ES2911448T3 - Vectores combinados y métodos para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Vectores combinados y métodos para el tratamiento del cáncer Download PDF

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Mei-Ling Liou
Lingzhi Xiao
Haishan Li
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Abstract

Un vector vírico que comprende una parte de carga terapéutica, en donde la parte de carga terapéutica comprende una primera secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a al menos una secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde al menos una secuencia de ARNm complementaria comprende una secuencia de ARNm de farnesil difosfato sintasa (FDPS), y en donde la primera secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de FDPS; y una segunda secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a una segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde la segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada comprende una secuencia de ARNm de CD47 o una secuencia de ARNm de cMyc, y en donde la segunda secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de CD47 o cMyc.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores combinados y métodos para el tratamiento del cáncer
Campo
La presente invención se refiere a vectores víricos que comprenden una parte de carga terapéutica que pueden usarse para tratar el cáncer.
Antecedentes
El cáncer es un problema de salud importante para la población mundial. Como ejemplo, el cáncer de hígado en hombres adultos es el quinto cáncer diagnosticado con más frecuencia en todo el mundo y es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en el mundo. Se han empleado numerosas estrategias terapéuticas en un intento por tratar eficazmente el cáncer. Los enfoques terapéuticos tradicionales han girado en torno al uso de quimioterapia y radioterapia.
La quimioterapia se refiere a la administración de uno o más fármacos contra el cáncer y/u otros agentes a un paciente con cáncer mediante varios métodos. En términos generales, la mayoría de los fármacos quimioterapéuticos actúan alterando la mitosis (división celular), y se dirigen eficazmente a las células en división rápida. Sin embargo, también se ven afectadas otras células en división rápida tales como las responsables del crecimiento del cabello y del reemplazo del epitelio (revestimiento) intestinal. Dado que la quimioterapia afecta a la división celular, las células tanto normales como cancerosas son susceptibles a los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos.
La radioterapia se refiere a la exposición de un paciente a radiación de alta energía, incluyendo radiografías, rayos gamma y neutrones. Este tipo de terapia incluye, sin limitación, terapia de haz externo, radioterapia interna, radiación de implante, braquirradioterapia, radioterapia sistémica y radioterapia. La radioterapia de haz externo puede incluir radioterapia conformada tridimensional, radioterapia de intensidad modulada y radioterapia conformada con haz de protones. En la práctica, es difícil proteger el tejido normal cercano de los efectos citotóxicos de la radiación y seguir suministrando una dosis terapéutica. Una complicación adicional de la radiación es la inducción de células resistentes a la radiación durante el ciclo del tratamiento. Por tanto, incluso las mejores técnicas radioterapéuticas a menudo dan como resultado una reducción incompleta del tumor y la recurrencia posterior.
Más recientemente, se han empleado enfoques inmunoterapéuticos en un intento de aprovechar el poder del sistema inmunitario del hospedador para tratar el cáncer. Por ejemplo, se han empleado estrategias para dirigirse a antígenos asociados al cáncer con linfocitos T basadas en el hospedador que reconocen específicamente dichos antígenos. Por ejemplo, un enfoque reciente se ha centrado en el desarrollo y uso de linfocitos T con receptores de antígeno quimérico (CAR, chimeric antigen receptor) (también conocidos como linfocitos T-CAR). Como posibles efectos secundarios asociados a la terapia con linfocitos T-CAR se incluyen síndrome de liberación de quimiocinas, aplasia de linfocitos B y síndrome de lisis tumoral. A pesar del desarrollo de estos enfoques, el cáncer sigue siendo un problema de salud importante.
Sumario
La presente invención es como se expone en las reivindicaciones. En un aspecto de la divulgación, se desvela un vector vírico que comprende una parte de carga terapéutica. La parte de carga terapéutica comprende una primera secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a al menos una secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde al menos una secuencia de ARNm complementaria comprende una secuencia de ARNm de FDPS (siglas del inglés farnesyl diphosphate synthase, farnesil difosfato sintasa) y en donde la primera secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de FDPS; y una segunda secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a una segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde la segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada comprende una secuencia de ARNm de CD47 o una secuencia de ARNm de cMyc, y en donde la segunda secuencia de a Rn pequeño es capaz de inhibir la expresión de CD47 o cMyc. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un primer promotor y la segunda secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un segundo promotor. En algunas realizaciones, la parte de carga terapéutica puede comprender además una tercera secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a una tercera secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde la tercera secuencia de ARNm complementaria predeterminada comprende una secuencia de ARNm de CD47 o una secuencia de ARNm de cMyc, y en donde la tercera secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de CD47 o cMyc. En algunas realizaciones, la al menos una secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un primer promotor, la segunda secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un segundo promotor, y la tercera secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un tercer promotor. En algunas realizaciones, las secuencias de ARN pequeño están bajo el control de un solo promotor. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN pequeño es un microARN (miARN) o un ARN en horquilla corto (ARNhc).
En otro aspecto, la secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 80 %, o de al menos 85 %, o de al menos 90 %, o de al menos 95 % por ciento con una secuencia de ARN pequeño de FDPS que comprende
GTCCTGGAGTACAAATGCCATTCTCGGAAATGGCATTGTACTCCAGGACTTTTT (SEQ ID NO: 1);
GCAGGATTTCGTTCAGCACTTCTCGAGAAGTGCTGAACGAAATCCTGCTTTTT (SEQ ID NO: 2);
GCCATGTACATGGCAGGAATTCTCGAGAATTCCTGCCATGTACATGGCTTTTT (SEQ ID NO: 3); o
GCAGAAGGAGGCTGAGAAAGTCTCGAGACTTTCTCAGCCTCCTTCTGCTTTTT (SEQ ID NO: 4). En algunas realizaciones, la secuencia de ARN pequeño se selecciona de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
En otro aspecto, la segunda secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80 %, o de al menos 85 %, o de al menos 90 %, o de al menos 95 % con una secuencia de ARN pequeño de CD47 que comprende
GGTGAAACGATCATCGAGCCTCGAGGCTCGATGATCGTTTCACCTTTTT (SEQ ID NO: 5);
GCTACTGGCCTTGGTTTAACTCGAGTTAAACCAAGGCCAGTAGCTTTTT (SEQ ID NO: 6);
CCTCCTTCGTCATTGCCATCTCGAGATGGCAATGACGAAGGAGGTTTTT (SEQ ID NO: 7);
GCATGGCCCTCTTCTGATTCTCGAGAATCAGAAGAGGGCCATGCTTTTT (SEQ ID NO: 8); o
GGTGAAACGATCATCGAGCTACTCGAGTAGCTCGATGATCGTTTCACCTTTTT (SEQ ID NO: 9)
o una secuencia de ARN pequeño de cMyc que comprende
GCTTCACCAACAGGAACTATGCTCGAGCATAGTTCCTGTTGGTGAAGCTTTT (SEQ ID NO: 10);
GCGAACACACAACGTCTTGGACTCGAGTCCAAGACGTTGTGTGTTCGCTTTT (SEQ ID NO: 11);
GACATGGTGAACCAGAGTTTCCTCGAGGAAACTCTGGTTCACCATGTCTTTTT (SEQ ID NO: 12);
GAGAATGTCAAGAGGCGAACACTCGAGTGTTCGCCTCTTGACATTCTCTTTTT (SEQ ID NO: 13); o
GCTCATTTCTGAAGAGGACTTCTCGAGAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTT (SEQ ID NO: 14). En algunas realizaciones, la segunda secuencia de ARN pequeño se selecciona de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14.
En otro aspecto, la tercera secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80 %, o de al menos 85 %, o de al menos 90 %, o de al menos 95 % con una secuencia de ARN pequeño de CD47 que comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 o 9 o una secuencia de ARN pequeño de cMyc que comprende las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13 o 14. En algunas realizaciones, la tercera secuencia de ARN pequeño se selecciona de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14.
En otro aspecto, el vector vírico es un vector lentivírico. En otro aspecto, se desvela una partícula lentivírica capaz de infectar una célula diana. La partícula lentivírica incluye una proteína de envoltura optimizada para infectar la célula diana y el vector vírico como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula tumoral.
En otro aspecto, se desvela una composición que comprende la partícula lentivírica como se describe en el presente documento, y un fármaco de aminobisfosfonato. En algunas realizaciones, el fármaco de aminobisfosfonato es ácido zoledrónico.
En otro aspecto, se desvela la composición, como se detalla en el presente documento, para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto. El método puede comprender, administrar al sujeto, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición como se detalla en el presente documento.
También se describe un método de prevención del cáncer en un sujeto. El método descrito comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula lentivírica, como se detalla en el presente documento, y una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco de aminobisfosfonato. En el método descrito, las etapas anteriores se llevan a cabo simultáneamente. En el método descrito, entre las etapas anteriores transcurre un período de tiempo definido. En el método descrito, el fármaco de aminobisfosfonato es ácido zoledrónico. En el método descrito, la cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula lentivírica comprende una pluralidad de dosis únicas de dicha partícula. En el método descrito, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco de aminobisfosfonato comprende una sola dosis del fármaco de aminobisfosfonato.
Otros aspectos y ventajas de las invenciones descritas en el presente documento resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, tomada junto con los dibujos adjuntos, que ilustran como ejemplo los aspectos de las invenciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa un sistema lentivírico ilustrativo de 3 vectores circularizados.
La figura 2 representa un sistema lentivírico ilustrativo de 4 vectores circularizados.
La figura 3 representa, (A ) un mapa lineal de un vector lentivírico que codifica una secuencia dirigida a ARNhc de FDPS; (B) un mapa lineal de un vector lentivírico que codifica un microARN (miARN) sintético con una secuencia dirigida a FDPS; y (C) un mapa lineal de un vector combinado lentivírico que codifica un microARN (miARN) sintético con secuencias diana dirigidas a la expresión de cMyc, FDPS y CD47.
La figura 4 representa, (A ) niveles de expresión relativos de ARNm de FDPS humano en respuesta a varias construcciones de ARNhc, como se describe en el presente documento; y (B) que la interferencia de ARN basada en miR, suministrada por un vector lentivírico, inhibe la expresión de FDPs .
La figura 5 representa niveles de expresión de citocinas en linfocitos T gamma delta de sangre periférica humana después de la exposición a (A ) células THP1 o (B) HepG2 que se han transducido con lentivirus para suprimir la FDPS.
La figura 6 representa el porcentaje de lisis específica de la línea celular tumoral THP-1 que se modificó mediante transducción lentivírica para suprimir la FDPS mezclada después con linfocitos T gamma delta humanos normales sometidos una variedad de condiciones experimentales como se describe en el presente documento.
La figura 7 representa: (A ) niveles de expresión relativos de ARNm de CD47 humano en respuesta a varias construcciones de ARNhc, como se describe en el presente documento; (B) que la interferencia de ARN basada en miR, suministrada por un vector lentivírico, inhibe la expresión de CD47.
La figura 8 representa: (A ) niveles de expresión relativos de cMyc humano en respuesta a varias construcciones de ARNhc, como se describe el presente este documento y (B) que la interferencia de ARN basada en miR, suministrada por un vector lentivírico, inhibe la expresión de cMyc.
La figura 9 representa un mapa lineal de un vector lentivírico que codifica una secuencia dirigida a ARNhc de FDPS como se usa en el Ejemplo 6 del presente documento.
La figura 10 representa el efecto del tratamiento con ácido zoledrónico de ratones NOD/SCID a los que se les implantó células PC3 transducidas con LV-FDPShc o LV de control como se describe en el presente documento. (A ) representa datos fotográficos del día 8; (B) representa datos de intensidad fotónica del día 8; (C) representa datos fotográficos del día 22; y (D) representa datos de intensidad fotónica del día 22.
Descripción detallada
Visión general de la divulgación
La presente divulgación se refiere a vectores terapéuticos y al suministro de los mismos a las células. Los vectores terapéuticos se dirigen a más de un ARNm diana. Los vectores terapéuticos están provistos de ARN pequeños, incluidos los ARN de homología cortos (ANRhc) o los microARN (miARN) que se dirigen a FDPS, reduciendo así los niveles de expresión de esta enzima. Los vectores terapéuticos incluyen vectores lentivíricos. La presente divulgación demuestra que el direccionamiento a la FDPS, junto con el tratamiento con un fármaco de aminobifosfonato, puede tratar eficazmente el cáncer.
Definiciones e interpretación
A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación, tendrán los significados habitualmente entendidos por los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto exija lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. En general, la nomenclatura utilizada en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y de ácidos nucleicos e hibridación que se describen en el presente documento, son las de sobra conocidas y habitualmente utilizadas en la técnica. A menos que se indique lo contrario, los métodos y las técnicas de la presente divulgación se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales de sobra conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo: Sambrook J. y Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Todas las reacciones enzimáticas o las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realizan habitualmente en la técnica o como se describe en el presente documento. La nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento, son las de sobra conocidas y habitualmente utilizadas en la técnica.
Como se usa en la descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la", se utilizan indistintamente y pretenden incluir también las formas en plural e incluirse en cada significado, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, como se usa en el presente documento, "y/o" se refiere a, e incluye, todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o más de los puntos enumerados, así como la ausencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
Todas las designaciones numéricas, p. ej., pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, incluyendo los intervalos, son aproximaciones que varían (+) o (-) en incrementos de 0,1. Debe entenderse, aunque no siempre se indique explícitamente, que todas las designaciones numéricas están precedidas por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" también incluye el valor exacto "X" además de incrementos minoritarios de "X", tales como "X 0,1" o "X - 0,1". También hay que entender, aunque no siempre se indique explícitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son simplemente ilustrativos y que en la técnica se conocen sus equivalentes.
Como se usa en el presente documento, una persona normalmente versada en la materia entenderá el término "aproximadamente" y este variará hasta cierto punto dependiendo del contexto en el que se utilice. Si hay usos del término que no estén claros para una persona normalmente versada en la materia, dado el contexto en el que se utilice, "aproximadamente" significará hasta más o menos un 10 % del término particular.
Debe entenderse que los términos "administración de" o "administrar" un agente activo, significan proporcionar un agente activo al sujeto que necesita tratamiento en una forma que pueda introducirse en el organismo de ese individuo en una forma terapéuticamente útil y en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Como se usa en el presente documento, la expresión "vector combinado" significa un vector terapéutico que se dirige a más de un ARNm. Por ejemplo, un vector terapéutico que contenga dos ARNhc o dos miARN dirigidos hacia dos ARNm diferentes, puede denominarse "vector combinado".
Como se usa en el presente documento, la expresión "que comprende" pretende significar que las composiciones y los métodos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente en" cuando se usa para definir las composiciones y los métodos, significará excluir de la composición o métodos otros elementos de cualquier significado esencial. "Que consistente en" significará la exclusión de más que oligoelementos de otros ingredientes para las composiciones reivindicadas y las etapas sustanciales del método. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta divulgación. Por consiguiente, se pretende que los métodos y las composiciones puedan incluir etapas y componentes adicionales (que comprendan) o, como alternativa, que incluyan etapas y composiciones poco significativos (que consistan esencialmente en) o como alternativa, que incluyan únicamente las etapas o composiciones del método indicados (que consistan en).
Como se usa en el presente documento, "expresión", "expresado", o "codifica", se refiere al proceso mediante el cual los polinucleótidos se transcriben en ARNm y/o el proceso mediante el cual el ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. La expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota u otras formas de modificación postranscripcional o modificación postraduccional.
En el presente documento, la expresión "farnesil difosfato sintasa" también puede indicarse como FDPS, y también puede indicarse como farnesil pirofosfato sintasa o FPPS.
En el presente documento, la expresión "linfocito T gamma delta" también puede indicarse como linfocito T y§, o además como linfocito T GD. La expresión "activación de linfocitos T gamma delta" se refiere a cualquier fenómeno biológico medible asociado a un linfocito T gamma delta que sea representativo de dicho linfocito T que se esté activando. Los ejemplos no limitantes de dicho fenómeno biológico incluyen un aumento de la producción de citocinas, cambios en la composición cualitativa o cuantitativa de las proteínas de la superficie celular, un aumento en la proliferación de linfocitos T y/o un aumento en la función efectora de los linfocitos T, como destruir una célula diana o ayudar a otra célula efectora a destruir una célula diana. Una célula diana puede ser una célula cancerosa.
