ES2780192T3

ES2780192T3 - Folato receptor alfa como marcador diagnóstico y de pronóstico para cánceres que expresan folato receptor alfa

Info

Publication number: ES2780192T3
Application number: ES16186634T
Authority: ES
Inventors: Daniel J O'shannessy; Luigi Grasso; Shanhong Wan; Qimin Chao; Elizabeth Brooke Somers
Original assignee: Eisai Inc
Current assignee: Eisai Inc
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2020-08-24
Anticipated expiration: 2031-11-04
Also published as: JP2013544354A; MX2013005067A; RU2764592C2; AU2018201760A1; WO2012061759A2; EP2635304B1; AU2016203408A1; BR112013011072A2; IL225871A0; JP2018036270A; SG10201701933XA; US20120207771A1; WO2012061759A3; AU2011323124A1; JP6224456B2; ES2627061T3; EP3130605B1; EP3130605A1; AU2011323124B2; JP6554152B2

Abstract

Un método para evaluar si un sujeto padece cáncer de ovario, comprendiendo el método determinar el nivel de receptor de folato alfa (FRα) que no está unido a una célula, en una muestra de suero o plasma derivada de dicho sujeto realizando un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) o un inmunoensayo enzimático (EIA); y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRα) que no está unido a una célula con el nivel de FRα en una muestra de control, identificar un aumento en el nivel de FRα en la muestra de suero o plasma derivada de dicho sujeto en comparación con el nivel de FRα en la muestra de control; y determinar que el sujeto padece cáncer de ovario en base a dicho aumento.

Description

DESCRIPCIÓN

Folato receptor alfa como marcador diagnóstico y de pronóstico para cánceres que expresan folato receptor alfa Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud provisional de EE.UU. N° 61/410.497, presentada el 5 de noviembre de 2010 y la solicitud provisional de EE.UU. n° 61/508.444, presentada el 15 de julio, 2011.

Antecedentes de la invención

En los seres humanos, el receptor de alta afinidad para el folato aparece en tres isoformas: alfa, beta y gamma. Las formas alfa y beta típicamente se encuentran unidas a las membranas de las células mediante un anclaje de fosfatidilinositol de glicosilo (GPI). Se reciclan entre compartimentos extracelulares y endocíticos y son capaces de transportar el folato al interior de la célula. Las formas solubles de FRa se pueden derivar por la acción de proteasas o fosfolipasa en los receptores de folato anclados a membranas.

El receptor de folato alfa (también referido como FRa , FR-alfa, FOLR-1 o FOLR1) se expresa en una variedad de tejidos epiteliales, que incluyen los del plexo coroideo, pulmón, tiroides, riñón, útero, mama, trompa de Falopio, epidídimo, y las glándulas salivales. Weitman, SD et al. Cáncer Res 52: 3396-3401 (1992); Weitman S.D. et al., Cáncer Res 52: 6708-6711. La sobreexpresión de FRa se ha observado en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón (p.ej. carcinomas bronquioalveolares, tumores carcinoides, y cánceres de pulmón de célula no pequeña, tales como adenocarcinomas); mesotelioma; cáncer de ovario; cáncer renal; cáncer de cerebro (p.ej., ependimoma anaplásico, astrocitoma pilocítico juvenil cerebeloso, y metástasis cerebrales); cáncer de cuello uterino; cáncer nasofaríngeo; tumor derivado mesodérmicamente; carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer endometrial; adenocarcinomas endometrioides del ovario, cistoadenocarcinomas serosos, cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de páncreas; cáncer de hueso (p.ej., osteosarcoma de alto grado); cáncer de pituitaria (p.ej., adenomas de la pituitaria); cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular. Véase, p.ej., la Patente de EE.UU. N27.754.698; la Solicitud de Patente de EE.UU. N22005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121 (2): 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Fisher R.E. J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95-(1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15 (3): 889-899; Parker N. et al. Analytical Biochemistry, 338: 284-293 (2005); Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba NF et al. Head Neck, 31 (4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). En algunos tipos de cánceres (p.ej., carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), se asocia un mayor nivel de expresión FRa con un peor pronóstico, mientras que en otros tipos de cánceres (p.ej., cáncer de pulmón de célula no pequeña), un mayor nivel de expresión FRa se asocia con un mejor pronóstico. Véase, p.ej., Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15 (3): 889-899; Saba NF et al. Head Neck, 31 (4): 475-481 (2009).

Montovani et al. 1994 evalúa la distribución del receptor de folato alfa en fluidos biológicos, concluyendo en última instancia que no hay diferencia estadísticamente significativa en el nivel de receptor de folato alfa en la orina de sujetos con cáncer de ovario en comparación con el de sujetos sanos.

La detección temprana del cáncer mejora las tasas de supervivencia y la calidad de vida. Para mejorar la probabilidad de detección y tratamiento tempranos, existe una necesidad apremiante de métodos no invasivos para el diagnóstico de cáncer, para la determinación del nivel de riesgo de desarrollar cáncer, y para predecir la progresión del cáncer. La presente invención satisface estas necesidades de cánceres que expresan FRa.

Compendio de la invención

La presente invención queda definida por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier materia objeto identificada en la solicitud como "invención", "realización", "aspecto", etc., que excede el alcance de la invención tal como se representa a través de las reivindicaciones, no forma parte de la invención reivindicada, sino que sirve meramente como información adicional para comprender mejor la invención.

La presente invención proporciona métodos para evaluar si un sujeto está afectado por cánceres que expresan FRa como el cáncer de pulmón o de ovario, métodos para evaluar la progresión de cánceres que expresan FRa como el de cáncer de pulmón o de ovario en un sujeto afectado por cánceres que expresan FRa, métodos para clasificar a un sujeto con cáncer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia del cáncer, métodos para evaluar la eficacia del tratamiento con MORAb-003 de cáncer de ovario o cáncer de pulmón, y kits para evaluar si un sujeto está afectado por cánceres que expresan FRa tales como cáncer de pulmón o de ovario, o para evaluar la progresión de cánceres que expresan FRa como el cáncer de pulmón o de ovario en un sujeto.

Métodos para evaluar si un sujeto está afectado por un cáncer que expresa FRa

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para evaluar si un sujeto está afectado por un cáncer que expresa FRa, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece un cáncer que expresa FRa; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une a FRa. En una realización particular, la muestra es orina, suero, plasma o ascitis.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para evaluar si un sujeto está afectado con un cáncer que expresa FRa, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula de una muestra de orina derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece un cáncer que expresa FRa. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para evaluar si un sujeto padece un cáncer que expresa FRa, determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de suero derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece un cáncer que expresa FRa.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, el cáncer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de cuello de útero, cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de hueso, cáncer de pituitaria, cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular. En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otra realización, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón no microcítico, tal como un adenocarcinoma.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a métodos para evaluar si un sujeto padece cáncer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto, donde la presencia de FRa que no está unido a una célula en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9100 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario. En varios aspectos de los anteriores aspectos de la invención, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9500 pg/ml, de aproximadamente 10.000 pg/ml, de aproximadamente 11.000 pg/ml, aproximadamente 12.000 pg/ml, aproximadamente 13.000 pg/ml, aproximadamente 14.000 pg/ml, aproximadamente 15.000 pg/ml, aproximadamente 16.000 pg/ml, aproximadamente 17.000 pg/ml, aproximadamente 18.000 pg/ml, aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente 20.000 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario.

En varios aspectos, el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(m) un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) como CDRL2 y SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) como CDRL3;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(p) un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) como CDRL3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(s) un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) como CDRL3;

(t) el anticuerpo 24F12;

(u) un anticuerpo que comprende una cadena ligera de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);

(v) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);

(w) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);

(x) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); y

(y) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).

En una realización particular, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003. En otra realización, el anticuerpo incluye S^eQ ID NO: 1 (GFTFS^gY^{g l}S) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realización, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En aún otra realización, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18. En otra realización adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (S^eQ ID NO: 13); ^lK26H^uVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinación, el anticuerpo incluye una cadena pesada de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la región variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID nO: 21) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); la cadena pesada de la región variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la cadena ligera de la región variable de LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); o la región variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

En una realización particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado en un soporte sólido y marcado como anticuerpo MORAb-003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte sólido y marcado como anticuerpo 24F12; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado sobre un soporte sólido y marcado como anticuerpo 19D4; y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte sólido y marcado como anticuerpo 26B3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo y un dominio de anticuerpo. Alternativamente, o en combinación, el anticuerpo está marcado, por ejemplo, con una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en un radiomarcador, un marcador de biotina, un marcador cromóforo, un marcador fluoróforo o un marcador enzimático. En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una técnica seleccionada del grupo que consiste en análisis de transferencia western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, ensayo en fase de disolución, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y ensayo ELISA.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano.

En ciertas realizaciones, la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente o en combinación, la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente, o en combinación, la muestra se centrifuga, se agita con vórtex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

En otro aspecto adicional, la presente invención está dirigida a un método para evaluar si un sujeto está afectado por cáncer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles de FRa en la muestra derivada del sujeto y en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado en un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado en un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4, y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

Métodos de evaluación de la progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto

En un aspecto adicional, la presente invención está dirigida a un método para evaluar la progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresará rápidamente; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresará lentamente o retrocederá, evaluando de ese modo la progresión del cáncer que expresa FRa en el sujeto; en el que el nivel de FRa que no está unido a una célula en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une a FRa. En una realización particular, la muestra es orina, suero, plasma o ascitis.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para evaluar el progreso de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto; y comparando el nivel de folato receptor alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresará rápidamente; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresará lentamente o retrocederá, evaluando de ese modo la progresión del cáncer que expresa FRa en el sujeto.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para evaluar la progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de suero derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en la muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer avanzará rápidamente; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresará lentamente o retrocederá, evaluando de esta manera el progreso del cáncer que expresa FRa en el sujeto.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, el cáncer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer cerebral, cáncer de cuello de útero, cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de hueso, cáncer de pituitaria, cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular. En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otra realización, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón no microcítico, tal como un adenocarcinoma.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a métodos para evaluar si un sujeto padece de cáncer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto, en el que la presencia de FRa que no está unido a una célula en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9100 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario. En varios aspectos de los aspectos anteriores de la invención, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9500 pg/ml, aproximadamente 10.000 pg/ml, aproximadamente 11.000 pg/ml, aproximadamente 12.000 pg/ml, aproximadamente 13.000 pg/ml, aproximadamente 14.000 pg/ml, aproximadamente 15.000 pg/ml, aproximadamente 16.000 pg/ml, aproximadamente 17.000 pg/ml, aproximadamente 18.000 pg/ml, aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente 20.000 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario.

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

En una realización particular, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003. En otra realización, el anticuerpo incluye SeQ ID NO: 1 (GFTFSgYg lS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realización, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En otra realización adicional, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinación, el anticuerpo incluye una cadena pesada de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID nO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la región variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la región variable de cadena ligera lK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); la región de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); o la región variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).

En una realización particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado sobre un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4; y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo, y un dominio de anticuerpo. Alternativamente, o en combinación, el anticuerpo está marcado, por ejemplo, con una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en un radiomarcador, un marcador de biotina, un marcador cromóforo, un marcador fluoróforo o un marcador enzimático. En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una técnica seleccionada del grupo que consiste en el análisis de transferencia western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, ensayo en fase de disolución, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y ensayo ELISA.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano. En otra realización, la muestra de control es una muestra previamente obtenida del sujeto.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para evaluar la progresión del cáncer de ovario en un sujeto que padece cáncer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer de ovario progresará rápidamente; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer de ovario progresará lentamente o retrocederá, evaluando con ello la progresión del cáncer de ovario en el sujeto; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado en un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4, y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

Métodos para clasificar un cáncer que expresa FRa en grupos de terapia de cáncer

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para clasificar a un sujeto aquejado de un cáncer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no se une a una célula, en una muestra derivada del sujeto; y clasificar al sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer en base al nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula; en donde el nivel de FRa que no está unido a una célula en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, la muestra se selecciona del grupo que consiste en orina, suero, plasma o ascitis.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para clasificar a un sujeto aquejado de un cáncer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto; y clasificando al sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer en base al nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula de la muestra. En un aspecto adicional, la presente invención está dirigida a métodos para clasificar a un sujeto aquejado de cáncer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa ) que no está unido a una célula en una muestra de suero derivada del sujeto; y clasificando al sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia del cáncer en base al nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de suero.

En diversas realizaciones de los anteriores aspectos de la invención, el cáncer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer cerebral, cáncer de cuello de útero, cáncer nasofaríngeo, carcinoma celular escamoso de la cabeza y cuello, cáncer endometrial, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de hueso, cáncer pituitario, cáncer colorrectal y cáncer medular tiroideo. En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otra realización, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón no microcítico, tal como un adenocarcinoma.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a métodos para evaluar si un sujeto está afectado por cáncer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto, en donde la presencia de FRa que no está unido a una célula en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9100 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece de cáncer de ovario. En varios aspectos de los aspectos anteriores de la invención, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9500 pg/ml, aproximadamente 10.000 pg/ml, aproximadamente 11.000 pg/ml, aproximadamente 12.000 pg/ml, aproximadamente 13.000 pg/ml, aproximadamente 14.000 pg/ml, aproximadamente 15.000 pg/ml, aproximadamente 16.000 pg/ml, aproximadamente 17.000 pg/ml, aproximadamente 18.000 pg/ml, aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente 20.000 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario.

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

En una realización particular, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003. En otra realización, el anticuerpo incluye SeQ ID NO: 1 (GFTFSgYg lS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realización, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En otra realización adicional, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinación, el anticuerpo incluye una cadena pesada de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID ⁿO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la región variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la región variable de cadena ligera lK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); la región de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); o la región variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).

En una realización particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4; y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo, y un dominio de anticuerpo. Alternativamente, o en combinación, el anticuerpo está marcado, por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un radiomarcador, un marcador de biotina, un marcador cromóforo, un marcador fluoróforo, o un marcador enzimático. En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una técnica seleccionada del grupo que consiste en análisis de transferencia western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, ensayo en fase de disolución, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y ensayo ELISA.

En una realización particular, el sujeto se clasifica en cáncer de ovario de estadio I, estadio II, estadio III o estadio IV. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para clasificar un sujeto de cáncer ovario en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada del sujeto; y clasificando el sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer en base al nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa mediante contacto de la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4, y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

Métodos para monitorizar la eficacia de tratamiento con MORAb-003 de cáncer de ovario o cáncer de pulmón En un aspecto, la presente invención proporciona un método de monitorización de la eficacia de tratamiento con MORAb-003 de cáncer de ovario o cáncer de pulmón en un sujeto que padece de cáncer de ovario o cáncer de pulmón, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra derivada del sujeto, donde al sujeto se le ha administrado previamente MORAb-003; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el tratamiento con MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el tratamiento con MORAb-003 es eficaz. En realizaciones particulares, el nivel de FRa que no está unido a una célula en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de monitorización de la eficacia del tratamiento con MORAb-003 de cáncer de ovario o cáncer de pulmón en un sujeto que padece de cáncer de ovario o cáncer de pulmón, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto, en el que se ha administrado previamente al sujeto MORAb-003; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el tratamiento con MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el tratamiento con MORAb-003 es eficaz.

En otro aspecto adicional, la presente invención está dirigida a un método de monitorización de la eficacia del tratamiento con MORAb-003 de cáncer de ovario o cáncer de pulmón en un sujeto que padece de cáncer de ovario o cáncer de pulmón, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de suero derivada del sujeto, en el que se ha administrado previamente al sujeto MORAb-003; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en el muestra de suero derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el tratamiento con MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el tratamiento con MORAb-003 es eficaz.

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

En una realización particular, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003. En otra realización, el anticuerpo incluye SeQ ID NO: 1 (GFTFSgYg lS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realización, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En otra realización adicional, el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinación, el anticuerpo incluye una cadena pesada de región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID ⁿO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la región variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la región variable de cadena ligera ^lK26H^uVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); la región de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); o la región variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).

En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de ratón, un humano anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo, y un dominio de anticuerpo. Alternativamente, o en combinación, el anticuerpo está marcado, por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un marcador radiactivo, marcador de biotina, marcador cromóforo, marcador fluoróforo, o un marcador enzimático. En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una técnica seleccionada del grupo que consiste en análisis de transferencia western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, ensayo en fase de disolución, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y ensayo ELISA.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano. En otra realización, la muestra de control es una muestra obtenida previamente del sujeto.

Métodos para predecir si un sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir si un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa, como el cáncer de ovario o el cáncer de pulmón, responderá al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir si un sujeto que padece cáncer que expresa FRa, como el cáncer de ovario o el cáncer de pulmón, responderá al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para predecir si un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa, como cáncer de ovario o cáncer de pulmón, responderá al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de suero derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003.

En realizaciones adicionales, el cáncer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer endometrial, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de hueso, cáncer pituitario, cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular. En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otra realización, el cáncer de pulmón que expresa FRa es cáncer de pulmón de célula no pequeña, tal como adenocarcinoma.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para predecir si un sujeto que padece cáncer de ovario responderá al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a células en una muestra de orina derivada del sujeto, en el que la presencia de FRa que no está unido a una célula en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9100 pg/ml es un indicio de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9500 pg/ml, aproximadamente 10.000 pg/ml, aproximadamente 11.000 pg/ml, aproximadamente 12.000 pg/ml, aproximadamente 13.000 pg/ml, aproximadamente 14.000 pg/ml, aproximadamente 15.000 pg/ml, aproximadamente 16.000 pg/ml, aproximadamente 17.000 pg/ml, aproximadamente 18.000 pg/ml, aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente 20.000 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo, y un dominio de anticuerpo. Alternativamente, o en combinación, el anticuerpo está marcado, por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un marcador radiactivo, marcador de biotina, marcador cromóforo, marcador fluoróforo, o un marcador enzimático. En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una técnica seleccionada del grupo que consiste en análisis de transferencia western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, ensayo en fase de disolución, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y ensayo ELISA.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para predecir si un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa, como el cáncer de ovario o el cáncer de pulmón, responderá al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles de FRa en la muestra derivada del sujeto y en la muestra de control es un indicio de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4, y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, el MORAb-003 para el tratamiento es (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 8; (b) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003; o (c) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, la SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, la SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.

Métodos de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de ovario o cáncer de pulmón

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de ovario o cáncer de pulmón mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa), que no está unido a una célula, en una muestra derivada de dicho sujeto (por ejemplo, orina, suero, plasma o ascitis); y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario o cáncer de pulmón; y administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de MORAb-003 a dicho sujeto.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de ovario o cáncer de pulmón mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra de orina derivada de dicho sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario o cáncer de pulmón; y administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de MORAb-003 a dicho sujeto.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que padece cáncer de ovario o cáncer de pulmón mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra de suero derivada de dicho sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero derivada de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario o cáncer de pulmón; y administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de MORAb-003 a dicho sujeto.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para tratar un sujeto que padece cáncer de ovario mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto, en donde la presencia de FRa que no está unido a una célula en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9100 pg/ml es un indicio de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003; y administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de MORAb-003 a dicho sujeto. En realizaciones particulares, el nivel de FRa que no está unido a una célula en la muestra derivada de dicho sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa.

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

En una realización particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4; y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para tratar a un sujeto que padece cáncer de ovario o cáncer de pulmón, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada del sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles de FRa en la muestra derivada del sujeto y la muestra de control es un indicio de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo MORAb-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 19D4, y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y etiquetado como anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

Kits

En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un kit para evaluar si un sujeto padece un cáncer que expresa FRa o para evaluar la progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto, el kit incluye medios para determinar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada del sujeto; e instrucciones para uso del kit para evaluar si el sujeto padece un cáncer que expresa FRa o para evaluar la progresión de un cáncer que expresa FRa. Por ejemplo, el cáncer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de hueso, cáncer pituitario, cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular. En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otra realización adicional, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón de célula no pequeña, por ejemplo, adenocarcinoma. En una realización adicional, la muestra es orina, suero, plasma o ascitis.

En una realización adicional, los medios incluyen un agente de unión de receptor de folato alfa (FRa), por ejemplo, un anticuerpo. En una realización adicional, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

(y) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).

En ciertas realizaciones, el anticuerpo está marcado, incluyendo, pero no limitado a, un marcador radiactivo, un marcador de biotina, un marcador cromóforo, un marcador fluoróforo, o un marcador enzimático.

En otra realización adicional, el kit incluye un medio para obtener una muestra del sujeto.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante la siguiente descripción detallada y las siguientes figuras.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de un método de inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) para evaluar FRa en orina, tal como se describe en los Ejemplos. El anticuerpo MOV18 unido a soportes sólidos se unió al FRa de la orina. El FRa fue detectado posteriormente por unión a anticuerpo MORAb-003 marcado con Ru.

La Figura 2 muestra la distribución de niveles de FRa en la orina de sujetos con cáncer de ovario y de sujetos de control normales, medidos mediante ECLIA (véase el Ejemplo 1).

La Figura 3 representa la detección de FRa en la orina de pacientes con cáncer de ovario (banda pálida en el carril 1, banda clara en el carril 2) usando inmunotransferencia (véase el Ejemplo 5).

La Figura 4 muestra la distribución de niveles de FRa en la orina de los sujetos con cáncer de ovario y los sujetos de control normales, medidos mediante ECLIA después de tratarse la orina con guanidina, tal como se describe en el Ejemplo 7.

