ES2788686T3 - Nuevo bacteriófago y composición que comprende el mismo - Google Patents
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Abstract
Un bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) que tiene una capacidad específica para matar Salmonella. Una composición que comprende el bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) según la reivindicación 1 como un ingrediente activo
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevo bacteriófago y composición que comprende el mismo
Campotécnico
La presente invención se refiere a un bacteriófago nuevo que tiene una capacidad específica para matar ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones, una composición que incluye el mismo y un nuevo bacteriófago para utilizar en la prevención de enfermedades causadas por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones.
Antecedentesdelatécnica
Salmonella es un género de bacterias anaerobias, Gram-negativas (anaerobias facultativas) de la familia Enterobacteriaceae y es un bacilo no formador de endosporas que tiene flagelos peritricosos para la movilidad. Salmonella es un microorganismo patógeno que causa diferentes enfermedades no solo a diferentes ganados, sino también a los seres humanos.
La salmonelosis en los seres humanos es causada principalmente por la ingestión de productos animales, tales como carne de cerdo y similares. Los informes dicen que diversas cepas de Salmonella tienen especificidad por las aves de corral y por tanto, causan infección en aves de corral, provocando daños económicos enormes a las granjas de aves de corral y a los consumidores y se sabe que aves de corral infectadas por Salmonella y la ingestión de tales aves de corral infectadas provoca intoxicación alimentaria en los seres humanos.
Específicamente, según las estadísticas de 2005 de los centros estadounidenses para el control y prevención de enfermedades (CDC; del inglés, Centers for Disease Control and Prevention), nueve cepas de Salmonella, entre las cepas de Salmonella aisladas de los seres humanos que sufrieron de intoxicación alimentaria causada por Salmonella, coinciden con cepas de Salmonella derivadas de aves de corral y se confirmó que la cepa de Salmonella predominante aislada de los seres humanos que sufrieron intoxicación alimentaria coincide con la cepa de Salmonella predominante aislada de pollos.
Un bacteriófago se refiere a un virus específico de bacterias que previene e inhibe el crecimiento de la bacteria. Como los bacteriófagos tienen una especificidad por el hospedador más fuerte que los antibióticos y la emergencia reciente de bacterias resistentes a antibióticos y los antibióticos residuales en animales se han vuelto serios, la aplicación de bacteriófagos ha atraído gran interés.
Sin embargo, la mayoría de estudios sobre bacteriófagos se centran en controlar Escherichia coli, Listeria y Chlorstridium. Salmonella también es contagiosa tanto para los seres humanos como para los animales, ha seguido causando enfermedades infecciosas y es capaz de crecer en un fagocito que ingiere bacterias, siendo de este modo resistente a antibióticos. Por tanto, existe una necesidad de bacteriófagos que puedan controlar eficazmente Salmonella y en particular, existe una necesidad de bacteriófagos y del desarrollo de tecnologías relevantes para controlar Salmonella en aves de corral para prevenir enfermedades infecciosas causadas por Salmonella en aves de corral para evitar intoxicaciones alimentarias mediadas por aves de corral en seres humanos.
Problematécnico
Como resultado de una investigación seria encaminada a prevenir eficazmente y a tratar enfermedades infecciosas causadas por Salmonella, los presentes inventores proporcionan un bacteriófago nuevo OCJ26 (KCCM11464P) que tiene una capacidad específica para matar ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones.
Además, para resolver la emergencia de bacterias resistentes debido al uso de antibióticos y los problemas de antibióticos residuales en la carne, la presente invención proporciona antibióticos, aditivos para piensos, aditivos para agua de bebida, piensos, agua de bebida, desinfectantes o detergentes, incluyendo el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) como un ingrediente activo.
Adicionalmente, la presente invención proporciona una composición para prevenir no solo las enfermedades infecciosas causadas por Salmonella en aves de corral sino también la intoxicación alimentaria en seres humanos, que incluye el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) como un ingrediente activo y usos medicinales adicionales del bacteriófago o de la composición que lo comprende como se expone en las reivindicaciones 3, 10 y 11.
Solucióntécnica
Un aspecto de la presente invención proporciona un bacteriófago nuevo OCJ26 (KCCM11464P) que tiene una capacidad específica para matar ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones.
Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición para prevenir las enfermedades infecciosas
causadas por Salmonella, que incluye un bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) como un ingrediente activo.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona antibióticos, aditivos para piensos, aditivos para agua de bebida, piensos, agua de bebida, desinfectantes o detergentes, incluyendo un bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) como un ingrediente activo.
Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) o una composición que incluye el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) como un ingrediente activo para utilizar en la prevención de enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella como se expone en las reivindicaciones.
Efectosventajosos
Según la presente invención el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) tiene una capacidad específica para matar ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones.
Además, el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) de acuerdo con la presente invención tiene una resistencia al ácido excelente, resistencia al calor y resistencia al secado y por tanto puede utilizarse no solo como un agente para prevenir o tratar enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones a diferentes intervalos de temperatura, pH y condiciones de secado, sino también como antibióticos, aditivos para piensos, aditivos para agua de bebida, piensos, agua de bebida, desinfectantes, detergentes y similares, incluyendo el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) como un ingrediente activo.
