ES2780398T3

ES2780398T3 - Anticuerpo anti-antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas y uso de los mismos

Info

Publication number: ES2780398T3
Application number: ES13814340T
Authority: ES
Inventors: Justin A Caravella; Stark Ellen A Garber; Dania Mounir Rabah; Frederick R Taylor
Original assignee: Biogen MA Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: RS60084B1; US20150299325A1; EP2928923B1; KR102344907B1; EP2928923A1; MX363407B; CN111961134A; CN111961134B; HRP20200174T1; JP2024045253A; AU2013359419A1; AU2013359419B2; PL2928923T3; JP6889741B2; CA2893375A1; IL238804B; JP2016505556A; HK1216027A1; BR112015012942A2; JP6490591B2

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une al antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas (BDCA2) (SEQ ID NO: 1), donde el anticuerpo comprende un dominio pesado variable (VH) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y donde el anticuerpo comprende un dominio ligero variable (VL) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas y uso de los mismos

Antecedentes

El antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas (BDCA2, por sus siglas en inglés) es una lectina de tipo C expresada en células dendríticas plasmocitoides humanas (pDC, por sus siglas en inglés) (Dzionek y col., J. Immunol., 165:6037-6046 (2000)), una población especializada de células derivadas de la médula ósea que secretan interferones tipo I (IFN) en respuesta a los ligandos del receptor tipo toll (TLR, por sus siglas en inglés). BDCA2 consiste en un único dominio de reconocimiento de carbohidratos extracelulares (CRD, por sus siglas en inglés), que pertenece al grupo de lectina tipo C y tipo II, en su extremo C-terminal, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en su extremo N-terminal que no alberga un motivo de señalización. BDCA2 transmite señales intracelulares a través de un adaptador transmembrana asociado, el F^ceRI^y, e induce una cascada de señalización similar al receptor de células B (BCR, por sus siglas en inglés).

El documento WO 01/036487 proporciona fragmentos de unión a antígeno específicos para BDCA-2.

Resumen

Esta descripción se basa, al menos en parte, en la identificación y caracterización de anticuerpos que se unen a BDCA2. Dichos anticuerpos pueden reducir o inhibir la secreción de citocinas y quimiocinas inflamatorias. Los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud también son capaces de agotar las pDC por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) o citotoxicidad mediada por el complemento (CDC, por sus siglas en inglés). Además, los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud pueden regular negativamente los niveles de CD32a y/o CD62L en la superficie de las pDC. Además, los anticuerpos anti-BDCA2 de esta descripción pueden mediar en la internalización de BDCA2 desde la superficie celular de las pDC. Por al menos estas razones, los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud son útiles para tratar o impedir afecciones autoinmunitarias e inflamatorias. Esta descripción también muestra que los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud pueden combinarse con un agente antipalúdico para efectos mejorados.

En base a la descripción contenida en esta solicitud, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado que se une al antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas humanas (BDCA2) (SEQ ID NO: 1), donde el anticuerpo comprende un dominio pesado variable (VH) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y donde el anticuerpo comprende un dominio ligero variable (VL) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

La presente invención también proporciona un fragmento de unión a antígeno aislado que se une al antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas humanas (BDCA2) de SEQ ID NO: 1), donde el fragmento de unión a antígeno comprende un dominio pesado variable (VH) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y donde el fragmento de unión a antígeno comprende un dominio ligero variable (VL) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

Esta invención y realizaciones preferidas de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo opcionalmente comprende o consiste además en una, dos, tres, cuatro o cinco, de las siguientes características: una CE⁵⁰(BDCA2 humana) de 0,5 a 3 pg/ml o de 4 nM a 10 nM; una CE⁵⁰(BDCA2 de cynomolgus) de 0,5 a 3 pg/ml o 5 nM a 10 nM; un pl de 7 a 7.5; no se une a Clec4b2 de rata, o se une a Clec4b2 de rata con una afinidad de unión menor que BDCA2 humana, cynomolgus o rhesus; inhibe la producción o secreción de quimiocinas como MlP-1-a/CCL3, MlP-1 p (3/CCL4, CCL5/RANTES, IP-10/CXCL10. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno tiene una CE50 (BDCA2 humana) de 4,5 nM, 4,6 nM, 4,7 nM, 4,8 nM, 4,9 nM, 5,0 nM, 5,1 nM, 5,2 nM, 5,3 nM, 5,4 nM, o 5,5 nM. En una realización específica, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno tiene una CE50 (BDCA2 humana) de 4,9 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno tiene una CE50 (BDCA2 cynomolgus) de 4,0 nM, 4,1 nM, 4,2 nM, 4,3 nM, 4,4 nM, 4,5 nM, 4,6 nM, 4,7 nM, 4,8 nM, 4,9 nM, o 5,0 nM. En una realización específica, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno tiene una CE50 (BDCA2 cynomolgus) de 4,4 nM. En ciertas realizaciones de este aspecto, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada y la cadena ligera humana. En determinadas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH1 y una región bisagra. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH3. Si la región constante de la cadena pesada incluye sustituciones, dichas sustituciones modifican las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, aumentan o disminuyen uno o más de: unión al receptor de Fc, glicosilación del anticuerpo, la cantidad de residuos de cisteína, función de células efectoras o función del complemento). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG. En realizaciones específicas, el anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 7 a 15 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 10 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 11 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 12 pg/ml.

Estos anticuerpos (i) se unen a BDCA2 humana o mono cynomolgus pero no se unen significativamente a BDCA2 de especies filogenéticas por debajo de los primates; y/o (ii) inhiben la producción de interferón tipo I inducida por TLR7/TLR9 y otras citocinas o quimiocinas por las pDC humanas; y/o (iii) median en la internalización de BDCA2 desde la superficie de las pDC; y/ o (iv) regulan negativamente CD32a y/o CD62L desde la superficie de las pDC; y/o (v) agotan las pDC in vitro por ADC^co CDC. En ciertas realizaciones de este aspecto, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada y la cadena ligera humana.

En ciertas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada y la cadena ligera humana. En determinadas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH1 y una región bisagra. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH3. Si la región constante de la cadena pesada incluye sustituciones, dichas sustituciones modifican las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, aumentan o disminuyen uno o más de: unión al receptor de Fc, glicosilación del anticuerpo, la cantidad de residuos de cisteína, función de células efectoras o función del complemento). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG. En realizaciones específicas, el anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 7 a 15 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 10 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 11 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 12 pg/ml.

En ciertas realizaciones, la cadena pesada comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:4. En una realización particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende o consiste en una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:4 y una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:3. Estas realizaciones se refieren a todos los aspectos anteriores y sus realizaciones. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de cadena sencilla. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un fragmento F^ab, un fragmento F^(ab')2, un fragmento F^ab', un fragmento F^sc, un fragmento F^v, un scFv, un sc (Fv)², o un diacuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG1.

En todos los aspectos anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo además: (i) inhibe la secreción de interferones tipo I y/o interferones tipo III además de otras citocinas y quimiocinas de las células dendríticas plasmacitoides; o (ii) induce o aumenta el agotamiento de las células dendríticas plasmacitoides in vitro. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo regula negativamente CD32a y/o CD62L en una pDC (en relación con una pDC que no está en contacto con un anticuerpo anti-BDCA2). En ciertas realizaciones, el anticuerpo media en la internalización de BDCA2 desde la superficie de las pDC. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al BDCA2 cynomolgus (SEQ ID NO:72) y al BDCA2 rhesus (SEQ ID NO:72). En ciertas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la secreción o producción de interferón tipo I, interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interferón tipo III, proteína 1 inflamatoria de macrófagos (MIP-1)-a/CCL3, MIP-1p/CCL4, ligando 5 de quimiocina (motivo C-C) (CCL5/RANTES) o proteína 10 inducida por interferón ^y(IP-10/CXCL10). En ciertas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de cadena sencilla. En otras realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un fragmento F^ab, un fragmento F(^ab')², un fragmento F^ab', un fragmento F^sc, un fragmento F^v, un scFv, un sc(Fv)², o un diacuerpo. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG1. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG2. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG4. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el anticuerpo es un híbrido de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 e IgG4.

En ciertas realizaciones, la descripción proporciona una célula aislada que produce cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En otras realizaciones, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de unión a antígeno de los mismos formulados en una composición que comprende citrato 10-25 mM, cloruro de sodio 100-200 mM y un pH de 5,5-6,5. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica incluye opcionalmente Tween-80 (0,01 a 0,3 %, por ejemplo, 0,03 %). En otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de unión a antígeno de los mismos formulados en una composición que comprende citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, y un pH de 6,0. En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento de fabricación de un anticuerpo anti-BDCA2. El procedimiento implica proporcionar una célula que comprende una cadena pesada y/o una cadena ligera del anticuerpo BDCA2, incubar la célula en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo y aislar el anticuerpo. El procedimiento opcionalmente comprende purificar el anticuerpo. En determinadas modalidades, la célula es una célula CHO. En otras realizaciones, la célula es una célula 293. En una realización particular, el anticuerpo anti-BDCA2 es BIIB059. En una realización, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO:4, y la cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO:3.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento de detección de la presencia de una célula dendrítica plasmacitoide en un tejido. El procedimiento comprende poner en contacto el tejido con un anticuerpo anti-BDCA2. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene lupus eritematoso sistémico. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene esclerodermia. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene morfea. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene artritis reumatoide. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene psoriasis. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene dermatomiositis. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene polimiositis. En ciertos aspectos, el tejido es una biopsia de piel de un sujeto que tiene enfermedad inflamatoria intestinal. En aspectos específicos, el lupus eritematoso sistémico es lupus cutáneo, lupus discoide o nefritis lúpica. El anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede marcarse, por ejemplo, con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa Fluor 647). En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 es BIIB059. En otros aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 es el clon 124B3.13 (dendríticas). En ciertos aspectos, el procedimiento comprende además poner en contacto el tejido con un anticuerpo anti-CD 123.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento de inducción de la muerte de una célula dendrítica plasmacitoide en un sujeto que lo necesita. El procedimiento implica administrar al sujeto o poner en contacto una célula dendrítica plasmacitoide que expresa BDCA2 con cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en esta solicitud.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento de reducción de la producción de citocinas o quimiocinas inflamatorias por una célula dendrítica plasmacitoide en un sujeto que lo necesita. El procedimiento comprende administrar al sujeto o poner en contacto una célula dendrítica plasmacitoide que expresa BDCA2 con una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en esta solicitud. En ciertos aspectos, las citocinas o quimiocinas inflamatorias se seleccionan de entre el grupo que consiste en: interferón tipo I, IL-6 o TNF-a, interferón tipo III, MIP-1a/CCL3, MIP-1p/CCL4, CCL5/RANTES, e IP-10/CXCL10.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento de regulación negativa de la expresión de CD32a en la superficie de una célula dendrítica plasmacitoide. El procedimiento comprende poner en contacto la célula dendrítica plasmacitoide con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 tiene una región constante de la cadena pesada de IgG1. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG2. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG4. En algunos aspectos, el anticuerpo es un híbrido de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 e IgG4. En ciertos aspectos, el anticuerpo está aglicosilado. En aspectos específicos, el anticuerpo es un híbrido aglicosilado de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 e IgG4.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento de regulación negativa de la expresión de CD32a (FcYRIIa) en la superficie de una célula dendrítica plasmacitoide en un sujeto humano que lo necesita. El procedimiento comprende administrar al sujeto humano una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 tiene una región constante de la cadena pesada de IgG1. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG2. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG4. En algunos aspectos, el anticuerpo es un híbrido de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 e IgG4. En ciertos aspectos, el anticuerpo está aglicosilado. En un aspecto específico, el anticuerpo es un híbrido aglicosilado de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 e IgG4.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento de inhibición de la estimulación de una célula dendrítica plasmacitoide por complejos inmunitarios en un sujeto humano que lo necesite. El procedimiento comprende administrar al sujeto humano una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud. En algunos aspectos, la administración reduce el nivel de CD32a en la superficie de las pDC. En algunos aspectos, el sujeto tiene hipersensibilidad de tipo III. En un aspecto, el sujeto humano tiene LES. En otro aspecto, el sujeto humano tiene artritis reumatoide. En otro aspecto más, el sujeto tiene el síndrome de Sjogren. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 tiene una región constante de la cadena pesada de IgG1. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG2. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG4. En algunos aspectos, el anticuerpo es un híbrido de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 e IgG4.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento de regulación negativa de la expresión (o desprendimiento) de CD62L (L-selectina) en la superficie de una célula dendrítica plasmacitoide en un sujeto humano que lo necesite. El procedimiento comprende administrar al sujeto humano una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno descrito en esta solicitud. En aspectos específicos, la administración del anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno aumenta el nivel de una o más metaloproteinasas. En ciertos aspectos, la regulación negativa de CD62L se produce a través de la escisión por una metaloproteinasa. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 tiene una región constante de la cadena pesada de IgG1. En algunos casos, de los cinco aspectos anteriores, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG2. En algunos casos de los cinco aspectos anteriores, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada de IgG4. En algunos casos, de los cinco aspectos anteriores, el anticuerpo es un híbrido de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 e IgG4.

En un aspecto adicional, la descripción presenta cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio en un sujeto que lo necesite. El procedimiento implica administrar al sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos anti-BDCA2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en esta solicitud. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio se selecciona de entre el grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (LES), lupus cutáneo, lupus discoide, nefritis lúpica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis sistémica, morfea, psoriasis, diabetes tipo I, dermatomiositis, polimiositis y enfermedad de Sjogren. En una realización particular, el trastorno inflamatorio es LES. En otra realización particular, el trastorno inflamatorio es lupus discoide. En otra realización particular más, el trastorno inflamatorio es nefritis lúpica. En otra realización particular, el trastorno inflamatorio es lupus cutáneo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LES general. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LES moderado. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LES moderado sin compromiso en el SNC activo severo y/o renal activo severo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LES moderado con compromiso en el SNC activo severo y/o renal activo severo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene manifestaciones cutáneas de LES (por ejemplo, erupción malar o discoide). En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LES severo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LES severo sin compromiso en el SNC activo severo y/o renal activo severo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LES severo con compromiso en el SNC activo severo y/o renal activo severo. El lupus moderado o severo es una estadificación del lupus (véase, por ejemplo, Guidelines for Referral and Management of Systemic Lupus Erythematosus in Adults, Arthritis & Rheumatism, 42 (9):1785-1795 (1999); Gladman, Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus, Curr. Opin. Rheumatol., 8:430-437 (1996); Kalunian y col., Definition, classification, activity and damage indices. En: Dubois' lupus eyrthematosus. 5a ed., Baltimore: Williams y Wilkins; págs. 19-30 (1997)).

En otro aspecto, la descripción presenta cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite. El procedimiento implica administrar al sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos anti-BDCA2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en esta solicitud.

En cualquiera de los aspectos anteriores relacionados con los procedimientos, en ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En cualquiera de los aspectos anteriores relacionados con los procedimientos, en ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno se administra en combinación con al menos uno de: un antipalúdico (por ejemplo, hidroxicloroquina), un inhibidor de señalización TLR7, un inhibidor de señalización TLR9 o un corticosteroide. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 comprende además una región Fc que se une a CD32a con una CE50 de al menos aproximadamente 7 a 15 pg/ml (por ejemplo, 10, 11, 12 pg/ml). En una realización específica, el anticuerpo anti-BDCA2 es BIIB059.

En otro aspecto, la descripción presenta una combinación que comprende un antipalúdico (por ejemplo, hidroxicloroquina) y el anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 comprende además una región Fc que se une a CD32a con una CE50 de al menos aproximadamente 7 a 15 pg/ml (por ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14 pg/ml). En una realización específica, el anticuerpo anti-BDCA2 es BIIB059.

En otro aspecto, la descripción presenta una combinación que comprende un inhibidor de señalización TLR7 y/o TLR9 y el anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 comprende además una región Fc que se une a CD32a con una CE50 de al menos aproximadamente 7 a 15 pg/ml (por ejemplo, 10, 11, 12 pg/ml). En una realización específica, el anticuerpo anti-BDCA2 es BIIB059.

En otro aspecto, la descripción presenta una combinación que comprende un corticosteroide y el anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 comprende además una región Fc que se une a CD32a con una CE50 de al menos aproximadamente 7 a 15 pg/ml (por ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14 pg/ml). En una realización específica, el anticuerpo anti-BDCA2 es BIIB059.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en esta solicitud tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente un experto en la materia al que pertenece esta invención. Si bien pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o análisis de la presente invención, A continuación, se describen métodos y materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud, incluyendo las definiciones. Los materiales, procedimientos y ejemplos son meramente a título ilustrativo y no pretenden ser limitativos.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es una representación esquemática de la señalización de BDCA2 en una célula dendrítica plasmacitoide (véase, Geijtenbeek y col., Nature Reviews Immunology, 9:465-479 (2009)).

La FIG. 2 es un gráfico que muestra las variantes de hu24F4 Hx/L1 que se unen a BDCA2 humano.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra las variantes de hu24F4 Hx/L1 que se unen a BDCA2 cynomolgus.

La FIG.4 es un mapa esquemático del plásmido pJP009 que codifica la cadena ligera anti-BDCA2. La secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera anti-BDCA2 está bajo control transcripcional del promotor IE de hCMV y las secuencias de poliadenilación de hGH. El gen para la aminoglucósido fosfotransferasa (resistencia a la neomicina) está bajo control transcripcional del promotor de la fosfoglicerina quinasa murina (muPGK) y las secuencias de poliadenilación. Las secuencias restantes, incluido el gen de la beta-lactamasa, son para propagación y selección en E. coli.

La FIG. 5 es un mapa esquemático del plásmido pJP010 que codifica la cadena pesada anti-BDCA2. La secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada anti-BDCA2 está bajo control transcripcional del promotor IE de hCMV y las secuencias de poliadenilación de hGH de crecimiento humano. El gen para la dihidrofolato reductasa (dhfr) está bajo control transcripcional del promotor SV40E y las secuencias de poliadenilación. Las secuencias restantes, incluido el gen de la beta-lactamasa, son para propagación y selección en E. coli.

La FIG. 6 es un gráfico lineal que muestra la unión de BIIB059 en células dendríticas plasmocitoides cynomolgus (A) y humanas (B). Se incubó sangre entera de mono cynomolgus (A) o humana (B) con concentraciones variables de anticuerpo BIIB059 marcado con Alexa647 (círculos), o un isotipo de IgG humano (cuadrados) en hielo. Los datos se adquirieron utilizando la máquina FACS LSRII-4 color y se analizaron utilizando el software FlowJo y GraphPad Prism. La FIG.7 es un gráfico lineal que muestra los resultados de un ensayo AlphaScreen para autoasociación. Clave: diamante = BIIB059; cuadrado = 5c8; y triángulo = LT105.

La FIG. 8 es un gráfico lineal que muestra los resultados de una fluorometría de barrido diferencial para probar la estabilidad de BIIB059 en diferentes condiciones. Este gráfico muestra datos con cloruro de sodio 150 mM y sacarosa 250 mM en función del pH.

La FIG. 9 es un gráfico lineal que muestra el efecto de la agitación en la agregación a lo largo del tiempo. La agregación se suprimió con la adición de Tween 80.

La FIG. 10 es un gráfico lineal que muestra la unión directa de AC144 a BDCA2 de superficie humana y de cynomolgus. La FIG. 11 es una serie de gráficos que muestran los resultados del análisis de cromatografía de exclusión por tamaño de proteínas de fusión Fc.

La FIG. 12 es un gráfico que muestra el efecto del calcio en la unión de BIIB059 a BDCA2. La unión de BIIB059 a BDCA2 se mejora mediante la adición de calcio en relación con EDTA dando una señal aproximadamente 2 veces mayor. La FIG. 13 es un gráfico que muestra los resultados de la unión de octeto de BIIB059 a ectodominios BDCA2 humanos y de mono cynomolgus.

La FIG. 14 es un gráfico que muestra que BIIB059 inhibe potentemente el IFNa de las PBMC estimuladas con el agonista TLR9. Cada símbolo representa CI⁵⁰de un experimento independiente y las líneas verticales representan el EEM. Las FIG. 15A-C proporcionan una serie de gráficos que muestran que BIIB059 inhibe potentemente las citocinas y las quimiocinas de la sangre entera estimulada con el ligando TLR9. La f Ig .15A muestra la inhibición de IFNa usando sangre venosa heparinizada de donantes sanos. La FIG. 15B muestra la inhibición de IFNa usando sangre entera de dos pacientes con LES (paneles superiores) en comparación con los resultados usando sangre entera de 2 donantes sanos (paneles inferiores). La FIG. 15C proporciona una serie de gráficos de barras que muestran que el tratamiento con BIIB059 condujo a la inhibición de una gran variedad de citocinas y quimiocinas.

La FIG. 16 es un gráfico de barras que muestra que BIIB059 inhibe la expresión de interferón de tipo I.

La FIG. 17 incluye dos gráficos de líneas que muestran que el ligamiento de BDCA2 con BIIB059 inhibe la producción de citocinas inducida por TLR9 en pDC purificadas.

La FIG. 18 es un gráfico de barras que muestra que el ligamiento de BDCA2 suprime la inducción de la producción de IFN-a en pDC estimuladas con suero de LES.

La FIG. 19A es un gráfico de líneas que muestra que BDCA2 se internaliza después del ligamiento con BIIB059. La FIG.

19B es un gráfico de líneas que muestra que la internalización no afecta a la inhibición mediada por BIIB059 de la producción de IFN-a.

La FIG. 20 es una serie de gráficos de líneas que muestran la unión de BIIB059 a los receptores Fcy.

La FIG. 21 proporciona los resultados del ELISA C1q que muestra la unión del C1q humano a concentraciones crecientes (0-15 pg/ml) de anticuerpo recubierto.

Las FIG.22A-D son una serie de gráficos que muestran que BIIB059 media la muerte celular a través de ADCC. La estirpe celular CHO (EAG2456 T1F2 Clon 34.16.7) se usó como la célula diana. El nivel de expresión de BDCA2 en la superficie de las células CHO se determinó mediante FACS usando un mAb anti-BDCA2 marcado con APC (clon AC144, Miltenyi). Se usaron células NK como células efectoras. ADCC se evaluó utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad Vybrant (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo detecta G6PD de células dañadas basándose en la reducción de resazurina dependiente de G6PD que emite fluorescencia a 590 nm después de la excitación a 530 nm. El ensayo ADCC representado en la FIG.22A se realizó usando células CHO con alta expresión de BDCA2 (FIG.22C) mientras que el ensayo ADCC en la FIG.22B usó células CHO con menor expresión de BDCA2 (FIG.22D).

La FIG. 23 es un gráfico de líneas que muestra que BIIB059 media la muerte celular a través de CDC. Las células CHO (EAG2456 T1F2 Clon 34.16.7) se sembraron a 5 x 10⁴células en placas de 96 pocillos de colágeno negro y se incubaron a 370 durante 48 horas. Las placas se lavaron e incubaron con complemento de suero de conejo y yoduro de propidio (PI) en presencia de mAbs efectores competentes anti-BDCA2 (24F4S y BIIB059), mAbs deficientes de la función efectora (24F4S-Agli y 24F4A-Agli) o control de isotipo IgG1 durante 1 h a 37^°C. El control negativo consistió en pocillos que contenían células CHO, complemento de suero de conejo, PI, sin anticuerpos.

La FIG. 24 es una serie de gráficos utilizados para determinar la CE50 de la unión de BIIB059 ("directa") y la unión competitiva de BIIB059-A647 ("indirecta") en pDC de mono cynomolgus. Antes de una inyección in vivo de BIIB059, se extrajo sangre de doce monos cynomolgus una vez a la semana durante tres semanas en total. La citometría de flujo se utilizó para determinar la CE50 de la unión de BIIB059 a BDCA2 en la superficie celular de pDC (método "directo"), y la cantidad de receptor BDCA2 disponible en presencia de BIIB059 (procedimiento "indirecto"). La sangre se incubó con una valoración de seis puntos de BIIB059 en un intervalo de 40-0,04 pg/ml. Las pDC se identificaron mediante citometría de flujo como CD20-CD14-CD123 HLA-DR+, y se trataron con un secundario anti-IgG humano marcado con PE o BIIB059-A647 marcado con 10 ug/ml. El MFI de PE (símbolos abiertos, representados gráficamente en el eje y izquierdo) o A647 (símbolos cerrados, representados gráficamente en el eje y derecho) se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism (ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros de datos transformados logarítmicamente). Aquí se muestran gráficos representativos de cuatro de los doce monos cynomolgus.

La FIG.25 es un gráfico representativo que presenta la unión en meseta del anticuerpo anti-BDCA2 BIIB059 a la superficie celular BDCA2 en pDC en sangre entera de mono cynomolgus. La sangre se incubó con una valoración de seis puntos de BIIB059 en un intervalo de 40-0,04 pg/ml. Las pDC se identificaron mediante citometría de flujo como CD20-CD14-CD123 HLA-DR+, y se trataron con un secundario anti-IgG humano marcado con PE. El MFI de PE se calculó en el software FlowJo, y se calculó el porcentaje de unión máxima, utilizando el punto de 40 pg/ml como 100 %. Cada línea representa un mono cynomolgus individual, para un total de doce monos cynomolgus, y se representa gráficamente con el software GraphPad Prism (ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros de datos transformados logarítmicamente). La tinción se repitió una vez a la semana durante tres semanas en total. Las líneas discontinuas demuestran que una concentración de 10 pg/ml de BIIB059 satura la unión del receptor BDCA2 para todos los monos cynomolgus.

La FIG. 26A-C aborda los niveles de BIIB059 unido y la tinción de BDCA2 libre en monos cynomolgus tratados con vehículo. La FIG. 26A es una serie de histogramas por FACS que muestran la tinción de PE de fondo en monos cynomolgus tratados con vehículo. A los monos cynomolgus 1,4 y 12 se les administró una única inyección IV de control de vehículo (citrato de sodio) en el momento 0. Después de 1 hora, se extrajo sangre entera y las pDC se identificaron mediante citometría de flujo como CD20-CD14-CD123 HLA-DR+, y se trataron con anti-IgG humano PE (histogramas abiertos) o tampón FACS como control de fluorescencia menos uno (FMO) de PE (histogramas sólidos). La FIG. 26B es un gráfico de la tinción de PE en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con vehículo en los puntos temporales indicados. El MFI de PE se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism. La FIG. 26C es un gráfico de la tinción A647 en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con vehículo en los puntos de tiempo indicados. Se añadió BIIB059-A647 a 10 pg/ml a las extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con vehículo en cada uno de los puntos de tiempo indicados, y se analizó la tinción de A647 en pDC. El MFI de A647 se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism.

Las FIG. 27A-C muestran que BIIB059 unido y el receptor BDCA2 ya no están disponibles en la superficie celular de pDC después de una dosis única de 10 mg/kg de BIIB059 en mono cynomolgus. La FIG. 27A es una serie de histogramas por FACs que muestran la tinción BIIB059 en monos cynomolgus tratados con 10 mg/kg de BIIB059. A los monos cynomolgus 3, 8 y 10 se les administró una única inyección IV de BIIB059 a 10 mg/kg en el momento 0. Después de 1 hora, se extrajo sangre entera y se identificaron pDC como CD20-CD14-CD123 HLA-DR+, y se trataron con anti-IgG humano PE (histogramas abiertos) o tampón FACS como control de FMO de PE (histogramas sólidos). La FIG. 27B es un gráfico de tinción de PE en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en los puntos de tiempo indicados. El MFI de PE se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism. La FIG. 27C es un gráfico de la tinción A647 en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en los puntos de tiempo indicados. Se añadió BIIB059-A647 a 10 pg/ml a las extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en cada uno de los puntos de tiempo indicados, y se analizó la tinción de A647 en pDC. El MFI de A647 se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism.

Las FIG. 28A-C muestran que BIIB059 unido y el receptor BDCA2 ya no están disponibles en la superficie celular de pDC después de una dosis única de 1 mg/kg de BIIB059 en mono cynomolgus. La FIG. 28A es una serie de histogramas por FAC^sque muestran la tinción BIIB059 en monos cynomolgus tratados con 1 mg/kg de BIIB059. A los monos cynomolgus 3, 8 y 10 se les administró una única inyección IV de BIIB059 a 1 mg/kg en el momento 0. Después de 1 hora, se extrajo sangre entera y se identificaron pDC como CD20-CD14-CD123 HLA-DR+, y se trataron con anti-IgG humano PE (histogramas abiertos) o tampón FACS como control de FMO de PE (histogramas sólidos). La FIG. 28B es un gráfico de tinción de PE en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en los puntos de tiempo indicados. El MFI de PE se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism. La FIG. 28C es un gráfico de la tinción A647 en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en los puntos de tiempo indicados. Se añadió BIIB059-A647 a 10 pg/ml a las extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en cada uno de los puntos de tiempo indicados, y se analizó la tinción de A647 en pDC. El MFI de A647 se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism.

Las FIG. 29A-C muestran que los receptores BIIB059 y BDCA2 unidos ya no están disponibles en la superficie celular de pDC después de una dosis subcutánea (SC) única de 0,2 mg/kg de BIIB059 en mono cynomolgus. La FIG. 29A es una serie de histogramas por FACS que muestran la tinción BIIB059 en SC de 0,2 mg/kg en monos cynomolgus tratados con BIIB059. A los monos cynomolgus 4, 6 y 12 se les administró una única inyección SC de BIIB059 a 0,2 mg/kg en el momento 0. Después de 1 hora, se extrajo sangre entera y las pDC se identificaron como CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, y se trataron con anti-IgG humano PE (histogramas abiertos) o tampón FACS como control FMO de PE (histogramas sólidos). La FIG. 29B es un gráfico de tinción de PE en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en los puntos de tiempo indicados. El MFI de PE se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism. La FIG. 29C es un gráfico de la tinción A647 en pDC a partir de extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en los puntos de tiempo indicados. Se añadió BIIB059-A647 a 10 pg/ml a las extracciones de sangre de los tres monos cynomolgus tratados con BIIB059 en cada uno de los puntos de tiempo indicados, y se analizó la tinción de A647 en pDC. El MFI de A647 se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente con el software GraphPad Prism.

La FIG. 30 es una serie de gráficos que muestran las correlaciones PK/PD observadas para monos cynomolgus que recibieron BIIB059 IV a 1 mg/kg, y monos cynomolgus que recibieron BIIB059 IV a 10 mg/kg. Para cada gráfico de esta figura, la concentración sérica de BIIB059 se representa en el eje y izquierdo (símbolos abiertos), y la densidad del receptor BDCA2 se representa en el eje y derecho (símbolos sólidos). La depuración acelerada observada en el mono cynomolgus 5 probablemente se debió a la inmunogenicidad a BIIB059.

La FIG. 31 es una serie de gráficos que muestran las correlaciones observadas de PK/PD para monos cynomolgus que recibieron BIIB059 SC a 0,2 mg/kg. Para cada gráfico de esta figura, la concentración sérica de BIIB059 se representa en el eje y izquierdo (símbolos abiertos), y la densidad del receptor BDCA2 se representa en el eje y derecho (símbolos sólidos).

La FIG. 32 es una serie de gráficos de barras que muestran los resultados de los ensayos ELISA o multiplex para medir las concentraciones de citocinas y quimiocinas inflamatorias producidas por pDC tratadas con CpG-A, CpG-A en presencia de anti-BDCA2 y CpG-A en presencia de control de isotipo. Cada barra representa la media y la desviación típica (SD) para pocillos duplicados de un donante humano sano representativo de 5 analizados. Las líneas verticales representan la SD.

La FIG. 33 es una serie de gráficos de barras que muestran los resultados de los ensayos ELISA o multiplex para medir las concentraciones de citocinas y quimiocinas inflamatorias producidas por pDC tratadas con complejos inmunitarios Sm/RNP, complejos inmunitarios Sm/RNP en presencia de anti-BDCA2 y complejos inmunitarios Sm/RNP en presencia de control de isotipo. Cada barra representa la media y la desviación típica (SD) para pocillos duplicados de un donante humano sano representativo de 5 analizados. Las líneas verticales representan la SD.

La FIG. 34 es una serie de gráficos de barras que muestran los resultados de los ensayos de qPCR para determinar el efecto de BIIB059 en la transcripción de subtipos de IFN tipo I en pDC estimuladas por IC de Sm/RNP de donantes humanos sanos. Cada barra representa el cambio múltiplo relativo medio para los pocillos cuadruplicados de un donante representativo de 3 analizados (n = 3) y las líneas verticales representan la desviación típica (SD).

La FIG. 35A muestra la inhibición dependiente de la dosis mediada por BIIB059 de IFNa inducido por TLR9 por PBMC de un donante humano sano representativo de 18 analizados. Cada símbolo representa la media y la desviación típica (SD) para pocillos duplicados. La FIG. 35B muestra la inhibición dependiente de la dosis mediada por BIIB059 de IFNa inducido por TLR9 por PBMC de un paciente con LES representativo de 11 analizados. Cada símbolo representa la media y la desviación típica (SD) para pocillos duplicados. La FIG. 35C muestra los valores de CI50 para la inhibición de BIIB059 de la producción de IFNa inducida por t LR9 por PBMC en donantes humanos sanos (HD) en comparación con pacientes con LES (LES). Cada símbolo representa un donante individual y las líneas verticales representan la SD.

La FIG. 36A muestra la inhibición dependiente de la dosis mediada por BIIB059 de IFNa inducido por TLR9 de un análisis representativo de sangre entera de 12 analizados. Cada símbolo representa la media y la desviación típica (SD) para pocillos duplicados. La FIG. 36B muestra los valores de CI50 para la inhibición de BIIB059 de la producción de IFNa inducida por TLR9 en ensayos de sangre entera en comparación con los ensayos de PBMC. Cada símbolo representa un donante individual y las líneas verticales representan la SD.

La FIG. 37 Las PBMC de donantes humanos sanos se estimularon con 1 pM del ligando TLR3 (Poli I:C) y se trataron con concentraciones de BIIB059 que varían de 10 pg/ml a 0,5 ng/ml en un volumen de ensayo total de 250 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante la noche (18 horas) a 37 y 5 % de CO2. Se reco gieron 200 pl de los sobrenadantes para la evaluación de los niveles de IFNa por ELISA. Cada símbolo representa los niveles promedio de IFNa producidos en cada condición de tratamiento. Se muestran datos de dos donantes independientes. Las líneas verticales representan la desviación estándar (SD).

La FIG. 38A muestra la internalización de BDCA2 mediada por BIIB059 dependiente de la dosis de un donante humano sano representativo. Los círculos representan MFI de la tinción 2D6 a las diversas dosis de BIIB059. El triángulo representa el MFI de 2D6 en presencia del control de isotipo (tinción máxima). El diamante representa el MFI del control de FMO (tinción de fondo). La FIG. 38B muestra la CE50 de la internalización de BDCA2 inducida por BIIB059 en pDC en análisis de sangre entera de donantes humanos sanos (círculos cerrados; n = 10 donantes). La EC50 promedio fue de 0,017 ± 0,005 pg/ml.

La FIG. 39 es una representación gráfica de los valores medios de intensidad de fluorescencia (MFI) de la tinción 2D6-FITC de CD14-CD20-HLA-DR CD123 pDC separados. El isotipo (iso) representa la tinción máxima, FMO (control de fluorescencia menos uno) consistió en el cóctel de tinción de FACS menos 2D6-FITC representa la tinción de fondo. En esta figura se muestra un experimento representativo de 4 experimentos independientes realizados.

La FIG. 40 son imágenes confocales de pDC humanas purificadas de sangre periférica y luego incubadas con 10 pg/ml de BIIB059-AF647 (blanco) a 4 °C (izquierda) o a 37 °C en 5 % de CO2 (derecha) durante 15 min. La distribución de células BIIB059 se evaluó mediante microscopía confocal y se muestra una imagen representativa para cada condición. La FIG. 41 Es una representación gráfica del efecto de la internalización de BDCA2 sobre la inhibición de la producción de IFNa. Esta figura es representativa de 3 experimentos independientes.

La FIG. 42 es una representación gráfica que muestra que los valores de CE50 de la internalización de BDCA2 mediada por BIIB059 se correlacionan con los valores de CI50 de la inhibición mediada por BIIB059 de IFNa inducido por TLR9 en análisis de sangre entera (n = 10). Valor de R2 de 0,57.

La FIG. 43A muestra los resultados expresados como la media y la desviación típica (SD) de los coeficientes de colocalización de Manders para la localización de TLR9 en el compartimento LAMP1+. La FIG.43B muestra los resultados expresados como la media y la SD de los coeficientes de colocalización de Manders para la localización de BIIB059/BDCA2 en el compartimento TLR9+. La FIG. 43C muestra los resultados expresados como la media y la SD de los coeficientes de colocalización de Manders para la localización de BIIB059/BDCA2 en el compartimento LAMP1+. Cada símbolo representa una célula individual; las líneas horizontales representan la media, las líneas verticales representan la SD.

La FIG. 44A es un histograma de un experimento representativo de sangre entera tratada con 10 pg/ml de BIIB059 (histograma teñido), control de isotipo de 10 pg/ml (línea de puntos) o sangre entera estimulada con el ligando TLR9, CpG-A (línea continua). La FIG. 44B es una representación gráfica del efecto del tratamiento con BIIB059 de sangre entera que resultó en el desprendimiento de CD62L (cuadrados cerrados). El cuadrado abierto representa el tratamiento del isotipo (10 pg/ml). Esta figura es representativa de 3 experimentos independientes.

La FIG. 45 Es una representación gráfica de la expresión superficial de CD62L analizada por citometría de flujo. La expresión de CD62L se midió en presencia de BIIB059 solo, y con concentraciones crecientes de GM6001 (círculos). El cuadrado abierto representa el control tratado con isotipo (10 pg/ml). El triángulo invertido representa el control DMSO tratado con BIIB059. Esta figura es representativa de 2 experimentos independientes.

La FIG. 46A es una representación gráfica de BIIB059 y la internalización dependiente de la dosis de BDCA2 mediada por 24F4A-Agly en la superficie de pDC de un donante humano sano representativo (n = 5). Las pDC de donantes sanos humanos se aislaron usando un procedimiento de separación de perlas magnéticas de dos etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). Las pDC se trataron con concentraciones crecientes de BIIB059 (círculos) o la forma a-glicosilada del anticuerpo-24F4-A glicosilada (cuadrados). Las células también se trataron con 10 pg/ml de un control de isotipo (triángulo) y se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las pDC se tiñe ron luego para la expresión superficial de BDCA2 y CD32. La FIG.

46B es un histograma que muestra los niveles de CD32 en pDC aisladas tratadas con 10 pg/ml de BIIB059 (sombreado) o el control de isotipo (punteado) (n = 5). La FIG. 46C es un histograma que muestra los niveles de CD32 en pDC aisladas tratadas con 10 pg/ml de la forma a-glicosilada-24F4-A (sombreada) o el control de isotipo (punteado). La línea continua representa las células sin teñir (n = 5). La FIG. 46D es una representación gráfica de la modulación descendente dependiente de la dosis mediada por BIIB059 de CD32 en la superficie de pDC de un donante humano sano representativo (n = 5). La FIG. 46E es un histograma que muestra los niveles de CD32 en pDC aisladas tratadas durante 1 hora a 4 °C en presencia de 10 pg/ml de BIIB059 (sombreado), la forma a-glicosilada (discontinua) o un control de isotipo (punteado). Después de la incubación, se evaluó la expresión superficial de CD32 en las pDC. La línea negra continua representa células sin teñir (n = 3). La FIG. 46F es un histograma que muestra los niveles de CD32 en pDC aisladas tratadas durante 1 hora a 37 °C en presencia de 10 pg/ml de BIIB059 (sombreado), la forma a-glicosilada (discontinua) o un control de isotipo (punteado). Después de la incubación, se evaluó la expresión superficial de CD32 en las pDC. La línea negra continua representa células sin teñir (n = 3).

