran tasas de crecimiento altas o que presentan genomas pequeños, la optimización en el uso de codones está normalmente ausente, y las preferencias de codones se determinan por los sesgos mutaciones característicos observados en ese genoma particular. Los ejemplos de esto son Homo sapiens (ser humano) y Helicobacterpylori. Los organismos que muestran un nivel intermedio de optimización en el uso de codones incluyen Drosophila melanogaster(mosca de la fruta), Caenorhabditis elegans (gusano nemátodo) o Arabidopsis thaliana (berro trepador).
Tabla 3: uso de codones y preferencia de codones en el ser humano. Para cada codón, la tabla muestra la frecuencia del uso de cada codón (por mil) en las regiones codificadoras humanas (primera columna) y la frecuencia relativa de cada codón entre codones sinónimos (segunda columna).
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Como se ha discutido previamente, los textos generales, y sitios de internet comerciales, no lucrativos y académicos que describen técnicas de biología molecular útiles en la presente memoria, incluyendo el uso de vectores, promotores y muchos otros asuntos relevantes, incluyen Current Protocols ([www.]currentprotocols.com;
[www.]springerprotocols.com; [http://jcshprotocols.chslp.org/; Nature Protocols ([http://wwwjnature.com/nprot/index.html; serie de Methods in Enzymology ([http: //www.jelsevier.com/books/bookseries/methods-in- enzymology).
En otra realización, la descripción proporciona un vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno de la proliferación celular. El sujeto puede ser cualquier mamífero, y es preferiblemente un ser humano. El sujeto se pone en contacto con un vector recombinante de la descripción. El contacto puede ser in vivo o ex vivo. Los métodos para administrar el vector de la descripción se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, administración sistémica, administración tópica, administración intraperitoneal, administración intramuscular, intracraneal, cerebroespinal, así como administración directamente en el sitio de un tumor o trastorno de la proliferación celular. Otras rutas de administración conocidas en la técnica.
Se preparó vector infeccioso para uso in vitro y a pequeña escala por transfección transitoria de células diana como se describe. Típicamente, esto proporcionó titulaciones de 2x106 a 2x107 unidades de transducción (TU)/ml. El vector puede usarse como una preparación cruda o purificarse adicionalmente como se describe en WO2010148203. El vector infeccioso también puede prepararse usando una línea celular productora permanente y crecerse en cultivo sin suero y/o en suspensión para generar recogidas crudas de varios cientos de litros y material purificado en una formulación clínicamente aceptable como se describe (WO2010/148203). El material purificado tiene típicamente titulaciones de aproximadamente 109 TU/ml.
Los vectores de esta descripción pueden usarse según las propiedades del tumor diana. El tratamiento incluye habitualmente una etapa ablativa conjuntamente con una o dos moléculas de ARNsi con direccionamiento diferenciado. La etapa ablativa puede ser a través del uso de la administración de 5-FC después de la administración de un vector que codifica ARNsi anti-PD-L1 y citosina desaminasa. Alternativamente, la ablación puede ser mediante quimioterapia antes o después de la administración de un vector que codifica tanto ARNsi anti-PD-L1 como ARNsi anti-IDO-1. La quimioterapia puede ser con cualquier fármaco que se sabe que permite una recuperación inmune rápida o recuperación preferencial de células inmunes activadas sobre células inmunes inmunosupresoras tales como Temolozolomida o Ciclofosfamida (Treg) o 5-FC/5-FU (5-FU es tóxico preferentemente para las células supresoras derivadas de mieloide.
Los vectores descritos aquí permiten la administración a largo plazo de parejas de agentes, que se sabe que son ventajosas, a diferencia de la administración de un único agente. Los vectores pueden administrarse intratumoralmente, en cavidades de resección después de la resección o Intravenosamente. La inyección intratumoral o en la cavidad de resección puede causar la regresión de la lesión local, pero también puede dar lugar a efectos sistémicos, con el control de lesiones remotas a través de respuestas inmunes. Las dosis intratumorales o en la cavidad de resección pueden ser entre 106 TU a 1011 TU, con una única inyección o alternativamente con administración seriada espaciada entre 3, 6, 12, 24 o 36 meses. La administración IV usa dosis que son hasta 1.000 veces mayores, pero lo más probablemente aproximadamente 100 o 10 veces mayores. El vector IV se administra preferiblemente en múltiples días secuenciales, por ejemplo, cada 3 días o cada 5 días o cada 7 días como en animales (Huang et al., Hum Gen Ther 26:82-93, 2015). Alternativamente, la administración puede ser en múltiples días que no son secuenciales.
Así, la descripción incluye varias composiciones farmacéuticas útiles para tratar un trastorno de la proliferación celular. Las composiciones farmacéuticas según la descripción se preparan poniendo un vector que contiene una secuencia de polinucleótido heteróloga útil para tratar o modular un trastorno de la proliferación celular según la descripción en una forma adecuada para la administración a un sujeto usando vehículos, excipientes y aditivos o auxiliares. Los vehículos o auxiliares usados frecuentemente incluyen carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteína de la leche, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales, polietilen glicoles y disolventes, tales como agua estéril, alcoholes, glicerol y alcoholes polihídricos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes. Los conservantes incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y semejantes, como se describe, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV., 14a ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). El pH y la concentración exacta de los distintos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según las técnicas rutinarias en la técnica. Véase, Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7a ed.).
Se pretende que los siguientes Ejemplos ilustren, pero no limiten, la descripción. Aunque dichos Ejemplos son típicos de los que podrían usarse, pueden utilizarse alternativamente otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplos
Los linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) humanos pueden producir respuestas inmunes específicas de tumor cuando se estimulan con dianas celulares cognadas. Específicamente, las dianas tales como tumores o células presentadoras de antígeno que expresan un péptido antigénico específico de tumor presentado en el contexto de una molécula HLA emparejada pueden unirse al receptor de las células T (TCR) en el TIL, lo que inicia una cascada de señalización que dirige finalmente al TIL a proliferar, expresar marcadores de activación en la superficie celular y producir citoquinas efectoras tales como TNF-alfa e interferón gamma (IFNg, Smith-Garvin et al., Annu Rev Immunol 27: 591-619, 2009). Los TIL que interaccionan con tumores emparejados pueden ser herramientas útiles para entender los mecanismos inmunológicos básicos o para evaluar los parámetros inmunológicos de una inmunoterapia experimental.
Ejemplo 1: la expresión de IDO1 es inducida por IFNy en glioma. La expresión de IDO1 que se sabe que está regulada al alza en gliomas y se induce por IFNy. Un panel de líneas celulares de glioma fue evaluado para determinar su expresión de IDO1 después de la inducción con IFNy. La Figura 2 muestra que IDO1 (anti-I DO1 humano a 1:1.500, Cell Signaling) está regulado al alza por IFNy y el nivel de inducción varía entre las líneas celulares de glioma. La detección de GAPDH (anti-GAPDH humano a 1:500, Cell Signaling) se incluyó como un control de carga.
Ejemplo 2: la expresión de PD-L1 en la superficie celular se induce por IFNy en líneas celulares de glioma y otras líneas celulares tumorales. Se sabe que la expresión de PDL1 está regulada al alza en líneas celulares de glioma y otras líneas celulares tumorales. Su expresión puede inducirse además por IFNy. Un panel de líneas celulares de cáncer incluyendo líneas celulares de glioma se evalúa para determinar su expresión de PDL1 (anticuerpo anti-PD-L1 humano, eBioscience) antes y después de la inducción con IFNy. La Figura 3 muestra que la expresión basal de PDL1 varía entre líneas celulares y que la mayor parte de las líneas celulares, pero no todas, ensayadas aquí responde a IFNy para inducir adicionalmente la expresión de PDL1.
Ejemplo 3: las expresiones de TGFp1 y 2 están reguladas al alza en un panel de líneas celulares de glioma y otras líneas celulares tumorales. Se sabe que la expresión de TGFp1 y TGFp2 está regulada al alza en líneas celulares de glioma y otras líneas celulares tumorales. Un panel de líneas celulares de cáncer incluyendo líneas celulares de glioma fue evaluado para determinar su expresión de TGFp1, 2 y 3 expresión antes y después del tratamiento con IFNy usando cebadores Taqman específicos de la isoforma de TGFp humana (Life Technology). La Figura 4 muestra que los niveles de expresión de TGFpl, 2 y 3 varían entre las líneas celulares. Algunas expresan más TGFpl y otras expresan más TGFp2. En todos los casos, la expresión de TGFp3 es baja. A diferencia de IDO1 y PDL1, la expresión de TGFp1,2 y 3 no se induce por IFNy.