Los términos "individuo", "sujeto", y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero individual, p. ej., bovino, canino, felino, equino o humano.
El término "LV" se refiere generalmente a "lentivirus". Como ejemplo, la referencia a "LV-FDPShc" es una referencia a un lentivirus que expresa un ARNhc que se dirige a la FDPS.
El término "miARN" se refiere a un microARN, y en el presente documento también puede indicarse como "miR".
La expresión "línea celular de empaquetamiento" se refiere a cualquier línea celular que pueda usarse para expresar una partícula lentivírica.
La expresión "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje específico de nucleótidos o de restos de aminoácidos que son iguales (por ejemplo, cuando se comparan y alinean para obtener una correspondencia máxima, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias que se describe a continuación (por ejemplo, BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para los expertos) o mediante inspección visual. Dependiendo de la aplicación, el "porcentaje de identidad" puede existir sobre una región de la secuencia a comparar, p. ej., sobre un dominio funcional, o, como alternativa, puede existir sobre la longitud completa de las dos secuencias a comparar. Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia de la secuencia o secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados.
Para la comparación, la alineación óptima de las secuencias puede realizarse, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete del programa informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (véase, en líneas generales, más adelante, Ausubel et al.).
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del sitio web National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional de Información Biotecnológica).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP del paquete del programa informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. También puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de ponderación de restos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete del programa informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las secuencias de ácido nucleicos y de proteínas de la presente divulgación pueden usarse además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Con el programa NBLAST, pueden realizarse búsquedas BLAs T de nucleótidos, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la divulgación. Con el programa XBLAST, pueden realizarse búsquedas BLAST de proteínas, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las de una molécula proteica de la divulgación. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.
25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Como se usa en el presente documento, "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que, dentro del alcance del buen criterio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos, los órganos y/o los líquidos corporales de seres humanos y animales, sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones en línea con una relación entre beneficio/riesgo razonable.
Como se usa en el presente documento, un "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a, e incluye, todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Las composiciones pueden incluir una sal farmacéuticamente aceptable, p. ej., una sal de adición de ácido o una sal de adición de base (véase, p. ej., Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66:1-19).
Como se usa en el presente documento, la expresión "SEQ ID NO" es sinónima de "Secuencia ID No".
Como se usa en el presente documento, "ARN pequeño" se refiere a ARN no codificante que generalmente tiene una longitud de aproximadamente 200 nucleótidos o menor y posee una función de silenciamiento o de interferencia. En otras realizaciones, el ARN pequeño tiene una longitud de aproximadamente 175 nucleótidos o menor, de aproximadamente 150 nucleótidos o menor, de aproximadamente 125 nucleótidos o menor, de aproximadamente 100 nucleótidos o menor, o de aproximadamente 75 nucleótidos o menor. Dichos ARN incluyen microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc) y ARN en horquilla corto (ARNhc). El "ARN pequeño" de la divulgación debe ser capaz de inhibir o atenuar la expresión génica de un gen diana, generalmente a través de vías que dan como resultado la destrucción del ARNm del gen diana.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente de los agentes activos de la presente divulgación, en una composición adecuada y en una forma farmacéutica adecuada para tratar o prevenir los síntomas, el avance o la aparición de las complicaciones observadas en pacientes que padecen una determinada dolencia, lesión, enfermedad o afección. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del estado de la afección del paciente o de su gravedad, y de la edad, el peso, etc., del sujeto que se va a tratar. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar, dependiendo de cualquiera de diversos factores, incluyendo, p. ej., la vía de administración, la afección del sujeto, así como de otros factores entendidos por los expertos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, la expresión "vector terapéutico" incluye, sin limitación, referencia a un vector lentivírico o un vector vírico adenoasociado (AAV). Adicionalmente, como se usa en el presente documento con referencia al sistema de vector lentivírico, el término "vector" es sinónimo del término "plásmido". Por ejemplo, los sistemas de 3 y 4 vectores, que incluyen los sistemas de empaquetamiento de 2 y 3 vectores, también pueden denominarse sistemas de 3 y 4 plásmidos.
"Un tratamiento" pretende dirigirse al cuadro clínico y combatirlo, es decir, mejorar o impedir el cuadro clínico. Por lo tanto, el tratamiento particular dependerá del cuadro clínico al que se dirige y del estado actual o futuro de las terapias médicas y enfoques terapéuticos. Un tratamiento puede tener toxicidades asociadas.
El término "tratamiento" o "tratar" se refiere a una intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del sujeto que se esté tratando y puede realizarse para profilaxis o durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables incluyen, pero sin limitación, prevenir la aparición o recidiva de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la supresión, disminución o inhibición de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, mejorar o paliar el cuadro clínico y causar remisión o mejorar el pronóstico.
Descripción de aspectos y realizaciones de la divulgación
En un aspecto de la divulgación, se desvela un vector vírico que comprende una parte de carga terapéutica. La parte de carga terapéutica comprende una primera secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a al menos una secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde al menos una secuencia de ARNm complementaria comprende una secuencia de ARNm de FDPS (siglas del inglés farnesyl diphosphate synthase, farnesil difosfato sintasa) y en donde la primera secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de FDPS; y una segunda secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a una segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde la segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada comprende una secuencia de ARNm de CD47 o una secuencia de ARNm de cMyc, y en donde la segunda secuencia de a Rn pequeño es capaz de inhibir la expresión de CD47 o cMyc. En algunas realizaciones, la parte de carga terapéutica puede comprender además una tercera secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a una tercera secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde la tercera secuencia de ARNm complementaria predeterminada comprende una secuencia de ARNm de CD47 o una secuencia de ARNm de cMyc, en donde la tercera secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de CD47 o de cMyc. La secuencia de ARN pequeño puede ser un microARN (miARN) o un ARN en horquilla corto (ARNhc).
En otro aspecto, la secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80 %, o de al menos 81 %, o de al menos 82 %, o de al menos 83 %, o de al menos 84 %, o de al menos 85 %, o de al menos 86 %, o de al menos 87 %, o de al menos 88 %, o de al menos 89 %, o de al menos 90 %, o de al menos 91 %, o de al menos 92 %, o de al menos 93 %, o de al menos 94 %, o de al menos 95 % o mayor con una secuencia de ARN pequeño de FDPS que comprende las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN pequeño se selecciona de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
En otro aspecto, la segunda secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 80 %, o de al menos 81 %, o de al menos 82 %, o de al menos 83 %, o de al menos 84 %, o de al menos 85 %, o de al menos 86 %, o de al menos 87 %, o de al menos 88 %, o de al menos 89 %, o de al menos 90 %, o de al menos 91 %, o de al menos 92 %, o de al menos 93 %, o de al menos 94 %, o de al menos 95 % o mayor con una secuencia de ARN pequeño de CD47 que comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 o 9 o una secuencia de a Rn pequeño de cMyc que comprende las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13 o 14. En algunas realizaciones, la segunda secuencia de ARN pequeño se selecciona de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14.
En otro aspecto, la tercera secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 80 %, o de al menos 81 %, o de al menos 82 %, o de al menos 83 %, o de al menos 84 %, o de al menos 85 %, o de al menos 86 %, o de al menos 87 %, o de al menos 88 %, o de al menos 89 %, o de al menos 90 %, o de al menos 91 %, o de al menos 92 %, o de al menos 93 %, o de al menos 94 %, o de al menos 95 % o mayor con una secuencia de ARN pequeño de CD47 que comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 o 9 o una secuencia de ARN pequeño de cMyc que comprende las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13 o 14. En algunas realizaciones, la tercera secuencia de ARN pequeño se selecciona de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14.
En otro aspecto, las secuencias de ARN pequeño a las que se hace referencia en el presente documento, pueden comprender una secuencia que tenga una identidad de al menos 80 %, o de al menos 81 %, o de al menos 82 %, o de al menos 83 %, o de al menos 84 %, o de al menos 85 %, o de al menos 86 %, o de al menos 87 %, o de al menos 88 %, o de al menos 89 %, o de al menos 90 %, o al de menos 91 %, o de al menos 92 %, o de al menos 93 %, o de al menos 94 %, o de al menos 95 % o mayor, con cualquiera de las secuencias de miARN detalladas en el presente documento, incluyendo: la secuencia de miR30 de FDPS secuencia n.° 1 (SEQ ID NO: 53), la secuencia de miR30 de FDPS n.° 2 (SEQ ID NO: 54), la secuencia de miR30 de FDPS n.° 3 (s Eq ID NO: 55), la secuencia de miR155 de FDPS n.° 1 (SEQ ID NO: 56), la secuencia de miR21 de FDPS n.° 1 (SEQ ID NO: 57), la secuencia de miR185 FDPS n.° 1 (SEQ ID NO: 58), la secuencia de miR155 de CD47 n.° 1 (SEQ ID NO: 82; la secuencia diana de miR155 de CD47 n.° 2 (SEQ ID NO: 66), la secuencia diana de miR155 de Cd 47 n.° 3 (SEQ ID NO: 67), la secuencia diana de miR155 de CD47 n.° 4 (SEQ ID NO: 68), la secuencia de miR21 de cMyc (SEQ ID NO: 83); o la secuencia de miR155 de cMyc (SEQ ID NO: 70).
En algunas realizaciones, las secuencias de ARN pequeño pueden comprender cualquiera de las secuencias de miARN detalladas en el presente documento, incluyendo: la secuencia de miR30 de FDPS secuencia n.° 1 (SEQ ID NO: 53), la secuencia de miR30 de FDPS n.° 2 (SEQ ID NO: 54), la secuencia de miR30 de FDPS n.° 3 (Se Q ID NO: 55), la secuencia de miR155 de FDPS n.° 1 (SEQ ID NO: 56), la secuencia de miR21 de FDPS n.° 1 (Se Q ID NO: 57), la secuencia de miR185 FDPS n.° 1 (SEQ ID NO: 58), la secuencia de miR155 de CD47 n.° 1 (s Eq ID NO: 82; la secuencia diana de miR155 de CD47 n.° 2 (SEQ ID NO: 66), la secuencia diana de miR155 de Cd 47 n.° 3 (SEQ ID NO: 67), la secuencia diana de miR155 de CD47 n.° 4 (SEQ ID NO: 68), la secuencia de miR21 de cMyc (Se Q ID NO: 83); o la secuencia de miR155 de cMyc (SEQ ID NO: 7o).
En otro aspecto, el vector vírico es un vector lentivírico. En otro aspecto de la divulgación, se desvela una partícula lentivírica capaz de infectar una célula diana. La partícula lentivírica incluye una proteína de envoltura optimizada para infectar la célula diana; y el vector vírico como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula tumoral.
En otro aspecto, se desvela una composición que comprende la partícula lentivírica como se describe en el presente documento, y un fármaco de aminobisfosfonato. En algunas realizaciones, el fármaco de aminobisfosfonato es ácido zoledrónico.
En otro aspecto de la divulgación, se desvela la composición, como se detalla en el presente documento, para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto. El método puede comprender, administrar al sujeto, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición como se detalla en el presente documento.
También se describe un método de tratamiento del cáncer en un sujeto. El método descrito comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula lentivírica como se detalla en el presente documento; y una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco de aminobisfosfonato. En el método descrito, las etapas anteriores se llevan a cabo simultáneamente. En el método descrito, entre las etapas anteriores transcurre un período de tiempo definido. En el método descrito, el fármaco de aminobisfosfonato es ácido zoledrónico. En el método descrito, la cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula lentivírica comprende una pluralidad de dosis únicas de dicha partícula. En el método descrito, la cantidad terapéuticamente eficaz de los fármacos de aminobisfosfonato comprende una sola dosis del fármaco de aminobisfosfonato.
También de describe el desarrollo de vectores dirigidos a múltiples genes para el tratamiento del cáncer y, como ejemplo no limitativo, para el tratamiento del carcinoma hepatocelular ("CHC"). Estos vectores abordan tres aspectos con respecto a la terapia del CHC. En primer lugar, los vectores terapéuticos pueden incluir construcciones de ARN inhibidor para reducir la expresión de la proteína del oncogén cMyc. La proteína del oncogén cMyc es responsable de la tumorigénesis, el crecimiento tumoral y la evasión inmunitaria. El vector terapéutico puede incluir más de una construcción de ARN inhibidor para reducir la expresión de cMyc. Por ejemplo, los vectores combinados se contemplan específicamente cuando cMyc es una diana del vector. En segundo lugar, se han desarrollado vectores (p. ej., a través de construcciones de ARN inhibidor) para reducir la expresión de la farnesil difosfato sintasa ("FDPS"). Al reducir los niveles de FDPS, las células tumorales se modifican, por ejemplo, para convertirse en células estimuladoras de linfocitos T gamma delta. Estos linfocitos T gamma delta son capaces de destruir la citotoxicidad de las células tumorales. En tercer lugar, se han desarrollado vectores para reducir la expresión (p. ej., a través de construcciones de ARN inhibidor) de al menos otro producto génico. El al menos otro producto génico puede ser un regulador del punto de control inmunitario. Los ejemplos de reguladores del punto de control inmunitario incluyen, pero sin limitación, el ligando 1 de muerte programada (PD-L1), la lectina 9 soluble de unión a galactosidasa (LGAl s 9a ), el miembro 14 (HVEM) de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, el inhibidor 1 de activación de linfocitos T que contiene dominio el V-set (B7-H4), la molécula CD276 (B7-H3, la molécula CD80 (CD28LG1) y la molécula CD86 (CD28LG2). En algunas realizaciones, el regulador del punto de control inmunitario es PD-L1. Al reducir la expresión cMyc, los niveles de PD-L1 disminuyen consiguientemente porque cMyc es un regulador positivo de la expresión de PD-L1 y otros genes de evasión inmunitaria, incluido CD47, que se expresan en las células tumorales. Al disminuir los niveles de CD47, la fagocitosis de las células tumorales aumenta, lo que conduce a mejorar las respuestas de los linfocitos T a través de la presentación cruzada de antígenos tumorales en las células presentadoras de antígenos. Al disminuir PD-L1 y posiblemente otras moléculas inhibidoras del punto de control inmunitario, la eficacia de la estimulación inmunitaria de los linfocitos T, incluyendo la estimulación de los linfocitos T gamma delta, puede mejorarse. Aunque cMyc regula los niveles de PD-L1, PD-L1 u otros reguladores de puntos de control inmunitario pueden dirigirse directamente utilizando los vectores terapéuticos descritos en el presente documento, generando los ARNhc o los miARN que se dirigen específicamente a PD-L1 o a los otros reguladores de puntos de control inmunitario seleccionados.
El al menos otro producto génico puede ser un producto génico que influya en la fagocitosis. Por ejemplo, el al menos otro producto génico que influye en la fagocitosis puede ser c D47. Al reducir la expresión de CD47, se elimina el bloqueo de la fagocitosis de macrófagos de las células tumorales. Estos dos mecanismos se combinan para aumentar la eficacia y la actividad de la inmunidad adquirida o innata necesaria para tratar o eliminar el CHC.
Los vectores combinados desvelados en el presente documento están optimizados de manera que se ha seleccionado el promotor correcto para que coincida mejor con los requisitos del sistema de procesamiento de ARN. Adicionalmente, la parte de carga terapéutica se ha diseñado de manera que el miARN o los miARN estén en un grupo de modo que el procesamiento del primer miARN facilite el procesamiento del segundo miARN y así sucesivamente. El orden de los miARN puede ser importante para mejorar la fidelidad del procesamiento y las tasas asociadas, de manera que se garantice que el procesamiento no sea tan rápido como para que se procese el ARN genómico para el empaquetamiento en partículas lentivíricas, disminuyendo así la eficacia de la fabricación de lentivirus. Adicionalmente, los vectores combinados pueden diseñarse de modo que la parte de carga terapéutica incluya múltiples ARNhc bajo el control de distintos promotores.