Adicionalmente, la presente invención proporciona el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) o los antibióticos que incluyen al mismo como ingrediente activo, que tienen especificidad por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones en comparación con antibióticos típicos de modo que matan selectivamente bacterias patógenas específicas sin matar bacterias beneficiosas y no inducen resistencia a fármacos, dando lugar a una extensión de la vida de los productos en comparación con los antibióticos típicos.
Adicionalmente, la presente invención proporciona usos medicinales adicionales del bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) como un ingrediente activo, para las aves de corral como se expone en la reivindicación 11.
Descripcióndelosdibujos
La Fig. 1 es una imagen de microscopía electrónica de un bacteriófago nuevo OCJ26 (KCCM11464P) (en adelante, referido como OCJ26).
La Fig. 2 muestra los resultados de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) de un bacteriófago nuevo OCJ26.
La Fig. 3 muestra los resultados de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato (SDS-PAGE) de un bacteriófago nuevo OCJ26.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de resistencia al ácido de un bacteriófago nuevo OCJ26.
La Fig. 5 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de resistencia al calor de un bacteriófago nuevo OCJ26.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de resistencia al secado de un bacteriófago nuevo OCJ26.
Mejor forma de realización
En adelante, se describirán en mayor detalle realizaciones de la presente invención. Se omitirá la descripción de detalles evidentes para una persona experta en la técnica en el presente documento.
Una realización de la presente invención proporciona un bacteriófago nuevo OCJ26 (KCCM11464P) (en adelante referido como ‘OCJ26’) que tiene una capacidad específica para matar ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones.
Salmonella es un microorganismo patógeno que infecta diferentes ganados y que causa diversas enfermedades y específicamente, puede causar intoxicación alimentaria en seres humanos cuando se ingiere pollo infectado con Salmonella y por tanto, se la conoce como la bacteria causante de la intoxicación alimentaria más frecuente entre los patógenos que causan enfermedades mediadas por alimentos (transmitidas por alimentos) en Corea.
En la actualidad, dicen los informes que Salmonella incluye unos 2500 serotipos que están ampliamente divididos en cepas que tienen especificidad por el hospedador dependiendo de los animales y cepas que no tienen especificidad por el hospedador y se encuentran como bacterias parásitas en diversos animales.
Entre los ejemplos de Salmonella, según la clasificación serológica, pueden incluirse Salmonella senftenberg, Salmonella derby, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A o C, Salmonella schottmulleri, Salmonella choleraesuis, Salmonella montevideo, Salmonella newport, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella mbandaka, Salmonella abortusovi, Salmonella abortusequi, Salmonella dublin, Salmonella sofia, Salmonella thompson, Salmonella havana, Salmonella bovismorbificans, Salmonella kentucky, Salmonella infantis, Salmonella hadar, Salmonella arizonae y Salmonella anatum, sin limitarse a los mismos.
Específicamente, según la presente invención Salmonella son cepas de Salmonella derivadas de aves de corral que consisten en Salmonella senftenberg, Salmonella montevideo, Salmonella newport, Salmonella Kentucky, Salmonella mbandaka, Salmonella infantis, Salmonella hadar, Salmonella derby, Salmonella thompson y Salmonella choleraesuis.
En el presente documento, aves de corral es un nombre genérico para aves domésticas. Las aves de corral no se circunscriben particularmente y pueden comprender al menos uno del grupo que consiste en pollos, gansos, pavos y similares. Específicamente, según esta realización Salmonella puede derivarse de los pollos.
Según esta realización, Salmonella crece bien en medios comunes y es capaz de crecer a una temperatura de aproximadamente 7°C a aproximadamente 48 °C con una temperatura de crecimiento ideal que varía de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 37 °C. Específicamente, la expresión de factores patógenos se realiza eficazmente a aproximadamente 42 °C. Adicionalmente, Salmonella puede crecer a pH que varía de 4,5 a 9,0. Un bacteriófago es un virus específico de bacterias capaz de infectar una bacteria específica e inhibir el crecimiento de la bacteria y es un virus que incluye ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), mono o bicatenario, como un material genético.
Específicamente, el bacteriófago OCJ26 según la presente invención es un bacteriófago que tiene especificidad de especie o que infecta selectivamente ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones y morfológicamente pertenece a la familia Siphoviridae, teniendo una cápside icosaédrica y una cola larga no contráctil (véase la Fig. 1). Se compara la homología entre una secuencia de nucleótidos del bacteriófago OCJ26 y las secuencias de nucleótidos descodificadas de otros bacteriófagos y los resultados se muestran en la Tabla 1. El bacteriófago OCJ26 muestra resistencia al ácido estable a pH 4,0 hasta pH 5,5 sin perder actividad (Fig. 4) y en términos de resistencia al calor, el bacteriófago OCJ26 no muestra disminución de actividad cuando se expone a 60 °C durante 2 horas (Fig. 5). En términos de resistencia al secado, el bacteriófago OCJ26 muestra disminución de actividad de aproximadamente 1 log tras el secado (Fig. 6). La secuencia de nucleótidos parcial del bacteriófago OCJ26 se expone en las SEQ ID NO: 1 a 3 de la lista de secuencias.
El bacteriófago OCJ26 es un bacteriófago nuevo aislado por el presente inventor y se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea) el 25 de octubre de 2013, con el número de entrada KCCM11464P.