Ejemplo 4: Clonación y caracterización de pAC3-U6ARNsh y pAC3-U6miR30ARNsh frente a IDO1, PDL1 y TGFp2. Los vectores retrovirales competentes para la replicación, pAC3-U6-miR30ARNsh, derivaron del núcleo de pAC3-yCD2 (SEQ ID NO:1). El núcleo de pAC3 se aisló por digestión con endonucleasa del ADN del plásmido pAC3-yCD2 con Mlu I y Not I. El casete U6-ARNsh contiene un promotor U6 humano y una secuencia de ARNsh específica de diana dirigida a IDO1, PDL1 y TGFp2. El casete U6-miR30ARNsh contiene un promotor U6 y una secuencia de ARNsh específica de diana incluida en el núcleo de microARN30 (miR30) dirigida a IDO1, PDL1 y TGFp2 (Figura 5). Cada fragmento de ADN de U6miR30ARNsh se sintetizó con sitio de enzima de restricción Mlu I y Not I presente en cada extremo del fragmento de ADN para la inserción posterior en el sitio correspondiente en el núcleo de pAC3.
Se produjo una preparación del vector por transfección transitoria del ADN plasmídico que codifica el vector en células 293T usando el método del fosfato de calcio. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante que contenía el vector se recogió y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm y se usó inmediatamente o se almacenó en partes alícuotas a -80 °C para uso posterior. Los valores de titulación de estos vectores se determinaron en células PC3 por el método de qPCR usando el conjunto de cebadores (5-MLV-U3-B: 5'-AGCCCACAACCCCTCACTC-3 ' (SEQ ID NO: 2), 3-MLV-Psi: 5'-TCTCCCGATCCCGGACGA-3' (SEQ ID NO:3). Sonda: FAM-5'-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-3'-BHQ1 (SEQ ID NO: 4)). Veinte microlitros de las preparaciones de vector recogidas se usaron para infectar células de cáncer de próstata humano, PC3. Cuarenta y ocho horas después de la infección, el ADN genómico de las células PC3 infectadas se extrajo para el ensayo de la titulación. La titulación de las preparaciones de vector se determinó por qPCR con una inclusión de estándares con números de copias conocidos.
Se usó una MOI de 0,1 para infectar células LN18 que se sabe que expresan un nivel marcado de IDO1, PDL1 y TGFp2. La actividad de inactivación de miR30ARNsh para cada gen diana específico se midió directamente a nivel de proteína. Aproximadamente en el día 14 después de la infección, las células infectadas con los vectores pAC3-U6-30ARNsh y pAC3-U6miR30ARNsh se recogieron para diferentes ensayos, dependiendo del gen diana de interés, para medir la actividad de inactivación del ARNsh.
Las células LN18 infectadas con los vectores pAC3-U6-IDO1ARNsh o pAC3-U6-IDO1miR30ARNsh se recogieron para el análisis cualitativo del nivel de expresión de IDO1 después de la inducción con IFNy. La Figura 6 muestra que pAC3-U6-IDO1ARNsh2, pAC3-U6-IDO1miR30ARNsh1 y pAC3-U6- IDOmiR30ARNsh2 tienen más del 50 % de actividad de inactivación frente a IDO1 en comparación con la de las células no infectadas. Asimismo, las células LN18 y LN229 infectadas con el vector pAC3-U6-PDL1miR30ARNsh4 también tienen más del 50 % de actividad de inactivación (Figura 7). Para la medición de la actividad de inactivación de TGFp2, las células LN18 no infectadas o completamente infectadas con los vectores pAC3-U6-TGFp2ARNsh1, pAC3-U6-TGFp2ARNsh2 o pAC3-U6-TGFp2ARNsh3 se sembraron con el mismo número de células en matraz T25. El sobrenadante de células con densidad confluente se recogió para medir el nivel de TGFp2 bioactivo por ELISA (R & D Systems). La Figura 8 muestra que pAC3-U6-TGFp2ARNsh1, pAC3-U6-TGFp2ARNsh2 y pAC3-U6TGFp2ARNsh4 tienen más del 50 % de actividad de inactivación. Además, el tratamiento con IFNy y ARNsh tiene un efecto sinérgico en la regulación a la baja de TGFp2.
La estabilidad del vector de algunos vectores pAC3-U6-miR30ARNsh frente a IDO1, PDL1 o TGFp2 descritos anteriormente se evaluó por PCR de punto final en células LN18 infectadas. Las células infectadas con vectores a una MOI de 0,1 se subcultivan en cultivo durante hasta 21 días. El ADN genómico se extrajo de las células infectadas seguido de PCR de punto final usando un conjunto de cebadores que abarcaba la región env en 3' y UTR en 3' (UCLA-5-127: 5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3' (SEQ ID NO: 5); UCLA-3-37: 5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3' (SEQ ID NO: 6)). La Figura 9 muestra que pAC3-U6-IDO1miR30ARNsh1, pAC3-U6-IDO1miR30ARNsh2, pAC3-U6-PDL1miR30ARNsh4, pAC3-U6-TGFp2miR30ARNsh1, pAC3-U6-TGFp2miR30ARNsh2, y pAC3-U6-TGFp2miR30ARNsh4 son estables en las células LN18.
Ejemplo 5: Clonación y caracterización de pAC3-H1-mi30ARNsh frente a IDO1, PDL1. Los vectores retrovirales competentes para la replicación, pAC3-H1-IDO1miR30ARNsh y pAC3-H1-PDL1miR30ARNsh, derivan del núcleo de pAC3-yCD2 (SEQ ID NO:1). El núcleo de pAC3 se aisló por digestión con endonucleasa del ADN del plásmido pAC3-yCD2 con Mlu I y Not I. El casete H1-miR30ARNsh contiene un promotor H1 humano y una secuencia de ARNsh específica de diana dirigida a IDO1 y PDL1 (Figura 5). Cada fragmento de ADN de H1 miR30ARNsh se sintetizó con sitio de enzima de restricción Mlu I y Not I presente en cada extremo del fragmento de ADN para la inserción posterior en el sitio correspondiente en el núcleo de pAC3.
Se produjo una preparación del vector por transfección transitoria del ADN plasmídico que codifica el vector en células 293T usando el método del fosfato de calcio. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante que contenía el vector se recogió y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm y se usó inmediatamente o se almacenó en partes alícuotas a -80 °C para uso posterior. Los valores de titulación de estos vectores se determinaron en células PC3 por el método de qPCR usando el conjunto de cebadores (5-MLV-U3-B: 5'-AGCCCACAACCCCTCACTC-3' (SEQ ID NO: 2), 3-MLV-Psi: 5'-TCTCCCGATCCCGGACGA-3' (SEQ ID NO:3). Sonda: FAM-5'-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-3'-BHQ1 (SEQ ID NO: 4)). Veinte microlitros de las preparaciones de vector recogidas se usaron para infectar células de cáncer de próstata humano, PC3. Cuarenta y ocho horas después de la infección, el ADN genómico de las células PC3 infectadas se extrajo para el ensayo de la titulación. La titulación de las preparaciones de vector se determinó por qPCR con una inclusión de estándares con números de copias conocidos.
Se usó una MOI de 0,1 para infectar células LN18 que se sabe que expresan un nivel marcado de IDO1 y PDL1. La actividad de inactivación de miR30ARNsh para cada gen diana específico se midió directamente a nivel de proteína. Aproximadamente en el día 14 después de la infección, las células infectadas con los vectores pAC3-H1-miR30ARNsh se recogieron para diferentes ensayos, dependiendo del gen diana de interés, para medir la actividad de inactivación del ARNsh.
Las células LN18 infectadas con los vectores pAC3-H1 IDO1ARNsh se recogieron para el análisis cualitativo del nivel de expresión de IDO1 después de la inducción con IFNy. La Figura 10 muestra que pAC3-H1-IDO1miR30ARNsh2 tiene más del 50 % de actividad de inactivación frente a IDO1 en comparación con la de las células no infectadas. Asimismo, Las células LN18 infectadas con el vector pAC3-H1-PDL1 miR30ARNsh4 también mostraron más del 50 % de actividad de inactivación (Figura 11).
La estabilidad del vector de algunos vectores pAC3-H1-miR30ARNsh frente a IDO1 o PDL1 descritos anteriormente se evaluó por PCR de punto final en células LN18 infectadas. Las células infectadas con los vectores a una MOI de 0,1 se subcultivaron en cultivo durante hasta 21 días. El ADN genómico se extrajo de las células infectadas seguido de PCR de punto final usando un conjunto de cebadores que abarcaba la región env en 3' y UTR en 3' (UCLA-5-127: 5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3' (SEQ ID NO: 5); UCLA-3-37: 5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3' (SEQ ID NO: 6)). La Figura 12 muestra que pAC3-H1-IDO1 miR30ARNsh2 y pAC3-H1-PDL1miR30ARNsh4 son estables en las células LN18.