La Figura 5 representa una curva ROC que muestra la sensibilidad y especificidad de la medición ECLIA de niveles de FRa en orina después de que la orina fuera tratada con guanidina, tal como se describe en el Ejemplo 7. El área bajo la curva (AUC) mide la precisión del ensayo para separar los sujetos con cáncer de ovario de los sujetos de control. Se usó un valor de corte de 9100 pg/mL (por encima del cual se consideró los resultados de la prueba como anormales).

La Figura 6 muestra la distribución de niveles de FRa en sujetos con cáncer de ovario (OC) y en sujetos de control normales después de la corrección para los niveles de creatinina. Hay una diferencia estadísticamente significativa entre los pacientes de cáncer de ovario y los controles en los niveles corregidos para creatinina de FRa (p=0,007)-(véase el Ejemplo 8).

La Figura 7 representa un análisis ROC de los niveles de FRa corregidos para creatinina determinados usando ensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) de muestras de orina tratadas con guanidina (véase el Ejemplo 8).

La Figura 8 es una representación esquemática del método de inmunoensayo enzimático (EIA) utilizado para evaluar el nivel de FRa (es decir, FRa) en muestras, como se describe en el Ejemplo 9. MOV-18 actuó como el anticuerpo de captura, que se unió al FRa de fluidos biológicos. El FRa fue detectado mediante la unión a MORAb-003 biotinilado, que se detectó usando peroxidasa de rábano conjugada con avidina (avidina-HRP). La Figura 9 representa los resultados obtenidos para la medición de FRa en suero utilizando procedimientos de incubación de uno y de dos pasos, como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 10 es una representación esquemática de las tres combinaciones diferentes de anticuerpos de captura y detector que se utilizaron con el método de inmunoensayo enzimático (EIA) para evaluar el nivel de FRa en plasma humano, como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 11 muestra las concentraciones plasmáticas de FRa (pg/ml) correspondientes a sujetos individuales determinadas utilizando EIA con tres combinaciones de anticuerpos de captura y detector, como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 12 representa la relación entre los valores de DO y las concentraciones de FRa (véase el Ejemplo 11). La Figura 13 muestra la distribución de concentraciones de FRa en plasma en sujetos con cáncer de ovario y en sujetos de control normales, determinada mediante EIA (véase el Ejemplo 12).

La Figura 14 representa la correlación entre concentraciones plasmáticas de FRa determinadas utilizando EIA y ECLIA (véase el Ejemplo 12).

La Figura 15 muestra las correlaciones entre las medidas ECLIA de niveles de FRa en suero y orina. La correlación para pacientes con cáncer fue de r=0,24 (panel superior) y la correlación para los pacientes con cáncer de ovario fue de r=-0,76 (panel inferior) (véase el Ejemplo 13).

La Figura 16 muestra la correlación de los niveles de FRa en suero frente a plasma para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 (véase el Ejemplo 16).

La Figura 17 muestra la correlación de los niveles de FRa en suero frente a plasma para los ensayos llevados a cabo usando el par 2 (véase el Ejemplo 16).

La Figura 18 muestra la correlación de los niveles en suero de FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 frente al par 2 (véase el Ejemplo 16).

La Figura 19 muestra la correlación de los niveles en plasma de FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 frente al par 2 (véase el Ejemplo 16).

La Figura 20 muestra la correlación intradía de niveles en suero de FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 2 (Ejemplo 16).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que el receptor de folato alfa (FRa), no unido a una célula, se encuentra en niveles elevados en los fluidos corporales, por ejemplo, orina o suero, de un sujeto que tiene un cáncer que expresa FRa tal como cáncer de pulmón o de ovario en comparación con una muestra de control. Además, la presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación de un ensayo inmunológico que exhibe la sensibilidad necesaria para la evaluación de niveles de FRa en muestras, donde intentos previos han fallado repetidamente. Como resultado, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar un cáncer que expresa FRa mediante la evaluación de los niveles de un FRa no unido a una célula en muestras derivadas del sujeto. De hecho, la presente invención supera los retos observados durante los intentos previos para desarrollar un ensayo de diagnóstico basado en FRa para cánceres que expresan FRa, tales como el cáncer de ovario, proporcionando un ensayo inmunológico capaz de evaluar con precisión los niveles de FRa no unido a una célula en las muestras.

Por consiguiente, se proporcionan los métodos y kits para evaluar si un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer que expresa FRa y, además, para evaluar la progresión del cáncer que expresa FRa. En diversas realizaciones, los métodos implican la comparación de niveles de FRa no unido a una célula en muestras, por ejemplo, orina y suero, en comparación con los niveles de control, en la evaluación de la presencia, el grado o el riesgo de desarrollo de cáncer de ovario en el sujeto. En realizaciones particulares, los métodos implican el uso del anticuerpo MORAb-003, anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003 o anticuerpos que tienen la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, la SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, la SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 6 (Q^qWSSYPYMYT) como CDRL3, en la evaluación de los niveles de FRa no unido a una célula en una muestra, por ejemplo, orina o suero. Alternativamente o adicionalmente, el anticuerpo MOV18 o un anticuerpo que se une al mismo epítopo del anticuerpo MOV18, el anticuerpo 548908, un anticuerpo que se une al mismo epítopo del anticuerpo 548908, el anticuerpo 6D398 o un anticuerpo que se une al mismo epítopo del anticuerpo 548908, pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la presente invención. En las siguientes subsecciones se describen varios aspectos de la invención con más detalle:

I. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado en esta sección.

Los artículos "un" y "una" se usan aquí para referirse a uno o a más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a humanos y a animales no humanos, incluyendo sujetos veterinarios. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perro, gato, caballo, vaca, pollos, anfibios y reptiles. En una realización preferida, el sujeto es un humano.

Los términos "cáncer" o "tumor" son bien conocidos en la técnica y se refieren a la presencia, por ejemplo, en un sujeto, de células que poseen características típicas de células causantes de cáncer, tales como la proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, rápido crecimiento y velocidad de proliferación, y ciertas propiedades morfológicas características. Las células cancerosas a menudo se encuentran en la forma de un tumor, pero dichas células pueden existir solas dentro de un sujeto, o pueden ser células cancerosas no tumorigénicas, tales como células de leucemia. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cáncer" incluye los cánceres pre-malignos, así como los cánceres malignos.

Tal como se usa en este documento, un "cáncer que expresa FRa" incluye cualquier tipo de cáncer caracterizado porque las células cancerosas expresan FRa. En realizaciones concretas, el cáncer que expresa FRa incluye condiciones cancerosas que se caracterizan porque las células cancerosas son capaces de secretar, derramar, exportar o liberar FRa de tal manera que se pueden detectar niveles elevados de FRa en una muestra biológica del sujeto. Los cánceres que expresan FRa incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinomas bronquioalveolares, tumores carcinoides, y cáncer de pulmón de célula no pequeña, tales como adenocarcinomas); mesotelioma; cáncer de ovarios; cáncer renal; cáncer de cerebro (por ejemplo, ependimoma anaplásico y astrocitoma pilocítico juvenil cerebeloso); cáncer de cuello uterino; cáncer de la nasofaringe; tumor derivado de mesodermo; carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer endometrial; adenocarcinomas de endometrio del ovario, cistadenocarcinomas serosos, cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de páncreas; cáncer de hueso (por ejemplo, osteosarcoma de alto grado); cáncer de pituitaria (por ejemplo, adenoma de la pituitaria). Véase por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 7.754.698; la Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121 (2): 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11,506-519 (2006); Franklin, W.A. et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15 (3): 889-899; Weitman, S.D. et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba NF et al. Head Neck, 31 (4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otra realización, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de célula no pequeña. En otras realizaciones, el cáncer que expresa FRa es cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular.

Tal como se usa en la presente memoria, un sujeto que "padece un cáncer que expresa FRa" es uno que ha sido diagnosticado clínicamente con dicho cáncer por un médico cualificado (por ejemplo, mediante los métodos de la presente invención), o uno que exhibe uno o más signos o síntomas de un cáncer (por ejemplo, niveles elevados de FRa en fluidos biológicos), y que es diagnosticado clínicamente posteriormente con dicho cáncer por un médico cualificado (por ejemplo, mediante los métodos de la presente invención). Un sujeto no humano, que sirve como un modelo animal de cáncer que expresa FRa, también puede caer dentro del alcance de la expresión de un sujeto "que padece un cáncer que expresa FRa".

El término "cáncer de ovario" se refiere a la enfermedad reconocida en la técnica e incluye cada uno de cáncer de ovario epitelial (EOC; >90% de cáncer de ovario en los países occidentales), tumores de células germinales (aproximadamente 2-3% de cáncer de ovario), y el cáncer de ovario del estroma. El cáncer de ovario se clasifica en diferentes grupos basados en la diferenciación del tejido tumoral. En el grado I, el tejido tumoral está bien diferenciado. En el grado II, el tejido tumoral está moderadamente bien diferenciado. En el grado III, el tejido tumoral está pobremente diferenciado. Este grado se correlaciona con un pronóstico menos favorable que los grados I y II.

El cáncer de ovario se clasifica en diferentes estadios en base a la propagación del cáncer. El estadio I se limita generalmente dentro de la cápsula que rodea un ovario (estadio IA) o ambos ovarios (estadio IB), aunque en algunos cánceres de estadio I (a saber, estadio IC), las células malignas pueden ser detectadas en la ascitis, en el líquido de enjuague peritoneal, o en la superficie de los ovarios. El estadio II implica la extensión o metástasis del tumor a partir de uno o ambos ovarios a otras estructuras pélvicas. En el estadio IIA, el tumor se extiende o se ha metastatizado al útero, las trompas de Falopio, o ambos. El estadio IIB implica la extensión del tumor a la pelvis. El estadio IIC es el estadio IIA o IIB en el que las células malignas pueden ser detectadas en la ascitis, en el líquido de enjuague peritoneal, o en la superficie de los ovarios. En el estadio III, el tumor comprende al menos una extensión maligna al intestino delgado o el epiplón, se han formado implantes peritoneales extrapélvicos de tamaño microscópico (estadio IIIA) o macroscópico (<2 centímetros de diámetro, estadio IIIB; > 2 centímetros de diámetro, estadio IIIC), o se ha metastatizado a un ganglio linfático inguinal o retroperitoneal (un indicador alternativo del estadio IIIC). En el estadio IV, se puede detectar metástasis distante del tumor (es decir, no-peritoneal).

Las duraciones de los diversos estadios del cáncer de ovario no se conocen actualmente, pero se cree que son al menos de aproximadamente un año cada uno (Richart et al., 1969, Am J. Obstet Gynecol. 105: 386). El pronóstico disminuye al aumentar la designación de estadio. Por ejemplo, las tasas de supervivencia a 5 años para sujetos humanos diagnosticados con cáncer de ovario de estadio I, II, III y IV son de 80%, 57%, 25% y 8%, respectivamente. Todos y cada uno de los tipos, grupos y estadios del cáncer de ovario anteriores quedan abarcados por el término "cáncer de ovario" tal como se usa en el presente documento.

Tal como se utiliza aquí, el término "cáncer de pulmón" se refiere a una enfermedad en los tejidos del pulmón que implica un crecimiento celular incontrolado, que, en algunos casos, conduce a la metástasis. El cáncer de pulmón es la causa más común de muerte por cáncer en hombres y mujeres. La mayoría de los cánceres primarios de pulmón son carcinomas de pulmón, derivados a partir de células epiteliales. Los principales tipos de cáncer de pulmón son el carcinoma de pulmón de célula pequeña (SCLC) y carcinoma de pulmón de célula no pequeña (NSCLC). En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es un cáncer de pulmón de célula no pequeña.

El cáncer de pulmón de célula pequeña o carcinoma de pulmón de célula pequeña (SCLC) es un cáncer maligno del pulmón, en el que las células cancerosas tienen una forma plana y citoplasma escaso; por lo tanto, el SCLC a veces es llamado "carcinoma de célula de avena". El SCLC generalmente es más metastásico que el NSCLC, y a veces aparece en combinación con carcinomas de células escamosas.

Tal como se utiliza aquí, el término "cáncer de pulmón de célula no pequeña", también conocido como carcinoma de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), se refiere a un cáncer de pulmón epitelial distinto del carcinoma de pulmón de célula pequeña (SCLC). Hay tres subtipos principales: adenocarcinoma, carcinoma de pulmón de células escamosas y carcinoma de pulmón de célula grande. Otros tipos menos comunes de cáncer de pulmón de célula no pequeña incluyen pleomórfico, tumor carcinoide, carcinoma de glándula salival, y carcinoma no clasificado. Los adenocarcinomas representan aproximadamente el 40% de los cánceres de pulmón, y son el tipo más común de cáncer de pulmón en personas que nunca han fumado. Los carcinomas de células escamosas representan aproximadamente el 25% de los cánceres de pulmón. El carcinoma de células escamosas del pulmón es más común en hombres que en mujeres, y está correlacionado de forma aún más clara con antecedentes de consumo de tabaco que otros tipos de carcinoma de pulmón. Hay al menos cuatro variantes de carcinoma de células escamosas de pulmón (papilar, de célula pequeña, de célula clara, y basaloide). Los carcinomas de pulmón de célula grande son un grupo heterogéneo de neoplasmas malignos que se originan a partir de células epiteliales transformadas del pulmón. Los carcinomas de pulmón de célula grande son carcinomas que carecen de las características microscópicas ligeras del carcinoma de célula pequeña, el carcinoma de célula escamosa, o el adenocarcinoma. Se utilizan diferentes sistemas de clasificación para SCLC y NSCLC. El SCLC se clasifica como enfermedad limitada confinada al hemitórax ipsilateral o como enfermedad extensiva con metástasis más allá del hemitórax ipsilateral. El NSCLC puede clasificarse utilizando el sistema de estadificación de tumor-nodos-metástasis (TNM). Véase Spira J & Ettinger, D.S. Multidisciplinary management of lung cáncer, N Engl J Med, 350: 382 (2004) (en adelante, Spira); Greene FL, Page DL, Fleming ID, Fritz AG, Balch CM, Haller DG, et al (eds). AJCC Cáncer Staging Manual. 6a edición. Nueva York: Springer-Verlag, 2002: 167-77 (en lo sucesivo, Greene); Sobin LH, Wittekind CH (eds). Internacional Union Against Cancer. TNM classificacion of malignant tumors. 6a edición. Nueva York: Wiley-Liss (2002) (en adelante, Sobin). Además, el NSCLC se trata típicamente según el estadio del cáncer determinado por el siguiente esquema de clasificación (véase http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/non-small-celllung/Patient/page2#Keypoint10).

En el estadio oculto (escondido), se observan células cancerosas en el esputo (moco expulsado de los pulmones), pero no se observa ningún tumor en el pulmón mediante imágenes o broncoscopia, o el tumor es demasiado pequeño para ser revisado.

En el estadio 0 (carcinoma in situ), se observan células anormales en el revestimiento de las vías respiratorias. Estas células anormales se pueden volver cancerosas y diseminarse hasta el tejido cercano normal. El estadio 0 también se llama carcinoma in situ.

Estadio I, en el que se ha formado el cáncer, se divide en los estadios IA y IB.

En el estadio IA, el tumor está solo en el pulmón y es de 3 centímetros o menos.

En el estadio IB, el cáncer no se ha extendido a los ganglios linfáticos y se cumple una o más de las siguientes afirmaciones: (i) El tumor es mayor de 3 centímetros, pero no mayor de 5 centímetros; (ii) el cáncer se ha diseminado al bronquio principal y está al menos 2 centímetros por debajo de donde la tráquea se une con el bronquio; (iii) el cáncer se ha extendido a la capa más interna de la membrana que cubre el pulmón; (iv) una parte del pulmón se ha colapsado o ha desarrollado neumonitis (inflamación del pulmón) en el área donde la tráquea se une con el bronquio.

En estadio IIA, el cáncer se ha extendido a ciertos ganglios linfáticos del mismo lado del pecho que el tumor primario; el cáncer es (a) de 5 cm o más pequeño, (b) se ha extendido hasta el bronquio principal, y/o (c) se ha extendido a la capa más interna del revestimiento del pulmón. O, el cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos; el cáncer es (d) mayor de 5 cm, pero no de 7 cm, (e) se ha extendido hasta el bronquio principal, y/o (f) se ha extendido a la capa más interna del revestimiento del pulmón. Parte del pulmón puede haberse colapsado o haberse inflamado. El estadio IIA se divide en dos secciones, dependiendo del tamaño del tumor, de dónde se encuentra el tumor, y de si existe cáncer en los ganglios linfáticos. En la primera sección, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos en el mismo lado del pecho del tumor. Los ganglios linfáticos con cáncer están dentro del pulmón o cerca del bronquio. Además, una o más de las siguientes afirmaciones es cierta: (i) el tumor no tiene más de 5 centímetros, (ii) el cáncer se ha diseminado al bronquio principal y está al menos 2 centímetros por debajo de donde la tráquea se une con el bronquio, (iii) el cáncer se ha extendido a la capa más interna de la membrana que cubre el pulmón, (iv) una parte del pulmón se colapsa o desarrolla neumonitis (inflamación del pulmón) en el área donde la tráquea se une con el bronquio. En la segunda sección, el cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos y una o más de las siguientes situaciones es cierta: (i) el tumor es mayor de 5 centímetros, pero no de 7 centímetros, (ii) el cáncer se ha diseminado al bronquio principal y está al menos 2 centímetros por debajo de donde la tráquea se une con el bronquio, (iii) el cáncer se ha extendido a la capa más interna de la membrana que cubre el pulmón, (iv) una parte del pulmón se colapsa o desarrolla neumonitis (inflamación del pulmón) en la zona donde la tráquea se une con el bronquio.

En el estadio IIB, el cáncer se ha extendido a ciertos ganglios linfáticos en el mismo lado del pecho que el tumor primario; el cáncer es (a) mayor de 5 cm, pero no de 7 cm, (b) se ha extendido hasta el bronquio principal, y/o (c) se ha extendido a la capa más interna del revestimiento del pulmón. Parte del pulmón puede haberse colapsado o inflamado. Alternativamente, (d) el cáncer es mayor de 7 cm; (e) se ha extendido hasta el bronquio principal, (f) el diafragma, (g) la pared torácica o el revestimiento de la pared torácica; y/o (h) se ha extendido a la membrana que rodea el corazón. Puede haber uno o más tumores separados en el mismo lóbulo del pulmón; el cáncer puede haberse diseminado al nervio que controla el diafragma; todo el pulmón puede haberse colapsado o inflamado. El estadio IIB se divide en dos secciones, dependiendo del tamaño del tumor, de dónde se encuentra el tumor, y de si existe cáncer en los ganglios linfáticos. En la primera sección, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos cercanos del mismo lado del pecho del tumor. Los ganglios linfáticos con cáncer están dentro del pulmón o cerca del bronquio. Además, uno o más de las siguientes afirmaciones es cierta: (i) el tumor es mayor de 5 centímetros, pero no de 7 centímetros, (ii) el cáncer se ha diseminado al bronquio principal y está al menos 2 centímetros por debajo de donde la tráquea se une a los bronquios, (iii) el cáncer se ha extendido a la capa más interna de la membrana que cubre el pulmón, (iv) una parte del pulmón se ha colapsado o ha desarrollado neumonitis (inflamación del pulmón) en el área donde la tráquea se une con el bronquio. En la segunda sección, el cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos y una o más de las siguientes situaciones es cierta: (i) el tumor es mayor que 7 centímetros, (ii) el cáncer se ha diseminado al bronquio principal (y está menos de 2 centímetros por debajo de donde la tráquea se une con el bronquio), la pared torácica, el diafragma, o el nervio que controla el diafragma, (iii) el cáncer se ha extendido a la membrana que rodea el corazón o al revestimiento de la pared del pecho, (iv) todo el pulmón se ha colapsado o ha desarrollado neumonitis (inflamación del pulmón), (v) hay uno o más tumores separados en el mismo lóbulo del pulmón.

El estadio IIIA se divide en tres secciones, dependiendo del tamaño del tumor, de dónde se encuentra el tumor, y de qué ganglios linfáticos tienen cáncer (si es que hay alguno). En la primera sección del estadio IIIA, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos del mismo lado del pecho que el tumor. Los ganglios linfáticos con cáncer están cerca del esternón (hueso torácico) o donde el bronquio entra en el pulmón. También, el tumor puede ser de cualquier tamaño; parte del pulmón (donde la tráquea se une con el bronquio) o todo el pulmón puede haberse colapsado o haber desarrollado neumonitis (inflamación del pulmón); puede haber uno o más tumores separados en el mismo lóbulo del pulmón; y el cáncer puede haberse diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) bronquio principal, pero no el área donde la tráquea se une con el bronquio, (ii) pared torácica, (iii) el diafragma y el nervio que lo controla, (iv) la membrana alrededor del pulmón o el revestimiento de la pared del pecho, (iv) la membrana alrededor del corazón. En la segunda sección del estadio IIIA, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos del mismo lado del pecho que el tumor. Los ganglios linfáticos con cáncer están dentro del pulmón o cerca del bronquio. También, el tumor puede ser de cualquier tamaño; todo el pulmón puede haberse colapsado o haber desarrollado neumonitis (inflamación del pulmón); puede haber uno o más tumores separados en cualquiera de los lóbulos del pulmón con cáncer; y el cáncer puede haberse diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) bronquio principal, pero no el área donde la tráquea se une con el bronquio, (ii) pared torácica, (iii) el diafragma y el nervio que lo controla, (iv) la membrana alrededor del pulmón o el revestimiento de la pared del pecho, (v) el corazón o la membrana alrededor de él, (vi) los vasos sanguíneos principales que conducen al corazón o que salen desde el corazón, (vi) la tráquea, (vii) el esófago, (viii) el nervio que controla la laringe (caja de voz), (ix) el esternón (hueso torácico) o la columna vertebral, (x) la carina traqueal (donde la tráquea se une con los bronquios). En la tercera sección del estadio IIIA, el cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos y el tumor puede ser de cualquier tamaño, y el cáncer se ha diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) el corazón, (ii) los principales vasos sanguíneos que conducen hacia el corazón o que salen desde el corazón, (iii) la tráquea, (iv) el esófago, (v) el nervio que controla el laringe (caja de voz), (vi) el esternón (hueso torácico) o la columna vertebral, (vi) la carina traqueal (donde la tráquea se une con los bronquios).