Otra realización de la presente invención proporciona una composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones, que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo.
Dado que el bacteriófago OCJ26 muestra actividad antibacteriana capaz de matar específicamente ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones, se puede utilizar el bacteriófago OCJ26 en la prevención de enfermedades causadas por la infección de ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones. Entre las enfermedades infecciosas causadas por Salmonella se incluye la salmonelosis, sin limitarse a la misma.
En el presente documento, el término "salmonelosis" se refiere a una enfermedad epidémica digestiva aguda o crónica debida a la infección con Salmonella y los síntomas de la misma incluyen fiebre, gastroenteritis o sepsis, como síntomas principales con acompañamiento de neumonía, encefalitis, artritis, aborto, fiebre, diarrea, cianoderma y similares. Algunas subespecies pueden causar enfermedades infecciosas tanto en seres humanos como en animales, tales como la intoxicación alimentaria debida a la ingesta de carne de ganado infectada con Salmonella. En el presente documento, el término "que previene" o "prevención" se refiere a todas las acciones para inhibir o retrasar las correspondientes enfermedades o retrasar la aparición de las enfermedades correspondientes, mediante la administración a un animal del bacteriófago OCJ26 y/o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo.
La composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella expuestas en las reivindicaciones puede incluir el bacteriófago OCJ26 en cantidades de 5x102 ufp/ml a 5x1012 ufp/ml, específicamente, 1 x 106 ufp/ml a 1 x1010 ufp/ml.
La composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella expuestas en las reivindicaciones puede incluir adicionalmente vehículos farmacéuticamente aceptables y puede formularse con
los vehículos para proporcionar piensos, medicamentos, aditivos para piensos o aditivos para agua de bebida y similares.
En el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a vehículos o diluyentes que no estimulan un organismo y que no inhiben la actividad biológica ni las propiedades de los compuestos administrados.
Los tipos de vehículos aplicables a esta realización no se circunscriben particularmente y puede utilizarse cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable utilizado habitualmente en la técnica. Entre los ejemplos de vehículos pueden incluirse suero salino, agua destilada, solución de Ringer, solución salina tamponada, solución de inyección de albúmina, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerol, etanol y similares, sin limitarse a los mismos. Estos pueden utilizarse solos o en combinación de los mismos.
Es más, según sea necesario, se pueden añadir a la composición otros aditivos comunes tales como antioxidantes, soluciones tamponadas y/o citostáticas según la presente invención y se pueden añadir adicionalmente diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y/o lubricantes a la composición según la presente invención para elaborar formulaciones inyectables tales como soluciones acuosas, suspensiones y emulsiones, píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos o similares.
Los métodos para administrar la composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones no se circunscriben particularmente y pueden utilizarse métodos cualesquiera utilizados habitualmente en la técnica. Un ejemplo del método de administración de la composición puede incluir administración oral o administración parenteral.
Entre los ejemplos de formas de administración para administración oral se pueden incluir trociscos, pastillas para chupar, comprimidos, suspensiones solubles en agua, suspensiones de base oleosa, polvo de formulación, gránulos, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas blandas, jarabes o elixires, sin limitarse a los mismos.
Para formular la composición según esta realización en formas de administración tales como un comprimidos o cápsulas, se pueden añadir adicionalmente aglutinantes, tales como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, amilopectina, celulosa y gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; disgregadores, tales como almidón de maíz y almidón de batata; lubricantes, tales como estearato de magnesio, estearato de calcio, estearil fumarato sódico y cera de polietilenglicol y para la formulación de cápsulas, se pueden incluir adicionalmente vehículos líquidos, tales como aceites grasos, además de las sustancias mencionados anteriormente.
Entre los métodos para administrar parenteralmente la composición de esta realización se pueden incluir, por ejemplo, inyección intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea y administración tópica y un método de aplicación o pulverización de la composición según la presente invención a una región afectada, sin limitarse a los mismos.
Con el fin de formular formas de administración parenteral, por ejemplo, la composición de esta realización puede formularse en formas de administración para inyección tales como inyección subcutánea, inyección intravenosa e inyección intramuscular; supositorios; o formas de administración para pulverización, tales como aerosoles a fin de mantener la inhalación mediante inhaladores, sin limitarse a los mismos. Con el fin de formular formas de administración para inyección, la composición de esta realización se puede mezclar en agua con estabilizadores o agentes tamponadores para preparar soluciones o suspensiones, que se formulan en formas de administración por unidad de administración, tales como ampollas o viales. Cuando la composición se formula en formas de administración para pulverización tales como aerosoles, la composición se puede formular con propelentes y similares junto con aditivos, de manera que se dispersa en la misma un concentrado disgregado en agua o un polvo humedecido.
Las cantidades adecuadas de aplicación, pulverización o administración de la composición para prevenir o tratar enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones pueden diferir según factores como edad, peso corporal y sexo de los animales, grado de los síntomas de la enfermedad, piensos ingeridos, tasa de excreción y similares, además de un método para formular la composición, un método de administración, tiempo de administración y/o rutas de administración y un veterinario experto puede determinar y prescribir fácilmente cantidades de dosis eficaces para el tratamiento previsto.
Una realización adicional de la presente invención proporciona antibióticos, que incluyen el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo.