Cáncer
Las composiciones proporcionadas en el presente documento se usan para tratar el cáncer. Una célula, tejido o diana puede ser una célula cancerosa, un tejido canceroso, albergar tejido canceroso, o ser un sujeto o paciente diagnosticado o en riesgo de desarrollar una enfermedad o afección. En determinados aspectos, una célula puede ser una célula epitelial, endotelial, mesotelial, glial, estromal o mucosa. La población de células cancerosas puede incluir, pero sin limitación, una célula cerebral, neuronal, sanguínea, endometrial, meníngea, esofágica, pulmonar, cardiovascular, hepática, linfoidea, mamaria, ósea, del tejido conectivo, de grasa, retiniana, tiroidea, glandular, suprarrenal, pancreática, estomacal, intestinal, renal, vesical, colónica, prostática, uterina, ovárica, útero cervical, testicular, esplénica, dérmica, de la musculatura lisa, del músculo cardíaco o una célula muscular estriada. En otro aspecto más, el cáncer incluye, pero sin limitación, astrocitoma, leucemia mieloide aguda, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia linfoblástica aguda, angiosarcoma, linfoma de linfocitos B, linfoma de Burkitt, carcinoma de mama, carcinoma de vejiga, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma cervicouterino, leucemia linfoblástica crónica, leucemia mieloide crónica, carcinoma colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma epidermoide esofágico, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, glioma, glioblastoma, gastrinoma, carcinoma gástrico, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, sarcoma de Kaposi, linfoma de Hodgkin, carcinoma de células escamosas de laringe, carcinoma de laringe, leucemia, leiomiosarcoma, lipoma, liposarcoma, melanoma, linfoma de células del manto, meduloblastoma, mesotelioma, mixofibrosarcoma, leucemia mieloide, linfoma de linfocitos B de tejido linfoide asociado a mucosas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico de alto riesgo, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, neurofibroma, linfoma no hodkiniano de alto grado, linfoma no hodkiniano, carcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar no microcítico, carcinoma de ovario, carcinoma de esófago, osteosarcoma, carcinoma pancreático, feocromocitoma, carcinoma de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, tumor de glándulas salivales, schwannoma, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, tumor testicular, carcinoma de tiroides, carcinoma urotelial y tumor de Wilm.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento también se usan para tratar CPNM (cáncer de pulmón no microcítico), neoplasias malignas pediátricas, tumores cervicouterinos y otros tumores causados o promovidos por el virus del papiloma humano (HPV), melanoma, esófago de Barrett (síndrome premaligno), cánceres suprarrenales y de piel y autoinmunitarios, enfermedades cutáneas neoplásicas.
Vectores terapéuticos
Los vectores terapéuticos pueden suministrarse a través de vectores de transfección y/o transducción conocidos, incluyendo, pero sin limitación, vectores lentivíricos, virus adenoasociados, poxvirus, vectores de herpesvirus, complejos proteicos y/o lipídicos, liposomas, micelas y similares.
Los vectores víricos pueden dirigirse preferentemente a tipos de células que son útiles para los métodos desvelados (es decir, células tumorales o células mieloides). Los vectores víricos pueden usarse para transducir genes en células diana debido a interacciones específicas entre la envoltura del virus y receptores de la célula hospedadora y a mecanismos víricos para la expresión génica. Como resultado, los vectores víricos se han utilizado como vehículos para la transferencia de genes a muchos tipos de células diferentes, incluidos embriones completos, huevos fertilizados, muestras de tejido aisladas, dianas tisulares in situ, y líneas celulares cultivadas. La capacidad de introducir y expresar genes extraños en una célula es útil para el estudio de la expresión génica y para esclarecer linajes celulares, además de proporcionar la posibilidad de realizar intervenciones terapéuticas tales como terapia génica, reprogramación de células somáticas de células madre pluripotentes inducidas y varios tipos de inmunoterapia. En los vectores desvelados pueden usarse componentes víricos de virus como Papovaviridae (p. ej., virus del papiloma bovino o BPV) o Herpesviridae (p. ej., virus de Epstein Barr o EBV) o Hepadnaviridae (p. ej., virus de la hepatitis B o HBV) o vectores de la viruela, incluyendo la variolovacuna.
Los vectores lentivíricos son un tipo de vector preferido para las composiciones y los métodos desvelados, aunque la divulgación no se limita específicamente a los vectores lentivíricos. Lentivirus es un género de virus que puede suministrar una cantidad significativa de ácido nucleico vírico en una célula hospedadora. Los lentivirus se caracterizan por tener una capacidad única para infectar/transducir células que no se dividen y, después de la transducción, los lentivirus integran su ácido nucleico en los cromosomas de la célula hospedadora.
Los lentivirus infecciosos tienen tres genes principales que codifican las proteínas de virulencia gag, pol y env, y dos genes reguladores que incluyen tat y rev. Según el serotipo y el virus específicos, puede haber genes accesorios adicionales que codifiquen proteínas implicadas en la regulación, síntesis y/o procesamiento de ácidos nucleicos víricos y otras funciones replicativas.
Por otro lado, los lentivirus contienen regiones de repetición terminal larga (LTR), que puede tener una longitud de aproximadamente 600 nt. Las LTR se pueden segmentar en regiones U3, R y U5. Las LTR pueden mediar en la integración del ADN retrovírico en el cromosoma hospedador a través de la acción de la integrasa. Como alternativa, sin integrasa funcional, las LTR pueden usarse para circularizar el ácido nucleico vírico.
Las proteínas víricas implicadas en las primeras fases de la replicación de lentivirus incluyen la transcriptasa inversa y la integrasa. La transcriptasa inversa es ARN polimerasa dependiente de ARN codificada viralmente. La enzima utiliza como molde el genoma de ARN vírico para la síntesis de una copia de ADN complementario. La transcriptasa inversa también tiene actividad RNasaH (ribonucleasa H) para la destrucción del molde de ARN. La integrasa se une tanto a ADNc vírico generado por la transcriptasa inversa como a ADN del hospedador. La integrasa procesa la LTR antes de insertar el genoma vírico en el ADN del hospedador. Tat actúa como un transactivador durante la transcripción para potenciar la iniciación y elongación. El elemento de respuesta rev actúa postranscripcionalmente, regulando el corte y empalme del ARNm y el transporte al citoplasma.
Los vectores víricos, en general, comprenden glucoproteínas y las diversas glucoproteínas pueden proporcionar afinidades específicas. Por ejemplo, los péptidos VSVG pueden aumentar la transfección en células mieloides. Como alternativa, los vectores víricos también pueden tener fracciones de direccionamiento, tales como anticuerpos, unidos a sus péptidos armazón. Los anticuerpos dirigidos pueden ser específicos de antígenos que se sobreexpresan en un tumor, por ejemplo, como HER-2, PSA, CEA, M2-PK y CA19-9. En la técnica también se conocen otras especificidades de vectores víricos y pueden usarse para dirigirse a poblaciones particulares de células. Por ejemplo, los vectores de poxvirus se dirigen a macrófagos y células dendríticas.
Con respecto a los vectores terapéuticos detallados en el presente documento, en aspectos de la presente divulgación, un miARN o ARNhc está bajo el control de un solo promotor. En algunas realizaciones, cuando en el mismo vector terapéutico hay múltiples miRNA, los miARN están bajo el control de un solo promotor, por ejemplo, un promotor Pol II. En algunas realizaciones, el promotor de Pol II es un promotor del EF1-alfa o un promotor del CMV (citomegalovirus).
En algunas realizaciones, cuando en el mismo vector terapéutico hay múltiples ARNhc, los ARNhc están bajo el control de múltiples promotores. Por ejemplo, un primer ARNhc está bajo el control de un primer promotor, un segundo ARNhc está bajo el control de un segundo promotor, un tercer ARNhc está bajo el control de un tercer promotor, y así sucesivamente. En realizaciones no limitativas, los promotores pueden seleccionarse de HI (SEQ ID NO: 15), U6 (SEQ ID NO: 16) o 7SK (SEQ ID NO: 17).
El vector de la presente invención se define en las reivindicaciones. Como se representa en la figura 3C, un ejemplo no limitante de un vector terapéutico incluye una carga terapéutica de tres miARN dirigidos a mRNA de cMyc, FDPS y CD47. Como se muestra en la Tabla 1 del presente documento, se pueden usar combinaciones alternativas de una a tres secuencias de miARN en la forma final del vector terapéutico de manera que el vector terapéutico sea un vector combinado. Aunque en el vector terapéutico final pueden usarse combinaciones de una a tres secuencias de miARN, se contempla que, en el vector terapéutico final podrían usarse específicamente hasta cuatro, hasta cinco, o hasta seis, o hasta siete, o hasta ocho o más secuencias de miARN. Además, las secuencias de miARN pueden disponerse secuencial o aleatoriamente (es decir, el primer miARN no necesita preceder al segundo miARN, etc.). Además de las combinaciones seleccionadas, en estos vectores lentivíricos, pueden usarse todos los órdenes posibles de miARN desde el extremo 5' al 3' de la cadena de sentido. Los componentes del vector no se repiten en cada combinación de miARN. Al desarrollar los vectores que contienen los miARN, los ARNhc de los genes de interés se utilizan primero para demostrar que el gen de interés funcionará en la construcción de lentivirus; a partir de entonces, y una vez que se demuestre que los ARNhc funcionan (como se describe a continuación), se ensamblan en grupos de miARN como se muestra, por ejemplo, en la figura 3C del presente documento. Los miARN conservan las secuencias de direccionamiento, pero tienen cambios en su estructura general para adaptarse mejor a la vía de procesamiento de miARN.
Tabla 1. Combinaciones de secuencias de miARN
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También pueden generarse vectores combinados utilizando los ARNhc. Sin embargo, en estas circunstancias, es necesario utilizar promotores distintos para cada secuencia diana, como se describe en el presente documento.
Sistema de vector lentivírico
Un virión (partícula) lentivírico se expresa mediante un sistema vectorial que codifica las proteínas víricas necesarias para producir un virión (partícula vírica). Existe al menos un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas pol lentivíricas necesarias para la transcripción inversa y la integración, unido operativamente a un promotor. En otra realización, las proteínas pol se expresan mediante múltiples vectores. También existe un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas gag lentivíricas necesarias para formar una cápside vírica unido operativamente a un promotor. En una realización, esta secuencia de ácido nucleico de gag está en un vector distinto al de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de pol. En otra realización, el ácido nucleico de gag está en un vector distinto de todas las secuencias de ácido nucleico de pol que codifican proteínas pol.
Se pueden realizar numerosas modificaciones en los vectores, que se utilizan para crear las partículas para minimizar además la posibilidad de obtener retromutantes de tipo silvestre. Estas incluyen, pero sin limitación, deleciones de la región U3 de la LTR, deleciones tat y deleciones de matriz (MA).
El vector o los vectores gag, pol y env, no contienen nucleótidos del genoma lentivírico que empaquete el ARN lentivírico, los que se denomina secuencia de empaquetamiento lentivírico.
Preferentemente, el vector o los vectores que forman la partícula no contienen una secuencia de ácido nucleico del genoma lentivírico que exprese una proteína de envoltura. Preferentemente, se usa un vector distinto que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura unida operativamente a un promotor. Este vector env tampoco contiene una secuencia de empaquetamiento lentivírico. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de env codifica una proteína de envoltura lentivírica.
En otra realización, la proteína de envoltura no es del lentivirus, si no de un virus diferente. La partícula resultante se denomina partícula seudotipificada. A través de una selección adecuada de envolturas, se puede "infectar" prácticamente cualquier célula. Por ejemplo, se puede usar un gen env que codifique una proteína de envoltura que se dirija a un compartimento endocítico tal como el del virus de la gripe, VSV-G (glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular), alfavirus (virus del bosque Semliki, virus Sindbis), arenavirus (virus de la coriomeningitis linfocítica), flavivirus (virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, virus de la hepatitis C, virus GB), rabdovirus (virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia), paramixovirus (parotiditis o sarampión) y ortomixovirus (virus de la gripe). Otras envolturas que pueden utilizarse, incluyen preferentemente las del virus de la leucemia de Moloney tales como MLV-E, MLV-A y GALV. Estas últimas envolturas son particularmente preferidas cuando la célula hospedadora es una célula primaria. Dependiendo de la célula hospedadora deseada, pueden seleccionarse otras proteínas de envoltura. Por ejemplo, para el suministro al cerebro se puede utilizar el direccionamiento de receptores específicos, tal como un receptor de dopamina. Otra diana puede ser el endotelio vascular. Estas células pueden dirigirse usando una envoltura de filovirus. Por ejemplo, la Gp del Ébola, que por modificación postranscripcional se convierte en las glucoproteínas GP y GP2. En otra realización, se pueden usar diferentes cápsides lentivíricas con una envoltura seudotipificada (por ejemplo, FIV o SHIV [patente de EE. UU. n.° 5.654.195]). Un vector seudotipificado del SHIV (virus de la inmunodeficiencia en simios) puede usarse fácilmente en modelos animales tales como monos.
Como se detalla en el presente documento, un sistema de vector lentívirico normalmente incluye al menos un plásmido auxiliar que comprende al menos uno de un gen gag, pol o rev. Cada uno de los genes gag, pol y rev pueden proporcionarse en plásmidos individuales, o pueden proporcionarse uno o más genes juntos en el mismo plásmido. En una realización, los genes gag, pol y rev se proporcionan en el mismo plásmido (p. ej., figura 1). En otra realización, los genes gag y pol se proporcionan en un primer plásmido y el gen rev se proporciona en un segundo plásmido (por ejemplo, figura 2). Por consiguiente, para producir un lentivirus como se describe en el apartado de Ejemplos y en otras partes del presente documento, se pueden usar sistemas de 3 y 4 vectores. El vector terapéutico, el plásmido de envoltura y al menos un plásmido auxiliar, se transfectan en una línea celular de empaquetamiento. Un ejemplo no limitante de una línea celular de empaquetamiento es la línea celular HEK 293T/17. Cuando el vector terapéutico, el plásmido de envoltura y al menos un plásmido auxiliar, se transfectan en la línea celular de empaquetamiento, finalmente se produce una partícula lentivírica.
En otro aspecto, se desvela un sistema de vector lentivírico para expresar una partícula lentivírica. El sistema incluye un vector lentivírico como se describe en el presente documento; un plásmido de envoltura para expresar una proteína de envoltura optimizada para infectar una célula; y al menos un plásmido auxiliar para expresar los genes gag, pol y rev, en donde cuando el vector lentivírico, el plásmido de envoltura, y el al menos un plásmido auxiliar, se transfectan en una línea celular de empaquetamiento, la línea celular de empaquetamiento produce una partícula lentivírica, en donde la partícula lentivírica es capaz de inhibir los genes a los que se dirigen los ARNhc o los miRNA.
En otro aspecto, el vector terapéutico, puede incluir los siguientes elementos: repetición terminal larga híbrida en el extremo 5' (RSV/5' LTR) (las Se Q ID NO: 74-75), secuencia psi (lugar de empaquetamiento de ARN) (SEQ ID NO: 76), RRE (elemento de respuesta a Rev) (SEQ ID NO: 77), cPPT (tramo de polipurina) (SEQ ID NO: 78), promotor HI (s Eq ID No : 15), ARNhc de FDPS (por ejemplo, las SEQ ID n O: 1, 2, 3, 4 o variantes de las mismas), elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE, por las siglas del inglés Woodchuck Post-Transcriptional Regulatory Element) (SEQ ID n O: 79) y 3' Delta LTR (SEQ iD NO: 80). En otro aspecto, para modificar las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento, puede utilizarse variación de secuencia, mediante sustitución, deleción, adición o mutación.
