JPH08511420A - 抗 体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、改変された補体結合能を有する抗体を提供する。本発明はさらに、該抗体を含有する薬剤用、治療用および診断用組成物、そして該抗体を用いる治療法および診断法に関する。さらに本発明は、該抗体を用いる細胞表面抗原の機能を調節する方法を提供する。また該抗体を調製する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体 発明の分野 本発明は、改変された抗体、該抗体を含有する薬剤組成物、治療用組成物およ び診断用組成物；該組成物の調製方法；該抗体を用いる治療方法および診断方法 、該抗体を用いる細胞表面関連抗原の機能の調節方法；該抗体をコードするＤＮ Ａ配列；該抗体をコードするＤＮＡ配列を含有するクローニングおよび発現ベク ター；該ベクターで形質転換された宿主細胞、および該抗体の調製方法に関する 。発明の背景 抗体が治療的に有効であるためには、有意な毒性作用を引き起こさずに必要な 生理学的作用を示すことが好ましい。このような毒性作用は、例えば補体結合に より媒介される。 同種の抗原（cognate antigen）に結合した抗体は、補体カスケードに結合し これを活性化することができる。補体は複雑な蛋白のシリーズよりなる。補体系 の蛋白は、相互に関連した２つの酵素カスケード（古典的経路と副経路と呼ばれ 、補体系の中心的反応であるＣ３の切断に至る２つの経路を提供する）を形成す る。古典的補体経路よりなる反応の順序は、認識、酵素活性化、および膜の攻撃 であり、細胞の死に至る。補体系の認識単位は、Ｃ１複合体である。Ｃ１補体蛋 白複合体は、Ｃ３転換に至る古典的補体カスケードのユニークな特徴である。Ｃ １ｑ亜成分が免疫グロブリン抗原免疫複合体に直接結合すると、補体結合が起き る。補体結合が起きるか否かは、いくつかの制約に依存する。例えば、免疫グロ ブリンのあるサブクラスのみが、最適な条件下で補体に結合することができる。 これらは、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＭであり、マウス ではＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＭである。 Ｃ１ｑ分子は、免疫グロブリンの補体結合部位への結合に関して多価の能力を 有する。ＩｇＧのＣ_H２ドメインとＩｇＭのおそらくＣ_H４ドメインが、Ｃ１ｑへ の結合部位を有する。 Ｆｃを有する細胞も、関係するクラスの抗体でコートされた標的細胞に結合し 、これをオプソニン化、食菌または死滅させることにより、免疫応答の効果を増 強する役割を果たす。齧歯類およびヒトの白血球について、３つのＩｇＧ結合受 容体（ＦｃγＲ）が記載されている。ＦｃγＲＩは、モノマーＩｇＧに対して強 い親和性を有し、ＦｃγＲIIとＦｃγＲIIIは、モノマーＩｇＧに対する親和性 は弱く、主に抗原と複合体を形成したＩｇＧと相互作用をする。Ｆｃ受容体の存 在はこれらの免疫細胞に、液性応答のエフェクター相で重要な多くのエフェクタ ー機構を媒介する能力を与える。 ヒトＩｇＧのガンマ１イソタイプは、ＩｇＧ３のようにＦｃＲＩに結合し、そ の同種抗原と複合体を形成した時、補体を活性化し、ＦｃＲIIやＦｃＲIIIに結 合する。逆にヒトＩｇＧ２やＩｇＧ４は比較的不活性なイソタイプであり、いず れも古典的補体経路を活性化せず、そしてＩｇＧ４はＦｃＲＩに弱く結合する［ バートン・ディー・アールとウーフ・ジェイ・エム（Burton，D R and Woof，J M）、（1992），Adv．Immunol．51，１。ルキサノ・バリム・ワイ・エムとラッ クマン・ピー・ジェイ（Lucisano Valim，Y M and Lachmann，P J．（1991），C lin．exp．Immunol．84，１］。 ヒトＩｇＧのＣ_H２ドメインでＦｃＲＩと相互作用するＩｇＧのアミノ酸残基 の局在は、十分確立されている［ウーフ・ジェイ・エム（Woof，J M）ら（1986 ）Molec．Immunol．23，319。ルンド・ジェイ（Lund J）ら（1991）J Immunol， 147，2657；キャンフィールド・エス・エムとモリソン・エス・エル（Canfie1d ，S M and Morrison，S L）（1991），J．exp．Med．173，1483；チャペル・エ ス・エム（Chappel，S M）ら（1991）Proc．Natl．Acd．Sci．88，9036；チャペ ル・エス・エム（Chappel，S M）ら（1993），J．Biol．Chem268，25124；アレ グレ・エム・エル（Alegre，M-L）ら（1992）J．Immunol．148，3461］。ＦｃＲ Ｉに充分結合する異なる種およびサブクラスの抗体のＣ_H２ドメインのアミノ酸 配列の比較は、残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９よりなるＣ_H２のＮ−末端の領 域（カバト（Kabat）のEu番号付け法を使用［カバト・イー・エー（Kabat，E A ）ら（1987）、免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of proteins of Imm unological interest）、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒュー マン・サービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）、ベセスダ（B ethesda）、メリーランド州、米国］が、ＦｃＲＩとの相互作用に決定的に重要 であることを示唆した。ＦｃＲＩに対して強い親和性を有するすべてのＩｇＧイ ソタイプには、モチーフＬｅｕ２３４，Ｌｅｕ２３５，Ｇｌｙ２３６，Ｇｌｙ２ ３７，Ｐｒｏ２３８，Ｓｅｒ２３９が存在する［ウーフ・ジェイ・エム（Woof， J M）ら（1986）Molec．Immunol．23，319］。異なるＦｃエフェクター機能を有 する免疫グロブリン間のドメインの交換により、ＦｃＲＩ結合に対するＣ_H２（ 特に残基２３５）の重要性が証明された［キャンフィールド・エス・エムとモリ ソン・エス・エル（Canfield，S M and Morrison，S L）（1991），J．exp．Med ．173，1483；チャペル・エス・エム（Chappel，S M）ら（1991）Proc．Natl．A cd．Sci．88，9036；チャペル・エス・エム（Chappel，S M）ら（1993），J．Bi ol．Chem268，25124］。２３５位でＬｅｕ残基をＧｌｕで置換すると、ＦｃＲＩ に対するＩｇＧ３の親和性が１００倍低下する［ルンド・ジェイ（Lund J）ら（ 1991）J Immunol，147，2657；キャンフィールド・エス・エムとモリソン・エス ・エル（Canfield，S M and Morrison，S L）（1991），J．exp．Med．173，148 3］。ＯＫＴ３のＩｇＧ４変種で同じＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変更を行う［ アレグレ・エム・エル（Alegre，M-L）ら（1992）J．Immunol．148，3461］と、 ＦｃＲＩ結合がなくなり、従ってその分裂促進性が なくなった。 ＦｃＲIII結合に対する配列の必要条件はあまり研究されていないが、サーメ イ（Sarmay）ら［（1992）Molec．Immunol．29，633］は、すべての３つのＦｃ 受容体へのＩｇＧ３の結合には、Ｃ_H２ドメインの残基２３４〜２３７が重要で あることを証明した。各残基の相対的重要性は各Ｆｃ受容体で異なり、ＦｃＲII I媒介細胞死滅には２３５と２３７が最も重要である。 これに対してもう１つのＦｃ介在機能であるＣ１ｑ結合と引き続く補体活性化 は、Ｃ_H２ドメインのカルボキシ末端側の半分を必要とするようである［タオ・ エム・エィチ、キャンフィールド・エス・エムおよびモリソン・エス・エル（Ta o，M H.，Canfield，S M.，and Morrison，S L）（1991）J．Exp．Med．173，10 25］。モリソン（Morrison）のグループは、ヒトＩｇＧのＣ_H２ドメインの多型 性をを配列解析して、Ｃ_H２のＣ−末端領域の重要性を証明した。ＩｇＧ１の３ ３１位のＰｒｏをＳｅｒへ変化させて、かれらは補体結合をなくし、Ｃ１ｑ結合 能を低下させた［タオ・エム・エィチ（Tao，J H）ら（1993），J．Exp．Med．1 78，661］。ＣＡＭＰＡＴＨ−１のドメイン間およびドメイン内スイッチ変種を 用いて、グリーンウッド（Greenwood）ら（1993）［Eur．J．Immunol．23，1098 ］は、さらにＣ_H２のＣ−末端の重要性を支持した。Ｎ−末端側の半分や他のド メインではなく、ただＣ_H２のカルボキシ末端により、ヒトＩｇＧ４へ補体結合 能が回復される。ダンカンとウィンター（Duncan and Winter）（1988）［Natur e，332，21］は、マウスＩｇＧ２ｂイソタイプのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０お よびＬｙｓ３２２のモチーフを同定した。これらの残基のいずれかを変化させる と、この領域の配列の競合的ペプチドを使用した場合と同じように、Ｃ１ｑ結合 能がなくなった。しかし補体結合をしない抗体においてもＣ１ｑモチーフ残基が 見いだされるため、これらの残基は補体活性化に必要であるが充分ではないかも 知れないことを示唆している。 本発明者らは、抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｌ２４３をベースとする作成した抗体（eng ineered antibody）の適合セット（matched set）を用いて、ヒトＩｇＧ１のＣ １ｑ結合およびＦｃＲ結合に必要なアミノ酸残基は、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端 領域（残基２３１〜２３８）に存在することを、見いだした。ＩｇＧ３およびＩ ｇＧ４のＣ_H２領域のロイシン２３５をグルタミン酸に変更すると、ＦｃＲＩ結 合能がなくなることはすでに公知であるが、本発明者らはＩｇＧ１においてもこ の事実を確認し、同時にヒト補体結合能はなくなるがＦｃＲIII介在機能は保持 されることを確認した。またＩｇＧ１の２３７位のグリシンをアラニンに変更し てもＦｃＲＩ結合能がなくなり、補体結合能とＦｃＲIII介在機能が低下した。 ２３３〜２３６の全領域を、ヒトＩｇＧ２に存在する配列と交換すると、ＩｇＧ １のＦｃＲＩ結合能と補体結合能がなくなり、ＦｃＲIII介在機能が低下した。 これに対して、前述のＣ１ｑ結合モチーフにおいて３２０位のリジンをアラニン に変更しても、ＩｇＧ１介在補体結合能には何の影響も与えなかった。 記載された部位Ｌｅｕ２３４−Ｌｅｕ２３５−Ｇｌｙ２３６−Ｇｌｙ２３７− Ｐｒｏ２３８−Ｓｅｒ２３９は、ＦｃγＲＩに強い親和性を有するすべてのＩｇ Ｇイソタイプに存在する。ＩｇＧ３抗体に対する最近の突然変異誘発実験におい て、この領域において点突然変異が導入され、突然変異体がＦｃＴＲＩと結合す ることができるか否かが試験されている［ルンド（Lund）ら（1991）J Immunol ，147，2657-2662］。最も顕著な効果は２３５位で見られ、天然に存在するＬｅ ｕ残基をＧｌｕ残基で置換するとＦｃγＲＩへの親和性が１００倍以上低下した 免疫グロブリンが得られる。 抗体の補体結合能への残基２３５の改変の効果に関する本発明者らの観察結果 は、きわめて驚くべきものである。以前の蛋白工学的研究では、ＩｇＧ上のＣ１ ｑ結合部位を見つけるために、種々の位置に突然変異が導入された［ダンカンと ウィンター（Duncan and W inter）（1988）Nature，332，738-740］。Ｃ１ｑの結合部位は、マウスＩｇＧ ２ｂのイソタイプの３つの側鎖（Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２ ２）に局在化された。残基Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２は、 すべてのヒトＩｇＧ、ラットＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ、マウスＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、モルモットＩｇＧ１およびウサギＩｇＧで保存され ている。 さらなる実験で、残基２３５が突然変異されたマウスＩｇＧ２ｂ抗体突然変異 体に対するヒトＣ１ｑの親和性は変化しない（すなわち、野生型と同じ範囲の値 である）ことが証明された。 本発明者らも観察したようにＩｇＧのＣ_H２領域の残基２３５を改変するとＦ ｃγＲＩ結合能がなくなるが、同時に補体結合能が実質的に低下するということ は、どこにも報告や示唆されておらず、まったく予想外のことであった。発明の要約 本発明は、未改変抗体（unaltered antibody）に比較して、抗体の補体結合能 が改変されていることを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１ つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変された改変抗体（altered antibody）を 投与することよりなる、抗体介在補体結合のため抗体療法が好ましくない毒性を 与える疾患の治療方法を提供する。 