En el presente documento, el término "antibióticos" se refiere a una preparación que se administra a animales, incluyendo los seres humanos, en una forma medicinal y muestra eficacia para matar bacterias y se usa como término general para antisépticos, germicidas y agentes antibacterianos.
Para prevenir o tratar Salmonella, se han llevado a cabo activamente muchos estudios respecto a vacunas e
inmunidad antiinfeccciosa, pero se ha informado sobre 2.500 serotipos de subespecies de Salmonella hasta el momento que no tienen regiones hospedadoras específicas y por tanto al menos un animal se infecta o contamina con tales serotipos, fue prácticamente casi imposible erradicar Salmonella.
Además, Salmonella es capaz de crecer en un fagocito que ingiere bacterias y por tanto, no puede tratarse con antibióticos e incluso si un animal, que no tiene Salmonella, con el uso de antibióticos, el animal puede mostrar una susceptibilidad creciente a la reinfección con Salmonella cuando se detiene la administración de antibióticos y por tanto, existe la necesidad de desarrollar antibióticos que actúen específicamente sobre Salmonella.
Los antibióticos que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo tienen efectos en los que los antibióticos tienen especificidad por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones en comparación con antibióticos típicos y por tanto, matan bacterias patógenas específicas, pero no bacterias beneficiosas; y en que los antibióticos no inducen resistencia a fármacos, provocando la extensión de la vida de los productos en comparación con los antibióticos típicos.
Todavía otra realización de la presente invención proporciona un aditivo para piensos o agua de bebida, que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo.
Los aditivos para piensos o los aditivos para agua de bebida pueden utilizarse para preparar separadamente aditivos para piensos o aditivos para agua de bebida utilizando el bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el mismo y mezclado aditivos o agua de bebida con los aditivos o añadiendo directamente el bacteriófago ÓCJ26 o la composición que incluye el mismo en un proceso de preparación de piensos o agua de bebida.
El bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo utilizado en forma de aditivos para piensos o aditivos para agua de bebida según esta realización, puede ser una forma líquida o una forma seca, por ejemplo, una forma de polvo seco.
El bacteriófago OCJ26 según la presente invención se mezcla con una forma de polvo en cantidades de 0,05 % en peso (%p) a 10 %p, específicamente 0,1 %p a 2%p, según el peso de los aditivos para piensos.
No se circunscriben métodos de secado en particular de los aditivos para piensos o de los aditivos para agua de bebida según esta realización para producir polvo seco y puede utilizarse cualquier método utilizado habitualmente en la técnica. Entre los ejemplos del método de secado se pueden incluir el secado por aire, secado natural, secado por pulverización y liofilización, sin limitarse a los mismos. Estos métodos pueden utilizarse solos o en combinación de los mismos.
Los aditivos para piensos o los aditivos para agua de bebida según esta realización pueden incluir adicionalmente otros microorganismos no patógenos. Los microorganismos pueden seleccionarse del grupo que consiste en Bacillus sp., tal como Bacillus subtilis capaz de producir proteasas, ligasas y/o glicosiltransferasas; bacterias de ácido láctico tales como Lactobacillus sp. que tienen actividad fisiológica y capacidad de descomponer materia orgánica en condiciones anaerobias como el estómago del ganado; bacterias filamentosas tales como Aspergillus oryzae que tiene efectos de ganancia de peso en animales, aumento de producción de leche e incremento de la tasa de digestión-absorción de los piensos; y levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y similares. Estos microorganismos pueden utilizarse solos o en combinación de los mismos.
Los aditivos para piensos o los aditivos para agua de bebida según esta realización que incluyen el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo pueden comprender adicionalmente otros aditivos si es necesario.
Entre los ejemplos de aditivos utilizables se pueden incluir los aglutinantes, emulsionantes y conservantes añadidos para la prevención del deterioro de la calidad de piensos o agua de bebida; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, compuestos de nitrógeno no proteicos, silicatos, agentes tamponadores, agentes colorantes, agentes extractantes u oligosacáridos que se añaden para incrementar la utilidad de piensos o agua de bebida; y otros suplementos para piensos, sin limitarse a los mismos. Estos aditivos pueden utilizarse solos o en combinación de los mismos.
Los aditivos para piensos según la presente invención pueden estar presentes en cantidades de 0,05 partes en peso a 10 partes en peso, específicamente 0,1 partes en peso a 2 partes en peso, basados en 100 partes en peso de piensos. Los aditivos para agua de bebida según la presente invención pueden estar presentes en cantidades de 0,0001 en peso a 0,01 partes en peso, específicamente 0,001 partes en peso a 0,005 partes en peso, basados en 100 partes en peso de agua de bebida. Dentro de estos intervalos, los aditivos permiten la actividad del bacteriófago OCJ26 contra ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones para que se despliegue suficientemente.
Todavía otra realización de la presente invención proporciona piensos o agua de bebida preparada añadiendo los aditivos para piensos o los aditivos para agua de bebida que incluyen el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo para piensos o agua de bebida o directamente añadiendo el bacteriófago OCJ26 a los mismos.