Ejemplo 6: Clonación y caracterización de pAC3-RSV-miR30ARNsh frente a IDO1, PDL1. Los vectores retrovirales competentes para la replicación, pAC3-RSV-IDO1miR30ARNsh y pAC3-RSV-PDL1miR30ARNsh, derivan del núcleo de pAC3-yCD2 (SEQ ID NO:1). El núcleo de pAC3 se aisló por digestión con endonucleasa del ADN del plásmido pAC3-yCD2 con Mlu I y Not I. El casete RSVmiR30ARNsh contiene un promotor de RSV y una secuencia de ARNsh específica de diana dirigida a IDO1 y PDL1 (Figura 5). Cada fragmento de ADN de RSVmiR30ARNsh se sintetizó con sitio de enzima de restricción Mlu I y Not I presente en cada extremo del fragmento de ADN para la inserción posterior en el sitio correspondiente en el núcleo de pAC3.
Se produjo una preparación del vector por transfección transitoria del ADN plasmídico que codifica el vector en células 293T usando el método del fosfato de calcio. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante que contiene el vector se recoge y se filtra a través de un filtro de jeringa de 0,45 pm y se usa inmediatamente o se almacena en partes alícuotas a -80 °C para uso posterior. Los valores de titulación de estos vectores se determinaron en células PC3 por el método de qPCR usando el conjunto de cebadores (5-MLV-U3-B: 5'-AGCCCACAACCCCTCACTC-3' (SEQ ID NO: 2), 3-MLV-Psi: 5'-TCTCCCGATCCCGGACGA-3' (SEQ ID NO:3). Sonda: FAM-5'-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-3'-BHQ1 (SEQ ID NO: 4)). Veinte microlitros de las preparaciones de vector recogidas se usaron para infectar células de cáncer de próstata humano, PC3. Cuarenta y ocho horas después de la infección, el ADN genómico de las células PC3 infectadas se extrajo para el ensayo de la titulación. La titulación de las preparaciones de vector se determinó por qPCR con una inclusión de estándares con números de copias conocidos.
Se usó una MOI de 0,1 para infectar células LN18 que se sabe que expresan un nivel marcado de IDO1 y PDL1. La actividad de inactivación de miR30ARNsh para cada gen diana específico se mide directamente a nivel de proteína. Aproximadamente en el día 14 después de la infección, las células infectadas con los vectores pAC3-RSV-miR30ARNsh se recogieron para diferentes ensayos, dependiendo del gen diana de interés, para medir la actividad de inactivación del ARNsh.
Las células LN18 infectadas con los vectores pAC3-RSV-IDO1ARNsh se recogieron para el análisis cualitativo del nivel de expresión de IDO1 después de la inducción con IFNy. La Figura 10 muestra que pAC3-RSV-IDO1miR30ARNsh2 tiene más del 50 % de actividad de inactivación frente a IDO1 en comparación con la de las células no infectadas. Asimismo, las células LN18 infectadas con el vector pAC3-RSV-PDL1miR30ARNsh4 también mostraron más del 50 % de actividad de inactivación (Figura 13).
La estabilidad del vector de algunos vectores pAC3-RSV-PDL1miR30ARNsh frente a IDO1 o PDL1 descritos anteriormente se evaluaron por PCR de punto final en células LN18 infectadas. Las células infectadas con vectores a una MOI de 0,1 se subcultivan en cultivo durante hasta 21 días. El ADN genómico se extrajo de las células infectadas seguido de PCR de punto final usando un conjunto de cebadores que abarcaba la región env en 3' y UTR en 3' (UCLA-5-127: 5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3' (SEQ ID NO: 5); UCLA-3-37: 5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3' (SEQ ID NO: 6)). La Figura 12 muestra que pAC3-RSV-IDO1 miR30ARNsh2 y pAC3-RSV-PDL1 miR30ARNsh4 son estables en las células LN18.
Ejemplo 7: Clonación y caracterización de pAC3-RSV-yCD2-IDO1miR30ARNsh2 y pAC3-RSV-yCD2-PDL1 miR30shRA4. Los vectores retrovirales competentes para la replicación, pAC3-RSV-yCD2- IDO1 miR30ARNsh2 y pAC3-RSV-yCD2-PDL1miR30ARNsh4, derivan del núcleo de pAC3-yCD2 (SEQ ID NO:1). El núcleo de pAC3 se aisló por digestión con endonucleasa del ADN del plásmido pAC3-yCD2 con Mlu I y Not I. El casete RSV-yCD2-miR30ARNsh contiene un promotor de RSV y una secuencia de ARNsh específica de diana dirigida a IDO1 y PDL1 (Figura 5). Cada fragmento de ADN de RSV-yCD2-miR30ARNsh se sintetizó con sitio de enzima de restricción Mlu I y Not I presente en cada extremo del fragmento de ADN para la inserción posterior en el sitio correspondiente en el núcleo de pAC3.
Se produjo una preparación del vector por transfección transitoria del ADN plasmídico que codifica el vector en células 293T usando el método del fosfato de calcio. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante que contenía el vector se recogió y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm y se usó inmediatamente o se almacenó en partes alícuotas a -80 °C para uso posterior. Los valores de titulación de estos vectores se determinan en células PC3 por el método de qPCR usando el conjunto de cebadores (5-MLV-U3-B: 5'-AGCCCACAACCCCTCACTC-3' (SEQ ID NO: 2), 3-MLV-Psi: 5'-TCTCCCGATCCCGGACGA-3' (SEQ ID NO:3). Sonda: FAM-5'-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-3'-BHQ1 (SEQ ID NO:4)). Veinte microlitros de las preparaciones de vector recogidas se usaron para infectar células de cáncer de próstata humano, PC3. Cuarenta y ocho horas después de la infección, el ADN genómico de las células PC3 infectadas se extrajo para el ensayo de la titulación. La titulación de las preparaciones de vector se determinó por qPCR con una inclusión de estándares con números de copias conocidos.
Se usó una MOI de 0,1 para infectar las células LN18 que se sabe que expresan un nivel marcado de IDO1 y PDL1. La actividad de inactivación de miR30ARNsh para cada gen diana específico se midió directamente a nivel de proteína. Aproximadamente en el día 14 después de la infección, las células infectadas con los vectores pAC3-H1miR30ARNsh se recogieron para diferentes ensayos, dependiendo del gen diana de interés, para medir la actividad de inactivación del ARNsh.
Las células LN18 infectadas con los vectores pAC3-RSV-yCD2-IDO1miR30ARNsh se recogieron para el análisis cualitativo del nivel de expresión de IDO1 después de la inducción con IFNy. La Figura 10 muestra que pAC3-RSV-yCD2-IDO1miR30ARNsh2 tiene más del 50 % de actividad de inactivación frente a IDO1 en comparación con la de las células no infectadas. Asimismo, las células LN18 infectadas con el vector pAC3-RSV-yCD2-PDL1 miR30ARNsh4 también mostraron aproximadamente el 50 % actividad de inactivación (Figura 14).
La estabilidad del vector de algunos vectores pAC3-RSV-yCD2miR30ARNsh frente a IDO1 o PDL1 descritos anteriormente se evaluó por PCR de punto final en células LN18 infectadas. Las células infectadas con vectores a una MOI de 0,1 se subcultivan en cultivo durante hasta 21 días. El ADN genómico se extrajo de las células infectadas seguido de PCR de punto final usando un conjunto de cebadores que abarcaba la región env en 3' y UTR en 3' (UCLA-5-127: 5'-CT GAT CTT ACT CTTTGGACCTTG-3' (SEQ ID NO: 5); UCLA-3-37: 5'-CCCCTTTTT CTGGAGACT AAAT AA-3' (SEQ ID NO: 6)). La Figura 12 muestra que pAC3-RSV-yCD2-IDO1miR30ARNsh2 y pAC3-RSV-yCD2-PDL1 miR30ARNsh4 son estables en las células LN18.
Ejemplo 8: Clonación y caracterización de pAC3-RSV-yCD2-U6-IDO1miR30ARNsh2 y pAC3-RSV-yCD2-U6-PDL1miR30shR A4. Los vectores retrovirales competentes para la replicación, pAC3-RSV-yCD2-U6-IDO1miR30ARNsh2 y pAC3-RSV-yCD2-U6-PDL1miR30ARNsh4, derivan del núcleo de pAC3-yCD2. El núcleo de pAC3 se aisló por digestión con endonucleasa del ADN del plásmido pAC3-yCD2 con Mlu I y Not I. El casete RSV-yCD2-U6-miR30ARNsh contiene un promotor de RSV y una secuencia de ARNsh específica de diana dirigida a IDO1 y PDL1 (Figura 5). Cada fragmento de ADN de RSV-yCD2-U6-miR30ARNsh se sintetizó con sitio de enzima de restricción Mlu I y Not I presente en cada extremo del fragmento de ADN para la inserción posterior en el sitio correspondiente en el núcleo de pAC3.