La FIG. 47A es una representación gráfica de los niveles de IFNa de pDC aisladas tratadas con concentraciones crecientes de BIIB059 (cuadrados), concentraciones crecientes de la forma a-glicosilada del anticuerpo 24F4-A (círculos) o control de istotipo a 10 pg/ml (triángulo). Las pDC se estimularon en presencia de CpG-A (75 pg/ml) o se dejaron sin estimular (triángulo invertido). Las pDC se incubaron durante 16 horas a 37 °C y los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar IFNa por ELISA. Se muestra un experimento representativo de 2 realizados. La FIG. 47B es una representación gráfica de los niveles de IFNa de pDC aisladas tratadas con concentraciones crecientes de BIIB059 (cuadrados), concentraciones crecientes de la forma a-glicosilada del anticuerpo 24F4-A (círculos), control de istotipo a 10 pg/ml (triángulo), o mAb anti-CD32 humano a 10 pg/ml. Los complejos inmunitarios Sm/RNP (IC) se preformaron mezclando Sm-RNP de timo de ternero y anticuerpos anti-RNP purificados de sueros de pacientes con LES durante 30 minutos en medio libre de suero. Las células aisladas se estimularon con complejos inmunitarios o se trataron con antígeno solo (no estimulado). Las células se incubaron durante 16 horas a 37 °C y los sobrenadantes s e recogieron y se analizaron para determinar el IFNa por ELISA. Se muestra una figura representativa de 3 realizados. Cada símbolo representa la media y la desviación típica (SD) para pocillos duplicados.

La FIG. 48A es un gráfico de barras que muestra la expresión de CD32 en pDC aisladas tratadas con complejos inmunitarios en presencia de 10 pg/ml de BIIB059, 24F4-A, mAb anti-CD32 (clon AT10), anticuerpo anti-CD40 humanizado o control de isotipo. Las células se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las pDC se tiñeron para la ex presión superficial de CD32 y CD40. La FIG. 48B es un gráfico de barras que representa los niveles de IFNa medidos por ELISA en los sobrenadantes recogidos de A. Se muestra una figura representativa (n = 3). La FIG. 48C es un histograma que muestra la expresión de CD40 en la superficie de las pDC. La línea de puntos representa la expresión de CD40 en la superficie celular. El histograma teñido representa los niveles de CD40 en pDC después del tratamiento con anticuerpo anti-CD40. La línea continua representa células sin teñir.

La FIG. 49 representa el impacto de HCQ en la potencia de BIIB059. Cada símbolo representa las concentraciones de IFNa medidas a partir de un donante humano sano individual y las líneas verticales representan la SD. Las PBMC de donantes humanos sanos se trataron con concentraciones variables de BIIB059 solo, HCQ solo o en combinación (BIIB059 HCQ) en un volumen de ensayo total de 250 pl/pocillo. Las concentraciones de BIIB059 variaron de 10 pg/ml a 0,1 ng/ml. Las concentraciones de HCQ variaron de 10 pM a 156 nM. 1x106 células PBMC/pocillo se estimularon con 5 pM del ligando TLR7 (R848). Las placas que contienen PBMC se incubaron durante la noche (18 horas) a 37 °C y 5 % de CO2. Se recogieron 200 pl de los sobrenadantes para su evaluación de IFNa en ELISA (PBL InterferonSource).

La FIG. 50 representa el impacto de HCQ en la potencia de BIIB059. Cada símbolo representa las concentraciones de IFNa medidas a partir de un donante representativo de 2 donantes sanos probados y las líneas verticales representan la desviación típica (SD). Las PBMC de sangre venosa heparinizada de donantes humanos sanos o pacientes con LES se aislaron mediante centrifugación en gradiente discontinuo sobre Ficoll, se lavaron en PBS y se resuspendieron en medio de cultivo completo (RPMI con FBS al 3 %). Las PBMC se trataron con concentraciones variables de BIIB059 solo, HCQ solo o en combinación (BIIB059 HCQ) en un volumen de ensayo total de 250 pl/pocillo. Las concentraciones de BIIB059 variaron de 10 pg/ml a 0,1 ng/ml. Las concentraciones de HCQ variaron de 10 pM a 156 nM. 1x106 células PBMC/pocillo se estimularon con 1 pM del ligando TLR9 (CPG-A). Las placas que contienen PBMC se incubaron durante la noche (18 horas) a 37 °C y 5 % de CO2. Se recogieron 200 pl de los sobrenadantes para su evaluación de IFNa en ELISA (PBL InterferonSource).

La FIG. 51 muestra distribuciones de porcentaje de pDC circulante en sangre entera de mono cynomolgus sano en escala original (panel izquierdo) y en escala logarítmica (panel derecho). Se extrajo sangre entera de doce monos cynomolgus una vez por semana durante un total de cuatro semanas. Las pDC se identificaron usando citometría de flujo como CD20-CD14-CD123 HLA-DR+. La pDC como porcentaje de las células CD20-CD14- se calculó con el software FlowJo. El gráfico se obtuvo usando el lenguaje R para cálculo estadístico.

La FIG. 52 es una representación gráfica del porcentaje de pDC circulante (en escala logarítmica) en sangre entera de mono cynomolgus sano en diferentes puntos de tiempo antes de la inyección IV de BIIB059. En los puntos de tiempo indicados, se extrajo sangre entera, y las pDC se identificaron mediante citometría de flujo como CD20-CD14-CD123 HLA-DR+. El porcentaje de pDCS se calculó en el software FlowJo y se representó gráficamente utilizando el software R.

La FIG. 53 es una representación de un modelo ajustado final para el porcentaje de pDC circulante (en escala logarítmica) en sangre entera de mono cynomolgus sano en diferentes puntos de tiempo antes de la inyección IV de BIIB059. Un modelo de efectos lineales mixtos para valores logarítmicos (% de pDC) con diferentes puntos de tiempo como factores fijos y cynos como las interceptaciones aleatorias no muestra diferencias entre las relaciones de los valores pDC porcentuales de las medias geométricas medidas por semanas de diferencia (valor p basado en la prueba F para todos los efectos de tiempo igual a cero es 0,67). El análisis gráfico y estadístico se calculó utilizando el lenguaje R para cálculo estadístico. La línea negra muestra el modelo ajustado final, que solo incluye una intercepción fija y las intercepciones aleatorias para monos cynomolgus. El paquete lme4 en R se utilizó para ajustar el modelo lineal de efectos mezclados.

La FIG. 54 representa el porcentaje de pDC circulante en escala logarítmica antes y después de la dosis IV del vehículo de citrato de sodio, 1 mg/kg de BIIB059 o 10 mg/kg de BIIB059 en mono cynomolgus. A los tres monos cynomolgus se les administró para cada grupo de dosis en el momento 0. En los puntos de tiempo indicados, se extrajo sangre entera, y las pDC se identificaron mediante citometría de flujo como CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. El porcentaje de pDC se calculó en el software FlowJo y se representaron gráficamente con el software R.

La FIG. 55 representa el modelo final ajustado para el porcentaje de pDC circulante en escala logarítmica antes y después de la dosis IV del vehículo de citrato de sodio, 1 mg/kg de BIIB059 y 10 mg/kg de BIIB059 en monos cynomolgus. Un modelo de efectos lineales mezclados para valores logarítmicos (% de pDC) con factores fijos para el grupo de dosis, niveles de tiempo de 1 hora, 6 horas y más de 28 días, y con intercepción aleatoria para monos cynomolgus. La línea continua muestra el modelo ajustado. El paquete lme4 en R se utilizó para ajustar el modelo lineal de efectos mezclados. El análisis gráfico y estadístico se calculó utilizando el lenguaje R para cálculo estadístico.

La FIG.56 muestra el porcentaje de pDC circulante después de la dosis SC de 0,2 mg/kg de BIIB059 en mono cynomolgus. A los monos cynomolgus 4, 6 y 12 se les administró una única inyección SC de 0,2 mg/kg de BIIB059 en el momento 0. De los tres monos cynomolgus, el mono cynomolgus 6 fue dosificado con mg/kg de BIIB059 en un estudio previo. Los monos cynomolgus 4 y 12 fueron dosificados con vehículo en un estudio previo. En los puntos de tiempo indicados, se extrajo sangre entera, y las pDC se identificaron mediante citometría de flujo como CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. El porcentaje de pDC se calculó en el software FlowJo y se representaron gráficamente con el software R.

La FIG. 57 representa el modelo final ajustado para el porcentaje de pDC circulante después de la dosis SC de 0,2 mg/kg de BIIB059 en mono cynomolgus. Se ajusta un modelo de efectos lineales mezclados para valores logarítmicos (% de pDC) con efectos fijos durante un tiempo continuo y un tiempo a 1 hora, y con monos cynomolgus como intercepciones aleatorias. La línea continua muestra el modelo ajustado. El paquete lme4 en R se utilizó para ajustar el modelo lineal de efectos mezclados. El análisis gráfico y estadístico se calculó utilizando el lenguaje R para cálculo estadístico.

La FIG. 58 es una representación esquemática del diseño experimental PK/PD de mono cynomolgus. Nueve monos cynomolgus completaron el estudio de dosis intravenosa (IV). Los monos cynomolgus se desangraron antes y después de la administración IV del vehículo, 1 mg/kg de BIIB059 o 10 mg/kg de BIIB059 según el programa de sangrado que se muestra. Tras la finalización de este estudio, 3 monos cynomolgus completaron un estudio de dosis subcutánea (SC), donde recibieron una inyección SC única de 0,2 mg/kg de BIIB059. En cada punto de tiempo de sangrado, se realizó un análisis de sangre entera donde la sangre entera de los monos cynomolgus se diluyó 1:4 con RPMI 1640 completo y se estimuló con CPG-A hasta una concentración final de 200 pg/ml en una placa de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos y se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 18-20 horas. Al final del cultivo, la sangre entera estimulada se centrifugó para recoger suero. En el bioensayo MxA, las células A549 fueron estimuladas con el suero recogido durante 19-20 horas a 37 °C, 5 % de CO2 para inducir la proteína MxA. De spués de 20 horas, se lisaron las células A549 y se realizó un ELISA en sándwich para detectar concentraciones de proteína MxA. Los niveles de IFNa (unidades/ml) se volvieron a calcular a partir de una curva estándar generada tratando células A549 con dosis crecientes de rIFNa.

La FIG. 59 es una representación gráfica de la tendencia hacia la producción reducida de IFNa inducida por TLR9 en monos cynomolgus que reciben una dosis intravenosa única de BIIB059 en relación con los promedios previos al tratamiento. La sangre entera de monos cynomolgus tratados con una dosis intravenosa única de vehículo, 1 mg/kg de BIIB059, o 10 mg/kg de BIIB059 se diluyó 1:4 con RPMI 1640 completo y se estimuló con CPG-A (2216) hasta una concentración final de 200 pg/ml en una placa de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos y se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 18-20 horas. Al final del cultivo, la sangre entera estimulada se centrifugó para recoger suero. Las células A549 se estimularon con el suero recogido durante 19-20 horas a 37 °C, 5 % de CO2 para inducir la proteína MxA. Después de 20 horas, se lisaron las células A549 y se realizó un ELISA en sándwich para detectar concentraciones de proteína MxA. Los niveles de IFNa (unidades/ml) se volvieron a calcular a partir de una curva estándar generada tratando células A549 con dosis crecientes de rIFNa. La concentración media de IFNa de presangrado se calculó para cada mono promediando todas las mediciones de IFNa de los puntos de tiempo de presangrado (días 21, 14, 7 y T0). Luego se calculó el % de IFNa para cada punto de tiempo de sangrado después de la administración de BIIB059 hasta el día 14 dividiendo la concentración de IFNa en ese momento por el promedio de presangrado para ese animal y multiplicándolo por 100. Estos valores se promediaron para cada grupo de tratamiento. El gráfico representa la media ± error estándar de la media. El análisis gráfico y estadístico se calculó utilizando el software Excel y GraphPad 6.0 (GraphPad, San Diego, CA).

La FIG. 60 es una representación gráfica de la producción disminuida de IFNa inducida por TLR9 en un ensayo de sangre entera ex ^vivo de monos cynomolgus tratados por vía intravenosa con BIIB059. La sangre entera de monos cynomolgus tratados con una dosis intravenosa única de vehículo (panel superior), 1 mg/kg de BIIB059 (panel central) o 10 mg/kg de BIIB059 (panel inferior) se diluyó 1:4 con RPMI 1640 completo y se estimuló con CPG-A (2216) a una concentración final de 200 pg/ml en una placa de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos y se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 18-20 horas. Al final del cultivo, la sangre entera estimulada se centrifugó para recoger suero. Las células A549 se estimularon con el suero recogido durante 19-20 horas a 37 °C, 5 % de CO2 para inducir la proteína MxA. Después de 20 horas, se lisaron las células A549 y se realizó un ELISA en sándwich para detectar concentraciones de proteína MxA. Los niveles de IFNa (unidades/ml) se volvieron a calcular a partir de una curva estándar generada tratando células A549 con dosis crecientes de rIFNa. Se ajustó un análisis de varianza de efectos mezclados bidireccionales (ANOVA) a los valores de log10 de las concentraciones calculadas de IFNa. Los valores de IFNa se representan (en la escala de log10) frente al día de sangrado para cada animal dentro de cada grupo de dosis. Las líneas verticales indican agrupaciones de días de sangrado en predosis, después de la dosis hasta 31 días y después de la dosis de más de 31 días. Los días de sangrado posteriores al día 31 no se utilizaron en el análisis. Las estimaciones basadas en modelos de valores geométricos medios de IFNa están representadas por gruesas líneas horizontales negras dentro de las regiones pre- y post-dosis de cada panel. El análisis gráfico y estadístico se calculó utilizando el lenguaje R para cálculo estadístico.

La FIG. 61 es una representación gráfica de la disminución de la producción de IFNa inducida por TLR9 en un ensayo de sangre entera ex ^vivo de monos cynomolgus tratados por vía subcutánea con BIIB059. La sangre entera de monos cynomolgus tratados con una dosis subcutánea única de 0,2 mg/kg de BIIB059 se diluyó 1:4 con RPMI 1640 completo y se estimuló con CPG-A (2216) a una concentración final de 200 pg/ml en una placa de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos y se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 18-20 horas. Al final del cultivo, la sangre entera estimulada se centrifugó para recoger suero. Las células A549 se estimularon con el suero recogido durante 19-20 horas a 37 °C, 5 % de CO2 para inducir la proteína MxA. Después de 20 horas, se lisaron las células A549 y se realizó un ELISA en sándwich para detectar concentraciones de proteína MxA. Los niveles de IFNa (unidades/ml) se volvieron a calcular a partir de una curva estándar generada tratando células A549 con dosis crecientes de rIFNa. Se ajustó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con efectos aleatorios a los valores de log10 de las concentraciones calculadas de IFNa. Los valores de IFNa se representan (en la escala de log 10) frente al día de sangrado para cada animal. Las líneas verticales indican agrupaciones de días de sangrado en predosis, después de la dosis hasta 33 días y después de la dosis de más de 33 días. Los días de sangrado posteriores al día 33 no se utilizaron en el análisis. Las estimaciones basadas en modelos de valores geométricos medios de IFNa están representadas por gruesas líneas horizontales negras dentro de las regiones pre- y post-dosis de cada panel. El análisis gráfico y estadístico se calculó utilizando el lenguaje R para cálculo estadístico.

Descripción detallada

BIIB059 es un anticuerpo monoclonal ejemplar que se une específicamente a BDCA2 humano. Los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud inhiben la producción de pDC y/o la secreción de citocinas y quimiocinas inflamatorias. Además, los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud pueden regular negativamente los niveles de CD32a y/o CD62L en la superficie de las pDC. Además, los anticuerpos anti-BDCA2 de esta descripción pueden mediar la internalización de BDCA2 desde la superficie de las pDC. Además, los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud pueden usarse para agotar las pDC por ADCC o CDC y pueden usarse para tratar o impedir trastornos inmunológicos tales como afecciones inflamatorias y autoinmunitarias. Esta descripción también muestra que la combinación de un antipalúdico con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud puede producir efectos mejorados en comparación con el tratamiento con cualquier agente solo. BDCA2

BDCA2 es una lectina de tipo C tipo II que se expresa específicamente en pDC. BDCA2 consta de un solo dominio de reconocimiento de carbohidratos extracelulares (CRD) en su extremo C-terminal, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en su extremo N-terminal que no alberga un motivo de señalización. BDCA2 transmite señales intracelulares a través de un adaptador transmembrana asociado, F^csRI^y(véase la Figura 1). El ligamiento mediado por anticuerpos de BDCA2 conduce al reclutamiento de bazo de tirosina quinasa (SYK) a motivo de activación del inmunorreceptor fosforilado basado en tirosina (ITAM) de FcsRIy. La activación de Syk conduce a la activación del enlazador de células B (Blnk), la tirosina quinasa de Bruton (BTK) y la fosfolipasa Cy2 (PLCy2), lo que lleva a una movilización de Ca2+.

La secuencia de aminoácidos de la proteína BDCA2 humana (número de acceso a Genbank NP_569708.1) se muestra a continuación, (el dominio transmembrana está en cursiva; el ectodominio está subrayado).

1 MVPEEEPQDREKGLWWFQLKVWSM A W S IL LLSVC FTVSS WPHNFMYSK

51 TVKRLSKLREYQQYHPSLTCVMEGKDIEDWSCCPTPWTSFQSSCYFISTG

101 MQSWTKSQKNCSVMGADLVVINTREEQDFI IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR

151 RHWQWVDQTPYNENVTFWHSGEPNNLDERCAIINFRSSEEWGWNDIHCHV

201 PQKSICKMKK IYI* (SEQIDNO:l)

La secuencia de aminoácidos del F^osRI^yhumano (número de acceso a Genbank NP_004097.1) se muestra a continuación.

1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALGEPQLCYILDA ILFLYGIVLTLLYCRLKIQV

51RKAAITSYEK SDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ*(SEQIDNO:2)

El homólogo de BDCA2 de rata más cercano, Clec4b2 de rata (número de acceso a Genbank NM_001005896), comparte solo el 51,0 % de identidad con el BDCA2 humano. En contraste, el BDCA2 de mono cynomolgus y rhesus comparten una identidad del 90,6 % con el BDCA2 humano. Además, la secuencia de la proteína F^osRI^yde mono cynomolgus y rhesus, que son idénticas entre sí, comparte una identidad del 98,9 % con la proteína F^osRI^yhumana.

Las proteínas BDCA2 de humano, mono cynomolgus y rhesus pueden usarse como inmunógenos para preparar anticuerpos anti-BDCA2. Para preparar anticuerpos anti-BDCA2 humanos, la proteína BDCA2 humana puede usarse como inmunógeno. Los anticuerpos anti-BDCA2 humanos pueden seleccionarse para identificar anticuerpos que tengan una o más de las características descritas en esta solicitud (por ejemplo, reducción de la producción/secreción de uno o más interferones de tipo I o tipo III, IL-6, TNF-a, MIP-1-a, MIP-1 p, CCL5 e IP-10/CXCL10; agotamiento de pDC; competición por unión al dominio extracelular de BDCA2 con BIIB059; unión selectiva al ectodominio de BDCA2 humano, cynomolgus y rhesus pero sin unión a Clec4b2 de rata; inhibición del desarrollo de la enfermedad en un modelo de xenoinjerto psoriásico humano).

Anticuerpos anti-BDCA2

Esta descripción incluye las secuencias de un anticuerpo monoclonal, BIIB059, que se une al BDCA2 humano, cynomolgus y rhesus, pero no a Clec4b2 de rata. BIIB059 no se une o no muestra una unión significativa a BDCA2 de especies filogenéticas por debajo de los primates. BIIB059

BIIB059 es un anticuerpo de lgG1 humanizado que reconoce específicamente BDCA2 en la superficie de las células dendríticas plasmacitoides. Se deriva de un anticuerpo murino (24F4) que se une a BDCA2 de la siguiente manera. Se inyectó un plásmido que codifica BDCA2 humano de longitud completa en ratones con una pistola génica. Los esplenocitos de este ratón se fusionaron con las células de mieloma y el hibridoma resultante produjo el anticuerpo 24F4. El anticuerpo 24F4 se genomanipuló en una estructura de lgG1 humano de tipo salvaje para mantener la función efectora completa. Las secuencias de aminoácidos predichas de las cadenas pesadas y ligeras maduras de BIIB059 se muestran a continuación. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) 1,2 y 3 de la cadena ligera variable (VL) y la cadena pesada variable (VH) se muestran en ese orden desde N hasta el extremo C-terminal de las secuencias VL y VH maduras y son ambas subrayadas y están en negrita. Un anticuerpo que consiste en la cadena pesada madura (SEQ ID NO: 4) y la cadena ligera madura (SEQ ID NO: 3) enumeradas A continuación, se denomina BIIB059.

Cadena ligera (LC) madura BIIB059

DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLESGVPSRFSGSG

SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPR TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC (SEQIDNO:3)

Cadena pesada (HC) madura BIIB059

DVQLVESGGGLVKPGGSLRL SCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVATISPGDSFGYYYPDSVQGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQIDNO:4)

La cadena ligera variable (VL) de BIIB059 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQANEDPRTFGQGTKVEI K (SEQIDNO:23)

La cadena pesada variable (VH) de BIIB059 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: DVQLVESGGGLVKPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMSWVRQAPGKGLEWVATISPGDSFGYYYPDSVQGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQIDNO:24)

Las secuencias de aminoácidos de CDR de VL de BII059 se enumeran a continuación:

CDR1 de VL: KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO:5);

CDR2 de VL: AASTLES (SEQ ID NO:6); y

CDR3 de VL: QQANEDPRT (SEQ ID NO:7).

Las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH de BII059 se enumeran a continuación:

CDR1 de VH: TYTMS (SEQ ID NO:8) (CDR1 de Kabat) o GFTFSTYTMS (SEQ ID NO:9) (CDR1 de Chothia/AbM mejorada);

CDR2 de VH: TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO:10);

CDR3 de VH: DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO:11)

Como se indicó anteriormente, la definición mejorada de CDR de Chothia/AbM de CDR1 de VH es 5 aminoácidos más larga que la definición de Kabat de esta CDR. Los cinco aminoácidos adicionales de CDR1 de Chothia/AbM de VH mejorado son GFTFS (SEQ ID NO:12).

Los anticuerpos anti-BDCA2 de esta descripción también pueden comprender "CDR alternativas" de BIIB059. CDR "alternativas" significa CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) definidas según cualquiera de Chothia de AbYsis, CDR de Chothia/AbM mejorada, o las definiciones de contacto. Estas CDR alternativas se pueden obtener, p. ej., mediante el uso de la base de datos de AbYsis (www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi). Las secuencias de aminoácidos de CDR 1, 2 y 3 "alternativas" de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de BIIB059 se comparan con las CDR definidas según Kabat en la siguiente Tabla.

Los anticuerpos anti-BDCA2 pueden abarcar CDR 1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera según la definición de Kabat, la definición de Chothia de Abysis, la definición mejorada de CDR de Chothia/AbM o la definición de contacto. Estos anticuerpos pueden tener, por ejemplo, 1,2 o 3 sustituciones dentro de una o más (es decir, 1,2, 3, 4, 5 o 6) de las CDR. Estos anticuerpos (i) se unen a BDCA2 humano o mono cynomolgus pero no se unen significativamente a BDCA2 de especies filogenéticas por debajo de los primates; y/o (ii) inhiben la producción de interferón tipo I inducida por TLR7/TLR9 y otras citocinas o quimiocinas por las pDC humanas; y/o (iii) median en la internalización de BDCA2 desde la superficie de las pDC; y/o (iv) regulan negativamente CD32a y/o CD62L desde la superficie de las pDC; y/o (v) agotan las pDC in vitro por ADCC o CDC.

Los anticuerpos de IgG humanos son moléculas tetraméricas que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Cada cadena ligera de BIIB059 está unida covalentemente a una cadena pesada a través de un enlace disulfuro intercatenario (LC Cys 218-HC Cys 225) y las cadenas pesadas están unidas entre sí por dos disulfuros intercatenarios (HC Cys 231-Cys 231 y Cys 234-Cys 234). Todas las demás cisteínas forman disulfuros intramoleculares que estabilizan los dominios constantes y variables.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-BDCA2 incluyen una región constante de la cadena pesada y la cadena ligera humana. En determinadas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH1 y una región bisagra. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH3. Si la región constante de la cadena pesada incluye sustituciones, dichas sustituciones modifican las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, aumentan o disminuyen uno o más de: unión al receptor de Fc, glicosilación del anticuerpo, la cantidad de residuos de cisteína, función de células efectoras o función del complemento). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG. En realizaciones específicas, el anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una afinidad de 7 pg/ml a 15 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a F^cyRII (CD32a) con una CE50 de 10 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 11 pg/ml. En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc humana que se une a FcYRIIa (CD32a) con una CE50 de 12 pg/ml. La Tabla 1 proporciona una lista de las propiedades del anticuerpo de BIIB059.

TABLA 1

BIIB059 exhibe propiedades fisicoquímicas adecuadas para un anticuerpo terapéutico. Este anticuerpo muestra bajos niveles de agregación. La estructura de IgG1 de tipo salvaje contiene un único sitio de glicosilación unido a N en la molécula y BIIB059 y se une a los receptores Fc con afinidades típicas de esta clase de moléculas. El pI calculado de 7,26 es algo bajo para un anticuerpo. La heterogeneidad de carga detectada en BIIB059 sugiere que una fracción significativa de BIIB059 contiene modificaciones. Los niveles de glicación de hasta aproximadamente el 10 % detectados en lotes purificados de BIIB059 representan al menos en parte esta heterogeneidad de carga. La Tm plegable para el BIIB059 está en el extremo inferior de los valores típicos observados para los anticuerpos, mientras que los de los dominios CH2 y CH3 son típicos para un mAb de IgG1 completamente glicosilado. En base a la fluorimetría de barrido diferencial y las mediciones de viscosidad, el BIIB059 puede formularse, por ejemplo, a 50 mg/ml en citrato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Este anticuerpo también se puede formular a concentraciones mucho más altas, como 150-300 mg/ml (por ejemplo, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 300 mg/ml).

BIIB059 es un mAb de IgG1 competente para la función Fc completamente humanizado que exhibe una alta afinidad por BDCA2 y se une igualmente bien al BDCA2 humano y al cynomolgus nativo. BIIB059 es un potente inhibidor de todos los IFN de tipo I inducidos por TLR9, así como de otras citocinas y quimiocinas por pDC. BIIB059 es igualmente potente para inhibir el interferón tipo I inducido por TLR9 por las pDC de donantes humanos sanas y pacientes con LES. BIIB059 inhibe específicamente el IFN tipo I inducido por TLR9 por pDC y no afecta a la producción de IFN por otros tipos de células desencadenadas con diferentes ligandos TLR. BIIB059 conduce a una rápida internalización de BDCA2 desde la superficie celular. Tras la estimulación, BDCA2 se colocaliza con TLR9 en el compartimento endosómico/lisosómico que parece ser necesario para inhibir la señalización de TLR9. Se descubrió que BIIB059 causa desprendimiento de CD62L de la superficie de las pDC humanas que podría afectar a su orientación a los órganos diana. Los estudios de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADC^c) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) in vitro sugieren que BIIB059 puede tener actividad de agotamiento celular en estirpes celulares que sobreexpresan BDCA2. Sin embargo, el hecho de que BIIB059 conduce a una internalización rápida y completa de BDCA2 desde la superficie de las pDC hace que sea menos probable que BIIB059 afecte a las pDC de agotamiento sostenido in vivo. La combinación de BIIB059 e hidroxicloroquina (HCQ) condujo a un efecto inhibidor aditivo sobre la producción de IFNa inducida por TLR7 e TLR9 por PBMC de donantes humanos sanos. Estos datos destacan el beneficio terapéutico aditivo potencial de BIIB059 cuando se administra con compuestos antipalúdicos como HCQ.

Los anticuerpos, como BIIB059, se pueden elaborar, por ejemplo, preparando y expresando genes sintéticos que codifican las secuencias de aminoácidos recitadas o mutando genes de la línea germinal humana para proporcionar un gen que codifique las secuencias de aminoácidos recitadas. Además, este anticuerpo y otros anticuerpos anti-BDCA2 pueden obtenerse, por ejemplo, usando uno o más de los siguientes procedimientos.

Procedimientos de obtención de anticuerpos anti-BDCA2

Existen numerosos procedimientos disponibles para obtener anticuerpos, particularmente anticuerpos humanos. Un método ejemplar incluye el análisis de bibliotecas de expresión de proteínas, p. ej., bibliotecas de expresión en fagos o ribosomas. La expresión en fagos se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.223.409; Smith, Science 228:1315-1317 (1985); WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; y WO 90/02809. La expresión de Fab en fagos se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.° 5.658.727; 5.667.988; y 5.885.793.

Además del uso de las bibliotecas de expresión, se pueden utilizar otros procedimientos para obtener un anticuerpo de unión a BDCA2. Por ejemplo, se puede utilizar la proteína de BDCA2 o un péptido del mismo como un antígeno en un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón, un hámster o una rata. Además, las células transfectadas con un ADNc que codifica BDCA2 se pueden inyectar en un animal no humano como forma de producir anticuerpos que se unan de forma efectiva a la proteína BDCA2 de superficie celular.

En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón con deficiencia de producción de anticuerpo de ratón con fragmentos grandes de loci de Ig humano. Utilizando la tecnología de hibridomas, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales específicos del antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véanse, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green y col., Nature Genetics 7:13-21 (1994), U.S. 2003-0070185, WO 96/34096, y WO 96/33735.

En otra realización, un anticuerpo monoclonal se obtiene del animal no humano y después se modifica, por ejemplo, se humaniza o se desinmuniza. Winter describe un procedimiento de injerto de c Dr ejemplar que se puede utilizar para preparar los anticuerpos humanizados descritos en esta solicitud (documento U.S. 5.225.539). Se pueden reemplazar la totalidad o algunas de las CDR de un anticuerpo humano particular con al menos una parte de un anticuerpo no humano. Es posible que solo sea necesario reemplazar las CDR necesarias para la unión o los determinantes de unión de dichas CDR para obtener un anticuerpo humanizado útil que se una a BDCA2.

Se pueden generar anticuerpos humanizados mediante el reemplazo de secuencias de la región variable de Fv que no participan directamente en la unión al antígeno por secuencias equivalentes de las regiones variables de Fv humana. Los procedimientos generales para generar anticuerpos humanizados son proporcionados por Morrison, S. L., Science, 229:1202-1207 (1985), por Oi y col., BioTechniques,4:214 (1986), y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Estos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte de las regiones variables de Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o una cadena ligera. Las fuentes de dicho ácido nucleico son conocidas por los entendidos en la técnica y, por ejemplo, se pueden obtener de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se describe arriba, de genes de inmunoglobulina de línea germinal o de construcciones sintéticas. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado se puede clonar en un vector de expresión adecuado.

Las secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, se describen en Tomlinson, IA y col., J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992); Cook, G. P. y col., Immunol. Today, 16: 237-242 (1995); Chothia, D. y col., J. Mol. Bio. 227:799-817 (1992); y Tomlinson y col., EMBO J., 14:4628-4638 (1995). El directorio V BASE proporciona un directorio integral de secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana (reunido por Tomlinson y col., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). Estas secuencias se pueden utilizar como una fuente de secuencia humana, p. ej., para las regiones marco y las CDR. Las regiones de estructura humanas de consenso también se pueden utilizar, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense n.° 6.300.064.

Un anticuerpo de unión a BDCA2 no humano también puede modificarse mediante deleción específica de epítopos de células T humanas o "desinmunización" mediante los procedimientos descritos en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. En resumen, se pueden analizar las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo en cuanto a la presencia de péptidos que se unen a MHC clase II; estos péptidos representan posibles epítopos de células T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epítopos de células T, se puede aplicar una estrategia de modelado por ordenador denominado "reconocimiento del plegamiento de péptidos", y además se puede buscar en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humanos los motivos presentes en las secuencias V^hy V^l, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos DR principales de MHC clase Il, y, por lo tanto, constituyen posibles epítopos de células T. Se pueden eliminar los posibles epítopos de células T detectados a través de la sustitución de pequeñas cantidades de residuos de aminoácidos en las regiones variables, o preferentemente, a través de sustituciones de un único aminoácido. En la medida de lo posible, se realizan sustituciones conservadoras. Con frecuencia, aunque no exclusivamente, se puede utilizar un aminoácido común en una posición en las secuencias de aminoácidos de líneas germinales humanas. Después de identificar los cambios desinmunizantes, se pueden construir ácidos nucleicos codificantes de V^hy V^lpor mutagénesis u otros procedimientos sintéticos (por ejemplo, síntesis de novo, reemplazo de casete, entre otros). Una secuencia variable mutagenizada se puede fusionar, opcionalmente, con una región constante humana, por ejemplo, regiones constantes kappa o de IgG1 humana.

En algunos casos, un posible epítopo de células T incluirá los residuos que se sabe o que se prevé que serán importantes para la función del anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos de células T posibles generalmente se inclinan hacia las CDR. Además, los epítopos de células T posibles se pueden encontrar en residuos marco importantes para la estructura y la unión del anticuerpo. Los cambios para eliminar estos posibles epítopos en algunos casos requerirán más exámenes, p. ej., mediante la realización y la prueba de cadenas con o sin el cambio. Cuando sea posible, se pueden eliminar los epítopos de células T posibles que se superponen con las CDR mediante sustituciones fuera de las CDR. En algunos casos, una alteración dentro de una CDR es la única opción y, por lo tanto, se pueden probar variantes con o sin esta sustitución. En otros casos, la sustitución necesaria para retirar un epítopo de célula T posible es en una posición de residuo dentro del marco que podría ser fundamental para la unión al anticuerpo. En estos casos, se prueban variantes con o sin esta sustitución. Por ende, en algunos casos, se diseñan diversas regiones variables de cadena ligera y pesada desinmunizadas variantes y se prueban diversas combinaciones de cadena pesada/ligera para identificar el anticuerpo desinmunizado óptimo. La elección del anticuerpo desinmunizado final se puede realizar considerando la afinidad de unión de las diferentes variantes en combinación con la medida de la desinmunización, particularmente, la cantidad de epítopos de células T posibles que permanecen en la región variable. La desinmunización se puede utilizar para modificar cualquier anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que incluye una secuencia no humana, por ejemplo, un anticuerpo sintético, un anticuerpo murino, otro anticuerpo monoclonal no humano o un anticuerpo aislado de una biblioteca de expresión.

También se pueden utilizar otros procedimientos de humanización de anticuerpos. Por ejemplo, otros métodos pueden representar la estructura tridimensional del anticuerpo, las posiciones de marco que se encuentran en proximidad tridimensional a los determinantes de unión y las secuencias de péptidos inmunogénicas. Véanse, por ejemplo, el documento WO 90/07861; las patentes estadounidenses n.° 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; y 6.407.213; Tempest y col. (1991) Biotechnology 9:266-271. Otro procedimiento se denomina "humaneering" (humanización mediante modificación por ingeniería genética) y se describe, por ejemplo, en el documento U.S. 2005-008625.

El anticuerpo puede incluir una región Fc humana, por ejemplo, una región Fc de tipo salvaje o una región Fc que incluye una o más alteraciones. En una realización, la región constante es alterada, por ejemplo, mutada, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir uno más de: unión al receptor de Fc, glicosilación del anticuerpo, la cantidad de residuos de cisteína, función de células efectoras o función del complemento). Por ejemplo, la región constante de IgG1 humana puede mutar en uno o más residuos, p. ej., uno o más de los residuos 234 y 237 (según la numeración de Kabat). Los anticuerpos pueden tener mutaciones en la región CH2 de la cadena pesada que reducen o alteran la función efectora, p. ej., la unión al receptor de Fc y la activación del complemento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener mutaciones como las descritas en las patentes estadounidenses n.° 5.624.821 y 5.648.260. Los anticuerpos también pueden tener mutaciones que estabilizan el enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas de una inmunoglobulina, como las mutaciones en la región bisagra de IgG4, como se describe en la técnica (por ejemplo, Angal y col., (1993) Mol. Immunol. 30:105-08). Véase también, por ejemplo, el documento U.S. 2005-0037000.

Maduración por afinidad

En una realización, un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo se modifica, por ejemplo, por mutagénesis, para proporcionar un grupo de anticuerpos modificados. Los anticuerpos modificados se evalúan para identificar uno o más anticuerpos que presentan propiedades funcionales alteradas (por ejemplo, unión mejorada, estabilidad mejorada, antigenicidad reducida o estabilidad aumentada in vivo). En una implementación, la tecnología de biblioteca de expresión se utiliza para seleccionar o evaluar el conjunto de anticuerpos modificados. Se identifican anticuerpos con mayor afinidad de unión a partir de la segunda biblioteca, p. ej., mediante el uso de condiciones de mayor rigurosidad o lavado y unión más competitivas. También se pueden utilizar otras técnicas de identificación selectiva. En algunas implementaciones, la mutagénesis se dirige a regiones que se sabe o que probablemente se encuentran en la interfaz de unión. Por ejemplo, si las proteínas de unión identificadas son anticuerpos, entonces la mutagénesis se puede dirigir a las regiones de CDR de las cadenas pesada o ligera, como se describe en esta solicitud. Además, la mutagénesis se puede dirigir a regiones de estructura cercanas o adyacentes a las CDR, por ejemplo, regiones de estructura, particularmente dentro de 10, 5 o 3 aminoácidos de una unión de CDR. En el caso de los anticuerpos, la mutagénesis también se puede limitar a una o algunas de las CDR, por ejemplo, para realizar mejoras graduales.

En una realización, la mutagénesis se utiliza para hacer que un anticuerpo sea más similar a una o más secuencias de línea germinal. Un método de línea germinal ejemplar puede incluir: identificar una o más secuencias de líneas germinales que son similares (p. ej., muy similares en una base de datos particular) a la secuencia del anticuerpo aislado. Se pueden realizar mutaciones (a nivel del aminoácido) en el anticuerpo aislado, ya sea de forma gradual, en combinación o ambos. Por ejemplo, se realiza una biblioteca de ácido nucleico que incluye secuencias que codifican algunas o todas las mutaciones de líneas germinales posibles. Se evalúan los anticuerpos mutados, p. ej., para identificar un anticuerpo que tenga uno o más residuos de línea germinal adicionales con respecto al anticuerpo aislado y que aún sea útil (p. ej., que tenga actividad funcional). En una realización, se introducen tantos residuos de línea germinal en un anticuerpo aislado como sea posible.

En una realización, la mutagénesis se utiliza para sustituir o insertar uno o más residuos de línea germinal en una región CDR. Por ejemplo, el residuo de CDR de línea germinal puede ser de una secuencia de línea germinal que es similar (por ejemplo, muy similar) a la región variable que se va a modificar. Después de la mutagénesis, se puede evaluar la actividad (p. ej., la unión u otra actividad funcional) del anticuerpo para determinar si se toleran el o los residuos de línea germinal. Se puede realizar una mutagénesis similar en las regiones de estructura.

La selección de una secuencia de línea germinal se puede realizar de diferentes maneras. Por ejemplo, se puede seleccionar una secuencia de línea germinal si cumple con ciertos criterios predeterminados para la selectividad o similitud, p. ej., al menos determinada identidad porcentual, p. ej., al menos el 75, el 80, el 85, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 99,5 % de identidad, con respecto al anticuerpo no humano donante. La selección se puede realizar utilizando al menos 2, 3, 5 o 10 secuencias de líneas germinales. En el caso de CDR1 y CDR2, la identificación de una secuencia de línea germinal similar puede incluir la selección de una de dichas secuencias. En el caso de CDR3, la identificación de una secuencia de línea germinal similar puede incluir la selección de una de dichas secuencias, pero puede incluir el uso de dos secuencias de líneas germinales que contribuyen separadamente con la parte de extremo amino y la parte de extremo carboxi. En otras implementaciones, se utilizan más de una o dos secuencias de líneas germinales, por ejemplo, para formar una secuencia de consenso.

Los cálculos de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se realizan como sigue. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas se pueden descartar para fines de comparación). Se determina el alineamiento óptimo como el mejor puntaje utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntaje Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por hueco extendido de 4 y una penalización por hueco de cambio de marco de 5. Luego, se comparan los residuos aminoácidos o los nucleótidos en posiciones de aminoácido o de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia se encuentra ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.

En otras realizaciones, se puede modificar el anticuerpo para que tenga un patrón de glicosilación alterado (es decir, alterado con respecto al patrón de glicosilación original o nativo). Según se utiliza en este contexto, "alterado" significa que tiene una o más eliminaciones de restos de carbohidratos y/o que tiene una o más adiciones de sitios de glicosilación con respecto al anticuerpo original. La adición de sitios de glicosilación a los anticuerpos descritos actualmente se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos para contener secuencias consenso del sitio de glicosilación; tales técnicas son bien conocidas en la técnica. Otro medio para aumentar el número de restos de carbohidratos en los anticuerpos es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a los residuos de aminoácidos del anticuerpo. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 y Aplin y Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22:259-306. La eliminación de cualquier resto de carbohidrato presente en los anticuerpos puede realizarse química o enzimáticamente como se describe en la técnica (Hakimuddin y col. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259:52; Edge y col. (1981) Anal. Biochem., 118:131; y Thotakura y col. (1987) Meth. Enzymol., 138:350). Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.869.046 para conocer una modificación que aumenta la semivida in vivo al proporcionar un epítopo de unión al receptor de rescate.