Los piensos utilizados en esta realización no se circunscriben en particular y puede utilizarse cualquiera de los piensos usados habitualmente en la técnica. Entre los ejemplos de piensos pueden utilizarse piensos vegetales tales como granos, tubérculos, subproductos de procesamiento de alimentos, algas, fibras, subproductos farmacéuticos, aceites y grasas, almidones, residuos o subproductos de granos y similares; y piensos animales tales como proteínas, sustancias inorgánicas, aceites y grasas, minerales, proteínas de unicelulares y plancton animal o piensos animales, sin limitarse a los mismos. Estos piensos pueden utilizarse solos o en combinación de los mismos.
El agua de bebida utilizada en esta realización no se circunscribe en particular y puede utilizarse cualquier agua de bebida usada habitualmente en la técnica.
Además, según esta realización los piensos se pueden añadir al agua de bebida mediante mezcla y el agua de bebida resultante puede disminuir sistemáticamente el número de ciertos serotipos intestinales de Salmonella mostrados en las reivindicaciones, lo que podría proporcionar una solución a la producción de ganado libre de Salmonella.
Todavía otra realización de la presente invención proporciona desinfectantes o detergentes, que incluyen el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo. Las formas de administración de los desinfectantes o de los detergentes no se circunscriben en particular y puede utilizarse cualquiera de las formas de administración usadas habitualmente en la técnica.
Para eliminar ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones, los desinfectantes pueden pulverizarse a hábitats de los animales, mataderos, zonas muertas, cocinas y equipamiento de cocina, sin limitarse a los mismos.
Los detergentes pueden utilizarse para limpiar una superficie de la dermis o partes del cuerpo de aves de corral que están expuestas o que pueden exponerse a Salmonella, sin limitarse a los mismos.
Todavía otra realización de la presente invención proporciona el bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo para utilizar en la prevención de enfermedades infecciosas causadas por ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones.
Específicamente, el uso para prevención según las reivindicaciones 3, 10 y 11 prevé la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz del bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo para aves de corral que están expuestas o pueden estar expuestas a Salmonella. Las cantidades totales adecuadas del bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el mismo por día puede determinarse por un veterinario dentro del criterio médico apropiado, como es evidente para los expertos en la materia.
Se puede determinar una cantidad concreta farmacéuticamente eficaz del bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo para aves de corral, teniendo en cuenta los tipos y el grado de reacción a conseguir, edad, peso corporal, estado de salud general, sexo o dieta de los individuos correspondientes, tiempo de administración y rutas de administración del bacteriófago OCJ26 o una composición que incluye el mismo y la tasa de secreción de la composición, periodo de tratamiento y similares y puede diferir dependiendo de varios factores y factores similares bien conocidos en el campo de la medicina que incluyen componentes de medicinas que se utilizan simultáneamente o en diferentes momentos.
El bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo son para administrar en forma de una preparación farmacéutica para aves mediante pulverización intranasal o añadido directamente a piensos avícolas o a agua de bebida de modo que tiene que ser digerido y puede mezclarse en forma de aditivos para piensos o aditivos para agua de bebida con piensos o agua de bebida.
Las rutas y métodos de administración del bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo no se circunscriben en particular y la administración puede realizarse mediante rutas y métodos en tanto que la administración permita al bacteriófago OCJ26 o la composición que incluye el mismo alcanzar los tejidos deseados.
Concretamente, el bacteriófago OCJ26 o la composición que incluyen el bacteriófago OCJ26 como un ingrediente activo son para administrar mediante diferentes rutas orales o parenterales y entre los ejemplos de administración se pueden incluir la oral, rectal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdérmica, intranasal o por inhalación, sin limitarse a las mismas.
En adelante, la presente invención se describirá con mayor detalle con referencia a algunos ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes de la presente invención.
[Ejemplo1] - Aislamientodel bacteriófagoque infectaciertosserotipos de Salmonella mostradosenlas
reivindicaciones
<Ejemplo 1-1>
Cribado de bacteriófagos y aislamiento de bacteriófagos individuales
Se centrifugaron 50 ml de una muestra obtenida a partir de heces de pollo recogidas en torno a una granja de aves de corral en Gwangcheon, Hongsunggun, Chungcheong, a 4.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante resultante se filtró mediante un filtro de 0,45 pm para preparar un líquido de muestra, que a su vez se utilizó para realizar un método de superposición de agar blando. El método de superposición de agar blando se refiere a un método de observación de lisis por bacteriófagos que utiliza una célula hospedadora que crece sobre agar (unido a un medio sólido que utiliza agar al 0,7 %).
Específicamente, se mezclaron 150 pl de una solución de cultivo agitado (OD600 = 2) de Salmonella senftenberg (SS) obtenida del Department of Veterinary Medicine de Konkuk University y 2 ml de medio 10xLB (10 g/l de triptófano; 5 g/l de extracto de levadura; 10 g/l de NaCI) con 18 ml del líquido de muestra filtrado, seguido del cultivo a 37 °C durante 18 horas y la solución de cultivo resultante se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante resultante se filtró mediante un filtro de 0,45 pm. Posteriormente, una solución mixta que consiste en 3 ml de agar 0,7 % (p/v) y 150 pl de una solución de cultivo agitado (OD600 = 2) de SS se vertió y solidificó sobre una placa de medio Lb , sobre la que se añadieron 10 pl del líquido de muestra gota a gota, seguido de cultivo a 37 °C durante 18 horas, identificando de este modo la formación de placas.