El estadio IIIB se divide en dos secciones, dependiendo del tamaño del tumor, de dónde se encuentra el tumor, y de qué ganglios linfáticos tienen cáncer. En la primera sección, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos situados encima de la clavícula o a los ganglios linfáticos del lado opuesto del pecho que el tumor; el tumor puede ser de cualquier tamaño; parte del pulmón (donde la tráquea se une con el bronquio) o todo el pulmón puede haber colapsado o haber desarrollado neumonitis (inflamación del pulmón); puede haber uno o más tumores separados en cualquiera de los lóbulos del pulmón con cáncer; y el cáncer puede haberse diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) bronquio principal, (ii) pared torácica, (iii) el diafragma y el nervio que lo controla, (iv) la membrana alrededor del pulmón o el revestimiento de la pared del pecho, (iv) el corazón o la membrana alrededor de él, (v) los vasos sanguíneos principales que conducen al corazón o que salen desde el corazón, (vi) la tráquea, (vii) el esófago, (viii) el nervio que controla la laringe (caja de voz), (ix) el esternón (hueso torácico) o la columna vertebral, (x) la carina traqueal (donde la tráquea se une con los bronquios). En la segunda sección del estadio IIIB, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos del mismo lado del pecho que el tumor; los ganglios linfáticos con cáncer están cerca del esternón (hueso torácico) o donde el bronquio entra en el pulmón; el tumor puede ser de cualquier tamaño; puede haber tumores separados en diferentes lóbulos del mismo pulmón; y el cáncer se ha diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) el corazón, (ii) los principales vasos sanguíneos que van hacia el corazón o que salen desde el corazón, (iii) la tráquea, (iv) el esófago, (v) el nervio que controla la laringe (caja de la voz), (vi) el esternón (hueso torácico) o la columna vertebral, (vii) la carina traqueal (donde la tráquea se une con los bronquios).

En el estadio IV, el tumor puede ser de cualquier tamaño y el cáncer puede haberse diseminado a los ganglios linfáticos. Una o más de las siguientes afirmaciones es cierta: hay uno o más tumores en ambos pulmones; el cáncer se encuentra en el líquido alrededor de los pulmones o el corazón; el cáncer se ha extendido a otras partes del cuerpo, como el cerebro, el hígado, las glándulas suprarrenales, los riñones, o el hueso.

Por consiguiente, en diversas realizaciones de la invención anterior, el cáncer de pulmón puede clasificarse en cualquiera de los estadios anteriores (por ejemplo, oculto, estadio 0, estadio IA, estadio IB, estadio IIA, estadio IIB, estadio IIIA, estadio IIIB o estadio IV) en base a la evaluación de los niveles de FRa no unido a una célula, tal como una célula normal o cancerosa, en una muestra (por ejemplo, orina o suero) de un sujeto.

Tal como se utiliza aquí, el término "receptor de folato alfa" (también referido como FRa, FR-alfa, FOLR-1 o FOLR1) se refiere a la isoforma alfa del receptor de folato de alta afinidad. El FRa ligado a membrana se une a la superficie celular mediante un anclaje de glicosil fosfatidilinositol (GPI)), se recicla entre los compartimentos extracelulares y endocíticos y es capaz de transportar folato al interior de la célula. El FRa se expresa en una variedad de tejidos epiteliales, incluyendo los del tracto reproductivo femenino, la placenta, la mama, los túbulos proximales del riñón, el plexo coroideo, el pulmón y las glándulas salivales. Las formas solubles de FRa se pueden derivar a través de la acción de proteasas o fosfolipasa en los receptores de folato ligado a membrana.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de consenso correspondientes al FRa humano se presentan en el presente documento como SEQ ID NO: 24 y 25, respectivamente. Las variantes, por ejemplo, variantes alélicas naturales o secuencias que contienen al menos una sustitución de aminoácidos, quedan abarcadas por los términos usados en la presente memoria.

Tal como se utiliza aquí, el término "no unido a una célula" se refiere a FRa que no está unido a la membrana celular de una célula, tal como una célula cancerosa. En una realización particular, el FRa no unido a una célula no está unido a ninguna célula y se encuentra flotando libremente o solubilizado en fluidos biológicos, por ejemplo, orina o suero. Por ejemplo, el FRa puede ser derramado, secretado o exportado desde células normales o cancerosas, por ejemplo, desde la superficie de células cancerosas, a los fluidos biológicos.

El "nivel" del receptor de folato alfa no unido a una célula, tal como se usa en el presente documento, se refiere al nivel de la proteína de receptor de folato alfa determinada usando cualquier método conocido en la técnica para la medición de niveles de proteína. Tales métodos incluyen, por ejemplo, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión, reacciones de precipitina de fluido o gel, la espectroscopía de absorción, ensayos colorimétricos, ensayos espectrofotométricos, citometría de flujo, inmunodifusión (simple o doble), ensayo en fase de disolución, inmunoelectroforesis, transferencia western, radioinmunoensayo (RIA), ensayos de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia, e inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ejemplificado más adelante), y similares. En una realización preferida, el nivel se determina usando técnicas basadas en anticuerpos, como se describe en más detalle en el presente documento.

En general, es preferible inmovilizar o bien un anticuerpo o una proteína de unión específica para FRa no unido a una célula en un soporte sólido para las transferencias western y para las técnicas de inmunofluorescencia. Los soportes o vehículos de fase sólida adecuados incluyen cualquier soporte capaz de unirse a un antígeno o un anticuerpo. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita.

El especialista en la técnica conocerá muchos otros vehículos adecuados para la unión de anticuerpo o antígeno, y será capaz de adaptar dicho soporte para su uso en la presente invención. Por ejemplo, se puede someter la proteína aislada de una muestra de un sujeto (por ejemplo, orina o suero) a un análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida e inmovilizarse sobre un soporte en fase sólida tal como nitrocelulosa. El soporte se puede lavar con tampones adecuados, seguido de un tratamiento con el anticuerpo marcado. El soporte de fase sólida se puede lavar con el tampón una segunda vez para eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido sobre el soporte sólido puede detectarse entonces por medios convencionales. Los medios para detectar proteínas usando técnicas electroforéticas son bien conocidos por los especialistas en la técnica (véase, de forma general, R. Scopes (1982) Protein Purificación, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).

Otros métodos estándar incluyen técnicas de inmunoensayo que son bien conocidas para el especialista en la técnica y se pueden encontrar en Principies And Practice Of Immunoassay, 2a edición, Price y Newman, eds., MacMillan (1997) y Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, cap. 9 (1988).

Los anticuerpos utilizados en inmunoensayos para determinar el nivel de expresión de receptor de folato alfa se pueden marcar con un marcador detectable. El término "marcado", con respecto al agente o anticuerpo de unión, se pretende que abarque el marcaje directo del agente o anticuerpo de unión por acoplamiento (es decir, vincular físicamente) de una sustancia detectable al agente o anticuerpo de unión, así como el marcaje indirecto del agente de unión o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Un ejemplo de marcado indirecto incluye la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. En una realización, el anticuerpo está marcado, por ejemplo, radiomarcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo, o marcado con enzima. En otra realización, el anticuerpo es un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado a un sustrato o a la proteína o ligando de un par proteína-ligando (por ejemplo, biotina-estreptavidina), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de cadena única, un dominio hipervariable de anticuerpo aislado) que se une específicamente a FRa no unido a una célula.

En una realización de la invención, se usan métodos proteómicos, por ejemplo espectrometría de masas. La espectrometría de masas es una técnica analítica que consiste en compuestos químicos ionizantes para generar moléculas cargadas (o fragmentos de las mismas) y la medición de sus relaciones de masa a carga. En un procedimiento típico de espectrometría de masas, se obtiene una muestra de un sujeto, se carga en la espectrometría de masas, y sus componentes (por ejemplo, FRa) se ionizan por diferentes métodos (por ejemplo, mediante el impacto con un haz de electrones), resultando en la formación de partículas cargadas (iones). La relación de carga a masa de las partículas se calcula entonces a partir del movimiento de los iones cuando se mueven a través de campos electromagnéticos.

Por ejemplo, para determinar el nivel de FRa se puede utilizar la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser asociada a matriz (MALDI-TOF MS) o la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser mejorada en superficie (SELDI-TOF MS), que implica la aplicación de una muestra, tal como orina o suero, a un chip de unión a proteínas (Wright, GL, Jr., et al (2002) Expert Rev Mol Diagn 2: 549; Li, J., et al (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C., et al (2003) Dis Markers. 19: 229; Petricoin, EF, et al. (2002) 359: 572; Adam, b L, et al (2002) Cancer Res 62: 3609; Tolson, J., et al (2004) Lab Invest. 84: 845; Xiao, Z., et al (2001) Cancer Res 61: 6029).

Adicionalmente, las técnicas in vivo para la determinación del nivel de FRa no unido a una célula incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra FRa, que se une y transforma al FRa en una molécula detectable. La presencia, nivel, o ubicación de los FRa detectables no unidos a una célula en un sujeto pueden determinarse usando técnicas estándar de imagen.

El término "muestra" tal como se utiliza aquí se refiere a una colección de fluidos similares, células, o tejidos aislados de un sujeto, así como fluidos, células, o tejidos presentes dentro de un sujeto. En realizaciones preferidas, la muestra es un fluido biológico que contiene FRa no unido a una célula cancerosa. Los fluidos biológicos son típicamente líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden incluir fluidos de origen natural presentes, retirados, expresados o extraídos de otro modo de un sujeto o de una fuente biológica. Ciertos fluidos biológicos se derivan de determinados tejidos, órganos o regiones localizadas y otros ciertos fluidos biológicos pueden ser más globales o situarse sistémicamente en un sujeto o fuente biológica. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, fluidos oculares, líquido quístico, gotas de lágrimas, heces, esputo, secreciones mucosas de los tejidos secretores y órganos, secreciones vaginales, fluidos ginecológicos, fluidos ascíticos, tales como los asociados con tumores no sólidos, fluidos de la cavidad pleural, pericárdica, peritoneal, abdominal y de otras cavidades corporales, fluidos recogidos por lavado bronquial y similares. En una realización particular, la muestra es orina o suero. En otra realización, la muestra no incluye ascitis o no es una muestra de ascitis. En otra realización, la muestra no incluye fluido peritoneal o no es fluido peritoneal. En una realización, la muestra se extrae del sujeto. En otra realización, la muestra está presente dentro del sujeto. Los fluidos biológicos también pueden incluir disoluciones líquidas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, medio de cultivo celular y de órgano, que incluye medio de cultivo celular y de órgano acondicionado, fluidos de lavado y similares.

En algunas realizaciones, sólo una porción de la muestra se somete a un ensayo para determinar el nivel de FRa no unido a una célula, o diversas porciones de la muestra son sometidas a diversos ensayos para determinar el nivel de FRa no unido a una célula. Además, en muchas realizaciones, la muestra puede ser pre-tratada por medios físicos o químicos antes del ensayo. Por ejemplo, en realizaciones descritas con más detalle en la sección de Ejemplos, las muestras, por ejemplo, muestras de orina, se sometieron a centrifugación, dilución y/o tratamiento con una sustancia solubilizante (por ejemplo, tratamiento con guanidina) antes de ensayar las muestras para determinar el FRa no unido a célula. Tales técnicas sirven para mejorar la precisión, la fiabilidad y reproducibilidad de los ensayos de la presente invención.

El término "muestra de control", tal como se usa aquí, se refiere a cualquier muestra de control clínicamente relevante, incluyendo, por ejemplo, una muestra de un sujeto sano no afectado por cáncer de ovario, una muestra de un sujeto que tiene un cáncer de ovario menos grave o de progresión más lenta que el sujeto a evaluar, una muestra de un sujeto que tiene algún otro tipo de cáncer o enfermedad, y similares. Una muestra de control puede incluir una muestra derivada de uno o más sujetos. Una muestra de control también puede ser una muestra del sujeto a evaluar tomada a un tiempo previo. Por ejemplo, la muestra de control podría ser una muestra tomada del sujeto a evaluar antes de la aparición del cáncer que expresa FRa como el cáncer de pulmón o el cáncer de ovario, en una fase anterior de la enfermedad, o antes de la administración del tratamiento o de una parte de tratamiento. La muestra de control también puede ser una muestra de un modelo animal, o de un tejido o líneas celulares derivadas del modelo animal, del cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de pulmón o de ovario. El nivel de FRa no unido a una célula en una muestra de control que consiste en un grupo de mediciones puede determinarse en base a cualquier medida estadística adecuada, tal como, por ejemplo, medidas de tendencia central que incluyen valores de media, mediana, o modales.

El término "nivel de control" se refiere a un nivel aceptado o pre-determinado de FRa que se utiliza para comparar con el nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto. En una realización, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una célula en la muestra(s) de un sujeto(s) que presenta una progresión lenta de la enfermedad. En otra realización, el nivel de control de FRa no unido a una célula se basa en el nivel en una muestra de un sujeto(s) que presenta una progresión rápida de la enfermedad. En otra realización, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una célula en una muestra(s) a partir de un sujeto(s) no afectado, es decir, no enfermo, es decir, un sujeto que no tiene un cáncer que expresa FRa tal como cáncer de pulmón o de ovario. En aún otra realización, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una célula en una muestra de un sujeto(s) antes de la administración de una terapia para el cáncer de ovario. En otra realización, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una célula en una muestra(s) de un sujeto(s) que tiene un cáncer que expresa FRa como cáncer de pulmón o de ovario que no ha sido puesta en contacto con un compuesto de ensayo. En otra realización, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una célula en una muestra(s) de un sujeto(s) que no tiene un cáncer que expresa FRa como el cáncer de pulmón o de ovario que ha sido puesta en contacto con un compuesto de ensayo. En una realización, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una célula en una muestra(s) de un modelo animal de un cáncer que expresa FRa como el cáncer de pulmón o el cáncer de ovario, una célula, o una línea celular derivada del modelo animal de un cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de pulmón o de ovario.

En una realización, el control es un control normalizado, tal como, por ejemplo, un control que está predeterminado utilizando un promedio de los niveles de FRa no unido a una célula de una población de sujetos que no tienen cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de pulmón o cáncer de ovario. En otras realizaciones adicionales de la invención, un nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una célula en una muestra no cancerosa derivada del sujeto que tiene un cáncer que expresa FRa, como el cáncer de pulmón o de ovario. Por ejemplo, cuando una laparotomía u otro procedimiento médico revela la presencia de cáncer de ovario en una porción de los ovarios, el nivel de control de FRa puede determinarse utilizando la parte no afectada del ovario, y este nivel de control puede ser comparado con el nivel de FRa en una parte afectada de los ovarios. De forma similar, cuando una biopsia u otro procedimiento médico revela la presencia de un cáncer de pulmón en una porción de los pulmones, el nivel de control de FRa puede determinarse utilizando la parte no afectada de los pulmones, y este nivel de control puede ser comparado con el nivel de FRa en una parte afectada de los pulmones.

Tal como se usa en este documento, "una diferencia" entre el nivel de receptor de folato alfa no unido a una célula en una muestra de un sujeto (es decir, una muestra de ensayo) y el nivel de receptor de folato alfa no unido a una célula en una muestra de control, se refiere de forma general a cualquier diferencia clínicamente relevante y/o estadísticamente significativa en el nivel de receptor de folato alfa entre las dos muestras. En una realización ejemplar, la diferencia se selecciona en base a un valor de corte determinado usando un análisis de característica de operación de receptor (ROC), un ejemplo del cual se presenta en el Ejemplo 6.

En otras realizaciones, la diferencia debe ser mayor que los límites de detección del método para determinar el nivel de FRa no unido a una célula. Se prefiere que la diferencia sea al menos mayor que el error estándar del método de evaluación, y preferiblemente una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o mayor que el error estándar del método de evaluación. La diferencia puede ser evaluada mediante cualquier comparación apropiada, incluyendo cualquier estadística o comparación descriptiva paramétrica o no paramétrica apropiada. Por ejemplo, "un aumento" en el nivel de FRa no unido a una célula puede referirse a un nivel en una muestra de prueba que es aproximadamente dos, y más preferiblemente aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco, aproximadamente seis, aproximadamente siete, aproximadamente ocho, aproximadamente nueve, aproximadamente diez o más veces mayor que el nivel de FRa en la muestra de control. Un aumento también puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente al menos aproximadamente 1,5, y más preferiblemente aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco o más desviaciones estándar por encima del nivel medio de FRa en la muestra de control. Del mismo modo, "una disminución" en el nivel de FRa no unido a una célula puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente al menos aproximadamente dos, y más preferiblemente aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco, aproximadamente seis, aproximadamente siete, aproximadamente ocho, aproximadamente nueve, aproximadamente diez o más veces inferior al nivel de FRa en la muestra de control. Una disminución también puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente al menos aproximadamente 1,5, y más preferiblemente aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco o más desviaciones estándar inferior al nivel medio de FRa en la muestra de control.

Tal como se utiliza aquí, el término "poner en contacto la muestra" con un agente de unión a FRa, por ejemplo, un anticuerpo anti-FRa, incluye exponer la muestra, o cualquier porción de la misma al agente o anticuerpo, de tal modo que al menos una porción de la muestra entra en contacto con el agente o anticuerpo. La muestra o porción de la misma puede ser alterada de alguna manera, tal como sometiéndola a tratamientos físicos o químicos (por ejemplo, dilución o tratamiento con guanidina), antes del acto de ponerla en contacto con el agente o anticuerpo.

El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, comprende cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro, así como cualquier fragmento funcional (es decir, de unión a antígeno), mutante, variante, o derivación de las mismas, que conserva las características de unión al epítopo esenciales de una molécula de Ig. Dicho mutante, variante, o formatos de anticuerpo derivados son conocidos en la técnica, e incluyen moléculas tales como fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fabc, anticuerpos Sc (anticuerpos de cadena sencilla), diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpos, y similares. Las moléculas de inmunoglobulinas pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, di spuestas desde el extremo amino-terminal al extremo carboxi-te rmina l en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmu noglobulina a tejidos del huésped o a factores, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, FRa no unido a una célula). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser llevada a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios de VH y CH1 y; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye dominios V^hy V^l; (vi) un fragmento de dAb (Ward et al (1989) Nature 341, 544-546), que consiste en un dominio V^h; (vii) un dAb que consiste en un dominio VH o VL; y (viii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada o (ix) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un ligando sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^ly V^h, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un ligando sintético que les permite constituirse en una única cadena proteica en la que las regiones V^ly V^hse emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase por ejemplo, Bird et al (1988) Science 242, 423-426; y Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85, 5879-5883). Se pretende que dichos anticuerpos de cadena única también queden abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica, y los fragmentos se criban en función de su utilidad, de la misma manera que los anticuerpos intactos. Se pueden producir porciones de unión a antígeno mediante técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de ratón, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, y anticuerpos humanos, y aquellos producidos de forma natural o que son producidos recombinantemente de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica.

En una realización, un anticuerpo para su uso en los métodos de la invención es un anticuerpo biespecífico. Un "anticuerpo biespecífico" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos, que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553.

En otra realización, un anticuerpo para uso en los métodos de la invención es un anticuerpo camélido como el descrito en, por ejemplo, la publicación PCT WO 94/04678.

Una región del anticuerpo camélido que es el dominio de variable pequeño y único identificado como V^hhse puede obtener mediante ingeniería genética para producir una proteína pequeña que tiene una alta afinidad por una diana, lo que resulta en una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida com o "nanoanticuerpo camélido". Véase la patente de los Estados Unidos. N° 5.759.808; véase también Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003, Bioconjugate Chem.

14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; y Lauwereys et al., 1998 EM^bO J. 17: 3512 3520. Se dispone comercialmente de bibliotecas modificadas de anticuerpos camélidos y de fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, de Ablynx, Gante, Bélgica. Por consiguiente, una característica de la presente invención es un nanocuerpo camélido que tiene una alta afinidad por FRa.

En otras realizaciones de la invención, un anticuerpo para uso en los métodos de la invención es un diacuerpo, un diacuerpo de cadena sencilla, o un di-diacuerpo.

Los diacuerpos son moléculas bivalentes biespecíficas en las que los dominios V^hy V^lse expresan en una única cadena polipeptídica, conectada por un ligando que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Los dominios V^hy V^lse emparejan con dominios complementarios de otra cadena, creando de este modo dos sitios de unión de antígeno (véase por ejemplo, Holliger et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448; Poljak et al. 1994 Structure 2: 1121-1123). Los diacuerpos pueden ser producidos mediante la expresión de dos cadenas de polipéptidos, ya sea con la estructura V^ha-V^lby V^hb-V^la(configuración V^h-V^l), o V^la-V^hby V^lb-V^ha(configuración V^l-V^h) dentro de la misma célula. La mayoría de ellos se puede expresar en forma soluble en bacterias.

Los diacuerpos de cadena única (scDb) se producen mediante la conexión de las dos cadenas polipeptídicas de formación de diacuerpo con un ligando de aproximadamente 15 residuos de aminoácido (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol Immunother, 45 (3-4): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1): 21-36). Los scDb pueden expresarse en bacterias en forma monomérica soluble activa (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol Immunother, 45 (34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1): 21-36; Pluckthun y Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng, 9 (7): 617-21).