En un aspecto, un anticuerpo tiene secuencias de CDR (por ejemplo, una CDR de Chothia o Kabat) que difieren de las del anticuerpo monoclonal BIIB059. Las secuencias de CDR que difieren de las del anticuerpo BIIB059 humanizado incluyen cambios de aminoácidos, como sustituciones de 1, 2, 3 o 4 aminoácidos si una CDR tiene 5-7 aminoácidos de longitud, o sustituciones de 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos en la secuencia de una CDR si una CDR tiene 10 aminoácidos o más de longitud. El aminoácido que se sustituye puede tener una carga similar, hidrofobicidad o características estereoquímicas. En algunos aspectos, la(s) sustitución(es) de aminoácidos es(son) una sustitución conservadora. En otros aspectos, la(s) sustitución(es) de aminoácidos es(son) una sustitución no conservadora. Dichas sustituciones se encuentran dentro de las capacidades del entendido en la técnica. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo del mismo que contienen las CDR sustituidas pueden identificarse selectivamente para identificar anticuerpos que tengan una o más de las características descritas en esta solicitud (por ejemplo, reducción de la producción/secreción de interferones de tipo I o tipo III, IL-6, TNF-a, MIP-1-a/CCL3, MIP-10/CCL4, CCL5/RANTES, IP-10/CXCL10; agotamiento de las pDC; competición por unirse al dominio extracelular de BDCA2 con BIIB059; unión selectiva al ectodominio de BDCA2 humano, cynomolgus y rhesus pero sin unión a Clec4b2 de rata o unión a Clec4b2 de rata con una afinidad de unión menor que a BDCA2 humano, cynomolgus o rhesus; inhibición del desarrollo de la enfermedad en un modelo de xenoinjerto psoriásico humano).

A diferencia de las CDR, se pueden realizar cambios más sustanciales en las regiones estructurales (FR) sin afectar negativamente a las propiedades de unión de un anticuerpo. Los cambios en las FR incluyen, entre otros, humanizar una estructura de origen no humano o modificar genéticamente determinados residuos estructurales que son importantes para el contacto del antígeno o para estabilizar el sitio de unión, por ejemplo, cambiar la clase o la subclase de la región constante, cambiar residuos de aminoácidos específicos que podrían alterar una función efectora como la unión al receptor Fc (Lund y col., J. Immun., 147:2657-62 (1991); Morgan y col., Immunology, 86:319-24 (1995)), o cambiar la especie de la cual se deriva la región constante.

Los anticuerpos anti-BDCA2 pueden estar en forma de anticuerpos de longitud completa, o en forma de formas de bajo peso molecular (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos biológicamente activos o minicuerpos) de los anticuerpos anti-BDCA2, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')², Fv, Fd, dAb, scFv, y sc(Fv)2. Otros anticuerpos anti-BDCA2 comprendidos por esta descripción incluyen el anticuerpo de dominio sencillo (sdAb) que contiene una cadena variable sencilla como VH o VL o un fragmento de la misma biológicamente activo. Véanse, por ejemplo, Moller y col., J. Biol. Chem., 285 (49): 38348 38361 (2010); Harmsen y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77(1):13-22 (2007); documento U.S. 2005/0079574 y Davies y col. (1996) Protein Eng., 9(6):531-7. Al igual que un anticuerpo completo, un sdAb se puede unir selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de solo 12-15 kDa, los sdAb son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes e incluso más pequeños que los fragmentos Fab y los fragmentos variables de cadena sencilla.

Se proporcionan en esta solicitud composiciones que comprenden una mezcla de un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión al antígeno del mismo y una o más variantes ácidas del mismo, por ejemplo, donde la cantidad de variantes ácidas es inferior a aproximadamente 80 %, 70 %, 60 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 %. También se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende al menos un sitio de desamidación, donde el pH de la composición es de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,5, de modo que, por ejemplo, al menos aproximadamente el 90 % de los anticuerpos anti-BDCA2 es no desamidado (es decir, menos de aproximadamente el 10 % de los anticuerpos es desamidado). En determinadas modalidades, menos que aproximadamente el 5 %, el 3 %, el 2 % o el 1 % de los anticuerpos es desamidado. El pH puede ser de entre 5,0 y 6,0, por ejemplo, 5,5 o 6,0. En determinadas realizaciones, el pH de la composición es 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 o 6,5.

Una "variante ácida" es una variante de un polipéptido de interés que es más ácida (por ejemplo, según lo determinado por cromatografía de intercambio catiónico) que el polipéptido de interés. Un ejemplo de una variante ácida es una variante desamidada.

Una variante "desamidada" de una molécula de polipéptido es un polipéptido donde uno o más residuos de asparagina del polipéptido original se han convertido en aspartato, es decir, la cadena lateral amida neutra se ha convertido en un residuo con un carácter ácido general.

El término "mezcla", según se utiliza en esta solicitud, con referencia a una composición que comprende un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, significa la presencia del anticuerpo anti-BDCA2 deseado o el fragmento de unión a antígeno del mismo y una o más variantes ácidas del mismo. Las variantes ácidas pueden comprender un anticuerpo anti-BDCA2 mayoritariamente desamidado, con cantidades pequeñas de otras variantes ácidas. En ciertas realizaciones, la afinidad de unión (K^d), constante de asociación (K^Das) y/o constante de disociación (K^Ddis) del anticuerpo que fue mutado para eliminar la desamidación es similar al del anticuerpo de tipo salvaje, por ejemplo, que tiene una diferencia de menos de aproximadamente 5 veces, 2 veces, 1 vez (100 %), 50 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 3 %, 2 % o 1 %.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo o anticuerpos de bajo peso molecular del mismo se unen a BDCA2 en pDC e inhiben o reducen la producción y/o secreción por pDC de IFN tipo I y tipo III, IL-6, TNF-a y otras citocinas y quimiocinas inflamatorias (por ejemplo, MIP-1a/CCL3, MIP-1pCCL4, CCL5 e IP-10/CXCL10); y/o agota las pDC por ADCC o CDC o apoptosis; y/o reduce la gravedad de los síntomas cuando se administra a pacientes humanos que tienen uno o más de los modelos animales de lupus eritematoso sistémico, lupus cutáneo, lupus discoide, nefritis lúpica, esclerodermia, morfea, artritis reumatoide, polimiositis-dermatomiositis, psoriasis, Síndrome de Sjogren, vasculitis y diabetes tipo I. En una realización, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo o los anticuerpos de bajo peso molecular del mismo inhiben el desarrollo de la enfermedad en un modelo de xenoinjerto psoriático humano (Nestle y col., J. Exp. Med. 202(1): 135-143 (2005)). Estas características de un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo o anticuerpos de bajo peso molecular del mismo se pueden medir según los procedimientos descritos en los Ejemplos, así como por otros procedimientos conocidos en la técnica.

Fragmentos de anticuerpos

Los fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Facb, y Fv) pueden prepararse mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener mediante el tratamiento del anticuerpo completo con una enzima como papaína, pepsina o plasmina. La digestión de papaína de los anticuerpos completos produce F(ab)2 o fragmentos Fab; la digestión de pepsina de los anticuerpos completos produce F(ab')2 o Fab'; y la digestión de plasmina de los anticuerpos completos produce fragmentos Facb.

Alternativamente, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir de forma recombinante. Por ejemplo, los ácidos nucleicos codificantes de los fragmentos de anticuerpo de interés se pueden construir, introducir en un vector de expresión y expresar en células hospedadoras adecuadas. Véanse, por ejemplo, Co, M.S. y col., J. Immunol., 152:2968-2976 (1994); Better, M. y Horwitz, A.H., Methods in Enzymology, 178:476-496 (1989); Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods in Enzymology, 178:476-496 (1989); Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 121:652-663 (1989); Rousseaux, J. y col., Methods in Enzymology, (1989) 121:663-669 (1989); y Bird, R.E. y col., TIBT^eC^h, 9:132-137 (1991)). Los fragmentos de anticuerpo se pueden expresar y secretar a partir de E. coli, lo que permite la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo. Alternativamente, se pueden recuperar los fragmentos Fab'-SH directamente de E. coli y unir químicamente para formar fragmentos F(ab)2 (Carter y col., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Conforme con otro enfoque, es posible aislar fragmentos F(ab')2 directamente de cultivo de células hospedadoras recombinantes. Se describen fragmentos Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor salvaje en la patente estadounidense n.° 5.869.046.

Minicuerpos

Los minicuerpos de los anticuerpos anti-BDCA2 incluyen diacuerpos, (scFv) de cadena sencilla y (Fv)2 de cadena sencilla (sc(Fv)2).

Un "diacuerpo" es un minicuerpo bivalente construido por fusión génica (véanse, por ejemplo, Holliger, P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:6444-6448 (1993); documentos EP 404.097; WO 93/11161). Los diacuerpos son dímeros compuestos por dos cadenas de polipéptidos. El dominio VL y VH de cada cadena de polipéptidos del diacuerpo está unido por enlazadores. La cantidad de residuos de aminoácidos que constituye un enlazador puede ser de entre 2 y 12 residuos (p. ej., 3-10 residuos o cinco o aproximadamente cinco residuos). Los enlazadores de los polipéptidos en un diacuerpo son típicamente demasiado cortos para permitir que VL y VH se unan entre sí. Por ende, VL y VH codificadas en la misma cadena de polipéptidos no pueden formar un fragmento de región variable de cadena simple, en cambio forman un dímero con un fragmento de región variable de cadena simple diferente. Como resultado, un diacuerpo tiene dos sitios de unión a antígeno.

Un scFv es un anticuerpo polipeptídico de cadena sencilla obtenido uniendo VH y VL con un enlazador (véanse, por ejemplo, Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85:5879-5883 (1988); y Plickthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol.113, Ed Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, págs. 269-315, (1994)). El orden de VH y VL para unirse no está limitado particularmente y se pueden disponer en cualquier orden. Algunos ejemplos de disposiciones incluyen: [VH] enlazador [VL]; o [VL] enlazador [VH]. La región V de cadena H y la región V de cadena L en un scFv se puede derivar de cualquier anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en esta solicitud. Un sc(Fv)2 es un minicuerpo en el que dos VH y dos VL se unen por un enlazador para formar una cadena sencilla (Hudson y col., J. Immunol. Methods, (1999) 231: 177-189 (1999)). Un sc(Fv)2 se puede preparar, por ejemplo, conectando los scFv con un enlazador. El sc(Fv)2 de la presente invención incluye anticuerpos, preferentemente, en los cuales dos VH y dos VL se disponen en el siguiente orden: VH, VL, VH y VL ([VH] enlazador [VL] enlazador [VH] enlazador [VL]), comenzando en el extremo N de un polipéptido de cadena simple; sin embargo, el orden de las dos VH y las dos VL no se limita a la disposición anterior y se pueden disponer en cualquier orden. A continuación, se enumeran ejemplos de disposiciones:

[VL] enlazador [VH] enlazador [VH] enlazador [VL]

[VH] enlazador [V^l] enlazador [VL] enlazador [V^h]

[v h ] enlazador [VH] enlazador [VL] enlazador [Vl]

[VL] enlazador [VL] enlazador [V^h] enlazador [V^h]

[VL] enlazador [VH] enlazador [VL] enlazador [VH]

Normalmente, se necesitan tres enlazadores cuando se unen cuatro regiones variables de anticuerpo; los enlazadores utilizados pueden ser idénticos o diferentes. No existe una limitación particular para los enlazadores que unen las regiones VH y VL de los minicuerpos. En algunas modalidades, el enlazador es un enlazador peptídico. Cualquier péptido de cadena simple arbitrario que comprende de aproximadamente tres a 25 residuos (p. ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) se puede utilizar como enlazador. Algunos ejemplos de dichos enlazadores peptídicos incluyen: Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:13); Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO:14); Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:15); Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 16); Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17); Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 20); (Gly Gly Gly Gly Ser (SeQ ID NO: 21)ⁿ, donde n es un número entero de uno o más; y (Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 22)ⁿ, donde n es un número entero de uno o más.

En determinadas realizaciones, el enlazador es un enlazador de compuesto sintético (agente reticulante químico). Algunos ejemplos de agentes reticulantes que están disponibles en el mercado incluyen N-hidroxisuccinimida (NHS), disuccinimidilsuberato (DSS), bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3), ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP), ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato) (DTSSP), etilenglicolbis(succinimidilsuccinato) (EGS), etilenglicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS), disuccinimidil tartrato (DST), disulfosuccinimidil tartrato (sulfo-DST), bis[2-(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) y bis[2-(sulfosuccinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfoBSOCOES).

La secuencia de aminoácidos de VH o VL en los minicuerpos puede incluir modificaciones como sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Por ejemplo, la modificación puede estar en una o más de las CDR del anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, BIIB059). En ciertas realizaciones, la modificación implica una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en una o más CDR del dominio VH y/o VL del minicuerpo anti-BDCA2. Dichas sustituciones se realizan para mejorar la unión y/o la actividad funcional del minicuerpo anti-BDCA2. En otras realizaciones, uno, dos o tres aminoácidos de las CDR del anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., BIIB059) se pueden eliminar o añadir siempre que haya unión y/o actividad funcional de BDCA2 cuando VH y Vl se asocian.

Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Algunos anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína BDCA2. Otros anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a BDCA2 con un sitio de unión para otra proteína. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o formas de bajo peso molecular de los mismos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2, anticuerpos biespecíficos sc(Fv)2, anticuerpos biespecíficos de diacuerpos).

La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas-cadenas ligeras de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)). En un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en una célula hospedadora adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones de los tres fragmentos de polipéptidos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión único cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales produce rendimientos altos.

Según otra estrategia descrita en la patente estadounidense n.° 5.731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede genomanipular para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio C^{h 3}. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeño de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (p. ej., tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo remplazando las cadenas laterales grandes de aminoácidos por unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados como los homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar mediante el uso de cualquier procedimiento de reticulación conveniente.

La tecnología de "diacuerpo" proporciona un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden una VH conectada a una VL por medio de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento están obligados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, lo que forma de este modo dos sitios de unión al antígeno.

Anticuerpos multivalentes

Un anticuerpo multivalente se puede interiorizar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo. Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser anticuerpos multivalentes con tres o más sitios de unión al antígeno (p. ej., anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico codificante de las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. Un dominio de dimerización ejemplar comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. Un anticuerpo multivalente puede comprender (o consistir en) de tres a aproximadamente ocho (p. ej., cuatro) sitios de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende opcionalmente al menos una cadena de polipéptidos (p. ej., al menos dos cadenas de polipéptidos), en donde las cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptidos puede(n) comprender VD1-(X1)ⁿ-VD2-(X2)ⁿ-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena de polipéptidos de una región Fc, X1 y x 2 representan un aminoácido o espaciador de péptido y n es 0 o 1.

Anticuerpos conjugados

Los anticuerpos descritos en esta invención pueden ser anticuerpos conjugados que están unidos a diversas moléculas que incluyen sustancias macromoleculares tales como polímeros (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polietilenimina (PEI) modificada con PEG (PEI-PEG), copolímeros de metacrilamida (HPMA) de ácido poliglutámico (PGA) (N-2-hidroxipropil)), ácido hialurónico, materiales radiactivos (por ejemplo, ⁹⁰Y, ¹³¹I), sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, haptenos, enzimas, quelatos metálicos, fármacos y toxinas (por ejemplo, calcheamicina, Pseudomonas exotoxin A, ricina (por ejemplo, cadena de ricina A desglicosilada)).

En una realización, para mejorar las acciones citotóxicas de los anticuerpos anti-BDCA2 y, en consecuencia, su efectividad terapéutica, los anticuerpos se conjugan con sustancias altamente tóxicas, que incluyen radioisótopos y agentes citotóxicos. Estos conjugados pueden suministrar una carga tóxica selectivamente al sitio diana (es decir, células que expresan el antígeno reconocido por el anticuerpo) mientras que las células que no son reconocidas por el anticuerpo se salvan. Con el fin de minimizar la toxicidad, los conjugados generalmente se genomanipulan en base a moléculas con una semivida sérica corta (por lo tanto, el uso de secuencias murinas e isotipos de IgG3 o IgG4).

En determinadas realizaciones, se modifica un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo con un resto que mejora su estabilización y/o retención en circulación, por ejemplo, en la sangre, suero u otros tejidos, por ejemplo, al menos 1,5, 2,5, 10 o 50 veces. Por ejemplo, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar asociado (por ejemplo, conjugado) con un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como un óxido de polialquileno o un óxido de polietileno. Los polímeros adecuados varían sustancialmente según el peso. Se pueden utilizar polímeros que tienen pesos promedio en número molecular que varían de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 Daltons (o aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, y 2.000 a aproximadamente 12.500). Por ejemplo, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se puede conjugar con un polímero soluble en agua, por ejemplo, un polímero de polivinilo hidrofílico, por ejemplo, alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona. Los ejemplos de tales polímeros incluyen homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros en bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros en bloque. Otros polímeros útiles incluyen polioxialquilenos, como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno; polimetacrilatos; carbómeros; y polisacáridos ramificados o sin ramificar.

Los anticuerpos conjugados descritos anteriormente se pueden preparar mediante la realización de modificaciones químicas a los anticuerpos o las formas de menor peso molecular de los mismos descritas en esta invención. Los procedimientos de modificación de anticuerpos son conocidos en la técnica (por ejemplo, los documentos US 5057313 y US 5156840).

Procedimientos de producción de anticuerpos

Los anticuerpos se pueden producir en células bacterianas o eucariotas. Algunos anticuerpos, por ejemplo, Fab, se pueden producir en células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli. Los anticuerpos también se pueden producir en células eucariotas como estirpes celulares transformadas (por ejemplo, CHO, 293E, COS). Además, los anticuerpos (por ejemplo, ScFv) se pueden expresar en una célula de levadura como Pichia (véase, por ejemplo, Powers y col., J Immunol Methods. 251:123-35 (2001)), Hanseula o Saccharomyces. Para producir el anticuerpo de interés, se construye un polinucleótido codificante del anticuerpo, se introduce en un vector de expresión y se expresa en células hospedadoras adecuadas. Se utilizan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo.

Si el anticuerpo se va a expresar en células bacterianas (por ejemplo, E. coli), el vector de expresión debe tener características que permitan la amplificación del vector en las células bacterianas. Además, cuando se utiliza E. coli como JM109, DH5a, HB101 o XL1-Blue como hospedador, el vector debe tener un promotor, por ejemplo, un promotor de lacZ (Ward y col., 341:544-546 (1989), un promotor de araB (Better y col., Science, 240:1041-1043 (1988)) o un promotor de T7 que pueda permitir una expresión efectiva en E. coli. Algunos ejemplos de dichos vectores incluyen, por ejemplo, vectores de serie M13, vectores de serie pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (QIAGEN), pEGFP y pET (cuando se utiliza este vector de expresión, el hospedador es preferentemente BL21 que expresa ARN polimerasa T7). El vector de expresión puede contener una secuencia señal para la secreción del anticuerpo. Para la producción en el periplasma de E. coli, la secuencia señal de pelB (Lei y col., J. Bacteriol., 169:4379 (1987)) se puede utilizar como la secuencia señal para la secreción del anticuerpo. Para la expresión bacteriana, se pueden utilizar procedimientos con cloruro de calcio o de electroporación para introducir el vector de expresión en la célula bacteriana.

Si el anticuerpo se va a expresar en células animales como células CHO, COS y NIH3T3, el vector de expresión incluye un promotor necesario para la expresión en estas células, por ejemplo, un promotor de SV40 (Mulligan y col., Nature, 277:108 (1979)), un promotor de MMLV-LTR, un promotor de EF1a (Mizushima y col., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) o un promotor de c Mv . Además de la secuencia de ácido nucleico codificante de la inmunoglobulina o el dominio de esta, los vectores de expresión recombinantes pueden contener secuencias adicionales, como secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospedadoras (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la cual se ha introducido el vector. Algunos ejemplos de vectores con marcadores seleccionables incluyen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

En una realización, los anticuerpos se producen en células de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero ejemplares para la expresión de un anticuerpo incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células 293 de riñón embriónico humano (por ejemplo, 293, 293E, 293T), células COS, células NIH3T3, estirpes celulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2 y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria.

En un sistema ejemplar para la expresión de anticuerpos, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo de un anticuerpo anti-BDCA2 (por ejemplo, BIIB059) es introducido en células CHO dhfr- por transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo están cada uno unidos de manera funcional a elementos reguladores promotores/potenciadores (p. ej., derivados de SV40, CMV, adenovirus y otros similares, tales como un elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para dirigir niveles altos de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se transfectaron con el vector utilizando selección/amplificación de metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo y se recupera el anticuerpo del medio de cultivo.

Los anticuerpos también pueden ser producidos por un animal transgénico. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.849.992 describe un procedimiento de expresión de un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgen que incluye un promotor específico de leche y ácidos nucleicos codificantes del anticuerpo de interés y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por las hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretado allí, el anticuerpo de interés. El anticuerpo se puede purificar a partir de la leche, o para algunas aplicaciones, se puede utilizar directamente. También se proporcionan animales que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos descritos en esta solicitud.

Los anticuerpos de la presente descripción se pueden aislar desde adentro o afuera (como el medio) de la célula hospedadora y purificar como anticuerpos sustancialmente puros y homogéneos. Los métodos de aislamiento y purificación utilizados comúnmente para la purificación del anticuerpo se pueden utilizar para el aislamiento y la purificación de los anticuerpos y no se limitan a ningún método particular. Los anticuerpos se pueden aislar y purificar mediante la selección adecuada y la combinación, por ejemplo, cromatografía en columna, filtración, ultrafiltración, precipitación por sales, precipitación por disolvente, extracción por disolvente, destilado, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, enfoque isoeléctrico, diálisis y recristalización. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. R. Marshak y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). La cromatografía se puede realizar utilizando cromatografía de fase líquida como HPLC y FPLC. Las columnas utilizadas para cromatografía de afinidad incluyen la columna de proteína A y la columna de proteína G. Algunos ejemplos de columnas que utilizan la columna de proteína A incluyen Hyper D, POROS y Sepharose FF (GE Healthcare Biosciences). La presente descripción también incluye anticuerpos que están altamente purificados mediante el uso de estos procedimientos de purificación.

Caracterización de los anticuerpos

Las propiedades de unión a BDCA2 de los anticuerpos descritos en esta solicitud se pueden medir a través de cualquier procedimiento estándar, por ejemplo, uno o más de los siguientes procedimientos: OCTET®, resonancia de plasmón superficial (SPR), análisis BIACORE™, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), EIA (inmunoensayo enzimático), RIA (radioinmunoensayo) y transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).

La interacción de unión de una proteína de interés (un anticuerpo anti-BDCA2) y una diana (por ejemplo, BDCA2) puede analizarse utilizando los sistemas OCTET®. En este procedimiento, se utiliza una de diversas variaciones de instrumentos (por ejemplo, OCTET® QK^ey QK), realizadas por la empresa FortéBio para determinar las interacciones de las proteínas, la especificidad de unión y el mapeo de epítopos. Los sistemas OCTET® proporcionan una forma fácil de monitorizar la unión en tiempo real mediante la medición de los cambios en la luz polarizada que desciende por una punta personalizada y vuelve a un sensor.

La interacción de unión de una proteína de interés (un anticuerpo anti-BDCA2) y una diana (por ejemplo, BDCA2) puede analizarse utilizando la resonancia de plasmón superficial (SPR). La SPR o el análisis de interacción biomolecular (BIA) detectan las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar a ninguno de los elementos de interacción. Los cambios de masa en la superficie de unión (que indican una instancia de unión) del chip de BIA provocan modificaciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se mide como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. Los procedimientos de uso de SPR se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.641.640; Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander y Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo y col. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705 y recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia). Se puede utilizar la información de SPR para proporcionar una medida adecuada y cuantitativa de la constante de equilibrio de disociación (K^d), y los parámetros cinéticos, incluyendo K^afy K^dis, para la unión de una biomolécula a una diana.

Los epítopos también se pueden mapear directamente evaluando la capacidad de diferentes anticuerpos para competir entre sí por la unión al BDCA2 humano utilizando técnicas cromatográficas BIACORE (Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Epitope Mapping", Section 6.3.2, (May 1994); véase también Johne y col. (1993) J. Immunol. Methods, 160:191-198).

Cuando se emplea un inmunoensayo de enzimas, una muestra que contiene un anticuerpo, por ejemplo, un sobrenadante del cultivo de células productoras de anticuerpo o un anticuerpo purificado se añade a una placa recubierta con antígeno. Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima como la fosfatasa alcalina, se incuba la placa y, después del lavado, se añade un sustrato de enzima como p-nitrofenilfosfato, y se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión al antígeno.

Se puede encontrar orientación general adicional para evaluar anticuerpos, por ejemplo, inmunoelectrotransferencias y ensayos de inmunoprecipitación, en Antibodies: A Laboratory Manual, ed. de Harlow y Lane, Cold Spring Harbor press (1988)).

Depósitos

Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-BDCA2 denominado hibridoma murino BDCA2-1P24F4.1.1.1 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para el propósito del Procedimiento de Patentes el 15 de enero de 2013, y lleva el número de acceso PTA-13450. Los solicitantes reconocen su deber de reemplazar los depósitos en caso de que el depositario no pueda proporcionar una muestra cuando se solicite debido a la condición del depósito antes del final del plazo de una patente concedida en este documento. Los solicitantes también reconocen su responsabilidad de notificar a la ATCC sobre la emisión de dicha patente, en cuyo momento el depósito estará disponible para el público. Antes de ese momento, el depósito se pondrá a disposición del Comisionado de Patentes a tenor de 37 CFR § 1.14 y 35 USC § 112.

Anticuerpos con función efectora alterada

La interacción de los anticuerpos y los complejos de anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunitario dispara diversas respuestas, que se denominan en esta solicitud funciones efectoras. Las funciones efectoras mediadas por el sistema inmunitario incluyen dos mecanismos importantes: la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Ambas están mediadas por la región constante de la proteína de inmunoglobulina. El dominio Fc de anticuerpo es, por lo tanto, la parte que define las interacciones con los mecanismos efectores inmunitarios.

Los anticuerpos de IgG activan las vías efectoras del sistema inmunitario mediante la unión a los miembros de la familia de receptores Fc y de superficie celular y a C1q del sistema complementario. La ligación de las proteínas efectoras por los anticuerpos agrupados dispara diversas respuestas, incluido la liberación de citocinas inflamatorias, regulación de la producción de antígenos, endocitosis y destrucción celular. En algunas aplicaciones clínicas, estas respuestas son fundamentales para la eficacia de un anticuerpo monoclonal. En otras, provocan efectos secundarios no deseados como inflamación y la eliminación de células que contienen antígenos. En consecuencia, la presente invención se refiere además a proteínas de unión a BDCA2, incluyendo anticuerpos, con funciones efectoras modificadas, por ejemplo, aumentadas o reducidas.

La función efectora de un anticuerpo anti-BDCA2 de la presente invención se puede determinar utilizando uno de muchos ensayos conocidos. La función efectora del anticuerpo anti-BDCA2 se puede aumentar o reducir con respecto a un segundo anticuerpo anti-BDCA2. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo anti-BDCA2 puede ser cualquier anticuerpo que se una específicamente a BDCA2. En otras realizaciones, el segundo anticuerpo específico de BDCA2 puede ser cualquiera de los anticuerpos de la invención, tal como BIIB059. En otras realizaciones, cuando el anticuerpo anti-BDCA2 de interés se ha modificado para aumentar o reducir la función efectora, el segundo anticuerpo anti-BDCA2 puede ser una versión no modificada o parental del anticuerpo.

Las funciones efectoras incluyen citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), mediante la cual los anticuerpos se unen a receptores Fc en células T citotóxicas, células asesinas naturales (NK) o macrófagos que conducen a la muerte celular y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), que es la muerte inducida de la célula por activación de la cascada del complemento (revisado en Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997); Ward y Ghetie, Therapeutic Immunol., 2:77-94 (1995); y Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)). Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y se pueden evaluar utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO 05/018572, WO 05/003175 y U.S. 6.242.195).

Las funciones efectoras se pueden evitar mediante el uso de fragmentos de anticuerpos que carecen del dominio Fc como Fab, Fab'2 o Fv de cadena sencilla. Una alternativa es utilizar el anticuerpo del subtipo IgG4, que se une a FcyRI, pero que se une con poca fuerza a C1q y F^cyRII y RIII. El subtipo IgG2 también tiene unión reducida a los receptores Fc, pero mantiene una unión significativa al alotipo H131 de FcYRNa y a C1q. Por ende, se necesitan cambios adicionales en la secuencia Fc para eliminar la unión a todos los receptores Fc y a C1q.

Diversas funciones efectoras del anticuerpo, incluyendo ADCC, están mediadas por receptores Fc (FcR), que se unen a la región Fc de un anticuerpo. La afinidad de un anticuerpo por un FcR particular, y por ende la actividad efectora mediada por el anticuerpo, se puede modular mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos y/o las modificaciones postraduccionales de Fc y/o la región constante del anticuerpo.

Los FcR se definen por su especificidad por los isotipos de inmunoglobulina; los receptores Fc para los anticuerpos de IgG se denominan FcyR, para IgE como FcsR, para IgA como FcaR y así sucesivamente. Se han identificado tres subclases de F^cyR: F^cyRI (CD64), F^cyRII (CD32) y F^cyRIII (CD16). F^cyRII y F^cyRIII tienen dos tipos: FcYRIIa (CD32a) y F^cyRIIB (CD32b); y F^cyRIIIA (CD16a) y F^cyRIIIB (CD16b). Como cada subclase de F^cyR está codificada por dos o tres genes y la escisión de ARN alternativa produce múltiples transcripciones, existe una amplia diversidad en las isoformas de F^cyR. Por ejemplo, F^cyRII (CD32) incluye las isoformas IIa, IIb1, IIb2 IIb3 y IIc.

El sitio de unión en anticuerpos humanos y murinos para F^cyR se ha mapeado previamente en la denominada "región de la bisagra inferior" que consiste en los residuos 233-239 (numeración del índice de la UE como en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), Woof y col., Molec. Immunol. 23:319-330 (1986); Duncan y col., Nature 332:563 (1988); Canfield y Morrison, J. Exp. Med.

173:1483-1491 (1991); Chappel y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:9036-9040 (1991)). Entre los residuos 233-239, P238 y S239 se encuentran los que se dice que posiblemente participan en la unión. Otras áreas mencionadas anteriormente que posiblemente participan en la unión a F^cyR son: G316-K338 (IgG humana) para F^cyRI humano (Woof y col., Mol. Immunol., 23:319-330 (1986)); K274-R301 (IgG1 humana) para FcyRIII humano (Sarmay y col., Molec. Immunol 21:43-51 (1984)); e Y407-R416 (IgG humana) para F^cyRIII humano (Gergely y col., Biochem. Soc. Trans. 12:739-743 (1984) y Shields y col., J Biol Chem 276: 6591-6604 (2001), Lazar GA y col., Proc Natl Acad Sci 103: 4005-4010 (2006)). Estos y otros tramos o regiones de los residuos de aminoácidos que participan en la unión de FcR pueden ser evidentes para el experto en la materia a partir de un análisis de las estructuras cristalinas de los complejos de Ig-FcR (véanse, por ejemplo, Sondermann y col. 2000 Nature 406(6793):267-73 y Sondermann y col. 2002 Biochem Soc Trans. 30(4):481-6). En consecuencia, los anticuerpos anti-BDCA2 de la presente invención incluyen modificaciones de uno o más de los residuos mencionados anteriormente (para aumentar o disminuir la función efectora según sea necesario).

Otra estrategia para alterar la función efectora del anticuerpo monoclonal incluye la mutación de aminoácidos en la superficie del anticuerpo monoclonal que están involucrados en las interacciones de unión efectora (Lund, J. y col. (1991)

J. Immunol. 147(8): 2657-62; Shields, R. L. y col. (2001) J. Biol. Chem. 276(9): 6591-604).

Los procedimientos para aumentar la función efectora de los anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Kelley y col., Methods Mol. Biol., 901:277-93 (2012); Natsume y col., Drug Des Devel Ther., 3:7-16 (2009);

247, 249, 283, 284,

320, 322, , , , , , , , , , , , , y , on e a numerac n e os residuos en la Fc es la del índice de la UE como en Kabat. En determinadas realizaciones, los anticuerpos BDCA2 tienen una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de entre el grupo que consiste en: D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225K, T225W, P227E, P227G, P227K, P227Y, P228E, P228G, P228K, P228Y, P230A, P230E, P230G, P230Y, A231E, A231G, A231K, A231P, A231Y, P232E, P232G, P232K, P232Y, E233A, E233D, E233F, E233G, E233H, E233I, E233K, E233L, E233M, E233N, E233Q, E233R, E233S, E233T, E233V, E233W, E233Y, L234A, L234D, L234E, L234F, L234G, L234H, L234I, L234K, L234M, L234N, L234P, L234Q, L234R, L234S, L234T, L234V, L234W, L234Y, L235A, L235D, L235E, L235F, L235G, L235H, L235I, L235K, L235M, L235N, L235P, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, G236A, G236D, G236E, G236F, G236H, G236I, G236K, G236L, G236M, G236N, G236P, G236Q, G236R, G236S, G236T, G236V, G236W, G236Y, G237D, G237E, G237F, G237H, G237I, G237K, G237L, G237M, G237N, G237P, G237Q, G237R, G237S, G237T, G237V, G237W, G237Y, P238D, P238E, P238F, P238G, P238H, P238I, P238K, P238L, P238M, P238N, P238Q, P238R, P238S, P238T, P238V, P238W, P238Y, S239D, S239E, S239F, S239G, S239H, S239I, S239K, S239L, S239M, S239N, S239P, S239Q, S239R, S239T, S239V, S239W, S239Y, V240A, V240I, V240M, V240T, F241D, F241E, F241L, F241R, F241S, F241W, F241Y, F243E, F243H, F243L, F243Q, F243R, F243W, F243Y, P244H, P245A, K246D, K246E, K246H, K246Y, P247G, P247V, D249H, D249Q, D249Y, R255E, R255Y, E258H, E258S, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262A, V262E, V262F, V262I, V262T, V263A, V263I, V263M, V263T, V264A, V264D, V264E, V264F, V264G, V264H, V264I, V264K, V264L, V264M, V264N, V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W, V264Y, D265F, D265G, D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P, D265Q, D265R, D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, V266A, V266I, V266M, V266T, S267D, S267E, S267F, S267H, S267I, S267K, S267L, S267M, S267N, S267P, S267Q, S267R, S267T, S267V, S267W, S267Y, H268D, H268E, H268F, H268G, H268I, H268K, H268L, H268M, H268P, H268Q, H268R, H268T, H268V, H268W, E269F, E269G, E269H, E269I, E269K, E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S, D270T, D270W, D270Y, P271A, P271D, P271E, P271F, P271G, P271H, P271I, P271K, P271L, P271M, P271N, P271Q, P271R, P271S, P271T, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W, E272Y, V273I, K274D, K274E, K274F, K274G, K274H, K274I, K274L, K274M, K274N, K274P, K274R, K274T, K274V, K274W, K274Y, F275L, F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N276I, N276L, N276M, N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, N276Y, Y278D, Y278E, Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L, Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, D280G, D280K, D280L, D280P, D280W, G281D, G281E, G281K, G281N, G281P, G281Q, G281Y, V282E, V282G, V282K, V282P, V282Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P, E283R, E283Y, V284D, V284E, V284L, V284N, V284Q, V284T, V284Y, H285D, H285E, H285K, H285Q, H285W, H285Y, N286E, N286G, N286P, N286Y, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290H, K290L, K290N, K290W, P291D, P291E, P291G, P291H, P291I, P291Q, P291T, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293F, E293G, E293H, E293I, E293L, E293M, E293N, E293P, E293R, E293S, E293T, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G, E294H, E294I, E294K, E294L, E294M, E294P, E294R, E294S, E294T, E294V, E294W, E294Y, Q295D, Q295E, Q295F, Q295G, Q295H, Q295I, Q295M, Q295N, Q295P, Q295R, Q295S, Q295T, Q295V, Q295W, Q295Y, Y296A, Y296D, Y296E, Y296G, Y296H, Y296I, Y296K, Y296L, Y296M, Y296N, Y296Q, Y296R, Y296S, Y296T, Y296V, N297D, N297E, N297F, N297G, N297H, N297I, N297K, N297L, N297M, N297P, N297Q, N297R, N297S, N297T, N297V, N297W, N297Y, S298D, S298E, S298F, S298H, S298I, S298K, S298M, S298N, S298Q, S298R, S298T, S298W, S298Y, T299A, T299D, T299E, T299F, T299G, T299H, T299I, T299K, T299L, T299M, T299N, T299P, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W, T299Y, Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300K, Y300M, Y300N, Y300P, Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V, Y300W, R301D, R301E, R301H, R301Y, V302I, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304H, S304L, S304N, S304T, V305E, V305T, V305Y, W313F, K317E, K317Q, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L, K320N, K320P, K320S, K320T, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F, K322G, K322H, K322I, K322P, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y, V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324L, S324M, S324P, S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F, N325G, N325H, N325I, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R, N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T, A327D, A327E, A327F, A327H, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327S, A327T, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D, L328E, L328F, L328G, L328H, L328I, L328K, L328M, L328N, L328P, L328Q, L328R, L328S, L328T, L328V, L328W, L328Y, P329D, P329E, P329F, P329G, P329H, P329I, P329K, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329R, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y, A330E, A330F, A330G, A330H, A330I, A330L, A330M, A330N, A330P, A330R, A330S, A330T, A330V, A330W, A330Y, P331D, P331F, P331H, P331I, P331L, P331M, P331Q, P331R, P331T, P331V, P331W, P331Y, I332A, I332D, I332E, I332F, I332H, I332K, I332L, I332M, I332N, I332P, I332Q, I332R, I332S, I332T, I332V, I332W, I332Y, E333F, E333H, E333I, E333L, E333M, E333P, E333T, E333Y, K334F, K334I, K334L, K334P, K334T, T335D, T335F, T335G, T335H, T335I, T335L, T335M, T335N, T335P, T335R, T335S, T335V, T335W, T335Y, I336E, I336K, I336Y, S337E, S337H y S337N, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat. En una realización particular, los anticuerpos BDCA2 comprenden una, dos o tres de las siguientes mutaciones: S239D, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S239D/I332E/G236A, S298A, A330L I332E, E333A y K334A.

La presencia de específicamente oligosacáridos, el oligosacárido unido a N en asparigina-297 en el dominio CH2 de IgG1 es importante para la unión a F^cyR, así como C1q. La reducción del contenido de fucosa de los anticuerpos mejora la función efectora (véase, por ejemplo, el documento US 8.163.551). En determinadas realizaciones, los anticuerpos BDCA2 presentan fucosilación reducida y sustituciones de aminoácidos que aumentan la función efectora (por ejemplo, una, dos o tres de las siguientes mutaciones: S298A; E333A y K334A). La función efectora también se puede lograr mediante la preparación y la expresión de los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud en presencia de inhibidores de alfa-manosidasa I (por ejemplo, kifunensina) en una concentración del inhibidor de aproximadamente 60

200 ng/ml (por ejemplo, 60 ng/ml, 75 ng/ml, 100 ng/ml, 150 ng/ml). Los anticuerpos expresados en presencia de inhibidores de alfa-manosidasa I contienen principalmente glicanos de tipo oligomanosa y, generalmente, demuestran mayor actividad ADCC y afinidad por F^cyRIIIA, pero unión a C1q reducida.