Se produjo una preparación del vector por transfección transitoria del ADN plasmídico que codifica el vector en células 293T usando el método del fosfato de calcio. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante que contenía el vector se recogió y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm y se usó inmediatamente o se almacenó en partes alícuotas a -80 °C para uso posterior. Los valores de titulación de estos vectores se determinaron en células PC3 por el método de qPCR usando el conjunto de cebadores (5-MLV-U3-B: 5'-AGCCCACAACCCCTCACTC-3' (SEQ ID NO: 2), 3-MLV-Psi: 5'-TCTCCCGATCCCGGACGA-3' (SEQ ID NO:3). Sonda: FAM-5'-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-3'-BHQ1 (SEQ ID NO: 4)). Veinte microlitros de las preparaciones de vector recogidas se usaron para infectar células de cáncer de próstata humano, PC3. Cuarenta y ocho horas después de la infección, el ADN genómico de las células PC3 infectadas se extrajo para el ensayo de la titulación. La titulación de las preparaciones de vector se determinó por qPCR con una inclusión de estándares con números de copias conocidos.
Se usó una MOI de 0,1 para infectar las células LN18 que se sabe que expresan un nivel marcado de IDO1 y PDL1. La actividad de inactivación de miR30ARNsh para cada gen diana específico se mide directamente a nivel de proteína. Aproximadamente en el día 14 después de la infección, las células infectadas con los vectores pAC3-RSV-yCD2-U6-miR30ARNsh se recogieron para diferentes ensayos, dependiendo del gen diana de interés, para medir la actividad de inactivación del ARNsh.
Las células LN18 infectadas con los vectores pAC3-RSV-yCD2-U6-IDO1miR30ARNsh se recogieron para el análisis cualitativo del nivel de expresión de IDO1 después de la inducción con IFNy. La Figura 10 muestra que pAC3-RSV-IDO1-U6-miR30ARNsh2 tiene más del 50 % de actividad de inactivación frente a IDO1 en comparación con la de las células no infectadas. Asimismo, las células LN18 infectadas con el vector pAC3-RSV-yCD2-U6-PDL1 miR30ARNsh4 también mostraron aproximadamente un 40 % actividad de inactivación (Figura 15).
La estabilidad del vector de algunos vectores pAC3-RSV-yCD2-U6-miR30ARNsh frente a IDO1 o PDL1 descritos anteriormente se evaluó por PCR de punto final en las células LN18 infectadas. Las células infectadas con vectores a una MOI de 0,1 se subcultivan en cultivo durante hasta 21 días. El ADN genómico se extrajo de las células infectadas seguido de PCR de punto final usando un conjunto de cebadores que abarcaba la región env en 3' y UTR en 3' (UCLA-5-127: 5'-CTGATCTTACTCTTTGGACCTTG-3' (SEQ ID NO: 5); UCLA-3-37: 5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3' (SEQ ID NO: 6)). La Figura 12 muestra que pAC3-RSV-yCD2-U6-IDO1miR30ARNsh2 y pAC3-RSV-yCD2-U6-PDL1 miR30ARNsh4 son estables en las células LN18.
Ejemplo 9: el cocultivo de una línea de TIL (1520 TIL) con una línea celular diana (FEMX) activa las células T y da lugar a la producción de IFN-y. Los efectos inmunológicos de la modulación de la expresión de PD-L1 en dianas tumorales se investigaron usando un TIL basado en melanoma (1520 TIL) reactivo frente a la línea celular de melanoma FEMX que expresa el antígeno de diferenciación gp100 (Voss et al., Immunol Res 45: 13-24, 2008). En primer lugar, el sistema de tumor TIL produjo IFN-y de una forma específica de tumor como se mide en un ensayo de liberación de citoquinas intracelular (ICS) estándar de 12 horas. Los datos se muestran en la Figura 16. El 1 % de los TIL CD3+CD8+ produjeron IFN-y cuando se cultivaron solos (Figura 16A-cuadrante superior derecho) pero más del 24 % de los TIL CD3+CD8+ produjeron IFN cuando se cocultivaron con tumores (Figura 16B-cuadrante superior derecho).
Ejemplo 10: el bloqueo de PD-L1 incrementa la frecuencia de células T CD8+ específicas de tumores que producen IFN-y. El experimento en el Ejemplo 9 también incluyó un brazo donde se añadieron 10pg de un anticuerpo anti-PD-L1 bloqueante (Biolegend clon 29E.2A3) a los tumores FEMX justo antes de añadir el TIL al cocultivo a una concentración final de 10pg/mL. Los resultados de este brazo del estudio mostraron que la actividad de bloqueo de PD-L1 aumentó la fracción de células T que produce IFN-gamma del 24,4 % hasta el 37,3 % (Figura 16C-cuadrante superior derecho). Pueden usarse otros puntos finales inmunológicos tales como un ensayo de proliferación CFSE o análisis fenotípico basado en citometría de flujo policromática para confirmar los efectos de esta perturbación del eje PD-L1 :PD-1 en el sistema TIL, y el resultado puede demostrarse en otras parejas de células T :tumor.
Ejemplo 11: inactivación de la expresión génica de PD-L1 después de la infección con un RRV-PDL1 mi30ARNsh. Se infectaron células FEMX a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 con el vector RRV que expresa el PD-L1ARNsh mostrado en la Figura 20. Se dejó que la infección continuara hasta que las células tumorales estuvieron infectadas al máximo y se midió la expresión en la superficie celular de PD-L1 por citometría de flujo. Los tumores FEMX transducidos con el vector RRV que expresa el PD-L1ARNsh demostraron una inactivación significativa en la expresión de PD-L1 en comparación con las líneas tumorales parentales y con ARNsh no específicos.
Ejemplo 12: la regulación a la baja de PD-L1 mediada por RRV en dianas tumorales incrementa el reconocimiento y activación de las células T. Se tratan células FEMX como se describe en el Ejemplo 3 y el experimento mostrado en los Ejemplos 1 y 2 se repitió, con la línea FEMX diana en las formas moduladas por RRV-anti-PD-L1 y no moduladas. Esta modulación de la expresión de PD-L1, aumentó la función de las células T específicas de tumor a niveles comparables con el anticuerpo de bloqueo como se mide en nuestro sistema TIL usando la lectura del Ejemplo 10. Pueden usarse otros puntos finales inmunológicos tales como un ensayo de proliferación CFSE o análisis fenotípico basado en citometría de flujo policromática para confirmar los efectos de esta perturbación del eje PD-L1 :PD-1 en el sistema TIL, y el resultado puede demostrarse en otras parejas de células T :tumor.
Ejemplo 13: la depleción de triptófano y la producción posterior de quinurenina están relacionadas con la cantidad de IDO en las células tumorales. La depleción del aminoácido esencial triptófano del medio completo mientras se incrementa la concentración de quinurenina (un metabolito tóxico del catabolismo del triptófano) ocurre cuando se cultivan tumores que expresan altas cantidades de IDO. Los niveles de expresión de IDO en los tumores pueden modularse por la transducción estable con un vector lentiviral que expresa la secuencia de ADNc de IDO (Origene). Las LN-18 parentales, control (secuencia desorganizada) y que sobreexpresan IDO (un glioblastoma humano) se cultivan con 500 U de IFN-y durante 72 horas y se ensayan para determinar la expresión de IDO por transferencia western, así como los niveles de triptófano y quinurenina por ELISA (Rocky Mountain Diagnostic). La expresión de la enzima IDO detectada por Western se correlaciona fuertemente con el incremento de quinurenina y la disminución de triptófano como se detecta por ELISA.
Ejemplo 14: las células T cocultivadas con tumores IDO+ son anergizadas por la ausencia de triptófano y altas cantidades de quinurenina. Se aíslan los sobrenadantes de cultivos de 72 horas de LN-18 parentales, control (secuencia desorganizada) y que sobreexpresan IDO y se usan como el medio de cultivo para ensayos de estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC marcadas con CFSE (Thermo) aisladas de donantes sanos se estimulan policlonalmente con lechos de anti-CD3/CD28 (Milteny) toda la noche y se usan tres puntos finales para medir el impacto de la concentración de quinurenina y triptófano en la función de las células T: secreción de IFN-y y TNF-a como se mide por ELISA, proliferación de las células T como se determina por la dilución de CFSE y niveles de expresión en la superficie celular de los marcadores de activación CD69, CD25 y CD71 en el citómetro de flujo (Critchley et al., PLoS Med., 4(5), 2007). Los resultados de los tres puntos finales se alinean entre sí cuando las PBMC cultivadas en los sobrenadantes de LN-18 que sobreexpresan IDO presentan una proliferación, liberación de citoquinas y expresión de los marcadores de activación relativamente limitadas en comparación con las PBMC cultivadas en el sobrenadante de LN-18 parentales o control.