好適な実施態様において、改変抗体は１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ受容体 、特にＦｃＲIIIであり、ＦｃＲＩは除かれる、に結合し、すなわち、該抗体は ＦｃＲＩには有意に結合せず、さらに好ましくはＦｃＲＩにまったく結合しない 。 従ってさらに、本発明は、未改変抗体に比較して抗体の補体結合能が改変され ていることを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそ れ以上のアミノ酸残基が改変された改変抗 体を提供する。 従ってさらに好適な実施態様において、本発明は、未改変抗体に比較して抗体 の補体結合能が改変されており、かつ該抗体は１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ 受容体、特にＦｃＲIIIに結合するが、ＦｃＲＩには有意に結合しないことを特 徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ 酸残基が改変された改変抗体を提供する。 本発明の改変される抗体の定常領域は動物起源であり、好ましくはヒト起源で ある。これはまた任意のイソタイプであるが、好ましくはヒトＩｇＧであり、最 も好ましくはヒトＩｇＧ１である。 本発明の好適な実施態様において、改変されるアミノ酸残基は２３１〜２３９ 位のアミノ酸内、好ましくは２３４〜２３９内にある。 本発明の特に好適な実施態様において、改変されるアミノ酸残基はモチーフＬ ｅｕ２３４ Ｌｅｕ２３５ Ｇｌｙ２３６ Ｇｌｙ２３７ Ｐｒｏ２３８ Ｓｅｒ２ ３９内にある。 最も好適な実施態様において、改変されるアミノ酸残基は、Ｌｅｕ２３５およ び／またはＧｌｙ２３７である。発明の詳細な説明 本明細書において、補体を結合する抗体の能力に関連して使用される時「改変 された」という用語は、通常は出発抗体に比較して補体を結合する抗体の能力の 低下を意味する。改変すべき適当なアミノ酸を選択することにより（例えば、残 基Ｌｅｕ２３５を改変するように）、その補体結合能力が実質的に低下している 抗体を産生することができる。また、例えばアミノ酸残基Ｇｌｙ２３７を改変す ることにより、中程度の補体結合能を有する抗体を産生することもできる。 本明細書において、「補体結合を実質的に低下させる」という用語は、ヒト補 体結合が、野生型の未改変の出発抗体で見られるレベ ルの、好ましくは≦３０％、さらに好ましくは≦２０％、そして最も好ましくは ≦１０％であることを意味する。 ＦｃＲＩ結合に関して使用される時「有意に」という用語は、ＦｃＲＩへの抗 体の結合は、未改変抗体で見られるものの典型的には≦２０％、そして最も好ま しくは≦１０％であることを意味する。 野生型の未改変抗体の濃度の１０倍以下の濃度で、抗体依存性細胞障害（ＡＤ ＣＣ）を媒介する能力により測定すると、本発明の改変抗体は好ましくはＦｃＲ IIIに結合する。 ゲノムの主要組織適合遺伝子複合体の領域でコードされる蛋白は、免疫認識の 多くの面に関与している。すべての哺乳動物とおそらくすべての脊椎動物は、基 本的に同じＭＨＣ系を有し、免疫応答遺伝子がＭＨＣに連結していることは公知 である。 ヒトでは主要組織適合遺伝子複合体は第６染色体上のＨＬＡ遺伝子塊である。 主要な領域はＤ、Ｂ、ＣおよびＡである。Ｄ領域は、免疫系の細胞間の協同作用 と相互作用に関与するクラスII蛋白の遺伝子を含有する。多くの疾患が、ＨＬＡ 遺伝子塊のＤ領域に関連していることが見いだされている。今日までの研究で、 自己免疫疾患（例えば、ヨーロッパ特許第68790号を参照）を含む膨大な数の疾 患との関連が証明されている。ヨーロッパ特許第68790号は、ＭＨＣクラスII抗 原に特異的なモノクローナル抗体に調節される免疫応答を選択的に抑制すること により、ヒトのＨＬＡ−Ｄ領域のようなＭＨＣのある領域の特定の対立遺伝子（ allele）に関連する疾患を調節することを示唆している。 本発明者らは、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３５位でＭＨＣ−クラスII 特異抗体を改変することにより、免疫抑制性を完全に保持しているがインビトロ の毒性は低下しておりインビボの毒性は許容される抗体を産生することができる ことを見いだした。 さらに好適な実施態様において、本発明は未改変抗体に比較して、抗体の補体 結合能が改変されていることを特徴とする、抗体のＣ_H２ ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変された、Ｍ ＨＣ特異抗体を提供する。 好適な実施態様において、本発明は、抗体はＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の ２３５位で改変されていることを特徴とする、ＭＨＣ特異的モノクローナル抗体 を提供する。 ＭＨＣ特異的モノクローナル抗体のようなある例において、抗体のＣ_H２ドメ インのＮ−末端領域の改変は、補体結合能を改変しながら、追加的にＦｃＲＩ受 容体への結合を阻害することが好ましい。 抗体は好ましくは、ＭＨＣクラスII抗原に対して特異的であるが、Ｃ_H２ドメ インのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の改変のため、ＦｃＲ Ｉには有意に結合しないであろう。 さらなる好適な実施態様において、本発明の改変抗体または本発明の使用のた めの改変抗体は、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３５位で改変されているこ とを特徴とし、ＭＨＣクラスII抗原に向けられている。 特に好適な実施態様において、本発明の改変抗体または本発明の使用のための 改変抗体は、ＭＨＣクラスII抗原に向けられたものであり、該抗体はＣ_H２ドメ インのＮ−末端領域の２３５位で改変されており、未改変抗体に比較して抗体の 補体結合能が改変されており、そして該改変抗体は１つまたはそれ以上の細胞性 Ｆｃ受容体、特にＦｃＲIIIに結合し、ＦｃＲＩには有意に結合しないことを特 徴とする。 さらに本発明は、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上 のアミノ酸を改変し、未改変抗体と比較して該抗体の補体結合能を改変すること よりなる、補体結合能が改変された改変抗体の産生方法を提供する。 本明細書において「改変抗体」という用語は、抗体のＦｃ領域のＣ_H２ドメイ ンのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基で、野生型の未改変抗体 とは異なる抗体を意味するのに使用される。この改変は、例えば野生型の出発抗 体のアミノ酸を別のアミノ酸に より置換、またはアミノ酸残基を欠失させることよりなる。 本明細書において使用される残基の番号付けは、カバト（Kabat）ら［（1991 ）免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of Proteins of Immunological i nterest）、第５版、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン ・サービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）］の記載したEu指 標による。 ヒトのＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体において、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域 の２３５位の天然に存在するアミノ酸はロイシン残基である。２３５位のロイシ ンをグルタミン酸またはアラニンで置換する改変は、インビトロの毒性が最小で ありインビボの毒性は許容できる強力な免疫抑制抗体を産生するのに、特に有効 であることが見いだされた。 ２３７位のグリシンをアラニンで置換する改変は、ヒト補体を結合する能力が 中程度、すなわち、補体結合レベルは野生型の出発未改変抗体の約１５−８０％ 、好ましくは２０−６０％、最も好ましくは２０−４０％である抗体を産生する ことが見いだされている。 残基は、例えばその側鎖上に不適当な官能基を有する他のアミノ酸またはアミ ノ酸誘導体により、前述の方法と類似の方法を使用して、同様に置換することが できるであろう。これは例えば、側鎖の電荷および／または極性を変化させるこ とにより達成される。 本発明の改変抗体はまた、例えば分子の適当な部位にグリコシル化部位を挿入 することにより２３５のような残基を欠失させることにより産生することもでき る。このような方法は当該分野で公知であり、例えばヨーロッパ特許出願EP-307 434号の記載を参照。 本発明の改変抗体はまた、異なるイソタイプの抗体の下部ヒンジ領域を交換す ることにより産生することもできる。例えばＧ１／Ｇ２下部ヒンジ交換により、 補体結合能がなくなり、これは本発明のさらに好適な実施態様である。これは添 付の実施例に、より詳細に記載される。Ｇ１／Ｇ２下部ヒンジ交換により、１つ またはそれ以 上の残基が改変および／または欠失された、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の２ ３１〜２３８位で改変残基を有する抗体が得られる。 本発明の特に好適な実施態様において、抗体はＭＨＣクラスII抗原に向けられ たヒトＩｇＧ１抗体である。 さらに本発明は、未改変抗体に比較して抗体の補体結合能は改変されているこ とを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上の アミノ酸残基が改変されている改変抗体を投与することよりなる、補体介在毒性 を避ける細胞表面関連抗原の機能を調節する方法を提供する。 本発明のこの面の好適な実施態様において、該改変抗体は１つまたはそれ以上 の細胞性Ｆｃ受容体、特にＦｃＲIIIに結合することができるが、ＦｃＲＩへの 結合は有意に低下している。 このような細胞表面抗原の例には、例えば接着分子、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４、 ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ６９、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスIIおよび ＣＤ２５がある。 本発明はまた、本発明の改変抗体よりなる治療用、薬剤用および診断用組成物 、および治療と診断におけるこれらの生成物と組成物の使用も含む。 さらに本発明は、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組合わさ れた、本発明の改変抗体よりなる治療用、薬剤用および診断用組成物を提供する 。 本発明はまた、本発明の改変抗体を薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤また は担体に混合することよりなる、治療用、薬剤用および診断用組成物の調製法を 提供する。 その抗体や組成物は、使用される治療の方法に適した任意の型および量で投与 される。 治療用、診断用および薬剤組成物で使用するための、または抗体に介在される 補体結合のために抗体療法が好ましくない毒性を引き起こす疾患の治療に使用す るための改変抗体は、好ましくはＭＨＣ 特異抗体であり、最も好ましくはＭＨＣクラスII抗原であり、最も好ましくはＤ Ｒα鎖依存抗原決定基に対する特異性を有する。 治療用、薬剤用および診断用組成物は投与のための適した任意の型でよく、好 ましくは注射や注入（例えば、ボーラス注入または点滴）のような非経口投与に 適した型でもよい。注射用または注入用の場合は、生成物は油性または水性媒体 中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの型でもよく、懸濁剤、保存剤、安定剤お よび／または分散剤のような製剤物質を含有してもよい。 あるいは抗体または組成物は、使用前に適当な無菌液で復元するために、乾燥 型でもよい。 抗体または組成物が経口投与に適しているなら、製剤は活性成分以外に、デン プン、例えば、ジャガイモデンプン、トモロコシデンプンまたは小麦デンプン、 またはセルロース、または微結晶セルロースのようなセルロース誘導体またはデ ンプン誘導体；シリカ；乳糖のような種々の糖；炭酸マグネシウムおよび／また はリン酸カルシウムのような添加剤を含有してもよい。もし製剤が経口投与用で あるなら、これは患者の消化管系に充分許容されることが好ましい。このために 、製剤中に粘液形成剤や樹脂を含有させることが好ましい。また抗体または組成 物を胃液に不溶性のカプセル内に製剤化することにより、耐性を改善することが できる。また、抗体または組成物を調節放出性製剤中に含有させることも好まし い。 抗体または組成物が直腸投与に適しているならば、その製剤は結合剤および／ または滑沢剤（例えば、高分子性グリコール、ゼラチン、ココアバターまたは他 の植物蝋または植物脂肪）を含有してよい。本発明はまた、ヒトまたは動物の被 験体に、有効量の本発明の改変抗体を投与することよりなる、治療と診断方法を 提供する。 本抗体または組成物は、これらが使用される治療に応じた任意の適当な型と量 で投与される。抗体が投与される用量は、治療すべき症状の本質と、抗体が予防 的に使用されているのかまたは現存する 症状の治療に使用されているのかに依存する。用量は患者の年齢や症状に応じて 選択される。本発明の抗体の治療用量は、例えば好ましくは１回の投与量が０. １−２５ｍｇ／ｋｇ体重である。 本発明の抗体により治療される免疫学的疾患には、例えば強直性脊髄炎、若年 性リウマチ様関節炎、リウマチ様関節炎のような関節疾患；多発性硬化症のよう な神経学的疾患；糖尿病、若年性糖尿病のような膵臓疾患；慢性活動性肝炎、セ リアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、悪性貧血のような消化器系疾患；乾癬 のような皮膚病；喘息のようなアレルギー病；および移植片対宿主反応、そして 同種移植片拒絶のような移植関連疾患がある。