Los anticuerpos anti-BDCA2 de la presente descripción con función efectora aumentada incluyen anticuerpos con afinidad de unión aumentada para uno o más de los receptores Fc (FcR) con respecto a un anticuerpo anti-BDCA2 no variante o parental. En consecuencia, los anticuerpos anti-BDCA2 con afinidad de unión a FcR aumentada incluyen anticuerpos anti-BDCA2 que presentan un aumento de 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o mayor en la afinidad de unión a uno o más de los receptores Fc en comparación con un anticuerpo anti-BDCA2 parental o no variante. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-BDCA2 con función efectora aumentada se une a un FcR con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor con respecto a un anticuerpo parental o no variante. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-BDCA2 con función efectora aumentada se une a un FcR con una afinidad aproximadamente 15 veces mayor o con una afinidad aproximadamente 20 veces mayor con respecto a un anticuerpo parental o no variante. El receptor FcR puede ser uno o más de F^cyRI (CD64), F^cyRII (CD32) y F^cyRIII y sus isoformas, y F^ceR, Fc|jR, Fc5R y/o un FcaR. En realizaciones particulares, un anticuerpo anti-BDCA2 con función efectora aumentada presenta un aumento de 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o mayor en la afinidad de unión a FcYRIIa.

Para reducir la función efectora, se pueden usar combinaciones de diferentes segmentos de secuencia de subtipo (por ejemplo, combinaciones de IgG2 e IgG4) para proporcionar una mayor reducción en la unión a los receptores F^cyque cualquiera de los subtipos solos (Armor y col., Eur. J. Immunol., 29:2613-1624 (1999); Mol. Immunol., 40:585-593 (2003)).

Además, los sitios de glicosilación unidos a N se pueden retirar como una forma de reducir la función efectora. En la técnica se conoce un gran número de variantes de Fc que tienen afinidades alteradas y/o reducidas para algunos o todos los subtipos de receptores de Fc (y, por lo tanto, para las funciones efectoras). Véanse, por ejemplo, los documentos US 2007/0224188 US 2007/0148171 US 2007/0048300 US 2007/0041966 US 2007/0009523 US 2007/0036799 U U

20050244403; U 20050233382; U 20050215768; U 20050118174; U 20050054832;U 20040228856; U 2004/132101;US 2003/158389; véanse también US 7.183.387; 6.737.056; 6.538.124; 6.528.624; 6.194.551; 5.624.821;

5.648.260.

Los anticuerpos anti-BDCA2 de la presente invención con función efectora aumentada incluyen anticuerpos con afinidad de unión aumentada para uno o más de los receptores Fc (FcR) con respecto a un anticuerpo anti-BDCA2 no variante o parental. En consecuencia, los anticuerpos anti-BDCA2 con afinidad de unión a FcR reducida incluyen anticuerpos anti-BDCA2 que presentan una disminución de 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o mayor en la afinidad de unión a uno o más de los receptores Fc en comparación con un anticuerpo anti-BDCA2 parental o no variante.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-BDCA2 con función efectora reducida se une a un FcR con una afinidad aproximadamente 10 veces menor con respecto a un anticuerpo parental o no variante. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-BDCA2 con función efectora reducida se une a un FcR con una afinidad aproximadamente 15 veces menor o con una afinidad aproximadamente 20 veces menor con respecto a un anticuerpo parental o no variante. El receptor

FcR puede ser uno o más de F^cyRI (CD64), F^cyRII (CD32) y F^cyRIII y sus isoformas, y F^ceR, FcjR, Fc5R y/o un FcaR.

En realizaciones particulares, un anticuerpo anti-BDCA2 con función efectora reducida presenta una disminución de 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o mayor en la afinidad de unión a FcYRIIa.

En la CDC, el complejo de anticuerpo-antígeno se une al complemento, lo que produce la activación de la cascada de complemento y la generación del complejo de ataque de membrana. La activación de la vía de complemento clásica se inicia mediante la unión del primer componente del sistema complementario (C1q) a los anticuerpos (de la subclase adecuada) que se unen a su antígeno cognato; por lo tanto, la activación de la cascada de complemento se regula en parte por la afinidad de unión de la inmunoglobulina a la proteína C1q. Para activar la cascada de complemento, es necesario que C1q se una a al menos dos moléculas de IgG1, IgG2 o IgG3, pero solo una molécula de IgM, unida a la diana antigénica (Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) pág. 80). Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Se ha propuesto que varios residuos de la molécula de IgG están involucrados en la unión a C1q, incluyendo los residuos Glu318, Lys320 y Lys322 en el dominio CH2, el residuo de aminoácido 331 ubicado en una curva cerca de la misma cadena beta, los residuos Lys235 y Gly237 ubicados en la región de la bisagra inferior, y residuos 231 a 238 ubicados en la región N-terminal del dominio CH2 (véanse, Xu y col., J. Immunol. 150: 152A (Resumen) (1993), documentos WO94/29351; Tao y col., J. Exp. Med., 178:661-667 (1993); Brekke y col., Eur. J. Immunol., 24:2542-47 (1994); Burton y col.; Nature, 288:338-344 (1980); Duncan ay Winter, Nature 332:738-40 (1988); Idusogie y col., J Immunol 164: 4178 4184 (2000; documentos U.S. 5.648.260, y U.S. 5.624.821).

Los anticuerpos anti-BDCA2 con unión a C1q mejorada pueden comprender una sustitución de aminoácido en uno, dos, tres o cuatro de las posiciones de aminoácidos 326, 327, 333 y 334 de la región Fc de IgG humana, donde la numeración de los residuos en la región Fc de IgG es la del índice de la UE como en Kabat. En una realización, los anticuerpos anti-BDCA2 incluyen las siguientes sustituciones de aminoácidos: K326W/E333S, que se sabe que aumentan la unión de un anticuerpo de IgG1 a C1q (Steurer W. y col., J Immunol., 155(3):1165-74 (1995)).

Los anticuerpos anti-BDCA2 con unión a C1q reducida pueden comprender una sustitución de aminoácido en uno, dos, tres o cuatro de las posiciones de aminoácidos 270, 322, 329 y 331 de la región Fc de IgG humana, donde la numeración de los residuos en la región Fc de IgG es la del índice de la UE como en Kabat. Por ejemplo, en IgG1, dos mutaciones en la región terminal COOH del dominio CH2 de IgG1 humana-K322A y P329A- no activan la vía de CDC y se demostró que producen una disminución de más de 100 veces en la unión a C1q (documento US 6.242.195).

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-BDCA2 de la presente invención exhibe una unión aumentada o reducida a una proteína del complemento con respecto a un segundo anticuerpo anti-BDCA2. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-BDCA2 de la invención presenta unión aumentada o reducida a C1q por un factor de aproximadamente 1,5 veces o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 6 veces o más, aproximadamente 7 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 9 veces o más, aproximadamente 10 veces o más o aproximadamente 15 veces o más, con respecto a un segundo anticuerpo anti-BDCA2.

Por ende, en determinadas realizaciones de la invención, se puede modificar, sustituir o eliminar uno o más de estos residuos o se puede introducir uno o más residuos de aminoácidos para aumentar o disminuir la actividad de CDC de los anticuerpos anti-BDCA2 proporcionados en esta solicitud.

En otras realizaciones determinadas, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-BDCA2 que presenta unión reducida a uno o más receptores de FcR, pero que mantiene su capacidad de unirse al complemento (por ejemplo, en un grado similar o, en algunas realizaciones, inferior a un anticuerpo anti-BDCA2 nativo, no variante o parental). En consecuencia, un anticuerpo anti-BDCA2 de la presente invención puede unir y activar un complemento y presentar a su vez unión reducida a un FcR, como por ejemplo FcYRIIa (por ejemplo, FcYRIIa expresado en plaquetas). Dicho anticuerpo con unión reducida o sin unión a FcYRIIa (como FcYRIIa expresado en plaquetas, por ejemplo), pero que se puede unir a C1q y activar la cascada de complemento en al menos algún grado, reducirá el riesgo de eventos tromboembólicos y mantendrá, a su vez, funciones efectoras que tal vez sean deseables. En realizaciones alternativas, un anticuerpo anti-BDCA2 de la presente invención presenta unión reducida a uno o más FcR, pero mantiene su capacidad de unirse a otro u otros FcR. Véanse, por ejemplo, los documentos US 2007-0009523, 2006-0194290, 2005-0233382, 2004-0228856 y 2004-0191244, que describen diversas modificaciones de aminoácidos que generan anticuerpos con unión reducida a FcRI, FcRII y/o FcRIII, así como sustituciones de aminoácidos que producen unión aumentada a un FcR, pero unión reducida a otro FcR.

En consecuencia, las funciones efectoras que comprenden la región constante de un anticuerpo anti-BDCA2 se pueden modular mediante la alteración de las propiedades de la región constante y la región Fc en particular. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 que tiene función efectora aumentada o disminuida se compara con un segundo anticuerpo con función efectora y que puede ser un anticuerpo no variante, nativo o parental que comprende una región Fc o constante nativa que media la función efectora.

Una región constante o Fc de secuencia nativa comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de cadena constante o Fc que se encuentra en la naturaleza. Preferentemente, una molécula de control que se utiliza para evaluar la función efectora relativa comprende la región Fc del mismo tipo/subtipo que el anticuerpo variante o de prueba. Una región constante o Fc modificada o variante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una región de cadena pesada de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido (como por ejemplo, una modificación postraduccional, una sustitución, inserción o eliminación de aminoácido). En consecuencia, la región constante variante puede contener una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos que producen modificaciones postraduccionales alteradas, incluido, por ejemplo, un patrón de glicosilación alterado. Un anticuerpo parental o región Fc es, por ejemplo, una variante que tiene función efectora normal utilizada para construir una región constante (es decir, Fc) que tiene una función efectora alterada, por ejemplo, aumentada.

Los anticuerpos con funciones efectoras alteradas (por ejemplo, aumentadas) se pueden generar mediante modificación genética o producción de anticuerpos con regiones de cadena pesada, Fc o constante variantes. La tecnología de ADN recombinante y/o el cultivo celular y las condiciones de expresión se pueden utilizar para producir anticuerpos con función y/o actividad modificadas. Por ejemplo, se puede utilizar la tecnología de ADN recombinante para realizar una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos en regiones (como por ejemplo, las regiones Fc o constantes) que afectan la función del anticuerpo, incluido las funciones efectoras. Alternativamente, los cambios en las modificaciones postraduccionales, como, por ejemplo, los patrones de glicosilación, se pueden lograr mediante la manipulación de la célula hospedadora y las condiciones de expresión y cultivo celular a través de las cuales se produce el anticuerpo.

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-BDCA2 que comprende secuencias de CDR de cadena pesada seleccionadas de entre CDR1 de VH de SEQ ID NO:9, CDR2 de VH de SEQ ID NO:10 y CDR3 de VH de SEQ ID NO:11; y secuencias de CDR de cadena ligera seleccionadas de entre CDR1 de VL o SEQ ⁱD NO:5, CDR2 de VL de SEQ ID NO:6 y CDR3 de VL de SEQ ID NO:7. Estos anticuerpos anti-BDCA2 i) inhiben la secreción de interferones tipo I y/o interferones tipo III además de otras citocinas y quimiocinas de las células dendríticas plasmacitoides; y/o (ii) inducen o potencian el agotamiento de las células dendríticas plasmacitoides in vitro.

La invención se refiere a un anticuerpo anti-BDCA2 que comprende una secuencia VL que comprende la SEQ ID NO:23, el anticuerpo además comprende una región Fc variante que confiere una función efectora reducida en comparación con una región Fc nativa o parental. La invención se refiere a un anticuerpo anti-BDCA2 que comprende una secuencia VH que comprende la SEQ ID NO:24, el anticuerpo además comprende una región Fc variante que confiere una función efectora reducida en comparación con una región Fc nativa o parental.

Los procedimientos de generación de cualquiera de las variantes de anticuerpo anti-BDCA2 mencionadas anteriormente que comprenden sustituciones de aminoácidos son bien conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, entre otros, preparación mediante mutagénesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR y mutagénesis por casete de una molécula de ADN preparada que codifica el anticuerpo o al menos la región constante del anticuerpo. La mutagénesis dirigida al sitio es conocida en la técnica (véanse, por ejemplo, Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4431-4443 (1985) y Kunkel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1987)). La mutagénesis por PCR también es adecuada para realizar variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido de partida. Véanse Higuchi, en PCR Protocols, págs.177-183 (Academic Press, 1990); y Vallette y col., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989). Otro procedimiento de preparación de variantes de secuencias, mutagénesis de casete, se basa en la técnica descrita por Wells y col., Gene, 34:315-323 (1985).

Anticuerpos anti-BDCA2 con glicosilación alterada

Diferentes glicoformas pueden afectar profundamente a las propiedades de un agente terapéutico, incluida la farmacocinética, la farmacodinámica, la interacción del receptor y la focalización específica del tejido (Graddis y col., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297). En particular, para los anticuerpos, la estructura de los oligosacáridos puede afectar a las propiedades pertinentes a la resistencia a la proteasa, la semivida sérica del anticuerpo mediada por el receptor de FcRn, la fagocitosis y la retroalimentación del anticuerpo, además de las funciones efectoras del anticuerpo (por ejemplo, la unión al complejo C1 complementario, que induce CDC y la unión a los receptores FcyR, que son responsables de la modulación de la vía de A^dC^c) (Nose y Wigzell, 1983; Leatherbarrow y Dwek, 1983; Leatherbarrow y col.,1985; Walker y col., 1989; Carter y col., 1992, PNAS, 89: 4285-4289).

En consecuencia, otro medio para modular la función efectora de los anticuerpos incluye modificar la glicosilación de la región constante del anticuerpo. La glicosilación modificada incluye, por ejemplo, una disminución o un aumento en la cantidad de residuos glicosilados, un cambio en el patrón o la ubicación de los residuos glicosilados, así como un cambio en las estructuras del azúcar. Los oligosacáridos encontrados en las IgG humanas afectan a su grado de función efectora (Raju, T.S. BioProcess International April 2003. 44-53); la microheterogeneidad de los oligosacáridos de IgG humana puede afectar a funciones biológicas como CDC y ADCC, unirse a varios receptores de Fc y unirse a la proteína Clq (Wright A. & Morrison SL. TIBTECH 1997, 1526-32; Shields y col. J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604; Shields y col. J Biol Chem. 2002; 277(30):26733-40; Shinkawa y col. J Biol Chem. 2003278(5):3466-73; Umana y col. Nat Biotechnol.

1999 Feb; 17(2): 176-80). Por ejemplo, la capacidad de IgG de unirse a C1q y activar la cascada de complemento puede depender de la presencia, ausencia o modificación del resto de carbohidratos ubicado entre los dos dominios CH2 (que, normalmente, está anclado en Asn297) (Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995).

Los sitios de glicosilación en un polipéptido que contiene Fc, por ejemplo, un anticuerpo como un anticuerpo de IgG, se pueden identificar a través de técnicas estándar. La identificación del sitio de glicosilación puede ser experimental o basada en análisis de secuencia o datos de modelado. Se han descrito motivos de consenso, es decir, la secuencia de aminoácidos reconocida por diversas glicosilo transferasas. Por ejemplo, el motivo de consenso para un motivo de glicosilación unido a N es, con frecuencia, NXT o NXS, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. También se han descrito diversos algoritmos para ubicar un posible motivo de glicosilación. En consecuencia, para identificar posibles sitios de glicosilación dentro de un anticuerpo o fragmento que contiene Fc, se analiza la secuencia del anticuerpo, por ejemplo, mediante el uso de las bases de datos disponibles al público como el sitio web proporcionado por el Center for Biological Sequence Analysis (véase los servicios NetNGlyc para predecir los sitios de glicosilación unidos a N y los servicios NetOGlyc para predecir los sitios de glicosilación unidos a O).

Estudios in vivo han confirmado la reducción de la función efectora de los anticuerpos aglicosilados. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD8 aglicosilado es incapaz de agotar las células que llevan CD8 en ratones (Isaacs, 1992 J. Immunol.

148: 3062) y un anticuerpo anti-CD3 aglicosilado no induce el síndrome de liberación de citocinas en ratones o humanos (Boyd, 1995 supra; Friend, 1999 Transplantation 68:1632). Las formas aglicosiladas del anticuerpo BDCA2 también tienen una función efectora reducida.

Es importante destacar que, aunque la eliminación de los glicanos en el dominio CH2 parece producir un efecto significativo sobre la función efectora, otras propiedades funcionales y físicas del anticuerpo permanecen inalteradas. Específicamente, se ha demostrado que la eliminación de los glicanos presentó poco o ningún efecto sobre la semivida sérica y la unión al antígeno (Nose, 1983 supra; Tao, 1989 supra; Dorai, 1991 supra; Hand, 1992 supra; Hobbs, 1992 Mol. Immunol. 29:949).

Los anticuerpos anti-BDCA2 de la presente invención pueden modificarse o alterarse para provocar funciones efectoras aumentadas o disminuidas (en comparación con un segundo anticuerpo específico de BDCA2). Otros procedimientos de alteración de los sitios de glicosilación de los anticuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos US 6.350.861 y US 5.714.350, WO 05/18572 y WO 05/03175; estos procedimientos se pueden utilizar para producir los anticuerpos anti-BDCA2 de la presente invención con glicosilación alterada, reducida o sin glicosilación.

Indicaciones

Un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud puede utilizarse para tratar o impedir una variedad de trastornos inmunológicos, tales como trastornos inflamatorios y autoinmunitarios. Los anticuerpos anti-BDCA2 son útiles para tratar o impedir tales trastornos, al menos porque deshabilitan o agotan las pDC, y/o inhiben las citocinas y quimiocinas inflamatorias producidas por las pDC, y/o regulan negativamente CD32a, y/o inhiben la estimulación del complejo inmunitario de las pDC, y/o regulan negativamente o causan el desprendimiento de CD62L. Los anticuerpos anti-BDCA2 de esta descripción se pueden combinar con un agente antipalúdico (por ejemplo, HCQ) para mejorar los efectos terapéuticos en el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios. Los anticuerpos anti-BDCA2 se pueden utilizar para reducir los niveles de citocinas y quimiocinas como: interferones tipo I, interferones tipo III, IL-6, TNF-a, MIP1-a y MIP1-P, CCL5 e IP-10. Los IFN de tipo I constituyen una familia de citocinas de múltiples miembros, que incluye 13 subtipos de IFN-a, IFN-p, -£, -^k, -^w, -5 y -^t. (Theofilopoulos, Annu. Rev. Immunol., 23:307-36 (2005)). Los interferones de tipo III consisten en tres moléculas de IFN-A llamadas IFN-A1, IFN-A2 e IFN-A3 (también conocidas como IL29, IL28A e IL28B, respectivamente). Al agotar y/o amortiguar la función de pDC, los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud proporcionan una estrategia de tratamiento más robusto que los tratamientos que intentan reducir subtipos de IFN específicos con anticuerpos neutralizantes. Además, la estrategia de tratamiento centrado en pDC de los anticuerpos anti-BDCA2 es más selectiva y potencialmente más segura que el bloqueo global de la respuesta de IFN. Por ejemplo, los anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud eliminan eficazmente los IFN de tipo I derivados de pDC mientras mantienen otras fuentes de IFN que podrían ser necesarias en caso de infecciones virales.

El término "tratar" se refiere a administrar una composición descrita en esta solicitud en una cantidad, manera y/o modo eficaz para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno o para impedir la progresión o exacerbación del trastorno (incluido el daño secundario causado por el trastorno) en un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable por un experto en la materia.

Las enfermedades o afecciones que pueden tratarse con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud incluyen, por ejemplo, lupus eritematoso sistemático (LES) (por ejemplo, lupus moderado o grave), lupus cutáneo, lupus discoide, nefritis lúpica, esclerosis sistémica (esclerodermia), morfea, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), deratomiositis, polimiositis y diabetes tipo I.

El LES es una enfermedad autoinmunitaria crónica donde múltiples órganos son dañados por complejos inmunitarios y autoanticuerpos que se unen a los tejidos (véase, Guidelines for Referral and Management of Systemic Lupus Erythematosus in Adults, Arthritis & Rheumatism, 42(9):1785-1795 (1999)). Los autoanticuerpos están presentes en el LES y pueden preceder al desarrollo de la enfermedad clínica (Arbuckle y col., N. Engl. J. Med., 349(16): 1526-33 (2003)). La internalización de los complejos inmunitarios que contienen autoanticuerpos a través de los receptores Fc conduce a la producción de interferón tipo I que a su vez promueve la pérdida de tolerancia, perpetuando el círculo vicioso de la autoinmunidad (Means y col., Ann NY Acad Sci., 1062:242-51 (2005)). El LES es heterogéneo con respecto a su presentación clínica, curso, pronóstico y genética. Los afroamericanos comparten un mayor riesgo de LES que a menudo es más grave en comparación con los pacientes blancos. Las deficiencias del complemento se reconocieron temprano como factores de riesgo para el desarrollo de LES. Más recientemente, se ha descrito que los polimorfismos genéticos asociados con las vías de interferón tipo I confieren susceptibilidad. Por ejemplo, el ADN anti-bicatenario y los autoanticuerpos anti-Ro se asociaron con un cierto haplotipo del factor de transcripción del factor 5 regulador del interferón (IRF5). El haplotipo también predijo altos niveles de IFN-a en el suero de pacientes con LES (Niewold y col., Ann. Rheum. Dis., 71(3):463-8 (2012)). Los niveles más altos de IFN-a se han correlacionado con un mayor grado de afectación de múltiples órganos en pacientes con LES (Bengtsson y col., Lupus, 9(9):664-71 (2000)). Además, la llamada "firma de interferón" parece ser prominente en el LES. La firma de interferón representa un patrón de expresión de ARNm de genes inducibles por interferón. Se encuentra una firma de interferón tipo I en más de la mitad de los pacientes con LES y se asocia con una mayor actividad de la enfermedad (Baechler y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100(5):2610-5 (2003)). Los anticuerpos monoclonales IFN-a ahora se han introducido en las clínicas y los resultados de la fase 1 de sifalimumab y rontalizumab han demostrado una reducción dependiente de la dosis en la firma de IFN tipo I en la sangre entera de pacientes con LES (McBride y col., Arthritis Rheum., 64(11):3666-76 (2012); Yao y col., Arthritis Rheum., (6):1785-96 (2009)). Se han desarrollado índices validados para la evaluación de la actividad de la enfermedad y la gravedad de la enfermedad (por ejemplo, moderada, severa) (véase, por ejemplo, Gladman, Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus, Curr. Opin. Rheumatol., 8:430-437 (1996); Kalunian y col., Definition, classification, activity and damage indices. En: Dubois' lupus eyrthematosus. 5a ed., Baltimore: Williams y Wilkins; págs. 19-30 (1997)).

La esclerosis sistémica o esclerodermia sistémica es una enfermedad autoinmunitaria sistémica o enfermedad sistémica del tejido conectivo que es un subtipo de esclerodermia. Se caracteriza por la deposición de colágeno en la piel y, con menos frecuencia, en los riñones, corazón, pulmones y estómago. La relación de mujeres a hombres para esta enfermedad es 4:1. La edad pico de inicio de la enfermedad es entre 30 y 50 años.

La psoriasis es una enfermedad autoinmunitaria que afecta a la piel. Se produce cuando el sistema inmunitario confunde las células de la piel como un patógeno y envía señales defectuosas que aceleran el ciclo de crecimiento de las células de la piel. La psoriasis se ha relacionado con un mayor riesgo de accidente cerebrovascular, y el tratamiento de los niveles elevados de lípidos en sangre puede mejorar. Existen cinco tipos principales de psoriasis: en placa, guttata, inversa, pustulosa y eritrodérmica. La forma más común, la psoriasis en placas, se ve comúnmente como tonos rojos y blancos de parches escamosos que aparecen en la primera capa superior de la epidermis. Sin embargo, algunos pacientes no tienen signos o síntomas dermatológicos.

La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio crónico que afecta a muchos tejidos y órganos, pero ataca principalmente las articulaciones flexibles. El proceso implica una respuesta inflamatoria de la cápsula alrededor de las articulaciones secundaria a la inflamación de las células sinoviales, el exceso de líquido sinovial y el desarrollo de tejido fibroso (pannus) en la membrana sinovial. La patología del proceso de la enfermedad a menudo conduce a la destrucción del cartílago articular y la anquilosis de las articulaciones. La artritis reumatoide también puede producir inflamación difusa en los pulmones, la membrana alrededor del corazón (pericardio), las membranas pulmonares (pleura) y el blanco del ojo (esclera), y también lesiones nodulares, más comunes en el tejido subcutáneo. Aunque se desconoce la causa de la artritis reumatoide, la autoinmunidad desempeña un papel fundamental tanto en su cronicidad como en su progresión, y la AR se considera una enfermedad autoinmunitaria sistémica. Se ha observado una sobreexpresión de TNFa y otras citocinas proinflamatorias en pacientes con artritis (Feldmann y col., Prog Growth Factor Res., 4:247-55 (1992)). Además, los animales transgénicos que sobreexpresan TNFa humano desarrollan una poliartritis erosiva con muchas características asociadas con la enfermedad (Keffer y col., EMBO J., 10(13):4025-31 (1991)). La analgesia y los fármacos antiinflamatorios, incluidos los esteroides, se utilizan para suprimir los síntomas, mientras que los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD, por sus siglas en inglés) son necesarios para inhibir o detener el proceso inmunitario subyacente e impedir el daño a largo plazo. Más recientemente, la terapia con anticuerpos anti-TNFa (Rituximab) se ha utilizado para controlar la enfermedad (Edwards, y col., N. Engl. J. Med., 350(25): 2572-81 (2004)).

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un grupo de afecciones inflamatorias del colon y el intestino delgado. Los principales tipos de EII son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (CU). La principal diferencia entre la enfermedad de Crohn y la CU es la ubicación y la naturaleza de los cambios inflamatorios: La enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal, desde la boca hasta el ano (lesiones por salto), aunque la mayoría de los casos comienzan en el íleon terminal; mientras que la CU está restringida al colon y al recto. Dependiendo del nivel de gravedad, la EII puede requerir inmunosupresión para controlar el síntoma, como prednisona, inhibición de TNF, azatioprina (Imuran), metotrexato o 6-mercaptopurina. Más comúnmente, el tratamiento de la EII requiere una forma de mesalazina.

La dermatomiositis (DM) es un tipo de enfermedad autoinmunitaria del tejido conectivo relacionada con la polimiositis (PM) que se caracteriza por la inflamación de los músculos y la piel. Si bien la DM afecta con mayor frecuencia a la piel y los músculos, es un trastorno sistémico que también puede afectar a las articulaciones, al esófago, a los pulmones y, con menos frecuencia, al corazón.

La polimiositis (PM) ("inflamación de muchos músculos") es un tipo de inflamación crónica de los músculos (miopatía inflamatoria) relacionada con la dermatomiositis y la miositis por cuerpos de inclusión.

La diabetes tipo I es una forma de diabetes mellitus que resulta de la destrucción autoinmunitaria de las células beta del páncreas productoras de insulina. La posterior falta de insulina conduce a un aumento de la glucosa en sangre y orina. Los síntomas clásicos son poliuria, polidipsia, polifagia y pérdida de peso.

Los ejemplos de otras enfermedades adecuadas para el tratamiento con anticuerpos anti-BDCA2 descritos en esta solicitud incluyen asma, enfermedad de Behcet, síndrome CREST, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, diabetes mellitus, lupus eritematoso discoide, fibrosis pulmonar, glomerulonefritis autoinmunitaria, glomerulopatía membranosa, artritis reumatoide juvenil (artritis crónica juvenil), enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, síndrome nefrótico, paniculitis, penfigoide, pénfigo, pénfigo eritematoso, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgar, polimialgia reumática, esclerosis sistémica, esclerosis sistémica progresiva (esclerodermia), esclerosis múltiple, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar, fenómeno/síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren y colitis ulcerosa.

A un sujeto que está en riesgo de ser diagnosticado o que tiene uno de estos trastornos se le puede administrar un anticuerpo anti-BDCA2 en una cantidad y durante un tiempo para proporcionar un efecto terapéutico general. El anticuerpo anti-BDCA2 puede administrarse solo (monoterapia) o en combinación con otros agentes (terapia de combinación). En una realización, el agente para su uso en terapia de combinación con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud es un agente antipalúdico. En una realización, el agente para su uso en terapia de combinación con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud es un inhibidor de señalización TLR7 y/o TLR9. En otra realización, el agente para su uso en terapia de combinación con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud es un corticosteroide. En ciertas realizaciones, el agente para su uso en terapia de combinación con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud es un fármaco antipalúdico y/o un inhibidor de quinasa (por ejemplo, inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib (PCI-32765), AVI-292, ONO-WG-307), inhibidor JAK1, inhibidor JAK2, inhibidor JAK3, inhibidor Tyk2). En una realización específica, el agente para su uso en terapia de combinación con un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud es hidroxicloroquina. Las cantidades y los tiempos de administración para las terapias combinadas pueden ser las que proporcionan, por ejemplo, un efecto terapéutico aditivo o sinérgico. Además, la administración del anticuerpo anti-BDCA2 (con o sin el segundo agente) se puede utilizar como tratamiento primario, por ejemplo, de primera línea, o como tratamiento secundario, por ejemplo, para sujetos que tienen una respuesta inadecuada a una terapia previamente administrada (es decir, una terapia que no sea una con un anticuerpo anti-BDCA2). En algunas realizaciones, la terapia de combinación incluye el uso de un anticuerpo anti-BDCA2 y uno o más de los siguientes agentes: glucocorticoides, AINE, prednisona, hidroxicloroquina, cloroquina, amodiaquina, pirimetamina, proguanil, mefloquina, dapsona, primaquina, metotrexato, micofenolato mofetilo, azatioprina, talidomida, ciclofosfamida, ciclosporina A, rapamicina, prostaciclina, inhibidor de la fosfodiesterasa, antagonistas de la endotelina, estatina, inhibidor de ACE y bloqueadores de los canales de calcio. En otras realizaciones, la terapia de combinación incluye el uso de un anticuerpo anti-BDCA2 y uno cualquiera o más de: sulfasalazina, doxiciclina, minociclina, penicilamina, tofacitinib y leflunomida.

Composiciones farmacéuticas

Se puede formular un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en esta solicitud como una composición farmacéutica para administración a un sujeto, por ejemplo, para tratar un trastorno descrito en esta solicitud. Típicamente, una composición farmacéutica incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en la presente, un “portador farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que son fisiológicamente compatibles. La composición puede incluir una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una sal de adición de ácido o una sal de adición de base (véase, por ejemplo, Berge, S.M., y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19).

La formulación farmacéutica es una técnica bien establecida y se describe adicionalmente, por ejemplo, en Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); y Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar de diversas formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida puede depender de la vía de administración y de la aplicación terapéutica pretendidas. Normalmente, las composiciones para los agentes descritos en esta solicitud están en forma de soluciones inyectables o infundibles.

En una realización, un anticuerpo anti-BDCA2 descrito en esta solicitud está formulado con materiales excipientes, tales como cloruro de sodio, citrato de sodio, fosfato dibásico de sodio heptahidratado, fosfato monobásico de sodio, Tween-80 y un estabilizador. Se puede proporcionar, por ejemplo, en una solución tamponada a una concentración adecuada y se puede almacenar a 2-8 °C. En otras realizaciones, el pH de la composición está entre aproximadamente 5,8 y 6,6 (por ejemplo, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6).

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir agentes que reducen la acumulación del anticuerpo BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo cuando se formulan. Algunos ejemplos de agentes de reducción de la acumulación incluyen uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en metionina, arginina, lisina, ácido aspártico, glicina y ácido glutámico. Estos aminoácidos se pueden añadir a la formulación en una concentración de entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 145 mM (p. ej., 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir un azúcar (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, manitol, sorbitol o xilitol) y/o un modificador de la tonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol o sorbitol) y/o un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato-20 o polisorbato-80).

Dichas composiciones se pueden administrar a través de un modo parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal o inyección intramuscular). En un aspecto, las composiciones del anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administran por vía subcutánea. En un aspecto, las composiciones del anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno de mismo se administran por vía intravenosa. Las expresiones "administración parenteral" y "administrada parenteralmente" como se utilizan en esta solicitud significan modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

La composición se puede formular como una solución, una microemulsión, una dispersión, un liposoma u otra estructura ordenada adecuada para un almacenamiento estable a una concentración alta. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un agente descrito en esta solicitud en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de un agente descrito en esta solicitud en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el liofilizado que proporcionan un polvo de un agente descrito aquí más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de este filtrada previamente en condiciones estériles. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, manteniendo el tamaño de las partículas necesario en caso de una dispersión y mediante el uso de surfactantes. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se puede preparar con un vehículo que protegerá al compuesto de la liberación rápida, por ejemplo, una formulación de liberación controlada, inclusive implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, como el acetato de etilenvinilo, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son conocidos generalmente. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978).

En una realización, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, BIIB059) a una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml a 300 mg/ml (por ejemplo, 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml), formulada con citrato de sodio, cloruro de sodio y opcionalmente Tween-80 (0,01-0,1 %, por ejemplo, 0,03 %, 0,05 % o 0,7 %). El pH de la formulación farmacéutica se puede encontrar entre 5,5 y 7,5 (p. ej., 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,46,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,3).

Administración

El anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que lo necesite, por ejemplo, un sujeto humano, a través de diversos procedimientos. Para muchas aplicaciones, la vía de administración es una de: inyección o infusión intravenosa (IV), inyección subcutánea (SC), inyección intraarterial, intraperitoneal (IP) o intramuscular. También es posible utilizar la entrega intraarticular. Se pueden utilizar otros modos de administración parenteral. Algunos ejemplos de dichos modos incluyen: inyección intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitario, intracardiaca, intradérmica, transtraqueal, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. En algunos casos, la administración puede ser oral.

La vía y/o el modo de administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo también se puede adaptar para el caso individual, por ejemplo, monitorizando al sujeto, por ejemplo, utilizando imágenes tomográficas, por ejemplo, para visualizar un tumor.

El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se puede administrar como una dosis fija o en una dosis de mg/kg. La dosis también se puede elegir para reducir o evitar la producción de anticuerpos contra el anticuerpo anti-BDCA2. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada, p. ej., una respuesta terapéutica o un efecto terapéutico combinatorio. En general, las dosis del anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo (y opcionalmente un segundo agente) se pueden utilizar para proporcionarle a un sujeto el agente en cantidades biodisponibles. Por ejemplo, se pueden administrar dosis en el intervalo de 0,1-100 mg/kg, 0,5-100 mg/kg, 1 mg/kg-100 mg/kg, 0,5-20 mg/kg, 0,1-10 mg/kg o 1-10 mg/kg. También se pueden utilizar otras dosis. En aspectos específicos, a un sujeto que necesita tratamiento con un anticuerpo anti-BDCA2 se le administra el anticuerpo en una dosis de 2 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg o 40 mg/kg.

Una composición puede comprender entre aproximadamente 1 mg/mL y 100 mg/ml o entre aproximadamente 10 mg/mL y 100 mg/ml o entre aproximadamente 50 y 250 mg/mL o entre aproximadamente 100 y 150 mg/ml o entre aproximadamente 100 y 250 mg/ml de anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo en una composición se encuentra mayoritariamente en forma monomérica, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 %, 98,5 % o 99 % en forma monomérica. Determinadas composiciones de anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo pueden comprender menos de aproximadamente 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3 o 0,1 % de agregados, según lo detectado, por ejemplo, por U^va A280 nm. Determinadas composiciones de anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden menos de aproximadamente 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 o 0,1 % de fragmentos, según lo detectado, por ejemplo, por UV a A280 nm.

La forma de dosificación unidad unitaria "dosis fija", como se utiliza en esta solicitud, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido y opcionalmente en asociación con el otro agente. Se pueden administrar dosificaciones únicas o múltiples. Alternativamente, o además, el anticuerpo se puede administrar mediante infusión continua.

Se puede administrar una dosis de anticuerpo anti-BDCA2 o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, en un intervalo periódico durante un período de tiempo (un curso de tratamiento) suficiente para abarcar al menos 2 dosis, 3 dosis, 5 dosis, 10 dosis, o más, por ejemplo, una o dos veces al día, o aproximadamente una a cuatro veces por semana, o preferentemente semanalmente, quincenalmente (cada dos semanas), cada tres semanas, mensualmente, por ejemplo, entre aproximadamente 1 a 12 semanas, preferentemente entre 2 a 8 semanas, más preferentemente entre aproximadamente 3 a 7 semanas, e incluso más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. Los factores que pueden afectar la dosificación y el tiempo necesario para tratar de forma eficaz a un sujeto incluyen, p. ej., la gravedad de la enfermedad o trastorno, la formulación, la vía de administración, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto puede incluir un tratamiento único o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos.

Si un sujeto está en riesgo de desarrollar un trastorno inmunológico descrito en esta solicitud, el anticuerpo puede administrarse antes del inicio completo del trastorno inmunológico, por ejemplo, como una medida preventiva. La duración de dicho tratamiento preventivo puede ser una dosificación única del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo o el tratamiento puede continuar (por ejemplo, dosificaciones múltiples). Por ejemplo, un sujeto en riesgo de sufrir el trastorno o que tiene predisposición al trastorno puede ser tratado con el anticuerpo durante días, semanas, meses o incluso años para impedir que el trastorno ocurra o se fulmine.

Una composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un agente descrito en esta solicitud. Dichas cantidades eficaces se pueden determinar según el efecto del agente administrado o el efecto combinado de los agentes si se utiliza más de un agente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente también puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad del compuesto de provocar una respuesta deseada en el individuo, p. ej., mejora de al menos un parámetro del trastorno o mejora de al menos un síntoma del trastorno. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una cantidad con la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía subcutánea a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml (por ejemplo, 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml). En un aspecto, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía subcutánea en una concentración de 50 mg/ml. En otro aspecto, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía intravenosa en una concentración de entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 300 mg/ml. En un aspecto particular, el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía intravenosa en una concentración de 50 mg/ml.

Dispositivos y kits para terapia

Las composiciones farmacéuticas que incluyen el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se pueden administrar con un dispositivo médico. El dispositivo se puede diseñar con características como portabilidad, almacenamiento a temperatura ambiente y facilidad de uso de modo que se pueda utilizar en situaciones de emergencia, p. ej., por un sujeto sin capacitación o por personal de emergencia en el campo, fuera de instalaciones médicas y otros equipos médicos. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, una o más cubiertas para almacenar preparaciones farmacéuticas que incluyen el anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y se puede configurar para suministrar una o más dosis unitarias del anticuerpo. El dispositivo se puede configurar además para administrar un segundo agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, ya sea como una composición farmacéutica única que también incluye el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo o como dos composiciones farmacéuticas separadas.

La composición farmacéutica se puede administrar con una jeringa. La composición farmacéutica también se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en los documentos US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Algunos ejemplos de implantes y módulos conocidos incluyen: el documento US 4.487.603 que describe una bomba de micro-infusión implantable para administrar medicamentos a una velocidad controlada; el documento US 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; el documento US 4.447.233 que describe una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; el documento US 4.447.224 que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para administración de fármaco continua; el documento US 4.439.196 que describe un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimentos de varias cámaras; y el documento US 4.475.196 que describe un sistema de administración de fármaco osmótico. También se conocen muchos otros dispositivos, implantes, sistemas de administración y módulos.

Se puede proporcionar un anticuerpo anti-BDCA2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en un kit. En una realización, el kit incluye (a) un recipiente que contiene una composición que incluye el anticuerpo anti-BDCA2 y, opcionalmente, (b) material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, de comercialización u otro material que se refiere a los procedimientos descritos en esta solicitud y/o el uso de los agentes para beneficio terapéutico.

En una realización, el kit también incluye un segundo agente para tratar un trastorno descrito en esta solicitud (por ejemplo, inhibidor de BTK, un antipalúdico, glucocorticoide, NSAID, prednisona, hidroxicloroquina, amodiaquina, pirimetamina, proguanil, sulfonamidas, mefloquina, atovacuona, primaquina, artemisinina y derivados, halofantrina, doxiciclina, clindamicina, metotrexato, micofenolato mofetilo, azatioprina, ciclofosfamida, sulfasalazina o leflunomida). Por ejemplo, el kit incluye un primer recipiente que contiene una composición que incluye el anticuerpo anti-BDCA2 y un segundo recipiente que incluye el segundo agente terapéutico.

El material informativo de los kits no se limita en este sentido. En una modalidad, el material informativo puede incluir información sobre la producción del compuesto, el peso molecular del compuesto, la concentración, la fecha de vencimiento, información sobre el lote o el sitio de producción, entre otros. En una realización, el material informativo se refiere a procedimientos de administración del anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, en una dosis, una forma de dosificación o un modo de administración adecuado (por ejemplo, una dosis, una forma de dosificación o un modo de administración descrito en esta solicitud), para tratar un sujeto que tiene o que presenta riesgo de sufrir un trastorno inmunológico descrito en esta solicitud. La información se puede proporcionar en diversos formatos, incluido texto impreso, material legible por ordenador, grabación de vídeo o grabación de audio o información que proporcione un enlace o dirección a material sustancial, por ejemplo, en internet.