Ejemplo 15: inactivación de la expresión génica de IDO después de la infección con un RRV-IDO1mi30ARNsh. Se infectaron células LN-18 con una MOI de 0,1 usando el vector RRV que expresa el IDOARNsh mostrado en la Figura 20. Se dejó que la infección continuara hasta que las células tumorales estuvieron infectadas al máximo y se midió la expresión de IDO por transferencia western (Cell Signaling). Los tumores de LN-18 transducidos con el vector RRV que expresa el IDOARNsh demostraron una inactivación significativa en la expresión de IDO-1 en comparación con las líneas tumorales parentales y con ARNsh no específico cuando se trataron con IFN-y (Figura 6 y 10).
Ejemplo 16: la inactivación de la expresión génica de IDO en glioma humano con RRV reduce la anergia de células T mediada por IDO. De manera similar al conjunto de experimentos en el Ejemplo 14, se aislaron los sobrenadantes de cultivos de 72 horas de líneas celulares LN-18 parentales, control (secuencia desorganizada) y que sobreexpresan IDO y con IDO inactivado y se usan como se hizo anteriormente para medir el impacto de la concentración de quinurenina y triptófano en la función de las células T. De manera similar al Ejemplo 14, las PBMC cultivadas en los sobrenadantes de LN-18 con IDO inactivado presentan una proliferación, liberación de citoquinas y expresión de los marcadores de activación aumentadas en comparación con las PBMC cultivadas en el sobrenadante de LN-18 parentales o control y especialmente las células LN-18 que sobreexpresan IDO.
Ejemplo 17: construcción de vectores pBA9b-IFNg. pBA9b deriva del vector pBA-5b y tiene la misma secuencia de núcleo de vector retroviral (Sheridan et al., 2000). Codifica el vector retroviral no replicativo basado en MLV que contiene una región de empaquetamiento extendida. El marco de lectura abierto de IFNy de ratón (no. de acceso BC119063) y humano (no. de acceso BC070256) que contiene el sitio de la enzima de restricción Xho I y Not I en cada extremo para dirigir la clonación se sintetiza con optimización de codones (IDT Inc). Los fragmentos sintetizados se clonaron en el núcleo de pBA9b en los sitios correspondientes de enzimas de restricción ("MC"). En el ORF de IFNg de ratón, se introduce posteriormente una etiqueta de His en el extremo C del ORF por PCR. El ADN plasmídico resultante se designó pBA9b-hlFNg y pBA9b-mlFNg. En ambas construcciones, la expresión de IFNg está mediada por el promotor LTR viral (Véase la Figura 16).
Ejemplo 18: las células productoras de virus producen una alta titulación viral y IFNg funcional dependiendo de si la línea productora es de una especie heteróloga o no. Los vectores se produjeron en primer lugar por transfección transitoria en células productoras 293GP. Las células 293GP derivan de las células HEK293 que producen de manera estable gag-pol basado en MLV. Los vectores producidos por transfección transitoria se pseudotiparon con la proteína de la cubierta VSV-G y posteriormente transdujeron células productoras HA-L2 que expresan de manera estable gagpol basado en MLV y proteína de cubierta anfotrópica 4070A. HA-L2 es una línea celular de empaquetamiento humana construida de la misma manera que VPCL HA-LB (Sheridan et al., 2000) los vectores pBA9b-hlFNg y pBA9b-mlFNg generados a partir de células transducidas de manera estable se titularon en células PC-3 de próstata humana usando el método de qPCR (5-MLV-U3-B: 5'-AGCCCACAACCCCTCACTC-3' (SEQ ID NO: 2), 3-MLV-Psi: 5'-TCTCCCGATCCCGGACGA-3' (SEQ ID NO: 3), sonda: FAM-5'-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-3'-BHQ1 (SEQ ID NO: 4)). El resultado mostró que los valores de titulación de pBA9b-hlFNg y pBA9b-mlFN producidos por las células HA-L2 varían sustancialmente (Tabla A). La titulación de pBA9b-hlFNg es al menos 2-log menor que pBA9bmlFNg. Sin embargo, cuando los vectores se producen en una línea celular de perro (DA-T1), la titulación viral de pBA-hlFNg se incrementó y fue comparable a la de pBA9b-mlFNg (Tabla B). DA-T1 es una línea celular de empaquetamiento de perro construida de la misma manera que VPCL DA (Sheridan et al. 2000). El sobrenadante viral también se usó para medir la expresión de IFNg por ELISA (R & D Systems). La Tabla A y B muestran que se produce una cantidad sustancial de mlFNg por las células HAL2 y DA-T1. Las células DA-T1 transducidas con el vector pBA9bhlFNg también produjeron un alto nivel de IFNg. Por el contrario, la baja titulación de pBA9b-hlFNg producida por las células HA-L2 se correlacionó con el bajo nivel de producción de hlFNg. Los datos sugieren que la señalización de IFNg humano interfiere con la producción viral y la producción de hlFNg en células productoras humanas.
Tabla A: titulación viral y expresión de IFNg de células transducidas HA-L2.
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Tabla B: titulación viral y expresión de IFNg de células transducidas DA-T1
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Para verificar la bioactividad de hlFNg recombinante y mIFNg producido a partir de la célula productora de virus, se realizó la regulación al alza de la expresión de MHC Clase I en la superficie celular por citometría de flujo. Se incubaron los sobrenadantes de concentración conocida de IFNg con la línea celular de carcinoma de colon de ratón concordante de especie, CT-26 o la línea celular de fibrosarcoma humana, HT1080. El grado de regulación al alza medido por la intensidad media de fluorescencia (MFI) se comparó con un estándar que es proteína recombinante purificada expresada a partir de E. coli. La Figura 18A muestra que el mIFNg recombinante producido por las células productoras de virus tiene una bioactividad comparable con la del mIFNg recombinante producido por E. coli. De forma similar, el hlFNg recombinante producido por las células productoras de virus también demuestra bioactividad. El hlFNg recombinante producido por las células productoras de virus es 3-5 veces mayor que el producido a partir de E. coli (Figura 2B). La diferencia se debe probablemente a las diferencias en la composición de aminoácidos, así como en el patrón de glicosilación.
Ejemplo 19: generación de una línea celular productora de virus con inactivación de IFNgR1 humano. Las tecnologías desarrolladas recientemente para la edición genómica incluyen el uso de métodos de nucleasas de dedo de cinc (ZNF), nucleasas efectoras semejantes a activador de la transcripción (TALEN) y proteínas asociadas con repeticiones palindrómicas agrupadas interespaciadas regularmente (CRISPR-Cas) para generar cambios permanentes dirigidos en genes de interés (Gaj et al., 2014, Bogdanove & Voytas, 2011; Jinek, et al., 2012; Shalem, et al., 2014; Wang, et al., 2014). En las células eucariotas, las roturas de cadena doble introducidas por ZNF, TALEN y CRISPR-Cas son reparadas por recombinación homóloga, lo que proporciona a los investigadores opciones para una inactivación génica más definida. Usando dichos métodos, puede introducirse la edición genómica incluyendo mutaciones de deleción, insercionales y de única base en una región definida específica de sitio para conseguir la inactivación génica. Entre los 3 métodos, se eligió el método CRISPR-Cas para generar un alelo genético nulo por deleción.
Se diseñan dos únicas secuencias de ARN guías (GeneCopoeia) para inactivar aproximadamente 500 nts en la región del exón 3 de la subunidad de IFNgR1 humano (no. de acceso NG_007394) localizada en el cromosoma 6. La inactivación se complementa por un ADN donante que porta un marcador de selección para la selección positiva. Un conjunto de células modificadas con IFNgR1 que contiene una inactivación de alelo único, doble o múltiples alelos se criba adicionalmente por dilución clonal. Aproximadamente 50 clones se criban para inactivación completa por el método de PCR. Tres clones designados HAL2g1, HAL2g2 y HAL2g3 con inactivación completa de IFNgR1 se eligen y ensayan para determinar su resistencia a IFNg usando el bioensayo descrito anteriormente. Los datos indican ausencia de regulación al alza de MHC Clase I en la superficie celular en comparación con su nivel de expresión basal.
Ejemplo 20: las células productoras de virus con inactivación de IFNgR1 producen una alta titulación viral y hlFNg funcional. El vector pBA9b-hIFNg pseudotipado con VSV-G se produce en primer lugar por transfección transitoria en las células productoras 293GP y posteriormente se transduce en las líneas celulares productoras HA-L2g1, HA-L2g2 y HA-L2g3. Los sobrenadantes recogidos de las células transducidas de manera estable se titulan entonces en células PC-3 de próstata humana usando el método de qPCR para determinar la titulación viral. Los datos muestran que los 3 clones produjeron un nivel similar de titulaciones y el valor de titulación es comparable con o mejor que el producido por las células DA-T1. El nivel de la expresión de hlFNg medido por ELISA también indica una cantidad similar a o mayor que la producida por las células DA-T1.