Un diacuerpo puede fusionarse a Fc para generar un "di-diacuerpo" (véase Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4): 2856-65).

También se pueden utilizar en los métodos de la presente invención moléculas de unión a FRa que exhiben propiedades funcionales de anticuerpos pero derivan sus porciones marco y de unión a antígeno de otros polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos distintos de los codificados por genes de anticuerpo o generados por la recombinación de genes de anticuerpos in vivo). Los dominios de unión a antígeno (por ejemplo, dominios de unión a FRa) de estas moléculas de unión se generan a través de un proceso de evolución dirigida. Véase la patente de los Estados Unidos. N° 7.115.396. Las moléculas que tienen un pliegue global similar al de un dominio variable de un anticuerpo (un pliegue de “tipo inmunoglobulina") son proteínas estructurales adecuadas. Las proteínas estructurales adecuadas para derivar moléculas de unión a antígeno incluyen fibronectina o un dímero de fibronectina, tenascina, N-cadherina, E-cadherina, ICAM, titina, receptor de GCSF, receptor de citocina, inhibidor de glicosidasa, cromoproteína antibiótica, molécula de adhesión a membrana de mielina P0, CD8, CD4, CD2, MHC de clase I, receptor de antígeno de células T, dominios de conjunto CD1, C2 e I de VCAM-1, dominio de inmunoglobulina de conjunto I de la proteína de unión a miosina C, dominio de inmunoglobulina de conjunto C de la proteína vinculante a miosina H, dominio de inmunoglobulina de conjunto I de teloquina, NCAM, twitchina, neuroglía, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de la eritropoyetina, receptor de la prolactina, receptor de interferón-gamma, p-galactosidasa/glucuronidasa, p-glucuronidasa, transglutaminasa, receptor de antígeno de células T, superóxido dismutasa, dominio de factor tisular, citocromo F, proteína verde fluorescente, GroEL, y taumatina.

"Unión específica", cuando se usa en el contexto de anticuerpos, o de fragmentos de anticuerpos, representa la unión a través de los dominios codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no reconocen sustancialmente ni se unen a otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas antigénicas. Típicamente, un anticuerpo se une a un antígeno relacionado con una Kd de menos de aproximadamente 1x10-8 M, medida mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie o un ensayo de unión celular.

Tal como se usa en este documento, un "agente de unión" de receptor de folato alfa incluye un anticuerpo que se une a FRa no unido a una célula, así como agentes de unión que no son anticuerpos. Para generar agentes de unión que no son anticuerpos o moléculas de unión, se puede crear una biblioteca de clones en cuyas secuencias las regiones de la proteína estructural que forman las superficies de unión a antígeno (por ejemplo, las regiones análogas en posición y estructura a las CDR de un dominio variable de anticuerpo plegado de la inmunoglobulina) se asignan al azar. Se evalúan clones de biblioteca para determinar la unión específica al antígeno de interés (por ejemplo, FRa) y para determinar otras funciones (por ejemplo, la inhibición de la actividad biológica de FRa). Los clones seleccionados se pueden utilizar como base para una aleatorización adicional y en la selección para producir derivados de mayor afinidad por el antígeno.

Las moléculas de unión de alta afinidad se generan, por ejemplo, usando el décimo módulo de fibronectina III (10Fn3) como estructura, descrito en las patentes de los Estados Unidos. N° 6.818.418 y 7.115.396.; Roberts y Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 12297; Patente de EE.UU. N° 6.261.804; Patente de EE.UU. N° 6.258.558; y Szostak et al. (WO98/31700).

Las moléculas de unión que no son anticuerpos pueden ser producidas como dímeros o multímeros para aumentar la avidez por el antígeno diana. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno se expresa como una fusión con una región constante (Fc) de un anticuerpo que forma dímeros Fc-Fc. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos. N27.115.396.

Un "antígeno" es una molécula reconocida por el sistema inmune; el término viene originalmente de "generador de anticuerpo" e incluye una molécula que se une específicamente a un anticuerpo. A nivel molecular, un antígeno se caracteriza por su capacidad de unirse en el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. En la presente invención, el antígeno es FRa, tal como FRa que no está unido a una molécula, FRa o una porción del mismo.

Tal como se utiliza aquí, el término "epítopo" se refiere a las características de la superficie molecular de un antígeno, por ejemplo FRa, capaces de unirse a un anticuerpo. Las moléculas antigénicas, que normalmente son “grandes" polímeros biológicos, por lo general presentan varias características de superficie que pueden actuar como puntos de interacción con anticuerpos específicos. Cualquier característica molecular de este tipo constituye un epítopo. Por lo tanto, la mayoría de los antígenos tienen el potencial de unirse a varios anticuerpos distintos, cada uno de los cuales es típicamente específico para un epítopo particular. En una realización de la presente invención, un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se une a un epítopo en FRa que está disponible en la forma del receptor que no está unido a una célula, pero no en la forma unida a membrana del receptor. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse al mismo epítopo en FRa al que se une MORAb-003.

Tal como se usa en este documento, la frase "progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa" incluye la progresión de un cáncer de este tipo de un estado menos severo a un estado más grave. Esto podría incluir un aumento en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer está creciendo y difundiéndose, y similares. Por ejemplo, "la progresión de cáncer de ovario" incluye la progresión de un cáncer de este tipo desde un estado menos severo a uno más grave, tal como la progresión desde el estadio I al estadio II, del estadio II al estadio III, etc. Alternativamente, la frase "progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa" puede referirse a la regresión de un cáncer que expresa FRa desde un estado más grave a un estado menos grave. Por ejemplo, en una realización, "la progresión de cáncer de ovario" se refiere a la regresión del estadio IV al estadio III, del estadio III al estadio II, etc. En otras realizaciones, la "progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa" puede referirse a la tasa de supervivencia determinada desde el comienzo de los síntomas del cáncer que expresa FRa, o a la tasa de supervivencia desde el momento del diagnóstico del cáncer que expresa FRa. Tal como se utiliza aquí, el término "clasificar" se refiere a la caracterización de un cáncer que expresa FRa, por ejemplo, cáncer de ovario o de pulmón, en un estadio apropiado, en base, por ejemplo, al grado de la propagación del cáncer, como clasificaciones bien aceptadas en la técnica. Por ejemplo, la clasificación incluye la caracterización del cáncer que expresa FRa en estadio I, estadio II, estadio III o estadio IV. En ciertas realizaciones, el estadio I se refiere a los cánceres que se localizan en una parte del cuerpo. En ciertas realizaciones, los estadios II y III se refieren a cánceres que están avanzados localmente, en los que una distinción entre estadios a menudo es específica del cáncer particular. Por último, el estadio IV se refiere a los cánceres que se han metastatizado o que se han propagado a otros órganos o partes del cuerpo.

Tal como se utiliza aquí, el término "supervivencia" se refiere a la continuación de la vida de un sujeto que ha sido tratado por cáncer. En una realización, la supervivencia se refiere a la no repetición de un tumor. Tal como se utiliza aquí, el término "reaparecer" se refiere a la regeneración de las células tumorales o cancerosas en un sujeto en el que se ha administrado el tratamiento primario para el tumor. El tumor puede reaparecer en el sitio original o en otra parte del cuerpo. En una realización, un tumor que se repite es del mismo tipo que el tumor original para el que se trató el sujeto. Por ejemplo, si un sujeto tenía un tumor de cáncer de ovario, se trató y posteriormente se desarrolló otro tumor de cáncer de ovario, el tumor ha reaparecido. Además, un cáncer puede reaparecer en un órgano o tejido diferente a aquel en el que apareció originalmente.

II. Métodos y kits de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que el receptor de folato alfa (FRa), no unido a una célula, se encuentra en niveles elevados en los fluidos corporales, por ejemplo, orina o suero, de un sujeto que tiene un cáncer que expresa FRa en comparación con una muestra de control. Además, la presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación de un ensayo inmunológico que exhibe la sensibilidad necesaria para evaluar los niveles de FRa no unido a célula en muestras, donde intentos anteriores habían fracasado repetidamente. De hecho, la presente invención supera los retos observados durante los intentos anteriores para desarrollar un ensayo de diagnóstico basado en FRa para cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de pulmón o de ovario, proporcionando un ensayo inmunológico capaz de evaluar con precisión los niveles de FRa no unido a una célula en una muestra, por ejemplo, orina o suero.

Por consiguiente, se proporcionan métodos y kits para evaluar si un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer que expresa FRa y, además, para evaluar la progresión de un cáncer que expresa FRa. En diversas realizaciones, los métodos implican la comparación de los niveles de FRa no unido a una célula en muestras, por ejemplo, de orina y suero, en comparación con los niveles de control, para determinar la presencia, el grado o el riesgo de desarrollar cáncer de ovario en el sujeto.

A. Métodos de diagnóstico, métodos de pronóstico, métodos de evaluación de riesgo, y métodos de clasificación Específicamente, la presente invención proporciona métodos de diagnóstico para evaluar si un sujeto padece un cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de pulmón o cáncer de ovario, los métodos de pronóstico para predecir la progresión de un cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de pulmón o cáncer de ovario, y los métodos de evaluación de riesgos para evaluar el nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cáncer que expresa FRa. Además, la invención proporciona métodos de clasificación para clasificar un sujeto que padece cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de pulmón o cáncer de ovario, en grupos de terapia de cáncer. Los diversos aspectos y realizaciones de la invención aquí descritos no pretenden ser limitativos ni abarcar todas las posibles combinaciones de las realizaciones específicas mencionadas, que pueden aplicarse a cualquiera de los métodos y kits discutidos en este documento o que se reivindican a continuación.

Los métodos de la presente invención se pueden llevar a la práctica en combinación con cualquier otro método utilizado por el especialista en la materia para diagnosticar un cáncer que expresa FRa, para predecir la progresión de un cáncer que expresa FRa, o para evaluar el nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cáncer que expresa FRa.

En un aspecto, la invención proporciona un método para evaluar si un sujeto padece un cáncer que expresa FRa, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra (tal como orina o suero) derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece un cáncer que expresa FRa. En una realización particular, el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une a FRa no unido a una célula y se selecciona del grupo que consiste en (a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003; y (b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, la SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, la SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En una realización, la muestra se selecciona del grupo que consiste en orina y suero.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para evaluar si un sujeto padece un cáncer que expresa FRa, como cáncer de pulmón o cáncer de ovario, comprendiendo el método la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) no unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece un cáncer que expresa FRa.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para evaluar si un sujeto padece un cáncer que expresa FRa, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) no unido a una célula en una muestra de suero derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto y la nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto padece un cáncer que expresa FRa. En realizaciones particulares, el sujeto no ha sido tratado con un agente, tal como un esteroide, que mejora los niveles de FRa en el suero. En una realización específica, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario y el sujeto no ha sido tratado con un agente, tal como un esteroide, que mejora los niveles de FRa en el suero.

En los métodos y kits de la presente invención, los cánceres que expresan FRa incluyen cánceres que se caracterizan porque las células cancerosas expresan FRa. En realizaciones particulares, el FRa se libera de las células de cáncer, por ejemplo, desde la superficie de la célula cancerosa, y se incorpora a los fluidos biológicos del sujeto. Los cánceres que expresan FRa incluyen cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinomas bronquioalveolares, tumores carcinoides, y cáncer de pulmón de célula no pequeña, tal como adenocarcinomas); mesotelioma; cáncer de ovario; cáncer renal; cáncer de cerebro (por ejemplo, ependimoma anaplásico y astrocitoma pilocítico juvenil cerebelar); cáncer de cuello uterino; cáncer de la nasofaringe; tumor derivado del mesodermo; carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer endometrial; adenocarcinomas de endometrio del ovario, cistoadenocarcinomas serosos, cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de páncreas; cáncer de hueso (por ejemplo, osteosarcoma de alto grado); y cáncer de pituitaria (por ejemplo, adenoma de la pituitaria). En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario.

En ciertas realizaciones de los métodos y kits de la presente invención, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón. En realizaciones más específicas, el cáncer de pulmón es carcinoma de pulmón de célula no pequeña (NSCLC). En dicha realización, el NSCLC se selecciona del grupo que consiste en adenocarcinoma, carcinoma de pulmón de células escamosas, carcinoma de pulmón de célula grande, NSCLC pleomórfico, tumor carcinoide, carcinoma de glándula salival, y carcinoma no clasificado. En una realización preferida, el NSCLC es adenocarcinoma. En realizaciones alternativas, el cáncer de pulmón es carcinoma de pulmón de célula pequeña (SCLC). En otra realización, el cáncer de pulmón es carcinoma bronquioalveolar. En aún otra realización, el cáncer de pulmón es un tumor carcinoide de pulmón.

La presente invención también proporciona métodos para evaluar si un sujeto padece cáncer de ovario mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) no unido a una célula en una muestra de orina derivada del sujeto, donde la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 3000 ua/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario. En realizaciones particulares, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 4000 ua/ml, aproximadamente 5000 ua/ml, aproximadamente 6000 ua/ml, aproximadamente 7000 ua/ml, aproximadamente 8000 ua/ml, aproximadamente 9000 ua/ml, aproximadamente 10000 ua/ml, aproximadamente 11000 ua/ml, aproximadamente 12000 ua/ml, aproximadamente 13000 ua/ml, aproximadamente 14000 ua/ml, aproximadamente 15000 ua/ml, aproximadamente 16000 ua/ml, aproximadamente 17000 ua/ml, aproximadamente 18000 ua/ml, aproximadamente 19000 ua/ml, aproximadamente 20000 ua/ml, aproximadamente 21000 ua/ml, aproximadamente 22000 ua/ml, aproximadamente 23000 ua/ml, aproximadamente 24000 ua/ml, aproximadamente 25000 ua/ml, aproximadamente 26000 ua/ml, aproximadamente 27000 ua/ml, aproximadamente 28000 ua/ml, aproximadamente 29000 ua/ml o aproximadamente 30000 ua/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para evaluar si un sujeto padece cáncer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) en una muestra de orina derivada del sujeto, en el que la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9100 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario o en el que una concentración de menos de aproximadamente 9100 pg/ml es un indicio de que el sujeto no padece cáncer de ovario. Por ejemplo, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentración de más de aproximadamente 9500 pg/ml, aproximadamente 10000 pg/ml, aproximadamente 11000 pg/ml, aproximadamente 12000 pg/ml, aproximadamente 13000 pg/ml, aproximadamente 14.000 pg/ml, aproximadamente 15000 pg/ml, aproximadamente 16000 pg/ml, aproximadamente 17000 pg/ml, aproximadamente 18000 pg/ml, aproximadamente 19000 pg/ml, aproximadamente 20000 pg/ml, aproximadamente 21000 pg/ml, aproximadamente 22000 pg/ml, aproximadamente 23000 pg/ml, aproximadamente 24000 pg/ml, aproximadamente 25000 pg/ml, aproximadamente 26000 pg/ml, aproximadamente 27000 pg/ml, aproximadamente 28000 pg/ml, aproximadamente 29000 pg/ml, aproximadamente 30000 pg/ml, aproximadamente 40000 pg/ml, aproximadamente 50000 pg/ml, aproximadamente 60000 pg/ml, aproximadamente 70000 pg/ml, aproximadamente 80000 pg/ml, aproximadamente 90000 pg/ml, aproximadamente 100000 pg/ml o aproximadamente 150000 pg/ml es un indicio de que el sujeto padece cáncer de ovario.

En ciertas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, los niveles de FRa no unido a una célula en una muestra (por ejemplo, una muestra tal como una muestra de orina o una muestra de suero) derivada de un sujeto se comparan con los niveles de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles es un indicio de que el sujeto padece un cáncer que expresa FRa tal como cáncer de cáncer de pulmón o de ovario. En una realización particular, la diferencia supone un aumento del nivel de FRa no unido a una célula en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control, donde dicho aumento es indicativo de la presencia o el crecimiento de un cáncer que expresa FRa. Alternativamente, la diferencia supone una disminución del nivel de FRa, en el que la disminución es indicativa de la ausencia o regresión del cáncer que expresa FRa. Tal como se usa en este documento, "una diferencia" entre el nivel de receptor de folato alfa no unido a una célula en una muestra de un sujeto (es decir, una muestra de ensayo) y el nivel de receptor de folato alfa en una muestra de control se refiere de forma general a cualquier cambio clínicamente relevante (incluyendo un aumento o una disminución) y/o diferencia estadísticamente significativa en el nivel de receptor de folato alfa en las dos muestras. En una realización ejemplar, la diferencia se selecciona en base a un valor de corte determinado usando un análisis de característica de operación de receptor (ROC), un ejemplo del cual se presenta en el Ejemplo 6. El valor de corte óptimo puede variar dependiendo de los métodos y condiciones de ensayo empleados. En otras realizaciones, la diferencia debe ser mayor que los límites de detección del método para determinar el nivel de FRa no unido a una célula. Se prefiere que la diferencia sea al menos mayor que el error estándar del método de evaluación, y preferiblemente una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o más superior al error estándar del método de evaluación. La diferencia puede ser evaluada mediante cualquier comparación apropiada, incluyendo cualquier estadística o comparación descriptiva paramétrica o no paramétrica apropiada. Por ejemplo, "un aumento" en el nivel de FRa puede referirse a un nivel que excede de un valor de corte determinado usando un análisis ROC. También puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es dos, y más preferiblemente de aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 150%, aproximadamente el 200%, aproximadamente el 300%, aproximadamente el 400%, aproximadamente el 500%, aproximadamente el 600%, aproximadamente el 700%, aproximadamente 800%, aproximadamente el 900% o aproximadamente el 1000% más que el nivel de FRa en la muestra de control. Un aumento también puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente de al menos aproximadamente 1,5, y más preferiblemente de aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco o más desviaciones estándar superior al nivel medio de FRa en la muestra de control. Del mismo modo, "una disminución" en el nivel de FRa no unido a una célula puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que no exceda de un valor de corte determinado usando un análisis ROC. También puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es de aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, o aproximadamente el 90% inferior al nivel de FRa en la muestra de control. Una disminución también puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente al menos aproximadamente 1,5, y más preferiblemente aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco o más desviaciones estándar por debajo del nivel medio de FRa en la muestra de control.

Las muestras útiles en los métodos y kits de la invención incluyen cualquier tejido, célula, biopsia o fluido corporal que puede contener niveles detectables de FRa no unido a una célula. En una realización, una muestra puede ser un tejido, una célula, sangre entera, plasma, rascado bucal, saliva, líquido cefalorraquídeo, heces o lavado broncoalveolar. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de tumor que expresa FRa o una muestra de tejidos o células donde se puede encontrar un cáncer que expresa FRa. En realizaciones preferidas, la muestra es una muestra de orina o suero.

Se pueden obtener muestras corporales de un sujeto mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, el uso de una biopsia, o raspando o frotando un área, o mediante el uso de una aguja para aspirar fluidos corporales. Los métodos para la recogida de diversas muestras corporales son bien conocidos en la técnica.

Las muestras adecuadas para la detección y la cuantificación del nivel de proteína FRa pueden ser frescas, congeladas o fijadas de acuerdo a métodos conocidos por un especialista en la técnica. Las muestras de tejido adecuadas preferentemente se seccionan y se colocan en un portaobjetos de microscopio para análisis adicional. Las muestras sólidas, es decir, muestras de tejido, pueden solubilizarse y/o homogeneizarse, y posteriormente se analizan como extractos solubles. Las muestras líquidas también pueden ser sometidas a tratamientos físicos o químicos. En algunas realizaciones, las muestras de orina son tratadas por centrifugación, agitación en vórtex, dilución y/o tratamiento con una sustancia solubilizante (tal como, por ejemplo, tratamiento con guanidina).

En una realización, una muestra de biopsia recién obtenida se congela usando, por ejemplo, nitrógeno líquido o difluorodiclorometano. La muestra congelada se monta para seccionarse utilizando, por ejemplo, OCT, y se secciona en serie en un criostato. Las secciones seriadas se recogen sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio. Para la tinción inmunohistoquímica los portaobjetos se pueden recubrir, por ejemplo, con cromo-alumbre, gelatina o poli-L-lisina para asegurar que las secciones se adhieran a los portaobjetos. En otra realización, las muestras se fijan y se embeben antes de seccionarse. Por ejemplo, una muestra de tejido puede fijarse, por ejemplo, en formalina, deshidratarse en serie e incluirse, por ejemplo, en parafina.

Una vez obtenida la muestra, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica por ser adecuado para detectar y cuantificar FRa no unido a una célula (ya sea a nivel de ácido nucleico o, preferiblemente, a nivel de proteína), como se describe en la sección (B) a continuación. En la técnica son bien conocidos ejemplos de métodos e incluyen, aunque sin limitación, transferencias Western, transferencias Northern, transferencias Southern, inmunohistoquímica, ensayo en fase de disolución, ELISA, por ejemplo, ELISA amplificado, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunocitoquímica, análisis espectrometrométrico de masa, por ejemplo, MALDI-TOF y SELDI-TOF, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ácido nucleico.