Además del anticuerpo, la composición en el kit puede incluir otros ingredientes, como un disolvente o tampón, un estabilizador o un conservante. El anticuerpo se puede proporcionar en cualquier forma, p. ej., en forma líquida, seca o liofilizada, preferentemente sustancialmente puro y/o estéril. Cuando los agentes se proporcionan en una solución líquida, la solución líquida es, preferentemente, una solución acuosa. Cuando los agentes se proporcionan como una forma seca, la reconstitución generalmente se realiza mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, se puede proporcionar opcionalmente en el kit.

El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición o composiciones que contienen los agentes. En algunas modalidades, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimientos para la composición y material informativo. Por ejemplo, la composición se puede encontrar en un frasco, recipiente o jeringa, y el material informativo se puede encontrar en un sobre plástico o paquete. En otras modalidades, los elementos separados del kit se encuentran dentro de un recipiente único, no dividido. Por ejemplo, la composición se encuentra en un frasco, recipiente o jeringa que contiene unido a este el material informativo en forma de una etiqueta. En algunas modalidades, el kit incluye múltiples (p. ej., un paquete) recipientes individuales, cada uno contiene una o más formas de dosificación unitaria (p. ej., una forma de dosificación unitaria descrita en la presente) de los agentes. Los recipientes pueden incluir una dosificación unitaria combinada, por ejemplo, una unidad que incluye el anticuerpo anti-BDCA2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo y el segundo agente, por ejemplo, en una relación deseada. Por ejemplo, el kit incluye múltiples jeringas, ampollas, sobres de aluminio, blísteres o dispositivos médicos, p. ej., cada uno contiene una única dosis unitaria de combinación. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, a prueba de agua (por ejemplo, impermeables a los cambios en la humedad o la evaporación) y/o herméticos a la luz.

El kit incluye, opcionalmente, un dispositivo adecuado para la administración de la composición, por ejemplo, una jeringa u otro dispositivo de administración adecuado. El dispositivo se puede proporcionar precargado con uno o ambos de los agentes o puede estar vacío, pero ser adecuado para cargar.

Usos para diagnóstico

Los anticuerpos anti-BDCA2 o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden utilizarse en un procedimiento de diagnósti

in vivo (por ejemplo, imagen en un sujeto in vivo). Por ejemplo, los anticuerpos anti-BDCA2 humanos o efectivamente humanos pueden administrarse a un sujeto para detectar BDCA2 dentro del sujeto. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse, por ejemplo, con un marcador detectable por MRI o un radiomarcador. El sujeto puede evaluarse utilizando un medio para detectar el marcador detectable. Por ejemplo, el sujeto puede ser explorado para evaluar la localización del anticuerpo dentro del sujeto. Por ejemplo, el sujeto es fotografiado, por ejemplo, por RMN u otros medios tomográficos.

Los ejemplos de etiquetas útiles para el diagnóstico por imágenes incluyen radiomarcadores como 131I, 111In, 123I, 99mTC, 32P, 33P, 125I, 3H, 14C, y 188Rh, marcadores fluorescentes como fluoresceína y rodamina, marcadores activos de resonancia magnética nuclear, isótopos emisores de positrones detectables por un escáner de tomografía por emisión de positrones ("PET"), quimioluminiscentes como la luciferina y marcadores enzimáticos como la peroxidasa o la fosfatasa. También se pueden emplear emisores de radiación de corto alcance, como los isótopos detectables por sondas detectoras de corto alcance. El ligando de la proteína puede marcarse con dichos reactivos utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, véase Wensel y Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York for techniques relating to the radiolabeling of antibodies and Colcher y col. (1986) Meth Enzymol. 121: 802-816.

El sujeto puede "fotografiado" in vivo utilizando técnicas conocidas tales como exploración radionuclear utilizando, por ejemplo, una cámara gamma o tomografía de emisión. Véase por ejemplo, A.R. Bradwell y col., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin y col., (eds.), págs. 65-85 (Academic Press 1985). Alternativamente, se puede utilizar un escáner de tomografía transaxial de emisión de positrones, como el Pet VI designado ubicado en el Brookhaven National Laboratory, donde el radiomarcador emite positrones (por ejemplo, 11C, 18F, 15O, y 13N).

La resonancia magnética (MRI) utiliza RMN para visualizar las características internas del sujeto vivo y es útil para el pronóstico, diagnóstico, tratamiento y cirugía. La MRI se puede utilizar sin compuestos trazadores radiactivos para obtener un beneficio obvio. Algunas técnicas de MRI se resumen en el documento EP0502814 A. En general, las diferencias relacionadas con las constantes de tiempo de relajación T1 y T2 de los protones de agua en diferentes entornos se utilizan para generar una imagen. Sin embargo, estas diferencias pueden ser insuficientes para proporcionar imágenes nítidas de alta resolución.

Las diferencias en estas constantes de tiempo de relajación pueden mejorarse mediante agentes de contraste. Los ejemplos de tales agentes de contraste incluyen varios agentes magnéticos, agentes paramagnéticos (que alteran principalmente a T1) y agentes ferromagnéticos o superparamagnéticos (que alteran principalmente la respuesta de T2). Los quelatos (por ejemplo, quelatos de EDTA, DTPA y NTA) pueden utilizarse para unir (y reducir la toxicidad) de algunas sustancias paramagnéticas (por ejemplo, Fe3+, Mn2+, Gd3+). Otros agentes pueden estar en forma de partículas, por ejemplo, de menos de 10 pm a aproximadamente 10 nm de diámetro). Las partículas pueden tener propiedades ferromagnéticas, anti-ferromagnéticas o superparamagnéticas. Las partículas pueden incluir, por ejemplo, magnetita (Fe3O4), Y-Fe2O3, ferritas y otros compuestos minerales magnéticos de elementos de transición. Las partículas magnéticas pueden incluir uno o más cristales magnéticos con y sin material no magnético. El material no magnético puede incluir polímeros sintéticos o naturales (tales como sefarosa, dextrano, dextrina, almidón y similares).

Los anticuerpos anti-BDCA2 o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos también pueden marcarse con un grupo indicador que contiene el átomo activo en RMN 19F, o una pluralidad de átomos tales como (i) sustancialmente todos los átomos de flúor naturalmente abundantes son el isótopo 19F y, por lo tanto, sustancialmente todos los compuestos que contienen flúor son activos por RMN; (ii) muchos compuestos polifluorados químicamente activos, como el anhídrido trifluoroacético, están disponibles comercialmente a un costo relativamente bajo, y (iii) muchos compuestos fluorados se han encontrado médicamente aceptables para su uso en humanos, como los poliéteres perfluorados utilizados para transportar oxígeno como reemplazos de hemoglobina. Después de permitir ese tiempo para la incubación, se realiza una resonancia magnética de todo el cuerpo utilizando un aparato como uno de los descritos por Pykett (1982) Scientific American, 246:78-88 para localizar y crear la imagen de distribución de BDCA2.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento de detección de la presencia de BDCA2 en una muestra in vitro (por ejemplo, una muestra biológica, como suero, plasma, tejido, biopsia). El procedimiento sujeto puede utilizarse para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno autoinmunitario (por ejemplo, LES) o para detectar niveles de pDC en una muestra. El procedimiento incluye: (i) poner en contacto la muestra o una muestra de control con el anticuerpo anti-BDCA2; y (ii) evaluar la presencia de BDCA2 en la muestra, por ejemplo, detectando la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-BDCA2 y BDCA2, o detectando la presencia del anticuerpo o BDCA2. Por ejemplo, el anticuerpo se puede inmovilizar, por ejemplo, en un soporte, y se detecta la retención del antígeno en el soporte, y/o viceversa. El anticuerpo utilizado puede marcarse, por ejemplo, con un fluoróforo. Se puede incluir una muestra de control. El control positivo puede ser una muestra conocida por evaluar la enfermedad o trastorno, y un control negativo puede ser una muestra de un sujeto que no tiene la enfermedad o trastorno que se está evaluando. Un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra en relación con la muestra de control puede ser indicativo de la presencia de BDCA2 en la muestra. Generalmente, un anticuerpo anti-BDCA2 puede utilizarse en aplicaciones que incluyen polarización de fluorescencia, microscopía, ELISA, centrifugación, cromatografía y clasificación celular (por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia). En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-BDCA2 es BIIB059 o el clon 124B3.13 de células dendríticas. En algunos aspectos, el procedimiento implica además inmunotinción de una muestra de tejido con un anticuerpo anti-CD 123. La muestra de tejido puede ser, por ejemplo, biopsias de piel de pacientes humanos con afecciones autoinmunitarias, por ejemplo, LES.

Los siguientes son ejemplos de la práctica de la invención. No debería considerarse que limiten el alcance de la invención de ningún modo.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada y no se interpretarán como limitantes del alcance de la invención. En la medida en que se mencionan los materiales específicos, es meramente con fines ilustrativos y no se pretende limitar la invención. Un experto en la materia puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin poner en práctica la capacidad inventiva y sin separarse del alcance de la invención.

5 Ejemplo 1: Clonación de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo anti-BDCA2 murino

El hibridoma murino 24F4 (IgG1, kappa) se obtuvo de un ratón Balb/c inmunizado por pistola génica con el plásmido pEAG2456, un vector de expresión de mamífero que coexpresa BDCA2 humano completo y ADNc de F^ceRI^y(véase el Ejemplo 17).

0

El ARN celular total de las células de hibridoma murino 24F4 se preparó utilizando un mini kit Qiagen RNeasy siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los ADNc que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se clonaron mediante RT-PCR a partir de ARN celular total utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de GE Healthcare siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante utilizando hexámeros aleatorios para el cebado.

5

Para la amplificación por PCR de los dominios variables de inmunoglobulina murina con secuencias de señal intactas, se utilizaron un cóctel de cebadores directos degenerados que hibridan con múltiples secuencias de señal de la familia de genes de inmunoglobulina murina y un único cebador posterior específico para el extremo 5' del dominio constante murino como se describe en Current Protocols in Immunology (Wiley and Sons, 1999). El dominio variable de la cadena pesada 0 de 24F4 se amplificó con los siguientes cebadores: 5' ACT AGT CGA CAT G^rA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT 3' (R=A/G y Y=C/T) (SEQ ID NO:25) y 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (R=A/G y Y=C/T) (SEQ ID NO:26). El dominio variable de la cadena ligera de 24F4 se amplificó con los siguientes cebadores: 5' ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT 3' (W=A/T y Y=C/T) (SEQ ID NO: 27) y 5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3'(SEQ ID NO:28).

5

Los productos de PCR se purificaron en gel utilizando un kit de extracción de gel Qiagen Qiaquick siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los productos de PCR purificados se subclonaron en el vector pCR2.1TOPO de Invitrogen utilizando su kit de clonación TOPO siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los insertos de múltiples subclones independientes se secuenciaron para establecer una secuencia consenso (del clon de cadena pesada 0 designado pYL647 y del clon de cadena ligera pYL651).

La variación en las secuencias entre los clones fue consistente con las posiciones de degeneración de los cebadores. El análisis BLAST de las secuencias de dominio variable confirmó su identidad de inmunoglobulina. Las secuencias N-terminales de cadena ligera y pesada maduras deducidas coinciden con las de las cadenas 24F4 auténticas derivadas de 5 los datos de degradación de Edman. Las masas intactas deducidas de las secuencias hipotéticas ensambladas mediante la adición de secuencias de dominio constante deducidas de los ADNc de cadena pesada de IgG1 de Balb/c clonadas y de cadena ligera kappa a las secuencias de dominio variable maduras deducidas fueron consistentes con las 24F4 derivadas del hibridoma purificado determinadas por espectroscopia de masas.

0 El dominio variable de cadena pesada (VH) 24F4 murino es un miembro del subgrupo III (D) murino. La secuencia del dominio variable de cadena pesada madura 24F4 murino con CDR H1, CDR H2 y CDR H3 subrayado en ese orden se muestra a continuación:

1 DVKLVESGGGLVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT

51 ISPGDSFGYY YPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD

101 IYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQIDNO:29)

5

El dominio variable de cadena ligera (VL) 24F4 murino es un miembro del subgrupo III murino kappa. La secuencia del dominio variable de la cadena ligera madura 24F4 murino con CDR L1, CDR L2 y CDR L3 subrayados en ese orden se muestra a continuación:

1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKL

51 LIYAASTLES GVPARFSGSGSGTDFTLNIH PVEEEDAATYYCQQCNEDPR

q 101 TFGGGTKLEI K (SEQIDNO:30)

Una cisteína no apareada está presente en el residuo 95 en CDRL3 en la secuencia VL 24F4 murina anterior (en la nomenclatura de Kabat, este Cys es el residuo 91).

5 Ejemplo 2. Quimerización del anticuerpo murino 24F4

Los ADNc que codifican los dominios variables 24F4 murinos se utilizaron para construir vectores para la expresión de quimeras murino-humanas (ch24F4) en las que las regiones variables mu24F4 se unieron a las regiones constantes de IgG1 y kappa humanas.

Los dominios variables se diseñaron primero por PCR para agregar una secuencia Kozak 5' e introducir secuencias humanas y nuevos sitios de restricción en las uniones de dominio constante/FR4 para fusión a dominios constantes de inmunoglobulina humana. Las secuencias de ADNc de la región variable en los plásmidos resultantes se confirmaron mediante secuenciación de ADN. El dominio variable de la cadena pesada en el plásmido pYL647 se utilizó como plantilla para PCR con los cebadores 5' GAT CCG CGG CCG CAC CAT GGA CTT TGG GTT CAG CTT G 3' (SEQ ID NO:31) (agrega sitio NotI y secuencia Kozak) y 5' GAT GGG CCC TTG GTG GAA GCT GCA GAG ACA GTG ACC AGA G 3' (SEQ ID NO:32) (agrega secuencias de IgG1 CH1 humanas en FR4/unión de dominio constante y un sitio ApaI), amplificando un fragmento de 0,45 kb que se purificó y se subclonó en el vector de clonación Invitrogen pCRBluntIITOPO, generando pYL668. Para la construcción de la quimera de la cadena pesada, el fragmento de 0,45 kb NotI-ApaI del dominio variable de la cadena pesada 24F4 de la construcción pYL668 y el fragmento de 0,98 kb ApaI-BamHI de pEAG1325 (un plásmido que contiene un ADNc de dominio constante de cadena pesada de huIgG1 confirmado por secuencia (con el residuo de lisina IgG1 C-terminal eliminado genéticamente) se subclonaron en la cadena principal del vector del vector de expresión pV90 (en el que la expresión del gen heterólogo está controlada por un promotor CMV-IE y una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento humano y que lleva un marcador seleccionable dhfr, véase la patente estadounidense n.° 7.494.805), para producir el vector de expresión pYL672. La secuencia de ADNc de cadena pesada en el plásmido resultante pYL672 se confirmó mediante secuenciación de ADN. A continuación, se muestra la secuencia de proteína de cadena pesada ch24F4-huIgG1 madura deducida codificada por pYL672:

1 DVKLVESGGGLVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT

51 ISPGDSFGYYYPDSVQGRFT ISRDNAKNTLFLQMSSLKSE DTAMYYCTRD

101 IYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCL

151 VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGT

201 QTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP

251 KPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

301 YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPRE

351 PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTP

401 PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSP

451 G (SEQIDNO:33)

También se construyó una forma de aglicosilado con baja función efectora de ch24F4 subclonando el fragmento de 0,45 kb NotI-ApaI del dominio variable de cadena pesada 24F4 de la construcción pYL668 y el fragmento de 0,98 kb ApaI-BamHI de pEAG2412 (un plásmido que contiene un ADNc del dominio constante de la cadena pesada híbrida S228P/N299Q huIgG4/IgG1 confirmada por secuencia con el residuo de lisina de C-terminal de IgG1 eliminado genéticamente) se subclonaron en la cadena principal del vector del vector de expresión pV90, generando el plásmido pYL670. La secuencia de ADNc de cadena pesada en el plásmido resultante pYL670 se confirmó mediante secuenciación de ADN. La secuencia de proteína de la cadena pesada híbrida agli ch24F4-huIgG4/G1 deducida madura codificada por pYL670 se muestra a continuación:

1 DVKLVESGGGLVKPGGSLKL SCAASGFTFS TYTMSWVRQT PEKRLEWVAT

51 ISPGDSFGYYYPDSVQGRFT ISRDNAKNTL FLQMSSLKSE DTAMYYCTRD

101 IYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCL

151 VKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT

201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPK

251 DTLMISRTPEVTCWVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQS

301 TYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQV

351 YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

401 DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQIDNO:34)

El dominio variable de la cadena ligera kappa en el plásmido pYL651 se utilizó como plantilla para PCR con los cebadores 5' GAT CCG CGG CCG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG 3' (SEQ ID NO:35) (agrega un sitio 5' NotI y secuencia Kozak) y 5' CCA CCG TAC GTT TGA TTT CCA GCT TGG TGC 3' (SEQ ID NO:36) (agrega secuencias de dominio constante kappa humanas en FR4/unión de dominio constante y un sitio 3' Bs/WI), amplificando un fragmento de 0,4 kb que se purificó y se subclonó en el vector de clonación Invitrogen pCRBluntIITOPO, generando pYL669. Las secuencias de ADNc de la región variable en el plásmido pYL669 se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Para la construcción de la quimera de cadena ligera, el fragmento de 0,4 kb de dominio variable de la cadena ligera NotI-BsWI de pYL669 y el fragmento de 0,34 kb BsWI-BamHI del plásmido pEAG1572 (que contiene un ADNc del dominio constante de la cadena ligera kappa humana confirmada por secuencia) se subclonaron en la cadena principal del vector de pV100 (en el que la expresión génica heteróloga se controla mediante un promotor CMV-IE y una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano y que lleva un marcador seleccionable de neomicina), para producir el vector de expresión pYL671. La secuencia de ADNc de la cadena ligera en el plásmido resultante pYL671 se confirmó mediante secuenciación de ADN. La secuencia de proteína de cadena ligera kappa humana ch24F4 madura deducida codificada por pYL671 se muestra a continuación:

1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKL

51 LIYAASTLES GVPARFSGSGSGTDFTLNIH PVEEEDAATYYCQQCNEDPR

101 TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV

151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEV

201 THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQIDNO:37)

Los vectores de expresión (vectores de cadena pesada ch24F4 pYL670 o pYL672 y vector de cadena ligera ch24F4 pYL671) se cotransfectaron en células 293-EBNA y las células transfectadas se analizaron para la secreción y especificidad de anticuerpos (vector vacío y células transfectadas por vector de mAb irrelevantes clonadas molecularmente sirvieron como controles). El análisis de inmunoelectrotransferencia (desarrollado con anticuerpos anti humanos de cadena pesada y ligera) de medio acondicionado indicó que las células transfectadas con ch24F4 sintetizaron y secretaron eficientemente cadenas pesadas y ligeras. La unión directa de FACS a la superficie de BDCA2 humano confirmó la especificidad de ch24F4. La unión CE50 de ambas variantes de ch24F4 fue equivalente a la del mAb 24F4 murino mediante la unión directa a BDCA2 humano expresado en superficie mediante el ensayo FACS de valoración por dilución. Las estirpes celulares CHO estables que secretan ch24F4-huIgGl, mAb kappa y mAb kappa híbrido ch24F4-huIgG4/Gl agli se produjeron por cotransfección con pYL672/pYL671 y pYL670/pYL671, respectivamente.

Ejemplo 3. Eliminación de un residuo de cisteína no apareado en CDRL3 del anticuerpo quimérico 24F4

Como las cisteínas no apareadas en una CDR expuesta pueden producir heterogeneidad o inestabilidad del producto, las variantes de ch24F4 C95S y C95T se construyeron mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el plásmido pYL671 del vector de expresión de cadena ligera ch24F4 como plantilla.

La mutagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando el kit de mutagénesis QuikChange II de Agilent siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. La variante C95S se construyó utilizando el cebador mutagénico 5' GCA ACC Ta T TAC TGT CAA CAA AGT AAT GAG GAT CCT CGG AC 3' (SEQ ID NO: 38) y su complemento inverso, que introdujo un nuevo sitio HincII, que produce el plásmido pEAG2678. La variante C95T se construyó utilizando el cebador mutagénico 5' CAA CCT ATT ACT GTC AGC AAA CTA ATG AAG ATC CTC GGA CGT TCG 3' (SEQ ID NO: 39) y su complemento inverso, que eliminó un sitio BamHI, que produce el plásmido pEAG2679. Los plásmidos mutados se identificaron mediante la identificación selectiva de los cambios introducidos en el sitio de restricción. Las secuencias de ADNc de cadena ligera de longitud completa en los plásmidos resultantes se confirmaron mediante secuenciación de ADN. El ch24F4 de tipo salvaje y los mAb de la variante C95S y C95T se expresaron transitoriamente en células 293E por cotransfección de pYL672 y pYL671, pEAG2678 o pEAG2679. El medio acondicionado se recogió a los 2 días después de la transfección. Los títulos (analizados por octeto en puntas Fc antihumanas) de ambas variantes fueron similares al del ch24F4 de tipo salvaje, y las membranas no reductoras de Western indicadas por SDS-PAGE no indicaron agregación bruta o recorte obvio en relación con el mAb de ch24F4 de tipo salvaje. La unión directa por FACS en la superficie de BDCA2 indicó que mientras que la CE50 aparente para la unión por la variante C95S era equivalente a la del ch24F4 de tipo salvaje, la unión de CE50 de la variante C95T se redujo en varias veces. Octeto analizó el medio acondicionado que contenía ch24F4 y los mAb de la variante C95 para la unión al ectodominio de BDCA2 humano. Los anticuerpos del medio acondicionado de las células transfectadas transitoriamente se unieron a las puntas de Fc antihumanas, luego se hizo fluir huBDCA2 monomérico sobre las puntas de Octet, para examinar la unión y la disociación. La cinética de unión y disociación de octet para ch24F4 de tipo salvaje y la variante C95S fueron equivalentes, mientras que la constante de disociación de la variante C95T fue más rápida que la del ch24F4 de tipo salvaje. Sobre la base de estos resultados, C95S se incorporó a CDRL3 de cadena ligera de 24F4 humanizado.

Ejemplo 4. Cadenas pesadas y ligeras de 24F4 humanizado ejemplares

Ejemplos de siete cadenas pesadas de 24F4 humanizado (hu) (estructura huIGHV3-21 *01/CDR de VH de 24F4) y sus correspondientes secuencias de ADN se muestran a continuación. Las CDR 1, 2 y 3 en cada cadena pesada están subrayadas en ese orden. Las retromutaciones de la estructura se muestran en negrita minúscula. Los cambios en los residuos de CDR del 24F4 murino se muestran por sombreado dentro de las secuencias de CDR. La CDR1 de la cadena pesada variable (CDR H1) se define según la definición de Chothia, que es 5 aminoácidos más larga que la definición de Kabat; los residuos en cursiva en CDR H1 identifican los 5 aminoácidos adicionales (es decir, GFTFS (SEQ ID NO:12)) que forman el CDR H1 de Chothia. La mayor parte del aminoácido N-terminal (es decir, ácido glutámico en las versiones H0, H1, H2 y H3 y ácido aspártico en las versiones H4, H5 y H6) del dominio de cadena pesada variable puede contactar al antígeno directamente y afectar a la afinidad de unión. El residuo enterrado en la posición Kabat 49 puede afectar a la conformación de CDR2 de la cadena pesada (serina en las versiones H0, H1, H2 y H3; y alanina en las versiones H4, H5 y H6). El residuo en la posición 93 de Kabat puede tener un efecto en el emparejamiento de cadenas ligeras pesadas (alanina en las versiones H0, H1, H2 y H3; y treonina en las versiones H4, H5 y h6. Los residuos de aminoácidos en las regiones CDR H1, H2 y H3 que difieren del CDR H1, H2 y H3 de 24F4 murino están sombreados.

_________ Versión H0 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFrFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:40 )

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCTCTGCTATTA

GTGGTAGCGGAGGTAGTACATACTATGCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC

AGTCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCTCGAGATATCTACTATAA

TTACGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID NO:41)

(pYL742)

Versión H1

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISPGDSFGYYPDSVKGRFTISRDNAKN

SLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:42)

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTA

GTCCAGGAGACAGTTTCGGATACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC

AGTCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCTCGAGATATTTACTATAA

TTACGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID NO:43)

(pYL743)

Versión H2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFrFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISPGDSSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:44)

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTA

GTCCAGGAGACAGTAGCACTATCTACTATGCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAG

AACAGTCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCCGAGATATTTACTA

TAATTACGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID NO:45)

(pYL744)

Versión H3

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISPGDSFGYYYPDSVQGRFTISRDNAK

NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:46)

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCTCTACCATTA

GTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGACAGTGTGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAG

AACAGTCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCCGAGATATTTACTA

TAATTACGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID NO:47)

(pYL745)

Versión H4 dVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVaTISPGDSFGYYYPDSVQGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:24)

GACGTCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTA

GTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGACAGTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAG

AACAGTCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTA

TAATTACGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID NO:48)

(pYL746)

Versión H5

dVQLVqSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFrFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVaTISPGDSFGYYYPDSVQGRFTISRDNAK NSLYLQMNrLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGrGTLVTVSS (SEQ ID NO:49)

GACGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTA

GTCCAGGAGACAGTTTCGGCTACTACTATCCAGACAGTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAG

AACAGTCTGTACCTGCAAATGAACAGGCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTA

TAATTACGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCAGAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID NO:50)

(pYL747)

Versión H6 dVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVaTISqGnnyGYsYPDSVkGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCtRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:52)

GACGTCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGG

ATTCACTTTCAGTACCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAAGCACCGGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTA

GTGGCGGAAATAACTACGGCTACTCCTATCCAGACAGTGTCAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAATGCCAAG

AACAGTCTGTACCTGCAAATGAACTCCCTGAGGGCAGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCGAGATATTTACTA

TAATTACGGAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC (SEQ ID NO:53)

(pYL748)

A continuación, se muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las versiones H0 a H6:

H0 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCññSGFTFSTYTMSWVRQñPGKGLEWVSñIS-GSGGSTY

H1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCññSGFTFSTYTMSWVRQñPGKGLEWVSTPSPGDSFG-Y

H2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCññSGFTFSTYTMSWVRQñPGKGLEWVSTPSPGDSSTPY

H3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCññSGFTFSTYTMSWVRQñPGKGLEWVSTPSPGDSFGYY

H4 DVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCññSGFTFSTYTMSWVRQñPGKGLEWVATPSPGDSFGYY

H5 DVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCññSGFTFSTYTMSWVRQñPGKGLEWVATPSPGDSFGYY

H6 DVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVATPSGGNNYGYS

H0 YADSVKGRFTPSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:40 )

H1 YPDSVKGRFTPSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:42 )

H2 YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:44 )

H3 YPDSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:46)

H4 YPDSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:24 )

H5 YPDSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNRLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:49 )

II6 YPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDIYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:52 )

Ejemplos de tres cadenas ligeras 24F4 humanizadas (estructura huIGKV1-13*02/CDR VL 24F4) y sus correspondientes secuencias de ADN se muestran a continuación. Las CDR 1,2 y 3 en cada cadena ligera están subrayadas en ese orden. Se resalta Ser91 (según la numeración de Kabat), que ha sido sustituido con Cys91 en todas las cadenas ligeras. La mayor parte del aminoácido N-terminal (es decir, alanina en la versión L0 y ácido aspártico en las versiones L1 y L2) del dominio de la cadena ligera variable puede contactar al antígeno directamente y afectar a la afinidad de unión. Las retromutaciones de la estructura se muestran en negrita minúscula. La primera versión (L0) contiene la menor cantidad de retromutaciones y la tercera versión (L2) contiene la mayoría de las retromutaciones (es decir, la menos "humanizada").

Versión LO

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTL

TISSLQPEDFATYYCQQSNEDPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:54)

GCTATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGCCTCTGTGGGGGACAGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAG

CCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCA

TCTACGCTGCATCCACTCTCGAGTCTGGGGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTC

ACAATCAGCTCACTCCAGCCAGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGG

TCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAG (SEQ ID NO:55) (pYL729)

_________ Versión L1 dIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQSNEDPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:56)

GACATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGCCTCTGTGGGGGACAGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAG

CCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCA

TCTACGCTGCATCCACTCTCGAGTCTGGGGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTC

ACAATCAGCTCACTCCAGCCAGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGG

TCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAG (SEQ ID NO:57) (pYL730)

Versión L2 dIQLTQSPSSLSvSVGDRaTIsCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSvQPEDFATYYCQQSNEDPRTFGQGTKVEIK (SEQIDNO:58)

GACATTCAGCTGACCCAATCTCCATCCTCTTTGTCCGTCTCTGTGGGGGACAGGGCAACCATCTCCTGCAAGGCCAG

CCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAGGCTCCCAAACTCCTCA

TCTACGCTGCATCCACTCTTGAGTCTGGGGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTC

ACAATCAGCTCAGTGCAGCCAGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGCAACGAGGATCCTCGGACGTTCGG

^{T C A G G G C A C C A A A G T G G A A A T C A A G}(SEQ^IDNO:59) (pYL731)

A continuación, se muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las versiones L0 a L2:

LO AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLES

L1 DIQLTQ3F33L3A3VGDRVTITCKA3Q3VDYDGD3YMNWYQQKFGKAFKLLIYAA3TLE3

L2 DFQLTQ8P88L8V8VGDRATF8CKA8Q8VDYDGD8YMNWYQQKPGKAPKLLFYAA8TLE8

LO GVP'SRFSGSGSGTDFTLTI3SLQEEDFATYYCQQSNEDFRTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:54)

L1 GVP'SRFSGSGSGTDFTLTI3SLQE'EDFATYYCQQSNEDF'RTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:56)

L2 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQSNEDF'RTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:58)

Las secuencias de aminoácidos de VH y VL humanizadas anteriores no contienen ningún sitio potencial de glicosilación ligada a N o sitios de desamidación de Asn-Gly. Las metioninas en los dominios de VH y VL se observan en las secuencias de la línea germinal y no están expuestas en la superficie, por lo que el riesgo de oxidación de la metionina parece ser mínimo.

La solubilidad de las proteínas puede correlacionarse con su pI. Los pI de las construcciones diseñadas se calcularon utilizando pK de aminoácidos en Bjellqvist y col. (Electrophoresis, 14:1023-31 (1993); Electrophoresis, 15:529-39 (1994)). Los valores que se muestran A continuación, se calcularon utilizando cadenas pesadas de IgG 1 humana. Cada uno de los anticuerpos humanizados tiene un pI significativamente superior a 7 y, por lo tanto, se espera que tenga una carga positiva significativa a pH neutro. Cada entrada en la tabla es el valor de pI calculado del anticuerpo combinado completo, con la carga neta entre paréntesis.

Ejemplo 5. Unión de Hx/Ll a BDCA2

Las 21 posibles variantes de las cadenas pesadas y ligeras de hu24F4 (descritas en el Ejemplo 4) y ch24F4 se expresaron transitoriamente en células 293E mediante cotransfección de plásmidos de cadena pesada y ligera. Todas las versiones de hu24F4 se ensamblaron y secretaron, con títulos superiores a los de ch24F4 (determinado por cuantificación de mAb en medio acondicionado por unión de Octet a puntas Fc antihumanas). Las inmunoelectrotransferencias de análisis SDS-PAGE no reductoras de mAbs 24F4 quiméricos y humanizados no mostraron evidencia de agregación bruta o recorte obvio en relación con ch24F4.

El medio acondicionado se ensayó mediante FACS de unión directa en células DG44 CHO transfectadas de forma estable que coexpresan BDCA2 de longitud completa ADNc de Fc^eRI^y(humano o mono cynomolgus), (los vectores de expresión relevantes son BDCA2/FcsRI^y: pEAG2456, cyno BDCA2/Fc^eRI^y: pEAG2668). En la unión directa a superficies BDCA2 humano o mono cynomolgus, se observó una pérdida completa de unión para las series H0, H1 y ^h2 de hu24F4, se observó una pérdida significativa de afinidad de unión para la serie H3 de hu24F4, buena retención de afinidad para las series H4 y H5 de hu24F4 y una pérdida moderada de unión para la serie H6 de variantes de hu24F4 (Figuras 2 y 3). Según el título y los valores aparentes de CE50 en el análisis de FACS de unión directa, H4/L1 y H5/L1 se determinaron como las "mejores" variantes de hu24F4.

Octet analizó el medio acondicionado que contenía ch24F4 y todos los mAb variantes de hu24F4 para determinar la unión al ectodominio BDCA2 humano. El ectodominio huBDCA2 monomérico se preparó mediante escisión proteolítica a partir de la proteína de fusión muIgG2a Fc-huBDCA2 purificada (plásmido relevante: pEAG2423). Los anticuerpos del medio acondicionado de las células transfectadas transitoriamente se unieron a puntas de Fc antihumanas, y luego se hizo fluir huBDCA2 monomérico sobre las puntas de Octet, para examinar la unión y la disociación. Las series H4 y H5 de variantes hu24F4 mostraron las mejores afinidades por huBDCA2.

Ejemplo 6. Mejora de la afinidad de hu24F4

Para explorar la posibilidad de mejorar la afinidad de hu24F4 por sustitución en la posición de la cisteína no apareada CDR L3 versión L1 de 24F4 (C95S en el vector de expresión pYL740 de la cadena ligera de hu24F4), se construyeron varias variantes de versión L1 por mutagénesis dirigida al sitio. La retromutación a la cisteína no apareada, es decir, S95C, fue construida por mutagénesis dirigida al sitio produciendo el plásmido pYL749. Las variantes S95T, S95A y S95V se construyeron mediante mutagénesis dirigida al sitio produciendo los plásmidos pYL750, pYL751 y pYL752, respectivamente. Las secuencias de ADNc de cadena ligera de longitud completa en los plásmidos resultantes se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los mAbs de hu24F4 de la variante C95 se expresaron transitoriamente en células 293E mediante la co-transfección de hu24F4 H4 de la cadena pesada pYL746 o hu24F4 H5 de la cadena pesada pYL747 con los plásmidos C95S pYL740, S95C pYL749, S95T pYL750, S95A pYL751 o S95V pYL752 de cadenas ligeras de las variantes L1 de hu24F4. El medio acondicionado se recogió a los 2 días después de la transfección. Los títulos (analizados por Octet en puntas Fc antihumanas) de todas las variantes fueron similares, y las inmunoelectrotransferencias no reductoras de SDS-PAGE indicaron que no había agregación bruta o recorte evidente. Octet analizó el medio acondicionado que contenía los mAb de la variante C95 para la unión al ectodominio BDCA2 humano. Los anticuerpos del medio acondicionado de las células transfectadas transitoriamente se unieron a las puntas de Fc antihumanas, luego se hizo fluir huBDCA2 monomérico sobre las puntas de Octet, para examinar la unión y la disociación. Las variantes de C95A tuvieron las constantes de asociación más lentas.

En base a estos resultados, se produjeron estirpes celulares CHO estables para las variantes hu24F4 H4/L1 C95T y C95A y las variantes H5/L1 C95T y C95A, que tenían las constantes de disociación aparente más lentas. Los estudios de unión Octet se repitieron para mAbs hu24F4 purificados. Se seleccionó la variante hu24F4 H4/L1 C95A como el candidato principal. Las secuencias de los plásmidos pYL746 (cadena pesada de hu 24F4 H4) y pYL751 ((cadena ligera de hu 24F4 L1) se utilizaron para la codificación y construcción de vectores de expresión para la generación de estirpes celulares de producción de CHO.

La secuencia de aminoácidos de cadena ligera hu24F4 L1 C95A madura deducida codificada por pYL751 se muestra A continuación, (CDR L1, CDR L2 y CDR L3 están subrayados):

1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKL

51 LIYAASTLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQANEDPR

101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV

151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEV

201 THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQIDNO:3)

La secuencia de aminoácidos de cadena pesada de hu24F4 H4-hulgG1 madura deducida codificada por pYL746 se muestra A continuación, (CDR H1; CDR H2 y CDR H3 están subrayados):

1 DVQLVESGGGLVKPGGSLRL SCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVAT

51 ISPGDSFGYYYPDSVQGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRD

101 IYYNYGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCL

151 VKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGT

201 QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP

251 KPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

301 YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPRE

351 PQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTP

401 PVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSP

451 G (SEQIDNO:4)

Un anticuerpo que consiste en la cadena pesada madura (SEQ ID NO: 4) y la cadena ligera madura (SEQ ID NO: 3) enumeradas anteriormente se denomina BIIB059.

Ejemplo 7. Recodificación de los genes de cadena pesada y ligera

Para mejorar potencialmente la expresión, la secuencia de nucleótidos de los genes de la cadena ligera y pesada se recodificó sin cambiar la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN modificada para el gen de la cadena ligera anti-BDCA2 se muestra a continuación. Los aminoácidos 1-240 contienen la secuencia de la cadena ligera. Los aminoácidos 1-22 (nucleótidos en minúsculas) contienen el péptido señal de la cadena ligera nativa. El extremo N-terminal maduro comienza con el aminoácido 23 (D).

1 atg gac atg agg gtc ccc gct cag etc ctg ggg etc ctt ctg etc tgg etc cct gga gca cga tgt

1 > M D M R V P A Q L L G L L L L W L P G A R C

67 GAC ATT CAG CTG ACC CAA TCT CCA TCC TCT TTG TCC GCC TCT GTG GGG GAC AGG GTC ACC ATC ACC

23> D I Q L T Q S P S S L S A S V G D R V T I T

133 TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAT CAA

199 GGG AAG GCT CCC AAA CTC CTC ATC TAC GCT GCA TCC ACT CTC GAG TCT GGG GTC CCA 67> G K A P K L L I Y A A S T L E S G V P S R F

265 AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTCACC CTC ACA ATC AGC TCA CTC CAG CCA GAG GAT TTC GCA

89> S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A

331 ACC TAT TAC TGT CAA CAA GCC AAC GAA GAT CCT CGG ACC TTC GGT CAG GGC ACC AAA GTG GAA ATC

397 AAG CGG ACC GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCT CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA

133> K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G

463 ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTG CAG TGG AAG GTG

155> T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V

529 GAT AAC GCC CTC CAA TCT GGC AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC

177> D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T

595 TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACC CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC

199> Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C

661 GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCT CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TGA (SEQ ID

NO:60)

221> E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C * (SEQ ID

NO:61)

La secuencia de ADN modificada para el gen de cadena pesada anti-BDCA2 se muestra a continuación. Los aminoácidos 1-470 contienen la secuencia de la cadena pesada. Los aminoácidos 1-19 (nucleótidos en minúsculas) contienen el péptido señal nativo de la cadena pesada. El extremo N-terminal maduro comienza con el aminoácido 20 (D).

1 atg ggt tgg age etc ate ttg etc ttc ctt gtc gct gtt gct acc cgg gtc ctg tcc GAC GTC CAG 1> M G w S L I L L F L V A V A T R V L s D V Q

67 CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC CTG GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGC GCA GCC TCT 23> L V E S G G G L V K P G G S L R L S C A A S

133 GGA TTC ACT TTC AGT ACC TAT ACC ATG TCT TGG GTT CGC CAA GCA CCT GGC AAG GGA CTG GAG TGG 45> G F T F S T Y T M S W V R Q A P G K G L E W

199 GTC GCA ACC ATT AGT CCA GGA GAC AGT TTC GGC TAC TAC TAT CCA GAC AGT GTC CAG GGC CGA TTC 67> V A T I S P G D S F G Y Y Y P D S V Q G R F

265 ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC AGT CTG TAC CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGG GCA GAG GAC 89> T I S R D N A K N S L Y L Q M N S L R A E D

331 ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACC CGA GAT ATT TAC TAT AAT TAC GGA GCC TGG TTT GCT TAC TGG GGC

397 CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT AGC GCT TCC ACC AAG GGC CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCA CCC 133> Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P

463 TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCT GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA 155> S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E

529 CCC GTG ACC GTG TCC TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCC GCT GTC CTG 177> P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L

595 CAA TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC TCC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG 199> Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q

661 ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA

221> T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K

727 TCT TGT GAC AAG ACT CAC ACA TGC CCA CCT TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCT TCA GTC

243> S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V

793 TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG

265> F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V

859 GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAT GTT GAC GGC GTG GAG GTC

287> V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V

925 CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCT CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACC TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC

309> H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L

991 ACC GTC CTG CAC CAA GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC

331> T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L

1057 CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC

353> P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T

1123 CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAA GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC

375> L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F

1189 TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCT GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACA

397> Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T

1255 CCT CCC GTG TTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC TCC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG

419> P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R

1321 TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACC CAG

441> W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q

1387 AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCC GGT TGA (SEQ ID NO:62)

463> K S L S L S P G * (SEQ ID NO:63)

Ejemplo 8. Casetes y vectores de expresión

El gen de la cadena pesada y los genes de la cadena ligera se escindieron y se ligaron en vectores de expresión separados. Cada gen está bajo control transcripcional del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano y la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento humano.