Dado que se sabe que está presente un tipo de bacteriófago por placa, los inventores trataron de aislar bacteriófagos individuales de las placas formadas. Específicamente, se añadieron 400 pl de solución SM (5,8 g/l de NaCI; 2 g/l de MgSO47H2O; 50 ml de Tris-HCI 1M (pH 7,5)) a las placas y se dejaron a temperatura ambiente durante 4 horas, obteniendo de este modo una solución de bacteriófago.
A continuación, se mezclaron 100 pl de la solución de bacteriófagos con 12 ml de agar 0,7 % (p/v) y 500 pl de una solución de cultivo agitado (OD600 = 2) de SS, que se utilizó para realizar un método de superposición de agar blando utilizando una placa de medio LB que tiene un diámetro de 150 mm donde se realizó el cultivo hasta que el bacteriófago se lisó completamente. Después de completarse el cultivo, se añadieron 15 ml de solución SM a la placa de medio LB y se dejó a temperatura ambiente durante 4 horas, obteniendo de este modo una solución de bacteriófago.
Se añadió a la solución cloroformo 1 % (v/v) y se mezcló durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos, obteniéndose de este modo un sobrenadante, que a su vez se filtró mediante un filtro de 0,45 pm para obtener una muestra final.
<Ejemplo 1-2>
Cultivo a gran escala y purificación del bacteriófago
El bacteriófago obtenido en el Ejemplo 1-1 se cultivó a gran escala utilizando Salmonella senftenberg (SS) y de ahí se purificó el bacteriófago a continuación.
Específicamente, SS se produjo en cultivo agitado y se inoculó a 1,5x1010 ufc, seguido de centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos y resuspensión en 4 ml de solución SM. A esto, se añadió el bacteriófago a 1,5x108 ufp con multiplicidad de infección (MOI; del inglés, Multiplicity of Infection) de 0,0001 y a continuación se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
A continuación, con ello se inocularon 150 ml de medio LB y se cultivó a 37 °C durante 6 horas. Después de completarse el cultivo, se añadió cloroformo a un volumen de 1 % (v/v) del volumen final, seguido de agitación durante 20 minutos, a lo que se añadieron ADNasa y ARNasa como enzimas de restricción en una concentración final de 1 pg/ml, respectivamente y se dejó a 30 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron cloruro de sodio y polietilenglicol a una concentración final de 1M y 10 % (p/v), respectivamente y se dejó a 4 °C durante 3 horas, seguido de centrifugación a 4 °C y 12.000 rpm durante 20 minutos, obteniéndose de este modo un precipitado.
El precipitado obtenido se suspendió en 5 ml de solución de SM y a continuación se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadieron 4 ml de cloroformo al mismo con agitación, seguido de centrifugación a 4 °C con 4.000 rpm durante 20 minutos, obteniéndose de este modo un sobrenadante. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 pm, seguido de ultracentrifugación (35.000 rpm, 1 hora, 4 °C) utilizando un método de gradiente de densidad de glicerol (densidad: glicerol 40 %, 5 %), purificando de este modo un bacteriófago.
Los presentes inventores aislaron un bacteriófago que tiene una capacidad específica para matar ciertos serotipos de Salmonella mostrados en las reivindicaciones a partir de muestras recogidas de heces de pollos en granjas, que
se designó como "Bacteriófago OCJ26" y se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (361 221 Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea) el 25 de octubre de 2013, con el número de entrada KCCM11464P.
<Ejemplo 2>
ObservaciónmorfológicadeOCJ26
El bacteriófago OCJ26 purificado en el Ejemplo 1 se diluyó en una solución de gelatina 0,01 % y continuación se fijó en una solución de glutaraldehído 2,5 %. El bacteriófago resultante se añadió gota a gota a una placa de mica recubierta de carbono (aprox. 2,5 mmx2,5 mm), se aclimató durante 10 minutos y a continuación se lavó con agua destilada.
Posteriormente, la película de carbono se montó sobre una rejilla de cobre y se tiñó con acetato de uranilo 4 % durante 60 segundos, se secó y se examinó en un microscopio electrónico de transmisión (JEM-1011, 80 kV, de x200.000 aumentos) (Fig. 1).
La Fig. 1 es una imagen de microscopía electrónica de transmisión del bacteriófago OCJ26, en la que el bacteriófago OCJ26 tiene características morfológicas de una cápside icosaédrica con una cola no contráctil, que indican que el bacteriófago pertenece al morfotipo Siphoviridae.
<Ejemplo 3>
Análisis de tamaño de ADN genómico total de QCJ26
El ADN genómico se extrajo del bacteriófago OCJ26 purificado en el Ejemplo 1.
Específicamente, se añadieron ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 20 mM, 50 pg/ml de proteasa K y dodecilsulfato sódico (SDS) 0,5 % (p/v) a una solución cultivada del bacteriófago OCJ26 y se dejó a 50 °C durante una hora, a la que se añadió una cantidad igual de fenol (pH 8,0) con agitación, seguido de centrifugación a temperatura ambiente y 12.000 rpm durante 10 minutos, obteniendo de este modo un sobrenadante.