他の疾患には、ヨーロッパ特許第 68790号に開示されたものがある。 本発明の改変抗体はまた、感染性疾患、例えば、ウイルスまたは細菌感染、の 治療および癌免疫療法にも有用である。 本明細書において「抗体」という用語は、天然の抗体、キメラ抗体およびＣＤ Ｒ移植抗体またはヒト化抗体を包含するのに使用される。キメラ抗体とは、１つ の抗体の完全可変ドメインよりなる抗原結合部位が、別の抗体の定常ドメインに 結合した抗体である。このようなキメラの作成法は、ＥＰ120694号（セルテック 社（Celltech Limited））、ＥＰ125023号（ジェネンテク社（Genentech Inc） およびシティ・オブ・ホープ（City of Hope））、ＥＰ171496号（レス・デブ・ コープ（Res．Dev．Corp.）、日本）、ＥＰ173494号（スタンフォード大学）お よびＷＯ86/01533号（セルテック社（Celltech Limited））に記載されている。 ＣＤＲ移植またはヒト化抗体は、ヒトでない種の免疫グロブリン由来の抗原結合 部位を有し、残りの免疫グロブリン部分はヒト免疫グロブリン由来である抗体分 子である。ＣＤＲ移植またはヒト化抗体を作成する方法は、ＷＯ91/09967号（セ ルテック社（Celltech Limited））、ＷＯ90/07861号（プロテイン・デザイン・ ラボズ社（Protein Design Labs．Inc））およびＷＯ92/11383号（セルテック社 （Celltech Limited））に記載さ れている。 さらに本発明は、本発明の改変抗体をコードするＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列を 含有するクローニングおよび発現ベクター、該ＤＮＡにより形質転換される宿主 細胞、および形質転換された宿主細胞中でＤＮＡ配列を発現することよりなる本 発明の改変抗体を産生する方法を含有する。 さらに、本発明において： ａ．抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベク ター中で産生させ、 ｂ．相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡＤＮＡ配列を有するオペ ロンを発現ベクター中で産生させ、 ｃ．両オペロンで宿主細胞をトランスフェクションし、そして ｄ．トランスフェクションした細胞株を培養して、少なくとも１つの発現ベクタ ーは、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残 基が対応する未改変抗体のアミノ酸残基からは改変されている抗体の重鎖をコー ドするＤＮＡ配列を含有する抗体分子を産生することよりなる、 本発明の改変抗体を産生するための方法が提供される。 当業者には明らかなように、全改変抗体が発現された後、部位特異的突然変異 誘発のような方法を用いて、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域中の改変を行うこと ができる。未改変抗体を発現するためには、改変抗体について記載した前述の方 法を用いてＤＮＡ配列を発現すべきである。 ＤＮＡ配列は好ましくはヒト化抗体であり；ｃＤＮＡ移植重鎖および／または 軽鎖またはキメラ抗体をコードする。 この細胞株は２つのベクターでトランスフェクションされ、第１のベクターは 軽鎖由来のポリペブチドをコードするオペロンを含有し、第２のベクターは重鎖 由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する。各ポリペプチド鎖が同様 に発現されることができる だけ確認できるように、コード配列と選択マーカーに関する限り、好ましくはこ れらのベクターは同一である。 あるいは、選択マーカーと、軽鎖由来と重鎖由来のポリペプチドをコードする オペロンを含有する、単一のベクターを使用することができる。 種々のベクターの一般的作成方法、トランスフェクション法および培養法は公 知である。そのような方法は例えば、マニアチス（Maniatis）ら、分子クローニ ング（Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring H arbor）、ニューヨーク、１９８９、およびプリムローズとオールド（Primrose and O1d）、遺伝子操作の原理（Principles of Gene Manipulation）、ブラック ウェル、オックスフォード、１９８０に記載されている。 本発明の改変抗体は、好ましくは抗ＭＨＣ抗体Ｌ２４３（これは受理番号ＡＴ ＣＣＨＢ５５でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックヴ ィル、メリーランド州）に寄託されている）由来であり、最も好ましくはそのキ メラまたはＣＤＲ移植誘導体である。Ｌ２４３はすでにランプソンとレヴィ（La mpson and Levy）［J．Immunol．（1980）125，293）］に記載されている。 本発明の改変抗体をコードするＤＮＡ配列を調製するのに、分子生物学の標準 的方法が使用される。オリゴヌクレオチド合成法を使用して、目的のＤＮＡ配列 のすべてまたはその一部が合成される。適宜部位特異的突然変異誘発およびポリ メラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）法が使用される。例えば「ＤＮＡ増幅のための ＰＣＲ技術の原理と応用」（”PCR Technology Principles and Applications f or DNA Amplification”）（1989）、エィチ・エー・アーリッヒ（H．A．Erlich ）編、ストックトン・ブレス（Stockton Press）、ニューヨーク、ロンドンを参 照。例えば、ジョーンズ（Jones）ら［Nature，321，522(1986)］が記載したオ リゴヌクレオチド特異的合成を使用することができる。またクラーマー（Kramer ）ら［Nucl eic Acids Res．12，9441(1984)］が記載したオリゴヌクレオチド特異的突然変 異誘発法を使用することもできる。 改変抗体をコードするＤＮＡ配列の発現に、任意の適当な宿主細胞／ベクター 系を使用することができる。細菌、例えば、大腸菌（E．coli）および他の微生 物系を使用することができる。例えばＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞［ベビントン・シ ー・アール（Bebbington，C R）ら（1991）Methods２，136-145］、およびミエ ローマまたはハイブリドーマ細胞株［ベビントン・シー・アール（Bebbington， C R）ら（1992）Bio/Techonology 10，169-175］のような真核細胞（例えば、哺 乳動物）宿主細胞発現系を使用することもできる。 改変抗体がＬ２４３由来の場合は、ＣＨＯベースの発現系を使用することが好 ましい。 ＡＤＣＣ測定法を間接的に介するＦｃＲIII結合の測定法、補体結合およびＣ １ｑ結合の測定法は、当該分野で公知であり、下記の実施例に詳述されている。 免疫機能／抗体による免疫抑制は、当該分野で公知の方法を用いて測定され、 例えば混合リンパ球応答、および破傷風トキソイドに対するＴ細胞呼び出し応答 （T-cell recall response）がある。これらの測定法は下記の実施例に詳述され ている。 本発明は、以下の非限定実施例に以下の図を参照して例示されている。 図中、 図１は、プラスミドｐＭＲ１５.１の地図を示す。 図２は、プラスミドｐＭＲ１４の地図を示す。 図３は、Ｌ２４３重鎖のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。 図４は、（ａ）クローン４３、（ｂ）クローン１８３、（ｃ）クローン１９２ のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 図５は、Ｌ２４３軽鎖のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を 示す。 図６は、プラスミドｐＧａｍｍａ１の地図を示す。 図７は、プラスミドｐＧａｍｍａ２の地図を示す。 図８は、ヒトＣ−ガンマ１のヒンジ領域とＣ_H２領域のヌクレオチド配列を示 す。 図９は、Ｌ２４３ヒトイソタイプシリーズの抗原結合能を示す。 図１０は、Ｌ２４３イソタイプシリーズのＦｃＲＩ結合を示す。 図１１は、Ｌ２４３イソタイプシリーズのヒト補体結合を示す。 図１２は、Ｌ２４３ヒトイソタイプシリーズへのヒトＣ１ｑの結合を示す。 図１３は、Ｌ２４３イソタイプのヒト補体結合を示す。 図１４は、Ｌ２４３イソタイプのモルモット補体結合を示す。 図１５は、Ｌ２４３イソタイプのウサギ補体結合を示す。 図１６は、ＡＤＣＣによるＬ２４３イソタイプシリーズのＦｃＲIII結合を示 す。 図１７は、Ｔ細胞呼び出し応答のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。 図１８は、Ｔ細胞呼び出し応答のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。 図１９は、混合リンバ球反応のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。 図２０は、Ｔ細胞呼び出し応答のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。 図２１は、混合リンバ球反応のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。 図２２は、Ｌ２４３−ｇＬ１中のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列 を示す。 図２３は、Ｌ２４３−ｇＬ２中のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列 を示す。 図２４は、Ｌ２４３−ｇＨ中のＶｈ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を 示す。 図２５は、Ｌ２４３移植片対ＦＩＴＣキメラＬ２４３に対する競 合測定法の結果のグラフを示す。 図２６は、Ｌ２４３ガンマ４のスキャチャード解析のグラフを示す。 図２７は、ＡＤＣＣで測定したキメラ、移植および移植［Ｌ２３５Ｅ］Ｌ２４ ３のFcＲIII結合のグラフを示す。 図２８は、ＭＬＲで測定したＣＤＲ移植Ｌ２４３の免疫抑制活性のグラフを示 す。 図２９は、ＣＤＲ移植Ｌ２４３と移植［Ｌ２３５Ｅ］Ｌ２４３Ｔ細胞リコール 応答のグラフを示す。 図３０は、ＣＤＲ移植Ｌ２４３とＣＤＲ移植［Ｌ２３５Ｅ］Ｌ２４３の補体介 在細胞毒性能のグラフを示す。 本発明の具体的な実施態様の詳細な説明 実施例 実施例１ 遺伝子クローニングと発現 Ｌ２４３ハイブリドーマ細胞からのＲＮＡ調製 後述のように３×１０⁷個のＬ２４３ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを調製 した。細胞を生理食塩水で洗浄してＲＮＡzol（１０⁶細胞当たり０.２ｍｌ）に 溶解した。クロロホルム（ホモジネート２ｍｌ当たり０.２ｍｌ）を添加し、混 合物を激しく１５秒間撹拌し、氷の上に１５分間置いた。得られた水層および有 機層を、エッペンドルフ遠心分離機で１５分間遠心分離して、同容量のイソプロ パノールを添加して水層からＲＮＡを沈殿させた。氷上で１５分間後、遠心分離 によりＲＮＡをペレットにし、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＲＮＡａｓ ｅを含まない無菌水に溶解した。ＲＮＡの収率は３５０μgであった。Ｌ２４３軽鎖のアミノ酸配列 成熟Ｌ２４３軽鎖の最初の９個のアミノ酸の配列は、ＮＨ２−ＤＩＱＭＴＱＳ ＰＡＳと決定された。Ｌ２４３ＶｈとＶｌのＰＣＲクローニング Ｌ２４３の重鎖と軽鎖の可変領域のｃＤＮＡ遺伝子は、逆転写酵素を用いて合 成して、総ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの１本鎖ｃＤＮＡコピーを作成し、次に 特異的オリゴヌクレオチドプライマーによりｃＤＮＡ上でポリメラーゼチェイン 反応（ＰＣＲ）を行なった。 ａ）ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡは以下の試薬を含む２０μｌの反応液中で合成した：５０ｍＭトリス −塩酸ｐＨ８.３、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂、０.５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、２０単位のＲＮＡ sin、７５ｎｇのランダムヘキサヌクレオチドプライマー、２μｇのＬ２４３ Ｒ ＮＡおよび２００単位のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素。４２℃で６ ０分間インキュベート後、９５℃で５分間加熱することにより反応を停止させた 。 ｂ）ＰＣＲ 重鎖と軽鎖のプライマーの組合せを用いて、ｃＤＮＡの一定分量にＰＣＲを行 なった。重鎖と軽鎖の５’ブライマーのヌクレオチド配列は、それぞれ表１と２ に示される。