El plásmido que expresa la cadena ligera, pJP009, también contiene un casete de expresión para el gen de neomicina fosfotransferasa (neo) que contiene el promotor temprano de la fosfoglicerato quinasa murina (muPGK) y la secuencia de poliadenilación de muPGK (Figura 4). El plásmido que expresa la cadena pesada, pJP010, también contiene un casete de expresión para el gendhfr que se utilizó como marcador seleccionable y amplificador de metotrexato. Las características clave de los plásmidos pJP009 y pJP010 se resumen a continuación.

Nombre del Péptidos señal Cadena de Marcadores plásmido polipéptidos eleccionables maduros

pJP009 Subgrupo I kappa Cadena ligera 218 Neomicina humano nativo aa sfotransferasa:

(G418) eta-lactamasa: (ampicilina) pJP010 Secuencia de Cadena pesada 451 DHFR: (alfapéptido de señal aa nucleósidos)

sintética

eta-lactamasa:

(ampicilina) Abreviaturas citomegalovirus humano inmediato temprano (hCMV IE), virus de simio temprano 40 (SV40E), fosfoglicerato quinasa murina (muPGK), hormona de crecimiento humano (hGH), gen de neomicina fosfotransferasa (resistencia G418), gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), gen bacteriano para la resistencia a la ampicilina (beta lactamasa).

La secuencia completa de nucleótidos del plásmido pJP009 se muestra a continuación. Los tres marcos de lectura abiertos son la cadena ligera 24F4, la neomicina fosfotransferasa y la betalactamasa.

1TTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA

93CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACT

185TTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA

277 CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCA 369 TCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATT 461 GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG 553 GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATA 645 GAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTAT 737 AGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGT 829 GATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACA 921 TGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGT 1013 CTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAAT 1105 CTCGGGTACGTGTTCCGGAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGA 1197 CTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGGGATCCGCCACC ATG GAC ATG AGG GTC CCC > M D M R V P CAG CTC CTG GGG CTC CTT CTG CTC TGG CTC CCT GGA GCA CGA TGT GAC ATT CAG CTG ACC CAA TCT

Q L L G L L L L W L P G A R C D I Q L T Q S TCC TCT TTG TCC GCC TCT GTG GGG GAC AGG GTC ACC ATC ACC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT S S L S A S V G D R V T I T C K A S Q S V D GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGG AAG GCT CCC AAA CTC CTC ATC TAC D G D S Y M N W Y Q Q K P G K A p K L L I Y GCA TCC ACT CTC GAG TCT GGG GTC CCA TCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC A S T L E S G V P S R F S G S G S G T D F T ACA ATC AGC TCA CTC CAG CCA GAG GAT TTC GCA ACC TAT TAC TGT CAA CAA GCC AAC GAA GAT CCT T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A N E D P ACC TTC GGT CAG GGC ACC AAA GTG GAA ATC AAG CGG ACC GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC T F G Q G T K V E I K R T V A A P S V F I F CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P GAG GCC AAA GTG CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCT GGC AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACC CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG

Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCT CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N GGA GAG TGT TGA GGATCCCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCí > R G E C (SEQ ID NO:64)

2058 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTTTGACTAGGTGTCCTTGTATAATATTATGGGGTGGAGGCGGGTGGT 2150 ATGGAGCAAGGGGCAGGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTTCAGGGTCTATTGGGAACCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTTGGCTCG 2242 CTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGTCTCCCGAATAGTTGGGATTCCAGGCATGCACGACCAGGCTCAGCTAA 2334 TTTTTGTATTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGTCTGGTCTCCATCTCCTGACCTCAGGTAATCCGCCCGCCTCGGCCTCC 2426 CAAATTGCTGGGATTACAGGTATGAGCCACTGGGCCCTTCCCTGTCCTGTGATTTTAAAATAATTATACCAGCAGAAGGACGTCCAGACACA 2518 GCATGGGCTACCTGGCCATGCCCAGCCAGTTGGACATTTGAGTTGTTTGCTTGGCACTGTCCTCTCATGAATTCCTGCAGGATTCGAGGGCC 2610 CCTGCAGGTCAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTA 2702 CACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTA 2794 CTCCTCCCGTAGTCAGGAAGTTGCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTG 2886 CAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAG 2978 GCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCA 3070 CGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGGATCGGCCATTGAACA > M G S A I E Q 3162 AGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCG > D G L H A G S P A A W V E R L F G Y D W A Q Q T I G C S D A 3254 CCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCG > A V F R L S A Q G R P V L F V K T D L S G A L N E L Q D E A A 3346 CGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGA > R L S W L A T T G V P C A A V L D V V T E A G R D W L L L G E 3438 AGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTG > V P G Q D L L S S H L A P A E K V S I M A D A M R R L H T L 3530 ATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGAT > D P A T C P F D H Q A K H R I E R A R T R M E A G L V D Q D D 3622 CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCA > L D E E H Q G L A P A E L F A R L K A R M P D G D D L V V T H 3714 TGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATC > G D A C L P N I M V E N G R F S G F I D C G R L G V A D R Y 3806 AGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCC > Q D I A L A T R D I A E E L G G E W A D R F L V L Y G I A A P 3898 GATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGGGGATCGATCCGCTGTAAGTCTGCAGAAATTGATGATCTATTA 4082 TTGGAGCTACGGGGGTGGGGGTGGGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCTTTACTGAAGGCTCTTTACTATTGCTTTATGATAATGTTTCAT 4174AGTTGGATATCATAATTTAAACAAGCAAAACCAAATTAAGGGCCAGCTCATTCCTCCCACTCATGATCTATAGATCTATAGATCTCTCGTGG 4266 GATCATTGTTTTTCTCTTGATTCCCACTTTGTGGTTCTAAGTACTGTGGTTTCCAAATGTGTCAGTTTCATAGCCTGAAGAACGAGATCAGC 4358 AGCCTCTGTTCCACATACACTTCATTCTCAGTATTGTTTTGCCAAGTTCTAATTCCATCAGAAGCTGACTCTAGATCTGGATCGATGAATTC 4450 GGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCA 4542 TAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGAC 4634 CGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGG 4726 TTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATA 4818 CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCG > M S I Q H F R 4910 TGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGT > V A L I P F F A A F C L P V F A H P E T L V K V K D A E D Q 5002 TGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGC > L G A R V G Y I E L D L N S G K I L E S F R P E E R F P M M S 5094 ACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA > T F K V L L C G A V L S R I D A G Q E Q L G R R I H Y S Q N D 5186 CTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATA > L V E Y S P V T E K H L T D G M T V R E L C S A A I T M S D 5278 ACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTT >N T A A N L L L T T I G G P K E L T A F L H N M G D H V T R L 5370 GATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT > D R W E P E L N E A I P N D E R D T T M P V A M A T T L R K L 5462 ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGG > L T G E L L T L A S R Q Q L I D W M E A D K V A G P L L R S 5554 CCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAG >A L P A G W F I A D K S G A G E R G S R G I I A A L G P D G K 5646 CCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGAT > P S R I V V I Y T T G S Q A T M D E R N R Q I A E I G A S L I 5738 TAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGA > K H W • (SEQ ID NO:66)

5830 TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCT 5922 TGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACC 6014 AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGA 6106 ACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGAC

6198 TCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA

6290 ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAA

6382 CAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTT

6474 TTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA

6566 CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCG

6658 AGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGG

6750 CACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTT

6842 TATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC (SEQ ID NO:67 )

La secuencia completa de nucleótidos del plásmido pJP010 (Figura 5) se muestra a continuación. Los tres marcos de lectura abiertos son la cadena pesada 24F4, la dihidrofolato reductasa murina y la betalactamasa.

1 TTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA

93 CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACT

185 TTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA

277 CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCA

369 TCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATT

461 GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG

553 GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATA

645 GAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTAT

737 AGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGT

829 GATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACA

921 TGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGT

1013 CTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAAT

1105 CTCGGGTACGTGTTCCGGAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGA

1197 CTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGGGATCCGCCACC ATG GGT TGG AGC CTC ATC

> M G W S L I

1281 TTG CTC TTC CTT GTC GCT GTT GCT ACC CGG GTC CTG TCC GAC GTC CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC

> L L F L V A V A T R V L S D V Q L V E S G G G

1350 CTG GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGC GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT ACC TAT ACC

> L V K P G G S L R L S C A A S G F T F S T Y T

1419 ATG TCT TGG GTT CGC CAA GCA CCT GGC AAG GGA CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT CCA GGA GAC AGT

>M S W V R Q A P G K G L E W V A T I S P G D S 1488 TTC GGC TAC TAC TAT CCA GAC AGT GTC CAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC AGT > F G Y Y Y P D S V Q G R F T I S R D N A K N S 1557 CTG TAC CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGG GCA GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACC CGA GAT ATT TAC > L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C T R D I Y 1626 TAT AAT TAC GGA GCC TGG TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT AGC GCT TCC ACC > Y N Y G A W F A Y W G Q G T L V T V S S A S T 1695 AAG GGC CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCT GCC CTG GGC > K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G 1764 TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCC GTG ACC GTG TCC TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC >C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G 1833 GTG CAC ACC TTC CCC GCT GTC CTG CAA TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC TCC AGC GTG GTG ACC GTG CCC >V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P 1902 TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC >S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D 1971 AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAG ACT CAC ACA TGC CCA CCT TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG > K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L 2040 GGG GGA CCT TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG > G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E 2109 GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAT GTT GAC GGC > V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G 2178 GTG GAG GTC CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCT CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACC TAC CGG GTG GTC AGC > V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S 2247 GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAA GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC > V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A

2316 CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC > L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T 2385 CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAA GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT > L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y 2454 CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCT GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACA CCT CCC > P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P 2523 GTG TTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC TCC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG > V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q 2592 GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACC CAG AAG AGC CTC TCC > G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S 2661 CTG TCT CCC GGT TGA GGATCCCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA > L S P G • (SEQ ID NO:68 )

2748 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTTTGACTAGGTGTCCTTGTATAATATTATGGGGTGGAGGCGGGTGGT 2840 ATGGAGCAAGGGGCAGGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTTCAGGGTCTATTGGGAACCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTTGGCTCG 2932 CTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGTCTCCCGAATAGTTGGGATTCCAGGCATGCACGACCAGGCTCAGCTAA 3024 TTTTTGTATTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGTCTGGTCTCCATCTCCTGACCTCAGGTAATCCGCCCGCCTCGGCCTCC 3116 CAAATTGCTGGGATTACAGGTATGAGCCACTGGGCCCTTCCCTGTCCTGTGATTTTAAAATAATTATACCAGCAGAAGGACGTCCAGACACA 3208 GCATGGGCTACCTGGCCATGCCCAGCCAGTTGGACATTTGAGTTGTTTGCTTGGCACTGTCCTCTCATGAATTCGTCGACAGATCTGCGCAG 3300 CACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGG 3392 TGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTC 3484 CCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGC 3576 CCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG 3668 TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTC 3760 GTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGC 3852 GTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGC 3944 TAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAA

>M V R P L N C I V A V S Q N M G I G K N

4036 CGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGG > G D L P W P P L R N E F K Y F Q R M T T T S S V E G K Q N L 4128 TGATTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAA >V I M G R K T W F S I P E K N R P L K D R I N I V L S R E L K 4220 GAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACAT > E P P R G A H F L A K S L D D A L R L I E Q P E L A S K V D M 4312 GGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAAT > V W I V G G S S V Y Q E A M N Q P G H L R L F V T R I M Q E

4404 TTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAA >F E S D T F F P E I D L G K Y K L L P E Y P G V L S E V Q E E 4496 AAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGG > K G I K Y K F E V Y E K K D • (SEQ ID NO:69)

4588 CCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTG 4680 TGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGG 4772 AGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTGTCGACGAATTCACTGGCCGTCGTTTTA 4864 CAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGC 4956 CCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTT 5048 CACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCC 5140 TGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACC 5232 GAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 5324 TTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATG 5416 CTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTT

> M S I Q H F R V A L I P F F A A F C L P V F

5508 TGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTA > A H P E T L V K V K D A E D Q L G A R V G Y I E L D L N S G 5600 AGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGAC >K I L E S F R P E E R F P M M S T F K V L L C G A V L S R I D 5692 GCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGG > A G Q E Q L G R R I H Y S Q N D L V E Y S P V T E K H L T D G 5784 CATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGG > M T V R E L C S A A I T M S D N T A A N L L L T T I G G P K 5876 AGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAG > E L T A F L H N M G D H V T R L D R W E P E L N E A I P N D E 5968 CGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT > R D T T M P V A M A T T L R K L L T G E L L T L A S R Q Q L I 6060 AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTG > D W M E A D K V A G P L L R S A L P A G W F I A D K S G A G 6152 AGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACT > E R G S R G I I A A L G P D G K P S R I V V I Y T T G S Q A T 6244 ATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTA > M D E R N R Q I A E I G A S L I K H W ♦ (SEQ ID NO:70 )

6336 GATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTT 6428 CGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAA 6520 AAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACC 6612 AAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTAC 6704CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACG

6796GGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCC

6888CGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATC

6980TTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC

7072AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTAT

7164TACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATAC

7256GCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCA

7348ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA

7440ATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC(SEQIDNO:71)

Ejemplo 9. Construcción de estirpe celular

La célula hospedadora utilizada fue una dihidrofolato reductasa de ovario de hámster chino (dhfr) deficiente de la estirpe celular hospedadora, CHO-DG44. El banco de células hospedadoras DG44 se ha probado y se ha encontrado negativo para la presencia de agentes adventicios antes de su uso. El huésped DG44 (CER-00-05-01) se utilizó para la construcción de estirpes celulares que expresan el anti-BDCA2.

Los plásmidos pJP009 y pJP010 que expresan la cadena ligera y la cadena pesada recodificadas de anti-BDCA2, respectivamente, se transfectaron en la estirpe celular hospedadora mediante electroporación. Las células transfectadas que expresan dhfr fueron seleccionadas utilizando un medio deficiente en nucleósidos a. Después de la selección en los medios libres de nucleósidos aMEM descritos anteriormente, el conjunto transfectado se enriqueció para estirpes celulares de alta expresión utilizando una combinación de clasificación celular activada por fluorescencia y el instrumento Genetix Clonepix FL (CER-00-09-03). Las colonias de células aisladas por ClonePix FL se recogieron del medio semisólido a placas de 96 pocillos. Los pocillos individuales se expandieron y se evaluó la productividad. La estirpe celular que muestra el título más alto en el análisis de lote alimentado en matraz de agitación (N.° 49) se transfirió a Research Animal Fermentation para crecimiento en un biorreactor de 10 l para generación de material para caracterización.

Después de la selección inicial de la estirpe celular, se seleccionaron las estirpes celulares de mayor producción para la amplificación. Las estirpes celulares superiores se sometieron a amplificación con metotrexato (MtX). Los grupos amplificados se subclonaron utilizando dilución limitante a una densidad teórica de 0,5 células por pocillo en placas de 384 pocillos. Se tomaron imágenes de los pocillos individuales de placas de 384 pocillos utilizando un instrumento Cellavista (Innovatis) para la presencia de una sola célula por pocillo y se verificó que era clonal.

Las cuatro primeras estirpes celulares clonales amplificadas se seleccionaron en base a un matraz de agitación por lotes alimentado a escala reducida y un análisis de calidad del producto. Los bancos de células premaestras (Pre-MCB) se hicieron a partir de estas 4 estirpes celulares superiores que se evalúan en biorreactores. Se seleccionó un subclón de plomo según el rendimiento del biorreactor y el análisis de calidad del producto. Se transfirió un vial Pre-MCB de la estirpe celular de plomo a fabricación para la generación del banco de células maestras.

Ejemplo 10. Modificaciones postraduccionales del anticuerpo anti-BDCA2, BIIB059

a) Oxidación

El mapeo del péptido Endo-Lys-C del anticuerpo anti-BDCA2 BIIB059 reveló que las cadenas pesadas Met-257, Met-433 y Trp-163 son sitios susceptibles a la oxidación. Los niveles oscilaron entre 4 y 7 %. Los datos experimentales indican que gran parte de la oxidación está relacionada con la preparación de la muestra.

b) Desamidación

El análisis del mapa de péptidos Endo-Lys-C del anticuerpo BIIB059 mostró que ~ 2,5 % de cada uno de Asn-389, Asn-394 y Asn-395 en la cadena pesada estaba desamidado (desamidación combinada y formación de succinimida), y que ~ 2,5 % de Asn-320 en la cadena pesada fue desamidado (en forma de succinimida). La cantidad total de formas de succinimida para Asp-32 y Asp-34 en la cadena ligera fue de ~ 3 %. La isomerización combinada de Asp-32 y Asp-34 en la cadena ligera fue de ~ 5 %. Similar a la oxidación, algunas de estas modificaciones pueden estar relacionadas con la preparación de muestras.

c) Glicación

La glicación es una modificación no enzimática causada por la reacción de grupos amino en proteínas con glucosa, un componente del medio de cultivo. La glicación se detecta rutinariamente en proteínas y los niveles varían ampliamente dependiendo de las condiciones del cultivo celular. En el anticuerpo BIIB059, el nivel de glicación, medido por análisis de masa intacta de la proteína no reducida, fue de ~ 10 %. El análisis de mapeo de péptidos reveló ~ 0,46 % de la glicación en Lys-107 de la cadena ligera, 0,28 % en Lys-103 de la cadena ligera y ~ 0,2 % en Lys-295 de la cadena pesada O vinculada

d) Glicosilación

No hubo glicosilación detectable vinculada a O de BIIB059.

e) Otras modificaciones (por ejemplo, hidroxilisina, etc.)

Los análisis mostraron que <1 % de la cadena pesada del anticuerpo BIIB059 está en forma de aglicosilo. El análisis no mostró sustituciones de Asn-a-Ser y no hubo modificaciones o mutaciones desconocidas a un nivel de >1 % en el anticuerpo.

Ejemplo 11. Enlace directo de BIIB059 a la superficie celular de las células dendríticas plasmocitoides

Se desarrolló un ensayo de citometría de flujo de sangre entera para evaluar la unión de BIIB059 a BDCA2 en las células dendríticas plasmocitoides (pDC) humanas o de cynomolgus. La sangre de mono cynomolgus (Toxikon, Inc, Bedford, MA) o periférica humana (Biogen Idec) se recogieron en tubos de recogida de heparina de sodio y se mantuvieron a temperatura ambiente. Se añadió un cóctel de anticuerpos con tinción FACS para identificar pDC a cada alícuota de sangre entera, incorporando los anticuerpos CD20, CD14, CD123 y HLA-DR. BIIB059 marcado con Alexa647 (Biogen Idec, lote N.° 17073-057) o se agregó un control de isotipo hIgG marcado con Alexa647 al cóctel de tinción FACS, a una concentración de 0 a 40 pg/ml. La sangre se incubó en hielo, protegida de la luz, durante 30 min. Después de 30 min, cada alícuota de 500 pl de sangre entera (cyno) o 100 pl (humana) se trató con 10 ml (cyno) o 2 ml (humana) de tampón de lisis 1X Easy (Leinco Technologies) que se incubó a 37 C durante al menos una hora. Después de una i ncubación a temperatura ambiente durante 10-15 min., las muestras se centrifugaron a 1400 rpm durante 5 min. El sobrenadante se decantó, dejando solo un sedimento de glóbulos blancos (WBC, por sus siglas en inglés). Cada sedimento de WBC se lavó con 5 ml de tampón FACS (BSA al 1 % 0,002 % de NaAzida CaCl21 mM MgCl21 mM en PBS), y se centrifugó a 1400 rpm durante 5 min. El sobrenadante se decantó, y cada sedimento de WBC se resuspendió en 200 pl de tampón FACS y se transfirió a una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Fisher Scientific). La placa se centrifugó a 1400 rpm durante 5 min. El sobrenadante se desechó de la placa, y cada sedimento de WBC se lavó con 200 pl de tampón FACs . La placa se centrifugó a 1400 rpm durante 5 min., y el sobrenadante se desechó de la placa. Después del lavado (como anteriormente), los WBC se resuspendieron en 200 pl de paraformaldehído al 1 % (PFA) en p Bs , y se fijaron a 4 durante la noche, protegidos de la luz. Inmediatamente antes del análisis de citometría de flujo, los WBC se filtraron utilizando una placa de filtro de malla de nylon de 60 micrómetros (Millipore). Luego, cada sedimento se transfirió a una nueva placa de fondo redondo de 96 pocillos y se centrifugó a 1400 rpm durante 5 min. Cada gránulo de WBC se resuspendió en 250 pl de tampón FACS y se midió la intensidad de fluorescencia en una máquina FACS de 4 colores LSRII. La compensación de un solo color se adquirió utilizando un conjunto de microesferas de partículas de compensación de Ig anti-ratón (BD Biosciences). El análisis se realizó utilizando el software FlowJo y GraphPad Prism. BIIB059 se unió a las células de cynomolgus y a las humanas de manera similar con los valores de CE50 de 1-2 pg/ml (7 13 nM) (Figura 6).

Ejemplo 12. Evaluación de autoasociación para BIIB059

El ensayo AlphaScreen es un ensayo de proximidad homogéneo que utiliza microesferas de donante y aceptor de glutatión (Perkin Elmer) para unir GST de FcRIIa humano (CD32a). Se agregaron varias concentraciones de los anticuerpos a analizar en esta mezcla. Dado que la unión del anticuerpo a FcRIIa es monovalente, la única forma de generar una señal es si las microesferas donantes y aceptoras tienen un anticuerpo unido que luego se asocia llevando las microesferas en 200 nm permitiendo la producción de oxígeno singlete y la consiguiente emisión de luz. El nivel de emisión detectado por el instrumento Envision (Perkin Elmer) es proporcional al grado de autoasociación.

La Figura 7 muestra los resultados de Alpha Screen para BIIB059 en comparación con 5c8 (control negativo) y LT105 (control positivo con fuerte autoasociación).

Ejemplo 13. Evaluación de la unión no específica de BIIB059

La cromatografía de interacción cruzada (CIC, por sus siglas en inglés) es un procedimiento de alto rendimiento para la evaluación preliminar de la adherencia de los candidatos de mAb (Jacobs y col., Pharm Res., 27(1):65-71 (2010)). En este procedimiento, la IgG humana policlonal a granel se acopla químicamente a una resina de cromatografía activada por NHS. Los tiempos de retención de BIIB059 en columnas no derivatizadas y derivadas de IgG se compararon con un panel de control de mAbs con buen comportamiento y mal comportamiento. BIIB059 no mostró evidencia de unión no específica por este procedimiento como lo demuestran sus bajos tiempos de retención y valores de K'.

Datos de CIC ue muestran solubilidad unión no es ecífica

Ejemplo 14. Evaluación de la estabilidad de BIIB059

La fluorometría diferencial de barrido se utilizó para probar la estabilidad de BIIB059 en un intervalo de condiciones de tampón para la formulación de investigación inicial. El despliegue de proteínas se controló en un sistema de PCR en tiempo real Mx3005p (Agilent Technologies) en un formato de 96 pocillos utilizando 10 pg de proteína en 50 pl de PBS (a pH 7,0) suplementado con fluoróforo de naranja SYPRO a una concentración final de 10X (basado en designación de existencias de Invitrogen de 1000X). Las muestras se calentaron de 25 °C a 95 °C a 1 °C/min con intensi dad de fluorescencia medida tres veces cada 1 °C. Las inte nsidades de fluorescencia se representaron en función de la temperatura. Las Tm se derivaron de estas curvas tomando la derivada negativa ("-R'(T)" en el software Mx3005p) y seleccionando los mínimos locales de las gráficas de derivadas. Utilizando un tampón base de citrato de sodio 20 mM, el pH varió de 5,0 a 7,5 y las concentraciones de NaCl y sacarosa variaron de 50 a 250 mM. La estabilidad fue similar en todos estos intervalos de tampón. La Figura 8 muestra datos con NaCl 150 mM y sacarosa 250 mM en función del pH. Se eligió citrato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM pH 6,0 como formulación de investigación sobre la sacarosa debido a la dificultad de alcanzar altas concentraciones con sacarosa utilizando concentradores centrífugos de investigación.

Ejemplo 15. Evaluación de la estabilidad de agitación de BIIB059

Un volumen de 0,2 ml de la solución de mAb de BIIB059 a 1 mg/ml en citrato de sodio 20 mM, pH 6,0, NaCl 150 mM se sometió a agitación recíproca a temperatura ambiente en viales de vidrio de 2 ml (Waters, WAT270946C) utilizando un instrumento Lab-Line Instruments modelo 4626 Titer Plate Shaker establecido a 600 rpm. La agregación se evaluó supervisando los aumentos en la turbidez a 320 nm utilizando un espectrofotómetro Beckman DU640. BIIB059 muestra agregación dependiente del tiempo. Normalmente, los anticuerpos de IgG1 humanos de tipo salvaje no se agregan bajo estas condiciones de agitación. Como se muestra en la Figura 9, la agregación se suprimió completamente mediante la adición de Tween 80 al 0,03 %, un excipiente de formulación común. La agregación inducida por la agitación a veces puede ser altamente dependiente del pH. La IgG4/IgGI aglicosilado mostró una agregación más rápida y más extensa que BIIB059. La agregación de IgG4/IgGI aglicosilada también se suprimió con la adición de Tween 80.

Ejemplo 16. Evaluación de la viscosidad de BIIB059

La estabilidad y la viscosidad de las muestras de BIIB059 se midieron a altas concentraciones de 150 mg/ml y mayores, para apoyar el desarrollo potencial del producto para administración subcutánea. Las soluciones de BIIB059 se centrifugaron en tubos ultraconcentrador para limitar los volúmenes y las concentraciones alcanzadas se determinaron mediante exploraciones UV. La estabilidad se determinó por cromatografía de exclusión por tamaños después del almacenamiento a 2-8 °C durante una y dos semanas. Se alcanzaron fácilmente concentraciones de proteínas superiores a 200 mg/ml para pequeñas cantidades de proteína en citrato 20 mM, pH 6, tampón NaCl 150 mM y el agregado permaneció bajo (0,68 %) después de dos semanas a 2-8 °C. Se midió la viscosidad utilizando un instrum ento Viscopro2000 (Cambridge Viscosity). La viscosidad a 150 mg/ml fue de solo 8 cP en el tampón citrato/solución salina.

Estos resultados demuestran que debe lograrse una formulación de alta concentración de BIIB059.

Ejemplo 17. Clonación del gen de BDCA2 humano

El ADNc de BDCA2 humano completo (huBDCA2) se subclonó en el vector de clonación pCR4TOPO de Invitrogen de Open Biosystems: este plásmido se designó pEAG2367. La secuenciación de ADN confirmó que su ADNc era idéntico al ADNc de BDCA2 humano de longitud completa en el número de acceso a Genbank de referencia NM_130441. El marco de lectura abierto de longitud completa huBDCA2 codificado por pEAG2420 se muestra a continuación, con el dominio transmembrana predicho por TM-HMM subrayado:

1 MVPEEEPQDREKGLWWFQLKVWSMAWSIL LLSVCFTVSSWPHNFMYSK

51 TVKRLSKLREYQQYHPSLTCVMEGKDIEDWSCCPTPWTSFQSSCYFISTG

101 MQSWTKSQKNCSVMGADLW INTREEQDFI IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR

151 RHWQWVDQTPYNENVTFWHS GEPNNLDERCAIINFRSSEEWGWNDIHCHV

201 PQKSICKMKK IYI* (SEQIDNO:l)

A continuación, se muestra el marco de lectura abierto de longitud completa huFcsRty codificado por pEAG2413, que es idéntico a la secuencia de referencia en el número de acceso a Genbank NP_004097:

1 MIPAWLLLL LLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV

51 RKAAITSYEK SDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ* (SEQIDNO:2)

Se construyó un vector de expresión CHO que coexpresaba ADNc de BDCA2 y F^ceRI^yhumano en unidades transcripcionales en tándem subclonando el fragmento de 2,11 kb SpeI de pEAG2413 en la cadena principal del vector de 6,71 kb SpeI linealizado, fosfatado de pEAG2420, lo que resulta en "univector" designado pEAG2456. Los ADNc de BDCA2 y FceRIy humanos en pEAG2420 se confirmaron en secuencia. Se produjo una estirpe celular CHO estable que coexpresaba de manera estable los ADNc de BDCA2 y F^ceRI^ypor transfección con pEAG2456.

Ejemplo 18. Clonación del gen de BDCA2 de Cyno y rhesus

El marco de lectura abierto de BDCA2 de macaco deducido codificado por pEAG2384 y una de las formas de SNP observadas en pEAG2383 se muestra a continuación. A continuación, se hace referencia a esta forma de SNP como la forma SNP E73 de BDCA2 de cyno. En el rhesus, se observó una única secuencia idéntica a la forma SNP E73 de BDCA2 de cyno.

1 MVPEEEPQDREKGVWWFQLKVWSVAWSIL LLCVCFTVSSVASHNFMYSK

51 TVKRLSKLQEYQQYYPSLTCVMEGKDMEDWSCCPTPWTSFQSSCYFISTV

101 MQSWTKSQNNCSVMGADLW INTKEEQDFI TQNLKINSAYFLGLSDPKGW

151 RHWQWVDQTPYNKNVTFWHS GEPNSPDERCAIINFRSEEWGWNDVHCHVP

201 QKSICKMKKI YI* (SEQIDNO:72)

En una segunda forma SNP de BDCA2 de cyno, el residuo 73 (GAA = Glu, E) resaltado anteriormente es lisina (AAA = Lys, K). Esta segunda forma de SNP se conoce como la forma SNP K73 de BDCA2 de mono cynomolgus. En BDCA2 humano, el residuo 73 es ácido glutámico. A continuación, se muestra la alineación de las secuencias de BDCA2 humano (superior) y macaco (inferior), que comparten una identidad del 90,6 %. Los posibles sitios de glicosilación unidos a N están sombreados. El BDCA2 de macaco carece de un sitio potencial de glicosilación ligados a N presente en humanos (NSS en 137-139 en humanos frente a NSA en macacos).

1 MVPEEEPQDREKGLWWFQLKVWSMAWSILLLSVCFTVSSWPHNFMYSK 50

1111111111111.111111111.11111111 I I I I I I I I I I I I I I I

1 MVPEEEPQDREKGVWWFQLKVWSVAWSILLLCVCFTVSSVASHNFMYSK 50

51 TVKRLSKLREYQQYHPSLTCVMEGKDIEDWSCCPTPWTSFQSSCYFISTG 100

I I I I I I I I • I I I I I : I I I I I I I I I I I • I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

51 TVKRLSKLQEYQQYYPSLTCVMEGKDMEDWSCCPTPWTSFQSSCYFISTV 100

101MQSWTKSQKNCSVMGADLWINTREEQDFIIQNLKRNSSYFLGLSDPGGR 150

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I I I I l i l i I I - I I I I I I I I I

101MQSWTKSQNNCSVMGADLWINTKEEQDFITQNLKINSAYFLGLSDPKGW 150

151RHWQWVDQTPYNENVTFWHSGEPNNLDERCAIINFRSSEEWGWNDIHCHV200

I I I I I I I I I I I I • I I I I I I I I I I I • I I I I I I I I I I 11111111:1111

151RHWQWVDQTPYNKNVTFWHSGEPNSPDERCAIINFR.SEEWGWNDVHCHV 199

A continuación, se muestra un marco de lectura abierto de F^ceR^íyde mono cynomolgus consenso:

1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALGEPQLCYILDA ILFLYGIVLTLLYCRLKIQV

51 RKAAIASYEK SDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (SEQIDNO:73)

La secuencia de ADNc de Fc^eRí^ydel mono cynomolgus es una combinación perfecta con la del ADNc de rhesus predicha (basado en lecturas genómicas cortas) descritas en el número de acceso a Genbank XM_001115585 y una secuencia de cyno depositada como número de acceso a Genbank AF485816 por los científicos de Genentech. La secuencia de la proteína de Fc^eRí^yde cyno comparte una identidad del 98,9 % con la proteína de Fc^eRí^yhumano, que se diferencia solo por una única sustitución conservadora. A continuación, se muestra la alineación entre Fc^eRí^yhumano (superior) y cyno (inferior):

1 MIPAWLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV50

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

1 MIPAWLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV50

Se construyó un vector de expresión CHO que coexpresaba la forma de SNP E73 de cyno de los ADNc de BDCA2 y Fc^eRí^yen unidades transcripcionales en tándem subclonando el fragmento de 2,11 kb Spel de pCN652 en la cadena principal del vector de 6,72 kb Spel linealizado, fosfatado de pCN654, lo que resulta en "univector" designado pEAG2668. Los ADNc de BDCA2 y Fc^eRí^yde cyno en pEAG2668 se confirmaron en secuencia. Se produjo una estirpe celular CHO estable que coexpresaba de manera estable los ADNc de BDCA2 y Fc^eRí^ypor transfección con pEAG2668.

Ejemplo 19. Reactividad cruzada entre BDCA2 humano y de cyno

Para determinar si el BDCA2 SNP E73/K73 de mono cynomolgus afectó a la unión anti-BDCA2, las células 293E se cotransfectaron con vectores de expresión que portaban un indicador EGFP (pEAG1458) y ADNc de BDCA2 y Fc^eRí^y(BDCA2 humano: pEAG2420 y Fc^eRí^y: pEAG2413; BDCA2 E73 de cyno: pCN652 o BDCA2 K73: pCN656 y Fc^eRí^yde cyno: pCN652) a relaciones molares 1:1:1. A los 3 días después de la transfección, las células se recogieron y se tiñeron con mAb AC 144 anti-BDCA2 humano Miltenyi conjugado con PE (número de catálogo Miltenyi Biotec 130-090-511) en un FACS de titulación de dilución de unión directa, separándose en células verdes positivas para EGFP. La Figura 10 muestra la unión directa de AC 144 a BDCA2 de superficie humana y cyno.

Las CE50 aparentes son esencialmente equivalentes para BDCA2 humano y las formas SNP E73 y K73 del BDCA2 de mono cynomolgus. Dado este resultado, se generaron transfectantes estables CHO para BDCA2 de superficie completa utilizando el vector de expresión de BDCA2/Fc^eRí^yhumano pEAG2456 y el vector de expresión BDCA2/Fc^ERl^Ycyno SNP E73 pEAG2668. Estas líneas se utilizaron para la clasificación de anticuerpos anti-BDCA2 de reactividad cruzada humanos/cyno.

Ejemplo 20. Construcciones de fusión de Fc de ectodominios de BDCA2 humano y de cynomolgus

Se diseñaron cinco construcciones de fusión de Fc de ECD de BDCA2 humano y cyno. En tres de las construcciones, BDCA2 se une a través de una secuencia enlazadora G4S al extremo C-terminal de la bisagra de IgG1 humana y Fc. En dos de las construcciones, el enlazador G4S se reemplazó con un sitio de escisión de proteasa TEV ENLYFQC.

Como BDCA2 es una proteína de membrana tipo II (el extremo C-terminal está fuera de la célula), el diseño de proteínas de fusión de Fc solubles implicaba agregar el ectodominio C-terminal de BDCA2 (residuos 45-213 para BDCA2 humano) al extremo C-terminal del Fc de IgG genomanipulado con secreción fue estimulado por una secuencia de señal de cadena ligera kappa murina en marco. La construcción de huBDCA2 de longitud completa pEAG2367 se utilizó como plantilla para PCR con cebadores 5' CAG TGT CTG TTT CAC TCC CGG GGG TGG CGG TGG TAG CAA TTT TAT GTA TAG C 3' (SEQ ID NO:74) (para agregar un 5' XmaI (Pro-Gly) y un enlazador Gly4Ser inmediatamente antes del extremo 5' del ectodominio huBDCA2) y 5' CCA GGG AGA ATA GGA TCC TTA TAT GTA GAT CTT 3' (SEQ ID NO:75) (para agregar un sitio BamHI de 3' inmediatamente después del terminador huBDCA2). El producto de PCR de 0,56 kb se purificó y se subclonó en el vector de clonación pCRBluntIITOPO de Invitrogen, produciendo pEAG2417, cuya secuencia de ADNc de inserción se confirmó. El fragmento XmaI-BamHI de 0,53 kb de pEAG2417 y el fragmento NotI-XmaI de 0,75 kb de pEAG1397 (que lleva un Fc huIgGl genomanipulado cuya secreción es estimulada por una secuencia de señal de cadena ligera kappa murina genomanipulada en el marco) se ligaron con los fragmentos de la cadena principal BamHI-XbaIde 1,89 kb y XbaI-NotI de 4,17 kb pV90, produciendo el vector de expresión de proteína de fusión huIgGl Fc-huBDCA2 pEAG2421, cuya secuencia de inserción de ADNc se confirmó. El marco de lectura abierto deducido codificado por pEAG2421 se muestra a continuación:

1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPK

51 PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

101 NSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREP

151 QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP

201 VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

251 GGGGSNFMYS KTVKRLSKLREYQQYHPSLTCVMEGKDIEDWSCCPTPWTS

301 FQSSCYFISTGMQSWTKSQKNCSVMGADLVVINTREEQDF IIQNLKRNSS

351 YFLGLSDPGGRRHWQWVDQT PYNENVTFWH SGEPNNLDERCAIINFRSSE

401 EWGWNDIHCHVPQKSICKMKKIYI*(SEQIDNO:76)

secuencia de señal de la cadena ligera kappa: residuos 1-19 anteriores (en cursiva)

Fc de IgG1 humana: residuos 20-250 anteriores

enlazador G4S: residuos 251-255 anteriores (en negrita)

ectodominio huBDCA2: residuos 256-424 anteriores (subrayado)

Para construir un vector de expresión para una proteína de fusión muIgG2a Fc-huBDCA2, el fragmento XmaI-BamHI de 0,53 kb de pEAG2417 y el fragmento NotI-XmaI de 0,75 kb de pEAG1442 (que transporta un Fc de IgG2a murino genomanipulado cuya secreción es estimulada por una secuencia de señal de la cadena ligera kappa murina en marco) se ligaron con los fragmentos de la cadena principal del vector BamHI-XbaI de 1,89 kb y XbaI-NotI de 4,17 kb del vector de expresión pV90, produciendo pEAG2423, cuya secuencia de inserción de ADNc se confirmó. El marco de lectura abierto deducido codificado por pEAG2423 se muestra a continuación:

i MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PRGPTIKPSP PCKCPAPNLLGGPSVFIFPP

51 KIKDVLMISL SPIVTCVWDVSEDDPDVQI SWFVNNVEVHTAQTQTHRED

101 YNSTLRVVSALPIQHQDWMS GKEFKCKVNNKDLPAPIERT ISKPKGSVRA

151 PQVYVLPPPE EEMTKKQVTL TCMVTDFMPE DIYVEWTNNGKTELNYKNTE

201 PVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSC SVVHEGLHNHHTTKSFSRTP

251 GGGGGSNFMY SKTVKRLSKL REYQQYHPSL TCVMEGKDIE DWSCCPTPWT

301 SFQSSCYFIS TGMQSWTKSQKNCSVMGADLWINTREEQD FIIQNLKRNS

351 SYFLGLSDPGGRRHWQWVDQTPYNENVTFWHSGEPNNLDERCAIINFRSS

401 EEWGWNDIHCHVPQKSICKMKKIYI*(SEQIDNO:77)

Fc de IgG2a murina: residuos 20-251 anteriores

enlazador G4S: residuos 252-256 anteriores (en negrita)

ectodominio huBDCA2: residuos 257-425 anteriores (subrayado)

Las estirpes celulares CHO estables que producen las proteínas de fusión Fc-huBDCA2 se produjeron por transfección con los vectores de expresión pEAG2421 y pEAG2423. Estas proteínas de fusión se utilizaron en ensayos de unión ELISA y Octet para la selección de anticuerpos durante la identificación selectiva de candidatos.