El sobrenadante se mezcló con una cantidad igual de FC (fenol: cloroformo= 1:1), seguido de centrifugación a temperatura ambiente y a 12.000 rpm durante 10 minutos, obteniéndose de este modo un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con una cantidad igual de cloroformo, seguido de centrifugación a temperatura ambiente y a 12.000 rpm durante 10 minutos, obteniéndose de este modo un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con 10 % (v/v) de acetato de sodio 3M basado en el volumen total, seguido de la adición de 2 volúmenes de etanol 95 % frío, mezclado y permaneciendo a -20 °C durante 1 hora.
Posteriormente, la sustancia resultante se centrifugó a 0°C y 12.000 rpm durante 10 minutos, de la que se retiró un sobrenadante para obtener un precipitado, que se disolvió en 50 pl de solución tamponada de TE (Tris-EDTA, pH 8,0). El ADN extraído se diluyó 10 veces y se determinó la concentración de ADN mediante la medición de la absorbancia a OD260.
A continuación, se cargó 1 pg de ADN sobre un gel de agarosa PFGE (electroforesis en gel de campo pulsado) 1 % y se desarrolló utilizando el BIORAD PFGE SYSTEM NO.7 PROGRAM (tamaño que varía de 25 kb a 100 kb; rampa de tiempo de conmutación de 0,4 a 2,0 segundos, forma lineal; tensión directa, 180 V; tensión inversa, 120 V) a temperatura ambiente durante 20 horas (Fig. 2).
La Fig. 2 es una fotografía de gel de electroforesis de ADN genómico del bacteriófago OCJ26 y puede observarse que el tamaño de ADN genómico del bacteriófago OCJ26 fue de aproximadamente 90 kpb.
<Ejemplo 4>
Análisis del patrón de proteínas de QCJ26
Se mezclaron 15 pl de la solución de bacteriófago OCJ26 purificado (valoración 1011 ufp/ml) con 3 pl de 5xsolución de muestra de SDS y a continuación se hirvieron durante 5 minutos para realizar SDS-PAGE 12 % (Fig. 3).
La Fig. 3 es una fotografía de electroforesis de resultados de SDS-PAGE realizada sobre el bacteriófago OCJ26 y puede observarse que las proteínas principales tienen un tamaño de aproximadamente 12,1 kDa, aproximadamente 16,4 kDa, aproximadamente 44 kDa y aproximadamente 54 kDa.
<Ejemplo 5>
Análisis de las propiedades genéticas de QCJ26
Para determinar las propiedades genéticas del bacteriófago OCJ26 purificado en el Ejemplo 1, el ADN del bacteriófago OCJ26 se analizó utilizando como un analizador génico un FLX Titanium Sequencer (Roche). Los genes se recombinaron utilizando GS y un software ensamblador de novo (Roche) de Macogen Inc. El marco abierto de lectura se identificó utilizando los software Gene-Mark. hmm, Glimmer v3.02 y FGENESB. El marco abierto de lectura se anotó utilizando BLASTP y el programa InterProScan.
La secuencia de nucleótidos del bacteriófago OCJ26 mostró similaridad a la secuencia de nucleótidos de bacteriófagos notificados anteriormente (fago SPT- de Salmonella, fago EC6 de Escherichia, fago SA1 de Staphylococcus), pero pudo observarse que no hubo bacteriófagos en los que todos los fragmentos coincidieran al 100 %. En consecuencia, pudo observarse que el bacteriófago era un bacteriófago aislado nuevo.
La siguiente Tabla 1 muestra los resultados de la comparación entre la secuencia de nucleótidos del bacteriófago OCJ26 y la secuencia de nucleótidos descodificada del bacteriófago notificado en la técnica.
TABLA 1
El ADN del bacteriófago preparado OCJ26 se analizó utilizando un secuenciador de ADN y los resultados de la secuencia de nucleótidos total analizada se muestran en las SEQ ID NO: 1 a 3.
<Ejemplo 6>
Estabilidad de pH de QCJ26
Para identificar si el bacteriófago OCJ26 puede mantener estabilidad a pH bajo como las condiciones estomacales, la estabilidad del bacteriófago OCJ26 se examinó a diferentes pH (pH 3,0, 4,0, 5,0, y 5,5).
Para el experimento, se prepararon diferentes soluciones de pH (soluciones tamponadoras de acetato de sodio (pH 4,0, pH 4,5, pH 5,0, pH 5,5), soluciones tamponadoras de citrato de sodio (pH 3,0)) a una concentración de 0,2M. Se mezclaron 180 pl de cada solución de pH con 20 pl de una solución de bacteriófago con valoración de 108 UFP/ml para permitir que cada solución de pH tuviera una concentración de 1M y a continuación la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas. Para un grupo de control, se mezclaron 20 pl de una solución de bacteriófago con valoración 108 UFP/ml con 180 pl de solución SM mediante el mismo método y la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después, las soluciones se diluyeron en serie y se cultivaron 10 pl de cada una de las soluciones en cada etapa de dilución mediante el método de superposición de agar blando a 37 °C durante 18 horas para determinar la valoración de bacteriófago basándose en si el bacteriófago se lisó (Fig. 4).
La Fig. 4 muestra resultados experimentales de resistencia al ácido del bacteriófago OCJ26. En la figura 4, se pudo observar que el bacteriófago ÓCJ26 no perdió su actividad y mantuvo la estabilidad desde pH 4 a pH 5,5, en comparación con el grupo de control.