これらの配列は５’末端の６つのヌクレオチドから始まる制限部位 、得られるｍＲＮＡの翻訳を最適化するためにその後に配列ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ 、開始コドンおよびさらに２０−３０ヌクレオチドを含有し、公知のマウス抗体 のリーダーペプチド配列に基づく寄せ集めである［カバト（Kabat）ら（1991） 免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of Proteins of Immunological int erest）、第５版、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・ サービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）］。 ３’プライマーは表３に示される。軽鎖プライマーは、抗体のＶ−Ｃ結合部に またがっており、Ｖｌ ＰＣＲ断片のクローニングを促進するために酵素Ｓｐｌ １の制限部位を含有する。重鎖３’プライマーは、抗体のＪ−Ｃ結合部にまたが るように設計された混合物で ある。最初の２３ヌクレオチドは、ヒトＣ−ガンマ１、２、３および４遺伝子の 開始部分に見いだされたものと同一であり、これらのヒトイソタイブに共通のＡ ｐａ１制限部位を含む。プライマーの３’領域は、公知のマウス抗体で見いださ れた配列に基づく混合配列を含有する［カバト・イー・エー、ウー・ティー・テ ィー（Kabat，E A，Wu，T.T.）；ペリー・エィチ・エム、ゴッテスマン・ケー・ エスおよびフォエラー・エル（Perry H M，Gottesman K S，and Foeller L）； 免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of Proteins of Immunological Int erest）第５版、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サ ービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）、(1991)］。 上記のプライマーの組合せは、ＶｈとＶｌのＰＣＲ生成物を適当な発現ベクタ ー（下記参照）上に直接クローン化して、キメラ（マウス−ヒト）重鎖および軽 鎖を産生し、そしてこれらの遺伝子を哺乳動物細胞で発現して目的のイソタイプ のキメラ抗体を産生することを可能にする。 ＰＣＲ用のインキュベート（２０μｌ）は以下のように行なった。各反応物は １０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３、５０ｍＭ ＫＣｌ 、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン 酸、１〜６ピコモルの５’プライマーミックス（表４）、６ピコモルの３’プラ イマー、１μｌのｃＤＮＡおよび０.２５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する 。反応物は９５℃で５分間インキュベートし、次に９４℃で１分間、５５℃で１ 分間そして７２℃で１分間でサイクルさせた。３０サイクル後に各反応物の一定 分量をアガロースゲルの電気泳動で分析した。５’プライマーミックスＢ１、Ｂ ２、Ｂ３およびＢ５を含有する反応物は、全長Ｖｌ断片に一致するサイズのバン ドを生成し、反応物Ｂ９は、Ｖｈ遺伝子に予測されるサイズの断片を生成した。 Ｂ１プライマーにより生成されたバンドはすでに、ハイブリドーマ細胞に より産生される軽鎖の偽遺伝子であることが証明されていたので、このバンドは さらに追跡しなかった。 ｃ）ＰＣＲ断片の分子クローニング 反応物Ｂ２、Ｂ３およびＢ５中で産生されるＤＮＡ断片を酵素ＢｓｔＢ１とＳ ｐｌ１で消化し、エタノール沈殿により濃縮し、１.４％アガロースゲルで電気 泳動し、４００塩基対の範囲のＤＮＡバンドを回収した。これらを、ＢｓｔＢ１ とＳｐｌ１で制限切断したベクターｐＭＲ１５.１（図１）に結合させてクロー ン化した。結合後、混合物を大腸菌ＬＭ１０３５に形質転換し、得られる細菌の コロニーからのプラスミドを、ＢｓｔＢ１とＳｐｌ１で消化して挿入体について スクリーニングした。各結合反応からの挿入体を有する代表的なプラスミドをヌ クレオチド配列決定により解析した。 同様の方法で、反応物Ｂ９中で産生されＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で消化したＤ ＮＡ断片を、ＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で制限切断したベクターｐＭＲ１４（図２ ）にクローン化した。挿入体を含有する代表的プラスミドを、再びヌクレオチド 配列決定により解析した。 ｄ）ヌクレオチド配列解析 反応物Ｂ９からのＶｈ挿入体を含有する２つの単離体からのプラスミドＤＮＡ （ｐＥ１７０１とｐＥ１７０２）を、プライマーＲ１０５３（ｐＭＲ１４中のＨ ＣＭＶプロモーターの３’領域で開始する）とＲ７２０（ヒトＣ−ガンマ４の５ ’領域で開始し、ｐＭＲ１４上のＤＮＡの配列決定を可能にする）を用いて、配 列決定を行なった。ｐＥ１７０２中のＬ２４３Ｖｈの決定されたヌクレオチド配 列と予想アミノ酸配列を図３に示す。ｐＥ１７０１中のＶｈ挿入体のヌクレオチ ド配列は、ヌクレオチド２０（ｐＥ１７０１ではＡ）とヌクレオチド４２６（ｐ Ｅ１７０１ではＡ）を除いて、ｐＥ１７０２と同一であった。これらの２つの差 は、それぞれシグナルペプチドとＶｈのＪ領域中にあり、調べたこの２つのクロ ーンが、ＰＣＲ工程中のオリゴヌクレオチド混合物とは異なるプライマーを使用 することにより得られる独立の単離物であることを示している。 軽鎖クローンを解析するために、Ｒ１０５３でプライミングすることにより得 られる配列を試験した。反応物Ｂ２（クローン１８３）、Ｂ３（クローン４３） そしてＢ５（クローン１９２）から得られるＶｌ遺伝子のヌクレオチド配列と予 想アミノ酸配列を、図４に示す。予想される蛋白配列の比較により、以下のこと が示される： ｉ）クローン１８２、１８３、４３および４５はすべて、Ｖｌ遺伝子をコードし 、シグナルペプチドを除去した時、Ｌ２４３軽鎖のアミノ酸配列解析により決定 された配列と同じ配列を有する軽鎖を産生する（前述）。 ii）クローン１８２と１８３は、２０アミノ酸のシグナルペプチドをコードする Ｖｌ遺伝子を含有し、クローン４３と４５のＶｌ遺伝子は異なるセットのオリゴ ヌクレオチドによるプライミングにより得られ、わずかに１５アミノ酸のリーダ ー配列を有する。 iii）クローン１９２はＬ２４３Ｖｌをコードしない。そのかわり抗体配列のデ ータベースを調査すると、クローン１９２はＭＯＰＣ２１（Ｌ２４３ハイブリド ーマの産生に使用されるＮＳ１ミエローマ融合の相手により合成される軽鎖）の Ｖｌ遺伝子を含有することを示していた。 iv）クローン１８２と１８３は、ヌクレオチド２６（クローン１８２ではＴであ り、クローン１８３ではＣ）以外は同一である。この差はＰＣＲにおいて異なる プライマーを使用したことで説明され、これはクローン１８２と１８３は同じ遺 伝子の独立した単離体であることを示している。クローン１８３からの完全なＶ ｌ遺伝子のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を図５に示す。ヒトガンマ１およびガンマ２イソタイプの作成 Ｌ２４３Ｖｈ遺伝子をＨｉｎｄIII−Ａｐａ１断片上でｐＧａｍｍａ１とｐＧ ａｍｍａ２（それぞれヒトＣ−ガンマ１とＣ−ガンマ２をコードするベクター） 中にサブクローニングした（図６と７を参 照）。ヒトイソタイプ突然変異体 ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、ベクターｐＧａｍｍａ１に含有されるヒトＣ− ガンマ１中の残基２３５をロイシンからグルタミン酸またはアラニンへ、そして 残基２３７をグリシンからアラニンへ変更した。ヒトＣ−ガンマ１の下部ヒンジ 領域もまた、ヒトＣ−ガンマ２の対応する領域で置換した。これらの変更をする ために以下のオリゴヌクレオチドを使用した： １）Ｌ２３５Ｅ変更 ２）Ｌ２３５Ａ変更 ３）Ｇ２３７Ａ変更 ４）下部ヒンジ領域の交換 ＰＣＲ突然変異誘発に使用した他のオリゴヌクレオチドは、以下である： Ｒ４７３２とＲ４９１２はそれぞれ、ヒトＣ−ガンマ１のヌクレオチド８３４ と８５８の間と、ヌクレオチド１１５６と１１３７の間でプライムする（図８） 。 ＰＣＲ突然変異誘発の一般的方法は以下の通りである。各アミノ酸の変化につ いて、２回のＰＣＲを行い、必要な置換を有するＤＮ Ａ断片を作成する。次にこれらの断片をＢｇｌIIとＳｔｙ１で切断し、ｐＧａｍ ｍａ１ベクター中に野生型配列を含有する対応する配列を置換するのに使用した （図６）。 第１回目のＰＣＲでは、以下の試薬を含有する反応物（２０μｌ）を調製した ：１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、 ０.０１％ゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、５０ ｎｇのｐＧａｍｍａ１ ＤＮＡ、０.４単位のＴａｑポリメラーゼおよび６ピコモ ルの各プライマー。以下のプライマーの組合せを使用した： ９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間を３０サイクル行なっ た後、反応物をクロロホルムで抽出し、新たに合成したＤＮＡをエタノールで沈 殿させ、水に溶解し、１.４％アガロースゲルで電気泳動した。ＤＮＡ断片を含 有するゲルスライスをゲルから切り出し、「マーメイド」（”Mermaid”）（登 録商標）キット（ストラテック・サイエンティフィック社（Stratech Scientifi cLtd.）、ルートン（Luton）、イングランド）を用いてアガロースからＤＮＡを 回収し、２０μｌの無菌水に溶出させた。 第２回目のＰＣＲは、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ ＫＣｌ，０.０１％ゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレ オシド三リン酸、２単位のＴａｑポリメラーゼ、第１回目の反応からの各対のＤ ＮＡ断片の１／２０、および ３０ピコモルのＲ４７３２とＲ４９１２を含有する、反応物１００μｌ中で行な った。３０サイクル（前記参照）の後、反応物をフェノール／クロロホルム（１ ／１）で抽出し、エタノールで沈殿させた。断片をＢｇｌIIとＳｔｙ１で消化し 、１.４％アガロースゲルで電気泳動し、２５０塩基対のＤＮＡバンドを、前述 のようにゲルスライスから回収した。 これらのＢｇｌII−Ｓｔｙ１断片を８３０塩基対のＳｔｙ１−ＥｃｏＲＩ断片 （Ｃ_H２ドメインのＣ−末端部分とヒトＣ−ガンマ１の全ＣＨ３ドメインを含有 する）と、ｐＧａｍｍａ１からのＢｇｌII−ＥｃｏＲＩベクター断片に、３方向 結合させた（図６参照）。ＬＭ１０３５中へ形質転換後、得られたコロニーのプ ラスミドミニプレップをＢｇｌII−Ｓｔｙ１断片の存在についてスクリーニング し、それぞれの代表的なものを取りヌクレオチド配列解析を行なった。ここから 、目的の配列を含有するプラスミドを同定し、以後の参照のために下記のように 命名するした： 残基２３５にグルタミン酸を含有するｐＧａｍｍａ１［Ｌ２３５Ｅ］、残基２３ ５にアラニンを含有するｐＧａｍｍａ１［Ｌ２３５Ａ］、残基２３７にアラニン を含有するｐＧａｍｍａ１［Ｇ２３７Ａ］、Ｃ−ガンマ２下部ヒンジ領域を含有 するｐＧａｍｍａ１［ｇ１→ｇ２］。 上記プラスミドはそれぞれＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で切断し、Ｌ２４３Ｖｈを含 有するＨｉｎｄIII−Ａｐａ１断片を挿入して以下のプラスミドを作成した： Ｌ２４３ガンマ１［Ｌ２３５Ｅ］ Ｌ２４３ガンマ１［Ｌ２３５Ａ］ Ｌ２４３ガンマ１［Ｇ２３７Ａ］ Ｌ２４３ガンマ１［ｇ１→ｇ２］ ａ）キメラＬ２４３抗体の産生 リン酸カルシウム沈殿法を用いてチャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞中に同時トランスフェクションした後、適当な重鎖および軽鎖の 一時的トランスフェクションにより、生理学的評価のための抗体を産生した。 トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ−Ｌ７６１細胞がセミコンフルエン スになったフラスコをトリプシン処理し、細胞を計測し、それぞれ１０⁷個の細 胞を有するＴ７５フラスコを作成した。 翌日トランスフェクションの３時間前に培地を交換した。トランスフェクショ ンのために、重鎖および軽鎖発現ベクターをそれぞれ５０μｇ含有する０.２５ Ｍ ＣａＣｌ₂の１.２５ｍｌと、１.２５ｍｌの２×ＨＢＳ（水１リットル中にＮ ａＣｌ １６.３６ｇ、ＨＥＰＥＳ １１.９ｇ、およびＮａ₂ＨＰＯ₄０.４ｇ、ｐ ＨはＮａＯＨで７.１に調整）を混合してリン酸カルシウム沈殿物を調製し、直 ちに細胞上の培地に添加した。ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で３時間後、 培地と沈殿物を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１５％グリセロ ール１５ｍｌを加えて１分間細胞にショックを与えた。グリセロールを除去し、 細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０ｍＭ酪酸ナトリウムを含有する培地２５ｍｌ中 で４８〜９６時間インキュベートした。プロテインＡ−セファロースに結合させ 溶出して培地から抗体を精製し、免疫グロブリンＥＬＩＳＡ（後述）を用いて定 量した。 