En otro aspecto, y como se detalla en el presente documento, se ha diseñado un plásmido auxiliar que incluye los siguientes elementos: promotor CAG (SEQ ID NO: 19); componente gag del HIV (SEQ ID NO: 21); componente pol del HIV (SEQ ID NO: 22); Int del HIV (SEQ ID NO: 23); RRE del HIV (SEQ ID NO: 24); y Rev de1HIV (SEQ ID NO: 25). En otro aspecto, el plásmido auxiliar puede modificarse para que incluya un primer plásmido auxiliar para que exprese los genes gag y pol, y un segundo plásmido distinto para que exprese el gen rev. En otro aspecto, para modificar las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento, puede utilizarse variación de secuencia, mediante sustitución, deleción, adición o mutación.
En otro aspecto, y como se detalla en el presente documento, se ha diseñado un plásmido de envoltura para que incluya los siguientes elementos de izquierda a derecha: promotor de ARN polimerasa II (CMV) (SEQ ID NO: 27) y glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) (SEQ ID NO: 29). En otro aspecto, para modificar las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento, puede utilizarse variación de secuencia, mediante sustitución, deleción, adición o mutación.
En otro aspecto, los plásmidos utilizados para el empaquetamiento lentivírico pueden modificarse con elementos similares y las secuencias intrónicas podrían eliminarse posiblemente sin pérdida de la función del vector. Por ejemplo, en los plásmidos que comprenden el sistema de empaquetamiento, pueden reemplazarse los siguientes elementos similares: los promotores del factor de elongación 1 (EF-1), de la fosfoglicerato cinasa (PGK) y de la ubiquitina C (UbC), pueden reemplazarse por el promotor del CMV o de CAG. La poli A del SV40 A y la poli A de la bGH pueden reemplazar a la poli A de la beta globina de conejo. Las secuencias del HIV (virus de la inmunodeficiencia humana) en el plásmido auxiliar, pueden construirse a partir de diferentes cepas o clados de1HIV. La glucoproteína G del VSV puede sustituirse con glucoproteínas de membrana del virus endógeno felino (RD114), virus de la leucemia del simio gibón (GALV, por sus siglas en inglés), virus de la rabia (FUG, fusion glycoprotein, glucoproteína de fusión), virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV, por sus siglas en inglés), virus de la peste aviar de la gripe A (FPV, por sus siglas en inglés), alfavirus del río Ross (RRv , por sus siglas en inglés), virus de la leucemia murina (MLV, por sus siglas en inglés) 10A1 o virus del Ébola (EboV, por sus siglas en inglés).
Cabe señalar que, los sistemas de empaquetamiento lentivírico se pueden adquirir en el comercio (por ejemplo, el kit de empaquetamiento Lenti-vpak de OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD), y también pueden diseñarse como se describe en el presente documento. Por otro lado, está dentro de la habilidad de un experto en la materia sustituir o modificar aspectos de un sistema de empaquetamiento lentivírico para mejorar cualquier número de factores relevantes, incluyendo la eficacia de producción de una partícula lentivírica.
Dosis y Formas Farmacéuticas
Las composiciones vectoriales que se desvelan permiten la expresión a corto, medio o largo plazo de genes o secuencias de interés y el mantenimiento episómico de los vectores desvelados. Por consiguiente, los regímenes de dosificación pueden variar según la afección que se esté tratando y el método de administración.
En algunas realizaciones, las composiciones vectoriales para su uso en el tratamiento del cáncer, se pueden administrar a un sujeto que lo necesite en dosis variables. Específicamente, a un sujeto se le puede administrar aproximadamente > 106 dosis infecciosas (donde como promedio se necesita 1 dosis para transducir 1 célula diana). Más específicamente, a un sujeto se le puede administrar aproximadamente > 107, aproximadamente > 108, aproximadamente > 109 o aproximadamente > 1010 dosis infecciosas, o cualquier cantidad de dosis entre estos valores. Los límites superiores de dosificación se determinarán para cada indicación de enfermedad, incluido un tipo de cáncer específico, y dependerán de los perfiles de toxicidad/seguridad de cada producto o lote de producto individual.
Adicionalmente, las composiciones vectoriales de la presente divulgación, para su uso en el tratamiento del cáncer, pueden administrarse periódicamente, tal como una o dos veces al día, o cualquier otro período de tiempo adecuado. Por ejemplo, las composiciones vectoriales pueden administrarse a un sujeto que lo necesite una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, cada dos meses, cada tres meses, cada seis meses, cada nueve meses, una vez al año, cada dieciocho meses, cada dos años, cada treinta meses o cada tres años.
En algunas realizaciones, las composiciones vectoriales desveladas para su uso en el tratamiento del cáncer, pueden administrarse como una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular en una amplia variedad de formas farmacéuticas, que incluyen, pero sin limitación, formas farmacéuticas para aplicación nasal, pulmonar, oral, tópica o parenteral. Cada una de las formas farmacéuticas puede comprender varios agentes solubilizantes, agentes disgregantes, tensioactivos, cargas, espesantes, aglutinantes, diluyentes, tales como agentes humectantes u otros excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica también se puede formular para inyección, insuflación, infusión o exposición intradérmica. Por ejemplo, una formulación inyectable puede comprender los vectores desvelados en una solución acuosa o no acuosa a un pH y una tonicidad adecuados.
Las composiciones vectoriales desveladas para su uso en el tratamiento del cáncer, pueden administrarse a un sujeto mediante inyección directa en el lugar donde está un tumor o una infección. En algunas realizaciones, los vectores pueden administrarse por vía sistémica. En algunas realizaciones, las composiciones vectoriales pueden administrarse mediante canulación guiada a tejidos que rodean inmediatamente los lugares donde está el tumor o la infección.
Las composiciones vectoriales desveladas para su uso en el tratamiento del cáncer, se pueden administrar usando cualquier método farmacéuticamente aceptable, tal como intranasal, bucal, sublingual, oral, rectal, ocular, parenteral (intravenosa, intradérmica, intramuscular, por vía subcutánea o por vía intraperitoneal), pulmonar, intravaginal, administrado localmente, administrado tópicamente, administrado tópicamente después de la escarificación, administrado por vía mucosa, a través de un aerosol, en medios semisólidos como agarosa o gelatina, o mediante una formulación de aerosol bucal o nasal.
Además, las composiciones vectoriales desveladas para su uso en el tratamiento del cáncer se pueden formular en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, tal como una forma farmacéutica sólida, comprimido, píldora, pastilla para chupar, cápsula, dispersión líquida, gel, aerosol, aerosol pulmonar, aerosol nasal, pomada, crema, forma farmacéutica semisólida, una solución, una emulsión, y una suspensión. Además, la composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación controlada, formulación de liberación prolongada, formulación de liberación inmediata, o cualquier combinación de las mismas. Además, la composición farmacéutica puede ser un sistema de suministro transdérmico.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular en una forma farmacéutica sólida para administración oral, y la forma farmacéutica sólida puede ser polvos, granulados, cápsulas, comprimidos o píldoras. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica sólida puede incluir uno o más excipientes tales como carbonato de calcio, almidón, sacarosa, lactosa, celulosa microcristalina o gelatina. Además, la forma farmacéutica sólida puede incluir, además de los excipientes, un lubricante tal como talco o estearato de magnesio. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica oral puede ser una forma de liberación inmediata o de liberación modificada. Las formas farmacéuticas de liberación modificada incluyen liberación controlada o lenta, liberación entérica, y similares. Los excipientes utilizados en las formas farmacéuticas de liberación modificada son habitualmente conocidos por un experto en la materia.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular como una forma farmacéutica sublingual o bucal. Dichas formas farmacéuticas comprenden comprimidos sublinguales o composiciones en solución que se administran debajo de la lengua y comprimidos bucales que se colocan entre la mejilla y la encía.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular como una forma farmacéutica nasal. Dichas formas farmacéuticas de la presente invención comprenden composiciones en solución, suspensión y gel para el suministro nasal.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular en una forma farmacéutica líquida para administración oral, tal como suspensiones, emulsiones o jarabes. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica líquida puede incluir, además de los diluyentes sencillos habitualmente usados, tales como agua y parafina líquida, diversos excipientes tales como humectantes, edulcorantes, sustancias aromáticas o conservantes. En algunas realizaciones, la composición se puede formular para que sea adecuada para la administración a un paciente pediátrico.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular en una forma farmacéutica para administración parenteral, tal como soluciones acuosas, suspensiones, emulsiones, soluciones no acuosas o supositorios estériles. En algunas realizaciones, las soluciones o suspensiones pueden incluir propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres inyectables tales como oleato de etilo.
La dosis de la composición farmacéutica puede variar dependiendo del peso, de la edad y del sexo del paciente, del tiempo y modo de administración, de la tasa de excreción y de la gravedad de la enfermedad.
En algunas realizaciones, el tratamiento del cáncer se realiza mediante inyección directa guiada en los tumores de las construcciones vectoriales desveladas, usando una aguja o una canulación intravascular. En algunas realizaciones, las composiciones vectoriales se administran en el líquido cefalorraquídeo, la circulación sanguínea o linfática por canalización o inyección venosa o arterial, suministro intradérmico, suministro intramuscular o inyección en un órgano de drenaje cerca del lugar de la enfermedad.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar aspectos de la presente invención. Sin embargo, ha de entenderse, que la invención no debe limitarse a las condiciones o detalles específicos descritos en estos ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Desarrollo de un Sistema Vectorial Lentivírico
Se desarrolló un sistema vectorial lentivírico como se resume en la figura 1 (forma circularizada). Se produjeron partículas lentivíricas en células HEK 293T/17 (adquiridas en la American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA) después de la transfección con el vector terapéutico, el plásmido de envoltura y el plásmido auxiliar. En la transfección de las células HEK 293T/17, a través de la cual se produjeron partículas víricas funcionales, se empleó el reactivo Poli(etilenimina) (PEI) con objeto de aumentar la eficacia de la captación de ADN plasmídico. Los plásmidos y el ADN se añadieron inicialmente por separado en medio de cultivo sin suero a una proporción de 3:1 (proporción en masa de PEI con respeto a ADN). Después de 2-3 días, se recogió el medio celular y las partículas lentivíricas se purificaron mediante centrifugación y/o filtración a alta velocidad seguido de cromatografía de intercambio aniónico. La concentración de las partículas lentivíricas puede expresarse en términos de unidades transductoras/ml (UT/ml). La determinación de las u T se realizó midiendo los niveles de p24 de1HIV en líquidos de cultivo (la proteína p24 se incorpora en las partículas lentivíricas), midiendo el número de copias de ADN vírico por célula transducida mediante PCR cuantitativa, o infectando las células y usando luz (en el caso de que los vectores codifiquen marcadores de luciferasa o proteínas fluorescentes).
Como se ha mencionado anteriormente, para la producción de las partículas lentivíricas, se diseñó un sistema de 3 vectores (es decir, que incluía un sistema de empaquetamiento lentivírico de 2 vectores). En la figura 1 se muestra un esquema del sistema de 3 vectores. Resumiendo, y con referencia a la figura 1, el vector de la parte más superior es un plásmido auxiliar, que, en este caso, incluye Rev. El vector que aparece en la parte central de la figura 1 es el plásmido de envoltura. El vector de la parte más inferior es el vector terapéutico, como se describe en el presente documento.
En referencia a la figura 1, el plásmido auxiliar más Rev incluye un potenciador de CAG (SEQ ID NO: 18); un promotor de CAG (SEQ ID NO: 19); un intrón de beta actina de pollo (SEQ ID NO: 20); un gag de1HIV (SEQ ID NO: 21); un Pol del HIV (SEQ ID NO: 22); un Int del HIV (SEQ ID NO: 23); un RRE del HIV (SEQ ID NO: 24); un Rev de1HIV (SEQ ID NO: 25); y una poli A de beta globina de conejo (SEQ ID NO: 26).
El plásmido de envoltura incluye un promotor del CMV (SEQ ID NO: 27); un intrón de beta globina (SEQ ID NO: 28); una VSV-G (SEQ ID NO: 29); y una poli A de beta globina de conejo (s Eq ID NO: 30).
Síntesis de un sistema de 3 vectores, que incluye un sistema de empaquetamiento lentivírico de 2 vectores, que consiste en los plásmidos auxiliar (más Rev) y envoltura.
Materiales y métodos:
Construcción del plásmido auxiliar: El plásmido auxiliar se construyó mediante amplificación por PCR inicial de un fragmento de ADN del plásmido pNL4-3 del HIV (NIH Aids Reagent Program) que contenía los genes Gag, Pol e Integrasa. Se diseñaron cebadores para amplificar el fragmento con sitios de restricción EcoRI y NotI que pudieran usarse para insertar en los mismos sitios en el plásmido pCDNA3 (Invitrogen). El cebador directo era (5'-TAAGCAGAATTC ATGAATTTGCCAGGAAGAT-3') (SEQ ID NO: 31) y el cebador inverso era (5'-CCATACAATGAATGGACACTAGGCGGCCGCACGAAT-3') (SEQ ID NO: 32).