En muchas realizaciones, el nivel de FRa no unido a una célula en la muestra (tal como, por ejemplo, orina o suero) se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une a FRa. Los anticuerpos que se unen a FRa son conocidos en la técnica e incluyen (i) el anticuerpo monoclonal de ratón LK26 (las cadenas pesadas y ligeras del mismo se presentan en el presente documento como SEQ ID NO: 22 y 23), como se describe en la Solicitud de Patente Europea N° 86104170.5 (Rettig); (ii) el anticuerpo MORAb-003, como se describe en la Publicación Internacional N° WO2004/113388 y en la Patente de EE.UU. N° 5.646.253. Los anticuerpos monoclonales MOV18 y MOv19 también se unen a diferentes epítopos de la molécula FRa (anteriormente conocida como gp38/FBP). Miotti, S. et al. Int J Cáncer, 38: 297-303 (1987). Por ejemplo, el anticuerpo MOV18 se une al epítopo mostrado en el presente documento como SEQ ID NO: 26 (TELLⁿV^xMⁿA^k*XKEKPXPX*KLXXQX) (nótese que en la posición 12, un residuo de triptófano o histidina es posible, y en la posición 21, es posible tener un residuo de ácido aspártico o un residuo de ácido glutámico), como se muestra en Coney et al. Cáncer Res, 51: 6125-6132 (1991).

Tal como se utiliza aquí, el término "MORAb-003" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a FRa y que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada madura mostrada en la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de cadena ligera madura de la SEQ ID NO: 8. Las correspondientes secuencias de aminoácidos preproteína para MORAb-003 se muestran en la SEQ ID NO: 9 (cadena pesada) y 10 (cadena ligera). El anticuerpo MORAb-003 comprende las siguientes CDRs: SEQ ID NO: 1 como CDRH1, SEQ ID NO: 2 como CDRH2, SEQ ID NO: 3 como CDRH3, SEQ ID NO: 4 como CDRL1, SEQ ID NO: 5 como CDRL2, y SEQ ID NO: 6 como CDRL3. Las células productoras de anticuerpos MORAb-003 han sido depositadas en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 24 de abril de 2006, y se les ha asignado el N° de Acceso PTA-7552.

Otros anticuerpos que se unen FRa y para uso en los métodos de la presente invención incluyen 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (también denominado 9F3), 19D4.B7 (también denominado 19D4), 24F12.B1 (también denominado 24F12), y 26B3.F2 (también denominado 26B3). Las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos, sus CDR, y sus dominios variables de cadena pesada y ligera, así como las secuencias de polinucleótidos que pueden codificarlos, se proporcionan en la Tabla 33. En algunas realizaciones, estos anticuerpos son de IgG de ratón, o derivados de la misma. En otras realizaciones, los anticuerpos son humanos, humanizados, o quiméricos.

9F3

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 31. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 33. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 27; una secuencia de aminoácidos de CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ I D NO: 28; y una secuencia de aminoácidos de CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 29. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 31; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 32; y una secuencia de aminoácidos de CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 33. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 27; una secuencia de CDR2 de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 28; y una secuencia de aminoácidos de CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 29, y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 31; una secuencia de CDR2 de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 32; y una secuencia de aminoácidos de CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 33.

El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 30. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 34. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir dominios variables de cadena ligera y pesada, donde el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 30, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es el anticuerpo 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (9F3) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse ya sea a una forma nativa o a una forma no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de IgG2a de ratón.

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo producido por las células productoras de anticuerpos depositadas en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 2209) el 19 de mayo de 2011 y se le ha asignado el N° de Acceso PTA-11887. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende una o más de las CDRs de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas.

19D4

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 39. En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 41. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 35; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 36; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 37. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 39; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 40; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 41. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 35; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 36; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 37, y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 39; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 40; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 41.

El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 38. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 42. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera o pesada de los dominios variables, en el que el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 38, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es el anticuerpo 19D4.B7 (19D4) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse ya sea a una forma nativa o a una forma no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de IgG2a de ratón.

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo producido por las células productoras de anticuerpos depositadas en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 2209) el 19 de mayo de 2011, y se le ha asignado el N° de Acceso PTA-11884. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende una o más de las CDRs de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas.

24F12

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 47. En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 48. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 49. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 43; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 44; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 45. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 47; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 48; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 49. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 43; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 44; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 45, y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 47; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 48; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 49.

El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 46. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 50. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir dominios variables de cadena ligera y pesada, en la que el dominio variable de cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 46, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 50. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es el anticuerpo 24F12.B1 (24F12) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse ya sea a una forma nativa o a una forma no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de IgG1 de ratón.

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo que es producido por las células productoras de anticuerpos depositadas en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 19 de mayo de 2011 y se le ha asignado el N° de Acceso PTA-11886. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende una o más de las CDRs de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas.

26B3

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 51. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 52. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 53. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 55. En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 56. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa incluye una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 57. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 51; una secuencia de CDR2 de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 52; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 53. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 55; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 56; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 57. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 51; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 52; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 53, y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos CDR1 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 55; una secuencia de aminoácidos CDR2 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 56; y una secuencia de aminoácidos CDR3 sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 57.

El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 54. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 58. El anticuerpo que se une a FRa puede incluir dominios variables de cadena ligera y pesada, donde el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 54, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual, o idéntica a la SEQ ID NO: 58. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es el anticuerpo 26B3.F2 (26B3) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse ya sea a una forma nativa o a una forma no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de IgG1 de ratón.

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa es un anticuerpo producido por las células productoras de anticuerpos depositadas en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 2209) el 19 de mayo de 2011 y se le ha asignado el N° de Acceso PTA-11885. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende una o más de las CDRs de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a FRa comprende las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas.

Las disposiciones de unión a antígeno de las CDRs se pueden diseñar usando proteínas de tipo anticuerpo como plantillas de CDR. Las proteínas de unión a antígeno diseñadas se incluyen dentro del alcance de los anticuerpos que se unen a FRa.

En la técnica se conocen otros anticuerpos reactivos que se unen a FRa, y en la actualidad, muchos de dichos anticuerpos reactivos están disponibles comercialmente (en base a una búsqueda de anticuerpos anti-FRa en http://www.biocompare.com), que se enumeran en la siguiente tabla.

En una realización preferida, el anticuerpo que se une a FRa comprende al menos una de las siguientes CDRs, derivadas de las cadenas pesada y ligera de LK26 de ratón: SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Véase la Patente de EE.UU. N° 5.646.253. Se pueden realizar otras mutaciones en las regiones de marco, tal como se muestra en la Patente de EE.UU. N° 5.646.253.

En otra realización preferida, el anticuerpo incluye una cadena ligera de la región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13), LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14), LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15), y LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO:16); y una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Véase la Patente de EE.UU. N25.646.253 y la Patente de EE.UU. N° 6.124.106. En otra realización, el anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). En otra realización, el anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). En una realización adicional, el anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).

En algunas realizaciones, las muestras pueden necesitar ser modificadas con el fin de hacer accesible el FRa a la unión del anticuerpo. En un aspecto particular de los métodos de inmunocitoquímica o inmunohistoquímica, los portaobjetos se pueden transferir a un tampón de pretratamiento y calentarse opcionalmente para aumentar la accesibilidad del antígeno. El calentamiento de la muestra en el tampón de pretratamiento interrumpe rápidamente la bi-capa lipídica de las células, y hace que los antígenos (puede ser el caso en muestras frescas, pero no lo que ocurre típicamente en muestras fijadas) (es decir, la proteína FRa) sean más accesibles para la unión del anticuerpo. El término "tampón de pretratamiento" se usa indistintamente en este documento para referirse a un tampón que se utiliza para preparar las muestras de citología o histología para la inmunotinción, en particular mediante el aumento de la accesibilidad de la proteína FRa para la unión de anticuerpos. El tampón de pretratamiento puede comprender una disolución salina de pH específico, un polímero, un detergente, o un tensioactivo no iónico o aniónico, tal como, por ejemplo, un agente tensioactivo etilooxilado aniónico o no iónico, un alcanoato o un alcoxilato o incluso mezclas de estos tensioactivos, o incluso el uso de una sal biliar. El tampón de pretratamiento puede ser, por ejemplo, una disolución de 0,1% a 1% de ácido desoxicólico, sal de sodio, o una disolución de sodio de laurilo-13-carboxilato de metilo (por ejemplo, Sandopan LS) y/o un complejo aniónico etoxilado. En algunas realizaciones, el tampón de pretratamiento también puede utilizarse como tampón de almacenamiento de portaobjetos. En una realización particular, la muestra, por ejemplo, muestra de orina, se centrifuga, se agita con vórtex, se diluye y/o se somete a tratamiento con guanidina.

En la práctica de la invención se puede utilizar cualquier método para la fabricación de proteína FRa más accesible para la unión de anticuerpo, incluyendo los métodos de recuperación de antígeno conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bibbo, et al. (2002) Acta. Cytol. 46: 25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27: 365-370; Bibbo, et al. (2003) Anal. Quant. Citol. Histol. 25: 8-11.

Tras el pretratamiento para aumentar la accesibilidad de la proteína de FRa, las muestras pueden ser bloqueadas usando un agente de bloqueo adecuado, por ejemplo, un reactivo de bloqueo de peroxidasa, tal como peróxido de hidrógeno. En algunas realizaciones, las muestras pueden ser bloqueadas usando un reactivo de bloqueo de proteína para prevenir la unión no específica del anticuerpo. El reactivo de bloqueo de proteína puede comprender, por ejemplo, caseína purificada. A continuación, se incuba con la muestra un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o policlonal, que se une específicamente a FRa.

Las técnicas para la detección son bien conocidas en la técnica de unión de anticuerpos. La unión a FRa del anticuerpo puede ser detectada mediante el uso de reactivos químicos que generan una señal detectable que se corresponde con el nivel de unión de anticuerpos y, en consecuencia, con el nivel de expresión de proteína FRa. En uno de los métodos de inmunohistoquímica o inmunocitoquímica de la invención, se detecta la unión de anticuerpos a través del uso de un anticuerpo secundario que está conjugado a un polímero marcado. Los ejemplos de polímeros marcados incluyen, aunque sin limitación, conjugados de polímero-enzima. Las enzimas de estos complejos se utilizan típicamente para catalizar la deposición de un cromógeno en el sitio de unión antígenoanticuerpo, lo que resulta en una tinción de las células que se corresponde con el nivel de expresión del biomarcador de interés. Las enzimas incluyen, aunque sin limitación, peroxidasa de rábano (HRP) y fosfatasa alcalina (AP).

En un método inmunohistoquímico o inmunocitoquímico de la invención, la unión del anticuerpo a la proteína FRa se detecta a través del uso de un polímero marcado con HRP que se conjuga a un anticuerpo secundario. La unión del anticuerpo también se puede detectar a través del uso de un reactivo de sonda específica de la especie, que se une a anticuerpos monoclonales o policlonales, y un polímero conjugado con HRP, que se une al reactivo de sonda específica de la especie. Los portaobjetos se tiñen para la unión usando cualquier cromógeno, anticuerpo, por ejemplo, el cromógeno 3,3-diaminobencidina (DAB), y después se contratiñen con hematoxilina y, opcionalmente, un agente de azulado tal como hidróxido de amonio o TBS/Tween-20. Otros cromógenos adecuados incluyen, por ejemplo, 3-amino-9-etilocarbazol (AEC). En algunos aspectos de la invención, los portaobjetos son revisados microscópicamente por un citotécnico y/o un patólogo para evaluar la tinción de células, por ejemplo, la tinción fluorescente (es decir, la expresión de FRa). Alternativamente, las muestras pueden ser revisadas mediante microscopía automatizada o por personal con la ayuda de software de ordenador que facilite la identificación de células de tinción positiva.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo está marcado. Por ejemplo, la detección de la unión del anticuerpo se puede facilitar mediante el acoplamiento del anticuerpo anti-FRa a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S, 14C o 3H. En una realización particular, el anticuerpo está marcado con un radiomarcador, un marcador cromóforo, un marcador fluoróforo, o un marcador enzimático.

En una realización de la invención se preparan muestras congeladas como se ha descrito anteriormente y se tiñen a continuación con anticuerpos contra FRa diluidos a una concentración apropiada usando, por ejemplo, disolución salina tamponada con Tris (TBS). Los anticuerpos primarios pueden detectarse mediante incubación de los portaobjetos en anti-inmunoglobulina biotinilada. Esta señal opcionalmente puede ser amplificada y visualizarse usando precipitación con diaminobencidina del antígeno. Además, los portaobjetos se pueden contrateñir opcionalmente con, por ejemplo, hematoxilina, para visualizar las células.

En otra realización, las muestras fijadas y embebidas se tiñen con anticuerpos contra FRa y se contratiñen como se ha descrito anteriormente para las secciones congeladas. Además, las muestras se pueden tratar opcionalmente con agentes para amplificar la señal con el fin de visualizar la tinción de anticuerpos. Por ejemplo, puede utilizarse una deposición catalizada por peroxidasa de biotinil-tiramida, que a su vez se hace reaccionar con estreptavidina conjugada con peroxidasa (Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, DAKO, Carpinteria, CA).

El especialista en la técnica reconocerá que la concentración de un anticuerpo particular utilizado para llevar a la práctica los métodos de la invención variará dependiendo de factores tales como el tiempo para la unión, el nivel de especificidad del anticuerpo para FRa, y el método de preparación de la muestra. Además, cuando se usan múltiples anticuerpos, la concentración requerida puede verse afectada por el orden en que los anticuerpos se aplican a la muestra, por ejemplo, al mismo tiempo como un cóctel o secuencialmente como reactivos de anticuerpo individuales. Además, la química de detección utilizada para visualizar la unión de anticuerpo a FRa debe ser optimizada para producir la relación señal-ruido deseada. En una realización de la invención, se utilizan métodos proteómicos, por ejemplo, espectrometría de masas, para detectar y cuantificar la proteína FRa. Por ejemplo, se puede utilizar espectrometría de masas de tiempo-de-vuelo de desorción/ionización por láser asociada a la matriz (MALDI-TOF MS) o espectrometría de masas de tiempo-de-vuelo de desorción/ionización por láser potenciada por superficie (SELDI-TOF MS), que implica la aplicación de una muestra, tal como suero, a un chip de unión a proteínas (Wright, GL, Jr., et al (2002) Expert Rev Mol Diagn. 2: 549; Li, J., et al (2002) Clin Chem. 48: 1296; Laronga, C., et al (2003) Dis Markers 19: 229; Petricoin, EF, et al. (2002) 359: 572; Adam, BL, et al (2002) Cáncer Res 62: 3609; Tolson, J., et al (2004) Lab Invest 84: 845; Xiao, Z., et al (2001) Cancer Res 61: 6029) para detectar y cuantificar la proteína FRa. Los métodos de espectrometría de masas se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N25.622.824, 5.605.798 y 5.547.835.

La presente invención además implica, al menos en parte, la identificación de FRa como biomarcador de pronóstico, es decir, como biomarcador de la progresión y/o la gravedad de un cáncer que expresa FRa, tal como cáncer de ovario o cáncer de pulmón de célula pequeña. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de evaluación de la progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece cáncer de ovario, comparando el nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que una diferencia en el nivel de FRa en la muestra (tal como una muestra de orina o suero) derivada del sujeto en comparación con la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresa rápidamente. Del mismo modo, los métodos de evaluación del nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cáncer que expresa FRa implican comparar el nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia en el nivel de FRa en la muestra (tal como una muestra de orina o suero) derivada del sujeto en comparación con la muestra de control es un indicio de que el sujeto tiene un mayor nivel de riesgo de desarrollar un cáncer que expresa FRa con respecto al riesgo normal en un individuo sano.

En una realización, la diferencia es un aumento. En otra realización, la diferencia es una disminución. En algunos tipos de cáncer (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de la cabeza y cuello, cáncer de ovario), un mayor nivel de expresión de FRa se asocia con un peor pronóstico, mientras que en otros tipos de cánceres (por ejemplo, cáncer de pulmón de célula no pequeña), un mayor nivel de expresión de FRa se asocia con un mejor pronóstico. Por lo tanto, en una realización específica, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario o carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, y la diferencia es un aumento. En otra realización específica, el cáncer que expresa FRa es un cáncer de pulmón de célula no pequeña, y la diferencia es una disminución.

En ciertos aspectos, la invención proporciona métodos de evaluación de la progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa mediante la comparación del nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde un aumento en el nivel de FRa en la muestra (tal como una muestra de orina o suero) derivada del sujeto en comparación con la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresará rápidamente, o una disminución en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el cáncer progresará lentamente o retrocederá. Del mismo modo, los métodos de evaluación del nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cáncer que expresa FRa implican comparar el nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde un aumento del nivel de FRa en la muestra (tal como una muestra de orina o suero) derivada del sujeto en comparación con la muestra de control es un indicio de que el sujeto tiene un mayor nivel de riesgo de desarrollar un cáncer que expresa FRa en comparación con el riesgo normal en un individuo sano, o una disminución en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto tiene un nivel inferior de riesgo de desarrollar un cáncer que expresa FRa, en comparación con un riesgo normal en un individuo sano.

Cualquier aumento o disminución clínicamente relevante o estadísticamente significativa, usando cualquier método de análisis conocido en la técnica, puede utilizarse en la evaluación del pronóstico, el riesgo y otros métodos de la invención. En una realización, un aumento en el nivel de FRa se refiere a un nivel que excede de un valor de corte determinado usando un análisis ROC, como se ejemplifica en el Ejemplo 6. En otra realización, una disminución en el nivel de FRa se refiere a un nivel en una muestra de ensayo que no excede de un valor de corte determinado utilizando un análisis de ROC.

En otras realizaciones, el aumento o disminución debe ser mayor que los límites de detección del método para determinar el nivel de FRa. En realizaciones adicionales, el aumento o disminución debe ser al menos mayor que el error estándar de un método de evaluación, y preferiblemente una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o mayor que el error estándar del método de evaluación. En algunas realizaciones, el aumento o disminución se evalúa utilizando estadísticas descriptivas paramétricas o no paramétricas, comparaciones, análisis de regresión, y similares.

En otras realizaciones, el aumento o la disminución es un nivel en la muestra derivada del sujeto que es aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150%, aproximadamente 200%, aproximadamente 300%, aproximadamente 400%, aproximadamente 500%, aproximadamente 600%, aproximadamente 700%, aproximadamente 800%, aproximadamente 900% o aproximadamente 1.000% mayor o menor que el nivel de FRa en la muestra de control. En realizaciones alternativas, el aumento o la disminución es un nivel en la muestra derivada del sujeto que es al menos aproximadamente 1,5, y más preferiblemente aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco o más desviaciones estándar por encima o por debajo del nivel medio de FRa en la muestra de control. Tal como se usa en la presente memoria, la frase "progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa" puede referirse a la progresión de un cáncer que expresa FRa desde un estado de cáncer menos severo a un estado más grave. Esto podría incluir un aumento en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer está creciendo y extendiéndose, y similares. En ciertas realizaciones, la progresión es una progresión desde un estadio menos severo a un estadio más severo, donde el estadio se evalúa de acuerdo con un esquema de clasificación conocido en la técnica. En una realización, en la que el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario, la progresión se refiere a una progresión desde el estadio I al estadio II, desde el estadio II al estadio III, etc. En otra realización, en la que el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), la progresión se refiere a una progresión del estadio 0 al estadio IA, del estadio IA al estadio IB, del estadio IB al estadio IIA, del estadio IIA al estadio IIB, del estadio Etapa IIB al estadio IIC, etc. En otra forma de realización, en la que el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), la progresión se refiere a una progresión desde un estado menos severo a uno más severo, determinado con arreglo al sistema de clasificación TNM. Véase Spira; Greene; Sobin.

Alternativamente, la frase "progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto que padece un cáncer que expresa FRa" puede referirse a una regresión de un cáncer que expresa FRa desde un estado más grave a uno menos grave, tal como una disminución en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer está creciendo extendiéndose, y similares. En ciertas realizaciones, la progresión es una progresión desde un estadio más severa a una estadio menos grave, en la que la estadio se evalúa de acuerdo con un esquema de clasificación conocido en la técnica. En una realización, en el que el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario, la progresión se refiere a una regresión desde el estadio IV al estadio III, desde el estadio III al estadio II, etc. En otra realización, en el que el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), la progresión se refiere a una progresión desde el estadio IV al estadio IIIB, desde el estadio IIIB al estadio IIIA, desde el estadio IIIA al estadio IIB, etc. En otra realización, en el que el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), la progresión se refiere a una progresión desde un estadio más severo a uno menos severo, tal como se determina bajo el sistema de clasificación TNM. Véase Spira; Greene; Sobin.

En realizaciones adicionales, puede usarse el nivel de FRa para calcular la probabilidad de que un sujeto esté afectado por un cáncer que expresa FRa, determinar la progresión de un cáncer que expresa FRa en un sujeto, determinar el nivel de riesgo de desarrollar un cáncer que expresa FRa, determinar el riesgo de recurrencia del cáncer en un sujeto que está siendo tratado por un cáncer que expresa FRa, determinar la supervivencia de un sujeto que está siendo tratado por un cáncer que expresa FRa, determinar la eficacia del régimen de tratamiento para tratar un cáncer que expresa FRa, y similares, utilizando los métodos de la invención, que pueden incluir los métodos de análisis de regresión conocidos por el especialista en la técnica. Por ejemplo, los modelos de regresión adecuados incluyen, aunque sin limitación, CART (por ejemplo, Hill, T y Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Aplications" StatSoft, Tulsa, OK), Cox (por ejemplo, www.evidence-based-medicine.co.uk), exponencial, normal y log normal (por ejemplo, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), logística (por ejemplo, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression), paramétrico, no paramétrico, semi-paramétrico (por ejemplo, www.soc-serv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), lineal (por ejemplo, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), o aditivo (por ejemplo, www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model).