Para diseñar BDCA2 de cynomolgus (cyno) para hacer una proteína de la proteína de fusión de Fc, la variante SNP E73 completa de BDCA2 de cyno en la construcción pCN648 se sometió a mutagénesis dirigida al sitio con cebadores 5' CTC TGT GTC TGT TTC ACT CCC GGG GGT GGC GGT GGT AGC AAT TTT ATG TAT AGC 3' (SEQ ID NO:78) y su complemento inverso, para agregar un 5' XmaI (Pro-Gly) y un enlazador Gly4Ser inmediatamente antes del extremo 5' del ectodominio huBDCA2, produciendo la construcción pEAG2675, cuya secuencia de inserción de ADNc se confirmó. Para construir un vector de expresión para una proteína de fusión muIgG2a Fc-BDCA2 de cyno, el fragmento XmaI-BamHI de 0,53 kb de pEAG2675 y el fragmento NotI-XmaI de 0,75 kb de pEAG1442 (que transporta un Fc de IgG2a murino genomanipulado cuya secreción es estimulada por una secuencia de señal de la cadena ligera kappa murina genomanipulada en marco) se ligaron con los fragmentos de la cadena principal del vector BamHI-XbaI de 1,89 kb y XbaI-NotI de 4,17 kb del vector de expresión pV90, produciendo pEAG2677, cuya secuencia de inserción de ADNc se confirmó. El marco de lectura abierto deducido codificado por pEAG2677 se muestra a continuación:

1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PRGPTIKPSP PCKCPAPNLLGGPSVFIFPP

51 KIKDVLMISL SPIVTCVWDVSEDDPDVQI SWFVNNVEVHTAQTQTHRED

101 YNSTLRVVSALPIQHQDWMS GKEFKCKVNNKDLPAPIERT ISKPKGSVRA

151 PQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPE DIYVEWTNNGKTELNYKNTE

201 PVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSC SVVHEGLHNHHTTKSFSRTP

251 GGGGGSNFMY SKTVKRLSKLQEYQQYYPSLTCVMEGKDMEDWSCCPTPWT

301 SFQSSCYFIS TVMQSWTKSQNNCSVMGADLWINTKEEQD FITQNLKINS

351 AYFLGLSDPKGWRHWQWVDQTPYNKNVTFWHSGEPNSPDERCAIINFRSE

401 EWGWNDVHCHVPQKSICKMKKIYI*(SEQIDNO:79)

Fc de IgG2a murina: residuos 20-251 anteriores

enlazador G4S: residuos 252-256 anteriores (en negrita)

ectodominio de BDCA2 de cyno: residuos 257-424 anteriores (subrayado)

Se produjo una estirpe celular CHO estable que produce la proteína de fusión BDCA2 Fc cyno por transfección con el vector de expresión pEAG2677.

Las proteínas de fusión BDCA2 muIgG2a Fc se sometieron a proteólisis limitada, para aislar proteínas monoméricas de ectodominio de BDCA2. Para facilitar el aislamiento del ectodominio de BDCA2 soluble recombinante, se construyeron nuevas construcciones de fusión de Fc donde se insertó un sitio de escisión de la proteasa TEV entre el extremo C-terminal del Fc y el extremo N-terminal del ectodominio de BDCA2. Los singenes que llevan ectodominios de BDCA2 humanos o cyno diseñados con un 5' XmaI (Pro-Gly) para fusión al extremo C-terminal de Fc seguido de un sitio de escisión TEV en marco (ENLYFQG) fusionado al residuo 45 de la secuencia de BDCA2 y un sitio 3' BamHI que sigue al terminador de BDCA2 fue diseñado y entregado por GeneWiz como XmaI-BamHI de inserción en su propio vector de clonación pUC57-amp. Se confirmaron las secuencias de las inserciones en construcciones de ADNc de ectodominio de BDCA2 TEV XmaI-BamHI genomanipuladas, pEAG2917 (humano) y pEAG2918 (cyno). Para construir vectores de expresión de CHO basados en pV90-IRES-dhfr para proteínas de fusión huIgG1 Fc-TEV-BDCA2, el fragmento de 0,75 kb NotI-XmaI de pEAG1397 y el fragmento de 0,54 kb XmaI-BamHI de pEAG2917 o pEAG2918 se subclonaron en el fragmento de la cadena principal del vector de 5,4 kb BglII-NotI de pXJC194, produciendo pEAG2937 (Fc-huBDCA2) o pEAG2938 (Fc-cyno B^dC^a2). Los de ADNc de inserción en pEAG2937 y pEAG2938 se confirmaron en secuencia. Se generaron estirpes celulares CHO estables mediante transfección con pEAG2937 y pEAG2938. El marco de lectura abierto deducido de la proteína de fusión huFc-TEV-huBDCA2 codificada por pEAG2937 se muestra a continuación:

1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPK

51 PKDTLMISRT PEVTCWVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

101 NSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREP

151 QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP

201 VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

251 ENLYFQGNFMYSKTVKRLSKLREYQQYHPS LTCVMEGKDI EDWSCCPTPW

301 TSFQSSCYFI STGMQSWTKSQKNCSVMGADLVVINTREEQDFIIQNLKRN

351 SSYFLGLSDPGGRRHWQWVDQTPYNENVTFWHSGEPNNLDERCAIINFRS

401 SEEWGWNDIHCHVPQKSICKMKKIYI* (SEQIDNO:80)

Fc de IgG1 humana: residuos 20-250 anteriores

sitio de escisión TEV: residuos 251-257 anteriores (en negrita)

ectodominio de huBDCA2: residuos 258-426 anteriores

A continuación, se muestra el marco de lectura abierto deducido de la proteína de fusión huFc-TEV-cyno BDCA2 codificada por pEAG2938:

1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSE PKSSDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPK

51 PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

101 NSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREP

151 QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP

201 VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

251 ENLYFQGNFMYSKTVKRLSKLQEYQQYYPS LTCVMEGKDMEDWSCCPTPW

301 TSFQSSCYFI STVMQSWTKSQNNCSVMGADLVVINTKEEQDFITQNLKIN

351 SAYFLGLSDPKGWRHWQWVDQTPYNKNVTFWHSGEPNSPDERCAIINFRS

401 EEWGWNDVHCHVPQKSICKMKKIYI* (SEQIDNO:81)

Fc de IgG1 humana: residuos 20-250 anteriores

sitio de escisión TEV: residuos 251-257 anteriores (en negrita)

ectodominio de BDCA2 de cyno: residuos 258-425 anteriores (subrayado)

Ejemplo 21. BIIB059 se une a las proteínas de fusión de BDCA2-Fc

La SEC evaluó la capacidad de BIIB059 para unirse a huBDCA2-Fc en solución (Figura 11). Cuando se analizó solo, BIIB059 (panel superior) y huBDCA2 (panel central) se eluyeron como picos agudos individuales con masas moleculares de ~150 kDa. Cuando BIIB059 y huBDCA2-Fc se mezclaron y analizaron (panel inferior), hubo un cambio de BIIB059 y huBDCA2-Fc a masas superiores de >550 kDa como se evidencia por su elución en posiciones anteriores en el cromatograma. La heterogeneidad en el pico de elución se debe presumiblemente al hecho de que tanto BIIIB059 como BDCA2-Fc contienen cada uno 2 sitios de unión y, en consecuencia, se forma un gran número de complejos con diferentes estequiometrías de BIIB059 y BDCA2.

La unión de BDCA2 ECD cyno a BIIB059 también fue evaluada por SEC y de manera similar condujo a un cambio cuantitativo a complejos de masa molecular superior.

Ejemplo 22. El calcio mejora la unión de BIIB059 a BDCA2

Se estudió la unión de BIIB059 a BDCA2 humano fusionado a Fc murino (huBDCA2-muFc) en presencia de calcio o EDTA en un ensayo de unión de Octet. La proteína huBDCA2-muFc se capturó en un biosensor de Fc anti-murino, seguido de la asociación de BIIB059 y la etapa de disociación. Todas las etapas se realizaron en HEPES 50 mM, pH 7, NaCl 100 mM, 1 mg/ml de BSA, Tween 20 al 0,02 % y azida al 0,001 % que contenía CaCl210 mM o EDTA 10 mM.

La Figura 12 muestra que la unión de BIIB059 se mejora mediante la adición de calcio en relación con EDTA que conduce a una señal aproximadamente 2 veces mayor. Las constantes de asociación y disociación se vieron afectadas por el calcio.

Ejemplo 23. Mediciones de unión

Octet se utilizó para controlar la unión de BIIB059 a la proteína de fusión BDCA2-Fc y ECD BDCA2. La Figura 13 muestra un experimento de Octet en el que BIIB059 se cargó en puntas de Octet de Fc antihumano a una concentración de 20 gg/ml. Para la etapa de asociación, se añadió ECD BDCA2 humano y cynomolgus a una concentración de 2 gg/ml. El tampón para este experimento fue HEPES 50 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaC12 5 mM, 1 mg/ml de BSA, Tween 20 al 0,02 % y azida al 0,001 %. En estas condiciones, fue comparable la unión de BIIB059 a ECD BDCA2 humano y de cyno.

Ejemplo 24. Ensayo de PBMC para determinar el valor de CI50 de BIIB059 para la inhibición de la producción de IFNa inducida por TLR9

Se ha demostrado que el ligamiento de BDCA2 activa una cascada de señalización similar a BCR, que suprime de forma potente la capacidad de las pDC para producir IFN tipo I y otras citocinas en respuesta a los ligandos de TLR (Cao W. y col., PLoS Biol., 5(10): e248 (2007)). La inhibición de la producción de IFNa inducida por TLR9 por PBMC se usó como el ensayo celular primario para la identificación selectiva.

Las PBMC de sangre venosa heparinizada de donantes sanos se aislaron por centrifugación en gradiente discontinuo sobre Ficoll, se lavaron en PBS y se volvieron a suspender en medio de cultivo completo (RPMI con FBS al 3 %). 1x106 células se sembraron/pocillo y se estimularon con 10 pg/ml del ligando de TLR9 (CpG-A ODN 2216) en presencia de dosis de BIIB059 y 24F4A-Agli (una versión Fc lisiada de BIIB059), o mAb de control de isotipo que varía de 10 pg/ml a 1 pg/ml en un volumen de ensayo total de 200 pl/pocillo. Las placas se incubaron durante la noche (18 horas) a 37 °C, y los sobrenadantes se recogieron para evaluación en ensayos ELISA de IFNa (PBL InterferonSource). Los ensayos se realizaron según el protocolo del fabricante. Las valoraciones de BIIB059 y 24F4A agli se probaron para determinar la CI50 para la inhibición de la producción de IFNa inducida por TLR9. Un total de doce experimentos independientes dieron una CI50 promedia de 0,001 pg/ml para BIIB059. El mAb aglicosilado fue menos potente, con una CI50 promedia de 0,007 pg/ml (Figura 14).

También se probó la capacidad del mAb anti-BDCA2 para inhibir la producción de IFNa después de la estimulación con un ligando fisiológicamente relevante, a saber, sueros de pacientes con LES. Se cree que los sueros de LES inducen el tipo I IFN a través de complejos de autoanticuerpos anti-ADN y ADN hipometilado inmunoestimulador que estimulan TLR9. Las PBMC se estimularon con suero de un paciente con LES (proporcionado por el Dr. Gregg Silverman, NYU) y se usaron a una dilución final de 1/5. El anticuerpo 24F4S H4/L1C95S, que difiere de BIIB059 por 1 residuo de aminoácido, anuló completamente la producción de IFNa a partir de pDC estimuladas con suero de SLE (Figura 18).

Ejemplo 25. Producción de IFNa inducida por TLR9 en análisis de sanare entera

La actividad de BIIB059 también se evaluó en un análisis de sangre entera de la producción de IFNa inducida por TLR9. Se extrajo sangre entera de sangre venosa heparinizada de donantes sanos. Las dosis de BIIB059 y 24F4A-Agli variaron de 10 pg/ml a 1 pg/ml en un volumen de ensayo total de 200 pl/pocillo. Se añadió CpG-A a 200 pg/ml, que se determinó que era óptimo para la estimulación de la producción de IFNa en sangre entera. Las placas se incubaron durante 18 horas a 37 y se recogieron los sobrenadantes para su uso en ensayos de ELISA de IFNa (PBL InterferonSource). Los ensayos se realizaron según el protocolo del fabricante. En la Figura 15A se muestra un experimento representativo de 6 experimentos independientes realizados. La potencia inhibitoria de BIIB059 en el ensayo de IFNa inducido por TLR9 en sangre entera fue similar a la potencia observada en los ensayos de PBMC. Además de inhibir las citocinas derivadas de pDC (IFNa, IL-6), el tratamiento con BIIB059 también condujo a la inhibición de una gran variedad de citocinas y quimiocinas (Figura 15C).

El siguiente experimento se realizó para determinar si BIIB059 podría inhibir la producción de IFNa inducida por TLR9 en sangre entera de pacientes con LES de manera similar a los voluntarios sanos. Con este fin, se estimuló sangre entera de 2 pacientes con LES o 2 controles sanos con 200 pg/ml de CpGA en presencia de BIIB059 a 10 pg/ml y se evaluó la producción de IFNa mediante ELISA. Específicamente, Bioreclamation LLC proporcionó sangre entera de 2 pacientes con LES o 2 donantes sanos mediante envío nocturno. A su llegada, la sangre se trató con 10 pg/ml de BIIB059 o control de isotipo y se estimuló con 200 pg/ml de CpG-A y se cultivó en placas en una placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 18 horas a 37 °C y se recogieron los sobrenadantes para su uso en ensayos de ELISA de IFNa (PBL InterferonSource). Los ensayos se realizaron según el protocolo del fabricante.

Como se muestra en la Figura 15B, BIIB059 mostró una potencia similar en sangre entera de pacientes con LES en comparación con voluntarios sanos.

Ejemplo 26. Evaluación de la inhibición mediada por BIIB059 de los interferones tipo I

La actividad inhibitoria de BIIB059 también se confirmó usando pDC purificadas estimuladas con agonistas sintéticos de TLR (CpG-A) o con el estímulo más fisiológico (sueros de LES). También se determinó el efecto inhibidor de la reticulación de BDCA2 en otras citocinas derivadas de pDC (IL-6). La actividad de BIIB059 se confirmó utilizando una variedad de estrategias, tales como la reacción en cadena de la polimerasa cualitativa y ELISA.

a) Q-PCR

Trece subtipos de IFNa y un solo miembro de IFNp existen en humanos. La estimulación con el agonista de TLR9 da como resultado una regulación positiva de la mayoría de los IFN tipo I (Ito T. y col., Blood, 107(6):2423-31 (2006)). La inhibición de genes individuales de IFN tipo I se evaluó mediante ensayos cualitativos de reacción en cadena de la polimerasa (Q-PCR).

Las pDC se purificaron usando un procedimiento de separación de microesferas magnéticas de dos etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). 5 x 104 pDC/pocillo se estimularon con 5 pM de CPG-A en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de BIIB059 o 10 |jg/ml de control de isotipo. El volumen total del ensayo fue de 200 jl/pocillo. Las placas se incubaron durante 18 horas a 37 'C, y el ARN se extrajo de las células usando reactivo Trizol (Invitrogen Corporation) y se purificó adicionalmente usando una mini columna RNeasy (Qiagen Sciences). Todos los cebadores y sondas fueron adquiridos en Applied Biosystems Inc. Las cantidades de transcrito relativas se determinaron para cada muestra en comparación con la curva estándar de oligonucleótidos usando el software de detección de secuencia (Applied Biosystems Inc.) y se normalizaron a un control (GAPDH).

El tratamiento con BIIB059 inhibió la transcripción de todos los IFN de tipo I probados, recapitulando así datos previos utilizando el clon de anticuerpo anti-BDCA2 AC144 (Cao W. y col., PLoS Biol., 5(10):e248 (2007)).

b) ELISA

El efecto de BIIB059 sobre la inhibición de las citocinas de pDC se probó a nivel de proteína usando ELISA. 5 x104 pDC purificadas/pocillo se estimularon con 5 jM de CPG-A en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de BIIB059 o 10 jg/ml de control de isotipo. En la Figura 17 se muestran las cantidades de IFNa e IL-6 secretadas medidas de un donante representativo de tres donantes sanos probados.

El ligamiento de BDCA2 con BIIB059 inhibió potentemente la producción de IFNa y redujo en gran medida la producción de IL-6 inducida por la estimulación con CpG-A.

Ejemplo 27. Internalización del receptor mediada por BIIB059

Se ha demostrado que el ligamiento de BDCA2 con mAb anti-BDCA2 (clon AC144, Miltenyi) induce rápidamente la internalización del receptor (Dzionek A. y col., J. Immunol., 165(11):6037-46 (2000)). El siguiente experimento fue dirigido a determinar la cinética de la internalización de BDCA2 mediada por BIIB059.

La sangre entera humana se trató con 10, 1,0,1 o 0,01 jg/ml de BIIB059 o un control de isotipo (10 jg/ml) a 37 “C durante los períodos indicados y luego se incubó durante 30 min a 4 “C con mAb anti-BDCA2 FITC de bloqueo no cruz ado marcado con FITC (clon 2D6), anti-HLADR, anti-CD123, anti-CD14 y anti-CD20. Los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) se lisaron usando tampón de lisis Easy 1X (BD Bioscience) y se fijaron las células restantes. En la Figura 19A se muestran los valores medios de intensidad de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés) de la tinción 2D6-FITC de CD14-CD20-HLA-DR+CD123+pDC clasificados. FMO (control de fluorescencia menos uno) consistió en el cóctel de tinción FACS menos 2D6-FITC. Los datos en esta figura son un experimento representativo de 3 experimentos independientes realizados.

Como se muestra en la Figura 19A, tras la incubación con BIIB059 a 1 jg/ml, la intensidad de la tinción 2D6 marcada con FITC disminuyó rápidamente alcanzando niveles de fondo en un plazo de una hora de incubación a 37 °C. La concentración diez veces menor de BIIB059 (0,1 jg/ml) afectó a la cinética de la endocitosis, retrasándola en 2 horas. Esto demuestra que BDCA2 se internaliza tras el ligamiento con BIIB059 con una cinética dependiente de la dosis. El siguiente experimento se realizó para determinar si la internalización del receptor mediada por BIIB059 afectaba a la inhibición de IFN. Se recogió sangre entera de sangre venosa heparinizada de donantes sanos y se incubó previamente con BIIB059 (para permitir la internalización del receptor) o isótopo durante la duración indicada. En cada punto de tiempo después de la preincubación, las células se expusieron a 200 jg/ml de CpGA y se incubaron durante 18 horas adicionales a 37 °C. Los sobrenadantes se recogieron para su uso en ensayos de ELISA de IFNa (PBL InterferonSource). Los ensayos se realizaron según el protocolo del fabricante. La Figura 19B es un experimento representativo de 3 experimentos independientes realizados. Como se muestra en la Figura 19B, después de 9 horas de preincubación con BIIB059 antes de la estimulación, correspondiente a la internalización máxima, no afectó a la inhibición de IFN, lo que sugiere que la endocitosis de BDCA2 y la inhibición de TLR9 están potencialmente vinculadas. Para probar esta hipótesis, se utilizaron mAbs anti-BDCA2 incapaces de mediar la inhibición de IFN y demostraron falta de internalización. Además, se ha demostrado previamente que la unión bivalente era necesaria para la inhibición de IFN mediada por anti-BDCA2. De hecho, el fragmento Fab no condujo a la internalización o inhibición de IFN. Tomados en conjunto, estos datos aumentan la posibilidad de que la inhibición de TLR9 mediada por BDCA2 requiera endocitosis y localización en compartimentos endosómicos que contengan TLR9. Esta hipótesis se puede probar usando imágenes en vivo para rastrear la internalización y el tráfico de BDCA2 en la célula después del ligamiento de BIIB059.

Ejemplo 28. Función efectora de anticuerpos

El dominio Fc de BIIB059 es una IgG1 humana completamente glicosilada, y es competente para unirse tanto a los receptores Fcy celulares como al complemento, e inducir respuestas celulares inmunitarias efectoras celulares, tanto a través de la citotoxicidad dependiente de antígeno (ADCC) como de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Para confirmar la unión de BIIB059 a los receptores Fc, se midieron las afinidades de unión relativas usando la tecnología de Ensayo Homogéneo de Proximidad Luminiscente Amplificada (ALPHA) de Perkin Elmer (Figura 20). El ensayo se realizó en un formato competitivo en el que se incubaron diluciones en serie de anticuerpos de prueba con las proteínas de fusión receptor-GST y microesferas aceptoras anti-GST durante la noche a 4 °C en una placa de 96 poci llos. También se incubaron microesferas donantes de estreptavidina e IgG1 de tipo salvaje biotinilado durante la noche a 4 °C en un tubo separado y luego se añadieron a la placa de ensayo al día siguiente. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h con agitación suave y se leyeron en un lector de placas Envision (Perkin Elmer). Los datos se representaron gráficamente en un ajuste de curva de 4 parámetros usando el software Graphpad Prism para calcular los valores de CI50 para determinar las afinidades de unión relativas. Valores de CI50 de BIIB059 para FcyRI: se calcularon 0,03 pg/ml de FcYR11a: 11 pg/ml de FcYR11b: 17 pg/ml de FcYR111a: y 3 pg/ml. Estos valores están en línea con los observados para otros anticuerpos de IgG1 humanos en este ensayo. También se determinaron los valores de CI50 para la versión de la función efectora baja de G4P/G1 agli de 24F4 utilizada en cyno. Como se esperaba, no se detectó unión a FcYR11a, FcYR11b y FcYR111a y la unión a F^cyR1 se redujo en 100 veces. El anticuerpo 5c8, tanto en las regiones de estructura de IgG1 TS como en G4P/G1 agli, se incluyeron en los ensayos como comparadores.

Ejemplo 29. Fijación del complemento

Se ha demostrado que el recubrimiento de anticuerpos de las dianas media mecanismos de destrucción potentes a través de ADCC o CDC. Estas funciones efectoras de los anticuerpos están mediadas por la región Fc del anticuerpo. Este experimento se dirigió a probar la capacidad de BIIB059 para reclutar un complemento mediante la prueba de su unión a C1q por ELISA.

El ensayo de unión a C1q se realizó en un formato ELISA de 96 pocillos utilizando placas Maxisorb ELISA. El anticuerpo de prueba se revistió en una serie de dilución de 3 veces en p Bs a partir de 15 pg/ml durante la noche a 2-8 °C y los pocillos se lavaron con PBS, Tween 20 al 0,05 % y se bloquearon con 200 pl de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2, NaCl 0,1 M, gelatina al 0,1 %, Tween 20 al 0,05 %. Posteriormente, se añadieron 50 pl/pocillo de 2 pg/ml de C1q humano de Complement Technology (A099) diluido en tampón de bloqueo/diluyente y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Después de aspirar y lavar como se indicó anteriormente, se añadieron 50 pl/pocillo de C1q anti-IgY de pollo humano (producción personalizada por Aves Labs, Inc usando C1q humano de Sigma, C0660) diluido 8.000 veces en tampón de bloqueo/diluyente. Después de la incubación durante 1,5 h a temperatura ambiente, los pocillos se aspiraron y se lavaron como anteriormente. El conjugado de burro anti-IgY de F(ab')2 de pollo con HRP (Jackson ImmunoResearch 703-030-155) diluido a 5.000 veces en bloqueo/diluyente se añadió luego a 50 pl/pocillo y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de aspirar y lavar como se indicó anteriormente, 100 pl de sustrato TMB (420 pM de TMB, 0,004 % de H2O2 en tampón de acetato de sodio/ácido cítrico 0,1 M, pH 4,9) se añadió e incubó durante 2 minutos antes de parar con 100 pl de ácido sulfúrico 2 N. La absorbancia se leyó a 450 nm con un instrumento Softmax PRO y se usó el software Softmax para determinar la afinidad de unión relativa (valor C) con un ajuste de 4 parámetros.

La Figura 21 muestra que mientras BIIB059 es capaz de unirse a C1q, 24F4A IgG4.P/IgG1 agli está esencialmente desprovisto de la unión de C1q.

Ejemplo 30. Estudios de agotamiento celular

BIIB059 inhibe potentemente la producción de IFN de tipo I e IL-6 después del ligamiento de BDCA2. Además de su actividad agonista, estos experimentos se llevaron a cabo para evaluar si BIIB059 podría agotar las pDC con BDCA2 en virtud de su Fc funcional. Para investigar la potencia citotóxica de BIIB059 se probó su actividad en ensayos de ADCC y CDC.

a) Ensayo de ADCC

ADCC es un mecanismo por el cual una célula efectora del sistema inmunitario lisa activamente una célula diana, cuyos receptores de superficie han sido unidos por anticuerpos (Figura 22).

La estirpe celular CHO (EAG2456 T1F2 Clon 34.16.7) se usó como la célula diana. El nivel de expresión de BDCA2 en la superficie de las células CHO se determinó mediante FACS usando un mAb anti-BDCA2 marcado con APC (clon AC144, Miltenyi). Las células NK se usaron como células efectoras y se separaron de la sangre entera mediante selección negativa usando el cóctel de enriquecimiento de células NK humano RosetteSep™ (Stem Cells Technologies). Después de una incubación de 20 minutos con el cóctel a temperatura ambiente, las células NK se aislaron por centrifugación en gradiente discontinuo sobre ficoll. Las células CHO y las células NK humanas se sembraron en una relación de 5:1 (NK:CHO) en presencia de mAbs anti-BDCA2 efectores competentes (24F4S y BIIB059), mAbs lisiados por Fc (24F4SAgli y 24F4A-Agli) o control de isotipo de IgG1 y se incubaron durante 4 horas a 37 El control negativo consistió en pocilios que contenían células CHO y NK sin anticuerpos. Las células NK y CHO lisadas con Tx-100 se usaron para determinar la destrucción máxima. ADCC se evaluó utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad Vybrant (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo detecta G6PD de células dañadas basándose en la reducción de resazurina dependiente de G6PD que emite fluorescencia a 590 nm después de la excitación a 530 nm. El ensayo de ADCC representado en la Figura 22, panel A, se realizó usando células CHO con alta expresión de BDCA2 (panel C), mientras que el ensayo de ADCC en la Figura 22, panel B, usó células CHO con menor expresión de BDCA2 (panel D).

24F4S condujo a la destrucción al 100 % de las células CHO con BDCA2 similares a la lisis de tritón X. Como se esperaba, la versión aglicosilada del mAb (24F4S-agli) no condujo a ADCC (Figura 22A). En comparación con 24F4S, BIIB059 tenía una actividad ADCC idéntica (Figura 22 B). Es de destacar que la eficacia de la destrucción se correlacionó con el nivel de expresión de BDCA2 en las células CHO (Figura 22C y Figura 22D).

b) Ensayo de CDC

En la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), C1q se une al anticuerpo que desencadena la cascada del complemento y conduce a la lisis celular (Figura 23). Como se muestra en la sección Ejemplo 29, BIIB059 puede unirse eficientemente al componente C1q del complemento. Este experimento se realizó para confirmar que BIIB059 puede mediar CDC.

Se sembraron células transfectantes estables CHO-BDCA2/F^ceRI^y(EAG2456 T1F2 Clon 34.16.7) a 5 x 104 células en placas de 96 pocillos de colágeno negro y se incubaron a 37 °C durante 48 horas. Las placas se lavaron e incubaron con complemento de suero de conejo y yoduro de propidio (PI) en presencia de mAbs anti-BDCA2 efectores competentes (24F4S y BIIB059), mAbs deficientes de la función efectora (24F4S-Agli y 24F4A-Agli) o control de isotipo de IgG1 durante 1 h a 37 °C. El control negativo consistió en pocill os que contenían células CHO, complemento de suero de conejo y PI, sin anticuerpos. Las células NK y CHO lisadas con T-100x se usaron para determinar la destrucción máxima. Las placas se leyeron usando el lector de placas de fluorescencia Cytoflour (ex530/em645). Los mAbs anti-BDCA2 (BIIB059 y 24F4S) condujeron a la destrucción celular por CDC, similar a la lisis de Tritón. Como se esperaba, los mAbs aglicosilados deficientes en efectores (24F4S-Agli y 24F4A-Agli) no median en los CDC (Figura 23). BIIB059 tiene el potencial de agotar las pDC que llevan BDCA2 en virtud de su región funcional Fc de IgG1. Si bien BIIB059 es capaz de actividad citotóxica en células que sobreexpresan BDCA2, no se espera que se agote in vivo debido a la internalización rápida, sostenida y casi completa del receptor después del ligamiento de BIIB059.

Ejemplo 31. Clonación de un homólogo de BDCA2 de rata e identificación selectiva para la unión por BIIB059 Cuando la secuencia de ADNc de BDCA2 humano se ejecuta en BLAST contra secuencias de rata en la base de datos de NCBI, el homólogo más cercano es Clec4b2 de rata, descrito en el número de acceso a Genbank NM_001005896. Para determinar si el mAb principal hu24F4 H4/L1 C95A era capaz de unirse a un homólogo de rata de BDCA2 humano, se clonaron ADNc y se construyeron vectores de expresión para Clec4b2 de rata y F^ceRI^yde rata. La secuencia de la proteína Clec4b2 de rata de longitud completa comparte solo el 51,0 % de identidad con el BDCA2 humano. A continuación, se muestra la alineación de BDCA2 humano (superior) y Clec4b2 de rata (inferior):

1 MVPEEEPQDREKGLWWFQLKVWSMAWSILLLSVCFTVSSWPHNFMYSK50

1 MMQEKLPQG..KGGCW.TLRLWSAAVISMLLLSTCFIMSCWTYQFMMEK47

51 TVKRLSKLREYQQYHPSLTCVMEGKDIED..WSCCPTPWTSFQSSCYFIS 98

48 PNRRLSEL...HTYNSNFTCCSDGTMVSGKVWSCCPKDWKPFGSHCYFTT 94

99 TGMQSWTKSQKNCSVMGADLWINTREEQDFIIQNLKRNSSYFLGLSDPG 148

95 DFVANWNESKEKCSHMGAHLLVIHSQEEQDFINGILDTRWGYFTGLSDQ.143

149GRRHWQWVDQTPYNENVTFWHSGEPNNLDERCAIINFRSSEEWGWNDIHC 198

144GQNQWQWIDQTPYNESVTFWHEDEPNNDYEKCVEINHHKDIGWGWNDWC 193

199HVPQKSICKMKKIYI 213 (SEQIDNO:l)

194SSEHKSICQVKKIYL 208 (SEQIDNO: 82)

Clec4b2 de rata se clonó por RT-PCR a partir de primera cadena de ADNc de bazo de rata con cebadores 5' GAC CTT CTG AAT ATA TGC GGC CGC CAT GAT GCA GGA AAA AC 3' (SEQ ID NO: 83 (que agrega un sitio NotI 5' y una secuencia Kozak inmediatamente antes del iniciador de metionina Clec4b2) y 5' CCC ACA GCC ATG GAG GAC AGG ATC CTC ATA AGT ATA TTT TC 3' (SEQ ID NO:(SEQ ID NO: 84) (que agrega un sitio BamHI 3' inmediatamente después del terminador de Clec4b2). El producto RT-PCR de 0,64 kb se purificó y se subclonó en el vector de clonación pCR2.1TOPO de Invitrogen, produciendo la construcción pCN815, cuyo inserto fue secuenciado. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó en la plantilla pCN815 con cebadores 5' CAG gAt TTC ATC AAC GGA ATC CTA GAC ACT CGT TGG G 3' (SEQ ID NO:85) y su complemento inverso, para corregir un error de PCR, dando como resultado la construcción pCN822, cuya secuencia de proteína deducida de Clec4b2 se confirmó que era idéntica a la de NM_001005896. Se construyó un vector de expresión de mamífero para el ADNc de longitud completa Clec4b2 de rata ligando el fragmento de 0,64 kb Notl-BamHI de pCN822 con los fragmentos de la cadena principal del vector de 1,89 kb BamHI-Xbal y 4,17 kb Xbal-Notl del vector de expresión pV90, para producir el vector de expresión pCN834, cuya secuencia de inserción de ADNc se confirmó.

El ADNc de FceRIy de rata se describe en el número de acceso a Genbank NM_001131001. La secuencia de la proteína FceRIy de rata comparte una identidad del 90,7 % con FceRIy humano: la alineación, con humano (superior) y rata (inferior) se muestra a continuación:

1 MIPAWLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV50

1 MIPAVILFLLLLVEEAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV50

51 RKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ 86 (SEQIDNO: 2)

51 RKADIASREKSDAVYTGLNTRNQETYETLKHEKPPQ 86 (SEQIDNO:86)

El ADNc de Fo^eRI^yde rata se clonó por RT-PCR a partir de primera cadena de ADNc de bazo de rata con cebadores 5' CCC AGC GCT GCA GCC CGC GGC CGC CAT GAT CCC AGC GGT 3' (SEQ ID NO: 87) (que agrega un sitio Nol y secuencia de Kozak inmediatamente antes del iniciador de metionina Fo^eRI^y) y 5' GAA CAC GTG TTG GGA TCC Ta T TGG GGT GGT TTC TC 3' (SEQ ID NO:88) (que agrega un sitio 3' BamHl inmediatamente después del terminador de Fo^eRI^y). El producto RT-Pc R de 0,27 kb se purificó y se subclonó en el vector de clonación pCR2.1TOPO de Invitrogen, produciendo la construcción pCN816, cuyo inserto fue secuenciado y se confirmó que era idéntico al de NM-001131001. El fragmento de 0,27 kb Notl-BamHl de pCN816 se ligó al fragmento de 0,66 kb BamHl-Xhol y los fragmentos de la cadena principal del vector de 4,16 kb Xhol-Notl de pBHS103, para construir el vector de expresión de mamífero pCN844, cuya secuencia de inserción de ADNc de F^oeRI^yde rata se confirmó.

Para determinar si el mAb principal hu24F4 H4/L1 C95A era capaz de unirse a la superficie de Clec4b2 de rata, se cotransfectaron transitoriamente células 293E con un vector de expresión indicador EGFP (pEAG1458) y vectores BDCA2/F^oeRI^yhumano (pEAG2420 y pEAG2413) o vectores de Clec4b2/Fc^ERl^Yde rata (pCN834 y pCN844) en relaciones molares 1:1:1. A los 3 días después de la transfección, las células se recogieron y se tiñeron con el mAb principal hu24F4 H4/L1 C95A en un ensayo de unión de FACS directo de titulación de dilución, separándose con células positivas para EGFP in vivo. Aunque se observó una unión de alta afinidad por hu24F4 a la superficie de BDCA2 humano, no se detectó unión a la superficie de Clec4b2 de rata. Esto indica que hu24F4 no tiene reactividad cruzada con el homólogo de rata más cercano del BDCA2 humano.

Ejemplo 32. La administración de BIIB059 a monos cynomolgus sanos da como resultado la pérdida de BDCA2 de la superficie de las células dendríticas plasmocitoides, probablemente por internalización

Para evaluar si los niveles de superficie de BDCA2 cambiaron tras la administración de BIIB059 a monos cynomolgus, se usaron dos ensayos. El primer ensayo, el llamado procedimiento "directo", detecta BIIB059 unido a la superficie con un anticuerpo secundario anti-humano marcado con p E. Idealmente, se usaría un anticuerpo no de bloqueo no cruzado para BDCA2 para detectar BDCA2 total; sin embargo, tal anticuerpo no existe. Por lo tanto, en el segundo ensayo, el llamado procedimiento "indirecto", el BDCA2 desocupado se detecta mediante la adición de BIIB059 conjugado con A647.

Antes de la administración de cualquier artículo de prueba, para cada mono cynomolgus, la intensidad de fluorescencia media (MFl) máxima para la unión de BIIB059 a las pDC se estableció en 3 puntos de tiempo diferentes (semanas -3, -2 y -1 antes de la inyección única de BIIB059). En cada punto de tiempo, se añadió la titulación de BIIB059 sin marcar (concentración final de 40 a 0,04 pg/ml) a alícuotas de sangre, y se detectó BIIB059 usando un anticuerpo secundario marcado con PE (procedimiento "directo") o BDCA2 libre evaluado con BIIB059-A647 (procedimiento "indirecto"). Los valores máximos se tomaron de los valores en la meseta en cada ensayo (Figuras 24 y 25). La evaluación de los valores reveló una fluctuación muy modesta en la MFl máxima para cada mono cynomolgus, con más variación entre los monos cynomolgus, lo que demuestra que la densidad de BDCA2 en pDC en mono cynomolgus es variable (Tabla 2).

Tabla 2. Resumen de la unión CE50 promedio de BIIB059 a la superficie celular de BDCA2 en pDC en sangre entera de mono cynomolgus

Se extrajo sangre entera de doce monos cynomolgus, una vez por semana durante tres semanas en total. La sangre se incubó con diversas concentraciones de lgG1 humana de BIIB059 (0,04 a 40 ug/ml, curva de 6 puntos, diluciones 1:4 veces). Las pDC se identificaron usando citometría de flujo como CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, y se trataron con un secundario anti-lgG humano marcado con PE para detectar BIIB059 unido al receptor BDCA2 en pDc. El MFl de PE se calculó con el software FlowJo, y las curvas de CE50 se generaron en el software GraphPad Prism.

Después de la administración del vehículo, no se encontró BIIB059 como se esperaba, y no se encontró ningún cambio significativo en los niveles de BDCA2 según se evaluó mediante la unión de BIIB059-A647 (10 pg/ml) (Figura 26).

Después de la administración intravenosa (IV) de BIIB059 a 10 mg/kg o 1 mg/kg, no se detectó BIIB059 en la superficie, incluso tan pronto como después de 1 hora de la inyección de BIIB059 (Figuras 27 y 28). Además, no hubo BDCA2 libre según lo evaluado por la falta de BIIB059-A647 durante 38 días para todos los monos cynomolgus tratados, con la excepción del mono cynomolgus 5; las concentraciones séricas en este mono cynomolgus disminuyeron rápidamente el día 10, probablemente debido a la inmunogenicidad desarrollada contra BIIB059.

Después de la administración subcutánea de una dosis más baja de BIIB059 (0,2 mg/kg), se observó brevemente BIIB059 en la superficie de las pDC (en 1 hora, desapareció a las 6 horas). En el mismo punto de tiempo (1 h), se observó cierto BDCA2 libre (13 %, 74 %, 72 % de MFI de valor basal). Nuevamente, no se detectó ningún fármaco durante el resto del estudio, y no se detectó ningún receptor BDCA2 libre hasta el día 14 después de la inyección de BIIB059 (Figura 29). En todos los monos cynomolgus, la reaparición de BDCA2 libre coincidió con una caída en los niveles de fármaco en suero por debajo de 1 pg/ml (Figuras 30 y 31). Por lo tanto, 1 pg/ml parece ser la concentración mínima de BIIB059 necesaria para mediar en la internalización de toda la superficie de BDCA2.

La tabla 3 resume la internalización de CE10, CE50 y CE90 del receptor BDCA2 en pDC tras el ligamiento con BIIB059 en sangre entera de mono cynomolgus. Las curvas de EC10-50-90 se generaron en el software GraphPad Prism utilizando un r r m r .

Para resumir, los experimentos descritos en este ejemplo muestran que: la administración IV in vivo de dosis altas (10 y 1 mg/kg) de BIIB059 condujo a la desaparición rápida de BDCA2 disponible y del fármaco unido de la superficie celular, lo que sugiere la internalización del receptor. La administración subcutánea de una dosis baja (0,2 mg/kg) de BIIB059 resultó en una detección muy transitoria (en 1 h) de BIIB059 en la superficie de pDC. A las 6 horas, no se detectó BIIB059 en la superficie celular de pDC. La reaparición de BDCA2 disponible en la superficie celular se produjo cuando la exposición al fármaco disminuyó por debajo de 1 pg/ml.

Ejemplo 33: BIIB059 inhibe los mediadores proinflamatorios además de todos los tipos de IFN tipo I

El ligamiento de BDCA2 suprime la capacidad de las pDC para producir IFN tipo I en respuesta a los ligandos de TLR (véase la Figura 16). Para confirmar la actividad inhibitoria del mAb anti-BDCA2, BIIB059, se estimularon pDC purificadas de donantes humanos sanos con el ligando sintético TLR9, CpG-A, en presencia de 10 pg/ml de BIIB059 o mAbs de control de isotipo. Específicamente, las pDC de donantes sanos humanos se aislaron usando un procedimiento de separación de microesferas magnéticas de dos etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). 5 x104 pDC purificadas humanas/pocillos se dejaron sin tratar (medio) o se estimularon con 1 pM de ligando de TLR9 (CPG-A) en presencia de 10 pg/ml de BIIB059 (CpG-A BIIB059) o control de isotipo (CpG-A Iso). Las placas que contenían pDC se incubaron durante 18 horas a 37 y se recogieron los sobren adantes para su uso en ensayos ELISA o multiplex para medir las concentraciones de citocinas y quimiocinas inflamatorias. Estos experimentos mostraron que BIIB059 inhibía potentemente el IFNa inducido por TLR9 y otras citocinas derivadas de pDC como TNFa e IL-6, así como las quimiocinas inducidas por TLR-9 como CCL3, CCL4, CCL5 (Figura 32).