La secuencia del fragmento de Gag, Pol, Integrasa era la siguiente:
GA ATTCATGA ATTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGA GGTTTT AT C A A A G T A AGAC AGT AT GAT C AGAT AC TC AT AGA A AT C T GCGGAC AT A A AGC T AT AGGT AC AGT ATT AGT AGGACC T AC AC CTGTC A AC AT A ATT GGA AGA A ATCTG TTGA CTCAGATTGGCTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAGACT GTACCAG TAA AATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCA TTG ACAGA AG AA AAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAG GA AG GA AAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTT GC C AT A A AGA A A A A AGAC AGT AC T A A AT GGAGA A A ATT AGT AGATTTC AGAGA A CTTAA TAAGAGAACTCAAGATTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCTG CA GG GTTAAAACAGAAAAAATCAGTAACAGTACTGGATGTGGGCGATGCATATT
T AT A A AC A AT G A G AC AC CAGGGATT AGAT AT C AGT AC A AT GT GC TT CC AC AGGG AT GGA A AGGAT C AC C AGC A AT AT T C C AGT GT AGC AT GAC A A A A AT C TT AGAGC C TTTTAG AAAACAAAATCCAGACATAGTCATCTATCAATACATGGATGATTTGTAT GT AGGAT C T GAC T T AG AA AT AGGGC AGC AT A G A AC A A A A AT AGAGGA AC T GAG AC AAC ATCTGTTGAGGTGGGGATTT AC C AC ACC AGAC AAAAAAC AT C AGAAAGA ACCTCCATTCCTTTGGATGGGTTATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAGTACAG C CT AT AGT GCTGCC AGA AA AGGAC AGC T GGAC T GT C A AT GAC AT AC AGA A ATT A GTGGGAAAATTGAATT GGGC AAGTC AGATTT ATGC AGGGATTAAAGTAAGGC AA TT AT GT A AAC TTCTT AGGGGAACC A AAGC ACT AAC AGA AGT AGT ACC ACT AAC A GAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGCAGAAAACAGGGAGATTCTAAAAGAACCGGT
GGGGCAAGGCCAATGGACATATCAAATTTATCAAGAGCCATTTAAAAATCTGAA AAC AGGAAAGT ATGC AAGAATGAAGGGTGCCCACACTAATGATGTGAAACAATT AAC AG AGGC AGT AC A AA AA AT AGC C AC AGA AAGC AT AGT A AT AT GGGG A A AG A CTCCTAAATTTAAATTACCCATACAAAAGGAAACATGGGAAGCATGGTGGACAG AGTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAGTTTGTCAATACCCCTCCCTT AGTGAAGTTATGGTACCAGTTAGAGAAAGAACCCATAATAGGAGCAGAAACTTT C T AT GT AGAT GGGGC AGC C A AT AGGG A A ACT A A ATT AGGA A A AGC AGGAT AT GT AACTGACAGAGGAAGACAAAAAGTTGTCCCCCTAACGGACACAACAAATCAGAA GACTGAGTTACAAGCAATTCATCTAGCTTTGCAGGATTCGGGATTAGAAGTAAAC ATAGTGACAGACTCACAATATGCATTGGGAATCATTCAAGCACAACCAGATAAG AGT GAATC AGAGTTAGT C AGTC AAAT AATAGAGC AGTT AAT AAAAAAGGAAAAA GTCT ACCT GGC AT GGGT ACC AGC AC AC A AAGGAATTGGAGGAA ATGAAC A AGT A GAT AAATT GGTC AGT GCT GGAATC AGGAAAGT AC TATTTTT AGAT GGAAT AGAT A AGGC C C A AG AAGA AC AT GAGA AAT AT C AC AGT A ATT GGAGAGC A AT GGC T AGT G ATTTTAACCTACCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATG TCAGCTAAAAGGGGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGCCCAGGAATATG GCAGCTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCTTGGTAGCAGTTCATGTA GCC AGT GGAT AT AT AGAAGC AGA AGT AATTCC AGC AGAGAC AGGGC AAGAAAC AGCATACTTCCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATAC AGACAATGGC AGC AATTTCACCAGT ACTAC AGTT AAGGCCGCCTGTTGGTGGGC GGGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAAT AGA ATCT AT G A AT A A AGAATT A A AGA A A ATT AT AGG AC AGGT A AGAGATC AGGC TGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGA A A AGGGGGGATT GGGGGGT AC AGT GC AGGGGA A AGA AT AGT AG AC AT AAT AGC AACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTT TCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCT C C TC TGGA AAGGT G A AGGGGC AGT AGT AAT AC A AG AT A AT AGTG AC ATA A A AGT
AGT GCC A AGAAGAAAAGC AAAGAT C AT C AGGGATT ATGGAA AAC AGAT GGC AG GTGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAA (SEQ ID NO: 33) A continuación, un fragmento de ADN que contenía la secuencia Rev, RRE y la poli A de beta globina de conejo con sitios de restricción flanqueantes XbaI y XmaI, se sintetizó en MWG Operon. Después, el fragmento de ADN se insertó en el plásmido en los sitios de restricción XbaI y XmaI. La secuencia de ADN era la siguiente:
TCTAGAATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTCATCAGAACAGT
CAGACTCATCAAGCTTCTCTATCAAAGCAACCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACC
CGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGAT
CCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTGGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCT
GTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGATTGTAACGAGGATT
GTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTC
CTACAATATTGGAGTCAGGAGCTAAAGAATAGAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCT
T GGGAGC AGC AGGAAGC ACT ATGGGCGC AGCGT C AAT GACGCTGACGGT AC AGG
C C AGAC A ATT ATTGT C T GGT AT AGT GC AGC AGC AGA AC A ATTT GC T GAGGGC T AT
TGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCA
GGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGATCT
TTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACT
TCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTG
TCTCTC ACTCGGAAGGAC AT AT GGGAGGGC AAAT C ATTT AAAAC ATC AGAATGA
GTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAG
GTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTA
TTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTT
ATTTTTTTCTTT AAC ATCCCT AAAATTTTCCTT A C AT GTTTT A CT AGCC AGATTTTT
CCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCC
TCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAA
ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAA
AGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTG
CCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTC
AGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGT
TCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGA
GGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGC
CTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATA
AA GCAA TAG CATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGT
TG TGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCAGCGGCCGCCCCGGG (SEQ ID
NO: 34)
Finalmente, el promotor del CMV de pCDNA3.1 se reemplazó por el potenciador/promotor de CAG más una secuencia intrónica de la beta actina de pollo. En MWG Operon, se sintetizó un fragmento de ADN que contenía la secuencia potenciador/promotor/intrón de CAG con sitios de restricción flanqueantes MluI y EcoRI. Después, el fragmento de ADN se insertó en el plásmido en los sitios de restricción MluI y EcoRI. La secuencia de ADN era la siguiente:
ACGCGTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATAT
ATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCA
ACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAAT
AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG
GCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACG
GTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC
TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCC
CACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTT
ATTT ATTTTTT AATT ATTTTGT GC AGCGAT GGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGC
GCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTG
CGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGC
GGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCT
GCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGC
TCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCC
GGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTG
AAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGG
GGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCG
GCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCG
CGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGG
GA AC A A AGGCTGCGT GCGGGGT GT GT GC GT GGGGGGGT GAGC AGGGGGT GT GG
ACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCG
TGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCT
CGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGC
TGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGG
GCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCC
GCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGA
AATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTC
CAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGG
C GGGGTT C GGC TT C T GGC GT GT GAC C GGC GGGA AT T C (SEQ ID NO: 35) Construcción delplásmido de envoltura de VSV-G:
La secuencia de la glucoproteína del virus de la cepa Indiana de la estomatitis vesicular (VSV-G), se sintetizó en MWG Operon con sitios de restricción EcoRI flanqueantes. Después, el fragmento de ADN se insertó en el plásmido pCDNA3.1 (Invitrogen) en el sitio de restricción EcoRI y, a través de secuenciación, se determinó la orientación correcta utilizando un cebador específico de CMV. La secuencia de ADN era la siguiente:
GAATTCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGCAA
GTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCT
AATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAG
GCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACG
GTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGG
ACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGC
AAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCT
CCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAG
GTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCAC
AGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTAC
AACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCC
ATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAG
GGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGC
AAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCG
AGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGG
GTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGAC
GTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGA
GCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAG
GAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAG
ATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATC
AGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGAC
GTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTT
TATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGC
TCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGAT
GAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAG
A AGGTTGGTT C AGT AGTT GGA A A AGC TC T ATT GC CTCTTTTTTCTTT AT C AT AGGG
TTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATT
AAAGC AC ACC AAGAA AAGAC AGATTT AT AC AGAC AT AGAGAT GAGA ATT C (SEQ
ID NO: 29)
Utilizando los métodos y materiales descritos en el presente documento también se ha diseñado y producido un sistema de 4 vectores, que incluye un sistema de empaquetamiento lentivírico de 3 vectores. En la figura 2 se muestra un esquema del sistema de 4 vectores. Resumiendo, y con referencia a la figura 2, el vector de la parte más superior es un plásmido auxiliar, que, en este caso, no incluye Rev. El segundo vector de la parte superior es un plásmido Rev distinto. El segundo vector de la parte inferior el plásmido de envoltura. El vector de la parte más inferior es el vector terapéutico como se describe en este documento.
En referencia a la figura 2, el plásmido auxiliar incluye un potenciador de CAG (SEQ ID NO: 18); un promotor de CAG (SEQ ID NO: 19); un intrón de beta actina de pollo (SEQ ID NO: 20); un gag de1HIV (SEQ ID NO: 21); un Pol de1HIV (SEQ ID NO: 22); un Int del HIV (SEQ ID NO: 23); un RRE del HIV (SEQ ID NO: 24); y una poli A de beta globina de conejo (SEQ ID NO: 26).
El plásmido Rev incluye un promotor del RSV (SEQ ID NO: 80); un Rev del HIV (SEQ ID NO: 25); y una poli A de beta globina de conejo (SEQ ID NO: 26).
El plásmido de envoltura incluye un promotor del CMV (SEQ ID NO: 27); un intrón de beta globina (SEQ ID NO: 28); una VSV-G (SEQ ID NO: 29); y una poli A de beta globina de conejo (s Eq ID NO: 30).
Síntesis de un sistema de 4 vectores, que incluye un sistema de empaquetamiento lentivírico de 3 vectores que consiste en los plásmidos auxiliar, rev y de envoltura.
Materiales y métodos:
Construcción del plásmido auxiliar sin Rev:
El plásmido auxiliar sin Rev se construyó insertando un fragmento de ADN que contenía la secuencia de RRE y poli A de beta globina de conejo. Esta secuencia se sintetizó en MWG Operon con sitios de restricción XbaI y XmaI flanqueantes. Después, se insertó la secuencia de RRE/poli A beta globina de conejo en el plásmido auxiliar en los sitios de restricción XbaI y XmaI. La secuencia de ADN es la siguiente:
TCTAGAAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGC
GCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGC
AGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAAC
TCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGAT
ACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGA
CATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTC
ATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGA
GGGC AAATC ATTT A AAAC AT C AGAAT GAGT ATTT GGTTT AGAGTTT GGC AAC AT A
TGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATAT
GAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGT
TAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTT
GCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAAT
CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAAC
ATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAA
CTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGT
GCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCG
CCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACT
AATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAG
AAGT AGT GAGGAGGCTTTTTT GGAGGCCT AGGCTTTT GC AAA AAGCT AACTTGTT
T ATT GC AGCTT AT AAT GGTT AC AAAT AAAGC AAT AGC AT C AC AAATTT C AC AAAT
AAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATC
TTATCACCCGGG (SEQ ID NO: 34)
Construcción del plásmido Rev:
El promotor del RSV y las secuencias de Rev del VIH se sintetizaron como un solo fragmento de ADN en MWG Operon con sitios de restricción MfeI y XbaI flanqueantes. Después, el fragmento de ADN se insertó en el plásmido pCDNA3.1 (Invitrogen) en los sitios de restricción MfeI y XbaI en los que el promotor del CMV se reemplazó por el promotor del RSV. La secuencia de ADN era la siguiente:
CA A TTGCG ATG TA CGG GCCAG ATA TA CGCGTA TCTGAG GG GA CTA GGG TGTGTTT
AG GCGA AAA GCGG G G CTTCG G TTG TA CG CG G TTA G G A G TCCCCTCA G G A TA TA G
T AGTTTC GC T TTTGC AT A G GG AG GGG GA A AT GT AGT C TT AT GC A AT AC AC TT GT A
GTCTTG CA ACA TGG TA ACG ATG A G TTA G CA A CA TG CCTTA CA A G G A G A G A A A A A
GCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGA
AGGCAACAGACAGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCA
GAGATAATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTC
ACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTCGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGC
CTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCC
AGCCTCCCCTCGAAGCTAGCGATTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAG
ACAGCGACGAAGAACTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAA
GCAACCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAA
GAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTA
GCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGA
GAGACTT ACTCTT GATTGT AACGAGGATT GT GGAACTTCTGGGACGC AGGGGGT G
GGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAATATTGGAGTCAGGAGCTAAA
GAATAGTCTAGA (SEQ ID NO: 36)
Los plásmidos utilizados en los sistemas de empaquetamiento se pueden modificar con elementos similares, y las secuencias intrónicas se pueden eliminar posiblemente sin pérdida de la función del vector. Por ejemplo, en el sistema de empaquetamiento, pueden reemplazarse los siguientes elementos similares:
Promotores: el promotor del factor de elongación 1 (EF-1) (SEQ ID NO: 37), de la fosfoglicerato quinasa (PGK) (SEQ ID NO: 38) y de la ubiquitina C (UbC) (SEQ ID NO: 39), pueden reemplazarse por el promotor del CMV (SEQ ID NO: 27) o de CAG (SEQ ID NO: 19). Estas secuencias también pueden modificarse mediante adición, sustitución, deleción o mutación.
Secuencias de poli A: La poli A de SV40 (SEQ ID NO: 40) y la poli A de bGH (SEQ ID NO: 41), pueden reemplazar a la poli A de beta globina de conejo (SEQ ID NO: 26). Estas secuencias también pueden modificarse mediante adición, sustitución, deleción o mutación.
Secuencias de Gag, Pol e Integrasa del HIV: Las secuencias del HIV en el plásmido auxiliar pueden construirse a partir de diferentes cepas o clados del HIV. Por ejemplo, las secuencias Gag de1HIV (SEQ ID NO: 21); Pol de1HIV (SEQ ID NO: 22); e Int del HIV (SEQ ID NO: 23) de la cepa Bal, pueden intercambiarse por las secuencias gag, pol e int contenidas en los plásmidos auxiliar/auxiliar más Rev como se indica en el presente documento. Estas secuencias también pueden modificarse mediante adición, sustitución, deleción o mutación.
Envoltura: La glucoproteína G del VSV puede sustituirse con glucoproteínas de membrana del virus endógeno felino (RD114) (SEQ ID NO: 42), virus de la leucemia del simio gibón (Ga Lv ) (SEQ ID NO: 43), virus de la rabia (FUG) (SEQ ID NO: 44), virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (SEQ ID NO: 45), virus de la peste aviar (FPV, por sus siglas en inglés) de la gripe A (SEQ ID NO: 46), alfavirus del río Ross (RRV) (SEQ ID NO: 47), virus de la leucemia murina 10A1 (MLV) (SEQ ID NO: 81) o virus del Ébola (EboV) (SEQ ID n O: 48). Las secuencias de estas envolturas se identifican en la parte de secuencia del presente documento. Además, estas secuencias también pueden modificarse mediante adición, sustitución, deleción o mutación.
Resumiendo, los sistemas de 3 vectores frente a los de 4 vectores se pueden comparar y contrastar de la siguiente manera. El sistema vectorial lentivírico de 3 vectores contiene: 1. Plásmido auxiliar: Gag, Pol, Integrasa y Rev/Tat del HIV; 2. Plásmido de envoltura: envoltura VSV-G/FUG; y 3. Vector terapéutico: RSV 5'LTR, Señal de empaquetamiento Psi, fragmento gag, RRE, fragmento env, cPPT, WPRE y 3'5 LTR. El sistema vectorial lentivírico de 4 vectores contiene: 1. Plásmido auxiliar: Gag, Pol e Integrasa del HIV; 2. Plásmido Rev: Rev; 3. Plásmido de envoltura: envoltura VSV-G/FUG; y 4. Vector terapéutico: RSV 5'LTR, Señal de empaquetamiento Psi, fragmento gag, RRE, fragmento env, cPPT, WPRE y 3'delta LTR. Las secuencias correspondientes a los elementos anteriores se identifican en la parte de listados de secuencias del presente documento.
Ejemplo 2. Vectores terapéuticos
Se han diseñado y desarrollado vectores terapéuticos ilustrativos como se muestra, por ejemplo, en la figura 3.
Con referencia primero a la figura 3A, de izquierda a derecha, los elementos genéticos clave son los siguientes: repetición terminal larga híbrida en el extremo 5' (RSV/LTR), secuencia Psi (sitio de empaquetamiento de ARN), RRE (elemento de respuesta a Rev), cPPT (tramo de polipurina), promotor HI, una secuencia de ARNhc de FDPS que incluye las secuencias de ARNhp de FDPS detalladas en el presente documento, elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE) y LTR con una deleción en la región U3.
Haciendo referencia a continuación a la figura 3B, de izquierda a derecha, los elementos genéticos clave son los siguientes: repetición terminal larga híbrida en el extremo 5' (RSV/LTR), secuencia Psi (sitio de empaquetamiento de ARN), RRE (elemento de respuesta a Rev), cPPT (tramo de polipurina), EF-1 alfa (promotor EF-1 alfa de transcripción génica), un miR (miARN) de FDPS que incluye las secuencias de miARN de FDPS detalladas en el presente documento, elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE) y LTR con una deleción en la región U3.
Para producir los vectores indicados en general en las figuras 3A y 3B, se emplearon los siguientes métodos y materiales.
Diseño de ARN inhibidor: Para atenuar los niveles de FDPS en células humanas, se utilizó la secuencia de ARNm de la farnesil difosfato sintasa (FDPS, por sus siglas en inglés) de Homo sapiens (NM_002004.3) para buscar posibles candidatos a ARNip o ARNhc. Las posibles secuencias de interferencia de ARN se eligieron entre las candidatas seleccionadas por los programas de diseño de ARNip o ARNhc, como los del GPP Web Portal del Broad Institute (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/) o BLOCK-iT RNAi Designer de Thermo Scientific (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/). Para regular la expresión de ARNhc, se insertaron secuencias de ARNhc individuales seleccionadas en un vector lentivírico inmediatamente en el extremo 3 prima con un promotor HI de ARN polimerasa III (SEQ ID NO: 15). Estas construcciones de ARNhc de lentivirus se usaron para transducir células y medir el cambio de los niveles específicos de ARNm. El ARNhc más fuerte para reducir los niveles de ARNm se incorporó individualmente en una cadena principal de microARN para permitir la expresión por parte de los promotores de ARN polimerasa II del EF-1 alfa o del CMV. La cadena principal de microARN se seleccionó de mirbase.org. También se sintetizaron secuencias de ARN como oligonucleótidos de ARNip sintéticos y se introdujeron directamente en las células sin usar ningún vector lentivírico.