En una realización, un análisis de regresión incluye el nivel de FRa. En realizaciones adicionales, un análisis de regresión puede incluir covariables clínicas y/o moleculares adicionales. Tales covariables clínicas incluyen, aunque sin limitación, la edad del sujeto, el estadio del tumor, el grado del tumor, el tamaño del tumor, el régimen de tratamiento, por ejemplo, quimioterapia y/o terapia de radiación, el resultado clínico (por ejemplo, recaída, supervivencia específica de la enfermedad, fracaso de la terapia), y/o el resultado clínico en función del tiempo después del diagnóstico, tiempo después del inicio de la terapia, y/o el tiempo después de la finalización del tratamiento. Las covariables moleculares pueden incluir, aunque sin limitación, valores de otros marcadores moleculares adicionales. Por ejemplo, en realizaciones en las que el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario, tales marcadores pueden incluir, por ejemplo, los niveles de CA125 en suero, niveles de DF3 de suero, y/o los niveles de LPA en plasma.

En otros aspectos, la invención proporciona métodos para monitorizar la eficacia de un régimen de terapia o tratamiento. Por ejemplo, la presente invención proporciona métodos para monitorizar la eficacia del tratamiento con MORAb-003 de cáncer de ovario o cáncer de pulmón en un sujeto que padece de cáncer de ovario o cáncer de pulmón. Específicamente, los métodos implican determinar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra derivada de dicho sujeto, en el que a dicho sujeto se le ha administrado previamente MORAb-003; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control, en donde un incremento o ningún cambio en el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control, es un indicio de que el tratamiento con MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminución en el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el tratamiento MORAb-003 es eficaz.

Por ejemplo, la muestra de control puede derivarse de un sujeto no sometido al régimen de tratamiento, y una muestra de ensayo puede derivarse de un sujeto sometido a al menos una parte del régimen de tratamiento. Alternativamente, la muestra de ensayo y la muestra de control pueden derivarse del mismo sujeto. Por ejemplo, la muestra de ensayo puede ser una muestra derivada de un sujeto después de la administración de un agente terapéutico, tal como MORAb-003. La muestra de control puede ser una muestra derivada de un sujeto antes de la administración de un compuesto terapéutico o en una etapa anterior del régimen terapéutico. Por consiguiente, una disminución en el nivel de expresión de FRa en la muestra de ensayo, respecto a la muestra de control, es un indicio de que la terapia ha frenado la progresión del cáncer que expresa FRa, por ejemplo, cáncer de ovario. Para cánceres que expresan FRa en los que un nivel más alto de FRa está asociado con un peor pronóstico, tales como por ejemplo cáncer de ovario o carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, una disminución en el nivel de expresión de FRa en la muestra de ensayo, respecto de la muestra de control, es un indicio de que la terapia es eficaz para retrasar la progresión del cáncer que expresa FRa, o para producir una regresión del cáncer, en el sujeto que padece el cáncer que expresa FRa. En una realización preferida, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario.

En diversas realizaciones de este aspecto de la invención, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis. En realizaciones particulares, la muestra es orina o suero. Además, el FRa puede determinarse por contacto de la muestra con un anticuerpo que se une a FRa, opcionalmente, usando anticuerpos como los descritos en el presente documento y métodos de ensayo como los descritos en el presente documento.

En diversas realizaciones, el anticuerpo de tratamiento MORAb-003 es (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada establecida en la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera establecida en la SEQ ID NO: 8; (b) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003; o (c) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GfTFSGYGLS) como CDRH1, la SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, la SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.

En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otras realizaciones, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón. En realizaciones más específicas, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC). En una de tales realizaciones, el NSCLC se selecciona del grupo que consiste de adenocarcinoma, carcinoma de pulmón de células escamosas, carcinoma de pulmón de célula grande, NSCLC pleomórfico, tumor carcinoide, carcinoma de glándula salival, y carcinoma no clasificado. En una realización preferida, el NSCLC es adenocarcinoma. En realizaciones alternativas, el cáncer de pulmón es carcinoma de pulmón de célula pequeña (SCLC). En otra realización, el cáncer de pulmón es carcinoma bronquioalveolar. En otra realización adicional, el cáncer de pulmón es un tumor carcinoide de pulmón.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para clasificar un sujeto con un cáncer que expresa FRa en grupos de terapia de cáncer en base al nivel determinado de FRa en una muestra. En una realización preferida, el método implica la clasificación de un sujeto con un cáncer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer. En otras realizaciones, el método implica la clasificación de un sujeto con un cáncer que expresa FRa en uno de al menos aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco, aproximadamente seis, aproximadamente siete, aproximadamente ocho, aproximadamente nueve, o aproximadamente diez grupos de terapia de cáncer.

Según la presente invención, los niveles de FRa pueden estar asociados con la gravedad, es decir, el estadio, del cáncer que expresa FRa. Por ejemplo, el cáncer de ovario se clasifica en diferentes estadios en función de la gravedad del cáncer, como se expone en el presente documento. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para clasificar el cáncer de ovario en Estadio I, por ejemplo, Estadio IA, Estadio IB o Estadio IC; Estadio II, por ejemplo, Estadio IIA, Estadio IIB o Estadio IIC; Estadio III, por ejemplo, Estadio IIIA, Estadio IIIB o Estadio IIIC; o cáncer de ovario de Estadio IV.

El SCLS o el NSCLC pueden clasificarse en diferentes estadios en función de la gravedad del cáncer, como se expone en el presente documento. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de clasificación del cáncer de pulmón, por ejemplo, SCLS o NSCLC, en estadio oculto (escondido); estadio 0; Estadio I, por ejemplo, estadios IA y IB; Estadio II, por ejemplo, estadios IIA y IIB; Estadio III, por ejemplo, etapas IIIA y IIIB; o cáncer de pulmón de Estadio IV.

En otro aspecto adicional, la presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que el FRa puede servir como biomarcador predictivo para el tratamiento de cánceres que expresan FRa. Específicamente, los métodos de la presente invención permiten evaluar si un sujeto responderá al tratamiento, por ejemplo, con MORAb-003, y si iniciar el tratamiento y cuándo hacerlo, por ejemplo, con MORAb-003, mediante la evaluación de los niveles de FRa en un sujeto.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir si un sujeto que padece de un cáncer que expresa FRa, por ejemplo, cáncer de ovario o de pulmón, responderá al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinación del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada de dicho sujeto; y comparando el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en la muestra derivada de dicho sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra deriva de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto responde al tratamiento con MORAb-003.

En ciertas realizaciones, el grado de diferencia entre los niveles de FRa no unido a una célula de cáncer en la muestra de ensayo en comparación con la muestra de control es indicativo de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003. Por ejemplo, una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o mayor que el error estándar del método de evaluación es indicativo de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003. Alternativamente o en combinación, una diferencia de al menos aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150%, aproximadamente 200%, aproximadamente 300%, aproximadamente 400%, aproximadamente 500%, aproximadamente 600%, aproximadamente 700%, aproximadamente 800%, aproximadamente 900% o aproximadamente 1000% es indicativo de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003. Alternativamente o en combinación, una diferencia de al menos aproximadamente 1,5, y más preferiblemente de aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco o más desviaciones estándar es indicativo de que el sujeto responderá al tratamiento con MORAb-003.

En diversas realizaciones, el anticuerpo de tratamiento MORAb-003 es (a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003; o (b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, la SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, la SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.

En diversas realizaciones, la muestra es orina, plasma, suero o ascitis. En realizaciones particulares, la muestra es orina o suero. En realizaciones adicionales, el cáncer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer cerebral, cáncer del cuello uterino, cáncer de la nasofaringe, carcinoma de células escamosas de la cabeza y cuello, cáncer endometrial, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de hueso, cáncer de hipófisis, cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular. En una realización particular, el cáncer que expresa FRa es cáncer de ovario. En otra realización, el cáncer que expresa FRa es cáncer de pulmón de célula no pequeña, tal como adenocarcinoma.

B. Ensayos basados en anticuerpos anti-FRa para detectar cánceres que expresan FRa

Hay una variedad de formatos de ensayo conocidos por los especialistas en la una técnica para el uso de un anticuerpo para detectar un polipéptido en una muestra, que incluyen, aunque sin limitación, análisis de inmunoabsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, ensayo en fase de disolución, diálisis de equilibrio, inmunodifusión y otras técnicas. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, DM, “Handbook of Experimental Immunology”, 1986, Blackwell Scientific, Boston. Por ejemplo, el ensayo puede realizarse en un formato de transferencia de Western, en el que una preparación de proteína de la muestra biológica se somete a electroforesis, se transfiere a una membrana adecuada y se deja reaccionar con el anticuerpo. La presencia del anticuerpo en la membrana puede entonces detectarse utilizando un reactivo de detección adecuado, como es bien conocido en la técnica y se describe a continuación.

En otra realización, el ensayo implica el uso de un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse al polipéptido FRa diana y separarlo del resto de la muestra. El polipéptido FRa unido puede entonces detectarse usando un segundo anticuerpo reactivo con un determinante antigénico de polipéptido FRa distinto, por ejemplo, un reactivo que contiene un resto informador detectable. Como ejemplo no limitativo, de acuerdo con esta realización, el anticuerpo inmovilizado y el segundo anticuerpo que reconoce determinantes antigénicos distintos pueden ser cualquiera de dos de los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento, seleccionados de MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398, o variantes de los mismos tal como se describe en el presente documento. Alternativamente, se puede utilizar un ensayo competitivo en el que el FRa es marcado con un resto indicador detectable y se deja unir al anticuerpo anti-FRa inmovilizado después de la incubación del anticuerpo inmovilizado con la muestra. La medida en que los componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido marcado al anticuerpo es indicativa de la reactividad de la muestra con el anticuerpo inmovilizado y, como resultado, es indicativa del nivel de FRa en la muestra.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los especialistas en la técnica al que el anticuerpo puede unirse, tal como un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o un plástico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El anticuerpo puede inmovilizarse sobre el soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas por los especialistas en la técnica, ampliamente descritas en la bibliografía científica y de patentes.

En ciertas realizaciones preferidas, el ensayo para la detección de FRa en una muestra es un ensayo tipo sándwich de dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse poniendo en contacto primero un anticuerpo específico de FRa (p.ej., MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 o variantes de los mismos tal como se describe en el presente documento) que ha sido inmovilizado sobre un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una de placa de microtitulación, con la muestra biológica, de manera que se permite la unión al anticuerpo inmovilizado de una molécula soluble de origen natural en la muestra y que tiene un determinante antigénico que es reactivo (por ejemplo, generalmente es suficiente un tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente) para formar un complejo antígeno-anticuerpo o un complejo inmune. Los constituyentes no unidos de la muestra se separan de los complejos inmunes inmovilizados. A continuación, se añade un segundo anticuerpo específico para FRa, en el que el sitio de combinación de antígeno del segundo anticuerpo no inhibe competitivamente la unión del sitio de combinación de antígeno del primer anticuerpo de FRa inmovilizado (por ejemplo, MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 o variantes de los mismos tal como se describen aquí, que no es igual que el anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre el soporte sólido). El segundo anticuerpo puede estar marcado de forma detectable, tal como se indica en la presente memoria, de manera que se puede detectar directamente. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede ser detectado indirectamente a través del uso de un anti-anticuerpo secundario (o "segunda etapa") marcado de manera detectable, o usando un reactivo de detección específica como se proporciona aquí. El método objeto de la invención no se limita a cualquier procedimiento particular de detección, como apreciarán los que tienen familiaridad con inmunoensayos, ya que hay numerosos reactivos y configuraciones para detectar inmunológicamente un antígeno particular (por ejemplo, FRa) en un inmunoensayo tipo sándwich de dos anticuerpos.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención que usan el ensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos descrito anteriormente, el primer anticuerpo inmovilizado específico para FRa es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo específico para FRa es un anticuerpo policlonal. En otras formas particulares de realización de la invención, el primer anticuerpo inmovilizado específico para FRa es un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo específico para FRa es un anticuerpo policlonal. En otras formas específicas de realización de la invención, el primer anticuerpo inmovilizado específico para FRa es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo específico para FRa es un anticuerpo monoclonal. En otras formas específicas de realización de la invención, el primer anticuerpo inmovilizado específico para FRa es un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo específico para FRa es un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, en las realizaciones cabe señalar que los anticuerpos monoclonales MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 o variantes de los mismos tal como se describen en el presente documento, como se proporciona aquí, reconocen determinantes antigénicos distintos y no competitivos (por ejemplo, epítopos) en polipéptidos de FRa, de manera que se puede emplear cualquier combinación de pares de estos anticuerpos monoclonales. En otras realizaciones preferidas de la invención, el primer anticuerpo inmovilizado específico para FRa y/o el segundo anticuerpo específico para FRa pueden ser cualquiera del tipo de anticuerpos conocidos en la técnica y referenciados en el presente documento, por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, proteínas de fusión de la región V de inmunoglobulina o anticuerpos de cadena sencilla. Aquellos familiarizados con la técnica apreciarán que la presente invención abarca el uso de otras formas de anticuerpos, fragmentos, derivados y similares, en los métodos descritos y reivindicados en el presente documento.

En ciertas realizaciones particularmente preferidas, el segundo anticuerpo puede contener un resto indicador o marcador detectable tal como una enzima, colorante, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o biotina, o similares. La cantidad del segundo anticuerpo que permanece unido al soporte sólido se determina entonces utilizando un método apropiado para el resto indicador detectable o etiqueta específicos. Para grupos radioactivos, generalmente son apropiados el recuento de centelleo o métodos autorradiográficos. Los conjugados anticuerpoenzima se pueden preparar usando una variedad de técnicas de acoplamiento (para una revisión véase, por ejemplo, Scouten, WH, Methods in Enzymology 135: 30-65, 1987). Para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes se pueden utilizar métodos espectroscópicos (incluyendo, por ejemplo, productos colorimétricos de reacciones enzimáticas). La biotina puede detectarse utilizando avidina o estreptavidina, acoplada a un grupo indicador diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos pueden detectarse generalmente mediante la adición de sustrato (generalmente durante un periodo específico de tiempo), seguido por medios espectroscópicos, análisis espectrofotométrico u otro de los productos de reacción. Se pueden utilizar patrones y adiciones de patrones para determinar el nivel de polipéptido de mesotelina en una muestra, utilizando técnicas bien conocidas.

Un método de cribado para determinar la presencia de un cáncer que expresa FRa de acuerdo con la presente invención puede mejorarse adicionalmente mediante la detección de más de un marcador asociado a tumor en una muestra biológica de un sujeto. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método de cribado que, además de la detección de la reactividad de FRa no unido a una célula, también incluye la detección de al menos un marcador soluble adicional de un cuadro clínico maligno utilizando métodos establecidos, como se conoce en la técnica y se proporciona en el presente documento. Como se señaló anteriormente, hay actualmente un número de antígenos asociados a tumores solubles que son detectables en muestras de fluidos biológicos obtenidos fácilmente.

C. Kits

La invención también proporciona usos de kits para evaluar si un sujeto padece un cáncer que expresa FRa, para la evaluación de la progresión de un cáncer que expresa FRa, para evaluar el nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cáncer que expresa FRa, o para monitorizar la eficacia de un régimen de terapia o tratamiento para un cáncer que expresa FRa. Estos kits incluyen medios para determinar el nivel de expresión de FRa e instrucciones para el uso del kit para evaluar la progresión de un cáncer que expresa FRa, para evaluar el nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cáncer que expresa FRa, o para supervisar la eficacia de un régimen de terapia o tratamiento de un cáncer que expresa FRa.

Los kits pueden comprender opcionalmente componentes adicionales útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender medios para obtener una muestra de un sujeto, una muestra de control, por ejemplo, una muestra de un sujeto que padece un cáncer de progresión lenta y/o un sujeto que no tiene cáncer, uno o más compartimentos de muestra, e instrucciones que describen el rendimiento de un método de la invención y controles/estándares específicos de tejidos.

Los medios para determinar el nivel de FRa incluyen métodos conocidos en la técnica para la evaluación de los niveles de proteína, como se ha discutido anteriormente, y formas de realización preferidas específicas, por ejemplo, utilizando el anticuerpo MORAb-003, como se discute en el presente documento. Así, por ejemplo, en una realización, el nivel de FRa se evalúa poniendo en contacto una muestra derivada de un sujeto (tal como orina o suero) con un agente de unión de receptor de folato alfa (FRa). En una realización preferida, el agente de unión es un anticuerpo. Muchos de los tipos de anticuerpos que se unen a FRa se discuten más arriba en los métodos de la invención y también se pueden utilizar en los kits.

Los medios para determinar el nivel de FRa pueden incluir además, por ejemplo, tampones u otros reactivos para su uso en un ensayo para determinar el nivel de FRa. Las instrucciones pueden ser, por ejemplo, instrucciones impresas para realizar el ensayo y/o instrucciones para evaluar el nivel de expresión de FRa.

Los kits pueden incluir también medios para aislar una muestra de un sujeto. Estos medios pueden comprender uno o más elementos del equipo o de los reactivos que se pueden utilizar para obtener un fluido o tejido de un sujeto. Los medios para la obtención de una muestra de un sujeto también pueden comprender medios para aislar componentes de la sangre, tales como suero, a partir de una muestra de sangre. Preferiblemente, el kit está diseñado para su uso con un sujeto humano.

III. Ensayos de cribado

En realizaciones adicionales, la invención también proporciona métodos (también denominados aquí "ensayos de selección") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por ejemplo, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos), que modulan el crecimiento, la progresión y/o la agresividad del cáncer, por ejemplo, un cáncer que expresa FRa, o una célula de cáncer, por ejemplo, una célula de cáncer de ovario, monitorizando y comparando los niveles de FRa en una muestra. Tales ensayos comprenden típicamente un compuesto de ensayo, o una combinación de compuestos de ensayo, cuya actividad contra el cáncer o una célula de cáncer se evalúa. Los compuestos identificados mediante ensayos tales como los descritos en el presente documento pueden ser útiles, por ejemplo, para modular, por ejemplo, inhibir, paliar, tratar, o prevenir la agresividad de un cáncer que expresa FRa o de una célula de cáncer que expresa FRa, por ejemplo, una célula de cáncer de ovario. Monitorizando el nivel de FRa en una muestra se puede determinar si el cáncer que expresa FRa está progresando o retrocediendo, y si el compuesto de ensayo tiene el efecto deseado. Por ejemplo, en realizaciones en las que el cáncer que expresa FRa es un cáncer para el cual mayores niveles de FRa se asocian con un peor pronóstico, una disminución en el nivel de FRa después de la administración del/de los compuesto(s) de ensayo sería indicativa de la eficacia del compuesto de ensayo. Por el contrario, un aumento en el nivel de FRa después de la administración del/de los compuesto(s) de ensayo indicaría que el compuesto de ensayo no es eficaz en el tratamiento de cáncer de ovario. Por el contrario, en formas de realización en las que el cáncer que expresa FRa es un cáncer para el que mayores niveles de FRa están asociados con un mejor pronóstico, un aumento en el nivel de FRa después de la administración del/de los compuesto(s) de ensayo sería indicativo de la eficacia del compuesto de ensayo. Por el contrario, una disminución en el nivel de FRa después de la administración del/de los compuesto(s) de ensayo indicaría que el compuesto de ensayo no es eficaz en el tratamiento de cáncer de ovario.

Los compuestos de ensayo utilizados en los ensayos de cribado de la presente invención pueden obtenerse de cualquier fuente disponible, incluyendo bibliotecas sistemáticas de los compuestos naturales y/o sintéticos. Los compuestos de ensayo también se pueden obtener mediante cualquiera de las numerosas estrategias de los métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con un nuevo esqueleto no peptídico que son resistentes a la degradación enzimática, pero que sin embargo siguen siendo bioactivas; véase, por ejemplo, Zuckermann et al., 1994, J. Med Chem. 37: 2678-85); bibliotecas en fase de disolución o en fase sólida paralelas espacialmente direccionables; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren deconvolución; el método de biblioteca 'una perla-un compuesto'; y métodos de bibliotecas sintéticas que emplean la selección por cromatografía de afinidad. Las estrategias de biblioteca biológica y biblioteca de peptoides se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que las otras cuatro estrategias son aplicables a bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145).

En la técnica se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten, 1992, Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (Lam, 1991, Nature 354: 82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364: 555-556), bacterias y/o esporas, (Ladner, Patente de EE.UU. 5.223.409), plásmidos (Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865 1869) o en fago (Scott y Smith, 1990, Science 249: 386-390; Devlin, 1990, Science 249: 404-406; Cwirla et al., 1990, Proc Natl Acad Sci. 87: 6378-6382; Felici, 1991, J. Mol Biol 222: 301-310; Ladner, ver anterior).

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

EJEMPLO 1. Determinación de niveles de FRa en muestras de orina de sujetos humanos con y sin cáncer de ovario medidos por inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA).