También se investigó la capacidad de BIIB059 para inhibir la producción de IFNa y mediadores proinflamatorios después de la estimulación con un ligando fisiológicamente relevante, complejos inmunitarios. Específicamente, los complejos inmunitarios (IC) Sm/RNP se preformaron mezclando sm-RNP de timo de ternero y anticuerpos purificados anti-RNP en suero de pacientes con LES durante 1 h en medio sin suero. Las pDC de donantes sanos humanos se aislaron usando un procedimiento de separación de microesferas magnéticas de dos etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec). 5 x104 pDC/pocillo se dejaron sin tratar (medio) o se estimularon con IC Sm/RNP preformado en presencia de 10 pg/ml de BIIB059 (IC BIIB059) o control de isotipo (IC Iso). Las placas que contenían pDC se incubaron durante 18 horas a 37 y se recogieron los sobrenadantes para su uso en ensayos ELISA o multiplex para medir las concentraciones de citocinas y quimiocinas inflamatorias. Estos estudios mostraron que BIIB059 inhibía potentemente el IFNa inducido por complejos inmunitarios Sm/RNP y otras citocinas derivadas de pDC como TNFa e IL-6. BIIB059 también inhibió las quimiocinas inducidas por los complejos inmunitarios Sm/RNP, como CCL3 y CCL4 (Figura 33).

Ejemplo 34: BIIB059 inhibe la transcripción inducida por IC Sm/RNP de subtipos de IFN tipo I por pDC humanas purificadas

Trece subtipos de IFNa y un solo miembro de IFNp existen en humanos. El efecto de BIIB059 sobre la transcripción de los subtipos de IFN tipo I en pDC estimuladas con IC Sm/RNP de donantes humanos sanos se evaluó mediante ensayos cualitativos de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR).

Los complejos inmunitarios (IC) Sm/RNP se preformaron mezclando sm-RNP del timo de ternero y anticuerpos anti-RNP purificados de sueros de pacientes con LES durante 30 minutos en medio sin suero. Las pDC de donantes sanos humanos se aislaron usando un procedimiento de separación de microesferas magnéticas de dos etapas (kit MACS, Miltenyi Biotec).

7,5 x105 pDC humanas purificadas/pocillos se dejaron sin tratar (Medio) o se estimularon con IC Sm/RNP preformado en presencia de 10 pg/ml de BIIB059 (IC BIIB059) o control de isotipo (IC Iso). Las placas que contenían pDC se incubaron durante 16 horas a 37 y 5 % de CO2. Se recogieron células pDC y se aisló el ARN de pDC para evaluación en la reacción qPCR.

Este experimento mostró que el tratamiento con BIIB059 inhibía el nivel de transcrito de todos los subtipos de IFN de tipo I probados (Figura 34).

Ejemplo 35: BIIB059 inhibe la producción de IFNa inducida por TLR9 por PBMC humana de donantes sanos y pacientes con LES

Las pDC son las principales productoras de IFN en respuesta a la estimulación TLR7 y TLR9. Las pDC pueden producir mil veces más IFN que cualquier otro tipo de célula. Este experimento investiga si BIIB059 podría inhibir la producción de IFNa inducida por ^tLR9 en cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) sin la necesidad de aislamiento de pDC. Las PBMC de donantes humanos sanos o pacientes con LES se estimularon con 1 o 5 pM del ligando de TLR9 (CpG-A) y se trataron con concentraciones de BIIB059 que varían de 10 pg/ml a 2 ng/ml en un volumen de ensayo total de 250 pl/pocillo. Las placas se incubaron durante la noche (18 horas) a 37 y 5 % de CO2. Los sobre nadantes se recogieron para su evaluación en ensayos de ELISA de IFNa.

Este experimento mostró que BIIB059 inhibía la producción de IFNa inducida por TLR9 por PBMC de donantes sanos con una CI50 promedio de 0,04 /- 0,05 pg/ml (Figura 35A y 35C). BIIB059 mostró una potencia similar en la inhibición de la producción de IFNa inducida por t LR9 por PBMC de pacientes con LES con una CI50 promedio de 0,03 /- 0,01 pg/ml (Figura 35B y 35C).

Ejemplo 36: BIIB059 inhibe la producción de IFNa en sangre entera estimulada con el ligando de TLR9

La actividad de BIIB059 también se evaluó en análisis de sangre entera (WBA, por sus siglas en inglés). La sangre entera de donantes humanos sanos se estimuló con ligando de TLR9 en presencia de concentraciones crecientes de BIIB059 y se calculó la inhibición de la CI50 para cada donante individual. Específicamente, se incubó sangre entera de donantes humanos sanos con concentraciones crecientes de BIIB059 que variaban de 10 pg/ml a 2 ng/ml o control de isotipo en un volumen de ensayo total de 200 pl/pocillo. Se añadió CpG-A a 75 pg/ml (cuadrado abierto), que se determinó que era óptimo para la estimulación de la producción de IFNa en sangre entera. Las placas se incubaron durante 18 horas a 37 y se recogieron los sobrenadantes para su uso en ensayos de ELISA de IFNa (PBL InterferonSource).

BIIB059 mostró una inhibición dependiente de la dosis de la producción de IFNa inducida por TLR9 en análisis de sangre entera y exhibió una CI50 similar a la observada con cultivos de PBMC (Figura 36).

Ejemplo 37: BIIB059 no inhibe la producción de IFNa inducida por TLR3 por PBMC humana de donantes humanos sanos

Este experimento se realizó para determinar si otros tipos de células activados con diferentes ligandos de TLR todavía pueden producir IFN tipo I incluso en presencia de BIIB059. TLR3 no se expresa en pDC y, por lo tanto, el ligando de TLR3 no induce la producción de IFN por pDC. Las PBMC de donantes sanos humanos fueron estimuladas con poli:IC, que es un ligando de TLR3 que puede inducir potentemente IFN tipo I predominantemente por monocitos. Específicamente, las PBMC de donantes humanos sanos se estimularon con 1 pM del ligando de TLR3 (Poli I:C) y se trataron con concentraciones de BIIB059 que varían de 10 pg/ml a 0,5 ng/ml en un volumen de ensayo total de 250 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante la noche (18 horas) a 37 y 5 % de CO2. Se reco gieron 200 pl de los sobrenadantes para la evaluación de los niveles de IFNa por ELISA. Como se muestra en la Figura 37, BIIB059 no impactó en la producción de IFNa inducida por TLR3 por PBMC de donantes humanos sanos.

Para resumir, los Ejemplos 33-37 muestran que BIIB059 puede inhibir potentemente el interferón tipo I estimulado por TLR 9 mediante pDC purificadas, PBMC y hemocultivos enteros. BIIB059 es igualmente potente para inhibir el interferón tipo I inducido por TLR9 por las pDC de donantes humanos sanos y pacientes con LES. Además de inhibir el IFN tipo I, BIIB059 puede inhibir la producción de otras citocinas y quimiocinas derivadas de pDC. BIIB059 inhibe específicamente el IFN tipo I inducido por TLR9 por pDC y no afecta a la producción de IFN por otros tipos de células activadas con un ligando de TLR diferente. Por lo tanto, los datos in vitro proporcionados en esta solicitud respaldan la actividad farmacológica y la potencia de BIIB059 además de su especificidad para IFN tipo I inducida por TLR7/9 por pDC.

Ejemplo 38: BIIB059 media la internalización de BDCA2 en pDC humanas

Para determinar si BIIB059 induce la internalización de BDCA2, se incubó sangre entera humana de 10 donantes humanos sanos con concentraciones crecientes de BIIB059 a 37 °C durante 16 horas. El resto de la superficie celu lar de BDCA2 se detectó usando un mAb anti-BDCA2 de bloqueo no cruzado marcado con FITC (clon 2D6).

Específicamente, se incubó sangre entera de 10 donantes humanos sanos con concentraciones crecientes de BIIB059 o 10 pg/ml de anticuerpo de control de isotipo durante 16 horas a 37 °C y 5 % de CO2 y luego se incubó d urante 30 minutos a 4 °C con mAb anti-BDCA2 de bloqueo no cruzado marcado con FITC (clon 2D6), anti-HLA-DR, anti-CD123, anti-CD14 y anti-CD20. Luego se incubó sangre entera durante 30 minutos a 4 °C con 50 |jl de una solución de tinción, que incluía los siguientes mAbs: MAb anti-BDCA2 de bloqueo no cruzado marcado con FⁱT^c(clon 2D6), anti-HLA-DR, anti-CD123, anti-CD14 y anti-CD20. Los glóbulos rojos (RBC) se lisaron usando 1X tampón de lisis/fijación (BD Bioscience).

Como se muestra en la Figura 38, BIIB059 condujo a una disminución dependiente de la dosis en la intensidad de la tinción 2D6 marcado con FITC con una CE50 promedio de 0,017 ± 0,005 jg/ml.

Ejemplo 39: BDCA2 se internaliza rápidamente tras el ligamiento con BIIB059

Para determinar la cinética de la internalización de BDCA2 inducida por BIIB059, se incubó sangre entera humana con diferentes concentraciones de BIIB059 a 37 °C durante varios períodos. Específicamente, la sangre entera se trató con 10,1,0,1 o 0,01 jg/ml de BIIB059 o un anticuerpo de control de isotipo (10 jg/ml) a 37 durante los períodos indicados. Luego se incubó la sangre entera durante 30 minutos a 4 con 50 j l de una solución de tinción que in cluía los siguientes mAbs: MAb anti-BDCA2 de bloqueo no cruzado marcado con FITC (clon 2D6), anti-HLA-DR, anti-CD123, anti-CD14 y anti-CD20. Los glóbulos rojos (RBC) se lisaron y se fijaron usando 1X tampón de lisis/fijación (BD Bioscience). Como se muestra en la Figura 39, tras la incubación con BIIB059 a 1 jg/ml, la intensidad de la tinción 2D6 marcado con FITC disminuyó rápidamente alcanzando niveles de fondo en un plazo de una hora de incubación. La incubación con una concentración de BIIB059 diez veces menor (0,1 jg/ml) retrasó la internalización de BDCA2 en 2 horas. Estos datos muestran que la tasa de internalización de BDCA2 depende de la dosis de BIIB059.

Ejemplo 40: BIIB059 induce la internalización de BDCA2 en células dendríticas plasmocitoides humanas Para visualizar la internalización de BDCA2 después del ligamiento con BIIB059, las pDC purificadas se incubaron con BIIB059 marcado con A647 y se analizaron por microscopía confocal. Como se esperaba, BDCA2 se localizó en la superficie celular de pDC a 4 C. Después de una co rta incubación a 37 °C, se detectó claramente BDCA2 d entro de las células (Figura 40).

Ejemplo 41: La internalización no altera la inhibición mediada por BIIB059 de la producción de IFN-a

Este experimento investigó si la internalización de BDCA2 altera la capacidad de BIIB059 para inhibir la producción de IFNa inducida por TLR9 por pDC. Las células se incubaron previamente con BIIB059 a 37 °C durante varios perí odos correspondientes a la internalización máxima de BDCA2 y luego se estimularon con ligando de TLR9 durante 18 horas adicionales. Específicamente, se recogió sangre entera de sangre venosa heparinizada de donantes sanos y se incubó previamente con BIIB059 o anticuerpo de control de isótopos durante la duración indicada. En cada punto de tiempo después de la preincubación, las células se estimularon con 200 jg/ml de ligando de TLR9 (CpG-A) y se incubaron durante 18 horas adicionales a 37 °C. Los sobrenadantes se recogieron para su uso en ensayos de ELISA de IFNa (PBL InterferonSource). Como se muestra en la Figura 41, la preincubación con BIIB059 (hasta 9 horas) no alteró la capacidad de BIIB059 para inhibir la producción de IFNa inducida por TLR9 en análisis de sangre entera de donantes humanos sanos. Estos datos sugieren que la internalización de BDCA2 podría ser necesaria para la inhibición de la señalización de TLR9.

Ejemplo 42: La CE50 de la internalización de BDCA2 mediada por BIIB059 en pDC se correlaciona con la CI50 de la inhibición mediada por BIIB059 de IFNa inducida por TLR9 por pDC en ensayos de sangre entera

Para explorar más a fondo el vínculo entre la internalización de BDCA2 y la inhibición de la señalización de TLR9, se comparó la potencia de la internalización mediada por BIIB059 de BDCA2 en pDC y la inhibición de la producción de IFNa mediada por TLR por pDC en 10 donantes humanos sanos.

Para evaluar la internalización de BDCA2 mediada por BIIB059, se incubó sangre entera con BIIB059 durante 16 horas. Luego se recogió la sangre entera, se lisó y se evaluó la expresión de BDCA2 mediante citometría de flujo usando el anticuerpo 2D6 de bloqueo no cruzado conjugado con FITC. Para evaluar la inhibición mediada por BIIB059 de IFNa inducida por TLR9 por pDC, se incubó sangre entera con concentraciones crecientes de BIIB059 durante 16 horas en presencia de un ligando de TLR9. Los sobrenadantes fueron cosechados y evaluados para IFNa por ELISA. La CE50 de la internalización de BDCA2 mediada por BIIB059 fue de 0,02 jg/ml. La CI50 de la inhibición mediada por BIIB059 del IFNa inducida por TLR9 fue de 0,07 jg/ml. Se observó una correlación entre la CE50 de la internalización mediada por BIIB059 de BDCA2 y la CI50 de la inhibición de IFNa de BIIB059 con un valor R cuadrado de 0,57 (Figura 42).

o 43: La activación de TLR9 induce la colocalización de BDCA2 con TLR9 y con el marcador lisosomal

Para probar la hipótesis de que la inhibición de TLR9 mediada por BIIB059 requiere la internalización y localización de BDCA2 en compartimentos endosómicos/lisosómicos que contienen TLR9, se usó microscopía confocal para seguir la distribución intracelular de BDCA2 después del ligamiento BIIB059. Las pDC humanas purificadas se cultivaron durante 7 días y se incubaron con BIIB059 marcado con A647 durante 15 minutos a 37 °C. Durante los últimos 10 min utos de la incubación, las células se trataron con 1 pM del ligando de TLR9 CpG-A o se dejaron sin tratar. Las células se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia para TLR9 y el marcador endosómico/lisosómico tardío, LAMP1, y se analizaron por microscopía confocal.

TLR9 se reclutó a un compartimento endosómico/lisosómico tardío después de la estimulación con el ligando de TLR9, como lo demuestra el aumento de la colocalización de TLR9 con LAMP1 (Figura 43). La estimulación con TLR9 también aumentó significativamente la fracción de colocalización de BDCA2 con TLR9 y LAMP1. Estos resultados sugieren que BIIB059, cuando se une a BDCA2, se localiza preferentemente en compartimentos intracelulares en los que está presente TLR9 activado.

En resumen, los Ejemplos 38-43 muestran que BIIB059, un anticuerpo monoclonal humanizado contra BDCA2, compromete a BDCA2 y conduce a su internalización. Tras la estimulación, BDCA2 se colocaliza con TLR9 en el compartimento endosómico/lisosómico en el que media la inhibición de la señalización de TLR9. Estos datos sugieren que la internalización de BDCA2 es una etapa necesaria para mediar la inhibición de los mediadores proinflamatorios inducidos por TLR9 por las pDC.

Ejemplo 44: Efecto de BIIB059 en los niveles de CD62L

Las pDC circulantes expresan altos niveles de CD62L (L-selectina) y albergan tejido linfoide que contiene vénulas endoteliales altas (HEV, por sus siglas en inglés). PNAd es un ligando para CD62L que se expresa de manera constitutiva en HEV y media el retorno al lugar habitual de las células que expresan CD62L al tejido linfoide organizado. Se encontró que PNAd se expresaba por células endoteliales dérmicas en lesiones de eritematosis de lupus cutáneo. En virtud de su expresión de CD62L, las pDC podrían reclutarse para tejidos periféricos inflamados que expresan PNAd.

Para determinar si BIIB059 impacta en la expresión de CD62L en la superficie de las pDC humanas, se trató sangre entera con concentraciones variables de BIIB059 durante 1 hora a 37 °C sin estimulación. Específicamente, la s angre entera de donantes humanos sanos se trató con concentraciones crecientes de BIIB059 durante 1 hora a 37 °C y 5 % de CO2. El MFI de CD62L se determinó separando las pDC según lo definido por CD14-, CD20-, HLA-DR y CD123+.

BIIB059 causó una disminución dependiente de la dosis en la expresión de CD62L en la superficie de las pDC humanas según lo evaluado por citometría de flujo (Figura 44). La estimulación de pDC con ligando de TLR no tuvo impacto en la expresión de CD62L (Figura 44A).

Ejemplo 45: El tratamiento de PBMC con GM6001 inhibe la eliminación de CD62L mediada por BIIB059 de la superficie de pDC humanas

Se sabe que las metaloproteinasas inducen la eliminación de CD62L de la superficie de las células inmunitarias. Para investigar si las metaloproteinasas están involucradas en la disminución mediada por BIIB059 de CD62L superficial, se prepararon PBMC de donantes humanos sanos y se pretrataron con GM6001 (un inhibidor de metaloproteinasas) durante 30 minutos a 37 °C y 5 % de CO2, seguido de la adición de 10 pg/ml de BIIB059 durante 1 hora. La expresión superficial de CD62L se analizó por citometría de flujo. GM6001 inhibió el CD62L de modulación descendente mediada por BIIB059 de una manera dependiente de la dosis (Figura 45). Estos datos sugieren que BIIB059 induce la eliminación de CD62L de una manera dependiente de metaloproteinasa.

En resumen, los Ejemplos 44 y 45 muestran que BIIB059 disminuye la expresión de CD62L en la superficie de las pDC humanas. La baja modulación de CD62L mediada por BIIB059 es inhibida por el inhibidor de metaloproteinasas (GM6001), lo que indica que BIIB059 induce la eliminación de CD62L de la superficie de las pDC humanas a través, al menos en parte, de la activación de metaloproteinasas. Por lo tanto, se espera que el tratamiento con BIIB059 reduzca o impida el tráfico de pDC a órganos específicos en LES.

Ejemplo 46: Impacto de la región Fc de BIIB059 en la producción de IFN mediada por complejos inmunitarios por células dendríticas plasmocitoides

El receptor Fc gamma IIA (CD32a) es una proteína de la superficie celular que se une a la IgG con baja afinidad. Las células dendríticas plasmacitoides humanas expresan exclusivamente el receptor Fc gamma IIA, CD32a. Se ha demostrado que la estimulación de pDC con complejos inmunitarios depende de CD32. Los complejos inmunitarios son internalizados por CD32 y estimulan el TLR7/9 endosómico para inducir la producción de IFN por pDC.

Para determinar el efecto de BIIB059 sobre la expresión superficial de CD32a, las pDC aisladas se trataron con concentraciones crecientes de BIIB059 o la forma aglicosilada del anticuerpo, 24F4-A, y se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las pDC se tiñeron luego con BDCA2 marcado con FITC y anti-CD32 marcado con PE (clon AT10) y la expresión de superficie de BDCA2 y CD32 se evaluó mediante citometría de flujo. BIIB059 y la versión aglicosilada, 24F4-A, fueron igualmente potentes en su capacidad para inducir la internalización de BDCA2 (Figura 46A). Solo BIIB059 fue capaz de inducir la modulación descendente de CD32 en la superficie celular de las pDC como lo indica la disminución dependiente de la dosis en la intensidad media fluorescente (MFI) de CD32 (Figura 46B-D). El tratamiento con control de isotipo competente efector no tuvo efecto sobre los niveles de superficie de CD32 (Figura 46). Estos datos indican que la modulación descendente mediada por BIIB059 de los niveles de CD32a en la superficie de las pDC es específica para la unión de la región Fc de BIIB059.

Para garantizar que la unión de la región Fc de BIIB059 no solo enmascara el epítopo de CD32 reconocido por el mAb anti-CD32 marcado con FITC, las pDC se trataron con 10 pg/ml de BIIB059 durante 1 hora a 4 °C o 37 °C y luego se tiñó con anti-CD32 marcado. Como se muestra en la Fig.46E, el tratamiento con BIIB059 a 4 °C no disminuyó el MFI de CD32, lo que indica que el tratamiento con BIIB059 no interfiere con la unión del mAb anti-CD32 marcado. El hecho de que la modulación descendente de CD32a ocurriera solo después de la incubación con BIIB059 a 37 °C sugiere que CD32a podría perderse de la superficie celular de las pDC.

Para determinar si la modulación descendente de CD32a por BIIB059 tiene un impacto biológico, las pDC se incubaron en presencia de concentraciones crecientes de BIIB059 o la forma aglicosilada, 24F4A-Agli, y se estimularon con complejos inmunitarios o el ligando sintético de TLR9 (CPG-A). Como se esperaba, BIIB059 y 24F4A-Agli no se distinguían en su capacidad para inhibir el IFNa inducido por CPG-A por pDC, que es independiente de CD32 (Figura 47A). Hubo una clara separación en potencia entre BIIB059 y 24F4A-agli cuando las pDC se estimularon con complejos inmunitarios. BIIB059 inhibió el IFNa inducido por inmunocomplejos con una CI50 de 0,04 en comparación con una CI50 de 1,4 pg/ml por 24F4A-Agli. (Figura 47B). Estos datos indican que BIIB059 modula de forma descendente CD32a en virtud de su Fc funcional y, por lo tanto, inhibe la estimulación de pDC por complejos inmunitarios.

Para confirmar que la modulación descendente de CD32a fue exclusiva de BIIB059, se investigó el efecto de un anticuerpo anti-CD40 completamente humanizado en los niveles de CD32 y la producción de IFNa mediada por inmunocomplejos por pDC. CD40 es una proteína de la superficie celular expresada en pDC. Un anticuerpo anti-CD40 con un Fc completamente funcional tiene la capacidad de captar CD40 y unirse a CD32 en la superficie de las pDC. El tratamiento con mAb anti-CD40 no tuvo efecto en la expresión superficial de CD32 y no tuvo un efecto significativo en la producción de IFNa a partir de pDC estimuladas por complejos inmunitarios (Figura 48A y B). La unión de anti CD40mAb se confirmó demostrando el acoplamiento máximo de CD40 en células tratadas con anti-CD40 (Figura 48C).

Como se mostró anteriormente, el ligamiento de BDCA2 con BIIB059 o la forma aglicosilada 24F4A-Agli conduce a la internalización del receptor y la inhibición del IFNa inducida por TLR9 por las pDC. En este estudio se muestra que BIIB059 provoca una modulación descendente de CD32a en pDC e inhibición de la producción de IFNa estimulada por inmunocomplejos por pDC de una manera dependiente de Fc. La modulación descendente de CD32a desencadenada por BIIB059 no es el resultado de cualquier anticuerpo con un Fc funcional que pueda unir una molécula de la superficie celular expresada en pDC. Este estudio destaca el potencial terapéutico novedoso de un mAb anti-BDCA2 competente efector, que puede amortiguar las respuestas de pDC a través de sus regiones Fab'2 y Fc, lo que conduce a una mayor eficacia.

Ejemplo 47: Interacción de BIIB059 con hidroxicloroauina (HCQ)

Los agentes antipalúdicos, como la hidroxicloroquina (HCQ), se han utilizado en el tratamiento del LES. Las pDC de pacientes con LES tratados con HCQ tienen una capacidad deteriorada para producir IFNa tras la estimulación con ligandos de TLR7 y TLR9. Dado que tanto BIIB059 como HCQ tienen un impacto sobre el IFNa inducido por TLR7/9 en pDC, se investigó si el efecto de BIIB059 y HCQ podría ser redundante.

Para abordar esta cuestión, las PBMC humanas se prepararon a partir de sangre de donantes sanos y se estimularon con ligandos de TLR7 o TLR9 en presencia de concentraciones variables de BIIB059 solo, HCQ solo o BIIB059 en combinación con HCQ. Los sobrenadantes se cosecharon después de 18 horas y se ensayaron para determinar IFNa por ELISA. La adición de HCQ aumentó la potencia de BIIB059 y condujo a un efecto inhibidor aditivo sobre la producción de IFNa inducida por TLR7 e TLR9 por PBMC de donantes humanos sanos. Estos datos demuestran que la actividad de BIIB059 y HCQ no son redundantes y destacan el beneficio terapéutico adicional de BIIB059 cuando se administra con compuestos antipalúdicos como HCQ.

Ejemplo 48: Efecto de BIIB059 sobre las pDC que expresan BDCA2 in vivo

El objetivo de este estudio fue determinar si la administración de BIIB059 al mono cynomolgus media el agotamiento de las pDC en la sangre periférica.

Se recogieron cuatro hemorragias de dosificación pre-BIIB059 a intervalos semanales de doce monos cynomolgus para establecer una frecuencia de pDC de referencia para cada animal (Tabla 3).

Tabla 3. Resumen de las frecuencias de pDC circulantes promedio en sangre entera de mono cynomolgus sano.

Se extrajo sangre entera de doce monos cynomolgus una vez por semana durante un total de cuatro semanas. Las pDC se identificaron usando citometría de flujo como CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. La pDC como porcentaje de las células CD20-CD14- se calculó con el software FlowJo.

En todos los análisis estadísticos, las frecuencias de pDC se transformaron logarítmicamente para reducir la asimetría (Figura 51). La distribución original de las frecuencias de pDC en el panel izquierdo de la Figura 51 estaba severamente sesgada a la derecha. Sin embargo, después de una transformación logarítmica, la distribución de las frecuencias de pDC transformadas (Figura 51, panel derecho) siguió aproximadamente una distribución normal. Estos datos transformados logarítmicamente se usaron para todos los procedimientos de análisis estadístico. La Figura 52 muestra los niveles de pDC en la escala logarítmica para cada mono cynomolgus durante cuatro puntos de tiempo antes de la inyección IV. Utilizando un modelo de efectos mixtos lineales con cuatro puntos de tiempo como factores fijos e intercepciones aleatorias para cynos, se concluyó que las medias geométricas de los porcentajes de pDC para todos los monos fueron iguales en los 4 puntos de tiempo previos a la dosis (Figura 53, valor de p para el tiempo basado en una prueba F: 0,67). Este análisis indicó que la media geométrica del porcentaje de pDC circulantes fue relativamente estable en el tiempo para los monos cynomolgus.

Nueve de estos doce monos cynomolgus se dividieron en 3 grupos (3/grupo) y se asignaron al azar para incluir una representación igual de la densidad de BDCA2 y el porcentaje de pDC en cada grupo. Los monos cynomolgus recibieron una inyección intravenosa única de cualquier vehículo (citrato de sodio), 10 mg/kg de BIIB059 o 1 mg/kg de BIIB059. La citometría de flujo se usó para identificar pDC circulantes en la sangre entera como CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, y la frecuencia de pDC (en la escala logarítmica) en cada punto de tiempo se representó gráficamente en el software R (Figura 54). Se ajustó un modelo de efectos mixtos lineales para registrar las frecuencias (pDC) utilizando intercepciones aleatorias para monos cynomolgus y efectos fijos para el grupo de dosis y el período de tiempo: 1 hora, 6 horas, 1-27 días y más de 28 días. Para evaluar si pDC cambió entre diferentes grupos de dosis en diferentes períodos de tiempo, un modelo preliminar también incluyó los términos de interacción para el grupo de dosis y diferentes períodos de tiempo. El valor p basado en la prueba F para probar todos los términos de interacción igual a 0 es 0,81, lo que indica que no hay diferencia para los cambios de pDC entre los diferentes grupos de dosis. Por lo tanto, el modelo ajustado final solo incluyó los efectos estadísticamente significativos para el período de tiempo y los factores del grupo de dosis (Tabla 4).

Tabla 4. Estimaciones del modelo ajustado para puntos de tiempo después de una única inyección intravenosa de BIIB059 o vehículo.

Estimaciones para los efectos fijos utilizando un modelo de efectos lineales mixtos utilizando intercepciones aleatorias para monos cynomolgus, y factores fijos para grupos de dosis y niveles de tiempo de 1 hora, 6 horas y más de 28 días, para el porcentaje de pDC circulante en la escala logarítmica antes y después de dosis de vehículo IV de citrato de sodio, BIIB059 a 1 mg/kg, o BIIB059 a 10 mg/kg en monos cynomolgus.

Las estimaciones de los parámetros para los factores fijos se expondrán para interpretarlos como las relaciones de las frecuencias de pDC en estos períodos de tiempo en comparación con la dosificación previa a BIIB059. En general, la relación fue significativamente menor que uno al comparar las frecuencias de pDC a 1 hora después de la inyección IV con las frecuencias de pDC previas a la dosis (CI del 95 %: 0,43-0,77, valor p: 0,0003). La relación fue significativamente mayor que la comparación de las frecuencias de pDC a las 6 horas después de la inyección IV con las frecuencias de pDC previas a la dosis (CI del 95 %: 1,18-2,12, valor p: 0,003). La relación no fue significativamente diferente de uno cuando se compararon las frecuencias de pDC 1-28 días después de la inyección IV con las frecuencias de pDC previas a la dosis. La relación fue significativamente menor que uno cuando se compararon las frecuencias de pDC después de 28 días después de la inyección IV con las frecuencias de pDC previas a la dosis (CI del 95%: 0,55-0,70, valor p: <0,0001). El modelo ajustado final se mostró en un gráfico en la Figura 55. Los resultados revelaron que hubo un agotamiento significativo in vivo de las pDC circulantes en monos cynomolgus en una 1 hora, un aumento significativo de las pDC circulantes a las 6 horas y un agotamiento significativo de las pDC circulantes después de 28 días después de la inyección IV, pero los cambios en el porcentaje de pDC a lo largo del tiempo fueron los mismos para todos los grupos de tratamiento.

Adicionalmente, después de completar los puntos de tiempo del estudio IV, tres de estos monos cynomolgus (4, 6 y 12) recibieron una dosis subcutánea única de BIIB059 a 0,2 mg/kg, para evaluar el efecto de una dosis más baja en las frecuencias circulantes de pDC. La frecuencia de pDC (en la escala logarítmica) en cada punto de tiempo se representó gráficamente en el software R (Figura 56). Se ajustó un modelo lineal de efectos mixtos, usando tiempo continuo y tiempo a 1 hora como factores fijos, y monos cynomolgus como intercepciones aleatorias. Los resultados se muestran en la tabla 5.

Tabla 5. Estimaciones del modelo ajustado para puntos de tiempo después de una sola inyección subcutánea de BIIB059.

Estimaciones para los efectos fijos usando un modelo de efectos mixtos lineales usando tiempo continuo y 1 hora como factores fijos, y monos cynomolgus como intercepciones aleatorias para el porcentaje de pDC circulante en escala lo arítmica, antes des ués de una in ección subcutánea única de BIIB059 a 0,2 m /k en monos c nomol us

Similar a los resultados anteriores, se observó un agotamiento significativo in vivo de las pDC circulantes en monos cynomolgus en 1 hora después de las inyecciones IV (CI del 95 %: 0,34-0,55, valor p <0,0001), pero la media geométrica del % de pDC para los tres monos cynomolgus aumentó constantemente a medida que aumentó el tiempo (CI del 95 %: 1,00-1,03 de cambio múltiplo por día, valor p <0,0001). El modelo ajustado se mostró en un gráfico en la Figura 57. En conclusión, estos datos muestran que BIIB059 no media un agotamiento sostenido de pDC en la sangre de monos cynomolgus cuando se administra a las dosis probadas. Esto probablemente se deba a la internalización de BDCA2. Ejemplo 49: La administración de BIIB059 a monos cynomolgus resulta en la inhibición de la producción de IFNa inducida por TLR9 en el ensayo de sanare entera ex vivo

El objetivo de este estudio fue determinar si BIIB059, cuando se administra a monos cynomolgus in vivo, podría alterar la producción de IFNa en respuesta a la estimulación de TLR9 en un análisis de sangre entera ex vivo (WBA).

Se evaluaron las vías de dosificación intravenosa y subcutánea para determinar su capacidad de impactar en la inducción de IFNa, que se midió utilizando el bioensayo MxA según el plan experimental descrito en la Figura 58. El ligando de TLR9 (CpG-A) indujo cantidades medibles de IFNa en hemocultivos enteros en todos los puntos de tiempo y en todos los monos cynomolgus, mientras que no se detectó IFNa en los cultivos tratados con PBS de control (datos no mostrados). Para los monos cynomolgus dosificados por vía intravenosa, los valores de IFNa después del tratamiento se calcularon como porcentajes de la media previa a la dosis para cada animal. Los datos de hemorragias después del día 14 se excluyeron del análisis ya que el análisis de sangre entera no se realizó para el grupo BIIB059 a 10 mg/kg después de este punto de tiempo. Se observó una tendencia hacia un % de IFNa reducido en relación con la media previa a la dosis varios días después de la administración del fármaco en los grupos de dosificación de 1 mg/kg y 10 mg/kg de BIIB059 en comparación con el grupo de vehículo (Figura 59).

Se realizó un análisis más exhaustivo de los datos utilizando un análisis de varianza de efectos mixtos bidireccional (ANOVA) para estimar el IFNa medio y las diferencias posteriores versus previas para cada grupo de dosis en el estudio IV. Los datos durante las primeras 24 horas posteriores a la administración se excluyeron debido a una disminución observada en los porcentajes de células dendríticas plasmacitoides de sangre periférica. Los datos de hemorragias después del día 31 después de la dosis se excluyeron del análisis debido al retorno de la expresión de BDCA2 observado en este momento. Para el grupo de dosificación del vehículo, la media geométrica de IFNa fue de 362 unidades/ml (U/ml) antes de la dosis y 314 U/ml después de la dosis; para el grupo dosificado de 1 mg/kg, la media geométrica fue 399 U/ml antes de la dosis y 237 U/ml después de la dosis; para el grupo de 10 mg/kg, la media geométrica de IFNa fue de 211 U/ml antes de la dosis y 102 U/ml después de la dosis (Figura 4). Las diferencias posteriores-previas en la medio de log10 IFNa fueron de -0,061 (p = 0,511) para el grupo de vehículo, -0,226 (p = 0,016) para el grupo de 1 mg/kg y -0,317 (p = 0,004) para el grupo de 10 mg/kg. Después de la transformación anti-log10, estos resultados revelaron que el grupo de vehículo tenía 10A(-0,061)=87% (CI del 95 %: 57 %-133 %) de la concentración de IFNa posterior a la dosis en comparación con la dosis previa; el grupo de 1 mg/kg tuvo 10A(-0,226)=59 % (CI del 95 %: 39 %-91 %) de la concentración de IFN después de la dosis en comparación con la dosis previa; y el grupo de 10 mg/kg tuvo 10A(-0,317)=48 % (CI del 95 %: 29 %-79 %) de la concentración de IFN después de la dosis en comparación con la dosis previa (Figura 60). Para la cohorte de mono cynomolgus dosificado por vía subcutánea, se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con efectos aleatorios para estimar la media de IFNa y las diferencias posteriores versus previas para todo el grupo. Los datos durante las primeras 24 horas posteriores a la administración se excluyeron debido a una disminución observada en los porcentajes de células dendríticas plasmacitoides de sangre periférica. Los datos de hemorragias después del día 33 después de la dosis se excluyeron del análisis debido a la recuperación de la expresión de BDCA2 observada en este momento. Para el grupo dosificado por vía subcutánea, la media geométrica de IFNa fue de 1243 U/ml antes de la dosis y 812 U/ml después de la dosis, produciendo una relación posterior/previa del 65 %. Se estimó que la diferencia posterior-previa en el log 10 medio era -0,185 (p = 0,059) que, después de la transformación anti-log10, corresponde a 10A(-0,185) = 65 % de la media geométrica previa a la dosis; la CI del 95 % de este efecto es 41 %-102 % (Figura 61).

Como solo se utilizó un pequeño número de monos cynomolgus en el experimento, la concentración de IFNa determinada para cada mono influye mucho en los resultados para ese grupo. La proporción de variación debida a diferencias animales en el estudio intravenoso fue del 69 % de la variabilidad total, y el resto se debió principalmente a diferencias entre los puntos de tiempo dentro del mono cynomolgus (26 %), y una pequeña cantidad (<6 %) debido a fuentes de ensayo de variación. La variación entre los monos cynomolgus es mucho mayor que la variación entre los puntos de tiempo dentro de los monos cynomolgus, lo que sugiere que agregar monos cynomolgus a este experimento en lugar de más puntos de tiempo de sangrado potenciaría mejor el estudio. La proporción de variación debida a diferencias de mono cynomolgus en el estudio intravenoso fue del 45 % de la variabilidad total, y el resto se debió principalmente a diferencias entre los puntos de tiempo dentro del mono cynomolgus, y una pequeña cantidad (<2 %) debido a fuentes de ensayo de variación. La variabilidad observada entre los monos cynomolgus y dentro de los monos cynomolgus puede deberse a una serie de factores, incluidas las fluctuaciones en las condiciones fisiológicas de los monos cynomolgus, la composición celular de la sangre, la composición molecular de la célula y la precisión del ensayo funcional.

Si bien hubo cierta fluctuación en los porcentajes de células dendríticas plasmocitoides en cada animal a lo largo del tiempo, el % de pDC en la sangre no se vio afectado por el tratamiento con BIIB059 (Véase Rsch-2013-046) y no mostró una correlación constante con la producción de IFNa. Adicionalmente, se observó una pérdida rápida y sostenida de BDCA2 de la superficie celular en pDC después de la administración IV y SC de BIIB059, lo que sugiere un alto nivel de ocupación del receptor (Véase Rsch-2013-043).Teniendo en cuenta el alto nivel de variabilidad en la capacidad de respuesta de pDC de monos cynomolgus a la estimulación por TLR9, hubo una tendencia hacia respuestas de IFNa amortiguadas después de la administración intravenosa y subcutánea de BIIB059, con la mayor reducción en el grupo de dosificación IV de 10 mg/kg, seguido por el grupo SC de 0,2 mg/kg y luego el grupo IV de 1 mg/kg.

En conclusión, BIIB059 cuando se dosifica in vivo a los monos cynomolgus, mostró una tendencia hacia la producción inhibida de IFN inducida por TLR9 en un WBA ex vivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une al antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas (BDCA2) (SEQ ID NO: 1), donde el anticuerpo comprende un dominio pesado variable (VH) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y donde el anticuerpo comprende un dominio ligero variable (VL) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada de IgG1.

4. Un fragmento de unión a antígeno aislado que se une al antígeno 2 de células dendríticas sanguíneas humanas (BDCA2) (SEQ ID NO: 1), donde el fragmento de unión a antígeno comprende un dominio pesado variable (VH) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y donde el fragmento de unión a antígeno comprende un dominio ligero variable (VL) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

5. El fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 4, donde el fragmento de unión a antígeno es:

(a) un anticuerpo de cadena sencilla;

(b) un fragmento Fab;

(c) un fragmento F(ab')2;

(d) un fragmento Fab';

(e) un fragmento Fsc;

(f) un fragmento Fv;

(g) un scFv;

(h) un sc(Fv)2; o

(i) un diacuerpo.

6. Una célula aislada que produce el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o que produce el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.

7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio o una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto humano que lo necesite.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 8, donde:

(a) el trastorno inflamatorio se selecciona de entre el grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, lupus discoide, nefritis lúpica, lupus cutáneo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis sistémica (esclerodermia), psoriasis, diabetes tipo I, dermatomiositis y polimiositis;

(b) el trastorno inflamatorio es lupus moderado a severo con compromiso activo en el sistema nervioso central (SNC) y/o renal; o

(c) el trastorno inflamatorio es lupus moderado a severo sin compromiso en el sistema nervioso central (SNC) activo y/o renal.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 8, donde el trastorno inflamatorio es lupus eritematoso sistemático (LES).

11. Un procedimiento in vitro de producción del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o del fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, donde el procedimiento comprende:

(a) construir un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno;

(b) introducir el polinucleótido en un vector de expresión; y

(c) expresar el polinucleótido en una célula hospedadora.