Ejemplo 21: selección positiva in vitro de células HA-L2g transducidas con pBA9b-hIFNg-yCD2. Pueden usarse varios genes como marcadores seleccionables positivos. Estos incluyen: dihdrofolato reductasa (DHFR, Simonsen et al., Nuc Acid Res., 16: 2235-2246, 1988) con metotrexato conjuntamente con un inhibidor del transporte de nucleótidos tal como dipiridamol (Warlick et al. Biochemical Pharmacology, 59: 141-151, 2000) o nitrobencilmercaptopurina ribósido fosfato (Allay etal., Stem Cells, 16 (supl 1):223-233, 1998); Citosina desaminasa usando N-(fosfonacetil)-L-aspartato (PALA) para bloquear la síntesis de novo de uracilo y bases anabólicamente aguas abajo y citosina para suministrar estas a través de las rutas de recuperación de pirimidina (Wahl et al., J Biol Chem., 254:8679 y Unger et al., Can. Gene Ther. 14:30-38); y varios otros marcadores seleccionables, obvios para los expertos en la técnica. En general, mayores niveles del agente de selección seleccionan una mejor expresión. El vector pBA9b-hIFNg-yCD2 que codifica el marcador seleccionable yCD2 da lugar a la selección de la mejor expresión de yCD2 en presencia de PALA citosina e inosina. Presumiblemente, también puede dar lugar a la coselección de clones que producen una alta titulación viral y un mayor nivel de expresión de hlFNg.
Se determina la concentración de PALA requerida para matar a las células HA-L2g transducidas con el vector pBA9bhIFNg-yCD2. Las células se siembran a 1e3 células en placas de 96 pocillos el día anterior. A las 24 horas posteriores a la siembra de las células, se añade PALA a 1, 10, 50 y 100 pM al cultivo durante 4 días consecutivos seguido del ensayo MTS para determinar la viabilidad celular. Los resultados muestran que las células son sensibles a PALA a 10 pM y alcanzan la meseta a 50 pM. También se determina un rango de concentraciones de citosina (0.2, 1, 510 mM) en cultivo realizando el mismo experimento descrito anteriormente. Los datos indican que las células pueden tolerar la citosina en todas las concentraciones ensayadas.
Para la selección positiva in vitro, se siembra un conjunto de células HA-L2g transducidas con pBA9b-hIFNg a 1e5 células en un matraz T25 en presencia de PALA 50 pM y citosina 10 mM e inosina 4 mM. Una semana después de la selección, se realiza dilución clonal para aislar el clon de célula única para una selección adicional. Se seleccionan entonces veinticinco clones y se expanden para medir su expresión de yCD2 por inmunotransferencia y expresión de IFNg por ELISA, así como la titulación viral. Los datos muestran que varios clones expresan un alto nivel de yCD2, hlFNg y producen una mayor titulación en comparación con las células combinadas.
Ejemplo 22: construcción de los vectores pBA9b-IFNg-yCD2 y los vectores pBA9b-IL2. Los vectores pBA9b-IFNgyCD2 se generan por subclonación del fragmento de ADN de IRES-yCD2 en el núcleo de pBA9b-hIFNg y pBA9bmIFNg. El fragmento de ADN de IRES-yCD2 se amplifica por PCR usando el vector pAC3-yCD2 como el molde y los siguientes cebadores: Sall-IRES-F: 5'-GTACGTCGACTACTGGCCGAAGCCGCTTGGA-3' (SEQ ID NO: 17) y ClaI-yCD2-R: 5'-GTACATCGATTTACTCGCCGATATCCTCGAAC-3' (SEQ ID NO:18). El fragmento de ADN amplificado por PCR se purificó en gel y se digirió con Sal I y Cla I. El fragmento digerido se subclonó entonces en el núcleo de pBA9b-hIFNg y pBA9b-mIFNg en los sitios correspondientes (Figura 19).
De forma similar, se amplifican IL-2 humana (no. de acceso BC066257) e IL-2 de ratón (no. de acceso NM_008366) en el núcleo de pAC3 usando los siguientes cebadores de PCR: el fragmento de ADN de IRES-yCD2 se amplifica por PCR usando el vector pAC3-yCD2 como el molde y los siguientes cebadores: Sall-IRES-F: 5'-GTACGTCGACTACTGGCCGAAGCCGCTTGGA-3' (SEQ ID NO: 17), ClaI-hIL-2-R: 5'-GTACATCGATT CAAGTCAGTGTT GAGATGATG-3' (SEQ ID NO: 19) y ClaI-mIL-2-R: 5'-GTACATCGATTTATTGAGGGCTTGTTGAGATG-3' (SEQ ID NO:20). El fragmento de ADN amplificado por PCR se purificó en gel y se digirió con Sal I y Cla I. El fragmento digerido se subclonó entonces en el núcleo de pBA9b-hIFNg y pBA9b-mIFNg en los sitios correspondientes (Figura 19).
Ejemplo 23: las células productoras de virus producen una titulación relativamente alta, expresión de CD e IL-2 funcional. Los vectores VSV-G pseudotipados se producen en primer lugar por transfección transitoria en células productoras 293GP y posteriormente se transducen células HA-L2. Los vectores pBA9b-hIFNg-yCD2 y pBA9b-mIFNgycD2 generados a partir de células HA-L2 transducidas de manera estable se titulan en células PC-3 de próstata humana usando qPCR. El sobrenadante viral también se usa para medir la cantidad de expresión de IL-2 por ELISA (R & D Systems). El resultado mostró valores de titulación similares a los de pBA9b-hIFNg y pBA9b-mIFNg producidos por células HA-L2g y HA-L2, respectivamente.
Para medir la bioactividad de hIL-2 y mlL-2 recombinantes producidas a partir de las células HA-L2, se realiza un ensayo de proliferación celular usando una línea de células T citotóxicas murinas derivadas de la cepa de ratón C57/B1/6, CTLL-2, que expresa de manera constitutiva receptores de IL-2. El crecimiento de las células CTLL-2 depende en gran medida de la presencia de IL-2. La bioactividad de IL-2 se determina por el nivel de incorporación de 3H-timidina en el ADN de las células proliferantes. Debido a una homología >60 % entre la IL-2 de ratón y humana, la línea celular responde tanto a hIL-2 como a mIL-2 de una manera dependiente de la dosis en el rango de concentración de aproximadamente 50 pg/mL a 50 ng/mL. Los datos muestran que tanto hIL-2 como mIL-2 recombinante producidas por las células HA-L2 tienen una bioactividad comparable con la de hIL-2 y mIL-2 recombinantes producidas por E. coli. Además, el nivel de la expresión de CD de células HA-L2 transducidas con pBA9b-IFNg-yCD2 también se detecta por inmunotransferencia usando un anticuerpo frente a CD.
Ejemplo 24: construcción de vectores pBA9b-IFNg-mi30ARNsh y pBA9b-IFNg-ARNsh. Muchos cánceres expresan o secretan varias moléculas inmunosupresoras, incluyendo HLA G, IDO, FasL, PDL-1 y TGF-p1, 2 y 3, con el fin de escapar de las respuestas inmunes antitumorales (Jackson et al., 2011, Avril et al., 2010). Estas moléculas suprimen la proliferación de las células T, inhiben la activación de las células T y su diferenciación en células efectoras citotóxicas, o desencadenan la apoptosis de las células T. La Figura 20A-C muestra una prueba preliminar del principio para RRV como un vehículo de administración para estos tipos de moléculas in vitro. Aquí, se presenta el diseño de configuraciones multimodales que contienen IFNg y ARNsh dirigidos a PDL-1, IDO y TGF-p en un vector retroviral no replicativo como una inmunoterapia de combinación.
Los vectores pBA9b-IFNg-ARNsh se generan por subclonación del fragmento de ADN en el núcleo de pBA9b-hIFNg y pBA9b-mIFNg en el sitio de la enzima de restricción Not I. Los fragmentos de ADN de U6-ARNsh se amplifican por PCR usando los vectores pAC3-ARNsh como los moldes y los siguientes cebadores universales con sitio de la enzima de restricción Not I al final (Table C).
Tabla C: cebadores universales para la amplificación de los casetes U6-ARNsh y U6-mi30ARNsh.
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Los casetes U6-ARNsh y U6-miR30ARNsh dirigidos a IDO1, PDL-1 y TGF-p murinos se clonan en el núcleo de pBA9bmIFNg. Asimismo, los casetes U6-ARNsh y U6-miR30ARNsh dirigidos a IDO1, PDL-1 y TGF-p humanos se clonan en el núcleo de pBA9b-hIFNg. Se generan vectores con orientación tanto directa como inversa respecto a la LTR en 5' (Figura 21).