ｂ）ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡのために、ヌンク（Nunc）のＥＬＩＳＡプレートを、コーティング 緩衝液（１５ｍＭ炭酸ナトリウム、３５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６.９） 中５μｇ／ｍｌのポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ断片特異抗体（ジャクソン・イ ムノリサーチ（Jackson Immuno-research）、コード109-006-098）のＦ（ａｂ）₂ 断片で、４℃で一晩コーティングした。コーティングしなかった抗体は、蒸留 水で５回洗浄することにより除去した。定量する試料と標準物質を、結合緩衝液 （０.１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７.０、０.１Ｍ ＮａＣｌ、 ０.２％ｖ／ｖツイーン２０、０.２％ｖ／ｖハマーステン（Hammersten）カゼイ ン）中約１μｇ／ｍｌに希釈した。マイクロタイターウェル中で試料を連続２倍 希釈して各ウェルの最終液量を０.１ｍｌとして、プレートを激しく撹拌しなが ら室温で１時間インキュベートした。最初のインキュベート後プレートを蒸留水 で１０回洗浄し、次に結合緩衝液中７００倍希釈のマウスモノクローナル抗ヒト カッパ（クローンＧＤ１２）ペルオキシダーゼ結合抗体（ザ・バインディング・ サイト（The Binding Site）、コードＭＰ１３５）０.１ｍｌで前と同じように インキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質溶液（０.１ｍｌ）を各ウェ ルに加えた。基質溶液は、ｐＨ６.０中１５０μｌのＮ,Ｎ,Ｎ,Ｎ−テトラメチル ベンジジン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）、１５０μｌの過酸化水素（３０％溶 液）を含有する。初めの標準物質の６３０ｎｍの吸光度が約１.０になるまで、 プレートを５〜１０分間発色させる。６３０ｎｍの吸光度はプレートリーダーを 用いて測定し、試料の濃度は標準物質の力価曲線と比較して求めた。 実施例２ 作成したＬ２４３の生物学的性質 以下の実験の目的は、抗−ＭＨＣ−II抗体の使用の結果としての毒性の可能性 から免疫抑制作用を分離することであった。この過程において、免疫抑制にどの Ｆｃ有効機能が必要であるかを証明できると本発明者らは考える。阻害測定法による抗原結合能 本実験の原理は、同じ結合能を有する抗体は、同種の抗原に対して標識抗体と 完全に競合することである。作成したＬ２４３抗体の抗原結合能が少しでも変化 すれば、この系で明らかにされるであろう。 標準的方法を用いて、マウスＬ２４３（ＩｇＧ２ａ）をフルオレセン（ＦＩＴ Ｃ）で標識した。すべての希釈、操作およびインキュベートは、０.１％アジ化 ナトリウム（ビーディーエィチ（ＢＤＨ）、英国）と５％胎児牛血清（シグマ（ Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ（ＧＩＢＣＯ 、英国）中で行なった。ＲＢポリスチレンチューブ（２０５２ １２×７５ｍｍ ）ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）中の１００μｌ中の連続希釈した作成抗 体を、一定量の１００μｌ（あらかじめ決定された最適濃度で）の標識抗体と、 ５×１０⁴指示細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹＢリンパ芽球細胞株 ）上で前もって混合した。細胞と抗体を一緒に４℃で３０分間インキュベートし 、２回洗浄し、フルオレセン活性化細胞スキャナー（ＦＡＣＳベクトンディッキ ンソン）を用いて結合を明らかにした。適当な解析の後、平均蛍光強度を抗体濃 度に対してプロットした。結果 予想されたように、この分子のＦｃ領域の変化は抗原結合能に全く影響を与え なかった（図９）。ＦｃγＲＩ結合の評価 作成したＬ２４３の変種のＦｃｇＲＩへの結合能を測定した。この実験の原理 は、抗体はＦｃ受容体を介して細胞に結合し、この相互作用の親和性はサブクラ ス、従って抗体のＦｃの構造により決定されるということである。本測定法は、 ＩＦＮγ刺激Ｕ９３７細胞への結合に対して、作成抗体がＦＩＴＣ標識マウスＩ ｇＧ２ａと競合する能力に基づく。 Ｕ９３７（骨髄単球性）細胞は５００μ／ｍｌのＩＦＮγ（ジェンザイム（Ｇ ｅｎｚｙｍｅ）、英国）で２４時間インキュベートすると、ＣＤ６４結合とモノ マーＩｇＧ２ａ結合で評価したとおり、高レベルのＦｃｇＲＩ、低レベルのＦｃ ＴＲIIを発現し、ＦｃγＲIIIを全く発現しない。 Ｕ９３７細胞を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）を含有 するＤＭＥＭで充分洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中 で３７℃で２時間インキュベートし、次に２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ギブコ（ＧＩ ＢＣＯ、英国）を含有するＤＭＥＭで再度洗浄して、Ｆｃ受容体に結合した牛Ｉ ｇＧを除去した。作成抗体の連続希釈液を、Ｖ底の９６ウェルマイクロタイター プレート（アイシーエヌ／フロー（ＩＣＮ／Ｆｌｏｗ）、英国）中で０.１％ア ジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国 ）中で５０μｌに調製し、５０μｌ中の５×１０⁴個のＵ９３７細胞と４℃で３ ０分間インキュベートした。次にすべてのウェルに、あらかじめ決定した最適濃 度でＦＩＴＣ標識ＩｇＧ２ａ抗体５０μｌを加え、４℃でさらに９０分間インキ ュベートした。マイクロタイタートレイ中で細胞を１回洗浄し、ＲＢポリスチレ ンチューブ（２０５２ １２×７５ｍｍ、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国） に移し、もう一度洗浄し、フルオレセン活性化細胞スキャナー（ＦＡＣＳベクト ンディッキンソン）を用いて結合を明らかにした。適当な解析の後、平均蛍光強 度を抗体濃度に対してプロットした。結果 ＩｇＧ１のＣ_H２ドメインのＮ−末端の変化は、ＦｃＲＩへの結合に対して大 きな影響を与えた（図１０）。予想されるように、野生型ＩｇＧ１はＦｃＲＩに 充分結合し、ＩｇＧ４は約１０倍弱く結合し、ＩｇＧ２は全く結合しなかった。 本発明者らはヒトＩｇＧ４中のＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変化は、そのＦｃＲ Ｉへの低い結合能をゼロにし、ＩｇＧ１中の同じ変化によりＦｃＲＩ結合は全く なくなることを確認した。２３５のＡｌａはＦｃＲＩ結合を低下（約１００倍） させたが、ゼロにはならなかった。ＩｇＧ１のＧｌｙ２３７をＡｌａに変化させ ると、全領域２３３をＩｇＧ２で見られる配列の２３６で交換させた時のように 、ＦｃＲＩ結合がなくなった。Ｇ１［Ｋ３２０Ａ］変化はＦｃＲＩ結合には影響 がなかった。抗体依存性補体介在細胞障害 抗体依存性補体介在細胞障害の方法を用いて、Ｌ２４３の作成抗体変種のヒト 補体結合能を評価した。 この実験の原理は、抗体のＦｃが（通常の古典的）補体カスケードの成分と相 互作用することができるなら、抗体はその同種抗原を有する標的細胞の補体溶解 を媒介することである。決定的に重要な相互作用はＣ１ｑ分子との相互作用であ る。 これらの実験の補体の供給源は、エンドトキシンを含まないガラスビン中に採 血し、次に３７℃で１時間凝固させたヒト静脈血である。ガラスから凝固塊を切 り離し、次に４℃で２時間インキュベートして収縮させる。次に凝固塊を除去し 、１０００ｇで遠心分離して残存する赤血球から血清を分離する。いったん調製 された血清は、活性の大きな変化もなく−２０℃で１ヶ月まで保存できるが、新 鮮なまま使用することが最も好ましい。 すべての操作、希釈およびインキュベートは、２ｍＭグルタミン（ギブコ（Ｇ ＩＢＣＯ、英国）と１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有す るＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（ＧＩＢＣ Ｏ、英国）中で行なった。標的細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹ Ｂ リンパ芽球細胞株）を１ｍＣｉのＮａ⁵¹Ｃｒで室温で１時間（１５分毎に撹拌し て）標識する。次に細胞を３回洗浄して放射標識物を除去し、２×１０⁶／ｍｌ で再懸濁する。抗体の連続希釈物を、Ｖ底の９６ウェルマイクロタイタープレー ト（アイシーエヌ／フロー（ＩＣＮ／Ｆｌｏｗ）、英国）に２５μｌで２重に調 製する。測定法のバックグランド値を与える標識物の自発的放出を確立するため に、培地のみを含有する対照ウェルを調製する。標的⁵¹Ｃｒ標識ＪＹ細胞を、す べてのウェルに１０μｌ添加する。１００％放出値を確立するために、２％トリ トンＸ１００を含有するすべてのウェルにも、同数のＪＹ細胞を添加する。標的 細胞と抗体を一緒にインキュベートして、室温で１時間後補体源としてすべての ウェル（１００％は除く）に２５μｌの血清を加え、さらに室温で１時間インキ ュベートする。次に４℃で１００μｌのＥＤＴＡを加えて、さらなる細胞死滅を 停止させ、マイクロタイタープレートを２００ｇで遠心分離して、完全な細胞を ペレットにして、１００μｌの上澄液を取り、ガンマカウンター中で計測する。 すべての値からバックグランド値を引いて細胞の死滅率を計算し、最大放出に 対して補正した割合として表す。多重測定の変動は５％未満である。次に細胞溶 解の割合を抗体希釈率に対してプロットする。結果 Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域（残基２３３〜２３７）のいずれの変化も、ヒ ト補体を結合するＬ２４３の能力に影響を与えなかった（図１１）。野生型のＩ ｇＧ１は強力な死滅性を媒介し、６００ｎｇ／ｍｌが最大細胞死滅の半分を与え た（最大の６４％）。ＩｇＧ２とＩｇＧ４は２０μｇ／ｍｌでも細胞を全く死滅 させなかった。２３７のＧｌｙからＡｌａへの変化は中程度の死滅を与えた（２ μｇ／ｍｌで最大死滅の２０％）。下部ヒンジ領域のすべてをヒトＩ ｇＧ２で見いだされる配列と交換しても、２０μｇ／ｍｌでも溶解を引き起こさ なかった。ＩｇＧ１の２３５を変更すると、ヒト補体結合に対して予想外に大き な影響を与えた。Ｌｅｕ２３５をＧｌｕに変更すると、補体溶解がなくなった（ ２０μｇ／ｍｌでの死滅はなかった）。２３５のＡｌａでは低レベルの死滅があ った。これに対して、３２０のＬｙｓからＡｌａへの前述のＣ１ｑ結合モチーフ の変化［ダンカン・エー・アールとウィンター・ジー（Duncan A R and Winter G）（1988）Nature，332，21.］は、野生型ＩｇＧ１の死滅と全く変化がなかっ た（６００ｎｇ／ｍｌで最大の細胞死滅の７０％であり、半分の細胞が死滅した ）。Ｃ１ｑの直接結合 補体介在細胞障害は古典的経路の活性化によるものであることを確認するため に、Ｌ２４３の異なる作成抗体変種に対するヒトＣ１ｑの直接結合の測定を確立 した。 精製したヒトＣ１ｑ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を、従来法を用いて直接 フルオレセンイソシアネート（ＦＩＴＣ シグマ）で標識した。すべての希釈、 操作およびインキュベートは、０.１％アジ化ナトリウム（ビーディーエィチ（ ＢＤＨ）、英国）と５％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有する リン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で行なった。ＲＢポリ スチレンチューブ（２０５２ １２×７５ｍｍ、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、 英国）中で、４℃で１時間飽和濃度でインキュベートすることにより、５×１０⁴ 指示細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹ Ｂリンパ芽球細胞株）を異な る作成抗体でコーティングした。洗浄後、１００μｌ中のＦＩＴＣ標識Ｃ１ｑの 連続希釈物を添加し、さらに４℃で３０分間一緒にインキュベートした。洗浄後 、蛍光活性化細胞スキャナー（ＦＡＣＳベクトンディッキンソン）を用いて結合 を明らかにした。適当な解析の後、平均蛍光強度を抗体濃度に対してプロットし た。結果 Ｌ２４３ヒトイソタイプシリーズへのヒトＣ１ｑの直接結合は、補体介在細胞 障害（図１２）で得られた結果を確認した。標識ヒトＣ１ｑはＪＹ細胞に結合し た時、野生型ＩｇＧ１に充分結合し、ＩｇＧ４に弱く結合した。基本的にクラウ ゼらの記載した方法［Behring Inst．Mitt．87 56(1990)］により平衡解離定数 を求め、ＩｇＧ４とＩｇＧ１についてそれぞれ１.２×１０^-7Ｍと１.５×１０^-8 Ｍであった。これらの値は、同様の機能を有するマウスの抗体ＩｇＧ１とＩｇＧ ２ａで得られた値によく匹敵する［レザーバローとヅウエック（Leatherbarrow and Dwek）（1984），Molec．Immunol．21，321］。ＩｇＧ１のＬｅｕ２３５か らＧｌｕへの変化は、Ｃ１ｑへの結合をＩｇＧ４と同じレベルまで低下させた。 これに対して、３２０のＬｙｓからＡｌａへの前述のＣ１ｑ結合モチーフの変化 ［ダンカン・エー・アールとウィンター・ジー（Duncan A R and WinterG）（19 88）Nature，332，21］は、Ｃ１ｑ結合に対して何の影響も与えなかった。