Materiales y métodos

Se obtuvieron muestras de orina de sujetos humanos, incluidos los sujetos que padecen cáncer de ovario y de sujetos de control normales que no padecen cáncer de ovario. Se determinaron los niveles de FRa en muestras de orina utilizando un inmunoensayo de electroquemiluminescencia (ECLIA), de acuerdo con el siguiente procedimiento (véase Namba et al (1999) Analytical Science 15: 1087-1093):

i. Recubrimiento de anticuerpos en microperlas

El anticuerpo anti-receptor de folato alfa monoclonal se revistió sobre la superficie de microesferas (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal). Se mezclaron treinta y seis miligramos de microperlas con 1,2 mL de anticuerpo MOV18 (0,36 mg/ml, Enzo Life Science) en 0,15 mol/L de solución salina de tampón fosfato (PBS) de pH 7,8, seguido de un mezclado suave durante 16 horas a temperatura ambiente. A continuación, las microperlas se lavaron 5 veces con tampón HEPES 50 mM que contenía suero normal de conejo (NRS) al 0,1%, 150 mmol/L de NaCl, 0,01% de Tween 20 pH 7,5 (tampón de lavado). A continuación, las microesferas revestidas se suspendieron en 1,2 mL de tampón HEPES 50 mM que contenía 20% de NRS, 150 mmol/L de NaCl y 0,01% de Tween 20 pH 7,5 (tampón de reacción) para bloquear la superficie no unida, seguido de un mezclado suave durante 3,5 horas a temperatura ambiente. Por último, las microperlas se lavaron 5 veces con tampón de lavado y se resuspendieron con 1,2 mL de tampón HEPES 50 mM que contiene 10% de NRS, 150 mmol/L de NaCl, 10 mmol/L de EDTA-2Na y 0,01% de Tween 20 pH 7,5 (tampón de reacción), de modo que la concentración de microesferas fue de 30 mg/mL. Las microesferas se almacenaron a 4°C hasta su uso.

ii. Etiquetado de anticuerpo con rutenio-quelato-NHS (Ru)

Un mililitro de MORAb-003 (1 mg/mL) en PBS se mezcló con 14 pL de Ru (10 mg/mL), la relación molar inicial de anticuerpo a Ru fue de 1:20, seguido de agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción se terminó mediante la adición de 25 pL de disolución de glicina 2 mol/L, seguido de incubación durante 20 minutos. El anticuerpo marcado se purificó por filtración en gel utilizando Sephadex G-25 (GE Healthcare) eluido con PBS. Se recogió la fracción amarilla que se eluyó primero y se determinó la concentración de anticuerpo y Ru por medio del kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific) y la absorción a 455 nm, respectivamente. La relación molar final se calculó mediante la fórmula: Relación molar final=[(absorción a 455)/13700]/[Ab(mg/mL/150.000)]. El anticuerpo marcado se almacenó a 4°C hasta su uso.

iii. Inmunoensayo de una etapa

Las microperlas revestidas de anticuerpo se establecieron en la tabla de reactivos de Picolumi 8220 (Sanko, Tokio, Japón) después de ajustar la concentración de las perlas a 1,5 mg/mL (disolución de trabajo) en tampón de reacción. El anticuerpo marcado con Ru se estableció en la tabla de reactivos de Picolumi 8220 después de ajustar la concentración de anticuerpo a 2 pg/mL (disolución de trabajo) en tampón de reacción.

Se dispensaron diez microlitros de orina (diluidos 1:51 en tampón de reacción) o de patrón de FRa (preparado en tampón de reacción) y 100 pL de tampón de reacción en un tubo de reacción (Sanko, Tokio, Japón) y se estableció en Picolumi 8220.

Los pasos siguientes se llevaron a cabo automáticamente mediante Picolumi 8220. Se dispensaron veinticinco microlitros de perlas (disolución de trabajo) y 180 pL de anticuerpo marcado con Ru (disolución de trabajo). Después de 26 minutos de incubación a 30 /- 2°C, las perlas se lavaron y se suspendieron en 300 pL de la disolución de electrolito (Sanko, Tokio, Japón). Las perlas lavadas se transfirieron posteriormente al electrodo y se midió la emisión de electroquimioluminiscencia (ECL).

Todas las mediciones de ECL se llevaron a cabo por duplicado.

Resultados

La Tabla 1 representa los niveles en orina de FRa en sujetos individuales con cáncer de ovario y en sujetos de control femeninos no afectados.

Tabla 1: Niveles de FRa en la orina de sujetos con cáncer de ovario y de sujetos de control femeninos normales.

La Figura 2 representa la distribución de niveles de FRa en la orina de sujetos con cáncer de ovario y de sujetos de control femeninos normales, tal como se expone en la Tabla 1.

La Tabla 2 resume el número de sujetos (n), la media, la desviación estándar (SD), los valores máximos (Max.) y mínimos (Min.) correspondientes a los niveles de FRa en el grupo de cáncer de ovario y en el grupo de control normal femenino.

Tabla 2: Resumen de la medición de FRa en orina.

Discusión

Se detectó un nivel alto de FRa en la orina de los sujetos con cáncer de ovario. Por otra parte, los niveles de FRa diferían significativamente entre los grupos de cáncer de ovario y los grupos de control femeninos normales (p=0,03, unilateral).

EJEMPLO 2. Linealidad de dilución - Determinación de niveles de FRa en muestras de orina diluidas en serie, medidos mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA)

La linealidad de dilución es una medida de la precisión de un ensayo. Dos muestras de orina se diluyeron en serie en un factor de 10 y 100. Los niveles FRa de cada muestra se midieron tal como se expone en el Ejemplo 1 y se compararon para evaluar el porcentaje de error. El error porcentual se calcula del siguiente modo:

[[(FRa en la muestra diluida)*(factor de difusión)] -(FRa en la muestra no diluida)1*100

(FRa en la muestra no diluida)

Los resultados se presentan en la Tabla 3:

Tabla 3: Linealidad de dilución para la orina

Los resultados anteriores demuestran la linealidad de dilución en la evaluación de los niveles de FRa en muestras de orina humana y que, dentro de los errores aceptables, la orina puede diluirse hasta un factor de al menos 100 conservando niveles precisos de FRa. En consecuencia, se puede considerar la dilución de las muestras de orina antes de determinar los niveles de FRa.

EJEMPLO 3: Centrifugación de muestras de orina - determinación de la reproducibilidad

También se examinó la reproducibilidad del ensayo ECLIA para una muestra de orina en particular. Por ejemplo, tal como se refleja en la Tabla 4, los ensayos de ECLlA de la misma muestra dieron lugar a resultados variables.

Tabla 4. Reproducibilidad sin centrifugación de la muestra

Se planteó la hipótesis de que la presencia de material insoluble (precipitados) en muestras de orina era responsable de la variabilidad observada en la medición de los niveles de FRa. Como resultado, la centrifugación de muestras con el fin de eliminar el sedimento de orina, antes de la medición de los niveles de FRa, se consideró como una opción para mejorar la exactitud y la reproducibilidad del ensayo.

La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos al centrifugar tres muestras antes de la realización del ensayo ECLlA. Tabla 5. Reproducibilidad con centrifugación de la muestra

Como se ha expuesto anteriormente, los resultados indican que la centrifugación proporciona mediciones más consistentes de concentración de FRa.

Adicionalmente, se sometieron dos muestras a (i) centrifugación (a 2000 x g durante 2 min) y el sobrenadante se retiró para la medición de FRa (representado como muestra "A" a continuación en la Tabla 6), y (ii) centrifugación seguida de agitación en vórtex (representado como muestra "B" a continuación en la Tabla 6), antes de la medición de los niveles de FRa mediante el ensayo ECLIA expuesto en el Ejemplo 1. Los resultados se reflejan en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6: Efecto de la centrifugación en los niveles de FRa en orina

La diferencia (%) se determinó como se indica a continuación:

[[(Nivel de FRa en "B") -(nivel de FRa en "A")1 * 100

(nivel de FRa en "A")

Tal como se muestra en la Tabla 6, los niveles de FRa determinados mediante el ensayo ECLIA varían dependiendo de si la orina se clarificó por centrifugación para eliminar precipitados o de si la orina se agitó en vórtex para suspender o dispersar los sedimentos. Por consiguiente, en ciertas realizaciones se puede llevar a cabo una centrifugación o una agitación de las muestras de orina antes de determinar los niveles de FRa.

EJEMPLO 4. Determinación de los niveles de FRa en muestras de orina centrifugadas de sujetos humanos con y sin cáncer de ovario, medido mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA).

En base a los resultados del Ejemplo 3, se modificó el ensayo para la evaluación de los niveles de FRa en los sujetos para introducir un paso de centrifugación. Los niveles de FRa fueron determinados en las mismas muestras utilizadas en el Ejemplo 1, incluyendo el grupo de sujetos con cáncer de ovario y el grupo de sujetos de control femeninos normales.

Materiales y métodos

La metodología utilizada fue como se describe en el Ejemplo 1, excepto que las muestras de orina se centrifugaron a 10.000 x g durante 1 minuto y el sobrenadante resultante se diluyó posteriormente 1:51 en tampón de reacción. Resultados

La Tabla 7 representa los niveles de FRa en muestras de orina centrifugadas y no centrifugadas de sujetos que padecen cáncer de ovario y los sujetos de control sanos.

Tabla 7: Nivel de FRa1 en orina en el grupo de cáncer de ovario y el grupo de control normal

De acuerdo con los resultados expuestos en la Tabla 7, la centrifugación dio como resultado una disminución de la medida de niveles de FRa en algunas muestras, como se ha demostrado anteriormente en la Tabla 6.

EJEMPLO 5: Detección de FRa en sedimento urinario mediante inmunotransferencia

En base a los resultados mostrados en los Ejemplos 3 y 4, se evaluó la presencia o ausencia de FRa en el sedimento/precipitado de orina mediante transferencia Western.

Materiales y métodos

Se sometieron muestras de orina de 2 pacientes con cáncer de ovario, para las que las concentraciones medidas de FRa fueron 18.747 pg/mL y 145.564 pg/mL, respectivamente (véase la Tabla 10 anterior), a los siguientes procedimientos. Las muestras de control consistieron en 10 gg de lisado de células HeLa, 20 gg de lisado de tejido hepático, y 20 gg de lisado de tejido de cáncer de ovario.

• se centrifugaron 900 gL de orina durante 2 minutos a 10.000 g

• se eliminó el sobrenadante

• se disolvió el sedimento restante en 15 gL de tampón de muestra PAGE (que contiene LDS 292 mM) y posteriormente se hirvió a 70°C durante 10 min

• la muestra completa (aprox. 20 gL) se cargó en el gel de bis-tris NuPAGE (Invitrogen)

• después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF

• se añadió 1% de leche desnatada/0,05% de Tween 20/PBS para bloquear

• la membrana se lavó con 0,05% de Tween 20/PBS

• se añadieron 0,5 mL de anticuerpo monoclonal 548908 (R&D Systems) a 2 gg/mL y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente

• la membrana se lavó con 0,05% de Tween 20/PBS

• se añadieron 10 mL de IgG anti-ratón-HRP (DAKO p0447, 1:2000) y se dejó incubar durante 60 minutos • la membrana se lavó con 0,05% de Tween 20/PBS

• se añadió sustrato Pierce ECL a la membrana

• la membrana se retiró de los sustratos y después se obtuvieron imágenes usando el sistema LAS-3000 (FUJIFILM)

Resultados

La inmunotransferencia resultante se muestra en la Figura 3. En esta figura, los carriles 1-5 corresponden a FRa detectado en las siguientes fuentes:

(1) orina de pacientes con cáncer de ovario con un nivel de FRa medido de 18.747 pg/mL

(2) orina de pacientes con cáncer de ovario con un nivel de FRa medido a 145.564 pg/mL

(3) lisado de células HeLa: 10 gg

(4) lisado de tejido de hígado: 20 gg

(5) lisado de tejido de cáncer de ovario: 20 gg

El carril 6 en la transferencia Western representa marcadores de peso molecular y demuestra que la banda observada en los carriles 1,2, 3 y 5 corresponde al peso molecular esperado para FRa.

Los carriles 3 y 5 son muestras de control positivo y el carril 4 es una muestra de control negativo. La banda débil del carril 1 y la banda clara del carril 2 demuestra que se puede detectar FRa en el sedimento de orina de pacientes con cáncer de ovario mediante transferencia Western.

EJEMPLO 6. Determinación de los niveles de FRa en muestras de orina humana normal tratadas con guanidina mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA).

En base a los resultados del Ejemplo 4, en el que la centrifugación dio como resultado niveles disminuidos de FRa, y los resultados del Ejemplo 5, donde se demostró que el sedimento de orina obtenido mediante centrifugación para contener FRa inmunorreactivo, se buscaron métodos para solubilizar los sedimentos de orina para obtener mediciones más cuantitativas y precisas de FRa.

En este sentido, se intentó el tratamiento de muestras de orina femeninas normales con guanidina antes de evaluar los niveles de FRa.

La metodología utilizada fue la descrita en el Ejemplo 1, excepto que se mezclaron muestras de orina en una relación 1:1 con guanidina 6 M en tampón (PBS) o con tampón solo. Posteriormente, se diluyeron las muestras de orina a 1:51 en tampón de reacción.

Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: Nivel de FRa normal en orina con o sin tratamiento de guanidina.

Los resultados de este experimento indican que la guanidina no interfiere con las mediciones de FRa. Como se puede observar, para el control de antígeno puro (Std Ag), esta metodología de tratamiento con guanidina y posterior dilución no tiene ningún efecto en la medición de FRa. Además, cabe destacar que en las tres (3) muestras de orina evaluadas, los niveles de FRa fueron mayores en las muestras tratadas (solubilizadas) con guanidina en relación con las muestras no tratadas con guanidina.

La fiabilidad del pre-tratamiento de guanidina de las muestras de orina se evaluó adicionalmente mediante la exposición de tres muestras a guanidina y la medición de la concentración de FRa de cada muestra de guanidina tratada 3 veces usando el ensayo ECLIA. Los resultados se reflejan en la Tabla 9 a continuación:

Tabla 9: Reproducibilidad intra-ensayo de orina tratada con guanidina

Como se ha expuesto anteriormente, los resultados indican que el tratamiento con guanidina de la orina antes del ensayo de FRa proporciona mediciones consistentes de concentración de FRa con CV’s muy bajos.

EJEMPLO 7. Determinación de los niveles de FRa en muestras de orina tratadas con guanidina de sujetos humanos con y sin cáncer de ovario, medidos mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA).

En base a los resultados del Ejemplo 6 en el que se muestra que el tratamiento de guanidina no interfiere con los ensayos de FRa, se empleó un protocolo de ensayo modificado para medir FRa en las muestras de orina de los sujetos con y sin cáncer de ovario del Ejemplo 1.

Se empleó el siguiente protocolo de ensayo:

Materiales y métodos

La metodología utilizada fue la descrita en el Ejemplo 1, excepto que las muestras de orina se mezclaron en una relación 1:1 con un tampón de guanidina 6 M y posteriormente se diluyeron 1:26 en tampón de reacción.

Resultados

La Tabla 10 muestra los niveles de FRa en muestras de orina tratadas de guanidina de sujetos que padecen cáncer de ovario y de sujetos de control femeninos sanos.

Tabla 10: Nivel de FRa en orina en el grupo de cáncer de ovario y el grupo de control normal

La Figura 4 muestra la distribución de niveles de FRa en la orina de sujetos con cáncer de ovario y en sujetos de control normales femeninos utilizando el protocolo modificado con el tratamiento de guanidina. Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos. La Tabla 11 resume estos resultados.

Tabla 11: Resumen de las medidas de FRa en orina

Mediante el uso de los datos de este experimento, se realizó un análisis de característica operativa del receptor (ROC). La Figura 5 muestra una curva ROC de la sensibilidad y especificidad de la medida ECLIA de niveles de FRa en orina después de tratar la orina con guanidina. AUC es el área bajo la curva, que mide la precisión de la prueba para discriminar el cáncer de ovario de los sujetos de control.

Mediante el uso de un valor de corte arbitrario de 9100 pg de FRa/mL, el AUC era de 0,70 con un valor predictivo positivo de 70% y un valor predictivo negativo del 80%, como se muestra en la Tabla 12. Usando este valor de corte, 15/19 pacientes con cáncer de ovario presentaron una concentración de FRa por encima de 9100 pg/mL, y 8/10 sujetos normales presentaron una concentración de FRa inferior a 9100 pg/mL.

Tabla 12: Tratamiento de guanidina para la medición de la orina

EJEMPLO 8: Corrección de creatinina de concentraciones de FRa determinadas en muestras de orina tratadas con guanidina mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA)

Las concentraciones de FRa se determinaron previamente utilizando ECLIA en muestras de orina tratadas con guanidina de pacientes con cáncer de ovario y de controles femeninos normales (véase el Ejemplo 7, Tabla 10). Aquí, estas concentraciones de FRa fueron corregidas respecto a los niveles de creatinina en orina con el fin de normalizar en relación a la velocidad de filtración glomerular. Los valores resultantes se sometieron a un análisis ROC.

Métodos

El nivel de creatinina urinaria se determinó mediante el kit de ensayo aprobado por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, determinante L CRE (Kyowa Medex, Japón). El valor corregido para concentración de FRa en orina se calculó del siguiente modo:

Corrección de creatina de FRa de orina (ng/g)

=(FRa en orina (ng/L) x 1000) / (Creatina en orina (mg/dL) x10)

=(FRa en orina (ng/L) x 1000) / Creatina en orina (mg/L)

= FRa en orina (ng/L) / Creatina en orina (g/L)

= FRa en orina (ng) / Creatina en orina (g)

o

= 1/1000 x FRa en orina (pg) / Creatina en orina (g)

Resultados

La Tabla 13 presenta los niveles de FRa corregidos para creatinina resultantes.

Tabla 13: Niveles de FRa corregidos para creatinina determinados usando ECLIA de muestras de orina tratadas con guanidina

La Figura 6 muestra la distribución de niveles de FRa en sujetos de cáncer de ovario (OC) y en sujetos de control femeninos normales después de la corrección para los niveles de creatinina en orina. Hay una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de FRa corregidos para creatinina de pacientes de cáncer de ovario y de los controles (p=0,007).

El resumen de datos correspondientes a sujetos de cáncer de ovario y de control normales se proporciona en la Tabla 14.

Tabla 14: Resumen de las estadísticas para niveles de FRa corregidos para creatinina.

Los niveles de FRa corregidos para creatinina se sometieron además a un análisis ROC. La curva ROC se muestra en la Figura 7. La Tabla 15 presenta la sensibilidad, especificidad, y el área bajo la curva (AUC) para varios valores de corte del ensayo corregido para creatinina.

Tabla 15: Sensibilidad, especificidad y AUC para varios valores de corte del ensayo de FRa corregido para creatinina.

Como se señaló anteriormente, existe una clara discriminación entre orinas de pacientes con cáncer de ovario y las de los sujetos de control sanos femeninos.

EJEMPLO 9: Inmunoensayo enzimático (EIA) y optimización del mismo

1. Inmunoensayo enzimático (EIA)

Recubrimiento de anticuerpo a placas de microtitulación

El anticuerpo monoclonal anti-receptor de folato alfa se revistió sobre la superficie de placas de microtitulación (Nunc-immunoplate, Thermo Scientific) del siguiente modo. Se dispensó en los pocillos cien microlitros de anticuerpo (absorbancia de 0,02 a 280 nm) en 50 mmol/L de tampón de carbonato de pH 9,4, seguido de revestimiento durante 16 horas a 4°C. A continuación, las microplacas se lavaron 2 veces con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (PBS-T). Después de esto se dispensaron en los pocillos 0,15 mL de PBS que contenía 20% suero normal de conejo pH 7,8 para bloquear la superficie no unida, seguido de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, las microplacas se lavaron 2 veces con PBS-T. Las placas recubiertas de anticuerpo se secaron y se mantuvieron a 4°C en bolsas de aluminio hasta su uso.

Etiquetado con biotina

El etiquetado con biotina se realizó de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes para EZ-Link Sulfo-NHS LC-LC-Biotin (N° de Producto 21338, Thermo Scientific). Brevemente, se mezcló 1 mg de anticuerpo en 0,4 mL de PBS con 0,013 mL de 10 mM de Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin, con una relación inicial molar de anticuerpo a biotina de 1:20, seguido de incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo acoplado a biotina se purificó por filtración en gel utilizando una columna PD-10 (GE Healthcare) eluida con PBS para eliminar la biotina no reaccionada. Con el fin de determinar el nivel de incorporación de biotina, se utilizó el kit de cuantificación EZ Biotin (Producto N° 28005, Thermo Scientific). El anticuerpo marcado con biotina se almacenó a -80°C hasta su uso. Inmunoensayo de dos etapas

Para la primera reacción, se dispensó en los pocillos recubiertos de anticuerpo 40 pL de plasma o de antígeno estándar y 60 pL de tampón HEPES 50 mM que contiene 10% de NRS, 150 mmol/L de NaCl, 10 mmol/l de EDTA-2Na, 0,01% de Tween 20, pH 7,5 (tampón de reacción). La placa se incubó durante 18 horas a 4°C, y posteriormente se lavó 5 veces con PBS-T. Para la segunda reacción, se dispensaron 100 pL de anticuerpo marcado con biotina 10 pg/mL en tampón de reacción. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, y posteriormente se lavó 5 veces con PBS-T. Se dispensaron 100 pL de estreptavidina (Pierce) marcada con peroxidasa de rábano. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron 5 veces con PBS-T. Finalmente, para el desarrollo del color, se dispensaron 100 pL de disolución de TMB (KPL) y se dejó durante 15 minutos en la oscuridad. Después de parar el desarrollo del color mediante la adición de 100 pL de HCl 1N, se leyó la absorción a 450 nm usando un lector de placas. Todas las etapas de lavado se realizaron automáticamente mediante un dispositivo automático de lavado de placas (AMW-8, Biotec, Japón), y todas las mediciones de EIA se llevaron a cabo por duplicado.

La Figura 8 representa el ensayo EIA usando MOV18 como anticuerpo de captura y MORAb-003 biotinilado como anticuerpo detector.

2. Optimización de los procedimientos de EIA

Los procedimientos de EIA anteriores se formularon, en parte, en base a los siguientes experimentos diseñados para optimizar el procedimiento.

En primer lugar, se comparó el anticuerpo marcado con biotina y avidina-HRP y el anticuerpo marcado con HRP. En comparación con el anticuerpo marcado con HRP, el anticuerpo marcado con biotina y avidina-HRP proporcionó una señal más alta; por lo tanto, se empleó el anticuerpo marcado con biotina y avidina-HRP.