Ejemplo 25: las células productoras de virus producen una alta titulación viral e I FNg funcional. Los vectores VSV-G pseudotipados se producen en primer lugar por transfección transitoria en células productoras 293GP y posteriormente se transducen células HA-L2 o HA-L2g. Los vectores pBA9b-mIFNg-ARNsh generados a partir de células HA-L2 o HA-L2g transducidas de manera estable se titulan en células PC-3 de próstata humana usando qPCR. El sobrenadante viral también se usa para medir la cantidad de la expresión de I FNg por ELISA (R & D Systems). El resultado muestra valores de titulación similares a los de pBA9b-hIFNg y pBA9b-mIFNg producidos por las células HA-L2g y HA-L2, respectivamente.
La bioactividad de I FNg humano se realiza como se describe. La bioactividad de ARNsh dirigido a IDO1, PDL-1 y TGF-p2 humanos, se realiza por transducción de la línea celular de glioma humano LN-18, que expresa un alto nivel de IDO1, PDL-1 y TGFb2, a una MOI de 10-20. Una semana después de la transducción, la actividad de inactivación de ARNsh en las células transducidas se confirma evaluando la expresión de proteína de IDO1, PDL-1 y TGF-p2 por inmunotransferencia, citometría de flujo o ELISA.
La bioactividad de I FNg de ratón se realiza como se describe. La bioactividad de ARNsh dirigido a IDO1, PDL-1 y TGF-p2 de ratón, se realiza por transducción de líneas celulares tumorales murinas que expresan un alto nivel de IDO1, PDL-1 y TGF-p2, a una MOI de 10-20. Una semana después de la transducción, la actividad de inactivación de ARNsh en las células transducidas se confirma evaluando la expresión de proteína de IDO1, PDL-1 y TGF-p2 por inmunotransferencia, citometría de flujo o ELISA.
Las Tablas D-H como se muestran en la solicitud provisional (Solicitud de Patente de EE. UU. No. 61/970.823) proporcionan secuencias de ARNi que pueden usarse para promover la estimulación inmune. Las Tablas E-H de la solicitud provisional se incorporan en la presente memoria por referencia y demuestran otras secuencias que pueden insertarse en 3' de un promotor polIII o RSV en un vector de la descripción. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente y usar las secuencias descritas en las Tablas E-H.
Tabla D: secuencias de ARNsi dirigidas a IDO1, PDL1 y TGFb2 de ratón.
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Ejemplo 26: estudios de eficacia antimelanoma con vectores que expresan IFN gamma de ratón en un modelo de melanoma subcutáneo en ratones.
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de un vector retroviral no replicativo (RNV) que porta el gen de IFN gamma de ratón y un gen de citosina desaminasa (CD) de levadura modificado (Perez et al., Mol.Ther., 2012) administrado mediante inyección intratumoral (IT) en ratones DBA/2 que presentan melanoma subcutáneo (Cloudman S91).
Se adquirieron ratones DBA/2 hembra (edad ~8 semanas) en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los ratones se aclimataron durante 7 días después de su llegada antes de iniciar los estudios.
Las células Cloudman S91 (ATCC, Manassas VA) son un melanoma que surge espontáneamente derivadas de ratones DBA/2. Las células se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero fetal bovino al 10 %, piruvato de sodio, y Glutamax (Hyclone, Logan UT, e Invitrogen, San Diego CA). Las células se resuspenden en PBS (Hyclone, Logan UT) para el implante. Las células S91 (1E6 en 100 pL) se inyectan en el flanco derecho de los ratones DBA/2.
Las preparaciones de vectores se hacen por transfección transitoria del plásmido del vector con un plásmido que expresa la cubierta anfotrópica en una línea 293gag pol (Burns et al., PNAS 90:8833-8037, 1993); alternativamente, una línea celular productora (bien clonal o una combinación) basada en una línea celular de empaquetamiento MLV anfotrópica basada en HT1080 humano o la línea celular de empaquetamiento anfotrópica basada en D-17 de perro con titulaciones de aproximadamente 10E6TU/ml o mayores. Para los estudios iniciales, el vector no se purifica ni se concentra adicionalmente. Para los experimentos subsiguientes para determinar las curvas de respuesta a la dosis completa, se prepara un material purificado con alta titulación con una titulación esperada de alrededor de 1-5x 10E8/ml. El vector se administra IT en un volumen de 5-100 pL e IV en 100 pL en partes durante 1 a 7 días, y la dosis total/ratón entre aproximadamente 4x10E4 - 2,5x10E8 TU/ratón.
Las preparaciones de vector retroviral purificado con alta titulación se prepararon a partir de células crecidas en cámaras de cultivo celular Corning® CellSTACK® o equivalente. Las células se crecieron a 37 °C en DMEM con alto contenido en glucosa (Irvine Scientifics, Irvine, CA) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS), y se dejó que se expandieran durante varios días. Los sobrenadantes se recogieron, se aclararon por filtración, se trataron con nucleasas y se purificaron y concentraron adicionalmente por columnas de intercambio iónico y cromatografía en columna de exclusión por tamaño. El vector concentrado se estabilizó y formuló en un tampón de formulación adecuado (p. ej., Tris 20 mM, NaCl 100 mM, 10 mg/mL de sacarosa, y 10 mg/mL de manitol, pH 7,4). Los tampones de formulación también pueden incluir un componente de proteína tal como suero fetal bovino o albúmina de suero humano.
Las titulaciones de las preparaciones de vector usadas en los estudios in vivo fueron 2-5 x 10E8 TU/ml. El vector se almacenó congelado a -80°C y se descongeló rápidamente justo antes de la inyección.
Se implantan subcutáneamente a cinco grupos de DBA/2 hembras (55 ratones, 9-10 semanas de edad) células de melanoma S91 (Día 0) y después se dosificaron (día 4-10) dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor S91; aproximadamente 50-100mm3) con vehículo (Grupos 1), con vector control [vector pBA-9b o pBA-9b-CD], (Grupo 2), intratumoral (IT) (inyección del vector CD-IFN gamma (Grupos 3), o inyección intravenosa del vector CD-IFN gamma (grupo 4). Los grupos 3 y 4 se dividieron adicionalmente en los grupos 3a y 4a que no se trataron con 5- fluorocitosina (5-FC), y los grupos 3b y 4b que sí se trataron.
El vector se inyecta a dosis crecientes desde 10E4 a 5x10E8, tanto cambiando la concentración del vector como incrementando el número de días de la administración. Esto se realiza para los dos grupos IT e IV. Esta estrategia permite la comparación de la eficacia relativa de diferentes estrategias terapéuticas a lo largo de un amplio rango de dosis de vector. En los grupos de 5-FC, la 5-FC se administra IP 2 x/día a 500mg/kg durante 5 días desde el inicio a los 3-10 días después de la administración del vector.
El análisis del crecimiento tumoral se realiza hasta 2.000 mm3 o hasta 60 días sobre la base de lo que se produzca antes. Se representará el tamaño tumoral con el tiempo de 10 ratones de cada grupo. La significancia estadística se determinará usando análisis de varianza (ANOVA). Los valores p <0,05 se consideran estadísticamente significativos en todos los análisis, que se realizan con el software estadístico Prism 5 (Software GraphPad) o equivalente. También se toman observaciones en vivo para evaluar cualquier evento adverso de la expresión de IFN gamma durante el tratamiento.
La administración de IFN gamma por RNV intratumoralmente muestra un retraso estadísticamente significativo del crecimiento en comparación con los controles que también depende de la dosis. La administración de IFN gamma por RNV intravenosamente muestra un retraso estadísticamente significativo del crecimiento en comparación con los controles tratados con vector control que expresa CD solo o vacío, y mitiga la carga de melanoma del modelo de melanoma de ratón DBA/2-Cloudman S91. La administración del vector IFN gamma-CD seguido de la administración de 5-FC muestra una eficacia incrementada en comparación con aquellos grupos tratados con el mismo vector y sin tratamiento con 5-FC.
Ejemplo 27: estudios de eficacia antitumoral con vectores que expresan IFN gamma de ratón en modelos de melanoma y colorrectal en ratón, con tumor subcutáneo y diseminado.
Se adquirieron ratones BALB/c y C57BL/6 hembras de seis a 8 semanas de edad en Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN), se estabularon en jaulas con microaislante autoclavado que contenían un lecho estéril, y se les proporcionó alimento irradiado y agua acidificada ad libitum.
CT26, una línea de carcinoma colorrectal murino de origen BALB/c (Corbett et al., 1915) y B16F10, una línea celular de melanoma murino espontáneo de origen C57BL/6 se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más suero fetal bovino al 10 % suplementado con glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 100 microM, y tampón HEPES 18 mM. Las células se crecen in vitro en condiciones de cultivo tisular estándar, y se mantienen en fase log antes de la inoculación.