Ｉｇ Ｇ４のＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変化は野生型結合を変化させなかった。ウサギとモルモット補体 補体供給源としてヒトの代わりにウサギまたはモルモット血清を使用すると、 Ｇ１［Ｌ２３５Ｅ］およびＧ１［Ｌ２３５Ａ］修飾の挙動は異なっていた。ウサ ギＣ’では、野生型Ｇ１と同レベルの溶解を引き起こした。モルモットでは、Ｉ ｇＧ１野生型の８０％の死滅に対して、それぞれ４０％と４９％のプラトーレベ ルの死滅を引き起こした。２３５の変化はヒトの補体へのみ変化を与え、これは ウサギとモルモットの補体は、ヒトのＩｇＧ１とは相互作用が異なることを示し ている（図１３〜１５を参照）。抗体依存性細胞介在細胞障害 Ｌ２４３の作成抗体変種のＦｃＲIIIへの結合能を、抗体依存性細胞介在細胞 障害（ＡＤＣＣ）を用いて評価した。 この実験の原理は、抗体のＦｃが細胞障害能を有するエフェクター細胞を有す るＦｃ受容体と相互作用することができるなら、同種の抗原を有する標的細胞の 溶解を媒介することである。決定的に重要な相互作用は、抗体Ｆｃと細胞性Ｆｃ 受容体の間の相互作用である。 各実験でエフェクター細胞は新たに調製される。ヒト静脈血を、エンドトキシ ンを含まないヘパリン入りチューブに採取する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は 、製造業者（ファルマシア（Pharmacia））の指示に従い、密度勾配遠心分離法 により調製した。ＰＢＭＣは、２ｍＭのグルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国 ）と１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するＲＰＭＩ１６ ４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中（この培地中ですべての操作、希釈お よびインキュベートを行う）で１×１０⁷細胞／ｍｌに調製した。 標的細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹＢリンパ芽球細胞株）を１ｍ ＣｉのＮａ⁵¹で室温で１時間（１５分毎に撹拌して）標識する。次に細胞を３回 洗浄して遊離の放射標識物を除去し、２×１０⁶／ｍｌで再懸濁する。抗体の連 続希釈液を、無菌のＵ底９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン（Ｆ ａｌｃｏｎ）、英国）に２５μｌで２重に調製する。測定法のバックグランド値 を与える標識物の自発的放出を確立するために、培地のみを含有する対照ウェル を調製する。標的⁵¹Ｃｒ標識ＪＹ細胞を、すべてのウェルに１０μｌ添加する。 １００％放出値を確立するために、水中２％トリトンＸ１００を含有するウェル にも、同数のＪＹ細胞を添加する。標的細胞と抗体を一緒にインキュベートして 、室温で３０分後すべてのウェル（１００％は除く）に２５μｌのエフェクター 細胞を加え、さらに３７℃で４時間インキュベートする。次に４℃で１００μｌ のＥＤＴＡ生理食塩水を加えて、さらなる細胞死滅を停止させ、マイクロタイタ ープレートを２００ｇで遠心分離して完全 な細胞をペレットにして、１００μｌの上澄液を取り、ガンマカウンター中で計 測する。 すべての値からバックグランド値を引いて細胞の溶解率を計算し、最大放出の 割合として表す。多重測定の変動は５％未満である。次に細胞溶解の割合を抗体 希釈率に対してブロットする。結果 Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域（残基２３３〜２３７）の必ずしもすべての変 化が、ＦｃＲIII介在機能に影響を与えなかった（図１６と表５と７）。Ｌ２４ ３ ＩｇＧ２は、１００γ／ｍｌまでの濃度でＨＬＡ−ＤＲ陽性ＪＹリンパ芽球 の末梢血単核細胞細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介しなかった。ＩｇＧ４は低レベル のＡＤＣＣ（１γ／ｍｌで最大死滅の２０％）を引き起こし、これはＬｅｕ２３ ５からＧｌｕへの変更によりなくなった。野生型のＩｇＧ１は細胞死滅の強力な メディエーターであり、５ｎｇ／ｍｌ抗体で５０％細胞死滅を与えた。２３７の ＧｌｙからＡｌａへの変化は、ＩｇＧ１野生型による死滅ををＩｇＧ４で見られ るレベルまで低下させた。下部ヒンジ領域のすべてをヒトＩｇＧ２で見いだされ る配列と交換すると、５０％細胞死滅に５００ｎｇ／ｍｌを必要とする中程度の レベルの死滅を与えた。これに対してＩｇＧ１の２３５の変更は、ＡＤＣＣに対 して最小の影響を与えた。 Ｌｅｕ２３５をＡｌａに変更すると、Ｇ１野生型に匹敵する死滅のレベル（５ ０％細胞死滅について９ｎｇ／ｍｌ）であり、Ｌｅｕ２３５のＧｌｕへの変更は ＡＤＣＣを少し低下させた（５０％の細胞死滅について４０ｎｇ／ｍｌ）。３２ ０のＬｙｓからＡｌａへの前述のＣ１ｑ結合モチーフの変化は、ＡＤＣＣを媒介 するＩｇＧ１の能力に全く影響を与えなかった。免疫機能 エクス・ビボ（ex vivo）のＴ細胞機能実験を行なった（ここでＭＨＣ−IIと Ｔ細胞受容体の相互作用がＴ細胞活性化に必須の条件で ある）。Ｌ２４３イソタイプシリーズを混合リンパ球反応（これは未変性および 記憶Ｔ細胞活性化の両方を測定する）と、記憶Ｔ細胞応答のみを測定する破傷風 トキソイドに対する呼び出し応答で試験した。混合リンパ球反応 Ｌ２４３の作成抗体変種の免疫抑制能を、混合リンパ球反応で評価した。 この実験の原理は、ある個人の白血球を異なるＨＬＡアレレを発現する別の個 人の白血球と混合すると、これらはお互いを異物として認識して活性化されると いうことである。この活性化は主に、Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ複合体と抗原提 示細胞上のＭＨＣクラスII分子との相互作用に依存する。ＭＨＣ−IIに結合する 抗体はこの反応を阻害することは公知である。 各実験で白血球は新たに調製される。２人の個人のヒト静脈血を、エンドトキ シンを含まないヘパリン入りチューブに採取する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ） は、製造業者（ファルマシア（Pharmacia））の指示に従い、密度勾配遠心分離 法により調製した。ＰＢＭＣは、２ｍＭのグルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英 国）、１００μｇ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）、および１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ） 、英国）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で２ ×１０⁶細胞／ｍｌに調整する。この培地中ですべての操作、希釈およびインキ ュベートを行なった。１人の個人のＰＢＭＣに３０００ｒａｄの照射を行う。こ れらの細胞は、他の個人からの応答を刺激する。 抗体の連続希釈液を、無菌のＵ底９６ウェルマイクロタイタープレート（ファ ルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）に２５μｌで３重に調製する。最大の応答と最 大の阻害を確立するために、それぞれ培地のみと最適レベルのシクロスポリン（ サンディミュン（Sandimmu n）（登録商標）、サンド（Sandoz））を含有する対照ウェルを調製する。同数 の照射刺激物質と応答物質を混合し、各ウェルに１００μｌ添加する。刺激物質 のみおよび応答物質のみのウェルも、対照として準備する。実験は３７℃で湿度 １００％で５％ＣＯ₂で５日間インキュベートする。１μＣｉ／ウェルの³Ｈ−チ ミジン（アマーシャム（Amersham）、英国）とインキュベートして、ガラスフィ ルターマット上で採取して、ベータカウンターを用いて計測して、最後の１８時 間の培養中の増幅を評価することにより、応答を測定する。 抗体濃度に対するＣＰＭとして結果をプロットする。多重測定の変動は１０％ 未満である。破傷風トキソイドに対するＴ細胞呼び出し応答 ２次応答を抑制するＬ２４３の作成抗体変種の能力を、破傷風トキソイドに対 する呼び出し応答を用いて評価した。 この実験の原理は、あらかじめ破傷風トキソイド（ＴＴ）で免疫したある個人 のＴ細胞は、エクス・ビボ（ex vivo）で再暴露するとＴＴに応答することであ る。この活性化は、Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ複合体と、抗原を有しこれを提示 する細胞上のＭＨＣ−II分子との相互作用に依存する。ＭＨＣ−IIに結合する抗 体はこの反応を阻害することは公知である。 各実験でリンパ球は新たに調製される。ヒト静脈血を、エンドトキシンを含ま ないヘパリン入りチューブに採取する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、製造業 者（ファルマシア（Pharmacia））の指示に従い、密度勾配遠心分離法により調 製した。ＰＢＭＣは、２ｍＭのグルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）、１０ ０μｇ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ（Ｇ ＩＢＣＯ、英国）、および１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を 含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中、すべての操作 、希釈およびインキュベートを行なった。この培地中で２×１０⁶細胞／ｍｌに 調整する。 抗体の連続希釈液を、無菌のＵ底９６ウェルマイクロタイタープレート（ファ ルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）に１００μｌで３重に調製する。あらかじめ実 験で決定した最適濃度のＴＴを含有する５０μｌをすべてのウェルに添加する。 最大の応答と最大の阻害を確立するために、それぞれ培地のみと最適レベルのシ クロスポリン（サンディミュン（Sandimmun）（登録商標）、サンド（Sandoz） ）（１００ｎＭ）を含有する対照ウェルを調製する。次に５０μｌのＰＢＭＣを 各ウェルに加える。実験は３７℃で湿度１００％で５％ＣＯ₂で７日間インキュ ベートする。１μＣｉ／ウェルの³Ｈ−チミジンとインキュベートして、ガラス フィルターマット上で採取して、ベータカウンターを用いて計測して、最後の１ ８時間の培養中の増幅を評価することにより、応答を測定する。 抗体濃度に対するＣＰＭとして結果をブロットする。多重測定の変動は１０％ 未満である。結果 （図１７−２１） ＭＬＲとＴＴ応答の間のＬ２４３ヒトイソタイプシリーズの効果の間に有意の または定性的な差はなかった。最大阻害率は、Ｇ１、Ｇ１［Ｌ２３５Ｅ］および Ｇ１［Ｌ２３５Ａ］で達成された。同様の阻害率を得るために、約２桁多いＧ２ 、Ｇ４およびＧ１［Ｌ２３５Ａ］が必要であった。Ｇ１／Ｇ２ Ｌヒンジ交換突 然変異体は、中程度の免疫抑制能であった。補体結合またはＦｃＲＩ結合と免疫 抑制の間に相関はなく、Ｇ１はＦｃＲＩに充分結合し補体結合したが、Ｇ１［Ｌ ２３５Ｅ］はいずれの作用もなかった。しかしいずれも良好な免疫抑制能を示し た。しかし、ＦｃＲIII結合との間には良好な相関があった。ヒトＧ１とＧ１［ Ｌ２３５Ｅ］はＦｃＲIIIと相互作用し、良好な免疫抑制を示す。Ｇ１／Ｇ２ Ｌヒンジは、中程度のＦｃＲIII結合と免疫抑制を示した。これに対して、ヒト Ｇ１のＧ２３７Ａ突然変異は、報告されている観察結果と一致してＦｃＲIII結 合能を低下させる。この抗体は免疫抑制能は小さかった（表５）。表６ は、いくつかのＬ２４３イソタイプ突然変異体を示す。結論 本発明者らは、抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｌ２４３をベースにした作成抗体の適合セ ットを用いて、ヒトＩｇＧ１のＣ１ｑとＦｃＲ結合に必要なアミノ酸残基は、Ｃ_H ２ドメインのＮ−末端領域（残基２３１〜２３８）に位置することを見いだし た。ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣ_H２ドメインのロイシン２３５をグルタミン酸 に変化させると、ＦｃＲＩ結合能がなくなることはすでに公知であるが、本発明 者らはこれを確認し、また同時に、ＦｃＲIII介在機能を保持したままヒト補体 結合能がなくなることを見いだした。ＩｇＧ１の２３７のグリシンをアラニンに 変化させると、またＦｃＲＩ結合能がなくなり、補体結合能とＦｃＲIII介在機 能が低下した。２３３〜２３６の全領域を、ヒトＩｇＧ２中の配列で交換すると 、ＦｃＲＩ結合能と補体結合能がなくなり、ＩｇＧ１のＦｃＲIII介在機能が低 下した。これに対して、前述のＣ１ｑ結合モチーフを３２０のリジンをアラニン に変化させても、ＩｇＧ１介在補体結合には何の影響も与えなかった。 ＩｇＧ１の変化のＦｃＲＩ結合への影響は、ＩｇＧ３やＩｇＧ４を用いて得ら れた報告された観察結果、つまり下部ヒンジ／Ｎ−末端Ｃ_H２領域の２３５と２ ３７の変化はＦｃＲＩ結合能を著しく低下させる［ルンド・ジェイ（Lund J）ら 、J Immunol，1991．147，265：そしてアレグレ・エム・エル（A1egre，M-L）ら 、Ｊ．Immunol．1992．148，3461］と同じである。これらのイソタイプ間の類似 性は、これらが同様の方法でＦｃＲＩと相互作用することを強く示唆する。 