Construcciones vectoriales: Para el ARNhc de la FDPS, en Eurofins MWG Operon, se sintetizaron secuencias de oligonucleótidos que contenían sitios de restricción BamHI y EcoRI. Las secuencias de oligonucleótidos de sentido y de antisentido solapantes, se mezclaron y se hibridaron durante enfriamiento de 70 grados centígrados a temperatura ambiente. El vector lentivírico se digirió con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI durante una hora a 37 grados centígrados. El vector lentivírico digerido se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se extrajo del gel usando un kit de extracción de ADN en gel de Thermo Scientific. Se determinaron las concentraciones de ADN y se mezclaron el vector y el oligo (proporción 3:1), se permitió la hibridación y el ligamiento. La reacción de ligamiento se realizó con ADN ligasa de T4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. A 25 microlitros de células bacterianas competentes STBL3, se añadieron 2,5 microlitros de la mezcla de ligamiento. La transformación se logró después de un choque térmico a 42 grados centígrados. Las células bacterianas se diseminaron en placas de agar que contenían ampicilina y las colonias resistentes a fármaco (que indicaban la presencia de plásmidos resistentes a ampicilina) se recuperaron y expandieron en caldo LB. Para comprobar la inserción de las oligosecuencias, el ADN plasmídico se extrajo de cultivos bacterianos recogidos con el kit mini prep de ADN de Thermo Scientific. La inserción de secuencias de ARNhc en el vector lentivírico se verificó mediante secuenciación de ADN utilizando un cebador específico para el promotor utilizado para regular la expresión de ARNhc. Usando las siguientes secuencias diana, para atenuar la FDPS se determinaron secuencias ilustrativas de ARNhc:
GTCCTGGAGTACAATGCCATT (secuencia diana de FDPS; SEQ ID NO: 49);
GTCCTGGAGTACAAATGCCATTCTCGAGAATGGCATTGTACTCCAGGACTTTTT (secuencia n.° 1 de ARNhc de FDPS; SEQ ID NO: 1);
GCAGGATTTCGTTCAGCACTT (secuencia diana n.° 2 de FDPS; SEQ ID NO: 50);
GCAGGATTTCGTTCAGCACTTCTCGAGAAGTGCTGAACGAAATCCTGCTTTTT (secuencia n.° 2 de ARNhc de FDPS; SEQ ID NO: 2);
GCCATGTACATGGCAGGAATT (secuencia diana n.° 3 de FDPS; SEQ ID NO: 51);
GCCATGTACATGGCAGGAATTCTCGAGAATTCCTGCCATGTACATGGCTTTTT (secuencia n.° 3 de ARNhc de FDPS; SEQ ID NO: 3);
GCAGAAGGAGGCTGAGAAAGT (secuencia diana n.° 4 de FDPS; SEQ ID NO: 52); y
GCAGAAGGAGGCTGAGAAAGTCTCGAGACTTTCTCAGCCTCCTTCTGCTTTTT (secuencia n.° 4 de ARNhc de FDPS; SEQ ID NO: 4).
Después, las secuencias de ARNhc se ensamblaron en un microARN (miR) sintético bajo el control del promotor EF1 alfa. Resumiendo, se obtuvieron secuencias en horquilla de miR, tales como miR30, miR21 o miR185, como se detalla más adelante, en mirbase.org. Para construir la secuencia de miR sintética se utilizó la secuencia diana de ARNhc de 19-22 unidades monoméricas (meros). La secuencia de miR se dispuso como una secuencia diana de antisentido-secuencia de bucle en horquilla (específica de cada microARN)-secuencia diana de sentido.
Se desarrollaron las siguientes secuencias de miR:
AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACACTTTCTCAGCCTCCTTCTGCGTGAA
GCCACAGATGGCAGAAGGAGGCTGAGAAAGTGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCA
AGGGGCT (secuencia n.° 1 de miR30 de FDPS; SEQ ID NO: 53)
A A G G TA TATTG CTG TTGA CA GTG AG CGA CA CTTTCTCAGCCTCCTTCTG CGTGAA
G CCA CA G A TG GCAG AA GGG CTG AG AA AGTGCTGCCTACTGCCTCGG ACTTCA AG
GGGCT (secuencia n.° 2 de miR30 de FDPS; SEQ ID NO: 54)
T G C T G T T G A C A G T G A G C G A C T T T C T C A G C C T C C T T C T G C G T G A A G C C A C A G A T G G
CAGAAGGAGGCTGAGAAAGTTGCCTACTGCCTCGGA (secuencia n.° 3 de miR30 de FDPS; SEQ ID NO: 55)
C C TG G A G G C TTG C TG A A G G CTG TA TG C TG A CTTTCTC A G C CTC CTTCTG CTTTTG G
C C ACT G A CTG AG C A G AA GG GC TG A GA AA GTC AGGA C AC A A G G CC TG TT ACT AGC
ACTCA (secuencia n.° 1 de miR155 de FDPS; SEQ ID NO: 56)
CATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGACTTTCTCAGCCTCCTTCTGCCTGTTG
AA TCTCATGGCAGAAGGAGGCGAGAAAGTCTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGA
CCA (secuencia n.° 1 de miR21 de FDPS; SEQ ID NO: 57)
GGGCCTGGCTCGAGCAGGGGGCGAGGGATACTTTCTCAGCCTCCTTCTGCTGGTC
CCCTCCCCGCAGAAGGAGGCTGAGAAAGTCCTTCCCTCCCAATGACCGCGTCTTC
GTCG (secuencia n.° 1 de miR185 de FDPS; SEQ ID NO: 58)
Vectores combinados, como se muestra en general en la figura 3C, también pueden producirse basándose en el desarrollo de los vectores de una sola diana indicados anteriormente. En la figura 3C se muestra un vector combinado terapéutico ilustrativo, e incluye de izquierda a derecha: repetición terminal larga híbrida en el extremo 5' (RSV/LTR), secuencia Psi (sitio de empaquetamiento de ARN), RRE (elemento de respuesta a Rev), cPPT (tramo de polipurina), EF-1alfa (promotor del EF-1alfa de la transcripción génica), miR30-FDPS, miR155-CD47, miR21-cMyc, elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE) y LTR con una deleción en la región U3. El vector terapéutico detallado en la figura 3C puede producirse usando los materiales y métodos descritos usando las siguientes secuencias diana:
secuencia n° 1 de miR30 de FDPS:
A A G G TA T A TTG C TG TTG A C A G TG A G C G A C A C TTTC TC A G C C TC C TTC TG C G TG A A
G C C A C A G A T G G C A G A A G G A G G C T G A G A A A G T G C T G C C T A C T G C C T C G G A C T T C A
A G G G G C T (SEQ ID NO : 53)
secuencia diana n° 1 de miR155 de CD47:
CCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGTTATCCATCTTCAAAGAGGCAGTTTT
GGCCACTGACTGACTGCCTCTTAAGATGGATAACAGGACAC AAGGCCTGTT ACTA
GCACTCA (SEQ ID NO: 82)
secuencia de miR21 de cMyc:
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 3. Materiales y métodos para FDPS
Diseño de ARN inhibidor: Para atenuar los niveles de FDPS en células humanas, se utilizó la secuencia de ARNm, variante de transcrito 1, de la farnesil difosfato sintasa de Homo sapiens (NM_002004.3) para buscar posibles candidatos a ARNip o ARNhc. Las posibles secuencias de interferencia de ARN se eligieron entre candidatas seleccionadas por los programas de diseño de ARNsi o ARNhc, como los del Broad Institute o BLOCK-iT™ RNAi Designer de Thermo Scientific. Para regular la expresión de ARNhc, puede insertarse una secuencia de ARNhc en un vector lentivírico después de un promotor de ARN polimerasa III, tal como HI, U6 o 7SK. La secuencia de ARN también se puede incorporar en una cadena principal de microARN para permitir la expresión por parte de un promotor de ARN polimerasa II, tal como CMV o EF-1 alfa. La secuencia de ARN también puede sintetizarse como un oligonucleótido de ARNip y utilizarse independientemente de un vector lentivírico.
Construcciones vectoriales: Para el ARNhc de la FDPS, en MWG operon, se sintetizaron secuencias de oligonucleótidos que contenían sitios de restricción BamHI y EcoRI. Las secuencias de oligonucleótidos se hibridaron mediante incubación a 70 grados centígrados y enfriamiento a temperatura ambiente. Los oligonucleótidos hibridados se digirieron con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI durante una hora a 37 grados centígrados y después las enzimas se termoinactivaron a 70 grados centígrados durante 20 minutos. En paralelo, el vector lentivírico se digirió con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI durante una hora a 37 grados centígrados. El vector lentivírico digerido se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se extrajo del gel usando un kit de extracción de ADN en gel de Invitrogen. Se determinó la concentración de ADN y se ligó la secuencia de vector a oligo en la proporción de inserto a vector de 3:1. La reacción de ligamiento se llevó a cabo con ADN ligasa de T4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. A 25 microlitros de células bacterianas competentes STBL3, se añadieron 2,5 microlitros de la mezcla de ligamiento. La transformación se llevó a cabo por choque térmico a 42 grados centígrados. Las células bacterianas se sembraron en placas de agar que contenían ampicilina y después las colonias se expandieron en caldo LB. Para comprobar la inserción de las oligosecuencias, el ADN plasmídico se extrajo de cultivos de bacterias recogidas con el kit mini prep de ADN de Invitrogen. La inserción de la secuencia de ARNhc en el vector lentivírico se verificó mediante secuenciación de ADN utilizando un cebador específico para el que se utiliza cada promotor para regular la expresión del ARNhc. Los vectores lentivíricos que contenían una secuencia de FDPS correcta se usaron después para empaquetar partículas lentivíricas para probar su capacidad de atenuar la FDPS. Se transdujeron células de mamífero con partículas lentivíricas en presencia o ausencia de polibreno. Las células se recogieron después de 2-4 días y se analizó la proteína y el ARN para determinar la expresión de FDPS.
Ensayo funcional para la reducción de ARNm: El efecto de diferentes secuencias que se dirigen al ARN de homología corto (ARNhc) de FDPS sobre la expresión de FDPS, se determinó midiendo la expresión de ARNm. Con un vector lentivírico que contenía secuencias de ARNhc de FDPS, se transdujeron células de carcinoma hepatocelular HepG2. Después de 48 horas, se produjo la lisis celular y el ARN se extrajo utilizando el mini kit RNeasy de Qiagen. A continuación, se sintetizó ADNc a partir de ARN utilizando SuperScript VILO de Invitrogen. Después, las muestras se analizaron mediante RT-PCR cuantitativa utilizando un termociclador StepOne de Applied Biosystems. La expresión de FDPS se detectó con SYBR Green de Invitrogen usando el cebador directo (5'-AGGAATTGATGGCGAGAAGG-3') (SEQ ID NO: 59) y el cebador inverso (5'-CCCAAAGAGGTCAAGGTAATCA-3') (SEQ ID NO: 60) con condiciones estándar para el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa. Las muestras se normalizaron con respecto al ARNm para la expresión del gen de la beta-actina utilizando el cebador directo (5'-AGCGCGGCTACAGCTTCA-3') (SEQ iD NO: 61) y el cebador inverso (5'-GGCGACGTAGCACAGCTTCT-3') (Se Q ID NO: 62) con condiciones estándar para el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa. La expresión relativa de FDPS se determinó por su valor de Ct normalizado al nivel de actina de cada muestra.
Ensayo funcional de células tumorales modificadas por LV-FDPS y utilizadas para activar la producción de citocinas en linfocitos T gamma delta humanos: El vector LV-FDPS también se usó para tratar células tumorales que después se expusieron a linfocitos T gamma delta humanos primarios de donantes sanos. El tratamiento combinado de la línea celular tumoral con aminobisfosfonato y vector que suprime la farnesil pirofosfato sintasa (FDPS) tiene un efecto sinérgico sobre la producción de TNF-alfa por parte de los linfocitos T gamma delta. La línea celular tumoral monocitoide THP1 (A) o la línea celular tumoral monocitoide HepG2 (B) se trataron con vectores lentivíricos de control (LV-Control), con vectores lentivíricos que expresaban ARNhc para reprimir la FDPS (LV-FDPS), con ácido zoledrónico (Zol), con ácido zoledrónico más control lentivírico (Zol+LV-Control), o con ácido zoledrónico más vectores lentivíricos que expresaban ARNhc para reprimir la FDPS (Zol+LV-FDPS). Las células tratadas se mezclaron durante 4 horas con linfocitos T gamma delta a una proporción de 1:1. La producción de TNF-alfa por parte de los linfocitos T gamma delta se detectó mediante tinción intracelular y citometría de flujo.
Ensayo funcional de células tumorales modificadas con LV-FDPS y utilizadas para activar la destrucción de células tumorales por parte de los linfocitos T gamma delta humanos: Las células tumorales monocitoides (THP-1) se transdujeron con un vector de lentivirus que suprime el ARNm de FDPS, que después se usa para activar la citotoxicidad de las células tumorales en linfocitos T gamma delta humanos normales. Los linfocitos T gamma delta activados se recuperaron después de 4 horas de exposición a células THP-1 transducidas, que después se usaron en un ensayo de citotoxicidad para destruir las THP-1 no modificadas. Cuando los linfocitos T gamma delta se estimularon con una combinación de células THP-1 transducidas y ácido zoledrónico 10 micromolar, se observó una destrucción >70 % de THP-1 a una proporción de 4 linfocitos T gamma delta por 1 célula THP-1.
Datos experimentales de FDPS
En los experimentos descritos en el presente documento, se utilizaron las secuencias de ARNhc de FDPS que se representan en la Tabla 2. Además, las secuencias detalladas en la Tabla 2 pueden usarse en los vectores terapéuticos detallados en el presente documento.
Tabla 2. Secuencias de ARNhc de FDPS
Figure imgf000026_0001
Como se muestra en la figura 4A, se determinó el nivel de expresión relativa de la FDPS humana después de la administración de las cuatro secuencias de ARNhc de FDPS diferentes. La inhibición más significativa de la expresión de la FDPS humana se encontró en las muestras de FDPS-2 y FDPS-4 (como se muestra en el presente documento en la figura 4A).
Además, como se muestra en la figura 4B, se utilizó un sistema de suministro basado en lentivirus para dirigir la expresión de FDPS. Células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 se infectaron con vectores lentivíricos que contenían el promotor H1 y una secuencia de ARNhc de FDPS (SEQ ID NO: 4) o el promotor del EF-1alfa y las siguientes secuencias de FDPS basadas en miR30:
secuencia n° 1 de miR30 de FDPS:
AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACACTTTCTCAGCCTCCTTCTGCGTGAA
GCCACAGATGGCAGAAGGAGGCTGAGAAAGTGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCA
AGGGGCT (SEQ ID NO: 53)
secuencia n° 2 de miR30 de FDPS:
AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACACTTTCTCAGCCTCCTTCTGCGTGAA
GCCA CAG ATGGCAGAAGGGCTGAGAAAGTGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAG
GGGCT (SEQ ID NO: 54)
Después de 48 horas, se produjo la lisis celular y se realizó una inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-FDPS (Thermo Scientific) y anti-actina (Sigma) para un control de carga de proteínas. Como se muestra en la figura 4B, el tratamiento con el ARNhc de FDPS disminuyó significativamente la expresión de la proteína FDPS. El tratamiento con las secuencias de FDPS basadas en miR30 disminuyó la expresión de FDPS.
Como se muestra en la figura 5, las células cancerosas monocitoides (THP-1) (figura 5A) o hepatocelulares (HepG2) (figura 5B) transducidas con lentivirus que contenían ARNhc capaz de suprimir el ARNm de FDPS, activaron la expresión de citocinas en los linfocitos T gamma delta humanos.