<Ejemplo 7>
Estabilidad térmica del bacteriófago QCJ26
Si los bacteriófagos de formulan en aditivos para piensos entre las formas de administración de bacteriófagos, se puede generar calor durante los procesos de formulación y por tanto, se realizó el siguiente experimento para determinar la estabilidad térmica de los bacteriófagos.
Específicamente, se dejaron 200 pl de solución de bacteriófago OCJ26 con 108 UFP/ml a 60 °C, durante 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, respectivamente. Después, la solución de cultivo experimental resultante se diluyó en serie, se cultivaron 10 pl de cada una de las soluciones en cada etapa de dilución mediante el método de superposición de agar blando a 37 °C durante 18 horas para determinar la valoración de bacteriófago basándose en si el bacteriófago se lisó (Fig. 5).
La Fig. 5 muestra resultados experimentales de resistencia al calor del bacteriófago OCJ26. Como se muestra en la Fig. 5, se pudo observar que el bacteriófago OCJ26 no mostró pérdida de actividad hasta que el bacteriófago OCJ26 se expuso a 60 °C durante 120 minutos.
<Ejemplo 8>
Estabilidad de secado del bacteriófago QCJ26
Si los bacteriófagos de formulan en aditivos para piensos entre las formas de administración de bacteriófagos, los bacteriófagos se pueden secar durante los procedimientos de formulación y por tanto, se realizó el siguiente experimento para determinar la estabilidad de los bacteriófagos ante las condiciones de secado.
Basándose en los resultados del experimento de resistencia al calor, el experimento de secado se realizó utilizando un concentrador SpeedVac. Se secaron 200 pl de solución de bacteriófago OCJ26 con 108 UFP/ml a 60 °C al vacío durante 2 horas y los sedimentos resultantes se introdujeron en 200 pl de solución SM, seguido de resuspensión completa a 4 °C durante un día, midiendo valoraciones de este modo (Fig. 6).
Como se muestra en la Fig. 6, pudo observarse que después del secado, en comparación con valoraciones iniciales y estabilidad relativa, el bacteriófago OCJ26 mostró pérdida de actividad de aproximadamente 1 log cuando se secó el bacteriófago OCJ26 a 60 °C durante 2 horas.
<Ejemplo 9>
Examen del intervalo de infecciones del bacteriófago QCJ26 sobre una cepa aislada de tipo silvestre de Salmonella Se analizó la actividad lítica del bacteriófago OCJ26 para 9 cepas del tipo silvestre de Salmonella senftenberg, 14 cepas de Salmonella montevideo, 12 cepas de Salmonella newport, 10 cepas de Salmonella Kentucky, 13 cepas de Salmonella mbandaka, 11 cepas de Salmonella infantis, 4 cepas de Salmonella hadar, 5 cepas de Salmonella derby, 4 cepas de Salmonella sholeraesuis y 13 cepas de Salmonella thompson, que fueron todas aisladas de una granja dirigida por el College of Veterinary Medicine, Konkuk University (KU), además de Salmonella senftenberg, utilizada en el presente documento.
Específicamente, se mezclaron 150 pl de una solución de cultivo agitado de cada cepa (OD600 = 2) y se vertieron a la misma 10 pl de la solución de bacteriófago OCJ26 con valoración 109 ufp/ml y se cultivaron mediante el método de superposición de agar blando a 37 °C durante 18 horas y a continuación se examinó la formación de placas (Tablas 2 y 3).
Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3.
TABLA 2
Claims (11)
1. Un bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) que tiene una capacidad específica para matar Salmonella.
2. Una composición que comprende el bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) según la reivindicación 1 como un ingrediente activo.
3. El bacteriófago OCJ26 (KCCM11464P) según la reivindicación 1 para utilizar en la prevención de enfermedades infecciosas causadas por Salmonella, donde Salmonella es una seleccionada entre el grupo que consiste en Salmonella senftenberg, Salmonella montevideo, Salmonella newport, Salmonella kentucky, Salmonella mbandaka, Salmonella infantis, Salmonella hadar, Salmonella derby, Salmonella thompson y Salmonella choleraesuis.
4. Un aditivo para piensos que comprende la composición según la reivindicación 2 como un ingrediente activo.
5. Piensos que comprenden el aditivo para piensos según la reivindicación 4.
6. Un aditivo para agua de bebida que comprende la composición según la reivindicación 2 como un ingrediente activo.
7. Agua de bebida que comprende el aditivo para agua de bebida según la reivindicación 6.
8. Un desinfectante que comprende la composición según la reivindicación 2 como un ingrediente activo.
9. Un detergente que comprende la composición según la reivindicación 2 como un ingrediente activo.
10. La composición, según la reivindicación 2 para utilizar en la prevención de enfermedades infecciosas causadas por Salmonella, donde Salmonella es una seleccionada entre el grupo que consiste en Salmonella senftenberg, Salmonella montevideo, Salmonella newport, Salmonella kentucky, Salmonella mbandaka, Salmonella infantis, Salmonella hadar, Salmonella derby, Salmonella thompson y Salmonella choleraesuis.
11. El bacteriófago para utilizar según la reivindicación 3 o la composición para utilizar según la reivindicación 10, que es para la administración a aves de corral.
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