本発明者らは、Ｃ_H２領域の下部ヒンジ／Ｎ−末端内に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ ＲIII結合に必要な残基を見いだした。２３７を修飾し下部ヒンジをＩｇＧ２残 基で交換すると、それぞれ低および中程度のＦｃＲIII介在死滅を引き起こした 。これらの作用は、ヒトＩｇＧ３についてサーメイ（Sarmay）らが報告したもの ［Molec．Immunol．1992．29，633］と同様である。ＩｇＧ３を用いるサーメイ らの方法 に対して、ＩｇＧ１の残基２３５での本発明者らの変化はＦｃＲIII介在機能に 対してほとんど影響を与えなかった。 グリーンウッド（Greenwood）ら［Eur．J．Immunol．1993．23，1098］は、Ｉ ｇＧ１とＩｇＧ４の間のドメイン内およびドメイン間のスイッチ変種を用いて、 ２９２を越えるＣ_H２ドメインのＣ−末端中でＦｃＲIII結合に必要なＩｇＧ１内 の残基を同定している。これは、Ｃ_H２領域の下部ヒンジ／Ｎ−末端内に本発明 者らが同定した残基は、ヒトＩｇＧ１の結合を経由して介在されるＦｃＲIIIエ フェクター機能に必要であるが、充分ではないことを示している。 ２３５が変化したＩｇＧ１変種は、ヒト補体による溶解を媒介せず、精製した ヒトＣ１ｑに結合しなかった。本発明者らはまた、３２０が変化したＩｇＧ１分 子は、ＩｇＧ１野生型と同等の補体介在死滅を与えることを見いだした。残基Ｇ ｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２は、蛋白工学的研究によりマウス ＩｇＧ２ｂでＣ１ｑ結合に必要であることが証明された［ダンカン・エー・アー ルとウィンター・ジー（Duncan A R andWinter G），Nature，1988．332，21］ 。同じ研究でまた、マウスＩｇＧ２ｂの２３５の変化はヒトＣ１ｑに対する親和 性に対して影響を与えないことが証明された［ダンカン・エー・アールとウィン ター・ジー（Duncan A R and Winter G），Nature，1988．332，21］。これらの 観察結果の見かけの矛盾は、おそらくヒトＩｇＧ１とマウスＩｇＧ２ｂの間のＣ １ｑ接触の差によるものであろう。 本発明者らは、Ｃ_H２ドメインの下部ヒンジ／Ｎ−末端のほとんどの変化はＣ １ｑ結合に影響を与えることを見いだした。Ｇ１／Ｇ２下部ヒンジ交換は補体結 合能をなくし、２３７の変化はまたこれを有意に低下させる。これに対して、グ リーンウッド（Greenwood）ら［Eur．J．Immunol．1993．23，1098］は、Ｃ_H２ ドメインのＣ−末端側半分にヒト補体結合に必要な残基を見いだした。タオ（Ta o）ら［J．Exp．Med．1993，178，661］はまた、Ｃ_H２ドメインのＣ−末 端側半分が補体結合に必要であることを見いだしている。彼らはまた、Ｃ１ｑ結 合を補体介在溶解から分離することが可能である。Ｃ_H２ドメインのＣ−末端側 半分中の３３１がＰｒｏからＳｅｒへ変化したＩｇＧ１はまた、野生型と同様に ヒトＣ１ｑに結合できるが、補体を活性化することは不可能である。これは、Ｃ_H ２領域の下部ヒンジ／Ｎ−末端内で本発明者らが同定したアミノ酸が、Ｃ１ｑ 結合に必要であること、そしてＣ−末端残基が、Ｃ１ｑを越える抗体依存性補体 カスケードの結合と活性化に必要であることを予測している。 実施例３ Ｌ２４３は、ヒトＭＨＣクラスIIに対するマウスモノクローナル抗体である。 Ｌ２４３のＶｌとＶｈのヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、それぞれ図５と３ に示す。以下の実施例は、Ｌ２４３抗体のヒト化（ＣＤＲ移植）を説明する。Ｌ２４３軽鎖のＣＤＲ移植 Ｌ２４３軽鎖の枠組み構造領域をヒト軽鎖サブグループと整列させる［カバト ・イー・エー、ウー・ティー・ティー、ペリー・エィチ・エム、ゴッテスマン・ ケー・エスおよびフォエラー・シー（Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry H.M.，Got tesman K.S.，and FoellerC.），1991、免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequen ces of Proteins of Immunological interest）第５版］と、Ｌ２４３はヒト軽 鎖のサブグループ１に最も相同性が高いことが明らかになった。従ってＣＤＲ移 植軽鎖を作成するために、選択した枠組み構造領域はヒトグループ１コンセンサ ス配列の枠組み構造領域に対応する。Ｌ２４３とコンセンサスヒトグループ１軽 鎖との枠組み構造領域のアミノ酸配列の比較は以下に示されており、２つの配列 の間に２１の差（下線）があることを示している。 抗原結合に対するこれらの枠組み構造の差が与える寄与を解析（公開国際特許 出願ＷＯ91/09967号を参照）すると、研究のために４つの残基が同定された：こ れらは４５、４９、７０および７１位である。この解析に基づき、２つのＣＤＲ 移植軽鎖を作成した。この最初のもの（Ｌ２４３−ｇＬ１）では、残基４５、４ ９、７０および７１がＬ２４３軽鎖由来であり、第２のもの（Ｌ２４３−ｇＬ２ ）では、すべての残基はヒトコンセンサスである。軽鎖比較 ＣＤＲ移植軽鎖Ｌ２４３−ｇＬ１の作成 Ｌ２４３−ｇＬ１の作成を以下に詳述する。キメラ軽鎖の枠組み構造領域に変 更を導入するために、以下のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼチェイン反応（ ＰＣＲ）に使用した： それぞれ、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシ ド三リン酸、０.１μｇのキメラＬ２４３軽鎖ＤＮＡ、６ピコモルのＲ５０４３ ／Ｒ５０４４、またはＲ５０４５／Ｒ５０４６、またはＲ５０４７／Ｒ５０４８ 、および０.２５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する、各２０μｌの３つの反 応物を準備した。反応物を９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分 間でサイクルさせた。３０サイクル行なった後、反応物をアガロースゲルで電気 泳動し、ＰＣＲ断片をゲルから切り出し、「マーメイド」（”Mermaid”）キッ トを用いて回収した。 これらの一定分量に第２回目のＰＣＲを行なった。反応物１００μｌは、１０ ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０.０１ ％ｗ／ｖゼラチン、第１回目の反応からの３つのＰＣＲ断片のそれぞれの１／１ ０、およびＲ５０４３とＲ５０４８を各３０ピコモル、そして２.５単位のＴａ ｑポリメラーゼを含有していた。反応温度は前述の通りである。ＰＣＲ後、混合 物をフェノール／クロロホルム、次にクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿 させた。エタノール沈殿物を遠心分離により回収し、適当な緩衝液に溶解し、Ｂ ｓｔＥIIとＳｐIIで切断した。得られた生成物を最後にアガロースゲルで電気泳 動し、２７０塩基対のＤＮＡ断片をゲルスライスから回収し、あらかじめ同じ酵 素で消化したベクターｐＭＲ１５.１（図１）に結合させた。 結合混合物を使用して大腸菌ＬＭ１０３５を形質転換し、得られたコロニーを ＰＣＲで解析し制限酵素で消化し、そしてヌクレオチド配列決定を行なった。Ｌ ２４３−ｇＬ１のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を図２２に示す。ＣＤＲ移植軽鎖Ｌ２４３−ｇＬ２の作成 ＰＣＲを利用してＬ２４３−ｇＬ１からＬ２４３−ｇＬ２を作成した。アミノ 酸の変更を導入するために、以下のオリゴヌクレオチ ドを使用した： １０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８３、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０ .０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、 ０.１μｇのＬ２４３−ｇＬ１、６ピコモルのＲ１０５３／Ｒ５３５０またはＲ ５３４９／Ｒ６８４、および０.２５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する、各 ２０μｌの２つの反応物を準備した。反応物を９４℃で１分間、５５℃で１分間 そして７２℃で１分間でサイクルさせた。３０サイクル後、反応物をアガロース ゲルで電気泳動し、ＰＣＲ断片をゲルから切り出し、「マーメイド」（”Mermai d”）キットを用いて回収した。 これらの一定分量に第２回目のＰＣＲを行なった。反応物１００μｌは、１０ ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０.０１ ％ｗ／ｖゼラチン、第１回目の反応からのＰＣＲ断片のそれぞれの１／５、およ びＲ１０５３とＲ６８４を各３０ピコモル、そして２.５単位のＴａｑポリメラ ーゼを含有していた。反応温度は前述の通りである。ＰＣＲ後、反応物をフェノ ール／クロロホルム、次にクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。エ タノール沈殿物を遠心分離により回収し、適当な緩衝液に溶解し、ＢｓｔＥIIと ＳｐIIで切断した。得られた生成物を最後にアガロースゲルで電気泳動し、２７ ０塩基対のＤＮＡ断片をゲル スライスから回収し、あらかじめ同じ酵素で消化したベクターｐＭＲ１５.１（ 図１）に結合させた。 結合混合物を使用して大腸菌ＬＭ１０３５を形質転換し、得られたコロニーを ＰＣＲで解析し制限酵素で消化し、そしてヌクレオチド配列決定を行なった。Ｌ ２４３−ｇＬ２のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を図２３に示す。Ｌ２４３重鎖のＣＤＲ移植 軽鎖について記載した方法と同じ方法を用いて、Ｌ２４３重鎖のＣＤＲ移植を 行なった。Ｌ２４３重鎖は、サブグループ１に属するヒト重鎖に最も相同性が高 いことが明らかになり、従ってＬ２４３重鎖ＣＤＲを受け入れるために、ヒトサ ブグループ１枠組み構造のコンセンサス配列を選択した。 ２つの構造の枠組み構造領域の比較を以下に示す。ここで、Ｌ２４３はヒトコ ンセンサスとは２８個の位置（下線）で異なることがわかる。抗原結合に対して これらが与える寄与を解析すると、ＣＤＲ移植重鎖であるＬ２４３−ｇＨでは、 ２７、６７、６９、７１、７２および７５の残基のみが保持されていた。重鎖比較 ＣＤＲ移稙重鎖Ｌ２４３ｇＨの作成 適当なプライマーの存在下で、重複するオリゴヌクレオチドをＰＣＲに付して Ｌ２４３ｇＨを組み立てた。ＰＣＲには以下のオリゴヌクレオチドを使用した： 組立反応物（５０μｌ）は、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキ シリボヌクレオシド三リン酸、１ピコモルの各Ｒ４８９７〜Ｒ４９０５、１０ピ コモルの各Ｒ３００４とＲ３００５、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼを 含有していた。反応物を９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間 でサイクルさせた。３０サイクル後、反応物をフェノール／クロロホルム（１／ １）、次にクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。遠心分離後、ＤＮ Ａを適当な切断緩衝液に溶解し、ＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で消化した。得られた 断片をアガロースゲルから回収し、あらかじめ同じ酵素で消化したベクターｐＭ Ｒ１４（図２）に結合させた。ｐＭＲ１４はヒトガンマ４重鎖定常領域を含有し 、従ってこのベクターにより発現される重鎖はガンマ４イソタイプである。結合 混合物を使用して大腸菌ＬＭ１０３５を形質転換し、得られた細菌コロニーを制 限消化によりスクリーニングし、そしてヌクレオチド配列決定を行なった。こう してＬ２４３ｇＨの正しい配列を含有するプラスミドが同定された（図２４）。ガンマ１型のキメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３重鎖の作成 マウスおよびＣＤＲ移植重鎖の可変領域をＨｉｎｄIIIからＡｐａ１への断片 として、ベクターｐＧａｍｍａ１（図６）に移すことにより、ヒトガンマ１型の Ｌ２４３重鎖を作成した。このベクターは、ヒトガンマ１重鎖定常領域を有する 。ＣＤＲ移植遺伝子の活性の評価 ＣＤＲ移植遺伝子の活性は、これらを哺乳動物中で発現させ、新たに合成され た抗体を精製し定量することにより評価した。この方法は後述し、それに引き続 き抗体の生化学的性状解析に使用される生化学的および細胞ベースの測定法を記 載する。 ａ）ＣＨＯ細胞中の遺伝子発現 キメラＬ２４３の産生について前述したように、リン酸カルシウ ム沈殿法を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に同時トランス フェクションした後、重鎖および軽鎖対の一時的トランスフェクションにより、 生物学的評価のためのキメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３を産生した。 抗体濃度は、ヒト免疫グロブリンＥＬＩＳＡ（下記）を用いて定量した。 ｂ）ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡのために、ヌンク（Nunc）のＥＬＩＳＡプレートをーティング緩衝 液（１５ｍＭ炭酸ナトリウム、３５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６.