Las células tumorales se mantienen en fase log de crecimiento y se recogen con tripsina-EDTA, se lavan, y se resuspenden en disolución salina basal de Hanks inmediatamente antes de la inoculación en los animales. Para la formación de tumores subcutáneos, las células B16F10 se inyectan a 1 x 108 células/ratón en 0,1 ml en la región abdominal ventral de ratones C57BL/6. Las células CT26 se inyectan a 2 x 105 células/ratón en 0,1 ml en la región abdominal ventral de ratones BALB/c. Cuando los tumores crecen hasta volúmenes de 25-40 mm3, los animales se redistribuyen para obtener volúmenes tumorales de partida con un promedio similar en cada grupo de tratamiento de 7-10 ratones. Un único curso de terapia consistió en 50 microL de tampón de formulación, vector control, o vector terapéutico inyectados intratumoralmente una vez al día durante 1-7 días. Los tumores se miden cada 3-4 días y el volumen se calcula según la siguiente ecuación: volumen = longitud x anchura x altura x n16. La significancia estadística entre los grupos de tratamiento se determina usando análisis de varianza (ANOVA).
Para modelar la enfermedad diseminada, los animales se inoculan subcutáneamente concurrentemente con 2 x 105 células tumorales no modificadas (como se ha descrito anteriormente) e intravenosamente con 1x 104 o 1x 105 células por ratón, para sembrar los pulmones. El tamaño de los tumores subcutáneos se monitoriza dos veces a la semana hasta que los volúmenes tumorales en los grupos no tratados o tratados con tampón alcanzan tamaños >1.500 mm3. Los ratones se sacrifican entonces y los pulmones se pesan para determinar la carga tumoral y/o se examinan visualmente para registrar el número de focos de células tumorales. Los valores para los volúmenes tumorales y focos tumorales pulmonares se reportan como promedio SEM a no ser que se indique otra cosa. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se investigan usando ANOVA. La correlación entre el volumen tumoral y el peso de los pulmones se examina usando el ensayo rho de Spearman.
El vector se inyecta a dosis crecientes de 10E4 a 5x10E8, tanto cambiando la concentración del vector como incrementando el número de días de la administración. Esto se realiza para las rutas de administración IT e IV. Esta estrategia permite la comparación de la eficacia relativa de las diferentes estrategias de vector a lo largo de un amplio rango de dosis de vector. Los grupos tratados con 5-FC se tratan con un esquema similar al del ejemplo 26.
La administración de IFN gamma por RNV intratumoralmente muestra un retraso del crecimiento estadísticamente significativo en comparación con los controles que también depende de la dosis. La administración de IFN gamma por RNV intravenosamente muestra un retraso del crecimiento estadísticamente significativo en comparación con los controles tratados con vector control que expresa CD solo o vacío, y mitiga la carga de melanoma del modelo de melanoma de ratón B16 y CT26. La administración de vector IFN gamma-CD seguido de la administración de 5-FC muestra una eficacia incrementada en comparación con aquellos grupos tratados con el mismo vector sin tratamiento con 5-FC, en el tumor SC y también en el modelo de tumor diseminado. El tratamiento con IFN gamma-miRPDL1 mostró una eficacia incrementada en comparación con el vector IFN-gamma solo en los modelos tumorales SC y los modelos tumorales diseminados.
Estos métodos (en los ejemplos 26 y 27) pueden usarse para determinar la potencia relativa de cualquier conjunto de vector viral, con o sin el gen de IFNgamma, y los resultados se pueden extrapolar al uso humano con las secuencias homólogas de especie para IFNgamma, construcciones de ARNsi y semejantes.
Ejemplo 28: dosificación de pacientes con RRV que codifica un ARNsi o un anticuerpo de cadena única que regula a la baja una función inhibidora inmune en una célula o tejido.
Se incluyen pacientes con glioma maligno en estadio 3 o 4 recién diagnosticados y el vector se administra por administración en la cavidad de resección usando el vector en el rango de 106 a 1011 TU, dependiendo del paciente y del valor administrado en el momento de la resección. El estándar de cuidado para GBM en los EE. UU. requiere resección seguida de aproximadamente 6 semanas después con Temozolomida y radiación (Stupp et al., NEJM, 352:987-996, 2005), de manera que 5-FC se administra conjuntamente con el tratamiento de TMZ y o radiación, 4-6 semanas después. Los estudios en ratones han mostrado que los vectores RRV-CD con 5-FC son al menos aditivos con Temozolomida y radiación. Los resultados en pacientes se miden por tasas de respuesta a partir de escaneos MRI, supervivencia sin progresión, supervivencia global u otro marcador aceptado, y muestran una ventaja significativa sobre el estándar de cuidado.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante que comprende:
una proteína retroviral GAG;
una proteína retroviral POL;
una cubierta retroviral;
un polinucleótido retroviral basado en pAC3 que comprende:
secuencias de repetición terminal larga (LTR) en el extremo 3' de la secuencia de polinucleótido retroviral, una secuencia promotora en el extremo 5' del polinucleótido retroviral, siendo dicho promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero,
un dominio de ácido nucleico gag,
un dominio de ácido nucleico pol; y
un dominio de ácido nucleico env;
al menos un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo, en donde el casete se posiciona en 5' de la LTR en 3' y en 3' del dominio de ácido nucleico env que codifica la cubierta retroviral, y en donde el ácido nucleico heterólogo codifica una secuencia de ácido nucleico inhibidora incorporada en miR30ARNsh; y
secuencias que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, empaquetamiento e integración en una célula diana,
en donde la secuencia de ácido nucleico inhibidora regula a la baja un agente inhibidor inmune seleccionado de PD-L1, IDO-1, y TGFp2 y
en donde las secuencias de LTR, la secuencia promotora, el dominio de ácido nucleico gag, el dominio de ácido nucleico pol, el dominio de ácido nucleico env, y las secuencias que actúan en cis son secuencias retrovirales de secuencias de ADN de pAC3 correspondientes presentadas en las SEQ ID NO: 1 y 7-16.
2. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de la reivindicación 1, en donde el vector comprende al menos dos casetes,
en donde un primer casete comprende un promotor polIII unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora; y un segundo casete comprende un mini-promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un anticuerpo de cadena única; o
en donde un primer casete comprende un promotor polIII unido operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico inhibidora; y un segundo casete comprende un mini-promotor unido operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico inhibidora.
3. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de la reivindicación 1, en donde el vector tiene la estructura general de 5' a 3' que comprende una repetición terminal larga (LTR)-secuencia gag-secuencia polsecuencia env-(al menos un casete de expresión)-LTR.
4. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de la reivindicación 3, en donde el dominio de ácido nucleico gag tiene una secuencia retroviral que corresponde a la secuencia desde el número de nucleótido 1203 hasta el nucleótido 2819 de SEQ ID NO: 1 y 7-16; y/o
en donde el dominio pol tiene una secuencia retroviral que corresponde a la secuencia desde el número de nucleótido 2820 hasta el nucleótido 6358 de SEQ ID NO: 1 y 7-16; y/o
en donde el dominio env codifica una proteína env anfotrópica; y/o
en donde el dominio env tiene una secuencia retroviral que corresponde a la secuencia desde el número de nucleótido 6359 hasta el nucleótido 8323 de SEQ ID NO: 1 y 7-16.
5. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de la reivindicación 2,
en donde el al menos un casete comprende un promotor polIII unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora, de manera que se expresa la secuencia de ácido nucleico inhibidora, preferiblemente en donde el promotor polIII comprende un promotor H1 o un promotor U6, más preferiblemente en donde el promotor H1 tiene una secuencia retroviral que corresponde a la secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 7 o 12 desde 8330 a 8553 y comprende secuencias de terminación polIII que tienen secuencias retrovirales que corresponden a las secuencias como se muestra en la SEQ ID NO: 7 o 12 desde 8885 a 8889 y 8925 a 8930; o en donde el promotor U6 tiene una secuencia retroviral que corresponde a la secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 8 o 13 desde 8330-8595 y comprende secuencias de terminación polIII que tienen secuencias retrovirales que corresponden a las secuencias como se muestra en la SEQ ID NO: 7 o 12 desde 8922-8926 y 8962 a 8967.
6. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de la reivindicación 2, en donde el al menos un casete comprende un mini-promotor; preferiblemente
en donde el mini-promotor es un promotor de RSV; más preferiblemente, en donde el promotor de RSV tiene una secuencia retroviral que corresponde a la secuencia desde 8330 hasta aproximadamente 8591 de la SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, o 16.
7. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de la reivindicación 6, en donde el promotor de RSV está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora o a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa; o
en donde el promotor de RSV está unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa seguido de y unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico inhibidora.
8. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde el al menos un casete comprende dos casetes.
9. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de la reivindicación 8, en donde un primer casete comprende un promotor H1 o U6 unido a una secuencia de ácido nucleico inhibidora y el segundo casete comprende un promotor de RSV unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido; opcionalmente, en donde el polipéptido está optimizado para codones humanos.
10. El vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en donde la secuencia de ácido nucleico inhibidora inhibe PDL1.
11. Un vector retroviral gamma competente para la replicación recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1­ 10 para uso en el tratamiento de un cáncer o de un trastorno de la proliferación celular.
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