En segundo lugar, se compararon los procedimientos de incubación de una y dos etapas. Como se representa en la Figura 9, un procedimiento de incubación de dos etapas dio una señal más alta y por lo tanto éste fue el empleado. En tercer lugar, para optimizar el segundo tiempo de incubación, se compararon los tiempos de incubación de una a cuatro horas. Los resultados indicaron que los tiempos de incubación de una hora proporcionan la ratio señal a ruido más alta y por lo tanto se empleó a continuación un tiempo de incubación de una hora.

En cuarto lugar, con el fin de optimizar la concentración de trabajo de anticuerpo marcado con biotina, de anticuerpo marcado con HRP y el volumen de muestra, se emplearon diferentes concentraciones como se expone en la descripción anterior del ensayo EIA. Las concentraciones óptimas de valores se han descrito anteriormente.

EJEMPLO 10: Comparación de FRa en plasma humano usando inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) e inmunoensayo enzimático (EIA)

Se midieron los niveles de FRa en muestras de plasma humano tomadas de pacientes de cáncer de ovario y de controles femeninos sanos, utilizando el ensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) descrito en el Ejemplo 1 y la Figura 1 (utilizando MORAb-003 como anticuerpo de captura y MOV-18 marcado con rutenio (Ru) como anticuerpo detector marcado) y el inmunoensayo enzimático (EIA) descrito en el Ejemplo 9 y la Figura 8. En ambos ensayos, se evaluaron 40 pL de plasma.

La Tabla 16 muestra los niveles plasmáticos de FRa en sujetos de cáncer de ovario y en sujetos de control normales, determinados usando EIA y ECLIA.

Tabla 16: Concentraciones plasmáticas de FRa determinadas usando los métodos de EIA y ECLIA.

Con una sola excepción, los resultados para todos los sujetos indicaron que las concentraciones de FRa detectadas en suero utilizando EIA son más bajas que los niveles detectados usando ECLIA, lo que demuestra que el ensayo EIA, con este formato, no es tan sensible como el ensayo ECLIA cuando se emplea esta combinación particular de anticuerpo de captura (MOV-18) y anticuerpo detector (MORAb- 003). Por lo tanto, se llevaron a cabo experimentos adicionales con otros tipos de anticuerpos para desarrollar un procedimiento de EIA más sensible.

EJEMPLO 11: Viabilidad de los diferentes tipos de anticuerpos para la medición con EIA de FRa en el plasma humano

1. Experimentación preliminar de combinaciones de anticuerpos

Se consideraron varias combinaciones de anticuerpos de captura/detección. La experimentación preliminar rindió los resultados expuestos en la Tabla 17.

Tabla 17

2.Comparación de ensayos EIA usando varias combinaciones de anticuerpos y comparación con el ensayo ECLIA Se midieron los niveles de FRa en el plasma de pacientes con cáncer de ovario y controles normales femeninos sanos usando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (EIA) con diferentes combinaciones de anticuerpos de captura y anticuerpos marcados con biotina, y se compararon con los niveles de FRa medidos usando el ensayo ECLIA.

Materiales y métodos

El método ECLIA fue como se describe en el Ejemplo 1 y se representa en la Figura 1 (usando el anticuerpo MORAb-003 como anticuerpo de captura y el anticuerpo Mov-18 como anticuerpo detector marcado). El método EIA fue como se describe en el Ejemplo 9, excepto que se emplearon tres combinaciones diferentes de anticuerpo de captura/detector, tal como se representa en la Figura 10: MOV18/MORAb-003, 548908/MORAb-003 y 6D398/MORAb-003. Los anticuerpos 548908 y 6D398 están disponibles comercialmente. El anticuerpo 548908 se obtuvo de R&D Systems (North Las Vegas, NV) y el anticuerpo 6D398 se obtuvo de US Biological (Swampscott, MA 01907).

Resultados

Las concentraciones de FRa (pg/mL) determinadas usando los métodos EIA y ECLIA se muestran en la Tabla 18. Además, las concentraciones de FRa (pg/mL) determinadas por EIA usando varias combinaciones de anticuerpo de captura/detector se representan gráficamente en la Figura 11.

Tabla 18: Concentraciones plasmáticas de FRa (pg/mL) determinadas usando los métodos EIA y ECLIA con diversas combinaciones de anticuerpos de captura y anticuerpos detectores.

Los datos de la Tabla 18 indican que las medidas de niveles de FRa con EIA utilizando la combinación 54908-MORAb-003 dan resultados que son más similares a los resultados obtenidos utilizando el ensayo de ECLIA. Se realizaron análisis cuantitativos, que confirmaron esta observación. Además, estos datos demuestran que la detección de FRa es dependiente de los anticuerpos y de la combinación de anticuerpos empleados. Por consiguiente, se pueden emplear diferentes combinaciones de anticuerpos para la determinación de FRa en fluidos biológicos. Además, ya que los datos obtenidos de los formatos de ensayo EIA y ECLIA son similares, se pueden utilizar diferentes formatos de ensayo para la determinación de FRa.

Para cada una de las tres combinaciones de anticuerpos de captura y detector utilizadas para el método de EIA, se realizó un análisis de regresión, y las concentraciones de FRa (pg/mL) determinadas con EIA se correlacionaron con las concentraciones determinadas con el ensayo ECLIA. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 19 y en la Figura 12.

Tabla 19: Correlaciones de las concentraciones plasmáticas de FRa medidas por ECLIA con las concentraciones medidas por EIA utilizando tres combinaciones de anticuerpos de captura y detector.

Los resultados para EIA utilizando la combinación de captura-detector 548098-MORAb-003 se correlacionaron bien (r=0,96) con los resultados para ECLIA.

EJEMPLO 12: Niveles en plasma de FRa determinados mediante EIA y ECLIA en muestras de pacientes con cáncer de ovario

Las mediciones de niveles de FRa en suero se determinaron en un grupo de pacientes con cáncer de ovario (n=17) y en controles normales (n=35) utilizando ECLIA y EIA. Para las mediciones de la EIA, se empleó la combinación de anticuerpos 548908 captura/MORAb-003 detector. Para el resto de casos, el procedimiento EIA fue como se describe en el Ejemplo 9. El procedimiento ECLIA fue como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20: Concentraciones en plasma de FRa en pacientes con cáncer de ovario y en controles normales, determinadas usando EIA y ECLIA.

La Figura 13 muestra la distribución de concentraciones de FRa de plasma en sujetos con cáncer de ovario y en sujetos de control femeninos normales, determinadas usando EIA.

La Tabla 21 muestra las estadísticas descriptivas de resumen para las concentraciones de FRa en plasma de sujetos con cáncer de ovario y de sujetos de control normales femeninos, determinadas EIA.

Tabla 21: Resumen de concentraciones plasmáticas de FRa en sujetos con cáncer de ovario y en sujetos de control femeninos normales determinadas usando EIA.

La Figura 14 representa además la correlación entre las concentraciones plasmáticas de FRa determinadas utilizando EIA y ECLIA. La correlación es alta (r=0,95).

EJEMPLO 13. Determinación de los niveles de FRa en muestras contrastadas de orina y suero de pacientes con cáncer de pulmón y pacientes con cáncer de ovario, medidas mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA)

Se determinaron los niveles de FRa en muestras de orina y suero de pacientes de cáncer de pulmón y de cáncer de ovario usando ECLIA, donde se tomaron las muestras del mismo paciente. También se determinó la correlación entre los niveles de FRa en suero y orina.

Materiales y métodos

La metodología ECLIA utilizada es como se describe en el Ejemplo 1. La guanidina fue utilizada para solubilizar los sedimentos de orina tal como se describe en el Ejemplo 6.

Resultados

Los resultados de los ensayos de ECLIA de suero y orina de pacientes con cáncer de pulmón y cáncer de ovario se presentan en la Tabla 22.

Tabla 22: Concentraciones de FRa en las muestras de orina y suero de pacientes con cáncer pulmonar y pacientes de cáncer de ovario, determinadas por ECLIA.

Los datos resumidos correspondientes a los niveles de FRa en suero y orina de pacientes con cáncer de pulmón se presentan en la Tabla 23.

Tabla 23: Resumen de las estadísticas correspondientes a las concentraciones de FRa en las muestras de suero y orina de pacientes de cáncer de pulmón, determinadas por ECLIA

Los datos resumidos correspondientes a los niveles de FRa en suero y orina de pacientes con cáncer de ovario se presentan en la Tabla 24.

Tabla 24: Resumen de las estadísticas correspondientes a las concentraciones de FRa en las muestras de suero y orina de pacientes de cáncer de ovario, determinadas por ECLIA

La Figura 15 muestra las correlaciones entre las medidas de ECLIA de los niveles de FRa en muestras de suero y orina tomadas del mismo paciente. La correlación para pacientes con cáncer de pulmón fue de r=0,24 (panel superior) y la correlación para los pacientes con cáncer de ovario fue de r=-0,76 (panel inferior).

Estos datos demuestran la relativa falta de correlación entre las concentraciones de FRa medidas en la orina en comparación con el suero, especialmente tal como se muestra para pacientes de cáncer de pulmón. Además, estos datos demuestran que el FRa es básicamente no detectable por encima de los niveles de fondo en el suero de pacientes con cáncer de pulmón, respecto a los controles normales, mientras que el FRa sí es detectable en la orina de dichos pacientes.

EJEMPLO 14. Evaluación de los niveles de FRa en muestras de suero de pacientes con cáncer de ovario, pacientes con cáncer de pulmón, y controles normales

Se evaluaron los niveles de FRa en el suero de pacientes con cáncer de ovario, de pacientes con cáncer de pulmón, y de controles normales. Los niveles de FRa en suero se evaluaron usando ECLIA con dos pares diferentes de anticuerpos de captura-detector: Par 1, en el que 9F3 era el anticuerpo de captura y 24F12 era el anticuerpo detector, y el Par 2, en el que 26B3 era el anticuerpo de captura y 19D4 era el anticuerpo detector.

Los pares de FRa se ensayaron con las curvas de calibrador completo y 196 sueros individuales diluidos 1:4. En un experimento, se utilizó 26B3 como anticuerpo de captura después del procesamiento CR en un lote de placa (75 pg/mL, B, T) y se usó 19D4 como anticuerpo detector a 1,0 pg/mL. En otro experimento, se usó 9F3 como anticuerpo de captura y se utilizó 24F12 como anticuerpo detector a 1,0 pg/mL. Cada uno se procesó por CR (lote 10070) con una proporción de etiqueta a proteína (L/P) de 13,3. Se utilizó diluyente 100 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) mIgG para las muestras y el calibrador. Se utilizó diluyente 3 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) para las detecciones.

Se empleó el siguiente protocolo para ECLIA. Se añadieron las muestras a 50 pL/pocillo. Las muestras se agitaron durante 2 horas y posteriormente se lavaron con disolución salina de tampón de fosfato (PBS) con el detergente Tween 20 (PBST). El anticuerpo detector se añadió a 25 pL/pocillo. Las muestras se agitaron durante 2 horas y después se lavaron con PBST. Por último, la emisión de electroquimioluminiscencia (ECL) de las muestras se leyó con 2X MSD® Buffer T.

Los resultados se muestran en la Tabla 25 a continuación.

Tabla 25: Niveles de FRa en suero de pacientes con cáncer de ovario, pacientes con cáncer de pulmón y controles normales.

En base a los datos anteriores, es evidente que los anticuerpos 9F3, 2412, 26B3 y 19D4 son útiles en la detección de niveles de FRa en muestras biológicas, por ejemplo suero, derivadas de un sujeto. Además, las combinaciones particulares de (i) 9F3 como anticuerpo de captura y 24F12 como anticuerpo detector y (ii) 26B3 como anticuerpo de captura y 19D4 como anticuerpo detector son capaces y particularmente eficaces para evaluar los niveles de FRa en muestras biológicas.

EJEMPLO 15. Evaluación de los niveles de FRa en orina usando tres pares de anticuerpos detectores y de captura diferentes

Se evaluó la capacidad de los tres pares de anticuerpos anti-FRa en la detección de los niveles de FRa en muestras de orina. Los pares de anticuerpos utilizados fueron los siguientes: (1) 26B3 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura, y (2) 24F12 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura.

Método

Dos pares de anticuerpos fueron examinados con las curvas de calibrador completas y orina tratada previamente con una dilución 1:1 durante 2 minutos en guanidina 6 M, guanidina 3 M o control de PBS. Las siguientes muestras de orina fueron examinadas: tres depósitos de orina humana diluidos 1:80, y cinco orinas individuales humanas diluidas 1:80 (una masculina, cuatro femeninas).

Las placas se marcaron a 150 pg/mL, B, T, en 4spot STD ((Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)), una captura por pocillo. Las detecciones se realizaron a 1 pg/mL. Se utilizó diluyente 100 HAMA mIgG para las muestras y el calibrador. Se utilizó diluyente 3 para las detecciones. Los diluyentes eran diluyentes disponibles comercialmente obtenidos de Meso Scale Discovery.

Se empleó el siguiente protocolo para ECLIA. Se añadieron las muestras a 50 pL/pocillo. Las muestras se agitaron durante 2 horas. Las muestras se lavaron con disolución salina de tampón de fosfato (PBS) con el detergente Tween 20 (PBST). El anticuerpo detector se añadió a 25 pL/pocillo. Las muestras se agitaron durante 2 horas y posteriormente se lavaron con PBST. Se leyó la emisión de electroquimioluminiscencia (ECL) de las muestras con 2X MSD Buffer T.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las Tablas 26-27.

Tabla 26: Detección de niveles de FRa en orina usando 26B3 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura.

Tabla 27: Detección de niveles de FRa en orina usando 24F12 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura.

En base a los datos anteriores, es evidente que los anticuerpos de 9F3, 24F12, 26B3 y 19D4 son útiles en la detección de niveles de FRa en muestras biológicas derivadas de un sujeto. Además, las combinaciones de (1) 26B3 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura y (2) 24F12 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura, son capaces y particularmente eficaces para evaluar niveles de FRa en muestras biológicas. Se llevó a cabo un segundo conjunto de experimentos, siguiendo el protocolo descrito anteriormente y utilizando los mismos dos pares de anticuerpos, usando cuatro orinas individuales humanas femeninas diluidas 1:80. La orina se trató previamente con una dilución 1:1 durante 2 minutos en guanidina 3M o control de PBS. Los resultados se muestran en las Tablas 28-29.

Tabla 28: Detección de niveles de FRa en la orina usando 26B3 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura.

Tabla 29: Detección de niveles de FRa en orina usando 24F12 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura.

Los resultados de este segundo conjunto de experimentos confirman adicionalmente los resultados de la primera serie de experimentos, y demuestran que el nivel de FRa que no está unido a una célula se puede evaluar de manera fiable, por ejemplo, en la orina, usando ensayos tales como el ensayo ECLIA y utilizando los anticuerpos 26B3, 9F3, 24F12. Además, los resultados demuestran que tales ensayos pueden detectar eficazmente FRa usando pares de anticuerpos detector y de captura que se unen a FRa (tales como, por ejemplo, 26B3 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura, y 24F12 como anticuerpo detector y 9F3 como anticuerpo de captura). EJEMPLO 16. Evaluación de los niveles de FRa en suero y plasma

Los niveles de FRa se evaluaron en muestras de suero y plasma en dos días separados. Los sujetos de los que se derivaron las muestras eran o bien sujetos normales o bien pacientes con cáncer de ovario o pulmón.

El protocolo para evaluar los niveles de FRa fue igual al explicado en el Ejemplo 14 anterior. Los pares de anticuerpos usados para la evaluación de niveles FRa fueron también los mismos que en el Ejemplo 14, es decir, Par 1, en el que 9F3 era el anticuerpo de captura y 24F12 era el anticuerpo detector, y el Par 2, en el que 26B3 era el anticuerpo de captura y 19D4 era el anticuerpo detector.

Los resultados se proporcionan en la Tabla 30.

Tabla 30: Niveles de FRa evaluados en muestras de suero y plasma en diferentes días.

En base a los datos anteriores, es evidente que los anticuerpos 9F3, 2412, 26B3 y 19D4 son útiles en la detección de niveles de FRa en muestras biológicas, por ejemplo, de suero o plasma, derivadas de un sujeto. Además, las combinaciones particulares de (i) 9F3 como anticuerpo de captura y 24F12 como anticuerpo detector y (ii) 26B3 como anticuerpo de captura y 19D4 como anticuerpo detector son capaces y particularmente eficaces en la evaluación de los niveles de FRa en muestras biológicas.

Para los ensayos llevados a cabo utilizando tanto el par 1 como el par 2, se observó una alta correlación entre los niveles de FRa en suero y plasma. La Figura 16 muestra la correlación de los niveles de FRa en suero y plasma para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 (véase el ejemplo 16). El valor R2 fue de 0,8604. La Figura 17 muestra la correlación de los niveles FRa en suero y plasma para los ensayos llevados a cabo usando el par 2 (véase el Ejemplo 16). El valor R2 fue de 0,9766.

Tanto para muestras de suero como de plasma, se observó una alta correlación entre los niveles de FRa medidos usando el par 1 y el par 2. La Figura 18 muestra la correlación en los niveles de FRa en suero para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 frente al par 2 (véase el Ejemplo 16). El valor R2 fue 0,9028. La Figura 19 muestra la correlación de los niveles de FRa en plasma para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 frente al par 2 (véase el Ejemplo 16). El valor R2 fue 0,8773.

Los resultados también mostraron que hay una alta correlación entre los niveles de FRa medidos en días diferentes. La Figura 20 muestra la correlación entre días de los niveles de FRa en suero para ensayos realizados usando el par 2. El valor R2 fue 0,9839.

EQUIVALENTES

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando meramente experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención aquí descritas. Se pretende que las siguientes reivindicaciones abarquen tales equivalentes. Se contempla que cualquier combinación de las realizaciones descritas en las reivindicaciones anexas entre dentro del alcance de la invención.

Tabla 33: Secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar si un sujeto padece cáncer de ovario, comprendiendo el método

determinar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra de suero o plasma derivada de dicho sujeto realizando un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) o un inmunoensayo enzimático (EIA); y

comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control,

identificar un aumento en el nivel de FRa en la muestra de suero o plasma derivada de dicho sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control; y determinar que el sujeto padece cáncer de ovario en base a dicho aumento.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en

(a) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MORAb-003;

(b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, la SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, la SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 55 (GYFMN) como CDRH1, la SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1, la SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 19D4;

(m) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 39 (HPYMH) como CDRH1, la SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, la SEQ ID NO: 36 (LASNLES) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) como CDRL3;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3;

(p) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) como CDRH1, la SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, la SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, la SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) como CDRL3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 24F12;

(s) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 47 (SYAMS) como CDRH1, la SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, la SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, la SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, la SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) como CDRL2 y la SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) como CDRL3;

(t) el anticuerpo 24F12;

(u) un anticuerpo que comprende una cadena ligera de la región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);

(v) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la región variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH 1,1 (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);

(w) un anticuerpo que comprende la región de cadena pesada variable LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);

(x) un anticuerpo que comprende la región de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); y

(y) un anticuerpo que comprende la región de cadena pesada variable LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) y la región variable de cadena ligera LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).

3. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avímero, versacuerpo, nanocuerpo, y un dominio de anticuerpo, opcionalmente, en el que el anticuerpo está marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un marcador radiactivo, un marcador de biotina, un marcador cromóforo, un marcador fluoróforo, un marcador ECL y un marcador enzimático.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de FRa se determina mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA).

5. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de control comprende un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano.

6. El método de la reivindicación 1, en el que (i) la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra; o (ii) la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra; y/o la muestra se centrifuga, se agita con vórtex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en

(a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte sólido y anticuerpo MORAb-003 marcado,

(b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y anticuerpo 24F12 marcado,

(c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte sólido y el anticuerpo 19D4 marcado, y

(d) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte sólido y anticuerpo 26B3 marcado.

8. Un método para evaluar la progresión del cáncer de ovario en un sujeto que padece cáncer de ovario, método que comprende

determinar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra de suero o de plasma derivada de dicho sujeto llevando a cabo un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) o un inmunoensayo de enzima (EIA);

comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula con el nivel de FRa en una muestra de control; y

(i) identificar un aumento en la muestra de suero o plasma derivada de dicho sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control, y determinar que el cáncer de ovario progresará rápidamente en base a dicho aumento; o

(ii) identificar una disminución en el nivel de FRa en la muestra de suero o plasma derivada de dicho sujeto en comparación con el nivel de FRa en la muestra de control, y determinar que el cáncer de ovario progresará lentamente en base a dicha disminución.

9. Un método para clasificar a un sujeto que padece cáncer de ovario en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer que comprende:

determinar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula, en una muestra de suero o de plasma derivada de dicho sujeto llevando a cabo un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) o un inmunoensayo de enzima (EIA); y

clasificar al sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cáncer en base al nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula.

10. El método de la reivindicación 9, donde el sujeto se clasifica en cáncer de ovario de Estadio I, Estadio II, Estadio III o Estadio IV.

11. El uso de un kit según cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1-10 para determinar si un sujeto padece cáncer de ovario o para evaluar la progresión del cáncer de ovario en un sujeto, donde el kit comprende los medios para llevar a cabo el inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) o un inmunoensayo de enzima (EIA) para determinar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no está unido a una célula en una muestra derivada de dicho sujeto; y

las instrucciones para uso del kit para evaluar si el sujeto padece cáncer de ovario o para evaluar la progresión del cáncer de ovario.