９）中５ μｇ／ｍｌのポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ断片特異抗体（ジャクソン・イムノ リサーチ（Jackson Immuno-research）、コード109-006-098）のＦ（ａｂ）₂断 片で、４℃で一晩コーティングした。コーティングしなかった抗体は、蒸留水で ５回洗浄することにより除去した。定量する試料と標準物質を、結合緩衝液（０ .１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７.０）０.１ＭＮａＣｌ、０.２％ｖ／ｖツイーン２０ 、０.２％ｗ／ｖハマーステン（Hammersten）カゼイン）中約１μｇ／ｍｌに希 釈した。マイクロタイターウェル中で試料を連続２倍希釈して各ウェルの最終液 量を０.１ｍｌとして、プレートを激しく撹拌しながら室温で１時間インキュベ ートした。最初のインキュベート後プレートを蒸留水で１０回洗浄し、次に結合 緩衝液中７００倍希釈のマウスモノクローナル抗ヒトカッパ（クローンＧＤ１２ ）ペルオキシダーゼ結合抗体（ザ・バインディング・サイト（The Binding Site ）、コードＭＰ１３５）０.１ｍｌで前と同じように１時間インキュベートした 。プレートを再度洗浄し、基質溶液（０.１ｍｌ）を各ウェルに加えた。基質溶 液は、１０ｍｌの０.１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム、ｐＨ６.０中１ ５０μｌのＮ,Ｎ,Ｎ,Ｎ−テトラメチルベンジジン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ ）、１５０μｌの過酸化水素（３０％溶液）を含有する。初めの標準物質の６３ ０ｎｍの吸光度が約１.０になるまで、プレー トを５〜１０分間発色させた。６３０ｎｍの吸光度はプレートリーダーを用いて 測定し、試料の濃度は標準物質の力価曲線と比較して求めた。 ｃ）競合測定法 本測定法の原理は、抗原結合領域がマウスからヒト枠組み構造に正しく移行し たなら、ヒトＭＨＣクラスIIへの結合に対して、ＣＤＲ移植抗体は標識キメラ抗 体と等しく競合するということである。この系で抗原結合能の変化があれば明ら かになるであろう。 ウッド（Wood）らの方法［ウッド・ティー、トンプソン・エスおよびゴールド スタイン・ジー（Wood，Ｔ.，Thompson，S and Goldstein，G）、1965，J．Immu nol 95，225-229］を用いて、キメラＬ２４３をフルオレセン（ＦＩＴＣ）で標 識し、前述の競合測定法に使用した。 図２５は、ＪＹ細胞への結合に対してＦＩＴＣ標識キメラＬ２４３と競合する 、Ｌ２４３重鎖および軽鎖のすべての組合せの能力を比較している。すべての組 合せは有効な競合物質であるが、ＣＤＲ移植重鎖または軽鎖を含有するものはい ずれもキメラ抗体自身ほど有効ではなかった。すなわち、本測定法で組合せｃＨ ／ｇＬ１、ｇＨ／ｃＬおよびｇＨ／ｇＬ１は、キメラＬ２４３に対してそれぞれ ８９％、７８％および６４％の有効性であった。 ｄ）スキャチャード（Scatchard）解析による親和性定数の決定 Ｌ２４３抗体を、ＰＢＳ、５％胎児牛血清、０.１％アジ化ナトリウム中１０ μｇ／ｍｌから連続１.５倍希釈（各１５０μｌ）してから、測定点当たり５× １０⁴個のＪＹ細胞と氷上で１時間インキュベートした。あらかじめ細胞を数え 、洗浄し、試料と同じ緩衝液に再懸濁した。インキュベート後細胞を前記培地５ ｍｌで洗浄し、遠心分離し、上清液を廃棄した。結合した抗体は、ＦＩＴＣ結合 抗ヒトＦｃモノクローナル（ザ・バインディング・サイト（The Binding Site） 、コードＭＦ００１）の１／１００希釈液１００μｌを添加 して、明らかにした。次に細胞を氷の上で１時間インキュベートし、前述のよう に過剰のＦＩＴＣ結合体を洗浄して除去した。同じ緩衝液２５０μｌ中に細胞を 分散し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン）を用いて、細胞当たりの平 均蛍光強度を測定し、標準ビーズ（フロー・サイトメトリー・スタンダード社（ Flow Cytometry standards Corporation））を用いて較正した。こうして各細胞 濃度で、細胞当たり結合した抗体の分子数を求め、スキャチャードプロットを作 成するのに使用した。計算のために、Ｌ２４３に対するＦＩＴＣ結合体の結合価 は１：１であると仮定し、Ｆ／Ｐは３.３６であった（製造業者の提供による） 。 キメラＬ２４３（ｃＨ／ｃＬ）、Ｌ２４３−ｇＨ／Ｌ２４３−ｇＬ１およびＬ ２４３ｇＨ／Ｌ２４３−ｇＬ２の親和性を比較するスキャチャードプロットを、 図２６に示す。キメラＬ２４３の見かけのＫｄは４.１ｎＭであり、ｇＬ１とｇ Ｌ２軽鎖を含有するＣＤＲ移植抗体の見かけのＫｄは、それぞれ６.４ｎＭと９. ６ｎＭであった。２つのＣＤＲ移植軽鎖を有する抗体のＫｄ値の差は、親軽鎖か らＬ２４３−ｇＬ１に保持された残基４５、４９、７０および７１の寄与を反映 している。 ｅ）抗体依存性細胞介在細胞障害 抗体依存性細胞介在細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介するキメラとＣＤＲ移植Ｌ２ ４３の能力を、前述のように比較した。この実験の原理は、抗体のＦｃが、細胞 障害が可能なエフェクター細胞を有するＦｃ受容体と相互作用することができる なら、抗体は同種の抗原を有する標的細胞の溶解を媒介することである。 前記測定法でのキメラ（ｃＨ／ｃＬ）とＣＤＲ移植（ｇＨ／ｇＬ１）Ｌ２４３ ヒトガンマ１イソタイプの活性の比較を、図２７に示す。両抗体とも細胞溶解の 有効なメディエータであり、最大活性は、１００ｎｇ／ｍｌ未満の抗体濃度で達 成される。２つの抗体の活性の間に有意な差はなかった。 ｆ）免疫機能試験 エクス・ビボ（ex vivo）Ｔ細胞機能実験を行った（ここでＭＨＣ−IIとＴ細 胞受容体の間の相互作用は、Ｔ細胞活性化の必須要件であった）。キメラとＣＤ Ｒ移植Ｌ２４３抗体を、混合リンパ球反応（これは未変性および記憶Ｔ細胞活性 化を測定する）と破傷風トキソイドに対する呼び出し応答（これは記憶Ｔ細胞応 答のみを測定する）で比較した。 １）混合リンパ球反応（前述記載） この実験の原理は、ある個人の白血球を異なるＨＬＡアレレを発現する別の個 人の白血球と混合すると、これらはお互いを異物として認識して活性化されると いうことである。この活性化は主に、Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ複合体と抗原提 示細胞上のＭＨＣクラスII分子との相互作用に依存する。Ｌ２４３はこの反応を 阻害することが知られている。 Ｔ細胞活性化の阻害物質としてキメラとＣＤＲ移植Ｌ２４３のガンマ１イソタ イプの有効性を比較するためにＭＬＲを行っても、２つの抗体の間には有意な差 は観察されなかった（図２８）。いずれの抗体も１００ｎｇ／ｍｌを用いて、９ ０％以上のＭＬＲの阻害が観察された。 ２）破傷風トキソイドに対するＴ細胞呼び出し応答 ２次応答を抑制するキメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３の能力を、破傷風毒素に 対する呼び出し応答を用いて評価した。実験の原理は前述の通りである。 ＴＴへの呼び出し応答を阻害する、キメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３のヒトガ ンマ１イソタイプの能力を比較する実験の結果を、図２９に示す。両抗体ともＴ ＴへのＴ細胞応答の有効な阻害物質であり、区別できない力価曲線を与えた。実施例４ ２３５位が変化したＣＤＲ移植Ｌ２４３、すなわち、Ｌ［２３５ Ｅ］が抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力は、基本的に前述の実施 例に記載のように測定した。その結果を図２７に示す。 同様に基本的に前述の実施例に記載のように、ＣＤＲ移植Ｌ２４３［Ｌ２３５ Ｅ］を混合リンパ球反応と破傷風トキソイドへの呼び出し応答で試験した。その 結果を図２８と２９に示す。 前述の実施例に記載のように抗体依存性補体介在細胞障害を用いて、ヒト補体 を結合するＣＤＲ移植Ｌ２４３抗体［Ｌ２３５Ｅ］の能力を評価した。その結果 を図３０に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/531 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ (31)優先権主張番号 ９４０２４９９．９ (32)優先日 1994年２月９日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９４０６２４４．５ (32)優先日 1994年３月29日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ボドマー、マーク・ウィリアム イギリス国 オクスフォード オーエック ス１ ５エイエス、サウス・ヒンクセイ、 マナー・ロード５、ローズ・コテイジ (72)発明者 アスウォル、ディルジート・シン イギリス国 ロンドン エスイー17、ニュ ー・クロス・ゲイト、カッセラ・ロード33

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．未改変抗体に比較して抗体の補体結合能が改変されていることを特徴とする 、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域における１つまたはそれ以上のアミノ酸 残基が改変された改変抗体。 ２．１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ受容体に結合するが、ＦｃＲＩには有意に 結合しない、請求の範囲第２項に記載の抗体。 ３．改変されるアミノ酸残基は２３１〜２３９位のアミノ酸内にある、請求の範 囲第１項または第２項に記載の抗体。 ４．ＭＨＣ特異抗体である、前記請求の範囲のいずれかに記載の抗体。 ５．抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸を改 変し、未改変抗体と比較して該抗体の補体結合能を改変することよりなる、未改 変抗体と比較して補体結合能が改変された改変抗体の産生方法。 ６．未改変抗体と改変抗体とを比較して抗体の補体結合能は改変されていること を特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のア ミノ酸残基が改変されている改変抗体を投与することよりなる、補体介在毒性を 避ける細胞表面関連抗原の機能を調節する方法。 ７．改変抗体は、１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ受容体、特にＦcＲIIIに結合 することができるが、ＦｃＲＩへの結合は有意に低下している、請求の範囲第６ 項に記載の方法。 ８．前記請求の範囲のいずれかに記載の改変抗体よりなる、治療用、診断用また は薬剤組成物。 ９．前記請求の範囲のいずれかに記載の改変抗体を、薬剤学的に許容される賦形 剤、希釈剤または担体に混合することよりなる、治療用、薬剤用および診断用組 成物の調製法。 １０．ヒトまたは動物被験体に、前記請求の範囲のいずれかに記載 の改変抗体の有効量を投与することよりなる、治療および診断方法。 １１．前記請求項のいずれか１項に記載の改変抗体の産生方法であって、 ａ）抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベク ター中で産生させ、 ｂ）相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを 発現ベクター中で産生させ、 ｃ）両オペロンで宿主細胞をトランスフェクションし、そして ｄ）トランスフェクションした細胞株を培養して抗体分子を産生する、 ことを特徴とする方法。 １２．ＤＮＡ配列はヒト化抗体をコードする、請求の範囲第１１項に記載の方法 。 １３．ＤＮＡ配列は、ＣＤＲ移植重鎖および／または軽鎖、またはキメラ抗体を コードする、請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４．少なくとも１つの発現ベクターは、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つ またはそれ以上のアミノ酸残基が、対応する未改変抗体のアミノ酸残基から改変 されている、抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する、請求の範囲第１１、 １２または１３項に記載の方法。 １５．未改変抗体が発現された後にＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の改変がなさ れる、請求の範囲第１１または１２項に記載の方法。 １６．抗ＭＨＣ抗体Ｌ２４３（ＡＴＣＣＨＢ５５）由来の、前記請求の範囲のい ずれかに記載の改変抗体。 １７．抗体の下部ヒンジは異なるイソタイプの抗体と交換されている、前記請求 の範囲のいずれかに記載の改変抗体。 １８．ＩｇＧ１下部ヒンジ領域はＩｇＧ２下部ヒンジ領域と交換されている、請 求の範囲第１７項に記載の改変抗体。 １９．未改変抗体に比較して、抗体の補体結合能が改変されている ことを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上 のアミノ酸残基が改変された改変抗体を投与することよりなる、抗体介在補体結 合のため抗体療法が好ましくない毒性を与える疾患の治療方法。