Esta parte del ejemplo ilustra que la atenuación de FDPS en células de leucemia monocítica THP1 por ARNhc lentivírico (LV) que expresa FDPS (SEQ ID NO: 4; que también se denomina en el presente documento ARNhc LV-FDPS n.° 4), estimula la expresión de TNF-a en linfocitos T gamma delta, como se muestra en la figura 5A.
Células THP1 (1x105 células) se transdujeron durante 3 días con LV-control o ARNhc LV-FDPS n.° 4. Dos días después de la transducción, las células se trataron con o sin ácido zoledrónico 1 pM. Después de 24 horas, las células THP-1 transducidas se cocultivaron durante 4 horas con 5x105 células PBMC e IL-2 en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Las células PBMC (por las siglas del inglés, peripheral blood mononuclear cell, células mononucleares de sangre periférica) se preestimularon con ácido zoledrónico e IL-2 durante 11 días para expandir linfocitos T Vy9V52. Después de la tinción de Vy9V82 y TNF-a usando un anticuerpo anti TCR-V82 y anti-TNF-a conjugado con fluoróforo, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Se escogieron las células vivas y las células V82+ y TNF-a+ se seleccionaron en una transferencia puntual. Los linfocitos T citotóxicos Vy9V82 activados aparecieron en el cuadrante superior derecho de los citogramas de flujo. Sin ácido zoledrónico, el LV-control estimuló un 3,11 % de linfocitos T Vy9V52 que expresaban TNF-a y el ARNhc LV-FDPS n.° 4 estimuló un 5 %. Con tratamiento de ácido zoledrónico, el control lV estimuló un 7,2 % de linfocitos T Vy9V82 que expresaban TNF-a y el ARNhc LV-FDPS n.° 4 estimuló un 56,17 %.
Se usaron las mismas condiciones con células HepG2 y se generaron los siguientes datos. Sin ácido zoledrónico, el control LV estimuló un 2,5 % de linfocitos T Vy9V82 que expresaban TNF-a y el ARNhc LV-FDPS n.° 4 estimuló un 3,33 %. Con tratamiento de ácido zoledrónico, el LV-control estimuló un 9,1 % de linfocitos T Vy9V82 que expresaban TNF-a y el ARNhc LV-FDPS n.° 4 estimuló un 45,7 %.
Además, como se muestra en la figura 6, las células tumorales monocitoides (THP-1) transducidas con lentivirus capaces de suprimir el ARNm de FDPS activan la citotoxicidad de las células tumorales en linfocitos T gamma delta humanos normales.
Esta parte del ejemplo demuestra los resultados de mezclar células tumorales monocitoides THP-1 tratadas con linfocitos T GD humanos cultivados, como se muestra en la figura 6.
La línea celular monocitoide THP-1 se trató con el vector de control lentivírico (LV), con LV que suprime la expresión del gen de la farnesil difosfato sintasa (LV-FDPS), con ácido zoledrónico (Zol) o con combinaciones. La leyenda mostrada en la figura 6 es: vectores lentivíricos de control (LV-Control), vectores lentivíricos que expresan microARN para reprimir la FDPS (LV-FDPS), Zometa (Zol), Zometa más control lentivírico (Zol+LV-Control), o Zometa más vectores lentivíricos que expresan microARN para reprimir la FDPS (Zol+LV-FDPS).
Se cultivaron linfocitos T GD humanos de un donante anónimo y se añadieron a células THP-1 tratadas durante 4 horas a proporciones (GD T:THP-1) de 4:1, 2:1 o 1:1. La destrucción celular se midió mediante un ensayo de fluorescencia. Cuando las células THP-1 se trataron con una combinación de LV-FDPS y Zol, la destrucción de linfocitos T citotóxicos por parte de los linfocitos T GD aumentó enormemente en comparación con cualquiera de los tratamientos solos. Cuando el tratamiento con LV-FDPS solo se comparó con el tratamiento con Zol solo, el LV-FDPS condujo a una mayor destrucción, pero fue >3 veces inferior a la destrucción de células tumorales después del tratamiento combinado. El tratamiento combinado de LV-FDPS más Zol causó casi un 70 % de destrucción de células tumorales con una proporción de 4:1; esto fue más de 3 veces mayor que el segundo mejor tratamiento (LV-FDPS solo).
Ejemplo 4. Materiales y Métodos de CD47
Selección de ARN inhibidor: Para buscar posibles candidatos a ARNip o ARNhc capaces de reducir los niveles de CD47 en células humanas, se utilizó la secuencia de ARNm de la molécula c D47 (CD47) de Homo sapiens (NM_001777). Las posibles secuencias de interferencia de ARN se eligieron entre candidatas seleccionadas por los programas de diseño de ARNsi o ARNhc, como los del Broad Institute o BLOCK-iT™ RNAi Designer de Thermo Scientific. Inicialmente, para regular la expresión de ARNhc, secuencias de ARNhc individuales seleccionadas se insertaron en vectores lentivíricos inmediatamente en 3' a un promotor de ARN polimerasa III, tal como HI, U6 o 7SK. Estas construcciones de ARNhc-lentivirus se usaron para transducir células y medir el cambio de los niveles específicos de ARNm. El ARNhc más fuerte para reducir los niveles de ARNm se incorporó individualmente en una cadena principal de microARN para permitir la expresión por parte de los promotores de ARN polimerasa II del EF-1alfa o del CMV. También se sintetizaron secuencias de ARN como oligonucleótidos de ARNip sintéticos y se introdujeron directamente en las células sin usar ningún vector lentivírico.
Construcciones vectoriales: Para el ARNhc de CD47, en Eurofins MWG Operon, LLC, se sintetizaron secuencias de oligonucleótidos que contenían sitios de restricción BamHI y EcoRI. Las secuencias de oligonucleótidos de sentido y de antisentido solapantes, se mezclaron y se hibridaron durante la incubación a 70 grados centígrados antes de enfriarse a temperatura ambiente y con ADN polimerasa se extendieron los extremos no emparejados antes de enfriar a temperatura ambiente. La reacción de extensión creó secuencias bicatenarias en cada extremo del oligonucleótido que contenían sitios de enzimas de restricción BamHI y EcoRI. Los oligonucleótidos bicatenarios se digirieron con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI durante una hora a 37 grados centígrados y las enzimas se termoinactivaron a 70 grados centígrados durante 20 minutos. En paralelo, el vector lentivírico se digirió con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI durante una hora a 37 grados centígrados. El vector lentivírico digerido se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se extrajo del gel usando un kit de extracción de ADN en gel de Invitrogen. Se determinaron las concentraciones de ADN y se mezclaron el vector y el oligo (proporción 3:1), se permitió la hibridación y el ligamiento. La reacción de ligamiento se realizó con ADN ligasa de T4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. A 25 microlitros de células bacterianas competentes STBL3, se añadieron 2,5 microlitros de la mezcla de ligamiento. La transformación se logró después de un choque térmico a 42 grados centígrados. Las células bacterianas se diseminaron en placas de agar que contenían ampicilina y las colonias resistentes a fármaco (que indicaban la presencia de plásmidos resistentes a ampicilina) se recuperaron, se purificaron y expandieron en caldo LB. Para comprobar la inserción de las oligosecuencias, el ADN plasmídico se extrajo de cultivos de bacterias recogidas con el kit mini prep de ADN de Invitrogen. La inserción de la secuencia de ARNhc en el vector lentivírico se verificó mediante secuenciación de ADN utilizando un cebador específico para el promotor utilizado para regular la expresión de shRNA.
Ensayo funcional: El efecto de diferentes secuencias que se dirigen al ARNhc de CD47 sobre la expresión de CD47, se determinó midiendo la expresión de ARNm. Con un vector lentivírico que contenía secuencias de ARNhc de CD47, se transdujeron células de carcinoma hepatocelular Hep3B. Después de 48 horas, se produjo la lisis celular y el ARN se extrajo utilizando el mini kit RNeasy de Qiagen. A continuación, se sintetizó ADNc a partir de ARN utilizando SuperScript VILO de Invitrogen. Después, las muestras se analizaron mediante RT-PCR cuantitativa utilizando un termociclador StepOne de Applied Biosystems. La expresión de CD47 se detectó con SYBR Green de Invitrogen usando el cebador directo (5-CACTGTCGTCATTCCATGCT-3') (SEQ ID NO: 63) y el cebador inverso (5'-GCCTCTTGACATTCTCCTC-3') (SEQ ID NO: 64). Las muestras se normalizaron midiendo la expresión de actina utilizando el cebador directo (5'-AGCGCGGCTACAGCTTCA-3') (SEQ ID NO: 61) y el cebador inverso (5'-AAAGTCAGTGGGGACAGTGG-3') (SEQ ID NO: 65). La expresión relativa de CD47 se determinó por su valor de Ct normalizado al nivel de actina de cada muestra.
Datos experimentales de CD47
En los experimentos descritos en el presente documento, se utilizaron los ejemplos no limitativos de secuencias diana de ARNhc de CD47 que se representan en la Tabla 3. Además, las secuencias detalladas en la Tabla 3 pueden usarse en los vectores terapéuticos detallados en el presente documento.
Tabla 3. Secuencias de ARNhc de CD47
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Como se muestra en la figura 7A, el nivel de expresión relativa de CD47 humano se determinó después de la administración de las cuatro secuencias de ARNhc de CD47 diferentes. La inhibición más significativa de la expresión de CD47 humano se encontró en las muestras de shCD47-1 y shCD47-3 (como se muestra en el presente documento en la figura 7A).
Además, como se muestra en la figura 7B, se usó un sistema de suministro basado en lentivirus para dirigir la expresión de CD47. Células de carcinoma hepatocelular humano SNU449 se infectaron con vectores lentivíricos que contenían las siguientes secuencias de CD47 basadas en miR155:
secuencia diana n° 1 de miR155 de CD47:
CCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGTTATCCATCTTCAAAGAGGCAGTTTT
GGCCACTGA CTG ACTGCCTCTTAA GATGGA TAA CA GG ACA CA AG GCCTGTTACTA
GCACTCA (SEQ ID NO: 82)
secuencia diana n° 2 de miR155 de CD47:
CCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGTTAGCTCGATGATCGTTTCACGTTTTG
GCCACTGACTGACGTGAAACGCATCGAGCTAACAGGACACAAGGCCTGTTACTA
GCACTCA (SEQ ID NO: 66)
secuencia diana n° 3 de miR155 de CD47:
CC TG G A G G C TTG C TG A A G G CTG TA TG C TG A A G A A TG G C TCC A A CA A TG A CG TTTT
G G CCA CTG A CTG A CG TCA TTG TG A G CC A TTCTTC A G G A C A C A A G G C CTG TTA CTA
G CA CTCA (SEQ ID NO: 67)
secuencia diana n° 4 de miR155 de CD47:
CCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGTATACACGCCGCAATACAGAGGTTTT
GGCCACTGACTG ACCTCTG TA TCG GCG TGTATA CAG GA CA CAA GG CCTGTTA CTA
GCACTCA (SEQ ID NO: 68)
Como se muestra en la figura 7B, el tratamiento con el ARNhc de CD47 disminuyó significativamente la expresión de la proteína FDPS. El tratamiento con las secuencias de CD47 basadas en miR155 disminuyó significativamente la expresión de CD47.
Ejemplo 5. Materiales y métodos de cMyc
Diseño de ARN inhibidor: Para atenuar la expresión de MYC en líneas de células hepatocelulares, la secuencia de ARNm del homólogo del oncogén del virus de la mielocitomatosis (MYC) aviar v-myc de Homo sapiens (NM_002467.4), se utilizó para detectar posibles candidatos a ARNhc. Se obtuvieron cinco secuencias de ARNhc de MYC que podían reducir la expresión de MYC. Las posibles secuencias de interferencia de ARN se eligieron entre candidatas seleccionadas por los programas de diseño de ARNsi o ARNhc, como los del Broad Institute o BLOCK-iT™ RNAi Designer de Thermo Scientific. Para regular la expresión de ARNhc, puede insertarse una secuencia de ARNhc en un vector lentivírico después de un promotor de ARN polimerasa III, tal como HI, U6 o 7SK. La secuencia de ARN también se puede incorporar en una cadena principal de microARN para permitir la expresión por parte de un promotor de ARN polimerasa II, tal como CMV o EF-1 alfa. La secuencia de ARN también puede sintetizarse como un oligonucleótido de ARNip y utilizarse independientemente de un vector lentivírico.
Construcciones vectoriales: Para el ARNhc de cMyc, en MWG operon, se sintetizaron secuencias de oligonucleótidos que contenían sitios de restricción BamHI y EcoRI. Las secuencias de oligonucleótidos se hibridaron mediante incubación a 70 grados centígrados y enfriamiento a temperatura ambiente. Los oligonucleótidos hibridados se digirieron con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI durante una hora a 37 grados centígrados y después las enzimas se termoinactivaron a 70 grados centígrados durante 20 minutos. En paralelo, el vector lentivírico se digirió con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI durante una hora a 37 grados centígrados. El vector lentivírico digerido se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se extrajo del gel usando un kit de extracción de ADN en gel de Invitrogen. Se determinó la concentración de ADN y se ligó la secuencia de vector a oligo en la proporción de inserto a vector de 3:1. La reacción de ligamiento se llevó a cabo con ADN ligasa de T4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. A 25 microlitros de células bacterianas competentes STBL3, se añadieron 2,5 microlitros de la mezcla de ligamiento. La transformación se llevó a cabo por choque térmico a 42 grados centígrados. Las células bacterianas se sembraron en placas de agar que contenían ampicilina y después las colonias se expandieron en caldo LB. Para comprobar la inserción de las oligosecuencias, el ADN plasmídico se extrajo de cultivos de bacterias recogidas con el kit mini prep de ADN de Invitrogen. La inserción de la secuencia de ARNhc en el vector lentivírico se verificó mediante secuenciación de ADN utilizando un cebador específico para el que se utiliza cada promotor para regular la expresión del ARNhc. Después, los vectores lentivíricos que contenían una secuencia cMyc correcta, se usaron para empaquetar partículas lentivíricas para probar su capacidad para atenuar la FDPS. Se transdujeron células de mamífero con partículas lentivíricas en presencia o ausencia de polibreno. Las células se recogieron después de 2-4 días y se analizó la proteína y el ARN para determinar la expresión de cMyc.
Ensayo funcional: El efecto de diferentes secuencias que se dirigen al ARNhc de cMyc sobre la expresión de cMyc, se determinó midiendo la expresión de ARNm. Con un vector lentivírico que contenía secuencias de ARNhc de cMyc, se transdujeron células de carcinoma hepatocelular HepG2. Después de 48 horas, se produjo la lisis celular y el ARN se extrajo utilizando el mini kit RNeasy de Qiagen. A continuación, se sintetizó ADNc a partir de ARN utilizando SuperScript VILO de Invitrogen. Después, las muestras se analizaron mediante PCR cuantitativa utilizando un termociclador StepOne de Applied Biosystems. La expresión de cMyc se detectó con SYBR Green de Invitrogen usando el cebador directo (5'-GGACTATCCTGCt Gc CAA-3') (s Eq ID NO: 69) y el cebador inverso (5'-GCCTCTTGACATTCTCCTC-3') (SEQ ID NO: 64). Las muestras se normalizaron midiendo la expresión de actina utilizando el cebador directo (5'-AGCGCGGCTACAGCTTCA-3') (SEQ ID NO: 61) y el cebador inverso (5'-GGCGACGTAGCACAGCTTCT-3') (SEQ ID NO: 62). La expresión relativa de cMyc se determinó por su valor de Ct normalizado al nivel de actina de cada muestra.
Datos experimentales de cMyc
En los experimentos descritos en el presente documento, se utilizaron los ejemplos no limitativos de secuencias de ARNhc de cMyc que se representan en la tabla 4.
Tabla 4. Secuencias de ARNhc de cM c
Figure imgf000030_0002
Como se muestra en la figura 8A, se determinó el nivel de expresión relativa de cMyc humano después de la administración de las cinco secuencias de ARNhc de cMyc diferentes. La inhibición más significativa de la expresión de cMyc humano se encontró en la muestra de myc-2 (como se muestra en el presente documento en la figura 8A). Además, como se muestra en la figura 8B, células de carcinoma hepatocelular humano SNU449 se infectaron con vectores lentivíricos que contenían las siguientes secuencias de cMYC basadas en miR o en un ARNhc de cMyc: secuencia de miR155 de cMyc:
CCTGG AG GCTTGCTGA A G G CTG TA TG CTG TG TTCG CCTCTTG A CA TTCTCTTTTG G
CC A C TG A CTG A G A G A ATG TAG AG GCGAA CA CA GGA CA CA AGG CCTGTTACTAGC
A CTCA (SEQ ID NO: 70)
secuencia de miR21 de cMyc:
Figure imgf000030_0001
Las dos secuencias de cMyc anteriores se generaron utilizando la siguiente secuencia diana:
secuencia diana de cMyc:
GAGAATGTCAAGAGGCGMCA (SEQ ID NO: 71)
secuencia de ARNhc de cMyc:
Después de 48 horas, se produjo la lisis celular y se realizó una inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-cMyc (Santa Cruz) y anti-actina (Sigma) para un control de carga de proteínas. Como se muestra en la figura 8B, el tratamiento con el ARNhc de cMyc disminuyó significativamente la expresión de la proteína cMyc. El tratamiento con las secuencias de cMyc basadas en miR también disminuyó la expresión de cMyc.
Ejemplo 6. Tratamiento in vivo con ARNhc de FDPS y ácido zoledrónico
Descripción general del protocolo para la coadministración de LV-ARNhc-FDPS (farnesil difosfato sintasa) con o sin ácido zoledrónico en ratones a los que se implantó la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Se cultivaron células tumorales in vitro, después se transdujeron con control de vector lentivírico con un inserto de ARNhc de secuencia desordenada (no funcional) y un casete de expresión de luciferasa de luciérnaga, o con LV-FDPS con un ARNhc capaz de reducir la expresión de ARNm de FDPS y un casete de expresión de luciferasa de luciérnaga. Las células tumorales transducidas se implantaron en el costado de ratones inmunodeficientes mediante inyección subcutánea. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 200 mm3, todos los ratones recibieron una sola dosis de ácido zoledrónico (100 microgramos por kilogramo de peso corporal, que es similar a una dosis humana estándar) en solución salina. Siete (7) días después de la inyección de ácido zoledrónico, se repitió un estudio de imágenes para medir el volumen y la intensidad fotónica de los tumores individuales.
En la figura 9, se muestra esquemáticamente el vector LV-FDPS diseñado, desarrollado y utilizado en este ejemplo. El vector LV-FDPS se desarrolló usando los métodos y materiales descritos en el presente documento. Se utilizaron las siguientes secuencias y, como se describe más adelante, se generó una secuencia CMV GFP T2A luciferasa y se introdujo en el vector terapéutico.
Secuencia promotora del CMV:
ATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT
ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGT
GGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATG
GGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTC
CGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAG
CAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTT
(SEQ ID NO: 72)
secuencia GFP T2A Luciferasa:
ATGCCCGCCATGAAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAG TTCGAGCTGGTGGGCGGCGGAGAGGGCACCCCCGAGCAGGGCCGCATGACCAAC AAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCAC GTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACC CCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACACCAACACCCGCATCGAGAAGT ACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCC GCGTGATCGGCGACTTCAAGGTGGTGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGA TCTTCACCGACAAGATCATCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGCACCCCAT GGGCGATAACGTGCTGGTGGGCAGCTTCGCCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGG CGGCTACTACAGCTTCGTGGTGGACAGCCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCAC CCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAG CTGCACAGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACC CCCATCGCCTTCGCCAGATCTCGAGATATCAGCCATGGCTTCCCGCCGGCGGTGG CGGCGCAGGATGATGGCACGCTGCCCATGTCTTGTGCCCAGGAGAGCGGGATGG ACCGTCACCCTGCAGCCTGTGCTTCTGCTAGGATCAATGTGACCGGTGAGGGCAG AGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTTCCGGTAT GGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTAGAGGA TGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCC TGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGA ATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAAT ACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGG
TGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAA
TGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTT
TCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATC
C AGAAAATT ATT AT C AT GGATTCT AAAACGGATT AC C AGGGATTT C AGTCGAT GT
ACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCA
GAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAACTCCTCTGGATCTA
CTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTC
GCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTA
AGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGAT
ATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGA
TCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATT
CTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATT
GCTTCTGGGGGCGC ACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGA AGCGGTT GC AAAAC GC
TTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTA
TTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCC
ATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAAT
CAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACA
ATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAG
ACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTC
TTT AATT AAAT AC AAAGGAT ACC AGGT GGCCCCCGCTGAATT GGAGTCGAT ATT G
TTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACG
CCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGA
AAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCG
CGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGA
CGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTCCA
AATTGTAA (SEQ ID NO: 73)
secuencia promotora de HI:
GAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGG
C GGGA AC ACC C AGC GCGC GT GC GCC CTGGC AGGA AGAT GGC T GT GAGGGAC AGG
GGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATA
AACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTT
(SEQ ID NO: 15)
Construcción LVFDPS GFP T2A Luc:
El plásmido pGF-1 (System Biosciences) que contenía la secuencia CMV GFP T2A luciferasa, se digirió con Clal y KPN1 y el plásmido LV-H1-FDPShc se digirió con las enzimas de restricción BstBI y KpnI (NEB). El ADN se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y los fragmentos de ADN se extrajeron con un kit de extracción de ADN en gel (Thermo Scientific). Los dos fragmentos se ligaron con ADN ligasa de T4 (NEB) y se transformaron en bacterias STBL3 (Thermo Scientific). El ADN plasmídico se extrajo de bacterias con un kit min prep de ADN plasmídico (Thermo Scientific) y la secuencia se verificó mediante secuenciación de ADN (Eurofins Genomics).
Protocolo experimental detallado:
Día -19: En un matraz de 175 ml se cultiva hasta alcanzar la confluencia y se producen 1,87 x 107 ml de células PC3; en un matraz de 75 ml se cultiva hasta alcanzar la confluencia y se producen 7,5 x 106 ml de células PC3.
Día -7: Las células PC3se descongelan y se cultivan
Día -4: Preparación y Suministro de Material. Se prepara un control de vector lentivírico y las células PC3 se transducen con ARNhc de FDPS lentivírico.
1. En un matraz de 75 ml, a células PC3 con una confluencia del 50 % se añaden 12 pl de lenti-control 8 pl de polibreno, se incuba durante 5 min. y después se mezcla con 4 ml de RPMI-10 y se cubre la superficie de células PC3.
2. En un matraz de 75 ml, a células PC3 con una confluencia del 50 % se añaden 20 pl de lenti-FDPS 8 pl de polibreno, se incuba durante 5 min. y después se mezcla con 4 ml de RPMI-10 y se cubre la superficie de las células PC3.
3. Las células transducidas se incuban a 37 °C durante 8 horas. Se añaden 6 ml de RPMI-10 y se cultiva durante la noche.
Día -2: 75 ml de células PC3 transducidas (confluencia de 7,5 x 106 células) se exponen a tripsina y se transfieren a un matraz de 175 ml.
Día 0: Preparación y suministro del material
1. Las células PC3 transducidas con lenti-vector y lenti-FDPS con una confluencia del 80 % se transducen por separado y se realiza un recuento celular.
lenti-vector: 1,5 x 108 células (50 x 3 x 106/5 ml) matraz 15
lenti-FDPS: 1,5 x 108 células (50 x 3 x 106/5 ml) matraz 20
2. Las células PC3 transducidas con lenti-vector y lenti-FDPS se resuspenden en RPMI sin FBS, se prepara la concentración final en 3 x 106 células/100 pl
Material: I) 5 ml de células PC3-Lenti-vector (total 150 x 106 células) en RPMI sin FBS; II) 5 ml de células PC3-Lenti-FDPS (total 150 x 106 células) en RPMI sin FBS.
Día 0: Inyección subcutánea de células PC3. Grupo I (2 ratones NOD/SCID): por vía subcutánea, 0,15 ml de células PC3-Lenti-vector (0,1 ml de 3 x 106 Lenti-vector en RPMI sin FBS 0,05 ml de Matrigel) se inoculan en el costado derecho o izquierdo de los ratones (un total de 5 ml es suficiente para 50 ratones). Grupo II (3 ratones NOD/SCID): por vía subcutánea, 0,15 ml de PC3-Lenti-FDPS KD (0,1 ml de 3 x 106 Lenti-vector en Dm e M sin FBS 0,05 ml de Matrigel) se inoculan en el costado derecho o izquierdo de los ratones (un total de 5 ml es suficiente para 50 ratones).
Día 8: Vigilancia tumoral. Los primeros días después de la implantación el tumor es palpable. El tamaño del tumor se determina midiendo los diámetros perpendiculares del mismo con calibradores. El tamaño tumoral se calcula a través de la siguiente medición: Volumen tumoral (mm3) = d2 (d= diámetro más corto) x D/2 (D= diámetro más largo). Como una medida de la expresión de lentivirus del gen de luciferasa de luciérnaga, se realizan imágenes de bioluminiscencia para demostrar la ubicación, el tamaño y la intensidad fotónica del tumor.
Día 14: Cuando el tamaño del tumor alcanza un tamaño de 200~300 mm3, se realiza una inyección intraperitoneal de 100 pg/ml de ácido zoledrónico (Zol) o PBS a los ratones.
Día 22: Para medir el tamaño del tumor se lleva a cabo un estudio de obtención de imágenes.
Efectos de LV-ARNhc-FDPS con o sin ácido zoledrónico sobre el crecimiento tumoral de PC3 en ratones NOD/SCID. Los ratones se designaron Scr (para el control de vector desordenado) o KO para el LV-ARNhc-FDPS. Todos los LV utilizados en este estudio expresan el marcador de bioluminiscencia luciferasa de luciérnaga que permite la visualización directa de las células transducidas y su crecimiento. Un estudio de obtención de imágenes de bioluminiscencia el día 8, determinó el tamaño promedio de los tumores antes del tratamiento con ácido zoledrónico (figura 10A). La intensidad fotónica de los tumores se midió con un sistema de captura de luz CCD. El tamaño promedio del tumor de los animales Scr, fue ligeramente mayor que el encontrado en los animales KO (figura 10B) pero las diferencias no fueron significativas.
El estudio de obtención de imágenes se repitió 6 días después del tratamiento con ácido zoledrónico (todos los animales recibieron ácido zoledrónico por inyección intraperitoneal). El tamaño y la ubicación del tumor de los animales Scr (figura 10C) fueron similares a los de las observaciones anteriores, pero hubo diferencias notables en el tamaño del tumor en los animales del grupo KO. El volumen del tumor se redujo bruscamente en KOn.° 1 y KOn.° 3 mientras que en KOn.° 2 el tumor desapareció. La comparación de las intensidades fotónicas promedio en los grupos Scr y KO (figura 10D) reveló una diferencia sustancial, observándose un mayor cambio en el grupo KO.
Estos datos muestran que LV-ARNhc-FDPS tiene un impacto pequeño, pero detectable, en el crecimiento de tumores PC3 en ratones NOD/SCID. Cuando se combinó con una sola dosis de ácido zoledrónico, el efecto se magnificó y en un caso se logró la erradicación de las células transducidas con LV-ARNhc-FDPS. Por tanto, las células transducidas emisoras de luz, disminuyeron con el ácido zoledrónico solo si el LV expresaba un ARNhc-FDPS. La reducción de la masa tumoral no fue atribuible al tratamiento con ácido zoledrónico porque los animales con tumores transducidos con LV de control desordenado apenas mostraron cambios o no mostraron ningún cambio en la masa tumoral después del tratamiento con ácido zoledrónico.
La clave de la reducción del tumor fue el efecto combinado de LV-ARNhc-FDPS, que reduce los niveles de expresión de la enzima FDPS, y del ácido zoledrónico, que inhibe cualquier actividad residual de FDPS. Como se esperaba, el ácido zoledrónico no era tóxico para los ratones y no tenía efectos aparentes distintos de la reducción de la masa tumoral cuando se combinaba con LV-ARNhc-FDpS. El ácido zoledrónico es un tratamiento seguro y eficaz en seres humanos cuando se administra en dosis altas en embolada o como terapia prolongada para los trastornos de desmineralización ósea, incluida la osteoporosis.
La divulgación de las realizaciones de ejemplo pretende ser ilustrativa, aunque no de forma limitativa, del alcance de la invención, que se exponen en las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes. Aunque las realizaciones de ejemplo de las invenciones se han descrito con cierto detalle a efectos de claridad de comprensión, será evidente que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. En las siguientes reivindicaciones, los elementos y/o las etapas no implican ningún orden de operación particular, a menos que se indique explícitamente en las reivindicaciones o se requiera implícitamente en la divulgación.
Secuencias
En el presente documento se hace referencia a las siguientes secuencias:
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Aunque algunas de las realizaciones preferidas de la presente invención se han descrito e ilustrado específicamente con anterioridad, no se pretende que dichas realizaciones limiten la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un vector vírico que comprende una parte de carga terapéutica, en donde la parte de carga terapéutica comprende una primera secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a al menos una secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde al menos una secuencia de ARNm complementaria comprende una secuencia de ARNm de farnesil difosfato sintasa (FDPS), y en donde la primera secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de FDPS; y
una segunda secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a una segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde la segunda secuencia de ARNm complementaria predeterminada comprende una secuencia de ARNm de CD47 o una secuencia de ARNm de cMyc, y en donde la segunda secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de CD47 o cMyc.
2. El vector vírico de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un primer promotor, y la segunda secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un segundo promotor.
3. El vector vírico de la reivindicación 1, en donde la parte de carga terapéutica comprende además una tercera secuencia de ARN pequeño que es capaz de unirse a una tercera secuencia de ARNm complementaria predeterminada, en donde la tercera secuencia de ARNm complementaria predeterminada comprende una secuencia de ARNm de CD47 o una secuencia de ARNm de cMyc, y en donde la tercera secuencia de ARN pequeño es capaz de inhibir la expresión de CD47 o cMyc.
4. El vector vírico de la reivindicación 3, en donde la tercera secuencia de ARN pequeño está bajo el control de un tercer promotor.
5. El vector vírico de la reivindicación 3, en donde las secuencias de ARN pequeño están bajo el control de un solo promotor.
6. El vector vírico de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de ARN pequeño comprende un miARN o un ARNhc.
7. El vector vírico de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80 %, o de al menos 85 %, o de al menos 90 %, o de al menos 95 % o de 100 con una secuencia de ARN pequeño de FDPS de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
8. El vector vírico de la reivindicación 1, en donde la segunda secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de al menos 80 %, o de al menos 85 %, o de al menos 90 %, o de al menos 95 % o de 100 con:
una secuencia de ARN pequeño de CD47 de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 o 9; o
una secuencia de ARN pequeño de cMyc de SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13 o 14.
9. El vector vírico de la reivindicación 3, en donde la tercera secuencia de ARN pequeño comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad al menos 80 %, o de al menos 85 %, o de al menos 90 %, o de al menos 95 % o de 100 con una secuencia de ARN pequeño de CD47 de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 o 9 o una secuencia de ARN pequeño de cMyc de las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13 o 14.
10. El vector vírico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el vector vírico es un vector lentivírico.
11. Una partícula lentivírica capaz de infectar una célula diana, comprendiendo la partícula lentivírica:
a. una proteína de envoltura optimizada para infectar la célula diana; y
b. el vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. Una composición que comprende:
a. la partícula lentivírica de acuerdo con la reivindicación 11; y
b. un fármaco de aminobisfosfonato.
13. La composición de la reivindicación 12, en donde el fármaco de aminobisfosfonato es ácido zoledrónico.
14. La composición de la reivindicación 12 o 13 para su uso en el tratamiento del cáncer.
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